BR112020026523A2 - Proteínas inibidoras de inseto - Google Patents

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Catherine A. Chay
Todd A. Ciche
Stanislaw Flasinski
Arlene R. Howe
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Abstract

“proteínas inibidoras de inseto”. a presente invenção refere-se a uma classe de proteínas pesticidas de proteínas de fusão pira, pirb e pirab exibindo atividade tóxica contra espécies de pragas de coleópteros, lepidópteros e hemípteros. são fornecidos construtos de dna que contêm uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica as proteínas de fusão pira, pirb e pirab. plantas transgênicas, células de plantas, sementes e partes de plantas resistentes a infestação de coleópteros, lepidópteros e hemípteros são fornecidas, as quais contêm sequências de ácido nucleico recombinante que codificam as proteínas de fusão pira, pirb e pirab. métodos para detectar a presença das sequências de ácido nucleico recombinante ou das proteínas da presente invenção em uma amostra biológica, e métodos de controle de pragas de espécies de coleópteros, lepidópteros e hemípteros usando as proteínas de fusão pira, pirb e pirab também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para “PROTEÍNAS INIBIDORAS DE INSETO”.
REFERÊNCIA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US No. 62/736.236, depositado em 25 de setembro de 2018 incorporado na íntegra neste documento por meio de referência.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O arquivo denominado “MONS465wo-sequence_listing.txt” contendo uma forma legível por computador da Listagem de Sequência foi criado em 24 de setembro de 2019. Este arquivo é 456 bytes (medido no sistema operacional MS-Windows®), é simultaneamente movido pela apresentação eletrônica (utilizando o sistema de arquivamento EFS-Web United States Patent Office), e é incorporado a este pedido por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se geralmente ao campo de proteínas inibidoras de insetos. Uma nova classe de proteínas que exibe atividade inibidora de inseto contra as pragas relevantes para agricultura de plantas e sementes de produtos agrícolas são descritos. Particularmente, as proteínas descritas são, de forma inseticida, ativas contra pragas relevantes para o cultivo de plantas e sementes agrícolas, especialmente as espécies de pragas de insetos Coleoptera e Lepidoptera. As plantas, partes de plantas e sementes contendo um construto polinucleotídico recombinante que codifica uma ou mais das proteínas de toxina descritas são providas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Melhorar o rendimento das culturas de plantas agricultura significativas, incluindo, entre outros, milho, soja, cana-de-açúcar, arroz, trigo, vegetais e algodão, tornou-se cada vez mais importante. Além da crescente necessidade de produtos agrícolas para alimentar, vestir e fornecer energia para uma população humana em crescimento, os efeitos relacionados ao clima e a pressão da crescente população para usar outras terras além das práticas agrícolas deverão reduzir a quantidade de terra arável disponível para a agricultura. Esses fatores levam a previsões desanimadoras de segurança alimentar, particularmente por causa da falta de grandes melhorias na biotecnologia vegetal e práticas agronômicas. Tendo em vista essas pressões, melhorias ambientalmente sustentáveis em tecnologia, técnicas agrícolas e manejo de pragas são ferramentas essenciais para expandir a produção de culturas em relação a quantidade limitada de terras aráveis disponíveis para agricultura.
[005] Insetos, em especial insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera e Hemipteran, são considerados uma das principais causas de danos às culturas de campo, diminuindo o rendimento das culturas em áreas infestadas. Historicamente, foi confiada à aplicação intensiva de inseticidas químicos sintéticos como agente de controle de pragas na agricultura. As preocupações com o meio ambiente e saúde humana, além de problemas de resistência emergentes, estimularam a pesquisa e o desenvolvimento de pesticidas biológicos. Este esforço de pesquisa levou à descoberta progressiva e ao uso de várias espécies microbianas entomopatogênicas, incluindo bactérias.
[006] O paradigma de controle biológico mudou quando o potencial de bactérias entomopatogênicas, especialmente bactérias pertencentes ao gênero Bacilo, foram descobertas e desenvolvidas como um agente biológico de controle de pragas. Cepas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) foram utilizados como uma fonte de proteínas pesticidas, pois descobriu-se que as cepas Bt apresentam uma alta toxicidade contra insetos específicos. Cepas de Bt são conhecidas por produzir as delta-endotoxinas que estão localizadas dentro de corpos de inclusão cristalinos parasporais no início da esporulação e durante a fase de crescimento estacionário (por exemplo, proteínas Cry), e também são conhecidos por produzir proteína inseticida secretada. Após a ingestão por um inseto suscetível, as delta-endotoxinas, bem como as toxinas secretadas exercem seus efeitos na superfície do epitélio do intestino médio, interrompendo a membrana celular e levando à ruptura e morte celular. Genes que codificam proteínas inseticidas também foram identificados em espécies bacterianas diferentes de Bt, incluindo outros Bacillus e uma diversidade de espécies bacterianas adicionais, como Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus (“Ls” anteriormente conhecida como Bacillus sphaericus), Paenibacillus popilliae, Photorhabdus e Xenorhabdus.
[007] As toxinas insecticidas solúveis cristalinas e secretadas são altamente específicas para seus hospedeiros e ganharam aceitação mundial como alternativas aos inseticidas químicos. Por exemplo, as proteínas da toxina inseticida foram usadas em muitas aplicações agrícolas para proteger de infestações de insetos as plantas importantes para a agricultura, diminuir a necessidade de aplicações de pesticidas químicos e aumentar os rendimentos. As proteínas da toxina inseticida são usadas para controlar as pragas relevantes para agricultura por meio de métodos mecânicos, tais como a pulverização para dispersar formulações microbianas contendo muitas cepas de bactérias sobre superfícies de plantas e uso de técnicas de transformação genética para produzir plantas transgênicas e sementes que expressem proteína de toxina inseticida.
[008] O uso de plantas transgênicas expressando as proteínas da toxina inseticida foram totalmente adaptadas. Por exemplo, em 2012, 26,1 milhões de hectares foram plantados com culturas transgênicas expressando toxinas Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief nº 44). O uso global de culturas transgênicas protegidas contra insetos e o número limitado de proteínas de toxinas inseticidas utilizadas nestas culturas criou uma pressão de seleção para os alelos de insetos existentes que conferem resistência às proteínas de inseticida atualmente utilizado.
[009] O desenvolvimento da resistência em pragas específicas a proteínas de toxinas inseticidas cria a necessidade contínua de descoberta e desenvolvimento de novas formas de proteínas de toxina inseticidas que são úteis para administrar o aumento da resistência de insetos a culturas transgênicas expressando proteínas de toxinas inseticidas. As novas toxinas de proteínas com eficácia melhorada e que exibem controle sobre um espectro mais amplo de espécies de insetos suscetíveis reduzirão o número de insetos sobreviventes que podem desenvolver alelos de resistência. Além disso, o uso em uma planta de duas ou mais proteínas transgênicas de toxina inseticida tóxicas para a mesma praga de insetos e exibir os diferentes modos de ação reduz a probabilidade de resistência em qualquer espécie de inseto específico.
[0010] Assim, os inventores neste documento divulgam uma família de toxinas de proteínas de Xenorhabdus e Photorhabdus juntamente com proteínas de toxinas semelhantes, proteínas variantes e proteínas recombinantes exemplares que exibem atividade inseticida contra espécies alvo de lepidópteros, coleópteros e pragas hemípteras.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] É descrito neste documento um grupo de proteínas pesticidas com atividade inibidora de insetos (proteínas de toxina), referido neste documento como toxinas de proteína PirAB (Photorhabdus relacionada a inseto), que demonstram exibir atividade inibitória contra uma ou mais pragas de plantas de cultura. As proteínas na classe de toxina da proteína PirAB podem ser usadas sozinhas, ou como fusões de uma proteína PirA e uma proteína PirB, ou em combinação com outras proteínas inseticidas e agentes tóxicos em formulações e in planta, proporcionando assim alternativas para proteínas inseticidas e químicas inseticidas atualmente em uso em sistemas agrícolas.
[0012] Em uma modalidade, é descrita neste pedido uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou fragmento desta, em que: (a) a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; ou (c) o referido segmento polinucleotídico hibridiza com um polinucleotídeo possuindo a sequência nucleotídica de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81,
83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156 ou 158; ou (d) a referida molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor e o referido vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, fagemídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossomo artificial de bactéria ou levedura. A molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida numa planta ou é expressa em uma célula vegetal a fim de produzir uma quantidade pesticida eficaz de proteína pesticida.
[0013] Em outra modalidade deste pedido estão células hospedeiras compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante do pedido, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo constituído em uma célula bacteriana e uma célula vegetal. As células hospedeiras contempladas incluem Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea e Erwinia. Em determinadas modalidades, a referida espécie Bacillus é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, dita Brevibacillus é Brevibacillus laterosperus ou a referida Escherichia é Escherichia coli. As células hospedeiras vegetais contempladas incluem uma célula dicotiledônea e uma célula monocotiledônea. As células hospedeiro vegetais contempladas adicionalmente inclui uma célula vegetal de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brássicas, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão (Gossypium sp.), uma cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palma, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, álamo, abóbora, Pinus Radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo,
pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, switchgrass, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
[0014] Em ainda outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra insetos Coleoptera, incluindo a lagarta-da-raiz do milho do oeste da América do Norte, lagarta-da-raiz do milho do sudeste da América do Norte, lagarta-da-raiz do milho do nordeste da América do Norte, lagarta-da-raiz do milho mexicana, lagarta-da-raiz do milho brasileira, besouro da batata do Colorado, o complexo da lagarta-da- raiz do milho de ocorrência no Brasil consistindo em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa, besouro-pulga crucífero, besouro-pulga listrado e besouro-pulga preto do oeste da América do Norte.
[0015] Em outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra um inseto Lepidoptera, incluindo lagarta rosca, lagarta da espiga do milho, traça das crucíferas, Ostrinia nubilalis, lagarta do cartucho, lagarta das vagens, lagarta falsa medideira, broca grande da cana-de- açúcar, lagarta do tabaco, lagarta de veludo, lagarta de cana-de-açúcar, lagarta da maçã, broca da cana-de-açúcar, lagarta elasmo do milho, lagarta-do-cartucho preta, lagarta-do-cartucho pretada beterraba, Old World Bollworm, lagarta desfolhadora ou lagarta rosada.
[0016] Em ainda outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra uma espécie de inseto da ordem de Hemiptera, incluindo percevejo verde do Sul, percevejo marrom neotropical, percevejo verde do sul, percevejo marrom neotropical, percevejo faixa vermelha, espécies de percevejo barriga verde de espinhos pretos, percevejo asa marrom, percevejo marrom, percevejo verde, inseto percevejo marmorado marrom, percevejo ocidental ou percevejo manchador.
[0017] Também contempladas neste pedido estão as plantas que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou fragmento desta, em que: (uma referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; ou (c) o referido segmento polinucleotídico hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com o complemento da sequência nucleotídica de SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 146, 148, 150, 152, 154, 156, ou 158; ou (d) a referida planta exibe uma quantidade detectável da referida proteína pesticida.
Em certas modalidades, a proteína pesticida compreende SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,
100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou
157. Em uma modalidade, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em outra modalidade, a planta é selecionada do grupo consistindo em célula de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, álamo, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
[0018] Em outras modalidades, são descritas as sementes compreendendo as modalidades de ácido nucleico recombinante.
[0019] Noutra modalidade, são contempladas uma composição inibidora de inseto compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinantes descrita neste pedido. A composição inibidora de insetos pode compreender adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos outro agente pesticida diferente da dita proteína pesticida. O pelo menos um outro agente pesticida é selecionado do grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma proteína acessória. O pelo menos um outro agente pesticida na composição inibidora dos insetos exibe atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera ou Hemiptera. O pelo menos um outro agente pesticida na composição inibidora de inseto está em uma modalidade selecionada do grupo que consiste em: um Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, variantes de Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras de Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117 AXMI-100, AXMI-115, AXMI- 113 e AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI- 196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z e AXMI-225z, AXMI- 238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI -R1 e suas variantes, IP3 e suas variantes, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 DIG-11, Cry71Aa1, Cry72Aa1, variantes de PHI-4, variantes de PIP-72, variantes de PIP-45, variantes de PIP-64, variantes de PIP-74, variantes de PIP-75, variantes de PIP-77, Axmi422, Dig-305, Axmi440, variantes de PIP-47, Axmi281, BT-009, BT-0012, BT-0013, BT-0023, BT0067, BT- 0044, BT-0051, BT- 0068, BT-0128, DIG-17, DIG-90, DIG-79, Cry1JP578V, Cry1JPS1 e Cry1 JPS1P578V.
[0020] Os produtos de produtos que compreendem uma quantidade detectável das moléculas de ácido nucleico recombinante descritas neste pedido estão contemplados. Esses produtos de commodity incluem milho de commodity ensacado por um manipulador de cereais, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereais de milho e similares e produtos de commodity de algodão correspondentes como sementes de algodão inteiras ou processadas, óleo de algodão, fiapos, sementes e partes de plantas processadas para rações ou alimentos, fibras, papel,
biomassas e produtos combustíveis, como combustível derivado de óleo de algodão ou pelotas derivadas de resíduos de descaroçamento e produtos derivados de soja correspondentes tais como soja integral ou processada, óleo de soja, proteína de soja, farelo de soja, farelo de soja, farelo de soja, farelo de soja, queijo de soja, queijo de soja, ração animal compreendendo soja, papel composto por soja, creme composto por soja, biomassa de soja e produtos combustíveis produzidos a partir de plantas de soja e partes de plantas de soja e produtos correspondentes de arroz, trigo, sorgo, guandu, amendoim, frutas, melão e produtos hortícolas, incluindo, se for caso disso, sucos, concentrados, compotas, geleias, marmeladas e outras formas comestíveis desses produtos de base contendo uma quantidade detectável de tais polinucleótidos e ou polipéptidos deste pedido.
[0021] Um método de produção de semente que compreende as moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas neste pedido também é contemplado neste documento. O método compreende plantar pelo menos uma das sementes compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas neste pedido, cultivar a planta a partir da semente e colher as sementes das plantas, em que a semente colhida compreende as moléculas de ácido nucleico recombinantes neste pedido.
[0022] Em outra modalidade ilustrativa, é fornecida uma planta resistente à infestação de insetos, em que as células da referida planta compreendem: (a) uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma quantidade inseticida eficaz de uma proteína pesticida conforme estabelecido em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157;
ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143.
[0023] São também descritos neste pedido os métodos para controlar uma praga das espécies Coleoptera ou Lepidoptera e controlar uma infestação de pragas de espécies de Coleoptera ou Lepidoptera de uma planta, particularmente uma planta de cultura. O método compreende, em uma modalidade, (a) o contato da praga com uma quantidade inseticida eficaz de uma ou mais proteínas pesticidas, conforme estabelecido em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143.
[0024] É ainda fornecido neste documento um método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou fragmento desta, em que: (a) a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as
SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; ou (c) o referido segmento polinucleotídico hibridiza com um polinucleotídeo possuindo a sequência nucleotídica de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156 ou 158. Em uma modalidade da invenção, o método compreende o contato de uma amostra de ácidos nucleicos com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de uma planta compreendendo um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou fragmento deste no presente documento fornecido, e não hibridizar sob tais condições de hibridização com DNA genômico de uma planta isogênica que não compreende o segmento, em que a sonda é homóloga ou complementar a SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 146, 148, 150, 152, 154, 156 ou 158, ou uma sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoácidos com: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141;
ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143. O método pode ainda compreender (a) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridação rigorosas e, (b) detectar a hibridação da sonda com DNA da amostra.
[0025] Também são fornecidos pela invenção métodos de detecção da presença de uma proteína pesticida ou fragmento desta em uma amostra compreendendo proteína, em que a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos possuindo: (i) pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou (ii) pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou (iii) pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155, e 157; ou (iv) pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou (v) pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou (vi) pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou (vii) pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou (viii) pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou (ix) pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou (x) 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100,
105, 107, 139 e 143. Em uma modalidade, o método compreende: (a) contatar uma amostra com um anticorpo imunorreativo; e (b) detectar a ligação do anticorpo com a proteína pesticida ou fragmento desta, em que a ligação indica a presença da proteína. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende um ELISA ou um Western blot.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0026] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Xenorhabdus nematophila ISB000002 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC4771 PirA.
[0027] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC4771 PirA.
[0028] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Xenorhabdus nematophila ISB000002 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC4772 PirB.
[0029] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC4472 PirB.
[0030] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC6880 composta pelas sequências de codificação de TIC4771 e TIC4772 em ligação operável e em estrutura.
[0031] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC6880 PirAB.
[0032] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Xenorhabdus ehlersii 85823 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7575 PirA.
[0033] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7575 PirA.
[0034] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Xenorhabdus ehlersii 85823 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7576 PirB.
[0035] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7576 PirB.
[0036] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9316 composta pelas sequências de codificação TIC7575 e TIC7576 em ligação operável e em estrutura.
[0037] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9316 PirAB.
[0038] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus cabanillasii 85908 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7660 PirA.
[0039] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7660 PirA.
[0040] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus cabanillasii 85908 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7661 PirB.
[0041] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7661 PirB.
[0042] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9317 composta pelas sequências de codificação de TIC7660 e TIC7661 em ligação operável e em estrutura.
[0043] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9317 PirAB.
[0044] SEQ ID NO: 19 é uma sequência de ácido nucleico obtida a partir de cepa de Xenorhabdus ehlersii 85887 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7662 PirA.
[0045] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7662 PirA.
[0046] SEQ ID NO: 21 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Xenorhabdus ehlersii 85887 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7663 PirB.
[0047] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7663 PirB.
[0048] SEQ ID NO: 23 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9318 composta pelas sequências de codificação de TIC7662 e TIC7663 em ligação operável e em estrutura.
[0049] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9318 PirAB.
[0050] SEQ ID NO: 25 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus poinarii 86198 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7664 PirA.
[0051] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7664 PirA.
[0052] SEQ ID NO: 27 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus poinarii 86198 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7665 PirB.
[0053] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7665 PirB.
[0054] SEQ ID NO: 29 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9319 composta pelas sequências de codificação TIC7664 e TIC7665 em ligação operável e em estrutura.
[0055] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9319 PirAB.
[0056] SEQ ID NO: 31 é uma sequência de ácido nucleico obtida a partir da cepa de Photorhabdus luminescens 86197 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7666 PirA.
[0057] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos da proteína
TIC7666 PirA.
[0058] SEQ ID NO: 33 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa de Photorhabdus luminescens 86197 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC7667.
[0059] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7667 PirB.
[0060] SEQ ID NO: 35 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9322 composta pelas sequências de codificação TIC7666 e TIC7667 em ligação operável e em estrutura.
[0061] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9322 PirAB.
[0062] SEQ ID NO: 37 é uma sequência de ácido nucleico obtida a partir da cepa de Photorhabdus luminescens 86194 que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7668 PirA.
[0063] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7668 PirA.
[0064] SEQ ID NO: 39 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa 86194 de Photorhabdus luminescens que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7669 PirB.
[0065] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7669 PirB.
[0066] SEQ ID NO: 41 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9320 composta pelas sequências de codificação TIC7668 e TIC7669 em ligação operável e em estrutura.
[0067] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9320 PirAB.
[0068] SEQ ID NO: 43 é uma sequência de ácido nucleico obtida de uma cepa bacteriana desconhecida compreendida dentro de um microbioma que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC7939.
[0069] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7939 PirA.
[0070] SEQ ID NO: 45 é uma sequência de ácido nucleico obtida a partir de uma cepa bacteriana desconhecida compreendida dentro de um microbioma que codifica uma sequência de proteína pesticida TIC7940 PirB.
[0071] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC7940 PirB.
[0072] SEQ ID NO: 47 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC9321 composta pelas sequências de codificação TIC7939 e TIC7940 em ligação operável e em estrutura.
[0073] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC9321 PirAB.
[0074] SEQ ID NO: 49 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC6880PL PirAB em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de iniciação de metionina do fragmento de codificação da proteína TIC4771.
[0075] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC6880 PL PirAB.
[0076] SEQ ID NO: 51 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9316 PirAB.
[0077] SEQ ID NO: 52 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9317 PirAB.
[0078] SEQ ID NO: 53 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9318 PirAB.
[0079] SEQ ID NO: 54 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9319 PirAB.
[0080] SEQ ID NO: 55 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9320 PirAB.
[0081] SEQ ID NO: 56 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC9322 PirAB.
[0082] SEQ ID NO: 57 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Shewanella violacea DSS12 que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10357.
[0083] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10357 PirA.
[0084] SEQ ID NO: 59 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Shewanella violacea DSS12 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10366.
[0085] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10366 PirB.
[0086] SEQ ID NO: 61 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10375 composta pelas sequências de codificação de TIC10357 e TIC10366 em ligação operável e em estrutura.
[0087] SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10375 PirAB.
[0088] SEQ ID NO: 63 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Photorhabdus luminescens laumondii TTO1 que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10358.
[0089] SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10358 PirA.
[0090] SEQ ID NO: 65 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Photorhabdus luminescens laumondii TTO1 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10367.
[0091] SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10367 PirB.
[0092] SEQ ID NO: 67 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10376 composta pelas sequências de codificação de TIC10358 e TIC10367 em ligação operável e em estrutura.
[0093] SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10376 PirAB.
[0094] SEQ ID NO: 69 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Photorhabdus asymbiotica codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10360.
[0095] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10360 PirA.
[0096] SEQ ID NO: 71 é uma sequência de ácido nucleico obtida de Photorhabdus asymbiotica que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10369.
[0097] SEQ ID NO: 72 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10369 PirB.
[0098] SEQ ID NO: 73 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10377 composta pelas sequências de codificação de TIC10360 e TIC10369 em ligação operável e em estrutura.
[0099] SEQ ID NO: 74 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10377 PirAB.
[00100] SEQ ID NO: 75 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus sp. NBAII XenSa04 que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10361.
[00101] SEQ ID NO: 76 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10361 PirA.
[00102] SEQ ID NO: 77 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus sp. NBAII XenSa04 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10370.
[00103] SEQ ID NO: 78 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10370 PirB.
[00104] SEQ ID NO: 79 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10378 composta pelas sequências de codificação de TIC10361 e TIC10370 em ligação operável e em estrutura.
[00105] SEQ ID NO: 80 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10378 PirAB.
[00106] SEQ ID NO: 81 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Yersinia aldovae 670-83 que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10362.
[00107] SEQ ID NO: 82 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10362 PirA.
[00108] SEQ ID NO: 83 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Yersinia aldovae 670-83 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10371.
[00109] SEQ ID NO: 84 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10371 PirB.
[00110] SEQ ID NO: 85 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10379 composta pelas sequências de codificação de TIC10362 e TIC10371 em ligação operável e em estrutura.
[00111] SEQ ID NO: 86 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10379 PirAB.
[00112] SEQ ID NO: 87 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus doucetiae FRM16 que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10363.
[00113] SEQ ID NO: 88 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10363 PirA.
[00114] SEQ ID NO: 89 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus doucetiae FRM16 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10372.
[00115] SEQ ID NO: 90 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10372 PirB.
[00116] SEQ ID NO: 91 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10380 composta pelas sequências de codificação TIC10363 e TIC10372 em ligação operável e em estrutura.
[00117] SEQ ID NO: 92 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10380 PirAB.
[00118] SEQ ID NO: 93 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus griffiniaeBMMCB que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10364.
[00119] SEQ ID NO: 94 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10364 PirA.
[00120] SEQ ID NO: 95 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus griffiniae BMMCB que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10373.
[00121] SEQ ID NO: 96 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10373 PirB.
[00122] SEQ ID NO: 97 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10381 composta pelas sequências de codificação TIC10364 e TIC10364 em ligação operável e em estrutura.
[00123] SEQ ID NO: 98 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10381 PirAB.
[00124] SEQ ID NO: 99 é uma sequência de ácido nucleico obtida de Xenorhabdus nematophila que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida TIC10359.
[00125] SEQ ID NO: 100 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10359 PirA.
[00126] SEQ ID NO: 101 é uma sequência de ácido nucleico obtida de Xenorhabdus nematophila que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC10368.
[00127] SEQ ID NO: 102 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC10368 PirB.
[00128] SEQ ID NO: 103 é uma sequência de ácido nucleico que codifica um operon composto pelas sequências de codificação TIC10359 e TIC10368.
[00129] SEQ ID NO: 104 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa Hm de Photorhabdus luminescens que codifica uma sequência de proteína PirA pesticida PirA_ABE68878.
[00130] SEQ ID NO: 105 é a sequência de aminoácidos da proteína PirA_ABE68878 PirA.
[00131] SEQ ID NO: 106 é uma sequência de ácido nucleico obtida da cepa Hm Photorhabdus luminescens que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida PirB_ABE68879.
[00132] SEQ ID NO: 107 é a sequência de aminoácidos da proteína PirB_ABE68879 PirB.
[00133] SEQ ID NO: 108 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC10434 composta pelas sequências de codificação PirA_ABE68878 e PirB_ABE68879 em ligação operável e em estrutura.
[00134] SEQ ID NO: 109 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10434 PirAB.
[00135] SEQ ID NO: 110 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11210 composta pelas sequências de codificação TIC7575 e TIC7665 em ligação operável e em estrutura.
[00136] SEQ ID NO: 111 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11210 PirAB.
[00137] SEQ ID NO: 112 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11211 composta pelas sequências de codificação TIC7575 e TIC7667 em ligação operável e em estrutura.
[00138] SEQ ID NO: 113 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11211 PirAB.
[00139] SEQ ID NO: 114 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11212 composta pelas sequências de codificação TIC7662 e TIC7665 em ligação operável e em estrutura.
[00140] SEQ ID NO: 115 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11212 PirAB.
[00141] SEQ ID NO: 116 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11301 composta pelas sequências de codificação de TIC7575 e TIC7661 em ligação operável e em estrutura.
[00142] SEQ ID NO: 117 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11301 PirAB.
[00143] SEQ ID NO: 118 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11302 composta pelas sequências de codificação TIC7660 e TIC7576 em ligação operável e em estrutura.
