UA126327C2 - Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що проявляє інгібуючу активність відносно комах - Google Patents

Description

способу боротьби з видами твердокрилих, лускокрилих та напівтвердокрилих шкідників із застосуванням пестицидного білка.

Перехресне посилання на споріднені заявки

ІЇО0О0О1| У даній заявці заявляється пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 62/199,024, що подана 30 липня 2015 року, яка включена в даний документ за допомогою посилання в повному обсязі.

Включення переліку послідовностей

І0002| Файл з ім'ям "МОМ5394Уу/О-зедцпепсе і5іпудлх", що містить машинозчитувану форму списку послідовностей, був створений 19 липня 2016 року. Цей файл містить 16,077 байт (виміряний в М5-Ууіпдом5Ф)), одночасно поданий в електронному вигляді (з використанням системи реєстрації ЕЕ5-Ууер Патентного відомства США) і повністю включається в дану заявку за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Галузь техніки 0003) Винахід в цілому стосується області білків, що володіють інгібіторною активністю по відношенню до комах. Розкрито новий клас білків, які проявляють інсектицидну інгібуючу активність проти сільськогосподарських шкідників сільськогосподарських культур і насіння.

Зокрема, описаний білок є інсектицидно активним опо відношенню до шкідників сільськогосподарських культур і насіння, зокрема видів комах-шкідників рядів твердокрилих, лускокрилих і напівтвердокрилих. Пропонуються рослини, частини рослин і насіння, що містять рекомбінантний полінуклеотидний конструкт, який кодує один або більше описаних білків токсину.

Рівень техніки

І0004| Все більшого значення набуває підвищення врожайності сільськогосподарських культур, включаючи кукурудзу, сою, цукровий очерет, рис, пшеницю, овочі та бавовну. За прогнозами, на додаток до зростаючої потреби в сільськогосподарській продукції для забезпечення їжею, одягом та забезпечення енергією зростаючого населення, кліматичних наслідків і тиску з боку зростаючого населення на використання землі, відмінної від сільськогосподарської, зменшується кількість доступних орних земель для ведення сільського господарства. Дані фактори призвели до неоптимістичних прогнозів продовольчої безпеки, особливо в умовах відсутності значних поліпшень в галузі біотехнології рослин і агрономічних практик. У світлі даних факторів, екологічно стабільні удосконалення в області технологій,

Зо агротехніки і боротьби зі шкідниками є життєво важливими інструментами для розширення виробництва сільськогосподарських культур на обмеженій кількості орних земель, доступних для ведення сільського господарства.

ЇО00О5| Комахи, особливо комахи в межах рядів лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих вважаються основною причиною пошкодження польових культур, тим самим знижуючи врожайність культур в заражених районах. Види лускокрилих шкідників, які негативно впливають на сільське господарство, включають, але без обмежень: Неїїсомегра 7єа, Об5ігіпіа пибріїайії5, Оіаїгаєа зассНагаїв5, Оіаїгаєа агапаїіозеїІа, Апіісагзіа деттаїаїї5, 5родорівга Ігидірегаа,

Зродорієга ехідца, Адгоїїв ірвіп, Тиспоріизіа пі, СНгузодеїхів іпсійдеп5, Неїоїнів мігезсепв,

Рішейа хуовзієМПа, Ресііпорпога доз55уріеМа, Неїїсомегра агптідега, ЕІазтораїрив5 Ідпозеїсв5, зігіасовіа аібісобїа та РПпуПоспівії5 сйгейа. Види жуків шкідників, які негативно впливають на сільське господарство, включають, але без обмежень: Адгіоїе5 5рр., Апіпопотив» 5рр., Аютагіа

Іпеагів, Спаєюспета біаїї5, Со5тороїйевз 5рр., Ситгсшіо в5рр., Оептезіевв 5рр., Оіабгоїїса 5рр.,

Ерпаснпа з5рр., Егетпив5 5рр., І ерііпоїаїза десетіїпеаїа, І ів5огпорігиб5 5рр., Мепіоіопіна 5рр.,

Огусаерпійни5 врр., Обйогпупспи5 врр., РАїусіїпиз 5рр., Роріййа 5рр., РзуїПодев5 в5рр., Впігорепна 5рр., Зсагареіїдає, Зпорнийи5 врр., Зйоїтода 5рр., Тепебіо 5рр., Тіроїїшт врр. і Тгододегта 5рр, зокрема, в яких шкідником є Оіаргоїїса мігудіїега мігдіїега (західний кукурудзяний жук, УУСК),

Оіабгоїїса Багбегі (північний кукурудзяний жук, МОСК), Оіаргоїїса мігаїега 7еае (мексиканський кукурудзяний жук, МОСК), Оіабгоїїса рбанеага (бразильський кукурудзяний жук (В2К), Ріабгоїїса ипаесітрипсіага Ппоугагаії (південний кукурудзяний жук, 5СК) і група бразильського кукурудзяного жука (ВСК), що складається з Оіабгоїйса мігпідша та Оіабгоїїса 5ресіоза). Види напівтвердокрилих шкідників, які негативно впливають на сільське господарство, включають, але без обмежень: І уди5 Ппезрегив, І удиз Ійпеоїагі5 та Рхейдайтозвзсеїї5 зегіайив.

ІО00О6| Історично склалося так, що інтенсивне застосування синтетичних хімічних інсектицидів використовувалося як засіб боротьби з шкідниками в сільському господарстві.

Стурбованість з приводу навколишнього середовища і здоров'я людини, окрім виникаючих проблем зі стійкістю, стимулювала дослідження і розробку біологічних пестицидів. Дане дослідження привело до прогресивного відкриття і застосування різних ентомопатогенних видів мікроорганізмів, включаючи бактерії.

І0007| Парадигма біологічних методів боротьби змінилася, коли був відкритий потенціал 60 ентомопатогенних бактерій, особливо бактерій, що відносяться до роду Васійи5, і застосований в розробці агентів для біологічної боротьби з шкідниками. Штами бактерії Васійи5 (игіпдіепвів (ВО використовували в якості джерела пестицидних білків, оскільки було виявлено, що штами Ві проявляють високу токсичність проти конкретних комах. Відомо, що штами Ві продукують дельта-ендотоксини, що локалізовані в параспоральних кристалічних тільцях включення на початку споруляції та під час фази стаціонарного росту (наприклад, білки Сгу) і також відомо, що вони продукують інсектицидний білок, що секретується. При ковтанні чутливою комахою, дельта-ендотоксини, а також токсини, що секретуються, діють на поверхню епітелію середньої кишки, руйнують клітинну мембрану, приводячи до руйнування і загибелі клітин. Гени, що кодують інсектицидні білки, також були ідентифіковані у бактеріальних видів, відмінних від Ві, в тому числі інших Васіїйш5 ії багатьох інших видів бактерій, таких як Вгемірасійи5 Іатегозрогив,

ГузіпірасШив зрпаєгісиз ("І 5" раніше відомий як Васійиз зрпаєгіси5) та РаєпірасШиз роріїає.

ЇО0О8| Кристалічні і такі, що секретуються розчинні інсектицидні токсини (є високоспецифічними для їх господарів і отримали світове визнання як альтернатива хімічним інсектицидам. Наприклад, інсектицидні білки-токсини застосовують в різних сільськогосподарських цілях з метою захисту господарсько-цінних рослин від зараження комахами, зменшення потреби в застосуванні хімічних пестицидів і підвищення врожайності.

Інсектицидні білки-токсини застосовують для боротьби з сільськогосподарськими шкідниками культурних рослин механізованими способами, такими як розпорошення дисперсних мікробних препаратів, що містять різні штами бактерій, на поверхні рослин, та з використанням методів генетичної трансформації для отримання трансгенних рослин і насіння, що експресують інсектицидний білок-токсин.

ІЇ0009| Застосування трансгенних рослин, що експресують інсектицидні білки-токсини, визнано в світовому масштабі. Наприклад, у 2012 році 26,1 мільйона гектарів були засаджені трансгенними культурами, що експресували токсини Ві (дате5, С., сіобра! еЗашев ої

Сотітпегсіаійлей Віотесп/зМ Сгоре: 2012. Короткий зміст звіту ІЗААА (Міжнародна служба зі збору відомостей стосовно застосування біотехнологій в сільському господарстві) Мо 44).

Глобальне застосування трансгенних культур, захищених від комах, та обмежена кількість інсектицидних білків-токсинів, що застосовуються для цих культур, створило тиск відбору для існуючих алелів комах, які надають стійкість до інсектицидних білків, що застосовуються в даний час.

ІЇ0010| Розвиток резистентності у цільових шкідників до інсектицидних білків-токсинів створює постійну потребу у відкритті і розробці нових форм інсектицидних токсичних білків, які є корисними для контролю над підвищенням резистентності комах до трансгенних культур, що експресують інсектицидні білки-токсини. Нові білкові токсини з підвищеною ефективністю, і які контролюють більш широкий спектр сприйнятливих видів комах, зменшують число комах, які вижили і можуть розвинути резистентні алелі. Крім того, застосування в одній рослині двох або більше трансгенних інсектицидних білків-токсинів, токсичних для однієї і тієї ж комахи-шкідника і які демонструють різні способи впливу, знижує ймовірність резистентності у будь-яких окремих цільових видів комах.

І00111| Таким чином, автори даного винаходу розкривають нове сімейство білкових токсинів від Васійи5 (Пигіпдіепві5 разом з подібними білками-токсинами, варіантними білками і типовими рекомбінантними білками, які проявляють інсектицидну активність до цільових видів лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих шкідників, зокрема, до західного кукурудзяного жука.

Короткий опис суті винаходу 0012) В даному документі описана нова група білків з інгібуючою активністю по відношенню до комах (білки-токсини), що згадуються в даному документі як ТІС5290, які, як показано, проявляють інгібуючу активність проти одного або більше шкідників сільськогосподарських рослин. Білок ТІС5290 та білки в класі білка-токсину ТІС5290 можуть застосовуватися окремо або в поєднанні з іншими інсектицидними білками і токсичними речовинами в препаратах і іп ріапіа, таким чином забезпечуючи альтернативи інсектицидним білкам та хімії інсектицидів, які в даний час використовуються в сільськогосподарських системах.

ІЇ0013| В одному варіанті реалізації винаходу в даній заявці представлена молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидним сегментом, що кодує пестицидний білок або його фрагмент, в якому: (а) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 2; або (Б) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або 98 95, або 99 95, або близько 100 95 ідентичності амінокислотної послідовності до 5ЕО ІЮО МО: 2; або (с) зазначений бо полінуклеотидний сегмент гібридизується з полінуклеотидом, що має нуклеотидну послідовність

ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 3; або (4) зазначений полінуклеотидний сегмент, який кодує пестицидний білок або його фрагмент, містить полінуклеотидну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або 98 95, або 99 95, або близько 100 95 ідентичності послідовності до нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 3; або (е) зазначена молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти знаходиться у функціональному зв'язку з вектором, і зазначений вектор вибирають з групи, що складається з плазміди, фагміди, бакміди, косміди і бактеріальної або дріжджової штучної хромосоми. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти може містити послідовність, яка функціонує для експресії пестицидного білка в рослині; або експресується в рослинній клітині для отримання пестицидно ефективної кількості пестицидного білка. (0014) В іншому варіанті реалізації винаходу даної заявки присутні клітини-господарі, що містять молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти даної заявки, причому клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з бактеріальної та рослинної клітини. Розглянуті клітини- хазяїни включають Адгобасіегішт, Кпі2обішт, Васійи5, Вгемірасійй5, Езспегіспіа, Рзендотопав,

КІебзівІа, Рапіова та Егміпіа. В окремих варіантах реалізації винаходу зазначеними видами

Васіїй5 були Васіїйй5 сегеи5 або Васіїйн5 ІпПигіпдіепві5, зазначеним Вгемірбасійн5 був Вгемірбасійи5

Іатегозреги5, або зазначеним Езспегіспіа був Езспегіснпіа соїї. Розглянуті клітини-хазяїни рослин включають клітину дводольних і клітину однодольних. Додатково, розглянуті клітини-господарі рослин включають рослинну клітину люцерни, банана, ячменю, квасолі, броколі, капусти,

Вгаззіса, моркви, маніоки, рицини, цвітної капусти, селери, нуту, китайської капусти, цитрусових, кокосової пальми, кави, кукурудзи, конюшини, бавовника (Со55урішт 5р.), гарбузових, огірка,

Дугласової ялиці, баклажана, евкаліпта, льону, часника, винограду, хмелю, цибулі порею, салату-латуку, сосни ладанної, проса, дині, горіха, вівса, оливи, цибулі, декоративної рослини, пальми, трави пасовиська, гороху, арахісу, перцю, голубиного гороху, сосни, картоплі, тополі, гарбуза, сосни променистої, редису, ріпаку, рису, кореневищних злаків, жита, американського шафрану, чагарника, сорго, південної сосни, сої, шпинату, кабачка, полуниці, цукрових буряків, цукрової тростини, соняшника, солодкої кукурудзи, амбрового дерева, солодкої картоплі, проса прутовидного, чаю, тютюну, томату, тритикале, дернової трави, кавуна і пшениці. 0015) У ще одному варіанті реалізації винаходу пестицидний білок проявляє активність

Зо проти комахи ряду твердокрилих, в тому числі західного кукурудзяного жука, південного кукурудзяного жука, північного кукурудзяного жука, мексиканського кукурудзяного жука, бразильського кукурудзяного жука або групи бразильського кукурудзяного жука, що складається з Оіаргоїїса мігідшіа та Оіаргоїйса зресіоза. 0016) В іншому варіанті реалізації винаходу пестицидний білок проявляє активність проти комахи ряду лускокрилих, в тому числі совки оксамитових бобів, вогнівки очеретяної, точильника зернового, совки бавовняної, тютюнової листовійки, соєвої совки, африканської совки, південної совки, совки трав'яної, совки бурякової, совки американської, азіатської бавовняної совки, рожевого коробкового хробака бавовника, совки-іпсилон, вогнівки кукурудзяної південно-західної, капустяної молі або метелика стеблового кукурудзяного.

І0017| У ще одному варіанті реалізації винаходу пестицидний білок проявляє активність проти комахи ряду напівтвердокрилих, в тому числі сліпняка західного матового, клопа трав'яного або бавовняного сліпняка. 0018) Також в даній заявці розглядаються рослини, що містять молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидним сегментом, що кодує пестицидний білок або його фрагмент, причому: (а) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 2; або (б) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 7095, або 7595, або 8095, або 8595, або 9095, або 9595, або 9895, або 99 95, або приблизно 100 95 ідентичності амінокислотній послідовності до ЗЕО ІЮ МО: 2; або (с) зазначений полінуклеотидний сегмент гібридизується в жорстких умовах гібридизації з комплементарною нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1 або ЗЕО ІЮ МО: 3; або (4) вказана рослина проявляє таку кількість зазначеного пестицидного білка, яка може бути виявлена. В окремих варіантах реалізації винаходу пестицидний білок містить ЗЕО ІЮО МО: 2. В одному варіанті реалізації винаходу рослина є однодольною або дводольною. В іншому варіанті реалізації винаходу рослину вибирають з групи, що складається з люцерни, банана, ячменю, бобів, броколі, капусти, Вгаззіса, моркви, маніоки, рицини, цвітної капусти, селери, нуту, китайської капусти, цитрусових, кокосової пальми, кави, кукурудзи, конюшини, бавовника, гарбузових, огірка, Дугласової ялиці, баклажана, евкаліпта, льону, часника, винограду, хмелю, цибулі порею, салату-латуку, сосни ладанної, проса, дині, горіха, вівса, оливи, цибулі, 60 декоративної рослини, пальми, трави пасовиська, гороху, арахісу, перцю, голубиного гороху,

сосни, картоплі, тополі, гарбуза, сосни променистої, редису, ріпаку, рису, кореневищних злаків, жита, американського шафрану, чагарника, сорго, південної сосни, сої, шпинату, кабачка, полуниці, цукрових буряків, цукрової тростини, соняшника, солодкої кукурудзи, амбрового дерева, солодкої картоплі, проса прутовидного, чаю, тютюну, томату, тритикале, дернової трави, кавуна і пшениці. 0019) У додаткових варіантах реалізації винаходу описуються насіння, що містять молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти.

