BR112018001379B1 - Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, composição inibidora de insetos, e métodos para produção de sementes e para controlar uma praga ou infestação de pragas - Google Patents

Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, composição inibidora de insetos, e métodos para produção de sementes e para controlar uma praga ou infestação de pragas Download PDF

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Abstract

PROTEÍNAS INIBIDORAS DE INSETO. Uma classe de proteína pesticida exibindo atividade tóxica contra as espécies de pragas Coleoptera, Lepidoptera e Hemiptera é divulgada e inclui, sem que esteja limitada a, TIC5290. São fornecidos construtos de DNA que contêm uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica a proteína pesticida TIC5290. São fornecidas plantas transgênicas, células vegetais, semente e partes de plantas resistentes à infestação Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera que contêm sequências de ácido nucleico recombinante que codificam a proteína pesticida TIC5290 da presente invenção. Métodos para detectar a presença de sequências de ácidos nucleicos recombinantes ou a proteína da presente invenção em uma amostra biológica e métodos de controle de praga de espécies Coleoptera, Lepidoptera e Hemiptera usando a proteína pesticida TIC5290 também são fornecidos.

Description

Referência ao Pedido Relacionado
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório N° de Série US 62/199,024, depositado em 30 de julho de 2015 incorporado integralmente a este documento por meio de referência.
Incorporação de Listagem de Sequências
[002] O arquivo chamado "listagem de sequênciaMONS394WO.txt" contendo uma forma legível por computador da listagem de sequência foi criado em19 de julho de 2016. Este arquivo tem 16,077 bytes (medido em MS-Windows®),é arquivado contemporaneamente por elétron (usando o sistema de depósito EFS- Web do escritório de patentes dos Estados Unidos) e é incorporado na íntegra neste documento por referência.
Campo da Invenção
[003] Em geral, a invenção diz respeito à área de proteínas inibidoras de inseto. Uma nova classe de proteínas que exibe atividade inibidora de inseto contra as pragas relevantes para agricultura de plantas e sementes de produtos agrícolas são divulgadas. Particularmente, a proteína divulgada é inseticidamente ativa contra pragas relevantes para o cultivo de plantas e sementes agrícolas, especialmente as espécies de pragas de insetos Coleoptera, Lepidoptera e Hemiptera. As plantas, as partes de plantas e sementes contendo um construto polinucleotídico recombinante que codifica uma ou mais das proteínas de toxina divulgadas são providas.
Antecedentes da Invenção
[004] Melhorar o rendimento das culturas de plantas agricultura significativas, incluindo, entre outros, milho, soja, cana-de-açúcar, arroz, trigo, vegetais e algodão, tornou-se cada vez mais importante. Além da crescente necessidade de produtos agrícolas para alimentação, vestimenta e fornecimento de energia para uma população humana em crescimento, os efeitos relacionados ao clima e a pressão advinda da população crescente para o uso do solo para outras práticas além da prática agrícola são previstos, reduzindo a quantidade de terras cultiváveis disponíveis para a agricultura. Esses fatores levam a previsões desanimadoras de segurança alimentar, particularmente por causa da falta de grandes melhorias na biotecnologia vegetal e práticas agronômicas. À luz dessas pressões, melhorias ambientalmente sustentáveis em tecnologia, técnicas agrícolas e manejo de pragas são ferramentas essenciais para expandir a produção de culturas em relação à quantidade limitada de terras aráveis disponíveis para agricultura.
[005] Insetos, em especial insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera, são considerados uma das principais causas de danos às culturas de campo, diminuindo o rendimento das culturas em áreas infestadas. As espécies de pragas de Lepidoptera que afetam negativamente a agricultura incluem, mas não estão limitadas a, Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicostae Phyllocnistis citrella. As espécies de pragas (insetos) Coleoptera incluem, mas não se limitam a, Agrotis spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculios spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolonthaspp spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabaeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp e Trogoderma spp., particularmente quando a praga é Diabrotica virgifera virgifera (WCR) Diabrotica barberi (NCR), Diabrotica virgifera zeae (MCR), Diabrotica balteata (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (SCR) e um complexo (BCR) consistindo em Diabrotica viridulum e Diabrotica speciosa. As espécies de praga Hemiptera que afetam negativamente a agricultura incluem, mas não estão limitadas a, Lygus hesperus, Lyglus lineolaris e Pseudatomoscelis seriatus.
[006] Historicamente, foi confiada à aplicação intensiva de inseticidas químicos sintéticos como agente de controle de pragas na agricultura. As preocupações com o meio ambiente e saúde humana, além de problemas de resistência emergentes, estimularam a pesquisa e o desenvolvimento de pesticidas biológicos. Este esforço de pesquisa levou à descoberta progressiva e ao uso de várias espécies microbianas entomopatogênicas, incluindo bactérias.
[007] O paradigma de controle biológico mudou quando o potencial de bactérias entomopatogênicas, especialmente bactérias pertencentes ao gênero Bacilo, foram descobertas e desenvolvidas como um agente biológico de controle de pragas. Cepas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) foram utilizadas como uma fonte de proteínas pesticidas, pois foi descoberto que as cepas Bt apresentam uma alta toxicidade contra insetos específicos. Cepas de Bt são conhecidas por produzir as deltaendotoxinas que estão localizadas dentro de corpos de inclusão cristalinos parasporais no início da esporulação e durante a fase de crescimento estacionário (por exemplo, proteínas Cry), e também são conhecidas por produzir proteína inseticida secretada. Após a ingestão por um inseto suscetível, as deltaendotoxinas, bem como as toxinas secretadas exercem seus efeitos na superfície do epitélio do intestino médio, interrompendo a membrana celular e levando à ruptura e morte celular. Os genes que codificam proteínas inseticidas também foram identificados em espécies bacterianas além de Bt, incluindo outros Bacillus e uma diversidade de outras espécies bacterianas, como Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls" anteriormente conhecidas como Bacillus sphaericus) e Paenibacillus popilliae.
[008] As toxinas inseticidas solúveis cristalinas e secretadas são altamente específicas para seus hospedeiros e ganharam aceitação mundial como alternativas aos inseticidas químicos. Por exemplo, as proteínas da toxina inseticida foram empregadas em muitas aplicações agrícolas para proteger de infestações de insetos as plantas importantes para a agricultura, diminuir a necessidade de aplicações de pesticidas químicos e aumentar os rendimentos. As proteínas da toxina inseticida são usadas para controlar as pragas relevantes para agricultura por meio de métodos mecânicos, tais como a pulverização para dispersar formulações microbianas contendo muitas cepas de bactérias sobre superfícies de plantas e uso de técnicas de transformação genética para produzir plantas transgênicas e sementes que expressem proteína de toxina inseticida.
[009] O uso de plantas transgênicas expressando as proteínas da toxina inseticida foi totalmente adaptado. Por exemplo, em 2012, 26,1 milhões de hectares foram plantados com culturas transgênicas expressando toxinas Bt (James, C., Status Global of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief n° 44). O uso global de culturas transgênicas protegidas contra insetos e o número limitado de proteínas de toxinas inseticidas utilizadas nestas culturas criaram uma pressão de seleção para os alelos de insetos existentes que conferem resistência a proteínas de inseticida atualmente utilizado.
[0010] O desenvolvimento da resistência em pragas específicas a proteínas de toxinas inseticidas cria a necessidade contínua de descoberta e desenvolvimento de novas formas de proteínas de toxina inseticidas que são úteis para administrar o aumento da resistência de insetos a culturas transgênicas expressando proteínas de toxinas inseticidas. As novas toxinas de proteínas com eficácia melhorada e que exibem controle sobre um espectro mais amplo de espécies de insetos suscetíveis reduzirão o número de insetos sobreviventes que podem desenvolver alelos de resistência. Além disso, o uso em uma planta de duas ou mais proteínas transgênicas de toxina inseticida tóxica para a mesma praga de insetos e exibir os diferentes modos de ação reduz a probabilidade de resistência em qualquer espécie de inseto específico.
[0011] Assim, os inventores deste documento divulgam uma nova família de toxinas de proteínas de Bacillus thuringiensis juntamente com proteínas de toxina semelhantes, proteínas variantes e proteínas recombinantes exemplares que exibem atividade inseticida contra espécies de pestes específicas de Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera, particularmente contra lagarta-da-raiz do milho.
Sumário da Invenção
[0012] É divulgado neste documento um novo grupo de proteínas pesticidas com atividade inibidora de insetos (proteínas de toxina), aqui referida como TIC5290, que demonstram exibir atividade inibitória contra uma ou mais pragas de plantas de cultura. A proteína TIC5290 e as proteínas na classe de toxina da proteína TIC5290 podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outras proteínas inseticidas e agentes tóxicos em formulações e in planta, proporcionando assim alternativas às proteínas inseticidas e químicas inseticidas atualmente em uso em sistemas agrícolas.
[0013] Numa modalidade, é divulgada neste pedido uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo ligado operativamente a um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma, em que: (a) a dita proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) a dita proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos para SEQ ID NO: 2; ou (c) o dito segmento polinucleotídico hibridiza com um polinucleotídeo com a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (d) o dito segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma compreende uma sequência polinucleotídica com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85%, 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou (e) a dita molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor, e o dito vetor é selecionado do grupo que consiste num plasmídeo, fagemídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossomo artificial bacteriano ou de levedura. A molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida numa planta ou é expressa em uma célula vegetal a fim de produzir uma quantidade pesticida eficaz de proteína pesticida.
