RU2765310C2 - Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым - Google Patents
Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым Download PDFInfo
- Publication number
- RU2765310C2 RU2765310C2 RU2018107162A RU2018107162A RU2765310C2 RU 2765310 C2 RU2765310 C2 RU 2765310C2 RU 2018107162 A RU2018107162 A RU 2018107162A RU 2018107162 A RU2018107162 A RU 2018107162A RU 2765310 C2 RU2765310 C2 RU 2765310C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- axmi
- plant
- protein
- nucleic acid
- corn
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 239
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 234
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 51
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims abstract description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 claims abstract description 49
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 30
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 196
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 claims description 85
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 76
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 74
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 73
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 71
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 71
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 41
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 37
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 241000289763 Dasygaster padockina Species 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 22
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 claims description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 241001012098 Omiodes indicata Species 0.000 claims description 16
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 14
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 11
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 11
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims description 10
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 claims description 10
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims description 10
- -1 namental Species 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 8
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 7
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 7
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 6
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 6
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 6
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 claims description 6
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims description 6
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 claims description 6
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 6
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 6
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 6
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 6
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 6
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000446 fuel Substances 0.000 claims description 6
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 6
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 claims description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000234282 Allium Species 0.000 claims description 5
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 claims description 5
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 claims description 5
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 claims description 5
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 5
- 235000003717 Boswellia sacra Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000012035 Boswellia serrata Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007551 Boswellia serrata Species 0.000 claims description 5
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims description 5
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010773 Cajanus indicus Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000105627 Cajanus indicus Species 0.000 claims description 5
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 claims description 5
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 claims description 5
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 claims description 5
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 claims description 5
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 claims description 5
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 5
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 5
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000014466 Douglas bleu Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 5
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 claims description 5
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 claims description 5
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004863 Frankincense Substances 0.000 claims description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 5
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 claims description 5
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 claims description 5
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 claims description 5
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 claims description 5
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 claims description 5
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 claims description 5
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 claims description 5
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 claims description 5
- 102000014386 PA14 domains Human genes 0.000 claims description 5
- 108050003408 PA14 domains Proteins 0.000 claims description 5
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 claims description 5
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims description 5
- 241001236219 Pinus echinata Species 0.000 claims description 5
- 235000005018 Pinus echinata Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000017339 Pinus palustris Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 claims description 5
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000219000 Populus Species 0.000 claims description 5
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 claims description 5
- 235000005386 Pseudotsuga menziesii var menziesii Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 claims description 5
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 claims description 5
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 claims description 5
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 claims description 5
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 claims description 5
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 claims description 5
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 5
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004248 saffron Substances 0.000 claims description 5
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 claims description 5
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000916731 Diabrotica speciosa Species 0.000 claims description 4
- 241000916730 Diabrotica viridula Species 0.000 claims description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 235000008577 Pinus radiata Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000218621 Pinus radiata Species 0.000 claims description 4
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 claims description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000123 paper Substances 0.000 claims description 4
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims description 4
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 claims description 3
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 3
- 241000353522 Earias insulana Species 0.000 claims description 3
- 244000111261 Mucuna pruriens Species 0.000 claims description 3
- 235000008540 Mucuna pruriens var utilis Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 3
- 241000209134 Arundinaria Species 0.000 claims description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 claims description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 claims description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 2
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004460 silage Substances 0.000 claims description 2
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 claims description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims 3
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 claims 2
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 claims 2
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 claims 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 2
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 claims 2
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 claims 2
- 241000214558 Nemapogon granella Species 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013528 soy cheese Nutrition 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 15
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 53
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 34
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 17
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 17
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 13
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 10
- 230000008653 root damage Effects 0.000 description 10
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 9
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 7
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 7
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 7
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 6
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 6
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 5
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 5
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 5
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 4
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 4
- 241001414823 Lygus hesperus Species 0.000 description 4
- 241000501345 Lygus lineolaris Species 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 244000221633 Brassica rapa subsp chinensis Species 0.000 description 3
- 241001635274 Cydia pomonella Species 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 3
- 241000721451 Pectinophora gossypiella Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 3
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 3
- 241000255632 Tabanus atratus Species 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 2
- 241001136265 Agriotes Species 0.000 description 2
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 2
- 241000218475 Agrotis segetum Species 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000254177 Anthonomus Species 0.000 description 2
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 2
- 241001174347 Atomaria Species 0.000 description 2
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 241001087583 Chaetocnema tibialis Species 0.000 description 2
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001212536 Cosmopolites Species 0.000 description 2
- 241000721021 Curculio Species 0.000 description 2
- 241001641895 Dermestes Species 0.000 description 2
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 2
- 241001529600 Diabrotica balteata Species 0.000 description 2
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 2
- 241000489973 Diabrotica undecimpunctata Species 0.000 description 2
- 241000381325 Diabrotica virgifera zeae Species 0.000 description 2
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 2
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 2
- 241000400698 Elasmopalpus lignosellus Species 0.000 description 2
- 241001301805 Epilachna Species 0.000 description 2
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 2
- 241000396080 Lissorhoptrus Species 0.000 description 2
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 2
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 2
- 241000254071 Melolontha Species 0.000 description 2
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 2
- 241000131737 Otiorhynchus Species 0.000 description 2
- 241001525654 Phyllocnistis citrella Species 0.000 description 2
- 241000254103 Popillia Species 0.000 description 2
- 235000005805 Prunus cerasus Nutrition 0.000 description 2
- 241000721694 Pseudatomoscelis seriatus Species 0.000 description 2
- 241001160824 Psylliodes Species 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000254181 Sitophilus Species 0.000 description 2
- 241000753143 Sitotroga Species 0.000 description 2
- 241000254105 Tenebrio Species 0.000 description 2
- 241000254086 Tribolium <beetle> Species 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 241000267823 Trogoderma Species 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- 241000001996 Agrotis orthogonia Species 0.000 description 1
- 241001652650 Agrotis subterranea Species 0.000 description 1
- 241000449794 Alabama argillacea Species 0.000 description 1
- 241000484415 Anarta trifolii Species 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 101000768857 Arabidopsis thaliana 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241001002470 Archips argyrospila Species 0.000 description 1
- 241001423656 Archips rosana Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 description 1
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 description 1
- 108010007108 Chloroplast Thioredoxins Proteins 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 241000098289 Cnaphalocrocis medinalis Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001340508 Crambus Species 0.000 description 1
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000489977 Diabrotica virgifera Species 0.000 description 1
- 241001572697 Earias vittella Species 0.000 description 1
- 241000738498 Epitrix pubescens Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 240000000047 Gossypium barbadense Species 0.000 description 1
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 description 1
- 241001441330 Grapholita molesta Species 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 244000061944 Helianthus giganteus Species 0.000 description 1
- 241001000403 Herpetogramma licarsisalis Species 0.000 description 1
- 241000630740 Homoeosoma electellum Species 0.000 description 1
- 241000370523 Hypena scabra Species 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241001261104 Lobesia botrana Species 0.000 description 1
- 241001414826 Lygus Species 0.000 description 1
- 241000732113 Mamestra configurata Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001310339 Paenibacillus popilliae Species 0.000 description 1
- 241000497111 Paralobesia viteana Species 0.000 description 1
- 241000459456 Parapediasia teterrellus Species 0.000 description 1
- 101100056487 Petunia hybrida EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 1
- 101100457857 Pseudomonas entomophila (strain L48) mnl gene Proteins 0.000 description 1
- 241000255893 Pyralidae Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000753145 Sitotroga cerealella Species 0.000 description 1
- 241001521235 Spodoptera eridania Species 0.000 description 1
- 244000107946 Spondias cytherea Species 0.000 description 1
- 241000098292 Striacosta albicosta Species 0.000 description 1
- 241001575047 Suleima Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 244000152045 Themeda triandra Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000255901 Tortricidae Species 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001389006 Tuta absoluta Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N bioresmethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OCC1=COC(CC=2C=CC=CC=2)=C1 VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N 0.000 description 1
- 244000037672 biotech crops Species 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000011655 cotton Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000021393 food security Nutrition 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 230000019637 foraging behavior Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007758 mating behavior Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001846 repelling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, для обеспечения растению устойчивости к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых. Также раскрыты трансформированное растение и его часть, семя, композиция, товарный продукт, содержащие указанную молекулу, полипептид, кодируемый указанной молекулой. Раскрыты способ борьбы с чешуекрылыми и жесткокрылыми насекомыми-вредителями с помощью указанной молекулы, способ детекции указанной молекулы. Изобретение позволяет эффективно бороться с чешуекрылыми и жесткокрылыми насекомыми-вредителями. 10 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 6 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/199,024, поданной 30 июля 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Файл с именем "MONS394WO-sequence_listing.txt", содержащий машиночитаемую форму списка последовательностей, был создан 19 июля 2016 года. Этот файл составляет 16,077 байт (измеренный в MS-Windows®), одновременно подан в электронной форме (с использованием системы регистрации EFS-Web Патентного ведомства США) и полностью включается в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Данное изобретение в целом относится к области белков, обладающих ингибиторной активностью в отношении насекомых. Раскрывается новый класс белков, проявляющих инсектицидную ингибирующую активность против сельскохозяйственных вредителей сельскохозяйственных культур и семян. В частности, описанный белок является инсектицидно активным в отношении вредителей сельскохозяйственных культур и семян, в частности видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых-вредителей. Предлагаются растения, части растений и семена, содержащие рекомбинантный полинуклеотидный конструкт, кодирующий один или более описанных белков токсина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Все большее значение приобретает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, включая, среди прочего, кукурузу, сою, сахарный тростник, рис, пшеницу, овощи и хлопок. По прогнозам, в дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для обеспечения пищей, одеждой и обеспечения энергией растущего населения, климатическим последствиям и давления со стороны растущего населения на использование земли, отличной от сельскохозяйственной, уменьшается количество доступных пахотных земель для ведения сельского хозяйства. Данные факторы привели к неоптимистичным прогнозам продовольственной безопасности, особенно в условиях отсутствия значительных улучшений в области биотехнологии растений и агрономических приемов. В свете данных факторов, экологически устойчивые усовершенствования в области технологий, агротехники и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.
[0005] Насекомые, особенно насекомые в пределах отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых считаются основной причиной повреждения полевых культур, тем самым снижая урожайность культур в зараженных районах. Виды чешуекрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta и Phyllocnistis citrella. Виды жесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. и Trogoderma spp, в частности, в которых вредителем является Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный жук, WCR), Diabrotica barberi (северный кукурузный жук, NCR), Diabrotica virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук, MCR), Diabrotica balteata (бразильский кукурузный жук (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (южный кукурузный жук, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR), состоящая из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa). Виды полужесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: Lygus hesperus, Lygus lineolaris и Pseudatomoscelis seriatus.