І0020| В іншому варіанті реалізації винаходу розглядається описана в даній заявці композиція, що володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, яка містить молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Композиція, яка володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, може додатково містити нуклеотидну послідовність, що кодує щонайменше один інший пестицидний агент, який відрізняється від зазначеного пестицидного білка. Щонайменше один інший пестицидний агент вибирають з групи, що складається з білка, який володіє інгібіторною активністю по відношенню до комах, молекули длРНК, що володіє інгібіторною активністю по відношенню до комах, і допоміжного білка. Щонайменше один інший пестицидний агент в композиції, яка володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, проявляє активність проти одного або більше видів шкідників із ряду лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих. Щонайменше один інший пестицидний агент в композиції, що володіє інгіібуючою активністю по відношенню до комах, в одному варіанті реалізації винаходу є вибраним з групи, що складається з: СтутА, СтутАб, СтутАс, СтутА.105, СтутАе, Сту1В, Стуї1с, варіантів Сту1!С, Стгу10О, СтутЕ, СтуїтЕ, химер СтгутА/Е, Сту1б, СтуїН, СгутліІ, Сту1у, СтуїК, Стуті,

СтугА, Стуг2АБ, Стуг2Ае, СтуЗз, варіантів СгуЗзА, СтуЗВ, Сту4В, Стуб, Сту7, Стув8, СтуЗ, Сту15, СтуЗ34,

Стуз5, Сту4ЗА, Сту4З3В, СтубіАа!, ЕТ29, ЕТЗ3, ЕТ34, ЕТЗ35, ЕТ6б, ЕТ70, ТІС400, ТІС407, ТІС417,

ТІС431, ТІС8О00, ТІС807, ТІС834, ТІС853, ТІС900, ТІС9О1, ТІС1201, ТІС1415, ТІС2160, ТІСЗ3131,

ТІС836, ТІС860, ТІС867, ТІС869, ТІС1100, МІРЗА, МІРЗВ, МІРЗАБ, АХМІ-АХМІ-, АХМІ-88, АХМІ-97,

АХМІ-102, АХМІ-112, АХМІ-117, АХМІ-100, АХМІ-115, АХМІ-113 та АХМІ-005, АХМІ134, АХМІ- 150, АХМІ-171, АХМІ-184, АХМІ-196, АХМІ-204, АХМІ-207, АХМІ-209, АХМІ-205, АХМІ-218, АХМІ- 220, АХМІ-2217, АХМІ-2227, АХМІ-2237, АХМІ-2247 і АХМІ-2257, АХМІ-238, АХМІ-270, АХМІ-279,

АХМІ-345, АХМІ-335, АХМІ-КІ1 та його варіантів, ІРЗ та його варіантів, 0ІС-3, БІС-5, 0102-10, 01С-

Зо 657 та білка БІС-11. 0021) Розглядаються товарні продукти, що містять молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, описаної в даній заявці, у кількості, яка може бути виявлена. Такі товарні продукти включають товарну кукурудзу, упаковану оброблювачем зерна, кукурудзяні пластівці, кукурудзяні коржі, кукурудзяну муку, кукурудзяну муку грубого помелу, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний силос, кукурудзяний крохмаль, кукурудзяну кашу тощо, а також відповідні бавовняні товарні продукти, такі як цілісне або оброблене насіння бавовнику, бавовняне масло, лінт, насіння і частини рослин, оброблені для корму або продуктів харчування, волокно, папір, біомаси і паливні продукти, такі як паливо, отримане з бавовняного масла або пелетів, отриманих з відходів бавовняного очищення, і відповідні товарні продукти з сої такі як цілісне або оброблене насіння сої, соєве масло, соєвий білок, соєве борошно грубого помелу, соєве борошно, соєві пластівці, соєві висівки, соєве молоко, соєвий сир, соєве вино, корм для тварин, що містить соєві боби, папір, що містить сою, вершки, що містять сою, біомасу соєвих бобів і паливні продукти, вироблені з використанням рослин сої і частин рослин сої, а також відповідні продукти з рису, пшениці, сорго, голубиного гороху, арахісу, фруктів, дині і товарної продукції овочів, включаючи, де це може бути застосовано, соки, концентрати, джеми, желе, мармелад та інші їстівні форми таких товарних продуктів, що містять такі полінуклеотиди та або поліпептиди даної заявки у кількості, яка може бути виявлена. 00221 У даній заявці також розглядається спосіб виробництва насіння, що містять молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, описаної в даній заявці. Спосіб включає посадку, щонайменше, одного з насіння, що містить молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, описаної в даній заявці; вирощування рослини з насіння; і збір насіння з рослин, причому зібране насіння містить молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти даної заявки.

І0023) В іншому ілюстративному варіанті реалізації винаходу пропонується рослина, стійка до зараження комахами, в якій клітини зазначеної рослини містять: (а) молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує інсектицидно ефективну кількість пестицидного білка, як зазначено в ЗЕО І МО: 2; або (Б) інсектицидно ефективну кількість білка, що містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або приблизно 100 95 ідентичність амінокислотної послідовності до

ЗЕО І МО: 2. 60 І0024| Також в даній заявці описані способи боротьби з шкідниками видів твердокрилих або лускокрилих, або напівтвердокрилих, і боротьби з ураженням рослин шкідниками видів твердокрилих або лускокрилих, або напівтвердокрилих, зокрема сільськогосподарської культури. В одному варіанті реалізації винаходу спосіб включає (а) контактування шкідника з інсектицидно ефективною кількістю одного або більше пестицидних білків, як зазначено в 5ХЕО

ІО МО: 2; або (Б) контактування шкідника з інсектицидно ефективною кількістю одного або більше пестицидних білків, що містять амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або приблизно 100 95 ідентичності амінокислотній послідовності до ХЕО ІЮ МО: 2. 0025) Додатково в даному документі пропонується спосіб виявлення наявності молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотидний сегмент, який кодує пестицидний білок або його фрагмент, в якому: (а) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2; або (5) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 8595, або 9095, або 9595, або 98595, або 9995, або приблизно 10095 ідентичності амінокислотній послідовності до БЕО ІЮ МО: 2; або (с) зазначений полінуклеотидний сегмент гібридизується з полінуклеотидом, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЗЕО

ІЮ МО: 3. В одному варіанті реалізації винаходу спосіб включає контактування зразка нуклеїнових кислот із зондом на основі нуклеїнової кислоти, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з геномною ДНК з рослини, що містить полінуклеотидний сегмент, який кодує пестицидний білок або його фрагмент, представлений в даному документі, і не гібридизується в таких умовах гібридизації з геномною ДНК з іншої ізогенної рослини, яка не містить сегмент, причому зонд є гомологічним або комплементарним до 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ

МО: 3, або послідовності, яка кодує пестицидний білок, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або 98 95, або 99 95, або близько 100 95 ідентичності амінокислотній послідовності до ЗЕО ІЮ МО: 2.

Спосіб може додатково включати (а) застосування до зразка і зонду жорстких умов гібридизації; і (Б) виявлення гібридизації зонда з ДНК зразка. (0026) Також винаходом передбачені способи виявлення наявності пестицидного білка або його фрагмента в зразку, що містить білок, причому вказаний пестицидний білок, містить

Ко) амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 2; або вказаний пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 65 95, або 70 95, або 75 95, або 80 95, або 85 95, або 90 95, або 95 95, або 98 95, або 99 95, або близько 100 95 ідентичності амінокислотній послідовності до ЗЕО ІЮ МО: 2. В одному варіанті реалізації винаходу спосіб включає: (а) контактування зразка з імунореактивним антитілом; і (Б) виявлення наявності білка. У деяких варіантах реалізації винаходу етап виявлення включає твердофазний імуноферментний аналіз

ЕГІ5А або вестерн-блот.

Короткий опис графічних матеріалів

І0027| На Фіг. 1 зображена іп ріапіа інгібуюча активність типових цільових і нецільових білків

ТІС5290 хлоропласта до західного кукурудзяного жука (МУСК).

Короткий опис послідовностей

І0028| 5ЕО ІО МО: 1 є нуклеїновою кислотою, що кодує послідовність пестицидного білка

ТІС5290, отриману з виду Васійн5 (Пигіпдіепоіз ЕОб657.

І0029| 5ЕО ІО МО: 2 є амінокислотною послідовністю білка ТІС5290. 0030) 5ЕО ІО МО: З є синтетичною кодуючою послідовністю, яка кодує пестицидний білок

ТІС5290, що використовується для експресії в рослинних клітинах.

Детальний опис суті винаходу

ІЇ0031| Проблема в області боротьби з сільськогосподарськими шкідниками може бути охарактеризована як потреба в нових білках-токсинах, які ефективні проти цільових шкідників, проявляють токсичність широкого спектра по відношенню до цільових видів шкідників, здатні експресуватися в рослинах, не викликаючи небажаних агрономічних проблем, та забезпечують альтернативний спосіб впливу в порівнянні з існуючими на сьогоднішній день токсинами, які використовують в рослинах в комерційних цілях.

І0032| В даному документі описані нові інсектицидні білки, прикладом яких є ТІС5290 і родинні члени сімейства, які забезпечують стійкість до комах-шкідників ряду твердокрилих, лускокрилих і напівтвердокрилих, більш конкретно до видів-шкідників кукурудзяних жуків. Також описаними є синтетичні кодують послідовності, призначені для експресії в рослинній клітині, які кодують ТІС5290. Далі описані молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містять промотор в оперативному зв'язку з кодуючою послідовністю, що кодує білок-токсин ТІС5290, або родинні члени сімейства або їх фрагменти. бо І0033| Посилання в цій заявці на ТІС5290, "білок ТІС5290", "білковий токсин ТІС5290", "білок-

токсин ТІС5290", "пестицидний білок ТІС5290", "ТІС5290-подібні токсини", або "ТІС5290-подібні білки-токсини" тощо, відноситься до будь-якого нового пестицидного білку або білку, що володіє інгібіторною активністю по відношенню до комах, який включає, складається, є по суті гомологічним, є подібним або отриманим з будь-якого пестицидного білка або білкової послідовності ТІС5290 (5ЕО ІО МО: 2), що володіє інгібіторною активністю по відношенню до комах, а також їх інгібуючим пестицидним сегментам або їх комбінаціям, що володіють інгібіторною активністю по відношенню до комах, які надають активність проти комах-шкідників ряду твердокрилих, комах-шкідників ряду лускокрилих та комах-шкідників ряду напівтвердокрилих, включаючи будь-який білок, що проявляє пестицидну або інгібуючу активність по відношенню до комах, якщо вирівнювання такого білка з ТІС5290 призводить до ідентичності амінокислотної послідовності будь-якого відсотка фракції від близько 65 до близько 100 відсотків.

І0034| Термін "сегмент" або "фрагмент" використовується в даній заявці для опису безперервних послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот, які коротше ніж повна амінокислотна або нуклеотидна послідовність, що описує білок ТІС5290 або пов'язаний з ним член сімейства інсектицидних білків. Сегмент або фрагмент, що виявляє інгібуючу активність відносно комах, також розкрито в даній заявці, якщо вирівнювання такого сегмента або фрагмента з відповідною ділянкою білка ТІС5290, викладеним в ЗЕО ІЮ МО: 2, призводить до ідентичності амінокислотної послідовності будь-якого відсотка фракції від близько 65 до близько 100 відсотків між сегментом або фрагментом і відповідною ділянкою білка ТІС5290. 0035) В контексті даної заявки терміни "активна" або "активність", "пестицидна активність" або "пестицидна" або "інсектицидна активність", "інгібітор по відношенню до комах" або "Інсектицидна" відносяться до ефективності токсичної речовини, такої як білок-токсин, в інгібуванні (інгібуванні росту, харчування, плодючості або життєздатності), пригніченні (пригніченні росту, годування, плодючості або життєздатності), боротьбі (боротьбі з ураженням комахами-шкідниками, контролі інтенсивності харчування комах-шкідників на певній культурі, що містить ефективну кількість білка ТІС5290), або знищенні (що викликає захворюваність, смертність або зниження плодючості) шкідника. Ці терміни покликані включати результат забезпечення пестицидно ефективної кількості токсичного білка для шкідника, при якій надання шкіднику токсичного білка призводить до захворюваності, смертності, зниження плодючості або затримки росту. Дані терміни також включають відлякування шкідника від рослини, тканини рослини, частини рослини, насіння, рослинних клітин або від конкретного географічного місця розташування, причому рослина може рости, в результаті забезпечення пестицидно ефективної кількості токсичного білка в або на рослині. Загалом, пестицидна активність відноситься до здатності токсичного білка бути ефективним в інгібуванні росту, розвитку, життєздатності, кормової поведінки, шлюбної поведінки, плодючості або будь-якого зниження, що може бути виміряне, викликаного несприятливими ефектами, в зв'язку з надходженням в раціон комахи даного білка, фрагмента білка, сегмента білка або полінуклеотиду, конкретному цільовому шкіднику, включаючи, але не обмежуючись ними, комах ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих. Токсичний білок може бути вироблений рослиною або може бути застосований до рослини або до навколишнього середовища в тому місці, де знаходиться рослина. Терміни "біоактивність", "ефективний", "дієвий" або їх варіації також є термінами, які взаємозамінно використовуються у даній заявці, для опису впливу білків даного винаходу на цільових комах-шкідників.

І0036| Пестицидно ефективна кількість токсичної речовини, забезпечена в раціоні цільового шкідника, проявляє пестицидну активність при контакті токсичної речовини з шкідником.

Токсична речовина може бути пестицидним білком або одною, або більше хімічною речовиною, відомою в даній галузі техніки. Пестицидні або інсектицидні хімічні речовини і пестицидні або інсектицидні білкові агенти можуть бути використані окремо або в поєднанні один з одним.

Хімічні речовини включають, але без обмежень, молекули длРНК, націлені на специфічні гени для придушення в цільовому шкіднику, органохлориди, органофосфати, карбамати, піретроїди, неонікотиноїди та ріаноїди. Пестицидні або інсектицидні білкові агенти включають білкові токсини, викладені в даній заявці, а також інші білкові токсичні речовини, включаючи ті, які націлені на види-шкідники ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих, а також білкові токсини, які використовуються для боротьби з іншими шкідниками рослин, такі як білки

Сгу, доступні в даній галузі техніки для застосування у боротьбі з видами ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих. (00371 Передбачається, що посилання на шкідника, особливо шкідника сільськогосподарської рослини, означає шкідників культурних рослин, особливо тих шкідників, 60 які контролюються білком ТІС5290. Однак, посилання на комаху-шкідника може також включати б комах-шкідників ряду рівнокрилих, а також нематод і грибів за умов, коли токсичні речовини, націлені на цих шкідників, спільно локалізуються або присутні разом з білком ТІС5290 або білком, який має від близько 65 до близько 100 відсотків ідентичності з ТІС5290. 0038) Інсектицидні білки, класу білкових токсинів ТІС5290 пов'язані спільною функцією і проявляють інсектицидну активність по відношенню до комах-шкідників з видів ряду твердокрилих і лускокрилих комах, в тому числі дорослих особин, лялечок, личинок і новонароджених, а також представників ряду напівтвердокрилих, в тому числі дорослих особин і німф.