[0014] Em outra modalidade deste pedido estão células hospedeiras compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante do pedido, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo constituído em uma célula bacteriana e uma célula vegetal. As células hospedeiras contempladas incluem Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea e Erwinia. Em determinadas modalidades, dita espécie Bacillus é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, dita Brevibacillus é Brevibacillus laterosperus ou dita Escherichia é Escherichia coli. As células hospedeiras vegetais contempladas incluem uma célula dicotiledônea e uma célula monocotiledônea. As células hospedeiras vegetais contempladas adicionalmente incluem uma célula vegetal de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brássicas, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão (Gossypium sp.), uma cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palma, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus Radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de- açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
[0015] Ainda noutra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra insetos Coleoptera, incluindo Lagarta-da-raiz do milho ocidental, Lagarta-da-raiz do milho meridional, Lagarta-da-raiz do milho setentrional, Lagarta-da-raiz do milho mexicana, Lagarta-da-raiz do milho brasileira ou complexo de Lagarta-da-raiz do milho brasileira consistindo em Viridula Diabrotica e Diabrotica speciosa.
[0016] Em outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra um inseto Lepidoptera, incluindo a lagarta-da-soja, broca da cana-de-açúcar, broca do colo, lagarta-da-espiga, lagarta-das-maçãs, lagarta-do-linho, Spodoptera exempta, Spodoptera eridania, lagarta-do- cartucho, Spodoptera exigua, Helicoverpa armigera, Spodoptera litura, lagarta rosada do algodão, Agrotis ipsilon, broca grande da cana-de- açúcar ou Ostrinia nubilalis.
[0017] Ainda em outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra um inseto Hemiptera, incluindo Lygus hesperus Knight, Lygus lineolaris ou Pseudatomoscelis seriatus.
[0018] Neste pedido também são contempladas plantas compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um segmento polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma, em que: (a) a dita proteína pesticida compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2; (b) a dita proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos para SEQ ID NO: 2; (c) o dito segmento de polinucleotídeo se hibridiza em condições de hibridização rigorosas ao complementar a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; ou (d) a dita planta exibe uma quantidade detectável da dita proteína pesticida. Em determinadas modalidades, a proteína pesticida compreende SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em outra modalidade, a planta é selecionada do grupo consistindo em célula de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho- poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
[0019] Em outras modalidades, são divulgadas sementes compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinantes.
[0020] Em outra modalidade é contemplada uma composição inibidora de inseto compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinantes divulgada neste pedido. A composição inibidora de insetos pode compreender adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos outro agente pesticida diferente da dita proteína pesticida. O pelo menos outro agente pesticida é selecionado do grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma proteína acessória. O pelo menos outro agente pesticida na composição inibidora dos insetos exibe atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera ou Hemiptera. O pelo menos outro agente pesticida na composição inibidora de inseto está em uma modalidade selecionada do grupo que consiste em: um Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. Variantes 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C, quimeras Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1A/F, variantes Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, e AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z e AXMI- 225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 e variantes das mesmas, IP3 e variantes da mesma, DIG-3, DIG-5, DIG- 10, DIG-657 e uma proteína DIG-11.
[0021] São contemplados produtos primários que compreendem uma quantidade detectável de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes divulgados neste pedido. Esses produtos primários incluem o milho primário ensacado por cerealista, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, farelo de milho, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereais de milho e similares, bem como produtos primários de algodão correspondentes como sementes de algodão integral ou processada, óleo de algodão, fiapos, sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimentação, fibras, papel, biomassas e produtos combustíveis, como o combustível derivado de óleo de algodão ou pellets derivados de resíduos de gim de algodão e produtos primários correspondentes de soja tais como sementes de soja integrais ou processadas, óleo de soja, proteína de soja, farelo de soja, refeição de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, alimentos para animais compreendendo soja, papel com soja, creme de soja, biomassa de soja e produtos combustíveis produzidos com plantas de soja e partes de plantas de soja, e produtos primários correspondentes de arroz, trigo, sorgo, ervilha d'angola, amendoim, frutas, melão e vegetais, incluindo, quando aplicável, sucos, concentrados, geleias, gelatinas, marmeladas e outras formas comestíveis de tais produtos primários contendo uma quantidade detectável de tais polinucleotídeos e ou polipeptídeos deste pedido.
[0022] Um método de produção de semente que compreende as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes divulgados neste pedido também é contemplado neste documento. O método compreende plantar pelo menos uma das sementes compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante divulgado neste pedido, cultivar a planta a partir da semente e colher as sementes das plantas, em que a semente colhida compreende as moléculas de ácido nucleico recombinantes neste pedido.
[0023] Em outra modalidade ilustrativa, é proporcionada uma planta resistente à infestação de insetos, em que as células da referida planta compreendem: (a) uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma quantidade inseticida eficaz de uma proteína pesticida, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou (b) uma quantidade inseticida eficaz de uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou cerca de 100% identidade da sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2.
[0024] Também divulgados neste pedido estão métodos para controlar espécies de praga Coleoptera ou Lepidoptera ou Hemiptera e controlar uma infestação de praga da espécie Coleoptera ou Lepidoptera ou Hemiptera de uma planta, particularmente uma planta de cultura. O método compreende, numa modalidade, (a) contatar a praga com uma quantidade inseticida eficaz de uma ou mais proteínas pesticidas conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2; ou (b) contatar a praga com uma quantidade inseticida eficaz de uma ou mais proteínas pesticidas compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos para SEQ ID NO: 2.
[0025] Além disso, é provido neste documento um método para detectar a presença de uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um segmento polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma, em que: (a) a dita proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou (b) a dita proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos para SEQ ID NO: 2; ou (c) o dito segmento de polinucleotídeo se hibridiza com um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. Numa modalidade da invenção, o método compreende contatar uma amostra de ácidos nucleicos com uma sonda de ácido nucleico que se hibridiza em condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de uma planta compreendendo um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma provida neste documento, e não hibridiza sob tais condições de hibridização com DNA genômico de uma planta de outra forma isogênica que não compreende o segmento, em que a sonda é homóloga ou complementar a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. O método pode ainda compreender (a) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas e, (b) detectar a hibridização da sonda com DNA da amostra.
[0026] Os métodos para detectar a presença de uma proteína pesticida ou um fragmento da mesma numa amostra compreendendo proteína também são providos, em que a dita proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou a dita proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% ou 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o método compreende: (a) contatar uma amostra com um anticorpo imunorreativo e, (b) detectar a presença da proteína. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende um ELISA ou um Western blot.
Breve Descrição dos Desenhos
[0027] A Figura 1 ilustra a atividade inibitória in planta da lagarta da raiz do milho (WCR) de proteínas TIC5290 específicas e não direcionadas de cloroplasto exemplar.
Breve Descrição das Sequências
[0028] A SEQ ID NO: 1 é um ácido nucleico que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC5290 obtida a partir da espécie EG6657 Bacillus thuringiensis.
[0029] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC5290.
[0030] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína pesticida TIC5290 usada para expressão em células vegetais.
Descrição Detalhada da Invenção
[0031] O problema na técnica de controle de pragas agrícolas pode ser caracterizado como uma necessidade de novas proteínas de toxinas que sejam eficazes contra as pragas alvo, que exibam amplo espectro de toxicidade contra espécies de praga alvo, que sejam capazes de ser expressas em plantas sem causar problemas agronômicos indesejáveis e que forneçam um modo alternativo de ação em comparação com as toxinas atuais usadas comercialmente nas plantas.
[0032] Novas proteínas inseticidas são aqui descritas, exemplificadas por TIC5290 e membros da família relacionados que provejam resistência contra Coleóptero, Lepidoptera e Hemiptera e, mais particularmente, contra espécies da lagarta da raiz do milho. Também são divulgadas sequências de codificação sintéticas concebidas para expressão numa célula vegetal que codifica TIC5290. São ainda divulgadas moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendendo um promotor em ligação operável a uma sequência de codificação que codifica uma proteína de toxina TIC5290, ou membros da família relacionados, ou fragmentos dos mesmos.
[0033] A referência neste pedido a TIC5290, "proteína TIC5290", "toxina da proteína TIC5290", "proteína da toxina TIC5290", "proteína pesticida TIC5290", "toxinas relacionadas a TIC5290" ou "proteína de toxina relacionada a TIC5290" e similares, dizem respeito a qualquer nova proteína pesticida ou proteína inibidora de insetos que compreende, que consiste em, que é substancialmente homóloga a, que é semelhante ou derivada de qualquer proteína pesticida ou sequência de proteína inibidora de insetos de TIC5290 (SEQ ID NO: 2) e seus segmentos inibitórios pesticidas ou inseticida ou suas combinações, que conferem atividade contra pragas de Coleóptero, pragas Lepidoptera e pragas Hemiptera, incluindo qualquer proteína que exiba atividade inibidora pesticida ou inseticida se o alinhamento dessa proteína com TIC5290 resultar numa identidade de sequência de aminoácidos de qualquer porcentagem de fração de cerca de 65 a cerca de 100 por cento.
[0034] O termo "segmento" ou "fragmento" é usado neste pedido para descrever sequências de aminoácidos ou sequências consecutivas de ácido nucleico mais curtas do que a sequência completa de aminoácidos ou ácido nucleico descrevendo a proteína TIC5290 ou a proteína inseticida associada à família. Um segmento ou fragmento exibindo a atividade inibidora inseticida também é divulgado neste pedido se o alinhamento desse segmento ou fragmento, com a seção correspondente da proteína TIC5290 estabelecida na SEQ ID NO: 2 resultar em identidade de sequência de aminoácidos de qualquer porcentagem de fração de cerca de 65 a cerca de 100 por cento entre o segmento ou fragmento e a seção correspondente da proteína TIC5290.