[0006] Исторически сложилось так, что интенсивное применение синтетических химических инсектицидов использовалось в качестве средства борьбы с вредителями в сельском хозяйстве. Обеспокоенность по поводу окружающей среды и здоровья человека, помимо возникающих проблем с устойчивостью, стимулировала исследования и разработку биологических пестицидов. Данное исследование привело к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных видов микроорганизмов, включая бактерии.
[0007] Парадигма биологических методов борьбы изменилась, когда был открыт потенциал энтомопатогенных бактерий, особенно бактерий, относящихся к роду Bacillus, и применен в разработке агентов для биологической борьбы с вредителями. Штаммы бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) использовали в качестве источника пестицидных белков, так как было обнаружено, что штаммы Bt проявляют высокую токсичность против конкретных насекомых. Известно, что штаммы Bt продуцируют дельта-эндотоксины, которые локализованы в параспоральных кристаллических тельцах включения в начале споруляции и во время фазы стационарного роста (например, белки Cry) и также известно, что они продуцирует секретируемый инсектицидный белок. При проглатывании восприимчивым насекомым, дельта-эндотоксины, а также секретируемые токсины оказывают свое действие на поверхность эпителия средней кишки, разрушают клеточную мембрану, приводя к разрушению и гибели клеток. Гены, кодирующие инсектицидные белки, также были идентифицированы у бактериальных видов, отличных от Bt, в том числе другие Bacillus и множество других видов бактерий, таких как Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls" ранее известный как Bacillus sphaericus) и Paenibacillus popilliae.
[0008] Кристаллические и секретируемые растворимые инсектицидные токсины являются высокоспецифичными для их хозяев и получили мировое признание как альтернативы химическим инсектицидам. Например, инсектицидные белки-токсины применяют в различных сельскохозяйственных целях для защиты хозяйственно-ценных растений от заражения насекомыми, уменьшения потребности в применении химических пестицидов и повышения урожайности. Инсектицидные белки-токсины применяют для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений механизированными способами, такими как распыление дисперсных микробных препаратов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и с использованием методов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный белок-токсин.
[0009] Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки-токсины, признано в мировом масштабе. Например, в 2012 году 26,1 миллиона гектаров были засажены трансгенными культурами, экспрессирующими токсины Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Краткое содержание отчета ISAAA (Международная служба по сбору сведений о применении биотехнологий в сельском хозяйстве) № 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество инсектицидных белков-токсинов, применяемых для этих культур, создало давление отбора для существующих аллелей насекомых, которые придают устойчивость к применяемым в настоящее время инсектицидным белкам.
[0010] Развитие резистентности у целевых вредителей к инсектицидным белкам-токсинам создает постоянную потребность в открытии и разработке новых форм инсектицидных токсичных белков, которые полезны для контроля над повышением резистентности насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки-токсины. Новые белковые токсины с повышенной эффективностью, и которые контролируют более широкий спектр восприимчивых видов насекомых, уменьшают число выживших насекомых, которые могут развить резистентные аллели. Кроме того, применение в одном растении двух или более трансгенных инсектицидных белков-токсинов, токсичных для одного и того же насекомого-вредителя и демонстрирующих различные способы воздействия, снижает вероятность резистентности у любых отдельных целевых видов насекомых.
[0011] Таким образом, авторы данного изобретения раскрывают новое семейство белковых токсинов от Bacillus thuringiensis вместе с подобными белками-токсинами, вариантными белками и типовыми рекомбинантными белками, которые проявляют инсектицидную активность к целевым видам чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей, в частности, к западному кукурузному жуку.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В данном документе описана новая группа белков с ингибирующей активностью по отношению к насекомым (белки-токсины), упоминаемые в данном документе как TIC5290, которые, как показано, проявляют ингибирующую активность против одного или более вредителей сельскохозяйственных растений. TIC5290 белок и белки в классе белка-токсина TIC5290 могут применяться отдельно или в сочетании с другими инсектицидными белками и токсичными веществами в препаратах и in planta, таким образом обеспечивая альтернативы инсектицидным белкам и химии инсектицидов, которые в настоящее время используются в сельскохозяйственных системах.
[0013] В одном варианте реализации изобретения в данной заявке представлена молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанный полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности последовательности к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (e) указанная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором, и указанный вектор выбирают из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, которая функционирует для экспрессии пестицидного белка в растении; или экспрессируется в растительной клетке для получения пестицидно эффективного количества пестицидного белка.
[0014] В другом варианте реализации изобретения данной заявки присутствуют клетки-хозяева, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клетки. Рассматриваемые клетки-хозяева включают в себя Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea и Erwinia. В определенных вариантах реализации изобретения указанными видами Bacillus являлись Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанным Brevibacillus являлся Brevibacillus laterosperus, или указанным Escherichia являлся Escherichia coli. Рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя клетку двудольных и клетку однодольных. Дополнительно, рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя растительную клетку люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника (Gossypium sp.), тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0015] В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против жесткокрылого насекомого, в том числе западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или группы бразильского кукурузного жука, состоящей из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa.
[0016] В другом варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против чешуекрылого насекомого, в том числе совки бархатных бобов, огневки тростниковой, точильщика зернового кукурузного, совки хлопковой, табачной листовертки, соевой совки, африканской совки, южной совки, совки травяной, совки свекольной, совки американской, азиатской хлопковой совки, розового коробочного червя хлопчатника, совки-ипсилон, огневки кукурузной юго-западной, капустной моли или мотылька стеблевого кукурузного.
[0017] В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против полужесткокрылого насекомого, в том числе слепняка западного матового, клопа травяного или хлопкового слепняка.
[0018] Также в данной заявке рассматриваются растения, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, причем: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с комплементарной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанное растение проявляет обнаруживаемое количество указанного пестицидного белка. В определенных вариантах реализации изобретения пестицидный белок содержит SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения растение является однодольным или двудольным. В другом варианте реализации изобретения растение выбирают из группы, состоящей из люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0019] В дополнительных вариантах реализации изобретения описываются семена, содержащие молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
[0020] В другом варианте реализации изобретения рассматривается описанная в данной заявке композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, обладающего ингибиторной активностью по отношению к насекомым, молекулы дцРНК, обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым, и вспомогательного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, проявляет активность против одного или более видов вредителей из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, в одном варианте реализации изобретения является выбранным из группы, состоящей из: Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и его вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и белка DIG-11.
[0021] Рассматриваются товарные продукты, содержащие обнаруживаемое количество молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Такие товарные продукты включают в себя товарную кукурузу, упакованную обработчиком зерна, кукурузные хлопья, кукурузные лепешки, кукурузную муку, кукурузную муку крупного помола, кукурузный сироп, кукурузное масло, кукурузный силос, кукурузный крахмал, кукурузную кашу и тому подобное, а также соответствующие хлопковые товарные продукты, такие как цельные или обработанные семена хлопчатника, хлопковое масло, линт, семена и части растений, обработанные для корма или продуктов питания, волокно, бумага, биомассы и топливные продукты, такие как топливо, полученное из хлопкового масла или таблеток, полученных из отходов хлопковой очистки, и соответствующие товарные продукты из сои такие как цельные или обработанные семена сои, соевое масло, соевый белок, соевая мука крупного помола, соевая мука, соевые хлопья, соевые отруби, соевое молоко, соевый сыр, соевое вино, корм для животных, содержащий соевые бобы, бумага, содержащая сою, сливки, содержащие сою, биомассу соевых бобов и топливные продукты, произведенные с использованием растений сои и частей растений сои, а также соответствующие продукты из риса, пшеницы, сорго, голубиного гороха, арахиса, фруктов, дыни и товарной продукции овощей, включая, где это применимо, соки, концентраты, джемы, желе, мармелады и другие съедобные формы таких товарных продуктов, содержащих обнаруживаемое количество таковых полинуклеотидов и или полипептидов данной заявки.
[0022] В данной заявке также рассматривается способ производства семян, содержащих молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Способ включает посадку, по меньшей мере, одного из семени, содержащего молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке; выращивание растения из семени; и сбор семени из растений, причем собранное семя содержит молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки.
[0023] В другом иллюстративном варианте реализации изобретения предлагается растение, устойчивое к заражению насекомыми, в котором клетки указанного растения содержат: (a) молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую инсектицидно эффективное количество пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) инсектицидно эффективное количество белка, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичность аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0024] Также в данной заявке описаны способы борьбы с вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылых, и борьбы с поражением растений вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылых, в частности сельскохозяйственной культуры. В одном варианте реализации изобретения способ включает (a) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0025] Дополнительно в данном документе предлагается способ обнаружения наличия молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации изобретения способ включает приведение в контакт образца нуклеиновых кислот с зондом на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, представленный в данном документе, и не гибридизуется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит сегмент, причем зонд является гомологичным или комплементарным к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, или последовательности, которая кодирует пестицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. Способ может дополнительно включать в себя (a) применение к образцу и зонду жестких условий гибридизации; и (b) обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
[0026] Также изобретением предусмотрены способы обнаружения наличия пестицидного белка или его фрагмента в образце, содержащем белок, причем указанный пестицидный белок, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения способ включает в себя: (a) приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и (b) обнаружение наличия белка. В некоторых вариантах реализации изобретения этап обнаружения включает в себя твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или вестерн-блоттинг.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0027] На Фиг. 1 изображена in planta ингибирующая активность типовых целевых и нецелевых белков TIC5290 хлоропласта к западному кукурузному жуку (WCR).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0028] SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность пестицидного белка TIC5290, полученную из вида Bacillus thuringiensis EG6657.
[0029] SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность белка TIC5290.
[0030] SEQ ID NO: 3 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, которая кодирует пестицидный белок TIC5290, используемый для экспрессии в растительных клетках.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031] Проблема в области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как потребность в новых белках-токсинах, которые эффективны против целевых вредителей, проявляют токсичность широкого спектра по отношению к целевым видам вредителей, способны экспрессироваться в растениях, не вызывая нежелательных агрономических проблем, и обеспечивают альтернативный способ воздействия по сравнению с существующими на сегодняшний день токсинами, которые используют в растениях в коммерческих целях.
[0032] В данном документе описаны новые инсектицидные белки, примером которых является TIC5290 и родственные члены семейства, которые обеспечивают устойчивость к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым насекомым-вредителям, более конкретно к видам-вредителям кукурузных жуков. Также описанными являются синтетические кодирующие последовательности, предназначенные для экспрессии в растительной клетке, которые кодируют TIC5290. Далее описаны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие промотор в оперативной связи с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок-токсин TIC5290, или родственные члены семейства или их фрагменты.
