CN107849571A - 新型昆虫抑制蛋白 - Google Patents
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Abstract
公开了针对鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫物种表现出毒性活性的杀虫蛋白质类别，并且其包括但不限于TIC5290。提供了含有编码TIC5290杀虫蛋白的重组核酸序列的DNA构建体。提供了对鳞翅目、鞘翅目和半翅目侵扰具有抗性的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其含有编码本发明的TIC5290杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于在生物样品中检测本发明的重组核酸序列或蛋白质的存在的方法，以及使用TIC5290杀虫蛋白控制鞘翅目、鳞翅目和半翅目物种害虫的方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求2015年7月30日提交的美国临时申请号62/199,024的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
含有序列表的计算机可读形式的名称为“MONS394WO-sequence_listing.txt”的文件创建于2016年7月19日。此文件是16,077字节(在MS-Windows中测量)，同时通过电子提交方式(使用美国专利局EFS-Web提交系统)提交，并且以引用的方式整体并入本申请。
发明领域
本发明大体上涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型的针对作物植物和种子的农业相关害虫表现出昆虫抑制活性的蛋白质。具体地，所公开的蛋白质针对作物植物和种子的农业相关害虫(特别是昆虫害虫的鞘翅目、鳞翅目和半翅目物种)具有杀昆虫活性。提供了含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。
发明背景
改进农业重要植物(尤其包括玉米、大豆、甘蔗、稻、小麦、蔬菜和棉花)的作物产量已经变得越来越重要。除了越来越需要农业产品来为不断增长的人口供给食物、衣物并提供能源之外，预测与气候相关的影响以及来自不断增长的人口使用除农业活动之外的土地的压力将会减少可用于耕作的耕地。这些因素导致对食品安全的悲观预期，特别是在植物生物工艺学和农艺操作缺乏主要改进的情况下。鉴于这些压力，在工艺学、农业技术和害虫管理方面的环境可持续改进是在有限量的可用于耕作的耕地上扩大作物生产的至关重要工具。
昆虫，特别是鳞翅目、鞘翅目和半翅目内的昆虫，被认为是大田作物损害的主要原因，从而降低受侵扰地区的作物产量。对农业有负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、小蔗螟(Diatraeasaccharalis)、巨座玉米螟(Diatraea grandiosella)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黄豆银纹夜蛾(Chrysodeixisincludens)、绿棉铃虫(Heliothis virescens)、菱纹背蛾(Plutella xylostella)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、豆白缘切根虫(Striacosta albicosta)和桔潜蛾(Phyllocnistis citrella)。对农业有负面影响的鞘翅目害虫物种包括但不限于，缺隆叩甲属(Agriotes spp.)、花象属(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜胫跳甲(Chaetocnema tibialis)、根颈象属(Cosmopolites spp.)、象虫属(Curculiospp.)、皮蠹属(Dermestes spp.)、根萤叶甲属(Diabrotica spp.)、食植瓢虫属(Epilachnaspp.)、Eremnus属、科罗拉多金花虫(Leptinotarsa decemlineata)、稻水象属(Lissorhoptrus spp.)、鳃金龟属(Melolontha spp.)、锯谷稻属(Orycaephilus spp.)、耳象属(Otiorhynchus spp.)、斑象属(Phlyctinus spp.)、弧丽金龟属(Popillia spp.)、蚤跳甲属(Psylliodes spp.)、谷蠹属(Rhizopertha spp.)、金龟子科(Scarabeidae)、象虫属(Sitophilus spp.)、麦蛾属(Sitotroga spp.)、拟步行虫属(Tenebrio spp.)、拟谷盗属(Tribolium spp.)和斑皮蠹属(Trogoderma spp)，具体地其中所述害虫为玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫，WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabroticabarberi)(北方玉米根虫，NCR)、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫，MCR)、带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)(巴西玉米根虫(BZR))、黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardii)(南方玉米根虫，SCR)以及由叶甲蝽(Diabrotica viridula)和南美叶甲(Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合群(Brazilian Corn Rootworm complex(BCR))。对农业有负面影响的半翅目害虫物种包括但不限于，豆荚盲蝽(Lygus hesperus)、美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)和棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)。
从历史上看，农业中依赖于密集施加合成化学杀昆虫剂作为害虫控制剂。对环境和人类健康的关注，除了出现的抗性问题之外，还刺激了生物杀虫剂的研究和开发。这项研究工作导致逐步发现和使用各种昆虫病原微生物物种，包括细菌。
当昆虫病原细菌(尤其是属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌)的潜能被发现并开发为生物害虫控制剂时，生物控制模式发生转变。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis(Bt))细菌的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为发现Bt菌株对特定的昆虫显示出高毒性。已知Bt菌株在孢子形成开始时以及在静止生长期期间产生定位在伴胞晶体包涵体内的δ-内毒素(例如Cry蛋白)，并且还已知其产生分泌型杀昆虫蛋白。一旦被易感昆虫摄取，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因也已经在除Bt之外的细菌物种中进行鉴定，所述细菌物种包括其他芽孢杆菌属(Bacillus)和多种另外的细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本金龟子芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
结晶且分泌型的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且作为化学杀昆虫剂的替代品已经在全世界获得接受。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵扰，减少对化学杀虫剂应用的需要，并增加产量。杀昆虫毒素蛋白通过以下方式来控制作物植物的农业相关害虫：通过机械方法，诸如通过喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上以及通过使用遗传转化技术以产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。
表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经全球适应。例如，在2012年，有2610万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物(James,C.,Global Status of CommercializedBiotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief No.44)。转基因防昆虫作物的全球使用以及这些作物中的有限数量的杀昆虫毒素蛋白已经对现有的昆虫等位基因产生了选择压力，所述等位基因赋予了对当前使用的杀昆虫蛋白的抗性。
目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式杀昆虫毒素蛋白可用于管理对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。新的蛋白毒素具有改进的功效并且表现出对更广谱的易感昆虫物种的控制，这将减少可以产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用两种或更多种对相同昆虫害虫有毒性并展示出不同作用模式的转基因杀昆虫毒素蛋白在任何单一目标昆虫物种中降低了抗性的可能性。
因此，本发明人在本文中公开了来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白毒素家族以及类似的毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白，它们针对目标鳞翅目、鞘翅目和半翅目害虫物种(特别是针对西方玉米根虫)均表现出杀昆虫活性。
发明概述