[0035] A referência neste pedido aos termos "ativo" ou "atividade", "atividade pesticida", ou "pesticida", ou "atividade inseticida", "inibidor de insetos" ou "inseticida" se referem à eficácia de um agente tóxico, tal como uma toxina proteica, na inibição (inibição de crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), supressão (supressão do crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), controle (controle da infestação de pragas, controle das atividades de alimentação de pragas numa dada cultura contendo uma quantidade eficaz de uma proteína TIC5290) ou morte (morbidade, mortalidade ou fecundidade reduzida) de uma praga. Estes termos se destinam a incluir o resultado do provimento de uma quantidade pesticida eficaz de uma proteína tóxica para uma praga em que a exposição da praga à proteína tóxica resulta em morbidade, mortalidade, fecundidade reduzida ou nanismo. Estes termos também incluem repulsão da praga da planta, de um tecido da planta, de uma parte da planta, da semente, das células de plantas, ou da localização geográfica específica onde a planta esteja crescendo, como resultado do provimento de uma quantidade pesticida eficaz da proteína tóxica dentro ou sobre a planta. De um modo geral, uma atividade pesticida se refere à capacidade de uma proteína tóxica para ser eficaz na inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade, comportamento alimentar, comportamento de acasalamento, fecundidade, ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por uma alimentação de insetos desta proteína, fragmento de proteína, segmento proteína ou polinucleotídeo de uma determinada praga-alvo, incluindo, mas não se limitando aos insetos da ordem Coleóptera e Hemiptera. A proteína tóxica pode ser produzida pela planta ou pode ser aplicada à planta ou para o ambiente dentro do local onde a planta estiver localizada. O termo "bioatividade", "eficiente", "eficaz" ou variações dos mesmos também são termos utilizados intercambiavelmente neste pedido, a fim de descrever os efeitos das proteínas da presente invenção em pragas de insetos-alvo.
[0036] Uma quantidade pesticida eficaz de um agente tóxico, quando provido a uma praga-alvo, exibe atividade pesticida quando o agente tóxico contata a praga. O agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na técnica. Os agentes químicos pesticidas ou inseticidas e os agentes de proteínas pesticidas ou inseticidas podem ser usados sozinhos ou em combinações entre si. Os agentes químicos incluem, mas não estão limitados a, moléculas de dsRNA direcionando genes específicos para a supressão em uma praga-alvo, organoclorados, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides e ranoides. Os agentes de proteínas pesticidas ou inseticidas incluem as toxinas de proteínas estabelecidas neste pedido, bem como outros agentes tóxicos proteináceos, incluindo aqueles que visam espécies de pragas de Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera, bem como toxinas de proteínas usadas para controlar outras pragas de plantas, como proteínas Cry disponíveis na técnica para uso no controle de espécies Homoptera.
[0037] A referência a uma praga, particularmente uma praga de uma planta de cultivo, destina-se a significar as pragas de insetos de plantas de cultivo, particularmente aquelas controladas pela proteína TIC5290. No entanto, a referência a uma praga também pode incluir pragas de insetos Homópteros de plantas, bem como nemátodos e fungos, quando os agentes tóxicos que visam essas pragas são colocalizados ou presentes em conjunto com a proteína TIC5290 ou uma proteína que é cerca de 65 a cerca de 100 por cento idêntica ao TIC5290.
[0038] As proteínas inseticidas da classe de toxina da proteína TIC5290 estão relacionadas por função comum e exibem atividade inseticida em relação a pragas de insetos das espécies de insetos Coleoptera e Lepidoptera, incluindo adultos, pupas, larvas e neonatos, bem como espécies de insetos Hemiptera, incluindo adultos e ninfas.
[0039] Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não estão limitados a, gueixas, minhocas, loopers e heliothinae na Família Noctuidae, por exemplo, lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda), (Spodoptera exigua), (Mamestra configurata), lagarta das folhas (Spodoptera eridania), lagarta rosca (Agrotis ipsilon), lagarta plusia (Trichoplusia ni), lagarta falsa-medideira (Pseudoplusia includens), lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis), (Hypena scabra), lagarta da maçã (Heliothis virescens), lagarta rosca (Agrotis subterranea), gueixa (Pseudaletia unipuncta), (Agrotis orthogonia); brocas, traça-das- paredes, webworms, coneworms, vermes do repolho e esqueletonizers da família Pyralidae, por exemplo, (Ostrinia nubilalis), (Amyelois transitella), (Crambus caliginosellus), (Herpetogramma licarsisalis), (Homoeosoma electral), broca do colo (Elasmopalpus lignosellus); lagarta enroladeira, lagarta da maçã, lagarta da semente e lagarta das frutas na família Tortricidae, por exemplo, mariposas das maçãs (Cydia pomonella), (Endopiza viteana), mariposa oriental (Grapholita molesta), (Suleima helianthana); e muitos outros Lepidoptera economicamente importantes, por exemplo, traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), lagarta rosada do algodão (Pectinophora gossypiella) e mariposa- cigana (Lymantria dispar). Outras pragas de insetos da ordem Lepidoptera incluem, por exemplo, Alabama argillacea, Archips argyrospila, Archips rosana e outras espécies Archips, Chilo suppressalis, Cnaphalocrocis medinalis, Crambus caliginosellus, Crambus teterrellus, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Earias insulana, Earias vittella, Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Herpetogramma licarsisalis, Lobesia botrana, Phyllocnistis citrella, Pieris brassicae, Pieris rapae, Plutella xylostella, Spodoptera exigua, Spodoptera litura e Tuta absoluta.
[0040] Os insetos da ordem Coleoptera incluem, mas não estão limitados a, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp, particularmente quando a praga for Diabrotica virgifera (WCR), Diabrotica barberi (NCR), Diabrotica virgifera zeae (MCR), Diabrotica balteata (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (SCR) e um complexo BCR, consistindo em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa.
[0041] Os Insetos De Hemiptera Incluem, Mas Não Estão Limitados A: Lygus Hesperus, Lygus Lineolaris E Pseudatomoscelis Seriatus.
[0042] A referência neste pedido a uma "molécula de DNA isolada" ou um termo ou frase equivalente, destina-se a significar que a molécula de DNA é a que esteja presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácidos nucleicos, tais como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência principal não traduzida, sequência do promotor, sequência de terminação da transcrição e semelhantes que são encontradas naturalmente no DNA do genoma de um organismo não são considerados como "isolado" desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. No entanto, cada um destes elementos e suas subpartes seriam "isolados" no escopo da presente divulgação, desde que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. Da mesma forma, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida ou qualquer variante inseticida ocorrendo naturalmente dessa proteína seria uma sequência de nucleotídeos isolada, desde que a sequência de nucleotídeos não estivesse dentro do DNA da bactéria a partir da qual a sequência que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Uma sequência de nucleotídeo sintético que codifica a sequência de aminoácidos da proteína inseticida que ocorre naturalmente seria considerada isolada para os fins da presente divulgação. Para a finalidade da presente divulgação, qualquer sequência de nucleotídeos transgênicos, por exemplo, a sequência de nucleotídeos do DNA inserida no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente num vetor extracromossômico, seria considerada uma sequência de nucleotídeos isolada se estiver presente no plasmídeo ou na estrutura semelhante utilizada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis nos tecidos, na descendência, nas amostras biológicas ou produtos primários derivados da planta ou bactéria.
[0043] Conforme descrito adiante neste documento, um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica TIC5290 (SEQ ID NO: 1), foi descoberto no DNA obtido da estirpe EG6657 de Bacillus thuringiensis. A sequência de codificação foi clonada e expressa em células hospedeiras microbianas, a fim de produzir proteína (SEQ ID NO: 2) utilizada em bioensaios. O homólogo de toxina mais próximo do TIC5290 é a proteína Vip4Aa com uma identidade de sequência de 56,9%, indicando que o TIC5290 representa uma nova subfamília Vip4. O bioensaio utilizando proteínas derivadas de células hospedeiras microbianas de TIC5290 demonstrou atividade contra a praga Coleoptera: (Diabrotica virgifera virgifera, lagarta-da-raiz do milho); as espécies lepidoptera: lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda, FAW), lagarta da espiga (Helicoverpa zea, CEW), lagarta-europeia-do- milho (Ostrinia nubilalis) e traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), bem como o percevejo do algodoeiro (Lygus hesperus).
[0044] É contemplado que as sequências adicionais de proteína de toxina relacionadas ao TIC5290 podem ser criadas usando a sequência de aminoácidos de ocorrência natural de TIC5290 para criar novas proteínas e com novas propriedades. A proteína de toxina TIC5290 pode ser alinhada com outras proteínas semelhantes ao TIC5290, a fim de combinar as diferenças no nível da sequência de aminoácidos em novas variantes de sequências de aminoácidos e fazer modificações apropriadas na sequência de ácido nucleico recombinante que codifica as variantes.
[0045] É ainda contemplado que as variantes melhoradas de TIC5290 possam ser projetadas in planta usando vários métodos de edição de genes conhecidos na técnica. As tecnologias utilizadas para a edição do genoma incluem, mas não estão limitadas a, ZFN (nuclease de dedo de zinco), meganucleases, TALEN (nucleases com efetores do tipo ativador transcricional) e sistemas CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas)/Cas (associado a CRISPR). Estes métodos de edição de genoma podem ser utilizados para alterar a sequência de codificação de proteína de toxina transformada dentro de uma célula de planta para uma sequência de codificação de toxina diferente. Especificamente, através destes métodos, um ou mais códons dentro da sequência de codificação da toxina são alterados para projetar de uma nova sequência de aminoácidos de proteína. Alternativamente, um fragmento dentro da sequência de codificação é substituído ou eliminado, ou outros fragmentos de DNA são inseridos na sequência de codificação, a fim de projetar uma nova sequência de codificação de toxina. A nova sequência de codificação pode codificar uma proteína de toxina com novas propriedades, tais como atividade ou espectro aumentado contra pragas de insetos, bem como prover atividade contra uma espécie de praga de inseto que desenvolveu resistência contra a proteína de toxina de inseto original. A célula vegetal compreende a sequência de codificação de toxina editada por genes pode ser utilizada por métodos conhecidos na técnica para gerar plantas inteiras que expressem a nova proteína de toxina.