Ї0039| Комахи ряду лускокрилих, включають, але без обмежень, совок лугових, совок, п'ядунів, і совок з родини Мосіцідає, наприклад, кукурудзяну листову совку (5родорієга їтидірегда), совку помідорову (Зродоріега ехідча), совку латукову (Матевзіга сопіїдигайа), південну совку (Зродоріеєга егідапіа), совку-іпсилон (Адгоїїз5 ірзіоп), совку капустяну (Тгіспоріивіа пі), соєву совку (Рзецйдоріивіа іпсійдепв5), совку оксамитових бобів (Апіїсагсіа деттаїйаїї5), совку конюшинну (Нурепа 5сабга), тютюнову листовійку (Неїїоїйі5 мігезсеп5), совку бавовняну (Адгоїї5 зибБіегапеа), совку лугову (РзецйдаІейа ипірипсіа), совку прямокутну (Адгоїї5 огіподопіа); точильників, чохлоносок, метеликів, вогнівок шишкових, гусениць метелика капустянки і піроморфід з родини Ругаїїдає, наприклад, метелика стеблового кукурудзяного (Оз5ігіпіа пибріїа|й5), метелика-вогнівку (Атуеїоїі5 їгапзпеїПа), кукурудзяну вогнівку (Статриз саїїдіпозеПив5), лучного метелика (Негре(одгатіта Ісагвізаїі5), вогнівку соняшникову (Нотоеозота еїесіеПит), точильника зернового кукурудзяного (ЕІазтораїри5 ІдпозеПи5); листовійок, димчастих листовійок, плодожерок і плодових листовійок з родини Тогігісідае, наприклад, плодожерку яблуні (Судіа ротопеїІа), листовійку виноградну (Епдорі;а міеапа), листовійку східну (сгарпоїйна тоїевзіа), листовійки соняшнику (Зцйіеїта ПеїЇапіпапа); і багатьох інших економічно важливих лускокрилих, наприклад, капустяну міль (Рішейа хуїЇозіейа), рожевого коробкового хробака (Ресііпорпога доззурієЇІа) і шовкопряда непарного (І утапігіа аізраг). Комахи ряду лускокрилих включають, наприклад, совку бавовняну американську (АІабата агодіасеа), листовійку плодових дерев (Агспір5 агодугозріїа)», листовійку розанова (Агспір5 гозапа) та інших представників листовійок, (Спо зирргеззаїїх, вогнівку стеблову азіатську або жовту рисову вогнівку), листовійку рисову (Спарпаіосгосіє теадіпаїі5), блішку довговусу (Статбрив5 саїїдіпозеПив5),

Зо гусеницю тонконога (Стгатбри5 егегтеїйй5), вогнівку кукурудзяну південно-західну (Оіаїгаєа дгапаїозе|Ма), очеретяну вогнівку (Оіаїгаєа 5асспагаїї5), совку бавовняну єгипетську (Еагіаб5 іп5шапа), совку плямисту (Еагіаз міЩШейа), совку американську (Неїїсомегра аптідега), американську кукурудзяну совку (Неїїсомегра 7єа, також відому як совка бавовняна), тютюнову листовійку (Неїйоїпіб5 мігезсеп5), метелика лугового (Негре(одгатта Іісагвізаїї5), листовійку виноградну (ІГорезіа роїгапа), цитрусову мінуючу міль (РпуїЇоспівїі5 сігеПа), білявку капустяну (Рієгіє ргазвзісає), білявку ріпну (Рієгі5 гарає, також відому як ріпниця), капустяну міль (РішеїІа хуїохіеПа), совку бурякову (Зродорієга ехідца), тютюнову совку (5родоріега Ійига, також відому як тютюновий озимий черв'як) і томатну мінуючу міль (Тша арзоїша). 0040) Комахи ряду твердокрилих включають, але без обмежень, Адгіоїе5 5рр., Апіпопотив 5рр., Аютаїгїіа Ііпеагі5, Спавіоспета іріаійє, Соб5тороїйевз 5рр., Сигсшііо в5рр., Оептезіє5 в5рр.,

Оіабгоїїса 5рр., Ерпіаснппа 5рр., Егетпив5 5рр., І еріїпоїагїза десетіїпеаїа, Іівзогпоріги5 5рр.,

Меїпоіопіна 5рр., Огусаєрнійшв врр., Сбогпупсниз зрр., РНіусіїпив 5рр., Роріїйа 5рр., РзуїПодез врр.,

КПігорегійа 5рр., Ззсагареіїдає, Зпйорпійи5 5рр., Зпйоїгода 5рр., Тепебгіо 5рр., Тгіроїйшт 5рр. та

Тгододепта 5рр, зокрема, в яких шкідником є західний кукурудзяний жук (Оіабгоїїса мігдітега,

МУСК), північний кукурудзяний жук (Оіабгоїїса рагрегі, МОСК), мексиканський кукурудзяний жук (Оіаргоїїса мігуїєга 7еає, МОСК), бразильський кукурудзяний жук (Оіабгоїїса Бранеага, ВАК), південний кукурудзяний жук (Оіаргоїїса ипадесітрипсіайа ПпПоучлагаїй, ЗСК) і група бразильського кукурудзяного жука (ВСЕ, що складається з Оіабгоїса мігідша та Оіаргоїйса 5ресіовза). 0041) Комахи ряду напівтвердокрилих включають, але без обмежень, сліпняка західного матового (Гуди5 Ппезреги5), клопа трав'яного (Гуди5 Ііпеоіагіє) та бавовняного сліпняка (Реєидаютозсеїїв 5егіацшв). 0042) В контексті даної заявки термін "ізольована молекула ДНК" або еквівалентний термін або фраза означає, що молекула ДНК є молекулою ДНК, яка присутня окремо або в комбінації з іншими композиціями, але не в її природному середовищі. Наприклад, елементи нуклеїнової кислоти, такі як кодуюча послідовність, інтронна послідовність, нетрансльована лідерна послідовність, промоторна послідовність, термінуюча послідовність транскрипції тощо, які, природно, знаходяться в ДНК геному організму, не вважаються "виділеними" до того часу, поки елемент знаходиться в геномі організму і в тому місці геному, в якому він зустрічається в природі. Проте, кожен з цих елементів і їх частини були б "виділені" в рамках даного опису за бо умови, якщо елемент не знаходиться всередині геному організму і не в тому місці в геномі, в якому він зустрічається в природі. Точно так само нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок або будь-який інсектицидний варіант цього білка, що зустрічається в природі, буде виділеною нуклеотидною послідовністю, якщо нуклеотидна послідовність не знаходиться у ДНК бактерії, в якій природним чином знаходиться послідовність, що кодує білок.

Синтетична нуклеотидна послідовність, що кодує амінокислотну послідовність природного інсектицидного білка, буде вважатися виділеною для цілей даного опису. Для цілей даного опису будь-яка трансгенна нуклеотидна послідовність, тобто, нуклеотидна послідовність ДНК, вбудована в геном клітин рослини чи бактерії або присутня у позахромосомному векторі, буде вважатися виділеною нуклеотидною послідовністю незалежно від того, чи присутня вона в плазміді або подібній структурі, що використовується для трансформації клітин, в геномі рослини або бактерії, або присутня в тканинах, нащадках, біологічних зразках або товарах, отриманих з рослини або бактерії, у кількостях, що можуть бути виявлені. 0043) Як описано далі в даному документі, відкрита рамка зчитування (ВРЗ), що кодує

ТІС5290 (5ЕБЕО ІЮ МО: 1), була виявлена в ДНК, що отримана зі штаму Ебб657 ВасйШив5

Іигіпдіепбіз. Кодуючу послідовність клонували та експресували в мікробних клітинах- господарях для одержання білка (ЗЕО ІЮ МО: 2), що використовується в біологічних аналізах.

Найближчим гомологом токсину ТІС5290 є білок Мір4Аа з ідентичністю послідовності 56,9 95, що вказує на те, що ТІС5290 є новою підродиною Мір4. Біологічний аналіз з використанням білків

ТІС5290, отриманих з мікробних клітин-господарів, продемонстрував активність проти шкідника ряду твердокрилих західного кукурудзяного жука (Оіабгоїїса мігудіїєга мігудіїега, МУСК); видів лускокрилих - кукурудзяної листової совки (Зродоріеєга ІПидірегда, БАМ/), американської кукурудзяної совки (Неїїсомегра 7еа, СЕММ), метелика стеблового кукурудзяного (О5ігіпіа пибріїйайб) та капустяної молі (РішейПа хуїоб5іеМПа); а також шкідника ряду напівтвердокрилих сліпняка західного матового (І уди5 пезрегив).

І0044| Передбачається, що додаткові послідовності білка-токсину, пов'язані з ТІС5290, можуть бути створені з використанням природної амінокислотної послідовності ТІС5290 для створення нових білків з новими властивостями. Білок-токсин ТІС5290 може бути вирівняний з іншими білками, подібними до ТІС5290, з метою об'єднання відмінностей на рівні амінокислотної послідовності для нових варіантів амінокислотних послідовностей і внесення відповідних змін до послідовність рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує варіанти.

Ї0045| Додатково слід мати на увазі, що поліпшені варіанти ТІС5290 можуть бути сконструйовані іп ріапіа з використанням різних способів генної інженерії, відомих в даній галузі техніки. Такі технології, що використовуються в генній інженерії, включають, але без обмежень, 2ЕМ (нуклеазу з цинковими пальцями), мегануклеази, ТАГЕМ (ефекторні нуклеази, подібні активаторам транскрипції) та системи СКІ5РК (кластерні короткі паліндромні повтори, розділені регулярними проміжками)/Са5 (СКІ5РЕ асоційовані). Такі способи генної інженерії можуть бути використані для зміни кодуючої послідовності білка-токсину, що трансформована в рослинну клітину, в іншу послідовність, що кодує токсин. Зокрема, за допомогою цих способів один або більше кодонів в кодуючій послідовності токсину змінюються з метою розробки нової білкової амінокислотної послідовності. В альтернативному варіанті, фрагмент в межах кодуючої послідовності замінюється або видаляється, або додаткові фрагменти ДНК вставляються в кодуючу послідовність для створення нової кодуючої послідовності токсину. Нова кодуюча послідовність може кодувати білок-токсин з новими властивостями, такими як підвищена активність чи збільшений спектр проти комах-шкідників, а також забезпечувати активність проти видів комах-шкідників, які розвинули стійкість проти вихідного білка-токсину. Рослинна клітина, яка містить редаговану послідовність гена токсину, може бути використана, за допомогою способів відомих в даній галузі техніки, для отримання цілих рослин, що експресують новий білок-токсин. (0046) Також передбачається, що фрагменти білка ТІС5290 або його варіанти, можуть бути вкороченими формами з інгібуючою активністю по відношенню до комах, в яких одна або більше амінокислот видаляються з М-кінця, С-кінця, середини білка, або їх комбінацій. Ці фрагменти можуть бути природного походження або синтетичними варіантами ТІС5290 або варіантами похідного білка, але повинні зберігати інгібуючу активність ТІС5290 по відношенню до комах.

І0047| Білки, що нагадують білок ТІС5290, можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння один з одним з використанням різних комп'ютерних алгоритмів, відомих в даній галузі техніки.

Наприклад, ідентичність амінокислотних послідовностей білків, пов'язаних з ТІС5290, може бути проаналізована з використанням вирівнювання Сіивіа! М/ з використанням даних параметрів за замовчуванням: Матриця порівняння: Біозит, штраф на внесення делеції у вирівнювання: 10,0, 60 штраф на подовження делеції: 0,05, гідрофільні делеції: Увімк., гідрофільні залишки:

СРБМООБЕКК, штраф на залишкоспецифічні делеції: Увімк. (Тпотрзоп, та співавт. (1994)

Мисівїс Асіа5 Незеєагси, 22: 4673-4680). Відсоток ідентичності амінокислот далі розраховується у вигляді виразу 100 95 помножених на (ідентичності амінокислот/довжина шуканого білка). Інші алгоритми вирівнювання також доступні в даній галузі техніки і забезпечують результати, аналогічні тим, що отримані з використанням вирівнювання Сіизіа! МУ. (0048) Передбачається, що білок, який проявляє інгібуючу активність по відношенню до видів комах ряду лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих, є пов'язаним з ТІС5290, якщо вирівнювання такого шуканого білка з ТІС5290 демонструє, щонайменше, від 65 95 до 100 95 ідентичності амінокислот по довжині шуканого білка, що становить близько 65 95, 66 95, 67 Фо, 68 95, 69 96, 70 90, 7590, 769, 77 Чо, 78 90, 79 У, 80 Ус, 81 У, 82 У, 83 У, 84 Ус, 85 У, 85 У, 8796, 8896, 8995, 9095, 91 95, 92965, 93595, 94 95, 95590, 9695, 97 95, 9890, 9996, 100 9о ідентичності амінокислотній послідовності (або будь-який відсоток в даному діапазоні) між шуканим і досліджуваним білком. 0049) Білок ТІС5290 також може бути пов'язаний первинною структурою (консервативні амінокислотні мотиви), довжиною (близько 937 амінокислот) та іншими характеристиками.

Біоінформаційний аналіз показує, що ТІС5290 є пороутворюючим білком, має домен РА14 Ріат (РЕО7691), який, ймовірно, залучений у зв'язування з клітинним рецептором(ами) в шлунку цільового комахи, домен знаходиться в позиції амінокислот з 16 по 140 амінокислоту, а потім розташований домен Віпагу їохВ Ріат (РЕОЗ3495) в позиції амінокислот з 186 по 593, що може сприяти утворенню бета-складчастої трансмембранної пори. Обидва цих Ріат, ймовірно, сприяють інсектицидній активності білка. Характеристики білкового токсину ТІС5290 представлені в таблиці 1.

Таблиця 1

Окремі характеристики білка ТІС5290.

Кількість о. о. о.

Мопекулярна Амінокислотна | Ізоелектрична | Заряд при РН |сильноосновни Кількість . Кількість Кількість маса (в сильнокислих | гідрофобних полярних ее БП, тата и м ях ЛЖВ,

ЇОО50О| Як описано далі в прикладах даної заявки, послідовності молекул рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодують ТІС5290, були сконструйовані для застосування в рослинах.

Ілюстративна, оптимізована для рослин, послідовність молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТІС5290, яка була сконструйована для застосування в рослинах, викладена в 5ЕО ІЮО МО: 3.

Зо І0051| Експресійні касети і вектори, що містять ці синтетичні послідовності нуклеїнової кислоти, можуть бути сконструйовані та введені в клітини рослин кукурудзи, сої, бавовнику або клітини інших рослин відповідно до способів та методик трансформації, що відомі в даній галузі техніки. Наприклад, опосередкована Адгобасіегішттрансформація описана в публікаціях патентної заявки США 2009/0138985А1 (соя), 2008/0280361А1 (соя), 2009/0142837А1 (кукурудза), 2008/0282432 (бавовник), 2008/0256667 (бавовник), 2003/0110531 (пшениця), 2001/0042257 А1 (цукрові буряки), патентах США Мо 5,750,871 (канола), 7,026,528 (пшениця) і 6,365,807 (рис), та в Агепсіріа та співавт. (1998) Тгапздепіс Ке5. 7:213-222 (цукрова тростина) повний зміст яких включено в даний документ за допомогою посилання. Трансформовані клітини можуть бути відтворені у трансформовані рослини, які експресують ТІС5290 та демонструють пестицидну активність за допомогою біологічних аналізів, що проводяться в присутності личинок шкідників ряду лускокрилих або напівтвердокрилих, що використовують листові диски, отримані з трансформованих рослин. Для випробування пестицидної активності до шкідників ряду твердокрилих, трансформовані рослини генерації Ко та БГ1 використовувалися в аналізі впливу шкідника на корінь, як описано в прикладі нижче. 00521 В якості альтернативи традиційним способам трансформації, послідовність ДНК, така як трансгени, експресійна касета(-ти) тощо, може бути вставлена або інтегрована в конкретний сайт або локус в геномі рослини або рослинної клітини через сайт-спрямовану інтеграцію.

Таким чином, конструкт(-ти) рекомбінантної ДНК та молекула(-и) даного опису можуть включати послідовність донорної матриці, що містить, щонайменше, один трансген, експресійну касету або іншу послідовність ДНК для вставки в геном рослини або рослинної клітини. Така донорна матриця для сайт-спрямованої інтеграції може додатково включати одне або два гомологічних "плеча", що фланкують послідовність вставки (тобто, послідовність, трансген, касету тощо, які повинні бути вставлені в рослинний геном). Конструкт(-ти) рекомбінантної ДНК даного опису може додатково містити експресійну касету(-ти), що кодує сайт-специфічну нуклеазу та/або будь-який пов'язаний білок(-ки) для здійснення сайт-спрямованої інтеграції. Така касета(-ти), що експресує нуклеазу, може бути присутня в тій же молекулі або векторі, що й донорна матриця (в цис) або на окремій молекулі або векторі (в транс). У даній галузі техніки відомо декілька способів сайт-спрямованої інтеграції за участю різних білків (або комплексів білків та/або провідної РНК), які ріжуть геномну ДНК для отримання дволанцюгового розриву (ДЛР, Ю5В- доцбіе б5ігапа ргеаКк) або ніка на бажаному геномному сайті або локусі. Як зрозуміло з рівня техніки, в процесі репарації ДЛР або ніка, утворених ферментом нуклеази, ДНК донорної матриці може інтегруватися в геном в місці ДЛР або ніка. Наявність гомологічного "плеча"(-чей) у донорній матриці може сприяти впровадженню та націлюванню послідовності вставки в геном рослини під час процесу репарації за допомогою гомологічної рекомбінації, хоча вставка може відбуватися за допомогою негомологічного з'єднання кінців (МНЕО-поп-потоіодоиз епа |іоіпіпо).