[0033] Ссылка в этой заявке на TIC5290, "белок TIC5290", "белковый токсин TIC5290", "белок-токсин TIC5290", "пестицидный белок TIC5290", "TIC5290-подобные токсины", или "TIC5290-подобные белки-токсины" и тому подобные, относится к любому новому пестицидному белку или обладающему ингибиторной активностью по отношению к насекомым белку, который включает в себя, состоит, является по существу гомологичным, является подобным или получен из любого пестицидного белка или обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым белковой последовательности TIC5290 (SEQ ID NO: 2), а также их ингибирующим пестицидным или обладающим ингибиторной активностью по отношению к насекомым сегментам или их комбинациям, которые придают активность против жесткокрылых насекомых-вредителей, чешуекрылых насекомых-вредителей и полужесткокрылых насекомых-вредителей, включая любой белок, проявляющий пестицидную или ингибирующую активность по отношению к насекомым, если выравнивание такого белка с TIC5290 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов.
[0034] Термин "сегмент" или "фрагмент" используется в данной заявке для описания непрерывных последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая белок TIC5290 или связанный с ним член семейства инсектицидных белков. Сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, также раскрыт в данной заявке, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующим участком белка TIC5290, изложенным в SEQ ID NO: 2 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов между сегментом или фрагментом и соответствующим участком белка TIC5290.
[0035] В контексте данной заявки термины "активная" или "активность", "пестицидная активность" или "пестицидная" или "инсектицидная активность", "ингибитор в отношении насекомых" или "инсектицидная" относятся к эффективности токсического вещества, такого как белок-токсин, в ингибировании (ингибировании роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавлении (подавлении роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), борьбе (борьбе с поражением насекомыми-вредителями, контроле интенсивности питания насекомых-вредителей на определенной культуре, содержащей эффективное количество белка TIC5290), или уничтожении (вызывающем заболеваемость, смертность или снижение плодовитости) вредителя. Эти термины призваны включать в себя результат обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка для вредителя, при котором предоставление вредителю токсичного белка приводит к заболеваемости, смертности, снижению плодовитости или задержке роста. Данные термины также включают отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, растительных клеток или от конкретного географического местоположения, причем растение может расти, в результате обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсичного белка быть эффективным в ингибировании роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, в связи с предоставлением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомых отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых. Токсичный белок может быть произведен растением или может быть применен к растению или к окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины "биоактивность", "эффективный", "действенный" или их вариации также являются терминами, взаимозаменяемо используемыми в данной заявке, для описания воздействия белков данного изобретения на целевых насекомых-вредителей.
[0036] Пестицидно эффективное количество токсического вещества, обеспеченное в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность при контакте токсического вещества с вредителем. Токсичное вещество может представлять собой пестицидный белок или одно, или более химических веществ, известных в данной области техники. Пестицидные или инсектицидные химические вещества и пестицидные или инсектицидные белковые агенты могут быть использованы по отдельности или в сочетании друг с другом. Химические вещества включают в себя, но без ограничений, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Пестицидные или инсектицидные белковые агенты включают в себя белковые токсины, изложенные в данной заявке, а также другие белковые токсичные вещества, включая те, которые нацелены на виды-вредители чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как белки Cry, доступные в данной области техники для применения при борьбе с видами чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых.
[0037] Предполагается, что ссылка на вредителя, особенно вредителя сельскохозяйственного растения, означает вредителей культурных растений, особенно тех вредителей, которые контролируются белком TIC5290. Однако, ссылка на насекомого-вредителя может также включать в себя равнокрылых насекомых-вредителей, а также нематод и грибов при тех условиях, когда токсичные вещества, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с белком TIC5290 или белком, который имеет от около 65 до около 100 процентов идентичности с TIC5290.
[0038] Инсектицидные белки, класса белковых токсинов TIC5290 связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность по отношению к насекомым-вредителям из видов жесткокрылых и чешуекрылых насекомых, включая взрослых особей, куколок, личинок и новорожденных, а также представителей полужесткокрылых, включая взрослых особей и нимф.
[0039] Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, но без ограничений, совок луговых, совок, пядениц, и совок из семейства Noctuidae, например, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку помидорную (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), южную совку (Spodoptera eridania), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Pseudoplusia includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hypena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia); точильщиков, чехлоносок, бабочек, огневок шишковых, гусениц бабочки капустницы и пироморфид из семейства Pyralidae, например, мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus); листоверток, дымчастых листоверток, плодожорок и плодовых листоверток из семейства Tortricidae, например, плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную (Grapholita molesta), листовертку подсолнечника (Suleima helianthana); и многих других экономически важных чешуекрылых, например, капустную моль (Plutella xylostella), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella) и шелкопряда непарного (Lymantria dispar). Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, например, совку хлопковую американскую (Alabama argillacea), листовертку плодовых деревьев (Archips argyrospila), листовертку розанова (Archips rosana) и других представителей листоверток, (Chilo suppressalis, огневку стеблевую азиатскую или желтую рисовую огневку), листовертку рисовую (Cnaphalocrocis medinalis), блошку длинноусую (Crambus caliginosellus), гусеницу мятлика (Crambus teterrellus), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella), тростниковую огневку (Diatraea saccharalis), совку хлопковую египетскую (Earias insulana), совку пятнистую (Earias vittella), совку американскую (Helicoverpa armigera), американскую кукурузную совку (Helicoverpa zea, также известную как совка хлопковая), табачную листовертку (Heliothis virescens), мотылька лугового (Herpetogramma licarsisalis), листовертку виноградную (Lobesia botrana), цитрусовую минирующую моль (Phyllocnistis citrella), белянку капустную (Pieris brassicae), белянку репную (Pieris rapae, также известную как репница), капустную моль (Plutella xylostella), совку свекольную (Spodoptera exigua), табачную совку (Spodoptera litura, также известную как табачный озимый червь) и томатную минирующую моль (Tuta absoluta).
[0040] Насекомые отряда жесткокрылых включают в себя, но без ограничений, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. и Trogoderma spp, в частности, в которых вредителем является западный кукурузный жук (Diabrotica virgifera, WCR), северный кукурузный жук (Diabrotica barberi, NCR), мексиканский кукурузный жук (Diabrotica virgifera zeae, MCR), бразильский кукурузный жук (Diabrotica balteata, BZR), южный кукурузный жук (Diabrotica undecimpunctata howardii, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR, состоящая из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa).
[0041] Насекомые отряда полужесткокрылых включают в себя, но без ограничений, слепняка западного матового (Lygus hesperus), клопа травяного (Lygus lineolaris) и хлопкового слепняка (Pseudatomoscelis seriatus).
[0042] В контексте данной заявки термин "изолированная молекула ДНК" или эквивалентный термин или фраза означает, что молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, терминирующая последовательность транскрипции и тому подобные, которые, естественно, находятся в ДНК генома организма, не считаются "выделенными" до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природе. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части были бы "выделены" в рамках данного описания при условии, если элемент не находится внутри генома организма и не в том месте в геноме, в котором он встречается в природе. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой естественным образом находится последовательность, кодирующая белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность природного инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей данного описания. Для целей данного описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть, нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или подобной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарах, полученных из растения или бактерии.
[0043] Как описано далее в данном документе, открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая TIC5290 (SEQ ID NO: 1), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG6657 Bacillus thuringiensis. Кодирующую последовательность клонировали и экспрессировали в микробных клетках-хозяевах для получения белка (SEQ ID NO: 2), используемого в биологических анализах. Ближайшим гомологом токсина TIC5290 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4. Биологический анализ с использованием белков TIC5290, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против вредителя жесткокрылых западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR); видов чешуекрылых - кукурузной листовой совки (Spodoptera frugiperda, FAW), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea, CEW), мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis) и капустной моли (Plutella xylostella); а также вредителя полужесткокрылых слепняка западного матового (Lygus hesperus).
[0044] Предполагается, что дополнительные последовательности белка-токсина, связанные с TIC5290, могут быть созданы с использованием естественной аминокислотной последовательности TIC5290 для создания новых белков с новыми свойствами. Белок-токсин TIC5290 может быть выровнен с другими белками, подобными к TIC5290, с целью объединения различий на уровне аминокислотной последовательности для новых вариантов аминокислотных последовательностей и внесения соответствующих изменений в последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая кодирует варианты.
[0045] Дополнительно следует иметь в виду, что улучшенные варианты TIC5290 могут быть сконструированы in planta с использованием различных способов генной инженерии, известных в данной области техники. Такие технологии, используемые в генной инженерии, включают в себя, но без ограничений, ZFN (нуклеазу с цинковыми пальцами), мегануклеазы, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) и системы CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)/Cas (CRISPR-ассоциированные). Такие способы генной инженерии могут быть использованы для изменения кодирующей последовательности белка-токсина, трансформированной в растительную клетку, в другую последовательность, кодирующую токсин. В частности, с помощью этих способов один или более кодонов в кодирующей последовательности токсина изменяются с целью разработки новой белковой аминокислотной последовательности. В альтернативном варианте, фрагмент в пределах кодирующей последовательности заменяется или удаляется, или дополнительные фрагменты ДНК вставляются в кодирующую последовательность для создания новой кодирующей последовательности токсина. Новая кодирующая последовательность может кодировать белок-токсин с новыми свойствами, такими как повышенная активность или увеличенный спектр против насекомых-вредителей, а также обеспечивать активность против видов насекомых-вредителей, которые развили устойчивость против исходного белка-токсина. Растительная клетка, содержащая редактированную последовательность гена токсина, может быть использована, с помощью способов известных в данной области техники, для получения целых растений, экспрессирующих новый белок-токсин.
[0046] Также предполагается, что фрагменты белка TIC5290 или его варианты, могут быть укороченными формами с ингибирующей активностью в отношении насекомых, в которых одна или более аминокислот удаляются с N-конца, С-конца, середины белка, или их комбинаций. Эти фрагменты могут быть естественного происхождения или синтетическими вариантами TIC5290 или вариантами производного белка, но должны сохранять ингибирующую активность TIC5290 в отношении насекомых.
[0047] Белки, которые напоминают белок TIC5290, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники. Например, идентичности аминокислотных последовательностей белков, связанных с TIC5290, может быть проанализирована с использованием выравнивания Clustal W с использованием данных параметров по умолчанию: Матрица сравнения: blosum, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,0, штраф на продолжение делеции: 0,05, гидрофильные делеции: Вкл., гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штраф на остаткоспецифичные делеции: Вкл. (Thompson, и соавт (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывается в виде выражения 100% умноженных на (идентичности аминокислот/длина искомого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и обеспечивают результаты, аналогичные тем, которые получены с использованием выравнивания Clustal W.
