ES2704652T3 - Uso combinado de las proteínas de CRY1Da y CRY1Fa para gestionar la resistencia de los insectos - Google Patents

Abstract

Una planta o célula vegetal transgénica que comprende ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1Da y ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1Fa.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso combinado de las proteínas de CryIDa y CrylFa para gestionar la resistencia de los insectos.

Antecedentes de la invención

Los seres humanos cultivan el maíz para aplicaciones alimentarias y energéticas. Los seres humanos también cultivan muchos otros cultivos, incluyendo la soja y el algodón. Los insectos comen y dañan las plantas y, por lo tanto, socavan estos esfuerzos humanos. Miles de millones de dólares se gastan cada año para controlar las plagas de insectos y miles de millones se pierden por el daño que infligen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las principales herramientas utilizadas para controlar las plagas de insectos, pero los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han desempeñado un papel importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a los insectos mediante la transformación con genes de proteínas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha aumentado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Varias proteínas Bt se han utilizado para crear plantas transgénicas resistentes a los insectos que se han registrado y comercializado con éxito hasta la fecha. Estos incluyen Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F y Cry3Bb en maíz, Cry1Ac y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en patata.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una única proteína, excepto en los casos en que se desee el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ejemplo, Cry1Ab y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a plagas de lepidópteros y al gusano de la raíz, respectivamente) o cuando la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de la resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, Cry1Ac y Cry2Ab en el algodón combinado para proporcionar el control de resistencia para el gusano cogollero del tabaco).

Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a los insectos que han llevado a una rápida y generalizada adopción de esta tecnología también dan lugar a la preocupación de que las poblaciones de plagas desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para preservar la utilidad de rasgos de resistencia a los insectos basados en Bt que incluyen el implementación de proteínas a una dosis alta en combinación con un refugio, y la alternancia, o el coimplementación, con diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol.

16:144 - 146).

Las proteínas seleccionadas para su uso en una pila de manejo resistente a insectos (IRM) necesitan ejercer su efecto insecticida independientemente de modo que la resistencia desarrollada a una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plagas que es resistente a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", se concluiría que no existe resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería efectiva para retrasar la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, las evaluaciones pueden hacerse basándose en otras características que se supone están relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. La utilidad de la unión mediada por receptores en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no presentan resistencia cruzada ha sido sugerida (van Mellaert et al., 1999). El principal predictor de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por los receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si ese receptor muta en ese insecto de modo que una de las toxinas ya no se une a ese receptor y, por lo tanto, ya no es un insecticida contra el insecto, podría ser el caso de que el insecto también fuera resistente a la segunda toxina (que se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser una indicación de que el insecto no sería simultáneamente resistente a esas dos toxinas.

La proteína Cry1Fa es útil en el control de muchas especies de plagas de lepidópteros, incluyendo la barrenadora europea del maíz (ECB, Ostrinia nubilalis (Hübner)) y el gusano de la caña (fAw , Spodoptera frugiperda), y es activa contra la barrena de la caña de azúcar (SCB, Diatraea saccharalis). La proteína Cry1Fa, tal como se produce en plantas de maíz transgénicas que contienen el evento TC1507, es responsable de un rasgo de resistencia a los insectos líder en la industria para el control de FAW. Cry1Fa se despliega adicionalmente en los productos Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™.

La capacidad para llevar a cabo estudios de unión de receptores (competitivos u homólogos) utilizando la proteína Cry1Fa está limitada debido a que la técnica más común disponible para el marcaje de proteínas para la detección en ensayos de unión de receptores inactiva la actividad insecticida de la proteína Cry1Fa.

Otras toxinas Cry se enumeran en el sitio web del comité de nomenclatura oficial de B.t. (Crickmore et al., lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Véase el Apéndice A adjunto. Actualmente, hay cerca de 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt adicionales y toxinas VIP y similares. Muchas de cada grupo numérico tienen subgrupos de letras mayúsculas, y los subgrupos de letras mayúsculas tienen sub-subgrupos de letras minúsculas. (Cry1 tiene A-L, y Cry1A tiene a-i, por ejemplo).

Breve compendio de la invención

La presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que una población del gusano cogollero (Spodoptera frugiperda; FAW) resistente a la actividad insecticida de la proteína Cry1Fa no es resistente a la actividad insecticida de la proteína Cry1Da. Como cualquier experto en la técnica reconocerá gracias a esta descripción, las plantas que expresan estas dos proteínas insecticidas, o sus partes insecticidas, serán útiles en el retraso o la prevención del desarrollo de la resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas solas.

La invención objeto también se apoya en el descubrimiento de que Cry1Fa y Cry1Da no compiten entre sí por los receptores de unión en el intestino de FAW.

La presente invención también se refiere en parte a las pilas triple o "pirámides" de tres toxinas, o más, siendo Cry1 Fa y Cry1 Da el par de bases.

La invención objeto también se relaciona en parte con pilas triples o "pirámides " de tres toxinas (o más), siendo las toxinas Cry1Fa y Cry1Da el par base. Una pirámide preferida proporciona al menos proteínas que proporcionan actividad no cruzada frente a dos plagas el FAW y el ECB (por sus siglas en inglés, el taladro del maíz; Ostrinia nubilabis): Cry1Fa más Cry1Da más una o más toxinas anti-ECB, tales como Cry1Ab. En algunas realizaciones preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres modos separados de acción contra FAW. Estas combinaciones piramidales preferidas de “tres modos de acción” son Cry1Fa más Cry1Da, más otra toxina/gen seleccionado del grupo que consiste en Vip3Ab, Cry1C, Cry1Be y Cry1E. Las plantas (y los acres plantados con tales plantas) que producen estas tres toxinas están incluidas dentro del alcance de la presente invención. También pueden añadirse otras toxinas/genes, pero estas pilas triples particulares, de acuerdo con la presente invención, proporcionarían, ventajosa y sorprendentemente, tres modos de acción contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requisito de superficie de refugio. La presente invención también se refiere de forma general al uso de tres proteínas insecticidas (proteínas Cry en algunas realizaciones preferidas) que no compite con otras contra una plaga objeto individual.

Por lo tanto, Cry1 Da podría usarse como en la combinación de 3 genes para el maíz y otras plantas (algodón y soja, por ejemplo). Un gen de Cry1Da podría combinarse, por ejemplo, en un producto Cry1Fa tal como Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™. De acuerdo con esto, el uso de Cry1Da podría ser significativo en la reducción de la presión de selección en otras proteínas comercializadas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Daño (porcentaje medio de daño de hoja SEM) a segmentos de hojas de maíz infestados con FAW (barras azules) o rFAW (barras púrpuras). Todos los tratamientos precedidos por los números "5163 " son segmentos foliares de plantas transformadas con una construcción que contiene Cry1Da. Las plantas en las que no se detectó la expresión de Cry1Da se agrupan en el extremo izquierdo del gráfico. Las plantas en las que se detectó la expresión de Cry1Da se agrupan en el centro del gráfico. Los controles no transgénicos (es decir, negativos) están en el extremo derecho del gráfico y se denominan "B104 ", "Hill " e "Isolina". Una endogámica comercial que contiene Cry1Fa es el primer tratamiento a la derecha (denominado "Herculex I") y es el mismo fondo genético que el control no transgénico denominado "Isolina".

Figura 2: Competición por la unión a BBMV de Spodoptera frugiperda por la toxina nuclear de CrylFa, la toxina nuclear de Cry1Da, y la proteína de la toxina nuclear de Cry1Da denominada 1251

Descripción detallada de la invención

Como se informó en el presente documento, una toxina Cry1Da producida en maíz transgénico (y otras plantas; algodón y soja, por ejemplo) es muy eficaz en el control del gusano cogollero (FAW; Spodoptera frugiperda) que ha desarrollado resistencia frente a la actividad de Cry1Fa. Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que el gusano cogollero resistente a Cry1Fa es susceptible (es decir, no tiene resistencia cruzada) frente a Cry1Da.

La presente invención también se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que la toxina Cry1Daes efectiva en la protección de plantas (tales como plantas de maíz) del daño causado por el gusano cogollero resistente a Cry1Fa. Para una discusión de esta plaga, véase, por ejemplo, Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 n°. 49, 19.029-19.030.

La presente invención incluye el uso de la toxina Cry1Da para proteger el maíz y otras especies vegetales de importancia económica de los daños y proporciona menores pérdidas causadas por la alimentación del gusano cogollero o frente a poblaciones del gusano cogollero que han desarrollado resistencia a Cry1Fa.

Así pues, la presente invención muestra una pila IRM para prevenir o mitigar el desarrollo de la resistencia por parte del gusano cogollero frente a Cry1Fa y/o Cry1Da.

La presente invención proporciona el uso de una composición para controlar plagas de lepidópteros que comprende células que producen una proteína que contiene la toxina nuclear Cry1Fa y una proteína que contiene la toxina nuclear Cry1Da.

La invención comprende además una planta transgénica o célula de planta transformada para producir tanto una proteína que contiene la toxina nuclear Cry1Fa y una proteína que contiene la toxina nuclear Cry1Da, en donde el polinucleótido cry1Fa o el polinucleótido cry1Da están preferiblemente en una construcción genética bajo el control de (es decir, unidos operativamente o que comprenden) uno o varios promotores no de Bacillus-thuringiensis. Los polinucleótidos pueden comprender el uso del codón para la expresión mejorada en una planta.

Se pretende además que la invención proporcione un método de control de plagas lepidópteras que comprende poner en contacto dichas plagas o el medio ambiente de dichas plagas con una cantidad eficaz de una composición que contiene una proteína que contiene la toxina nuclear de Cry1Fa y contiene además una proteína que contiene la toxina nuclear Cry1Da.

La descripción comprende una planta de maíz que comprende un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina nuclear de Cry1Da y un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina nuclear de Cry1 Fa y una semilla de dicha planta.

Una descripción adicional comprende una planta de maíz en la que el gen expresable en planta que codifica la proteína que contiene la toxina nuclear de Cry1Da y un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina nuclear de Cry1 Fa se han introducido en dicha planta de maíz y semilla de dicha planta.

Receptores de insectos. Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión de receptores competitivos usando la proteína de la toxina nuclear de Cry1Da radiomarcada muestran que la proteína de la toxina nuclear de Cry1Fa no compite por el sitio de unión de alta afinidad en tejidos de insecto FAW a los que Cry1Da se une. Estos resultados indican que la combinación de las proteínas Cry1Fa y Cry1Da es un medio eficaz para mitigar el desarrollo de la resistencia en poblaciones FAW frente a Cry1Fa (y de este modo, el desarrollo de la resistencia a Cry1Da), y que probablemente aumentaría el nivel de resistencia a esta plaga en plantas de maíz que expresen ambas proteínas.

De este modo, basándose en parte en los datos descritos en este documento y en otras partes, se cree que la coproducción (apilamiento) de las proteínas Cry1Ca y Cry1Fa puede usarse para producir una pila IRM de dosis alta para FAW. Se pueden agregar otras proteínas a esta combinación para ampliar el espectro de control del insecto. Por ejemplo, en el maíz, la adición de Cry1Ab crearía una pirámide iRm para controlar el taladro del maíz.