Прикладами використовуваних сайт-специфічних нуклеаз є нуклеази з цинковими пальцями, сконструйовані або нативні мегануклеази, ТАЇ Е-ендонуклеази та керовані за допомогою РНК- гідів ендонуклеази (наприклад, Са5з9 або Ср). Для способів використання керованих за допомогою РНК-гідів сайт-специфічних ендонуклеаз (наприклад, Са59 або Ср), конструкт(-ти) рекомбінантної ДНК також буде містити послідовність, що кодує одну або більше провідна РНК (дціде ЕМА) для направлення нуклеази на бажану ділянку в геномі рослини. 0053 Розглядаються композиції молекул рекомбінантної нуклеїнової кислоти, які кодують

ТІС5290. Наприклад, білок ТІС5290 може експресуватися конструктами рекомбінантної ДНК, в яких молекула полінуклеотиду з ВРЗ (відкритої рамки зчитування), що кодує білок, функціонально пов'язана з елементами генетичної експресії, такими як промотор та будь-який інший регуляторний елемент, необхідний для експресії в системі для якої призначений даний конструкт. Приклади без обмежень включають функціональний промотор рослини, функціонально пов'язаний з кодуючими послідовностями білка ТІС5290, для експресії білка в рослинах, або Ві-функціональний промотор, функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю білка ТІС5290, для експресії білка в ВІ бактерії або інших видах роду Васіїїш5. Інші елементи можуть бути функціонально пов'язані з кодуючими послідовностями білка ТІС5290, включаючи, але не обмежуючись ними, енхансери, інтрони, нетрансльовані лідери, кодовані білкові іммобілізаційні мітки (гістидинові мітки), транслокаційні пептиди (тобто, пластидні транзитні пептиди, сигнальні пептиди) поліпептидні послідовності для посттрансляційних модифікаційних ферментів, сайти зв'язування рибосом і сайти-мішені РНКІі. Типові рекомбінантні полінуклеотидні молекули, представлені в даному документі, включають, але без обмежень, гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, таким як

ЗБЕО ІЮ МО: 1 та 5ЕБЕО ІЮО МО: 3, який кодує поліпептид або білок, що має амінокислотну послідовність викладену в ЗЕО ІЮ МО: 2. Гетерологічний промотор також може бути функціонально пов'язаний із синтетичними кодуючими послідовностями ДНК, що кодують

ТІС5290, націлений на пластид, та ненацілений ТІС5290. Кодони молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодують білок, описаний в даному документі, можуть бути замінені синонімічними кодонами (відомі в даній галузі техніки як мовчазні заміни (5ієепі зиБ5ійШшоп)). 0054) Конструкт рекомбінантної ДНК, що містить послідовність, яка кодує білок ТІС5290, може додатково містити область ДНК, яка кодує одну або більше речовин, що володіють інгібуючою активністю по відношенню до комах, що можуть бути сконструйовані для одночасної експресії або коекспресії з послідовністю ДНК, що кодує білок ТІС5290, білок відмінний від білка

ТІС5290, молекулу длРНК, що володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, або допоміжний білок. Допоміжні білки включають, але без винятків, кофактори, ферменти, партнери по зв'язуванню або інші агенти, які сприяють підвищенню ефективності агента, що володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, наприклад, сприяючи його експресії, впливаючи на його стабільність в рослинах, оптимізуючи вільну енергію для олігомеризації, збільшуючи його токсичність та збільшуючи спектр його активності. Допоміжний білок може полегшувати захоплення однієї або більше речовин, що володіють інгібуючою активність по відношенню до комах, наприклад, або посилювати токсичну дію токсичної речовини. 0055) Конструкт рекомбінантної ДНК можна збирати так, щоб всі білки або молекули длРНК були експресовані з одного промотора, або кожен білок або молекула длРНК експресувалися під контролем окремого промотора, або в певній їх комбінації. Білки відповідно до даного винаходу можуть бути експресовані з мультигенної системи експресії, в якій білок ТІС5290 експресується із загального нуклеотидного сегмента, який також містить інші відкриті рамки зчитування та промотори, в залежності від обраного типу системи експресії. Наприклад, 60 мультигенна система експресії рослин може використовувати єдиний промотор для керування експресією багатократнопов'язаних/тандемних відкритих рамок зчитування з одного оперона. В іншому прикладі мультигенна система експресії рослин може використовувати багатократно непов'язані експресійні касети, кожна з яких експресує інший білок або інший агент, такий як одна або більше молекул длРНК. 0056) Рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти або конструкції рекомбінантної ДНК, що містять послідовність, яка кодує білок ТІС5290, можуть бути доставлені в клітини-господарі векторами, наприклад, плазмідою, бакуловірусом, синтетичною хромосомою, віріоном, космідою, фагмідою, фагом або вірусним вектором. Такі вектори можуть бути використані для досягнення стабільної або транзієнтної експресії послідовності, що кодує білок ТІС5290, в клітині-сосподарі, або більш пізньої експресії поліпептиду, що кодується. Екзогенний рекомбінантний полінуклеотид або конструкт рекомбінантної ДНК, який містить послідовність, що кодує білок ТІС5290, і який вводиться в клітину-господаря, згадується в даному документі як "трансген".

І0057| В даному документі представлені трансгенні бактерії, трансгенні клітини рослин, трансгенні рослини і частини трансгенних рослин, які містять рекомбінантний полінуклеотид, який експресує будь-яку одну або більше з кодуючих послідовностей білка ТІС5290. Термін "бактеріальна клітина" або "бактерія" може включати, але без обмежень, клітину Адгобасіегішт,

Васійи5, Езспегіспіа, ЗаІтопеїПа, Рзенидотопах або КПі2обішт. Термін "клітина рослини" або "рослина" може включати, але без обмежень, клітину дводольної рослини або клітину однодольної рослини. Розглянуті рослини і клітини рослин включають, але без обмежень, клітину або рослину люцерни, банана, ячменю, бобів, броколі, капусти, Вгаввзіса, моркви, маніоки, рицини, цвітної капусти, селери, нуту, китайської капусти, цитрусових, кокосової пальми, кави, кукурудзи, конюшини, бавовника, гарбузових, огірка, Дугласової ялиці, баклажана, евкаліпта, льону, часника, винограду, хмелю, цибулі порею, салату-латуку, сосни ладанної, проса, дині, волоського горіха, вівса, оливи, цибулі, декоративної рослини, пальми, трави пасовиська, гороху, арахісу, перцю, голубиного гороху, сосни, картоплі, тополі, гарбуза, сосни променистої, редису, ріпаку, рису, кореневищних злаків, жита, американського шафрану, чагарника, сорго, південної сосни, сої, шпинату, кабачка, полуниці, цукрових буряків, цукрової тростини, соняшника, солодкої кукурудзи, амбрового дерева, солодкої картоплі, проса

Зо прутовидного, чаю, тютюну, томату, тритикале, дернової трави, кавуна і пшениці. У деяких варіантах реалізації винаходу представлені трансгенні рослини та частини трансгенних рослин, які регенерували з трансгенної рослинної клітини. У деяких варіантах реалізації винаходу трансгенні рослини можуть бути отримані з трансгенного насіння шляхом розрізання, зривання, подрібнення або іншого відділення частини від рослини. В окремих випадках реалізації винаходу частина рослини може бути насінням, коробочкою, листом, квіткою, стеблом, коренем або будь-якою його частиною або частиною, що не регенерує, трансгенної частини рослини. Як використовується в даному контексті, частина трансгенної частини рослини, що "не регенерується" є частиною, яка не може бути індукована для утворення цілої рослини або яка не може бути індукована для утворення цілої рослини, здатної до статевого та/або безстатевого розмноження. У деяких варіантах реалізації винаходу частина відібраної частини рослини, що не регенерується, є частиною трансгенного насіння, коробочки, листа, квітки, стебла або кореня.

Ї0058| Наведено способи отримання трансгенних рослин, які містять інгібуючі по відношенню до комах ряду твердокрилих, лускокрилих і напівтвердокрилих кількості білків

ТІС5290. Такі рослини можуть бути отримані шляхом введення рекомбінантного полінуклеотиду, який кодує білок ТІС5290, передбачений в даній заявці, у рослинну клітину і відбору рослини, отриманої з вказаної рослинної клітини, яка експресує інгібуючу по відношенню до комах ряду твердокрилих, лускокрилих і напівтвердокрилих кількість білків

ТІС5290. Рослини можуть бути отримані з рослинних клітин шляхом регенерації, з насіння, пилку або меристеми, отриманих способами трансформації. Способи трансформації рослин відомі в даній галузі техніки. 0059) Оброблені рослинні продукти, причому процесований продукт містить білок ТІС5290, у кількості, що може бути виявленою, сегменти і фрагменти, що володіють інгібіторною активністю по відношенню до комах, або його фрагмент або будь-яку його відмінну частина, також описані в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу оброблений продукт вибирають з групи, що складається з частин рослини, біомаси рослин, масла, борошна, цукру, корму для тварин, борошна, пластівців, висівок, пуху, шкірки, обробленого насіння і насіння. В окремих випадках реалізації винаходу оброблений продукт є таким, що не регенерується.

Рослинний продукт може включати товар або інші комерційні продукти, отримані з трансгенної 60 рослини або частини трансгенних рослин, причому товар або інші продукти можна відстежити шляхом виявлення нуклеотидних сегментів або експресованих РНК або білків, які кодують або містять частини білка ТІС5290, що відрізняються.

ІЇ0060| Рослини, які експресують білок ТІС5290, можна схрещувати шляхом селекції з трансгенними об'єктами, що експресують інші білки-токсини та/або інші трансгенні ознаки, такі як гени стійкості до гербіцидів, гени, що підвищують врожайність або стійкість до стресу тощо, або ознаки можуть бути об'єднані в одному векторі, так що всі ознаки будуть пов'язані між собою.

ЇОО61| Як описано далі в прикладах, синтетичні або штучні послідовності, що кодують

ТІС5290, які були призначені для використання в рослинах, викладені в ЗЕО ІЮО МО: 3. 00621 Для експресії в рослинних клітинах білок ТІС5290 може експресуватися так, щоб він знаходився в цитоплазмі або був націлений на різні органели рослинної клітини. Наприклад, націлювання білка на хлоропласт може призводити до збільшення рівнів експресованого білка в трансгенній рослині, запобігаючи появі ознак інших фенотипів. Націлювання може також призводити до підвищення резистентності до шкідників у трансгенного об'єкта. Цільовий пептид або транзитний пептид є коротким пептидним ланцюгом (довжиною 3-70 амінокислот), який спрямовує транспортування білка в певну область клітини, включаючи ядро, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум (ЕР), хлоропласт, апопласт, пероксисому та плазматичну мембрану. Деякі сигнальні пептиди відщеплюються від білка під дією сигнальної пептидази після транспортування білків. Для націлювання на хлоропласт, білки містять транзитні пептиди, які містять близько 40-50 амінокислот. Для опису застосування транзитних пептидів хлоропласта, див. патенти США Мо 5,188,642 та 5,728,925. Багато локалізованих на хлоропласті білків експресуються з ядерних генів як попередники та націлені на хлоропласт транзитним пептидом хлоропласта (ТПХ). Приклади таких виділених білків хлоропласту включають, але без обмежень, такі що пов'язані з малою субодиницею (МСУ) рибулозо-1,5,- бісфосфаткарбоксилази, фередоксином, фередоксин-оксидоредуктазою, білком І та білком ІЇ світлозбирального комлексу, тіоредоксином Р, 5-енолпіруват -шикімат-З3-фосфатсинтазою (ЕПШФС) та транзитними пептидами, що описані в патенті США Мо 7,193,133. В умовах іп мімо та іп міго було продемонстровано, що нехлоропластні білки можуть бути націлені на хлоропласт з використанням білкових гібридів з гетерологічним ТПХ і що наявності ТІПХ досить для

Зо націлювання білка на хлоропласт. Включення відповідного хлоропластного транзитного пептиду, такого як ЕПШФС ТПХ Агабрідорзіх Іпаіапа (ТПХ2) (див., Кіее та співавт., Мої. (еп.

Сепеї. 210:437-442, 1987) або ЕПШФС ТПХ Реїйшпіа пургічза (ТПХ4) (див., деПа-Сіорра та співавт., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 83: 6873-6877, 1986) було показано, що вони націлюють гетерологічні послідовності біла ЕПШФС на хлоропласти в трансгенних рослинах (див., патенти США Мо 5,627,061; 5,633,435; та 5,312,910; та ЕР 0218571; ЕР 189707; ЕР 508909; та ЕР 924299). Для націлювання білка ТІС5290 на хлоропласт, послідовність, що кодує транзитний пептид хлоропласта, розташована 5' у функціональному зв'язку та в рамці до синтетичної кодуючої послідовності, що кодує білок ТІС5290, який був сконструйований для оптимальної експресії в рослинних клітинах.

І0063| Експресійні касети і вектори, що містять дані синтетичні або штучні нуклеотидні послідовності, можуть бути сконструйовані і введені в клітини рослин кукурудзи, бавовни та сої відповідно до способів і методик трансформації, які відомі в даній галузі техніки.

Трансформовані клітини регенерували в трансформовані рослини, які, як було виявлено, експресували ТІС5290. Для перевірки пестицидної активності, біологічне тестування проводили в присутності шкідників ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих.

ІЇ0064| Послідовності, що кодують білок ТІС5290, та послідовності, які мають значну відсоткову ідентичність з ТІС5290, можуть бути ідентифіковані з використанням способів, що відомі фахівцям в даній галузі техніки, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), термічна ампліфікація та гібридизація. Наприклад, білок ТІС5290 може бути використаний для отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з подібними білками і можуть бути використані для скринінгу та пошуку інших білків, які тісно пов'язані. 0065) Крім того, нуклеотидні послідовності, що кодують білок-токсин ТІС5290, можуть бути використані в якості зондів і праймерів для скринінгу та ідентифікації інших членів класу з використанням способів термоциклічної або ізотермічної ампліфікації та гібридизації.

Наприклад, олігонуклеотиди, отримані з послідовності, як вказано в 5ЕО ІЮ МО: 3, можуть бути використані для встановлення присутності або відсутності трансгена ТІС5290 в зразку дезоксирибонуклеїнової кислоти, отриманої з товарного продукту. З огляду на чутливість певних способів виявлення нуклеїнових кислот, які використовують олігонуклеотиди, передбачається, що олігонуклеотиди, отримані з послідовності, як вказано в ЗЕО ІЮО МО: 3, бо можуть бути використані для виявлення трансгена ТІС5290 в товарних продуктах, отриманих з об'єднаних джерел, де тільки частина товарного продукту отримана з трансгенної рослини, що містить БЕО ІЮ МО: 3. Крім того, визнано, що такі олігонуклеотиди можуть бути використані для введення зміни послідовності нуклеотидів в зХЕО ІЮО МО: 3. Такі "мутагенезні" олігонуклеотиди є корисними для ідентифікації варіантів амінокислотної послідовності ТІС5290, що проявляють діапазон інгібуючої активності по відношенню до комах або різну експресію в клітинах- господарях трансгенної рослини. 0066) Гомологи нуклеотидної послідовності, наприклад, інсектицидні білки, які кодуються нуклеотидними послідовностями, що гібридизуються з кожною або будь-якою з послідовностей, розкритих в даній заявці в умовах гібридизації, також є варіантом реалізації даного винаходу.

Винахід також відноситься до способу виявлення першої нуклеотидної послідовності, яка гібридизується з другою нуклеотидною послідовністю, причому перша нуклеотидна послідовність (або її зворотна комплементарна послідовність) кодує пестицидний білок або його пестицидний фрагмент і гібридизується в жорстких умовах гібридизації з другою нуклеотидною послідовністю. В такому випадку друга нуклеотидна послідовність може бути нуклеотидною послідовністю, що представлена як ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 3 в жорстких умовах гібридизації. Кодуючі нуклеотидні послідовності гібридизуються одна з одною у відповідних умовах гібридизації, а білки, які кодуються цими нуклеотидними послідовностями, перехресно реагують з антисироваткою до будь-якого з інших білків. Жорсткі умови гібридизації, як визначено в даному документі, включають, щонайменше, гібридизацію при 42" С з подальшими двома промивками протягом п'яти хвилин кожна при кімнатній температурі з 2 Х 55С, 0,1 Фо

ДСН, з подальшими двома промивками протягом 30 хвилин кожна при 65" С в 0,5 Х 5550,0,1 95

ДСН. Промивання за ще більш високих температур є ще більш жорсткими умовами, наприклад, умови гібридизації 68 "С з наступним промиванням при 68 "С, в 2 х 55С, що містить 0,1 95 ДСН.