[00144] SEQ ID NO: 119 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11302 f PirAB.
[00145] SEQ ID NO: 120 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11440 composta pelas sequências de codificação TIC4771, TIC4771 e TIC4472 em ligação operável e em estrutura.
[00146] SEQ ID NO: 121 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11440 PirAB.
[00147] SEQ ID NO: 122 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11441 composta pelas sequências de codificação TIC7575, TIC7575, e TIC7576 em ligação operável e em estrutura.
[00148] SEQ ID NO: 123 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11441 f PirAB.
[00149] SEQ ID NO: 124 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11442 composta pelas sequências de codificação TIC7575, TIC4771 e TIC4472 em ligação operável e em estrutura.
[00150] SEQ ID NO: 125 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11442 PirAB.
[00151] SEQ ID NO: 126 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11443 composta pelas sequências de codificação TIC7660, TIC7575, e TIC7576 em ligação operável e em estrutura.
[00152] SEQ ID NO: 127 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11443 PirAB.
[00153] SEQ ID NO: 128 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11444 composta pelas sequências de codificação TIC7660 e TIC7576 em ligação operável e em estrutura.
[00154] SEQ ID NO: 129 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11444 PirAB.
[00155] SEQ ID NO: 130 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11445 composta pelas sequências de codificação de TIC7660, TIC7662 e TIC7663 em ligação operável e em estrutura.
[00156] SEQ ID NO: 131 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11445 PirAB.
[00157] SEQ ID NO: 132 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, TIC11446 composta pelas sequências de codificação TIC7662, TIC7660 e TIC7661 em ligação operável e em estrutura.
[00158] SEQ ID NO: 133 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11446 PirAB.
[00159] SEQ ID NO: 134 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus nematophila MDI-0035777 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC11505.
[00160] SEQ ID NO: 135 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC11505 PirB.
[00161] SEQ ID NO: 136 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11506 composta pelas sequências de codificação TIC10364 e TIC11505 em ligação operável e em estrutura.
[00162] SEQ ID NO: 137 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11506 PirAB.
[00163] SEQ ID NO: 138 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus bovienii MDI-0035808 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC11510.
[00164] SEQ ID NO: 139 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC11510 PirB.
[00165] SEQ ID NO: 140 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11512 composta pelas sequências de codificação TIC10364 e TIC11510 em ligação operável e em estrutura.
[00166] SEQ ID NO: 141 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11512 PirAB.
[00167] SEQ ID NO: 142 é uma sequência de ácido nucleico obtida de cepa de Xenorhabdus nematophila AN6/1 que codifica uma sequência de proteína PirB pesticida TIC11511.
[00168] SEQ ID NO: 143 é a sequência de aminoácidos da proteína TIC11511 PirB.
[00169] SEQ ID NO: 144 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão PirAB, TIC11513 composta pelas sequências de codificação TIC10364 e TIC11511 em ligação operável e em estrutura.
[00170] SEQ ID NO: 145 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11513 PirAB.
[00171] SEQ ID NO: 146 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC10376PL PirAB, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação do fragmento de codificação da proteína TIC10358.
[00172] SEQ ID NO: 147 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10376PL PirAB.
[00173] SEQ ID NO: 148 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC10378PL PirAB, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação do fragmento de codificação da proteína TIC10361.
[00174] SEQ ID NO: 149 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10378PL PirAB.
[00175] SEQ ID NO: 150 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC10380PL PirAB em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação do fragmento de codificação da proteína TIC10363.
[00176] SEQ ID NO: 151 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10380PL PirAB.
[00177] SEQ ID NO: 152 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC10381PL PirAB, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação do fragmento de codificação da proteína TIC10364.
[00178] SEQ ID NO: 153 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC10381PL PirAB.
[00179] SEQ ID NO: 154 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC11103 PirAB composta pelas sequências de codificação TIC7661 e TIC7660 operacionalmente ligadas.
[00180] SEQ ID NO: 155 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11103 PirAB.
[00181] SEQ ID NO: 156 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC11104 PirAB composta pelas sequências de codificação TIC7663 e TIC7662 operacionalmente ligadas.
[00182] SEQ ID NO: 157 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão TIC11104 PirAB.
[00183] SEQ ID NO: 158 é uma sequência de codificação sintética usada para expressão em células vegetais que codificam uma proteína de fusão TIC11302 PirAB.
[00184] SEQ ID NO: 159 é uma sequência de codificação sintética que codifica uma etiqueta de histidina que está operacionalmente ligada a sequências de codificação expressas em Escherichia coli e usadas para purificação de proteínas.
[00185] SEQ ID NO: 160 é a sequência de aminoácidos do marcador de Histidina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00186] Um problema na técnica de controle de pragas agrícolas pode ser caracterizado como uma necessidade de novas proteínas de toxinas que sejam eficazes contra as pragas alvo, que exibam amplo espectro de toxicidade contra espécies de praga alvo, que sejam capazes de serem expressas em plantas sem causar problemas agronômicos indesejáveis e que forneçam um modo alternativo de ação em comparação com as toxinas atuais usadas comercialmente nas plantas.
[00187] São descritos neste documento classes de proteína pesticida PirAB inovadoras, exemplificadas por proteínas PirA TIC4771, TIC7575, TIC7660, TIC7662, TIC7664, TIC7666, TIC7668, TIC7939, TIC10357, TIC10358, TIC10360, TIC10361, TIC10362, TIC10363, TIC10364, TIC10359 e PirA_ABE68878 (coletivamente, "As Proteínas PirA"); as proteínas PirB TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669, TIC7940, TIC10366, TIC10367, TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, TIC10368, PirB_ABE68879, TIC11505, TIC11510 e TIC11511 (coletivamente, "As Proteínas PirB"); e as proteínas de fusão PirAB, TIC6880, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9322, TIC9320, TIC9321, TIC6880PL, TIC10375, TIC10376, TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10380, TIC10381, TIC10434, TIC11210, TIC11211, TIC11212, TIC11301, TIC11302, TIC11440, TIC11441, TIC11442, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11506, TIC11512, TIC11513, TIC10376PL,
TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103 e TIC11104 (coletivamente, "As Proteínas de Fusão PirAB) que fornecem resistência contra pragas de insetos coleópteros, hemípteros e lepidópteros.
[00188] Também são descritas sequências de codificação sintéticas projetadas para expressão em uma célula vegetal que codifica as proteínas de fusão PirAB, TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103 e TIC11104. Além disso, são descritas moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendendo um promotor em ligação operável a uma sequência de codificação que codifica uma ou mais das proteínas PirA, proteínas PirB ou proteínas de fusão PirAB.
[00189] A referência neste pedido a "proteínas PirA", "toxina da proteína PirA", "proteína da toxina PirA", "proteína pesticida PirA", "toxinas relacionadas à PirA" ou "proteína da toxina relacionada à PirA" e semelhantes, referem-se a qualquer nova proteína pesticida ou proteína inibidora de inseto, que compreende, que consiste em, que é substancialmente homóloga, que é semelhante a, ou que é derivada de qualquer proteína pesticida ou sequência de proteína inibidora de inseto de TIC4771 (SEQ ID NO: 2), TIC7575 (SEQ ID NO: 8), TIC7660 (SEQ ID NO: 14), TIC7662 (SEQ ID NO: 20), TIC7664 (SEQ ID NO: 26), TIC7666 (SEQ ID NO: 32), TIC7668 (SEQ ID NO: 38), TIC7939 (SEQ ID NO: 44), TIC10357 (SEQ ID NO: 58), TIC10358 (SEQ ID NO: 64), TIC10360 (SEQ ID NO: 70), TIC10361 (SEQ ID NO: 76), TIC10362 (SEQ ID NO: 82), TIC10363 (SEQ ID NO: 88), TIC10364 (SEQ ID NO: 94), TIC10359 (SEQ ID NO: 100) e PirA_ABE68878 (SEQ ID NO: 105) e segmentos de pesticidas ou inibidores de insetos destes, ou combinações dos mesmos, que conferem atividade contra pragas de Coleoptera, Hemiptera e Lepidópteros, incluindo qualquer proteína que exibe atividade pesticida ou inibidora de insetos se o alinhamento de tal proteína com qualquer uma das proteínas PirA resultar em identidade de sequência de aminoácidos de qualquer porcentagem de fração de cerca de 20 a cerca de 100 por cento.
[00190] Referência neste pedido a "proteínas PirB", "toxina de proteína PirB", "proteína de toxina PirB", "proteína pesticida PirB", "toxinas relacionadas a PirB" ou "proteína de toxina relacionada a PirB" e semelhantes, referem-se a qualquer nova proteína pesticida ou proteína inibidora de inseto, que compreende, que consiste em, que é substancialmente homóloga a, que é semelhante a, ou que é derivada de qualquer proteína pesticida ou sequência de proteína inibidora de inseto de TIC4772 (SEQ ID NO: 4), TIC7576 (SEQ ID NO: 10), TIC7661 (SEQ ID NO: 16), TIC7663 (SEQ ID NO: 22), TIC7665 (SEQ ID NO: 28), TIC7667 (SEQ ID NO: 34), TIC7669 (SEQ ID NO: 40), TIC7940 (SEQ ID NO: 46), TIC10366 (SEQ ID NO: 60), TIC10367 (SEQ ID NO: 66), TIC10369 (SEQ ID NO: 72), TIC10370 (SEQ ID NO: 78), TIC10371 (SEQ ID NO: 84), TIC10372 (SEQ ID NO: 90), TIC10373 (SEQ ID NO: 96), TIC10368 (SEQ ID NO: 102), PirB_ABE68879 (SEQ ID NO: 107), TIC11505 (SEQ ID NO: 135), TIC11510 (SEQ ID NO: 139), e TIC11511 (SEQ ID NO: 143) e seus segmentos pesticidas ou inibidores de inseto, ou combinações dos mesmos, que conferem atividade contra pragas de coleópteros, Hemípteros e Lepidópteros, incluindo qualquer proteína que exibe atividade pesticida ou inibidora de inseto se o alinhamento de tal proteína com e das proteínas PirB resultar na identidade de sequência de aminoácidos de qualquer porcentagem de fração de cerca de 24 para cerca de 100 por cento.
[00191] O termo "proteína de fusão PirAB" é usado neste pedido para descrever uma proteína que compreende uma proteína PirA contígua com uma proteína PirB. A sequência de DNA que codifica a proteína de fusão PirAB pode compreender uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirA operacionalmente ligada e em quadro com uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirB de modo que quando for expressa em uma célula produzirá uma proteína de fusão compreendendo uma proteína PirA e PirB proteína.
A proteína PirA pode ser composta por uma proteína PirA e uma proteína PirB derivada do mesmo operon bacteriano ou, alternativamente, pode ser composta por uma proteína PirA e uma proteína PirB derivada de diferentes operons bacterianos.
Proteínas de fusão PirAB exemplares, em que a proteína PirA é contígua com uma proteína PirB, são fornecidas na Tabela 1. Tabela 1. Proteínas de fusão PirAB exemplares compreendidas por uma proteína PirA contígua com uma proteína PirB e as proteínas PirA e PirB correspondentes compreendidas dentro.
Proteína PirA Proteína PirB Proteína de Fusão PirAB Proteína SEQ Proteína Proteína Toxina ID NO: Toxina SEQ ID NO: Toxina SEQ ID NO: TIC4771 2 TIC4772 4 TIC6880 6 TIC7575 8 TIC7576 10 TIC9316 12 TIC7660 14 TIC7661 16 TIC9317 18 TIC7662 20 TIC7663 22 TIC9318 24 TIC7664 26 TIC7665 28 TIC9319 30 TIC7666 32 TIC7667 34 TIC9322 36 TIC7668 38 TIC7669 40 TIC9320 42 TIC7939 44 TIC7940 46 TIC9321 48 TIC4771* 2 TIC4772 4 TIC6880PL* 6 TIC10357 58 TIC10366 60 TIC10375 62 TIC10358 64 TIC10367 66 TIC10376 68 TIC10360 70 TIC10369 72 TIC10377 74 TIC10361 76 TIC10370 78 TIC10378 80 TIC10362 82 TIC10371 84 TIC10379 86 TIC10363 88 TIC10372 90 TIC10380 92 TIC10364 94 TIC10373 96 TIC10381 98 PirA_ABE68878 105 PirB_ABE68879 107 TIC10434 109
Proteína PirA Proteína PirB Proteína de Fusão PirAB Proteína SEQ Proteína Proteína Toxina ID NO: Toxina SEQ ID NO: Toxina SEQ ID NO: TIC10358* 64 TIC10367 66 TIC10376PL* 147 TIC10361* 76 TIC10370 78 TIC10378PL* 149 TIC10363* 88 TIC10372 90 TIC10380PL* 151 TIC10364* 94 TIC10373 96 TIC10381PL* 153 TIC7575 8 TIC7665 28 TIC11210 111 TIC7575 8 TIC7667 34 TIC11211 113 TIC7662 20 TIC7665 28 TIC11212 115 TIC7575 8 TIC7661 16 TIC11301 117 TIC7660 14 TIC7576 10 TIC11302 119 TIC10364 94 TIC11505 135 TIC11506 137 TIC10364 94 TIC11510 139 TIC11512 141 TIC10364 94 TIC11511 143 TIC11513 145 * compreende um resíduo de alanina adicional imediatamente após o resíduo de metionina de iniciação.
[00192] O termo "proteína de fusão PirAB" também é usado neste pedido para descrever uma proteína que compreende uma proteína PirB contígua com uma proteína PirA. A sequência de DNA que codifica a proteína de fusão PirAB deste tipo pode compreender uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirB operacionalmente ligada e em quadro com uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirA de modo que quando for expresso em uma célula produzirá uma proteína de fusão compreendendo tanto um Proteína PirB e proteína PirA. A proteína PirB pode ser composta por uma proteína PirB e uma proteína PirA derivada do mesmo operon bacteriano ou, alternativamente, pode ser composta por uma proteína PirB e uma proteína PirA derivada de diferentes operons. Proteínas de exemplo em que uma proteína PirB é contígua com uma proteína PirA são fornecidas na Tabela 2. Tabela 2. Proteínas de fusão PirAB exemplares compreendidas por uma proteína PirB contígua com uma proteína PirA e as proteínas
PirB e PirA correspondentes compreendidas dentro. Proteína PirB Proteína PirA Proteína de Fusão PirAB Proteína SEQ ID Proteína SEQ ID Proteína SEQ Toxina NO: Toxina NO: Toxina ID NO: TIC7661 16 TIC7660 14 TIC11103 155 TIC7663 22 TIC7662 20 TIC11104 157
[00193] O termo "proteína de fusão PirAB" também é usado neste pedido para descrever uma proteína que compreende duas proteínas PirA contíguas com uma proteína PirB. A sequência de DNA que codifica a proteína de fusão PirAB deste tipo pode compreender uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirA, operacionalmente ligada a uma sequência de codificação que codifica a mesma proteína PirA ou uma proteína PirA diferente, operacionalmente ligada a uma sequência de codificação que codifica uma proteína PirB de modo que quando for expressa em uma célula produzirá uma proteína de fusão compreendendo uma proteína PirA, outra proteína PirA e uma proteína PirB. Proteínas de fusão PirAB de exemplo compreendendo duas proteínas PirA contíguas com uma proteína PirB são fornecidas na Tabela 3. Tabela 3. Proteínas de fusão PirAB de exemplo compreendidas por uma proteína PirA contígua com outra proteína PirA, e contígua com uma proteína PirB e as proteínas PirA e PirB correspondentes compreendidas dentro. Proteína PirA Proteína PirA Proteína PirB Proteína de Fusão PirAB Proteín Proteína Proteína Proteína a SEQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID Toxina ID NO: Toxina NO: Toxina NO: Toxina NO: TIC4771 2 TIC4771 2 TIC4772 4 TIC11440 121 TIC7575 8 TIC7575 8 TIC7576 10 TIC11441 123 TIC7575 8 TIC4771 2 TIC4772 4 TIC11442 125 TIC7660 14 TIC7575 8 TIC7576 10 TIC11443 127 TIC7575 8 TIC7660 14 TIC7661 16 TIC11444 129 TIC7660 14 TIC7662 20 TIC7663 22 TIC11445 131 TIC7662 20 TIC7660 14 TIC7661 16 TIC11446 133
[00194] O termo "proteína de fusão PirAB" também é usado neste pedido para descrever uma proteína que compreende várias proteínas PirA e/ou várias proteínas PirB contíguas umas às outras. As múltiplas proteínas PirA e/ou PirB podem ser proteínas PirA ou PirB duplicadas ou podem ser proteínas PirA ou PirB diferentes. A combinação de múltiplas proteínas PirA e/ou PirB como uma proteína de fusão pode aumentar a atividade contra uma espécie de praga alvo específica ou pode aumentar a gama de espécies de praga em que a atividade está presente.
[00195] O termo "segmento" ou "fragmento" é usado neste pedido para descrever sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos consecutivas que são mais curtas do que o aminoácido completo ou sequência de ácido nucleico que descreve uma das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas PirAB. Um segmento ou fragmento exibindo atividade inibidora de inseto também é descrito neste pedido se o alinhamento de tal segmento ou fragmento, com a seção correspondente das proteínas PirA estabelecidas em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100 ou 105; as proteínas PirB estabelecidas em SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 107, 135, 139 ou 143; ou as proteínas de fusão PirAB estabelecidas em SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 50, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 137, 141, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157, ou proteína inseticida de membro da família relacionada resulta em um alinhamento de cerca de 65 a cerca de 100 por cento de identidade entre o segmento ou fragmento e a seção correspondente da proteína alinhada. Um segmento ou fragmentos de uma das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas PirAB descritas neste documento podem compreender pelo menos cerca de 50 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 75 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 100 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 125 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 150 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 200 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 250 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 300 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 350 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 400 aminoácidos contíguos aminoácidos, pelo menos cerca de 450 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 500 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 550 aminoácidos contíguos, ou pelo menos cerca de 600 aminoácidos contíguos de uma das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas PirAB. Um segmento ou fragmento de uma das proteínas PirA, das proteínas PirB ou das proteínas PirAB no presente documento descritas pode exibir a atividade da sequência de base.
[00196] A referência neste pedido aos termos "ativo" ou "atividade", "atividade pesticida" ou "pesticida" ou "atividade inseticida", "inibidor de inseto" ou "inseticida" refere-se à eficácia de um agente tóxico, como uma toxina de proteína, em inibir (inibir o crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), suprimir (suprimir o crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), controlar (controlar a infestação de pragas, controlar as atividades de alimentação de pragas em uma cultura específica contendo uma quantidade eficaz de um ou mais das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB. Estes termos se destinam a incluir o resultado do provimento de uma quantidade pesticida eficaz de uma proteína tóxica para uma praga em que a exposição da praga à proteína tóxica resulta em morbidade, mortalidade, fecundidade reduzida ou nanismo. Estes termos também incluem repulsão da praga da planta, de um tecido da planta, de uma parte da planta, da semente, das células de plantas, ou da localização geográfica específica onde a planta esteja crescendo, como resultado do provimento de uma quantidade pesticida eficaz da proteína tóxica dentro ou sobre a planta. De um modo geral, uma atividade pesticida se refere à capacidade de uma proteína tóxica para ser eficaz na inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade, comportamento alimentar, comportamento de acasalamento, fecundidade, ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por uma alimentação de insetos desta proteína, fragmento de proteína, segmento proteína ou polinucleotídeo de uma determinada praga-alvo, incluindo, mas não se limitando aos insetos da ordem Coleóptera e Hemiptera. A proteína tóxica pode ser produzida pela planta ou pode ser aplicada à planta ou para o ambiente dentro do local onde a planta estiver localizada. O termo "bioatividade", "eficiente", "eficaz", ou variações dos mesmos também são termos utilizados intercambiavelmente neste pedido, a fim de descrever os efeitos das proteínas da presente invenção em pragas de insetos-alvo.
[00197] Uma quantidade pesticida eficaz de um agente tóxico, quando provido a uma praga-alvo, exibe atividade pesticida quando o agente tóxico contata a praga. Um agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na técnica. Os agentes químicos pesticidas ou inseticidas e os agentes proteicos pesticidas ou inseticidas podem ser usados sozinhos ou em combinações uns com os outros. Os agentes químicos incluem, mas não estão limitados a, moléculas de dsRNA direcionando genes específicos para a supressão em uma praga-alvo, organoclorados, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinóides e ranóides. Os agentes protéicos pesticidas ou inseticidas incluem as toxinas proteicas apresentadas neste pedido, bem como outros agentes tóxicos proteicos, incluindo aqueles que têm como alvo as espécies de pragas de coleópteros, Lepidópteros, Hemípteranos, Tisanópteros ou Dípteros.
[00198] As proteínas "relacionadas a inseto Photorhabdus", ou proteínas PirAB, são toxinas binárias com atividade pesticida contra alguns insetos.
Algumas proteínas PirAB demonstraram ter atividade de lepidópteros quando injetadas na hemocele do inseto.
No entanto, quando apresentada na dieta do inseto, a aplicação oral das proteínas PirAB mostrou pouca ou nenhuma atividade (ver, por exemplo, Yang et al. (2017) A proteína PirAB de Xenorhabdus nematophila HB310 exibe uma toxina binária com atividade inseticida e citotoxicidade na Galleria mellonella.
J.
Invertebr Pathol, 148: 43-50; Li et al. (2014) Photorhabdus luminescens PirAB-fusion protein exhibits both cytotoxicity and insecticidal activity.
FEMS Microbial Lett, 356: 23-31; Wu e Yunhong (2016) Scientific Reports 6, Article number: 34996; doi:10.1038/srep34996; e Zhang et al. (2013) XaxAB-like binary toxin from Photorhabdus luminescens exhibits both insecticidal activity and cytotoxicity.
FEMS Microbiol Lett 350: 48-56). A atividade oral das proteínas PirAB contra Lepidotera foi relatada, mas esses estudos se basearam na ingestão de uma dieta composta por bactérias E. coli que expressam as proteínas PirAB e não a toxina purificada fornecida na dieta do inseto (ver, por exemplo,Waterfield et al. (2005) The Photorhabdus Pir toxins are similar to a developmentally regulated insect protein but show no juvenile hormone esterase activity.
FEMS Microbiol Lett, 245: 47-52 e Blackburn et al. (2006) Remarkable susceptibility of the diamondback moth (Plutella xylostella) to ingestion of Pir toxins from Photorhabdus luminescens.
Entomologia Experimentalis et Applicata, 121: 31–37). Em total contraste, neste documento, conforme descrito nos Exemplos, preparações de proteínas das Proteínas PirA, Proteínas PirB e Proteínas de Fusão PirAB foram fornecidas nos bioensaios de dieta de inseto.
Atividade oral contra pragas de insetos lepidópteros, coleópteros e hemípteros foi observada e é apresentada nos exemplos.
Além disso, discos de folhas derivados de plantas que expressam as proteínas de fusão PirAB, TIC9316, TIC9317 e TIC9318 foram usados em estudos de alimentação de insetos orais que demonstraram atividade contra as espécies de praga de inseto Lepidóptero, broca do milho europeia e broca do milho do Sudoeste (SWCB). Além disso, os discos de folhas derivados de plantas que expressam TIC10376, TIC10378, TIC10380 e TIC10381 demonstraram atividade contra SWCB. Além disso, conforme descrito nos Exemplos, TIC9315 e TIC11302 demonstraram atividade contra pragas de Diabrotica virgifera em plantas estavelmente transformadas.
[00199] Pretende-se que a referência a uma praga, particularmente uma praga de uma planta de cultivo, signifique pragas de insetos de plantas de cultivo, particularmente aquelas que são controladas por pelo menos uma das Proteínas PirA, Proteína PirB e Proteínas PirAB, uma família relacionada proteína membro inseticida, ou um segmento ou fragmento da mesma.
[00200] Conforme descrito nos Exemplos, uma ou mais das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas PirAB exibem atividade inseticida contra pragas de insetos das espécies de pragas de insetos Coleópteros, Hemípteros e Lepidópteros, incluindo adultos, pupas, larvas e neonatos.
[00201] Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, lagartas na Família Noctuidae, por exemplo, lagarta militar do inverno (Spodoptera frugiperda), lagarta do cartucho da beterraba (Spodoptera exigua), lagarta do cartucho preta (Spodoptera exempta), lagarta do cartucho Bertha (Mamestra configurata), lagarta do cartucho do sul (Spodoptera eridania), lagarta de mariposa preta (Agrotis ipsilon), lagarta plusia do repolho (Trichoplusia ni), lagarta plusia da soja (Pseudoplusia includens), lagarta de veludo (Anticarsia gemmatalis), Hypena scabra, lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (Heliothis virescens), lagarta de mariposa granulada (Agrotis subterranea), lagarta do cartucho (Pseudaletia unipuncta), lagarta de mariposa ocidental (Agrotis orthogonia); larvas da Família Pyralidae, por exemplo, broca do milho europeu (Ostrinia nubilalis), larva de laranja (Amyelois transitella), verme de teias da raiz do milho (Crambus caliginosellus), verme de teias dos gramados (Herpetogramma licarsisalis), mariposa de girassol (Homoeosoma electellum), lagarta-elasmo (Elasmopalpus lignosellus); lagartas da Família Tortricidae, por exemplo, bicho da maçã (Cydia pomonella), traças de uva (Endopiza viteana), mariposa oriental (Grapholita molesta), traça do broto do girassol (Suleima helianthana); e muitas outras economicamente importantes de Lepidoptera, por exemplo, traças das crucíferas (Plutella xylostella), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) e mariposa-cigana (Lymantria dispar). Outras pragas de insetos da ordem dos lepidópteros incluem, por exemplo, curuquerê (Alabama argillacea), Archips argyrospila), desfolhador europeu (Archips rosana) e outras espécies Archips, (Chilo suppressalis, verme de arroz asiático ou verme de caule de arroz), lagarta-enroladeira do arroz (Cnaphalocrocis medinalis), verme de teias da raiz do milho (Crambus caliginosellus), lagarta da grama azul (Crambus teterrellus), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), broca da cana (Diatraea saccharalis), Earias insulana, Earias vittella, Helicoverpa armigera, lagarta da espiga do milho (Helicoverpa zea, também conhecida como broca-do-tomateiro), lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (Heliothis virescens), lagarta dos citros (Herpetogramma licarsisalis, Striacosta albicosta, traça-europeia-dos- cachos-da videira (Lobesia botrana), minadora de folha (Phyllocnistis citrella), borboleta branca do repolho (Pieris brassicae), borboleta pequena do repolho (Pieris rapae, também conhecida como verme do couve), lagarta-desfolhadora (Spodoptera litura) e minadora de tomate (Tuta absoluta).