[0048] Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении видов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых, является связанным с TIC5290, если выравнивание такого искомого белка с TIC5290 демонстрирует, по меньшей мере, от 65% до 100% идентичности аминокислот по длине искомого белка что составляет около 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичности аминокислотной последовательности (или любой процент в данном диапазоне) между искомым и исследуемым белком.
[0049] Белок TIC5290 также может быть связан первичной структурой (консервативные аминокислотные мотивы), длиной (около 937 аминокислот) и другими характеристиками. Биоинформационный анализ показывает, что TIC5290 является порообразующим белком, имеет домен PA14 Pfam (PF07691), который, вероятно, вовлечен в связывание с клеточным рецептором(-ами) в желудке целевого насекомого, домен находится в позиции аминокислот с 16 по 140 аминокислоту, а затем следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в позиции аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Оба этих Pfam, вероятно, способствуют инсектицидной активности белка. Характеристики белкового токсина TIC5290 представлены в таблице 1.
Таблица 1. Отдельные характеристики белка TIC5290.
Белок | Молекулярная масса (в дальтонах) | Аминокислотная длина | Изоэлектрическая точка | Заряд при PH 7,0 | Количество сильноосновных (-) аминокислот | Количество сильнокислых аминокислот | Количество гидрофобных аминокислот | Количество полярных аминокислот |
TIC5290 | 104962,93 | 937 | 6,7076 | 1,0 | 116 | 110 | 440 | 497 |
[0050] Как описано далее в примерах данной заявки, последовательности молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие TIC5290, были сконструированы для применения в растениях. Иллюстративная, оптимизированная для растений, последовательность молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая белок TIC5290, которая была сконструирована для применения в растениях, изложена в SEQ ID NO: 3.
[0051] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие эти синтетические последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, сои, хлопчатника или клетки других растений в соответствии со способами и методиками трансформации, известными в данной области техники. Например, опосредованная Agrobacterium трансформация описана в публикациях патентной заявки США 2009/0138985A1 (соя), 2008/0280361A1 (соя), 2009/0142837A1 (кукуруза), 2008/0282432 (хлопчатник), 2008/0256667 (хлопчатник), 2003/0110531 (пшеница), 2001/0042257 A1 (сахарная свекла), патентах США №5,750,871 (канола), 7,026,528 (пшеница) и 6,365,807 (рис), и в Arencibia и соавт. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (сахарный тростник) полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Трансформированные клетки могут быть воспроизведены в трансформированные растения, которые экспрессируют TIC5290 и демонстрируют пестицидную активность посредством биологических анализов, проводимых в присутствии личинок вредителей чешуекрылых или полужесткокрылых, использующих листовые диски, полученные из трансформированных растений. Для испытания пестицидной активности к вредителям жесткокрылых, трансформированные растения генерации Ro и F1 использовались в анализе влияния вредителя на корень, как описано в примере ниже.
[0052] В качестве альтернативы традиционным способам трансформации, последовательность ДНК, такая как трансген, экспрессионная кассета(-ты) и тому подобные, может быть вставлена или интегрирована в конкретный сайт или локус в геноме растения или растительной клетки через сайт-направленную интеграцию. Таким образом, конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК и молекула(-ы) данного описания могут включать в себя последовательность донорной матрицы, содержащую, по меньшей мере, один трансген, экспрессионную кассету или другую последовательность ДНК для вставки в геном растения или растительной клетки. Такая донорная матрица для сайт-направленной интеграции может дополнительно включать в себя одно или два гомологичных "плеча", фланкирующие последовательность вставки (то есть, последовательность, трансген, кассету и тому подобное, которые должны быть вставлены в растительный геном). Конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК данного описания может дополнительно содержать экспрессионную кассету(-ты), кодирующую сайт-специфическую нуклеазу и/или любой связанный белок(-ки) для осуществления сайт-направленной интеграции. Такая кассета(-ты), экспрессирующая нуклеазу, может присутствовать в той же молекуле или векторе, что и донорная матрица (в цис) или на отдельной молекуле или векторе (в транс). В данной области техники известно несколько способов сайт-направленной интеграции с участием различных белков (или комплексов белков и/или направляющей РНК), которые режут геномную ДНК для получения двухцепочечного разрыва (ДЦР, DSB-double strand break) или ника на желаемом геномном сайте или локусе. Как понятно из уровня техники, в процессе репарации ДЦР или ника, произведенных ферментом нуклеазы, ДНК донорной матрицы может интегрироваться в геном в месте ДЦР или ника. Наличие гомологичного "плеча"(-чей) в донорной матрице может способствовать внедрению и нацеливанию последовательности вставки в геном растения во время процесса репарации посредством гомологичной рекомбинации, хотя вставка может происходить посредством негомологичного соединения концов (NHEJ-non-homologous end joining). Примерами использующихся сайт-специфичных нуклеаз являются нуклеазы с цинковыми пальцами, сконструированные или нативные мегануклеазы, TALE-эндонуклеазы и управляемые при помощи РНК-гидов эндонуклеазы (например, Cas9 или Cpf1). Для способов использования управляемых при помощи РНК-гидов сайт-специфических эндонуклеаз (например, Cas9 или Cpf1), конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК также будет содержать последовательность, кодирующую одну или более направляющих РНК для направления нуклеазы на желаемый участок в геноме растения.
[0053] Рассматриваются композиции молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют TIC5290. Например, белок TIC5290 может быть экспрессирован конструктами рекомбинантной ДНК, в которых молекула полинуклеотида с ОРС (открытой рамкой считывания), кодирующая белок, функционально связана с элементами генетической экспрессии, такими как промотор и любой другой регуляторный элемент, необходимый для экспрессии в системе для которой предназначен данный конструкт. Неограничивающие примеры включают функциональный промотор растения, функционально связанный с кодирующими последовательностями белка TIC5290, для экспрессии белка в растениях, или Bt-функциональный промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью белка TIC5290, для экспрессии белка в Bt бактерии или других видах рода Bacillus. Другие элементы могут быть функционально связаны с кодирующими последовательностями белка TIC5290, включая, но не ограничиваясь ими, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые иммобилизационные метки (гистидиновые метки), транслокационные пептиды (то есть, пластидные транзитные пептиды, сигнальные пептиды) полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи. Типичные рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, представленные в данном документе, включают в себя, но без ограничений, гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, который кодирует полипептид или белок, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2. Гетерологичный промотор также может быть функционально связан с синтетическими кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими TIC5290, нацеленный на пластид, и ненацеленный TIC5290. Кодоны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, описанный в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известны в данной области техники как молчащие замены).
[0054] Конструкт рекомбинантной ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок TIC5290, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует одно или более веществ, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, которые могут быть сконструированы для одновременной экспрессии или коэкспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей белок TIC5290, белок отличный от белка TIC5290, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают в себя, но без исключений, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые способствуют повышению эффективности агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, например, способствуя его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергию для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектр его активности. Вспомогательный белок может облегчать захват одного или более веществ, обладающих ингибирующих активностью в отношении насекомых, например, или усиливать токсическое действие токсического вещества.
[0055] Конструкт рекомбинантной ДНК можно собирать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК были экспрессированы из одного промотора, или каждый белок или молекула дцРНК экспрессировались под контролем отдельного промотора, или в определенной их комбинации. Белки согласно данному изобретению могут быть экспрессированы из мультигенной система экспрессии, в которой белок TIC5290 экспрессируется из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа системы экспрессии. Например, мультигенная система экспрессии растений может использовать единственный промотор для управления экспрессией многократносвязанных/тандемных открытых рамок считывания из одного оперона. В другом примере мультигенная система экспрессии растений может использовать многократно несвязанные экспрессионные кассеты, каждая из которых экспрессирует другой белок или другой агент, такой как одна или более молекул дцРНК.
[0056] Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность, кодирующую белок TIC5290, могут быть доставлены в клетки-хозяева векторами, например, плазмидой, бакуловирусом, синтетической хромосомой, вирионом, космидой, фагмидой, фагом или вирусным вектором. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или транзиентной экспрессии последовательности, кодирующей белок TIC5290, в клетке-хозяине, или более поздней экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или конструкт рекомбинантной ДНК, который содержит последовательность, кодирующую белок TIC5290, и который вводится в клетку-хозяина, упоминаемая в данном документе как "трансген".
[0057] В данном документе представлены трансгенные бактерии, трансгенные клетки растений, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат рекомбинантный полинуклеотид, экспрессирующий любую одну или более из кодирующих последовательностей белка TIC5290. Термин "бактериальная клетка" или "бактерия" может включать в себя, но без ограничений, клетку Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, или Rhizobium. Термин "клетка растения" или "растение" может включать в себя, но без ограничений, клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. Рассматриваемые растения и клетки растений включают в себя, но без ограничений, клетку или растение люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, грецкого ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и части трансгенных растений, которые регенерировали из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени путем разрезания, срывания, измельчения или иного отделения части от растения. В определенных вариантах реализации изобретения часть растения может быть семенем, коробочкой, листом, цветком, стеблем, корнем или любой его частью или нерегенерируемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, "нерегенерируемая" часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть индуцирована для образования целого растения или которая не может быть индуцирована для образования целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть отбираемой части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.
[0058] Приведены способы получения трансгенных растений, которые содержат ингибирующее в отношении жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количества белков TIC5290. Такие растения могут быть получены путем введения рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует белок TIC5290, предусмотренный в данной заявке, в растительную клетку и отбора растения, полученного из указанной растительной клетки, которое экспрессирует ингибирующее в отношении видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка TIC5290. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации, из семян, пыльцы или меристемы, полученных способами трансформации. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[0059] Обработанные растительные продукты, причем процессированный продукт содержит обнаруживаемое количество белка TIC5290, сегменты и фрагменты, обладающие ингибиторной активностью в отношении насекомых, или его фрагмент или любую его отличительную часть, также описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения обработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растения, биомассы растений, масла, муки, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, пуха, кожуры, обработанных семян и семян. В определенных вариантах реализации изобретения обработанный продукт является нерегенерируемым. Растительный продукт может включать в себя товар или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенных растений, причем товар или другие продукты можно отследить путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированных РНК или белков, которые кодируют или содержат отличающиеся части белка TIC5290.
[0060] Растения, экспрессирующие белок TIC5290, можно скрещивать путем селекции с трансгенными объектами, экспрессирующими другие белки-токсины и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как гены устойчивости к гербицидам, гены, повышающие урожайность или устойчивость к стрессу, и тому подобное, или признаки могут быть объединены в одном векторе, так что все признаки будут связаны между собой.
[0061] Как описано далее в примерах, синтетические или искусственные последовательности, кодирующие TIC5290, которые были предназначены для использования в растениях, изложены в SEQ ID NO: 3.