І0067| Фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що через виродженість генетичного коду багато інших послідовностей здатні кодувати білки, подібні ТІС5290, і ці послідовності в тій мірі, в якій вони функціонують для експресії пестицидних білків або в штамах Васійи5 або в рослинних клітинах є варіантами реалізації даного винаходу, маючи на увазі, звичайно, що багато таких вироджених кодуючих послідовностей не будуть гібридизуватися в цих умовах з нативними послідовностями Васіїйи5, що кодують ТІС5290. Дана заявка розглядає застосування

Зо цих та інших способів ідентифікації, відомих фахівцям в даній галузі техніки, для ідентифікації послідовностей, що кодують білок ТІС5290 і послідовностей, що мають значну відсоткову ідентичність з послідовностями, що кодують білок ТІС5290. 0068) Також в даній заявці розкриті способи боротьби з комахами, зокрема, зараженнями культурних рослин лускокрилими або твердокрилими, або напівтвердокрилими комахами з використанням білка ТІС5290. Такі способи можуть включати вирощування рослини, що містить інгіібуючу по відношенню до комах ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих кількість білка-токсину ТІС5290. У деяких варіантах реалізації винаходу такі способи можуть додатково включати будь-яке одне або більше з: (І) нанесення будь-якої композиції, яка містять або кодує білок-токсин ТІС5290, на рослину або насіння, яке дає початок рослині; та (Ії) трансформацію рослини або клітини рослини, які дають початок рослині, полінуклеотидом, що кодує білок-токсин ТІС5290. Загалом, передбачається, що білок-токсин ТІС5290 може бути забезпечений в композиції, наявної в мікроорганізмі, або наявної в трансгенній рослині, для забезпечення інгібуючої активності по відношенню до комах ряду лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих. 0069) У деяких варіантах реалізації винаходу молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти білка-токсину ТІС5290 є інсектицидно активним інгредієнтом композиції, яка має інгібуючу активність по відношенні до комах, отриманої культивуванням рекомбінантної клітини Васіййи5 або будь-якої іншої рекомбінантної бактеріальної клітини, трансформованої з метою експресії білка-токсину ТІС5290 в умовах, що підходять для експресії білка-токсину ТІС5290. Така композиція може бути отримана шляхом висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, седиментації або концентрування культури таких рекомбінантних клітин, що експресують/продукують вказаний рекомбінантний поліпептид. Такий процес може призвести до утворення екстракту бактеріальних клітин, суспензії клітин, клітинного гомогенату, клітинного лізату, клітинного супернатанта, клітинного фільтрату або осадження клітин Васійи5 або іншого ентомопатогена. Отримавши таким чином сконструйований рекомбінантний поліпептид, створюють композицію, яка містить рекомбінантний поліпептид, може містити бактеріальні клітини, бактеріальні спори, а також параспоральні тільця і може поставлятися для різних застосувань, включаючи продукти-спреї, що володіють інгібуючою активністю по відношенні до сільськогосподарських комах або препарати кормової біомаси, що володіють 60 інгібуючою активністю по відношенні до комах в кормових біологічних тестах.

І0070| В одному варіанті реалізації винаходу для зниження ймовірності розвитку резистентності, композиція, що володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, що містить ТІС5290, може додатково містити, щонайменше, один додатковий поліпептид, який проявляє інгібуючу активність проти тих же видів комах ряду лускокрилих, твердокрилих та напівтвердокрилих, але який відрізняється від білка-токсину ТІС5290. Можливі додаткові поліпептиди для такої композиції містять білок, що володіє інгібуючою активністю проти комах, і молекулу длРНК, що володіє інгібуючою активністю проти комах. Один із прикладів використання таких рибонуклеотидних послідовностей для боротьби з комахами-шкідниками описаний в Вашт та співавт. (публікація патенту США 2006/0021087 АТ). Такий додатковий поліпептид для боротьби з лускокрилими-шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, який володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, такого як, без обмежень, СтгутТА (публікація патенту США Мо 5,880,275), СтутАб, СтутАс, СтутА.105, Сту1Ае,

Сту1В (публікація патенту США Мо 10/525,318), Сту1!С (публікація патенту США Мо 6,033,874),

Сту1ор, Стуїба та їх варіантів, СтуїтЕ, Стуї1Р, і химер СгтутА/Е (публікація патенту США Мо 7,070,982; 6,962,705; та 6,713,063), Сту1б, Сту1Н, Сгуті, Сгу1у, СтуїК, Стуті,, химери типу Стут, такі як, але без обмежень, ТІС836, ТІС860, ТІС867, ТІС869 і ТІС1100 (публікація міжнародної заявки УМО2016/061391 (А2)), ТІС2160 (публікація міжнародної заявки М/О2016/061392 (А2)),

СтугА, Стуг2АБ (публікація патенту США Мо 7,064,249), Стгуг2Ає, Сту4В, Стуб, Сгу7, Стув8, Сгу9,

Сту15, Сту4ЗА, Сту4З3В, СтубіАа!, ЕТ6б, ТІС400, ТІС800, ТІС834, ТІС1415, МірзА, МІРЗАБ, МІРЗВ,

АХМІ-001, АХМІ-002, АХМІ-030, АХМІ-035 і АХМІ-045 (публікація патенту США 2013-0117884

АТ), АХМІ-52, АХМІ-58, АХМІ-88, АХМІ-97, АХМІ-102, АХМІ-112, АХМІ-117, АХМІ-100 (публікація патенту США 2013-0310543 АТ), АХМІ-115, АХМІ-113, АХМІ-005 (публікація патенту США 2013- 0104259 Ат), АХМІ-134 (публікація патенту США 2013-0167264 Ат), АХМІ-150 (публікація патенту США 2010-0160231 АТ), АХМІ-184 (публікація патенту США 2010-0004176 АТ), АХМІ- 196, АХМІ-204, АХМІ-207, ахті209 (публікація патенту США 2011-0030096 АТ), АХМІ-218, АХМІ- 220 (публікація патенту США 2014-0245491 АТ), АХМІ-2217, АХМІ-2227, АХМІ-2237, АХМІ-2247,

АХМІ-2257 (публікація патенту США 2014-0196175 АТ), АХМІ-238 (публікація патенту США 2014- 0033363 Ат), АХМІ-270 (публікація патенту США 2014-0223598 Ат), АХМІ-345 (публікація патенту США 2014-0373195 АТ), АХМІ-335 (міжнародна публікація заявки УМО2013/134523(А2)),

Зо ріа-3 (публікація патенту США 2013-0219570 Ат), рІС-5 (публікація патенту США 2010-0317569

АТ), 0ІС-11 (публікація патенту США 2010-0319093 АТ), АПР-ТА та його похідні (публікація патенту США 2014-0033361 АТ), АПР-1В та його похідні (публікація патенту США 2014-0033361

АТ), РІР-ТАРІР-1В (публікація патенту США 2014-0007292 АТ), РЗЕЕМЗ3174 (публікація патенту

США 2014-0007292 АТ), АЕСРС,-592740 (публікація патенту США 2014-0007292 АТ), Рриї 1063 (публікація патенту США 2014-0007292 АТ), 012-657 (міжнародна публікація заявки

УМО2015/195594(А2)), Рриї 1064 (публікація патенту США 2014-0007292 АТ), 215-135 та його похідні (публікація патенту США 2012-0233726 АТ), 55153 та його похідні (публікація патенту

США 2012-0192310 АТ), 55154 та його похідні (публікація патенту США 2012-0192310 АТ), 5155 та його похідні (публікація патенту США 2012-0192310 АТ), 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2012-0167259 АТ, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2012-0047606 АТ, ЗЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2011-0154536 АТ, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2011-0112013 АТ, 5ЕО ІО МО. 2 та 4, і їх похідні, як описано в публікації патенту США 2010- 0192256 А1Т, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2010-0077507 АТ,

ЗЕО І МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2010-0077508 АТ, 5ЕО ІЮ МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США 2009-0313721 АТ, 5ЕО ІЮО МО: 2 або 4, та їх похідні, як описано в публікації патенту США 2010-0269221 А1, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту США Мо 7,772,465 (82), СЕ161 0085 та його похідні, як описано в

УМО2014/008054 А2, токсичні до лускокрилих білки та їх похідні, як описано в публікації патентів

США 052008-0172762 АТ, 0О52011-0055968 А1 та 052012-0117690 А1; 5ЕО ІЮО МО: 2 та її похідні, як описано в 57510878 (82), 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в публікації патенту

США Ме7812129 (В1); тощо. 00711) Такий додатковий поліпептид для боротьби з твердокрилими-шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, який володіє інгібуючою активністю по відношенню до комах, такого як, без обмежень, СтгузВр (публікація патенту США Мо 6,501,009), варіанти Сту1С, варіанти СгузЗА, Сту3, СтуЗзВ, Сту34/35, 5307, АХМІ134 (публікація патенту США 2013-0167264

АТ), АХМІ-184 (публікація патенту США 2010-0004176 АТ), АХМІ-205 (публікація патенту США 2014-0298538 АТ), ахті207 (публікація патенту США 2013-0303440 АТ), АХМІ-218, АХМІ-220 (публікація патенту США 20140245491А1), АХМІ-2217, АХМІ-2237 (публікація патенту США 2014- бо 0196175 АТ), АХМІ-279 (публікація патенту США 2014-0223599 АТ), АХМІ-КІ1 та його варіанти

(публікація патенту США 2010-0197592 Ат), ТІС407, ТІС417, ТІС431, ТІС807, ТІС853, ТІС9О1,

ТІС1201, ТІСЗ3131, 01-10 (публікація патенту США 2010-0319092 АТ), еНІРз» (публікація патенту на патент США Мео2010/0017914), ІРЗ та його варіанти (публікація патенту США 2012-0210462

АТ) ії п-Нехаюхіп-Нмта (публікація заявки на патент США 0О52014-0366227 АТ). 0072) Такий додатковий поліпептид для боротьби з напівтвердокрилими-шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білків, активних по відношенню до напівтвердокрилих, таких як, без обмеження, ТІС1415 (публікація патенту США 2013-0097735 А1), ТІС807 (публікація патенту США Мо 8609936), ТІС834 (публікація патенту США 2013-0269060 АТ), АХМІ- 036 (публікація патенту США 2010-0137216 АТ) та АХМІ-171 (публікація патенту США 2013- 0055469 А1). Додаткові поліпептиди для боротьби з комахами-шкідниками ряду твердокрилих, лускокрилих та напівтвердокрилих можна знайти на сайті номенклатури токсину Васійиб5

Іигіпдіепбоі5, що підтримується Меї СтісКтоге (у всесвітній павутині за адресою

Біпотепсіайиге.іпо).

І0073)| В інших варіантах реалізації винаходу така композиція/препарат може додатково містити, щонайменше, один додатковий поліпептид, який проявляє інгібуючу активність по відношенню до комах-шкідників, які не інгібуються білком за цим винаходом, що в інших випадках володіє інгібуючою активністю проти комах, з тим щоб розширити спектр інгібуючої активності по відношенню до комах.

І0074| Здатність комах розвивати стійкість до певних інсектицидів була описана в даній галузі техніки. Одна стратегія керування стійкістю комах полягає в використанні трансгенних культур, які експресують дві різні речовини, що володіють інгібуючою активністю проти комах, які діють через різні механізми дії. Таким чином, будь-які комахи зі стійкістю до однієї з речовин, що володіють інгібуючою активністю проти комах, можуть контролюватися за допомогою іншої речовини, що володіє інгібуючою активністю проти комах. Інша стратегія боротьби зі стійкістю комах полягає в застосуванні рослин, які не захищені від цільових видів комах рядів твердокрилих, лускокрилих та напівтвердокрилих, з метою забезпечення укриття для таких незахищених рослин. Один конкретний приклад описаний в патенті США Мо 6,551,962, повний зміст якого включено за допомогою посилання. 0075) Інші варіанти реалізації винаходу, такі як пестицидні хімікати, що застосовуються

Зо локально, які розроблені для боротьби зі шкідниками, що також регулюються білками, описаними в даному документі, для застосування з білками в препаратах для обробки насіння, запилення, точкового поливу або протирання, і які можуть бути нанесені безпосередньо на грунт (поливання грунту), нанесені на рослини, що вирощуються, які експресують білки, описані в даному документі, або приготовлені для нанесення на насіння, що містять один або більше трансгенів, що кодують один або більше описаних білків. Такі препарати для застосування при обробці насіння можна наносити за допомогою різних наклейок і липких речовин, відомих в даній галузі техніки. Такі препарати можуть містити пестициди, які є синергічними за способом дії з описаними білками, так що пестициди препарату діють за допомогою іншого способу дії для боротьби з тими ж або схожими шкідниками, які можуть регулюватися описаними білками, або що такі пестициди діють для боротьби зі шкідниками в ширшому діапазоні господарів або видів шкідників рослин, які неефективно регулюються пестицидними білками ТІС5290.

І0076| Вищезгадана композиція/препарат може додатково містити сільськогосподарсько прийнятний носій, такий як приманка, порошок, дуст, таблетки, гранули, спреї, емульсія, колоїдна суспензія, водний розчин, препарати спор/кристалів Васійй5, протрава насіння, рекомбінантна рослинна клітина/рослинна тканина/насіння/рослина, трансформовані для експресії одного або більше білків, чи бактерія, трансформована для експресії одного або більше білків. Залежно від рівня інгібування по відношенню до комах або інсектицидного інгібування, властивого рекомбінантному поліпептиду, і рівня препарату, який повинен застосовуватися в аналізі рослин або раціону, склад/препарат може містити різні масові кількості рекомбінантного поліпептиду, наприклад, Від 0,0001 95 до 0,001 95, до 0,01 95, до 1 95, до 99 95 від маси рекомбінантного поліпептиду.

Приклади

І0077| Зважаючи на вищевикладене фахівцям в даній галузі техніки повинно бути зрозуміло, що можуть бути зроблені зміни в конкретних описаних аспектах, і все ж буде отримано подібний або аналогічний результат, не відходячи від суті і об'єму винаходу. Таким чином, конкретні структурні і функціональні деталі, описані в даному документі, не повинні інтерпретуватися як такі, що обмежують. Слід розуміти, що повне розкриття кожної із зазначених вище публікацій включено в описі даної заявки.

Приклад 1 бо Виявлення ТІС5290

0078) У цьому прикладі описано виявлення пестицидного білка ТІС5290.

І0079| Послідовність, що кодує новий пестицидний білок Васійй5 Ійпигіпдіепзіє (ВО була ідентифікована, клонована, підтверджена і протестована в біологічному аналізі комах.

Пестицидний білок ТІС5290, представлений в даному документі як 5ЕО ІЮО МО: 1 (кодуюча послідовність ВО та 2 (білок), був виділений зі штаму ВЕ ЕО6657. ТІС5290 є білюом довжиною 937 амінокислот, що ідентифікований на основі гомології з відомими інсектицидними білковими токсинами та за допомогою аналізу Ріат, з метою розподілу по відомим родинам інсектицидних білків. Біоїнформатичний аналіз вказує на те, що ТІС5290 є пороутворюючим білком. Домен

РА14 Ріат (РЕО7691) в межах амінокислот з 16 по 140, ймовірно, залучений у функції зв'язування. За цим доменом розташований домен Віпагу їохВ Ріат (РЕО3495) в межах амінокислот з 186 по 593, що може сприяти утворенню бета-складчастої трансмембранної пори.

Найближчим гомологом ВІ -токсину ТІС5209 є білок Мір4Аа з ідентичністю послідовності 56,9 Об, що вказує на те, що ТІС5290 є новою підродиною Мір4і. (0080| ПЛР-праймери були розроблені для ампліфікації повнорозмірної копії кодуючої області для ТІС5290 із загальної геномної ДНК, виділеної зі штаму ЕОб657. ПЛР-амплікон також включав ініціюючий і термінуючий кодони послідовності, що кодує. 0081) Амплікон ТІС5290 клонували з використанням способів, відомих в даній галузі техніки, в експресуючий вектор плазміди Ві у функціональному зв'язку з експресуючим промотором Ві, який є активним під час споруляції бацили. Крім того, амплікон клонували в вектор, який використовується для експресії білка, в системі експресії Еб5спегіспіа соїї (Е. соїї). Було виявлено, що рекомбінантні штами експресують рекомбінантний білок.

Приклад 2

ТІС5290 демонструє активність по відношенню до твердокрилих, лускокрилих та напівтвердокрилих в біологічному аналізі комах.

І00821| Даний приклад ілюструє інгібуючу активність, що проявляється білками ТІС5290 по відношенню до різних видів ряду твердокрилих, лускокрилих та напівтвердокрилих.