本文公开了一组新型的具有昆虫抑制活性的杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文中称之为TIC5290，其示出针对作物植物的一种或多种害虫表现出抑制活性。TIC5290蛋白和TIC5290蛋白毒素类中的蛋白可以单独地或者与其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合地用于制剂中和植物体内，从而为农业系统当前使用的杀昆虫蛋白和杀昆虫剂化学品提供替代品。
在一个实施方案中，本申请公开的是重组核酸分子，其包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或(d)所述编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％的序列同一性的多核苷酸序列；或(e)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。重组核酸分子可以包含下述序列，所述序列用于在植物中表达杀虫蛋白；或者在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
在本申请的另一个实施方案中是宿主细胞，其包含本申请的重组核酸分子，其中所述宿主细胞选自细菌和植物细胞。设想的宿主细胞包括农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属物种为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，或所述埃希氏菌属为大肠杆菌(Escherichia coli)。设想的植物宿主细胞包括双子叶细胞和单子叶细胞。另外设想的植物宿主细胞包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花菜、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉属(Gossypium sp.))、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞。
在又另一实施方案中，所述杀虫蛋白针对鞘翅目昆虫表现出活性，所述鞘翅目昆虫包括西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、巴西玉米根虫或者由叶甲蝽和南美叶甲组成的巴西玉米根虫复合群。
在另一个实施方案中，杀虫蛋白针对鳞翅目昆虫表现出活性，所述鳞翅目昆虫包括黎豆毛虫、甘蔗螟、小玉米螟、玉米穗虫、烟草夜蛾、大豆尺蠖、黑粘虫、南方粘虫、秋粘虫、甜菜粘虫、东半球棉铃虫(Old World bollworm)、东方叶虫、红铃虫、黑切根虫、西南玉米螟、小菜蛾或欧洲玉米螟。
在又另一实施方案中，杀虫蛋白针对半翅目昆虫表现出活性，所述半翅目昆虫包括豆荚草盲蝽、牧草盲蝽或棉盲蝽。
本申请还设想包含重组核酸分子的植物，所述重组核酸分子包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的补体杂交；或(d)所述植物表现出可检测量的所述杀虫蛋白。在某些实施方案中，所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花菜、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦。
在另外的实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
在另一个实施方案中，设想了包含本申请公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。所述昆虫抑制组合物还可以包含编码与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种表现出活性。昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂在一个实施方案中选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657和DIG-11蛋白。
设想了包含可检测量的本申请公开的重组核酸分子的商品产品。此类商品产品包括由谷物处理器装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷类等，以及对应的棉花商品产品，诸如完整的或加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸材、生物质和燃料产品诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的粒料的种子和植物部分，以及对应的大豆商品产品，诸如完整的或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片、大豆麸、豆浆、大豆奶酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸材、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品，以及对应的大米、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品产品，在适用情况下包括果汁、浓缩物、果酱、果胶、橘子果酱以及含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的其他可食用形式的商品产品。
本申请还设想了一种生产包含本申请中公开的重组核酸分子的种子的方法。所述方法包括种植包含本申请公开的重组核酸分子的至少一种种子；由所述种子长出植物；并从所述植物收获种子，其中所收获的种子包含本申请的重组核酸分子。
在另一个说明性实施方案中，提供了对昆虫侵扰抗性的植物，其中所述植物的细胞包含：(a)编码如SEQ ID NO:2所示的杀昆虫有效量的杀虫蛋白的重组核酸分子；或(b)包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的杀昆虫有效量的蛋白质。
本申请还公开了用于控制鞘翅目或鳞翅目或半翅目物种害虫，以及控制植物(尤其是作物植物)的鞘翅目或鳞翅目或半翅目害虫侵扰的方法。在一个实施方案中本方法包括(a)使害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:2所示的一种或多种杀虫蛋白接触；或(b)使害虫与杀昆虫有效量的包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的一种或多种杀虫蛋白接触。
本文还提供了检测包含编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的重组核酸分子的存在的方法，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在所述杂交条件下不与来自不包含所述区段的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或编码包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白的序列同源或互补。所述方法还可包括(a)使样品和探针经受严格杂交条件；和(b)检测探针与样品的DNA的杂交。
本发明还提供了在包含蛋白质的样品中检测杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与免疫反应性抗体接触；和(b)检测蛋白质的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
附图简述
图1说明了示例性叶绿体靶向和非靶向TIC5290蛋白在植物体内的西部玉米根虫(WCR)抑制活性。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码从苏云金芽孢杆菌物种EG6657获得的TIC5290杀虫蛋白序列的核酸。
SEQ ID NO:2是TIC5290蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码用于在植物细胞中表达的TIC5290杀虫蛋白的合成编码序列。
发明详述
农业害虫控制领域中的问题可以描述为对新的毒素蛋白的需要，所述新的毒素蛋白对目标害虫有效，对目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不引起不需要的农艺学问题，并且与植物中商业使用的当前毒素相比提供了替代性作用模式。
本文公开了新型杀昆虫蛋白，其通过针对鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫并且更具体地针对玉米根虫害虫物种提供抗性的TIC5290和相关家族成员举例说明。还公开了设计用于在植物细胞中表达、编码TIC5290的合成编码序列。还公开了包含与编码TIC5290毒素蛋白或其相关家族成员或其片段的编码序列可操作连接的启动子的重组核酸分子。
本申请中对TIC5290、“TIC5290蛋白”、“TIC5290蛋白毒素”、“TIC5290毒素蛋白”、“TIC5290杀虫蛋白”、“TIC5290相关毒素”或“TIC5290相关毒素蛋白”等的提及是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫、鳞翅目害虫和半翅目害虫的活性的TIC5290的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列(SEQ ID NO:2)及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白质，只要此种蛋白质与TIC5290的比对产生约65％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。
术语“区段”或“片段”在本申请中用于描述连续氨基酸或核酸序列，其比描述TIC5290蛋白或相关家族成员杀昆虫蛋白的完整氨基酸或核酸序列更短。本申请还公开了表现出昆虫抑制活性的区段或片段，只要此种区段或片段与SEQ ID NO:2所示的TIC5290蛋白的对应部分的比对产生所述区段或片段与TIC5290蛋白的对应部分之间的约65％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。