[00202] Os insetos da ordem Coleoptera incluem, mas não estão limitados a, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp, particularmente quando a praga é a lagarta-da-raiz do milho do oeste da América do Norte (Diabrotica virgifera, WCR), lagarta-da-raiz do milho do nordeste da América do Norte (Diabrotica barberi, NCR), lagarta-da-raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae, MCR), lagarta-da-raiz do milho brasileira (Diabrotica balteata, BZR), lagarta-da-raiz do milho do sudeste da América do Norte (Diabrotica undecimpunctata howardii, SCR), besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata, CPB), um complexo de larva de raiz do milho brasileira (BCR, consistindo em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa), besouro-pulga cricífero (Phyllotreta cruciferae), besouro-pulga listrado (Phyllotreta striolata) e besouro- pulga preto do oeste da América do Norte (Phyllotreta pusilla).
[00203] Os insetos da ordem Hemiptera incluem, mas não estão limitados a, percevejos da família Pentatomidae: percevejos verdes do gênero Chinavia (Chinavia hilaris, Chinavia marginata, e Chinavia pensylvanica), percevejos do gênero Chlorochroa (Chlorochroa granulose, Chlorochroa kanei, Chlorochroa ligata, Chlorochroa lineate, Chlorochroa opuntiae, Chlorochroa persimilis, Chlorochroa rossiana, Chlorochroa sayi, Chlorochroa uhleri, Chlorochroa belfragii, Chlorochroa faceta, Chlorochroa osborni, Chlorochroa< saucia e Chlorochroa senilis), percevejos verdes do sul (Nezara viridula), percevejos do geênero Edessa (Edessa meditabunda, Edessa bifida, e Edessa florida), os percevejos verdes marrons neotropicais (Euschistus heros), percevejos do gênero Euschistus (Euschistus acuminatus, Euschistus biformis, Euschistus conspersus, Euschistus crenator, Euschistus egglestoni, Euschistus ictericus, Euschistus inflatus, Euschistus latimarginatus, Euschistus obscures, Euschistus politus, Euschistus quadrator, Euschistus sevus, Euschistus strenuous, Euschistus tristigmus e Euschistus variolarius), percevejo marmorado marrom (Halyomorpha halys), percevejo ombro vermelho (Thyanta accerra), percevejos do gênero Thyanta (Thyanta calceata, Thyanta custator, Thyanta pallidovirens, Thyanta perditor, Thyanta maculate, e Thyanta pseudocasta), percevejo barriga verde (Dichelops melacanthus) e outros percevejos do gênero Dichelops (Dichelops avilapiresi, Dichelops bicolor, Dichelops dimidatus, Dichelops furcatus, Dichelops furcifrons, Dichelops lobatus, Dichelops miriamae, Dichelops nigrum, Dichelops peruanus, Dichelops phoenix, and Dichelops saltensis), percevejo faixa vermelha (Piezodorus guildinni) assim como Piezodorus lituratus; e insetos da família dos Plataspidae, como percevejo kudzu (Megacopta cribraria), percevejo ocidental (Lygus hesperus), e percevejo manchado (Lygus lineolaris).
[00204] A referência neste pedido a uma "molécula de DNA isolada" ou um termo ou frase equivalente, destina-se a significar que a molécula de DNA é a que esteja presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácidos nucleicos, tais como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência principal não traduzida, sequência do promotor, sequência de terminação da transcrição e semelhantes que são encontradas naturalmente no DNA do genoma de um organismo não são considerados como "isolado "desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. No entanto, cada um destes elementos e suas subpartes seriam "isolados" no escopo da presente divulgação, desde que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. Da mesma forma, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida ou qualquer variante inseticida ocorrendo naturalmente dessa proteína seria uma sequência de nucleotídeos isolada, desde que a sequência de nucleotídeos não estivesse dentro do DNA da bactéria a partir da qual a sequência que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Uma sequência de nucleotídeo sintético que codifica a sequência de aminoácidos da proteína inseticida que ocorre naturalmente seria considerada isolada para os fins da presente divulgação. Para a finalidade da presente divulgação, qualquer sequência de nucleotídeos transgênicos, por exemplo, a sequência de nucleotídeos do DNA inserida no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente num vetor extra- cromossômico, seria considerada uma sequência de nucleotídeos isolada se estiver presente no plasmídeo ou na estrutura semelhante utilizada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis nos tecidos, na descendência, nas amostras biológicas ou produtos primários derivados da planta ou bactéria.
[00205] Conforme descrito adicionalmente neste documento, um operon contendo duas estruturas de leitura aberta (ORFs) que codificam a proteína PirA, TIC4771 (SEQ ID NO: 1) e a proteína PirB, TIC4772 (SEQ ID NO: 3), foi descoberto no DNA obtido da cepa de Xenorhabdus nematophila ISB000002 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC6880 (SEQ ID NO: 5), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC6880 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 6. O bioensaio usando células hospedeiras microbianas derivadas de TIC4771 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros Helicoverpa zea, CEW, Plutella xylostella,
DEM, Ostrinia nubilalis, ECB, Anticarsia gemmatalis, VBC, e Spodoptera eridania, SAW; as espécies de Coleópteros Leptinotarsa decemlineata, CPB; e as espécies Hemipteran Lygus lineolaris, TPB. O bioensaio usando TIC4772 derivado de célula hospedeira microbiana demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros CEW, DBM e VBC e as espécies de hemípteros TPB. Bioensaio usando proteína de fusão PirAB derivada de célula hospedeira microbiana, TIC6880 composta por TIC4771 e TIC4772, demonstrou atividade contra as espécies de Lepidóptero Spodoptera frugiperda, FAW, CEW, Diatraea grandiosella, SWCB, DBM, ECB e VBC, as espécies Coleópteros CPB e Diabrotica virgifera, WCR; as espécies de Hemipteras Lygus lineolaris, TPB, Lygus Hesperus, WTP, Nezara viridula, SGB e Euschistus heros, NBSB e as espécies de Dípteros Aedes aegypti, YFM.
[00206] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7575 (SEQ ID NO: 7) e a proteína PirB, TIC7576 (SEQ ID NO: 9) foi descoberto no DNA obtido de Xenorhabdus ehlersii cepa 85823 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9316 (SEQ ID NO: 11), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9316 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 12. O bioensaio usando TIC7575 e TIC7576 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos testados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC9316 - composta por TIC7575 e TIC7576 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, Lagarta rosca (Agrotis ipsilon, BCW), SAW, Lagarta do tabaco (Heliothis virescens, TBW), ECB e VBC, o Espécies de coleópteros CPB e as espécies de hemípteros TPB, WTP, SGB e NBSB.
[00207] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7660 (SEQ ID NO: 13) e a proteína PirB, TIC7661 (SEQ ID NO: 15) foi descoberto no DNA obtido de Xenorhabdus cabanillasii cepa 85908 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9317 (SEQ ID NO: 17), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9317 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 18. O bioensaio usando TIC7660 e TIC7661 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC9317 - composta por TIC7660 e TIC7661 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de Coleoptera CPB e WCR, e as espécies de Hemipteran TPB, WTP e SGB.
[00208] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7662 (SEQ ID NO: 19) e a proteína PirB, TIC7663 (SEQ ID NO: 21) foi descoberto no DNA obtido de Xenorhabdus ehlersii cepa85887 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 22, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9318 (SEQ ID NO: 23), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9318 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 24. O bioensaio usando TIC7662 e TIC7663 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC9318 - composta por TIC7662 e TIC7663 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, BCW, TBW, ECB e VBC, as espécies de coleópteros CPB e WCR, e as espécies de hemípteros TPB, WTP, SGB, e NBSB.
[00209] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7664 (SEQ ID NO: 25) e a proteína PirB, TIC7665 (SEQ ID NO: 27) foi descoberto no DNA obtido a partir de cepa de Xenorhabdus poinarii 86198 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9319 (SEQ ID NO: 29), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9319 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 30. O bioensaio usando TIC7664 derivado de célula hospedeira microbiana demonstrou atividade contra a espécie de Coleoptera CPB. O bioensaio usando TIC7665 derivado de célula hospedeira microbiana demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros TBW. O bioensaio usando a proteína de fusão PirAB, TIC9319 - composta por TIC7664 e TIC76653 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, BCW, ECB e VBC, a espécie de Coleoptera CPB e as espécies de Hemiptera TPB, WTP e SGB.
[00210] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC7666 (SEQ ID NO: 31) e a proteína PirB TIC7667 (SEQ ID NO: 33) foi descoberto no DNA obtido da cepa de Photorhabdus luminescens 86197 que codifica as toxinas da proteína apresentadas como SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9322 (SEQ ID NO: 35), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9322 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 36. O bioensaio usando TIC7666 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. O bioensaio usando TIC7667 derivado de célula hospedeira microbiana demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB. O bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC9322 - composta por TIC7666 e TIC7667 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB e VBC, as espécies de Coleópteros CPB e as espécies de hemípteros TPB.
[00211] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7668 (SEQ ID NO: 37) e a proteína PirB, TIC7669 (SEQ ID NO: 39) foi descoberto no DNA obtido a partir da cepa Photorhabdus luminescens 86194 que codifica as toxinas da proteína apresentadas como SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9320 (SEQ ID NO: 41), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9320 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 42. O bioensaio usando TIC7668 e TIC7669 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC9320 - composta por TIC7668 e TIC7669 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de coleópteros CPB e WCR, e as espécies de hemípteros TPB, SGB e NBSB.
[00212] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC7939 (SEQ ID NO: 43) e a proteína PirB, TIC7940 (SEQ ID NO: 45) foi descoberto no DNA obtido de uma espécie bacteriana desconhecida compreendida dentro de um microbioma que codifica as toxinas da proteína apresentado como SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC9321 (SEQ ID NO: 47), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC9321 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 48.
[00213] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC10357 (SEQ ID NO: 57) e a proteína PirB, TIC10366 (SEQ ID NO: 59) foi descoberto no DNA obtido de Shewanella violacea que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 60, respectivamente. Os dois quadros de leitura aberto foram usados para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10375 (SEQ ID NO: 61), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em frame para produzir a proteína de fusão TIC10375 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 62
[00214] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC10358 (SEQ ID NO: 63) e a proteína PirB, TIC10367 (SEQ ID NO: 65) foi descoberto no DNA obtido da cepa de Photorhabdus luminescens laumondii TTO1 que codifica as toxinas da proteína apresentadas como SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10376 (SEQ ID NO: 67), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10376 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 68. O bioensaio usando TIC10358 e TIC10367 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC10376 - composta por TIC10358 e TIC10367 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB e contra as espécies de Coleópteros Northern Corn Rootworm (Diabroticabarberi, NCR) e WCR.
[00215] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA, TIC10360 (SEQ ID NO: 69) e a proteína PirB, TIC10369 (SEQ ID
NO: 71) foi descoberto em DNA obtido de Photorhabdus asymbiotica que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 72, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10377 (SEQ ID NO: 73), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10377 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 74.
[00216] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC10361 (SEQ ID NO: 75) e a proteína PirB TIC10370 (SEQ ID NO: 77) foi descoberto em DNA obtido de Xenorhabdus sp.estirpe NBAII XenSa04 que codifica as toxinas proteicas apresentadas como SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 78, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10378 (SEQ ID NO: 79), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10378 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 80.
[00217] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC10362 (SEQ ID NO: 81) e a proteína PirB TIC10371 (SEQ ID NO: 83) foi descoberto no DNA obtido de cepa de Yersinia aldovae 670- 83 que codifica as toxinas da proteína apresentadas como SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 84, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10379 (SEQ ID NO: 85), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10379 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 86.
[00218] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC10363 (SEQ ID NO: 87) e a proteína PirB TIC10372 (SEQ ID NO: 89) foi descoberto no DNA obtido de cepa de Xenorhabdus doucetiae FRM16 que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 90, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10380 (SEQ ID NO: 91), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10380 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 92. O bioensaio usando TIC10363 e TIC10372 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC10380 - composta por TIC10363 e TIC10372 - demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros FAW, as espécies de coleópteros NCR e WCR e as espécies de Hemípteros NBSB.
[00219] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC10364 (SEQ ID NO: 93) e a proteína PirB TIC10373 (SEQ ID NO: 95) foi descoberto no DNA obtido de cepa de Xenorhabdus griffiniae BMMCB que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 94 e SEQ ID NO: 96, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10381 (SEQ ID NO: 97), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10381 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 98. O bioensaio usando TIC10364 e TIC10373 derivados de células hospedeiras microbianas não demonstrou atividade contra os insetos usados no ensaio. No entanto, o bioensaio usando a proteína de fusão PirAB TIC10378 - composta por TIC10364 e TIC10373 - demonstrou atividade contra as espécies de Coleoptera NCR e WCR e a espécie de Hemipteran NBSB.
[00220] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA TIC10359 (SEQ ID NO: 99) e a proteína PirB TIC10368 (SEQ ID NO: 101) foi descoberto no DNA obtido de Xenorhabdus nematophila que codifica as toxinas de proteína apresentadas como SEQ ID NO: 100 e SEQ ID NO: 102, respectivamente. Uma sequência de operon compreendendo TIC10359 e TIC10368 é apresentada como SEQ ID NO: 103.
[00221] Um operon contendo duas ORFs que codificam a proteína PirA PirA_ABE68878 (SEQ ID NO: 104) e a proteína PirB, PirB_ABE68879 (SEQ ID NO: 106) foi descoberto no DNA obtido da cepa de Photorhabdus luminescens Hm que codifica as toxinas da proteína apresentadas como SEQ ID NO. : 105 e SEQ ID NO: 107, respectivamente. As duas ORFs foram usadas para fazer uma proteína de fusão PirAB que codifica a sequência de DNA TIC10434 (SEQ ID NO: 108), em que as duas sequências de codificação foram operacionalmente ligadas e em quadro para produzir a proteína de fusão TIC10378 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 109. Bioensaio usando proteína de fusão PirAB derivada de célula hospedeira microbiana TIC10434 - composta por PirA_ABE68878 e PirB_ABE68879 - demonstrou atividade contra as espécies de Coleoptera NCR e WCR.
[00222] Um operon contendo a proteína PirB ORF que codifica TIC11505 (SEQ ID NO: 134) foi descoberto a partir de cepa de Xenorhabdus nematophila MDI-0035777 que codifica a toxina de proteína apresentada como SEQ ID NO: 135. A sequência de codificação da proteína de fusão PirAB TIC11056 (SEQ ID NO: 136) compreendeu a sequência de codificação de TIC10364 operacionalmente ligada na estrutura com a sequência de codificação de TIC11505 para produzir a proteína de fusão TIC11506 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 137.
[00223] Um operon contendo a proteína PirB ORF que codifica TIC11510 (SEQ ID NO: 138) foi descoberto a partir da cepa de Xenorhabdus nematophila MDI-0035777 que codifica a toxina de proteína apresentada como SEQ ID NO: 139. A sequência de codificação da proteína de fusão PirAB TIC11512 (SEQ ID NO: 140) compreendeu a sequência de codificação TIC10364 operacionalmente ligada na estrutura com a sequência de codificação de TIC11505 para produzir a proteína de fusão TIC11056 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 141.
[00224] Um operon contendo a proteína PirB ORF que codifica TIC11511 (SEQ ID NO: 142) foi descoberto a partir de cepa de Xenorhabdus nematophila MDI-0035777 que codifica a toxina de proteína apresentada como SEQ ID NO: 143. A sequência de codificação da proteína de fusão PirAB TIC11513 (SEQ ID NO: 144) compreendia a sequência de codificação de TIC10364 operacionalmente ligada na estrutura com a sequência de codificação de TIC11513 para produzir a proteína de fusão TIC11056 PirAB apresentada como SEQ ID NO: 145.
[00225] As proteínas de fusão PirAB, TIC11210, TIC11211 e TIC11301 compreenderam a proteína PirA TIC7575 e as proteínas PirB, TIC7665, TIC7667 e TIC7661, respectivamente. A proteína de fusão PirAB, TIC11212 compreende a proteína PirA TIC7662 e a proteína PirB TIC7665. A proteína de fusão PirAB, TIC11302 compreende a proteína PirA, TIC7660 e a proteína PirB, TIC7576. As proteínas de fusão PirAB TIC11210 e TIC11211 demonstraram atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB e as espécies de Hemípteros NBSB. As proteínas de fusão PirAB TIC11301 e TIC11302 demonstraram atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de Coleópteros WCR e as espécies de Hemípteros NBSB e WTP.
[00226] As proteínas de fusão PirAB, TIC11103 e TIC11104 compreendem uma proteína PirB congruente com uma proteína PirA. A proteína de fusão PirAB, TIC11103 é composta pela proteína PirB, TIC7661 e pela proteína PirA, TIC7660. A proteína de fusão PirAB, TIC11104 é composta pela proteína PirB TIC7663 e pela proteína PirA
TIC7662.
[00227] A proteína de fusão PirAB TIC11140 é composta por uma duplicação da proteína PirA TIC4771 e da proteína PirB TIC4472. A proteína de fusão PirAB TIC11141 é composta por uma duplicação da proteína PirA TIC7575 e da proteína PirB TIC7576. A proteína de fusão PirAB TIC11142 é composta pelas proteínas PirA, TIC7575 e TIC4771, e pela proteína PirB TIC4772. A proteína de fusão PirAB TIC11443 é composta pelas proteínas PirA TIC7660 e TIC7575 e pela proteína PirB, TIC7576. A proteína de fusão PirAB TIC11444 é composta pelas proteínas PirA TIC7575 e TIC7660 e pela proteína PirB TIC7661. A proteína de fusão PirAB TIC11445 é composta pelas proteínas PirA TIC7660 e TIC7662 e pela proteína PirB TIC7663. A proteína de fusão PirAB TIC11446 é composta pelas proteínas PirA TIC7662 e TIC7660 e pela proteína PirB TIC7661. TIC11442 derivado de célula hospedeira bacteriana demonstrou atividade contra a espécie de praga Hemipteran NBSB. TIC11444 derivado de células hospedeiras bacterianas demonstrou atividade contra as espécies SWCB de lepidópteros e as espécies NBSB de Hemípteros.
[00228] Conforme descrito nos Exemplos, as sequências de DNA sintético que codificam as proteínas de fusão PirAB TIC6880PL (SEQ ID NO: 49), TIC9316 (SEQ ID NO: 51), TIC9317 (SEQ ID NO: 53), TIC9318 (SEQ ID NO: 55), TIC9320 (SEQ ID NO: 57), TIC9322 (SEQ ID NO: 59), TIC10376PL (SEQ ID NO: 146), TIC10378PL (SEQ ID NO: 148), TIC10380PL (SEQ ID NO: 150), TIC10381PL (SEQ ID NO : 152), TIC11103 (SEQ ID NO: 154), TIC11104 (SEQ ID NO: 156) e TIC11302 (SEQ ID NO: 158) foram projetados para expressão em uma célula vegetal. Plantas de milho transformadas com construções de plasmídeo de transformação binária que expressam TIC9316, TIC9317 e TIC9318 demonstraram atividade contra as espécies de praga de Broca-do-milho europeia e Broca-do-milho do Sudoeste.
[00229] Para expressão em células vegetais, as proteínas de fusão PirAB pode ser expressa para residir no citossol ou direcionada a várias organelas da célula vegetal.
Por exemplo, direcionar uma proteína para o cloroplasto pode resultar em níveis aumentados de proteína expressada em uma planta transgênica enquanto evita a ocorrência de fenótipos inativos.
O direcionamento também pode resultar em um aumento na eficácia da resistência de pragas no evento transgênico.
Um peptídeo alvo ou peptídeo de trânsito é uma cadeia peptídica curta (3-70 aminoácidos) que direciona o transporte de uma proteína para uma região específica na célula, incluindo o núcleo, mitocôndria, retículo endoplasmático (ER), cloroplasto, apoplasto, peroxissoma e membrana plasmática.
Alguns peptídeos alvo são clivados da proteína por peptidases sinal após as proteínas serem transportadas.
Para direcionar o cloroplásto, as proteínas contêm peptídeos sinal que ficam em torno de 40-50 aminoácidos.
Para descrições do uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto, ver as patentes U.S.
N° 5,188,642 e 5,728,925. Muitas proteínas localizadas em cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de sinal do cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplastos isoladas incluem, mas não estão limitados a, aquelas associadas a subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5, carboxilase-bisfosfato, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, a proiteína I e II do complexo de colheita de luz, tioredoxina F, e enolpiruvil chiquimato fosfato sintase (EPSPS) e peptídeos de sinal descritos na patente Nº 7,193,133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que as proteínas não cloroplásticas podem ser direcionadas ao cloroplasto por meio do uso de fusões proteicas com uma CTP heteróloga e que a CTP é suficiente para direcionar uma proteína ao cloroplasto.
A incorporação de um peptídeo de sinal de cloroplasto adequado, como o Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2)
(Consultar, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) ou Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (Consultar, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) mostrou ter como alvo heterólogos Sequências de proteínas EPSPS para cloroplastos em plantas transgênicas (Consultar, Patentes U.S. nºs 5,627,061; 5,633,435; e 5,312,910; e EP 0218571; EP 189707; EP 508909; e EP 924299). Para direcionar uma das Proteínas de Fusão PirAB para o cloroplasto, uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto é colocada 5' em ligação operável e em quadro a uma sequência de codificação sintética que codifica uma das Proteínas de Fusão PirAB que foi projetada para expressão ideal em células vegetais.
[00230] É contemplado que sequências de proteínas de toxinas adicionais relacionadas às proteínas PirA, proteínas PirB e proteínas de fusão PirAB podem ser criadas usando a sequência de aminoácidos de ocorrência natural das proteínas PirA, proteínas PirB e proteínas de fusão PirAB para combinar diferenças no nível da sequência de aminoácidos em novas variantes da sequência de aminoácidos e fazer alterações apropriadas na sequência de ácido nucleico recombinante que codifica as variantes.
[00231] Essa divulgação contempla ainda que variantes melhoradas das proteínas PirA, das proteínas PirB e das proteínas de fusão PirAB podem ser manipuladas in planta usando vários métodos de edição de genes conhecidos na técnica. Essas tecnologias usadas para edição de genoma incluem, mas não estão limitadas a, ZFN (nuclease de dedo de zinco), meganucleases, TALEN (nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição) e sistemas CRISPR (repetições palindrômicas curtas com espaçamento regular entre espaçadas agrupadas)/Cas (associado a CRISPR). Estes métodos de edição de genoma podem ser utilizados para alterar a sequência de codificação de proteína de toxina transformada dentro de uma célula de planta para uma sequência de codificação de toxina diferente. Especificamente, através destes métodos, um ou mais códons dentro da sequência de codificação da toxina são alterados para projetar de uma nova sequência de aminoácidos de proteína. Alternativamente, um fragmento dentro da sequência de codificação é substituído ou eliminado, ou outros fragmentos de DNA são inseridos na sequência de codificação, a fim de projetar uma nova sequência de codificação de toxina. A nova sequência de codificação pode codificar uma proteína de toxina com novas propriedades, tais como atividade ou espectro aumentado contra pragas de insetos, bem como prover atividade contra uma espécie de praga de inseto que desenvolveu resistência contra a proteína de toxina de inseto original. A célula vegetal compreende a sequência de codificação de toxina editada por genes pode ser utilizada por métodos conhecidos na técnica para gerar plantas inteiras que expressem a nova proteína de toxina.
[00232] As proteínas que se assemelham às proteínas PirA, às proteínas PirB e às proteínas de fusão PirAB podem ser identificadas por comparação entre si usando vários algoritmos baseados em computador conhecidos na técnica. Por exemplo, as identidades de sequência de aminoácidos de proteínas relacionadas com as proteínas PirA, as proteínas PirB e as proteínas de fusão PirAB podem ser analisadas usando um alinhamento Clustal W usando esses parâmetros padrões: Matriz de ponderação: blosum, penalidade de abertura de intervalo: 10,0, extensão de intervalo penalidade: 0,05, Lacunas hidrofílicas: Ligado, Resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, penalidades de lacunas específicas de resíduos: Ligado (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680). A percentagem de identidade de aminoácidos é ainda calculada pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de aminoácidos/comprimento da proteína objeto). Outros algoritmos de alinhamento também estão disponíveis na técnica e proveem resultados semelhantes aos obtidos usando um alinhamento Clustal W.
[00233] Pretende-se que uma proteína que exibe atividade inibidora de inseto contra uma espécie de inseto Lepidóptero, ou Coleóptero ou Hemíptero esteja relacionada às Proteínas PirA se o alinhamento de tal proteína query com TIC7939 exibir pelo menos 65% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC7664 ou TIC7666 exibir pelo menos 97% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre as proteínas query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC4771 exibir pelo menos 98% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre as proteínas query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC7575, TIC7660, TIC7662, TIC7668, TIC10357, TIC10358, TIC10360, TIC10361, TIC10362, TIC10364, TIC10359 ou PirA_ABE68878 exibir 100% de identidade entre a proteína query e a objeto.
[00234] Pretende-se também que uma proteína que exibe atividade inibidora de inseto contra uma espécie de inseto Lepidóptero, ou Coleóptero ou Hemíptero esteja relacionada às Proteínas PirB se o alinhamento de tal proteína query com TIC7940 exibir pelo menos 65% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC4772 exibir pelo menos 97% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC4772 exibir pelo menos 97% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre as proteínas query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC7665, TIC7667 ou TIC10368 exibir pelo menos 98% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7669, TIC10366, TIC10367, TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, PirB_ABE68879, TIC11510, ou TIC11510, ou TIC11511 exibir 100% de identidade de sequência de aminoácidos entre a proteína query e a objeto.