І0083| Новий пестицидний білок ТІС5290 експресували в Ві і Е. соїї та аналізували на токсичність по відношенню до різних видів ряду твердокрилих, лускокрилих, напівтвердокрилих та двокрилих. Препарати кожного токсину з Ві і Е. соїї були проаналізовані проти видів

Зо твердокрилих Герііпоїагза десетіїпеаїа (колорадський жук, КЖ) та Оіабгоїїса мігудіїега мігдітега (західний кукурудзяний жук, УУСК). Препарати токсину також аналізувалися проти видів лускокрилих американської кукурудзяної совки (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), метелика стеблового кукурудзяного (ЕСВ, Оз5ігіпіа пибіїаій5), кукурудзяної листової совки (ГАМУ, зродоріега Ігидірегаа), соєвої совки (ЗВ, СПгузодеїхі5 іпсіцдеп5), вогнівки кукурудзяної південно-західної (ЗМУМС,

Оіаїгаєа дгапаіозейа), тютюнової листовійки (ТВУМ, Неїїоївпі5 мігезсеп5) та капустяної молі (ОВМ, (Рішеїйа хуїовіеПа). Препарати токсину також аналізувалися проти видів напівтвердокрилих клопа трав'яного (ТРВ, Гудиз Імпеоіїагі5) та сліпняка західного матового (УМТР, Іуди Ппезрегив); а також видів двокрилих, комара жовтолихоманкового (УЕМ, Аеде5 аедурії). Американська кукурудзяна совка (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа) також згадується як коробковий черв'як (ЗРУМ) та совка бавовняна (СВУ). (0084) Аналіз білків, що експресуються в кожному з векторів, вимагає різних препаратів, доданих до раціону комах. Для векторів, що використовують активний під час споруляції промотор, суміш кристалів/спор збирали після трьох днів росту в культурі та використовували в раціоні комах (зазвичай застосовували в штучних раціонах комах і годували окремо різних комах). Препарати білка, отримані шляхом експресії в Е. соїї були очищені і також представлені в раціоні комах. 0085) ТІС5290 продемонстрував активність проти УУСК, СЕМ, ЕСВ, ЕАМУ, ОВМ та УМТР, як показано в таблиці 2 нижче, в якій "«" позначає активність.

Таблиця 2

Біологічний аналіз активності ТІС5290 проти комах-шкідників ряду твердокрилих, лускокрилих, напівтвердокрилих і двокрилих.

СВ 111

Таблиця 2 (Продовження)

ПЕТ: ПОН НО мс тв

РВС мм

Приклад З

Розробка синтетичних кодуючих послідовностей, які кодують ТІС5290 для експресії в клітинах рослин (0086) Синтетичні або штучні кодуючі послідовності були сконструйовані для застосування в експресії ТІС5290 у рослинах, клоновані в бінарний вектор для трансформації рослин та використовувалися для трансформації рослинних клітин. Синтетичні послідовності нуклеїнової кислоти синтезували відповідно до способів, в цілому описаних в патенті США 5,500,365, уникаючи деяких непідходящих проблемних послідовностей, таких як послідовності поліаденілювання рослин, збагачені АТТТА і А/І/, при збереженні амінокислотної послідовності нативного білка Ві. Синтетична кодуюча послідовність для пестицидного білка ТІС5290 представлена у вигляді 5ЕО ІЮО МО: З і кодує білок, представлений у вигляді ЗЕО ІЮО МО: 2.

Приклад 4

Експресійні касети для експресії ТІС5290 в клітинах рослин

І0087| Різноманітні експресійні касети рослин були сконструйовані з послідовностями, як викладено в 5ЕО ІЮО МО: 3. Такі експресійні касети є корисними для транзієнтної експресії в протопластах рослин або трансформації рослинних клітин. Типові експресійні касети були розроблені з урахуванням можливого розміщення білка всередині клітини рослини. Для білка, орієнтованого на пластид, синтетичну послідовність, що кодує пестицидний білок ТІС5290, функціонально пов'язували в рамці з послідовністю, що кодує сигнальний пептид, для доставки в хлоропласт. Отримані вектори трансформації рослин містять першу трансгенну касету для експресії пестицидного білка, яка містить конститутивний промотор, функціонально пов'язаний 5 з лідерною послідовністю, функціонально пов'язаний 5' з інтроном (або при необхідності без інтрону), функціонально пов'язаний 5' з синтетичною кодуючою послідовністю, яка кодує націлений або ненацілений на пластид білок ТІС5290, який, в свою чергу, функціонально пов'язаний 5' з 3'-нетрансльованою областю і; другу трансгенну касету для відбору трансформованих рослинних клітин з використанням гліфосату або антибіотиків. Всі елементи, описані вище, були розташовані поруч, часто з додатковою послідовністю, передбаченою для

Зо створення експресійної касети, такою як сайти ендонуклеази рестрикції або сайти безлігазного клонування.

Приклад 5

ТІС5290 забезпечує ефективну стійкість до західного кукурудзяного жука (Оіабгоїїса мігдітега мігдітега) у випадку експресії в стабільно трансформованих рослинах кукурудзи

ІЇ0088| Даний приклад ілюструє інгібіторну активність, що проявляється ТІС5290 по відношенню до жуків, таких як злаковий кореневий черв'як, у випадку експресії в рослинах і пропонується у вигляді корму для відповідних комах-шкідників.

І0089| Бінарні вектори трансформації рослин, що містять трансгенні касети, сконструйовані для експресії як націлених, так і ненацілених на пластид пестицидних білків ТІС5290, клонували з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Отримані вектори використовувалися для стабільної трансформації кукурудзяних рослин. Відбиралися і вирощувалися об'єкти з одиночними вставками Т-ДНК. Пестицидну активність аналізували по відношенню до твердокрилого західного кукурудзяного жука (Оіабгоїїса мігдіїега мігдіїега), що харчувався корінням стабільно трансформованих кукурудзяних рослин.

ІЇ0090| Стабільно трансформовані рослини КО використовували для аналізу стійкості твердокрилих, а також для отримання нащадків Е1. З кожної трансформації бінарним вектором відбирали велику кількість об'єктів з однією копією. Частина цих об'єктів, що виникають з кожної трансформації бінарним вектором, використовувалася в аналізі твердокрилих, в той час як інша частина об'єктів використовувалася для отримання нащадків Її з метою подальшого тестування.

0091) Рослини для аналізу КО пересаджували в двадцятисантиметрові горщики. Рослини були інокульовані яйцями західного кукурудзяного жука (Оіабгоїїса мігдітега мігудіега, МУСК). Яйця інкубували протягом приблизно десяти днів до інокуляції з метою їх вилуплення через чотири дні після інокуляції, для забезпечення достатньої кількості тих личинок, що вижили і здатні атакувати коріння кукурудзи. Трансформовані рослини інокулювали приблизно зі стадії М2 до

М3. Рослини вирощували після зараження протягом приблизно двадцяти восьми днів. Рослини видаляли з горщиків, ретельно промиваючи коріння, щоб видалити весь грунт. Шкоду корінню оцінювали з використанням шкали оцінки пошкоджень 1-5, як показано в таблиці З нижче по тексту. Для гарантії правильного виконання аналізу, порівняння також робили з негативним контролем. Низькі оцінки пошкодження коренів вказують на стійкість, що передана білком

ТІС5290 до шкідника твердокрилих. При аналізі МСК використовували велику кількість об'єктів

КО для кожної трансформації бінарним вектором. Багато з об'єктів КО, що експресують як націлений, так і ненацілений на пластид ТІС5290, продемонстрували стійкість до МУСК, яка визначається шкалою оцінок пошкодження коренів, в порівнянні з трансгенними контролями.

Таблиця З

Шкала оцінок пошкодження коренів Ко.

І0092| Частина стабільно трансформованих об'єктів КО, що виникають 3 кожної трансформації бінарним вектором, використовувалася для отримання нащадків Е1. Стабільно трансформовані рослини КО самозапилювалися, даючи нащадків Е1. Насіння Е1 висаджували.

Гетерозиготні рослини ідентифікували за допомогою молекулярних методів, відомих в даній галузі техніки, і використовували для аналізу проти МУСК, а також для вимірювання експресії білка-токсину ТІС5290 за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ЕГІЗА. Частина гетерозиготних нащадків ЕТ від кожного об'єкта використовувалася для аналізу на комахах, в той час як інша частина використовувалася для вимірювання експресії ТІС5290.

І0093| Яйця від західного кукурудзяного жука (Оіабгоїїса мігдітега мігудітега, УУСЕ) інкубували протягом приблизно десяти днів для вилуплення протягом чотирьох днів після інокуляції.

Рослини інокулювали приблизно зі стадії М2 до М3. У випадку з МУСЕ, в кожен горщик інокулювали близько двох тисяч яєць. Рослини вирощували після зараження протягом приблизно двадцяти восьми днів. Рослини видаляли з горщиків, ретельно промиваючи коріння,

Зо щоб видалити весь грунт. Шкоду корінню оцінювали з використанням шкали оцінки пошкоджень 0-3, як показано в таблиці 4 нижче по тексту. Для гарантії правильного виконання аналізу порівняння робили з негативним контролем. Низькі оцінки пошкодження коренів вказували на стійкість, що передається білком ТІС5290 до шкідника твердокрилих. Багато з об'єктів Е1 демонстрували ефективну стійкість до М/СЕ. в порівнянні з контролями. На фігурі 1 зображена середня оцінка пошкодження коренів декількох об'єктів для ТІС5290, коли він експресується в рослинах кукурудзи Е1, незалежно від того, націлений білок на хлоропласт чи ні.

Таблиця 4

Шкала оцінок пошкодження коренів РЕ.ч. кореня 1111110 |Видиміпошкодженнявідсутнід//:////СС:(3«/3н8/СССС//:///бСССС:С(:"С о рослини

Приклад 5

Аналіз активності ТІС5290 по відношенню до лускокрилих шкідників, при експресії в стабільно трансформованих рослинах кукурудзи, сої або бавовника.

І0094| Бінарні вектори трансформації рослин, що містять трансгенні касети, сконструйовані для експресії як націленого, так і ненаціленого на пластид пестицидного білка ТІС5290, клонували з використанням способів, відомих у даній галузі техніки.

І0095| Кукурудзу, сою або бавовник трансформували за допомогою бінарних векторів трансформації, описаних вище, із застосуванням способу трансформації, опосередкованої

Адгорасіегічт. Трансформовані клітини індукували для утворення рослин за допомогою способів, відомих в даній галузі техніки. Біотестування з використанням листових дисків рослини виконували за аналогією з тими, які описані в публікації патенту США Мо 8,344,207.

Тканину, отриману з нетрансформованих рослин кукурудзи, сої або бавовника, використовували в якості негативного контролю. Численні об'єкти трансформації від кожного бінарного вектора оцінювалися проти шкідників лускокрилих таких як, але без обмежень, американська кукурудзяна совка (СЕМУ, Неїїсомегра 7єа), метелик стебловий кукурудзяний (ЕСВ,

О5ігіпіа пибіїаій5), кукурудзяна листова совка (ЕАМУ, Зродоріега Ігидірегда), соєва совка (5ВІ,

Спгузодеїхі5 іпсіцдеп5), вогнівка кукурудзяна південно-західна (ЗМУСВ, Оіаїнаєа агапаїйозег|а), тютюнова листовійка (ТВУУ, Неїїоїтіб5 мігезсеп5) та капустяна міль (ОВМ, РішейПа хуїоєіеПа).

Встановлено, що ті комахи, які демонструють затримку росту та/або смертність в біологічному аналізі комах, схильні до дії токсину ТІС5290.

Приклад 6

Аналіз активності проти напівтвердокрилих шкідників із застосуванням стабільно трансформованих бавовників, що експресують ТІС5290. 0096) Бінарні вектори трансформації рослин, що містять трансгенні касети, сконструйовані для експресії як націлених, так і ненацілених на пластид пестицидних білків ТІС5290, клонували з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Отримані вектори використовувалися для стабільної трансформації бавовників. Пестицидну активність аналізували проти напівтвердокрилих шкідників, що харчуються стабільно трансформованими рослинами

Зо бавовнику.

І0097| Бінарні вектори, описані раніше в прикладі 3, в яких експресується як націлений, так і ненацілений на пластид ТІС5290, застосовували для стабільної трансформації рослин бавовнику. Відбиралися і вирощувалися об'єкти з одиночними вставками Т-ДНК. Стабільно трансформовані рослини КО самозапилювалися, даючи нащадків К1. (0098) Трансгенне насіння К1, що містить експресійні касети для ТІС5290, висівали в 25- сантиметрові горщики, як і насіння, що відповідає не трансгенному контролю. Рослини вирощувалися в камері з контрольованим середовищем з фотоперіодом шістнадцять годин світла при тридцяти двох градусах Цельсія та вісім годин темряви при двадцяти трьох градусах

Цельсія, і інтенсивністю світла від восьмисот до дев'ятсот мікро-ейнштейнів. По закінченню від сорока до сорока п'яти днів після посадки, окремі рослини поміщали в ізолятор, зроблений з пластикових листів "запилення", що пропускають повітря (Міїші5 апа Сотрапу Іпс, Франкфорт, штат Іллінойс). Листи кріпилися до основного стрижня безпосередньо над поверхнею грунту, з використанням застібки МеЇсгоФ. Дві пари дорослих особин (у віці б-ти днів), статевозрілих самців і самок Гуди5 Іїпеоіагіє або Гудиб5 Ппезрагиє з лабораторної культури збирали в чотирнадцатиміліметрову пластикову трубку з круглим дном (Весіоп Рріскзоп І абулаге, Франклін

Лейкс, штат Нью-Джерсі) і використовували для кожної рослини. Дорослих особин вивільняли в кожен окремий ізолятор через невелику щілину на стороні ізолятора і потім ізолятор надійно закривали, гарантуючи, що комахи не втечуть. Комахи мали можливість паруватися і рослини утримували в ізоляторі протягом двадцяти одного дня. Через двадцять один день рослини підрізали під ізоляторами і переміщали в лабораторію, де комах збирали з кожної рослини і підраховували. Перед відкриттям ізолятора, рослини інтенсивно струшували, щоб всі комахи відчепилися від місць годування і впали до основи ізолятора. Потім основу ізолятора відкривали і весь рослинний матеріал поміщали на чорний лист. Комах збирали за допомогою аспіратора.

Потім рослину ретельно перевіряли з метою видалення будь-яких комах, що лишилися. Для кожної рослини фіксували кількість комах та їх стадію розвитку. Підрахунок комах ділили на декілька груп, що базувалися на зрілості організму Лігуса; німфи до 3-го віку, 4-го віку, 5-го віку і дорослі особини. Трансгенні рослини бавовнику, що демонструють скорочення числа личинок та дорослих особин в порівнянні з нетрансформованими контрольними рослинами бавовнику, демонструють стійкість до напівтвердокрилих шкідників, за допомогою експресії білка-токсину (510) ТІСБ5290.