本申请中对术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫的”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制的”或“杀昆虫的”的提及是指毒性剂(诸如蛋白毒素)在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存力)、禁止(禁止生长、摄食、繁殖力或生存力)、控制(控制害虫侵扰、在含有有效量的TIC5290蛋白的特定作物上控制害虫摄食活性)或杀死害虫(引起害虫的发病、死亡或繁殖力降低)方面的功效。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中所述害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或生长迟缓。这些术语还包括作为在植物内或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置排斥害虫。一般来讲，杀虫活性是指毒性蛋白能够有效抑制特定目标害虫(包括但不限于鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫)的生长、发育、生存力、摄食行为、交配行为、繁殖力或者由昆虫摄食此蛋白质、蛋白质片段、或多核苷酸而引起的不利影响的任何可测量的减少。毒性蛋白可以由植物产生，或者可以施用于植物或植物所位于的位置内的环境。术语“生物活性”、“有效的(effective)”、“有功效的(efficacious)”或其变型也是本申请中可交换使用的术语，以描述本发明的蛋白质对目标害虫的影响。
当在目标害虫的饲料(diet)中提供时，杀虫有效量的毒性剂在毒性剂与害虫接触时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学试剂。杀虫或杀昆虫化学试剂和杀虫或杀昆虫蛋白试剂可以单独使用或彼此组合使用。化学试剂包括但不限于靶向用于抑制目标害虫的特定基因的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱和瑞诺烷类(ryanoid)。杀虫或杀昆虫蛋白试剂包括本申请所示的蛋白毒素以及其他蛋白质毒性剂，包括以鳞翅目、鞘翅目和半翅目害虫物种为攻击目标的蛋白毒性剂以及用于控制其他植物害虫的蛋白毒素，诸如本领域可用于控制同翅目物种的Cry蛋白。
预期对害虫特别是作物植物的害虫的提及意指作物植物的昆虫害虫，特别是由TIC5290蛋白控制的昆虫害虫。然而，当以这些害虫为攻击目标的毒性剂与TIC5290蛋白与TIC5290具有约65％至约100％的同一性的蛋白质共同定位或一起存在时，对害虫的提及还可以包括植物的同翅目昆虫害虫以及线虫和真菌。
TIC5290蛋白毒素类的杀昆虫蛋白通过共同的功能而相关，并且对鞘翅目和鳞翅目昆虫物种(包括成虫、蛹、幼虫和新生幼虫)以及半翅目昆虫物种(包括成虫和若虫)的昆虫害虫表现出杀昆虫活性。
鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和棉铃虫，例如秋粘虫(草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(甜菜夜蛾)、披肩粘虫(bertha armyworm)(蓓带夜蛾(Mamestra configurata))、南方粘虫(南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania))、黑切根虫(小地老虎)、包菜尺蠖(粉纹夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾(Pseudoplusia includens))、黎豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、苜蓿绿夜蛾(green cloverworm)(苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra))、烟草夜蛾(绿棉铃虫)、颗粒地老虎(Agrotis subterranea)、粘虫(一星粘虫(Pseudaletia unipuncta))、西方切根虫(西部灰地老虎(Agrotis orthogonia))；来自螟蛾科(Pyralidae)的螟虫、鞘蛾、结网毛虫、锥形虫、菜青虫和雕叶虫，例如，欧洲玉米螟(European corn bore)(欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis))、脐橙螟(navel orangeworm)(脐橙螟蛾(Amyelois transitella))、玉米根网螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、草地螟(水稻切叶野螟(Herpetogrammalicarsisalis))、向日葵螟(向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum))、小玉米茎螟虫(南美玉米苗斑螟)；来自卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种虫(seed worm)和果蠕虫，例如，苹果蠹蛾(codling moth)(苹果卷叶蛾(Cydia pomonella))、葡萄浆果蛾(葡萄小食心虫(Endopiza viteana))、东方果蛾(梨小食心虫(Grapholita molesta))、向日葵芽蛾(sunflower bud moth)(向日葵芽蛾(Suleima helianthana))；以及许多其他经济上重要的鳞翅目，例如，小菜蛾(菱纹背蛾(Plutella xylostella))、红铃虫(棉红铃虫(Pectinophora gossypiella))和舞毒蛾(gypsy moth)(舞毒蛾(Lymantria dispar))。鳞翅目的其他昆虫害虫包括，例如，棉叶虫(棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea))、果树卷叶虫(果树黄卷蛾(Archips argyrospila))、欧洲卷叶虫(蔷薇黄卷蛾(Archips rosana))和其他黄卷蛾物种(二化螟(Chilo suppressalis)、亚洲水稻螟虫或稻杆螟虫)、水稻卷叶虫(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))、玉米根网螟(玉米根草螟)、蓝草网螟(早熟禾草螟(Crambus teterrellus))、西南玉米螟(巨座玉米螟(Diatraea grandiosella))、甘蔗螟虫(surgarcane borer)(小蔗螟(Diatraea saccharalis))、多刺螟铃(棉斑实蛾(Eariasinsulana))、斑点螟铃(翠纹钻夜蛾(Earias vittella))、东半球棉铃虫(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、玉米穗虫(谷实夜蛾，也称为大豆豆荚虫和棉铃虫(cottonbollworm))、烟草夜蛾(绿棉铃虫)、草地螟(水稻切叶野螟)、欧洲葡萄树蛾(鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana))、柑橘潜叶虫(桔潜蛾(Phyllocnistis citrella))、大菜粉蝶(欧洲粉蝶(Pieris brassicae))、小菜粉蝶(纹白蝶(Pieris rapae)，也称为菜青虫(importedcabbageworm))、小菜蛾(菱纹背蛾)、甜菜粘虫(甜菜夜蛾)、烟草切根虫(斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，也称为茶蚕(cluster caterpillar))和番茄潜叶虫(番茄斑潜蝇(Tuta absoluta))。
鞘翅目的昆虫包括但不限于，缺隆叩甲属、花象属、甜菜隐食甲、甜菜胫跳甲、根颈象属、象虫属、皮蠹属、根萤叶甲属、食植瓢虫属、Eremnus属、科罗拉多金花虫、稻水象属、鳃金龟属、锯谷稻属、耳象属、斑象属、弧丽金龟属、蚤跳甲属、谷蠹属、金龟子科、象虫属、麦蛾属、拟步行虫属、拟谷盗属和斑皮蠹属，具体地当害虫为西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲，NCR)、墨西哥玉米根虫(玉米根萤叶甲，MCR)、巴西玉米根虫(带斑黄瓜叶甲，BZR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲，SCR)以及巴西玉米根虫复合群(BCR，由叶甲蝽和南美叶甲组成)。
半翅目的昆虫包括但不限于，豆荚草盲蝽(豆荚盲蝽)、牧草盲蝽(美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris))或棉盲蝽(棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus))。
本申请中对“分离的DNA分子”或等同术语或短语的提及旨在意指DNA分子是单独存在的或与其他成分一起存在但不存在于其天然环境内的DNA分子。例如，天然存在于生物体基因组的DNA中的核酸元件诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在天然存在的基因组内的位置处就不被认为是“分离的”。然而，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内是“分离的”，只要所述元件不在有机体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处。类似地，编码杀昆虫蛋白或该蛋白质的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在天然存在编码所述蛋白质的序列的细菌的DNA内。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入到植物或细菌的细胞基因组中的或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论它是存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内、植物或细菌基因组内，还是以可检测量存在于来源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如本文进一步所述，在从苏云金芽孢杆菌菌株EG6657获得的DNA中发现了编码TIC5290(SEQ ID NO:1)的开放阅读框(ORF)。在微生物宿主细胞中克隆并表达所述编码序列以产生用于生物测定的蛋白质(SEQ ID NO:2)。与TIC5290最接近的毒素同系物是具有56.9％序列同一性的Vip4Aa蛋白，这表明TIC5290代表新型Vip4亚家族。使用微生物宿主细胞来源的TIC5290蛋白进行生物测定证明了针对鞘翅目害虫西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)；鳞翅目物种秋粘虫(草地贪夜蛾，FAW)、玉米穗虫(谷实夜蛾，CEW)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)和小菜蛾(菱纹背蛾)；以及半翅目豆荚草盲蝽(豆荚盲蝽)的活性。