[0046] Também é contemplado fragmentos da proteína TIC5290 ou suas variantes de proteínas que podem ser formas truncadas em que um ou mais aminoácidos são excluídos da extremidade N-terminal, extremidade C-terminal, meio da proteína ou suas combinações com atividade inibidora de insetos. Esses fragmentos podem ser variantes naturais ou sintéticas de TIC5290 ou variantes de proteínas derivadas, porém devem reter a atividade inibitória dos insetos de TIC5290.
[0047] As proteínas que se assemelham à proteína TIC5290 podem ser identificadas por comparação entre si usando vários algoritmos baseados em computador conhecidos na técnica. Por exemplo, as identidades da sequência de aminoácidos das proteínas relacionadas ao TIC5290 podem ser analisadas utilizando um alinhamento Clustal W com esses parâmetros padrão: Matriz de peso: blosum, penalidade de abertura de intervalo: 10,0. Penalidade de extensão de intervalo: 0,05, vazamentos hidrofílicos: On, resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, penalidades de vazamento específico de resíduos: On (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680). A percentagem de identidade de aminoácidos é ainda calculada pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de aminoácidos/comprimento da proteína em questão). Outros algoritmos de alinhamento também estão disponíveis na técnica e proveem resultados semelhantes aos obtidos usando um alinhamento Clustal W.
[0048] Pretende-se que uma proteína que exiba atividade inibidora de insetos contra espécies de insetos Lepidoptera, Coleoptera ou hemiptera esteja relacionada ao TIC5290 se o alinhamento dessa proteína de consulta com TIC5290 exibir pelo menos 65% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína de consulta isso é de cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%. 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de porcentagem desse intervalo) entre a consulta e a proteína em questão.
[0049] A proteína TIC5290 também pode ser relacionada por estrutura primária (motivos de aminoácidos conservados), por comprimento (cerca de 937 aminoácidos) e por outras características. A análise bioinformática sugere que o TIC5290 é uma proteína formadora de poros, tem um domínio PA14 Pfam (PF07691) que provavelmente está envolvido com funções de ligação ao(s) receptor(es) celular(es) no intestino médio do inseto-alvo, é detectado nos aminoácidos 16-140, seguido por um domínio Pfam Binary_toxB (PF03495) nos aminoácidos 186-593 que podem contribuir para a formação de um poro transmembranar do barril beta. Ambos estes Pfams provavelmente contribuem para a atividade inseticida da proteína. As características da toxina da proteína TIC5290 são relatadas na Tabela 1. Tabela 1. Características selecionadas da proteína TIC5290.
[0050] Conforme também descrito nos exemplos deste pedido, as sequências de moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam TIC5290 foram concebidas para utilização em plantas. Uma sequência molecular de ácido nucleico recombinante otimizado em planta exemplar foi concebida para utilização em plantas que codificam a proteína TIC5290 é estabelecida na SEQ ID NO: 3.
[0051] Os cassetes e vetores de expressão contendo estas sequências moleculares de ácido nucleico sintético podem ser construídos e introduzidos em milho, soja, algodão ou outras células de plantas, de acordo com os métodos e técnicas de transformação conhecidos na técnica. Por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium é descrita nas publicações de pedidos de patente norte- americano US 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (milho), 2008/0282432 (algodão), 2008/0256667 (algodão), 2003/0110531 (trigo), 2001/0042257 A1 (beterraba), nas patentes norte-americanas US N° 5.750.871 (canola), 7.026.528 (trigo) e 6.365.807 (arroz) e em Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7: 213222 (cana-de-açúcar), todos incorporados na íntegra neste documento por referência. As células transformadas podem ser regeneradas em plantas transformadas que expressam TIC5290 e demonstram atividade pesticida através de bioensaios realizados na presença de larvas de pragas Lepidoptera ou Hemiptera utilizando discos de folhas de plantas obtidos a partir de plantas transformadas. Para testar a atividade pesticida contra pragas Coleoptera, as plantas transformadas da geração Ro e F1 são usadas no teste de lagartas de raiz, conforme descrito no exemplo abaixo.
[0052] Como alternativa aos métodos de transformação tradicionais, uma sequência de DNA, como um transgene, um cassete de expressão, etc., pode ser inserida ou integrada em um local ou locus específico dentro do genoma de uma planta ou célula vegetal por meio da integração direcionada ao local. O(s) construto(s) e a(s) molécula(s) de DNA recombinante(s) desta divulgação pode(m), assim, incluir uma sequência de molde de doador compreendendo pelo menos um transgene, um cassete de expressão ou outra sequência de DNA para a inserção no genoma da planta ou célula vegetal. Esse modelo de doador para integração direcionada ao local pode ainda incluir um ou dois braços de homologia flanqueando uma sequência de inserção (por exemplo, a sequência, o transgene, o cassete, etc., a serem inseridos no genoma da planta). O(s) construto(s) de DNA recombinante(s) desta divulgação pode(m) compreender ainda um(ns) cassete(s) de expressão que codifica(m) uma nuclease específica do local e/ou qualquer(quaisquer) proteína(s) associada(s) para realizar a integração direcionada ao local. Esse(s) cassete(s) expressando nuclease podem estar presentes na mesma molécula ou vetor que o modelo doador (em cis) ou numa molécula ou vetor separado (em trans). Vários métodos para a integração direcionada ao site são conhecidos na técnica envolvendo diferentes proteínas (ou complexos de proteínas e/ou RNA guia) que cortam o DNA genômico para produzir uma ruptura de cadeia dupla (DSB) ou corte em um local ou locus genômico desejado. Conforme entendido na técnica, durante o processo de reparação do DSB ou corte introduzido pela enzima nuclease, o DNA do molde do doador pode se tornar integrado ao genoma no local do DSB ou corte. A presença do(s) braço(s) de homologia no modelo do doador pode promover a adoção e direcionamento da sequência de inserção no genoma vegetal durante o processo de reparo através de recombinação homóloga, embora um evento de inserção possa ocorrer através de união de extremidade não homóloga (NHEJ). Exemplos de nucleases específicas do local que podem ser utilizadas incluem nucleases de dedo de zinco, meganucleases artificiais ou nativas, endonucleases TALE e endonucleases guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Para métodos que utilizam nucleases específicas do local guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1), a (s) construção (s) de DNA recombinante também compreenderá uma sequência que codifica um ou mais RNAs guia para direcionar a nuclease para o local desejado dentro do genoma da planta.
[0053] As composições de moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam TIC5290 são contempladas. Por exemplo, a proteína TIC5290 pode ser expressa com construtos de DNA recombinante nas quais uma molécula polinucleotídica com uma ORF que codifica a proteína está operacionalmente ligada a elementos de expressão genética tais como um promotor e qualquer outro elemento regulador necessário para expressão no sistema para o qual o construtor é feito. Exemplos não limitativos incluem um promotor funcional da planta ligado operacionalmente às sequências codificadoras da proteína TIC5290 para expressão da proteína nas plantas ou um promotor funcional Bt ligado operacionalmente a uma sequência de codificação de proteína TIC5290 para expressão da proteína em uma bactéria Bt ou outra espécie de Bacilo. Outros elementos podem ser operativamente ligados às sequências de codificação da proteína TIC5290 incluindo, mas não limitado a, intensificadores, íntrons, líderes não traduzidos, etiquetas de imobilização de proteínas codificadas (marca HIS), peptídeos de translocação (por exemplo, peptídeos de trânsito de plastídio, peptídeos de sinal), sequências polipeptídicas para enzimas modificadoras pós- tradução, locais de ligação ribossômica e locais alvo de RNAi. As moléculas de polinucleotídeos recombinantes exemplares providas neste documento incluem, mas não estão limitadas a, um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um polinucleotídeo tal como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 que codifica o polipeptídeo ou proteína com a sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em SEQ ID NO: 2. Um promotor heterólogo também pode estar operacionalmente ligado às sequências de codificação de DNA sintético que codificam um plastídeo direcionado TIC5290 e TIC5290 não direcionado. Os códons de uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica a proteína aqui divulgada podem ser substituídos por códons sinônimos (conhecidos na técnica como uma substituição silenciosa).
[0054] Um construto de DNA recombinante compreendendo uma sequência de codificação de proteína relacionada com TIC5290 pode ainda compreender uma região de DNA que codifica para um ou mais agentes inibidores de insetos que podem ser configurados para expressar ou coexpressar concomitantemente com uma sequência de DNA que codifica uma proteína TIC5290, uma proteína diferente de TIC5290, uma molécula dsRNA inibidora de insetos ou uma proteína acessória. As proteínas acessórias incluem, mas não estão limitadas a, cofatores, enzimas, parceiros de ligação ou outros agentes que funcionam para auxiliar na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, ao contribuir para a sua expressão, influenciando a sua estabilidade em plantas, ao otimizar e energia livre para oligomerização, ao aumentar a sua toxicidade e aumentar o seu espectro de atividade. Uma proteína acessória pode facilitar a absorção de um ou mais agentes inibidores de insetos, por exemplo, ou tornar possível os efeitos tóxicos do agente tóxico.
[0055] Um construto de DNA recombinante pode ser montado de modo que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA sejam expressas a partir de um promotor ou cada proteína ou molécula de dsRNA estejam sob controle de promotor separado ou alguma combinação destes. As proteínas desta invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão multigenético em que TIC5290 é expressa de um segmento de nucleotídeos comum que também contém outras fases e promotores de leitura aberta, dependendo do tipo de sistema de expressão escolhido. Por exemplo, um sistema de expressão multigenético vegetal pode utilizar um único promotor para conduzir a expressão de ORFs multiplamente ligados/tandem a partir de dentro de um óperon único. Em outro exemplo, um sistema de expressão multigenético vegetal pode utilizar cassetes de expressão multiplamente ligados, cada um expressando uma proteína diferente ou outro agente, tal como uma ou mais moléculas de dsRNA.