[0062] Для экспрессии в растительных клетках белок TIC5290 может экспрессироваться так, чтобы он находился в цитозоле или был нацелен на различные органеллы растительной клетки. Например, нацеливание белка на хлоропласт может приводить к увеличению уровней экспрессированного белка в трансгенном растении, предотвращая появление признаков иных фенотипов. Нацеливание может также приводить к повышению резистентности к вредителям у трансгенного объекта. Целевой пептид или транзитный пептид представляет собой короткую пептидную цепь (длиной 3-70 аминокислот), которая направляет транспортировку белка в определенную область клетки, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), хлоропласт, апопласт, пероксисому и плазматическую мембрану. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка под действием сигнальной пептидазы после транспортирования белков. Для нацеливания на хлоропласт, белки содержат транзитные пептиды, которые содержат около 40-50 аминокислот. Для описания применения транзитных пептидов хлоропласта, см. патенты США № 5,188,642 и 5,728,925. Многие локализованные на хлоропласте белки экспрессируются из ядерных генов как предшественники и нацелены на хлоропласт транзитным пептидом хлоропласта (ТПХ). Примеры таких выделенных хлоропластных белков включают, но без ограничений, такие, которые связаны с малой субъединицей (МСУ) рибулозо-1,5,-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксином, ферредоксин-оксидоредуктазой, белком I и белком II светособирающего комлекса, тиоредоксином F, 5-енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазой (ЕПШФС) и транзитными пептидами, описанными в патенте США №7,193,133. В условиях in vivo и in vitro было продемонстрировано, что нехлоропластные белки могут быть нацелены на хлоропласт с использованием белковых гибридов с гетерологичным ТПХ и что наличия ТПХ достаточно для нацеливания белка на хлоропласт. Включение подходящего хлоропластного транзитного пептида, такого как ЕПШФС ТПХ Arabidopsis thaliana (ТПХ2) (см., Klee и соавт., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) или ЕПШФС ТПХ Petunia hybrida (ТПХ4) (см., della-Cioppa и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) было показано, что они нацеливают гетерологичные последовательности белка ЕПШФС на хлоропласты в трансгенных растениях (см., патентах США №5,627,061; 5,633,435; и 5,312,910; и EP 0218571; EP 189707; EP 508909; и EP 924299). Для нацеливания белка TIC5290 на хлоропласт, последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропласта, расположена 5' в функциональной связи и в рамке к синтетической кодирующей последовательности, кодирующей белок TIC5290, который был сконструирован для оптимальной экспрессии в растительных клетках.
[0063] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие данные синтетические или искусственные нуклеотидные последовательности, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, хлопка и сои в соответствии со способами и методиками трансформации, которые известны в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было обнаружено, экспрессировали TIC5290. Для проверки пестицидной активности, биологическое тестирование проводили в присутствии чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей.
[0064] Последовательности, кодирующие белок TIC5290, и последовательности, имеющие значительную процентную идентичность с TIC5290, могут быть идентифицированы с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, белок TIC5290 может быть использован для получения антител, которые специфически связываются с подобными белками, и могут быть использованы для скрининга и поиска других белков, которые тесно связаны.
[0065] Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок-токсин TIC5290, могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга и идентификации других членов класса с использованием способов термоциклической или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для определения присутствия или отсутствия трансгена TIC5290 в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной из товарного продукта. Учитывая чувствительность определенных способов обнаружения нуклеиновых кислот, которые используют олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для обнаружения трансгена TIC5290 в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего SEQ ID NO: 3. Кроме того, признано, что такие олигонуклеотиды могут быть использованы для введения изменения последовательности нуклеотидов в SEQ ID NO: 3. Такие "мутагенезные" олигонуклеотиды полезны для идентификации вариантов аминокислотной последовательности TIC5290, проявляющих диапазон ингибирующей активности в отношении насекомых или различную экспрессию в клетках-хозяевах трансгенного растения.
[0066] Гомологи нуклеотидной последовательности, например, инсектицидные белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из последовательностей, раскрытых в данной заявке в условиях гибридизации, также являются вариантом реализации данного изобретения. Изобретение также относится к способу обнаружения первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, причем первая нуклеотидная последовательность (или ее обратная комплементарная последовательность) кодирует пестицидный белок или его пестицидный фрагмент и гибридизуется в условиях жесткой гибридизации со второй нуклеотидной последовательностью. В таком случае вторая нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в условиях жесткой гибридизации. Кодирующие нуклеотидные последовательности гибридизуются друг с другом в соответствующих условиях гибридизации, а белки, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисывороткой к любому из других белков. Жесткие условия гибридизации, как определено в данном документе, включают в себя, по меньшей мере, гибридизацию при 42 °С с последующими двумя промывками в течение пяти минут каждая при комнатной температуре с 2X SSC, 0,1% ДСН, с последующими двумя промывками в течение 30 минут каждая при 65 °C в 0,5X SSC, 0,1% ДСН. Промывки при еще более высоких температурах представляют собой еще более жесткие условия, например, условия гибридизации 68°C с последующим промыванием при 68oC, в 2x SSC, содержащем 0,1% ДСН.
[0067] Специалисту в данной области техники будет понятно, что из-за вырожденности генетического кода многие другие последовательности способны кодировать белки, подобные TIC5290, и эти последовательности в той степени, в которой они функционируют для экспрессии пестицидных белков либо в штаммах Bacillus или в растительных клетках являются вариантами реализации данного изобретения, подразумевая, конечно, что многие такие вырожденные кодирующие последовательности не будут гибридизоваться в этих условиях с нативными последовательностями Bacillus, кодирующими TIC5290. Данная заявка рассматривает применение этих и других способов идентификации, известных специалистам в данной области техники, для идентификации последовательностей, кодирующих белок TIC5290 и последовательностей, имеющих значительную процентную идентичность с последовательностями, кодирующими белок TIC5290.
[0068] Также в данной заявке раскрыты способы борьбы с насекомыми, в частности, заражениями культурных растений чешуекрылыми или жесткокрылыми, или полужесткокрылыми насекомыми с использованием белка TIC5290. Такие способы могут включать в себя выращивание растения, содержащего ингибирующее в отношении чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка-токсина TIC5290. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать любое одно или более из: (I) нанесения любой композиции, содержащей или кодирующей белок-токсин TIC5290, на растение или семя, которое дает начало растению; и (II) трансформацию растения или клетки растения, которые дают начало растению, полинуклеотидом, кодирующим белок-токсин TIC5290. В общем, предполагается, что белок-токсин TIC5290 может быть обеспечен в композиции, имеющейся в микроорганизме, или имеющейся в трансгенном растении, чтобы обеспечить ингибирующую активность против чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых.
[0069] В некоторых вариантах реализации изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты белка-токсина TIC5290 является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной культивированием рекомбинантной клетки Bacillus или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной с целью экспрессии белка-токсина TIC5290 в условиях, подходящих для экспрессии белка-токсина TIC5290. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих указанный рекомбинантный полипептид. Такой процесс может привести к образованию экстракта бактериальных клеток, суспензии клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или осаждению клеток Bacillus или другого энтомопатогена. Получив таким образом сконструированный рекомбинантный полипептид, создают композицию, которая содержит рекомбинантный полипептид, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца и может поставляться для различных применений, включая продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении сельскохозяйственные насекомых или препараты кормовой биомассы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых в кормовых биологических тестах.
[0070] В одном варианте реализации изобретения для снижения вероятности развития резистентности, композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая TIC5290, может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность против тех же видов чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых, но который отличается от белка-токсина TIC5290. Возможные дополнительные полипептиды для такой композиции содержат белок, обладающий ингибирующей активностью против насекомых, и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью против насекомых. Одним из примеров использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описаны в Baum и соавт. (публикация патента США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид для борьбы с чешуекрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry1A (публикация патента США №5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США №10/525,318), Cry1C (публикация патента США №6,033,874), Cry1D, Cry1Da и их вариантов, Cry1E, Cry1F, и химер Cry1A/F (публикация патента США №7,070,982; 6,962,705; и 6,713,063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, химеры типа Cry1, такие как, но без ограничений, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 и TIC1100 (публикация международной заявки WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (публикация международной заявки WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (публикация патента США №7,064,249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 (публикация патента США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (публикация патента США 2013-0310543 A1 ), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (публикация патента США 2013-0104259 A1), AXMI-134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (публикация патента США 2010-0160231 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209 (публикация патента США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (публикация патента США 2014-0033363 A1), AXMI-270 (публикация патента США 2014-0223598 A1), AXMI-345 (публикация патента США 2014-0373195 A1), AXMI-335 (международная публикация заявки WO2013/134523(A2)), DIG-3 (публикация патента США 2013-0219570 A1), DIG-5 (публикация патента США 2010-0317569 A1), DIG-11 (публикация патента США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента США 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (публикация патента США 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (публикация патента США 2014-0007292 A1), Pput_1063 (публикация патента США 2014-0007292 A1), DIG-657 (международная публикация заявки WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (публикация патента США 2014-0007292 A1), GS-135 и его производные (публикация патента США 2012-0233726 A1), GS153 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS154 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS155 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0047606 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 и 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 или 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США №7,772,465 (B2), CF161_0085 и его производные, как описано в WO2014/008054 A2, токсичные к чешуекрылым белки и их производные, как описано в публикации патентов США US 2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 и US 2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в US 7510878(B2), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США № 7812129(B1); и тому подобное.
[0071] Такой дополнительный полипептид для борьбы с жесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry3Bb (публикация патента США №№ 6,501,009), варианты Cry1C, варианты Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-205 (публикация патента США 2014-0298538 A1), axmi207 (публикация патента США 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-279 (публикация патента США 2014-0223599 A1), AXMI-R1 и его варианты (публикация патента США 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (публикация патента США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация патента на патент США №2010/0017914), IP3 и его варианты (публикация патента США 2012-0210462 A1) и ϖ-Hexatoxin-Hv1a (публикация заявки на патент США US2014-0366227 A1).
[0072] Такой дополнительный полипептид для борьбы с полужесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белков, активных в отношении полужестокрылых, таких как, без ограничения, TIC1415 (публикация патента США 2013-0097735 A1), TIC807 (публикация патента США №8609936), TIC834 (публикация патента США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (публикация патента США 2010-0137216 A1) и AXMI-171 (публикация патента США 2013-0055469 A1). Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и полужесткокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на сайте номенклатуры токсина Bacillus thuringiensis поддерживаемом Neil Crickmore (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).
[0073] В других вариантах реализации изобретения такая композиция/препарат может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность в отношении насекомых-вредителей, которые не ингибируются белком данного изобретения, в прочих случаях обладающим ингибирующей активностью против насекомых, с тем чтобы расширить спектр ингибирующей активности в отношении насекомых.