[00235] Pretende-se também que uma proteína que exibe atividade inibidora de inseto contra uma espécie de inseto Lepidóptero, ou
Coleóptero ou Hemíptero está relacionada com as Proteínas de Fusão PirAB se o alinhamento de tal proteína query com TIC9321, TIC11411, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11513 exibir pelo menos 65% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC10434, TIC11440 ou TIC11442 exibir pelo menos 70% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9322, TIC9320, TIC10375, TIC10376, TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10381, TIC11211, TIC11301, TIC11302, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10381PL, TIC11103, ou TIC11104 exibir pelo menos de 80% até cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC9319, TIC10380, TIC11210, TIC11212 ou TIC10380PL exibir pelo menos 82% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC6880 ou TIC6880PL exibir pelo menos 86% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto; ou se o alinhamento de tal proteína query com TIC11506 ou TIC11512 exibir pelo menos 94% a cerca de 100% de identidade de aminoácidos ao longo do comprimento da proteína query que é cerca de 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência de aminoácidos (ou qualquer fração de uma porcentagem neste intervalo) entre a proteína query e a objeto.
[00236] As proteínas de exemplo PirA TIC4771, TIC7575, TIC7660, TIC7662, TIC7664, TIC7666, TIC7668, TIC7939, TIC10357, TIC10358, TIC10360, TIC10361, TIC10362, TIC10363, TIC10364, TIC10359 e PirA_ABE68878 foram alinhadas umas com as outras utilizando um algoritmo Clustal W. Uma matriz em pares de identidades de sequência de aminoácidos percentuais para cada uma das proteínas completas foi criada, conforme relatado nas Tabelas 4 e 5. Tabela 4. Exibição de matriz de pares de proteínas PirA. TIC766 TIC766 PirA_ABE6887 TIC103 TIC766 TIC103 TIC766 TIC103 Sequência 6 8 8 60 0 61 2 64 TIC7666 - 94,7 92,5 85,7 51,1 48,1 48,1 49,6 TIC7668 94,7 - 94 88,7 51,1 49,6 48,9 50,4 PirA_ABE688 78 89,1 90,6 - 81,2 47,8 46,4 47,1 48,6 TIC10360 85,7 88,7 84,2 - 50,4 50,4 52,6 52,6 TIC7660 48,2 48,2 46,8 47,5 - 93,6 75,2 71,6
TIC766 TIC766 PirA_ABE6887 TIC103 TIC766 TIC103 TIC766 TIC103 Sequência 6 8 8 60 0 61 2 64 TIC10361 44,8 46,2 44,8 46,9 92,3 - 75,5 73,4 TIC7662 45,4 46,1 46,1 49,6 75,2 76.6 - 85,1 TIC10364 46,5 47,2 47,2 49,3 71,1 73,9 84,5 - TIC7575 43,3 45,4 44 47,5 72.3 73,8 87.2 83.7 TIC4771 45,2 45,9 45,9 48,1 72,6 75,6 75,6 76,3 TIC7664 45,2 45,9 45,9 48,9 70,4 71,9 74,1 74,1 TIC10363 45,3 46 45,3 48,2 71,5 74,5 80,3 78,8 TIC10359 47,4 48,9 47,4 51,1 71,9 71,9 74,1 72,6 TIC7939 35,3 36,7 36 36,7 41,7 42,4 41,7 41,7 TIC10358 40,3 41 41 40,3 36,8 38,2 39,6 37,5 TIC10362 42,6 44,9 44,1 44,9 36,8 37,5 43,4 40,4 TIC10357 23,7 23,7 22,8 24,6 21,9 22,8 26,3 25,4
Tabela 5. Exibição de matriz de pares de proteínas PirA.
Sequência TIC7666 TIC7668 PirA_ABE68878 TIC10360 TIC7660 TIC10361 TIC7662 TIC10364 TIC7666 - 94,7 92,5 85,7 51,1 48,1 48,1 49,6 TIC7668 94,7 - 94 88,7 51,1 49,6 48,9 50,4 PirA_ABE68878 89,1 90,6 - 81,2 47,8 46,4 47,1 48,6 TIC10360 85,7 88,7 84,2 - 50,4 50,4 52,6 52,6 TIC7660 48,2 48,2 46,8 47,5 - 93,6 75,2 71,6 TIC10361 44,8 46,2 44,8 46,9 92,3 - 75,5 73,4 64/136 TIC7662 45,4 46,1 46,1 49,6 75,2 76.6 - 85,1 TIC10364 46,5 47,2 47,2 49,3 71,1 73,9 84,5 - TIC7575 43,3 45,4 44 47,5 72.3 73,8 87.2 83.7 TIC4771 45,2 45,9 45,9 48,1 72,6 75,6 75,6 76,3 TIC7664 45,2 45,9 45,9 48,9 70,4 71,9 74,1 74,1 TIC10363 45,3 46 45,3 48,2 71,5 74,5 80,3 78,8 TIC10359 47,4 48,9 47,4 51,1 71,9 71,9 74,1 72,6 TIC7939 35,3 36,7 36 36,7 41,7 42,4 41,7 41,7 TIC10358 40,3 41 41 40,3 36,8 38,2 39,6 37,5 TIC10362 42,6 44,9 44,1 44,9 36,8 37,5 43,4 40,4 TIC10357 23,7 23,7 22,8 24,6 21,9 22,8 26,3 25,4
[00237] Proteínas PirB de exemplo TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669 e TIC7940 foram alinhadas umas com as outras usando um algoritmo Clustal W.
Uma matriz em pares de identidades de sequência de aminoácidos percentuais para cada uma das proteínas completas foi criada, conforme relatado nas Tabelas 6 e 7.
Tabela 6. Exibição de matriz de pares de proteínas PirB.
Sequência TIC7667 TIC7669 PirB_ABE68879 TIC10369 TIC7576 TIC10373 TIC7663 TIC7661 TIC10370 TIC7667 - 95,5 93,6 93,3 49,6 48,7 49,6 48,9 49,4 TIC7669 95,5 - 95,7 94,5 50,4 49,6 50,4 49,4 49,9 PirB_ABE68879 93,6 95,7 - 94 50,1 49,2 50,8 49,2 49,9 TIC10369 93,3 94,5 94 - 49,4 48,9 50,4 49,2 49,4 TIC7576 48,9 49,6 49,4 48,7 - 94,8 90,6 87,5 89,9 TIC10373 48 48,9 48,5 48,2 94,8 - 92,7 86,4 87,8 TIC7663 48,9 49,6 50,1 49,6 90,6 92,7 - 84,2 86,1 66/136 TIC7661 48,2 48,7 48,5 48,5 87,5 86,4 84,2 - 95,3 TIC10370 48,7 49,2 49,2 48,7 89,9 87,8 86,1 95,3 - TIC10372 48,4 49,1 48,6 47,9 84,4 82,1 80,9 79,5 80,9 TIC11510 47,1 47,1 47,6 47,6 79,5 79 79,7 77,2 78,3 TIC11511 47,3 47,3 47,8 47,8 80 79,5 80,2 77,6 78.8 TIC10368 47,6 47,6 48 48 80,2 79,7 80,4 77,9 79 TIC11505 47 47 47,5 47,5 79,3 78.8 79,5 77 78,1 TIC4772 47,2 47,9 47,9 47,2 79,7 78,5 79,7 76,2 78 TIC7665 49 49,3 49,5 49,5 81,2 80,2 80,9 78,7 79,7 TIC10367 41,7 42,4 42 42,7 43,2 42,7 43,6 42,7 43,2 TIC10371 45,2 44,7 44,5 45 48,8 48,6 48,1 48,3 48,3 TIC7940 37 38,2 37,7 37 41,5 42,5 43 41,8 42,2 TIC10366 24,8 25,1 24,8 25,8 25,1 24,8 24,4 24,6 25,1
Tabela 7. Exibição de matriz de pares de proteínas PirB.
Sequência TIC10372 TIC11510 TIC11511 TIC10368 TIC11505 TIC4772 TIC7665 TIC10367 TIC10371 TIC7940 TIC10366 TIC7667 49,6 48,2 48,4 48,7 48,7 48,2 48,4 41,5 44,9 37 25,3 TIC7669 50,4 48,2 48,4 48,7 48,7 48,9 48,7 42,2 44,4 38,2 25,5 PirB_ABE68879 49,9 48,7 48,9 49,2 49,2 48,9 48,9 41,8 44,2 37,7 25,3 TIC10369 49,2 48,7 48,9 49,2 49,2 48,2 48,9 42,5 44,6 37 26,3 TIC7576 85,4 80,2 80,7 80,9 80,9 80,2 79.1 42,4 47,8 40,9 25,2 TIC10373 83,1 79,8 80,2 80,5 80,5 79.1 78,1 41,9 47,5 41,9 24,9 TIC7663 81,9 80,5 80,9 81,2 81,2 80,2 78.8 42,8 47,1 42,4 24,5 67/136 TIC7661 80,5 77,9 78,4 78,6 78,6 76,7 76,7 41,9 47,3 41,2 24,7 TIC10370 81,9 79.1 79,5 79,8 79,8 78,6 77,6 42,4 47,3 41,6 25,2 TIC10372 - 79.1 79,5 79,8 79,8 78.8 76,5 40,5 47,2 39,8 24,2 TIC11510 79,3 - 99,5 99,3 99,3 86,5 81,6 42,2 46,4 41 24,5 TIC11511 79,7 99,5 - 99,8 99,8 86,9 81,6 42,2 46,9 41 24,2 TIC10368 80 99,3 99,8 - 100 87,2 81,8 42 46,6 41 24 TIC11505 79 98,2 98,6 98,8 - 86,2 80,9 41,5 46,1 40,6 24 TIC4772 79,2 86,7 87,1 87,4 87,4 - 80,8 42,5 47 41,8 24,5 TIC7665 79,5 84,5 84,5 84,8 84,8 83,6 - 43 47,3 41,5 25,8 TIC10367 41,7 43,4 43,4 43,2 43,2 43,6 42,7 - 57,6 35 22,1 TIC10371 48,8 47,8 48,3 48,1 48,1 48,3 47,1 57,7 - 38,2 25,5 TIC7940 40,8 42 42 42 42 42,7 41,1 34,8 37,9 - 24,6 TIC10366 24,4 24,6 24,4 24,1 24,4 24,6 25,1 21,5 24,8 24,1 -
[00238] Proteínas de fusão PirAB exemplares TIC6880, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9322, TIC9320, TIC9321, TIC6880PL, TIC10375, TIC10376, TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10380, TIC10381, TIC10434, TIC11210, TIC11211, TIC11212, TIC11301, TIC11302, TIC11440, TIC11441, TIC11442, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11506, TIC11512, TIC11513, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, e TIC11104 foram alinhadas entre si usando um algoritmo Clustal W.
Uma matriz em pares de identidades de sequência de aminoácidos percentuais para cada uma das proteínas completas foi criada, conforme relatado nas Tabelas 8, 9, 10 e 11.
Tabela 8. Exibição de matriz de pares de proteínas de fusão PirAB.
Sequência TIC9322 TIC9320 TIC10434 TIC10377 TIC11211 TIC6880 TIC11440 TIC6880PL TIC11442 TIC11506 TIC9322 - 95,3 93,3 91,5 87,3 47,8 47,8 47,8 47,8 48,7 TIC9320 95,3 - 95,3 93,1 84,4 48,6 48,6 48,6 48,6 48,9 TIC10434 92,5 94,4 - 90,8 82 48,1 48,1 48,1 48,1 48,8 TIC10377 91,5 93,1 91,7 - 82,6 48 48 48 48 49,6 TIC11211 86,1 83,2 81,6 81,4 - 52,7 52,7 52,9 52,7 53,4 TIC6880 46,9 47,6 47,6 47,1 52,4 - 99,6 99,8 99,6 85,3 TIC11440 37,8 38,4 38,4 38 42,3 80,4 - 80,2 95,6 68,8
69/136 TIC6880PL 46,8 47,5 47,5 47 52,5 99,6 99,3 - 99,3 85,1 TIC11442 37,5 38,1 38,1 37,6 41,9 79,7 94,7 79,5 - 68,2 TIC11506 46,7 46,9 47,2 47,6 51,9 83,3 83,3 83,3 83,3 - TIC11513 46,9 47,1 47,5 47,8 52,2 83,9 83,9 83,9 83,9 99,8 TIC11512 46,8 46,9 47,3 47,6 52 83,5 83,5 83,5 83,5 99,5 TIC11210 47,2 47,7 47,6 48,3 55,5 81,1 81,1 81,1 81,1 84,7 TIC11212 47,2 47,6 47,7 48,5 54,2 80,9 80,9 80,9 80,9 84,7 TIC9319 47,7 48,1 48,3 48,8 54,3 83,2 83,2 83,1 83,2 82,5 TIC10380 47,8 48,5 48 48,1 53,8 79,2 79,2 79 79,2 79,9 TIC10380PL 47,7 48,4 47,9 48,1 53,9 78,9 78,9 79,2 78,9 79,8 TIC10381 47,4 48,3 48 48,1 52,7 78 78 78 78 84,8 TIC10381PL 47,4 48,2 47,9 48,1 52,6 77,8 77,8 77,8 77,8 84,5 TIC9318 47,5 48,2 48,6 48,9 54,4 78,4 78,4 78,4 78,4 81,8
Sequência TIC9322 TIC9320 TIC10434 TIC10377 TIC11211 TIC6880 TIC11440 TIC6880PL TIC11442 TIC11506 TIC11445 38 38,6 38,9 39,2 43,6 62,8 76,5 62,8 77,2 65,5 TIC9316 47,5 48,4 47,9 48,1 56 79 79 79 79 81,3 TIC11441 38 38,8 38,3 38,5 44,8 63,2 77,8 63,2 82,9 65,1 TIC11302 48,1 48,8 48,1 48,1 52,3 77,7 77,7 77,7 77,7 78,3 TIC11443 38,5 39 38,5 38,5 41,9 62,2 62,2 62,2 62,2 62,7 TIC9317 47,5 48,1 47,3 47,9 51,6 75,4 75,4 75,4 75,4 76,9 TIC11446 38 38,5 37,9 38,3 41,3 60,4 74,8 60,4 77,5 61,5 TIC11444 38 38,5 37,9 38,3 41,3 60,4 75 60,4 80,1 61,5 TIC11301 46,8 47,5 47 47,7 54,9 76,5 76,5 76,5 76,5 80
70/136 TIC10378 47,7 48,6 48,1 48,4 51,8 76,9 76,9 76,9 76,9 78 TIC10378PL 47,6 48,5 48 48,3 51,7 76,8 76,8 76,8 76,8 77,7 TIC11103 36,2 36,6 36,4 36,4 36,2 58,1 58,1 58,1 58,1 59 TIC11104 36,7 37,3 37,6 37,3 36,7 60,1 60,1 60,1 60,1 60,6 TIC10376 41,2 41,9 41,5 41,9 40,8 41,9 41,9 41,9 41,9 41,5 TIC10376PL 41,1 41,8 41,5 41,8 40,7 41,8 41,8 41,8 41,8 41,5 TIC10379 43,7 43,7 43,7 43,5 43,1 46,2 46,2 46,2 46,2 46,6 TIC9321 36,4 37,5 37,3 36,2 37,6 42,1 42,1 42,1 42,1 41,2 TIC10375 24,4 24,6 24,2 25,3 24,2 23,7 23,7 23,7 23,7 23,3
Tabela 9. Exibição de matriz em pares de proteínas de fusão PirAB.
Sequência TIC11513 TIC11512 TIC11210 TIC11212 TIC9319 TIC10380 TIC10380PL TIC10381 TIC10381PL TIC9318 TIC9322 48,6 48,4 47,5 47,5 47,5 49,1 49,1 48,7 48,7 48,7 TIC9320 48,7 48,6 48 47,8 47,8 49,8 49,8 49,6 49,6 49,5 TIC10434 48,7 48,5 47,4 47,6 47,6 48,8 48,8 48,8 48,8 49,4 TIC10377 49,5 49,3 48,6 48,7 48,6 49,5 49,5 49,5 49,5 50,2 TIC11211 53,2 53 55 53,8 53,2 54,5 54,6 53,4 53,4 55 TIC6880 85,1 84,7 79,9 79,8 81,2 79,8 79,6 78,5 78,5 78,9 TIC11440 68,6 68,3 64,5 64,3 65,5 64,3 64,2 63,3 63,3 63,6
71/136 TIC6880PL 84,9 84,6 79,8 79,6 80,9 79,4 79,8 78,4 78,4 78,7 TIC11442 68 67,8 63,9 63,8 64,9 63,8 63,6 62,8 62,8 63,1 TIC11506 99 98,6 81,6 81,6 78,6 78,6 78,6 83,5 83,3 80,4 TIC11513 - 99,6 82,1 82,1 79,2 79,2 79,2 84,1 83,9 80,9 TIC11512 99,6 - 82,1 82,1 79,2 78.8 78.8 83,7 83,5 80,6 TIC11210 84,5 84,5 - 96,8 93,2 79.1 79.1 80,9 80,7 82,2 TIC11212 84,5 84,5 96,8 - 92,8 79,3 79,3 80,9 80,7 85,2 TIC9319 82.3 82.3 94,2 93,8 - 79,4 79,2 78,7 78,7 79,2 TIC10380 79,7 79,4 77,4 77,6 76,9 - 99,8 81,7 81,7 81,1 TIC10380PL 79,6 79,2 77,3 77,5 76,6 99,6 - 81,5 81,5 81 TIC10381 84,7 84,3 79,2 79,2 76,2 81,7 81,7 - 99,8 90,7 TIC10381PL 84,3 84 78,9 78,9 76,1 81,5 81,5 99,6 - 90,3 TIC9318 81,6 81,3 80,6 83,6 76,9 81,3 81,3 90,8 90,6 -
Sequência TIC11513 TIC11512 TIC11210 TIC11212 TIC9319 TIC10380 TIC10380PL TIC10381 TIC10381PL TIC9318 TIC11445 65,3 65,1 64,5 66,9 61,5 65,1 65,1 72,7 72,6 80,1 TIC9316 81,1 80,7 83,4 80,4 77,2 83,7 83,7 92 91,9 89,8 TIC11441 64,9 64,6 66,8 64,4 61,8 67 67 73,7 73,6 71,9 TIC11302 78,1 77,7 77,2 77,7 76,1 81,6 81,6 89 88,9 86,7 TIC11443 62,5 62,2 61,8 62,2 61 65,3 65,3 71,3 71,1 69,4 TIC9317 76,7 76,3 75,8 76,1 74,4 77,9 77,9 82,7 82,5 82 TIC11446 61,4 61,1 60,7 61 59,5 62,4 62,4 66,2 66,1 65,6 TIC11444 61,4 61,1 60,7 61 59,5 62,4 62,4 66,2 66,1 65,6 TIC11301 79,9 79,5 82.3 79,2 75,6 79,9 79,9 85,9 85,7 84,8
72/136 TIC10378 77,8 77,5 76,6 76,9 75,4 79,4 79,4 84,3 84,2 83,5 TIC10378PL 77,5 77,2 76,3 76,6 75,2 79,3 79,3 84 84,4 83,1 TIC11103 58,8 58,5 57,4 57,4 57,4 60,4 60,4 64,8 64,8 63,3 TIC11104 60,4 60,1 59 59 59 61,5 61,5 69,6 69,6 75,1 TIC10376 41,7 41,7 41,4 41,7 40,8 40,6 40,6 41,5 41,5 42,8 TIC10376PL 41,6 41,6 41,3 41,6 40,7 40,6 40,6 41,5 41,5 42,7 TIC10379 46,7 46,4 45,5 46,6 45,3 47,1 47,1 46,9 46,7 47,3 TIC9321 41,2 41,2 40,3 40,9 40,9 41 41 41,9 41,9 42,5 TIC10375 23,5 23,7 24,6 24,6 25 24,2 24,2 24,2 24,2 24
Tabela 10. Exibição de matriz em pares de proteínas de fusão PirAB.
Sequência TIC11445 TIC9316 TIC11441 TIC11302 TIC11443 TIC9317 TIC11446 TIC11444 TIC11301 TIC9322 48,7 48,7 48,7 49,3 49,3 48,7 48,7 48,7 48 TIC9320 49,5 49,6 49,6 50 50 49,3 49,3 49,3 48,7 TIC10434 49,4 48,7 48,7 48,8 48,8 48,1 48,1 48,1 47,8 TIC10377 50,2 49,3 49,3 49,3 49,3 49,1 49,1 49,1 48,9 TIC11211 55 56,6 56,6 52,9 52,9 52,1 52,1 52,1 55,5 TIC6880 78,9 79,4 79,4 78.2 78.2 75,8 75,8 75,8 76,9 TIC11440 77,5 64 78.8 63 63 61,2 75,8 75,9 62
73/136 TIC6880PL 78,7 79,3 79,3 78 78 75,7 75,7 75,7 76,8 TIC11442 77,6 63,5 83,2 62,5 62,5 60,7 77,8 80,4 61,5 TIC11506 80,4 79,9 79,9 76,9 76,9 75,5 75,5 75,5 78,6 TIC11513 80,9 80,4 80,4 77,4 77,4 76 76 76 79,2 TIC11512 80,6 80 80 77,1 77,1 75,7 75,7 75,7 78.8 TIC11210 82,2 85 85 78,7 78,7 77,3 77,3 77,3 84 TIC11212 85,2 82 82 79,3 79,3 77,7 77,7 77,7 80,7 TIC9319 79,2 79,6 79,6 78,5 78,5 76,7 76,7 76,7 78 TIC10380 81,1 83,6 83,6 81,5 81,5 77,8 77,8 77,8 79,7 TIC10380PL 81 83,5 83,5 81,3 81,3 77,6 77,6 77,6 79,6 TIC10381 90,7 91,9 91,9 88,9 88,9 82,5 82,5 82,5 85,7 TIC10381PL 90,3 91,5 91,5 88,6 88,6 82,2 82,2 82,2 85,4 TIC9318 100 89,8 89,8 86,7 86,7 82 82 82 84,8
Sequência TIC11445 TIC9316 TIC11441 TIC11302 TIC11443 TIC9317 TIC11446 TIC11444 TIC11301 TIC11445 - 71,9 86,6 69,4 69,4 65,6 80,6 80,3 67,9 TIC9316 89,8 - 100 93,5 93,5 83,9 83,9 83,9 90,1 TIC11441 86,6 80,1 - 74,8 74,8 67,2 84,6 87,1 72,1 TIC11302 86,7 93,5 93,5 - 100 90,1 90,1 90,1 83,9 TIC11443 69,4 74,8 74,8 80,1 - 72,1 72,1 72,1 67,2 TIC9317 82 83,9 83,9 90,1 90,1 - 100 100 93,5 TIC11446 80,6 67,2 84,6 72,1 72,1 80,1 - 97,5 74,8 TIC11444 80,3 67,2 87,1 72,1 72,1 80,1 97,5 - 74,8 TIC11301 84,8 90,1 90,1 83,9 83,9 93,5 93,5 93,5 -
74/136 TIC10378 83,5 85,7 85,7 90,3 90,3 94,4 94,4 94,4 90 TIC10378PL 83,1 85,4 85,4 90 90 94 94 94 89,6 TIC11103 63,3 65,7 65,7 65,7 65,7 75,1 75,1 75,1 75,1 TIC11104 75,1 68 68 68 68 63,3 63,3 63,3 63,3 TIC10376 42,8 42,1 42,1 41,7 41,7 41,4 41,4 41,4 41,7 TIC10376PL 42,7 42 42 41,6 41,6 41,3 41,3 41,3 41,6 TIC10379 47,3 46,9 46,9 46 46 45,7 45,7 45,7 46,4 TIC9321 42,5 40,9 40,9 41,2 41,2 41,4 41,4 41,4 41 TIC10375 24 24,6 24,6 24 24 23,7 23,7 23,7 24,2
Tabela 11. Exibição de matriz em pares de proteínas de fusão PirAB.