[0056] As moléculas de ácido nucleico recombinantes ou os construtos de DNA recombinante compreendendo uma sequência codificadora de proteína TIC5290 podem ser entregues às células hospedeiras por vetores, por exemplo, um plasmídeo, baculovírus, cromossomo sintético, virion, cosmídeo, fagoide, fago ou vetor viral. Tais vetores podem ser utilizados para obter uma expressão estável ou transitória de uma sequência codificadora de proteína TIC5290 numa célula hospedeira ou subsequente expressão do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende uma sequência codificadora de TIC5290 e que é introduzida em uma célula hospedeira também é referido, neste documento, como um "transgene".
[0057] As bactérias transgênicas, células vegetais transgênicas, plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas que contêm um polinucleotídeo recombinante que expressa uma ou mais das sequências codificadoras da proteína TIC5290 são providas neste documento. O termo "célula bacteriana" ou "bactéria" pode incluir, mas não está limitado a, uma Agrobacterium, um Bacilo, uma Escherichia, uma Salmonella, uma Pseudomonas ou uma célula Rhizobium. O termo "célula vegetal" ou "planta" pode incluir, mas não está limitado a uma célula dicotiledônea ou a uma célula monocotiledônea. As plantas contempladas e células vegetais incluem, mas não estão limitadas a alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, portaenxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo. Em determinadas modalidades, são providas plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula vegetal transgênica. Em determinadas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica pelo corte, estalo, trituração ou desassociação de parte da planta. Em determinadas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz ou qualquer porção dela ou uma porção não regenerável de uma parte da planta transgênica. Conforme usado neste contexto, uma porção "não regenerável" de uma parte de planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira capaz de reprodução sexual ou assexual. Em certas modalidades, uma porção não regenerável de uma parte de planta é uma porção de uma semente, cápsula, folha, flor, caule ou de uma raiz transgênica.
[0058] São providos métodos de fabricação de plantas transgênicas que compreendem insetos, Coleoptera ou Lepidoptera ou quantidades inibidoras de Hemiptera de uma proteína TIC5290. Tais plantas podem ser feitas por meio da introdução de um polinucleotídeo recombinante que codifica a proteína TIC5290 provida neste pedido numa célula vegetal e seleção de uma planta derivada da dita célula vegetal que expressa uma quantidade inibidora de inseto, Coleoptera-, ou Lepidoptera- ou Hemiptera da proteína TIC5290. As plantas podem ser derivadas a partir de células vegetais por regeneração, sementes, pólen ou técnicas de transformação de meristema. Os métodos para transformação vegetal são conhecidos na técnica.
[0059] Produtos vegetais processados, em que o produto processado compreende uma quantidade detectável de uma proteína TIC5290, um segmento inibidor de inseto ou um fragmento do mesmo ou qualquer porção distintiva, também são divulgadas neste documento. Em certas modalidades, o produto processado é escolhido do grupo que consiste em partes de planta, biomassa de planta, óleo, refeição, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelos, fibras, cascas, sementes processadas e sementes. Em determinadas modalidades, o produto processado é não regenerável. O produto vegetal pode compreender produtos primários ou outros produtos primários derivados de uma planta transgênica ou de parte da planta transgênica, em que a mercadoria ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio por meio da detecção de segmentos de nucleotídeos ou RNA expresso ou proteínas que codificam ou compreendem porções distintivas de uma proteína TIC5290.
[0060] As plantas que expressam a proteína TIC5290 podem ser cruzadas por reprodução com eventos transgênicos que expressam outras proteínas de toxina e/ou que expressam outros traços transgênicos, como genes de tolerância a herbicidas, genes que conferem rendimento ou traços de tolerância ao estresse e similares, ou tais características podem ser combinadas em um vetor único para que os traços sejam todos ligados.
[0061] Conforme ainda descrito nos exemplos, as sequências sintéticas ou artificiais que codificam TIC5290 projetadas para uso em plantas são estabelecidas na SEQ ID NO: 3.
[0062] Para expressão em células vegetais, a proteína TIC5290 pode ser expressa para residir no citossol ou direcionada a várias organelas da célula vegetal. Por exemplo, direcionar uma proteína para o cloroplasto pode resultar em níveis aumentados de proteína expressada em uma planta transgênica enquanto evita a ocorrência de fenótipos inativos. O direcionamento também pode resultar em um aumento na eficácia da resistência de pragas no evento transgênico. Um peptídeo alvo ou peptídeo de trânsito é uma cadeia peptídica curta (3-70 aminoácidos) que direciona o transporte de uma proteína para uma região específica na célula, incluindo o núcleo, mitocôndria, retículo endoplasmático (ER), cloroplasto, apoplast, peroxissoma e membrana plasmática. Alguns peptídeos sinal são clivados da proteína por peptidases de sinal após as proteínas serem transportadas. Para direcionar o cloroplasto, as proteínas contêm peptídeos sinal que ficam em torno de 40-50 aminoácidos. Para descrições do uso de peptídeos sinal de cloroplasto, ver as patentes norte-americanas US N°s 5.188.642 e 5.728.925. Muitas proteínas localizadas em cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de sinal do cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplastos isoladas incluem, mas não estão limitados a, aquelas associadas à subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5, carboxilase-bisfosfato, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, a proteína I e II do complexo de colheita de luz, tioredoxina F, e enolpiruvil chiquimato fosfato sintase (EPSPS) e peptídeos de sinal descritos na patente norte-americana N° 7.193.133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que as proteínas não cloroplásticas podem ser direcionadas ao cloroplasto por meio do uso de fusões proteicas com uma CTP heteróloga e que a CTP é suficiente para direcionar uma proteína ao cloroplasto. A incorporação de um peptídeo de sinal de cloroplasto adequado, como o Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (ver, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210: 437-442, 1987) ou o Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (ver, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83: 6873-6877, 1986) direciona sequências de proteínas EPSPS heterólogas para cloroplastos em plantas transgênicas (ver, as patentes norte-americanas US N°s 5.627.061; 5.633.435; e 5.312.910; e EP 0 218 571; EP 189707; EP 508909 e EP 924299). Para direcionar a proteína TIC5290 para o cloroplasto, uma sequência que codifica um peptídeo de sinal de cloroplasto é colocada em ligação operável 5' e em quadro para uma sequência de codificação sintética que codifica a proteína de toxina TIC5290 que foi projetada para uma expressão ótima em células vegetais.
[0063] Os cassetes de expressão e os vetores que contêm estas sequências de nucleotídeos sintéticas ou artificiais podem ser construídos e introduzidos em células vegetais de milho, algodão e soja, de acordo com métodos e técnicas de transformação conhecidos na técnica. As células transformadas são regeneradas em plantas transformadas que são observadas como expressando TIC5290. A fim de testar a atividade pesticida, os bioensaios são realizados na presença de pragas Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera.
[0064] As sequências que codificam a proteína TIC5290 e as sequências com uma percentagem substancial de identidade com TIC5290 podem ser identificadas utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação térmica e hibridização. Por exemplo, a proteína TIC5290 pode ser usada para produzir anticorpos que se ligam especificamente a proteínas relacionadas e podem ser usadas para rastreio e encontrar outros membros da proteína que estão intimamente relacionados.
[0065] Além disso, as sequências de nucleotídeos que codificam a proteína da toxina TIC5290 podem ser utilizadas como sondas e primers para rastreio na identificação de outros membros da classe usando métodos de hibridização e amplificação isotérmica ou ciclo térmico. Por exemplo, os oligonucleotídeos derivados da sequência, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, podem ser utilizados para determinar a presença ou a ausência de um transgene TIC5290 numa amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um produto primário. Dada a sensibilidade de determinados métodos de detecção de ácido nucleico que empregam oligonucleotídeos, prevê-se que os oligonucleotídeos derivados da sequência, conforme estabelecido como SEQ ID NO: 3, podem ser utilizados para detectar um transgene TIC5290 em produtos primários derivados de fontes agrupadas em que apenas uma fração do produto primário é derivado de uma planta transgênica contendo SEQ ID NO: 3. É ainda reconhecido que tais oligonucleotídeos podem ser utilizados para introduzir a variação da sequência de nucleotídeos na SEQ ID NO: 3. Tais oligonucleotídeos de "mutagênese" são úteis para a identificação de variantes de sequências de aminoácidos TIC5290 que exibem uma gama de atividade inibidora de insetos ou expressão variada em células hospedeiras de plantas transgênicas.
[0066] Os homologadores de sequência de nucleotídeos, por exemplo, as proteínas inseticidas codificadas por sequências de nucleotídeos que se hibridizam com cada uma ou qualquer uma das sequências divulgadas neste pedido em condições de hibridização são também uma modalidade da presente invenção. A invenção também prove um método para detectar uma primeira sequência de nucleotídeos que se hibridiza a uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos (ou sua sequência de complemento reverso) codifica uma proteína pesticida ou um seu fragmento pesticida e hibridiza em condições de hibridização rigorosas para a segunda sequência de nucleotídeos. Nesse caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser a sequência de nucleotídeos apresentada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 em condições de hibridização rigorosas. As sequências de codificação de nucleotídeos se hibridizam entre si em condições de hibridização apropriadas e as proteínas codificadas por essas sequências de nucleotídeos reagem de forma cruzada com o antissoro levantado contra qualquer uma das outras proteínas. As condições de hibridização rigorosas, conforme definidas neste documento, compreendem pelo menos hibridização a 42°C seguida de duas lavagens durante cinco minutos cada uma à temperatura ambiente com SSC 2X, SDS a 0,1%, seguido por duas lavagens durante trinta minutos cada a 65°C em 0,5X SSC, SDS a 0,1%. As lavagens a temperaturas ainda maiores constituem condições ainda mais rigorosas, por exemplo, condições de hibridização de 68oC, seguida de lavagem a 68oC, em 2xSSC, contendo 0,1% de SDS.