[0074] Способность насекомых развивать устойчивость к определенным инсектицидам была описана в данной области техники. Одна стратегия управления устойчивостью насекомых заключается в использовании трансгенных культур, которые экспрессируют два различных вещества, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, которые действуют через различные механизмы действия. Таким образом, любые насекомые с устойчивостью к одному из веществ, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, могут контролироваться с помощью другого вещества, обладающего ингибирующей активностью против насекомых. Другая стратегия борьбы с устойчивостью насекомых состоит в применении растений, которые не защищены от целевых видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых, с целью обеспечения укрытия для таких незащищенных растений. Один конкретный пример описан в патенте США №6,551,962, полное содержание которого включено посредством ссылки.
[0075] Другие варианты реализации изобретения, такие как локально применяемые пестицидные химикаты, которые разработаны для борьбы с вредителями, которые также регулируются белками, описанными в данном документе, для применения с белками в препаратах для обработки семян, опыления, точечного полива или протирания, и которые могут быть нанесены непосредственно на почву (поливка почвы), нанесены на выращиваемые растения, экспрессирующие белки, описанные в данном документе, или приготовлены для нанесения на семена, содержащие один или более трансгенов, кодирующих один или более описанных белков. Такие препараты для применения при обработке семян можно наносить с помощью различных наклеек и липких веществ, известных в данной области техники. Такие препараты могут содержать пестициды, которые являются синергичными в способе действия с описанными белками, так что пестициды препарата действуют посредством другого способа действия для борьбы с теми же или похожими вредителями, которые могут регулироваться описанными белками, или что такие пестициды действуют для борьбы с вредителями в более широком диапазоне хозяев или видов вредителей растений, которые неэффективно регулируются пестицидными белками TIC5290.
[0076] Вышеупомянутая композиция/препарат может дополнительно содержать сельскохозяйственно приемлемый носитель, такой как приманка, порошок, дуст, таблетки, гранулы, спреи, эмульсия, коллоидная суспензия, водный раствор, препараты спор/кристаллов Bacillus, протравливание семян, рекомбинантная растительная клетка/растительная ткань/семена/растение, трансформированные для экспрессии одного или более белков, или бактерия, трансформированная для экспрессии одного или более белков. В зависимости от уровня ингибирования в отношении насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и уровня препарата, который должен применяться в анализе растений или рациона, состав/препарат может содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, например, от 0,0001% до 0,001%, до 0,01%, до 1%, до 99% от массы рекомбинантного полипептида.
ПРИМЕРЫ
[0077] Ввиду вышеизложенного специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны изменения в конкретных описанных аспектах, и все же будет получен подобный или аналогичный результат, не отходя от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, описанные в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие. Следует понимать, что полное раскрытие каждой из указанных выше публикаций включено в описании данной заявки.
ПРИМЕР 1
Обнаружение TIC5290
[0078] В этом примере описано обнаружение пестицидного белка TIC5290.
[0079] Последовательность, кодирующая новый пестицидный белок Bacillus thuringiensis (Bt) была идентифицирована, клонирована, подтверждена и протестирована в биологическом анализе насекомых. Пестицидный белок TIC5290, представленный в данном документе как SEQ ID NO: 1 (кодирующая последовательность Bt) и 2 (белок), был выделен из штамма Bt EG6657. TIC5290 представляет собой белок длиной 937 аминокислот, идентифицированный на основе гомологии с известными инсектицидными белковыми токсинами и с помощью анализа Pfam, с целью распределения по известным семействам инсектицидных белков. Биоинформатический анализ указывает на то, что TIC5290 является порообразующим белком. Домен PA14 Pfam (PF07691) в пределах аминокислот с 16 по 140, вероятно, вовлечен в функции связывания. За этим доменом следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в пределах аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Ближайшим гомологом Bt -токсина TIC5209 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4.
[0080] ПЦР-праймеры были разработаны для амплификации полноразмерной копии кодирующей области для TIC5290 из общей геномной ДНК, выделенной из штамма EG6657. ПЦР-ампликон также включал в себя инициирующий и терминирующий кодоны кодирующей последовательности.
[0081] Ампликон TIC5290 клонировали с использованием способов, известных в данной области техники, в экспрессирующий вектор плазмиды Bt в функциональной связи с экспрессируемым промотором Bt, который является активным во время споруляции бациллы. Кроме того, ампликон клонировали в вектор, используемый для экспрессии белка, в системе экспрессии Escherichia coli (E. coli). Было обнаружено, что рекомбинантные штаммы экспрессируют рекомбинантный белок.
ПРИМЕР 2
TIC5290 демонстрирует активность, по отношению к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым в биологическом анализе насекомых.
[0082] Данный пример иллюстрирует ингибирующую активность, проявляемую белками TIC5290, по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых.
[0083] Новый пестицидный белок TIC5290 экспрессировали в Bt и E. coli и анализировали на токсичность по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых. Препараты каждого токсина из Bt и E. coli были проанализированы против видов жесткокрылых Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук, КЖ) и Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный жук, WCR). Препараты токсина также анализировались против видов чешуекрылых американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), мотылька стеблевого кукурузного (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), огневки кукурузной юго-западной (SWC, Diatraea grandiosella), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens) и капустной моли (DBM, (Plutella xylostella). Препараты токсина также анализировались против видов полужесткокрылых клопа травяного (TPB, Lygus lineolaris) и слепняка западного матового (WTP, Lygus hesperus); а также видов двукрылых, комара желтолихорадочного (YFM, Aedes aegypti). Американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea) также упоминается как коробочный червь (SPW) и совка хлопковая (CBW).
[0084] Анализ белков, экспрессирующихся в каждом из векторов, требует различных препаратов, добавленных к рациону насекомых. Для векторов, использующих активный во время споруляции промотор, смесь кристаллов/спор собирали после трех дней роста в культуре и использовали в рационе насекомых (обычно применяли в искусственных рационах насекомых и кормили отдельно различных насекомых). Препараты белка, полученные путем экспрессии в E. coli были очищены и также представлены в рационе насекомых.
[0085] TIC5290 продемонстрировал активность против WCR, CEW, ECB, FAW, DBM и WTP, как показано в таблице 2 ниже, в которой "+" обозначает активность.
Таблица 2. Биологический анализ активности TIC5290 против жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых насекомых-вредителей.
Насекомое | Биологический анализ диеты |
WCR | + |
CPB | - |
CEW | + |
ECB | + |
FAW | + |
SBL | - |
SWC | - |
TBW | - |
DBM | + |
TPB | - |
WTP | + |
YFM | - |
ПРИМЕР 3
Разработка синтетических кодирующих последовательностей, которые кодируют TIC5290 для экспрессии в клетках растений
[0086] Синтетические или искусственные кодирующие последовательности были сконструированы для применения в экспрессии TIC5290 в растениях, клонированы в бинарный вектор для трансформации растения и использовались для трансформации растительных клеток. Синтетические последовательности нуклеиновой кислоты синтезировали в соответствии со способами, в целом описанными в патенте США 5,500,365, избегая некоторых неподходящих проблемных последовательностей, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные ATTTA и A/T, при сохранении аминокислотной последовательности нативного бека Bt. Синтетическая кодирующая последовательность для пестицидного белка TIC5290 представлена в виде SEQ ID NO: 3 и кодирует белок, представленный в виде SEQ ID NO: 2.
ПРИМЕР 4
Экспрессионные кассеты для экспрессии TIC5290 в клетках растений
[0087] Разнообразные экспрессионные кассеты растений были сконструированы с последовательностями, как изложено в SEQ ID NO: 3. Такие экспрессионные кассеты являются полезными для транзиентной экспрессии в протопластах растений или трансформации растительных клеток. Типичные экспрессионные кассеты были разработаны с учетом возможного размещения белка внутри клетки растения. Для белка, ориентированного на пластид, синтетическую последовательность, кодирующую пестицидный белок TIC5290, функционально связывали в рамке с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, для доставки в хлоропласт. Полученные векторы трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии пестицидного белка, которая содержит конститутивный промотор, функционально связанный 5' с лидерной последовательностью, функционально связанным 5' с интроном (или при необходимости без интрона), функционально связанный 5' с синтетической кодирующей последовательностью, которая кодирует нацеленный или не нацеленный на пластид белок TIC5290, который, в свою очередь, функционально связан 5' с 3'-нетранслируемой областью и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием глифосата или антибиотиков. Все элементы, описанные выше, были расположены рядом, часто с дополнительной последовательностью, предусмотренной для создания экспрессионной кассеты, такой как сайты эндонуклеазы рестрикции или сайты безлигазного клонирования.
ПРИМЕР 5
TIC5290 обеспечивает эффективную устойчивость к западному кукурузному жуку (
Diabrotica virgifera virgifera
) в случае экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы
[0088] Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую TIC5290 в отношении жесткокрылых, таких как злаковый корневой червь, в случае экспрессии в растениях и предлагается в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей.
[0089] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации кукурузных растений. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Пестицидную активность анализировали по отношению к жесткокрылому западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera), питающемуся корнями стабильно трансформированных кукурузных растений.
[0090] Стабильно трансформированные растения R0 использовали для анализа устойчивости жесткокрылых, а также для получения потомства F1. Из каждой трансформации бинарным вектором отбирали множество объектов с одной копией. Часть этих объектов, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась в анализе жесткокрылых, в то время как другая часть объектов использовалась для получения потомства F1 с целью дальнейшего тестирования.
[0091] Растения для анализа R0 пересаживали в двадцатисантиметровые горшки. Растения были инокулированы яйцами западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR). Яйца инкубировали в течение примерно десяти дней до инокуляции с целью их вылупления через четыре дня после инокуляции, для обеспечения достаточного количества выживших и способных атаковать корни кукурузы личинок. Трансформированные растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 1-5, как показано в таблице 3 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение также делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывают на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. При анализе WCR использовали множество объектов R0 для каждой трансформации бинарным вектором. Многие из объектов R0, экспрессирующих как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, продемонстрировали устойчивость к WCR, определяемую шкалой оценок повреждения корней, по сравнению с трансгенными контролями.
Таблица 3. Шкала оценок повреждения корней R
0
.
Оценка повреждения корня | Описание |
1 | Видимые повреждения отсутствуют |
2 | Некоторые повреждения; нет отсечений |
3 | Отсечение, по меньшей мере, одного корня |
4 | Отсечение всего узла |
5 | Отсечение более одного узла |
[0092] Часть стабильно трансформированных объектов R0, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась для получения потомства F1. Стабильно трансформированные растений R0 самоопылялись, давая потомство F1. Семена F1 высаживали. Гетерозиготные растения идентифицировали с помощью молекулярных методов, известных в данной области техники, и использовали для анализа против WCR, а также для измерения экспрессии белка-токсина TIC5290 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA. Часть гетерозиготного потомства F1 от каждого объекта использовалась для анализа на насекомых, в то время как другая часть использовалась для измерения экспрессии TIC5290.