Sequência TIC10378 TIC10378PL TIC11103 TIC11104 TIC10376 TIC10376PL TIC10379 TIC9321 TIC10375 TIC9322 49,1 49,1 37,1 37,7 41,8 41,8 43,7 36,8 23,9 TIC9320 50 50 37,5 38,2 42,6 42,6 43,7 37,9 24,1 TIC10434 49 49 37 38,2 41,8 41,8 43,3 37,3 23,5 TIC10377 49,8 49,8 37,3 38,2 42,6 42,6 43,5 36,6 24,8 TIC11211 52,5 52,5 36,6 37,1 40,9 40,9 42,5 37,5 23,4 TIC6880 77,6 77,6 58,4 60,4 41,7 41,7 45,3 41,7 22,7 TIC11440 62,6 62,6 47,1 48,7 33,7 33,7 36,5 33,7 18,3
75/136 TIC6880PL 77,5 77,5 58,3 60,3 41,7 41,7 45,2 41,7 22,7 TIC11442 62,1 62,1 46,7 48,3 33,4 33,4 36,2 33,4 18,2 TIC11506 76,9 76,7 58 59,5 40,5 40,5 44,6 39,9 21,9 TIC11513 77,4 77,2 58,3 59,9 41 41 45,2 40,3 22,2 TIC11512 77,1 76,9 58 59,5 41 41 44,8 40,3 22,4 TIC11210 78,4 78.2 58,6 60,2 41,8 41,8 45,2 40,5 24 TIC11212 78,7 78,6 58,6 60,2 42,2 42,2 46,3 41,1 24 TIC9319 78 78 59,2 60,8 41,7 41,7 45,5 41,5 24,6 TIC10380 79,5 79,5 60,3 61,4 40,2 40,2 45,9 40,4 23,1 TIC10380PL 79,4 79,4 60,2 61,3 40,1 40,1 45,8 40,3 23,1 TIC10381 84,5 84,3 64,7 69,5 41,1 41,1 45,7 41,3 23,1 TIC10381PL 84,2 84,5 64,6 69,4 41 41 45,4 41,2 23,1 TIC9318 83,7 83,6 63,3 75,1 42,4 42,4 46,1 41,9 23
Sequência TIC10378 TIC10378PL TIC11103 TIC11104 TIC10376 TIC10376PL TIC10379 TIC9321 TIC10375 TIC11445 67 66,9 50,6 60,1 33,9 33,9 36,9 33,5 18,4 TIC9316 86 85,9 65,7 68 41,7 41,7 45,8 40,3 23,5 TIC11441 68,9 68,7 52,6 54,5 33,4 33,4 36,6 32,2 18,8 TIC11302 90,6 90,5 65,7 68 41,3 41,3 44,9 40,6 23 TIC11443 72,6 72,4 52,6 54,5 33,1 33,1 35,9 32,5 18,4 TIC9317 94,7 94,5 75,1 63,3 41 41 44,5 40,8 22,6 TIC11446 75,8 75,7 60,1 50,6 32,8 32,8 35,6 32,7 18,1 TIC11444 75,8 75,7 60,1 50,6 32,8 32,8 35,6 32,7 18,1 TIC11301 90,3 90,1 75,1 63,3 41,3 41,3 45,2 40,5 23,1
76/136 TIC10378 - 99,8 71,3 64,4 41,5 41,5 44,5 41,4 23,1 TIC10378PL 99,6 - 71,2 64,3 41,5 41,5 44,3 41,3 23 TIC11103 71,6 71,6 - 82 31,6 31,6 35,7 30,9 18,4 TIC11104 64,7 64,7 82 - 32,3 32,3 35,5 31,8 18,2 TIC10376 42,1 42,1 31,9 32,6 - 99,8 54,9 34,8 21,6 TIC10376PL 42 42 31,9 32,6 99,6 - 54,8 34,7 21,5 TIC10379 45,8 45,7 36,6 36,4 55,8 55,8 - 37,1 24,5 TIC9321 42,1 42,1 31,4 32,3 34,9 34,9 36,7 - 22 TIC10375 24,2 24,2 19,2 19 22,4 22,4 25 22,7 -
[00239] Além da identidade percentual, as proteínas PirA, as proteínas PirB e as proteínas de fusão PirAB também podem estar relacionadas pela estrutura primária (motivos de aminoácidos conservados), pelo comprimento (cerca de 133 a cerca de 141 aminoácidos para PirA; cerca de 414 a cerca de 428 aminoácidos para PirB; cerca de 549 a cerca de 566 aminoácidos para as proteínas de fusão PirAB) e por outras características.
As características das proteínas PirA, das proteínas PirB e das proteínas de fusão PirAB são relatadas na Tabela 12. Tabela 12. Características selecionadas de proteínas PirA, proteínas PirB e proteínas PirAB.
Número Número de Amino- Comprim de Número Peso Carga ácidos Número de ento do Ponto Amino- de Amino- Proteína molecular em pH Fortemen Aminoácidos Amino- Isoelétrico ácidos ácidos (Daltons) 7,0 -te Hidrofóbicos ácido Fortemen Polares Básicos te Ácidos (-) TIC4771 14963,57 135 5,6164 -1,5 14 14 65 70 TIC4772 48146,05 428 4.5643 -16,0 41 53 216 212 TIC6880 63092,59 563 4,6836 - 17,5 55 67 281 282 TIC6880PL 63163,67 564 4,6836 - 17,5 55 67 282 282 TIC7575 15655,22 141 5,0636 -2,0 12 13 68 73 TIC7576 47775,12 425 4,7039 -12,5 44 53 221 204 TIC9316 63412,32 566 4,7572 14,5 56 66 289 277 TIC7660 15352,83 141 4,5839 -4,0 11 14 72 69 TIC7661 47774,39 425 4,7572 -5,5 50 51 222 203 TIC9317 63109.20 566 5,1542 -9,5 61 65 294 272 TIC7662 15761,42 141 4,6130 -3,5 11 14 68 73 TIC7663 47895,35 425 5,0745 -7,5 48 52 221 204 TIC9318 63638,76 566 4,9378 -11,0 59 66 289 277 TIC7664 14950,65 135 5,0636 -2,0 12 13 68 67 TIC7665 46819,71 414 4.6887 -12,5 43 52 214 200 TIC9319 61752,34 549 4,7452 14,5 55 65 282 267 TIC7666 14751,43 133 4,6137 -4,0 12 15 68 65
Número Número de Amino- Comprim de Número Peso Carga ácidos Número de ento do Ponto Amino- de Amino- Proteína molecular em pH Fortemen Aminoácidos Amino- Isoelétrico ácidos ácidos (Daltons) 7,0 -te Hidrofóbicos ácido Fortemen Polares Básicos te Ácidos (-) TIC7667 46246,08 419 5,4603 -5,5 50 51 220 199 TIC9322 60979,49 552 5,1485 -9,5 62 66 288 264 TIC7668 14785,54 133 5,1215 -2,5 14 15 68 65 TIC7669 46249,04 419 5,3001 -6,5 50 52 222 197 TIC9320 61016,56 552 5,2518 -9,0 64 67 290 262 TIC7939 15470,32 139 6,2480 -0,5 15 14 70 69 TIC7940 47493,26 419 4,8783 -11,0 53 60 218 201 TIC9321 62945,57 558 5,0432 -11,5 68 74 288 270 TIC10357 12838,48 114 4,7910 -3,0 11 13 68 46 TIC10366 47691,61 427 4,3657 -22,0 43 62 221 206 TIC10375 60512,07 541 4,4263 25,0 54 75 289 252 TIC10358 16198,29 144 7,7512 1,5 20 17 68 76 TIC10367 47147,69 417 7,7679 5,5 60 49 222 195 TIC10376 63327,96 561 7,8092 7,0 80 66 290 271 TIC10376PL 63399,04 562 7,8092 7,0 80 66 291 271 TIC10360 14976,76 133 4,8490 -2,5 14 16 64 69 TIC10369 46322,33 419 5,6804 -4,0 50 50 224 195 TIC10377 61281,07 552 5,3889 -6,5 64 66 288 264 TIC10361 15629,20 143 4,7632 -3,0 11 13 71 72 TIC10370 47710,32 425 5,0742 -8,0 48 52 225 200 TIC10378 63321,51 568 4,9947 -11,0 59 65 296 272 TIC10378PL 63392,59 569 4,9947 -11,0 59 65 297 272 TIC10362 15173,94 136 5,1440 -1,5 13 14 62 74 TIC10371 46.947,97 416 5,8572 -3,5 47 46 218 198 TIC10379 62103,90 552 5,6801 -5,0 60 60 280 272 TIC10363 15195,80 137 4,7774 -3,0 11 13 67 70 TIC10372 48400,97 430 4,7717 -11,0 45 53 229 201 TIC10380 63578,76 567 4.7697 -14,0 56 66 296 271 TIC10380PL 63649,84 568 4,7697 -14,0 56 66 297 271 TIC10364 15833,53 142 4,4792 -5,0 11 15 72 70 TIC10373 47791,02 425 4.7003 -12,5 44 53 220 205
Número Número de Amino- Comprim de Número Peso Carga ácidos Número de ento do Ponto Amino- de Amino- Proteína molecular em pH Fortemen Aminoácidos Amino- Isoelétrico ácidos ácidos (Daltons) 7,0 -te Hidrofóbicos ácido Fortemen Polares Básicos te Ácidos (-) TIC10381 63606,54 567 4,6406 - 17,5 55 68 292 275 TIC10381PL 63677,62 568 4,6406 - 17,5 55 68 293 275 TIC10359 14949,54 135 4,7873 -3,5 12 14 68 67 TIC10368 48194,25 429 4.7481 -11,5 43 51 219 210 PirA_ABE68878 15303,18 138 6,2470 -5,0 15 14 71 67 PirB_ABE68879 46424,34 419 5,2938 -6,5 50 52 224 195 TIC10434 61709,50 557 5,4906 -7,0 65 66 295 262 TIC11103 63109.20 566 5,1542 -9,5 61 65 294 272 TIC11104 63638,76 566 4,9378 -11,0 59 66 289 277 TIC11210 62456,91 555 4,7452 14,5 55 65 282 273 TIC11211 61883,28 560 5,3591 -7,5 62 64 288 272 TIC11212 62563,12 555 4,6679 -16,0 54 66 282 273 TIC11301 63411,60 566 5,3685 -7,5 62 64 290 276 TIC11302 63109,93 566 4,6735 - 16,5 55 67 293 273 TIC11440 78037,15 698 4,7751 19,0 69 81 346 352. TIC11441 79049,52 707 4,7960 - 16,5 68 79 357 350 TIC11442 78728,81 704 4,7287 -19,5 67 80 349 355 TIC11443 78747,13 707 4.7204 -18,5 67 80 361 346 TIC11444 78746,41 707 5,1362 -11,5 73 78 362 345 TIC11445 78973,57 707 4,8575 -15,0 70 80 361 346 TIC11446 78852,61 707 5,0123 -13,0 72 79 362 345 TIC10364 15833,53 142 4,4792 -5,0 11 15 72 70 TIC11505 48750,86 434 4,6998 -12,5 43 52 221 213 TIC11506 64566,38 576 4,6400 - 17,5 54 67 293 283 TIC11510 48184,21 429 4,7481 -11,5 43 51 218 211 TIC11512 63999,72 571 4,6730 - 16,5 54 66 290 281 TIC11511 48208,27 429 4,7481 -11,5 43 51 219 210 TIC11513 64023,79 571 4,6730 - 16,5 54 66 291 280
[00240] Conforme também descrito nos Exemplos deste pedido, as sequências de moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam as Proteínas de Fusão PirAB foram concebidas para utilização em plantas. Sequências de moléculas de ácido nucleico recombinantes otimizadas para plantas exemplares que foram projetadas para uso em plantas são apresentadas como SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 146, 148, 150, 152, 154, 156 e 158.
[00241] Cassetes de expressão e vetores contendo essas sequências de moléculas de ácido nucleico recombinantes podem ser construídos e introduzidos em milho, soja, algodão ou outras células vegetais de acordo com métodos e técnicas de transformação conhecidos na técnica. Por exemplo, a transformação mediada por Agrobacteriumé descrita nas Publicações do Pedido de Patente US 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (milho), 2008/0282432 (algodão), 2008/0256667 (algodão), 2003/0110531 (trigo), 2001/0042257 A1 (beterraba sacarina), Patentes US Nºs 5,750,871 (canola), 7,026,528 (trigo) e 6,365,807 (arroz), e em Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7: 213-222 (cana-de-açúcar), todos incorporados neste documento por referência em sua totalidade. As células transformadas podem ser regeneradas em plantas transformadas que expressam as proteínas de fusão PirAB TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320 ou TIC9322. Para testar a atividade pesticida, os bioensaios são realizados na presença de larvas de praga de Lepidoptera usando discos de folhas de plantas obtidos a partir de plantas transformadas, como descrito nos Exemplos. Para testar a atividade pesticida contra pragas Coleópteros, as plantas transformadas da geração Ro e F1 são usadas no teste de lagartas de raiz, conforme descrito no exemplo abaixo. Para testar a atividade pesticida contra as pragas de Hemiptera, vagens, espigas de milho ou folhas das plantas transformadas são utilizadas no ensaio, ou a partir de tecido removido da planta ou permanecendo na planta como descrito nos Exemplos.
[00242] Como uma alternativa aos métodos de transformação tradicionais, uma sequência de DNA, tal como um transgene, cassete(s) de expressão, etc., pode ser inserida ou integrada em um sítio específico ou locus dentro do genoma de uma planta ou célula vegetal via integração sítio-direcionada.
Os construtos de DNA recombinante e moléculas desta divulgação podem assim incluir uma sequência matriz doadora compreendendo pelo menos um transgene, cassete de expressão ou outra sequência de DNA para inserto no genoma da planta ou célula vegetal.
Tal matriz doadora para integração sítio- dirigida pode ainda incluir um ou dois braços de homologia flanqueando uma sequência de inserção (isto é, a sequência, transgene, cassete, etc., a ser inserido no genoma da planta). Os construtos de DNA recombinante desta divulgação podem compreender ainda cassetes de expressão que codifica uma nuclease sítio-específica e/ou quaisquer proteínas associadas para realizar a integração sítio-dirigida.
Estas cassete (s) expressando nuclease podem estar presentes na mesma molécula ou vector que o modelo doador (em cis) ou numa molécula ou vetor separado (em trans). Vários métodos para integração sítio-dirigida são conhecidos na técnica envolvendo diferentes proteínas (ou complexos de proteínas e/ou RNA guia) que cortam o DNA genômico para produzir uma quebra de fita dupla (double strand break, DSB) ou entalhes em um sítio genômico ou locus desejado.
Conforme entendido na técnica, durante o processo de reparação do DSB ou corte introduzido pela enzima nuclease, o DNA do molde do doador pode se tornar integrado ao genoma no local do DSB ou corte.
A presença do(s) braço(s) de homologia na matriz doadora pode promover a adoção e direcionamento da sequência de inserto no genoma vegetal durante o processo de reparo através de recombinação homóloga, embora um evento de inserto possa ocorrer através de união de extremidade não homóloga (NHEJ). Exemplos de nucleases específicas do local que podem ser utilizadas incluem nucleases de dedo de zinco,
meganucleases artificiais ou nativas, endonucleases TALE e endonucleases guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Para métodos que utilizam nucleases sítio-específicas guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1), os construtos de DNA recombinante também compreenderão uma sequência que codifica um ou mais RNAs guia para direcionar a nuclease para o sítio desejado dentro do genoma da planta.
[00243] São contempladas as composições de moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB ou proteínas inseticidas relacionadas. Por exemplo, as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB ou proteínas inseticidas relacionadas podem ser expressas com construtos de DNA recombinante em que uma molécula de polinucleotídeo com uma ORF que codifica a proteína está operacionalmente ligada a elementos de expressão genética, como um promotor e qualquer outro elemento regulador necessário para expressão no sistema para o qual o construto se destina. Exemplos não limitantes incluem um promotor funcional de planta operacionalmente ligado às proteínas de fusão PirAB, TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, e TIC11302 ou sequências codificadoras de proteína inseticida para membros da família relacionadas para a expressão da proteína em plantas ou um promotor funcional Btoperacionalmente ligado a proteínas PirA, tais como PirA_ABE68878, ou as proteínas PirB TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669, TIC7940, TIC10366, TIC10367, TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, TIC10368, PirB_ABE68879, TIC11505, TIC11510, and TIC11511; or the PirAB fusion proteins, TIC6880, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9322, TIC9320, TIC9321, TIC6880PL, TIC10375, TIC10376,
TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10380, TIC10381, TIC10434, TIC11210, TIC11211, TIC11212, TIC11301, TIC11302, TIC11440, TIC11441, TIC11442, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11506, TIC11512, TIC11513, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, and TIC11104, e ou sequências codificadoras de proteína inseticida relacionadas para a expressão da proteína em uma bactéria Bt ou outra espécie de Bacillus. Outros elementos podem ser operacionalmente ligados à proteína Pira PirA_ABE68878, as proteínas PirB TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669, TIC7940, TIC10366, TIC10367, TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, TIC10368, PirB_ABE68879, TIC11505, TIC11510, and TIC11511, or the PirAB fusion proteins, TIC6880, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9322, TIC9320, TIC9321, TIC6880PL, TIC10375, TIC10376, TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10380, TIC10381, TIC10434, TIC11210, TIC11211, TIC11212, TIC11301, TIC11302, TIC11440, TIC11441, TIC11442, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11506, TIC11512, TIC11513, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, e TIC11104, ou sequências codificadoras de proteína inseticida relacionadas, incluindo, mas não se limitando a, intensificadores, íntrons, líderes não traduzidos, tags de imobilização de proteína codificada (HIS-tag), peptídeos de translocação (ou seja, peptídeos de trânsito de plastídios, peptídeos de sinal), sequências de polipeptídeos para modificação pós-tradução de enzimas, sítios de ligação ribossomal e sítios alvo de RNAi.
[00244] Exemplos de moléculas de polinucleotídeos recombinantes fornecidos no presente documento incluem, mas não estão limitados a, um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um polinucleotídeo, tal como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:158 que codifica um polipeptídeo ou proteína com a sequência de aminoácidos conforme determinado na SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109,
SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155 e SEQ ID NO:157. Um promotor heterólogo também pode ser operacionalmente ligado a sequências de codificação de DNA sintéticas que codificam para um plastídeo alvo TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, e TIC11302 ou TIC6880PL não alvo, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 e TIC11302 ou proteínas inseticidas relacionadas. Os códons de uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica as proteínas descritas neste documento podem ser substituídos por códons sinônimos (conhecidos na técnica como uma substituição silenciosa).
[00245] Conforme usado neste documento, o termo "recombinante" refere-se a um DNA não natural, proteína, ou organismo que não seria normalmente encontrado na natureza e foi criado por intervenção humana. Uma “molécula de DNA recombinante” é uma molécula de DNA que compreende uma combinação de moléculas de DNA que não ocorreriam naturalmente juntas e é o resultado da intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA que é composta por uma combinação de pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas entre si, como uma molécula de DNA que compreende um transgene e o DNA genômico da planta adjacente ao transgene, é uma molécula de DNA recombinante.
[00246] Como utilizado neste documento, o termo "heterólogo"
refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de DNA quando tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes da mesma espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um elemento regulador é assim heterólogo no que diz respeito a uma molécula de DNA transcrevível operacionalmente ligado se uma tal combinação não é normalmente encontrada na natureza, por exemplo, a molécula de DNA transcrevível não ocorre naturalmente operacionalmente ligado ao elemento regulador.
[00247] Um construto de DNA recombinante compreendendo uma sequência de codificação para as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB ou proteína inseticida relacionada pode compreender ainda uma região de DNA que codifica um ou mais agentes inibidores de insetos que podem ser configurados para expressar concomitantemente ou coexpressar com uma sequência de DNA que codifica a proteína PirA, a proteína PirB ou a proteína de fusão PirAB, ou uma proteína inseticida relacionada, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto ou uma proteína acessória. As proteínas acessórias incluem, mas não estão limitadas a, co-fatores, enzimas, parceiros de ligação ou outros agentes que funcionam para auxiliar na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, ao contribuir para a sua expressão, influenciando a sua estabilidade em plantas, ao otimizar e energia livre para oligomerização, ao aumentar a sua toxicidade e aumentar o seu espectro de atividade. Uma proteína acessória pode facilitar a absorção de um ou mais agentes inibidores de insetos, por exemplo, ou tornar possível os efeitos tóxicos do agente tóxico.
[00248] Um construto de DNA recombinante pode ser montado de modo que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA sejam expressas a partir de um promotor ou cada proteína ou molécula de dsRNA estejam sob controle de promotor separado ou alguma combinação destes. As proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB e proteínas relacionadas desta invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão de múltiplos genes em que uma ou mais das proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB, ou proteínas relacionadas são expressas a partir de um segmento de nucleotídeo comum que também contém outras estruturas de leitura aberta e promotores, dependendo do tipo de sistema de expressão selecionado. Por exemplo, um sistema de expressão de multi-gene bacteriano pode utilizar um único promotor para conduzir a expressão de estruturas de leitura aberta multiplicar-ligados/tandem a partir de dentro de um único operon (ou seja, expressão policistrônica). Em outro exemplo, um sistema de expressão multigenético vegetal pode utilizar cassetes de expressão multiplamente ligados, cada um expressando uma proteína diferente ou outro agente, tal como uma ou mais moléculas de dsRNA.
[00249] Moléculas de ácido nucleico recombinante ou construtos de DNA recombinante compreendendo as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB, ou sequência de codificação de proteína membro da família relacionada, podem ser entregues às células hospedeiras por vetores, por exemplo, um plasmídeo, baculovírus, cromossomo sintético, vírion, cosmídeo, fagemídeo, fago ou vetor viral. Esses vetores podem ser usados para alcançar a expressão estável ou transitória das proteínas PirA, das proteínas PirB ou das proteínas de fusão PirAB, ou sequências de codificação de proteínas relacionadas em uma célula hospedeira, ou expressão subsequente do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende uma sequência codificadora de proteína e que é introduzida em uma célula hospedeira também é referido, neste documento, como um "transgene".
[00250] Bactérias transgênicas, células vegetais transgênicas, plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas que contêm um polinucleotídeo recombinante que expressa qualquer uma ou mais das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB ou sequências de codificação de proteínas relacionadas. O termo "célula bacteriana" ou "bactéria" pode incluir, mas não está limitado a, uma Agrobacterium, um Bacilo, uma Escherichia, uma Salmonella, uma Pseudomonas, ou uma célula de Rhizobium. O termo "célula vegetal" ou "planta" pode incluir, mas não está limitado a uma célula dicotiledônea ou a uma célula monocotiledônea. As plantas contempladas e células vegetais incluem, mas não estão limitadas a alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, álamo, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, portaenxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo. Em outras modalidades, são providas plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula vegetal transgênica. Em determinadas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica pelo corte, estalo, trituração ou desassociação de parte da planta. Em certas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, uma cápsula, uma folha, uma parte de flor, uma haste, uma raiz, ou qualquer porção dele, ou uma porção não-
regenerável de uma parte da planta transgênica. Conforme utilizado neste contexto, uma porção "não regenerável" de uma parte de planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira capaz de reprodução sexual ou assexual. Em certas modalidades, uma porção não regenerável de uma parte de planta é uma porção de uma semente, cápsula, folha, flor, caule ou de uma raiz transgênica.
[00251] Métodos de produção de plantas transgênicas que compreendem quantidades inibidoras de insetos, coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros de uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302; ou proteínas relacionadas são fornecidas. Essas plantas podem ser feitas introduzindo um polinucleotídeo recombinante que codifica qualquer proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou proteína relacionada fornecida neste pedido a uma célula vegetal, e selecionando uma planta derivada da referida célula vegetal que expressa uma quantidade inibidora de inseto, Coleoptera, Lepidoptera ou Hempitera das proteínas. As plantas podem ser derivadas a partir de células vegetais por regeneração, sementes, pólen ou técnicas de transformação de meristema. Os métodos para transformação vegetal são conhecidos na técnica.
[00252] Processados produtos vegetais, em que o produto processado compreende uma quantidade detectável de um TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou proteína relacionada, um segmento inibidor de inseto ou fragmento dele, ou qualquer porção distintiva dele, também são descritos neste pedido. Em certas modalidades, o produto processado é escolhido do grupo que consiste em partes de planta, biomassa de planta, óleo, refeição, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelos, fibras, cascas, sementes processadas e sementes. Em determinadas modalidades, o produto processado é não regenerável. O produto vegetal pode compreender produto primário ou outros produtos de comércio derivados de uma planta transgênica ou parte de planta transgênica, em que o produto primário ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio detectando segmentos de nucleotídeos ou RNA expresso ou proteínas que codificam ou compreendem porções distintas de uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou TIC11302; ou proteína relacionada.
[00253] Plantas que expressam uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou TIC11302, ou proteínas relacionadas podem ser cruzadas por reprodução com eventos transgênicos expressando outras proteínas de toxina e/ou expressando outros traços transgênicos como genes de tolerância a herbicidas, genes que conferem rendimento ou características de tolerância ao estresse, e semelhantes, ou tais características podem ser combinadas em um único vetor de modo que as características estejam todas ligadas.
[00254] Conforme descrito adicionalmente nos Exemplos, as sequências que codificam TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 e TIC11302 foram concebidas para uso em plantas. Cassetes de expressão e vetores contendo essas sequências de nucleotídeos sintéticos ou artificiais podem ser construídos e introduzidos em células de plantas de milho, algodão e soja de acordo com métodos e técnicas de transformação que são conhecidos na técnica. As células transformadas são regeneradas em plantas transformadas que expressam TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 e TIC11302. A fim de testar a atividade pesticida, os bioensaios são realizados na presença de pragas lepidópteros, coleópteros e hemipteranos.
[00255] Conforme descrito adicionalmente nos Exemplos, as sequências que codificam uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 ou porteína relacionada e sequências com uma identidade percentual substancial com essas proteínas, ou essas proteínas podem ser identificadas usando métodos conhecidos pelos versados na técnica, como reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação térmica e hibridização. Por exemplo, uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 ou proteínas relacionadas podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a proteínas relacionadas, e podem ser usadas para triar e encontrar outros membros da proteína que estão intimamente relacionados.
[00256] Além disso, as sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 ou proteínas relacionada podem ser usados como sondas e primers para identificar outros membros da classe usando ciclo térmico ou amplificação isotérmica e métodos de hibridização. Por exemplo, os oligonucleotídeos derivados de sequências conforme estabelecido como SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156 e SEQ ID NO: 158 podem ser usados para determinar a presença ou ausência de uma TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou transgene de proteína relacionado em uma amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um produto primário.
Dada a sensibilidade de certos métodos de detecção de ácido nucleico que usam oligonucleotídeos, antecipa-se que os oligonucleotídeos derivados das sequências estabelecidas como SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, e SEQ ID NO: 158 podem ser usados para detectar um transgene de TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou TIC11302 em produtos primários derivados de fontes agrupadas em que apenas uma fração do produto primário é derivada de uma planta transgênica que contém qualquer uma das SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, ou SEQ ID NO:158. É ainda reconhecido que tais oligonucleotídeos podem ser usados para introduzir a variação da sequência de nucleotídeos na SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO:
156 ou SEQ ID NO: 158. Tais oligonucleotídeos de “mutagênese” são úteis para a identificação de TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou relacionados com a sequência de aminoácidos variantes exibindo uma gama de atividade inibitória de inseto ou expressão variada em células hospedeiras de plantas transgênicas.