[0067] Um versado na técnica reconhecerá que, devido à redundância do código genético, muitas outras sequências são capazes de codificar as proteínas relacionadas a TIC5290, e essas sequências, na medida em que funcionam para expressar proteínas pesticidas tanto em cepas de Bacilo ou em células vegetais, são modalidades da presente invenção, reconhecendo, evidentemente, que muitas dessas sequências de codificação redundantes não se hibridizarão nestas condições com as sequências nativas de Bacilo que codificam TIC5290. Este pedido contempla a utilização destes e outros métodos de identificação conhecidos pelos versados na matéria, a fim de identificar as sequências codificadoras de proteínas TIC5290 e as sequências com uma percentagem substancial de identidade com as sequências codificadoras da proteína TIC5290.
[0068] Os métodos de controle de insetos, particularmente de infestações Lepidoptera ou Coleoptera ou de Hemiptera de plantas de cultivo com a proteína TIC5290, também são divulgados neste pedido. Tais métodos podem compreender o crescimento de uma planta compreendendo uma quantidade inibidora de insetos, Coleoptera ou Lepidoptera ou Hemiptera de uma proteína da proteína da toxina TIC5290. Em determinadas modalidades, esses métodos podem ainda compreender qualquer um ou mais de: (i) aplicar qualquer composição compreendendo ou codificando uma proteína de toxina TIC5290 para uma planta ou uma semente que dê origem a uma planta e, (ii) transformar uma planta ou uma célula vegetal que dá origem a uma planta com um polinucleotídeo que codifica uma proteína de toxina TIC5290. Em geral é contemplado que a proteína de toxina TIC5290 pode ser provida numa composição, em um micro-organismo ou em uma planta transgênica para conferir atividade inibidora de insetos contra insetos Lepidoptera, Coleoptera ou Hemiptera.
[0069] Em determinadas modalidades, uma molécula de ácido nucleico recombinante de proteína de toxina TIC5290 é o ingrediente inseticidamente ativo de uma composição inibidora de insetos preparada pelo cultivo de Bacillus recombinante ou qualquer outra célula bacteriana recombinante transformada para expressar uma proteína de toxina TIC5290 em condições adequadas para expressar a proteína da toxina TIC5290. Tal composição pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de tais células recombinantes que expressam/produzem o dito polipeptídeo recombinante. Esse processo pode resultar em um extrato de células bacterianas entomopatogênicas de Bacillus ou outros, de suspensão celular, de homogeneizado celular, de lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular ou pellet celular. Ao obter os polipeptídeos recombinantes assim produzidos, uma composição que inclui os polipeptídeos recombinantes podem incluir células bacterianas, esporos bacterianos e os corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para várias utilizações, incluindo produtos de pulverização inibidores de insetos agrícolas ou formulações inibidoras de insetos em bioensaios de dieta.
[0070] Numa modalidade, a fim de reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência, uma composição inibidora de inseto compreendendo TIC5290 pode ainda compreender pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de inseto contra as mesmas espécies de insetos Lepidoptera, Coleoptera ou hemípteros, mas que é diferente da proteína da toxina TIC5290. Polipeptídeos adicionais possíveis para tal composição incluem uma proteína inibidora de insetos e uma molécula de dsRNA inibidora de insetos. Um exemplo para a utilização de tais sequências de ribonucleotídeos para controlar pragas de insetos é descrito em Baum, et al. (publicação de patente norte-americana 2006/0021087 A1). Esse polipeptídeo adicional para o controlo de pragas de Lepidoptera pode ser selecionado do grupo que consiste em uma proteína inibidora de insetos, tal como, mas não limitado a, Cry1A (patente norte-americana US N°. 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (publicação da patente norte- americana US N°. 10/525.318), CrylC (patente norte-americana US N°. 6.033.874), Cry1D, Cry1Da e suas variantes, quimeras Cry1E, Cry1F e Cry1A/F (patentes norte-americana US N°. 7.070.982; 6.962.705; e 6.713.063), quimeras do tipo Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1 tais como, mas não limitadas a, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 e TIC1100 (publicação de pedido internacional WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (publicação de pedido internacional WO2016/061392 (A2)), Cry2A, Cry2Ab (patente norte-americana US N°. 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 (publicação de patente norte-americana US 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (publicação de patente norte-americana US 2013-0310543 A1), AXMI- 115, AXMI-113, AXMI-005 (publicação da patente norte-americana US 2013-0104259 A1), AXMI-134 (publicação de patente norte-americana US 2013-0167264 A1), AXMI-150 (publicação de patente norte- americana US 2010-0160231 A1), AXMI-184 (publicação de patente norte-americana US 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI- 207, axmi209 (publicação de patente norte-americana US 20110030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicação de patente norte- americana US 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (publicação de patente norte-americana US 2014-0196175 A1), AXMI-238 (publicação de patente norte-americana US 2014-0033363 A1), AXMI-270 (publicação de patente norte- americana US 2014-0223598 A1), AXMI-345 (publicação de patente norte-americana US 2014-0373195 A1), AXMI-335 (publicação do pedido internacional WO2013/134523(A2)), DIG-3 (publicação de patente norte-americana US 2013-0219570 A1), DIG-5 (publicação de patente norte-americana US 2010-0317569 A1), DIG-11 (publicação de patente norte-americana US 2010-0319093 A1), AfIP-1A e seus derivados (publicação de patente norte-americana US 2014-0033361 A1), AfIP-1B e seus derivados (publicação de patente norte-americana US 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (publicação de patente norte- americana US 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (publicação de patente norte-americana US 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (publicação de patente norte-americana US 2014-0007292 A1), Pput_1063 (publicação de patente norte-americana US 2014-0007292 A1), DIG-657 (publicação de pedido internacional WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (publicação de patente norte-americana US 2014-0007292 A1), GS-135 e seus derivados (publicação de patente norte-americana US 20120233726 A1), GS153 e seus derivados (publicação de patente norte- americana US 2012-0192310 A1), GS154 e seus derivados (publicação de patente norte-americana 2012-0192310 A1), GS155 e seus derivados (publicação de patente norte-americana 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 e suas derivadas, conforme descrito na publicação de patente norte-americana 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas, conforme descrita na publicação de patente norte-americana 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte-americana 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte- americana 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 e 4 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte-americana 20100192256 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte-americana 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte- americana 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na publicação de patente norte-americana 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 ou 4 e suas derivadas, conforme descrita na publicação de patente norte-americana 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrita na patente norte-americana US N°. 7.772.465 (B2), CF161_0085 e suas derivadas conforme descrita em WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de lepidópteras e suas derivadas conforme descrito na publicação de patente US 2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 e US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 e suas derivadas conforme descrito em US 7510878(B2), SEQ ID NO:2 e seus derivados conforme descrito na patente norte-americana US 7812129(B1) e similares.
[0071] Esse polipeptídeo adicional para o controle de pragas de Coleoptera pode ser selecionado do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, tal como, mas não limitado a, Cry3Bb (patente norte- americana US N° 6.501.009), variantes Cry1C, variantes Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (publicação de patente norte- americana US 2013-0167264 A1) AXMI-184 (publicação de patente norte-americana US 2010-0004176 A1), AXMI-205 (publicação de patente norte-americana US 2014-0298538 A1), axmi207 (publicação de patente norte-americana US 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI- 220 (publicação de patente norte-americana US 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (publicação de patente norte-americana US 2014-0196175 A1), AXMI-279 (publicação de patente norte-americana US 2014-0223599 A1), AXMI-R1 e suas variantes (publicação de patente norte-americana US 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (publicação de patente norte-americana US 2010-0319092 A1), eHIPs (publicação de pedido de patente norte-americano US N°. 2010/0017914), IP3 e suas variantes (publicação de patente norte- americana US 2012-0210462 A1) e -Hexatoxina-Hv1a (publicação de patente norte-americana US US2014-0366227 A1).
[0072] Tais polipeptídeos adicionais para o controle de pragas Hemiptera podem ser selecionados a partir do grupo constituído por proteínas ativas de Hemiptera tais como, mas não limitada a, TIC1415 (publicação de patente norte-americana US 2013-0097735 A1), TIC807 (patente norte-americana US N°. 8609936), TIC834 (publicação de patente norte-americana US 2013-0269060 A1), AXMI-036 (publicação de patente norte-americana US 2010-0137216 A1) e AXMI-171 (publicação de patente norte-americana US 2013-0055469 A1). Polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de inseto Coleoptera, Lepidoptera e Hemípteros podem ser encontrados no website de nomenclatura de toxina de Bacillus thuringiensis mantido por Neil Crickmore (na internet em btnomenclature. info).
[0073] Em outras modalidades, tal composição/formulação pode adicionalmente compreender pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de insetos para um inseto que não seja inibido por outra proteína inibidora de insetos da presente invenção, a fim de expandir o espectro de inibição de insetos obtido.
[0074] A possibilidade de insetos desenvolverem resistência a certos inseticidas tem sido documentada na técnica. Uma estratégia de gestão de resistência a insetos é empregar cultivos transgênicos que expressem dois agentes inibidores de insetos distintos operando através de diferentes modos de ação. Portanto, quaisquer insetos com resistência a qualquer um dos agentes inibidores de inseto pode ser controlado por outro agente inibidor de inseto. Outra estratégia de gestão de resistência a insetos emprega a utilização de plantas que não são protegidas para as espécies de pragas direcionadas Coleoptera ou Lepidoptera ou Hemiptera para fornecer um refúgio para tais plantas não protegidas. Um exemplo particular é descrito na patente norte- americana US N°. 6.551.962, que é incorporada neste documento na íntegra por referência.