0099) Всі композиції, розкриті і заявлені в даному документі, можуть бути зроблені і виконані без зайвого експериментування в світлі даного опису. Хоча композиції даного винаходу були описані з точки зору вищевикладених ілюстративних варіантів реалізації винаходу, фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що варіанти, зміни, модифікації та перебудови можуть бути застосовані до композиції, що описана в даному документі, без відступу від концепції, сутності та обсягу даного винаходу. Більш конкретно, буде очевидно, що деякі речовини, які як хімічно, так і фізіологічно спорідненні, можуть бути замінені на речовини, які описані в даному винаході, при цьому будуть досягнуті такі ж або подібні результати. Всі такі аналогічні заміни і модифікації, очевидні фахівцям в даній галузі техніки, вважаються такими, що не виходять за межі сутності, об'єму і концепції даного винаходу, як визначено в формулі винаходу, що додається. 00100) Всі публікації та опубліковані патентні документи, цитовані в даній специфікації, включені в даний документ за допомогою посилання в тому ж обсязі, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка були конкретно і окремо вказані для включення за допомогою посилання.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Мопвапсо Тесппо1оду ІІС «1205 НОВІ БІЛКИ, ЩО ПРОЯВЛЯЮТЬ ІНГІБУЮЧУ АКТИВНІСТЬ ПО ВІДНОШЕННЮ ДО

КОМАХ

«1305 МОоМ5:394О «1505 США 62/199,024 «1515 2015-07-30 «1605 З

Зо «1705 РагепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115 2814 «2125 ДНК «213» Васії1їїцв ЄпПигіпдієпвів «2205 «221» інша ознака «222» (1)..(2814) «223» Послідовність ДНК, отримана з штаму ВЕ ЕС6б657, що кодує ТІС5290. «4005 11 агєдсааааса ссдЕсЕсеЕссС ааааадсдаа саддсдасчд ссаєстодаєє ауссодеЕеес (219) гасеЕссааадч асадеасаєє сааачааєсуч асдеЕссаєсс аддеЕдддсда ааааадсаас 120

Есааєсєдааса аадсдадаас ааасасадає дсдсаасааа Ессааєсстає асчаєдчаєд 180 чадаасєсеєда адссеЕсссса аасодддадад бавгаддсеЕсс стасассеєєсс счваєдаааає 240

ЧдЕаассєстьдс ааасаааєсд сдааасадсс ассєаасєсаад сстаденасаса аааадасстує

Зоо ааассадаач саааєсаддс агаєсєдаааєс аачзасєєсдаде ассдеаасас аєсдаасаса

З6о

Есассачаєє єдсадесстасєє седдссааєсуд аасаасдсдс ааааадааса аассссоаодад 420 ааарасавтас ЕСсСЕСсСЕССааа СЄЕССЕСсСЕдаа ааадсаааєс сасеЕєдссда аааадаааса 480 сааадеЕєсст єсссаааєса єаареєтаєєс дасадасаас аадаааасдд адааааасаа 540

Ессаєдесеста ссссЕдсада сасачаєсаає чаєєдсаєсс садаєдааєд ддаадаааад бо ччавтасасає єсадаааєса асаааєгсдеєд ссаєддааєд асдсасаєад єдссдааддс бо тасаааваає асдссссааа Ссссаєсає дсасдаасад гааавачаєсс євасасадасє 720

ЕсеєЧдаааадчд гаасаддаса сбасдссддса дсдасчдаааєсє асдаадсаад адаєссаста 780 чЧдеЕадсеЕдсдЕ асссаєсддеЕ єддадеЕсдда аєддааааас єеЕсаєєєєс гсаааааєдає 840 асЕдсаассд адддааасдс сбдасасаааа Сстраааасаа ссасаааваас адзасасдасс 900

Зо асааасассд гачачаєсодд Єддассдссс ддасЕссеЕСад асаааддсеЕс яацеЕСеЕввессса 960 ареєєсассаа аасасасаса сЕСЕсддадеЕ адеадсасаєсє ссдеЕєдсада басддасаде

З5 19020 асаасаєддеЕ сеЕссасааає сддааєсаас асддсадааа дадсатаєєс аааєсдсааає 1980 дЕЄСЯЯ ває асааєсддєдуа аасддсасст аєстаєдаєс гаааассдас аасаааєсєсеє 1140 дЕСЕсСсСсааа асссададеєда сеЕССсСаєтасе асдаєсаасддд ссддасстаа єсаааєсодда 1200 аавгадестад дсдсаддсда басстраєссд саааааддас аддссссдаєс сеСаєтсадає 1260 ааггдсааасчд аддсеЕддсас адсааааасе дсаассаасд ссдаасааєс адасааааєса 1320 саадсєрддсра сачааасасєє ааасаєсадаа асврасдсааа асададдаса агаєсддааєсе 1380

Егадаєдааа ааддссаадс аасєссаддІ ддадааєсдду аєссдаєєсдд аасааатасєсєс 1440 чаєдсоддЕСЕ срддаєсасо сасасєтааає сеЕєддсасад ддааачаєад ЕСссдаасда ачадсадссд саааааасає чааєсдаєсса даадасаааа сасседаааєс басааєсааа 1550 чаадсааєсса аааавадсдсєс сСаасдсасаа дааааадаєд чсадаєсава свтасасоадває 1620 сааддсдааа аадастастаєсє сассдаєдаа ссусстаєта арсстааєсас адаєдаааає 1680 асааавааач аааседадсд ссаастааає сааасдссад дсаааасадчс агаєсдаєсдвеа 1740 аааєсддааас дсодддаєдаа чассасассеє саєдсассаа гааадсаста єдасеєеєсдаа 1800 ассЕссдааа асссасддса срасасасас саадааадсуд чаддасаєсас доадсаааааа 1860 счаддаадаа ЕсдЧдерасада сдодводсаєсддад асеєдсчаєдес саааєссаса аєсаааассд 1920 тасасаадсє асасддедсд єдсаєасдбра сдаасадсає саасаасддд сбадсааєсдаа 1980 дЕєЧЯТасЕсс асодсадаєсаа садссссоодуаа ааєддасаад дсдсааааЧчі аадсддаааа 2040

Зо

ЧдЕсасаддєд дсааасдддаа аасадсоддаа ЄСЕССЕЕеЕса асасеЕссвтаа саасссадад 2100

Гавєєссаааа гаассддеЕєє дааааасаас доадааєсдсста ассеЕссаєєє єчаєдаєдвнка

З5 2160

ЕсЕЧдсаавад адсддаааас ааасчдаааає ссЕсаааааа аасавтасаєє єдаааааєда 2220 азєЕсЕсвдаєє саааєдаєда дчаєсдчаєдаста додсдсаасує Єсасесудтає сссаадеєсу 2280 аачдаєссдає ассаасддаа аасааасдЧчеЕ аддеЕсдддаа дсаєаасасс єдсассдсса 2340

Есадасудсста асддеєаааад аассдеаасс саєддаєсаа ЕсасеЕдсвтає басссссаєд 2400 чааєсасаєд срдсадаєда ааааадаєдас аасссаааад гааагвдсадс єдаасісддас 2460 чачадсчдадча Есдааааадсі аасчавадає дсасасааає єссссоаддата дЕЧдДдтаєсства 2520

ЕСЕЧдаааасс сааасстдса гадурЕддаєсЕс адеЕсвстасаса аастасстда сагаєсеетає 2580 аагаасччртає сЕссеЕсаєаа аасссдадесд ааєддааааа аадеЕссааас адссесаааа ссаадсссас еЕсССЕЕСЕсСсСа дасаасяєєє ааєссааааа ассстааєда єддадасасетсає 2700 сстгассааач асдсассадс сдаастаєдда дсвасадтад дсддаааача Еесааадччед 2760

Егдсаєааде ддаєєссаааа аадсчаєсдеЕєс аєдчсасадсс адастаасаа таа 2814 «2105 2 «2115 937 «2125 ПРТ «213» Васії1їїцв ЄпПигіпдієпвів «2205 «2215 ІНША ОЗНАКА «2225 (1)..:(937) «223» Амінокислотна послідовність ТІС5290. «4005 2

Меє біп Авп Ії1е УМаії бБет бет Кпув бехт бі біп Аїа ТПт Уаії Іїе с01Уу 1 5 19 15

Зо теп Уаї с1у Рпе Тут Рібе гув Авр бек ТПт Рпе Гпув сій Ге Меє Ріе 20 25 30

Іїе біп Уа1! сіу біц Ппув Бек Авп Гей Месб Авп ув Аза Агуд І1е Авп 35 40 45

ТПЕ Авр Аїа сіп сіп І1е Сіп бек Іїе Агд Тгр Меє с1у Авп Гец Гуз 50 зо бо бек Рго біп ТПкх біу бі Туг Агд Гец бБет ТПх бек бехт Авр бій Авп 65 70 75 80 уаї Іїе Гец сіп І1е Авп сіу сі ТПїх Уаї Іїе Авп сбіп Аїа бет І1е 85 30 35 біп гув Авп о Гей Гпув Гец сі1ц Аза Авп сіп Уа1 Тух бій Іїе гув І1еє 1600 195 110 бі Тут Агд Авп оТПг бБет Авп ТПт Гецп Рго Авр Гец сбіп Гец РПпе Тгр 115 120 125 бек Меє Авп Авп Аза сбіп ув біц сбіп чІ1е Ркго сіц пуз Тук І1е Гей 130 135 140 зек Рко Авп Рпе бек сбіц пув Аїа Авп бБехт Тїей Аїа сіцЧ Гуз бі ТПг 145 150 155 160 біп бек Рпе Рпе Рго Авп Тут Авп Гец Рпе Авр Агу біп біп сб1цЧ Авп 165 170 175 сіу біш Гпув біп бБет Мес бБет ТПт Рко Уаії Авр ТПгІ Авр Авп Авр Сув 180 185 190

І1їе Рго Авр сіц Ткр січ сі пуз бі1іу Тухк ТПг Робе Агд Авп о сбіп сіп 195 200 205

І1е Маії Ркго Тгр Авп Авр Аїа Тут бек Аза біц біу Тут пув ПГув Тут 210 215 220

Уаї Бек Авп Рго Тут Нів А1ї1а Агд ТПкг Уаї Пув Авр Ркго Тут ТПг Авр 225 230 235 240

Рпе сіцп пув Уаї ТПк сіу Ніз Меє Рго Аза Аїа ТНПІ Гуз Тут б1ц А1а

Зо 245 250 255

Ат Авр Рго Гец Уаі Аїа Аїа Тут Рго бек Уаї Сіу Уаії сіу Меє сіц 260 265 270

З5 пув їец Нів РіПе бег КГув Авп Авр ТПк Уаї ТПг Сі б1у Авп А1їа Авр 275 280 285

ТпПк Кпув бБет Ппув ТПї ТПх ТП пув ТПг Авр ТПтї ТПтї ТБПт Авп Тк Уаї 290 295 300 січ Іїе сб1у сіу Бек Гец сіу Рпе бек Авр Гуз бі1у Рпе Бек РПе 5ег 305 310 315 320

І1е Бех Рго Пув Тут ТПт Нів бБет Тгр бег бек бетг ТіртІ бек Уаї А1а 325 330 335

Авр ТПІ Авр бБет ТПтІ ТПтІ Ткр бет бехт біп Іїе С1у Іїе Авп ТПтІ А1а 340 345 350 січ Агуд Аза Тут Гец Авп Аїа Авзп Уаі Агуд Тут Тут Авп сіу с1у ТПг 355 360 365

Аза Рхто Іїе Тут Авр Гец пув Ркго ТПї ТПїх Авп Рпе Уа! Рпе сіп Авп 370 375 380 бек б1у Авр бек Іїе ТПг ТПІ І1їе ТПІ Аза с1у Рго АвБп сіп Ії1е ШУ 385 390 395 400

Авп обет Гец с1у Аїа сіу Авр ТПІ Тут Рго біп ув б1у біп Аїа Ркго 405 410 415

Іїе Бек Гей Авр гув Аза Авп сіц Аїа сСіу ТПпПк Уаї Гув І1е Аїа Ше 420 425 430

Авп Аїа біц сбіп Гец Авр пув І1е сСіп Аїа Сі1у ТПг біц Іїе Тец Авп 435 440 445

І1е сбіц ТПт ТПт сіп Ап Агуд біу біп Тухкх біу Іїе їец Авр с1ц Гуз 450 455 460 сіу біп Маії Іїе Рго сіу сі1у сіц Тер Авр Рго І1е Агуд ТБбг АвБп І1е 465 470 475 480

Зо

Авр Аїа Уаї бБет сіу бБет Гецп ТПтІ Гей Авп Гей біу ТПт с1у Гув Авр 485 490 495 зет Гей біц Агуд Акд Уаі Аїа Аїа пув Авп Меєсб Авп Авр Рго б1ц Авр 500 505 510

Туз ТПтІ Рко сіц І1ї1е ТПї Іїе ув біш Аїа Іїе Гпув Гув Аїа Рпе Авп 515 520 525

Аїа біп біц Ггув Авр с1і1у Акд Гей Тут Тухк ТПгІ Авр сбіп с1у о1Ч Гуз 530 535 540

Авр Іїе Рпе Іїе Авр сіц Рко бет І1е Авп Гей Іїе ТПтІ Авр б1цЧ Авп 545 5Б5О 555 5б6О

ТпПЕ пув пув сі І1ї1е бій Агд біп Гей Авп обіп Меє Рго с1у Гуз ТЕПкК 565 570 575

Уаї Тук Авр Уа1 пув Тгр їув Агуд СсС1іу Мес їув І1е ТПг Іец Нів Уаї 580 585 5ЗО

Рко І1е пуз Тук Тук Авр Рпе бі ТПг бБет бі Авп Гецп Тгр Тук Тук 595 бо 605

ТПтг Тук сіп біц бек сіу с1у Ту ТПк сі1у Ггув Гув Агуд С1у Агд Іїе 610 615 620

Сіу ТБтІ Авр с1іу Нів сіу ТПг АїТїа Меє бек Авп Рго Сіп Гец Гув Рго 625 630 635 64

Тук ТПт бБет Тут ТПї Уаі Агд Аїа Тухкх Уаі1і Агуд ТПІ Аїа бек ТПкК ТЕПкК 645 650 655 сіу бехт Авп біц Маії УМаі Рпе Тут А1їа Авр Авзп бегт бет біу Авп 01Уу бо 665 670 біп б1у Аїа Ппув Маії Бек сіу Ппув Уаі ТПт с1у с1у пув Тгр гув Ії1є 675 680 685

А1їа бі Рпе бег Рпе Авп ТПї Рпе Авп Авп Рго біц Тут Рпе Гуз І1е 690 695 70о

ІТ1е с1у Гец Пув Авп Авзп б1іу Авп Аїа Авп Тїеєц Нів Ріе Авр Азр Уаї

Зо 705 710 715 720 бек Уаї І1е с1п Тер Пув ТрІ Авп бі Авп Гей біп Гуз Кпув Ніз І1е 725 730 735

З5

Рпе сій гпуз Тгр бек Рпе біу Бех Авп Авр сбіц Меє Уаі І1е с1у Аїа 740 745 75О

ТПЕ Рпе ТПтІ Акуд Уаії Рго бек бек пув Іїе Агуд Тут сіп ТЕр Гуз Ше 755 760 765

Авп о б1іу Агд Гей Сіу бБехт Іїе Іїе Рго Аїа Рго Рго Тей Авр Аїа Авп 770 775 780 сіу гув Атуд ТПт УМаії ТПт Тут сіу бБехт І1е ТБбгІ Аза Іїе ТПт Ркго Меє 785 790 795 800 біц Гей Тут Аїа Уаії Авр сіц Гув Авп Авр Авп Гей Гуз Уаї Гуз Уаї 805 810 815

Аїа сбіш їец сС1у сбіц бек Сі І1е сі пув Уаї Меє І1їе Авр Аїа Нівз 820 825 830

Туз Рпе бБет с1у Тгр Тгр Тух Ггец бек бій Авп Рго Авп Гецп Тук бек 835 840 845 с1у Гей бБет Гецп Тут пув Гец Ркго Авр І1е РпПе Тут Авп Авзп Уаї! 5бег 850 855 860 бек Тут Гуз Іїе Агд Уа1і1 Авп с1і1у Ппув Ппув Ма1і сіп ТПх Уа1ї бек Гуз 865 870 875 880

Рго Бек Рго Рпе Гей Рпе Сіп І1е ТПг Рпе Авзп Гец Гув Авп о Рго Авп 885 890 895 сіу б1у ТПтІ Тут Рго ТПтІ Гпув Авр Аїа бек Уаї біц їец Тгр Аїа ТПг 900 305 910 уаї сб1у сС1у Пув Авр їец гуз Уаї їецш Ніз Кпув Тер І1їе с1іп Гув 5бег 315 9320 325

Авр уаї Мес Тут Бек сіп ТПтї Авп о Авп 330 335

Зо «2105 З «2115» 2814 «2125 ДНК «2135» Штучна

З5 «2205 «223» Синтетична кодуюча послідовність, що кодує ТІС5290, сконструйована для експресії в рослинах. «4005 З асдсадааса Есодссіссосс саачадсдад саадсчасдд Есаєсддсесо ддссддсес бо тасеЕссаадд асесаассеєс сааддадсес аєдессаєссс аддсдддсда даадсссаас 120 сесаєсєдааса аддсеЕсдсаєс саасасддас дсссадсада Ессадсссає єСддеЕддаєд 180 часаасстрда ададсссдса дассддсдад бассдссесс ссасасссес сдасдадаас 240 чЧЕааєссесс адаєсаасдда сдачасддос ассаассадда счдадсаєссса даадаассес 300 ааассададд сааассаддс страсчачасє аадасєсдадс асаддаасас сеЕссаасасс

З6о сеЕдссддасс тгасадсссес сЕддссдаєд аасаасдсодс адааддааса дассссоадад аадчстасастас сдадсссдаа Єсссадсдад ааддсдаасої сЕСссдсдда дааддачасс 480 сададсесеЕсе ЕСсСсдаасса саассесссс дассдссадс аададаасдда сдадаадсад 540