[00257] Homologadores de sequência de nucleotídeos, por exemplo, as proteínas inseticidas codificadas por sequências de nucleotídeos que se hibridam com cada uma ou qualquer uma das sequências descritas neste pedido sob condições de hibridação são também uma modalidade da presente invenção. A invenção também prove um método para detectar uma primeira sequência de nucleotídeos que se hibrida a uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos (ou a sua sequência de complemento reverso) codifica uma proteína pesticida ou um seu fragmento pesticida e hibrida sob condições de hibridação rigorosas para a segunda sequência de nucleotídeos. Nesse caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91,
SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:158 em condições de hibridização rigorosas. As sequências de codificação de nucleotídeos se hibridam entre si sob condições de hibridação apropriadas e as proteínas codificadas por essas sequências de nucleotídeos reagem de forma cruzada com o antissoro levantado contra qualquer uma das outras proteínas. As condições de hibridação rigorosas, conforme definidas neste documento, compreendem pelo menos hibridação a 42°C seguida de duas lavagens durante cinco minutos cada uma à temperatura ambiente com SSC 2X, SDS a 0,1%, seguido por duas lavagens durante trinta minutos cada a 65°C em 0,5X SSC, SDS a 0,1%. As lavagens a temperaturas ainda maiores constituem condições ainda mais rigorosas, por exemplo, condições de hibridação de 68oC, seguida de lavagem às 68oC, em 2xSSC, contendo 0,1% de SDS.
[00258] Aquele versado na técnica reconhecerá que, devido à redundância do código genético, muitas outras sequências são capazes de codificar proteínas relacionadas com as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB e essas sequências, na medida em que eles funcionam para expressar proteínas pesticidas em cepas de Bacillus ou em células vegetais, são modalidades da presente invenção, reconhecendo, é claro, que muitas dessas sequências de codificação redundantes não hibridizarão sob essas condições com as sequências nativas de Xenorhabdus ou Photorhabdus que codificam as proteínas
PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB. Este pedido contempla o uso destes e de outros métodos de identificação conhecidos pelos versados na técnica, para identificar as proteínas PirA, as proteínas PirB ou as proteínas de fusão PirAB, ou sequências de codificação de proteínas relacionadas e sequências com um percentual de identidade substancial para isso.
[00259] Métodos de controle de insetos, em particular lepidópteros, coleópteros ou infestações de Hempiterana de plantas de cultivo, com a proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou proteínas relacionadas, também são descritos neste pedido. Tais métodos podem compreender o cultivo de uma planta compreendendo uma quantidade inibidora de inseto, Coleoptera, ou Lepidoptera ou Hemiptera de uma TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou proteína de toxina relacionada. Em certas modalidades, tais métodos podem compreender ainda qualquer um ou mais dentre: (i) aplicar qualquer composição compreendendo ou codificando uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302, ou proteína de toxina relacionada a uma planta ou uma semente que dá origem a uma planta; e (ii) transformar uma planta ou célula vegetal que dá origem a uma planta com um polinucleotídeo que codifica uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou TIC11302, ou proteína de toxina relacionada. Em geral, é contemplado que uma TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL,
TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou uma proteína TIC11302 fornecida pode ser fornecida em uma composição de toxina, ou proteína relacionada, fornecida, ou pode ser fornecida em uma composição de toxina relacionada ou em um microrganismo, ou fornecido em uma planta transgênica para conferir atividade inibidora de inseto contra insetos lepidópteros, coleópteros ou hemípteros.
[00260] Em certas modalidades, uma molécula de ácido nucleico recombinante das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB ou proteína de toxina relacionada é o ingrediente ativo como inseticida de uma composição inibidora de inseto preparada por cultura de Bacillus recombinante ou qualquer outra célula bacteriana recombinante transformado para expressar uma das proteínas PirA, proteínas PirB ou proteínas de fusão PirAB, ou proteína de toxina relacionada sob condições adequadas para expressão. Tal composição pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de tais células recombinantes que expressam/produzem o dito polipeptídeo recombinante. Esse processo pode resultar em um extrato de células bacterianas entomopatogênicas de Bacillus ou outros, suspensão celular, homogeneizado celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular ou pellet celular. Ao obter os polipeptídeos recombinantes assim produzidos, uma composição que inclui os polipeptídeos recombinantes podem incluir células bacterianas, esporos bacterianos e os corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para várias utilizações, incluindo produtos de pulverização inibidoras de insetos agrícolas ou formulações inibidoras de insetos em bioensaios de dieta.
[00261] Em uma modalidade, para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência, uma composição inibidora de inseto compreendendo uma das proteínas PirA, proteínas PirB ou proteínas de fusão PirAB ou uma proteína relacionada pode compreender ainda pelo menos um polipeptídeo adicional conhecido pelos versados ordinariamente na técnica que exibe atividade inibidora de insetos contra as mesmas espécies de insetos Lepidópteros, Coleópteros ou Hemípteros, mas que é diferente das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB ou uma proteína de toxina relacionada. Polipeptídeos adicionais possíveis para uma tal composição incluem uma proteína inibidora de insetos e uma molécula de dsRNA inibidora de insetos. Um exemplo para a utilização de tais sequências de ribonucleotídeos para controlar pragas de insetos é descrito em Baum, et al. (Publicação de Patente US 2006/0021087 A1).
[00262] Tais polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de lepidópteros podem ser selecionados do grupo que consiste de uma proteína inibidora de inseto, tais como, mas sem limitação, Cry1A (Patente US Nº 5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (Publicação de Patente US No. 10/525,318), Cry1C (Patente US Nº 6,033,874), Cry1D, Cry1Da e variantes respectivas, quimeras tipo Cry1E, Cry1F, e Cry1A/F (Patentes US Nºs 7,070,982; 6,962,705; e 6,713,063), quimeras tipo Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1 tais como, mas sem limitação, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, e TIC1100 (Publicação de Pedido Internacional WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (Publicação de Pedido Internacional WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (Patente US Nº 7,064,249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI- 030, AXMI-035, AND AXMI-045 (Publicação de Patente US 2013- 0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI- 112, AXMI-117, AXMI-100 (Publicação de Patente US 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (Publicação de Patente US 2013- 0104259 A1), AXMI-134 (Publicação de Patente US 2013-0167264 A1),
AXMI-150 (Publicação de Patente US 2010-0160231 A1), AXMI-184 (Publicação de Patente US 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (Publicação de Patente US 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (Publicação de Patente US 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (Publicação de Patente US 2014-0196175 A1), AXMI-238 (Publicação de Patente US 2014-0033363 A1), AXMI-270 (Publicação de Patente US 2014-0223598 A1), AXMI-345 (Publicação de Patente US 2014- 0373195 A1), AXMI-335 (Publicação de Pedido Internacional WO2013/134523(A2)), DIG-3 (Publicação de Patente US 2013-0219570 A1), DIG-5 (Publicação de Patente US 2010-0317569 A1), DIG-11 (Publicação de Patente US 2010-0319093 A1), AfIP-1A e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2014-0033361 A1), AfIP-1B e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (Publicação de Patente US 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (Publicação de Patente US 2014-0007292 A1), AECFG- 592740 (Publicação de Patente US 2014-0007292 A1), Pput_1063 (Publicação de Patente US 2014-0007292 A1), DIG-657 (Publicação de Pedido Internacional WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (Publicação de Patente US 2014-0007292 A1), GS-135 e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2012-0233726 A1), GS153 e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2012-0192310 A1), GS154 e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2012-0192310 A1), GS155 e derivados respectivos (Publicação de Patente US 2012- 0192310 A1), SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2011-0112013 A1, SEQ
ID NO:2 and 4 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 or 4 e derivados respectivos como descritos na Publicação de Patente US 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Patente US Nº 7,772,465 (B2), CF161_0085 e derivados respectivos como descritos na WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de lepidóptero e seus derivados como descritos nas Publicações de Patente US US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1, and US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos em US7510878(B2), SEQ ID NO:2 e derivados respectivos como descritos na Patente US Nº 7812129(B1), Cry71Aa1 e Cry72Aa1 (Publicação de Patente US US2016-0230187 A1), Axmi422 (US Publicação de Patente US2016-0201082 A1), Axmi440 (Publicação de Patente US US2016-0185830 A1), Axmi281 (Publicação de Patente US 2016-0177332 A1), BT-0044, BT-0051, BT-0068, BT-0128 e variantes respectivas (WO 2016-094159 A1), BT-009, BT-0012, BT-0013, BT- 0023, BT0067 e variantes respectivas (WO 2016-094165 A1), Cry1JP578V, Cry1JPS1, Cry1 JPS1P578V (WO 2016-061208 A1); e similares.
[00263] Esse polipeptídeo adicional para o controle de pragas de coleópteros pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, como, mas não se limitando a, Cry3Bb (Patente US Nº 6.501.009), variantes de Cry1C, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (Publicação de Patente US 2013-0167264 A1) AXMI-184 (Publicação de Patente 2010-0004176 A1), AXMI-205 (Publicação de Patente US 2014-0298538 A1), AXMI-
207 (Publicação de Patente US 2013- 0303440 A1), AXMI-218, AXMI- 220 (Publicação de Patente US 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI- 223z (Publicação de Patente US 2014-0196175 A1), AXMI-279 (Publicação de Patente US 2014-0223599 A1), AXMI- R1 e variantes destes (Publicação de Patente US 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (Publicação de Patente US 2010-0319092 A1), eHIPs (Publicação de Pedido Patente US Nº 2010/0017914), IP3 e suas variantes (Publicação de Patente US 2012-0210462 A1), -Hexatoxin-Hv1a (Publicação de Pedido Patente US 2014-0366227 A1), variantes de PHI-4 (Publicação de Pedido Patente US 2016-0281105 A1), variantes de PIP-72 (WO 2016-144688 A1), variantes de PIP-45, variantes de PIP-64, variantes de PIP-74, variantes de PIP-75 e variantes de PIP-77 (WO 2016-144686 A1), DIG-305 (WO 2016109214 A1), variantes de PIP-47 (Publicação de Patente US 2016-0186204 A1), DIG-17, DIG-90, DIG-79 (WO 2016- 057123 A1), DIG-303 (WO 2016-070079 A1); e semelhantes.
[00264] Tais polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de Hemiptera podem ser selecionados do grupo que consiste em proteínas ativas de Hemiptera, tais como, mas não se limitando a, TIC1415 (Publicação de Patente US 2013-0097735 A1), TIC807 (Patente US No. 8609936), TIC852 e TIC853 (Publicação de Patente US 2010-0064394 A1), TIC834 e suas variantes (Publicação de Patente US 2013-0269060 A1), AXMI-036 (Publicação de Patente US 2010-0137216 A1) e AXMI- 171 (Publicação de Patente US 2013-0055469 A1), Cry64Ba e Cry64Ca (Liu et al., (2018) Cry64Ba and Cry64Ca, Two ETX/MTX2-Type Bacillus thuringiensis Insecticidal Protein Active against Hemipteran Pests. Applied and Environmental Microbiology, 84(3): 1-11).
[00265] Em outras modalidades, essa composição/formulação pode compreender adicionalmente pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de inseto para um inseto que não é inibido por uma proteína inibidora de inseto da presente invenção para expandir o espectro de inibição de inseto obtido, por exemplo, um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de insetos para Thysanopterans.
[00266] A possibilidade de os insetos desenvolverem resistência a certos inseticidas foi documentada na técnica. Uma estratégia de manejo da resistência a insetos é usar culturas transgênicas que expressam dois agentes inibidores de insetos distintos que operam por meio de diferentes modos de ação. Portanto, quaisquer insetos com resistência a qualquer um dos agentes inibidores de inseto pode ser controlado por outro agente inibidor de inseto. Outra estratégia de gestão de resistência a insetos usa a utilização de plantas que não são protegidas para as espécies de pragas de coleópteros e Lepidópteros direcionadas para fornecer um refúgio para tais plantas não protegidas. Um exemplo particular é descrito na patente U.S. Nº 6,551,962, que é incorporada neste documento na íntegra por referência.
[00267] Outras modalidades, tais como produtos químicos pesticidas aplicados topicamente são concebidos para o controle de pragas que também são controladas pelas proteínas descritas neste documento para serem utilizadas com proteínas em tratamentos de sementes, spray, gotejamento ou formulações de limpeza podem ser aplicadas diretamente ao solo (calda de regulador de crescimento aplicada ao solo), aplicado a plantas em crescimento expressando as proteínas descritas neste documento ou formulada para ser aplicada a sementes contendo um ou mais transgenes codificando uma ou mais das proteínas descritas. Essas formulações para uso em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com vários adesivos e agentes de aderência conhecidos na técnica. Tais formulações podem conter pesticidas que são sinérgicos no modo de ação com as proteínas descritas, de modo que os pesticidas de formulação atuem por meio de um modo de ação diferente para controlar as mesmas pragas ou pragas semelhantes que podem ser controladas pelas proteínas descritas, ou que tais pesticidas atuem para controlar pragas dentro de uma gama mais ampla de hospedeiros ou espécies de pragas de plantas que não são efetivamente controladas por uma das Proteínas PirA, Proteínas PirB ou Proteínas de Fusão PirAB ou proteínas pesticidas relacionadas.
[00268] A composição/formulação mencionada acima pode compreender ainda um veículo aceitável em agricultura, tal como uma isca, um pó, poeira, grânulo, granulado, pulverização, emulsão, uma suspensão coloidal, uma solução aquosa, uma preparação de esporos/cristais Bacillus, um tratamento de sementes, uma célula vegetal recombinante/tecido vegetal/semente/planta transformada para expressar uma ou mais das proteínas ou bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas. Dependendo do nível de inibidor de pesticida ou inibição inseticida inerente ao polipeptídeo recombinante e o nível de formulação a ser aplicado a uma planta ou ensaio de dieta, a composição/formulação pode incluir várias quantidades por peso de polipeptídeo recombinante, por exemplo, a partir de 0,0001% a 0,001% a 0,01% a 1% a 99% por peso de polipeptídeo recombinante.
EXEMPLOS
[00269] Aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, compreender que muitas alterações podem ser feitas nos aspectos específicos que são descritos e ainda obter um resultado parecido ou semelhante, sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Assim, detalhes estruturais e funcionais específicos descritos neste documento não devem ser interpretados como limitativos. Deve ser entendido que a toda a divulgação de cada referência citada neste documento é incorporada dentro da divulgação do presente pedido. EXEMPLO 1 Descoberta das proteínas PirA e das proteínas PirB e da
Construção das Proteínas de Fusão PirAB
[00270] Este exemplo descreve a descoberta das proteínas PirA pesticidas TIC4771, TIC7575, TIC7660, TIC7662, TIC7664, TIC7666, TIC7668, TIC7939, TIC10357, TIC10358, TIC10360, TIC10361, TIC10362, TIC10363, TIC10364, TIC10359, e PirA_ABE68878 (coletivamente, "As Proteínas PirA"), proteínas PirB TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669, TIC7940, TIC10366, TIC10367, TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, TIC10368, PirB_ABE68879, TIC11505, TIC11510, e TIC11511 (coletivamente, "As Proteínas PirB"), e a criação das proteínas de fusão PirAB, TIC6880, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9322, TIC9320, TIC9321, TIC6880PL, TIC10375, TIC10376, TIC10377, TIC10378, TIC10379, TIC10380, TIC10381, TIC10434, TIC11210, TIC11211, TIC11212, TIC11301, TIC11302, TIC11440, TIC11441, TIC11442, TIC11443, TIC11444, TIC11445, TIC11446, TIC11506, TIC11512, TIC11513, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, e TIC11104 (coletivamente, "As Proteínas de Fusão PirAB").
[00271] As sequências que codificam as proteínas pesticidas PirAB Photorabdus e Xenorabdus foram identificadas a partir de coleções proprietárias, bem como informações de sequência públicas, sintetizadas, clonadas, confirmadas por sequência e testadas em bioensaios de insetos. Os operons bacterianos foram identificados a partir de espécies de Photorabdus e Xenorabdus, cada operon compreendendo uma sequência de codificação PirA e PirB. As proteínas pesticidas PirA TIC4771, TIC7575, TIC7660, TIC7662, TIC7664, TIC7666, TIC7668, TIC7939, TIC10357, TIC10358, TIC10360, TIC10361, TIC10362, TIC10363, TIC10364, TIC10359, and PirA_ABE68878; and PirB proteins TIC4772, TIC7576, TIC7661, TIC7663, TIC7665, TIC7667, TIC7669, TIC7940, TIC10366, TIC10367,
TIC10369, TIC10370, TIC10371, TIC10372, TIC10373, TIC10368, PirB_ABE68879, TIC11505, TIC11510, e TIC11511, foram isolados a partir das espécies Photorabdus e Xenorabdus listadas na Tabela 13. Com relação às proteínas TIC7939 e TIC7940, o operon foi identificado a partir de uma amostra de microbioma e a espécie bacteriana da qual foi derivado ainda é desconhecida. Tabela 13. Novas proteínas das toxinas pesticidas PirA e PirB e as espécies Photorabdus e Xenorabdus correspondentes. Proteína PirA Proteína PirB Nucleo- Nucleotí- tídeo Proteína deo Proteína
SEQ IDSEQ ID SEQ IDSEQ ID Espécies Bacterianas Toxina NO: NO: Toxina NO: NO: Xenorhabdus nematophila ISB000002 TIC4771 1 2 TIC4772 3 4 Xenorhabdus ehlersii 85823 TIC7575 7 8 TIC7576 9 10 Xenorhabdus cabanillasii 85908 TIC7660 13 14 TIC7661 15 16 Xenorhabdus ehlersii 85887 TIC7662 19 20 TIC7663 21 22 Xenorhabdus poinarii 86198 TIC7664 25 26 TIC7665 27 28 Photorhabdus luminescens 86197 TIC7666 31 32 TIC7667 33 34 Photorhabdus luminescens 86194 TIC7668 37 38 TIC7669 39 40 Microbioma TIC7939 43 44 TIC7940 45 46 Shewanella violacea DSS12 TIC10357 57 58 TIC10366 59 60 Photorhabdus luminescens laumondii TTO1TIC10358 63 64 TIC10367 65 66 Photorhabdus asymbiotica TIC10360 69 70 TIC10369 71 72 Xenorhabdus sp.NBAII XenSa04 TIC10361 75 76 TIC10370 77 78 Yersinia aldovae 670-83 TIC10362 81 82 TIC10371 83 84 Xenorhabdus doucetiae FRM16 TIC10363 87 88 TIC10372 89 90 Xenorhabdus griffiniae BMMCB TIC10364 93 94 TIC10373 95 96 Xenorhabdus nematophila TIC10359 99 100 TIC10368 101 102 Photorhabdus luminescens Hm PirA_ABE68878 104 105 PirB_ABE68879106 107 Xenorhabdus nematophila MDI-0035777 TIC11505 134 135 Xenorhabdus bovienii MDI-0035808 TIC11510 138 139 Xenorhabdus nematophila AN6/1 TIC11511 142 143
[00272] As sequências que codificam as proteínas pesticidas PirA e PirB de Photorabdus e Xenorabdus foram identificadas a partir de coleções proprietárias, bem como informações de sequência públicas, sintetizadas, clonadas, confirmadas por sequência e testadas em bioensaios de insetos. Os operons bacterianos foram identificados e os primers de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram projetados com base em contigs derivados do sequenciamento de cada espécie Photorabdus e Xenorabdus listada na Tabela 13. Amplicons da sequência codificadora completa para cada toxina de proteína foram produzidos usando o DNA total isolado de cada espécie listada na Tabela 13. Cada um dos amplicons foi clonado usando métodos conhecidos na técnica em vetores de expressão de Bacillus thuringiensis (Bt) em ligação operável com um promotor expressável de Bt.
[00273] As proteínas de fusão compreendendo as proteínas PirA e PirB foram feitas usando métodos conhecidos na técnica. As sequências de codificação que codificam as proteínas de fusão PirAB compreendem as sequências de codificação das proteínas PirA e PirB operacionalmente ligadas, de modo que, quando expressa em uma célula, uma proteína foi produzida compreendendo as proteínas PirA e PirB contíguas entre si. As proteínas de fusão PirAB compreendidas por uma proteína PirA contígua com uma proteína PirB são apresentadas na Tabela 1. As proteínas de fusão PirAB apresentadas na Tabela 1 são compostas por uma proteína PirA e PirB derivada do mesmo operon bacteriano, ou uma proteína PirA e PirB derivada de diferentes operons bacterianos. As proteínas de fusão PirAB compreendidas por uma proteína PirB contígua com uma proteína PirA são apresentadas na Tabela 2. As proteínas de fusão PirAB na Tabela 2 são compostas por uma proteína PirA e PirB derivada do mesmo operon bacteriano. As proteínas de fusão PirAB compreendidas por uma proteína PirA contígua com outra proteína PirA que por sua vez é contígua a uma proteína PirB são apresentadas na Tabela 3. Os componentes da proteína PirA das proteínas de fusão PirAB apresentadas na Tabela 3 podem ser proteínas PirA duplicadas ou diferentes proteínas PirA. EXEMPLO 2 Proteínas PirA, Proteínas PirB e Proteínas de Fusão PirAB Demonstram Atividade de Lepidópteros, Coleópteros e Hemípteros em Bioensaio de Insetos
[00274] Este exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pelas proteínas PirA, pelas proteínas PirB e pelas proteínas de fusão PirAB contra várias espécies de lepidópteros, coleópteros e hemípteros.
[00275] As proteínas PirA, as proteínas PirB e as proteínas de fusão PirAB foram expressas em Bt e E. coli e testadas quanto à toxicidade contra várias espécies de Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera e Dipteran. As preparações de cada toxina foram testadas contra as espécies de pragas de lepidópteros tipo Lagarta-do-cartucho do outono (Spodoptera frugiperda, FAW), Lagarta do Milho (Helicoverpa zea, (CEW), também conhecida como lagarta da soja e lagarta do algodão), "Southwestern Corn Borer" (Diatraea grandiosella, SWCB), Traça-das- Crucíferas (Plutella xylostella, DBM), Broca do Milho Europeia (Ostrinia nubilalis, ECB), Lagarta "Velvetbean" (Anticarsia gemmatalis, VBC), Lagarta-Rosca (Agrotis ipsilon, BCW), Lagarta-das-Vagens (Spodoptera eridania, SAW), Lagarta-falsa-medideira (Pseudoplusia includens, SBL) e Lagarta do tabaco (Heliothis virescens,TBW); as espécies de pragas de Coleoptera, besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata, CPB), larva da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi, NCR), lagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardii, SCR) e larva da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera, WCR); as espécies de Hemiptera Percevejo verde do sul (Nezara viridula, SG), percevejo marrom neotropical (Euschistus heros, NBSB), percevejo vegetal manchado (Lygus lineolaris, TPB) e percevejo vegetal manchado ocidental (Lygus Hesperus, WTP); e a espécie Diptera Mosquito da Febre Amarela (Aedes aegypti, YFM).
[00276] Bt e E. coli transformados que expressam as proteínas PirA, as proteínas PirB e as proteínas de fusão PirAB foram cultivados e esporos ou proteínas solubilizadas foram adicionados à dieta do inseto para o ensaio. Mortalidade e retardo de crescimento foram avaliados comparando o crescimento e desenvolvimento de insetos em uma dieta contendo uma ou mais das Proteínas PirA, Proteínas PirB e Proteínas de Fusão PirAB, com insetos em uma dieta com uma cultura controle não tratada. Atividade foi observada para pragas de insetos lepidópteros, coleópteros, hemípteros e dípteros. A atividade de bioensaio observada para cada proteína é apresentada nas Tabelas 14 (lepidópteros) e 15 (coleópteros, hemípteros e dípteros), em que “+” indica atividade, uma célula vazia indica que não foi observada atividade e “NT” indica que a toxina não foi testado contra essa praga de inseto específica. Tabela 14. Atividade de bioensaio de proteínas PirA, proteínas PirB e proteínas de fusão PirAB contra pragas de insetos lepidópteros. Tipo Toxina FAW CEW SWCB DBM ECB VBC BCW SAW SBL TBW PirA TIC4771 + + + + + PirB TIC4772 + + + Fusão TIC6880 + + + + + + PirA TIC7575 NT NT NT PirB TIC7576 NT NT NT Fusão TIC9316 NT + NT + + + + + PirA TIC7660 NT NT NT PirB TIC7661 NT NT NT Fusão TIC9317 NT NT + NT + + PirA TIC7662 NT NT NT PirB TIC7663 NT NT NT Fusão TIC9318 NT NT + NT + + + + PirA TIC7664 NT NT NT PirB TIC7665 NT NT NT + Fusão TIC9319 NT NT + NT + + + PirA TIC7666 NT NT NT
Tipo Toxina FAW CEW SWCB DBM ECB VBC BCW SAW SBL TBW PirB TIC7667 NT NT + NT Fusão TIC9322 + + + NT + PirA TIC7668 NT NT NT PirB TIC7669 NT NT NT Fusão TIC9320 NT NT + NT + + Fusão TIC9321 NT NT NT PirA TIC10357 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10366 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10375 NT NT NT NT NT NT PirA TIC10358 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10367 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10376 NT NT + NT NT NT NT PirA TIC10360 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10369 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10377 NT NT NT NT NT NT PirA TIC10361 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10370 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10378 NT NT + NT NT NT NT PirA TIC10362 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10371 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10379 NT + NT NT NT NT PirA TIC10363 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10372 NT NT + NT NT NT NT Fusão TIC10380 + NT NT NT NT NT PirA TIC10364 NT NT NT NT NT NT PirB TIC10373 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10381 NT NT NT NT NT PirB TIC10368 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10434 NT NT NT NT NT Fusão TIC11103 NT NT + NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC11104 NT NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC11210 NT NT + NT NT NT + NT Fusão TIC11211 NT NT + NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC11212 NT NT + NT NT NT NT Fusão TIC11301 NT + NT + + NT NT NT Fusão TIC11302 NT + NT + + NT NT NT
Tabela 15. Atividade de bioensaio de proteínas PirA, proteínas PirB e proteínas de fusão PirAB contra pragas de insetos Coleoptera, Hemiptera e Diptera.