[0075] Outras modalidades, tais como produtos químicos pesticidas aplicados topicamente são concebidos para o controle de pragas que também são controladas pelas proteínas divulgadas neste documento para serem utilizadas com proteínas em tratamentos de sementes, spray, gotejamento ou formulações de limpeza podem ser aplicadas diretamente ao solo (calda de regulador de crescimento aplicada ao solo), aplicado a plantas em crescimento expressando as proteínas divulgadas neste documento ou formulada para ser aplicada a sementes contendo um ou mais transgenes codificando uma ou mais das proteínas divulgadas. Tais formulações para utilização em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com vários adesivos e agentes de aderência conhecidos na técnica. Tais formulações podem conter os pesticidas que são sinérgicos em modo de ação com as proteínas divulgadas, de modo a que os pesticidas de formulação ajam através de um modo de ação diferente para controlar as mesmas pragas ou pragas semelhantes que possam ser controladas pelas proteínas divulgadas, ou que tais pesticidas atuem para controlar as pragas dentro de um intervalo de hospedeiro mais amplo ou espécies de pragas de plantas que não sejam efetivamente controladas pelas proteínas pesticidas TIC5290.
[0076] A composição/formulação mencionada acima pode compreender ainda um veículo aceitável em agricultura, tal como uma isca, um pó, poeira, grânulo, granulado, pulverização, emulsão, uma suspensão coloidal, uma solução aquosa, uma preparação de esporos/cristais Bacilo, um tratamento de sementes, uma célula vegetal recombinante/tecido vegetal/semente/planta transformada para expressar uma ou mais das proteínas ou bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas. Dependendo do nível de inibidor de pesticida ou inibição inseticida inerente ao polipeptídeo recombinante e o nível de formulação a ser aplicado a uma planta ou ensaio de dieta, a composição/formulação pode incluir várias quantidades por peso de polipeptídeo recombinante, por exemplo, de 0,0001% a 0,001% a 0,01% a 1% a 99% por peso de polipeptídeo recombinante.
Exemplos
[0077] Aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, compreender que muitas alterações podem ser feitas nos aspectos específicos que são divulgados e ainda obter um resultado parecido ou semelhante, sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Assim, detalhes estruturais e funcionais específicos divulgados neste documento não devem ser interpretados como limitativos. Deve ser entendido que a toda a divulgação de cada referência citada neste documento é incorporada dentro da divulgação do presente pedido.
Exemplo 1 Descoberta de tic5290
[0078] Este exemplo descreve a descoberta da proteína pesticida TIC5290.
[0079] Uma sequência que codifica uma Bacillus thuringiensis novo (Bt) a proteína pesticida foi identificada, clonada, confirmada em sequência e testada em bioensaio de insetos. A proteína pesticida, TIC5290, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 1 (sequência de codificação Bt) e 2 (proteína), foi isolado da cepa Bt EG6657. TIC5290 é uma proteína de aminoácidos longa 937 e foi identificada com base em homologia para toxinas de proteínas inseticidas conhecidas e através do uso da análise de Pfam para agrupá-la com famílias de proteínas inseticidas conhecidas. A análise da bioinformática sugere que o TIC5290 é uma proteína formadora de poros. Um domínio PA14 Pfam (PF07691) nos resíduos de aminoácidos 16 a 140 provavelmente está envolvido com funções de ligação. Este domínio é seguido por um domínio Pfam Binary_toxB (PF03495) nos aminoácidos 186 a 593 que podem contribuir para a formação de um poro transmembranar de barril beta. O homólogo de toxina Bt mais próximo de TIC5209 é a proteína Vip4Aa, com uma identidade de sequência de 56,9%, indicando que o TIC5290 representa uma nova subfamília Vip4.
[0080] Os primers de PCR foram concebidos para amplificar uma cópia completa da região de codificação para TIC5290 do DNA genômico total isolado da cepa EG6657. O amplicon PCR também incluiu os códons de início e parada da sequência de codificação.
[0081] O amplicon TIC5290 foi clonado usando métodos conhecidos na técnica em um vetor de expressão de plasmídeo Bt em ligação operável com um promotor expressável Bt durante a esporulação do bacilo. Além disso, o amplicon foi clonado em um vetor usado para a expressão da proteína em um sistema de expressão Escherichia coli (E. coli). Observou-se que as cepas recombinantes resultantes expressam a proteína recombinante.
Exemplo 2 Tic5290 demonstra atividade de coleoptera, lepidoptera e hemiptera em bioensaio de insetos
[0082] Este exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pelas proteínas TIC5290 contra várias espécies de Coleoptera, Lepidoptera e Hemiptera.
[0083] A nova proteína pesticida TIC5290 foi expressa em Bt e E. coli e avaliada quanto à toxicidade para várias espécies de Coleoptera, Lepidoptera, Hemiptera e Diptera. As preparações de cada toxina de Bt e. coli foram testadas contra as espécies de Coleoptera Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata, CPB) e Diabrotica virgifera virgifera (lagarta-da-raiz do milho, WCR). As preparações de toxina também foram testadas contra as espécies de Lepidoptera como (CEW) Helicoverpa zea, (ECB) Ostrinia nubilalis, (FAW) Spodoptera frugiperda, (SBL) Chrysodeixis includens, (SWC) Diatraea grandiosella, (TBW) Heliothis virescens e (DBM) lutella xylostella. As preparações de toxina também foram testadas contra as espécies de Hemiptera, como percevejo Lygus lineolaris (TPB) e percevejo do algodoeiro (WTP, Lygus hesperus); bem como a espécie Diptera, mosquito da febre amarela (YFM, Aedes aegypti). A lagarta da espiga (CEW, Helicoverpa zea) também é denominada em inglês Soybean pod worm (SPW) e Cotton bowl worm (CBW).
[0084] O ensaio de proteínas expressas em cada um dos vetores exigiu preparações diferentes adicionadas a uma dieta de insetos. Para os vetores que utilizam o promotor ativo durante a esporulação, uma mistura de cristal/esporos foi colhida após três dias de crescimento em cultura e utilizada numa dieta de insetos (geralmente aplicada a dietas artificiais de insetos e alimentada separadamente a vários insetos). As preparações de proteínas derivadas da expressão em E. coli foram purificadas e também fornecidas em uma dieta de insetos.
[0085] TIC5290 demonstrou atividade contra WCR, CEW, ECB, FAW, DBM e WTP, como mostrado na tabela 2 abaixo em que "+" indica atividade. Tabela 2. A atividade de bioensaio de TIC5290 contra pragas de insetos Coleoptera, Lepidoptera, Hemiptera e Diptera.
Exemplo 3 Criação de sequências de codificação sintética codificando tic5290 para expressão em células vegetais
[0086] Foram construídas sequências de codificação sintéticas ou artificiais para utilização na expressão de TIC5290 em plantas e foram clonados em um vetor de transformação de planta binária usado para transformar células vegetais. As sequências de ácido nucleico sintético foram sintetizadas de acordo com métodos geralmente descritos na patente US 5.500.365, evitando certas sequências problemáticas inimigas tais como sequências de poliadenilação de plantas ricas ATTTA e A/T, enquanto preserva a sequência de aminoácidos da proteína nativa Bt. A sequência de codificação sintética para a proteína pesticida TIC5290 é apresentada como SEQ ID NO: 3 e codifica a proteína apresentada como SEQ ID NO: 2.
Exemplo 4 Cassetes de expressão para expressão de tic5290 em células vegetais
[0087] Uma variedade de cassetes de expressão vegetais foi criada com as sequências, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3. Tais cassetes de expressão são úteis para expressão transitória em protoplastos vegetais ou transformação de células vegetais. Os cassetes de expressão típicos foram criados em relação à eventual colocação da proteína dentro da célula vegetal. Para proteína direcionada de plastídio, a sequência codificadora de proteína pesticida TIC5290 sintética foi operativamente ligada em quadro com uma sequência codificadora de peptídeo de sinal de direcionamento de cloroplasto. Os vetores de transformação vegetais resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida que compreende um promotor constitutivo, ligado operacionalmente 5' a um líder, ligada operacionalmente 5' a um íntron (ou opcionalmente sem íntron), ligado operacionalmente 5' a uma sequência de codificação sintética codificando uma proteína TIC5290 direcionada ou não direcionada, que é, por sua vez, ligada operacionalmente 5' a uma UTR 3' e um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas usando glifosato ou seleção de antibióticos. Todos os elementos descritos acima foram dispostos de forma contígua frequentemente com sequência adicional provida para a construção de cassete de expressão, tais como locais de endonuclease de restrição ou locais de clonagem independentes de ligação.
Exemplo 5 Tic5290 fornece uma resistência eficaz a lagarta-da-raiz do milho (Diabrotica virgifera virgifera) quando expressa em plantas de milho transformadas estáveis
[0088] Este exemplo ilustra a atividade inibidora exibida por TIC5290 contra Coleoptera tal como a lagarta da raiz do milho quando expressa em plantas e provida como uma dieta para a praga de insetos respectiva.
[0089] Os vetores de transformação de plantas binárias que compreendem cassetes de transgene projetados para expressar as proteínas pesticidas TIC5290 direcionadas e não direcionadas foram clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes foram utilizados para transformar plantas de milho estavelmente transformadas. Eventos de inserção de T-DNA simples foram selecionados e cultivados. A atividade pesticida foi testada contra a praga Coleoptera lagarta-da-raiz do milho (Diabrotica virgifera virgifera) alimentando-se nas raízes das plantas de milho estavelmente transformadas.
[0090] As plantas de milho estavelmente transformadas R0 foram usadas para testar a resistência de Coleoptera, bem como gerar progênie F1. Foram selecionados vários eventos de cópia única de cada transformação de vetor binário. Uma parcela desses eventos se origina de cada transformação vetorial binária usada no ensaio Coleoptera, enquanto outra parcela dos eventos foi usada para gerar progênie F1 para novos testes.
