BR112019012763A2

BR112019012763A2 - vegetais ou partes de vegetais, semente capaz de germinação em um vegetal, célula de vegetal ou capaz de regenerar um vegetal, célula de vegetal, produto de vegetal, progênie ou vegetal descendente, métodos para o controle de ervas daninhas e a produção de um vegetal, molécula de ácido nucléico, cassete de expressão, vetor, polipeptídeo de ppo mutada isolado, método para a produção de um produto de vegetal e produto de vegetal

Info

Publication number: BR112019012763A2
Application number: BR112019012763A
Authority: BR
Inventors: Massa Dario; Paulik Jill; Witschel Matthias; Aponte Raphael; Tresch Stefan; Seiser Tobias
Original assignee: Basf Agro Bv
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-12-10
Also published as: CA3044728A1; US20200270625A1; AR110554A1; EA201991300A1; CN110382702A; EP3559243A1; MX2019007469A; US11879132B2; ZA201904609B; IL267330A; WO2018114759A1

Abstract

a presente invenção se refere a um vegetal ou parte de vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ppo mutada, a expressão de dito polinucleotídeo confere a tolerância do vegetal ou de parte do vegetal aos herbicidas.

Description

“VEGETAIS OU PARTES DE VEGETAIS, SEMENTE CAPAZ DE GERMINAÇÃO EM UM VEGETAL, CÉLULA DE VEGETAL OU CAPAZ DE REGENERAR UM VEGETAL, CÉLULA DE VEGETAL, PRODUTO DE VEGETAL, PROGÊNIE OU VEGETAL DESCENDENTE, MÉTODOS PARA O CONTROLE DE ERVAS DANINHAS E A PRODUÇÃO DE UM VEGETAL, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, POLIPEPTIDEO DE PPO MUTADA ISOLADO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE VEGETAL E PRODUTO DE VEGETAL” Campo da Invenção [001]A presente invenção, em geral, se refere aos métodos para conferir a tolerância, a nível agrícola, dos vegetais a um herbicida. Especialmente, a presente invenção se refere aos vegetais que possuem uma tolerância aumentada aos herbicidas inibidores de PPO. Mais especificamente, a presente invenção se refere aos métodos e aos vegetais obtidos através da mutagênese e cruzamento e transformação que possuem uma tolerância aumentada aos herbicidas inibidores de PPO.

Antecedentes da Invenção [002]Os herbicidas que inibem a oxidase de protoporfirinogênio (a seguir denominada Protox ou PPO; EC:1.3.3.4), uma enzima chave na biossíntese da protoporfirina IX, são utilizados para o controle seletivo de ervas daninhas desde a década de 1960. A PPO catalisa a última etapa comum na biossíntese de clorofila e heme, que é a oxidação do protoporfirinogênio IX para a protoporfirina IX. (Matringe et al. 1989. Biochem. 1. 260: 231). Os herbicidas inibidores de PPO incluem diversas classes estruturais diferentes de moléculas (Duke etal. 1991. Weed Sei. 39: 465; Nandihalli et al. 1992. Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193; Matringe etal. 1989. FEBS Lett. 245: 35; Yanase e Andoh, 1989. Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70). Estes compostos herbicidas incluem os difeniléteres {por exemplo, o lactofeno, 5-{2-cloro-4-(trifluorometil)fenoxi}-2Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 208/498

2/266 nitrobenzoato de (+-)-2-etoxi-1-metil-2-oxoetila; acifluorfeno, ácido 5-{2-cloro-4(trifluorometil)fenoxi}-2-nitrobenzóico; seu éster de metila; ou oxifluorfeno, 2cloro-1-(3-etoxi-4-nitrofenoxi)-4-(trifluorobenzeno)}, oxidiazóis, (por exemplo, a oxidiazona, 3-{2,4-dicloro-5-(1 -metiletoxi)fenil}-5-( 1,1 -dimetiletil)-1,3,4oxadiazol-2-(3H)-ona), imidas cíclicas (por exemplo, o S-23142, N-(4-cloro-2fluoro-5-propargiloxifenila)-3,4,5,6-tetraidroftalimida, cloroftalim, N-(4-clorofenil)3,4,5,6-tetraidroftalimida), fenilpirazóis (por exemplo, a etila TNPP, 2-{1-(2,3,4triclorofenil)-4-nitropirazolil-5-oxi-propionato de etila, M&B 39279), derivados de piridina (por exemplo, o LS 82-556) e fenilato e seus análogos de Ofenilpirrolidino e piperidinocarbamato. Muitos desses compostos competitivamente inibem a reação normal catalisada através da enzima, aparentemente atuando como os análogos de substrato.

[003]A aplicação de herbicidas inibidores de PPO resulta no acúmulo de protoporfirinogênio IX no cloroplasto e nas mitocôndrias, que, se acredita, vazar para o citosol, em que é oxidado através de uma peroxidase. Quando exposta à luz, a protoporfirina IX provoca a formação de oxigênio singleto no citosol e a formação de outras espécies reativas de oxigênio, que podem provocar a peroxidação de lipídeo e ruptura das membranas conduzindo à morte celular rápida (Lee etal. 1993. Plant Physiol. 102: 881).

[004]Nem todas as enzimas de PPO são sensíveis aos herbicidas que inibem as enzimas de PPO do vegetal. Ambas as enzimas de PPO de Escherichia colie Bacillus subtilis (Sasarmen et al., 1993. Can. J. Microbiol. 39: 1155; Dailey et al., 1994. J. Biol. Chem. 269: 813) são resistentes a estes inibidores de herbicidas. Os mutantes da alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii resistentes ao herbicida de fenilimida S-23142 foram relatados (Kataoka et al. 1990. J. Pesticide Sci. 15: 449; Shibata et al. 1992. In Research in Photosynthesis, Vol. Ill, N. Murata, ed. Kluwer: Holanda, págs. 567-70). Pelo menos um desses mutantes parece possuir uma atividade alterada de PPO que

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3/266 é resistente não apenas ao inibidor herbicida em que o mutante foi selecionado, mas também a outras classes de inibidores de protox (Oshio et al. 1993. Z. Naturforsch. 48c: 339; Sato et al., 1994. No ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C). Foi também relatada uma linhagem de célula de tabaco mutante que é resistente ao inibidor S-21432 (Che etal., 1993, Z. Naturforsch. 48c: 350). Os mutantes auxotróficos de E. coliforam utilizados para confirmar a resistência aos herbicidas de herbicidas inibidores de PPO dos vegetais clonados.

[005]Três estratégias principais estão disponíveis para tornar os vegetais de tolerância aos herbicidas, isto é, (1) a desintoxicação do herbicida com uma enzima que transforma o herbicida, ou seu metabólito ativo, em produtos não tóxicos, tais como, por exemplo, as enzimas para a tolerância ao bromoxinila ou a basta (patentes EP 242.236, EP 337.899); (2) a mutação da enzima alvo em uma enzima funcional que é menos sensível ao herbicida, ou ao seu metabolito ativo, tal como, por exemplo, as enzimas para a tolerância ao glifosato (patente EP 293.356, Padgette SR etal., J. Biol. Chem. 266, 33, 1991); ou (3) a superexpressão da enzima sensível de maneira a produzir quantidades da enzima alvo no vegetal que sejam suficientes em relação ao herbicida, em vista das constantes cinéticas desta enzima, de maneira a possuir enzima funcional suficiente disponível apesar da presença do seu inibidor. A terceira estratégia foi descrita para obter com sucesso os vegetais que eram tolerantes aos inibidores de PPO (vide, por exemplo, as patentes US 5.767.373 ou US 5.939.602, e seus membros da família patentes). Além disso, as publicações US 2010/0100988 e WO 2007/024739 descrevem as sequências de nucleotídeos codificando as sequências de amino ácidos que possuem a atividade enzimática de tal maneira que as sequências de amino ácidos sejam resistentes aos produtos químicos herbicidas inibidores de PPO, em especial, aos mutantes de PPO específicos para os inibidores de 3-feniluracila.

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4/266 [006]A publicação WO 2012/080975 descreve os vegetais cuja tolerância é a um herbicida inibidor de PPO. Em especial, a publicação WO 2012/080975 descreve que a introdução de ácidos nucléicos que codificam para uma PPO mutada de uma PPO de Amaranthus tipo II, em que a Arginina na posição 128 foi substituída por uma leucina, alanina ou valina e a fenilalanina na posição 420 foi substituída por uma metionina, cisteína, isoleucina, leucina ou treonina, que confere a tolerância / resistência aumentada a um herbicida derivado de benzoxazinona. A publicação WO 2013/189984 descreve que a introdução de ácidos nucléicos que codificam uma PPO mutante, na qual a leucina correspondente à posição 397 e a fenilalanina correspondente à posição 420 de uma PPO de Amaranthus tipo II são substituídas confere a tolerância / resistência aumentada aos herbicidas inibidores de PPO. A publicação WO 2015/022636 descreve os mutantes de PPO inovadores, nos quais a arginina correspondente à posição 128 e a fenilalanina correspondente à posição 420 de uma PPO de Amaranthus tipo II são substituídas por amino ácidos que são diferentes daqueles descritos pela publicação WO 2012/080975. A publicação WO 2015/022640 descreve as enzimas de PPO inovadoras e seus mutantes derivados de Alopecurus myosuroides. A publicação WO 2015/092706 descreve que a transferência de mutações de Amaranthus (conforme descrito acima) para as sequências de PPO da cultura mostra um efeito de tolerância aumentado no vegetal. A patente US 7.671.254 descreve a PPO mutada de uma PPO de Amaranthus tipo II, na qual a glicina nas posições 210 e/ou 211 é eliminada. Ao contrário das posições correspondentes a 128, 397 e 420, se acredita que ditas posições 210 e/ou 211 se situam fora do local catalítico de PPO (“locais não ativos”). Os Depositantes ou a presente invenção descobriram no presente, de maneira surpreendente, que uma substituição de amino ácidos em Gly²¹0/211, ou em outros locais não ativos, em especial, quando combinada com uma substituição em posições em locais ativos, isto é, correspondendo às posições

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128, 397 e/ou 420 de PPO de Amaranthus tipo II aumentam a tolerância aos herbicidas.

Descrição Resumida da Invenção [007]Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um vegetal ou parte de vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de PPO mutada, a expressão de dito polinucleotídeo confere a tolerância do vegetal ou de parte do vegetal aos herbicidas.

[008]Em uma realização de preferência, dito polipeptideo de PPO mutada compreende um ou mais dos seguintes motivos:

(i) Motivo 1:

- GT[C/S]GGDP;

- em que a glicina na posição 4 e/ou 5 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido;

(ii) Motivo 2:

- [A/S/C]PS[D/N][X][X]L;

- em que a serina na posição 3 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido;

(iii) Motivo 3:

- [R/Q][E/D]KQQ[L/A]P;

- em que a glutamina na posição 4 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido;

(iv) Motivo 4:

- L[I/V]PSKE;

- em que a serina na posição 4 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido.

[009]De preferência, dito polipeptideo de PPO mutada de maneira

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6/266 adicional compreende um ou mais dos seguintes motivos:

(a) Motivo 5: SQ[N/K/H]KRYI, em que a Arg na posição 5 dentro de dito motivo é substituída por qualquer outro amino ácido;

(b) Motivo 6: TLGTLFSS, em que o Leu na posição 2 dentro de dito motivo é substituído por qualquer outro amino ácido; e (c) Motivo 7: [F/Y]TTF[V/I]GG, em que o Phe na posição 4 dentro de dito motivo é substituído por qualquer outro amino ácido.

[010]Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma semente capaz de germinar em um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células dos vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[011]Em um aspecto, a presente invenção fornece uma célula de vegetal capaz de regenerar um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo de presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas, em que a célula de vegetal compreende o polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor.

[012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula de vegetal que compreende um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em uma célula, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

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7/266 [013]Em outros aspectos, a presente invenção fornece um produto de vegetal preparado a partir de um vegetal ou parte de vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[014]Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma progênie ou vegetal descendente derivado a partir de um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, em que a progênie ou vegetal descendente compreende em, pelo menos, algumas de suas células, o polinucleotídeo recombinante operavelmente ligado ao promotor, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância da progênie ou do vegetal descendente aos herbicidas.

[015]Em outros aspectos, a presente invenção fornece um método para o controle de ervas daninhas em um local para o crescimento de um vegetal, o método compreende: (a) a aplicação de uma composição herbicida que compreende os herbicidas no local; e (b) o plantio de uma semente no local, em que a semente é capaz de produzir um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[016]Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método

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8/266 para o controle de ervas daninhas em um local para o crescimento de um vegetal, o método compreende: a aplicação de uma composição herbicida que compreende os herbicidas no local; em que o dito local é: (a) um local que contém: um vegetal ou uma semente capaz de produzir dito vegetal; ou (b) um local que deve ser após dita aplicação ser realizada para conter o vegetal ou a semente; em que o vegetal ou a semente compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[017]Em um aspecto, a etapa (a) ocorre antes, após ou concorrentemente com a etapa (b).

[018]Em outros aspectos, a presente invenção fornece um método para a produção de um vegetal que possui a tolerância aos herbicidas, o método compreende a regeneração de um vegetal a partir de uma célula de vegetal transformado com um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[019]Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de um vegetal de progênie que possui a tolerância aos herbicidas, o método que compreende: o cruzamento de um primeiro vegetal de tolerância ao herbicida com um segundo vegetal para a produção de um vegetal de progênie de tolerância ao herbicida, em que o primeiro vegetal e o vegetal de progênie compreendem em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor

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9/266 capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo da presente invenção, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[020]Além disso, a presente invenção se refere a um método para a identificação de um herbicida através da utilização de uma PPO mutada da presente invenção.

[021]Dito método compreende as etapas:

(a) da geração de uma célula ou vegetal transgênico que compreende um ácido nucléico que codifica uma PPO mutada da presente invenção, em que a PPO mutada da presente invenção é expressa;

(b) da aplicação de um herbicida à célula ou vegetal transgênico de (a) e a uma célula ou vegetal de controle da mesma variedade;

(c) da determinação do crescimento ou da viabilidade da célula ou vegetal transgênico e da célula ou vegetal de controle após a aplicação de dito composto de teste; e (d) da seleção de compostos de teste que conferem o crescimento reduzido à célula ou vegetal de controle em comparação com o crescimento da célula ou vegetal transgênico.

[022]Outro objeto se refere a um método para a identificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma PPO mutada da presente invenção que é resistente ou tolerante a um herbicida, o método compreende:

(a) a geração de uma biblioteca de ácidos nucléicos codificadores de PPO mutadas;

(b) a varredura de uma população dos ácidos nucléicos que codificam para a PPO mutada, expressando cada um de ditos ácidos nucléicos em uma célula ou vegetal e tratando dita célula ou vegetal com um herbicida;

(c) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida fornecidos através de dita população de ácidos nucléicos que codificam a PPO mutada com

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10/266 o nível de tolerância ao herbicida fornecido através de um ácido nucléico que codifica a PPO de controle; e (d) a seleção de, pelo menos um ácido nucléico que codifica a PPO mutada que fornece um nível significativamente aumentado de tolerância a um herbicida em comparação com aquele fornecido através do ácido nucléico que codifica a PPO de controle.

[023]Em uma realização de preferência, o ácido nucléico que codifica a PPO mutada selecionado na etapa (d) fornece, pelo menos, 2 vezes mais tolerância a um herbicida do que aquele fornecido através do ácido nucléico que codifica a PPO de controle.

[024]A resistência ou tolerância pode ser determinada através da geração de um vegetal transgênico que compreende uma sequência de ácido nucléico da biblioteca da etapa (a) e comparando dito vegetal transgênico com um vegetal de controle.

[025]Outra realização se refere a uma molécula de ácido nucléico produzida e/ou sintética isolada e/ou recombinante que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada selecionado a partir do grupo que consiste em:

(a) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,

72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92,

93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,

111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo;

(b) uma molécula de ácido nucléico, que, como resultado da

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11/266 degeneração do código genético, pode ser derivada de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo, e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação a uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

(c) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que possui 30% ou superior de identidade, de preferência, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou superior, com a sequência de amino ácidos de sequência de polipeptídeo de PPO de SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

(d) em molécula de ácido nucléico que híbrida com uma molécula de ácido nucléico de (a), (b) ou (c), sob condições de hibridação restringentes e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação

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12/266 com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

- em que a sequência de amino ácidos do polipeptídeo de PPO mutada codificada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptídeo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 32, 53, 57, 61,63, 64, 65, 67, 71,76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 103, 104, 106, 108, 116, 119, 126, 127, 129, 139, 159, 210,211,224, 245, 246, 248,

249, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 262, 264, 286, 291,305, 308, 309, 323,

335, 343, 345, 358, 372, 373, 387, 391,392, 400, 412, 414, 415, 425, 428, 431,

433, 434, 435, 436, 447, 451,453, 464, 466, 482 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

[026]Qutra realização se refere a uma molécula de ácido nucléico produzida e/ou sintética isolada e/ou recombinante que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada selecionado a partir do grupo que consiste em:

93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110,

(b) uma molécula de ácido nucléico, que, como resultado da degeneração do código genético, pode ser derivada de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que compreende a

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13/266 sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,

18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37,38,

39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59,

60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80,

(c) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptideo de PPO mutada que possui 30% ou superior de identidade, de preferência, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou superior, com a sequência de amino ácidos de sequência de polipeptideo de PPO de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81,82, 83, 84 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,

115, 116, 117 ou 129, e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

(d) em uma molécula de ácido nucléico que híbrida com uma molécula de ácido nucléico de (a), (b) ou (c), sob condições de hibridação restringentes e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

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14/266

- em que a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada codificada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 40, 250, 391, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531,532, 533, 534 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma eliminação ou inserção do amino ácido nessas posições.

[027] De preferência, a diferença correspondente à posição 391 de SEQ ID NO: 1 se refere a uma inserção e a diferença correspondente às posições 40, 250, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530. 531, 532, 533, 534 de SEQ ID NO: 1 ou 2 se refere a uma eliminação.

[028]Outro objeto se refere a um cassete de expressão que compreende a molécula de ácido nucléico da presente invenção e a um promotor operável em células de vegetal.

[029]Outro objeto se refere a um polipeptideo de PPO mutada isolado, recombinante e/ou quimicamente sintetizado codificado através da molécula de ácido nucléico de acordo com as reivindicações de 17 a 25 ou a um polipeptideo que possui, pelo menos, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56,57,

58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77,78,

79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo, em que a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 32, 53, 57, 61,63, 64, 65, 67, 71, 76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 103, 104, 106, 108, 116, 119, 126, 127,

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15/266

129, 139, 159, 210, 211,224, 245, 246, 248, 249, 252, 253, 254, 255, 257, 259,

260, 262, 264, 286, 291,305, 308, 309, 323, 335, 343, 345, 358, 372, 373, 387,

391,392, 400, 412, 414, 415, 425, 428, 431,433, 434, 435, 436, 447, 451,453,

464, 466, 482 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

[030]0utro objeto se refere a um polipeptideo de PPO mutada isolado, recombinante e/ou quimicamente sintetizado codificado através da molécula de ácido nucléico de acordo com as reivindicações de 17 a 25 ou a um polipeptideo que possui, pelo menos, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo, em que a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 40, 250, 391,520, 521,522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531,532, 533, 534 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma eliminação ou uma inserção do amino ácido nessas posições.

[031]Ainda em outros aspectos, a presente invenção fornece um vegetal ou parte de vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas, em que o

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16/266 vegetal ou parte de vegetal ainda exibe um segundo ou terceiro traço ao herbicida.

[032]Em outra realização, a presente invenção se refere a uma célula de vegetal transformado através de e expressando um ácido nucléico de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, ou um vegetal que foi mutado para obter um vegetal expressando, de preferência, sobreexpressando um ácido nucléico de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, em que a expressão de dito ácido nucléico na célula de vegetal resulta em resistência ou tolerância aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula de vegetal.

[033]Em outra realização, a presente invenção se refere a um vegetal que compreende uma célula de vegetal, de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucléico no vegetal resulta na resistência aumentada do vegetal ao herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal.

[034]Os vegetais da presente invenção podem ser transgênicos ou não transgênicos.

[035]De preferência, a expressão do ácido nucléico da presente invenção no vegetal resulta na resistência aumentada do vegetal aos herbicidas em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal.

[036]Em outra realização, a presente invenção se refere a uma semente produzida através de um vegetal transgênico que compreende uma célula de vegetal da presente invenção, em que a semente é a reprodução verdadeira para uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem da semente.

[037]Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a produção de uma célula de vegetal transgênico com uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade do

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17/266 tipo selvagem da célula de vegetal que compreende transformar a célula de vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo.

[038]Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a produção de um vegetal transgênico que compreende: (a) a transformação de uma célula de vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo e (b) a geração de um vegetal com uma resistência aumentada ao herbicida a partir da célula do vegetal.

[039]De preferência, o cassete de expressão ainda compreende uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução que são funcionais no vegetal.

Breve Descrição das Figuras [040]A Figura 1 mostra uma análise de germinação utilizando os vegetais de Arabidopsis transgênicos (SEQ ID NO: 1 o AMATU_PPO2_G211 A_F420M mutado). Os vegetais foram tratados com as concentrações indicadas de Saflufenacil. As fotografias foram tiradas 14 dias após o tratamento.

[041]A Figura 2 mostra a pulverização de tolerância T1 utilizando os vegetais de Arabidopsis transgênicos (SEQ ID NO: 1 AMATU_PPO2_G211 A_F420M mutado). As fotografias foram tiradas 8 dias após o tratamento (dias após a pulverização). De cima para baixo contêm 2 vegetais do tipo selvagem, 5 potes superiores contêm os eventos transgênicos independentes (os vegetais T1, selecionados através da confirmação da presença do gene de resistência AHAS).

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18/266 [042]A Figura 3 mostra os vegetais de Arabidopsis transgénicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Saflufenacil + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

AMATU_PPO2_R128A_S387L_F420M, (C)

AMATU_PPO2_G211 A_L397Q_F420M, (D) AMATU_PPO2_R128A_F420M (E) AMATU_PPO2_F420V, (F) AMATU_PPO2_L397Q_F420M, (G) tipo selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[043]A Figura 4 mostra os vegetais de Arabidopsis transgénicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Trifludimoxazina + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

AMATU_PPO2_R128A_S387L_F420M, (C) AMATU_PPO2_G211 A_F420V, (D) AMATU_PPO2_G211 A_L397Q_F420M, (E) AMATU_PPO2_R128A_F420M, (F) AMATU_PPO2_F420V, (L) AMATU_PPO2_L397Q_F420M (H) tipo selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[044]A Figura 5 mostra os vegetais de Arabidopsis transgénicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Saflufenacil + Trifludimoxazina + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

[045]A Figura 6 mostra os vegetais de Arabidopsis transgénicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Uracilpiridina 2 + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

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19/266

AMATU_PP02_R128A_S387L_F420M, (C) AMATU_PPO2_G211 A_F420V, (D) AMATU_PPO2_G211 A_L397Q_F420M, (E) AMATU_PP02_R128A_F420M, (F) AMATU_PPO2_F420V, (L) AMATU_PPO2_L397Q_F420M (H) tipo selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[046]A Figura 7 mostra os vegetais de Arabidopsis transgênicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Uracilpiridina 4 + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

[047]A Figura 8 mostra os vegetais de Arabidopsis transgênicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Uracilpiridina 1 + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

AMATU_PPO2_R128A_S387L_F420M, (C)

AMATU_PPO2_G211 A_L397Q_F420M, (D) AMATU_PPO2_R128A_F420M, (E) AMATU_PPO2_F420V, (F) AMATU_PPO2_L397Q_F420M, (G) tipo selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[048]A Figura 9 mostra os vegetais de Arabidopsis transgênicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Sulfentrazona + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

AMATU_PPO2_R128A_S387L_F420M, (C)

AMATU_PPO2_G211 A_L397Q_F420M, (D) AMATU_PPO2_R128A_F420M, (E) AMATU_PPO2_F420V, (F) AMATU_PPO2_L397Q_F420M, (G) tipo

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20/266 selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[049]A Figura 10 mostra os vegetais de Arabidopsis transgênicos pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de Flumioxazina + 1% (v/v) de MSO. Os vegetais abrigam os traços mutados de SEQ ID NO: 1: (A) AMATU_PPO2_R128A_G210S_F420M, (B)

AMATU_PPO2_R128A_S387L_F420M, (C) AMATU_PPO2_R128A_F420M, (D) AMATU_PPO2_F420V, (E) AMATU_PPO2_L397Q_F420M, (F) tipo selvagem (não transgênico). A avaliação é realizada 6 Dias Após o Tratamento (DAT).

[050]A Figura 11 mostra os vegetais de Arabidopsis transgênicos abrigando a construção de AMATU_PPO2_G211 A_F420M mutada com a SEQ ID NO: 1, pós pulverizados na estufa com a quantidade indicada de (A) Saflufenacil + Trifludimoxazina, (B) Tiafenacil, (C) Uracilpiridina 6, (D) Piraflufenetila, (E) Uracilpiridina 7, com + 1% (v/v) de MSO. A avaliação é realizada 14 Dias Após o Tratamento (DAT) e é apresentada como lesão (%) em relação aos vegetais tratados não transgênicos.

[051]A Figura 12 mostra os exemplos de Zea mays transgênicos abrigando as variantes de AmtuPPX2L após o tratamento pré-emergente com o Saflufenacil.

[052]A Figura 13 mostra a tolerância de variantes de AmtuPPX2L abrigando o Glycine max transgênico após o tratamento com uma mistura de Saflufenacil e Trifludimoxazina. 0/0 significa nenhum ingrediente ativo, 50/25 significa 50 gramas de ingrediente ativo por hectare (Al/Ha) de Saflufenacil e 25 gramas de Al/Ha de Trifludimoxazina, 100/50 significa 100 g de Al/Ha de Saflufenacil e 50g de Al/Ha de Trifludimoxazina e 200/100 significa 200 g de Al/Ha de Saflufenacil e 100 g de Al/Ha de Trifludimoxazina. O tipo selvagem não transformado é representado através de cultivar a soja (Glycine max) Jake (cv. Jake).

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21/266 [053]A Figura 14 mostra os exemplos de tolerância ao herbicida de variantes de AmtuPPX2L abrigando o Glycine max transgênico após o tratamento com uma mistura de Saflufenacil e Trifludimoxazina. 0/0 significa

nenhum ingrediente ativo, 25/50 significa 50 gramas de ingrediente ativo por
hectare (Al/Ha) de Saflufenacil e 25 gramas de Al/Ha de Trifludimoxazina, 50/100
significa 100g de Al/Ha de Saflufenacil e 50g de Al/Ha de Trifludimoxazina e
100/200 significa	200g de Al/Ha de Saflufenacil e 100g de Al/Ha de
Trifludimoxazina. 0 tipo selvagem não transformado é representado através de
cultivar a soja (Glycine max) Jake (cv. Jake).
	Legenda à Listagem de Sequências
SEQ ID	Organismo
1	Amaranthus tuberculatus
2	Amaranthus tuberculatus
3	Amaranthus tuberculatus
4	Amaranthus tuberculatus
5	Amaranthus hypochondriacus
6	Amaranthus tuberculatus
7	Spinacia oleracea
8	Vitis vinifera
9	Ricinus communis
10	Theobroma cacao
11	Glycine max
12	Prunus pérsica
13	Medicago truncatula
14	Fragaria vesca subsp. vesca
15	Citrus Clementina
16	Citrus Clementina
17	Cicer arietinum
18	Cucumis sativus
19	Cucumis sativus
20	Nicotiana tabacum
21	Solanum lycopersicum
22	Arabidopsis thaliana
23	Arabidopsis lyrata subsp. lyrata
24	Arabidopsis thaliana
25	Arabidopsis thaliana
26	Ambrosia artemisiifolia
27	Setaria italica
28	Sorghum bicolor
29	Arabidopsis thaliana

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Organismo Zea mays Zea mays LEMPA LEMPA Populus trichocarpa Capsella rubella Brachypodium distachyon Oryza sativa Japonica Group Picea sitchensis Solanum tuberosum Oryza sativa Indica Group Oryza sativa Japonica Group Eutrema salsugineum Selaginella moellendorffii Selaginella moellendorffii Amaranthus tuberculatus Amaranthus tuberculatus Zea mays Aegilops tauschii Genlisea aurea Amborella trichopoda Rhodothermus marinus Salinibacter ruber Salinibacter ruber M8 Zea mays Rhodothermus marinus Caldithrix abyss! Opitutus terrae PB90-1 Verrucomicrobia bacterium Ignavibacterium album Coraliomargarita sp. CAG:312 Salisaeta longa Ambrosia artemisiifolia Melioribacter roseus P3M-2 Halothiobacillus neapolitanus c2 Chondrus crispus Rubritalea marina Acidobacteria bacterium Coraliomargarita akajimensis DSM 45221 Oscillochloris trichoides DG6 Opitutaceae bacterium TAV1 Amborella trichopoda Opitutaceae bacterium TA V5 Chloroflexus sp. Y-400-fl Leptospirillum sp. Group II '5-way CG' Leptospirillum ferrifilum ML-04

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Organismo

Verrucomicrobia bacterium SCGC AAA300-017

Chloroflexus aggregans DSM 9485

Desulfurobacterium thermolithotrofum

Desulfurobacterium sp. TC5-1

Arthrospira platensis C1

Leptospirillum sp. Group II '075'

Verrucomicrobiae bacterium DG1235

Verrucomicrobia bacterium SCGC AAA300-K03

Synechococcus sp. JA-3-3Ab

Hymenobacter norwichensis

Pontibacter sp. BAB1700

Leptospirillum ferrodiazotrofum Prevotella histicola F0411 Flexithrix dorotheae

Geobacter metallireducens GS-15 Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13) Crinalium epipsammum PCC 9333 Planctomyces marls

Geobacter uraniireducens Rf4

Acidithiobacillus ferrivorans

Prevotella melaninogenica Thermovibrio ammonificans

Brassica_rapa

Gossypium

Conyza_canadensis

Kochia_scobaria

Lolium_rigidum

Gossypium hirsutum PP01

Beta vulgaris PPO1

Hordeum vulgare PP01

Hordeum vulgare PPO2

Triticum aestivum PPO1

Solanum lycopersicum PPO2

Triticum aestivum PPO1_v2

Gossypium hirsutum PPO1_v2

Gossypium hirsutum PPO2

Beta vulgaris PPO1_v2

Brassica napus_PPO2

Alopecurus myosuroides

Descrição Detalhada da Invenção

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24/266 [054]Os artigos “um” e “uma” são utilizados no presente para se referir a um ou mais de um (isto é, pelo menos, um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.