[0093] Яйца от западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) инкубировали в течение примерно десяти дней для вылупления в течение четырех дней после инокуляции. Растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. В случае с WCR, в каждый горшок инокулировали около двух тысяч яиц. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 0-3, как показано в таблице 4 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывали на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. Многие из объектов F1 демонстрировали эффективную устойчивость к WCR по сравнению с контролями. На фигуре 1 изображена средняя оценка повреждения корней нескольких объектов для TIC5290, когда он экспрессируется в растениях кукурузы F1, независимо от того, нацелен белок на хлоропласт или нет.
Таблица 4. Шкала оценок повреждения корней F
1.
Оценка повреждения корня | Описание |
0 | Видимые повреждения отсутствуют |
0,01-0,09 | Рубцы и следы |
0,1-0,9 | Отсечение корня, но меньше, чем полный узел |
1,0-1,9 | По меньшей мере полный узел (или эквивалент) поврежден в пределах 4 см от растения |
2,0-2,9 | Два или более узла уничтожены |
3 | Три или более узла уничтожены |
Пример 5
Анализ активности TIC5290 по отношению к чешуекрылым вредителям, при экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы, сои или хлопка.
[0094] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленного, так и не нацеленного на пластид пестицидного белка TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники.
[0095] Кукурузу, сою или хлопок трансформировали с помощью бинарных векторов трансформации, описанных выше, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium. Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотестирование с использованием листовых дисков растения выполняли по аналогии с теми, которые описаны в публикации патента США №8,344,207. Ткань, полученную из нетрансформированных растений кукурузы, сои или хлопка, использовали в качестве негативного контроля. Множественные объекты трансформации от каждого бинарного вектора оценивались против вредителей чешуекрылых таких как, но без ограничений, американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea), мотылек стеблевой кукурузный (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузная листовая совка (FAW, Spodoptera frugiperda), соевая совка (SBL, Chrysodeixis includens), огневка кукурузная юго-западная (SWCB, Diatraea grandiosella), табачная листовертка (TBW, Heliothis virescens) и капустная моль (DBM, Plutella xylostella). Установлено, что те насекомые, которые демонстрируют задержку роста и/или смертность в биологическом анализе насекомых, подвержены воздействию токсина TIC5290.
Пример 6
Анализ активности против полужесткокрылых вредителей с применением стабильно трансформированных хлопчатников, экспрессирующих TIC5290.
[0096] Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации хлопчатников. Пестицидную активность анализировали против полужесткокрылых вредителей, питающихся стабильно трансформированными растениями хлопчатника.
[0097] Бинарные векторы, описанные ранее в примере 3, в которых экспрессируется как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, применяли для стабильной трансформации растений хлопчатника. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Стабильно трансформированные растения R0 самоопылялись, давая потомство R1.
[0098] Трансгенные семена R1, содержащие экспрессионные кассеты для TIC5290, высевали в 25-сантиметровые горшки, как и семена, соответствующие не трансгенному контролю. Растения выращивались в камере с контролируемой средой с фотопериодом шестнадцать часов света при тридцати двух градусах Цельсия и восемь часов темноты при двадцати трех градусах Цельсия, и интенсивностью света от восьмисот до девятьсот микроэйнштейнов. По истечению от сорока до сорока пяти дней после посадки, отдельные растения помещали в изолятор, сделанный из пропускающий воздух пластиковых листов "опыления" (Vilutis and Company Inc, Франкфорт, штат Иллинойс). Листы крепились к основному стержню непосредственно над поверхностью почвы, с использованием застежки Velcro®. Две пары взрослых особей (в возрасте 6-ти дней), половозрелых самцов и самок Lygus lineolaris или Lygus hesparus из лабораторной культуры собирали в четырнадцатимиллиметровую пластиковую трубку с круглым дном (Becton Dickson Labware, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) и использовали для каждого растения. Взрослые особи высвобождали в каждый отдельный изолятор через небольшую щель на стороне изолятора и затем изолятор надежно закрывали, гарантируя, что насекомые не сбегут. Насекомых, имеющих возможность спариваться, и растения содержали в изоляторе в течение двадцати одного дня. Через двадцать один день растения подрезали под изоляторами и перемещали в лабораторию, где насекомых собирали с каждого растения и подсчитывали. Перед открытием изолятора, растения интенсивно встряхивали, чтобы все насекомые отцепились от мест кормления и упали до основания изолятора. Затем основание изолятора открывали и весь растительный помещали на черный лист. Насекомые собирались с помощью аспиратора. Затем растение тщательно проверяли с целью удаления любых оставшихся насекомых. Для каждого растения фиксировали количество насекомых и их стадию развития. Подсчет насекомых делили на несколько групп, основанных на зрелость организма Лигуса; нимфы до 3-го возраста, 4-го возраста, 5-го возраста и взрослые особи. Трансгенные растения хлопчатника, демонстрирующие сокращение числа личинок и взрослых особей по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями хлопчатника, демонстрируют устойчивость к полужесткокрылым вредителям, посредством экспрессии белка-токсина TIC5290.
[0099] Все композиции, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть сделаны и выполнены без излишнего экспериментирования в свете данного описания. Хотя композиции данного изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты, изменения, модификации и перестройки могут быть применены к композиции, описанной в данном документе, без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые вещества, являющиеся как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены на вещества, которые описаны в данном изобретении, при этом будут достигнуты такие же или сходные результаты. Все таковые аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[00100] Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в данной спецификации, включены в данный документ посредством ссылки в том же объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
Claims (46)
1. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты для обеспечения растению устойчивости к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его пестицидный фрагмент, при этом:
a. указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или
b. указанный пестицидный белок обладает пестицидной активностью, содержит домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
2. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
3. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что:
a. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая функционирует, экспрессируя пестицидный белок в растении; или
b. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты экспрессируется в растительной клетке, продуцируя пестицидно эффективное количество пестицидного белка; или
c. молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором и указанный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы.
4. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, которая определяется как присутствующая в клетке-хозяине, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клетки.
5. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 4, отличающаяся тем, что бактериальная клетка-хозяин происходит из рода бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea и Erwinia.
6. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 5, отличающаяся тем, что вид Bacillus представляет собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperus или указанный Escherichia представляет собой Escherichia coli.
7. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 4, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка представляет собой клетку двудольного или однодольного растения.
8. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 7, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из [растительной клетки] люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквенных, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, корневищных злаков, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
9. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против насекомого отряда жесткокрылых.
10. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 9, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или группу бразильского кукурузного жука, состоящую из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa.
11. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против вида насекомого отряда чешуекрылых.
12. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 11, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой совку бархатных бобов, огневку тростниковую, точильщика зернового кукурузного, совку хлопковую, табачную листовертку, соевую совку, африканскую совку, южную совку, совку травяную, совку свекольную, совку американскую, азиатскую хлопковую совку, розового коробочного червя хлопчатника, совку-ипсилон, огневку кукурузную юго-западную или мотылька стеблевого кукурузного.
13. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный пестицидный белок проявляет активность против насекомого отряда полужесткокрылых.
14. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 13, отличающаяся тем, что указанное насекомое представляет собой слепняка западного матового, клопа травяного или хлопкового слепняка.
15. Трансформированное растение, которое обладает устойчивостью к насекомым из отрядов жесткокрылых, чешуекрылых и/или полужесткокрылых, содержащее молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
16. Часть трансформированного растения, которое обладает устойчивостью к насекомым из отрядов жесткокрылых, чешуекрылых и/или полужесткокрылых, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
17. Растение по п. 15 или часть растения по п. 16, где указанное растение является однодольным растением или двудольным растением.
18. Растение по п. 15 или часть растения по п. 16, где растение выбирают из группы, состоящей из люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквенных, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, корневищных злаков, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
19. Семя растения по п. 15, отличающееся тем, что указанное семя предназначено для получения растения, обладающего устойчивостью к насекомым из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, и где семя содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
20. Композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, содержащая пестицидно эффективное количество молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.
21. Композиция по п. 20, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка.
22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, обладающего ингибиторной активностью в отношении насекомых, молекулы дцРНК, обладающей ингибиторной активностью в отношении насекомых, и вспомогательного белка.
23. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный агент проявляет активность в отношении одного или более видов вредителей отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых.
24. Композиция по п. 23, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный белок выбран из группы, состоящей из Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C; вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A; Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и их вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и белка DIG-11.
25. Композиция по п. 20, которая определяется как содержащая растительную клетку, которая экспрессирует указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
26. Товарный продукт для подачи в качестве корма, полученный из растения по п. 15 или части растения по п. 16, отличающийся тем, что товарный продукт содержит определимое количество указанной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты или пестицидного белка, кодируемого ею.
27. Товарный продукт для подачи в качестве продуктов питания, полученный из растения по п. 15 или части растения по п. 16, отличающийся тем, что товарный продукт содержит определимое количество указанной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты или пестицидного белка, кодируемого ею.
28. Товарный продукт по п. 26 или 27, выбранный из группы, состоящей из товарной кукурузы, упакованной обработчиком зерна, кукурузных хлопьев, кукурузных лепешек, кукурузной муки, кукурузной муки крупного помола, кукурузного сиропа, кукурузного масла, кукурузного силоса, кукурузного крахмала, кукурузной каши и тому подобного, цельных или обработанных семян хлопчатника, хлопкового масла, линта, семян и частей растений, обработанных для корма или продуктов питания, волокна, бумаги, биомассы и топливных продуктов, таких как топливо, полученное из хлопкового масла или пеллетов, полученных из отходов хлопковой очистки, цельных или обработанных семян сои, соевого масла, соевого белка, соевой муки крупного помола, соевой муки, соевых хлопьев, соевых отрубей, соевого молока, соевого сыра, соевого вина, корма для животных, содержащего соевые бобы, бумаги, содержащей сою, сливок, содержащих сою, биомассы соевых бобов и топливных продуктов, произведенных с использованием растений сои и частей растений сои.