Есдаєдссса содссддсдда сассдасаас дасрдсаєсс ссдаєдааєд ддаададааа бо ччасасассе ЕСссдтраасса дсачаєсдєд ссдеЕддаасд асдсстасад єдсадааддс бо гасаачаадс асдсдадсаа ссссбассас дсссдабасддд Есааадассс деасассдас 720

ЕЕСдадаадд сдастсдддса саєдсссдст дстасдаадсї аєчаддсдсд счдаєсссеста 780 чЧЕддссодссе ассссіссдс сдодсдЕСоода асддадчаадс єссассссад саадаасчає 840 асдаєдасдуд адддсаасдс ддасасааад адсаадасса саастраадас сдасассасд 900 ассаасассяд Есдчадаєсддда сддсадсстід додсЕссадсуд асаадддсесес садесессса

Зо 960 ассесассаа адсасассса садссддссд ссдЕССасаа дсЕдЕддссда сассдасеісь 19020 астассрєдда дЕссдсадає адддаєсаас асгсдссдада ддодсдртаєссе саасдсддаас 1980

ЧдЕДдсдсстасс асааєддєдда сассдсдссс асстасдасс гдаадссдас сассаасесєс 1140 дЕСЕссСсада асісаддсда садсаєсасс асдаєсассд ссддсесстаа ссадаєсддас 1200 аасеЕсдсесу дсдссоддсда сасстаєсссд садаадддсесс аддсеЕсстає сЕСсстадас 1260 ааддссаасуд аддсдддсас сдідаадчаса дсдаєссаасд ссдадсадсі ддасаадаєс 1320 саддсдддса сддадаєєсс саасаєсєсдад астасдсада ассдсддсса дгсасоддтасс 1380 сеЕсдасдада ааддссаддс дасасссоода доадсдадеддд асссдаєссо дасааасаєсе 1440 часдсеєдеЕса дсдододадссо басссеЕсаас сісддсасод дсааддаєад ссісдадсдс 1500 садддЕсдсду сдаадаасає даасчаєссд даддасаада сіссддадає сассаєссаад чаддссаєса адааддсдсс сСаасдсісад дадааддасд дсадассдта стасасдоодас 1620 садддєдада адчасасєссс саєсдчаєдад ссеЕсссаєса ассесаєсас ддасдадаас 1680 асдаадааад аааєсдадсд ссадстсдаас садаєдсссу дсаадасддеЕ дсасдасчаєд 1740 аадеддаадс дсоддсаєсдаа чассасодсса сасдссссда Есаадсаста сддасеЕєсвад 1800 ассеЕсадада асссдсддса стасасстас саадааєссуд даддссасас сддсаадаад 1860 садасддадсдда Есоддсассда сдддсасоддс асддсчаєдс сааасссдса дсгдаадсса 1920 гасасссссо асаседсдса ддсодбасдесєд сдсассдсса дсассасвєду дадсаасдад 1980 дЕСЯЄСЕсСЕ асдстдасаа садсеЕссддс аасдддсаад дсодсдаадде Есссоаоддаад 2040 чЧЕдассддса ддаадсддаа часадсоддад ЄсСсЕсСсСЕсса асасдсєссаа баассстдаа 2100

Зо тасеЕссаада єсассддсесо даадаасаас доддаасдсса ассеєдсасес сдасччаєсдеЕс 2160

Ессдєдаєсо адсддаачдчас саасчдадаас ссдсадаада аасасасєстЕс єдадаачдчсдад

З5 2220 гЕссЕсСсСоддсе ссаасддасча часддеєдасєс ддеЕдссасуає єсасеЕсдсдІ дссдадсадс 2280 аачаєссдає ассадсддаа дассаасддс сдссеЕсддта дсаєссаєссс гдсдссассяь 2340 сгддасдсса асдддаадсд дасддедасд сбасддсадса єсаседсдає сасдсстаєд 2400 чадсессасуд ссдсЕдасда даадаасдас аассісааад єдчааадссдс ЕдадсЕсддас 2460 чадеЕссдада Есдчадааадс басєдаєсдас дсссасааає ЕСссаддста дЕддваєссьс 2520

Есадачаасс сааасстдса сЕССддссЕсС адсстідваса адсеєдсссда сассеєсстас 2580 аасаасдудЕ сдадстасаа дасссдсдеЕд аасддсаада аддсссадас сдесадсаад 2640 ссдадсссує ЕСЕСсудЄссса дчасстасдЕєє ааєсссаада ассстаасдд сддадасстас ссдасчдааач асдстадсдс ададсеЕСссдд дсдасоддесд дсдддаадчда сссдаадЧвед 2760 срасасаадс дчдасесадаа ЧчеЕСОЧчаєдес асдерасадсс адассаасаа седа

Claims (31)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з полінуклеотидним сегментом, який кодує пестицидний білок або його пестицидний фрагмент, при цьому: а) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2; або р) зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 85 до ідентичності амінокислотній послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 2.

2. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що: а) молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти містить послідовність, яка функціонує, експресуючи пестицидний білок в рослині; або р) молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти експресується в рослинній клітині, продукуючи пестицидно ефективну кількість пестицидного білка; або с) молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти знаходиться у функціональному зв'язку з вектором і вказаний вектор вибраний з групи, що складається з плазміди, фагміди, бакміди, косміди та бактеріальної або дріжджової штучної хромосоми.

3. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка визначається як присутня в клітині- хазяїні, яка відрізняється тим, що зазначена клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з бактеріальної та рослинної клітин. Зо

4. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 3, яка відрізняється тим, що бактеріальна клітина-хазяїн походить із роду бактерій, вибраних з групи, що складається з: Адгорасіепит, ННігобіит, ВасіПпи5, Вгемібастив, Е5сНепісніа, Рхееидотопав, КіебзівеПа, Ратова та Епміпіа.

5. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 4, яка відрізняється тим, що вид Вас/ив 35 є Васійи5 сегеиз або Васіпив5 Іпигіпдіепвів, зазначений Вгеуірасілив5 є Вгеуірасіпив5 Іаїеговрегив або зазначений ЕзсНегісніа є ЕвсНегісніа сої.

6. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 3, яка відрізняється тим, що зазначена рослинна клітина є клітиною дводольної або однодольної рослини.

7. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 6, яка відрізняється тим, що зазначена 40 рослинна клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з рослинної клітини люцерни, банана, ячменю, бобів, броколі, капусти, Вгазвіса, моркви, маніоки, рицини, цвітної капусти, селери, нуту, китайської капусти, цитрусових, кокосової пальми, кави, кукурудзи, конюшини, бавовника, гарбузових, огірка, дугласової ялиці, баклажана, евкаліпта, льону, часнику, винограду, хмелю, цибулі-порею, салату-латуку, сосни ладанної, проса, дині, горіха, вівса, оливи, цибулі, 45 декоративної рослини, пальми, трави пасовиська, гороху, арахісу, перцю, голубиного гороху, сосни, картоплі, тополі, гарбуза, сосни променистої, редису, ріпаку, рису, кореневищних злаків, жита, американського шафрану, чагарника, сорго, південної сосни, сої, шпинату, кабачка, полуниці, цукрових буряків, цукрової тростини, соняшника, солодкої кукурудзи, амбрового дерева, солодкої картоплі, проса прутовидного, чаю, тютюну, томата, тритикале, дернової 50 трави, кавуна і пшениці.

8. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений пестицидний білок проявляє активність проти комахи ряду твердокрилих.

9. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 8, яка відрізняється тим, що вказана комаха є західним кукурудзяним жуком, південним кукурудзяним жуком, північним кукурудзяним 55 жуком, мексиканським кукурудзяним жуком, бразильським кукурудзяним жуком або групою бразильського кукурудзяного жука, що складається з ріабгоїса уїгідиа та ріабгоїса зресіоза.

10. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений пестицидний білок проявляє активність проти виду комахи ряду лускокрилих.

11. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 10, яка відрізняється тим, що вказана 60 комаха є совкою оксамитових бобів, вогнівкою очеретяною, точильником зерновим кукурудзяним, совкою бавовняною, тютюновою листовійкою, соєвою совкою, африканською совкою, південною совкою, совкою трав'яною, совкою буряковою, совкою американською, азіатською бавовняною совкою, рожевим коробковим хробаком бавовника, совкою-іпсилон, вогнівкою кукурудзяною південно-західною або метеликом стебловим кукурудзяним.

12. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений пестицидний білок проявляє активність проти комахи ряду напівтвердокрилих.

13. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 12, яка відрізняється тим, що вказана комаха є сліпняком західним матовим, клопом трав'яним або бавовняним сліпняком.

14. Рослина або її частина, що містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1.

15. Рослина або її частина за п. 14, яка відрізняється тим, що вказана рослина є однодольною рослиною або дводольною рослиною.

16. Рослина або її частина за п. 14, яка відрізняється тим, що рослину вибирають із групи, яка складається з люцерни, банана, ячменю, бобів, броколі, капусти, Вгавзвіса, моркви, маніоки, рицини, цвітної капусти, селери, нуту, китайської капусти, цитрусових, кокосової пальми, кави, кукурудзи, конюшини, бавовника, гарбузових, огірка, дугласової ялиці, баклажана, евкаліпта, льону, часнику, винограду, хмелю, цибулі порею, салату-латуку, сосни ладанної, проса, дині, горіха, вівса, оливи, цибулі, декоративної рослини, пальми, трави пасовиська, гороху, арахісу, перцю, голубиного гороху, сосни, картоплі, тополі, гарбуза, сосни променистої, редису, ріпаку, рису, кореневищних злаків, жита, американського шафрану, чагарника, сорго, південної сосни, сої, шпинату, кабачка, полуниці, цукрових буряків, цукрової тростини, соняшника, солодкої кукурудзи, амбрового дерева, солодкої картоплі, проса прутовидного, чаю, тютюну, томата, тритикале, дернової трави, кавуна і пшениці.

17. Насіння рослини за п. 14, яке відрізняється тим, що вказане насіння містить зазначену молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти.

18. Композиція, що має інгібуючу активність відносно комах, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де композиція, яка має інгібуючу активність відносно комах, проявляє активність проти одного або декількох видів шкідників рядів лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих.

19. Композиція, яка має інгібуючу активність відносно комах, за п. 18, яка додатково містить нуклеотидну послідовність, що кодує щонайменше один інший пестицидний агент, який відрізняється від зазначеного пестицидного білка.

20. Композиція, яка має інгібуючу активність відносно комах, за п. 19, яка відрізняється тим, що зазначений щонайменше один інший пестицидний агент вибирають з групи, що складається з білка, що має інгібуючу активність відносно комах, молекули длРНК, що має інгібуючу активність відносно комах, і допоміжного білка.

21. Композиція, що має інгібуючу активність відносно комах, за п. 19, яка відрізняється тим, що зазначений щонайменше один інший пестицидний агент проявляє активність відносно одного або більше видів шкідників ряду лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих.

22. Композиція, що має інгібуючу активність відносно комах, за п. 21, яка відрізняється тим, що зазначений щонайменше один інший пестицидний білок вибраний з групи, що складається з СтутА, СтутАБ, СтутАс, СтутА.105, СтутАе, Стгу1В, Сту1сС, варіантів Сту1!С; Сту10О, СтУуТЕ, СгутЕ, химер СтулА/Е; Сту1б, Стуї! Н, СгутІ, Стгуту, Стуї1К, Стут1ї, Стуг2А, Сту2АБ, Сту2Ае, СтгуЗ, варіантів СтузА; СтуЗВ, Сту4В, Стуб, Сту7, Стув, Сту9З, Сту15, Сту34, Сту35, Сту4ЗА, Сту43В, СтубіАаї, ЕТ29, ЕТЗ33, ЕТ34, ЕТЗ35, ЕТ6б, ЕТ70, ТІС400, ТІС407, ТІСА17, ТІС431, ТІС800, ТІС807, ТІС834, ТІС853, ТІС900, ТІС9О1, ТІС1201, ТІС1415, ТІС2160, ТІСЗ3131, ТІС836, ТІС860, ТІС867, ТІС869, ТІС1100, МІРЗА, МІРЗВ, МІРЗАБЮ, АХМІ-АХМІ-, АХМІ-88, АХМІ-97, АХМІ-102, АХМІ-112, АХМІ-117, АХМІ-100, АХМІ-115, АХМІ-113 та АХМІ-005, АХМІ134, АХМІ-150, АХМІ-171, АХМІ-184, АХМІ- 196, АХМІ-204, АХМІ-207, АХМІ-209, АХМІ-205, АХМІ-218, АХМІ-220, АХМІ-2217, АХМІ-2222, АХМІ-2237, АХМІ-2247 та АХМІ-2257, АХМІ-238, АХМІ-270, АХМІ-279, АХМІ-345, АХМІ-335, БО АХМІ-КІ1 та їхніх варіантів, ІРЗ та його варіантів, ОІС-3, 012-5, 0102-10, 013-657 та білка БІС-11.

23. Композиція, яка має інгібуючу активність відносно комах, за п. 18, яка визначається як така, що містить рослинну клітину, яка експресує зазначену молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти.

24. Товарний продукт, отриманий з рослини або її частини за п. 14, який відрізняється тим, що товарний продукт містить зазначену молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти і пестицидного білка, кодованого нею, у кількості, яка може бути визначена.

25. Товарний продукт за п. 24, вибраний з групи, яка складається з товарної кукурудзи, упакованої оброблювачем зерна, кукурудзяних пластівців, кукурудзяних коржів, кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна грубого помелу, кукурудзяного сиропу, кукурудзяної олії, 60 кукурудзяного силосу, кукурудзяного крохмалю, кукурудзяної каші тощо, цілісного або обробленого насіння бавовнику, бавовняної олії, лінту, насіння і частин рослин, оброблених для корму або продуктів харчування, волокна, паперу, біомаси і паливних продуктів, таких як паливо, отримане з бавовняної олії або пелетів, отриманих з відходів бавовняного очищення, цілісного або обробленого насіння сої, соєвої олії, соєвого білка, соєвого борошна грубого помелу, соєвого борошна, соєвих пластівців, соєвих висівок, соєвого молока, соєвого сиру, соєвого вина, корму для тварин, що містить соєві боби, паперу, що містить сою, вершків, які містять сою, біомаси соєвих бобів і паливних продуктів, вироблених з використанням рослин сої та частин рослин сої.

26. Спосіб отримання насіння, який включає: а) посадку щонайменше першого насіння за п. 17; Юр) вирощування рослини з насіння; і с) збирання насіння з рослини, що відрізняється тим, що вказане зібране насіння містить зазначену молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти.

27. Рослина, яка є стійкою до зараження комахами, при цьому клітини зазначеної рослини містять молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, і де рослина є стійкою до видів комах-шкідників рядів лускокрилих, твердокрилих або напівтвердокрилих.

28. Спосіб боротьби з лускокрилими або твердокрилими, або напівтвердокрилими комахами- шкідниками або ураженням комахами-шкідниками, причому зазначений спосіб включає: а) приведення у контакт шкідника з інсектицидно ефективною кількістю пестицидного білка, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО: 2; або Б) приведення у контакт шкідника з інсектицидно ефективною кількістю одного або більше пестицидних білків, які містять амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 85 95 ідентичності амінокислотної послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 2.

29. Спосіб виявлення наявності молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1 у зразку, що містить геномну ДНК рослин, який включає: а) приведення у контакт зразка із зондом нуклеїнової кислоти, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з геномною ДНК з рослини, що містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, і не гібридизується в таких умовах гібридизації з геномною ДНК з іншої ізогенної рослини, яка не містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1; Зо р) застосування до зразка жорстких умов гібридизації; і с) виявлення гібридизації зонда з ДНК-зразка.

30. Спосіб виявлення наявності пестицидного білка або його фрагмента у зразку, що містить білок, при цьому зазначений пестицидний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2; або вказаний пестицидний білок містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 85 95 ідентичності амінокислотної послідовності з «ЕО ІЮО МО: 2, що включає: а) приведення у контакт зразка з імунореактивним антитілом; і р) виявлення наявності білка.

31. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що етап виявлення включає імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) або вестерн-блотинг.

! Середня ОПІК. на аб'єкк дотя МС. і / ши і я 2 вен а в п м аа Я х ї : В : 1 8 : Е ТОЖ : : Ж і Н а іх м.

Й і Об'єкті сбб'єкта Єб'єкта Об'єкт Об'єкт бб'єкть Об'єк? Сб'єктя бб'єюте скректій Об'єкті. егативняй