[055]Conforme utilizado no presente, o termo “que compreende”, ou variações tais como “compreende” ou “que compreendem”, serão entendidos como implicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa declarado, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[056]O termo “controle de vegetação indesejada ou ervas daninhas” deve ser entendido como significando a morte de ervas daninhas e/ou o retardamento ou inibição do crescimento normal das ervas daninhas. As ervas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como significando todos aqueles vegetais que crescem em locais em que são indesejados. As ervas daninhas da presente invenção, por exemplo, incluem as ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus e Apera. Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, os

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25/266 vegetais cultivados que estão crescendo em um local não desejado. Por exemplo, um vegetal de milho voluntário que esteja em um campo que predominantemente compreende os vegetais de soja pode ser considerado uma erva daninha, se o vegetal de milho for indesejado no campo dos vegetais de soja.

[057]O termo “vegetal” é utilizado no seu sentido mais amplo, uma vez que pertence ao material orgânico e se destina a abranger os organismos eucariotas que são membros do Reino Vegetal, os exemplos dos quais incluem mas não estão limitados aos vegetais vasculares, legumes, grãos, flores, árvores, ervas, arbustos, gramíneas, trepadeiras, samambaias, musgos, fungos e algas e similares, assim como os clones, compensações e partes dos vegetais utilizadas para a propagação assexuada (por exemplo, as estacas, tubulações, brotos, rizomas, caules subterrâneos, aglomerados, coroas, bulbos, rebentos, tubérculos, rizomas, vegetais / tecidos produzidos em cultura de tecidos, e similares). O termo “vegetal” ainda abrange os vegetais inteiros, ancestrais e progênies dos vegetais e partes dos vegetais, incluindo as sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo os tubérculos), flores, florzinhas, frutas, pedículos, pedúnculos, estames, anteras, estigma, variedade, ovário, pétala, sépala, carpelo, ponta da raiz, topo da raiz, cabelo de raiz, cabelo de folha, cabelo de semente, grão de pólen, micrósporo, cotiledônia, hipocótilo, epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, um célula de guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos e células conhecidos de um vegetal, e tecidos e órgãos, em que cada um dos mencionados acima compreende o gene / ácido nucléico de interesse. O termo “vegetal” também abrange as células de vegetal, culturas em suspensão, tecido do calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dos mencionados acima compreende o gene / ácido nucléico de interesse.

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26/266 [058]Os vegetais que são especialmente úteis nos métodos da presente invenção incluem todos os vegetais que pertencem à superfamília Viridiplantae, em especial, os vegetais monocotiledôneos e dicotiledôneos, incluindo as forragens ou leguminosas forrageiras, vegetais ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo silvestre]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., CoFhorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uni flora, Fagopyrum spp., Fagusspp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortune!la spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica,

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Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malusspp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miHaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pin us spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, linho, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, morango, beterraba de açúcar, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora, chá e algas, entre outros. De acordo com uma realização de preferência da presente invenção, o vegetal é um vegetal de cultura. Os exemplos dos vegetais de cultura incluem, inter alia, a soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodão, tomate, batata ou tabaco. Além disso, o vegetal é um

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28/266 vegetal monocotiledôneo, tal como a cana de açúcar. Ainda de preferência, o vegetal é um cereal, tal como o arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, sorgo ou aveia.

[059]Em geral, o termo “herbicida” é utilizado no presente para significar um ingrediente ativo que mata, controla ou de outra maneira modifica adversamente o crescimento dos vegetais. A quantidade ou concentração de preferência do herbicida é uma “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz”. Por “quantidade eficaz” e “concentração eficaz” se entende uma quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de um vegetal, tecido de vegetal, célula de vegetal ou célula do hospedeiro similar, do tipo selvagem, mas dita quantidade não mata ou inibe severamente o crescimento dos vegetais de resistência aos herbicidas, tecidos de vegetal, células de vegetal e células do hospedeiro da presente invenção. Normalmente, a quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramente utilizada em sistemas de produção agrícola para matar as ervas daninhas de interesse. Tal quantidade é conhecida pelos técnicos no assunto. A atividade herbicida é exibida através dos herbicidas úteis para a presente invenção quando são aplicados diretamente no vegetal ou no local do vegetal em qualquer estágio de crescimento ou antes do plantio ou emergência. O efeito observado depende das espécies dos vegetais a serem controladas, do estágio de crescimento do vegetal, dos parâmetros de aplicação da diluição e do tamanho da gota de pulverização, do tamanho das partículas dos componentes sólidos, das condições ambientais no momento da utilização, do composto específico empregado, os adjuvantes e veículos específicos utilizados, o tipo de solo e similares, bem como a quantidade de produto químico aplicado. Estes e outros fatores podem ser ajustados conforme é conhecido no estado da técnica para promover uma ação herbicida não seletiva ou seletiva. Em geral, os tratamentos com os herbicidas podem ser aplicados PPI (Pré Plantação

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Incorporada), PPSA (Pós-tratamento aplicado na superfície do vegetal), pré- ou pós-emergente. O tratamento pós-emergente normalmente ocorre em vegetação indesejada em relação à imatura para alcançar o controle máximo de ervas daninhas.

[060]O termo um vegetal “de tolerância ao herbicida” ou “resistência ao herbicida”, significa que um vegetal que é tolerante ou resistente a, pelo menos um herbicida a um nível que normalmente iria matar ou inibir o crescimento de um vegetal normal ou do tipo selvagem. Os níveis de herbicida que normalmente inibem o crescimento de um vegetal não tolerante são conhecidos e facilmente determinados pelos técnicos no assunto. Os exemplos incluem os valores recomendados pelos fabricantes para a aplicação. A taxa máxima é um exemplo de uma quantidade de herbicida que normalmente iria inibir o crescimento de um vegetal não tolerante. Para a presente invenção, os termos “tolerância aos herbicidas” e “resistência aos herbicidas” são utilizados de maneira intercambiável e se destinam a possuir um significado equivalente e um âmbito equivalente. De maneira similar, os termos “tolerância aos herbicidas” e “resistência aos herbicidas” são utilizados de maneira intercambiável e se destinam a possuir um significado equivalente e um âmbito equivalente. De maneira similar, os termos “tolerância” e “resistência” são utilizados de maneira intercambiável e se destinam a possuir um significado equivalente e um âmbito equivalente. Conforme utilizado no presente, em relação a uma composição herbicida útil em diversas realizações, os termos tais como os herbicidas e similares, se referem aos ingredientes ativos herbicidas agronomicamente aceitáveis (A. I) reconhecidos no estado da técnica. De maneira similar, os termos tais como o fungicida, nematicida, pesticida e similares, se referem a outros ingredientes ativos agronomicamente aceitáveis reconhecidos no estado da técnica.

[061]Quando utilizado em referência a uma enzima ou polipeptídeo

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30/266 mutante especial, os termos tais como tolerância ao herbicida e tolerância ao herbicida se referem à capacidade de tal enzima ou polipeptídeo de desempenhar a sua atividade fisiológica na presença de uma quantidade de um A.l. herbicida que normalmente inativa ou inibe a atividade da versão do tipo selvagem (não mutante) de dita enzima ou polipeptídeo. Além disso, a atividade de PPO de uma proteína de PPO mutada de tolerância ao herbicida ou resistência ao herbicida pode ser referida no presente como a atividade de PPO de “tolerância ao herbicida” ou “resistência ao herbicida”.

[062]Conforme utilizado no presente, o termo “recombinante”, quando se refere ao ácido nucléico ou polipeptídeo, indica que esse material foi alterado como resultado da aplicação humana de uma técnica recombinante, tal como através da restrição e ligação de polinucleotídeo, através da sobreposiçãoextensão de polinucleotídeo ou inserção ou transformação genômica. Um quadro de leitura aberta de sequência genética recombinante se essa sequência de nucleotídeo for removida do seu texto natural e clonada em qualquer tipo de vetor de ácido nucléico artificial. O termo “recombinante” também pode se referir a um organismo com um material recombinante, por exemplo, um vegetal que compreende um ácido nucléico recombinante pode ser considerado um vegetal recombinante.

[063]O termo “vegetal transgênico” se refere a um vegetal que compreende um polinucleotídeo heterólogo. De preferência, o polinucleotídeo heterólogo está estavelmente integrado no genoma, de tal maneira que o polinucleotídeo é passado para as gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma isoladamente ou como parte de um cassete de expressão recombinante. O termo “transgênico” é utilizado no presente para se referir a qualquer célula, linhagem de célula, calo, tecido, parte de vegetal ou vegetal cujo genótipo foi alterado dessa maneira através da presença de ácido nucléico heterólogo incluindo os organismos transgênicos ou

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31/266 células inicialmente alteradas, tal como aqueles criados através de cruzamentos ou propagação assexuada do organismo transgênico inicial ou célula. Em algumas realizações, um organismo “recombinante” é um organismo “transgênico”. O termo “transgênico”, conforme utilizado no presente, não pretende abranger a alteração do genoma (cromossômico ou extracromossômico) através dos métodos convencionais de reprodução dos vegetais (por exemplo, os cruzamentos) ou através de eventos naturais tais como, por exemplo, a autofertilização, fertilização cruzada, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[064]Conforme utilizado no presente, o termo “mutagenizado” se refere a um organismo ou seu DNA que possui alteração(ões) na sequência biomolecular do seu material genético nativo em comparação com a sequência do material genético de um organismo ou DNA do tipo selvagem correspondente, em que a(s) alteração(ões) em material genético foi(ram) induzida(s) e/ou selecionada(s) por ação humana. Os exemplos de ação humana que podem ser utilizados para a produção de um organismo ou DNA mutagenizado incluem, mas não estão limitados a um tratamento com um mutagênio químico tal como o EMS e posterior seleção com o(s) herbicida(s); ou através do tratamento de células de vegetal com raios X e posterior seleção com o(s) herbicida(s). Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser utilizado para induzir as mutações. Os métodos de indução de mutações podem induzir as mutações em posições aleatórias no material genético ou podem induzir as mutações em locais específicos no material genético (isto é, podem ser técnicas direcionadas de a mutagênese), tal como através da utilização de uma técnica de genoplastia.

[065]Conforme utilizado no presente, o termo um “organismo geneticamente modificado” (OGM) é um organismo cujas características genéticas contêm a(s) alteração(ões) que foram produzidas por esforço humano

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32/266 provocando a transfecção que resulta na transformação de um organismo alvo com o material genético de outro ou “organismo de fonte” ou com o material genético nativo sintético ou modificado, ou um organismo que é um descendente do mesmo que retém o material genético inserido. O organismo de fonte pode ser de um tipo diferente de organismo (por exemplo, um vegetal OGM pode conter o material genético bacteriano) ou do mesmo tipo de organismo (por exemplo, um vegetal OGM pode conter o material genético de outro vegetal). Conforme utilizado no presente em relação aos vegetais e outros organismos, os termos “recombinante”, “transgênico” e “OGM” são considerados sinônimos e indicam a presença de material genético de uma fonte diferente; em contraste, o termo “mutagenizado” é utilizado para se referir a um vegetal ou outro organismo, ou ao seu DNA, em que nenhum material transgênico está presente, mas em que o material genético nativo sofreu a mutação, de maneira a diferir de um organismo do tipo selvagem correspondente ou DNA.

[066]Conforme utilizado no presente, o termo “tipo selvagem” ou “vegetal do tipo selvagem correspondente” significa a forma típica de um organismo ou de seu material genético, como ocorre normalmente, distinto, por exemplo, das formas mutagenizadas e/ou recombinantes. De maneira similar, o termo “célula de controle” ou “célula de vegetal ou célula do hospedeiro similar, do tipo selvagem, significa um vegetal, tecido de vegetal, célula de vegetal ou célula do hospedeiro, respectivamente, que não possui as características de resistência aos herbicidas e/ou ao polinucleotídeo especial da presente invenção que estão descritos no presente. A utilização do termo “tipo selvagem”, por conseguinte, é não pretende sugerir que um vegetal, tecido de vegetal, célula de vegetal ou outra célula do hospedeiro não possua o DNA recombinante em seu genoma e/ou não possua as características de resistência aos herbicidas que são diferentes daquelas descritas no presente.

[067]Conforme utilizado no presente, o termo “descendente” se

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33/266 refere a qualquer vegetal de geração. Em algumas realizações, um descendente é um primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo vegetal de geração.

[068]Conforme utilizado no presente, o termo “progênie” se refere a um vegetal de primeira geração.

[069]O termo “semente” compreende as sementes de todos os tipos, tais como, por exemplo, as sementes verdadeiras, cariopses, aquênios, frutos, tubérculos, plântulas e formas similares. No contexto das espécies Brassica e Sinapis, “semente” se refere à(s) semente(s) verdadeira(s) a menos que especificado de outra maneira. Por exemplo, a semente pode ser a semente dos vegetais ou vegetais transgênicos obtidas através dos métodos tradicionais de reprodução. Os exemplos de métodos de reprodução tradicionais podem incluir o cruzamento, autofagia, contra-cruzamento, salvamento de embriões, em cruzamentos, fora de cruzamento, endogamia, seleção, propagação assexuada e outras técnicas tradicionais como são conhecidas no estado da técnica.

[070] Embora exemplificado com referência aos vegetais específicos ou variedades dos vegetais e seus híbridos, em diversas realizações, os métodos presentemente descritos utilizando os herbicidas podem ser empregados com uma variedade dos vegetais comercialmente valiosa. As linhagens dos vegetais de tolerância aos herbicidas descritas como úteis na presente invenção podem ser empregadas em métodos de controle de ervas daninhas, direta ou indiretamente, isto é, por exemplo, como culturas para tratamento com os herbicidas ou como linhagens doadoras de traços de tolerância aos herbicidas para o desenvolvimento, para a produção de outras culturas de variedades e/ou híbridas contendo tais traços ou traço. Todas essas culturas resultantes de variedades ou híbridos, contendo os traço ou traços ancestrais de tolerância aos herbicidas, podem ser referidas no presente como progênie ou descendente da(s) linha(s) ancestral(is) de tolerância ao herbicida.

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Pode ser dito que tais vegetais resultantes retêm a(s) “característica(s) de tolerância ao herbicida” do vegetal ancestral, isto é, que possuem e expressam os componentes moleculares genéticos ancestrais responsáveis pelo traço.

[071]Em um aspecto, a presente invenção fornece um vegetal ou parte de vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de PPO mutada, a expressão de dito polinucleotídeo confere a tolerância do vegetal ou de parte do vegetal aos herbicidas.

[072]Em uma realização de preferência, o vegetal foi previamente produzido através de um processo que compreende a preparação de um vegetal por meio de introdução e superexpressão de um transgene de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, conforme descrito em maiores detalhes no presente.

[073]Em outra realização, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo polipeptídeo de PPO mutada compreende a sequência de ácido nucléico apresentada na SEQ ID N 118, 119, 120, 121,122, 123, 124, 125,126, 127, 128 ou 130, ou uma sua variante ou derivado.

[074]Em outras realizações, o polipeptídeo de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, é uma variante funcional que possui, além do comprimento total da variante, pelo menos, cerca de 80%, de maneira ilustrativa, pelo menos, cerca de 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou superior de identidade de sequência de amino ácidos com a SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54,

55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75,

76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96,

97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114, 115, 116, 117ou 129.

[075]Em outra realização, o polipeptídeo de PPO mutada para a

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35/266 utilização de acordo com a presente invenção é um fragmento funcional de um polipeptideo que possui a sequência de amino ácidos apresentada na SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65,

66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86,

87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129.

[076]É reconhecido que as moléculas de polinucleotídeos de PPO e os polipeptideos de PPO da presente invenção abrangem as moléculas de polinucleotídeos e polipeptideos que compreende uma sequência de nucleotídeo ou de amino ácidos que é suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeo apresentada nas SEQ ID NOs: 118,119,120,121,122., 123,124,125,126,127, 128 ou 130, ou na sequência de amino ácidos apresentada nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46,

47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86 87, 88,

89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129. O termo “suficientemente idêntico” utilizado no presente para referir a um primeiro amino ácido ou a uma sequência de nucleotídeo que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de amino ácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia secundária similar) a uma segunda sequência de amino ácidos ou nucleotídeos, de maneira que as primeira e segunda sequências de amino ácidos ou nucleotídeos possuam um domínio estrutural comum e/ou a atividade funcional comum.

[077]Em geral, o termo “identidade de sequência” se refere à

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36/266 extensão em que duas sequências de DNA ou de amino ácidos alinhadas de maneira ideal são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, os nucleotídeos ou amino ácidos. Uma “fração de identidade” para os segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos compartilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento de sequência de referência, isto é, toda a sequência de referência ou uma parte definida menor de sequência de referência. O termo “porcentagem de identidade” é a fração de identidade vezes 100. O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido dos técnicos no assunto e pode ser conduzido por ferramentas tal como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, a pesquisa através do método de similaridade de Pearson e Lipman e, de preferência, através de implementações computadorizadas desses algoritmos, tal como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA, disponíveis como parte do GCG. Pacote de Wisconsin. (Accelrys Inc. Burlington, Massachusetts).

POLINUCLEOTÍDEOS E OUGONUCLEOTÍDEQS [078]O termo um “polinucleotídeo isolado”, incluindo o DNA, RNA ou uma sua combinação, de cadeia simples ou dupla, na orientação senso ou anti-senso ou uma combinação de ambos, dsRNA ou de outra maneira, significa um polinucleotídeo que seja, pelo menos, parcialmente separado deas sequências de polinucleotídeos com as quais está associada ou ligada no seu estado nativo. De preferência, o polinucleotídeo isolado está, pelo menos, 60% livre, de preferência, pelo menos, 75% livre e, de maior preferência, pelo menos, 90% livre de outros componentes com os quais estão naturalmente associados. Como o técnico no assunto estaria ciente, um polinucleotídeo isolado pode ser um polinucleotídeo exógeno presente, por exemplo, em um organismo

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37/266 transgênico que não compreende naturalmente o polinucleotídeo. Além disso, os termos “polinucleotídeo(s)”, “sequência(s) de ácido(s) nucléico(s)”, “sequência(s) de nucleotídeo(s)”, “ácido(s) nucléico(s)”, “molécula de ácido nucléico” são utilizados no presente de maneira intercambiável e se referem aos nucleotideos. Os ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento.

[079]O termo “ácido nucléico de PPO mutada” se refere a um ácido nucléico de PPO com uma sequência que é mutada a partir de um ácido nucléico de PPO do tipo selvagem e que confere a tolerância ao herbicida aumentada a um vegetal na qual é expressa. Além disso, o termo “oxidase de protoporfirinogênio mutado (PPO mutada)” se refere à substituição de um amino ácido de sequência primária do tipo selvagem de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31,32, 33, 34 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,

72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92,

93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112,113,114,115,116,117 ou 129, ou uma variante, um derivado, um seu homólogo, um ortólogo, ou um seu parálogo, com outro amino ácido. A expressão “amino ácido mutado” será utilizada abaixo para projetoar o amino ácido que substituído por outro amino ácido, projetoando dessa maneira o local da mutação na sequência primária da proteína.

[080]Em uma realização de preferência, a sequência de nucleotídeo de PPO que codifica uma PPO mutada compreende a sequência de SEQ ID Nos 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 ou 130, ou uma variante ou seus derivados.

[081]Além disso, será entendido pelo técnico no assunto que as sequências de nucleotideos de PPO englobam os homólogos, parálogos e

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38/266 ortólogos de SEQ ID No 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, ou 130, conforme definido a seguir.

[082]Q termo “variante” em relação a uma sequência (por exemplo, um polipeptideo ou sequência de ácido nucléico tal como - por exemplo - uma sequência de nucleotideos reguladora da transcrição da presente invenção) pretende significar as sequências substancialmente similares. Para as sequências de nucleotideos que compreende um quadro de leitura aberto, as variantes incluem as sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de amino ácidos idêntica da proteína nativa. As variantes alélicas de ocorrência natural como estas podem ser identificadas com a utilização de técnicas bem conhecidas de biologia molecular, tal como, por exemplo, com a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridação. As sequências de nucleotideos variantes também incluem as sequências de nucleotideos derivadas sinteticamente, tais como aquelas geradas, por exemplo, utilizando a mutagênese direcionada ao local e para os quadros de leitura abertos, codificam a proteína nativa que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, ou 129, bem como aquelas que codificam um polipeptideo que possui as substituições de amino ácidos em relação à proteína nativa, por exemplo, a PPO mutada, de acordo com a presente invenção, conforme descrito no presente. Em geral, as variantes de sequência nucleotidica da presente invenção irão possuir, pelo menos, 30, 40, 50, 60, a 70%, por exemplo, de preferência, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%. para 79%, em geral, pelo menos, 80%, por exemplo, de 81% a 84%,

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39/266 pelo menos, 85%, por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, para 98% e 99% de “identidade de sequência” de sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 ou 130. A porcentagem (%) de identidade de um polinucleotídeo é determinada através da análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de intervalo = 5 e uma penalização de extensão de intervalo = 0,3. Salvo indicação em contrário, a sequência de consulta possui, pelo menos, 45 nucleotideos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências em uma região de, pelo menos, 45 nucleotideos. De preferência, a sequência de consulta possui, pelo menos, 150 nucleotideos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 150 nucleotideos. de maior preferência, a sequência de consulta possui, pelo menos, 300 nucleotideos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 300 nucleotideos. Ainda de maior preferência, a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de todo o seu comprimento.

Polipeptídeos [083]Q termo “polipeptideo substancialmente purificado” ou “purificado” se entende um polipeptideo que foi separado de um ou mais lipídeos, ácidos nucléicos, outros polipeptídeos ou outras moléculas contaminantes com as quais está associado no seu estado nativo. De preferência, é que o polipeptideo substancialmente purificado esteja, pelo menos, 60% livre, de maior preferência, pelo menos, 75% livre e, de maior preferência ainda, pelo menos, 90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado. Como o técnico no assunto irá considerar, o polipeptideo purificado pode ser um polipeptideo produzido de maneira recombinante. Os termos “polipeptideo” e “proteína”, em geral, são utilizados de maneira intercambiável e se referem a

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40/266 uma única cadeia de polipeptídeo que pode ou não ser modificada através da adição de grupos não amino ácidos. Deverá ser entendido que tais cadeias de polipeptídeos podem se associar a outros polipeptídeos ou proteínas ou outras moléculas, tais como os cofatores. Os termos “proteínas” e “polipeptídeos”, conforme utilizados no presente, também incluem as variantes, mutantes, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptídeos da presente invenção, conforme descritos no presente.

[084]A porcentagem (%) de identidade de um polipeptídeo é determinada através da análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de intervalo = 5 e uma penalização de extensão de intervalo = 0,3. A sequência de consulta possui, pelo menos, 25 amino ácidos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 25 amino ácidos. De maior preferência, a sequência de consulta possui, pelo menos, 50 amino ácidos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 50 amino ácidos. De maior preferência, a sequência de consulta possui, pelo menos, 100 amino ácidos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 100 amino ácidos. Ainda de maior preferência, a sequência de consulta possui, pelo menos, 250 amino ácidos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de, pelo menos, 250 amino ácidos. Ainda de maior preferência, a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de todo o seu comprimento.

[085]Em relação a um polipeptídeo definido, será considerado que a porcentagem (%) de valores de identidade superiores aos fornecidos acima irão abranger as realizações de preferência. Por conseguinte, quando aplicável, à luz das porcentagens (%) mínimas de identidade, de preferência, é que o polipeptídeo de PPO da presente invenção compreenda uma sequência de

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41/266 amino ácidos que seja, pelo menos, 40%, de preferência, pelo menos, 45%, de maior preferência, pelo menos, 50%, de maior preferência ainda, pelo menos, 55%, ainda de maior preferência, pelo menos, 60%, ainda de maior preferência, pelo menos, 65%, ainda de maior preferência, pelo menos, 70%, ainda de maior preferência, pelo menos, 75%, ainda de maior preferência, pelo menos, 80%, ainda de maior preferência, pelo menos, 85%, ainda de maior preferência, pelo menos, 90%, ainda de maior preferência, pelo menos, 91%, ainda de maior preferência, pelo menos, 92%, ainda de maior preferência, pelo menos, 93%, ainda de maior preferência, pelo menos, 94%, ainda de maior preferência, pelo menos, 95%, ainda de maior preferência, pelo menos, 96%, ainda de maior preferência, pelo menos, 97%, ainda de maior preferência, pelo menos, 98%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,1%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,2%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,3%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,4%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,5%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,6%, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,7%, ainda de maior preferência, 99,8% e, ainda de maior preferência, pelo menos, 99,9% idênticas às SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62,

63, 64, 65, 66, 67 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83,

84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,

104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117ou 129.

[086]O termo polipeptídeo “variante” significa um polipeptídeo derivado da proteína de SEQ ID NO: 2, por eliminação (denominada truncagem) ou adição de um ou mais amino ácidos à extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; a eliminação ou adição de um ou mais amino ácidos em um ou mais locais na proteína nativa; ou a substituição de um ou mais amino ácidos

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42/266 em um ou mais locais na proteína nativa. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. Os métodos para tais manipulações, em geral, são conhecidos no estado da técnica.

[087]Os “derivados” de uma proteína englobam os peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que possuem as substituições, eliminações e/ou inserções de amino ácidos em relação à proteína não modificada em questão e que possuem a atividade biológica e funcional similar como proteína não modificada a partir de que é derivadom. Por conseguinte, as variantes funcionais e fragmentos dos polipeptídeos de PPO, e as moléculas de ácido nucléico que codifica os mesmos, também estão dentro do âmbito da presente invenção e, a menos que especificamente descrito de outra maneira, independentemente da origem de dito polipeptideo e independentemente de ocorrer naturalmente. Podem ser empregadas diversas análises para a funcionalidade de um polipeptideo de PPO. Por exemplo, uma variante ou fragmento funcional do polipeptideo de PPO pode ser analizada para determinar a sua capacidade para conferir a desintoxicação aos herbicidas. A título ilustrativo, uma taxa de desintoxicação de herbicidas pode ser definida como uma taxa catalítica suficiente para fornecer um aumento determinável na tolerância aos herbicidas em um vegetal ou parte de vegetal que compreende um polinucletídeo recombinante codificando a variante ou fragmento do polipeptideo PPO, em que o vegetal ou parte do vegetal expressa a variante ou fragmento até cerca de 0,5%, de maneira ilustrativa, cerca de 0,05 a cerca de 0,5%, cerca de 0,1 a cerca de 0,4%, e cerca de 0,2 a cerca de 0,3% da proteína de célula total em relação a uma unidade de controle tratada de maneira similar que não expressa a variante ou fragmento.

[088]Em uma realização de preferência, o polipeptideo de PPO mutada é uma variante ou fragmento funcional de uma protoporfirinogênio oxidase que possui a sequência de amino ácidos apresentada na SEQ ID NO:

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1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23,24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,45,

46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 61,62, 63, 64, 65,66,

67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,87,

88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110., 111, 112, 113,114, 115, 116,117ου 129, em que a variante ou fragmento funcional possui, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de amino ácidos com a SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53,54,

55, 56 57, 58, 59 e 6 0, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74,75,

76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95,96,

97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117ou 129.

[089]Em outras realizações, a variante ou fragmento funcional ainda possui uma taxa de detoxificação de herbicidas definida como uma taxa catalítica suficiente para fornecer um aumento determinável na tolerância aos herbicidas em um vegetal ou parte de vegetal que compreende um polinucletídeo recombinante codificando a variante ou fragmento, em que o vegetal ou parte do vegetal expressa a variante ou fragmento até cerca de 0,5% da proteína de célula total para um vegetal de controle tratado de maneira similar que não expressa a variante ou o fragmento.

[090]Qs “homólogos” de uma proteína englobam os peptídeos, oligopeptídeos, polipeptideos, proteínas e enzimas que possuem as substituições, eliminações e/ou inserções de amino ácidos em relação à proteína não modificada em questão e com a atividade biológica e funcional similar como a proteína não modificada a partir de que é derivadom.

[091]Além disso, um técnico no assunto ainda iria entender que as

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44/266 alterações podem ser introduzidas através da mutação nas sequências de nucleotídeos da presente invenção, por conseguinte, provocando as alterações na sequência de amino ácidos das proteínas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas.

[092] Por conseguinte, por exemplo, uma molécula de polinucleotídeo isolada codificando um polipeptídeo de PPO mutada que possui uma sequência de amino ácidos que difere de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,

111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129 pode ser criada introduzindo uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos na sequência de nucleotídeo correspondente, de tal maneira que uma ou mais substituições, adições ou eliminações de amino ácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas através de técnicas padrão, tais como a mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes também estão abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, de preferência, podem ser realizadas substituições de amino ácidos conservativas em um ou mais resíduos de amino ácidos preditos, de preferência, não essenciais. Um resíduo de amino ácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir de sequência do tipo selvagem de uma proteína sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de amino ácido “essencial” é necessário para a atividade biológica.

[093]Uma eliminação se refere à remoção de um ou mais amino ácidos de uma proteína.

[094]Uma inserção se refere a um ou mais resíduos de amino

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45/266 ácidos sendo introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína. As inserções podem compreender as fusões N-terminais e/ou C-terminais, bem como as inserções intra-sequenciais de amino ácidos únicos ou múltiplos. Em geral, as inserções dentro de sequência de amino ácidos serão menores do que as fusões N-terminais ou C-terminais, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Os exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um ativador da transcrição conforme utilizado no sistema híbridos de duas leveduras, proteínas de revestimento do fago, (histidina)-6-tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação à maltose, diidrofolato-redutase, epítopo Tag*100, epítopo cmyc, epítopo-FLAG®, lacZ, CMP (calmodulina peptídeo de ligação), epítopo HA, epítopo da proteína C e epítopo VSV.

[095]Uma “substituição” se refere à substituição de amino ácidos da proteína por outros amino ácidos que possuem propriedades similares (tal como a hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensidade para formar ou romper as estruturas a- helicoidais ou estruturas em folhas-β). As substituições de amino ácidos normalmente são de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas sobre o polipeptídeo e podem variar de 1 a 10 amino ácidos; as inserções, em geral, serão da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de amino ácidos. Uma substituição de amino ácidos conservativa é aquela em que o resíduo de amino ácido é substituído por um resíduo de amino ácido com uma cadeia secundária similar. As famílias de resíduos de amino ácidos que possuem cadeias secundárias similares foram definidas no estado da técnica. Estas famílias incluem os amino ácidos com cadeias secundárias básicas (por exemplo, a lisina, arginina, histidina), cadeias secundárias ácidas (por exemplo, o ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias secundárias polares não carregadas (por exemplo, a glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias secundárias

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46/266 não polares (por exemplo, a alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias secundárias beta ramificadas (por exemplo, a treonina, valina, isoleucina) e cadeias secundárias aromáticas (por exemplo, a tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não seriam realizadas para os resíduos de amino ácidos conservados, ou para os resíduos de amino ácidos que residem dentro de um motivo conservado. As Tabelas de substituição conservative são bem conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds).

[096]As substituições, eliminações e/ou inserções de amino ácidos podem ser realizadas facilmente utilizando as técnicas sintéticas de peptídeos bem conhecidas no estado da técnica, tais como a síntese de peptídeos em fase sólida e similares, ou através da manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para a produção de variantes de substituição, inserção ou eliminação de uma proteína são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, as técnicas para a produção das mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA são bem conhecidas dos técnicos no assunto e incluem a mutagênese M13, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), a mutagênese sítio-direcionada QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), a mutagênese sítio-direcionada mediada por PCR, ou outros protocolos da mutagênese sítio-direcionada.

[097]O termo “derivados” ainda incluem os peptídeos, oligopeptídeos, polipeptideos que podem, em comparação com a sequência de amino ácidos da forma de ocorrência natural da proteína, tal como a proteína de interesse, compreender as substituições de amino ácidos por resíduos de amino ácidos de ocorrência não natural, ou adições de resíduos de amino ácidos de ocorrência não natural. Os “derivados” de uma proteína também englobam os peptídeos, oligopeptídeos, polipeptideos que contêm os resíduos de ocorrência

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47/266 natural (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, e assim por diante) ou resíduos de amino ácidos modificados de ocorrência não natural em comparação com a sequência de amino ácidos de uma forma de ocorrência natural do polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes ou adições de não amino ácidos em comparação com a sequência de amino ácidos de que é derivado, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligante, ligada de maneira covalente ou não covalente à sequência de aminoácido, tal como uma molécula repórter que é ligada para facilitar a sua detecção e os resíduos de amino ácidos que não ocorrem naturalmente em relação à sequência de aminoácidos de uma proteína de ocorrência natural. Além disso, os “derivados” também incluem as fusões da forma de ocorrência natural da proteína com os peptídeos de marcação, tais como o FLAG, HIS6 ou tioredóxina (para uma revisão dos peptídeos de marcação, vide Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

[098]Os termo “ortólogos” e “parálogos” englobam os conceitos evolutivos utilizados para descrever as relações ancestrais dos genes. Os parálogos são genes dentro da mesma espécie que se originaram através da duplicação de um gene ancestral; os ortólogos são genes de diferentes organismos que se originaram através da especiação, e também são derivados de um gene ancestral comum.

[099]É bem conhecido no estado da técnica que os parálogos e ortólogos podem compartilhar domínios distintos que abrigam os resíduos de amino ácidos adequados em determinados locais, tais como as bolsas de ligação para os substratos específicos ou motivos de ligação para a interação com outras proteínas.

[0100]0 termo “domínio” se refere a um conjunto de amino ácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas evolutivamente relacionadas. Embora os amino ácidos

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48/266 em outras posições possam variar entre os homólogos, os amino ácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam os amino ácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados através de seu elevado grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteínas, podem ser utilizados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeo previamente identificada.

[0101]O termo “motivo” ou “sequência de consenso” se refere a uma região curta e conservada na sequência de proteínas evolutivamente relacionadas. Os motivos frequentemente são partes altamente conservadas de domínios, mas também podem incluir apenas uma parte do domínio, ou estar localizados fora do domínio conservado (se todos os amino ácidos do motivo estiverem fora de um domínio definido).

[0102] Existem bancos de dados especializados para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz etal., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. US 95, 5.857-5.864, Letunic etal., (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), Um perfil generalizado sintetiza para os motivos das sequências biomoleculares e sua função na interpretação da sequência automática. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas de 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo etal., Nucl. Acids Res. 32: D134-D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Um conjunto de ferramentas para a análise in siiico de sequências de proteínas está disponível no servidor de proteômica ExPASy (Instituto Suíço de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy: o servidor proteômico para conhecimento e análise de proteínas em profundidade, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). Os domínios ou motivos também podem ser

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49/266 identificados utilizando técnicas de rotina, tal como através de um alinhamento de sequência.

[0103]0s métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica, tais métodos incluem o GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, abrangendo as sequências completas) das duas sequências, que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de intervalos. O algoritmo BLAST (Altschul etal. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a porcentagem da identidade de sequência e executa uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para a execução da análise BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). Os homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento ClustalW de sequências múltiplas (videsão 1.83), com os parâmetros padrão de alinhamento aos pares, e um método de pontuação, em porcentagem. As porcentagens globais da similaridade e identidade também podem ser determinadas utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10 julho de 2003, 04: 29 MatGAT: uma aplicação que gera as matrizes de similaridade / identidade utilizando a proteína ou sequências de DNA. A edição manual menor pode ser executada para otimizar o alinhamento entre os motivos conservados, tal como seria aparente para um técnico do assunto. Além disso, em vez de utilizar as sequências de comprimento total para a identificação dos homólogos, também podem ser utilizados os domínios específicos. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo de toda a sequência do ácido nucléico ou dos aminoácidos ou dos domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), utilizando os programas mencionados acima utilizando os

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50/266 parâmetros padrão. Para os alinhamentos locais, o algoritmo de SmithWaterman é especialmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol Biol 147 (1); 195-7).

[0104]As proteínas da presente invenção podem ser alteradas de diversas maneiras, incluindo as substituições, eliminações, truncamentos e inserções de amino ácidos. Os métodos para tais manipulações, em geral, são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, as variantes de sequência de amino ácidos podem ser preparadas através de mutações no DNA. Os métodos para a mutagênese e alterações na sequência de nucleotídeos são bem conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Kunkel (1985) PNAS, 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; patente US 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova lorque) e as referências citadas no presente. As orientações quanto às substituições de amino ácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C), incorporado no presente como referência. As substituições conservativas, tais como a troca de urn amino ácido por outro que possui propriedades similares, podem ser de preferência.

[0105] De maneira alternativa, as sequências de nucleotídeos variantes podem ser realizadas através da introdução aleatória de mutações ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação, tal como através da mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser varridos para a identificação de mutantes que codificam as proteínas que retêm a atividade. Por exemplo, após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de maneira recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada utilizando as técnicas de análise convencionais.

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51/266 [0106]0s Depositantes da presente invenção descobriram que substituindo um ou mais dos resíduos de amino ácidos nos locais não ativos da enzima de PPO de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4,5,6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,

59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,

101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, por exemplo, utilizando um dos métodos descrito acimas para mutar os ácidos nucléicos codificando a PPO, a tolerância ou resistência aos herbicidas específicos pode ser notavelmente aumentada.

[0107] As substituições de preferência de PPO mutada são aquelas que aumentam a tolerância ao herbicida do vegetal, mas deixam a atividade biológica da atividade enzimática de PPO substancialmente não afetada.

[0108] Por conseguinte, em outro objeto da presente invenção se refere a um polipeptideo de PPO mutada, que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64,

65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85,

86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107,108,109, 110,111,112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, uma sua variante, derivado, ortólogo, parálogo ou homólogo, cujos principais resíduos de amino ácidos são substituídos por qualquer outro amino ácido.

[0109]Será entendido pelo técnico no assunto que os amino ácidos localizados em uma proximidade próxima das posições dos amino ácidos mencionados abaixo também podem ser substituídos. Por conseguinte, em outra realização, a variante de SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,

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15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,116,117 ou 129, um sua variante, derivado, ortólogo, parálogo ou homólogo compreende uma PPO mutada, em que as posições de amino ácido ± 3, ± 2 ou ± 1 amino ácido de um amino ácido chave são substituídas por qualquer outro amino ácido.

[0110]Com base nas técnicas bem conhecidas no estado da técnica, pode ser desenvolvido um padrão de sequências altamente característico, por meio do qual podem ser pesquisados outros candidatos de PPO mutados com a atividade desejada.

[0111 ] A pesquisa de mais candidatos PPO mutados, aplicando um padrão de sequência adequado, também seria abrangida pela presente invenção. Será compreendido por um leitor habilitado que o presente padrão de sequência não é limitado pelas distâncias exatas entre dois resíduos de amino ácidos adjacentes de dito padrão. Cada uma das distâncias entre dois vizinhos nos padrões acima, por exemplo, pode variar independentemente entre si em até ± 10, ± 5, ± 3, ± 2 ou ± 1 posições de amino ácidos sem afetar substancialmente a atividade desejada.

[0112]Além disso, através da aplicação do método dea mutagênese direcionada ao local, por exemplo, a mutagânese de saturação (vide, por exemplo, Schenk et al., Biospektrum 03/2006, páginas 277-279), os Depositantes da presente invenção identificaram e geraram as substituições específicas de amino ácidos e suas combinações, as quais - quando introduzidas em um vegetal através de transformação e expressão do respectivo ácido nucléico codificando a PPO mutada - confere a resistência aumentada ao

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53/266 herbicida ou tolerância a um herbicida para dito vegetal.

[0113] Por conseguinte, em uma realização especialmente de preferência, a variante ou derivado de PPO mutada se refere a um polipeptideo de PPO que compreende a SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54,55,

56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75,76,

77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96,97,

98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, um ortólogo, parálogo ou um seu homólogo, em que a sequência de amino ácidos difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondendo às seguintes posições de SEQ. ID NO: 1 ou 2:

- 32, 53, 57, 61,63, 64, 65, 67, 71,76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 103, 104, 106, 108, 116, 119, 126, 127, 129, 139, 159, 210, 211,224, 245,246,

248, 249, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 262, 264, 286, 291,305, 308,309,

323, 335, 343, 345, 358, 372, 373, 387, 391,392, 400, 412, 414, 415, 425,428,

431,433, 434, 435, 436, 447, 451,453, 464, 466, 482 de SEQ ID NO: 1ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessa posição por qualquer outro amino ácido.

[0114] Em uma realização especialmente de preferência, a variante ou derivado de PPO mutada se refere a um polipeptideo de PPO que compreende a SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117

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54/266 ou 129, um ortólogo, parálogo ou um seu homólogo, em que a sequência de amino ácidos difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptídeo de PPO em uma ou mais posições correspondendo às seguintes posições de SEQ ID NO: 1 ou 2:40, 250, 391,520, 521,522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a um eliminação ou inserção do amino ácido nessas posições.

[0115] De preferência, a diferença correspondente à posição 391 de SEQ ID NO: 1 se refere a uma inserção e a diferença correspondente às posições 40, 250, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530. 531, 532, 533, 534 de SEQ ID NO: 1 ou 2 se refere a uma eliminação.

[0116] De preferência, ditas diferenças nestas posições de amino ácidos (correspondendo às respectivas posições na SEQ ID NO: 2 ou 4) incluem, mas não estão limitadas a um ou mais dos seguintes:

- o amino ácido correspondente à posição G32 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição V53 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição A57 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K61 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K63 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S64 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição H65 é substituído por qualquer outro amino ácido;

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55/266

- o amino ácido correspondente à posição L67 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição L71 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S76 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição L82 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K83 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição V85 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K86 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K87 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição D88 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição 191 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição E103 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição A104 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição V106 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S108 é substituído por qualquer outro amino ácido;

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56/266

- o amino ácido correspondente à posição R116 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Q119 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência Leu;

- o amino ácido correspondente à posição K127 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição N126 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Y129 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição L139 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Q159 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição G210 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência por Ser;

- o amino ácido correspondente à posição G211 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência por Asp, Asn, Thr ou Ala;

- o amino ácido correspondente à posição E224 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição L245 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K248 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S246 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição E249 é substituído por qualquer outro amino ácido;

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57/266

- o amino ácido correspondente à posição G252 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição E253 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição N254 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição A255 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição 1257 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K259 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição P260 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição V262 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição G264 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição D286 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Q291 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição P305 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição G308 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição N309 é substituído por qualquer outro amino ácido;

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58/266

- o amino ácido correspondente à posição Q323 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição R335 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição M343 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição F345 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição T358 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição D372 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K373 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S387 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência Leu;

- o amino ácido correspondente à posição H391 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição N392 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição L400 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S412 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência por Asn;

- o amino ácido correspondente à posição M414 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição C415 é substituído por qualquer outro amino ácido;

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 265/498

59/266

- o amino ácido correspondente à posição R425 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição K428 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição N431 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S433 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição M434 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição D435 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição E436 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Q447 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição T451 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição D453 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição S464 é substituído por qualquer outro amino ácido;

- o amino ácido correspondente à posição Q466 é substituído por qualquer outro amino ácido; e

- o amino ácido correspondente à posição D482 é substituído por qualquer outro amino ácido.

[0117]Os resíduos correspondentes em outras espécies são mostrados na seguinte Tabela:

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 266/498

60/266

Tabelai

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
1	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
2	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
3	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
4	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
5	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
6	G2	V23	A27	K31	K33	S34	H35	L37	L41	S46
7	V30	V52	A56	K60	K62	S63	N64	L66	L70	S75
8	K4	V25	A29	K33	K35	L36	H37	V39	L43	E48
9	S2	V24	A28	K32	K34	S35	H36	L38	V42	E47
10	N6	V23	A27	K31	K33	S34	H35	L37	M41	G46
11	T6	V23	A27	K31	K33	S34	H35	L37	V41	G46
12	L4	V21	A25	K29	K31	S32	H33	F35	V39	G44
13	K6	V23	A27	K31	K33	S34	H35	L37	V41	G46
14	Q6	V23	A27	K31	K33	S34	H35	F37	V41	G46
15	G6	V23	A27	K31	K33	S34	N35	V37	V41	E46
16	G11	V23	A27	K31	K33	S34	N35	V37	V41	E46
17	K6	V23	A27	K31	K33	S34	H35	L37	V41	G46
18	A5	V23	A27	K31	K33	S34	H35	F37	V41	E46
19	-	V18	A22	K26	K28	S29	H30	F32	V36	E41
20	G6	V23	A27	K31	K33	I34	H35	L37	V41	G46
21	G6	V20	A24	K28	K30	V31	H32	L34	V38	G43
22	G4	V26	A30	K34	K36	S37	R38	L40	V44	G49
23	G7	V28	A32	K36	K38	S39	R40	L42	V46	E51
24	G4	V26	A30	K34	K36	S37	R38	L40	V44	G49
25	G50	V72	A76	K80	K82	S83	R84	L86	V90	G95
26	-	-	A3	K7	K9	L10	H11	L13	V17	E22
27	G34	V53	A57	R61	R63	K64	S65	V67	V71	D76
28	G36	V55	V59	R63	R65	K66	S67	V69	V73	D78
29	G4	V26	A30	K34	K36	S37	R38	L40	V44	G49
30	G36	V55	A59	R63	R65	Q66	S67	V69	V73	D78
31	G36	V55	A59	R63	R65	Q66	S67	V69	V73	D78
32	G8	131	A35	K39	K41	S42	N43	F45	V49	G54
33	A41	I69	C73	A77	R86	S87	S88	P90	V94	D99
34	A4	V25	A29	K33	K35	S36	N37	V39	V43	G48
35	A69	V90	A94	K98	K100	S101	K102	L104	V108	G113
36	L36	V59	V63	R67	R69	K70	S71	V73	V77	D82
37	-	V20	A24	R28	R30	K31	R32	V34	V38	D43
38	H4	I25	A29	R33	K35	S36	Q37	L39	I43	G48
39	A2	V23	A27	K31	K33	I34	H35	L37	V41	G46
40	-	V20	A24	R28	R30	K31	R32	V34	V38	D43
41	-	V20	A24	R28	R30	K31	R32	V34	V38	D43
42	A7	V28	-	R29	K31	S32	R33	L35	V39	G44

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 267/498

61/266

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
43	M1	A22	A26	R30	R32	A33	A34	V36	V40	N45
44	M1	A22	A26	R30	R32	A33	A34	V36	V40	N45
45	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
46	G32	V53	A57	K61	K63	S64	H65	L67	L71	S76
47	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
48	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
49	-	V14	S18	K22	K24	L25	N26	L28	V32	G37
50	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
51	-	111	T15	E19	H21	R22	R23	L25	V29	D34
52	-	111	A15	R19	Q21	E22	H23	H25	L29	G34
53	-	111	A15	R19	Q21	E22	H23	H25	V29	G34
54	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
55	-	111	A15	E19	H21	R22	R23	L25	V29	D34
56	-	110	T14	Y18	K20	Q21	Q22	V24	V28	N33
57	S4	I27	T31	R35	T37	Q38	L39	H41	V45	D50
58	-	115	T19	E23	L25	K26	L27	H29	V33	S38
59	-	112	T16	L20	S22	K23	R24	F26	I30	S35
60	-	112	C16	E20	K22	K23	S24	F26	V30	E35
61	-	111	T15	Q19	Q21	Q22	Q23	H25	V29	G34
62	A2	V23	A27	K31	K33	L34	H35	L37	V41	E46
63	-	112	S16	W20	V22	K23	K24	Y26	I30	N35
64	M1	I22	A26	H30	S32	R33	M34	K36	V40	S45
65	-	P16	S20	R24	L26	H27	P31	L33	L39	G44
66	-	V12	S16	H20	Q22	Q23	A24	H26	V30	K35
67	-	112	S16	F20	K22	R23	A24	A26	V30	E35
68	-	111	A15	Q19	Q21	R22	K23	K25	V29	P34
69	-	113	S17	T21	F23	K24	R25	L27	V31	A36
70	-	110	T14	R18	A20	R21	E22	H24	L28	P33
71	-	V12	T16	R20	K22	S23	H24	L26	L30	G35
72	P8	I29	T33	R37	A39	R40	E41	H43	L47	P52
73	-	114	A18	T22	H24	K25	R26	Y28	V32	N37
74	-	V15	A19	T23	K25	N26	R27	V29	L33	G38
75	-	V15	A19	T23	K25	N26	R27	V29	L33	G38
76	-	L13	S17	S21	E23	N24	K25	N27	131	L36
77	-	115	A19	T23	Y25	K26	R27	Y29	V33	N38
78	-	110	S14	Y18	K20	K21	G22	A24	V28	K33
79	-	V11	S15	Y19	E21	K22	F23	G25	I32	N37
80	-	114	S18	S22	N24	R25	S28	R30	V37	N42
81	-	115	A19	T23	K25	N26	R27	V29	L33	G38
82	-	111	T15	L19	Q21	K22	Q23	Q25	V29	K34
83	-	L13	S17	S21	E23	N24	K25	N27	131	L36
84	-	I20	T24	R28	Q30	Q31	R36	G38	L45	S50
85	-	110	V14	Q18	Q20	K21	A22	V24	L28	T33
86	-	110	S14	Y18	Q20	R21	Q22	V24	L28	S33

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 268/498

62/266

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
87	-	115	A19	H23	K25	L26	A27	R29	L33	D38
88	-	L14	T18	H22	R24	H25	K26	Q28	V32	E37
89	-	I9	S13	H17	Q19	K20	L21	K23	L27	D32
90	-	111	A15	E19	R21	N22	I29	L31	L35	E40
91	-	112	T16	R20	Q22	Q23	S31	Q33	L37	S42
92	-	111	S15	A19	H21	Q22	D23	R25	L29	E34
93	-	117	S21	H25	Q27	E28	Q35	V37	L41	P46
94	-	111	A15	L19	R21	E22	M29	L31	I35	D40
95	-	111	A15	F19	R21	K22	Q23	W25	L29	A34
96	-	L13	T17	Y21	R23	R24	K25	Q27	V31	D36
97	-	V10	S14	Y18	K20	R21	G22	A24	L28	N33
98	G41	I65	C69	A73	V75	T76	A81	K83	V87	D92
99	N4	V25	A29	K33	K35	S36	K37	V39	V43	G48
100	S47	I68	C72	A76	A78	T79	V84	S86	V90	D95
101	A2	V23	A27	K31	K33	S34	Q35	L37	V41	G46
102	A45	I67	C71	A75	S77	T78	H80	G82	V86	E91
103	T6	V27	A31	K35	K37	L38	H39	141	V45	E50
104	-	I94	C98	A102	S104	T105	L110	T112	V116	D121
105	S36	I60	C64	A68	A70	T71	G74	T76	V80	A85
106	M1	V22	V26	R30	R32	K33	S34	V36	V40	D45
107	S47	I68	C72	A76	A78	T79	V84	S86	V90	D95
108	A64	I89	C93	A97	C99	T100	L105	P107	V111	D116
109	T38	I59	C63	A67	A69	T70	G73	G75	V79	D84
110	L47	V67	V71	M75	R77	K78	S79	V81	V85	D90
111	T39	I60	C64	A68	A70	T71	G74	S76	V80	D85
112	-	V20	A24	K28	K30	V31	H32	L34	V38	G43
113	T54	I75	C79	A83	A85	T86	G89	S91	V95	D100
114	S47	I68	C72	A76	A78	T79	V84	S86	V90	D95
115	A2	V23	A27	K31	K33	S34	Q35	L37	V41	G46
116	A64	I89	C93	A97	C99	T100	L105	P107	V111	D116
117	S3	V24	A28	K32	K34	S35	K36	V38	V42	G47
129	Y32	I62	V66	R70	S72	K73	S74	V76	V80	D85

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18	Pos 19	Pos 20
1	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
2	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
3	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
4	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
5	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
6	L52	K53	V55	K56	K57	D58	161	E73	A74	V76
7	L81	K82	V84	V85	K86	D87	I90	D102	E103	V105
8	L54	R55	V57	S58	Q59	H60	V63	E75	I76	V78
9	L53	R54	V56	N57	H58	D59	I62	E74	M75	V77
10	L52	R53	V55	S56	Q57	E58	161	E73	I74	V76

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 269/498

63/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18	Pos 19	Pos 20
11	L52	R53	V55	S56	Q57	D58	161	E73	I74	V76
12	L50	R51	V53	S54	H55	D56	I59	E71	K72	V74
13	L52	R53	V55	S56	R57	D58	V61	E73	I74	V76
14	L52	R53	V55	S56	Y57	N58	161	E73	T74	V76
15	L52	R53	I55	S56	K57	D58	161	E73	M74	V76
16	L52	R53	I55	S56	K57	D58	161	E73	M74	V76
17	L52	R53	V55	S56	R57	D58	V61	E73	A74	V76
18	L52	R53	V55	S56	Y57	K58	161	E73	P74	V76
19	L47	R48	V50	S51	Y52	K53	I56	E68	P69	V71
20	L52	R53	V55	S56	Q57	D58	161	E73	G74	V76
21	L49	R50	L52	S53	Q54	D55	I58	E70	G71	V73
22	L55	R56	V58	M59	Q60	N61	I64	E76	P77	V79
23	L57	T58	V60	M61	Q62	N63	I66	E78	P79	V81
24	L55	R56	V58	M59	Q60	N61	I64	E76	P77	V79
25	L101	R102	V104	M105	Q106	N107	1110	E122	P123	V125
26	L28	R29	V31	S32	Q33	D34	I37	E49	A50	V52
27	I82	R83	N85	S86	E87	A88	L91	E103	L104	V106
28	I84	R85	N87	S88	E89	G90	L93	E105	L106	A108
29	L55	R56	V58	M59	Q60	N61	I64	E76	P77	V79
30	I84	R85	N87	S88	E89	G90	V93	E105	W106	A108
31	I84	R85	N87	S88	E89	G90	V93	E105	W106	A108
32	I60	R61	G63	S64	Q65	E66	I69	-	V81	A83
33	1105	T106	V108	E109	R110	D111	L114	D126	A127	L129
34	L54	R55	V57	S58	H59	H60	V63	E75	V76	V78
35	L119	R120	V122	M123	H124	N125	1128	E140	P141	V143
36	I88	R89	N91	S92	D93	S94	L97	A109	L110	A112
37	I49	R50	N52	S53	E54	G55	I58	E70	L71	A73
38	I54	K55	F57	A58	Q59	N60	I63	E75	P76	V78
39	L52	R53	L55	S56	Q57	D58	161	E73	G74	V76
40	I49	R50	N52	S53	E54	G55	I58	E70	L71	A73
41	I49	R50	N52	S53	E54	G55	I58	E70	L71	A73
42	L50	R51	V53	M54	H55	K56	I59	E71	P72	V74
43	L51	K52	V54	S55	E56	N57	I60	D72	P73	I75
44	L51	K52	V54	S55	E56	N57	I60	D72	P73	I75
45	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
46	L82	K83	V85	K86	K87	D88	191	E103	A104	V106
47	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
48	-	-	-	-	-	-	-	A5	L6	A8
49	I43	R44	S46	S47	Q48	D49	I52	E64	E65	V67
50	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
51	I40	Q41	E43	R44	I45	D46	L49	S61	G62	F64
52	I40	R41	E43	S44	S45	E46	L49	A61	A62	L64
53	I40	R41	E43	S44	S45	E46	L49	A61	A62	L64
54	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 270/498

64/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18	Pos 19	Pos 20
55	I40	Q41	E43	R44	I45	D46	L49	S61	G62	F64
56	V39	I40	E42	K43	K44	D45	L48	S60	Q61	L63
57	I56	K57	E59	E60	V61	D62	L65	E77	L78	V80
58	I44	E45	I47	R48	Q49	N50	L53	S65	P66	I68
59	141	E42	I44	K45	E46	N47	L50	T62	P63	I65
60	141	G42	T44	A45	R46	D47	R50	S62	Q63	T65
61	I40	R41	E43	R44	T45	D47	L50	T62	P63	V65
62	P52	R53	V55	S56	Q57	D58	161	E73	A74	A76
63	M41	I42	R44	R45	L46	D47	L50	T62	P63	I65
64	V51	G52	I54	E55	E56	D57	L60	T71	P72	M74
65	V50	T51	A53	C54	D55	A56	C59	H71	P72	V74
66	141	Q42	I44	R45	E46	D47	L50	D62	K63	I65
67	M41	R42	R44	R45	F46	K47	L50	T62	P63	F65
68	I40	Q41	I43	L44	Q45	D46	L49	S61	L62	I64
69	M42	R43	I45	V46	T47	E49	V52	D64	P65	M67
70	I39	R40	E42	R43	D44	G45	L48	K60	P61	L63
71	141	R42	I44	A45	Y46	G47	I50	E62	M63	V65
72	I58	R59	E61	R62	D63	G64	L67	K79	P80	L82
73	I43	Q44	I46	T47	T48	E50	I53	D65	A66	L68
74	I44	R45	V47	R48	E49	D50	L53	E66	D67	I69
75	I44	R45	V47	R48	E49	D50	L53	E66	D67	I69
76	L42	Q43	I45	K46	S47	E48	L51	T63	K64	T66
77	I44	H45	I47	T48	T49	E51	T54	D66	V67	L69
78	M39	K40	I42	H43	E44	D45	I48	K60	P61	T63
79	M43	L44	V46	Q47	K48	D49	I52	K64	P65	T67
80	I48	T49	G51	R52	A53	D54	L57	T68	P69	L71
81	V44	R45	V47	R48	E49	E50	L53	D66	D67	I69
82	I40	S41	F43	R44	E45	E46	L49	D61	P62	V64
83	L42	Q43	I45	K46	S47	E48	L51	T63	K64	T66
84	I56	S57	Q59	S60	K61	D62	R65	T76	P77	L79
85	L39	R40	V42	S43	H44	D46	L49	S60	D61	L63
86	M39	R40	L42	R43	K44	N45	T48	N59	E60	L62
87	I44	R45	L47	S48	D49	S50	R53	E66	E67	L69
88	M43	Q44	E46	D47	F48	D49	I52	Y64	P65	V67
89	I38	C39	V41	K42	K43	E44	L47	D58	S59	161
90	I46	W47	I49	K50	E51	E52	L55	K67	P68	T70
91	I48	S49	Q51	S52	K53	D54	R57	V68	P69	L71
92	I40	T41	G43	K44	A45	G46	L49	T60	P61	L63
93	I52	G53	I55	S56	Q57	D58	R61	K73	P74	A76
94	I46	R47	I49	K50	E51	D52	L55	K67	P68	T70
95	L40	Q41	R43	Q44	E45	E46	L49	G61	H62	V64
96	M42	Q43	E45	E46	V47	D48	V51	Y63	P64	V66
97	A39	R40	Y42	Y43	E44	K45	I48	K60	P61	T63
98	I98	I99	R101	E102	E103	Q104	L107	S118	D119	M121

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 271/498

65/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18	Pos 19	Pos 20
99	L54	R55	V57	M58	H59	N60	I63	E75	P76	V78
100	1101	T102	V104	E105	R106	D107	L110	S121	D122	1124
101	L52	R53	V55	S56	R57	E58	161	E73	I74	V76
102	I97	S98	V100	E101	R102	D103	L106	S117	D118	M120
103	L56	R57	I59	S60	Q61	N62	I65	E77	P78	V80
104	1127	T128	K130	E131	D132	D133	1136	S147	D148	V150
105	191	T92	V94	E95	R96	E99	L102	S113	D114	V116
106	151	R52	N54	S55	D56	G57	L60	A72	L73	A75
107	1101	T102	V104	E105	R106	D107	L110	S121	D122	1124
108	1122	V123	V125	E126	A127	D128	1131	S142	D143	V145
109	I90	T91	V93	E94	R95	E98	L101	S112	D113	V115
110	I96	R97	N99	S100	D101	G102	L105	A117	L118	A120
111	191	T92	V94	E95	R96	E99	L102	S113	D114	V116
112	L49	R50	L52	S53	Q54	D55	I58	E70	G71	V73
113	1106	T107	V109	E110	R111	E114	L117	S128	D129	V131
114	1101	T102	V104	E105	R106	D107	L110	S121	D122	1124
115	L52	R53	V55	S56	R57	D58	161	E73	I74	V76
116	1122	V123	V125	E126	A127	D128	1131	S142	D143	V145
117	L53	R54	V56	M57	H58	N59	I62	E74	P75	V77
129	191	R92	N94	S95	D96	S97	L100	A112	L113	A115

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID	Pos 21	Pos 22	Pos 23	Pos 24	Pos 25	Pos 26	Pos 27	Pos 28	Pos 29	Pos 30
1	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	G210	G211
2	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	G210	G211
3	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	-	G210
4	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	-	G210
5	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	G210	G211
6	S78	R86	Q89	N96	K97	Y99	L109	Q129	G180	G181
7	S107	R115	L118	N125	K126	Y128	L138	Q158	G209	G210
8	S80	R88	Q91	N98	K99	Y101	L111	Q131	G182	G183
9	S79	R87	Q90	N97	K98	Y100	1110	Q130	A181	G182
10	S78	R86	Q89	K96	K97	Y99	1109	Q129	A180	G181
11	G78	Q86	Q89	H96	K97	Y99	V109	H129	A180	A181
12	T76	R84	Q87	N94	K95	Y97	1107	Q127	A175	G176
13	G78	H86	Q89	H96	K97	Y99	V109	Q129	A180	A181
14	T78	R86	Q89	N96	K97	Y99	L109	Q129	A177	G178
15	G78	R86	Q89	Y96	K97	Y99	1109	Q129	A180	A181
16	G78	R86	Q89	Y96	K97	Y99	1109	Q129	A180	A181
17	S78	Q86	Q89	H96	K97	Y99	V109	R129	A180	A181
18	C78	R86	Q89	N96	K97	Y99	V109	Q129	A180	G181
19	C73	R81	Q84	N91	K92	Y94	V104	Q124	A175	G176
20	F78	R86	Q89	N96	K97	Y99	L109	Q129	G178	G179
21	F75	R83	Q86	N93	K94	Y96	1106	Q126	G175	G176

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 272/498

66/266

SEQ ID	Pos 21	Pos 22	Pos 23	Pos 24	Pos 25	Pos 26	Pos 27	Pos 28	Pos 29	Pos 30
22	S81	R89	Q92	K99	K100	Y102	L112	Q132	A182	A183
23	S83	R91	Q94	K101	K102	Y104	L114	Q134	A186	A187
24	S81	R89	Q92	K99	K100	Y102	L112	Q132	A182	A183
25	S127	R135	Q138	K145	K146	Y148	L158	Q178	A228	A229
26	S54	R62	Q65	H72	K73	Y75	I85	Q105	G151	G152
27	R108	Q116	Q119	H126	K127	Y129	1139	A159	A213	G214
28	R110	Q118	Q121	H128	K129	Y131	1141	A161	A215	G216
29	S81	R89	Q92	K99	K100	Y102	-	-	A152	A153
30	R110	Q118	Q121	H128	K129	Y131	1141	A161	A215	G216
31	R110	Q118	Q121	H128	K129	Y131	1141	A161	A215	G216
32	E85	R93	Q96	S103	K104	Y106	1116	R136	G188	G189
33	M131	K138	L141	A148	P149	F151	V161	R181	A226	G227
34	S80	R88	Q91	N98	K99	Y101	1111	Q131	A182	G183
35	T145	R153	Q156	K163	K164	Y166	1176	E196	A248	A249
36	R114	Q122	Q125	H132	K133	Y135	1145	K165	A219	G220
37	R75	Q83	Q86	H93	K94	Y96	1106	K126	G179	G180
38	K80	R88	Q91	S98	K99	Y101	L111	N131	G186	A187
39	F78	R86	Q89	N96	K97	Y99	1109	Q129	G178	G179
40	R75	Q83	Q86	H93	K94	Y96	1106	K126	G190	G191
41	R75	Q83	Q86	H93	K94	Y96	1106	K126	G190	G191
42	S76	R84	Q87	K94	K95	Y97	1107	Q127	A179	A180
43	R77	R85	Q88	K95	K96	Y98	L108	K128	G175	S176
44	R77	R85	Q88	K95	K96	Y98	L108	K128	G175	S176
45	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	G210	G211
46	S108	R116	Q119	N126	K127	Y129	L139	Q159	-	G210
47	-	-	-	-	-	-	-	A13	A67	G68
48	R10	E18	L21	H28	K29	Y31	-	K42	A96	G97
49	F69	R77	Q80	Q87	K88	Y90	L100	Q120	G168	G169
50	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
51	E66	E74	C77	A85	N86	F88	L98	R118	A162	G163
52	T66	H74	R77	D85	T86	Y88	L98	R118	A161	G162
53	T66	H74	R77	D85	T86	Y88	L98	R118	A161	G162
54	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
55	E66	E74	C77	A85	N86	F88	L98	R118	A162	G163
56	Q65	Q73	K76	N84	K85	Y87	L97	Q117	A160	G161
57	K82	N90	R93	K101	N102	Y104	A114	K134	A178	G179
58	A70	D78	K81	K89	N90	Y92	M102	N122	A166	G167
59	Q67	K75	L78	N86	K87	Y89	L99	R119	A163	G164
60	D67	K75	I78	K86	K87	F89	V99	R119	G163	A164
61	R67	E75	R78	A85	T86	F89	L99	R119	A163	G164
62	S78	R86	Q89	H96	K97	Y99	1109	Q129	G175	G176
63	K67	S75	M78	A85	S86	Y89	L99	R119	A163	G164
64	A76	V84	I87	A94	K95	F98	L108	H128	A170	G171

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 273/498

67/266

SEQ ID	Pos 21	Pos 22	Pos 23	Pos 24	Pos 25	Pos 26	Pos 27	Pos 28	Pos 29	Pos 30
65	D76	K85	M88	A95	K96	Y99	L109	H129	S176	G177
66	A67	D75	I78	S85	K86	F89	L99	R119	A163	G164
67	E67	A75	R78	A85	R86	Y89	L99	R119	A161	G162
68	D66	E75	I78	A85	Q86	Y89	V99	R119	A163	G164
69	A69	R77	L80	G87	K88	Y91	1101	R121	S164	G165
70	A65	E73	R76	A83	K84	F87	A97	R117	A161	G162
71	R67	R75	Q78	N85	K86	F88	I98	R118	A173	A174
72	A84	E92	R95	A102	K103	F106	A116	R136	A180	G181
73	Q70	R78	181	S88	K89	F92	1102	R122	A166	G167
74	T71	R79	I82	S89	K90	Y93	V103	D123	A167	S168
75	T71	R79	I82	S89	K90	Y93	V103	D123	A167	S168
76	D68	L76	A79	S86	S87	F90	L100	R120	A165	A166
77	Q71	R79	I82	G89	R90	Y93	1103	R123	A167	G168
78	N65	E73	L76	A83	R84	F87	L97	R117	A161	G162
79	D69	E77	L80	A87	R88	F91	L101	R121	A165	G166
80	G73	K81	L84	L91	P92	Y94	V104	R124	A176	G177
81	A71	R79	I82	S89	K90	Y93	V103	D123	A167	S168
82	T66	R74	L77	A84	S85	Y88	V98	G118	A164	G165
83	D68	L76	A79	S86	S87	F90	L100	R120	A165	A166
84	N81	T89	L92	L99	P100	Y102	V112	R132	A177	G178
85	E65	V73	I76	S83	K84	Y87	L97	N117	A161	G162
86	Q64	E72	L75	N82	N83	Y86	V96	R116	G159	G160
87	K71	A79	I82	G89	K90	F93	L103	R123	A172	S173
88	E69	K77	L80	A87	K88	L91	L101	R121	A164	G165
89	D63	E71	M74	S81	K82	Y85	L95	S115	A158	G159
90	D72	S80	L83	A90	R91	F94	L104	R124	A168	G169
91	N73	A81	L84	L91	P92	Y94	V104	R124	A169	G170
92	K65	R73	L76	L83	P84	F86	V96	R116	A168	G169
93	E78	E86	L89	Y96	R97	L100	V110	R138	T187	S188
94	D72	D80	L83	A90	R91	F94	L104	R124	A170	G171
95	E66	E74	I77	A84	K85	Y88	V97	R117	A162	G163
96	E68	D76	L79	A86	K87	L90	L100	R120	A163	G164
97	E65	E73	L76	A83	R84	F87	L97	R117	A160	G161
98	T123	K131	L134	A141	P142	F144	V154	R174	A219	G220
99	S80	R88	Q91	K110	K111	Y113	1123	Q143	A195	A196
100	T126	K134	L137	A144	P145	F147	V157	R177	A222	G223
101	S78	Q86	E89	N96	K97	Y99	1109	Q129	A180	G181
102	T122	K130	L133	A140	P141	F143	V153	R173	A218	G219
103	R82	R90	Q93	H100	K101	Y103	V113	Q133	G179	G180
104	T152	K160	L163	A170	P171	F173	V183	R203	A248	G249
105	T118	K126	L129	A136	P137	F139	V149	R169	A214	G215
106	R77	E85	L88	H95	K96	Y98	1108	K128	A182	G183
107	T126	K134	L137	A144	P145	F147	V157	R177	A222	G223

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 274/498

68/266

SEQ ID	Pos 21	Pos 22	Pos 23	Pos 24	Pos 25	Pos 26	Pos 27	Pos 28	Pos 29	Pos 30
108	T147	K155	L158	A165	P166	F168	V178	R198	A243	G244
109	T117	K125	L128	A135	P136	F138	V148	R168	A213	G214
110	R122	Q130	L133	H140	K141	Y143	1153	K173	A227	G228
111	T118	K126	L129	A136	P137	F139	V149	R169	A214	G215
112	F75	R83	Q86	N93	K94	Y96	1106	Q126	G175	G176
113	T133	K141	L144	A151	P152	F154	V164	R184	A229	G230
114	T126	K134	X137	A144	P145	F147	V157	R177	A222	G223
115	S78	Q86	Q89	N96	K97	Y99	1109	Q129	A180	G181
116	T147	K155	L158	A165	P166	F168	V178	R198	A243	G244
117	S79	R87	Q90	K97	K98	Y100	1110	Q130	A182	A183
129	R117	E125	L128	H135	K136	Y138	1148	K168	A222	G223

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID	Pos 31	Pos 32	Pos 33	Pos 34	Pos 35	Pos 36	Pos 37	Pos 38	Pos 39	Pos 40
1	E224	L245	S246	K248	E249	G252	E253	N254	A255	I257
2	E224	L245	S246	K248	E249	G252	E253	N254	A255	I257
3	E223	L244	S245	K247	E248	G251	E252	N253	A254	I256
4	E223	L244	S245	K247	E248	G251	E252	N253	A254	I256
5	D224	L245	S246	K248	E249	G252	G253	E254	A256	I258
6	E194	L215	S216	K218	E219	G222	G223	G224	A226	I228
7	E223	S244	S245	K247	E248	G251	E252	K253	S255	N257
8	E196	S217	A218	R220	E221	G224	E225	T226	S229	E231
9	E195	S216	T217	R219	G220	Q223	E224	T225	S228	V230
10	E194	S215	A216	R218	E219	G222	E223	R224	T226	E228
11	E194	F215	A216	R218	E219	G222	E223	N224	A227	R229
12	D189	S210	A211	K213	G214	G217	E218	T219	S222	E224
13	E194	F215	G216	K218	D219	G222	E223	T224	V227	R229
14	E191	S212	S213	K215	E216	G219	D220	T221	S224	E226
15	E194	S215	A216	K218	E219	A222	E223	A224	S227	E229
16	E194	S215	A216	K218	E219	A222	E223	A224	S227	E229
17	E194	F215	G216	R218	D219	G222	E223	T224	A227	R229
18	E194	S215	T216	K218	E219	G222	V223	R224	T227	G229
19	E189	S210	T211	K213	E214	G217	V218	R219	T222	G224
20	E192	S213	P214	N216	E217	Q220	G221	P222	T225	A227
21	D189	S210	P211	K213	E214	Q217	G218	P219	T222	I224
22	D196	A217	A218	G220	G221	R224	D225	T226	S229	G231
23	D200	A221	A222	G224	G225	G228	E229	A230	S233	G235
24	D196	A214	A215	G217	G218	R221	D222	T223	S226	G228
25	D242	A260	A261	G263	G264	R267	D268	T269	S272	G274
26	E165	S186	S187	G189	G190	K193	-	-	P194	G196
27	A227	T248	A249	G251	D252	K255	T256	G257	L260	G262
28	A229	T250	A251	G253	D254	K257	T258	R259	S262	A264
29	D166	A187	A188	G190	G191	R194	D195	T196	S199	G201
30	A229	A250	A251	G253	D254	K257	T258	R259	S262	G264

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 275/498

69/266

SEQ ID	Pos 31	Pos 32	Pos 33	Pos 34	Pos 35	Pos 36	Pos 37	Pos 38	Pos 39	Pos 40
31	A229	A250	A251	G253	D254	K257	T258	R259	S262	G264
32	E202	L223	D224	R226	K227	T231	E232	R233	A234	V236
33	K240	E261	R262	K264	N265	P269	R270	D271	P272	L274
34	D196	S217	A218	K220	E221	K226	K227	G228	S229	E231
35	D283	A304	A305	-	-	-	-	-	-	-
36	G233	T254	A255	G257	D258	A263	D264	T265	S266	G268
37	A193	S214	T215	G217	D218	G223	G224	A225	S226	G228
38	E200	S221	R222	K224	A225	A229	K230	H231	V232	H234
39	E192	S213	P214	K216	E217	P222	P223	K224	T225	V227
40	A204	S225	T226	G228	D229	G234	G235	A236	S237	G239
41	A204	S225	T226	G228	D229	G234	G235	A236	S237	G239
42	D193	A214	A215	G217	G218	T223	R224	T225	S226	G228
43	E189	S210	K211	K213	K214	S227	D228	F229	P230	R232
44	E189	S210	K211	K213	K214	S227	D228	F229	P230	R232
45	E224	-	-	-	-	-	-	-	-	-
46	E223	-	-	-	-	-	-	-	-	-
47	A81	A102	A103	G105	D106	R111	H112	D113	S114	G116
48	G110	T131	A132	G134	D135	G140	G141	A142	S143	G145
49	D182	S203	A204	R206	G207	N212	K213	G214	S215	T217
50	-	S2	S3	G5	E6	H11	E12	A13	T14	R16
51	K176	K197	Q198	Y200	H201	-	-	-	-	-
52	R175	T196	S197	D199	G200	-	-	-	-	-
53	R175	T196	S197	D199	G200	-	-	-	-	-
54	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
55	K176	K197	Q198	Y200	H201	-	-	-	-	-
56	K174	E195	R196	K198	R199	-	-	-	-	-
57	K192	A213	R214	A216	R217	-	-	-	-	-
58	K180	E201	R202	K204	R205	-	-	-	-	-
59	K177	E198	R199	K201	R202	-	-	-	-	-
60	P177	E198	K199	A201	A202	-	-	-	-	-
61	R177	T198	G199	T201	D202	S205	T206	A207	T208	R210
62	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
63	K177	E198	R199	Q201	R202	E205	S206	K207	Q208	A210
64	K184	A205	A206	A208	N209	P212	V213	T214	L215	A217
65	K190	K211	T212	P214	D215	Y218	K219	P220	Y221	G223
66	K177	D198	Q199	N201	S202	S205	K206	H207	K208	Q210
67	R175	E196	R197	R199	R200	A203	P204	K205	I206	A208
68	K177	A198	A199	A201	N202	P205	K206	A207	K208	Y210
69	S178	A199	K200	A202	A203	K206	K207	A208	K209	1211
70	L175	A196	R197	A199	T200	A203	G204	P205	A206	K208
71	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
72	L194	A215	R216	A218	T219	A222	G223	P224	A225	K227
73	S180	P201	K202	Q204	V205	P208	K209	M210	R211	R213

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 276/498

70/266

SEQ ID	Pos 31	Pos 32	Pos 33	Pos 34	Pos 35	Pos 36	Pos 37	Pos 38	Pos 39	Pos 40
74	L181	K202	R203	K205	R206	G209	S210	S211	P212	G214
75	L181	K202	R203	K205	R206	G209	S210	S211	P212	G214
76	S179	Q200	P201	E203	K204	K207	S208	-	-	-
77	S181	Q202	K203	L205	I206	P209	K210	M211	R212	R214
78	A175	E196	A197	K199	S200	K203	S204	G205	P206	G208
79	A179	E200	K201	D203	A204	G207	P208	G209	-	-
80	R190	N211	K212	A214	P215	T218	P219	D220	P221	I223
81	L181	K202	R203	K205	R206	G209	S210	A211	P212	G214
82	L178	K199	Q200	-	-	G204	T205	A206	Y207	K209
83	S179	Q200	P201	E203	K204	K207	S208	-	-	-
84	R191	Q212	R213	Q215	P216	A219	A220	1221	Q222	P224
85	K175	G196	A197	R199	R200	-	-	-	-	-
86	E173	R194	G195	-	-	-	-	-	-	-
87	R186	Q207	K208	-	-	-	-	-	-	A210
88	K178	A199	P200	-	-	-	-	K201	S202	R204
89	A172	N193	T194	-	-	-	-	-	-	-
90	R182	K203	K204	E207	A208	G211	K212	A213	V214	S216
91	R183	S204	R205	H216	Q217	A220	N221	S222	P223	Q225
92	R182	Q203	R204	Q206	Q207	P210	T211	D212	P213	L215
93	R201	Q222	T223	-	-	-	K224	S225	A226	A228
94	R184	K205	K206	E209	1210	G213	K214	Q215	V216	S218
95	R176	K197	K198	-	-	-	-	S199	P200	T202
96	K177	Q198	P199	-	-	-	-	K200	T201	R203
97	T174	E195	A196	-	K197	G200	A201	K202	S203	G205
98	K233	A254	K255	A258	P259	T262	R263	D264	P265	L267
99	D209	A230	A231	K235	N236	T239	K240	S241	S242	G244
100	R236	E257	R258	T261	P262	P265	R266	D267	P268	L270
101	E194	S215	A216	T219	N220	E223	T224	K225	N226	V228
102	K232	A253	K254	S257	T258	P261	R262	D263	P264	L266
103	E193	S214	S215	-	R216	K219	K220	S221	P222	G224
104	R262	E283	K284	K287	P288	P291	R292	D293	P294	L296
105	K228	D249	R250	N253	P254	P257	R258	D259	P260	L262
106	A196	T217	A218	S222	T223	G226	S227	A228	V229	G231
107	R236	E257	R258	T261	P262	P265	R266	D267	P268	L270
108	K257	E278	R279	N282	P283	P286	R287	D288	Q289	L291
109	K227	D248	K249	N252	P253	P256	R257	D258	P259	L261
110	G241	T262	A263	S267	A268	G271	G272	A273	S274	G276
111	K228	D249	K250	N253	P254	P257	R258	D259	P260	L262
112	D189	S210	P211	K215	K216	P219	P220	R221	T222	I224
113	K243	D264	K265	N268	P269	P272	R273	D274	P275	L277
114	R236	E257	R258	T261	P262	P265	R266	D267	P268	L270
115	G194	S215	A216	T219	N220	E223	T224	K225	N226	V228
116	K257	E278	R279	N282	P283	P286	R287	D288	Q289	L291

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 277/498

71/266

SEQ ID	Pos 31	Pos 32	Pos 33	Pos 34	Pos 35	Pos 36	Pos 37	Pos 38	Pos 39	Pos 40
117	D196	A217	A218	K222	N223	T226	K227	S228	S229	G231
129	G236	T257	A258	G260	D261	G264	S265	A266	V267	G269

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID	Pos 41	Pos 42	Pos 43	Pos 44	Pos 45	Pos 46	Pos 47	Pos 48	Pos 49	Pos 50
1	K259	P260	V262	G264	D286	Q291	P305	G308	N309	Q323
2	K259	P260	V262	G264	D286	Q291	P305	G308	N309	Q323
3	K258	P259	V261	G263	D285	Q290	P304	G307	N308	Q322
4	K258	P259	V261	G263	D285	Q290	P304	G307	N308	Q322
5	K260	P261	V263	G265	D287	Q292	P306	G309	N310	Q324
6	K230	P231	V233	G235	D257	Q262	P276	G279	N280	Q294
7	K259	P260	V262	G264	D286	Q291	L305	E308	N309	Q323
8	K233	K234	Q236	G238	D260	K265	S279	E282	N283	K297
9	K232	K233	Q235	G237	D259	E264	S278	E281	N282	Q296
10	R230	K231	L233	G235	D257	K262	S276	E279	N280	Q294
11	N231	K232	K234	G236	D258	N263	S277	Q280	N281	-
12	G226	K227	Q229	G231	D253	N258	S272	E275	N276	Q290
13	N231	K232	Q234	G236	D258	N263	S277	Q280	N281	-
14	G228	K229	Q231	G233	H255	N260	S274	E277	N278	Q292
15	K231	H232	Q234	G236	D258	K263	S277	E280	N281	Q294
16	K231	H232	Q234	G236	D258	K263	S277	E280	N281	Q294
17	S231	K232	Q234	G236	D258	N263	S277	E280	N281	-
18	S231	K232	R234	G236	G258	R263	Y276	Q279	N280	L294
19	S226	K227	R229	G231	G253	R258	Y271	Q274	N275	L289
20	K229	K230	Q232	G234	D256	N261	S275	D278	S279	E293
21	K226	K227	Q229	G231	D253	N258	S272	D275	S276	E290
22	K233	K234	S236	G238	D260	D265	Q279	E280	N281	Q295
23	K237	R238	S240	R242	D264	D269	Q283	E284	N285	Q299
24	K230	K231	S233	G235	D257	D262	Q276	E277	N278	Q292
25	K276	K277	S279	G281	D303	D308	Q322	E323	N324	Q338
26	S198	K199	R201	G203	H225	Q230	A244	G246	N247	Q261
27	R264	R265	R267	A269	D291	G296	P310	G313	G314	D328
28	R266	R267	R269	V271	D293	G298	P312	G315	G316	D330
29	K203	K204	S206	G208	D230	D235	Q249	E250	N251	Q265
30	R266	R267	R269	V271	D293	G298	P312	G315	R316	D330
31	R266	R267	R269	V271	D293	G298	P312	G315	R316	D330
32	K238	R239	P241	G243	E265	N270	P284	D287	S288	S307
33	T276	P277	G279	T281	D302	S307	-	G319	G320	V334
34	K233	K234	Q236	G238	D260	E265	S279	E282	N283	S299
35	-	-	-	-	D322	D327	Q341	E342	N343	L359
36	G270	R271	K273	A275	G297	G302	S316	D319	G320	Q339
37	G230	R231	K233	V235	G257	G262	S276	G279	G280	Q299
38	Q236	K237	Q239	G241	E263	H268	P282	N285	N286	Q305
39	K229	K230	Q232	G234	D256	N261	S275	D278	S279	E295

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 278/498

72/266

SEQ ID	Pos 41	Pos 42	Pos 43	Pos 44	Pos 45	Pos 46	Pos 47	Pos 48	Pos 49	Pos 50
40	G241	R242	K244	V246	G268	G273	S287	G290	G291	Q310
41	G241	R242	K244	V246	G268	G273	S287	G290	G291	Q310
42	K230	K231	S233	G235	D257	D262	Q276	E277	N278	L294
43	R234	P235	R237	G239	E261	N266	P280	Q283	S284	K302
44	R234	P235	R237	G239	E261	N266	P280	Q283	S284	K302
45	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
46	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
47	R118	R119	R121	V123	D145	G150	P164	G167	R168	Q187
48	G147	R148	K150	A152	S174	G179	S193	D196	G197	Q216
49	E219	R220	K222	K224	N246	R251	S265	D268	S269	T286
50	P18	K19	Q21	G23	E45	H50	D64	S67	N68	Q87
51	-	-	R205	S207	H229	N234	-	N246	P247	R261
52	P203	D204	P206	G208	D229	N234	-	T245	A246	R261
53	P203	D204	P206	G208	D229	N234	-	T245	A246	R261
54	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
55	-	-	R205	S207	H229	N234	-	N246	P247	R261
56	A203	K204	R206	K208	E229	N234	P242	K245	G246	C260
57	-	-	R221	G223	G245	G250	V257	D260	K261	Q275
58	S209	K210	K212	K214	D235	S240	-	E251	K252	E262
59	S206	K207	S209	R211	D232	S237	-	E248	G249	I263
60	-	F205	K207	V209	D230	G235	-	D246	G247	E261
61	-	-	-	R211	A233	E237	-	G249	T250	-
62	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
63	-	-	-	K211	N233	S237	-	K249	Q250	I264
64	-	-	K218	K220	S242	D250	-	G262	G263	T276
65	-	K224	L226	A228	P252	H260	-	G272	A273	G280
66	-	-	K211	R213	G235	E240	-	K253	R254	G269
67	-	-	-	R209	T231	A235	-	A246	A247	L261
68	-	-	-	-	P232	G236	-	D247	M248	K258
69	P213	K214	R216	V218	Q240	N245	-	T256	G257	1271
70	R210	P211	R213	R215	G237	G242	A253	G256	A257	G272
71	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
72	R229	P230	R232	R234	G256	G261	A272	G275	A276	G291
73	-	-	-	-	G235	E240	-	S251	W252	I267
74	-	-	-	-	D236	N240	-	E251	G252	M266
75	-	-	-	-	D236	N240	-	E251	G252	M266
76	-	-	-	R209	P231	G235	-	V247	Q248	E263
77	-	-	-	-	G236	G241	-	G251	T252	I267
78	-	-	G210	V212	S234	E238	-	K249	G250	E264
79	-	-	-	V211	E233	G237	-	G248	K249	E263
80	K225	T226	P228	E230	R252	N256	-	Q268	T269	E284
81	-	-	-	-	D236	N240	-	E251	G252	M266
82	-	-	-	R210	R232	G236	-	D247	H248	G262

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 279/498

73/266

SEQ ID	Pos 41	Pos 42	Pos 43	Pos 44	Pos 45	Pos 46	Pos 47	Pos 48	Pos 49	Pos 50
83	-	-	-	R209	P231	G235	-	V247	Q248	E263
84	-	P225	R227	Q229	S251	G255	-	E266	L267	A282
85	-	-	-	R201	-	R226	-	G238	G239	F252
86	-	-	F197	R199	1219	D224	-	-	K236	E250
87	A212	P213	A216	E218	D239	N244	-	-	F257	I270
88	K206	R207	T209	E211	D233	G238	-	-	K250	I260
89	-	-	R196	L198	-	N222	-	-	-	T244
90	A218	G219	G221	V223	A245	G250	-	-	P263	I273
91	P227	P228	R230	Q232	S253	G258	R272	-	G274	V293
92	T217	V218	R220	E222	E243	N248	-	-	T261	V275
93	G230	A231	Y233	L235	T257	E263	-	-	-	Q289
94	A220	G221	G223	V225	D247	G252	-	-	-	L275
95	K204	T205	-	-	D227	N232	-	-	W245	W254
96	K205	R206	T208	A210	E232	N237	-	-	W250	I259
97	A207	G208	G210	V212	E233	E238	-	-	K250	E264
98	K269	P270	G272	T274	D295	S300	-	-	E313	V327
99	K246	K247	S249	G251	E273	D278	E292	-	N294	L310
100	K272	P273	G275	T277	S298	S303	-	-	G316	L330
101	R230	K231	L233	G235	D257	K262	S276	E279	N280	S296
102	T268	P269	G271	T273	S294	S299	-	-	G312	L326
103	S226	K227	R229	G231	H253	Q258	T272	G274	N275	Q291
104	K298	P299	G301	T303	S324	S329	-	-	E342	V356
105	T264	P265	G267	T269	S290	S295	-	-	G308	V322
106	G233	R234	K236	V238	G260	A265	S279	N282	G283	Q302
107	K272	P273	G275	T277	S298	S303	-	-	G316	L330
108	K293	P294	G296	T298	S319	S324	-	-	E337	V351
109	A263	P264	G266	T268	S289	S294	-	-	G307	V321
110	G278	R279	K281	A283	T305	G310	S324	D327	G328	Q347
111	A264	P265	G267	T269	S290	S295	-	-	G308	V322
112	K226	K227	Q229	G231	D253	N258	S272	D275	S276	E292
113	A279	P280	G282	T284	S305	S310	-	-	G323	V337
114	K272	P273	G275	T277	S298	S303	-	-	G316	L330
115	R230	K231	L233	G235	D257	K262	S276	E279	N280	S296
116	K293	P294	G296	T298	S319	S324	-	-	E337	V351
117	K233	K234	S236	G238	D260	D265	Q279	-	N281	L297
129	G271	R272	K274	A276	G298	G303	S317	D320	G321	H340

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID

Pos 51

Pos 52

Pos 53

Pos 54

Pos 55

Pos 56

Pos 57

Pos 58

Pos 59

Pos 60

Pos 61

Pos 62

Pos 63

1

R335

M343

F345

T358

D372

K373

S387

H391

N392

L400

S412

M414

C415

2

R335

M343

F345

T358

D372

K373

S387

H391

N392

L400

S412

M414

C415

3

R334

M342

F344

T357

D371

K372

S386

H390

N391

L399

S411

M413

C414

4

R334

M342

F344

T357

D371

K372

S386

H390

N391

L399

S411

M413

C414

5

R336

M344

F346

T359

D373

K374

S388

H392

N393

L401

S413

M415

C416

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 280/498

74/266

SEQ ID

Pos 51

Pos 52

Pos 53

Pos 54

Pos 55

Pos 56

Pos 57

Pos 58

Pos 59

Pos 60

Pos 61

Pos 62

Pos 63

6

R306

M314

F316

S329

D343

K344

S358

H362

N363

L371

S383

M385

C386

7

N335

M343

V345

S358

T372

N373

S387

H391

N392

L400

S412

V414

Y415

8

C311

M319

K321

S334

E348

N349

S363

Q367

N368

L376

N388

L390

Y391

9

C310

T318

N320

S333

D347

N348

S362

Q366

N367

L375

N387

L389

Y390

10

C308

M316

G318

S331

E345

N346

S360

Q364

N365

L373

N385

L387

Y388

11

Y305

T313

R315

S328

E342

N343

S357

K361

N362

L370

S382

L384

Y385

12

C304

T312

R314

V327

E341

N342

S356

K360

N361

L369

S381

L383

Y384

13

G305

K313

K315

T328

E342

N343

S357

Q361

N362

L370

S382

M384

H385

14

C306

T314

R316

N329

E343

N344

S358

E362

N363

L371

S383

Q385

Y386

15

C308

T316

G318

1331

E345

N346

S360

Q364

N365

L373

K385

L387

F388

16

C308

T316

G318

1331

E345

N346

S360

Q364

N365

L373

K385

L387

F388

17

G305

T313

R315

T328

E342

N343

S357

Q361

N362

L370

S382

L384

H385

18

C306

M314

G316

A329

E343

S344

S358

Q362

N363

L371

N383

E385

Y386

19

C301

M309

G311

A324

E338

S339

S353

Q357

N358

L366

N378

E380

Y381

20

C307

A315

R317

D330

E344

N345

S359

Q363

H364

L372

N384

V386

Y387

21

C304

A312

R314

D327

E341

S342

S356

K360

H361

L369

N381

V383

Y384

22

C309

M317

G319

N332

E346

K347

S361

K365

H366

L374

S386

V388

H389

23

C313

T321

G323

N336

E350

K351

S365

K369

H370

L378

S390

L392

H393

24

C302

M310

G312

N325

E339

K340

S354

K358

H359

L367

S379

V381

H382

25

C348

M356

G358

N371

E385

K386

S400

K404

H405

L413

S425

V427

H428

26

N274

T282

T284

S297

E311

N312

A326

E330

N331

L339

E351

V353

Y354

27

S345

R353

G355

N368

E382

D383

Y397

Q401

H403

L411

D423

Q425

Y426

28

S347

T355

G357

D370

E384

D385

Y399

Q403

H405

L413

D425

Q427

Y428

29

C279

M287

G289

N302

E316

K317

S331

K335

H336

L344

S356

V358

H359

30

S347

T355

G357

D370

D384

D385

Y399

Q403

H405

L413

D425

Q427

Y428

31

S347

T355

G357

D370

D384

D385

Y399

Q403

H405

L413

D425

Q427

Y428

32

G319

T327

K329

T342

E356

N357

S371

E375

G376

L384

S396

Q398

Y399

33

Y346

P354

S356

Y367

D381

S382

R402

-

1412

P424

R426

V427

34

C311

N319

G321

S334

E348

D349

S363

Q367

N368

L376

K388

S390

Y391

35

C371

M379

G381

K394

E408

K409

S423

K427

H428

L436

S448

L450

H451

36

S351

T359

G361

D374

E388

D389

Y403

K408

Y409

L417

N429

Q431

H432

37

S311

T319

G321

D334

E348

D349

Y363

K368

H369

L377

N389

Q391

Y392

38

-

T315

Q329

D330

S344

K348

N349

L357

T369

Q371

Y372

39

C307

A315

R317

D330

E344

S345

S359

K363

H364

L372

N384

V386

Y387

40

S322

T330

G332

D345

E359

D360

Y374

K379

H380

L388

N400

Q402

Y403

41

S322

T330

G332

D345

E359

D360

Y374

K379

H380

L388

N400

Q402

Y403

42

C306

V314

G316

K329

E343

K344

S358

K362

H363

L371

S383

L385

H386

43

D314

V322

D324

I337

D351

S352

S366

A371

N372

L380

E392

Q394

L395

44

D314

V322

D324

I337

D351

S352

S366

A371

N372

L380

E392

Q394

L395

45

-

46

-

47

S199

T207

G209

D222

D236

D237

Y251

K256

H257

L265

D277

Q279

Y280

48

S228

T236

G238

D251

E265

D266

F280

K285

H286

L294

N306

Q308

Y309

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 281/498

75/266

SEQ ID

Pos 51

Pos 52

Pos 53

Pos 54

Pos 55

Pos 56

Pos 57

Pos 58

Pos 59

Pos 60

Pos 61

Pos 62

Pos 63

49

S298

-

50

R99

S107

C109

M122

E136

N137

S151

G155

S156

L164

K176

Q178

Y179

51

H273

-

E293

E307

Q308

A322

-

L333

E345

H347

V348

52

H273

-

T293

D307

A308

P322

-

I333

E345

H347

V348

53

H273

-

T293

D307

A308

P322

-

I333

E345

H347

V348

54

S6

T14

G16

D29

D43

D44

Y58

K63

H64

L72

D84

Q86

Y87

55

H273

-

E293

E307

Q308

A322

-

L333

E345

H347

V348

56

Y272

S280

L282

L293

D307

D308

A322

-

I332

Q344

K346

V347

57

P287

G295

L297

E309

E323

Q324

A338

-

L348

L360

H362

V363

58

H274

-

I296

D310

Q311

K325

-

I335

E347

Y349

V350

59

Y275

S282

F284

Y296

K310

N311

E325

-

L335

N347

F349

A350

60

P273

-

Q295

Q309

D310

K324

-

L334

D346

Y348

I349

61

H272

-

W279

P292

A306

D307

S321

Q325

-

L332

A344

H346

V347

62

-

63

Y276

F282

E284

Y297

K311

D312

S326

K330

-

I336

E348

M350

A351

64

H286

L292

E294

E307

S321

E322

S336

K340

-

L346

A358

K360

V361

65

H292

M301

A303

K316

S330

Q331

T345

R349

-

N355

P368

K370

V371

66

H281

L288

E290

D303

E317

Q318

F332

S336

-

L342

E354

H356

V357

67

Y273

L279

R281

V294

T308

A309

E323

R327

-

I333

Q345

F347

V348

68

H270

-

D287

S301

A302

E316

R320

-

L326

E338

H340

G341

69

Y283

I289

E291

R304

N318

Q319

S333

R337

-

L343

A355

R357

V358

70

E294

1301

A303

E316

E330

Q331

S345

R349

-

L355

A367

H369

I370

71

-

T211

R225

M226

-

M233

-

72

E310

1317

A319

E332

E346

Q347

S361

R365

-

L371

A383

H385

I386

73

F278

I284

S286

P299

D313

Q314

S328

R332

-

L338

H350

H352

V353

74

P278

L284

G286

P299

E313

Q314

T328

R332

-

I338

E350

K352

V353

75

P278

L284

G286

P299

E313

Q314

T328

R332

-

I338

E350

K352

V353

76

H275

V283

I285

Y298

R312

Q313

E327

R331

-

L337

E349

S351

V352

77

Y279

V285

A287

P300

D314

Q315

S329

R333

-

L339

P351

R353

V354

78

Y276

L282

D284

E297

K311

G312

R326

R330

-

L336

S348

K350

A351

79

Y275

V281

N283

E296

K310

G311

R325

R329

-

L335

E347

K349

A350

80

H295

L301

P303

P316

S330

A331

R345

I349

-

I355

E367

W369

Q370

81

P278

L284

G286

P299

E313

Q314

T328

R332

-

I338

D350

K352

V353

82

H274

W281

E283

E296

E310

Q311

S325

P329

-

L335

D347

H349

C350

83

H275

V283

I285

Y298

R312

Q313

E327

R331

-

L337

E349

S351

V352

84

Y293

L299

E301

L314

E328

A329

R343

L347

-

I353

Q365

Y367

H368

85

F264

L270

P272

H285

E299

D300

K314

P318

-

I324

D336

Q338

V339

86

H262

I268

F270

N283

A297

E298

W312

-

I322

S334

E336

V337

87

A282

I288

P290

P303

D317

R318

S332

-

L342

D354

H356

V357

88

Y272

L278

F280

Y293

T307

G308

S321

-

L331

E343

G345

A346

89

Y256

I262

D264

N277

K291

D292

K306

-

1316

K328

Q330

F331

90

H285

V291

G293

P306

E320

R321

K335

-

L345

E357

K359

V360

91

Y305

L311

D313

P326

E340

A341

R355

-

I365

Q377

Y379

H380

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 282/498

76/266

SEQ ID

Pos 51

Pos 52

Pos 53

Pos 54

Pos 55

Pos 56

Pos 57

Pos 58

Pos 59

Pos 60

Pos 61

Pos 62

Pos 63

92

Y287

L293

N295

P308

D322

A323

R337

-

I347

Q359

W361

Q362

93

P301

L307

A309

E322

E336

N337

A351

-

A361

E373

C375

V376

94

Y287

L293

G295

P308

E322

K323

K337

-

L347

E359

K361

V362

95

G266

L272

P274

P287

M301

Q302

R316

-

L326

A338

Q340

V341

96

Y271

L277

F279

Y292

T306

G307

S320

-

L330

K342

G344

A345

97

Y276

L282

E284

E297

R311

G312

K326

-

L336

E348

K350

A351

98

H339

L345

P347

Y360

E374

A375

R395

-

I405

P417

R419

V420

99

C322

M330

G332

K345

E359

K360

S374

K378

H379

L387

S399

L401

H402

100

H342

L348

P350

Y363

E377

A378

R398

-

I408

S420

R422

V423

101

C308

T316

G318

S331

E345

N346

S360

Q364

N365

L373

N385

L387

Y388

102

Y338

L344

P346

Y359

E373

A374

R394

-

I404

P416

R418

V419

103

G303

T311

T313

S326

E340

N341

A355

E359

N360

L368

E380

L382

Y383

104

Y368

L374

P376

H389

E403

A404

R424

-

I434

P446

R448

T449

105

Y334

L340

P342

Y355

E369

A370

R390

-

I400

A412

R414

V415

106

S314

T322

G324

D337

E351

D352

Y366

K371

H372

L380

N392

Q394

H395

107

H342

L348

P350

Y363

E377

A378

R398

-

I408

S420

R422

V423

108

Y363

L369

P371

Y384

E398

A399

R419

-

I429

P441

R443

I444

109

Y333

L339

P341

Y354

E368

A369

R389

-

I399

A411

R413

V414

110

S359

T367

G369

D382

E396

D397

F411

K416

H417

L425

N437

Q439

H440

111

Y334

L340

P342

Y355

E369

A370

R390

-

I400

A412

R414

V415

112

C304

A312

R314

D327

E341

S342

S356

K360

H361

L369

N381

V383

Y384

113

Y349

L355

P357

Y370

E384

A385

R405

-

1415

A427

R429

V430

114

H342

L348

P350

Y363

E377

A378

R398

-

I408

S420

R422

V423

115

C308

T316

G318

S331

E345

N346

S360

Q364

N365

L373

N385

L387

Y388

116

Y363

L369

P371

Y384

E398

A399

R419

-

I429

P441

R443

I444

117

C309

M317

G319

K332

E346

K347

T361

K365

H366

L374

S386

L388

H389

129

S352

T360

G362

D375

E389

D390

Y404

Q408

H410

L418

N430

Q432

H433

Tabela 1 (Continuação)

SEQ ID

Pos 64

Pos 65

Pos 66

Pos 67

Pos 68

Pos 69

Pos 70

Pos 71

Pos 72

Pos 73

Pos 74

Pos 75

Pos 76

1

R425

K428

N431

S433

T434

D435

E436

Q447

T451

D453

S464

A466

D482

2

R425

K428

N431

S433

T434

D435

E436

Q447

T451

D453

S464

A466

D482

3

R424

K427

N430

S432

T433

D434

E435

Q446

T450

D452

S463

A465

D481

4

R424

K427

N430

S432

T433

D434

E435

Q446

T450

D452

S463

A465

D481

5

R426

K429

K432

S434

T435

D436

E437

Q448

T452

D454

S465

A467

D483

6

R396

K399

N402

S404

T405

D406

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Q418

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7

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8

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9

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E403

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T409

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D457

10

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K404

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S437

A439

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11

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E398

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T404

D405

E406

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12

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13

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T404

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S435

A437

E453

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 283/498

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Pos 71

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Pos 74

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15

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-

C404

-

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-

40

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A423

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G441

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A454

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-

43

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S413

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V431

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44

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G433

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45

-

46

-

47

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P298

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1301

K312

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-

50

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P397

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53

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A367

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V384

A386

P397

A399

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54

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P105

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S107

1108

K119

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G125

G136

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L364

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I384

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S399

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G401

P412

A414

A430

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 284/498

78/266

SEQ ID

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Pos 68

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Pos 70

Pos 71

Pos 72

Pos 73

Pos 74

Pos 75

Pos 76

58

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A401

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-

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V393

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68

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D377

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-

72

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D374

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L386

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P399

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N372

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P390

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E398

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85

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T359

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A391

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86

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E355

E356

R357

S358

Q369

I373

A375

Q387

A389

E405

87

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K370

Q373

F375

D376

E377

D378

S389

V393

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A408

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88

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E366

E367

T378

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D415

89

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Q363

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90

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91

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D409

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P427

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92

T372

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Q383

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K412

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N430

93

M386

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94

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E429

95

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D353

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D359

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P372

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P389

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D407

96

C355

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98

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100

T433

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G443

E444

K455

N461

K463

P474

A476

K492

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 285/498

79/266

SEQ ID

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R398

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K404

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V424

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102

T429

G432

S435

T437

E438

S439

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K451

K457

G459

P470

A472

K488

103

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104

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S487

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K518

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G411

P413

T414

A415

1416

K427

V431

G433

K444

A446

G462

107

T433

G436

S439

T441

E442

G443

E444

K455

N461

K463

P474

A476

K492

108

K454

G457

N460

S462

K463

D464

E465

R476

D482

K484

P495

A497

K513

109

T424

G427

S430

T432

E433

S434

D435

K446

R452

A454

P465

A467

K483

110

H450

D453

G456

P458

T459

A460

1461

K472

V476

G478

R489

A491

G507

111

T425

G428

S431

T433

E434

S435

D436

K447

R453

A455

P466

A468

K484

112

R394

E397

K400

S402

R403

T404

E405

Q416

A420

G422

S433

A435

D451

113

T440

G443

S446

T448

E449

S450

D451

K462

R468

A470

P481

A483

K499

114

T433

G436

S439

T441

E442

G443

E444

K455

N461

K463

P474

A476

K492

115

R398

K401

K404

S406

T407

D408

E409

Q420

V424

G426

S437

A439

E455

116

K454

G457

N460

S462

K463

D464

E465

R476

D482

K484

P495

A497

K513

117

R399

E402

K405

S407

T408

D409

E410

R421

V425

G427

N438

A440

D456

129

H443

D446

G449

P451

T452

S453

I454

K465

V469

G471

R482

A484

G500

[0118] Em outra realização, ditas diferenças nestas posições de amino ácidos (correspondendo às respectivas posições na SEQ ID NO: 2 ou 4) incluem, mas não estão limitadas a um ou mais dos seguintes:

- o amino ácido correspondente

- o amino ácido correspondente à posição P40 é eliminado; à posição K250 é eliminado;

à posição Q391 é inserido à posição Y520 é eliminado;

à posição L521 é eliminado;

à posição D522 é eliminado;

à posição S523 é eliminado;

à posição H524 é eliminado;

à posição I525 é eliminado;

à posição Y526 é eliminado;

à posição V527 é eliminado;

à posição K528 é eliminado;

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 286/498

80/266

- o amino ácido correspondente à posição M529 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição D530 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição E531 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição K532 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição T533 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição A534 é eliminado;

[0119] As posições de inserções e de exclusão correspondentes em outras espécies podem ser encontradas na Tabela a seguir.

Tabela 2

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
1	P40	K250	H391	Y520	L521	D522	S523	H524	I525	Y526
2	P40	K250	H391	Y520	L521	D522	S523	H524	I525	Y526
3	P40	K249	H390	Y519	L520	D521	S522	H523	I524	Y525
4	P40	K249	H390	Y519	L520	D521	S522	H523	I524	Y525
5	P40	K250	H392	Y521	L522	D523	S524	H525	L526	Y527
7	V36	K249	H391	Y520	L521	E522	S523	-	-	-
8	S9	K222	Q367	Y496	L497	N498	S499	S500	S501	D502
9	P11	K221	Q366	Y495	L496	E497	S498	S499	S500	D501
10	Q10	N220	Q364	Y493	L494	E495	S496	S497	H498	Q499
11	R11	K220	K361	Y490	L491	N492	S493	A494	S495	D496
12	-	K215	K360	Y489	L490	E491	S492	P493	S494	D495
13	R11	K220	Q361	Y490	L491	N492	N493	A494	S495	D496
14	R11	K217	E362	Y491	L492	E493	S494	S495	S496	D497
15	R11	K220	Q364	Y493	L494	E495	N496	S497	S498	D499
16	G11	K220	Q364	Y493	L494	E495	N496	S497	S498	D499
17	R11	K220	Q361	Y490	L491	N492	N493	A494	S495	D496
18	R10	S220	Q362	Y491	L492	E493	S494	S495	T496	D497
19	Q5	S215	Q357	Y486	L487	E488	S489	S490	T491	D492
20	S11	K218	Q363	Y492	L493	E494	S495	V496	S497	T498
21	-	K215	K360	Y489	L490	E491	A492	V493	S494	A495
22	E12	K222	K365	Y494	L495	E496	S497	C498	S499	N500
23	K12	K226	K369	Y498	L499	E500	S501	C502	S503	N504
24	E12	K219	K358	Y487	L488	E489	S490	C491	S492	N493
25	E58	K265	K404	Y533	L534	E535	S536	C537	S538	N539
26	-	K191	E330	Y459	L460	D461	S462	Y463	S464	N465
27	R39	P253	Q401	Y531	L532	E533	S534	Q535	T536	K537
28	R41	P255	Q403	Y533	L534	E535	S536	H537	T538	K539
29	E12	K192	K335	Y464	L465	E466	S467	C468	S469	N470
30	R41	P255	Q403	Y533	L534	E535	S536	H537	T538	K539

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 287/498

81/266

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
31	R41	P255	Q403	Y533	L534	E535	S536	H537	T538	K539
32	L16	K227	E375	Y504	I505	N506	S507	S508	V509	-
33	V49	N265	-	F536	L537	S538	K539	Y540	A541	R542
34	G11	K222	Q367	H466	L467	N468	S469	S470	A471	D472
35	K74	-	K427	Y556	L557	E558	S559	C560	S561	N562
36	R45	S259	Q407	Y537	L538	E539	S540	H541	Q542	A543
37	R8	S219	Q367	Y497	L498	E499	S500	C501	T502	D503
39	Q10	Q220	K363	-	-	-	-	-	-	-
40	P7	K232	K379	D505	-	-	-	-	-	-
41	P7	K232	K379	D505	-	-	-	-	-	-
42	A15	G221	K362	-	-	-	-	-	-	-
43	A9	E225	A371	Y500	L501	Q502	G503	S504	G505	G506
44	V9	E225	A371	Y500	L501	Q502	G503	S504	G505	G506
45	P40	-	-	-	-	-	-	-	-	-
46	P40	-	-	-	-	-	-	-	-	-
47	-	K109	K256	Y385	L386	E387	S388	H389	T390	K391
48	-	K138	K285	Y405	L406	E407	S408	G409	1410	K411
49	G1	E210	-	-	-	-	-	-	-	-
50	-	-	G155	-	-	-	-	-	-	-
51	-	-	-	H453	L454	R455	E456	E457	A458	A459
52	-	-	-	T453	D454	E455	R456	A457	A458	Q459
53	-	-	-	T453	D454	E455	R456	A457	T458	Q459
54	-	-	K63	Y192	L193	E194	S195	H196	T197	K198
55	-	-	-	H453	L454	R455	E456	E457	A458	A459
56	-	-	-	E452	K453	-	-	-	-	-
57	G14	-	-	-	-	-	-	-	-	-
58	G2	-	-	Q455	-	-	-	-	-	-
59	-	-	-	Q455	F456	T457	M458	H459	N460	V461
60	-	-	-	R454	I455	S456	D457	-	-	-
61	-	-	-	H452	L453	A454	G455	A456	D457	R458
62	Q10	-	-	-	-	-	-	-	-	-
63	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
64	E9	-	-	N466	T467	R468	T469	E470	E471	S472
65	E3	-	-	Y476	L477	K478	T479	L480	-	-
66	-	-	-	S462	L463	-	-	-	-	-
67	-	-	-	D453	R454	A455	R456	S457	-	-
68	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
69	-	G204	-	Y463	L464	K465	T466	R467	S468	A469
70	-	R201	-	-	-	-	-	-	-	-
71	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
72	T16	R220	-	-	-	-	-	-	-	-
73	M1	-	-	A458	L459	A460	A461	H462	G463	T464
74	A2	-	-	E456	D457	G458	G459	T460	P461	G462
75	A2	-	-	E456	D457	G458	G459	T460	P461	G462

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 288/498

82/266

SEQ ID	Pos 1	Pos 2	Pos 3	Pos 4	Pos 5	Pos 6	Pos 7	Pos 8	Pos 9	Pos 10
76	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
77	M2	-	-	A459	L460	D461	A462	Q463	G464	T465
78	-	-	-	G456	-	-	-	-	-	-
79	-	-	-	E455	-	-	-	-	-	-
80	M1	V216	-	H476	L477	H478	D479	C480	Q481	T482
81	A2	-	-	E456	D457	G458	G459	T460	P461	G462
82	-	-	-	D455	I456	D457	V458	-	-	-
83	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
84	E7	-	-	Q484	V485	-	-	-	-	-
85	-	-	-	K443	-	-	-	-	-	-
86	-	-	-	R441	A442	A443	S444	R445	S446	I447
87	A2	-	-	Q460	S461	P462	G463	-	-	-
88	M1	K201	-	-	-	-	-	-	-	-
89	-	-	-	N434	K435	F436	-	-	-	-
90	-	A209	-	Y465	L466	K467	G468	R469	-	-
91	-	D218	-	V496	R497	R498	-	-	-	-
92	-	K208	-	Q468	L469	S470	1471	I472	N473	D474
93	S4	K221	-	D481	L482	T483	A484	R485	V486	-
94	-	A211	-	F467	L468	Q469	S470	R471	-	-
95	-	-	-	Q445	R446	-	-	-	-	-
96	-	K200	-	S452	V453	S454	-	-	-	-
97	-	K198	-	S456	L457	C458	-	-	-	-
98	G49	K260	-	F529	M530	S531	R532	Y533	A534	Y535
99	P12	G237	K378	Y507	L508	E509	S510	C511	S512	N513
100	E55	K263	-	F532	L533	S534	Q535	Y536	A537	Y538
101	H10	E222	Q364	Y493	L494	E495	S496	S497	H498	D499
102	D51	K259	-	F528	L529	S530	R531	G532	V533	Y534
103	K14	-	E359	Y488	L489	D490	S491	Y492	S493	D494
104	E81	K289	-	F558	L559	S560	Q561	Y562	S563	D564
105	V44	K255	-	F524	L525	T526	K527	Y528	A529	Y530
106	A9	K224	K371	Y500	L501	E502	L503	G504	I505	K506
107	E55	K263	-	F532	L533	S534	Q535	Y536	A537	Y538
108	A76	K284	-	F553	L554	S555	Q556	Y557	S558	D559
109	V46	K254	-	F523	L524	T525	K526	Y527	A528	Y529
110	P55	K269	K416	Y545	L546	E547	S548	G549	I550	K551
111	V47	K255	-	F524	L525	T526	K527	Y528	A529	Y530
112	E7	Q217	K360	Y489	L490	E491	A492	V493	S494	A495
113	V62	K270	-	F539	L540	T541	K542	Y543	A544	Y545
114	E55	K263	-	F532	L533	S534	Q535	Y536	A537	Y538
115	H10	E222	Q364	Y493	L494	E495	S496	S497	H498	D499
116	A76	K284	-	F553	L554	S555	Q556	Y557	S558	D559
117	K11	G224	K365	Y494	L495	E496	S497	C498	S499	N500
129	P40	K262	Q408	Y538	L539	E540	S541	G542	I543	-

Tabela 2 (Continuação)

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 289/498

83/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18
1	V527	K528	M529	D530	E531	K532	T533	A534
2	V527	K528	M529	D530	E531	K532	T533	A534
3	V526	K527	M528	D529	E530	K531	T532	A533
4	V526	K527	M528	D529	E530	K531	T532	A533
5	V528	K529	M530	N531	E532	K533	T534	A535
7	N524	K525	M526	T527	E528	E529	T530	1531
8	G503	K504	M505	F506	K507	E508	-	-
9	D502	K503	M504	L505	K506	E507	G508	P509
10	K500	L501	L502	K503	D504	-	-	-
11	N497	T498	V499	P500	D501	K502	-	-
12	E496	K497	T498	R499	H500	K501	G502	-
13	N497	S498	V499	-	-	-	-	-
14	G498	K499	I500	L501	Q502	Q503	G504	S505
15	D500	K501	M502	L503	K504	E505	G506	S507
16	D500	K501	M502	L503	K504	E505	G506	S507
17	N497	T498	V499	A500	D501	K502	-	-
18	Q498	S499	C500	A501	E502	-	-	-
19	Q493	S494	C495	A496	E497	-	-	-
20	D499	S500	K501	R502	H503	C504	-	-
21	D496	T497	K498	N499	H500	S501	-	-
22	D501	K502	K503	P504	N505	D506	S507	L508
23	D505	K506	K507	P508	D509	E510	S511	L512
24	D494	K495	K496	P497	N498	D499	S500	L501
25	D540	K541	K542	P543	N544	D545	S546	L547
26	Q466	K467	-	-	-	-	-	-
27	H538	N539	N540	S541	H542	-	-	-
28	H540	N541	N542	L543	H544	-	-	-
29	D471	K472	K473	P474	N475	D476	S477	-
30	H540	N541	N542	S543	H544	-	-	-
31	H540	N541	N542	S543	H544	-	-	-
32	-	-	-	-	-	-	-	-
33	S543	F544	-	-	-	-	-	-
34	D473	K474	M475	L476	K477	K478	G479	S480
35	D563	K564	K565	P566	E567	D568	S569	-
36	R544	-	-	-	-	-	-	-
37	Q504	D505	N506	-	-	-	-	-
39	-	-	-	-	-	-	-	-
40	-	-	-	-	-	-	-	-
41	-	-	-	-	-	-	-	-
42	-	-	-	-	-	-	-	-
43	K507	K508	V509	F510	T511	M512	A513	S514
44	K507	K508	V509	F510	T511	M512	A513	S514
45	-	-	-	-	-	-	-	-
46	-	-	-	-	-	-	-	-

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84/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18
47	H392	N393	N394	S395	H396	-	-	-
48	Q412	V413	S414	-	-	-	-	-
49	-	-	-	-	-	-	-	-
50	-	-	-	-	-	-	-	-
51	G460	G461	L462	A463	K464	L465	V466	L467
52	P460	H461	-	-	-	-	-	-
53	P460	H461	-	-	-	-	-	-
54	H199	N200	N201	S202	H203	-	-	-
55	G460	G461	L462	A463	K464	L465	V466	L467
56	-	-	-	-	-	-	-	-
57	-	-	-	-	-	-	-	-
58	-	-	-	-	-	-	-	-
59	Q462	-	-	-	-	-	-	-
60	-	-	-	-	-	-	-	-
61	A459	V460	A461	A462	T463	G464	P465	-
62	-	-	-	-	-	-	-	-
63	-	-	-	-	-	-	-	-
64	-	-	-	-	-	-	-	-
65	-	-	-	-	-	-	-	-
66	-	-	-	-	-	-	-	-
67	-	-	-	-	-	-	-	-
68	-	-	-	-	-	-	-	-
69	V470	A471	S472	L473	R474	-	-	-
70	-	-	-	-	-	-	-	-
71	-	-	-	-	-	-	-	-
72	-	-	-	-	-	-	-	-
73	T465	A466	V467	S468	T469	E470	T471	A472
74	-	-	-	-	-	-	-	-
75	-	-	-	-	-	-	-	-
76	-	-	-	-	-	-	-	-
77	T466	A467	D468	T469	L470	E471	Q472	A473
78	-	-	-	-	-	-	-	-
79	-	-	-	-	-	-	-	-
80	A483	N484	-	-	-	-	-	-
81	-	-	-	-	-	-	-	-
82	-	-	-	-	-	-	-	-
83	-	-	-	-	-	-	-	-
84	-	-	-	-	-	-	-	-
85	-	-	-	-	-	-	-	-
86	A448	-	-	-	-	-	-	-
87	-	-	-	-	-	-	-	-
88	-	-	-	-	-	-	-	-
89	-	-	-	-	-	-	-	-
90	-	-	-	-	-	-	-	-

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 291/498

85/266

SEQ ID	Pos 11	Pos 12	Pos 13	Pos 14	Pos 15	Pos 16	Pos 17	Pos 18
91	-	-	-	-	-	-	-	-
92	N475	-	-	-	-	-	-	-
93	-	-	-	-	-	-	-	-
94	-	-	-	-	-	-	-	-
95	-	-	-	-	-	-	-	-
96	-	-	-	-	-	-	-	-
97	-	-	-	-	-	-	-	-
98	K536	-	-	-	-	-	-	-
99	D514	N515	K516	P517	E518	D519	S520	L521
100	K539	-	-	-	-	-	-	-
101	K500	L501	L502	K503	-	-	-	-
102	K535	-	-	-	-	-	-	-
103	E495	K496	R497	C498	-	-	-	-
104	K565	-	-	-	-	-	-	-
105	K531	-	-	-	-	-	-	-
106	R507	D508	N509	-	-	-	-	-
107	K539	-	-	-	-	-	-	-
108	K560	-	-	-	-	-	-	-
109	K530	-	-	-	-	-	-	-
110	H552	V553	N554	-	-	-	-	-
111	K531	-	-	-	-	-	-	-
112	D496	T497	K498	N499	H500	S501	-	-
113	K546	-	-	-	-	-	-	-
114	K539	-	-	-	-	-	-	-
115	K500	L501	L502	K503	-	-	-	-
116	K560	-	-	-	-	-	-	-
117	D501	K502	K503	S504	E505	D506	S507	L508
129	-	K544	Q545	D546	N547	-	-	-

[0120]0s Depositantes ou a presente invenção descobriram de maneira surpreendente que uma substituição de amino ácidos em Gly210/211, Q119, S387 ou S412, ou em outros locais não ativos, em especial quando combinados com uma substituição em posições em outros locais não ativos, ou quando combinados com mutações em locais ativos, isto é, correspondendo às posições 128,397 e/ou 420 de PPO de Amaranthus tipo II aumentam a tolerância aos herbicidas.

[0121]Consequentemente, em realizações de preferência, as combinações de mutações correspondentes às posições respectivas na SEQ ID NO: 2 ou 4 estão abrangidas pela presente invenção e são mostradas na Tabela

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AA seguinte.

Tabela AA

Duplo	Triplo	Quádruplo	Quíntuplo
Q119L, R128A	Q119T, G210T, S387L	Q119L, R128A, Q323H, S412N	Q119T, S387L, S412N, M414Q, E436I
Q119L, Q323H	Q119T, G211A, S387L	Q119L, Q323H, L397D, S412N
Q119T, S387L	Q119T, G211A, F420M	Q119L, Q323H, S412N, F420M
Q119L, L397D	Q119L, R128A, F420M	Q119T, S387L, S412N, M414Q
Q119L, S412N	Q119T, G210T, F420M	Q119T, S387L, M414Q, E436I
Q119T, M414Q	Q119L, Q323H, S412N	R128A, G211A, S387L, F420M
Q119L, F420M	Q119T, S387L, S412N
Q119T, E436I	Q119T, S387L, M414Q
K127N, R128C	Q119T, S387L, F420M
R128A, G210T	Q119T, S387L, E436I
R128A, G211A	Q119L, L397D, F420M
R128A, S387L	Q119T, S412N, E436I
R128A, S412N	Q119T, M414Q, E436I
D202A, S387V	R128A, G210T, F420V
G210C, G211A	R128A, G211A, F420M
G210T, S387L	R128A, S412N, F420M
G210C,L397Q	R128A, F420V, d H524
G210T, S412N	R128A, F420V, d V527
G210T, M414Q	G210T, G211A, M414Q
G210S, F420M	G211A, S387L, F420M
G211A, S387L	G211C, L397Q, F420V
G211C, L397Q	S387V, S412N, M414Q
G211A, M414Q	S387L, S412N, E436I
G211A, L397Q	S387L, M414Q, E436I
G211A, F420M	L397D, S412N, F420M
Q323H, S412N	L397E, F420M, d, H524
M343T, F420M	L397E, F420M, d, V527
D372E, K373D	LQ391, H392K, N393H
D372E,F420M	R128A, G211N, F420M
S387L, L397Q	R128A, G210S, F420M
S387V, S412N	R128A, G211C, F420M
S387L, M414Q
S387L, F420M
S387V, R425Y
S387L, E436I
L397D, S412N

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Duplo	Triplo	Quádruplo	Quíntuplo
S412N, M414Q
S412N, F420M
S412N, E436I
M414Q, E436I
M414Q, F420M
F420M, d H524
F420M, d V527
E436I, F420M
G211C, F420V
G211 D, F420M
G211N, F420M
G210T, G211C

[0122] Estará dentro do conhecimento do técnico no assunto identificar as regiões conservadas e motivos compartilhados entre os homólogos, ortólogos e parálogos. Tendo identificado tais regiões conservadas que podem representar os motivos de ligação adequados, os amino ácidos podem ser selecionados para serem substituídos por qualquer outro amino ácido, por exemplo, por amino ácidos conservados, de preferência, pelas substituições de amino ácidos descritas acima utilizando a SEQ ID NO: 2 ou 4 como referência.

[0123]Consequentemente, o vegetal ou vegetal da presente invenção compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de PPO mutada que compreende um ou mais dos seguintes motivos.

(i) Motivo 1:

- GT[C/S]GGDP;

(ii) Motivo 2:

- [A/S/C]PS[D/N][X][X]L;

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88/266 (iii) Motivo 3:

- [R/Q][E/D]KQQ[L/A]P;

(iv) Motivo 4:

- L[I/V]PSKE;

[0124] De preferência, o polipeptideo de PPO mutada da presente invenção de maneira adicional compreende um ou mais dos seguintes motivos:

[0125]Outro objeto se refere a um método para a identificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma PPO mutada que é resistente ou tolerante a um herbicida, o método compreende:

(a) a geração de uma biblioteca de ácidos nucléicos codificadores de PPO mutada;

(c) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida fornecidos através de dita população de ácidos nucléicos que codificam a PPO mutada com o nível de tolerância ao herbicida fornecido através de um ácido nucléico que

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89/266 codifica a PPO de controle; e (d) a seleção de, pelo menos um ácido nucléico que codifica a PPO mutada que fornece um nível significativamente aumentado de tolerância a um herbicida em comparação com aquele fornecido através do ácido nucléico que codifica a PPO de controle.

[0126]Os níveis de tolerância ao herbicida também podem ser determinados medindo a taxa de desintoxicação em uma célula, tecido ou vegetal.

[0127]A taxa de desintoxicação é a taxa de degradação do herbicida dentro de um determinado período de tempo em um tecido respectivo. A degradação e a formação do produto podem ser determinadas analiticamente, por exemplo, através da cromatografia líquida (LC) acoplada a um espectômetro de massa (MS) de resolução elevada (HR). O produto pode ser determinado através da comparação com os padrões autênticos e/ou através da elucidação da estrutura.

[0128] Em uma realização de preferência, o ácido nucléico que codifica a PPO mutada selecionado na etapa (d) fornece, pelo menos, 2 vezes mais resistência ou tolerância de uma célula ou vegetal a um herbicida em comparação com aquele fornecido através do ácido nucléico que codifica a PPO de controle.

[0129] Em uma outra realização de preferência, o ácido nucléico que codificada a PPO mutada selecionado na etapa (d) fornece, pelo menos, 2 vezes, pelo menos, 5 vezes, pelo menos, 10 vezes, pelo menos, 20 vezes, pelo menos, 50 vezes, pelo menos, 100 vezes, pelo menos, 500 vezes, tanta resistência ou tolerância de uma célula ou vegetal a um herbicida em comparação com aquela fornecida pelo ácido nucléico que codifica a PPO de controle.

[0130] A resistência ou tolerância pode ser determinada através da

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90/266 geração de um vegetal transgênico ou célula do hospedeiro, de preferência, uma célula de vegetal, que compreende uma sequência de ácido nucléico da biblioteca da etapa (a) e comparando dito vegetal transgênico com um vegetal de controle ou célula do hospedeiro, de preferência, uma célula de vegetal.

[0131] Muitos métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto estão disponíveis para obter os ácidos nucléicos candidatos adequados para a identificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma PPO mutada a partir de uma variedade de organismos de fonte potenciais diferentes incluindo os micróbios, vegetais, fungos, algas, culturas mistas, e similares, bem como as fontes de DNA, tal como o solo. Estes métodos incluem inter alia a preparação de bibliotecas de DNAc ou DNA genômico, a utilização de primers de oligonucleotídeos adequadamente degenerados, a utilização de sondas com base em sequências conhecidas ou análises de complementação (por exemplo, para o crescimento em tirosina) bem como a utilização de mutagênese e embaralhamento de maneira a fornecer as sequências de codificação de PPO mutada recombinadas ou embaralhadas.

[0132]Os ácidos nucléicos que compreendem as sequências de codificação candidatas e de controle de PPO podem ser expressas em levedura, em uma cepa hospedeira bacteriana, em uma alga ou em um vegetal superior tal como o tabaco ou Arabidopsis e os níveis relativos de tolerância inerente das sequências de codificação de PPO varridas, de acordo com um fenótipo indicador visível da cepa ou vegetal transformado na presença de diferentes concentrações do herbicida selecionado. As respostas dose e as mudanças relativas nas respostas à dose associadas a estes fenótipos indicadores (formação de cor castanha, inibição do crescimento, efeito herbicida, e similares) são convenientemente expressas em termos, por exemplo, de valores de GR50 (concentração para 50% de redução de crescimento) ou MIC (concentração inibitória mínima) em que os aumentos em valores correspondem aos aumentos

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91/266 na tolerância inerente de PPO expressa. Por exemplo, em um sistema de análise relativamente rápido com base na transformação de uma bactéria tal como E. coli, cada sequência de codificação de PPO mutada pode ser expressa, por exemplo, como um controle de expressão da sequência de DNA de um promotor controlável tal como o promotor lacZ e tendo em conta, por exemplo, a utilização de DNA sintético, questões tal como a utilização de códons, de maneira a obter um nível de expressão tão comparável quanto possível das diferentes sequências de PPO. Tais cepas que expressam os ácidos nucléicos que compreendem as sequências candidatas alternativas de PPO podem ser plaqueadas em diferentes concentrações do herbicida selecionado, opcionalmente, em um meio suplementado com a tirosina e os níveis relativos de tolerância inerente às enzimas de PPO expressas estimadas com base na extensão e MIC para a inibição da formação do pigmento ocrônico castanho, ou medindo a degradação do herbicida através de LC-HRMS (espectrometria de massa de resolução elevada através da cromatografia líquida).

[0133] Em outra realização, os ácidos nucléicos candidatos são transformados em material vegetal para gerar um vegetal transgênico, regenerados em vegetais férteis morfologicamente normais que, em seguida, são medidos para a tolerância diferencial aos herbicidas selecionados, conforme descrito na seção Exemplo a seguir. Muitos métodos adequados para a transformação utilizando os marcadores de seleção adequados, tais como a canamicina, vetores binários, tais como Agrobacterium e regeneração dos vegetais, tal como, por exemplo, a partir de discos foliares de tabaco, são bem conhecidos no estado da técnica. Opcionalmente, uma população de controle dos vegetais é igualmente transformada com um ácido nucléico expressando a PPO de controle. A média e distribuição dos níveis de tolerância aos herbicidas de um intervalo de eventos de transformação primária dos vegetais ou a sua progênie aos herbicidas descritos acima são avaliados de maneira normal com

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92/266 base em danos no vegetal, sintomas de branqueamento meristemático, e similares, em um intervalo de diferentes concentrações de herbicidas. Estes dados podem ser expressos em termos, por exemplo, de valores GR50 derivados de curvas dose / resposta que possui a “dose” representada no eixo x e a “porcentagem de morte”, “efeito herbicida”, “números dos vegetais verdes emergentes” e similares representados no eixo y em que os valores de GR50 aumentados correspondem aos níveis aumentados de tolerância inerente à PPO expressa. Os herbicidas podem ser aplicados adequadamente na préemergência ou pós-emergência.

[0134]Outro objeto da presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucléico produzida e/ou sintética isolada e/ou recombinante que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada selecionado a partir do grupo que consiste em:

(b) uma molécula de ácido nucléico que, como resultado da degeneração do código genético, pode ser derivada de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

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60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo, e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação a uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

(c) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que possui 30% ou superior de identidade, de preferência, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou superior, com a sequência de amino ácidos de sequência de polipeptídeo de PPO de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56,

78, 79, 80, 81,82, 83, 84 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,

(d) a molécula de ácido nucléico que híbrida com uma molécula de ácido nucléico de (a), (b) ou (c), sob condições de hibridação restringentes e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

- em que a sequência de amino ácidos do polipeptídeo de PPO mutada codificada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptídeo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às

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94/266 posições 32, 53, 57, 61,63, 64, 65, 67, 71,76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 103, 104, 106, 108, 116, 119, 126, 127, 129, 139, 159, 210,211,224, 245, 246, 248,

249, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 262, 264, 286, 291,305, 308, 309, 323,

335, 343, 345, 358, 372, 373, 387, 391,392, 400, 412, 414, 415, 425, 428, 431,

[0135] Em uma realização de preferência, a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada codificada difere de maneira adicional de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 128, 397 ou 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

[0136] Em outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 211,387 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 128 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 387 é substituído por Leu e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0137] Em outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 211 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 128 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Asn ou Cys e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0138] Em uma outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 210 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou

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95/266 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 128 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 210 é substituído por Ser e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0139] Em outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 412 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 128 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 412 é substituído por Asn e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0140] Em outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 119, 128 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 119 é substituído por Leu, o amino ácido correspondente à posição 128 é substituído por Ala e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0141] Em uma outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 211,397 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Ala, o amino ácido correspondente à posição 397 é substituído por Gin e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0142] Em outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 211 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

[0143] De preferência, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Cys e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Vai.

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96/266 [0144] De preferência, o amino ácido correspondente à posição 211 substituído por Ala e o amino ácido correspondente à posição 420 substituído por Vai.

[0145] De preferência, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Asp e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0146] De preferência, o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Asn e o amino ácido correspondente à posição 420 é substituído por Met.

[0147] Em uma outra realização de preferência, os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 210 e 211 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido. De preferência, o amino ácido correspondente à posição 210 é substituído por Thr e o amino ácido correspondente à posição 211 é substituído por Cys.

[0148] Em uma realização de preferência, a PPO mutada codificada é uma variante de SEQ ID NO: 2 ou 4, que inclui um ou mais dos seguintes:

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97/266

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98/266

- o amino ácido correspondente à posição G210 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência, Ser;

- o amino ácido correspondente à posição G211 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência Cys, Ala, Asp, Thr ou Asn;

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99/266

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100/266

- o amino ácido correspondente à posição S412 é substituído por qualquer outro amino ácido, de preferência Leu;

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101/266

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102/266 [0149] Em outra realização de preferência, a PPO mutada codificada é uma variante de SEQ ID NO: 2 ou 4, que inclui um ou mais dos seguintes:

- o amino ácido correspondente à posição P40 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição K250 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição Q391 é inserido;

- o amino ácido correspondente à posição Y520 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição L521 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição D522 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição S523 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição H524 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição I525 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição Y526 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição V527 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição K528 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição M529 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição D530 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição E531 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição K532 é eliminado;

- o amino ácido correspondente à posição T533 é eliminado; e

- o amino ácido correspondente à posição A534 é eliminado.

[0150] Em outros aspectos, a presente invenção abrange uma progênie ou um descendente de um vegetal de tolerância ao herbicida da presente invenção, bem como as sementes derivadas dos vegetais de tolerância ao herbicida da presente invenção e células derivadas dos vegetais de tolerância ao herbicida da presente invenção.

[0151] Em algumas realizações, a presente invenção fornece uma progênie ou vegetal descendente derivado a partir de um vegetal que

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103/266 compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, em que a progênie ou vegetal descendente compreende em, pelo menos, algumas de suas células o polinucleotídeo recombinante operavelmente ligado ao promotor, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância da progênie ou vegetal descendente aos herbicidas.

[0152]Em uma realização, as sementes da presente invenção, de preferência, compreendem as características de tolerância aos herbicidas do vegetal de tolerância ao herbicida. Em outras realizações, uma semente é capaz de germinar em um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância da progênie ou vegetal descendente aos herbicidas aos herbicidas.

[0153] Em algumas realizações, as células de vegetal da presente invenção são capazes de regenerar um vegetal ou parte do vegetal. Em outras realizações, as células de vegetal não são capazes de regenerar um vegetal ou parte do vegetal. Os exemplos de células são capazes de regenerar um vegetal incluem, mas não se limitam ao endosperma, revestimento de semente (testa e pericarpo) e parte superior de raiz.

[0154] Em outra realização, a presente invenção fornece uma célula de vegetal ou capaz de regenerar um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado pela polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas,

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104/266 em que a célula de vegetal compreende o polinucleotídeo recombinante operavelmente ligado a um promotor.

[0155] Em outras realizações, a presente invenção fornece uma célula de vegetal que compreende um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo PPO mutada que confere a tolerância da célula aos herbicidas.

[0156] Em outra realização, a presente invenção se refere a uma célula de vegetal transformado por um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucléico na célula de vegetal resulta em um aumento da resistência ou tolerância a um herbicida em comparação com um variedade do tipo selvagem da célula de vegetal. De preferência, o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de PPO mutada compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 118, 119,120,121,122,123, 124,125, 126, 127., 128, ou 130, ou uma sua variante ou derivado; b) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32,

33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95,

96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129 ou uma sua variante ou derivado; c) um polinucleotídeo que compreende, pelo menos, 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um de (a) ou b); e (d) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de qualquer de (a) a (c).

[0157] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um

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105/266 produto de vegetal preparado a partir dos vegetais de tolerância aos herbicidas. Em algumas realizações, os exemplos de produtos de vegetais incluem, sem limitação os grãos, óleo e farinha. Em uma realização, um produto de vegetal é o grão do vegetal (por exemplo, o grão adequado para a utilização como alimento ou para processamento), óleo vegetal (por exemplo, o óleo adequado para a utilização como alimento ou biodiesel) ou farinha de vegetal (por exemplo, a farinha adequada para a utilização como alimentação).

[0158] Em uma realização, é fornecido um produto de vegetal preparado a partir de um vegetal ou parte de vegetal, em que o vegetal ou parte de vegetal compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo PPO que codifica através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere uma tolerância do vegetal ou parte do vegetal aos herbicidas.

[0159] Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a produção de uma célula de vegetal transgênico com uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula de vegetal que compreende transformar a célula de vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo.

[0160]Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a produção de um vegetal transgênico que compreende: (a) a transformação de uma célula de vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo e (b) a geração de um vegetal com

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106/266 uma resistência aumentada ao herbicida a partir da célula do vegetal.

[0161] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para a produção de um vegetal de tolerância ao herbicida. Em uma realização, o método compreende: a regeneração de um vegetal de uma célula de vegetal transformado com um polinucleotideo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotideo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[0162]O termo “expressão / expressando” ou “expressão de gene” significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou uma construção genética específica. O termo “expressão” ou “expressão de gene” em especial significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução posterior deste último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.

[0163] Para obter o efeito desejado, isto é, os vegetais que são tolerantes ou resistentes ao herbicida derivado de herbicida da presente invenção, será entendido que, pelo menos um ácido nucléico é “superexpresso” através dos métodos e meios conhecidos do técnico no assunto no estado da técnica.

[0164]O termo “expressão aumentada” ou “superexpressão”, conforme utilizado no presente, significa qualquer forma de expressão que seja adicional ao nível de expressão do tipo selvagem. Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos genéticos estão bem documentados no estado da técnica e, por exemplo, incluem a superexpressão conduzida por promotores adequados, a utilização de intensificadores de transcrição ou intensificadores de tradução. Os ácidos nucléicos isolados que servem como elementos promotores

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107/266 ou intensificadores podem ser introduzidos em uma posição adequada (normalmente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo, de maneira a regular positivamente a expressão de um ácido nucléico que codifica o polipeptideo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo através da mutação, eliminação e/ou substituição (vide Kmiec, patente US 5.565.350; Zarling et al., WO 1993/22443), ou os promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de vegetal na orientação e distância adequada de um gene da presente invenção de maneira a controlar a expressão do gene. Se a expressão de polipeptideo for desejada, em geral, é desejado incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais ou de DNA-T. A sequência final 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintetase ou da octopina sintetase, ou de maneira alternativa de outro gene vegetal, ou de menor preferência de qualquer outro gene eucariótico. Uma sequência de intron também pode ser adicionada à região 5' não traduzida (UTR) ou a sequência de codificação de sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um intron emendável que pode ser sequestrado na unidade de transcrição em construções de expressão em vegetais e animais aumentou a expressão genética a níveis de RNAm e proteína até 1.000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4.395-4.405; Callis et al. (1987) Genes Dev): 1.183-1.200). Tal intensificação do intron da expressão do gene normalmente é maior quando colocado próximo da extremidade 5' da unidade de transcrição. A utilização dos introns de milho Adhi-S intron 1,2 e 6, o intron de Bronze-1 é conhecida no estado da técnica. Para informações gerais, vide: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

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108/266 [0165]Quando adequado, as sequências de ácido nucléico podem ser otimizadas para a expressão aumentada em um vegetal transformado. Por exemplo, podem ser fornecidas as sequências de codificação que compreendem os códons de preferência dos vegetais para a expressão aprimorada em um vegetal. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol., 92: 1-11 para uma discussão sobre a utilização de códon de preferência pelo hospedeiro. Os métodos também são conhecidos no estado da técnica para a preparação dos genes de preferência dos vegetais. Vide, por exemplo, patentes U.S. 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporadas no presente como referência.

[0166]Consequentemente, os ácidos nucléicos de PPO mutada da presente invenção são fornecidos em cassetes de expressão para a expressão no vegetal de interesse. O cassete irá incluir as sequências reguladoras operavelmente ligadas a uma sequência de ácido nucléico de PPO mutada da presente invenção. O termo “elemento regulador”, conforme utilizado no presente, se refere a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Inclui, mas não se limita aos promotores, intensificadores, introns, 5' UTRs e 3' UTRs. O termo ‘Operacionalmente ligado” significa uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição de sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Em geral, operacionalmente ligado significa que as sequências de ácido nucléico a serem ligadas são contínuas e, quando necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, contínuas e no mesmo quadro de leitura. O cassete, de maneira adicional, pode conter, pelo menos um gene adicional para ser cotransformado no organismo. De maneira alternativa, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em cassetes de expressão múltipla.

[0167] Um tal cassete de expressão é fornecido com uma

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109/266 pluralidade de locais de restrição para a inserção de sequência de ácido nucléico de PPO mutada, sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão, de maneira adicional, pode conter os genes marcadores selecionáveis. O cassete de expressão da presente invenção inclui na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (isto um promotor), uma sequência de ácidos nucléicos que codifica a PPO mutada da presente invenção e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, a região de terminação) funcional em vegetais. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, ao hospedeiro do vegetal e/ou à sequência de ácido nucléico de PPO mutada da presente invenção. De maneira adicional, o promotor pode ser a sequência natural ou de maneira alternativa uma sequência sintética. Quando o promotor é “estranho” ou “heterólogo” ao hospedeiro do vegetal, é pretendido que o promotor não seja encontrado no vegetal nativo em que o promotor é introduzido. Quando o promotor é “estranho” ou “heterólogo” à sequência de ácido nucléico de PPO mutada da presente invenção, é pretendido que o promotor não seja o promotor nativo ou que ocorra naturalmente para a sequência de ácido nucléico de ThriA mutada operavelmente ligada da presente invenção. Conforme utilizado no presente, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação operavelmente ligada a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga à sequência de codificação. Embora possa ser de preferência expressar os ácidos nucléicos de PPO mutada da presente invenção utilizando os promotores heterólogos, as sequências promotoras nativas podem ser utilizadas. Tais construções iriam alterar os níveis de expressão da proteína de PPO mutada no vegetal ou célula de vegetal. Por conseguinte, o fenótipo do vegetal ou célula de vegetal é alterado.

[0168]A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de PPO mutada

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110/266 operavelmente ligada, pode ser nativa com o hospedeiro do vegetal, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heterológa ao promotor, a sequência de ácido nucléico de PPO mutada de interesse, o hospedeiro do vegetal, ou qualquer sua combinação). As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina sintetase e da nopalina sintetase. Também vide Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon etal. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen etal. (1990) Plant Cell 2: 1.261-1.272; Munroe etal. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas etal. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 -7.903; e Joshi etal. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9.627-9.639. Quando adequado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para a expressão aumentada no vegetal transformado. Isto é, os genes podem ser sintetizados utilizando os códons, de preferência, dos vegetais para expressão aprimorada. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1 -11 para uma discussão sobre a utilização de códon, de preferência, pelo hospedeiro. Os métodos estão disponíveis no estado da técnica para sintetizar os genes, de preferência, dos vegetais. Vide, por exemplo, as patentes US 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporadas no presente como referência.

[0169] Por conseguinte, a presente invenção fornece um cassete de expressão que compreende uma molécula de ácido nucléico de ácido nucléico de PPO mutada, de acordo com a presente invenção, e um promotor operável em células dos vegetais.

[0170] Embora os polinucleotídeos da presente invenção possam encontrar a utilização como os genes marcadores selecionáveis para a transformação dos vegetais, os cassetes de expressão da presente invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da

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111/266 presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem, mas não estão limitados aos genes que codificam a resistência aos antibióticos, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), tais como os genes que conferem a resistência aos compostos herbicidas, tais como o glufosinato de amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4diclorofenoxiacetato (2,4-D). Em geral, vide Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotecnh. 3: 506-511; Christophers et al., (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 6.314-6.318; Yao et al. (1992) Ce//71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol Microbiol 6: 2.419-2.422; Barkley et al. (1980) em The Operon, págs. 177-220; Hu et al. (1987) Cell48: 555-566; Brown etal. (1987) Ce//49: 603-612; Figge etal. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86: 5.4005.404; Fuerst etal. (1989) Proc. Natl Acad. ScL USA 86: 2.549-2.553; Deuschle etal. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Tese, Universidade de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl Acad. ScL USA 90: 1.917-1.921; Labow et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 3.343-3.356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89: 3.952-3.956; Bairn et al. (1991) Proc. Natl Acad. ScL USA 88: 5.072-5.076; Wyborski etal., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol Struc. Biol 10: 143-162; Degenkolb etal. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 -1.595; Kleinschnidt etal. (1988) Biochemistry 27: 1.094-1.104; Bonin (1993) Ph.D. Tese, Universidade de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89: 5.547-5.551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim); Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724. Tais descrições estão incorporadas no presente como referência. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não pretende ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

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112/266 [0171]Além disso, as modificações de sequência adicionais são conhecidas para intensificar a expressão genética em um hospedeiro celular. Estes incluem a eliminação de sequências que codificam os sinais de poliadenilação espúrios, sinais do local de emenda exon-intron, repetições similares a transposon e outras sequências bem caracterizadas que podem ser nocivas para a expressão genética. O teor de G-C de sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado por referência aos genes conhecidos expressos na célula do hospedeiro. Também, caso desejado, as sequências podem ser facilmente modificadas para evitar as estruturas secundárias de RNAm em forma de grampo preditas. As sequências de nucleotídeos para intensificar a expressão genética também podem ser utilizadas nos vetores de expressão do vegetal. Estes, por exemplo, incluem os introns do milho do íntron 1,2 e 6 do gene AdhiS de Adh (Callis et al., Genes and Development 1: 1.183-1.200, 1987), e as sequências de liderança, (sequência W) a partir do vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosqueado clorótico do milho e vírus do mosaico da alfafa (Gallie etal., Nucleic Acid Res. 15: 8.693-8.711, 1987 e Skuzeski etal., Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). O primeiro íntron a partir do local de milho encolhido1 mostrou aumentar a expressão de genes em construções de genes quiméricos. As patentes US 5.424.412 e 5.593.874 descrevem a utilização de introns específicos em construções de expressão de gene, e Gallie etal. (Plant Physiol. 106: 929-939, 1994) também mostraram que os introns são úteis para regular a expressão de gene em uma base específica do tecido. Para intensificar ou otimizar ainda mais a expressão de gene, os vetores de expressão dos vegetais da presente invenção também podem conter as sequências de DNA contendo as regiões de anexação matriz (MARs). As células de vegetal transformadas com tais sistemas de expressão modificados, por conseguinte, podem exibir a superexpressão ou expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo da

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113/266 presente invenção.

[0172]A presente invenção ainda fornece um vetor de expressão recombinante isolado que compreende o cassete de expressão contendo um ácido nucléico de ácido nucléico de PPO mutada conforme descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula do hospedeiro resulta em uma tolerância aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula do hospedeiro. Conforme utilizado no presente, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça circular de DNA de fita dupla na qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula do hospedeiro, na qual são introduzidos (por exemplo, os vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplos, os vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula do hospedeiro após a introdução na célula do hospedeiro e, dessa maneira, são replicados em conjunto com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operavelmente ligados. Tais vetores são referidos no presente como “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente descrição, os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de maneira intercambiável como o plasmídeo é a forma de vetor mais normal utilizada. No entanto, a presente invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como os vetores virais (por exemplo, o retrovirus defeituoso na replicação, adenovirus e vírus adeno-associados), que servem as funções equivalentes.

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114/266 [0173]Os vetores de expressão recombinantes da presente invenção compreendem um ácido nucléico da presente invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucléico em uma célula do hospedeiro, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células do hospedeiro a serem utilizadas para a expressão, que estão operavelmente ligadas à sequência de ácido nucléico a ser expressa. As sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de células do hospedeiro e aquelas que direcionam a expressão de sequência de nucleotídeo apenas em determinadas células do hospedeiro ou sob determinadas condições. Será considerado pelos técnicos no assunto que a concepção do vetor de expressão pode depender de fatores, tais como a seleção da célula do hospedeiro a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado e similares. Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos em células do hospedeiro para, por conseguinte, produzir os polipeptídeos ou peptídeos, incluindo os polipeptídeos ou peptídeos de fusão, codificados através de ácidos nucléicos conforme descrito no presente (por exemplo, os polipeptídeos de PPO mutada, polipeptídeos de fusão e similares).

[0174]Os vetores de expressão, de maneira adicional, podem conter as sequências de liderança 5' na construção de expressão. Essas sequências de liderança podem agir para intensificar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos no estado da técnica e incluem: os líderes de picornavírus, por exemplo, o líder EMCV (região não codificadora 5’ de Encephalomyo carditis) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS, 86: 6.126-6.130); os líderes de potivírus, por exemplo, o líder TEV (vírus de gravação de tabaco) (Gallie etal. (1995) Gene 165 (2): 233-238), líder MDMV (vírus do mosaico anão do milho) (Virology 154: 9-20), e proteína de ligação de cadeia pesada de

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115/266 imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); líder não traduzido do RNAm da proteína de revestimento do virus do mosaico da alfafa (RNA do AMV 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); líder do virus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie etal. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), págs. 237-256); e líder do vírus da mancha clorótica do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-38). Vide também Della-Cioppa etal. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

[0175]Outros métodos conhecidos para intensificar a tradução também podem ser utilizados, por exemplo, os introns e similares. Ao preparar um vetor de expressão, os diversos fragmentos de ácido nucléico podem ser manipulados, de maneira a fornecer as sequências de ácido nucléico na orientação adequada e, conforme adequado, na estrutura de leitura adequada. Para este propósito, os adaptadores ou ligantes podem ser utilizados para unir os fragmentos de ácido nucléico ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer os locais de restrição convenientes, remoção de ácido nucléico supérfluo, remoção de locais de restrição ou similares. Para este propósito, a mutagênese in vitro, reparação de primers, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, as transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0176] Um número de promotores pode ser utilizado na prática da presente invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com os promotores constitutivos, de preferência, de tecido ou outros promotores para a expressão em vegetais.

[0177]Os promotores constitutivos, por exemplo, incluem o promotor do núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos na publicação WO 1999/43838 e na patente US 6.072.050; o promotor central do CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz

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116/266 (McElroy et al. (1990) Plant Cell2·. 163-171); ubiquitina (Christensen etal. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen etal. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675689); pEMU (Last etal. (1991) Theor. Appt Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor de ALS (patente US 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos, por exemplo, incluem as patentes US 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

[0178]Os promotores de tecido de preferência podem ser utilizados para visar a expressão intensificada dentro de um tecido de vegetal especial. Tais promotores de tecido de preferência incluem, mas não estão limitados aos promotores, de preferência, de folhas, promotores, de preferência, de raiz, promotores, de preferência, de sementes e promotores, de preferência, de haste. Alguns exemplos de promotores de tecido de preferência estão descritos, por exemplo, por Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart etal. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1.331-1.341; Van Camp etal. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini etal. (1996) Plant Physiol. 112(2): SIS24; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 -196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1.129-1.138; Matsuoka et al. (1993) Voc Natl. Acad. ScL USA 90(20): 9.5869.590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J 4(3): 495-505. Os promotores podem ser modificados, caso necessário, para a expressão fraca.

[0179] Em algumas realizações, os ácidos nucléicos de interesse podem ser direcionados para o cloroplasto para a expressão. Desta maneira, quando o ácido nucléico de interesse não é inserido diretamente no cloroplasto, o vetor de expressão irá conter, de maneira adicional, uma sequência de direcionamento ao cloroplasto que compreende uma sequência de nucleotídeo

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117/266 que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar o produto de gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos no estado da técnica. Em relação às sequências de direcionamento para o cloroplasto, o termo ‘Operacionalmente ligada” significa que a sequência de ácido nucléico que codifica um peptídeo de trânsito (isto é, a sequência de direcionamento para o cloroplasto) está ligada à sequência de codificação desejada da presente invenção de maneira que as duas sequências sejam contínuas e no mesmo quadro de leitura. Vide, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J Biol. Chem. 264: 17.544-17.550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commum. 196: 1.414-1.421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Por exemplo, um peptídeo de trânsito de cloroplasto conhecido no estado da técnica pode ser fundido com a sequência de amino ácidos de um polipeptideo de PPO da presente invenção operavelmente ligando uma sequência que visa o coroplasto à extremidade 5' de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptideo de PPO.

[0180]As sequências de direcionamento de cloroplasto são conhecidas no estado da técnica e incluem a subunidade pequena de cloroplastos de carboxilase de ribulose-l,5-bisfosfato (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al. al. (1991) J Biol. Chem. 266(5): 3.335-3.342); EPSPS (Archer et al. (1990) J Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); sintase de triptofano (Zhao et al. (1995) J Biol. Chem. 270(11): 6.081-6.087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J Biol. Chem. 272(33): 20.357-20.363); sintase de corismato (Schmidt et al. (1993) J Biol. Chem. 268(36): 27.447-27.457); e a proteína de ligação a/b de clorofila de colheita de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J Biol. Chem. 263: 14.996-14.999). Também vide Von Heijne etal. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark etal. (1989) J Biol. Chem. 264: 17.544-17.550; Della-Cioppa etal. (1987) Plant Physiol. 84:

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965-968; Romer et al. (1993) Biochem Biophys. Res. Commum. 196: 1.4141.421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

[0181]Os métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87: 8.526-8.530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab e Maliga (1993) EMBOJ. 12: 601-606. O método é com base na entrega de partículas de pistola de DNA contendo um marcador selecionável e de direcionamento do DNA para o genoma plastidial através de recombinação homóloga. De maneira adicional, a transformação plastidial pode ser alcançada através da transativação de um transgene silencioso proveniente plastidial através de expressão de preferência por tecido de uma polimerase de RNA codificada nuclear e plastidialmente codificada. Tal sistema foi relatado em McBride etal. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7.301-7.305.

[0182]Os ácidos nucléicos de interesse a serem visados para o cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto para considerar a diferenças na utilização de códon entre o núcleo do vegetal e este organelo. Desta maneira, os ácidos nucléicos de interesse podem ser sintetizados utilizando os códons de preferência de cloroplastos. Vide, por exemplo, a patente US 5.380.831, incorporada no presente como referência.

[0183]Os numerosos vetores de transformação dos vegetais e métodos para transformar os vegetais estão disponíveis. Vide, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant PysioL, 81: 301 -305; Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, Μ. (1988) Theor. Appl. Genet. 16: 161-1 1 A; Hinchee etal. (1990) Stadler. Genet Symp.2032 \ 2.203-2 \ 2; Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, P. P. e Slightom, J. L. (1992) Gene.118: 255260; Christou etal. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; Halluin et al. (1992) Bio / Technol. 10: 309-314; Dhir et al. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sd. USA 90: 1 1.212-1 1.216; Christou, P. (1993) In

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Vitro Cell. Dev. Biol-Plant; 29P.119-124; Davies etal. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, J. A. e Mchughen, A. (1993) Plant ScL 91:139-148; Franklin, C. I. e Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin et al. (1993) Plant ScL 90: 41-52; Guo Chin ScL Bull. 38: 2.072-2.078; Asano et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. e Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219-239; Barcelo et al. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Becker et al. (1994) Plant. J. 5: 299307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol. Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5:17-27; Eapen etal. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman etal. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala etal. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; e Wan, Y. C. e Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104: 3.748.

[0184] Em algumas realizações, os métodos da presente invenção envolvem a introdução de uma construção de polinucleotídeo em um vegetal. Por “introdução” se pretende apresentar ao vegetal a construção do polinucleotídeo de tal maneira que a construção possua acesso dentro de uma célula do vegetal. Os métodos da presente invenção não dependem de um método especial para introduzir uma construção de polinucleotídeo em um vegetal, apenas que a construção de polinucleotídeo ganhe acesso dentro de, pelo menos, uma célula do vegetal. Os métodos para introduzir as construções de polinucleotídeos em vegetais são conhecidos no estado da técnica incluindo, mas não limitados aos métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus. O termo “introdução” ou “transformação”, conforme referido no presente, ainda significa a transferência de um polinucleotídeo exógeno para uma célula do hospedeiro, independentemente do método utilizado para a transferência. O tecido de vegetal capaz de propagação clonal posterior, por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e um vegetal inteiro regenerado a partir disto. O tecido

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120/266 específico selecionado irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis, e mais adequado para as espécies específicas a serem transformadas. Os alvos teciduais exemplares incluem os discos foliares, pólen, embriões, cotiledônias, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente (por exemplo, a meristema apical, gemas axilares e meristemas de raiz) e tecido de meristema induzido (por exemplo, a meristema de cotiledônia e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido transiente ou estavelmente em uma célula do hospedeiro e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. De maneira alternativa, pode ser integrado no genoma do hospedeiro. A célula de vegetal transformado resultante, em seguida, pode ser utilizada para regenerar um vegetal transformado de uma maneira conhecida pelos técnicos no assunto.

[0185] Por “a transformação estável” se pretende que a construção de polinucleotídeo introduzida em um vegetal se integre no genoma do vegetal e seja capaz de ser herdada através de seus descendentes. Por “transformação transitória” se pretende que uma construção de polinucleotídeo introduzida em um vegetal não se integre no genoma do vegetal.

[0186] Para a transformação dos vegetais e células de vegetal, as sequências de nucleotideos da presente invenção são inseridas utilizando as técnicas padrão em qualquer vetor conhecido no estado da técnica que seja adequado para a expressão das sequências de nucleotideos em um vegetal ou célula de vegetal. A seleção do vetor depende da técnica de transformação de preferência e da espécie de vegetal alvo a ser transformada. Em uma realização da presente invenção, a sequência de nucleotídeo de codificação está operacionalmente ligada a um promotor do vegetal, por exemplo, um promotor conhecido no estado da técnica para a expressão a nível elevado em uma célula de vegetal e esta construção, por conseguinte, é introduzida em uma célula de vegetal que suscetível aos herbicidas; e um vegetal transformado é regenerado.

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Em algumas realizações, o vegetal transformado é tolerante à exposição a um nível de herbicidas que matariam ou prejudicariam significativamente um vegetal regenerado a partir de uma célula não transformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de vegetal ou culturas.

[0187] As metodologias para construir os vetores de expressão dos vegetais e introduzir os ácidos nucléicos estranhos nos vegetais em geral, são conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o DNA estranho pode ser introduzido em vegetais, utilizando os vetores de plasmídeo indutores de tumores (Ti). Outros métodos utilizados para entrega de DNA estranho envolvem a utilização de transformação de protoplasto mediada de PEG, eletroporação, filamentos de microinjeção e bombardeamento biolístico ou microprojétil para a captação direta de DNA. Tais métodos são conhecidos no estado da técnica, (patente US 5.405.765 de Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid eta/.al, (1991) MoL Gen. Genet., 228:104-112; Guerche etal. al., (1987) Plant Science 52: 111 -116, Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet., 75: 3036, Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73. Howell et al., (1980) Science 208: 1.265, Horsch etal., (1985) Science 227: 1.229-1.231, DeBlock etal., (1989) Plant Physiology 91: 694-701, Methods for Plant Molecular Biology. (Weissbach e Weissbach, eds) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds) Academic Press, Inc. (1989).

[0188]Outros métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos nas células de vegetais incluem a microinjeção conforme descrito, por exemplo, por Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334, electroporação, conforme descrito por exemplo, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. ScL USA 83: 5.602-5.606, transformação mediada por Agrobacterium, conforme descrita, por exemplo, por Townsend et al., patente US 5.563.055, Zhao et al., patente US 5.981.840, transferência direta de genes conforme descrito, por exemplo, por Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2.717-2.722, e

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122/266 aceleração de partículas balísticas conforme descrito, por exemplo, nas patentes US 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; e 5.932.782; Tomes etal. (1995) Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture·. Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); e transformação de LED (WO 2000/28058). Também vide Weissinger etal., (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou etal., (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe et al., (1988) Bio / Technology 6: 923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh etal, (1998) Theor. Appl. Genet96: 319-324 (soja); Datta etal., (1990) Biotechnology8: 736740 (arroz); Klein etal., (1988) PNAS, 85: 4305-4309 (milho); Klein etal., (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); patentes US 5.240.855; 5.322.783; e 5.324.646; Tomes et al., (1995) Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlim) (milho); Klein et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm etal., (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature (Londres) 31 1: 763-764; Bowen etal., patente US 5.736.369 (cereais); Bytebier etal, (1987) PNAS 84: 5.345-5.349 (Liliaceae); De Wet et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al, (Longman, Nova Iorque), págs. 197-209 (pólen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler etal., (1992) Theor. Apph Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por filamentos); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4: 1.495-1.505 (electroporação); Li et al., (1993) Plant Cell Reports 12: 250- 255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al, (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); cada urn dos quais está incorporado no presente como referência.

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123/266 [0189]Os vegetais transgênicos, incluindo as espécies vegetais transgênicas, de preferência, são produzidos via transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação no vegetal. Para este propósito, é possível, por exemplo, permitir que a agrobactéria atue sobre as sementes dos vegetais ou inocule o meristema do vegetal com a agrobactéria. Foi revelado especialmente vantajoso, de acordo com a presente invenção, permitir uma suspensão da agrobactéria transformada para atuar no vegetal intacto ou, pelo menos, sobre os primórdios da flor. O vegetal é posteriormente cultivado até que as sementes do vegetal tratado sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação do arroz mediada por Agrobacterium incluem os métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente europeia EP 1.198.985 A¹, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22(3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plants 6 (2): 271-282, 1994), cujas descrições estão incorporadas no presente como referência como sendo completamente conhecidas. No caso da transformação de milho, o método de preferência é conforme descrito em Ishida et al., (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al., (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002), cujas descrições estão incorporadas no presente como referência como sendo completamente conhecidas. Ditos métodos ainda são descritos a título de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a manipulação a serem expressos, de preferência, é clonado em um vetor, que é adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, o pBIN19 (Bevan et ai., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8.711). A agrobactéria transformada através de tal vetor pode, em seguida, ser utilizada de uma maneira conhecida para a

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124/266 transformação dos vegetais, tais como os vegetais utilizados como um modelo, tais como a Arabidopsis (Arabidopsis thaliana que está dentro do escopo da presente invenção não é considerada como um vegetal de cultura), ou vegetais de cultura, tais como, a título de exemplo, os vegetais de tabaco, por exemplo, através da imersão folhas manchadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacterial e, em seguida, culturados em meios adequados. A transformação dos vegetais por meio de Agrobacterium tumefaciens está descrita, por exemplo, por Hõfgen e Willmitzer em Nucl. Acid. Res (1988) 16, 9.877 ou é conhecida nomeadamente de F.F. White, Vetors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas. 15-38.

[0190] Um método de transformação conhecido pelos técnicos no assunto é a imersão de um vegetal florindo em uma solução de Agrobacteria, em que a Agrobacteria contém o ácido nucléico de PPO, seguido de reprodução dos gametas transformados. A transformação dos vegetais mediada por Agrobacterium pode ser realizada utilizando, por exemplo, a cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) ou LBA4404 (Clontech). A transformação pode ser realizada através de técnicas convencionais de transformação e regeneração (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13: 4.777-4.788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2a Ed) Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - em Sect., Ringbuc Zentrale Signatur. BT11-P ISBN 0-7923-2731-4, Glick, Bernard R. e Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotecnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, a colza pode ser transformada por meio de transformação de cotiledônias ou hipocótilo (Moloney et al., 1989, Plant Cell Reports: 238-242; De Block etal., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). A utilização de antibióticos para Agrobacterium e seleção dos vegetais depende do vetor

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125/266 binário e da cepa de Agrobacterium utilizada para a transformação. A seleção de colza normalmente é realizada utilizando a canamicina como marcador de vegetal selecionável. A transferência genética mediada por Agrobacterium para o linho pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13: 282-285. De maneira adicional, a transformação de soja pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita na patente europeia 0.424.047, patente US 5.322.783, patente europeia 0.397.687, patente US 5.376.543, ou patente US 5.169.770. A transformação do milho pode ser alcançada através do bombardeamento de partículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol ou através da técnica de fibra de carboneto de silicone. (Vide, por exemplo, Freeling e Walbot “The maize handbook’, de Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico da transformação de milho é encontrado na patente US N5.999.087, e um exemplo específico da transformação de trigo pode ser encontrado no pedido PCT NWO 1993/07256.

[0191] Em algumas realizações, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser introduzidos em vegetais através do contato dos vegetais com um vírus ou ácidos nucléicos virais. Em geral, tais métodos envolvem a incorporação de uma construção de polinucleotídeo da presente invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que os polipeptídeos da presente invenção podem ser inicialmente sintetizados como parte de uma poliproteína viral, que mais tarde pode ser processada através da proteólise in vivo ou in vitro para a produção do polipeptideo recombinante desejado. Além disso, é reconhecido que os promotores da presente invenção também abrangem os promotores utilizados para a transcrição através das polimerases de RNA virais. Os métodos para a introdução de construções de polinucleotídeos em vegetais e expressão de uma proteína codificada na mesma, envolvendo as moléculas de DNA ou RNA virais, são conhecidos no estado da técnica. Vide,

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126/266 por exemplo, as patentes US 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; incorporadas no presente como referência. As células que foram transformadas podem ser cultivadas em vegetais de acordo com formas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Estes vegetais, por conseguinte, podem ser cultivados, e ou polinizados com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e o híbrido resultante que possui a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, em seguida, colhidas as sementes para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada.

[0192] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de vegetal, incluindo, mas não se limitando às monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de espécies dos vegetais de interesse incluem, mas não estão limitados ao trigo ou milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), especialmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto, por exemplo, o milheto de pérola (Pennisetum glaucum), milheto de proso (Panicum miliaceum), milheto de rabo de rabosa (Setaria italica), milheto de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annu), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. Durum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.) abacate (Persea americana), figueira (Ficus

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127/266 casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, vegetais ornamentais e coníferas. De preferência, os vegetais da presente invenção são os vegetais cultivados (por exemplo, o girassol, Brassica sp., algodão, açúcar, beterraba, soja, amendoim, alfafa, cártamo, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, triticale de cevada, sorgo, milheto e similares).

[0193]Além da transformação das células somáticas, que, em seguida, precisam ser regeneradas nos vegetais intactos, também é possível transformar as células dos meristemas dos vegetais e, em especial, as células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados acompanham o desenvolvimento natural do vegetal, originando os vegetais transgênicos. Por conseguinte, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com a agrobactéria e as sementes são obtidas a partir dos vegetais em desenvolvimento em que uma determinada proporção é transformada e, por conseguinte, transgênica [Feldman, KA e Marks MD (1987). Mol Gen Genet208'. 274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapura, páginas. 274-289]. Os métodos alternativos são com base na remoção repetida das inflorescências e incubação do local de extração no centro da roseta com a agrobactéria transformada, em que as sementes transformadas igualmente podem ser obtidas em um ponto posterior no tempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994) Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especialmente eficaz é o método de infiltração por vácuo com as suas alterações tais como o método de “imersão floral”. No caso da infiltração por vácuo, os vegetais intactos de Arabidopsis sob pressão reduzida são tratados com uma suspensão agrobacterial [Bechthold, N (1993). C R Acad Sei. Paris Life Sei., 316:

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1.194-1.199], enquanto que no caso do método de “ imersão floral” o tecido floral desenvolvimento é rapidamente incubado com uma suspensão de tensoativo agrobacterial tratado [Clough, SJ e Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Uma determinada proporção das sementes transgênicas é colhida em ambos os casos e estas sementes podem ser distinguidas a partir das sementes não transgênicas através do crescimento nas condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável dos plastídios é vantajosa, uma vez que os plastídios são herdados maternalmente na maior parte das culturas reduzindo ou eliminando o risco do fluxo transgene através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto, em geral, é alcançada através de um processo, que foi esquematicamente indicado em Klaus etal., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. De maneira resumida, as sequências a serem transformadas são clonadas em conjunto com um gene marcador selecionável entre as sequências homólogas flanqueadas para o genoma do cloroplasto. Estas sequências homólogas flanqueadas conduzem à integração específica do local no plastoma. A transformação plastidal foi descrita para diversas espécies diferentes de vegetais e uma visão geral é fornecida em Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 de setembro de 2001,312 (3): 425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Os progressos biotecnológicos adicionais foram recentemente relatados na forma de transformantes plastidiais livres marcados, que podem ser produzidos através de um gene marcador cointegrado transitório (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2}, 225-223). As células dos vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas através de todos os métodos em que o técnico do assunto está familiarizado. Os métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.

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129/266 [0194] Em geral, após a transformação, as células dos vegetais ou os aglomeramentos de células são selecionados quanto à presença de um ou mais marcadores, que são codificados através dos genes expressáveis por vegetais cotransferidos com o gene de interesse, após o que o material transformado é regenerado em um vegetal inteiro. Para selecionar os vegetais transformados, o material vegetal obtido na transformação, em regra, é submetido às condições seletivas de maneira que os vegetais transformados podem ser distinguidos a partir dos vegetais não transformados. Por exemplo, as sementes obtidas conforme descritas acima podem ser cultivadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada através da pulverização. Uma possibilidade adicional consiste no cultivo das sementes, caso adequado, após a esterilização, em placas de ágar utilizando um agente de seleção adequado de maneira a que apenas as sementes transformadas possam crescer nos vegetais. De maneira alternativa, os vegetais transformados são testados quanto à presença de um marcador selecionável, tais como aqueles descritos acima.

[0195]Após a transferência e regeneração do DNA, os vegetais putativamente transformados também podem ser avaliados, por exemplo, utilizando a análise de Southern, para detectar a presença do gene de interesse, o número de cópias e/ou a organização genômica. De maneira alternativa ou adicional, os níveis da expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorizados utilizando análise de Northern e/ou Western, sendo ambas as técnicas bem conhecidas dos técnicos regulares do assunto.

[0196] Os vegetais transformados gerados podem ser propagados através de uma variedade de meios, tais como através das técnicas de propagação clonal ou clássicas de reprodução. Por exemplo, a primeira geração (ou T1) dos vegetais transformados pode ser autofecundada e os transformantes da segunda geração de homozigotos (ou T2) selecionados, e os vegetais T2

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130/266 podem, em seguida, ainda ser propagados através das técnicas clássicas de reprodução. Os organismos transformados gerados podem possuir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, nos vegetais, uma raiz transformada enxertada em um transplante não transformado).

[0197] De preferência, a expressão do ácido nucléico no vegetal resulta na resistência aumentada do vegetal ao herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal.

[0198] Em outra realização, a presente invenção se refere a um vegetal, que compreende uma célula de vegetal, de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucléico no vegetal resulta na resistência aumentada do vegetal ao herbicida em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal.

[0199]Os vegetais descritos no presente podem ser vegetais de culturas transgénicos ou vegetais não transgénicos.

[0200]Além da definição geral, os termos “transgênico”, “transgene” ou “recombinante” acima, por exemplo, significam uma sequência de ácido nucleico, uma expressão de cassete, uma manipulação de gene ou um vetor que compreende a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão ou vetores, de acordo com a presente invenção, todas as manipulações provocadas através dos métodos recombinantes, em que:

(a) as sequências de ácidos nucleicos codificam as proteínas úteis nos métodos da presente invenção, ou (b) a(s) sequência(s) de controle genético está(ão) operavelmente

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131/266 ligada(s) à sequência de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) (a) e (b)

- não estão localizadas no seu ambiente natural genético ou foram modificadas através dos métodos recombinantes, sendo possível que a alteração assuma a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, eliminação, inserção ou inversão de um ou mais resíduos de nucleotídeos para possibilitar a expressão de PPO mutada da presente invenção. O ambiente genético natural pretende significar o genoma natural ou /ocuscromossômico no vegetal original ou a presença de uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico, de preferência, é retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico, pelo menos, em um lado e possui um comprimento de sequência de, pelo menos, 50 bp, de preferência, de pelo menos 500 bp, de maior preferência, de pelo menos, 1.000 bp, de maior preferência ainda, de pelo menos. 5.000 bp. Um cassete de expressão de ocorrência natural, por exemplo, - a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucléicos com a sequência de ácidos nucléicos correspondentes que codifica para um polipeptídeo útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima - transforma um cassete de expressão transgênico quando este cassete de expressão é modificado através de métodos sintéticos não naturais (“artificiais”), tal como, por exemplo, o tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na patente US 5.565.350 ou na publicação WO 2000/15815.

[0201] Um vegetal transgênico, para os propósitos da presente invenção, por conseguinte, pretende significar, conforme acima, que os ácidos nucléicos utilizados no método da presente invenção não estão no seu locus natural no genoma de dito vegetal, sendo possível que os ácidos nucléicos sejam

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132/266 expressos, de maneira heteróloga ou homóloga. No entanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, enquanto os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, ou utilizados no método da presente invenção estão na sua posição natural no genoma de um vegetal, a sequência foi modificada em relação à sequência natural, e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. O termo transgênico, de preferência, pretende significar a expressão dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, em um locus não natural no genoma, isto é, é realizado na expressão heteróloga ou, de preferência, homóloga dos ácidos nucleicos. Os vegetais transgênicos de preferências são mencionados no presente. Além disso, o termo “transgênico” se refere a qualquer vegetal, célula de vegetal, calo, tecido de vegetal ou parte de vegetal, que contém todo ou parte de, pelo menos, um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante é integrado de maneira estável em um cromossoma ou elemento extracromossômico estável, de maneira que é passado para sucessivas gerações. Para os propósitos da presente invenção, o termo “polinucleotídeo recombinante” se refere a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado ou modificado através da engenharia genética. Os exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos, que estão ligados ou unidos às sequências heterólogas. O termo “recombinante” não se refere às alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos de ocorrência natural, tais como as mutações espontâneas, ou de mutagênese não espontânea, seguida de reprodução seletiva.

[0202]Os vegetais contendo as mutações surgidas devido à mutagênese não espontânea e reprodução seletiva são referidas no presente como vegetais não transgênicos e estão incluídos na presente invenção. Em realizações em que o vegetal é transgênico e compreende múltiplos ácidos nucléicos de PPO mutada, os ácidos nucléicos podem ser derivados de

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133/266 diferentes genomas ou do mesmo genoma. De maneira alternativa, em realizações em que o vegetal é não transgênico e compreende múltiplos ácidos nucléicos de PPO mutada, os ácidos nucléicos estão localizados em diferentes genomas ou no mesmo genoma.