设想与TIC5290相关的另外的毒素蛋白序列可以通过使用TIC5290的天然存在的氨基酸序列来产生新型蛋白质并具有新型特性。可以将TIC5290毒素蛋白与类似于TIC5290的其他蛋白质进行比对，以将氨基酸序列水平上的差异组合成新型氨基酸序列变体，并对编码变体的重组核酸序列做出适当的改变。
还设想可以通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物体内工程化TIC5290的改进的变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(类转录激活因子样效应核酸酶)和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可以用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体地，通过这些方法，毒素编码序列内的一个或多个密码子被改变以工程化新的蛋白质氨基酸序列。另选地，将编码序列内的片段替换或缺失或者将另外的DNA片段插入到编码序列中，以工程化新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新的特性(诸如针对昆虫害虫增加的活性或谱)的毒素蛋白，以及提供针对其中已针对原始昆虫毒素蛋白产生抗性的昆虫害虫物种的活性。可以通过本领域已知的方法使用包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞以生成表达新的毒素蛋白的完整植物。
还设想TIC5290蛋白的片段或其蛋白变体可以是具有昆虫抑制活性的截短的形式，其中一个或多个氨基酸从蛋白质的N末端、C末端、中部或其组合中缺失。这些片段可以是TIC5290的天然存在的或合成的变体或者衍生的蛋白质变体，但应保留TIC5290的昆虫抑制活性。
类似于TIC5290蛋白的蛋白质可以通过使用本领域已知的各种基于计算机的算法彼此比较来鉴定。例如，可以使用这些默认参数使用Clustal W比对来分析与TIC5290相关的蛋白质的氨基酸序列同一性：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，缺口延伸罚分：0.05，亲水缺口：开，亲水残基：GPSNDQERK，残基特异性缺口罚分：开(Thompson,等(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。进一步通过100％乘以(氨基酸同一性/主题蛋白的长度)的乘积来计算氨基酸同一性百分比。其他比对算法在本领域中也是可用的并且提供与使用Clustal W比对获得的结果类似的结果。
针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的蛋白质旨在与TIC5290相关，只要此类查询蛋白与TIC5290沿着查询蛋白长度的比对表现出至少65％至约100％的氨基酸同一性，即查询蛋白与主题蛋白之间的约65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的氨基酸序列同一性(或此范围内的任何分数百分比)。
TIC5290蛋白还可以由于一级结构(保守的氨基酸基序)、长度(约937个氨基酸)和其他特征而相关。生物信息学分析表明，TIC5290是一种成孔蛋白，具有PA14 Pfam结构域(PF07691)，所述结构域可能涉及与目标昆虫中肠上的细胞受体的结合功能、在氨基酸16-140中检测到；接着是在氨基酸186-593中的Binary_toxB Pfam结构域(PF03495)，所述结构域可能有助于形成β桶状跨膜孔。这两个Pfam都可能有助于蛋白质的杀昆虫活性。表1中报告了TIC5290蛋白毒素的特征。
表1.TIC5290蛋白所选择的特征。
如本申请实施例中进一步描述的，编码TIC5290的重组核酸分子序列被设计用于植物中。设计用于在植物中编码TIC5290蛋白的示例性植物优化的重组核酸分子序列示于SEQ ID NO:3中。
可以根据本领域已知的转化方法和技术构建含有这些合成核酸分子序列的表达盒和载体并将其引入玉米、大豆、棉花或其他植物细胞中。例如，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化描述于美国专利申请公布2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257 A1(甜菜)、美国专利号5,750,871(芥花)、7,026,528(小麦)和6,365,807(稻)中，以及Arencibia等(1998)Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)中，全部所述文献以引用的方式整体并入本文。转化的细胞可以再生成表达TIC5290的转化植物，并通过使用从转化植物获得的植物叶圆片在鳞翅目或半翅目害虫幼虫存在下进行的生物测定来证明杀虫活性。为了测试针对鞘翅目害虫的杀虫活性，将Ro和F1代的转化植物用于根虫测定，如以下实施例中所述。
作为传统转化方法的替代方案，可通过定点整合将DNA序列(诸如转基因、表达盒等)插入或整合到植物或植物细胞基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组DNA构建体和分子可包括供体模板序列，所述供体模板序列包含用于插入到植物或植物细胞的基因组中的至少一个转基因、表达盒或其他DNA序列。用于定点整合的此类供体模板还可包括侧接插入序列(即，待插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体还可包含编码位点特异性核酸酶和/或任何相关蛋白的表达盒以进行定点整合。这些核酸酶表达盒可作为供体模板(顺式)存在于相同的分子或载体中或存在于单独的分子或载体(反式)上。用于定点整合的若干种方法在本领域中是已知的，其涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或缺口的不同蛋白质(或者蛋白质复合物和/或指导RNA)。如本领域所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或缺口的过程中，供体模板DNA可在DSB或缺口的位点处整合到基因组中。尽管插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)发生，但供体模板中同源臂的存在可通过同源重组促进修复过程中插入序列在植物基因组中的接受性和靶向。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA的序列以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点。
设想了编码TIC5290的重组核酸分子组合物。例如，可用重组DNA构建体表达TIC5290蛋白，在所述构建体中将编码所述蛋白质的具有ORF的多核苷酸分子可操作地连接至在所述构建体意图的系统中表达所必需的遗传表达元件(诸如启动子)和任何其他调控元件。非限制性实例包括与TIC5290蛋白编码序列可操作地连接以在植物中表达蛋白质的植物功能性启动子，或者与TIC5290蛋白编码序列可操作地连接以在Bt细菌或其他芽孢杆菌物种中表达蛋白质的Bt功能性启动子。也可以将其他元件可操作地连接至TIC5290蛋白编码序列，所述其他元件包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定标签(HIS标签)、易位肽(即质体转运肽、信号肽)、用于翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。本文提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于可操作地连接至多核苷酸(诸如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列的多肽或蛋白质。异源启动子也可以可操作地连接至编码质体靶向的TIC5290和非靶向的TIC5290的合成DNA编码序列。编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子的密码子可被同义密码子取代(本领域已知为沉默取代)。
包含TIC5290蛋白编码序列的重组DNA构建体还可以包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，所述DNA区域可被配置成与编码TIC5290蛋白、与TIC5290蛋白不同的蛋白质、昆虫抑制dsRNA分子或辅助蛋白的DNA序列同时表达或共表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或功能在于有助于昆虫抑制剂的有效性的其他试剂，所述有助于例如通过有助于其表达、影响其在植物中的稳定性、优化用于寡聚反应的自由能、增加其毒性以及增加其活性谱。辅助蛋白可以促进对一种或多种昆虫抑制剂的摄取，例如或者加强毒性剂的毒性影响。
可以组装重组DNA构建体，使得所有蛋白质或dsRNA分子从一个启动子表达，或者每种蛋白质或dsRNA分子处于单独的启动子控制或其一些组合之下。本发明的蛋白质可以由多基因表达系统表达，在所述多基因表达系统中TIC5290由共同核苷酸区段表达，所述核苷酸区段也包含其他开放阅读框和启动子，这取决于所选择的表达系统类型。例如，植物多基因表达系统可以利用单一启动子来驱动单个操纵子内的多重连接/串联开放阅读框的表达。在另一个实例中，植物多基因表达系统可以利用各自表达不同蛋白质或其他试剂(诸如一个或多个dsRNA分子)的多重-非连接表达盒。
可通过载体(例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)将包含TIC5290蛋白编码序列的重组核酸分子或重组DNA构建体递送至宿主细胞。此类载体可以用于在宿主细胞中实现TIC5290蛋白编码序列的稳定或瞬时表达，或编码的多肽的后续表达。包含TIC5290蛋白编码序列并且引入到宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本文中被称为“转基因”。
本文提供了含有表达任何一种或多种TIC5290蛋白编码序列的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可以包括但不限于，农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属或者根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶细胞或单子叶细胞。设想的植物和植物细胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花菜、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了由转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可以由转基因种子、通过从植物中切割、折断、磨碎或以其他方式解离部分获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、圆荚、叶、花、茎、根或其任何部分或者转基因植物部分的不可再生部分。如在此背景下所用，转基因植物部分的“不可再生”部分为不能诱导以形成完整植物或者不能诱导来形成能够有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分为转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制备包含鞘翅目或鳞翅目或半翅目昆虫抑制量的TIC5290蛋白的转基因植物的方法。此类植物可以通过以下方式来制备：将编码本申请提供的TIC5290蛋白的重组多核苷酸引入到植物细胞中，并且选择来源于所述植物细胞的表达鞘翅目或鳞翅目或半翅目昆虫抑制量的TIC5290蛋白的植物。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。用于转化植物的方法是本领域已知的。
本文还公开了加工的植物产品，其中所述加工的产品包含可检测量的TIC5290蛋白、其昆虫抑制区段或片段或者其任何区别部分。在某些实施方案中，所述加工的产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、膳食、动物饲料、面粉、玉米片、糠、棉绒、果壳、加工的种子和种子。在某些实施方案中，加工的产品不可再生。植物产品可以包括来源于转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中所述商品或其他产品可以通过检测编码或包含TIC5290蛋白的区别部分的核苷酸区段或表达RNA或蛋白质来追踪。
表达TIC5290蛋白的植物可以通过培育与表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状(诸如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性状的基因等)的转基因品系杂交，或者可以将此类性状组合在单一载体中使得性状全部得以连锁。
如实施例中进一步描述的，设计用于植物中的编码TIC5290的合成或人工序列在SEQ ID NO:3中示出。
为了在植物细胞中表达，可以表达TIC5290蛋白使其驻留于细胞质中或靶向植物细胞的各种细胞器。例如，将蛋白质靶向叶绿体可导致转基因植物中表达蛋白质的水平增加，同时防止发生表型异常。靶向也可能导致转基因品系中害虫抗性功效的增加。靶肽或转运肽是引导蛋白质转运至细胞特定区域的短(3-70个氨基酸长)肽链，所述特定区域包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。一些靶肽在蛋白质被转运之后通过信号肽酶从蛋白质中裂解。为了靶向叶绿体，蛋白质含有大约40-50个氨基酸的转运肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位蛋白作为前体从核基因中表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与小亚单位(SSU)核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白质I和蛋白质II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及描述于美国专利号7,193,133中的转运肽相关联的那些蛋白质。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白可以通过使用与异源CTP的蛋白质融合物来靶向叶绿体，并且CTP足以将蛋白质靶向至叶绿体。已经示出并入合适的叶绿体转运肽(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或者矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)在转基因植物中将异源EPSPS蛋白序列靶向至叶绿体(参见美国专利号5,627,061；5,633,435和5,312,910；以及EP 0218571；EP189707；EP 508909和EP 924299)。为了将TIC5290蛋白靶向至叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列可操作连接地并同框地置于编码TIC5290毒素蛋白的合成编码序列的5ˊ端，所述合成编码序列已经被设计用于在植物细胞中最佳表达。
可以根据本领域已知的转化方法和技术构建含有这些合成或人工核苷酸序列的表达盒和载体并将其引入到玉米、棉花和大豆植物细胞中。转化的细胞再生成观察到表达TIC5290的转化植物。为了测试杀虫活性，在鳞翅目、鞘翅目和半翅目害虫的存在下执行生物测定。
可以使用本领域普通技术人员已知的方法(诸如聚合酶链式反应(PCR)、热扩增和杂交)来鉴定TIC5290蛋白编码序列和与TIC5290具有显著百分比同一性的序列。例如，蛋白质TIC5290可以用于产生与相关蛋白质特异性结合的抗体，并且可以用于筛选并发现密切相关的其他蛋白质成员。
此外，编码TIC5290毒素蛋白的核苷酸序列可以用作探针和引物进行筛选，以使用热循环或等温扩增和杂交方法来鉴定所述分类的其他成员。例如，来源于如SEQ ID NO:3所示的序列的寡核苷酸可以用于在来源于商品产品的脱氧核糖核酸样品中确定TIC5290转基因是否存在。考虑到采用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏性，预期来源于如SEQ IDNO:3所示序列的寡核苷酸可以用于检测来源于汇集来源的商品产品中的TIC5290转基因，其中仅一部分商品产品来源于含有SEQ ID NO:3的转基因植物。进一步认识到，可以使用此类寡核苷酸将核苷酸序列变体引入到SEQ ID NO:3中。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或不同表达的TIC5290氨基酸序列变体。
核苷酸序列同源物，例如由在杂交条件下与本申请公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白也是本发明的实施方案。本发明还提供了用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中所述第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段，并且在严格杂交条件下与第二核苷酸序列杂交。在此种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下表示为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当杂交条件下彼此杂交，由这些核苷酸序列编码的蛋白质与针对任何一种其他蛋白质产生的抗血清交叉反应。如本文所定义的严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，接着在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤2次，每次5分钟，接着在65℃下在0.5XSSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，接着在68℃下在含有0.1％SDS的2xSSC中洗涤。
本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余性，许多其他序列能够编码与TIC5290相关的蛋白质，并且那些序列就其用于在芽孢杆菌属菌株中或在植物细胞中表达杀虫蛋白的程度而言是本发明的实施方案，当然认识到许多此类冗余编码序列在这些条件下不会与编码TIC5290的天然芽孢杆菌属序列杂交。本申请设想使用本领域普通技术人员已知的这些和其他鉴定方法来鉴定TIC5290蛋白编码序列和与TIC5290蛋白编码序列具有显著百分比同一性的序列。
本申请还公开了用TIC5290蛋白质控制作物植物的昆虫(特别是鳞翅目或鞘翅目或半翅目)侵扰的方法。此类方法可以包括使包含鞘翅目或鳞翅目或半翅目昆虫抑制量的TIC5290毒素蛋白的蛋白质的植物生长。在某些实施方案中，此类方法还可以包括以下中的任何一项或多项：(i)将包含或编码TIC5290毒素蛋白的任何组合物施加于植物或产生植物的种子；和(ii)用编码TIC5290毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般来讲，设想TIC5290毒素蛋白可以提供在组合物中，提供在微生物中，或提供在转基因植物中以赋予针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫的昆虫抑制活性。
在某些实施方案中，TIC5290毒素蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述昆虫抑制组合物通过在适于表达TIC5290毒素蛋白的条件下培养经转化以表达TIC5290毒素蛋白的重组芽孢杆菌或任何其他重组细菌细胞来制备。此种组合物可以通过脱水、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。此种过程可以得到芽孢杆菌或其他昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。对于获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饲料生物测定中的昆虫抑制制剂。
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC5290的昆虫抑制组合物还可以包含至少一种另外的多肽，所述多肽针对相同的鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性，但不同于TIC5290毒素蛋白。用于此种组合物的可能的另外的多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列来控制昆虫害虫的一个实例描述于Baum等(美国专利公布2006/0021087A1)。用于控制鳞翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于，Cry1A(美国专利号5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布号10/525,318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体(诸如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公布WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公布WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利号7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AND AXMI-045(美国专利公布2013-0117884 A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259 A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264 A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、axmi209(美国专利公布2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491 A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363 A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598 A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195 A1)、AXMI-335(国际申请公布WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公布2013-0219570 A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569 A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292 A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292 A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292 A1)、DIG-657(国际申请公布WO2015/195594(A2))、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292 A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、如美国专利公布2012-0167259 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256 A1中所述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721 A1中所述的SEQ IDNO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221 A1中所述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如美国专利号7,772,465(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如WO2014/008054 A2中所述的CF161_0085及其衍生物、如美国专利公布US2008-0172762 A1、US2011-0055968 A1和US2012-0117690 A1中所述的鳞翅目毒素蛋白及其衍生物；如US7510878(B2)中所述的SEQID NO:2及其衍生物、如美国专利号7812129(B1)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物；等等。
用于控制鞘翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于，Cry3Bb(美国专利号6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538 A1)、axmi207(美国专利公布2013-0303440 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公布2010-0197592 A1)、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092 A1)、eHIPs(美国专利申请公布号2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公布2012-0210462 A1)和-Hexatoxin-Hv1a(美国专利申请公布US2014-0366227 A1)。
用于控制半翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：半翅目活性蛋白，诸如但不限于，TIC1415(美国专利公布2013-0097735 A1)、TIC807(美国专利号8609936)、TIC834(美国专利公布2013-0269060 A1)、AXMI-036(美国专利公布2010-0137216 A1)和AXMI-171(美国专利公布2013-0055469 A1)。用于控制鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫的另外的多肽可以在由Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站上(在万维网btnomenclature.info上)找到。
在其他实施方案中，此类组合物/制剂还可以包含至少一种另外的多肽，其对不被本发明的其他昆虫抑制蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性以扩大获得的昆虫抑制谱。
本领域已经记录了昆虫对某些杀昆虫剂产生抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略是采用表达两种通过不同作用模式起作用的不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来控制。另一种昆虫抗性管理策略采用对未针对目标鞘翅目或鳞翅目害虫物种加以防护的植物的使用来为此类未被保护的植物提供庇护。一个具体的实例描述于美国专利号6,551,962中，其以引用的方式整体并入本文。
其他实施方案，诸如设计用于控制也由本文公开的蛋白质控制的害虫、待与蛋白质一起用于种子处理的局部施用的杀虫化学物质、喷雾制剂、滴注制剂或擦拭制剂可以直接施用于土壤(土壤浸润)，施加于表达本文公开的蛋白质的生长植物，或配制成施加于含有一种或多种编码一种或多种所公开蛋白质的转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以与本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起施加。此类制剂可以含有与所公开的蛋白质作用方式具有协同作用的杀虫剂，使得制剂杀虫剂通过不同的作用模式起作用以控制可以被所公开的蛋白质控制的相同或类似的害虫，或者使得此类杀虫剂用于控制更广泛的宿主范围内的害虫或不能由TIC5290杀虫蛋白有效控制的植物害虫物种。
前述组合物/制剂还可以包含农业上可接受的载体，诸如诱饵、粉末、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮剂、水性溶液剂、芽孢杆菌孢子/晶体制备物、种子处理、转化以表达一种或多种蛋白质的重组植物细胞/植物组织/种子/植物或者转化以表达一种或多种蛋白质的细菌。根据重组多肽中固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和待施加于植物或饲料测定的制剂水平，组合物/制剂可以包含按重量计各种量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重组多肽。
实施例
根据上述内容，本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得相似或类似结果的特定方面中做出改变。因此，本文所公开的特定结构和功能细节不被解释为限制性的。应理解，本文引用的每篇参考文献的全部公开内容并入本申请的公开内容中。
实施例1
TIC5290的发现
本实施例描述了杀虫蛋白TIC5290的发现。