29. Способ борьбы с чешуекрылыми, или жесткокрылыми, или полужесткокрылыми насекомыми-вредителями или поражением насекомыми из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых и/или полужесткокрылых, причем указанный способ включает:
a. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO: 2; или
b. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, которые имеют домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam, и содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
30. Способ по п. 29, в котором указанный один или более пестицидных белков содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
31. Способ детекции наличия молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 в образце, содержащем геномную ДНК растений, включающий:
a. приведение в контакт образца с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего молекулу ДНК по п. 1, и не гибридизуется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2;
b. применение к образцу жестких условий гибридизации; и
c. обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
32. Способ обнаружения наличия пестицидного белка в образце, содержащем белок, при этом указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или указанный пестицидный белок обладает пестицидной активностью, содержит домен PA14 Pfam и домен Binary_toxB Pfam и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, включающий:
a. приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и
b. обнаружение наличия белка.
33. Способ по п. 32, в котором указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%-ную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
34. Способ по п. 32 или 33, отличающийся тем, что этап обнаружения включает твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или вестерн-блоттинг.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562199024P | 2015-07-30 | 2015-07-30 | |
US62/199,024 | 2015-07-30 | ||
PCT/US2016/044296 WO2017019787A1 (en) | 2015-07-30 | 2016-07-27 | Novel insect inhibitory proteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018107162A RU2018107162A (ru) | 2019-08-28 |
RU2018107162A3 RU2018107162A3 (ru) | 2020-01-28 |
RU2765310C2 true RU2765310C2 (ru) | 2022-01-28 |
Family
ID=57885446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018107162A RU2765310C2 (ru) | 2015-07-30 | 2016-07-27 | Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10100330B2 (ru) |
EP (1) | EP3328187B1 (ru) |
JP (1) | JP6933641B2 (ru) |
CN (1) | CN107849571B (ru) |
AR (1) | AR105768A1 (ru) |
BR (1) | BR112018001379B1 (ru) |
CA (1) | CA2992084A1 (ru) |
CL (1) | CL2018000227A1 (ru) |
CO (1) | CO2018000801A2 (ru) |
CR (1) | CR20180060A (ru) |
EC (1) | ECSP18006878A (ru) |
ES (1) | ES2904255T3 (ru) |
HR (1) | HRP20211858T1 (ru) |
HU (1) | HUE057364T2 (ru) |
MX (1) | MX2018001258A (ru) |
NI (1) | NI201800013A (ru) |
PE (1) | PE20180775A1 (ru) |
RU (1) | RU2765310C2 (ru) |
SV (1) | SV2018005620A (ru) |
UA (1) | UA126327C2 (ru) |
WO (1) | WO2017019787A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201800227B (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112018001379B1 (pt) * | 2015-07-30 | 2024-04-30 | Monsanto Technology Llc | Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, composição inibidora de insetos, e métodos para produção de sementes e para controlar uma praga ou infestação de pragas |
AU2017342921B2 (en) * | 2016-10-10 | 2023-06-15 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
WO2019070554A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Syngenta Participations Ag | GENETICALLY MODIFIED PROTEIN PESTICIDES AND METHODS FOR CONTROLLING PLANT PESTS |
EP3728606A1 (en) | 2017-12-22 | 2020-10-28 | Agbiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
BR112020026523A2 (pt) * | 2018-09-25 | 2021-04-06 | Monsanto Technology Llc | Proteínas inibidoras de inseto |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2382822C2 (ru) * | 2003-07-07 | 2010-02-27 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
DE602004030044D1 (de) * | 2003-12-16 | 2010-12-23 | Monsanto Technology Llc | Bacillus thuringiensis und deren verwendungen |
US8895306B2 (en) * | 2003-02-21 | 2014-11-25 | Intrexon Corporation | Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5849870A (en) * | 1993-03-25 | 1998-12-15 | Novartis Finance Corporation | Pesticidal proteins and strains |
JP2001502919A (ja) * | 1996-10-30 | 2001-03-06 | マイコーゲン コーポレーション | 新規殺虫性毒素およびこれらの毒素をコードする塩基配列 |
US6551962B1 (en) | 2000-10-06 | 2003-04-22 | Monsanto Technology Llc | Method for deploying a transgenic refuge |
CN102524294B (zh) | 2004-04-09 | 2018-04-06 | 孟山都技术有限公司 | 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法 |
RU2008112187A (ru) * | 2005-08-31 | 2009-10-10 | Монсанто Текнолоджи, Ллс (Us) | Инсектицидные композиции и способы получения устойчивых к насекомым трансгенных растений |
US7521235B2 (en) | 2006-07-21 | 2009-04-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Unique novel Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity |
DE602007004340D1 (de) | 2006-07-21 | 2010-03-04 | Du Pont | Verfahren zur identifizierung neuer gene |
US7772465B2 (en) | 2007-06-26 | 2010-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
US8283524B2 (en) | 2008-05-15 | 2012-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
MX2010013674A (es) | 2008-06-11 | 2011-03-15 | Pioneer Hi Bred Int Inc Star | Gen de bacillus thuringiensis novedoso con actividad lepidoptera. |
US8445749B2 (en) | 2008-09-19 | 2013-05-21 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
US20100077507A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity |
MX2011007157A (es) | 2009-01-23 | 2011-09-01 | Pioneer Hi Bred Int | Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera. |
WO2010099365A2 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Athenix Corporation | Pesticidal proteins and methods for their use |
BR112012011222A2 (pt) | 2009-11-12 | 2015-09-15 | Pioneer Hi Bred Int | molécula de ácido nucleico isolada, contruto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e métodos para controlar uma população de praga de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero e para proteger uma planta contra uma praga |
US8586832B2 (en) | 2009-12-21 | 2013-11-19 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity |
WO2012024200A2 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
WO2012092106A1 (en) | 2010-12-28 | 2012-07-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
CA2825951C (en) * | 2011-02-11 | 2019-08-20 | Monsanto Technology Llc | Pesticidal nucleic acids and proteins and uses thereof |
CN103596436B (zh) | 2011-04-07 | 2020-03-06 | 孟山都技术公司 | 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族 |
US20130227743A1 (en) * | 2011-08-19 | 2013-08-29 | Christopher J. Grandlic | Integrated method for high-throughput identification of novel pesticidal compositions and uses therefor |
AR097292A1 (es) * | 2013-08-09 | 2016-03-02 | Monsanto Technology Llc | Toxina pesticida activa contra insectos coleópteros y/o hemípteros |
BR112018001379B1 (pt) * | 2015-07-30 | 2024-04-30 | Monsanto Technology Llc | Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, composição inibidora de insetos, e métodos para produção de sementes e para controlar uma praga ou infestação de pragas |
-
2016
- 2016-07-27 BR BR112018001379-0A patent/BR112018001379B1/pt active IP Right Grant
- 2016-07-27 US US15/221,544 patent/US10100330B2/en active Active
- 2016-07-27 PE PE2018000135A patent/PE20180775A1/es unknown
- 2016-07-27 HR HRP20211858TT patent/HRP20211858T1/hr unknown
- 2016-07-27 MX MX2018001258A patent/MX2018001258A/es unknown
- 2016-07-27 EP EP16831304.7A patent/EP3328187B1/en active Active
- 2016-07-27 CR CR20180060A patent/CR20180060A/es unknown
- 2016-07-27 ES ES16831304T patent/ES2904255T3/es active Active
- 2016-07-27 JP JP2018504868A patent/JP6933641B2/ja active Active
- 2016-07-27 UA UAA201802018A patent/UA126327C2/uk unknown
- 2016-07-27 WO PCT/US2016/044296 patent/WO2017019787A1/en active Application Filing
- 2016-07-27 RU RU2018107162A patent/RU2765310C2/ru active
- 2016-07-27 CN CN201680043100.XA patent/CN107849571B/zh active Active
- 2016-07-27 CA CA2992084A patent/CA2992084A1/en active Pending
- 2016-07-27 HU HUE16831304A patent/HUE057364T2/hu unknown
- 2016-07-29 AR ARP160102316A patent/AR105768A1/es unknown
-
2018
- 2018-01-12 ZA ZA2018/00227A patent/ZA201800227B/en unknown
- 2018-01-26 NI NI201800013A patent/NI201800013A/es unknown
- 2018-01-26 CL CL2018000227A patent/CL2018000227A1/es unknown
- 2018-01-26 SV SV2018005620A patent/SV2018005620A/es unknown
- 2018-01-26 CO CONC2018/0000801A patent/CO2018000801A2/es unknown
- 2018-01-29 EC ECIEPI20186878A patent/ECSP18006878A/es unknown
- 2018-06-07 US US16/002,994 patent/US20180346925A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8895306B2 (en) * | 2003-02-21 | 2014-11-25 | Intrexon Corporation | Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
RU2382822C2 (ru) * | 2003-07-07 | 2010-02-27 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
DE602004030044D1 (de) * | 2003-12-16 | 2010-12-23 | Monsanto Technology Llc | Bacillus thuringiensis und deren verwendungen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3328187A4 (en) | 2019-01-09 |
ZA201800227B (en) | 2018-12-19 |
AR105768A1 (es) | 2017-11-08 |
ECSP18006878A (es) | 2018-04-30 |
JP6933641B2 (ja) | 2021-09-08 |
BR112018001379A2 (pt) | 2018-09-11 |
BR112018001379B1 (pt) | 2024-04-30 |
ES2904255T3 (es) | 2022-04-04 |
CA2992084A1 (en) | 2017-02-02 |
CL2018000227A1 (es) | 2018-04-27 |
PE20180775A1 (es) | 2018-05-07 |
MX2018001258A (es) | 2018-04-20 |
CO2018000801A2 (es) | 2018-04-10 |
US10100330B2 (en) | 2018-10-16 |
RU2018107162A3 (ru) | 2020-01-28 |
WO2017019787A1 (en) | 2017-02-02 |
JP2018525987A (ja) | 2018-09-13 |
EP3328187A1 (en) | 2018-06-06 |
HRP20211858T1 (hr) | 2022-03-04 |
NI201800013A (es) | 2018-06-12 |
US20170044568A1 (en) | 2017-02-16 |
CN107849571B (zh) | 2022-04-19 |
RU2018107162A (ru) | 2019-08-28 |
US20180346925A1 (en) | 2018-12-06 |
CN107849571A (zh) | 2018-03-27 |
EP3328187B1 (en) | 2021-11-10 |
HUE057364T2 (hu) | 2022-05-28 |
UA126327C2 (uk) | 2022-09-21 |
CR20180060A (es) | 2018-07-09 |
SV2018005620A (es) | 2018-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11254950B2 (en) | Insecticidal proteins toxic or inhibitory to hemtpteran pests | |
EA037469B1 (ru) | Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым | |
RU2765310C2 (ru) | Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым | |
US11987800B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
US11492640B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
US11673922B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
CN110678067B (zh) | 新型昆虫抑制蛋白 | |
US12104162B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
US20230013686A1 (en) | Novel insect inhibitory proteins | |
CN117616117A (zh) | 新型昆虫抑制蛋白 | |
EA040152B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей | |
EA040497B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей | |
EA040101B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей | |
EA040097B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей |