BR102012019662A2 - Uso de proteína cristal inseticida dig3 em combinação com cry1ab para o controle de resistência em broca do milho europeu - Google Patents

Abstract

Uso de proteína cristal inseticida dig3 em combinação com cry1ab para o controle de resistência em broca do milho europeu. A invenção refere-se a métodos e plantas para controle de broca de milho europeu, as feridas plantas compreendendo uma proteína inseticida cry1ab e uma proteína inseticida dig-3 para retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência pelo inseto

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE PROTEÍNA CRISTAL INSETICIDA DIG3 EM COMBINAÇÃO COM CrylAb PARA O CONTROLE DE RESISTÊNCIA EM BROCA DO MILHO EUROPEU".

Antecedente da Invenção Seres humanos cultivam o milho para alimento e aplicações de «r»r»rniο Ολγλγ kii imonAc tomkAm ai il+i\/om mi ilfoe ηi itroc αλΙΚλι+οο ιπαΙι ιϊ«/"Ι/·\ UI l\o I ^It4. W\^l I IUI I ÍUI IVU 1UI ( IVVI I ■ .. ■ VUU MV WWI· ■ Wl 1MW, II IWIMIÍ «MV soja e algodão. Insetos comem e danificam as plantas e desse modo minam estes esforços humanos. Bilhões de dólares são gastos a cada ano para controlar pestes de inseto e bilhões adicionais são perdidos pelo dano que eles infligem. Inseticidas químicos orgânicos sintéticos têm sido as ferramentas primárias usadas para controlar pestes de inseto, porém inseticidas biológicos, tais como as proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringien-sis (Bt), têm desempenhado um importante papel em algumas áreas. A capacidade de produzir plantas resistentes a inseto através da transformação com genes de proteína inseticida Bt tem revolucionado a agricultura moderna e aumentado a importância e valor de proteínas inseticidas e seus genes.

Diversas proteínas Bt têm sido usadas para criar as plantas transgênicas resistentes a inseto que têm sido bem-sucedidamente registradas e comercializadas até esta data. Estas incluem CrylAb, CrylAc, Cry1F e Cry3Bb em milho, CrylAc e Cry2Ab em algodão, e Cry3A em batata.

Os produtos comerciais que expressam estas proteínas expressam uma única proteína, exceto em casos em casos onde o espectro inseticida combinado de 2 proteínas é desejado (por exemplo, CrylAb e Cry3Bb em milho combinados para fornecer resistência às pestes lepidopteranas e lagarta das raízes, respectivamente) ou onde a ação independente das proteínas torna-as úteis como uma ferramenta para retardar o desenvolvimento de resistência em populações de inseto suscetíveis (por exemplo, CrylAc e Cry2Ab em algodão combinados para fornecer controle de resistência para " minhoca do botão do tabaco). SMART STAX é um produto comercial que incorpora diversas proteínas Cry. Veja também a Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2008/0311096, que se refere em parte a CrylAb para controlar a broca do milho Europeu resistente a Cry1F (ECB; Ostrinia nubilalis (Hiibner)). A Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2010/0269223 refere-se a DIG-3. A rápida e muito difundida adoção de plantas transgênicas resistentes a inseto deu origem ao conceito de que populações de peste desenvolverão resistência às proteínas inseticidas produzidas por estas plantas. Diversas estratégias foram sugeridas para preservar a utilidade de características de resistência a inseto com base em Bt que incluem dispor proteínas em uma alta dose em combinação com um refúgio, e alternação com, ou co-disposição de diferentes toxinas (McGaughey e outro (1998), "B.t. Resistência Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

As proteínas selecionadas para uso em uma pilha de controle resistente a inseto (IRM) necessitam exercer seu efeito inseticida independentemente de modo que a resistência desenvolvida a uma proteína não confira resistência à segunda proteína (isto é, não existe resistência cruzada às proteínas). Se, por exemplo, uma população de peste selecionado para resistência à "Proteína A" é sensível à "Proteína B", alguém concluiría que não existe resistência cruzada e que uma combinação de proteína A e proteína B seria eficaz no retardo da resistência à proteína A sozinha.

Na ausência de populações de inseto resistentes, estimativas podem ser feitas com base em outras características presumidas estarem relacionadas ao mecanismo de ação e potencial de resistência cruzada. A utilidade de ligação mediada pelo receptor na identificação de proteína inseticidas provavelmente para não exibir resistência cruzada foi sugerida (van Mellaert e outro 1999). O preditor chave de ausência de resistência cruzada inerente neste método é que as proteínas inseticidas não competem para receptores em uma espécie de inseto sensível.

No evento em que duas toxinas Bt compete para o mesmo receptor em um inseto, então se aquele receptor muta-se naquele inseto de modo que uma das toxinas não mais se ligue àquele receptor, e desse modo não seja mais inseticida contra o inseto, ele pode ser o caso em que o inseto também será resistente à segunda toxina (que competitivamente liga-se ao mesmo receptor). Isto é, o inseto é de resistência cruzada a ambas as toxinas Bt. Entretanto, se duas toxinas ligam-se a dois diferentes receptores, isto pode ser uma indicação de que o inseto não seria simultaneamente resistente àquelas duas toxinas.

Toxinas Cry adicionais são listadas no website do comitê de nomenclatura oficial de B.t. (Crickmais e outro; lifes-ci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Existem atualmente quase 60 grupos principais de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), com toxinas Cyt e toxinas VIP toxinas e similares. Muitos de cada grupo numérico têm subgrupos de letra maiúscula, e os subgrupos de letra maiúscula têm sub-subgrupos de letra minúscula. (Cry1 tem A-L, e Cry1A tem a-i, por exemplo).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção objeto refere-se em parte à surpreendente descoberta de que DIG-3 e CrylAb não competem para a ligação a sítios em preparações de membrana de célula de intestino de broca de milho Europeu (ECB; Ostrínia nubilalis (Hübner)). Como alguém versado na técnica reconhecerá com os benefícios desta descrição, plantas que produzem ambas estas proteínas (incluindo porções inseticidas das proteínas de tamanho natural) podem ser usadas para retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência de quaisquer destas proteínas inseticidas sozinhas. Milho é uma planta preferida para uso dse acordo com a invenção objeto. ECB é o inseto alvo preferido para o par objeto de toxinas.

Desse modo, a invenção objeto refere-se em parte ao uso de uma proteína CrylAb em combinações com uma proteína DIG-3. Plantas (e areas plantadas com tais plantas) que produzem ambas estas proteínas são incluídas no escopo da invenção objeto. A invenção objeto também se refere em parte a pilhas triplas ou "pirâmides" de três (ou mais) toxinas, com CrylAb e DIG-3 sendo o par de base. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, a combinação das toxinas selecionadas fornece três sítios de ação contra ECB. Algumas combinações de pirâmide preferidas de "três sítios de ação" incluem o par de base objeto de proteínas mais Cry1F como a terceira proteína para alvejar ECB. (Foi conhecido de US 2008 0311096 que CrylAb é eficaz contra ECB resistente a Cry1 Fa). Esta pilha tripla particular, por exemplo, de acordo com a invenção objeto, vantajosamente e surpreendentemente fornecería três sítios de ação contra ECB. Isto pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito para área de refugo.

Embora a invenção objeto seja descrita aqui como um par de base de toxinas, CrylAb e DIG-3, que, ou juntas como um par ou em uma "pirâmide" de três ou mais toxinas, provêm resistência ao inseto contra ECB em milho, deve ser entendido que outras combinações com CrylAb e DIG-3 podem ser também usadas de acordo com a invenção objeto, preferivelmente em milho.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A figura 1 mostra o percentual de ligação específica de 125l CrylAb (0,5 nM) em BBMV's de Ostrinia nubilalis versus competição por CrylAb (·) homólogo não rotulado e DIG-3 (■) heterólogo. A curva de deslocamento para competição homóloga por CrylAb resulta em uma curva em forma sigmoidal mostrando 50% deslocamento do radioligante em cerca de 0,5 nM de CrylAb. DIG-3 não desloca qualquer das ligações de 125l CrylAb de seu sítio de ligação em concentrações de 100 nM ou menor (200 vezes maior do que a concentração de 125l CrylAb no ensaio). Apenas em 300 nM observamos cerca de 25% de deslocamento da ligação de 125l CrylAb por DIG-3. Estes resultados mostram que DIG-3 não compete eficazmente para a ligação de CrylAb a sítios receptores localizados em BBMV’s de Ostrinia nubilalis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCAS SEQ ID NO:1 é a proteína exemplificada CrylAb de tamanho natural. (MR818) SEQ ID NO:2 é a proteína exemplificada DIG-3 de tamanho natural. DESCRIÇÃO DETAtHADA DA TNVENCÃO ---------------------------------- A invenção objeto refere-se em parte à surpreendente descoberta de que CrylAb e DIG-3 não competem uma com a outra para ligar sitios no intestino da broca de milho Europeu (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) ou as lagartas dos cereais do outono (FAW; Spodoptera frugiperda). Desse modo, a proteína CrylAb pode ser usada em combinações com uma proteína DIG-3, preferivelmente em milho transgênico, para retardar ou prevenir ECB de desenvolver resistência a quaisquer destas proteínas sozinhas. O par objeto de proteínas pode ser eficaz na proteção de plantas (tais como plantas de milho) de dano por ECB resistente a Cry. Isto é, um uso da invenção objeto é proteger milho e outras espécies de planta economicamente importantes de dano e perda de produção causada por populações de ECB que podem desenvolver resistência a CrylAb ou DIG-3. A invenção objeto desse modo ensina uma pilha de controle resistente a inseto (IRM) compreendendo CrylAb e DIG-3 para prevenir ou mitigar o desenvolvimento de resistência por ECB a qualquer ou ambas estas proteínas.

Além disso, embora a invenção objeto, descrita aqui, ensine uma pilha de IRM compreendendo CrylAb e DIG-3 para prevenir resistência por ECB a qualquer das duas ou ambas estas proteínas, inclui-se no escopo da invenção descrita aqui que um ou ambos CrylAb e DIG-3 podem ser adaptados, ou sozinho ou em combinação, para prevenir resistência por FAW a qualquer das duas ou ambas estas proteínas. A presente invenção fornece composições para controlar pestes lepidopteranas compreendendo células que produzem uma proteína contendo toxina de núcleo de CrylAb e uma proteína contendo toxina de núcleo DIG-3. A invenção também compreende um hospedeiro transformado para produzir tanto uma proteína inseticida CrylAb quanto uma proteína inseticida DIG-3, em que o referido hospedeiro é um micro-organismo ou uma célula de planta. O(s) polinucleotídeo(s) objeto são preferivelmente em uma construção genética sob controle de um promotor(es) não -Bacillus-thuringiensis. Os polinucleotídeos Objeto podem compreender uso de côdon para expressão realçada em uma planta. É adicionalmente pretendido que a invenção forneça um método de controle de pestes lepidopteranas compreendendo contatar as referidas pestes ou o ambiente das referidas pestes, com uma quantidade eficaz de uma composição que contém uma proteína inseticida CrylAb e também contenha uma proteína inseticida DIG-3.

Uma modalidade da invenção compreende uma planta de milho compreendendo um gene expressível de planta codificando uma proteína contendo toxina de núcleo DIG-3 e um gene expressível de planta codificando uma proteína contendo toxina de núcleo de CrylAb, e semente de tal planta.

Um outra modalidade da invenção compreende uma planta de milho em que um gene expressível de planta codificando a Proteína inseticida DIG-3 e um gene expressível de planta codificando a CrylAb proteína inseticida foram introduzidos na referida planta de milho, e semente de tal planta.

Como descrito nos exemplos, estudos de ligação de receptor competitivo usando proteínas DIG-3 e proteínas CrylAb radiorrotuladas mostram que a proteína DIG-3 não compete para ligação em tecidos de ECB aos quais CrylAb liga-se. Estes resultados também indicam que a combinação de proteínas CrylAb e DIG-3 pode ser um método eficaz para mitigar o desenvolvimento de resistência em populações de ECB a qualquer destas proteínas. Desse modo, com base em parte nos dados descritos aqui, co-produção (empilhamento) de DIG-3 com CrylAb para alta dose pode ser usada em pilhas de IRM para controlar ECB.

Outras proteínas podem ser adicionadas a este par. Por exemplo, a invenção objeto também se refere em parte a pilhas triplas ou "pirâmides" de três (ou mais) toxinas, com CrylAb e DIG-3 sendo o par de base. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, as toxinas selecionadas têm três sítios separados de ação contra ECB. Algumas combinações de pirâmide de "três sítios de ação" preferidas incluem o par de base objeto de proteínas mais CrylFa como a terceira proteína para alvejar ECB. Estas pilhas triplas particulares, de acordo com a invenção objeto, vantajosamente e surpreendentemente forneceriam três sítios de ação contra ECB. Isto pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de área em refúgio. Por "sítios de a-ção separados," entende-se qualquer das mencionadas proteínas que não causam resistência cruzada uma a outra.

Desse modo, uma opção de disposição é usar o par objeto de proteínas em combinações com uma terceira toxina/gene, e usar esta pilha tripla para mitigar o desenvolvimento de resistência em ECB a qualquer destas toxinas. Consequentemente, a invenção objeto também se refere em parte a pilhas triplas ou "pirâmides" de três (ou mais) toxinas. Em algumas modalidades de pirâmide preferidas, as toxinas selecionadas têm três sítios de ação separados contra ECB.

Incluídas entre as opções de disposição da invenção objeto seria usar duas, três, ou mais proteínas das proteínas objeto em regiões de cultivo de colheita onde ECB pode (ou é conhecida) desenvolver populações resistentes.

CrylFa é disposto nos produtos Herculex® e SmartStax™, por exemplo. O par objeto de genes (CrylAb e DIG-3) pode ser combinado em, por exemplo, um produto de CrylFa tal como Herculex® e/ou SmartStax™. Consequentemente, o par objeto de proteínas pode ser significante na redução da pressão de seleção sobre estas e outras proteínas. O par objeto de proteínas pode, desse modo, ser usado nas três combinações de gene para milho.

Como descrito acima toxinas/genes adicionais podem também ser adicionados de acordo com a invenção objeto. Por exemplo, para uso de CrylAb com CryIBe para alvejar ECB, veja WO 2011/084631. Para uso de CrylAb com Cry2Aa para alvejar ECB, veja WO 2011/075590. Desse modo, CryIBe e/ou Cry2Aa podem ser usados (opcionalmente com CrylFa) em pilhas de proteína múltiplas com o par objeto de proteínas.

Plantas (e áreas plantadas com tais plantas) que produzem qualquer das combinações objeto de proteínas são incluídas no escopo da invenção objeto. Toxinas/genes adicionais podem também ser adicionadas, porém as pilhas particulares descritas acima vantajosamente e surpreendentemente fornecem múltiplos sítios de ação contra ECB. Isto pode ajudar a reduzir ou eliminar o requisito de área em refúgio. Um campo desse modo plantado de mais de 40.470 m2 é desse modo incluído na invenção objeto. GENBANK pode também ser usado para obter as sequências para qualquer dos genes e proteínas descritos aqui. Patentes podem também ser usadas. Por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.188.960 e Patente dos Estados Unidos No. 5.827.514 descrevem a toxina de núcleo CrylFa contendo proteínas adequadas para uso na realização da presente invenção. A Patente dos Estados Unidos No. 6.218.188 descreve ssequên-cias de DNA otimizadas pela planta codificando proteínas contendo toxina núcleo CrylFa que são adequadas para uso na presente invenção.

Insetos relacionados com ECB podem também ser alvejados. Estes podem incluir brocas de caule e/ou insetos perfuradores do caule. A broca do milho°Cidental (Diatraea grandiosella - da subordem Heterocera) é um exemplo. A broca da cana-de-açúcar é também uma espécie Diatraea {Diatraea saccharalis). Combinações de proteíncomo descrito aqui podem ser usadas para alvejar estágios larvais do inseto alvo. Lepidopterans adultos, por exemplo, borboletas e mariposas, primariamente alimentam-se no néctar da flor e são um efetor significante de polinação. Quase todas as larvas de lepidopteran, isto é, lagartas, alimentam-se sobre as plantas, e muitas são sérias pestes. As lagartas alimentam-se sobre ou dentro da folhagem ou sobre as raízes ou tronco de uma planta, privando a planta de nutrientes e frequentemente destruindo a estrutura de suporte físico da planta. Adicionalmente, as lagartas alimentam-se sobre frutos, tecidos, e grãos armazenados e farinhas, destruindo estes produtos para venda ou severamente diminuindo seu valor.

Algumas toxinas quiméricas da invenção objeto compreendem uma porção de toxina de núcleo de terminação N de uma toxina Bt e, em algum ponto além da extremidade da porção de toxina núcleo, a proteína tem uma transição para uma sequência de protoxina heteróloga. A porção de toxina, inseticidamente ativa, de terminação N de uma toxina Bté referida como a toxina "núcleo". A transição do segmento de toxina "núcleo" para o segmento de protoxina heterólogo pode°Correr aproximadamente na junção de toxina/protoxina ou, na alternativa, uma porção da protoxina nativa (ex-tendendo-se além da porção de toxina "núcleo") pode ser retida, com a transição para a porção de protoxina heteróloga que°Corre a jusante.

Proteínas B.t. Cry de três domínios de tamanho natural típicas são aproximadamente 130 kDa a 150 kDa. CrylAb é um exemplo. DIG-3 é também uma toxina de três domínios — aproximadamente 142 kDa de tamanho.

Como um exemplo, uma toxina quimérica da invenção objeto, é uma porção de toxina "núcleo" completa de CrylAb (aproximadamente ami-noácidos 1 a 601) e/ou uma protoxina heteróloga (aproximadamente amino-ácidos 602 à terminação C). Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a protoxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb. Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a protoxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb.

Uma pessoa versada nesta técnica apreciará que toxinas Bt (mesmo dentro de uma certa classe tal como Cry1 B) pode variar em alguma extensão em comprimento e a localização precisa da transição de porção de toxina "núcleo" para porção de protoxina. Toxinas Cry de tamanho natural típicas são em torno de 1150 a cerca de 1200 aminoácidos em comprimento. A transição de porção de toxina "núcleo" para porção de protoxina tipica-mente°Correrá entre cerca de 50% a cerca de 60% da toxina de tamanho natural. A toxina quimérica da invenção objeto incluirá a expansão total desta porção de toxina "núcleo" de terminal N. Desse modo, a toxina quimérica compreenderá pelo menos cerca de 50% da proteína Cry1 de tamanho natural. Isto tipicamente será de pelo menos cerca de 590 aminoácidos (e pode incluir 600-650 ou então resíduos). Com respeito a uma porção de protoxina, uma expansão total da porção de protoxina CrylAb extende-se da extremidade da porção de toxina "núcleo" à terminação C da molécula. ------------Genes e toxinas. Os genes e toxinas úteis -de acordo com a invenção objeto incluem não apenas as sequências de tamanho natural descritas, porém também fragmentos destas sequências, variantes, mutantes, e proteínas de fusão que retêm a atividade pesticida característica das toxinas especificamente exemplificadas aqui. Como usado aqui, os termos "variantes" ou "variações" de genes referem-se às sequências de nucleotídeo que codificam as mesmas toxinas ou que codificam equivalentes toxinas tendo atividade pesticida. Como usado aqui, o termo "toxinas equivalentes" refere-se a toxinas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica contra as pestes alvos como as toxinas reivindicadas.

Como usado aqui, os limites representam aproximadamente 95% (Cry1Ab's, por exemplos), 78% (Cry1A's e Cry1B's), e 45% (Cry1's) de identidade de sequência, por "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteínas," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Fei-telson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, e D.H. Dean. Microbio-logy e Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estes cortes podem ser aplicados à toxina "núcleo" sozinha.

Deve ser evidente para uma pessoa versada nesta técnica que genes codificando toxinas ativas podem ser identificados e obtidos por meio de diversos métodos. Os genes ou porções de gene específicos exemplificados aqui podem ser obtidos dos isolados depositados em um depositório de cultura. Estes genes, ou porções ou variantes dos mesmos, podem também ser construídos sinteticamente, por exemplo, pelo uso de um sintetiza-dor de gene. Variações de genes podem ser facilmente construídas usando técnicas padrão para fazer mutações de ponto. Além disso, fragmentos destes genes podem ser feitos usando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedimentos padrão. Por exemplo, enzimas tais como Bal31 ou mutagênese direcionada ao sítio podem ser usadas para sistematicamente cortar nucleotídeos das extremidades destes genes. Genes que codificam fragmentos ativos podem também ser obtidos usando uma variedade de enzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para diretamente obter fragmentos ativos destas toxinas de proteína. ------Fragmentos e equivalentes que retêm a atividade pesticida das toxinas exemplificadas incluem-se no escopo da invenção objeto. Além disso, por causa da redundância do código genético, uma variedade de diferen- tes sequências de DNA pode codificar as sequências de aminoácido descritas aqui. Incluí-se bem na experiência de uma pessoa treinada na técnica criar estas sequências de DNA alternativas codificando as mesmas, ou essencialmente as mesmas, toxinas. Estas sequências de DNA variantes in-cluem-se no escopo da invenção objeto. Como usado aqui, referência a "essencialmente a mesma" sequência refere-se a sequências que têm substituições, deleções, adições, ou inserções de aminoácido que não afetam materialmente a atividade pesticida. Fragmentos de genes codificando proteínas que retêm a atividade pesticida são também incluídos nesta definição.

Um outro método para identificar os genes codificando as toxinas e porções de gene úteis de acordo com a invenção objeto é através do uso de sondas de oligonucleotídeo. Estas sondas são sequências de nucleo-tídeo detectáveis. Estas sequências podem ser detectáveis em virtude de um rótulo apropriado ou podem ser feitas inerentemente fluorescente como descrito no Pedido Internacional No. WO93/16094. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula sonda e amostra de ácido nucleico hibridizam formando uma forte ligação entre as duas moléculas, pode ser razoavelmente assumido que a sonda e amostra têm substancial homologia. Preferivelmente, a hibridização é conduzida sob condições rigorosas por técnicas bem conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Keller, G. Η., Μ. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nova Iorque, N.Y., pp. 169-170. Alguns exemplos de concentrações de sal e combinações de temperatura são como segue (a fim de aumentar a rigorosidade): 2X SSPE ou SSC em temperatura ambiente; 1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SSPE ou SSC a 65°C. A detecção da sonda fornece um método para determinar de uma maneira conhecida, se a hibridização°Correu. Tal análise da sonda fornece um rápido método para identificar genes codificando toxina da invenção objeto. Os segmentos de nucleotídeo que são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA e procedimentos^adrõesEstas sequências de nucleo-tídeo podem também ser usadas como iniciadores de PCR para amplificar genes da invenção objeto.

Toxinas variantes. Certas toxinas da invenção objeto foram especificamente exemplificadas aqui. Visto que estes toxinas são meramente exemplares das toxinas da invenção objeto, deve ser facilmente evidentes que a invenção objeto compreende de toxinas variantes ou equivalentes (e sequências de nucleotídeo codificando para toxinas equivalentes) tendo a mesma ou similar atividade pesticida da toxina exemplificadas. Toxinas e-quivalentes terão homologia de aminoácido com uma toxina exemplificada. Esta homologia de aminoácido tipicamente será maior do que 75%, preferivelmente será maior do que 90%, e mais preferivelmente será maior do que 95%. A homologia de aminoácido será maior em regiões críticas da toxina que é responsável pela atividade biológica ou está envolvida na determinação de configuração tridimensional que finalmente é responsável pela atividade biológica. Quanto a isto, certas substituições de aminoácido são aceitáveis e podem ser esperadass se estas substituições são em regiões que não são críticas para a atividade ou são substituições de aminoácido con-servativavs que não afetam a configuração tri-dimensional da molécula. Por exemplo, aminoácidos podem ser colocados nas seguintes classes: não-polar, polar não carregado, básico, e acídico. Substituições conservativas por meio das quais um aminoácido de uma classe é substituído com outro aminoácido do mesmo tipo incluem-se no escopo da invenção objeto contanto que a substituição não altere materialmente a atividade biológica do composto. Abaixo esta uma listagem de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.

Tabela 1: Exemplos de Aminoácidos dentro das Quarto Classes de Aminoácidos____________________________________________________________________ Em alguns casos, substituições não conservativas podem também ser feitas. O fator crítico é que estas substituições não devem signifi-cantemente depreciar a atividade biológica da toxina.

Hospedeiros recombinantes. Os genes que codificam as toxinas da invenção objeto podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos ou de planta. A expressão do gene de toxina resulta, diretamente ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Transferência conjugal e transferência recombinante podem ser usadas para criar uma linhagem Bt que expressa ambas as toxinas da invenção objeto. Outros organismos hospedeiros podem também ser transformados com um ou ambos os genes de toxina então usados para realizar o efeito sinérgico. Com hospedeítos microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao sítio da peste, onde eles proliferar-se-ão e serão ingeridos. O resultado é o controle da peste. Alternativamente, o micróbio hospedando o gene de toxina pode ser tratado sob condições que prolongam a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, que retêm a atividade tóxica, então pode ser aplicada ao ambiente da peste-alvo.

Onde o gene de toxina Bt é introduzido por meio de um vetor adequado em um hospedeiro microbiano, e o referido hospedeiro é aplicado ao ambiente em um estado vivo, é essencial que certos micróbios hospedeiros sejam usados. Hospedeiros de micro-organismo são selecionados que sejam conhecidos°Cupar a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, e/ou rizo-plano) de uma ou mais colheitas de interesse. Estes micro-organismos são selecionados de modo a serem capazes de bem-sucedidamente competir no ambiente particular (colheita e outros habitats de inseto) com os microorganismos do tipo selvagem, proverem a manutenção e expressão estáveis do gene expressando o pesticida de polipeptídeo, e, desejavelmente, proverem proteção melhorada do pesticida de degradação ambiental e inativação.

Um grande número de micro-organismos é conhecido habitar o filoplano (a superfície das folhas da planta) e/ou a rizosfera (o solo que circunda as raízes da planta) de uma ampla variedade de importantes colheitas. Estes micro-organismos incluem bactérias, algaa, e fungos. De particular interesse são os micro-organismos, tais como bactérias, por exemplo, gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomy- ces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Aceto-bacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes; fungos, particularmente levedura, por exemplo, gêneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyvemmyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasi-dium. De particular interesse são tais espécies bacterianas dafitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fíuorescerts, Serra tia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas s-pheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entro-phus, e Azotobacter vinlandii; e espécies de levedura de fifosfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marína, R. aurantiaca, Cryptococcus albi-dus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cere-visiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, e Aure-obasidium pollulans. De particular interesse são os micro-organismos pig-mentados.

Uma ampla variedade de métodos está disponível para introduzir um gene Bt que codifica uma toxina em um hospedeiro de micro-organismo sob condições que levam em consideração a manutenção e expressão estáveis do gene. Estes métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 5.135.867, que é incorporada aqui por referência.

Tratament de células. Bacillus thuringiensis ou células recombi-nantes expressando as toxinas Bt podem ser tratadas para prolongar a atividade da toxina e estabilizar a célula. A microcápsula pesticida que é formada compreende a toxina Bt ou toxinas dentro de uma estrutura celular que foi estabilizada e protegerá a toxina quando a microcápsula for aplicada ao ambiente da peste-alvo. Células hospedeiras adequadas podem incluir ou pro-cariotas ou eucariotas, normalmente sendo limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas a organismos maiores, tais como mamíferos. Entretanto, organismos que produzem substâncias tóxicas a organismos —maiores podem ser usados, onde as substâncias tóxicas são instáveis ou o nível de aplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, de interesse particular serão os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos. A célula usualmente será intacta e será substancialmente na forma proliferativa quando tratada, em vez de em uma forma de esporo, embora em alguns casos os esporos possam ser empregados.

Tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio contendo o gene ou genes de toxina Bt, pode ser por métodos químicos ou físicos, ou por uma combinação de métodos químicos e/ou físicos, contanto que a técnica não afete deleteriamente as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular de proteger a toxina. Exemplos de reagentes químicos são agentes de halogenação, particularmente halogênios de número atômico 17-80. Mais particularmente, iodo pode ser usado sob condições brandas e durante tempo suficiente para obter os resultados desejados. Outras técnicas adequadas incluem tratamento com aldeídos, tais como gluta-raldeído; anti-infecciosos, tais como cloreto de zefiran e cloreto de cetilpiridí-nio; álcoois, tais como isopropila e etanol; vários fixadores histológicos, tais como iodo de Lugol, fixador de Bouin, vários ácidos e fixadores de Helly (Veja: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman e Company, 1967); ou uma combinação de agentes físicos (aquecimento) e químicos que preservam e prolongam a atividade da toxina produzida em uma célula quando a célula é administrada ao ambiente do hospedeiro. E-xemplos de métodos físicos são radiação de comprimento de onda curto tais como radiação gama e radiação X, congelamento, Irradiação de UV, liofiliza-ção, e similares. Métodos para o tratamento de célula microbiana são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.695.455 e 4.695.462, que são incorporadas aqui por referência.

As células geralmente terão estabilidade estrutural realçada que realçará a resistência às condições ambientais. Onde o pesticida está em uma próforma, o método de tratamento celular deve ser selecionado de modo a não inibir o processamento da próforma para a forma madura do pesti-ctda pelo patógeno de pest&-alvo.-Por exemplo, formaldeído reticulará prote-ínas e poderá inibir o processamento da próforma de um pesticipa de poli-peptídeo. O método de tratamento deve reter pelo menos uma porção subs- tancial da biodisponibilidade ou bioatividade da toxina.

Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para os propósitos de produção incluem facilidade de introduzir o gene ou genes Bt no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, eficiência de expressão, estabilidade do pesticida no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Características de interesse para uso como uma microcápsula pesticida incluem qualidades protetoras para o pesticida, tais como paredes celulares grossas, pigmentação, e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; sobrevivência em ambientes aquosos; ausência de toxicidade mamífera; atração para pestes para ingestão; facilidade de matar e fixar sem dano para a toxina; e similares. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manipulação, econômicas, estabilidade em armazenagem, e similares.

Crescimento de células. O hospedeiro celular contendo o gene ou genes inseticidas Bt podem ser desenvolvidos em qualquer meio nutriente conveniente, onde a construto de DNA fornece um dano seletivo, provendo um meio seletivo de modo que substancialmente todas ou todas as células retêm o gene Bt. Estas células podem então ser colhidas de acordo com meios convencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes da colheita.

As células Bt que produzem as toxinas da invenção podem ser cultivadas usando meios e técnicas de fermentação da técnica padrão. Na conclusão do cliclo de fermentação as bactérias podem ser colhidas primeiro separando os esporos e cristais de Bt do caldo de fermentação por métodos bem conhecidos na técnica. Os esporos e cristais de Bt recuperados podem ser formulados em um pó umectável, concentrado líquido, grânulos ou outras formulações pela adição de tensoativos, dispersantes, veículos inertes, e outros componentes para facilitar a manipulação e aplicação para pestes alvo particulares. Estas formulações e procedimentos de aplicação são todos bem conhecidos na técnica— _________ _____________________ _____________ Formulações. Grânulos isca formulados contendo um atraente e esporos, cristais, e toxinas dos isolados Bt, ou micróbios recombinantes compreendendo os genes obteníveis de isolados de Bt descritos aqui, podem ser aplicados ao solo. Produto formulado pode também ser aplicado como um revestimento de semente ou tratamento de raiz ou tratamento de planta total em estágios posteriores do ciclo de colheita. Tratamentos de planta e solo de células Bt podem ser empregados como pós umectáveis, grânulos ou pós, por mistura com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, e similares) ou materiais botânicos (sabugos de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nogueira, e similares). As formulações podem incluir adjuvantes de disper-santes-adesivos, agenets estabilizantes, outros aditivos pesticidas, ou ten-soativos. Formulações líquidas podem ser de base aquosa ou não aquosa e empregadas como espumas, géis, suspensões, concentrados emulsificáveis, ou similares. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes, ou polímeros.

Como seria apreciado por uma pessoa versada na técnica, a concentração pesticida variará amplamente dependendo da natureza da formulação particular, particularmente se ela é um concentrado ou para ser usado diretamente. O pesticida estará presente em pelo menos 1% em peso e pode ser 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1 a 95% em peso do pesticida enquanto que as formulações líquidas geralmente serão de cerca de 1 a 60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formulações geralmente terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Estas formulações serão administradas em torno de 50 mg (líquidas ou secas) a 1 kg ou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas ao ambiente das pestes le-pidopteranas, por exemplo, folhagem ou solo, por vaporização, empoamen-to, borrifamento, ou similares.

Transformação de planta. Um hospedeiro recombinante preferido para a produção de uma proteína inseticida da invenção objeto é uma planta transformada. Genes .codificando proteínas._de toxina Bt, como descri-to aqui, podem ser inseridas em células de planta usando uma variedade de técnicas que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande nú- mero de vetores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em Escheríchia coli e um marcador que permite a seleção das células transformadas estão disponíveis para a preparação para a inserção de genes estranhos em plantas maiores. Os vsetores compreendem, por exemplo, pBR322, séries pUC, séries M13mp, pACYC184, entre outros. Consequentemente, o fragmento de DNA tendo a sequência codificando a proteína de toxina Bt pode ser inserido no vector em um sítio de restrição adequado. O plasmídeo resultante é usado para transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, em seguida colhidas e lisadas. O plasmídeo é recuperado. Análise de sequência, análise de restrição, ele-troforese, e outros métodos biológicos bioquímico-moleculares são geralmente realizados como métodos de análise. Após cada manipulação, a sequência de DNA usada pode ser clivada e unida à próxima sequência de DNA. Cada sequência de plasmídeo pode ser clonada no mesmo ou outros plasmídeos. Dependendo do método de inserção dos genes desejados na planta, outras sequências de DNA podem ser necessárias. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri é usado para a transformação da célula de planta, então pelo menos a borda direita, porém frequentemente a borda direita e a esquerda do T-DNA de plasmídeo Ti ou Ri, devem ser unidas como a região de flanqueamento dos genes a serem inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células de planta tem sido intensivamente pesquisado e suficientemente descrito em EP 120 516, Lee e Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley e outro, (1986), e An e outro, (1985), e é bem estabelecido na técnica.

Assim que o DNA inserido foi integrado no genoma de planta, é relativamente estável. O vetor de transformação normalmente contém um marcador selecionável que confere sobre as células de planta transformadas resistência a um biocida ou um antibiótico, tal como Bialaphos, Kanamicina, G418, Bleomicina, ou Higromícina, entre outros. O marcador individualmesn-te empregado deve consequentemente permitir a seleção de células trans-formadas em vez de células que não contêm o DNA inserido.

Um grande número de técnicas está disponível para inserir DNA em uma célula hospedeira de planta. Aquelas técnicas incluem transformação com T-DNA usando Agrobacteríum tumefaciens ou Agrobacterium rhi-zogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolísticos (bombardeiro de micropartícula), ou eletroporação, bem como outros métodos possíveis. Se as agrobactérias são usadas para a transformação, o DNA a ser inserido deve ser clonado em plasmídeos especiais, a saber, ou dentro de um vetor intermediário ou dentro de um vetor binário. Os vetores intermediários podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homóloga devido às sequências que são homólogas às sequências no T-DNA. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transformação do T-DNA. Vetores intermediários não podem replicar-se em Agrobactérias. O vetor intermediário pode ser transferido para dentro de A-grobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Vetores binários podem replicar-se tanto em E. coli e em Agrobactérias. Eles compreendem uma seleção de gene marcador e um ligador ou poliligador que são moldados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente dentro de Agrobactérias (Holsters e outro, 1978). O Agrobacterium usado como célula hospedeira deve compreender um plasmídeo transportando uma região vir. A região vir é necessária para a transformação do T-DNA na célula de planta. T-DNA adicional pode ser contido. A bactéria desse modo transformada é usada para a transformação de células de planta. Explantes de planta podem vantajosamente ser cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacteríum rhizogenes para a transferência do DNA na célula de planta. Plantas inteiras podem então ser regeneradas do material de planta infectado (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, porém também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, que pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plantas desse modo obtidas podem então ser testadas quanto à presença do DNA inserido. Nenhuma demanda espe-ciaí é feita dos plasmídeos no caso de injeção e eletroporação. É possível usar plasmídeos usuais, tais como, por exemplo, derivados de pUC.

As células transformadas desenvolvem-se dentro das plantas de maneira usual. Elas podem formar células germinativas e transmitem a(s) caracteristica(s) transformadas para plantas descendentes. Tais plantas podem ser desenvolvidas de maneira normal e cruzadas com plantas que têm os mesmos fatores hereditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indivíduos híbridos resultants têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em uma modalidade preferida da invenção objeto, plantas serão transformadas com genes em que o uso de códon foi otimizado para plantas. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.380.831, que é pelo presente incorporada por referência. Enquanto algumas toxinas truncadas são exemplificados aqui, é bem conhecido na técnica de Bt que toxinas do tipo 130 kDa (tamanho natural) têm uma meia terminação N que é uma toxina "núcleo", e uma meia terminal C que é uma protoxina "cauda." Desse modo, "caudas" apropriadas podem ser usadas com toxinas "nú-cleo"/truncadas da invenção objeto. Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 6.218.188 e Patente dos Estados Unidos No. 6.673.990. A-lém disso, métodos para criar genes Bt sintéticos para uso em plantas são conhecidos na técnica (Stewart e Burgin, 2007). Um exemplo não limitante de uma planta transformada preferido é uma planta de milho fértil compreendendo um gene expressível de planta codificando uma proteína CrylAb, e também compreendendo um segundo gene expressível de planta codificando uma proteína Cry1 Be.

Transferência (ou introdução) da(s) característica(s) determinada^) de CrylAb e CryIBe em linhagens de milho congênito pode ser obtida por reprodução de seleção recorrente, por exemplo, por cruzamento reversível. Neste caso, uma origem recorrente desejada é primeiro cruzada a um doador congênito (a origem não recorrente) que transporta o(s) gene(s) a-propriados para as características determinadas de Cry1A e CryIBe. A descendência deste cruzamento é então associada novamente à descendência recorrente seguido por seleção na descendência resultante quanto à(s) ca-racterística(s) desejada(s) a ser(em) transferidas da descendência não recorrente. Após três, preferivelmente quatro, mais preferivelmente cinco ou mais generations de cruzamentos reversíveis com a descendência recorrente com seleção quanto à(s) característica(s) desejada(s), a descendência será heterozigota para locos de controle da(s) característica(s) que está(ao) sendo transferida(s), porém serão como a origem recorrente para a maioria ou quase todos os outros genes (Veja, por exemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1: Theory e Technique, 360-376).

Estratégias de Controle da Resistência de Inseto (IRM). Roush e outro, por exemplo, delineia estratégias de duas toxinas, também chamadas "formação de pirâmide" ou "empilhamento," para controle de colheitas trans-gênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

Em seu website, a United States Environmental Protection A-gency (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica os seguintes requisitos para fornecer refúgios não transgênicos (isto é, não-B.t.) (uma seção de milho/colheitas não-Sf) para uso com colheitas transgênicas produzindo uma única proteína Bt ativa contra as pestes alvo. "Os requisitos estruturados específicos para produtos de milho Bt (CrylAb ou Cry1F) protegidos contra a broca de milho são como segue: Refúgios estruturados: 20% de refúgio de milho Bt não-Lepidopterano em Região de milho; 50% de de refúgio de milho Bt não-Lepidopterano em Região de milho;

Blocos Internos (isto é, no campo de Bt) Externos (isto é, campos separados em % milha (¼ milha de possível) do campo Bt para maximizar associação aleatória) Em faixas de campo As faixas devem ser pelo menos 4 fileiras amplas (preferivelmente 6 fileiras) para reduzir os efeitos dejnovimento larval!'_ ________ Além disso, a National Corn Growers Association, em seu website: (ncga.com/insect-resistência-management-fact-sheet-bt-corn) também fornece orientação similar com respeito aos requisitos de refúgio. Por exemplo: "Requisitos do IRM de Broca de Milho: - Plantar pelo menos 20% de seus metros quadrados de milho para híbridos de refúgio - Em regiões de produção de algodão, o refúgio deve ser de 50% - Deve ser plantado dentro de 1/2 milha dos híbridos de refúgio - O refúgio deve ser plantado como faixas dentro do campo de Bt, as faixas de refúgio devem ser de pelo menos 4 fileiras amplas - Refúgio pode ser tratado com pesticidas convencionais apenas, se limiares econômicos forem atingidos para o inseto-alvo - Inseticidas vaporizáveis com base em Bt não podem ser usados no milho de refúgio - Refúgio apropriado deve ser plantado em toda fazenda com milho Bt.

Como estabelecido por Roush e outro (nas páginas 1780 e 1784 coluna direita, por exemplo), empilhamento ou formação de pirâmide de duas diferentes proteínas cada uma eficaz contra as pestes alvos e com pouca ou nenhuma resistência cruzada pode prover uso de um refúgio menor. Roush sugere que para uma pilha bem-sucedida, um tamanho de refúgio de menos do que 10% de refúgio, pode fornecer controle de resistência comparável a cerca de 50% de refúgio para uma única característica (não formação de pirâmide). Para produtos de milho St em pirâmide atualmente disponíveis, a U.S. Environmental Protection Agency requer que refúgio significantemen-te menos (geralmente 5%) estruturado de milho não-Bf sejam plantados do que para produtos de única característica (geralmente 20%).

Existem várias maneiras de fornecer os efeitos de IRM de um reaúaio. incluindo vários padrões de plantação geométrica nos campos (co-mo acima mencionado) e misturas de semente em saco, como descrito também por Roush e outro (supra), e Patente dos Estados Unidos No. 6.551.962.

As percentagens acima, ou relações de refúgio similares, podem ser usadas para as pilhas duplals ou triplas objeto ou pirâmides. Para pilhas triplas com sítios de ação contra uma única peste-alvo, um objetivo seria refúgio zero (ou menos do que 5% de refúgio, por exemplo). Isto é particularmente real para áreas comerciais - de mais de 40.470 m2 por exemplo.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referents a ou citados aqui são incorporados por Referência em suas totalidades para a extensão em que elas não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos desta especificação. A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um, uma (a)", "um, uma (an)", e "o,a" significam "pelo menos um" como u-sado aqui.

Os seguintes são exemplos que ilustram procedimentos para a prática da invenção. Estes exemplos não devem ser construídos como limi-tantes. Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume, a menos que de outro modo mencionado. Todas as temperaturas são em graus Celsius.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Rotulagem de 125l de Proteína CrvIAb lodacão de toxina "núcleo" CrvIAb. Toxina CrylAb (SEQ ID NO:1) foi tripsina ativada e iodada usando Contas de lodo (Pierce). Em síntese, duas Contas de lodo foram lavadas duas vezes com 500 pl de salina tamponada por fosfato, PBS (20 mM de fosfato de sódio, 0,15 M de NaCI, pH 7,5), e colocadas em um tubo centrífugo de 1,5 ml de blindagem de chumbo traseira. A este foram adicionados 100 μΙ de PBS. Em uma coifa e através do uso de técnicas de manipulação radioativa apropriadas, 0,5 mCi Na125l (17.4 Ci/mg, Amersham) foi adicionado à solução de PBS com a Conta de lodo. Os componentes foram deixados reagir durante 5 minutos em — temperatura ambiente, em seguida dO pg de proteína CrylAb truncada alta-_ mente pura foram adicionados à solução e deixados reagir durante um adicional de 5 minutos. A reação foi terminada removendo a solução das Con- tas de lodo e aplicando-as em uma coluna giratória Zeba de 0,5 ml de des-salgamento (InVitrogen) equilibrada em 20 mM de tampão CAPS, pH 10,5 + 1 mM de DTT. A conta de iodo foi lavada duas vezes com 10 pl de PBS cada e a solução de lavagem foi aplicada à coluna de dessalgamento. A solução radioativa foi eluída através da coluna de dessalgamento por centrifuga-ção a 1,000 x g durante 2 minutos. Radiopureza da CrylAb radio-iodada foi determinada por SDS-PAGE, fosfor-imageamento e contagem gamma. Em síntese, 2 pl da proteína radioativa foram separados por SDS-PAGE usando 4 a 20% destes géis de poliacrilamida de glicina (1 mm de espessura, InVitrogen). Após separação, os géis foram secados usando um aparelho de secagem de gel BioRad seguindo as instruções do fabricante. Os géis secos foram imageados envolvendo-os em película Mylar (12 pm de espessura), e expondo-os sob uma tela fosfor de armazenagem Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm), durante 1 hora. As placas foram desenvolvidas usando um fos-forimageador Molecular Dynamics Storm 820 e imageadas e analisadas u-sando o software ImageQuant ®. A atividade específica foi de aproximadamente 4 pCi/pg proteína.

Exemplo 2 - Protocolo de Preparação de BBMV

Preparação e Fracionamento de BBMV's Solubilizados. Larvas de Ostrinia nubilalis de último instar foram jejuadas durante a noite e em seguida dissecadass na manhã seguinte após congelamento em gelo durante 15 minutos. O tecido do intestino médio foi removido da cavidade corporal, deixando para trás o intestino traseiro ligado ao integumento. O intestino médio foi colocado em volume de 9X de tampão de homogeneização delado (300 mM de manitol, 17 mM de tris. base, pH 7.5), suplementado com Coquetel1 de Inibidor de Protease (Sigma P-2714) diluído como recomendado pelo fornecedor. O tecido foi homogeneizado com 15 golpes de um homoge-neizador de tecido de vidro. BBMV's foram preparados pelo método de precipitação de MgCI2 de Wolfersberger (1993). Em síntese, um volume igual de uma soluçãode 24 mM de MgCI2 em 300 mM de manitol foi misturado com o homogeneizado de intestino médio, agitado durante 5 minutos e deixados permanecer sobre gelo durante 15 minutos. A solução foi centrifugada a 2,500 x g durante 15 minutos a 4o C. O sobrenadante foi salvado e a pélete suspensa no original volume de 0.5-X de tampão de homogeneização diluído e centrifugado novamente. Os sobrenandantes foram combinados, centrifugados a 27,000 x g durante 30 min a 4°C para formar a fração de BBMV. A pélete foi suspensa em 10 ml de tampão de homogeneização suplementado com inibidores de protease, e centrifugados novamente em 27,000 x g durante 30 minutos a 4°C para lavar os BBMV's. A pélete resultante foi suspensa em Tampão de Armazenagem BBMV (10 mM de HEPES, 130 mM de KCI, 10% de glicerol, pH 7,4) para uma concentração de cerca de 3 mg/ml de proteína. A concentração de proteína foi determinada usando o método Bradford (1976) com albumina de soro bovino (BSA) como um padrão. A determinação defosfatase alcalina foi feita antes do congelamento das a-mostras usando o ensaio Sigma seguindo as instruções do fabricante. A atividade específica desta enzima marcadora na fração de BBMV tipicamente aumentou 7 vezes em comparação àquela encontrada na Ifração de homo-genado de intestino médio. Os BBMV's foram aliquotados em amostras de 250 μΙ, congelados instantaneamente em N2 líquido e armazenados a -80°C. Exemplo 3 - Método para Medir a Ligação de Proteína 125l CrvIAb às Proteínas BBMV

Ligação de proteína 125l CrvIAb a BBMV's. Para determina a squasntidade ideal de proteína BBMV para uso nos ensaios de ligação, uma curva de saturação foi gerada. Proteína CrylAb radiorrotulada por 125l (0,5 nM) foi incubada durante 1 hora a 28°C com várias quantidades de proteína BBMV, variando de 0-500 pg/ml em tampão de ligação (8 mM de NaHP04, 2 mM de KH2PO4, 150 mM de NaCI, 0,1% de albumina de soro bovino, pH 7.4). O volume total foi de 0,5 ml. Proteína 125l CrylAb ligada foi separada de não ligadas por amostragem de 150 μΙ da mistura reacional em triplicada de um tubo centrífugo de 1,5 ml em um tubo centrífugo de 500 μΙ e centrifugando as amostras a 14,000 x g durante 6 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi suavemente removido, e a pélete suavemente lavada três __ vezes com tampão de ligação gelado. A base da centrífuga contendo a pélete foi retirada e colocada em um tubo de cultura de vidro de 13 x 75-mm. As amostras foram contadas durante 5 minutos cada na registradora gama. As contas contidas na amostra foram subtraídas das contas de base (reação sem qualquer proteína) e foram plotadas versus a concentração de proteína BBMV. A quantidade ideal de proteína para uso foi determinada ser de 0,15 mg/ml de proteína BBMV.

Para determinar os cinéticos de ligação, uma curva de saturação foi gerada. Em síntese, BBMV's (150 pg/ml) foram incubados durante 1 hr. a 28°C com concentrações crescentes de CrylAb de Toxina 125l, variando de 0,01 a 10 nM. Ligação total foi determinada por amostragem de 150 pl de cada concentração em triplicata, centrifugação da amostra e contagem como descrito acima. Ligação não específica foi determinada da mesma maneira, com a adição de 1,000 nM da toxina CrylAb não radioativa tripsinizada homóloga adicionada à mistura reacional para saturar todos os sítios de ligação de receptor não específico. Ligação específica foi calculada como a diferença entre a ligação total e ligação não específica.

Ensaios de ligação de competição homóloga (CrylAb) e heteró-loga (DIG-3) foram conduzidos usando 150 pg/ml de proteína BBMV e 0,5 nM da proteína CrylAb radiorrotulada por 125l. CrylAb e DIG-3 (SEQ ID NO:2) foram ativadas por tripsina e usadas como proteínas competidoras. A concentração da toxina CrylAb ou DIG-3 não radiorrotulada competitiva adicionada à mistura reacional variou de 0,03 a 1,000 nM e foi adicionada ao mesmo tempo que o ligante radioativo, para assegurar a real competição de ligação. Incubações foram realizadas durante 1 hora a 28°C e a quantidade de proteína 125l CrylAb ligada a sua toxina receptora medida como descrito acima com ligação não específica subtraída. Cem por cento de ligação total foram determinados na ausência de qualquer ligante competitor. Resultados foram plotados em um plote semi-logaritmico como ligação específica total percentual versus a concentração de ligante competitivo adicionado.

Exemplo 4 — Sumário de Resultados ____________Afigura 1 mostra jí percentual de Jigação específica de 125l CrylAb (0,5 nM) em BBMVs de Ostrínia nubilalis versus competição por CrylAb (·) homólogo não rotulado e DIG-3 (■) heterólogo. A curva de deslo- camento para competição homóloga por CrylAb resulta em uma curva em forma sigmoidal mostrando 50% de deslocamento do radioligante em cerca de 0,5 nM de CrylAb. DIG-3 não desloca qualquer das ligações de 125l CrylAb de seu sítio de ligação em concentrações de 100 nM ou menor (200 vezes maior do que a concentração de 125l CrylAb no ensaio). Apenas a 300 nM observamos cerca de 25% de deslocamento da ligação de 125l CrylAb por DIG-3. Estes resultados mostram que DIG-3 não compete eficazmente para a ligação de CrylAb a sítios receptores localizados em BBMVs de Os-trinia nubílalis.

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Claims (19)

1. Planta transgênica compreendendo DNA codificando uma proteína inseticida CrylAb e DNA codificando uma Proteína inseticida DIG-3.

2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, a referida planta também compreendendo DNA codificando uma terceira proteína inseticida, preferivelmente selecionada do grupo que consiste em CrylFa, CryIBe, e Cry2Aa.

3. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 2, a referida planta também compreendendo DNA codificando uma quarta proteína inseticida, preferivelmente selecionada do grupo que consiste em CryIBe e Cry2Aa onde a terceira proteína inseticida é a proteína CrylFa.

4. Semente de uma planta como definida em qualquer das reivindicações 1 a 3.

5. Campo de plantas compreendendo plantas de refúgio não-Bt e uma pluralidade de plantas como definida em qualquer das reivindicações 1 a 3, em que as referidas plantas de refúgio compreendem menos do que 40% de todas as plantas de colheita no referido campo.

6. Campo de plantas de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas plantas de refúgio compreendem menos do que 30% de todas as plantas de colheita no referido campo.

7. Campo de plantas de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas plantas de refúgio compreendem menos do que 20% de todas as plantas de colheita no referido campo.

8. Campo de plantas de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas plantas de refúgio compreendem menos do que 10% de todas as plantas de colheita no referido campo.

9. Campo de plantas de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas plantas de refúgio compreendem menos do que 5% de todas as plantas de colheita no referido campo.

10. Campo de plantas de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas plantas de refúgio estão em blocos ou faixas.

11. Mistura de sementes compreendendo sementes de refúgio de plantas de refúgio não-Sf, e uma pluralidade de sementes como definidas na reivindicação 4, em que as referidas sementes de refúgio compreendem menos do que 40% de todas as sementes na mistura.

12. Mistura de sementes de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas sementes de refúgio compreendem menos do que 30% de todas as sementes na mistura.

13. Mistura de sementes de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas sementes de refúgio compreendem menos do que 20% de todas as sementes na mistura.

14. Mistura de sementes de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas sementes de refúgio compreendem menos do que 10% de todas as sementes na mistura.

15. Mistura de sementes de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas sementes de refúgio compreendem menos do que 5% de todas as sementes na mistura.

16. Método de desenvolvimento de controle de resistência a uma proteína Cry por um inseto, o referido método compreendendo plantar sementes para produzir um campo de plantas como definido em qualquer das reivindicações 5 a 10.

17. Campo como definido em qualquer das reivindicações 5 a 10, em que as referidos plantas°Cupam mais de 40.470 m2 (10 acres).

18. Planta como definido em qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida planta é selecionada do grupo que consiste em milho, so-jas, e algodão.

19. Planta de acordo com a reivindicação 18, em que a referida planta é uma planta de milho.