Otra opción de implementación sería utilizar las proteínas Cry1Fa y Cry1Da en combinación con otra, tercera toxina/gen, y utilizar esta triple pila para mitigar el desarrollo de la resistencia en FAW frente a cualquiera de estas toxinas. Por lo tanto, otra opción de implementación de la presente invención sería utilizar uno, dos, tres (o más) de estas proteínas en regiones de cultivo donde FAW puede desarrollar poblaciones resistentes. De acuerdo con esto, la presente invención se refiere también, en parte, a pilas triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, siendo las toxinas Cry1 Fa y Cry1 Da el par de bases.

Otra opción de implementación sería usar las proteínas Cry1Fa y Cry1Da en combinación con otra tercera toxina/gen, y usar esta pila triple para mitigar el desarrollo de resistencia en FAW a cualquiera de estas toxinas. Por lo tanto, otra opción de implementación de la presente invención sería utilizar una, dos o tres (o más) de estas proteínas en regiones de cultivo donde FAW puede desarrollar poblaciones resistentes. En consecuencia, la presente invención también se relaciona en parte con las pilas triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, siendo las toxinas Cry1Fa y Cry1Da el par de bases. Una pirámide preferida proporciona al menos dos proteínas que proporcionan una actividad no resistente a los cruces contra dos plagas: el FAW y el BCE (taladro del maíz; Ostrinia nubilalis): Cry1Fa más Cry1Da más uno o más toxinas ECB como Cry1Ab (véase el documento US 20080311096), ya que Cry1F es activa contra ambos insectos. Otras toxinas del BCE incluyen Cry1Be (véase el documento USSN 61/284.290; presentada el 16 de diciembre de 2009), Cryll (véase el documento uSs N 61/284.278; presentada el 16 de diciembre de 2009), Cry2Aa (véase el documento USSN 61/284.278; archivada el 16 de diciembre de 2009 ) y DIG-3 (véase el documento US 2010 00269223). En algunas realizaciones de pirámide preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres modos de acción separados contra FAW. Estas combinaciones de pirámides con "tres modos de acción" preferidas son Cry1Fa más Cry1D más otra toxina/gen seleccionado del grupo que consiste en Vip3Ab, Cry1C (véase el documento USSN 61/284.281; presentada el 16 de diciembre de 2009), Cry1Be y Cry1E (véase el documento USSN 61/284,278; presentada el 16 de diciembre de 2009). Las plantas (y la superficie sembrada con tales plantas) que producen estas tres toxinas están incluidas dentro del alcance de la presente invención. También se pueden agregar toxinas/genes adicionales, pero estas pilas triples particulares, según la presente invención, proporcionarían de manera ventajosa y sorprendente tres modos de acción contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requisito de la superficie de refugio. Un campo así plantado de más de 10 acres se incluye así dentro de la invención objeto.

Por lo tanto, CryIDa podría usarse como en la combinación de 3 genes para el maíz que actualmente se encuentra en el Desarrollo I del nuevo proceso de desarrollo de rasgos. Cry1Fa se encuentra en los productos Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. Por consiguiente, el uso de Cry1 Da podría ser significativo para reducir la presión de selección en otras proteínas comercializadas.

Otras toxinas Vip3, por ejemplo, se enumeran en el Apéndice A adjunto. Esos números de GENBANK también se pueden usar para obtener las secuencias de cualquiera de los genes y proteínas descritos o mencionados en este documento.

La patente de EE.UU. n°. 5.188.960 y la patente de EE.UU. n°. 5.827.514 describen proteínas que contienen la toxina nuclear Cry1Fa convenientes para su uso al llevar a cabo la presente invención. La patente EE.UU. n° 6.218.188 describe las secuencias de ADN optimizadas en plantas que codifican proteínas que contienen toxinas nucleares de Cry1Fa que son apropiadas para su uso en la presente invención.

Las combinaciones de las toxinas descritas en la presente invención se pueden usar para controlar plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, las mariposas y polillas, se alimentan principalmente del néctar de las flores y son un importante efector de polinización. Casi todas las larvas de lepidópteros, es decir, las orugas, se alimentan de plantas y muchas son plagas graves. Las orugas se alimentan del follaje, o dentro de éste, o en las raíces o el tallo de las plantas, privando a la planta de nutrientes y, a menudo, destruyendo la estructura física de la planta. Además, las orugas se alimentan de frutos, tejidos y granos y harinas almacenadas, arruinando estos productos para la venta o reduciendo gravemente su valor. Tal como se utiliza en la presente memoria, la referencia a las plagas de lepidópteros se refiere a varias etapas de la vida de la plaga, incluyendo las etapas larvarias.

Algunas toxinas quiméricas comprenden una porción completa de toxina nuclear N-terminal de una toxina Bt y, en algún punto más allá del extremo de la porción de toxina nuclear, la proteína tiene una transición a una secuencia heteróloga de protoxina. La porción de toxina N-terminal, activa desde el punto de vista insecticida, de una toxina Bt se denomina toxina "nuclear". La transición desde el segmento de la toxina nuclear al segmento de protoxina heteróloga puede producirse aproximadamente en la unión toxina/protoxina o, en alternativa, puede conservarse una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina nuclear), ocurriendo la transición a la protoxina heteróloga posteriormente.

Como ejemplo, una toxina quimérica es una porción de toxina de nuclear completa de Cry1Ca (aproximadamente los primeros 600 aminoácidos) y/o una protoxina heteróloga (desde el aminoácido 602 al extremo C).

La porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina se deriva de una toxina proteica Cry1Ab. Como segundo ejemplo, una segunda toxina quimérica tiene la porción completa de la toxina nuclear de Cry1Da (aminoácidos 1 a 619) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 620 al extremo C-terminal). La porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina se deriva de una toxina de la proteína Cry1Ab.

Cualquier persona experta en esta técnica apreciará que las toxinas Bt, incluso dentro de una cierta clase tal como Cry1F, variarán en cierta medida en longitud y en la ubicación precisa de la transición desde la porción de la toxina del núcleo a la porción de la protoxina. Típicamente, las toxinas Cry1Da y Cry1Fa tienen una longitud de aproximadamente 1150 a aproximadamente 1200 aminoácidos. La transición de la porción de toxina del núcleo a la porción de protoxina típicamente ocurrirá entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la extensión completa de esta porción de toxina nuclear N-terminal. De este modo, la toxina quimérica comprenderá al menos aproximadamente el 50% de toda la longitud de la proteína de la toxina de Cry1Fa Bt o al menos aproximadamente el 50% de toda la longitud de la proteína de la toxina de Cry1Da Bt. Ésta tendrá típicamente al menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la extensión total de la porción de protoxina de Cry1Ab se extiende desde el extremo de la porción de toxina de núcleo hasta el extremo C de la molécula.

Genes y toxinas. Los genes y las toxinas incluyen no sólo las secuencias de longitud completa descritas, sino también los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente ejemplificadas en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma actividad biológica, o esencialmente la misma, contra las plagas objetivo, como las toxinas reivindicadas.

Tal como se usa en el presente documento, los límites representan aproximadamente el 95% (Cry1Fa y Da), 78% (Cry1F y Cry1D), y 45% (Cry1) de identidad de secuencia, por "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62: 807-813. Estos cortes también se pueden aplicar a las toxinas del núcleo solamente (para las toxinas Cry1 F y Cry1 D ).

Es evidente para cualquier persona experta en esta técnica que los genes que codifican las toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos a través de varios medios. Los genes o las porciones de genes específicos ejemplificados en este documento pueden obtenerse a partir de los aislados depositados en un depósito de cultivo.

Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también pueden construirse sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Pueden construirse variaciones de genes fácilmente utilizando técnicas estándar para realizar mutaciones puntuales. Además, pueden hacerse fragmentos de estos genes utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles según procedimientos estándar. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente los nucleótidos desde los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también se pueden obtener usando una variedad de enzimas de restricción. Pueden usarse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas proteicas.

Se describen en este documento fragmentos y equivalentes que retienen la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificadas. Además, debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria. Está dentro de la habilidad de cualquier persona experta en la técnica crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas toxinas, o esencialmente las mismas. Como se usa en este documento, la referencia a la secuencia “esencialmente igual” se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan materialmente a la actividad pesticida. También se incluyen en esta definición fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen la actividad pesticida.

Un método adicional para identificar los genes que codifican las toxinas y partes de genes útiles de acuerdo con la presente invención es mediante el uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de un marcador apropiado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional No. Wo 93/16094. Como es bien conocido en la técnica, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando una fuerte unión entre las dos moléculas, puede suponerse razonablemente que la sonda y la muestra tengan una homología sustancial. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones rigurosas mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperaturas son los siguientes (en orden creciente de rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X S^s P^e o SSC a 42°C; 0,1X SSPE o SSC a 42°C; 0,1X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si ha ocurrido la hibridación. Tal análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican la toxina de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden usar como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.

Toxinas variantes. Ciertas toxinas se han ejemplificado específicamente en la presente memoria. Las toxinas equivalentes tendrán una homología de aminoácidos con una toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos será típicamente mayor que 75%, preferiblemente mayor que 90% y, más preferiblemente, mayor que 95%. La homología de aminoácidos será la mayor en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia, es la responsable de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden colocar en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las que un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido del mismo tipo están dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación, se muestra una lista de ejemplos de aminoácidos pertenecientes a cada clase.

En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no deben perjudicar significativamente a la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican las toxinas de la presente invención se pueden introducir en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión del gen de la toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción y el mantenimiento intracelular del plaguicida. La transferencia conjugada y la transferencia recombinante se pueden usar para crear una cepa Bt que exprese ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos huésped también pueden ser transformados con uno o ambos genes de la toxina usados entonces para lograr el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, donde proliferarán y se ingerirán. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que aloja el gen de la toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede aplicarse entonces al medio ambiente de la plaga objetivo.

Cuando el gen de la toxina Bt se introduce a través de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica al medio ambiente en un estado vivo, es esencial que se utilicen ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan huéspedes de microorganismos que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir exitosamente en el entorno particular (cultivo y otros hábitats de insecto) con los microorganismos naturalnaturales, proporcionar un mantenimiento estable y la expresión del gen que expresa el plaguicida polipeptídico, y, deseablemente, proporcionar una mejor protección del plaguicida frente a la degradación e inactivación del medio ambiente.

Se sabe que un gran número de microorganismos habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interés son los microorganismos, tales como las bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.

Está disponible una amplia variedad de métodos para introducir un gen Bt que codifique una toxina en un huésped de microorganismo en condiciones que permitan el mantenimiento estable y la expresión del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.135.867.

Tratamiento de las células. Bacillus thuringiensis o células recombinantes que expresan las toxinas Bt pueden tratarse para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se forma comprende la toxina Bt o toxinas dentro de una estructura celular que se ha estabilizado y protegerá la toxina cuando la microcápsula se aplique al entorno de la plaga objetivo. Las células huésped adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, podrían utilizarse organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, en los que las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un huésped mamífero. Como huéspedes de particular interés estarán los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como los hongos.

La célula normalmente estará intacta y estará sustancialmente en la forma proliferativa cuando se trata, en lugar de en forma de esporas, aunque en algunos casos pueden emplearse esporas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen de la toxina B.t., puede ser por medios químicos o físicos, o por una combinación de medios químicos y/o físicos, siempre y cuando la técnica no afecte negativamente a las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular de proteger la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son los agentes halogenantes, particularmente los halógenos del número atómico 17-80. Más particularmente, se puede usar yodo en condiciones suaves y durante un tiempo suficiente para conseguir los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehídos, tales como glutaraldehído; anti-infecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropilo y etanol; varios fijadores histológicos, tales como lugol yodo, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (véase: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se administra al medio huésped. Los ejemplos de medios físicos son la radiación de longitud de onda corta, tal como la radiación gamma y radiación X, congelación, irradiación UV, liofilización y similares. Los métodos para el tratamiento de células microbianas se describen en las Patentes de EE.UU. Números 4.695.455 y 4.695.462.

Las células generalmente tendrán una estabilidad estructural mejorada que aumentará la resistencia frente a las condiciones ambientales. Cuando el plaguicida está en una proforma, el método de tratamiento celular debe seleccionarse de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del plaguicida por el patógeno de la plaga objetivo. Por ejemplo, el formaldehído reticulará las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un plaguicida polipeptídico. El método de tratamiento debe retener al menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de particular interés en la selección de una célula huésped con fines de producción incluyen la facilidad de introducción del gen o genes B.t. en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficiencia de expresión, la estabilidad del plaguicida en el huésped y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para su uso como microcápsula de pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetado intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en ambientes acuosos; falta de toxicidad de los mamíferos; atractivo para las plagas por ingestión; facilidad de matar y fijar sin dañar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manipulación, economía, estabilidad al almacenamiento, y similares.

Crecimiento de células. El huésped celular que contiene el gen o genes B.t. insecticidas se puede cultivar en cualquier medio nutriente conveniente, en el que la construcción de ADN proporcione una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de manera que sustancialmente todas, o todas, las células retengan al gen B.t. Estas células pueden ser luego recuperadas de acuerdo con los procedimientos convencionales. Alternativamente, las células pueden ser tratadas antes de la recolección.

Las células B.t. que producen las toxinas de la invención se pueden cultivar usando técnicas de fermentación y medios de la técnica estándar. Una vez completado el ciclo de fermentación, las bacterias se pueden recolectar separando primero las esporas B.t. y los cristales del caldo de fermentación por medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y cristales B.t. recuperados se pueden formular en un polvo humectable, concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar el manejo y la aplicación de plagas particulares. Estas formulaciones y los procedimientos de aplicación son bien conocidos en la técnica.

Formulaciones. Se pueden aplicar al suelo gránulos de cebo formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados B.t. o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles a partir de los aislados B.t. descritos en este documento. El producto formulado también se puede aplicar como tratamiento de recubrimiento de semillas o de raíz o como tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo del cultivo. Los tratamientos de plantas y suelos de células B.t. se pueden emplear como polvos humectables, gránulos o polvos, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cascaras de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir aditivos de adherencia, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser acuosas o no acuosas y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como apreciaría cualquier experto en la materia, la concentración de pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o se usa directamente. El plaguicida estará presente en al menos 1% en peso y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de aproximadamente 1-95% en peso del plaguicida mientras que las formulaciones líquidas tendrán generalmente de aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán a aproximadamente 50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar al medio ambiente de la plaga de lepidópteros, por ejemplo, follaje o suelo, por vaporización, pulverización, aspersión o similares.

Transformación de plantas. Un huésped recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican proteínas de toxina Bt, como se describe en este documento, se pueden insertar en células vegetales usando una variedad de técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permita la selección de las células transformadas están disponibles para la preparación para la inserción de genes ajenos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de la toxina Bt puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, después se recogen y se lisan. Se recupera el plásmido. El análisis de secuencias, el análisis de restricción, la electroforesis y otros métodos bioquímicos y biológicos moleculares se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido o en otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces se debe unir como mínimo el borde derecho, aunque a menudo el borde derecho e izquierdo del T-ADN del plásmido Ti o Ri, como la región flanqueante de los genes a insertar. El uso de T-ADN para la transformación de células de planta ha sido ampliamente investigado y suficientemente descrito en el documento EP 120516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) y An et al., (1985), y está bien establecido en la técnica.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, éste es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador seleccionable que confiere la resistencia en las células vegetales transformadas a un biocida o un antibiótico, tal como Bialaphos, Kanamicina, G418, Bleomicina, o Higromicina, entre otros. Por lo tanto, el marcador empleado individualmente debería permitir la selección de células transformadas en lugar de células que no contienen el ADN insertado.

Se dispone de un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como otros métodos posibles. Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar tiene que ser clonado en plásmidos especiales, a saber, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri por recombinación de homólogos debido a secuencias que son homólogas a las secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en Agrobacteria. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse ellos mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador que están enmarcados por las regiones frontera derecha e izquierda del ADN-T. Pueden transformarse directamente en Agrobacteria (Holsters et al., 1978). El Agrobacterium usado como célula huésped comprende un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula de planta. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria así transformada se utiliza para la transformación de células de planta. Los explantes de plantas se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula de planta. Las plantas enteras pueden entonces regenerarse a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas pueden entonces ser ensayadas en cuanto a la presencia del ADN insertado. No se hacen demandas especiales de los plásmidos en el caso de la inyección y la electroporación. Es posible utilizar plásmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir el(los) rasgo(s) transformado(s) a las plantas progenie. Tales plantas pueden crecer de la manera normal y cruzarse con plantas que tengan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

Las plantas pueden ser transformadas con genes en los que se ha optimizado el uso de codones para plantas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.380.831. Aunque algunas toxinas truncadas se ejemplifican en la presente memoria, es bien conocido en la técnica de Bt que las toxinas de tipo 130 kDa (de longitud completa) tienen una mitad N-terminal que es la toxina nuclear y una mitad C-terminal que es la protoxina "cola". De este modo, se pueden usar "colas" apropiadas con toxinas truncadas/nucleares de la presente invención. Véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos N° 6.218.188 y la Patente de Estados Unidos N° 6.673.990. Además, se conocen en la técnica métodos para crear genes Bt sintéticos para su uso en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende genes expresables en una planta que codifican una proteína Cry1Fa, y que comprenden además un segundo gen expresable en planta que codifica una proteína Cry1Da.

La transferencia (o introgresión) del rasgo o de los rasgos determinados por Cry1Fa y Cry1Da en líneas de maíz endogámico puede lograrse mediante la reproducción recurrente por selección, por ejemplo, mediante retrocruzamiento. En este caso, un progenitor recurrente deseado se cruza primero con un donante endogámico (el progenitor no recurrente) que lleva el gen(es) apropiado(s) para los rasgos determinados por Cry1F y Cry1D. La progenie de este cruce se vuelve a acoplar entonces al progenitor recurrente seguido por la selección en la progenie resultante para el/los rasgo(s) deseado(s) a ser transferidos del progenitor no recurrente. Después de tres, preferiblemente cuatro, más preferiblemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el progenitor recurrente con selección para el/los rasgo(s) deseado(s), la progenie será heterocigótica para los loci que controlan el/los rasgo/s que se transfieren, pero será como el progenitor recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360 - 376).

Estrategias de Control de la Resistencia de Insectos (IRM). Roush et al., por ejemplo, describen las estrategias de dos toxinas, también llamadas "pirámides" o "pilas", para el control de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777 - 1786).

En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/ bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no B.t.) (una sección de cultivos no Bt/maíz) para su uso con cultivos transgénicos que producen una única proteína Bt activa contra plagas diana.

"Los requisitos estructurados específicos para los productos de maíz Bt (CrylAb o CrylF) protegidos por el barrenador del maíz son los siguientes:

Refugios estructurados: 20% de refugio de maíz Bt no Lepidóptero en el Cinturón de Maíz;

50% de refugio Bt no Lepidóptero en el Cinturón de Algodón

Bloques

Internos (es decir, dentro del campo Bt)

Externos (es decir, campos separados dentro de 1/2 milla (0,8 km) (1/4 de milla (0,4 km) si es posible) del campo Bt para maximizar el acoplamiento al azar)

Franjas en el campo

Las franjas deben tener al menos 4 filas de ancho (preferiblemente 6 filas) para reducir los efectos del movimiento larvario"

Además, la Asociación Nacional de Productores de Maíz, en su sitio web:

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

también proporciona una orientación similar con respecto a los requisitos de refugio. Por ejemplo:

"Requisitos del IRM del barrenador del maíz:

-Plantar al menos el 20% de sus acres de maíz a híbridos de refugio

-En las regiones productoras de algodón, el refugio debe ser del 50%

-Debe ser sembrado dentro de 1/2 milla (0,8 km) de los híbridos de refugio

-El refugio se puede plantar como franjas dentro del campo Bt; las franjas de refugio deben tener al menos 4 filas de ancho

-El refugio puede tratarse con plaguicidas convencionales sólo si se alcanzan los umbrales económicos para los insectos objetivo

-Los insecticidas pulverizables basados en Bt no se pueden usar en el maíz de refugio

-Debe plantarse un refugio adecuado en todas las fincas con maíz Bt"

Como lo indican Roush et al. (por ejemplo, en las columnas de la derecha de las páginas 1780 y 1784), el apilamiento o pirámide de dos proteínas diferentes, cada una eficaz contra las plagas diana y con poca o ninguna resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que, para una pila exitosa, un refugio de tamaño menor del 10% de refugio, puede proporcionar un control de la resistencia comparable a un 50% de refugio para un rasgo único (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actualmente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos requiere que se deposite significativamente menos refugio estructurado (generalmente 5%) de maíz no Bt que para productos de un solo rasgo (generalmente 20%).

Existen varias maneras de proporcionar los efectos IRM de un refugio, incluyendo varios patrones de siembra geométricos en los campos (como se mencionó anteriormente) y mezclas de semillas dentro de bolsa, como se describe más adelante por Roush et al. (supra) y la Patente de Estados Unidos N° 6.551.962.

Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, se pueden usar para las pilas o pirámides dobles o triples objeto. Para las pilas triples con tres modos de acción contra una única plaga objetivo, un objetivo sería cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Esto es particularmente cierto para la superficie comercial - de más de 10 acres (4,05 ha), por ejemplo.

Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención.

Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de la mezcla de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius.

A menos que se indique específicamente o se implique, los términos "un", "uno/a", y "el/ella" significan "al menos uno", tal como se utiliza en este documento.

Ejemplos

Ejemplo 1

Datos del bioensayo

CryIDa expresada en maíz transgénico (pDAS5163) brinda protección contra la alimentación del cogollero del maíz (FAW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). Los mismos eventos son más efectivos en el control de FAW que han desarrollado resistencia frente a Cry1Fa y son claramente superiores a las plantas de maíz que contienen el evento TC1507, que es posiblemente el rasgo de resistencia a insectos líder en la industria para el control de FAW.

También hemos demostrado que Cry1Fa (proteína de la cepa DR1649 de Pseudomonas fluorescens recombinante; plásmido pDAB1817) y Cry1Da (proteína de la cepa DC782 de Pseudomonas fluorescens recombinante) son eficaces para controlar el fAw en bioensayos de dieta artificial y que la potencia de la combinación es mayor que lo que se espera de sus potencias individuales.

Según los datos descritos anteriormente, la expresión conjunta de Cry1Da y Cry1Fa puede producir una pila de IRM de dosis alta para FAW, otras especies importantes de Spodoptera y, quizás, otras plagas de lepidópteros. Se pueden agregar otras proteínas a esta combinación para agregar espectro. Por ejemplo, en maíz, la adición de Cry1Ab crearía una pila IRM para el barrenador de maíz europeo (BCE), Ostrinia nubilalis (Hübner).

Como se muestra en la Figura 1, el daño (media en % del daño en la hoja SEM) a los segmentos de la hoja de maíz infestados con FAW (barras azules) o rFAW (barras de color púrpura). Todos los tratamientos precedidos por los números "5163" son segmentos de hojas de plantas transformadas con una construcción que contiene Cry1Da. Las plantas en las que no se detectó la expresión de Cry1Da se agrupan en el extremo izquierdo del gráfico. Las plantas en las que se detectó la expresión de Cry1Da se agrupan en el centro del gráfico. Los controles no transgénicos (es decir, negativos) están en el extremo derecho de la gráfica y se denominan "B104", "Hill" e "Isolina". Una línea endogámica comercial que contiene Cry1Fa es el primer tratamiento a la derecha (denominado "Herculex I") y tiene los mismos antecedentes genéticos que el control no transgénico denominado "Isolina".

Se creó una quimera de protoxina que consistía en la secuencia de codificación de la toxina límite escindida con tripsina de Cry1Da y la secuencia de codificación para la región de protoxina c-terminal de Cry1Ab y se diseñó en un casete de expresión capaz de dirigir la expresión en maíz (pDAS5163). El maíz se transformó utilizando Agrobacterium tumefacians y se identificaron los eventos que contenían la quimera Cry1Da/1Ab. Las secciones de las hojas de las plantas regeneradas se sometieron a un bioensayo con gusanos cogolleros del maíz naturales (FAW) o larvas de una población de cogolleros del maíz que fueron resistentes a Cry1Fa (rFAW). Las plantas transformadas con Cry1Da/1Ab redujeron la alimentación de FAW pero no fueron tan efectivas como la línea endogámica que contiene 2 copias de Cry1Fa (Figura 1). (Los eventos de Cry1Da probados fueron hemicigotos para el transgén, mientras que las líneas endogámicas convertidas fueron homocigotas para el evento TC1507). Por el contrario, los mismos eventos que contenían Cry1Da/1Ab fueron generalmente mucho más efectivos para reducir la alimentación de rFAW que las líneas endogámicas que contenían Cry1Fa (Figura 1).

La actividad insecticida de CrylFa (proteína de la cepa DR1649 de Pseudomonas fluorescens recombinante; plásmido pDAB 1817), Cry1Da (proteína de la cepa DC782 de P. fluorescens recombinante) y una combinación 1:1 (p:p) de 2 se probó en bioensayos estándar de dieta artificial utilizados para evaluar la potencia. Las estimaciones de potencia se realizaron utilizando el análisis LOGIT (JMP® 8.0, SAS Inc. 2008) que produjo estimaciones de LC⁵⁰ y límites superior e inferior (95%) para la LC⁵⁰. Se realizó una prueba de sinergismo utilizando el método descrito por Tabashnik (1992) mediante el cual se calcula el valor esperado de la potencia de una combinación utilizando las potencias de cada componente solo. Una combinación se considera sinérgica cuando el límite de confianza superior estimado de la combinación es inferior a la potencia esperada calculada. En el caso del cogollero del maíz (FAw ) y una población del cogollero del maíz que fue resistente a Cry1Fa (rFAW), los límites de confianza superiores para los LC⁵⁰ de la combinación fueron más bajos que las potencias estimadas (Tablas 1 y 2), lo que llevó a la conclusión de que la combinación de Cry1Fa y Cry1Da en estas 2 poblaciones es sinérgica.

Tabla 1. Estimaciones de potencia, límites superior e inferior del intervalo de confianza del 95% (LCL y UCL, respectivamente), para Cry1Fa, Cry1Da y la combinación 1:1 (p:p) de los 2 en el gusano cogollero del maíz natural (FAW), Spodoptera frugiperda. La última columna contiene el valor LC⁵⁰ esperado basado en la potencia de cada proteína sola usando la fórmula descrita por Tabashnik (1992). Tabashnik BE. Evaluación del sinergismo entre toxinas de Bacillus Thuringiensis. Applied Environmental Microbiology 58 [10], 3343-3346, 1992. Una combinación se considera sinérgica cuando el valor esperado es más alto que el límite de confianza superior para la combinación.

Tabla 2. Estimaciones de potencia, límites superior e inferior del intervalo de confianza del 95% (LCL y UCL, respectivamente), para Cry1Fa, Cry1Da y la combinación 1:1 (p:p) de los 2 en el gusano cogollero del maíz resistente a Cry1Fa (rFAW), Spodoptera frugiperda. La última columna contiene el valor LC⁵⁰ esperado basado en la potencia de cada proteína sola usando la fórmula descrita por Tabashnik (1992). Una combinación se considera sinérgica cuando el valor esperado es más alto que el límite de confianza superior para la combinación.

Ejemplo 2

RESUMEN DE DATOS DE UNIÓN

Los experimentos de unión competitiva realizados con Cry1Da marcado con 125I usando vesículas de microvellosidades epiteliales del intestino de los insectos (BBMV) aisladas de FAW se describen a continuación. Los resultados de estos experimentos demuestran que Cry1Da se une fuertemente a su receptor y que Cry1Fa no compite con Cry1Da por los sitios de unión. Si la resistencia a Cry1Da puede basarse en una mutación en el receptor observado en estos estudios, estos datos sugieren que Cry1Fa sería una buena herramienta de IRM para controlar estas poblaciones resistentes o mitigar el desarrollo de dicha resistencia. Los resultados de los bioensayos con FAW resistentes a Cry1Fa (rFAW) demuestran que Cry1Da es activo en esta población. Juntos, estos datos sugieren que Cry1Fa y Cry1Da podrían ser una pila IRM que mitige de manera efectiva el desarrollo de la resistencia a cualquiera de las proteínas insecticidas.

Los ensayos de unión del receptor muestran que 125I Cry1Da se une fuertemente a su(s) receptor(es) y puede eliminarse de manera efectiva mediante Cry1Da sin marcar. Ni Cry1Ab, Cry1Fa ni Cry1Be pueden competir con 125I Cry1Da a partir de su(s) sitio(s) receptor(es) en las BBMV de FAW, lo que indica que Cry1Da tiene un sitio de unión único en el intestino medio de FAW con el que Cry1Ab, Cry1F y Cry1Be no compiten. Dado que los rFAW son tan sensibles frente a Cry1Da como los FAW naturales, esto indica que el supuesto sitio del receptor que se altera en los insectos rFAW no es el sitio del receptor al que se une Cry1Da. Por lo tanto, Cry1Da es un excelente compañero de apilamiento para Cry1Fa ya que interactúa en un sitio diana diferente que es responsable para su actividad biológica.

Cuando se agregó 125I Cry1Da a las BBMV de FAW, solo Cry1Da no radiomarcado fue capaz de desplazar el 125I Cry1Da unido. La incapacidad de Cry1Fa, Cry1Ab y Cry1Be para desplazar el 125I Cry1Da unido de las BBMV indicó que en el intestino medio de FAW, Cry1Da unido a un sitio receptor único con el que Cry1Fa, Cry1Ab y Cry1Be no interactúan, incluso aunque las cuatro de estas diferentes toxinas Cry sean activas contra las larvas de FAW.

Ejemplo 3

Diseño de toxinas quiméricas que comprenden las toxinas nucleares Cry1 y protoxinas heterólogas

Toxinas quiméricas. Se han publicado anteriormente proteínas quiméricas que utilizan el dominio de la toxina nuclear de una toxina Cry fusionada con el segmento de protoxina de otra toxina Cry, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. No. 5593881 y la Patente de EE. UU. 5932209.

Las variantes de proteínas quiméricas Cry1Da de esta invención incluyen toxinas quiméricas que comprenden un segmento de toxina nuclear del extremo N-terminal derivado de una toxina insecticida Cry1Da fusionada con un segmento de protoxina de endotoxina delta heteróloga en algún punto pasado el extremo del segmento de toxina nuclear. La transición de la toxina del núcleo al segmento de protoxinas heterólogas puede ocurrir aproximadamente aproximadamente en la unión de la toxina del núcleo/protoxinas o, como alternativa, se puede retener una parte de la protoxina nativa (que se extiende más allá del segmento de la toxina del núcleo), con la transición a la protoxina heteróloga que se produce posteriormente. De manera diferente, los segmentos de toxina central y protoxina pueden comprender exactamente la secuencia de aminoácidos de las toxinas nativas de las que se derivan, o pueden incluir adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no disminuyen, y pueden mejorar, la función biológica de los segmentos cuando se fusionan entre sí.

Por ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención comprende un segmento de toxina nuclear derivado de Cry1Da y una protoxina heteróloga. En una realización preferida de la invención, el segmento de toxina del núcleo derivado de Cry1Da2 (594 aminoácidos) se fusiona con un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina derivado de una delta-endotoxina Cry1Ab (545 aminoácidos). La secuencia de 1139 aminoácidos de la proteína quimérica, denominada en este documento Cry1Da. Debe entenderse que otras fusiones quiméricas que comprenden variantes de toxina nuclear Cry1Da2 y protoxinas derivadas de Cry1Ab están dentro del alcance de esta invención.

Una segunda proteína quimérica de la invención comprende un segmento de toxina nuclear derivado de Cry1Fa (603 aminoácidos) fusionado a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina derivado de una delta-endotoxina Cry1Ab (545 aminoácidos). La secuencia de 1148 aminoácidos de la proteína quimérica, llamada en este documento Cry1Fa.

Ejemplo 4. Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas quiméricas y expresión en Pseudomonas

Se utilizaron métodos de clonación estándar [como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y las actualizaciones de los mismos] en la construcción del constructo de expresión de Pseudomonas fluorescens (Pf) pDOW2848 diseñado para producir una proteína quimérica Cry1Da de longitud completa. La producción de proteínas se realizó en la cepa MB214 de Pseudomonas fluorescens (un derivado de la cepa MB101; P. fluorescens biovar I), con una inserción de un operón lac modificado como se describe en la patente de EE. UU. No. 5169760. La estrategia de clonación básica implicó subclonar un fragmento de ADN que codificaba la proteína Cry1Da en vectores plásmidos, por lo que se coloca bajo el control de la expresión del promotor Ptac y el terminador rrnBTlT2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Uno de estos plásmidos se denominó pDOW2848 y el aislado MB214 que albergaba este plásmido se denominaba Dpfl50.

Análisis del crecimiento y expresión en matraces de agitación. La producción de la proteína Cry1Da para la caracterización y el ensayo biológico de insectos se realizó mediante la cepa Dpfl50 P. fluorescens cultivada en matraz de agitación. La producción de proteína Cry1Da conducida por el promotor Ptac se realizó como se ha descrito previamente en la patente de EE.UU. N° 5527883. Los detalles de las manipulaciones microbiológicas están disponibles en Squires et al., (2004), Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20060008877, Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20080193974 y Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20080058262. La expresión se indujo mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30°C con agitación. De los cultivos se tomaron muestras en el momento de la inducción y en varios momentos después de la inducción. La densidad celular se midió por la densidad óptica a 600 nm (OD⁶⁰⁰).

Fraccionamiento celular y análisis de SDS-PAGE de muestras en matraz de agitación. En cada tiempo de muestreo, la densidad celular de las muestras se ajustó a OD⁶⁰⁰ = 20 y se centrifugaron alícuotas de 1 ml a 14000 x g durante cinco minutos. Los sedimentos celulares se congelaron a -80°C. Se generaron fracciones solubles e insolubles de muestras de peletes de células en matraz de agitación congeladas utilizando la solución de extracción de proteínas bacterianas EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Cada sedimento celular se resuspendió en 1 ml de solución EasyLyse™ y se diluyó adicionalmente 1:4 en tampón de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisado se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4°C y el sobrenadante se recuperó como la fracción soluble. El sedimento (fracción insoluble) se resuspendió luego en un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS; Na²HPO⁴11,9 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las muestras se mezclaron 1:1 con 2X tampón de muestra Laemmli que contenía p-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra) y se hirvieron durante 5 minutos antes de cargarlas en los geles Criterion XT Bis-Tris al 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). La electroforesis se realizó en el tampón XT MOPS recomendado. Los geles se tiñeron con Bio-Safe Coomassie Stain según el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y se tomaron imágenes utilizando el sistema de imágenes Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Preparación de cuerpos de inclusión. Las preparaciones de los cuerpos de inclusión de la proteína Cry1Da (IB) se realizaron en células de fermentaciones de P. fluorescens que produjeron la proteína insecticida Bt insoluble, como se demostró mediante SDS-PAGE y MALDI-MS (espectrometría de masas con ionización/desorción por láser asistida por matriz). Los sedimentos de fermentación de P. fluorescens se descongelaron en un baño de agua a 37°C. Las células se resuspendieron a 25% p/v en tampón de lisis [Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, sal disódica EDTA 20 mM (ácido etilendiaminotetraacético), Triton X-100 al 1% y ditiotreitol 5 mM (DTT); se agregaron 5 ml/l de cóctel inhibidor de la proteasa bacteriana (número de catálogo P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) justo antes de su uso]. Las células se suspendieron utilizando un homogeneizador manual en el ajuste más bajo (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se añadió lisozima (25 mg de Sigma L7651, de clara de huevo de gallina) a la suspensión celular mezclando con una espátula de metal, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió en hielo durante 15 minutos, luego se sonicó utilizando un Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1 minuto, a 50% de ciclo de trabajo, 30% de salida). La lisis celular se verificó mediante microscopía. Si fuera necesario, se agregaron 25 mg adicionales de lisozima, y se repitieron la incubación y la sonicación. Tras la confirmación de la lisis celular mediante microscopía, el lisado se centrifugó a 11.500 x g durante 25 minutos (4°C) para formar el sedimento de IB, y se descartó el sobrenadante. El sedimento de IB se resuspendió con 100 ml de tampón de lisis, se homogeneizó con el mezclador manual y se centrifugó como anteriormente. El sedimento de IB se lavó repetidamente por resuspensión (en 50 ml de tampón de lisis), homogeneización, sonicación y centrifugación hasta que el sobrenadante se volvió incoloro y el sedimento de IB se volvió firme y de color blanquecino. Para el lavado final, el sedimento de IB se resuspendió en agua destilada filtrada estéril (0,22 pl) que contenía EDTA 2 mM y se centrifugó. El sedimento final se resuspendió en agua destilada filtrada estéril que contenía EDTA 2 mM y se almacenó en alícuotas de 1 ml a -80°C.

El análisis de SDS-PAGE y la cuantificación de la proteína en preparaciones de IB se realizó descongelando una parte alícuota de 1 ml de pelete de IB y diluyendo 1:20 con agua destilada filtrada estéril. La muestra diluida se hirvió luego con tampón de muestra reductor 4X [Tris 250 mM, pH 6,8, glicerol al 40% (v/v), azul de bromofenol al 0,4% (p/v), SDS al 8% (p/v) y p-mercaptoetanol al 8% (v/v)] y se cargó en un Novex® 4-20% Tris-Glicina, 12 2 pocillos en gel (Invitrogen) ejecutado con tampón IX Tris/Glicina/SDS (BioRad). El gel se pasó durante 60 minutos a 200 voltios, luego se tiñó con azul de Coomassie (50% G-250/50% R-250 en 45% metanol, 10% de ácido acético) y se destiñó con 7% de ácido acético, 5% de metanol en agua destilada. La cuantificación de las bandas objetivo se realizó comparando los valores densitométricos de las bandas frente a las muestras estándar de albúmina de suero bovino (BSA) que se ejecutaron en el mismo gel para generar una curva estándar.

Solubilización de cuerpos de inclusión. Se centrifugaron seis ml de suspensión de cuerpos de inclusión Cry1Da del clon Pf DPf150 en el ajuste más alto de una microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para sedimentar las inclusiones. El sobrenadante del tampón de almacenamiento se eliminó y se reemplazó con 25 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM, pH 11, en un tubo cónico de 50 ml. Las inclusiones se resuspendieron usando una pipeta y se agitaron para mezclarlas completamente. El tubo se colocó en una plataforma de oscilación suave a 4°C durante la noche para extraer la proteína objetivo. El extracto se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos a 4°C, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (30.000 de corte de peso molecular; Millipore). El tampón de muestra se cambió luego a CAPS 10 mM [ácido 3-(ciclohexamino)1-propanosulfónico] pH 10 utilizando columnas desechables PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Solubilización y activación con tripsina de la proteína del cuerpo de inclusión. En algunos casos, la suspensión de los cuerpos de inclusión Cry1Da del clon Pfl DPfl50 se centrifugó en el ajuste más alto de una microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para sedimentar las inclusiones. El sobrenadante del tampón de almacenamiento se eliminó y se reemplazó con CAPS 100 mM, pH 11, para proporcionar una concentración de proteína de aproximadamente 50 mg/ml. El tubo se agitó a temperatura ambiente durante tres horas para solubilizar completamente la proteína. Se añadió tripsina en una cantidad igual del 5% al 10% (p:p, basado en el peso inicial del polvo IB) y la digestión se realizó mediante incubación mientras se agitaba durante la noche a 4°C o agitando de 90 a 120 minutos a temperatura ambiente. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio aniónico MonoQ (10 mm por 10 cm). La proteína Cry1Da activada se eluyó (según lo determinado por SDS-PAGE, ver más abajo) mediante un gradiente de NaCl 1 M de 0% a 100% en 25 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y, cuando fue necesario, se concentraron a menos de 10 ml utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 como anteriormente. El material se pasó luego a través de una columna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) en un tampón que contenía NaCl 100 mM, glicerol al 10%, Tween-20 al 0,5% y EDTA 1 mM. Se determinó mediante análisis de SDS-PAGE que la proteína activada (truncada enzimáticamente) eluye de 65 a 70 ml. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y se concentraron usando el concentrador centrífugo como se indicó anteriormente.

Electroforesis en gel. Las preparaciones de proteínas concentradas se prepararon para realizar la electroforesis diluyendo 1:50 en tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía DTT 5 mM como agente reductor y se calentó a 95°C durante 4 minutos. La muestra se cargó en carriles duplicados de un gel NuPAGE® al 4-12% junto con cinco estándares BSA que iban desde 0,2 pg a 2 pg/carril (para la generación de curvas estándar). El voltaje se aplicó a 200 V utilizando el tampón de ejecución MOPS SDS (Invitrogen) hasta que el tinte de rastreo alcanzó la parte inferior del gel. El gel se tiñó con un 0,2% de Coomassie Blue G-250 en un 45% de metanol, un 10% de ácido acético y se eliminó, primero brevemente con un 45% de metanol, un 10% de ácido acético, y luego con un 7% de ácido acético, un 5% de metanol hasta que el fondo se aclare. Después de destintar, el gel fue escaneado con un Multilmager BioRad Fluor-S. El software Quantity One v.4.5.2 del instrumento se usó para obtener volúmenes sustraídos de la línea de fondo de las bandas de proteína teñidas y para generar la curva estándar de BSA que se usó para calcular la concentración de proteína Cry1Da quimérica en la solución madre.

Ejemplo 5

Preparación de las proteínas de la toxina del núcleo Cry1Fa y Cry1Da y aislamiento de las vesículas de membrana con borde en cepillo Spodoptera frugiperda para experimentos de unión competitiva

Los siguientes ejemplos evalúan la unión competitiva de las proteínas de la toxina del núcleo Cry 1 a los receptores putativos en los tejidos del intestino del insecto. Se muestra que la proteína toxina Cry1Da marcada con 1251 se une con alta afinidad a las vesículas de microvellosidades epiteliales del intestino de los insectos (BBMV) preparadas a partir de Spodoptera frugiperda (gusano cogollero del maíz) y que la proteína de la toxina nuclear Cry1 Fa no compite con esta unión.

Purificación de las proteínas Cry. Un gen que codifica una proteína Cry1Da quimérica se expresó en la cepa de expresión de Pseudomonas fluorescens como se describe en el Ejemplo 4. De manera similar, un gen que codificaba una proteína quimérica que comprendía la toxina nuclear Cry1Fa (603 aminoácidos) y la protoxina Cry1Ab (545 aminoácidos) se expresó en el sistema Pf. En el caso de Cry1Fa, el plásmido de expresión se denominó pDAB1817 y la cepa de P. fluorescens que albergaba pDAB 1817 se denominó DPfl29. Las proteínas se purificaron mediante los métodos del Ejemplo 4, y luego se realizó la digestión con tripsina para producir toxinas nucleares activadas a partir de las proteínas de longitud completa, y los productos se purificaron mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4. Las preparaciones de las proteínas procesadas con tripsina (toxina del núcleo activada) tenían una pureza > 95% y tenían un peso molecular de aproximadamente 65 kDa, según lo determinado experimentalmente por SDS-PAGE. Como se usa en el presente documento, la toxina nuclear activada preparada a partir de la proteína Cry1Da se denomina proteína toxina nuclear Cry1Da, y la toxina nuclear activada preparada a partir de la proteína Cry1 Fa se denomina proteína toxina nuclear Cry1 Fa.

Preparación y fraccionamiento de BBMV solubilizadas. Se emplearon métodos estándar de cuantificación de proteínas y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida como se muestra, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y Ausubel (1995) y sus actualizaciones. Se mantuvieron larvas de S. frugiperda de último estadio en ayunas durante la noche y luego se diseccionaron después de enfriarlas en hielo durante 15 minutos. El tejido del intestino medio se retiró de la cavidad corporal, dejando atrás el intestino posterior unido al tegumento. El intestino medio se colocó en un volumen 9X de tampón de homogeneización enfriado con hielo (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, Tris base 17 mM, pH 7,5), suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich P-2714) diluido según lo recomendado por el proveedor. El tejido se homogeneizó con 15 golpes de un homogeneizador de tejido de vidrio. Las BBMV se prepararon mediante el método de precipitación con MgCl² de Wolfersberger (1993). Brevemente, se mezcló un volumen igual de una solución de MgCl² 24 mM en manitol 300 mM con el homogeneizado de intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar en hielo durante 15 minutos. La solución se centrifugó a 2.500 x g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se guardó y el sedimento se suspendió en el volumen original de tampón de homogeneización diluido 0,5X y se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron y se centrifugaron a 27.000 x g durante 30 minutos a 4°C para formar la fracción de BBMV. El sedimento se suspendió en tampón de almacenamiento BBMV (HEPES 10 mM, KCl 130 mM, glicerol al 10%, pH 7,4) hasta una concentración de aproximadamente 3 mg/ml de proteína. La concentración de proteína se determinó utilizando Albúmina Bovina de Suero (BSA) como estándar.

La determinación de la fosfatasa alcalina (una enzima marcadora para la fracción BBMV) se realizó antes de congelar las muestras utilizando el kit de ensayo de fosfatasa alcalina QuantiChrom™ DALP-250 (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima generalmente aumentó 7 veces en comparación con la que se encuentra en la fracción inicial de homogeneizado del intestino medio. Las BBMV se dividieron en partes alícuotas en muestras de 250 pl, se congelaron instantáneamente en N² líquido y se almacenaron a -80°C.

Electroforesis. El análisis de proteínas mediante SDS-PAGE se realizó bajo condiciones de reducción (es decir, en 5% de mercaptoetanol, BME) y desnaturalización (es decir, se calentó durante 5 minutos a 90°C en presencia de SDS al 4%). Las proteínas se cargaron en los pocillos de un gel de poliacrilamida de tris-glicina del 4% al 20% (BioRad; Hercules, CA) y se separaron a 200 voltios durante 60 minutos. Las bandas de proteínas se detectaron mediante tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250 (BioRad) durante una hora y se destiñeron con una solución de metanol al 5% en ácido acético al 7%. Se tomaron imágenes de los geles y se analizaron con un BioRad Fluoro-S Multi Imager™. Los pesos moleculares relativos de las bandas de proteína se determinaron por comparación con las movilidades de las proteínas de peso molecular conocido observadas en una muestra de BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) cargadas en un pocillo del gel.

Yodación de la proteína de la toxina del núcleo Cry1Da. La proteína de la toxina nuclear Cry1Da purificada se yodó utilizando perlas de yodación Pierce (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Brevemente, dos perlas de yodación se lavaron dos veces con 500 pl de PBS (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5) y se colocaron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml con 100 pl de PBS. Se agregaron 0,5 mCi de yoduro de sodio marcado con 125I, los componentes se dejaron reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregaron 1 pg de proteína de toxina nuclear Cry1Da a la solución y se dejó reaccionar durante 3 a 5 minutos más. La reacción se terminó pipeteando la solución a partir de las perlas de yodación y aplicándola a una columna de centrifugación Zeba™ (Invitrogen) equilibrada en CAPS 50 mM, pH 10,0, DTT 1 mM (ditiotreitol), EDTA 1 mM y glicerol al 5%. Las perlas de yodación se lavaron dos veces con 10 pl de PBS y la solución de lavado también se aplicó a la columna de desalación Zeba™. La solución radiactiva se eluyó a través de la columna de centrifugación mediante centrifugación a 1.000 x g durante 2 min. La proteína toxina nuclear Cry1Da radiomarcada con 125I se dializó luego contra CAPS 50 mM, pH 10,0, DTT 1 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 5%.

Imágenes. Se determinó la radio-pureza de la proteína toxina nuclear Cry yodada mediante SDS-PAGE y un generador de imágenes de fósforo. Brevemente, se secaron geles de SDS-PAG^e usando un aparato de secado de gel BioRad siguiendo las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de los geles secos envolviendo los geles en una película de Mylar (12 pm de espesor), y exponiéndolos a una criba de fósforo de almacenamiento de Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. Las placas se desarrollaron utilizando un generador de imágenes de fósforo Molecular Dynamics Storm 820 y la imagen se analizó con el software ImageQuant™.

Ejemplo 6

Unión de la proteína de la toxina nuclear Cry1 marcada con 125I a las BBMV de Spodoptera frugiperda

Se generó una curva de saturación para determinar la cantidad óptima de proteína BBMV para usar en los ensayos de unión con las proteínas de la toxina nuclear Cry1Da y Cry1Fa. Se incubaron 0,5 nM de la proteína de la toxina nuclear Cry1 radiomarcada con 125I durante 1 hora a 28°C en tampón de unión (NaHPÜ⁴8 mM, KH²PO⁴2 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1%, pH 7,4) con cantidades de proteína BBMV que variaban de 0 pg/mL a 500 pg/mL (volumen total de 0,5 mL). La proteína toxina nuclear Cry1 marcada con 125I unida a las proteínas BBMV se separó de la fracción no unida mediante el muestreo de 150 pl de la mezcla de reacción por triplicado en tubos de centrífuga de 1,5 ml separados y centrifugando las muestras a 14.000 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó suavemente y el sedimento se lavó tres veces con tampón de unión helado. La parte inferior del tubo de centrífuga que contenía el sedimento se cortó, se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm y las muestras se contaron durante 5 minutos cada una en el contador gamma. Se representaron los CPM (conteos por minuto) obtenidos menos los CPM de fondo (reacción sin proteína BBMV) frente a la concentración de proteína BBMV. De acuerdo con los resultados mostrados por otros (Luo et al., 1999), se determinó que la concentración óptima de proteína BBMV para usar en los ensayos de unión era de 150 pg/ml.

Ejemplo 7

Ensayos de unión competitiva frente a BBMV de S. flugiperda con proteínas de toxina de núcleo de Cry1Da y Cry1Fa

Se llevaron a cabo ensayos de unión competitiva homóloga y heteróloga utilizando 150 pg/ml de proteína BBMV de S. frugiperda y 0,5 nM de la proteína de toxina del núcleo de Cry1Da radiomarcada con 125I. Las concentraciones de la proteína de toxina central Cry1Fa no radiomarcada competitiva agregadas a la mezcla de reacción variaron de 0,045 nM a 1000 nM y se agregaron al mismo tiempo que la proteína de la toxina nuclear de Cr1Da radiactiva, para asegurar una verdadera competición de unión. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 1 hora a 28°C y la cantidad de proteína marcada con la toxina del núcleo de Cr1Da marcada en 125I unida al BBMV (unión específica) se midió como se describió anteriormente. La unión no específica se representó por los recuentos obtenidos en presencia de 1.000 nM de proteína de toxina nuclear de Cr1Da no radiomarcada. Se consideró que la unión total al cien por ciento era la cantidad de unión en ausencia de cualquier proteína competidora de toxina Cry1Fa.

Los ensayos de unión al receptor que utilizan la proteína de la toxina del núcleo de Cry1Da marcada con 125I determinaron la capacidad de la proteína de la toxina del núcleo Cry1Fa para desplazar este ligando radiomarcado de su sitio de unión en los BBMV de S. frugiperda. Los resultados muestran que la proteína de la toxina del núcleo Cry1Fa no desplazaba la proteína de la toxina del núcleo de la Cr1Da marcada con 125I unida a su proteína o proteínas receptoras a concentraciones tan altas como 1000 nM (2000 veces la concentración del ligando de unión radiactivo). Como se esperaba, la proteína de toxina central de Cry1Da no marcada fue capaz de desplazar la proteína de toxina nuclear de Cry1Da radiomarcada de su(s) proteína(s) de unión, mostrando una curva de respuesta a la dosis sigmoidal con un desplazamiento del 50% a 5 nM.

Por lo tanto, se indica que la proteína de la toxina del núcleo de Cry1Da interactúa con un sitio de unión en BBMV de S. frugiperda que no se une a la proteína de la toxina del núcleo de Cry1 Fa.

Lista de referencias

Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England.

Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, and M. J. Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001.

LeOra Software. 1987. POLO-PC. A user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA.

McGaughey, W. H., F. Gould, and W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146.

1998

Margon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, and B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hiibner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280—285.

Robertson, L.J. and H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL.

SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Release 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC.

Stone, B.F. 1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to Chemicals. Bull. WHO 38:325—329.

Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie, and H. Joos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499[400246], 57­ 19901205. EP. 5-31-1989Apéndice A

Lista de delta-endotoxinas - del sitio web de Crickmore et al. (citado en la solicitud)

El número de entrada es la entrada NCBI

Nombre N°. entrada Autores Año Cepa fuente Comentario Cry1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstaki HD1

Cry1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto

Cry1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7

Cry1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus

Cry1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7

Cry1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12

Cry1Aa8 I26149 Liu 1996 Solo la secuencia de ADN Cry1Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 Bt dendrolimus

T84A1

Cry1Aa10 AAD55382 Hou and Chen 1999 Bt kurstaki HD-1-02

Cry1Aa11 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki

Cry1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30

Cry1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto

Cry1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 no publicado

Cry1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt INTA Mol-12

Cry1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715

Cry1Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki

Cry1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715

Cry1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1

Cry1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7

Cry1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 Bt aizawai HD133

Cry1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1

Cry1Ab11 I12419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Solo la secuencia de ADN Cry1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93

Cry1Ab13 AAN76494 Tan et al 2002 Bt c005

Cry1Ab14 AAG16877 Meza-Basso & 2000 Native Chilean Bt

Theoduloz

Cry1Ab15 AAO13302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16

Cry1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-11

Cry1Ab17 AAT46415 Huang et al 2004 Bt WB9

Cry1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt

Cry1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2

Cry1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008

Cry1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 BtIS5056

Cry1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab

Cry1Ab-like AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 secuencia incierta Cry1Ab-like AAK14337 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 secuencia incierta Cry1Ab-like AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 secuencia incierta Cry1Ab-like ABG88858 Lin et al 2006 Bt ly4a3 secuencia insuficiente Cry1Ac1 AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae

Cry1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A

Cry1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A1

Cry1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 Bt kurstaki PS81GG

Cry1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12

Cry1Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac8 AAC44841 Omolo et al 1997 Bt kurstaki HD73

Cry1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732

Cry1Ac10 CAA05505 Sun 1997 Bt kurstaki YBT-1520

Cry1Ac11 CAA10270 Makhdoom & 1998

Riazuddin

Cry1Ac12 I12418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Solo la secuencia de ADN Cry1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1