对编码新型苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白的序列进行鉴定、克隆、序列确认并在昆虫生物测定中测试。从Bt菌株EG6657中分离出本文中呈现为SEQ ID NO:1(Bt编码序列)和2(蛋白质)的杀虫蛋白TIC5290。TIC5290是长为937个氨基酸的蛋白质，并且基于与已知杀昆虫蛋白毒素的同源性和通过使用Pfam分析进行鉴定来将TIC5290与已知的杀昆虫蛋白家族聚类。生物信息学分析表明TIC5290是一种成孔蛋白。氨基酸残基16至140处的PA14Pfam结构域(PF07691)很可能涉及结合功能。此结构域之后是氨基酸186至593处的Binary_toxB Pfam结构域(PF03495)，其可能有助于形成β-桶状跨膜孔。与TIC5209最接近的Bt毒素同系物是具有56.9％序列同一性的Vip4Aa蛋白，这表明TIC5290代表新型Vip4亚家族。
设计PCR引物以从分离自菌株EG6657的总基因组DNA中扩增TIC5290编码区的全长拷贝。PCR扩增子也包括编码序列的起始密码子和终止密码子。
使用本领域已知的方法将TIC5290扩增子克隆到Bt质粒表达载体中与芽孢杆菌芽孢形成过程中开启的Bt可表达启动子可操作地连接。此外，将扩增子克隆到用于在大肠杆菌(E.coli)表达系统中进行蛋白质表达的载体中。观察所得的重组菌株表达重组蛋白。
实施例2
TIC5290在昆虫生物测定中表现出鞘翅目、鳞翅目和半翅目活性
本实施例说明了TIC5290蛋白质针对鞘翅目、鳞翅目和半翅目的各种物种表现出的抑制活性。
新型杀虫蛋白TIC5290在Bt和大肠杆菌中表达，并测定了其对鞘翅目、鳞翅目、半翅目和双翅目的各种物种的毒性。针对鞘翅目物种科罗拉多金花虫(科罗拉多马铃薯甲虫，CPB)和玉米根萤叶甲(西方玉米根虫，WCR)测定来自Bt和大肠杆菌的每种毒素的制备物。还针对鳞翅目物种玉米穗虫(CEW，谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ECB，欧洲玉米螟)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，黄豆银纹夜蛾)、西南玉米螟(SWC，巨座玉米螟)、烟草夜蛾(TBW，绿棉铃虫)和小菜蛾(DBM，(菱纹背蛾)测定毒素制备物。还针对半翅目物种的牧草盲蝽(TPB，美国牧草盲蝽)和豆荚草盲蝽(WTP，豆荚盲蝽)；以及双翅目物种黄热蚊(YFM，埃及伊蚊(Aedes aegypti))测定了毒素制备物。玉米穗虫(CEW，谷实夜蛾)也被称为大豆豆荚虫(SPW)和棉铃虫(CBW)。
对每种载体中表达的蛋白质的测定需要将不同的制备物加入到昆虫饲料中。对于使用在孢子形成过程中有活性的启动子的载体，在培养物生长三天后收获晶体/孢子混合物并用于昆虫饲料(一般施加至昆虫人工饲料并分别喂食各种昆虫)。来源于大肠杆菌中的表达的蛋白质制备物被纯化，并且也以昆虫饲料形式提供。
如下表2所示，TIC5290展现出针对WCR、CEW、ECB、FAW、DBM和WTP的活性，其中“+”指示活性。
表2.TIC5290针对鞘翅目、鳞翅目、半翅目和双翅目昆虫害虫的生物测定活性。
实施例3
对用于在植物细胞中表达的编码TIC5290的合成编码序列的设计
构建合成或人工编码序列用于在植物中表达TIC5290，并且将所述合成或人工编码序列克隆到二元植物转化载体中并用于转化植物细胞。合成核酸序列根据美国专利5,500,365中大体描述的方法来合成，避免了某些有害的问题序列，诸如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留了天然Bt蛋白的氨基酸序列。TIC5290杀虫蛋白的合成编码序列如SEQ ID NO:3所呈现，并且编码SEQ ID NO:2所呈现的蛋白质。
实施例4
用于在植物细胞中表达TIC5290的表达盒
设计了具有如SEQ ID NO:3所示的序列的多种植物表达盒。此类表达盒可用于植物原生质体中的瞬时表达或植物细胞的转化。典型的表达盒是相对于蛋白质在植物细胞内的最终放置而设计的。对于质体靶向蛋白，合成TIC5290杀虫蛋白编码序列与叶绿体靶向信号肽编码序列同框可操作地连接。所得的植物转化载体包含用于表达杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接至前导序列的5ˊ端、可操作性地连接至内含子的5ˊ端(或任选地无内含子)、可操作性地连接至编码质体靶向的或非靶向的TIC5290蛋白的合成编码序列的5ˊ端，进而可操作地连接至3ˊUTR的5ˊ端；以及用于使用草甘膦或抗生素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。上述所有元件常常与提供用于构建表达盒的另外的序列(诸如限制性内切酶位点或连接非依赖性克隆位点)连续排列。
实施例5
TIC5290在稳定转化的玉米植物中表达时对西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)提供有效的抗性
本实施例说明了TIC5290在植物中表达时对鞘翅目(诸如玉米根虫)表现出抑制活性，并作为饲料提供给相应的昆虫害虫。
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计用于表达质体靶向的和非靶向的TIC5290杀虫蛋白。所得载体用于稳定转化玉米植物。选择单一T-DNA插入品系并使其生长。针对以稳定转化的玉米植物的根为食的鞘翅目害虫西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)测定杀虫活性。
R0稳定转化的植物用于测定鞘翅目抗性以及生成F1子代。从每个二元载体转化中选择多个单一复制品系。将来自每个二元载体转化的一部分品系用于鞘翅目测定，而另一部分品系用于生成F1子代以便进一步测试。
将R0测定植物移植到八英寸的盆中。用西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)的卵接种植物。在接种之前将卵孵育大约10天以允许在接种之后4天发生孵化，以确保足够数量的幼虫存活并且能够攻击玉米根。在大约V2至V3阶段接种转化的植物。侵扰大约二十八天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如下表3所呈现，使用1-5的损害等级量表来评估对根部的损害。还与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。低的根损害分数表明TIC5290蛋白赋予对鞘翅目害虫的抗性。在WCR测定中使用每个二元载体转化的多个R0品系。当与转基因对照相比时，表达质体靶向的和非靶向的TIC5290的许多R0品系表现出由根损害等级分数确定的WCR抗性。
表3.R0根损害等级分数。
| 根损害分数 | 描述 |
| 1 | 没有可见的摄食 |
| 2 | 一定程度的摄食；没有切断 |
| 3 | 切断至少一个根 |
| 4 | 整个节点被切断 |
| 5 | 多于一个节点被切断 |
将从每个二元载体转化产生的一部分R0稳定转化品系用于产生F1子代。使R0稳定转化植物自花授精，产生F1子代。种植F1种子。杂合植物通过本领域已知的分子方法来鉴定，并用于针对WCR的测定以及TIC5290毒素蛋白的ELISA表达测量。将来自每个品系的一部分杂合F1子代用于昆虫测定，而另一部分用于测量TIC5290表达。
将西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)的卵孵育大约10天，以允许在接种后四天内孵化。在大约V2至V3阶段接种植物。对于WCR，每个盆接种约两千个卵。侵扰大约二十八天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如下表4所呈现，使用0-3的损害等级量表来评估对根部的损害。与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。低的根损害分数表明TIC5290蛋白赋予对鞘翅目害虫的抗性。当与对照相比时，许多F1品系展示出有效的WCR抗性。图1描绘了当在F1玉米植物中表达时TIC5290的若干个品系的平均根损害等级，而不管蛋白质是否靶向叶绿体。
表4.F1根损害等级分数。
| 根损害分数 | 描述 |
| 0 | 没有可见的摄食 |
| 0.01-0.09 | 摄食疤痕和轨迹 |
| 0.1-0.9 | 根切断，但少于一个全长节点 |
| 1.0-1.9 | 在1.5英寸的植物内破坏至少一个全长节点(或等同物) |
| 2.0-2.9 | 两个或更多个节点消失 |
| 3 | 三个或更多个节点消失 |
实施例5
当在稳定转化的玉米、大豆或棉花植物中表达时TIC5290针对鳞翅目害虫的活性测定。
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计用于表达质体靶向的和非靶向的TIC5290杀虫蛋白。
将玉米、大豆或棉花使用农杆菌介导的转化方法用上述二元转化载体进行转化。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利号8,344,207中所述的那些来执行。使用未转化的玉米、大豆或棉花植物来获得用作阴性对照的组织。针对鳞翅目害虫评估来自每种二元载体的多个转化品系，所述害虫包括但不限于玉米穗虫(CEW，谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ECB，欧洲玉米螟)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，黄豆银纹夜蛾)、西南玉米螟(SWCB，巨座玉米螟)、烟草夜蛾(TBW，绿棉铃虫)和小菜蛾(DBM，(菱纹背蛾)。在昆虫生物测定中展示出发育迟缓和/或死亡的那些昆虫被确定为对TIC5290昆虫毒素的影响易感。
实施例6
使用稳定转化的表达TIC5290的棉花植物测定针对半翅目害虫的活性。
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒被设计用于表达质体靶向的和非靶向的TIC5290杀虫蛋白。所得的载体用于稳定转化棉花植物。针对以稳定转化的棉花植物为食的半翅目害虫测定杀虫活性。
先前在实施例3中描述的其中表达质体靶向的和非靶向的TIC5290的二元载体用于稳定转化棉花植物。选择单一T-DNA插入品系并使其生长。使R0稳定转化植物自花授精，产生R1子代。