[0091] As plantas de ensaios R0 foram transplantadas para potes de oito polegadas. As plantas foram inoculadas com ovos de lagarta-da- raiz do milho (Diabrotica virgifera virgifera, WCR). Os ovos foram incubados durante aproximadamente dez dias antes da inoculação para permitir que a eclosão ocorra em quatro dias após a inoculação, a fim de garantir que um número suficiente de larvas sobreviva e possa atacar as raízes do milho. As plantas transformadas foram inoculadas em estágio aproximadamente V2 a V3. As plantas foram cultivadas após infestação por aproximadamente vinte e oito dias. As plantas foram removidas dos potes com as raízes sendo cuidadosamente lavadas para remover todo o solo. O dano às raízes foi avaliado usando uma escala de classificação de danos de 1-5 conforme apresentado na tabela 3 abaixo. Foi também feita uma comparação com o controle negativo para garantia da realização correta do ensaio. As baixas pontuações de dano de raiz indicam resistência conferida pela proteína TIC5290 à praga de Coleoptera. Os eventos R 0 múltiplos para cada transformação do vetor binário foram utilizados no ensaio WCR. Muitos dos eventos R0 que expressam tanto TIC5290 direcionado quanto não direcionado demonstraram resistência ao WCR determinado pelos escores de classificação de dano de raiz quando comparados aos controles transgênicos. Tabela 3. Classificação de danos de raiz Ro.
[0092] Uma porção dos eventos estavelmente transformados R0 decorrentes de cada transformação vetorial binária foram utilizados para produzir progênie F1. As plantas estavelmente transformadas R0 foram autorizadas a autofertilizar, produzindo progênie F1. A semente F1 foi plantada. As plantas heterozigóticas foram identificadas através de métodos moleculares conhecidos na técnica, e utilizados para ensaio contra WCR, bem como medições de expressão ELISA da proteína da toxina TIC5290. Uma porção da progênie F1 heterozigótica de cada evento foi utilizada para ensaio de insetos, enquanto outra porção foi usada para medir a expressão de TIC5290.
[0093] Ovos de Diabrotica virgifera virgifera (WCR) foram incubados durante aproximadamente dez dias, a fim de permitir a eclosão dos ovos dentro de quatro dias após a inoculação. As plantas foram inoculadas em estágios aproximadamente V2 a V3. Para a WCR, cada pote foi inoculado com cerca de dois mil ovos. As plantas foram cultivadas após infestação por aproximadamente vinte e oito dias. As plantas foram removidas dos potes com as raízes sendo cuidadosamente lavadas para remover todo o solo. O dano às raízes foi avaliado usando uma escala de classificação de danos de 0-3 como apresentado na Tabela 4 abaixo. Foi feita uma comparação com o controle negativo para assegurar que o ensaio foi realizado corretamente. A classificação dos danos da raiz baixa indicou resistência conferida pela proteína TIC5290 à praga Coleoptera. Muitos dos eventos F1 demonstraram resistência eficaz ao WCR quando comparados aos controles. A Figura 1 representa a classificação média de dano de raiz para vários eventos para TIC5290 quando expresso em plantas de milho F1, independentemente de a proteína ter sido direcionada ao cloroplasto. Tabela 4. A classificação Fide pontuação de dano de raiz.
Exemplo 5 Ensaio de atividade de TIC5290 contra pragas de Lepidoptera quando expresso em plantas de milho, soja ou algodão estavelmente transformadas.
[0094] Os vetores de transformação de planta binária compreendendo cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC5290 direcionada e não direcionada por plastídio são clonados usando métodos conhecidos na técnica.
[0095] O milho, a soja ou o algodão são transformados com os vetores de transformação binários descritos acima usando um método de transformação mediado Agrobacterium. As células transformadas são induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bioensaios usando discos de folhas de plantas são realizados de forma análoga à descrita na patente norte-americana US N°. 8.344.207. Uma planta de milho, soja ou algodão não transformada é usada para obter tecido para ser usado como controle negativo. Os eventos de transformação múltipla de cada vetor binário são avaliados contra pragas de Lepidoptera, tais como, mas não limitado a, (CEW) Helicoverpa zea, (ECB) Ostrinia nubilalis, (FAW) Spodoptera frugiperda, (SBL) Chrysodeixis includens, (SWCB) Diatraea grandiosella, (TBW) Heliothis virescens e (DBM) lutella xylostella. Os insetos que demonstram o nanismo e/ou a mortalidade no bioensaio de insetos são determinados a serem suscetíveis aos efeitos da toxina de inseto TIC5290.
Exemplo 6 Ensaio de atividade contra pragas Hemiptera usando plantas de algodão estavelmente transformadas expressando TIC5290.
[0096] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene projetados para expressar tanto proteínas pesticidas TIC5290 direcionadas quanto não direcionadas por plastídio são clonados usando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes são usados para transformar estavelmente plantas de algodão. A atividade pesticida é testada contra pragas Hemiptera que se alimentam das plantas de algodão estavelmente transformadas.
[0097] Os vetores binários descritos anteriormente no exemplo 3, nos quais o TIC5290 direcionado e não direcionado de plastídio é expresso, são utilizados para transformar estavelmente plantas de algodão. Eventos de inserção de T-DNA simples são selecionados e cultivados. As plantas transformadas estavelmente R0 podem autofertilizar, produzindo progênie R1.
[0098] As sementes transgênicas R1 que compreendem os cassetes de expressão para TIC5290 são semeadas em potes de 10 polegadas juntamente com sementes que correspondem a um controle não transgênico. As plantas são mantidas em uma câmara de ambiente com um fotoperíodo de dezesseis horas de luz a trinta e dois graus Celsius e oito horas de escuro a vinte e três graus Celsius e uma intensidade de luz entre oitocentos e novecentos microeinsteins. De quarenta a quarenta e cinco dias após o plantio, as plantas individuais são incluídas em uma gaiola feita de folhas de polinização de plástico respirável (Vilutis and Company Inc, Frankfort, IL). As mangas da folha são fixadas ao caule principal logo acima da superfície do solo usando uma gravata Velcro®. Dois pares de Lygus lineolaris masculino e feminino, sexualmente maduras ou Lygus hesparus adultos (seis dias de idade) da cultura de laboratório são coletados em um tubo de plástico de fundo redondo de catorze mililitros (Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) e utilizados para cada planta. Os adultos são liberados em cada gaiola individual através de uma pequena fenda ao lado da gaiola e, em seguida, a gaiola é bem fechada, garantindo que os insetos não escapem. Os insetos podem acasalar e as plantas são mantidas na gaiola por vinte e um dias. Após vinte e um dias, as plantas são então cortadas abaixo das gaiolas e movidas para um laboratório onde os insetos são coletados para cada planta e contados. Antes de abrir a gaiola, as plantas são agitadas vigorosamente para garantir que todos os insetos caiam de seus locais de alimentação para a base da gaiola. Em seguida, a base da gaiola é aberta e todo o material da planta é removido e colocado em uma folha preta. Os insetos são coletados usando um aspirador. A planta é então cuidadosamente inspecionada para recuperar os insetos remanescentes. O número de insetos e seu estágio de desenvolvimento são registrados para cada planta. As contagens de insetos são divididas em vários grupos com base na maturidade do Lygus; ninfas até 3° instar 4° instar 5° instar e adultos. As plantas de algodão transgênico que demonstram um número reduzido de ninfas e adultos em relação às plantas de controle de algodão não transformadas demonstram resistência conferida às pragas Hemiptera através da expressão da proteína de toxina TIC5290.
[0099] Todas as composições e métodos divulgados e reivindicados neste documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Enquanto as composições desta invenção foram descritas em relação às modalidades precedentes ilustrativas, será evidente para aqueles versados na técnica que as variações, alterações, modificações e alterações podem ser aplicadas à composição descrita neste documento, sem que se afaste verdadeiro escopo e espírito da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, ao passo que resultados iguais ou semelhantes seriam atingidos. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.
[00100] Todas as publicações e documentos de patentes publicados neste documento são citados por referência da mesma forma como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica ou individualmente indicado a ser incorporado por referência.

Claims (21)

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um segmento de polinucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou uma sequência degenerada das mesmas que codifica uma proteína pesticida que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1, sendo que o referido vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, fagomídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossomo artificial de bactéria ou levedura.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta.
4. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida em uma célula hospedeira que é selecionada do grupo que consiste em uma célula bacteriana e uma planta.
5. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira bacteriana selecionada do grupo que consiste em: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea e Erwinia.
6. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a espécie Bacillus é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, sendo que o referido Brevibacillus é Brevibacillus laterosperus ou a referida Escherichia é Escherichia coli.
7. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal é uma célula vegetal dicotiledônea ou monocotiledônea.
8. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira de planta é selecionada do grupo que consiste em célula de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão-de-bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus Radiata, rabanete, colza, arroz, porta- enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata-doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
9. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida em uma planta ou parte dela.
10. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida planta é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.
11. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste em célula de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão-de-bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus Radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata- doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
12. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida em uma semente da planta.
13. Composição inibidora de insetos, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1, e a proteína pesticida codificada pelo segmento de polinucleotídeo.
14. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência nucleotídica que codifica pelo menos um outro agente pesticida selecionado do grupo que consiste em variantes de Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Quimeras Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry43, Cry, Cry, Cry1, Cry1, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC3608, TIC3131, TIC3608 , TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI- 100, AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1, IP3, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 e um DIG-11.
15. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida em uma célula vegetal.
16. Método para produção de sementes, caracterizado pelo fato de que compreende: a. plantar pelo menos uma primeira semente compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1; b. cultivar uma planta a partir da semente; e c. colher sementes da planta, sendo que a referida semente colhida compreende a referida molécula de ácido nucleico recombinante.
17. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida nas células de uma planta compreendida em uma planta que é resistente à infestação por insetos.
18. Método para controlar uma praga ou infestação de pragas das espécies de Lepidoptera, Coleoptera ou Hemiptera, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da praga com a composição inibidora de insetos, como definida na reivindicação 13.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a praga é uma lagarta-da-raiz do milho ocidental.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a praga é uma lagarta da espiga, traça-das-crucíferas, lagarta do cartucho ou lagarta do milho europeia.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a praga é um percevejo Lygus hesperus.
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