Coleoptera Hemiptera Diptera Tipo Toxina CPB NCR SCR WCR SGB NBSB TPB WTP YFM PirA TIC4771 + NT NT NT NT + NT PirB TIC4772 NT NT NT + NT Fusão TIC6880 + NT + + + + + + PirA TIC7575 NT NT NT NT NT PirB TIC7576 NT NT NT NT NT
109/136 Fusão TIC9316 + NT NT + + + + NT PirA TIC7660 NT NT NT NT NT NT PirB TIC7661 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC9317 + + + + + NT PirA TIC7662 NT NT NT NT NT PirB TIC7663 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC9318 + + + + + + NT PirA TIC7664 + NT NT NT NT NT NT PirB TIC7665 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC9319 + NT NT + + + NT PirA TIC7666 NT NT NT NT NT PirB TIC7667 NT NT NT NT NT NT
Coleoptera Hemiptera Diptera Fusão TIC9322 + NT NT + NT PirA TIC7668 NT NT NT NT NT NT PirB TIC7669 NT NT NT NT NT NT Fusão TIC9320 + NT NT + + + NT Fusão TIC9321 + NT NT NT NT NT PirA TIC10357 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10366 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10375 NT NT NT NT NT NT NT NT
110/136 PirA TIC10358 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10367 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10376 NT + NT + NT NT NT PirA TIC10360 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10369 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10377 NT NT NT NT NT NT NT NT PirA TIC10361 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10370 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10378 NT + NT + NT + NT NT PirA TIC10362 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10371 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10379 NT + NT + NT NT NT NT
Coleoptera Hemiptera Diptera PirA TIC10363 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10372 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10380 NT + NT + NT + NT NT NT PirA TIC10364 NT NT NT NT NT NT NT NT PirB TIC10373 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10381 NT + NT + NT + NT NT PirB TIC10368 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC10434 NT + NT + NT NT NT NT
111/136 Fusão TIC11103 NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC11104 NT NT NT NT NT + NT NT NT Fusão TIC11210 NT NT NT NT NT + NT NT Fusão TIC11211 NT NT NT NT NT + NT NT Fusão TIC11212 NT NT NT NT NT NT NT NT Fusão TIC11301 NT + NT + NT + NT + NT Fusão TIC11302 NT NT NT + NT + NT + NT
[00277] Como pode ser visto nas Tabelas 14 e 15, as proteínas da toxina PirA e PirB sozinhas na maioria dos casos não demonstraram atividade inseticida. No entanto, as proteínas de fusão compreendendo as proteínas PirA e PirB de cada operon mostraram um amplo espectro de atividade contra espécies de insetos lepidópteros, coleópteros, hemípteros e dípteros. Algumas das proteínas PirA e PirB demonstraram atividade oral quando testadas em sua capacidade individual. Por exemplo, a proteína PirA TIC4771 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros CEW, DBM, ECB, VBC, SAW, as espécies de coleópteros CPB e as espécies de Hemípteros TPB. A proteína PirB TIC4772 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros CEW, DBM, VBC, SAW e as espécies de Hemípteros TPB. Quando as proteínas TIC4771 e TIC4772 foram combinadas na proteína de fusão PirAB TIC6880, a maior parte da atividade contra a atividade contra lepidópteros foi retida (CEW, DBM, ECB e VBC). A atividade contra SAW foi perdida, mas atividade contra mais duas espécies de insetos FAW e SWCB foi observada. TIC6880 também demonstrou atividade adicional em relação aos indivíduos TIC4471 e TIC4772 com relação a espécies de insetos coleópteros e hemípteros. Com relação aos coleópteros, TIC6880 reteve atividade contra CPB e atividade adicional contra WCR. Com relação aos hemípteros, TIC6880 reteve atividade contra TPB e adicionou atividade observada contra SGB, NBSB e WTP. TIC6880 também demonstrou atividade contra a espécie de díptero YFM, que não foi observada por TIC4771 ou TIC4772.
[00278] Enquanto as proteínas PirA e PirB TIC7575 e TIC7576, respectivamente, não demonstraram atividade inibidora de inseto contra os insetos testados, a proteína de fusão PirAB correspondente, TIC9316, demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB, VBC, BCW, SAW e TBW. TIC9316 também demonstrou atividade contra as espécies de coleópteros CPB e as espécies de
Hemípteros SGB, NBSB, TPB e WTP.
[00279] As proteínas PirA e PirB TIC7660 e TIC7661, respectivamente, não demonstraram atividade. No entanto, a proteína de fusão PirAB correspondente TIC9317 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de coleópteros CPB e WCR e as espécies de Hemípteros SGB, TPB e WTP.
[00280] As proteínas PirA e PirB TIC7662 e TIC7663, respectivamente, não demonstraram atividade. No entanto, a proteína de fusão PirAB correspondente TIC9318 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB, VBC, BCW e TBW, as espécies de coleópteros CPB e WCR e as espécies de Hemípteros SGB, NBSB, TPB e WTP.
[00281] A proteína PirA TIC7664 demonstrou atividade contra a espécie de coleópteros CPB. A proteína PirB TIC7665 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros TBW. A proteína de fusão PirAB correspondente TIC9319 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB, VBC, e BCW, as espécies de coleópteros CPB e WCR e as espécies de Hemípteros SGB, TPB e WTP.
[00282] A proteína PirA TIC7666 não demonstrou atividade inibidora de insetos. A proteína PirB TIC7667 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB. A proteína de fusão PirAB correspondente TIC9322 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros FAW, CEW, SWCB e VBC, a espécie de coleópteros CPB e a espécie de Hemípteros TPB.
[00283] As proteínas PirA e PirB TIC7668 e TIC7669, respectivamente, não demonstraram atividade. A proteína de fusão PirAB correspondente TIC9320 demonstrou atividade contra as espécies de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de coleópteros CPB e as espécies de Hemípteros SGB, NBSB e TPB.
[00284] A proteína de fusão PirAB TIC9321 demonstrou atividade contra a praga de coleópteros CPB.
[00285] A proteína PirA TIC10357, a proteína PirB TIC10366 e a proteína de fusão PirAB correspondente TIC10375 não demonstraram atividade contra o número limitado de lepidópteros testados.
[00286] A proteína PirA TIC10358 e a proteína PirB TIC10367, respectivamente, não mostraram atividade contra as espécies de inseto testadas. No entanto, a proteína de fusão PirAB correspondente TIC10376 demonstrou atividade contra as espécies de insetos-praga Lepidópteros, SWCB e as espécies-praga de insetos Coleópteros, NCR e WCR.
[00287] A proteína PirA TIC10360 e a proteína PirB TIC10369, respectivamente, não demonstraram atividade contra o número limitado de espécies de insetos-praga lepidópteros testadas.
[00288] A proteína PirA TIC10361 e a proteína PirB TIC10370, respectivamente, não demonstraram atividade contra o número limitado de espécies de insetos-praga lepidópteros testadas. No entanto, a proteína de fusão correspondente TIC10378 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de insetos Lepidópteros, SWCB, as espécies de pragas de coleópteros, NCR e WCR, e as espécies de pragas de Hemípteros, NBSB.
[00289] A proteína PirA TIC10362 e a proteína PirB TIC10371 não demonstraram atividade contra o número limitado de espécies de insetos-praga lepidópteros testadas.
[00290] A proteína PirA TIC10363 não demonstrou atividade contra o número limitado de espécies de insetos-praga testadas. A proteína PirB TIC10372 demonstrou atividade contra a espécie de inseto Lepidóptero SWCB. A proteína de fusão correspondente TIC10380 reteve atividade contra as espécies de praga de inseto Lepidóptero,
SWCB e atividade adicionada contra as espécies de praga de coleópteros NCR e WCR e a espécie de praga de Hemípteros NBSB.
[00291] A proteína PirA TIC10364 e a proteína PirB TIC10373 não demonstraram atividade contra o número limitado de espécies de pragas de inseto testadas. A proteína de fusão correspondente TIC10381 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de coleópteros, NCR e WCR, e as espécies de praga de Hemípteros NBSB.
[00292] A proteína de fusão PirAB TIC10434 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de coleópteros NCR e WCR.
[00293] A proteína de fusão PirAB TIC11103 demonstrou atividade contra a espécie de praga de lepidópteros SWCB.
[00294] A proteína de fusão PirAB TIC1104 demonstrou atividade contra a espécie de Hemípteros NBSB.
[00295] A proteína de fusão PirAB TIC11210 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de lepidópteros SWCB e BCW e as espécies de pragas de Hemípteros NBSB.
[00296] A proteína de fusão PirAB TIC11211 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de lepidópteros SWCB e as espécies de Hemípteros NBSB.
[00297] A proteína de fusão PirAB TIC11212 demonstrou atividade contra a espécie de praga de insetos Lepidópteros SWCB.
[00298] A proteína de fusão PirAB TIC11301 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de pragas de coleópteros NCR e WCR e as espécies de pragas de Hemípteros NBSB e WTP.
[00299] A proteína de fusão PirAB TIC11302 demonstrou atividade contra as espécies de pragas de lepidópteros SWCB, ECB e VBC, as espécies de pragas de coleópteros WCR e as espécies de pragas de Hemípteros NBS e WTP.
EXEMPLO 3 Misturas das Proteínas de Fusão PirAB, PirA e PirB Demonstram Atividade de Lepidópteros, Coleópteros e Hemípteros em Bioensaio de Insetos
[00300] Este Exemplo ilustra a atividade inibidora exibida pela mistura das proteínas PirA TIC7575 e TIC7660 com as proteínas PirB TIC7576 e TIC7661, bem como pela mistura das proteínas de fusão PirAB TIC9316 e TIC9317; TIC9316 com TIC11301; e TIC9317 e TIC11302 em várias concentrações.
[00301] Misturas das proteínas PirA e PirB e misturas das proteínas de fusão PirAB em várias concentrações foram apresentadas na dieta de insetos e testadas quanto à atividade contra as espécies de praga de lepidópteros BCW, SWC e VBC, as espécies de praga de coleópteros WCR e NCR, e a espécie de praga de hemípteros NBSB. As misturas continham diferentes concentrações das proteínas da toxina. A Tabela 16 abaixo mostra as espécies de insetos nas quais a atividade foi observada para cada mistura. Tabela 16. Atividade de bioensaio de misturas das proteínas da toxina PirA e PirB e misturas das proteínas de fusão PirAB. Mistura Atividade TIC7575 0,0625mg/mL; TIC7576 0,1875mg/mL BCW; VBC; NBSB TIC7575 0,0625mg/mL; TIC7576 0,1875mg/mL; o dobro para 0,5mg/mL final NCR; WCR; NBSB TIC7575 0,0625mg/mL; TIC7661 0,1875mg/mL; o dobro para 0,5mg/mL final NCR; WCR TIC7660 0,0625mg/mL; TIC7576 0,1875mg/mL; o dobro para 0,5mg/mL final NCR; WCR TIC7660 0,0625mg/mL; TIC7661 0,1875mg/mL; o dobro para 0,5mg/mL final NCR; WCR TIC7575 0,0625mg/mL; TIC7576 0,125 mg/mL; TIC7660 0,0625mg/mL WCR; VBC TIC7575 0,0625mg/ml; TIC7660 0,0625mg/mL; TIC7661 0,125mg/mL WCR TIC9316 0,04mg/mL; TIC9317 0,01mg/mL VBC TIC9316 0,025mg/mL; TIC9317 0,025mg/mL VBC TIC9316 0,25mg/ml; TIC9317 0,25mg/mL NBS TIC9316 0,4mg/mL; TIC9317 0,1mg/mL NBS TIC9316 0,04mg/mL; TIC11301 0,01mg/mL VBC; SWC
Mistura Atividade TIC9316 0,025mg/mL; TIC11301 0,025mg/mL VBC TIC9316 0,01mg/mL; TIC11301 0,04mg/mL VBC TIC9316 0,1mg/mL; TIC11301 0,4mg/mL NBS TIC9316 0,4mg/mL; TIC11301 0,1mg/mL VBC; NBSB TIC9317 0,01mg/mL; TIC11302 0,04mg/mL VBC TIC9317 0,25mg/mL; TIC11302 0,25mg/mL NBS
[00302] Como pode ser visto na Tabela 16, as misturas das proteínas PirA TIC7575 e TIC7660 com as proteínas PirB TIC7576 e TIC7661 forneceram atividade semelhante às proteínas de fusão correspondentes, TIC9316 e TIC9317. Misturas das proteínas de fusão PirAB TIC9316 e TIC9317; TIC9316 com TIC11301; e TIC9317 e TIC11302 demonstraram atividade semelhante a uma ou ambas as proteínas de fusão. EXEMPLO 4 Projeto de sequências de codificação sintética que codificam as proteínas de fusão PirAB TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, e TIC11302 para expressão em células vegetais
[00303] Sequências de codificação sintéticas ou artificiais foram construídas para uso na expressão das proteínas de fusão PirAB TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, eTIC11302 em plantas. Estas sequências de codificação sintéticas foram clonadas em vetores binários de transformação de plantas e usadas para transformar células de plantas. As sequências de ácido nucleico sintético foram sintetizadas de acordo com métodos geralmente descritos na patente US 5.500.365, evitando certas sequências problemáticas inimigas tais como sequências de poliadenilação de plantas ricas ATTTA e A/T, enquanto preserva a sequência de aminoácidos da proteína de Fusão PirAB. A sequência de codificação sintética para as proteínas de fusão PirAB TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, e TIC11302 são apresentadas na Tabela 17. As sequências de codificação que codificam TIC6880PL, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, e TIC10381PL continham um códon de alanina adicional imediatamente após o resíduo de metionina de iniciação da porção de sequências de codificação de PirA correspondente dentro da sequência de codificação da proteína de fusão PirAB. Tabela 17. Sequências de codificação sintéticas usadas para expressão em células vegetais que codificam proteínas de fusão PirAB TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL e TIC11302.
Nucleotídeo Proteína SEQ Proteína de Fusão PirAB SEQ ID NO: ID NO: Proteína PirA Proteína PirB TIC6880PL* 49 50 TIC4771 * TIC4772 TIC9316 51 12 TIC7575 TIC7576 TIC9317 52 18 TIC7660 TIC7661 TIC9318 53 24 TIC7662 TIC7663 TIC9319 54 30 TIC7664 TIC7665 TIC9320 55 42 TIC7668 TIC7669 TIC9322 56 36 TIC7666 TIC7667 TIC10376PL* 146 147 TIC10358* TIC10367 TIC10378PL* 148 149 TIC10361* TIC10370 TIC10380PL* 150 151 TIC10363* TIC10372 TIC10381PL* 152 153 TIC10364* TIC10373 TIC11302 158 119 TIC7660 TIC7576 * compreende um resíduo de alanina adicional imediatamente após o resíduo de metionina de iniciação.
[00304] As sequências de codificação sintéticas e as sequências de proteínas correspondentes para TIC11103 e TIC11104 são apresentadas na Tabela 18 abaixo.
Tabela 18. Sequências de codificação sintéticas usadas para expressão em células vegetais que codificam as proteínas de fusão PirAB TIC11103 e TIC11104.
Proteína de Fusão Nucleotídeo PirAB SEQ ID NO: Proteína SEQ ID NO: Proteína PirB Proteína PirA TIC11103 154 155 TIC7661 TIC7660 TIC11104 156 157 TIC7663 TIC7662 EXEMPLO 5 Cassetes de expressão para Expressão de proteínas de fusão PirAB em Células Vegetais
[00305] Uma variedade de cassetes de expressão de plantas foi projetada com as sequências, conforme estabelecido na Tabela 17. Tais cassetes de expressão são úteis para expressão transitória em protoplastos de plantas ou transformação de células de plantas. Os cassetes de expressão típicas são criados em relação à eventual colocação da proteína dentro da célula de planta. Para uma proteína direcionada ao plastídeo, as sequências de codificação de proteínas pesticidas TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, e TIC11302 sintéticas são operacionalmente ligadas a uma estrutura com uma sequência de codificação de sinal do peptídeo direcionada a cloroplasto. Os vetores de transformação vegetais resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida que compreende um promotor constitutivo, ligado operacionalmente 5 'a um líder, ligada operacionalmente 5' a um intrão (ou opcionalmente sem intrão), ligado operacionalmente 5' a uma sequência de codificação sintética codificando uma proteína TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, e TIC11302 direcionada ou não direcionada a plastídeo, que é, por sua vez, ligada operacionalmente 5'
a uma UTR 3' e um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas usando glifosato ou seleção de antibióticos. Todos os elementos descritos acima são dispostos de forma contígua frequentemente com sequência adicional provida para a construção do cassete de expressão, tais como sítios de endonuclease de restrição ou sítios de clonagem independentes de ligação. EXEMPLO 6 Plantas Transgênicas de Milho que expressam TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC10376, TIC10378, TIC10380 e TIC10381 Demonstram Stividade Contra Espécies de Pragas de Lepidópteros
[00306] Este exemplo ilustra a atividade inibitória das proteínas de fusão PirAB TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC10378, TIC10380 e TIC10381 quando expressas em plantas de milho transgênicas e testadas contra espécies de praga de inseto lepidóptero.
[00307] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC10376, TIC10378, TIC10380 ou TIC10381 foram clonados usando métodos conhecidos na técnica. O vetor de transformação de planta compreendeu um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC10376, TIC10378, TIC10380 ou TIC10381 que compreendia um promotor expressável em planta, operacionalmente ligado em 5' a um líder, operacionalmente ligado em 5’ a um íntron, operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação sintética que codifica TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC10376, TIC10378, TIC10380 ou TIC10381, operacionalmente ligado em 5' a 3 'UTR, e um segundo cassete de transgene para a seleção de células vegetais transformadas usando glifosato. Os vetores resultantes foram usados para transformar estavelmente plantas de milho usando um método de transformação mediado por Agrobacterium. As células transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bioensaios usando discos de folhas de plantas foram realizados de forma análoga aos descritos na Patente US Nº 8.344.207. Uma planta de milho não transformada foi usada para obter tecido para ser usado como controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram avaliados contra as espécies de pragas de lepidópteros FAW, CEW, SWCB, ECB e BCW.
[00308] Vários eventos transformados que expressam TIC9316 demonstraram atividade inibitória de boa a moderada contra SWCB e ECB. Da mesma forma, eventos transformados que expressam TIC9317 também demonstraram atividade inibitória de boa a moderada contra SWCB e ECB. Os eventos transformados que expressam TIC9318 demonstraram atividade inibitória de boa a excelente contra SWCB e ECB. Os eventos transformados que expressam TIC10376, TIC10378, TIC10380 e TIC10381 demonstraram atividade boa a moderada contra SWCB. EXEMPLO 7 Ensaio de Atividade de Proteínas de Fusão PirAB Contra Pragas de Coleóptero Lagarta-da-raiz-do-milho (Diabrotica virgifera virgifera) Quando Expressas em Plantas de Milho Transformadas de Forma Estável
[00309] Este exemplo ilustra a atividade inibitória de TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 contra diferentes espécies de coleópteros que se alimentam de de raízes de milho.
[00310] Vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar tanto TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL,
TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 direcionadas e não direcionadas são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências conforme mostrado nas Tabelas 17 e 18. Os vetores resultantes são usados para transformar estavelmente plantas de milho usando métodos conhecidos na técnica. Eventos de inserção única de T-DNA são selecionados e cultivados. A atividade pesticida é testada contra as pragas de coleópteros NCR, SCR e WCR que se alimentam das raízes das plantas de milho estavelmente transformadas.
[00311] As plantas de milho estavelmente transformadas R0 são usadas para testar a resistência de Coleoptera, bem como gerar progênie F1. Vários eventos de cópia única são selecionados de cada transformação de vetor binário. Uma porção desses eventos se originam de cada transformação vetorial binária é usada no ensaio de Coleópteros R0 enquanto outra porção dos eventos é usada para gerar progênie F1 para novos testes.
[00312] As plantas de ensaios R0 são transplantadas para potes de oito polegadas. As plantas são inoculadas com ovos de WCR, NCR ou SCR. Os ovos são incubados durante aproximadamente dez (10) dias antes da inoculação para permitir que a eclosão ocorra em quatro (4) dias após a inoculação, a fim de garantir que um número suficiente de larvas sobreviva e possa atacar as raízes do milho. As plantas transformadas são inoculadas em estágio aproximadamente V2 a V3. As plantas são cultivadas após infestação por aproximadamente vinte e oito (28) dias. As plantas são removidas dos potes com as raízes sendo cuidadosamente lavadas para remover todo o solo. O dano às raízes é avaliado usando uma escala de classificação de danos de 1-5 conforme apresentado na Tabela 19. Uma comparação com os controles negativos é também feita para assegurar que o ensaio foi realizado corretamente. Os eventos R0 múltiplos para cada transformação do vetor binário são usados no ensaio de Coleópteros. Baixas pontuações de dano à raiz indicam resistência conferida pela proteína de fusão PirAB testada à praga de coleópteros testada. Tabela 19. Pontuações de dano de raiz R0. Pontuação de Dano de Raiz Descrição 1 Nenhuma alimentação visível 2 Alguma alimentação; sem podas 3 Poda de pelo menos uma raiz 4 Núcleo inteiro podado 5 Mais de um núcleo podado
[00313] Uma porção dos eventos estavelmente transformados R0 decorrentes de cada transformação vetorial binária são utilizados para produzir progênie F1. As plantas estavelmente transformadas R0 são autorizadas a autofertilizar, produzindo progênie F1. A semente F1 é plantada. As plantas heterozigóticas são identificadas através de métodos moleculares conhecidos na técnica e usados para ensaio contra pragas de Coleópteros, bem como medições de expressão ELISA da proteína de toxina. Uma porção da progênie F1 heterozigótica de cada evento é usada para ensaio de insetos, enquanto uma outra porção é usada para medir a expressão da proteína de toxina.
[00314] Ovos de WCR, NCR ou SCR são incubados por aproximadamente dez (10) dias para permitir a eclosão em quatro (4) dias após a inoculação. Para a WCR, cada pote é inoculado com cerca de dois mil ovos. Para a NCR, menos ovos podem ser usados devido à menor disponibilidade de ovos dessa espécie. As plantas são inoculadas em estágio aproximadamente V2 a V3. As plantas são cultivadas após infestação por aproximadamente vinte e oito (28) dias. As plantas são removidas dos potes com as raízes sendo cuidadosamente lavadas para remover todo o solo. O dano às raízes é avaliado usando uma escala de classificação de danos de 0-3 conforme apresentado na Tabela 20. Uma comparação com o controle negativo é feita para assegurar que o ensaio foi realizado corretamente. Baixas pontuações de danos à raiz indicam resistência conferida por TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL, TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104, ou TIC11302 à praga de coleópteros. Tabela 20. Pontuações de dano de raiz F1. Pontuação de Dano de Raiz Descrição 0 Nenhuma alimentação visível 0,01-0,09 Alimentando cicatrizes e trilhas 0,1-0,9 Poda de raiz, mas inferior a um núcleo completo 1,0-1,9 Pelo menos um núcleo completo (ou equivalente) destruído para em 1,5 polegadas de planta 2,0-2,9 Dois ou mais núcleos excluídos 3 Três ou mais núcleos excluídos EXEMPLO 8 Ensaio de Atividade das Proteínas de Fusão PirAB Contra Pragas de Lepidópteros Quando Expressas em Plantas de Milho, Soja ou Algodão Estavelmente Transformadas.
[00315] Este exemplo ilustra o ensaio de atividade contra várias espécies de pragas de lepidópteros alimentadas com tecido de milho, soja ou algodão estavelmente transformados que expressam uma das proteínas de fusão PirAB.
[00316] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar versões direcionadas e não direcionadas a plastídeos das Proteínas de Fusão PirAB são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências de codificação apresentadas nas Tabelas 17 e 18.
[00317] O milho, a soja ou o algodão são transformados com os vetores de transformação binários descritos acima usando um método de transformação mediado por Agrobacterium. As células transformadas são induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bioensaios usando discos de folhas de plantas são realizados de forma análoga aos descritos na Patente US Nº 8.344.207. Uma planta de milho, soja ou algodão não transformada é usada para obter tecido para ser usado como controle negativo. Vários eventos de transformação de cada vetor binário são avaliados contra pragas de lepidópteros, tais como, mas não se limitando a, BCW, CEW, DBM, ECB, FAW, SAW, SBL, SWCB, TBW e VBC. Os insetos que demonstram atrofia e/ou mortalidade no bioensaio de insetos são considerados suscetíveis aos efeitos das Proteínas de Fusão PirAB testadas. EXEMPLO 9 Ensaio de Atividade das Proteínas de Fusão PirAB Contra Pragas de Besouro-Saltador Quando Expressas em Plantas de Canola Transformadas de Forma Estável
[00318] Este Exemplo ilustra o ensaio de atividade contra várias espécies de besouro-saltador quando deixadas se alimentando de plantas de canola transgênicas inteiras ou tecidos derivados de plantas de canola transgênicas que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB.
[00319] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar versões direcionadas e não direcionadas a plastídeos das Proteínas de Fusão PirAB são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências de codificação apresentadas nas Tabelas 17 e 18.
[00320] Os vetores de transformação binários resultantes são usados para transformar de forma estável células de plantas de canola usando métodos conhecidos na técnica. As células transformadas são induzidas a formar plantas. Os bioensaios usando discos de folhas de plantas são realizados de forma análoga à descrita na patente U.S. Nº
8.344.207 usando besouros-saltadores coletados em campo. Uma planta de canola não transformada é usada para obter tecido para ser usado como controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário são avaliados contra pragas coléopteras de besouro- saltador tais como, mas sem limitação, Besouro-Saltador de Crucíferas (Phyllotreta cruciferae), Besouro-Saltador Listrado (Phyllotreta striolata), e "Western Black Flea Beetle" (Phyllotreta pusilla). A mortalidade de besouros-saltadores é determinada diariamente, à medida que os besouros continuam a se alimentar. Os discos das folhas são alterados a cada dois (2) para três (3) dias durante um período de doze (12) dias para garantir que material fresco esteja disponível para os besouros saltadores para alimentação e para reduzir qualquer impacto da degradação de proteínas na amostra.
[00321] Alternativamente, as plantas de canola transformadas podem ser plantadas em um campo onde estão presentes infestações por besouros-saltadores. As plantas podem ser abrigadas em uma barraca para impedir que os besouros-saltadores que emergem do solo escapem dos lotes experimentais. Avaliações de danos nas folhas de canola podem ser tomadas para determinar quais plantas sofreram menos danos e demonstraram resistência aos besouros-saltadores. Exemplo 10 Ensaio da atividade das Proteínas de Fusão PirAB contra Pragas de Hemípteros em Plantas de Soja Estavelmente Transformadas
[00322] Este exemplo descreve o ensaio de atividade contra pragas de insetos hemípteros em plantas de soja estavelmente transformadas para expressar uma das Proteínas de Fusão PirAB.