包含TIC5290表达盒的R1转基因种子与对应于非转基因对照的种子一起播种在10英寸盆中。将植物保持在环境室中，光周期为在三十二摄氏度下光照十六小时并且在二十三摄氏度下黑暗八小时，并且光强度在八百至九百微爱因斯坦之间。在种植后的四十至四十五天，将各个植物封装在由透气塑料“授粉”片材(Vilutis and Company Inc,Frankfort,IL)制成的罩中。使用系带将片材套筒固定至土壤表面正上方的主茎上。将来自实验室培养的两对性成熟的雄性和雌性美国牧草盲蝽或豆荚盲蝽成虫(6天龄)收集到14毫升圆底塑料管(Becton Dickson Labware,Franklin Lakes,NJ)中并用于每株植物。将所述成虫通过笼子一侧的小狭缝释放到每个单独的罩中，然后紧闭罩，确保昆虫不会逃脱。允许昆虫交配，并将植物在罩中保持二十一天。二十一天之后，然后在罩的下方切割植物并移至实验室，在实验室收集每株植物的昆虫并对其计数。在打开笼子之前，剧烈摇动植物以确保所有的昆虫从其摄食位点落到罩的底部。然后打开笼子基部，并且移取所有的植物材料并放在黑色片材上。用吸气器收集昆虫。然后对植物进行彻底检查，以回收任何残余的昆虫。记录每株植物的昆虫数量和其发育阶段。基于盲蝽的成熟度将昆虫计数分成若干组；若虫至3龄、4龄、5龄和成虫。相对于未转化的棉花对照植物展示出若虫和成虫数量减少的转基因棉花植物证实了通过TIC5290毒素蛋白的表达赋予的半翅目害虫抗性。
按照本公开，本文公开的并且要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物已经根据前述示例性实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的组合物发生变化、改变、修改和变更，而不偏离本发明的真实概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是在化学上和生理学上都相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时实现相同或相似结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
本说明书中引用的所有公布和公布的专利文件都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个公布或专利申请以引用的方式并入本文一般。
Claims (31)
1.一种重组核酸分子，其包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中：
a.所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或
b.所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：
a.所述重组核酸分子包含用于在植物中表达所述杀虫蛋白的序列；或
b.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白；或
c.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒以及细菌或酵母人工染色体。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其被定义为存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。
4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。
5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属物种为蜡状芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，或所述埃希氏菌属为大肠杆菌。
6.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述植物细胞是双子叶或单子叶植物细胞。
7.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花菜、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞。
8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述杀虫蛋白针对鞘翅目昆虫表现出活性。
9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述昆虫为西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、巴西玉米根虫或者由叶甲蝽和南美叶甲组成的巴西玉米根虫复合群。
10.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述杀虫蛋白针对鳞翅目的昆虫物种表现出活性。
11.如权利要求10所述的重组核酸分子，其中所述昆虫为黎豆毛虫、甘蔗螟、小玉米螟、玉米穗虫、烟草夜蛾、大豆尺蠖、黑粘虫、南方粘虫、秋粘虫、甜菜粘虫、东方棉铃虫、东方叶虫、红铃虫、黑切根虫、西南玉米螟或欧洲玉米螟。
12.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述杀虫蛋白针对半翅目昆虫表现出活性。
13.如权利要求12所述的重组核酸分子，其中所述昆虫为豆荚草盲蝽、牧草盲蝽或棉盲蝽。
14.一种植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
15.如权利要求14所述的植物或其部分，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
16.如权利要求14所述的植物或其部分，其中所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花菜、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦。
17.一种如权利要求14所述的植物的种子，其中所述种子包含所述重组核酸分子。
18.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
19.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其还可以包含编码与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。
21.如权利要求19所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种表现出活性。
22.如权利要求21所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫蛋白选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657和DIG-11蛋白。
23.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其被定义为包含表达所述重组核酸分子的植物细胞。
24.一种由权利要求14所述的植物或其部分产生的商品产品，其中所述商品产品包含可检测量的所述重组核酸分子或由其编码的杀虫蛋白。
25.如权利要求24所述的商品产品，其选自由以下组成的组：由谷物处理器装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷类等、完整的或加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸材、生物质和燃料产品诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的粒料的种子和植物部分、完整的或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片、大豆麸、豆浆、大豆奶酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸材、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
26.一种产生种子的方法，其包括：
a.种植根据权利要求17所述的至少第一种子；
b.由所述种子生长出植物；以及
c.从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含所述重组核酸分子。
27.一种对昆虫侵扰具有抗性的植物，其中所述植物的细胞包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
28.一种用于控制鞘翅目或鳞翅目或半翅目物种害虫或者害虫侵扰的方法，所述方法包括：
a.使所述害虫与如SEQ ID NO:2所示的杀昆虫有效量的杀虫蛋白接触；或
b.使所述害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与SEQID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
29.一种在包含植物基因组DNA的样品中检测如权利要求1所述的重组核酸分子的存在的方法，其包括：
a.使所述样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含如权利要求1所述的DNA分子的植物的基因组DNA杂交，并且在所述杂交条件下不与来自不包含如权利要求1所述的重组核酸分子的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、或编码包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白的序列同源或互补；
b.使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及
c.检测所述探针与所述样品的DNA的杂交。
30.一种在包含蛋白质的样品中检测杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；所述方法包括：
a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及
b.检测所述蛋白质的存在。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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