Cry1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30

Cry1Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt de Taiwan

Cry1Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3

Cry1Ac17 AAX18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549

Cry1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729

Cry1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33

Cry1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005

Cry1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA Mol-12

Cry1Ac22 ABZ01836 Zhang & Fang 2008 Bt WO5-1

Cry1Ac23 CAQ30431 Kashyap et al 2008 Bt

Cry1Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01

Cry1Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry1Ac26 FJ617446 Guan Peng et al 2009 Bt Tm41-4 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry1Ac27 FJ617447 Guan Peng et al 2009 Bt Tm44-1B Sin enlace NCBI Julio 09 Cry1Ac28 ACM90319 Li et al 2009 Bt Q-12

Cry1Ad1 AAA22340 Feitelson 1993 Bt aizawai PS811

Cry1Ad2 CAA01880 Anonymous 1995 Bt PS81RR1

Cry1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti

Cry1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423

Cry1Ag1 AAD46137 Mustafa 1999

Cry1Ah1 AAQ14326 Tan et al 2000

Cry1Ah2 ABB76664 Qi et al 2005 Bt alesti

Cry1Ai1 AAO39719 Wang et al 2002

Cry1A-tipo AAK14339 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3 secuencia incierta Cry1Ba1 CAA29898 Brizzard & Whiteley 1988 Bt thuringiensis

HD2

Cry1Ba2 CAA65003 Soetaert 1996 Bt entomocidus

HD110

Cry1Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001

Cry1Ba4 AAK51084 Nathan et al 2001 Bt entomocidus

HD9

Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12

Cry1Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bt S601

Cry1Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847

Cry1Bc1 CAA86568 Bishop et al 1994 Bt morrisoni

Cry1Bd1 AAD10292 Kuo et al 2000 Bt wuhanensis

HD525

Cry1Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt 834

Cry1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 Bt PS158C2

Cry1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003

Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 CrylBfl CAC50778 Arnaut et al 2001

Cry1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003

Cry1Bg1 AAO39720 Wang et al 2002

Cry1Ca1 CAA30396 Honee et al 1988 Bt entomocidus

60.5

Cry1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Bt aizawai 7.29

Cry1Ca3 AAA22343 Feitelson 1993 Bt aizawai PS811

Cry1Ca4 CAA01886 Van Mellaert et al 1990 Bt entomocidus

HD110

Cry1Ca5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29

Cry1Ca6 AAF37224 Yu et al 2000 Bt AF-2

Cry1Ca7 AAG50438 Aixing et al 2000 Bt J8

Cry1Ca8 AAM00264 Chen et al 2001 Bt c002

Cry1Ca9 AAL79362 Kao et al 2003 Bt G10-01A

Cry1Ca10 AAN16462 Lin et al 2003 Bt E05-20a

Cry1Ca11 AAX53094 Cai et al 2005 Bt C-33

Cry1Cb1 M97880 Kalman et al 1993 Bt galleriae HD29 Solo la secuencia de ADN Cry1Cb2 AAG35409 Song et al 2000 Bt c001

Cry1Cb3 ACD50894 Huang et al 2008 Bt 087

Cry1Cb-like AAX63901 Thammasittirong et 2005 Bt TA476-1 secuencia

al insuficiente Cry1Da1 CAA38099 Hofte et al 1990 Bt aizawai HD68

Cry1Da2 176415 Payne & Sick 1997 Solo la secuencia de ADN Cry1Db1 CAA80234 Lambert 1993 Bt BTS00349A

Cry1Db2 AAK48937 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry1Dc1 ABK35074 Lertwiriyawong et al 2006 BtJC291

Cry1Ea1 CAA37933 Visser et al 1990 Bt kenyae 4F1

Cry1Ea2 Ea2 CAA39609 Bosse et al 1990 Bt kenyae

Cry1Ea3 AAA22345 Feitelson 1991 Bt kenyae PS81F

Cry1Ea4 AAD04732 Barboza-Corona et 1998 Bt kenyae LBIT-147

al

Cry1Ea5 A15535 Botterman et al 1994 Solo la secuencia de ADN Cry1Ea6 AAL50330 Sun et al 1999 Bt YBT-032

Cry1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 BtJC190

Cry1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2

Cry1Eb1 AAA22346 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81A2

CrylFal AAA22348 Chambers et al 1991 Bt aizawai EG6346

Cry1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Bt aizawai PS811

CrylFbl CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A

Cry1Fb2 BAA25298 Masuda & Asano 1998 Bt morrisoni INA67

Cry1Fb3 AAF21767 Song et al 1998 Bt morrisoni

Cry1Fb4 AAC10641 Payne et al 1997

Cry1Fb5 AAO13295 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt 012

Cry1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087

Cry1Ga1 CAA80233 Lambert 1993 Bt BTS0349A

Cry1Ga 2 CAA70506 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis

Cry1Gb1 AAD10291 Kuo & Chak 1999 Bt wuhanensis

HD525

Cry1Gb2 AAO13756 Li et al 2000 Bt B-Pr-88

Cry1Gc AAQ52381 Baum et al 2003

Cry1Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA

Cry1Hb1 AAA79694 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190

Cry1 H-like AAF01213 Srifah et al 1999 Bt JC291 secuencia insuficiente Cry1Ia1 CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki

Cry1 Ia2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki

Cry1 Ia3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1

Cry1Ia4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88

Cry1 Ia5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61

Cry1 Ia6 AAC26910 Zhong et al 1998 Bt kurstaki S101

Cry1 Ia7 AAM73516 Porcar et al 2000 Bt

Cry1Ia8 AAK66742 Song et al 2001

Cry1Ia9 AAQ08616 Yao et al 2002 Bt Ly30

Cry1Ia10 AAP86782 Espindola et al 2003 Bt thuringiensis

Cry1Ia11 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3

Cry1 Ia12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt

Cry1 Ia13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt

Cry1Ia14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt11

Cry1 Ia15 FJ617445 Guan Peng et al 2009 Bt E-1B Sin enlace NCBI Julio 2009 Cry1 Ia16 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1A Sin enlace NCBI Julio 2009 Cry1 Ib1 AAA82114 Shin et al 1995 Bt entomocidus

BP465

Cry1Ib2 ABW88019 Guan et al 2007 BtPP61

Cry1Ib3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8

CrylIcl AAC62933 Osman et al 1998 Bt C18

Cry1 Ic2 AAE71691 Osman et al 2001

Cry1 Id 1 AAD44366 Choi 2000

CrylIel AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007

Cry1 If1 AAQ52382 Baum et al 2003

Cry1 I-like AAC31094 Payne et al 1998 secuencia insuficiente Cry1 I-like ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt ly4a3 secuencia insuficiente Cry1Ja1 AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847

Cry1Jb1 AAA98959 Von Tersch & 1994 Bt EG5092

Gonzalez

Cry1Jc1 AAC31092 Payne et al 1998

Cry1Jc2 AAQ52372 Baum et al 2003

Cry1Jd1 CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt

Cry1Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190

Cry1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1

Cry1 -like AAC31091 Payne et al 1998 secuencia insuficiente Cry2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki

Cry2Aa2 AAA83516 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1

Cry2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Solo la secuencia de ADN Cry2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 Bt kenyae HD549

Cry2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39

Cry2Aa6 CAA10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71

Cry2Aa7 CAA10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29

Cry2Aa8 AAO13734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66

Cry2Aa9 AAO13750 Zhang et al 2000

Cry2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001

Cry2Aa11 AAQ52384 Baum et al 2003

Cry2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39

Crv2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 But 146-158-01

Cry2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550

Cry2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1

Cry2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1

Cry2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002

Cry2Ab4 AAO13296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt ly30

Cry2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7

Cry2Ab7 AAZ66347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1

Cry2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2

Cry2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6

Cry2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD

Cry2Ab11 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1

Cry2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD

Cry2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4

Cry2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts

Cry2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt shanghai S1

Cry2Ac2 AAG35410 Song et al 2000

Cry2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003

Cry2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9

Cry2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005

Cry2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis

Cry2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1

Cry2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1

Cry2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2

Cry2Ac10 ABN15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1

Cry2Ac11 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29

Cry2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3

Cry2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30

Cry2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10

Cry2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1)

Cry2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2

Cry2Ad5 CAO78739 Saleem et al 2007 Bt HD29

Cry2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003

Cry2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81

Cry2Ag ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2

Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 Cry2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3

Cry2Ai FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 Cry3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego

Cry3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis

Cry3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987

Cry3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis

Cry3Aa5 AAA50255 Donovan et al 1988 Bt morrisoni

EG2158

Cry3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis

Cry3Aa7 CAB41411 Zhang et al 1999 Bt 22

Cry3Aa8 AAS79487 Gao and Cai 2004 Bt YM-03

Cry3Aa9 AAWO659 Bulla and Candas 2004 Bt UTD-001

Cry3Aa10 AAU29411 Chen et al 2004 Bt 886

Cry3Aa11 AAW82872 Kurt et al 2005 Bt tenebrionis Mm2

Cry3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis

Cry3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolworthi 43F

Cry3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208

Cry3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961

Cry3Bb2 AAA74198 Donovan et al 1995 Bt EG5144

Cry3Bb3 I15475 Peferoen et al 1995 Solo la secuencia de ADN Cry3Ca1 CAA42469 Lambert et al 1992 Bt kurstaki BtI109P

Cry4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis

Cry4Aa2 BAA00179 Sen et al 1988 Bt israelensis

HD522

Cry4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry4A-like AAY96321 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 secuencia insuficiente Cry4Ba1 CAA30312 Chungjatpornchai et 1988 Bt israelensis 4Q2-al 72

Cry4Ba2 CAA30114 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis

Cry4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis

Cry4Ba4 BAA00178 Sen et al 1988 Bt israelensis

HD522

Cry4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry4Ba-like ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 secuencia insuficiente Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 Bt HS18-1 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin enlace NCBI Julio 09

Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Bt MC28 Sin enlace NCBI Julio 09

Cry5Aa1 AAA67694 Narva et al 1994 Bt darmstadiensis

PS17

Cry5Ab1 AAA67693 Narva et al 1991 Bt darmstadiensis

PS17

Cry5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Solo la secuencia de ADN

Cry5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366

Cry5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q3

Cry5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518

Cry6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1

Cry6Aa2 AAM46849 Bai et al 2001 YBT 1518

Cry6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 B t96418

Cry6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1

Cry7Aa1 AAA22351 Lambert et al 1992 Bt galleriae

PGSI245

Cry7Ab1 AAA21120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511

Cry7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 1994 Bt kumamotoensis

867

Cry7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9

Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Sin enlace NCBI Julio 09

Cry7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola et al 2008 Bt monterrey GM-33

Cry7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122

Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin enlace NCBI Sept 09

Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin enlace NCBI Nov 09

Cry7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis

Cry7Ca1 ABR67863 Gao et al 2007 Bt BTH-13

Cry7Da1 ACQ99547 Yi et al 2009 Bt LH-2

Cry8Aa1 AAA21117 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis

Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX Sin enlace NCBI Julio 09

Cry8Ba1 AAA21118 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis

Cry8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002

Cry8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002

Cry8Ca1 AAA21119 Sato et al. 1995 Bt japonensis

Buibui

Cry8Ca2 AAR98783 Shu et al 2004 Bt HBF-1

Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Bt FTL-23 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae

Cry8Da2 BD133574 Asano et al 2002 Bt Solo la secuencia de ADN Cry8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt Solo la secuencia de ADN Cry8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5

Cry8Ea1 AAQ73470 Fuping et al 2003 Bt 185

Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 Bt 185 también AAW81032 Cry8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18

Cry8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145

Cry8Ga3 FJ198072 Xiaodong et al 2008 Bt FCD114 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Ia1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Ja1 EU625348 Du et al 2008 Bt FPT-2 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Ka1 FJ422558 Quezado et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae

Cry8-like FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis Solo la secuencia de ADN

Cry8-like ABS53003 Mangena et al 2007 Bt

Cry9Aa1 CAA41122 Shevelev et al 1991 Bt galleriae

Cry9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517

Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2) Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Bt T03C001 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Aa like AAQ52376 al Baum et 2003 secuencia incompleta Cry9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae

Cry9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al 2004 Btjaponensis

Cry9Ca1 CAA85764 Lambert et al 1996 Bt tolworthi

Cry9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003

Cry9Da1 BAA 19948 Asano 1997 Bt japonensis N141

Cry9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis

Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019

Cry9Ea1 BAA34908 Midoh & Oyama 1998 Bt aizawai SSK-10

Cry9Ea2 AAO12908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16

Cry9Ea3 ABM21765 Lin et al 2006 Bt lyA

Cry9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4

Cry9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts

Cry9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 11

Cry9Ea7 FJ380927 Sun et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Ea8 GQ249292 Su et al 2009 GQ249292 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001

Cry9Eb2 GQ249298 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae

Cry9Ed1 AAX78440 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019

Cry9Ee1 GQ249296 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin enlace NCBI Aug 09

Cry9-like AAC63366 Wasano et al 1998 Bt galleriae secuencia insuficiente Cry10Aa1 AAA22614 Thorne et al 1986 Bt israelensis

Cry10Aa2 E00614 Aran & Toomasu 1996 Bt israelensis ONR- Solo la secuencia 60A de ADN Cry10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry10Alike DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9 secuencia incompleta Cry11Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis

Cry11Aa2 AAA22611 Adams et al 1989 Bt israelensis

Cry11Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis

Tipo Cry11Aa DQ166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9 secuencia incompleta Cry11Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367

Cry11Bb1 AAC97162 Orduz et al 1998 Bt medellin

Cry12Bb1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2

Cry13Bb1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B

Cry14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1

Cry15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni

Cry16Aa1 CAA63860 Barloy et al 1996 Cb malaysia CH18

Cry17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18

Cry18Aa1 CAA67506 Zhang et al 1997 Paenibacillus

popilliae

Cry18Ba1 AAF89667 Patel et al 1999 Paenibacillus

popilliae

Cry18Ca1 AAF89668 Patel et al 1999 Paenibacillus

popilliae

Cry19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367

Cry19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo

Cry20Aa1 AAB93476 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis

Cry20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976

Cry20-like GQ144333 Yi et al 2009 Bt Y-5 Solo la secuencia de ADN Cry21Aa1 I32932 Payne et al 1996 Solo la secuencia de ADN Cry21Aa2 I66477 Feitelson 1997 Solo la secuencia de ADN Cry21Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis

Cry22Aa1 I34547 Payne et al 1997 Solo la secuencia de ADN Cry22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt

Cry22Aa3 ACD93211 Du et al 2008 Bt FZ-4

Cry22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140

Cry22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt

Cry22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt

Cry23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Binario con Cry37Aa1 Cry24Ba1 AAC61891 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto

Cry24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41

Cry25Aa1 AAC61892 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry26Aa1 AAD25075 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1166

Cry27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo

Cry28Aa1 AAD24189 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1161

Cry28Aa2 AAG00235 Moore y Debro 2000 Bt finitimus

Cry29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin

Cry30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin

Cry30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus

Cry30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto

Cry30Ca2 ACU24781 Sun and Park 2009 Bt jegathesan 367

Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry30Db1 BAE80088 Kishida et al 2006 Bt aizawai BUN1-14

Cry30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 BtS2160-1

Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 Sin enlace NCBI July09 Cry30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28

Cry30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS 18-1

Cry31Aa1 BAB11757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-11

Cry31Aa2 AAL87458 Jung and Cote 2000 Bt M15

Cry31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195

Cry31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25

Cry31Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10

Cry31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195

Cry31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5

Cry31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29

Cry32Aa1 AAG36711 Balasubramanian et 2001 Bt yunnanensis

al

Cry32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt

Cry32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt

Cry32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt

Cry33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota

Cry34Aa1 AAG50341 Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binario con Cry35Aa1 Cry34Aa2 AAK64560 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binario con Cry35Aa2 Cry34Aa3 AAT29032 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binario con Cry35Aa3 Cry34Aa4 AAT29030 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binario con Cry35Aa4 Cry34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binario con Cry35Ab1 Cry34Ac1 AAG50118 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binario con Cry35Ac1 Cry34Ac2 AAK64562 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binario con Cry35Ab2 Cry34Ac3 AAT29029 Schnepf et al 2004 Bt KR1369 Binario con Cry35Ab3 Cry34Ba1 AAK64565 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binario con Cry35Ba1 Cry34Ba2 AAT29033 Schnepf et al 2004 Bt PS201L3 Binario con Cry35Ba2 Cry34Ba3 AAT29031 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2 Binario con Cry35Ba3 Cry35Aa1 AAG50342 Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binario con Cry34Aa1 Cry35Aa2 AAK64561 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binario con Cry34Aa2 Cry35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binario con Cry34Aa3 Cry35Aa4 AAT29025 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binario con Cry34Aa4 Cry35Ab1 AAG41672 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binario con Cry34Ab1 Cry35Ab2 AAK64563 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binario con Cry34Ac2 Cry35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Binario con Cry34Ab3 Cry35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binario con Cry34Ac1 Cry35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binario con Cry34Ba1 Cry35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 BtPS201L3 Binario con Cry34Ba2 Cry35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2 Binario con Cry34Ba3 Cry36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt

Cry37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Binario con Cry23Aa Cry38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt

Cry39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai

Cry40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai

Cry40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14

Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin enlace NCBI July09 Cry40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2

Cry41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry41Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry43Aa1 BAD15301 Yokoyama and 2003 P. lentimorbus

Tanaka semadara

Cry43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae

Cry43Ba1 BAD15303 Yokoyama and 2003 P. lentimorbus

Tanaka semadara

Cry43-like BAD15305 Yokoyama and 2003 P. lentimorbus

Tanaka semadara

Cry44Aa BAD08532 Ito et al 2004 Bt entomocidus

INA288

Cry45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22

Cry46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota

Cry46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470

Cry46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt

Cry47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890

Cry48Aa CAJ18351 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 Binario con 49Aa Cry48Aa2 CAJ86545 Jones and Berry 2006 Bs 47-6B Binario con 49Aa2 Cry48Aa3 CAJ86546 Jones y Berry 2006 Bs NHA15b Binario con 49Aa3 Crv48Ab CAJ86548 Jones y Berry 2006 Bs LP1G Binario con 49Ab1 Cry48Ab2 CAJ86549 Jones y Berry 2006 Bs2173 Binario con 49Aa4 Cry49Aa CAH56541 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 Binario con 48Aa Cry49Aa2 CAJ86541 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B Binario con 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones y Berry 2006 BsNHA15b Binario con 48Aa3 Cry49Aa4 CAJ86544 Jones y Berry 2006 Bs2173 Binario con 48Ab2 Cry49Ab1 CAJ86542 Jones y Berry 2006 Bs LP1G Binario con 48Ab1 Cry50Aa1 BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto

Cry51Aa1 ABI14444 Meng et al 2006 Bt F14-1

Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 Sin enlace NCBI July09 Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 Sin enlace NCBI July09 Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 Sin enlace NCBI July09 Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al 2008 Bt MC28 Sin enlace NCBI July09 Cry54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt MC28

Cry55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518

Cry55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41

Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin enlace NCBI July09 Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 Sin enlace NCBI Aug09 Cry57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim

Cry58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus Cry59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una planta o célula vegetal transgénica que comprende ADN que codifica y expresa una proteína insecticida CryIDa y ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1 Fa.

2. La semilla de una planta de la reivindicación 1, en la que dicha semilla comprende ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cr1Da y ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1Fa.

3. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 2 que comprenden ADN que codifica y expresa una proteína insecticida de Cr1Da y ADN que codifica y expresa una proteína insecticida de Cry1Fa, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 40% de todas las semillas en la mezcla.

4. Un método para controlar el desarrollo de la resistencia a toxinas Cry por un insecto, comprendiendo dicho método plantar semillas que comprenden ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1Da y ADN que codifica y expresa una proteína insecticida Cry1 Fa para producir un campo de plantas.

5. La planta transgénica de la reivindicación 1, comprendiendo dicha planta además un ADN que codifica una proteína que contiene toxinas de núcleo de Cry1Ab, en donde una toxina de núcleo de Cry1Ab es la porción de toxina insecticida activa N-terminal de la proteína Cry1Ab.

6. El uso de una composición para controlar plagas de lepidópteros que comprenden células que expresan cantidades efectivas tanto de una proteína que contiene la toxina núcleo de Cry1Fa como de una proteína que contiene la toxina núcleo de Cry1 da, en donde una toxina núcleo de Cry1 Fa es la porción activa insecticida de toxina N-terminal de la proteína Cry1Fa, y en la que una toxina núcleo de Cry1Da es la parte de la toxina N-terminal, insecticida activa de la proteína Cry1Da.

7. El uso de una composición de la reivindicación 6, que comprende un huésped transformado para expresar una proteína que contiene tanto toxina nuclear Cry1Fa como proteína que contiene la toxina del núcleo Cry1Da, en donde dicho huésped es un microorganismo o una célula vegetal, en donde una toxina del núcleo Cry1Fa es la parte de toxina N-terminal, insecticida activa de la proteína Cry1Fa, y en donde una toxina del núcleo Cry1Da es la parte de la toxina N-terminal, insecticida activa de la proteína Cry1Da.

8. Un método para controlar plagas de lepidópteros que comprende presentar a dichas plagas o al medio ambiente de dichas plagas una cantidad eficaz de una composición de la reivindicación 6.

9. Una planta transgénica que produce tres proteínas insecticidas, que comprenden una proteína insecticida Cry1Da y una proteína insecticida Cry1Fa y una tercera proteína Cry insecticida, que son insecticidas para el mismo insecto objetivo, teniendo dicho insecto potencial para desarrollar resistencia a cualquiera de dichas proteínas Cry, y en donde cada una de dichas proteínas Cry se une a un receptor intestinal diferente en dicho insecto objetivo.

10. La planta de la reivindicación 9, en la que dicho insecto es el gusano cogollero del maíz.

11. Una planta transgénica que produce una proteína Cry1Fa más una proteína Cry1Da más una tercera proteína seleccionada del grupo que consiste en las proteínas Vip3A, Cry1C, Cry1Be, y Cry1E.