[00323] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar versões direcionadas e não direcionadas a plastídeos de umas das Proteínas de Fusão PirAB são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências de codificação apresentadas nas Tabelas 17 e 18. As plantas de soja são transformadas usando os vetores de transformação de plantas binárias. As células vegetais de soja transformadas são induzidas a formar plantas inteiras. O ensaio para atividade contra as pragas Hemiptera é realizado utilizando uma variedade de técnicas que dependerão das espécies de pragas de Hemiptera e do tecido alvo preferido dessa praga. Por exemplo, as espécies de insetos hemípteros geralmente se alimentam das sementes e vagens em desenvolvimento da planta de soja. Para testar a atividade contra percevejos, as vagens do estágio R5 são colhidas das plantas de soja transgênicas que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB e colocadas em uma placa de Petri coberta ou placa de múltiplos poços grande contendo uma camada de ágar ou papel úmido para o ambiente de alimentação. As ninfas de Percevejo de segundo ínstar são colocadas na placa de Petri ou na placa grande de múltiplos poços. Uma cobertura que fornece a troca de oxigênio, evitando a dessecação, é colocada sobre o ambiente de alimentação. As ninfas de Percevejo podem alimentar-se por vários dias. Medidas de nanismo e mortalidade são tomadas e comparadas com ninfas de percevejos que se alimentam de vagens de plantas de soja não transformadas.
[00324] Alternativamente, o ensaio de atividade pode também ser realizado em plantas inteiras transformadas de forma estável. As plantas transformadas que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB são cultivadas em uma câmara de crescimento ou em estufa. No estágio R5, as plantas são incluídas em uma gaiola feita de folhas de "polinização" de plástico respirável (Vilutis and Company Inc, Frankfort, IL). As mangas da folha são fixadas ao caule principal logo acima da superfície do solo usando uma gravata Velcro®. Cada planta é infestada com um número específico de ninfas de Percevejo de segundo ínstar. As ninfas são liberadas em cada gaiola individual através de uma pequena fenda ao lado da gaiola e, em seguida, a gaiola é bem fechada, garantindo que os insetos não escaparão. As ninfas podem se alimentar de vagens de soja por vários dias a uma semana ou mais. Observações são feitas a cada dia para determinar as medidas de nanismo e mortalidade. No final do período de alimentação, as ninfas vivas e mortas são coletadas. As plantas são cortadas abaixo das gaiolas e movidas para um laboratório onde os insetos são coletados para cada planta. Antes de abrir a gaiola, as plantas são agitadas vigorosamente para garantir que todos os insetos caiam de seus locais de alimentação para a base da gaiola. Em seguida, a base da gaiola é aberta e todo o material da planta é removido e colocado em uma folha preta. Os insetos podem ser coletados usando um aspirador ou algum outro meio. O número de insetos e seu estágio de desenvolvimento são registrados para cada planta. Além disso, o número e o estágio de desenvolvimento das ninfas mortas também são registrados. Estas medidas são comparadas com as medidas obtidas a partir de plantas não transformadas de controle negativo.
[00325] Atrasos no desenvolvimento das ninfas dos percevejos (nanismo) ou mortalidade são interpretados como uma indicação de toxicidade se, quando comparados aos controles não transformados, houver uma diferença significativa. Exemplo 11 Ensaio da atividade das Proteínas de Fusão PirAB contra Pragas de Hemípteros em Plantas de Milho Estavelmente Transformadas
[00326] Este exemplo descreve o ensaio de atividade contra pragas de insetos hemípteros em plantas de milho estavelmente transformadas para expressar uma das Proteínas de Fusão PirAB.
[00327] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar versões direcionadas e não direcionadas a plastídeos de umas das
Proteínas de Fusão PirAB são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências de codificação apresentadas nas Tabelas 17 e 18. As plantas de milho são transformadas usando os vetores de transformação de plantas binárias. As células vegetais de milho transformadas são induzidas a formar plantas inteiras. O ensaio para atividade contra as pragas Hemiptera é realizado utilizando uma variedade de técnicas que dependerão das espécies de pragas de Hemiptera e do tecido alvo preferido dessa praga. Por exemplo, as espécies de insetos Hemiptera geralmente se alimentam das plantas de milho jovens no final da primavera ou início do verão, resultando em buracos na folha e, se severas, plantas deformadas. No final do verão, os Percevejos normalmente se alimentam da espiga, destruindo diretamente os grãos.
[00328] Um método para testar a atividade do Percevejo é expor as ninfas do Percevejo a discos de folhas derivados de plantas de milho transformadas de forma estável que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB em grandes placas de múltiplos poços. As ninfas de Percevejo do segundo ínstar são colocadas em placas grandes de múltiplos poços com discos de folhas derivados das plantas de milho transformadas de modo estável e autorizadas a alimentar-se durante vários dias. Medidas de nanismo e mortalidade são tomadas e comparadas com ninfas de percevejos que se alimentaram de discos de folhas de milho não transformados.
[00329] Alternativamente, podem ser utilizadas plantas transformadas inteiras para ensaiar a atividade de percevejos. Plantas de milho estavelmente transformadas que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB são colocadas em gaiolas de uma maneira semelhante à descrita para plantas de soja no Exemplo 4. Ninfas de segundo ínstar são introduzidas em plantas de milho de estágio V3 e deixadas a se alimentar por vários dias a uma semana. Após o período de alimentação prescrito, as ninfas vivas e mortas são coletadas. As medidas de nanismo e mortalidade são comparadas com plantas de controle não transformadas.
[00330] Para avaliar a atividade do percevejo usando espigas de milho estavelmente transformadas, pode ser tomada uma abordagem semelhante à do ensaio em plantas de estágio V3. As espigas de milho em desenvolvimento de plantas de milho transformadas de forma estável que expressam uma das Proteínas de Fusão PirAB são encapsuladas usando folhas de material que permitem a livre troca de ar, evitando o escape das ninfas do Percevejo. As espigas encapsuladas são infestadas com ninfas de percevejo no segundo ínstar e autorizadas a alimentar-se os grãos em desenvolvimento da espiga por vários dias a uma semana. As medidas de nanismo e mortalidade são comparadas com espigas de plantas de controle não transformadas. Exemplo 12 Ensaio da atividade das Proteínas de Fusão PirAB contra Pragas de Hemípteros em Plantas de Algodão Estavelmente Transformadas
[00331] Este exemplo descreve o ensaio de atividade contra pragas de insetos hemípteros em plantas de algodão estavelmente transformadas para expressar uma das Proteínas de Fusão PirAB.
[00332] Os vetores de transformação de plantas binárias compreendendo cassetes de transgene concebidos para expressar versões direcionadas e não direcionadas a plastídeos de umas das Proteínas de Fusão PirAB são clonados usando métodos conhecidos na técnica e compreendem as sequências de codificação apresentadas nas Tabelas 17 e 18. As plantas de algodão são transformadas usando os vetores de transformação de plantas binárias. As células vegetais de algodão transformadas são induzidas a formar plantas inteiras. O ensaio para atividade contra as pragas Hemiptera é realizado utilizando uma variedade de técnicas que dependerão das espécies de pragas de Hemiptera e do tecido alvo preferido dessa praga. Por exemplo, as espécies de pragas de hemípteros, percevejos, são tipicamente alimentadores de sementes e, portanto, ferir os capulhos do algodão é a principal preocupação. Eles danificam principalmente o algodão, perfurando os capulhos e se alimentando das sementes. Sua atividade de alimentação pode resultar em manchas escuras de cerca de 1/16 de polegada de diâmetro na parte externa de capulhos maiores onde ocorreu a alimentação. A alimentação de sementes pode resultar na redução da produção de fiapos e manchas de fiapos perto do local de alimentação. Por causa de seu tamanho, os adultos e as ninfas de quarto e quinto ínstar têm o maior potencial para causar danos aos capulhos e, portanto, é importante matar o inseto em seus estágios ninfais iniciais. As espécies de pragas de hemípteros de Lygus se alimentam principalmente de botões e capulhos jovens. As ninfas são comedoras mais vorazes e tendem a causar os danos mais severos. Ao se alimentar de quadrados, Lygus tem como alvo as anteras em desenvolvimento, o que muitas vezes resulta no encolhimento do quadrado e na sua queda da planta. Para aqueles botões que se desenvolvem em capulhos, os capulhos podem ter anteras que são incapazes de formar pólen, sementes não fertilizadas e lóculos vazios. Ao se alimentar de cápsulas, Lygus visa as sementes em desenvolvimento, causando pequenas manchas escuras na parte externa do capulho.
[00333] Um método para testar a atividade das proteínas de fusão PirAB em plantas de algodão transformadas de forma estável é usar botões em um bioensaio de inseto. Os botões são colhidos de plantas de algodão transformadas que expressam TIC6880PL, TIC9316, TIC9317, TIC9318, TIC9319, TIC9320, TIC9322, TIC10376PL,
TIC10378PL, TIC10380PL, TIC10381PL, TIC11103, TIC11104 ou TIC11302. Os botões podem ser colocados em uma placa de Petri ou cada quadrado em um poço de uma placa grande. Jovens neonatos Lygus ou ninfas de percevejos são colocados na placa de Petri ou na placa do poço grande e alimentados por um tempo determinado. As medições de atrofiamento e mortalidade são feitas ao longo do tempo de alimentação e comparadas com controles nos quais quadrados derivados de algodoeiros não transformados são usados no ensaio.
[00334] Alternativamente, o ensaio de atividade pode ser realizado em plantas de algodão transformadas inteiramente. Por exemplo, para testar contra espécies Lygus, sementes R1 de plantas que expressam uma das proteínas de fusão PirAB são semeadas em vasos de 10 polegadas. Uma planta de algodão não transformada, de preferência da mesma variedade das plantas transformadas, é usada como controle negativo. As plantas são mantidas em uma câmara ambiental com fotoperíodo de dezesseis (16) horas de luz a trinta e dois (32) graus Celsius e oito (8) horas de escuridão a vinte e três (23) graus Celsius, e uma intensidade de luz entre oito cento (800) e novecentos (900) micro- Einsteins. De quarenta (40) a quarenta e cinco (45) dias após o plantio, as plantas individuais são incluídas em uma gaiola feita de folhas de polinização de plástico respirável (Vilutis and Company Inc, Frankfort, IL). As mangas da folha são fixadas ao caule principal logo acima da superfície do solo usando uma gravata Velcro®. Dois pares de Lygus lineolaris ou Lygus hesperus adultos masculino e feminino sexualmente maduros (seis dias de idade) de uma cultura de laboratório são coletados em um tubo de plástico de fundo redondo de catorze mililitros (Bacton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) e utilizados para cada planta. Os adultos são liberados em cada gaiola individual através de uma pequena fenda ao lado da gaiola e, em seguida, a gaiola é bem fechada, garantindo que os insetos não escapem. Os insetos podem acasalar e as plantas são mantidas na gaiola por vinte e um (21) dias.
[00335] Após vinte e um (21) dias, as plantas são então cortadas abaixo das gaiolas e movidas para um laboratório onde os insetos são coletados para cada planta e contados. Antes de abrir a gaiola, as plantas são agitadas vigorosamente para garantir que todos os insetos caiam de seus locais de alimentação para a base da gaiola. Em seguida, a base da gaiola é aberta e todo o material da planta é removido e colocado em uma folha preta. Os insetos são coletados usando um aspirador. A planta é então cuidadosamente inspecionada para recuperar os insetos remanescentes. O número de insetos coletados e seu estágio de desenvolvimento são registrados para cada planta. As contagens de insetos são divididas em vários grupos com base na maturidade do Lygus; ninfas até 3o ínstar, 4o ínstar, 5o ínstar e adultos.
[00336] Para ensaio contra espécies de percevejos, sementes R1 derivadas de plantas que expressam uma das proteínas de fusão PirAB são semeadas em vasos e cultivadas e engaioladas como descrito acima. Plantas de algodão não transformadas também são usadas como controle negativo. As ninfas do percevejo de segundo ínstar são usadas para infestar as plantas e alimentam-se dos botões e capulhos por vários dias ou semanas. As plantas enjauladas são coletadas conforme descrito acima e os percevejos coletados são examinados e avaliados quanto à mortalidade, bem como a maturidade das ninfas registrada. Essas pontuações são então comparadas com as plantas de controle negativo. EXEMPLO 13 TIC9318 e TIC11302 Demonstram Atividade Contra Pragas Diabrotica virgifera Quando Expressas em Plantas de Milho Estavelmente Transformadas
[00337] Este exemplo ilustra a atividade inibidora de TIC9318 e TIC11302 contra a lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera, WCR) em plantas de milho estavelmente transformadas.
[00338] As plantas de milho foram transformadas com construtos de transformação de plantas binárias compreendendo um cassete de expressão para a expressão de TIC9318 ou TIC11302. Os vetores binários de transformação de plantas compreendem cassetes de transgene concebidos para expressar TIC9318 e TIC11302 e foram clonados usando métodos conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas compreendem um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC9318 ou TIC11302 que compreende um promotor expressável em planta, operacionalmente ligado em 5' a um líder, operacionalmente ligado em 5' a um íntron, operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação sintética que codifica TIC9318 ou TIC11302, operacionalmente ligado em 5' a 3' UTR e, um segundo cassete de transgene para a seleção de células vegetais transformadas usando glifosato. Os vetores resultantes foram usados para transformar estavelmente plantas de milho usando um método de transformação mediado por Agrobacterium. As células transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica.
[00339] As plantas de milho estavelmente transformadas R0 foram usadas para testar a resistência de TIC11302 a WCR, bem como gerar progênie F1. Foram selecionados vários eventos de cópia única de cada transformação de vetor binário. Uma parte dos eventos decorrentes de cada transformação de vetor binário foi usada no ensaio R0 WCR.
[00340] As plantas de ensaios R0 foram transplantadas para potes de oito polegadas. As plantas foram inoculadas com aproximadamente dois mil ovos cada de WCR. Os ovos foram incubados durante aproximadamente dez (10) dias antes da inoculação para permitir que a eclosão ocorra em quatro (4) dias após a inoculação, a fim de garantir que um número suficiente de larvas sobrevivesse e pudesse atacar as raízes do milho. Cada pote foi inoculado com aproximadamente dois mil ovos WCR. As plantas transformadas foram inoculadas em estágio aproximadamente V2 a V3. As plantas foram cultivadas após infestação por aproximadamente vinte e oito (28) dias. As plantas foram removidas dos potes com as raízes sendo cuidadosamente lavadas para remover todo o solo. O dano às raízes foi avaliado usando uma escala de pontuação de danos de 1-5 conforme apresentado na Tabela 19 do Exemplo 17. Uma comparação com os controles negativos foi também feita para assegurar que o ensaio foi realizado corretamente. Múltiplos eventos R0 para cada transformação do vetor binário TIC11302 foram utilizados no ensaio WCR.
[00341] Uma porção dos eventos estavelmente transformados de R0 decorrentes de cada transformação vetorial binária de TIC9318 e TIC11302 foram utilizados para produzir progênie F1. As plantas estavelmente transformadas R0 foram deixadas se autofertilizando, produzindo progênie F1. A semente F1 foi plantada em vasos de oito polegadas. As plantas heterozigóticas foram identificadas através de métodos moleculares conhecidos na técnica e foram utilizadas para o ensaio contra WCR. A inoculação com os ovos WCR foi conforme descrito para os eventos R0 transformados de forma estável conforme descrito acima. Os danos às raízes foram avaliados usando uma escala de classificação de danos de 0-3, conforme apresentado na Tabela 20 do Exemplo 7. A comparação foi feita com o controle negativo para assegurar que o ensaio foi realizado adequadamente. A classificação média de danos à raiz (RDR) para cada construto é apresentada na Tabela 21 abaixo, em que "NT" indica não testado. Tabela 21. Avaliação Média de Danos à Raiz (RDR) para plantas de milho estavelmente transformadas com TIC9318 ou TIC11302.
Proteína Proteína R0 Neg. F1 Neg. de Fusão Nucleotídeo SEQ ID RDR de RDR de Construto PirAB SEQ ID NO: NO: R0 RDR controle F1 RDR controle Construto_1 TIC9318 53 24 NT NT 1,4 2,8 Construto _2 TIC9318 53 24 NT NT 1,5 1,8 Construto _3 TIC9318 53 24 NT NT 1,2 1,8 Construto _4 TIC11302 158 119 2,9 4,1 1,5 1,8 Construto _5 TIC11302 158 119 2,8 4,1 1,4 1,8 Construto _6 TIC11302 158 119 2,9 4,1 1,4 1,8
[00342] Como pode ser visto na Tabela 21 acima, tanto o TIC9318 quanto o TIC11302 demonstraram resistência à larva da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera) quando comparados aos controles negativos.
[00343] Todas as composições e métodos descritos e reivindicados neste documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Enquanto as composições desta invenção foram descritas em relação às modalidades precedentes ilustrativas, será evidente para aqueles versados na técnica que as variações, alterações, modificações e alterações podem ser aplicadas à composição descrita neste documento, sem que se afaste verdadeiro escope e espírito da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, ao passo que resultados iguais ou semelhantes seriam atingidos. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.
[00344] Todas as publicações e documentos de patentes publicadas neste documento são citados por referência da mesma forma como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica ou individualmente indicado a ser incorporado por referência.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou seu fragmento pesticida, caracterizada pelo fato de que: a. a referida proteína pesticida compreende a sequeência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou b. a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos que possui: i. pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou ii. pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou iii. pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155 e 157; ou iv. pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou v. pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou vi. pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou vii. pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou viii. pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2,
28, 34, 102 e 102; ou ix. pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou x. 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; ou c. o referido segmento polinucleotídico hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com um polinucleotídeo possuindo a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156 ou 158.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a. A molécula de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta; ou b. a molécula de ácido nucleico recombinante é expressa em uma célula vegetal, a fim de produzir uma quantidade de pesticida eficaz da proteína pesticida; ou c. a molécula de ácido nucleico recombinante possui ligação operacional com um vetor e o referido vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, fagemídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossomo artificial bacteriano ou de levedura.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, definida como presente dentro de uma célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula bacteriana e uma célula vegetal.
4. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira bacteriana é de um gênero de bactérias selecionadas do grupo que consiste em: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea e Erwinia.
5. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a espécie de Bacillus é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, o referido Brevibacillus é Brevibacillus laterosperus, ou a referida Escherichia is Escherichia coli.
6. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida célula de planta é uma célula de dicotiledônea ou monocotiledônea.
7. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira vegetal é selecionada do grupo que consiste em célula vegetal de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, couve, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citrus, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho- poró, alface, Pinus taeda, milhete, melões, noz, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, álamo, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, Pinus palustris, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, painço, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
8. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína pesticida exibe atividade contra um inseto coleóptero.
9. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido inseto é a largarta-da-raiz do milho do oeste da América do Norte, largarta-da-raiz do milho do nordeste da América do Norte, largarta-da-raiz do milho mexicana, largarta-da-raiz do milho brasileira, besouro da batata do Colorado, complexo da largarta-da-raiz do milho brasileira consistindo em Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa, besouro-pulga crucífero, besouro-pulga listrado, ou besouro-pulga preto do oeste da América do Norte.
10. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita proteína pesticida exibe atividade contra uma espécie de inseto da ordem de Lepidoptera.
11. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o referido inseto é lagarta rosca, lagarta da espiga do milho, traça das crucíferas, Ostrinia nubilalis, lagarta do cartucho, lagarta das vagens, lagarta falsa medideira, broca grande da cana-de-açúcar, lagarta do tabaco, lagarta de veludo, lagarta de cana-de-açúcar, lagarta da maçã, broca da cana- de-açúcar, lagarta elasmo do milho, lagarta-do-cartucho preta, lagarta- do-cartucho da beterraba, Old World Bollworm, lagarta desfolhadora ou lagarta rosada.
12. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tal proteína pesticida exibe atividade contra uma espécie de inseto na ordem Hemiptera.
13. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido inseto é percevejo verde da soja, o percevejo castanho neotropical, percevejo- faixa-vermelha, espécies de percevejo barriga-verde de espinhos pretos, percevejo asa marrom, percevejo marrom, percevejo verde,
inseto percevejo marmorado marrom, percevejo Lygus ocidental, e percevejo Lygus.
14. Planta ou parte dela, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.
15. Planta ou parte dela, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.
16. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira vegetal é selecionada a partir do grupo consistindo em célula de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, rícino, couve-flor, aipo, grão de bico, repolho chinês, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho- poró, alface, Pinus taeda, painço, melões, noz, aveia, azeite, cebola, ornamental, palmeira, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, guandu, pinho, batata, poplar, abóbora, Pinus radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, panicum, chá, tabaco, tomate, triticale, grama de relva, melancia e trigo.
17. Semente de planta, como definida na reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita semente compreende a dita molécula de ácido nucleico recombinante.
18. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1.
19. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos outro agente pesticida diferente da dita proteína pesticida.
20. Composição inibitória de inseto, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos outro agente pesticida é selecionado do grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma proteína auxiliar.
21. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um outro agente pesticida exibe atividade contra uma ou mais espécies de pragas das ordens Lepidoptera, Coleoptera ou Hemiptera.
22. Composição inibidora de inseto, de acordo com a reivindicaçõ 21, caracterizada pelo fato de que pelo menos um outro agente pesticida é uma proteína selecionada do grupo que consiste em: um Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, variantes de Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras de Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI- 117 AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 e AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z e AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI -R1 e suas variantes, IP3 e suas variantes, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 DIG-11, Cry71Aa1, Cry72Aa1, variantes de PHI-4, variantes de PIP-72, variantes de PIP-45, variantes de PIP-64,
variantes de PIP-74, variantes de PIP-75, variantes de PIP-77, Axmi422, Dig-305, Axmi440, variantes de PIP-47, Axmi281, BT-009, BT-0012, BT- 0013, BT-0023, BT-0067, BT-0044, BT-0051, BT- 0068, BT-0128, DIG- 17, DIG-90, DIG-79, Cry1JP578V, Cry1JPS1 e Cry1 JPS1P578V.
23. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada ainda pelo fato de ser definida como compreendendo uma célula vegetal que expressa a dita molécula de ácido nucleico recombinante.
24. Produto primário produzido a partir da planta ou de parte dela, como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto primário compreende uma quantidade detectável da dita molécula de ácido nucleico recombinante ou uma proteína pesticida codificada por essa.
25. Produto primário, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre o grupo que consiste em milho ensacado por cerealista, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereais de milho e semelhantes, sementes de algodão integral ou processadas, óleo de algodão, fibra de algodão, sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimentos, fibras, papel, biomassas e produtos combustíveis, como combustível derivado de óleo de algodão ou pastilhas derivados de resíduos de gim de algodão, sementes de soja integrais ou processadas, óleo de soja, proteína de soja, refeição de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, alimentos para animais compreendendo soja, papel compreendendo soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja e produtos combustíveis produzidos usando plantas de soja e partes de plantas de soja.
26. Método de produção de sementes, caracterizado pelo fato de que compreende:
a. plantar pelo menos uma primeira semente, conforme a reivindicação 17. b. cultivar uma planta da semente; e c. colher sementes da planta, em que a referida semente colhida compreende a referida molécula de ácido nucleico recombinante.
27. Planta resistente à infestação de insetos, caracterizada pelo fato de que as células da referida planta compreendem a molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1.
28. Método para controlar uma infestação por pragas ou por insetos de espécies de coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. colocar a praga em contato com uma quantidade inseticida eficaz de uma proteína pesticida conforme estabelecido em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou b. colocar a praga em contato com uma quantidade inseticida eficaz de uma ou mais proteínas pesticidas compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo: i. pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou ii. pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou iii. pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155 e 157; ou iv. pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30,
92, 111, 115 e 151; ou v. pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou vi. pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou vii. pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou viii. pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou ix. pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou x. 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143.
29. Método para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em uma amostra compreendendo DNA genômico vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: a. colocar em contato a amostra com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA genômico de uma planta que compreende a molécula de DNA da reivindicação 1, e não hibridiza sob tais condições de hibridização com DNA genômico de uma planta isogênica que não compreende a molécula recombinante de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, em que a sonda é homóloga ou complementar às SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 146, 148, 150, 152, 154, 156, ou 158, ou um sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo: i. pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou ii. pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou iii. pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155 e 157; ou iv. pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou v. pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou vi. pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou vii. pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou viii. pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou ix. pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou x. 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; b. submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas; e c. detectar a hibridização da sonda com DNA da amostra.
30. Método para detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento desta em uma amostra compreendendo proteína, caracterizado pelo fato de que a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90,
92, 94, 96, 98, 100, 102, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155 ou 157; ou a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos que tem: i. pelo menos 65% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 123, 127, 129, 131, 133 e 145; ou ii. pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 109, 121 e 125; ou iii. pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 18, 24, 36, 42, 62, 68, 74, 80, 86, 98, 113, 117, 119, 147, 149, 153, 155 e 157; ou iv. pelo menos 82% de identidade com as SEQ ID NOs: 30, 92, 111, 115 e 151; ou v. pelo menos 86% de identidade com as SEQ ID NOs: 6 e 50; ou vi. pelo menos 94% de identidade com as SEQ ID NOs: 137 e 141; ou vii. pelo menos 97% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 26 e 32; ou viii. pelo menos 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 28, 34, 102 e 102; ou ix. pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135; ou x. 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 16, 20, 22, 38, 40, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 76, 78, 82, 84, 88, 90, 94, 96, 100, 105, 107, 139 e 143; em que o método compreende: xi. colocar a amostra em contato com um anticorpo imunorreativo; e xii. detectar a ligação do anticorpo com a proteína pesticida ou fragmento dela, em que a ligação indica a presença da proteína.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende um ELISA, ou um Western blot.
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