[0203] Em determinadas realizações, a presente invenção envolve os vegetais de resistência aos herbicidas que são produzidos através da reprodução através da mutação. Tais vegetais compreendem um polinucleotídeo que codifica uma PPO mutada e são tolerantes a um ou mais herbicidas inibidores de PPO. Tais métodos podem envolver, por exemplo, a exposição dos vegetais ou sementes a um mutagênio, especialmente, um mutagênio químico tal como, por exemplo, o metanossulfonato de etila (EMS) e selecionar os vegetais que possuam uma tolerância aumentada a pelo menos um ou mais herbicidas inibidores de PPO. [vide Exemplo 1]. No entanto, a presente invenção não se limita aos vegetais de tolerância aos herbicidas que são produzidos através de um método da mutagênese envolvendo o EMS mutagênico químico. Qualquer método da mutagênese conhecido no estado da técnica pode ser utilizado para a produção dos vegetais de resistência aos herbicidas da presente invenção. Esses métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, a utilização de qualquer um ou mais dos seguintes agentes mutagênicos: radiação, tais como os raios X, raios gama (por exemplo, o cobalto 60 ou césio 137), nêutrons (por exemplo, o produto da fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (por exemplo, emitida a partir de radioisótopos como o fósforo 32 ou carbono 14) e radiação ultravioleta (de preferência, a partir de 250 a 290 nm) e mutagênicos químicos como análogos de bases (por exemplo, a 5bromo-uracila), compostos relacionados (por exemplo, a cafeína de 8-etoxi), antibióticos (por exemplo, a estrepetonigrina), agentes alquilantes (por exemplo, as mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso ou

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134/266 acridinas. Os vegetais de resistência aos herbicidas também podem ser produzidos utilizando os métodos de cultura de tecidos para selecionar as células dos vegetais que compreendem as mutações de resistência aos herbicidas e, em seguida, regenerar os vegetais de resistência aos herbicidas a partir das mesmas. Vide, por exemplo, as patentes US 5.773.702 e 5.859.348, ambas incorporadas no presente na sua totalidade como referência. Podem ser encontrados mais detalhes da reprodução de mutações em “Principals of Cultivar Development’, Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, cuja descrição está incorporada no presente como referência.

[0204]De maneira alternativa, os vegetais de resistência aos herbicidas, de acordo com a presente invenção, também podem ser produzidos utilizando os métodos de edição de genomas para selecionar as células dos vegetais que compreendem as mutações de resistência aos herbicidas e, em seguida, regenerar os vegetais de resistência aos herbicidas a partir das mesmas. O termo “Edição de Genoma” se refere a um tipo de engenharia genética na qual o DNA é inserido, eliminado ou substituído no genoma de um organismo utilizando as nucleases projetadas. Essas nucleases são conhecidas pelo técnico no assunto para criar as quebras de fita dupla específicas do local em localizações desejadas no genoma. As quebras de fita dupla induzidas são reparadas por meio de junção de extremidades não homólogas ou recombinação homóloga, resultando em mutações direcionadas. Conhecidas no estado da técnica atualmente são as quatro famílias de nucleases manipuladas que podem ser utilizadas para os propósitos da presente invenção: a meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases com base em efetoras do tipo ativador da transcrição (TALEN) e o sistema CRISPR-Cas. Para referências, vide, por exemplo, Esvelt, KM. e Wang, HH. (2013) “Genome-scale engineering for systems and synthetic biology”, Mol Syst Biol. 9(1): 641; Tan, WS. et al., (2012) “Precision editing of large animal genomes”, Adv Genet. 80: 37-97;

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Puchta, H. e Fauser, F. (2013) “Gene targeting in plants: 25 years lateT, Int. J. Dev. Biol. 57:629-637; Boglioli, Elsy e Richard, Magali “Rewriting the book of life: a new era in precision genome editing’’, Boston Consulting Group, retirado em 30 de novembro de 2015; Método do ano de 2011. Nat Meth 9(1),1-1.

[0205]0 vegetal da presente invenção compreende, pelo menos, um ácido nucléico de PPO mutada ou ácido nucléico de PPO superexpressa do tipo selvagem e possui tolerância aumentada a um herbicida inibidor de PPO em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal. É possível que os vegetais da presente invenção possuam múltiplos ácidos nucléicos de PPO mutada a partir de diferentes genomas, uma vez que estes vegetais podem conter mais do que um genoma. Por exemplo, um vegetal contém dois genomas, em geral, referidos como os genomas A e B. Uma vez que a PPO é uma enzima metabólica requerida, é assumido que cada genoma possui, pelo menos, um gene que codifica a enzima de PPO (isto é, pelo menos um gene de PPO). Conforme utilizado no presente, o termo “local do gene de PPO” se refere à posição de um gene de PPO em um genoma, e os termos “gene de PPO” e “ácido nucléico de PPO” se referem a um ácido nucléico que codifica a enzima de PPO. O ácido nucléico de PPO em cada genoma difere na sua sequência de nucleotídeo de um ácido nucléico de PPO em outro genoma. Um técnico no assunto pode determinar o genoma de origem de cada ácido nucléico de PPO através de cruzamento genético e/ou métodos de sequenciação ou métodos de digestão com a exonuclease conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0206]A presente invenção inclui os vegetais que compreendem um, dois, três ou mais alelos de PPO mutada, em que o vegetal possui a tolerância aumentada a um herbicida inibidor de PPO em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal. Os alelos de PPO mutada podem compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em um polinucleotídeo conforme definido na SEQ ID NO: 118,119,120,

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121, 122, 123,124, 125, 126, 127, 128 ou 130, ou um sua variante ou derivado, um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo conforme definido na SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante ou derivado, homólogo, ortólogo, parálogo, um polinucleotídeo que compreende, pelo menos, 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer dos polinucleotídeos mencionados acima; e um polinucleotídeo complementar a qualquer dos polinucleotídeos mencionados acima.

[0207] Os termo “alelos” ou “variantes alélicas” são formas alternativas de um gene fornecido, localizado na mesma posição cromossômica. As variantes alélicas abrangem os Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), bem como os Polimorfismos de Inserção / Eliminação Pequenos (INDELs). O tamanho dos INDELs, em geral, é inferior a 100 pb. Os SNPs e INDELs formam o maior conjunto de variantes de sequência em cepas polimórficas de ocorrência natural da maioria dos organismos.

[0208]O termo “variedade” se refere a um grupo dos vegetais dentro de uma espécie definida através da partilha de um conjunto comum de características ou traços aceita pelos técnicos no assunto como suficientes para distinguir uma cultivar ou variedade de outra cultivar ou variedade. Não existe implicação em qualquer termo que todos os vegetais de qualquer cultivar ou variedade sejam geneticamente idênticas no gene inteiro ou no nível molecular ou que qualquer vegetal fornecido seja homozigótico em todos os locais. Uma cultivar ou variedade é considerada “reprodução verdadeira” para um traço especial se, quando a variedade ou cultivar verdadeira for autopolinizada, toda

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137/266 a progênie contém o traço. Os termos “linhagem de reprodução” ou “linhagem” se referem a um grupo dos vegetais dentro de uma cultivar definida através do compartilhamento de um conjunto comum de características ou traços aceita pelos técnicos no assunto como suficientes para distinguir uma linhagem ou linhagem de reprodução a partir de outra linhagem ou linhagem de reprodução. Não existe implicação em qualquer termo que todas os vegetais de qualquer linhagem ou linhagem de reprodução sejam geneticamente idênticas no gene inteiro ou no nível molecular ou que qualquer vegetal fornecido seja homozigótico em todos os locais. Uma linhagem de reprodução ou linhagem é considerada “reprodução verdadeira” para um traço especial se, quando a linhagem de reprodução verdadeira ou a linhagem de reprodução for autopolinizada, toda a progênie contém o traço. Na presente invenção, o traço surge de uma mutação em um gene de PPO do vegetal ou semente.

[0209] Os vegetais de resistência aos herbicidas da presente invenção que compreendem os polinucleotídeos que codificam os polipeptideos de PPO mutada também encontram a utilização em métodos para aumentar a resistência aos herbicidas de um vegetal através do aprimoramento dos vegetais convencional envolvendo a reprodução sexual. Os métodos compreendem o cruzamento de um primeiro vegetal que é um vegetal de resistência ao herbicida da presente invenção a um segundo vegetal que pode ou não ser resistente ao mesmo herbicida ou herbicida que o primeiro vegetal ou pode ser resistente aos diferentes herbicidas ou herbicidas do que o primeiro vegetal. O segundo vegetal pode ser qualquer vegetal que seja capaz de produzir os vegetais descendentes viáveis (isto é, as sementes) quando cruzados com o primeiro vegetal. Normalmente, mas não necessariamente, os primeiros e segundos vegetais são da mesma espécie. Os métodos opcionalmente podem envolver a seleção dos vegetais de progênie que compreendem os polipeptideos de PPO mutada do primeiro vegetal e as características de resistência aos herbicidas do segundo

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138/266 vegetal. Os vegetais de progênie produzidos através deste método da presente invenção possuem a resistência aumentada a um herbicida quando comparados com o primeiro ou segundo vegetal ou ambos. Quando o primeiro e segundo vegetais são resistentes aos diferentes herbicidas, os vegetais descendentes irão possuir as características combinadas de tolerância aos herbicidas do primeiro e segundo vegetais. Os métodos da presente invenção ainda podem envolver uma ou mais gerações de retrocruzamento dos vegetais de progênie do primeiro cruzamento para um vegetal da mesma linhagem ou genótipo que o primeiro ou segundo vegetal. De maneira alternativa, a progênie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento posterior pode ser cruzada para um terceiro vegetal que é de uma linhagem ou genótipo diferente do primeiro ou segundo vegetal.

[0210] A presente invenção também fornece os vegetais, órgãos de vegetal, tecidos de vegetal, células de vegetal, sementes e células do hospedeiro não humanas que são transformadas com, pelo menos, uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de transformação da presente invenção. Tais vegetais transformados, órgãos de vegetal, tecidos de vegetal, células de vegetal, sementes e células do hospedeiro não humanas intensificaram a tolerância ou resistência a, pelo menos, um herbicida, a níveis do herbicida que matam ou inibem o crescimento de um vegetal não transformado, tecido de vegetal, célula de vegetal ou célula do hospedeiro não humana, respectivamente. De preferência, os vegetais transformados, tecidos de vegetal, células de vegetal e sementes da presente invenção são Arabidopsis thaliana e os vegetais cultivados.

[0211] Em outra realização, a presente invenção se refere a uma semente produzida através de um vegetal transgênico que compreende uma célula de vegetal da presente invenção, em que a semente é a reprodução verdadeira para uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com

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139/266 uma variedade do tipo selvagem da semente.

[0212] Em outros aspetos, os vegetais de tolerância ao herbicida da presente invenção podem ser empregues como linhagens doadoras de traços de tolerância aos herbicidas para o desenvolvimento, tal como através de reprodução dos vegetais tradicionais, para a produção de outras culturas varietais e/ou híbridas contendo esse traço ou traços. Todas essas culturas resultantes de variedades ou híbridas, contendo o traço ou traços ancestrais de tolerância aos herbicidas, podem ser referidas no presente como a progênie ou descendente da(s) linhagem(ns) ancestral(is) de tolerância ao herbicida.

[0213]Em outras realizações, a presente invenção fornece um método para a produção de um vegetal de tolerância ao herbicida. O método compreende: o cruzamento de um primeiro vegetal de tolerância ao herbicida com um segundo vegetal para a produção de um vegetal de progênie de tolerância ao herbicida, em que o primeiro vegetal e o vegetal de progênie compreendem em, pelo menos, algumas de suas células um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o polinucleotídeo recombinante sendo eficaz nas células do primeiro vegetal para expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[0214]A reprodução dos vegetais tradicionais pode ser utilizada, em que o traço de tolerância ao herbicida é introduzido no vegetal de progênie, por conseguinte, resultante. Em uma realização, a presente invenção fornece um método para a produção de um vegetal de progênie de tolerância ao herbicida, o método compreende: cruzar um vegetal parental com um vegetal de tolerância ao herbicida para introduzir as características de tolerância ao herbicida do vegetal de tolerância ao herbicida no germoplasma do vegetal de progênie, em que o vegetal de progênie possui a tolerância aumentada aos herbicidas em

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140/266 relação ao vegetal mãe. Em outras realizações, o método ainda compreende a etapa de introduzir as características de tolerância aos herbicidas através de técnicas de reprodução dos vegetais tradicionais para obter um vegetal descendente que possui as características de tolerância aos herbicidas.

[0215] Em outros aspectos, os vegetais da presente invenção incluem aqueles vegetais que, além de serem tolerantes aos herbicidas que inibem a PPO, foram submetidos às modificações genéticas adicionais através da reprodução, mutagênese ou engenharia genética, por exemplo, foram tornados tolerantes às aplicações de outras classes específicas de herbicidas, tais como os inibidores de AHAS; herbicidas auxínicos; herbicidas de branqueamento, tais como os inibidores da hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) ou inibidores de fitoeno dessaturase (PDS); os inibidores de EPSPS, tais como o glifosato; os inibidores de glutamina sintetase (GS), tais como o glufosinato; os inibidores da biossíntese de lipídio, tais como os inibidores de carboxilase de acetil-CoA (ACCase); ou oxinila {isto é, as herbicidas de bromoxinila ou ioxinila) como um resultado de métodos convencionais de reprodução ou engenharia genética. Por conseguinte, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção podem ser tornados resistentes a múltiplas classes de herbicidas através de múltiplas modificações genéticas, tais como a resistência ao glifosato e glufosinato ou ao glifosato ou a um herbicida de outra classe, tais como os inibidores da HPPD, inibidores de AHAS ou inibidores de ACCase. Estas tecnologias de resistência aos herbicidas, por exemplo, estão descritas em Pest Management Science (em volume, ano, página): 61, 2005, 246; 61,2005, 258; 61,2005, 277; 61,2005, 269; 61,2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Science 57, 2009, 108; Australian Journal of Agricultural Research 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1.185; e suas referências citadas. Por exemplo, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção, em algumas realizações, podem ser tolerantes aos inibidores de ACCase, tais como

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141/266 os “dims” {por exemplo, o cicloxidim, setoxidim, cletodim ou tepraloxidim), “fops” {por exemplo, o clodinafop, diclofop, fluazifop, haloxifope ou quizalofop) e “denos” (tal como o pinoxadeno); aos herbicidas auxínicos, tais como adicamba; aos inibidores de EPSPS, como o glifosato; aos inibidores da biossintese de celulose; e aos inibidores de GS, como o glufosinato.

[0216] Além destas classes de inibidores, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção também podem ser tolerantes aos herbicidas que possuem outros modos de ação, por exemplo, os inibidores de pigmentação de clorofila / carotenóide, disruptores da membrana celular, inibidores da fotografiassíntese, inibidores da divisão celular, inibidores da raiz, inibidores de tiro, e suas combinações.

[0217]Tais traços de tolerância podem ser expressos, por exemplo, como as proteínas de HPPD mutante ou do tipo selvagem, como as proteínas de PPO mutantes ou do tipo selvagem, como as proteínas de AHASL mutantes, proteínas de ACCase mutantes, proteínas de EPSPS mutantes ou proteínas de glutamina sintetase mutantes; ou como a dioxigenase de ariloxialcanoato nativa, natural ou transgênica mutante (AAD ou DHT), haloarilnitrilase (BXN), dehalogenase do ácido 2,2-dicloropropiônico (DEH), glifosato-Nacetiltransferase (GAT), descarboxilase de glifosato (GDC), oxidoredutase de glifosato (GOX), glutationa-S-transferase (GST), acetiltransferase de fosfinotricina (PAT ou bar), ou proteínas de CYP450s que possuem uma atividade de degradação de herbicidas. Os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção também podem ser empilhadas com outros traços incluindo, mas não limitadas aos traços pesticidas, tais como Bt Cry e outras proteínas que possuem a atividade pesticida em relação aos coleópteros, lepidópteros, nematoides ou outras pragas; os traços de nutrição ou nutricionais, tais como o teor de óleo modificado ou traços de perfil de óleo, traços de concentração elevada de proteína ou de amino ácidos elevada e outros tipos de

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142/266 traços conhecidos no estado da técnica.

[0218] Além disso, em outras realizações, os vegetais de tolerância aos herbicidas também são cobertos, que são, através da utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou através de reprodução e/ou selecionados para tais características, capazes de sintetizar uma ou mais proteínas inseticidas, especialmente aquelas conhecidas do gênero da bactéria Bacillus, especialmente a partir de Bacillus thuringiensis, como as endotoxinas, por exemplo, CrylA(b), CrylA(c), CrylF, CrylF(a2), CryllA(b), CrylIA, CrylllB(bl) ou Cry9c; as proteínas inseticidas vegetativas (VIP), por exemplo, VIP1, VIP2, VIP3 ou VIP3A; as proteínas inseticidas de nematoides que colonizam as bactérias, por exemplo, Photorhabdus spp.. ou Xenorhabdus spp..; as toxinas produzidas através de animais, tais como as toxinas de escorpião, toxinas de aranhas, toxinas de vespa ou outras neurotoxinas específicas de insetos; as toxinas produzidas através de fungos, tais como as toxinas de estreptomiceto; as lectinas vegetais, tais como as lectinas de ervilha ou cevada; as aglutininas; os inibidores de proteinase, tais como os inibidores de tripsina, inibidores de protease de serina, inibidores de patatina ou cistatina; proteínas inativadoras de ribossomas (RIP), tais como a ricina, milho-RIP, abrina, luffina, saporina ou briodina; as enzimas do metabolismo de esteróides, tais como a oxidase de 3hidroxi-esteróide, ecdisteroide-IDP-glicosil-transferase, oxidases de colesterol, inibidores de ecdisona ou HMG-CoA-redutase; os bloqueadores dos canais iônicos, tais como os bloqueadores dos canais de sódio ou cálcio; a esterase hormonal juvenil; os receptores hormonais diuréticos (receptores de helicocinina); a sintase de estilbeno, sintase de bibenzila, quitinases ou glucanases. No contexto da presente invenção, estas proteínas ou toxinas inseticidas também devem ser entendidas expressamente como pré-toxinas, proteínas híbridas, proteínas truncadas ou de outra maneira modificadas. As proteínas híbridas são caracterizadas através de uma nova combinação de

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143/266 domínios proteicos (vide, por exemplo, a publicação WO 2002/015701). Os exemplos adicionais de tais toxinas ou vegetais geneticamente modificadas capazes de sintetizar tais toxinas estão descritos, por exemplo, nas publicações EP-A 374.753, WO 1993/007278, WO 1995/34656, EP-A 427.529, EP-A 451.878, WO 2003/18810 e WO 2003/52073. Os métodos para a produção de tais vegetais geneticamente modificados, em geral, são conhecidos pelo técnico no assunto e estão descritos, por exemplo, nas publicações mencionadas acima. Estas proteínas inseticidas contidas nos vegetais geneticamente modificados conferem aos vegetais que produzem essas proteínas tolerância às pragas nocivas de todos os grupos taxonômicos de artrópodes, especialmente para os besouros (Coeloptera), insetos de duas asas (Diptera) e mariposas (Lepidoptera) e para os nematoides (Nematoda).

[0219] Em algumas realizações, a expressão de uma ou mais toxinas proteicas (por exemplo, as proteínas inseticidas) nos vegetais de tolerância aos herbicidas é eficaz para o controle de organismos que, por exemplo, incluem os membros das classes e ordens: Coleoptera tal como o gorgulho do feijão americano Acanthoscelides obtectus; o besouro das folhas Agelastica alni; os besouros de clique (Agriotes lineatus, Agriotes obscurus, Agriotes bicolor); o besouro de grão Ahasverus advena; a forra de verão Amphimallon solstitialis; o besouro de mobília Anobium punctatum; Anthonomus spp.. (gorgulhos); o besouro mangold pigmeu Atomaria linearis; os besouros de tapete (Anthrenus spp.., Attagenus spp.); o gorgulho do caupi Callosobruchus maculates; o besouro de frutos fritos Carpophilus hemipterus; o gorgulho de sementes de repolho Ceutorhynchus assimilis; o gorgulho de haste do inverno do estupro Ceutorhynchus picitarsis; os larva-arame Conoderus vespertinus e Conoderus falli; o gorgulho da banana Cosmopolites sordidus; o verme da grama da Nova Zelândia Costelytra zealandica; o besouro de junho Cotinis nítida; o gorgulho do caule de girassol Cylindrocopturus adspersus; o besouro Dermestes

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144/266 lardarius; as vermes das raizes Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera e Diabrotica barber!; o besouro do feijoeiro mexicano Epilachna varivestis; a velha broca da casa Hylotropes bajulus; o gorgulho de lucerna Hypera postica; o besouro de aranha brilhante Gibbium psylloides; o besouro do cigarro Lasioderma serricorne; o escaravelho da batata do Colorado Leptinotarsa decemlineata; os besouros de Lyctus {Lyctus spp.., o besouro do pólen Meligethes aeneus; a forra comum Melolontha melolontha; o besouro de aranha americano Mezium americanum; o besouro de aranha dourado Niptus hololeucs; os besouros do grão Oryzaephilus surinamensis e Oryzaephilus Mercator; o gorgulho da videira negra Otiorhynchus sulcatus; o besouro de mostarda Phaedon cochleariae, o besouro de pulga de crucifixo Phyllotreta cruciferae; o escaravelho da pulga listrado Phyllotreta striolata; o besouro de pulga de vapor de repolho Psylliodes chrysocephala; Ptinus spp.. (besouros de aranha); a broca de grãos menores Rhizopertha dominica; a ervilha e gorgulho Sitona lineatus; os escaravelhos de arroz e de capoeira Sitophilus oryzae e Sitophilus; o gorgulho de semente de girassol vermelho Smicronyx fulvus; o besouro de farmácia Stegobium paniceum; o escaravelho amarelo Tenebrio molitor, os besouros Tribolium castaneum e Tribolium confusum; besouros de armazém e de gabinete {Trogoderma spp.); o besouro do girassol Zygogramma exclamationis; Dermaptera (lacraias), tais como a lacraia europeia Forficula auricularia e a lacraia listrada Labidura riparia; Dictyoptera tais como a barata oriental Blatta orientalis; o milípede de estufa Oxidus gracilis; a mosca da beterraba Pegomyia betae; a mosca frita Oscinella frit; moscas da fruta (Dacus spp.., Drosophila spp.); Isoptera (cupins), incluindo as espécies das famílias Hodotermitidae, Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, Termitidae, Termopsidae; o inseto do vegetal manchado Lygus lineolaris; o afideo do feijãopreto Aphis fabae; o afideo do algodão ou melão Aphis gossypii; o afideo de maçã verde Aphis pomi; a mosca branca cítrica Aleurocanthus spiniferus; a

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145/266 mosca branca da batata doce Bemesia tabaci; o afídeo da couve Brevicoryne brassicae; a pera psylla Cacopsylla pyricola; o afídeo de groselha Cryptomyzus ribis; a filoxera da uva Daktulosphaira vitifoliae; a psylla cítrica Diaphorina citri; a cigarrinha da batata Empoasca fabae; a cigarrinha do feijão Empoasca Solana; a cigarrinha da videira Empoasca vitis; o afídio lanoso Eriosoma lanigerum; a fruta europeia de escala Eulecanium corni; o afídio de ameixa Hyalopterus arundinis;o pequeno plantador marrom Laodelphax striatellus; o afídeo da batata Macrosiphum euphorbiae; o afídeo verde do pessegueiro Myzus persicae; a cigarrinha do arroz verde Nephotettix cinticeps; o plantador marrom NHaparvata lugens; o afídeo do lúpulo Phorodon humuli; o afídeo de ave-cereja Rhopalosiphum padi; o afídeo do grão Sitobion avenae; Lepidoptera, tais como Adoxophyes orana (traça do tortrix da fruta do verão); Archips podana (traça do tortrix da árvore da fruta); Bucculatrix pyrivorella (mineira-das-pêras); Bucurrix thurberiella (perfurador de folhas de algodão); Bupalus piniarius (laço de pinheiro); Carpocapsa pomonella (mariposa da maça verde); Chilo suppressalis (broca de arroz listrada); Choristoneura fumiferana (lagarta do espruce oriental); Cochylis hospes (mariposa de girassol unida); Diatraea grandiosella (broca de milho do sudoeste); Eupoecilia ambiguella (mariposa europeia da uva); Helicoverpa armigera (lagarta do algodão); Helicoverpa zea (lagarta do algodão); Heliothis vires cens (larva do tabaco), Homeosoma electellum (mariposa do girassol); Homona magnanima (traça oriental do tortrix da árvore do chá); Lithocolletis blancardella (pintassilgo tempiformes pintados); Lymantria díspar (traça cigana); Malacosoma neustria (lagarta da barraca); Mamestra brassicae (lagarta do repolho); Mamestra configurata (lagarta de Bertha); Operophtera brumata (mariposa de inverno); Ostrinia nubilalis (broca do milho europeu), Panolis flammea (mariposa da beleza do pinheiro), Phyllocnistis citrella (minador de citrinos); Pieris brassicae (borboleta branca de repolho); Rachiplusia ni (laçador de soja); Spodoptera exígua (lagarta da beterraba); Spodoptera littoralis

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146/266 (lagarta da folha do algodo); Sylepta derogata (rolo de folha de algodão); Trichoplusia ni (laçador de repolho); os ortópteros como o grilo comum Acheta domesticus, os gafanhotos das árvores (Anacridium spp.), o gafanhoto migratório Locusta migratória, o gafanhoto geminado Melanoplus bivittatus, o gafanhoto diferencial Melanoplus diferem entialis, o gafanhoto de perna vermelha Melanoplus femurrubrum, o gafanhoto migratório Melanoplus sanguinipes, o grilo de toupeira do norte Neocurtilla hexadectyla, o gafanhoto vermelho Nomadacris septemfasciata, o grilo de toupeira de asa curta Scapteriscus abbreviates, o grilo de toupeira do sul Scapteriscus borellii, o grilo de toupeira marrom de Scapteriscus vicinus, e o gafanhoto do deserto Schistocerca gregaria; Symphyla tal como a sinfonia do jardim Scutigerella immaculata; Thysanoptera como as tripes de tabaco Frankliniella fusca, as tripes da flor Frankliniella intonsa, as tripes da flor ocidental Frankliniella occidentalism, a tripes de algodão Frankliniella schultzei, as tripes de estufas unidas Hercinothrips femoralis, as tripes de soja Neohydatothrips variabilis, as tripes cítricas de Kelly Pezothrips kellyanus, as tripes de abacate Scirtothrips perseae, as tripes de melão Thrips palmie as tripes de cebola Thrips tabaci; e similares e as combinações que compreendem um ou mais dos organismos anteriores.

[0220] Em algumas realizações, a expressão de uma ou mais toxinas proteicas (por exemplo, as proteínas inseticidas) nos vegetais de tolerância aos herbicidas é eficaz para o controle dos besouros da pulga, isto é, os membros da tribo do besouros da família Chrysomelidae, de preferência contra Phyllotreta spp.., tais como Phyllotreta cruciferae e/ou Phyllotreta triolata. Em outras realizações, a expressão de uma ou mais toxinas proteicas {por exemplo, as proteínas inseticidas) nos vegetais de tolerância aos herbicidas é eficaz para o controle do gorgulho das couves de repolho, a lagarta de bertha, os insetos Lygus ou a traça de diamante.

[0221]Além disso, em uma realização, os vegetais de tolerância

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147/266 aos herbicidas também são abrangidos e, por exemplo, são através da utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou através da reprodução e/ou selecionado de outra maneira para tais traços, capaz de sintetizar uma ou mais proteínas para aumentar a resistência ou tolerância desses vegetais aos agentes patogênicos bacterianos, virais ou fúngicos. Os métodos para a produção de tais vegetais geneticamente modificados, em geral, são conhecidos pelo técnico no assunto.

[0222]Além disso, em outra realização, os vegetais de tolerância aos herbicidas também são abrangidos e, por exemplo, são através da utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou através da reprodução e/ou selecionado de outra maneira para tais traços, capaz de sintetizar uma ou mais proteínas para aumentar a produtividade (por exemplo, o teor de óleo), tolerância à aridez, salinidade ou outros limitantes ambientais fatores ou tolerância às pragas e patogênicos fúngicos, bacterianos ou virais desses vegetais.

[0223]Além disso, em outras realizações, os vegetais de tolerância aos herbicidas também são abrangidos e, por exemplo, são através da utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou através da reprodução e/ou selecionado de outra maneira para tais traços, alteradas para conter uma quantidade modificada de uma ou mais substâncias ou substâncias novas, por exemplo, para aprimorar a nutrição humana ou animal, por exemplo, as culturas oleaginosas que produzem os ácidos graxos omega-3 de cadeia longa promotores de saúde ou ácidos graxos omega-9 insaturados (por exemplo, a colza Nexera (R), Dow Agro Sciences, Canadá).

[0224]Além disso, em algumas realizações, os vegetais de tolerância aos herbicidas também são abrangidos, que, por exemplo, são através da utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou através da reprodução e/ou selecionadas de outra maneira para tais traços, alterados para conter as quantidades aumentadas de vitaminas e/ou minerais e/ou perfis aprimorados de

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148/266 compostos nutracêuticos.

[0225] Em uma realização, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção, em relação a um vegetal do tipo selvagem, compreendem uma quantidade aumentada de, ou um perfil aprimorado, de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: glucosinolatos (por exemplo, a glucorafanina (4-metilsulfinilbutil-glucosinolato), sulforafano, 3-indolilmetilglucosinolato (glucobrassicina), 1 -metoxi-3-indolilmetil-glucosinolato (neoglucobrassicina)); os fenólicos (por exemplo, os flavonoides (por exemplo, a quercetina, kaempferol), derivados de hidroxicinamoíla (por exemplo, a 1,2,2'trisinapoilgentiobiose, 1,2-dif eruloilgentiobiose, 1,2'-disinapoil-2-feruloilg liobiose, 3-0-cafeoil-quínico (ácido neoclorogênico)) e vitaminas e minerais (por exemplo, a vitamina C, vitamina E, caroteno, ácido fólico, niacina, riboflavina, tiamina, cálcio, ferro, magnésio, potássio, selênio e zinco).

[0226] Em outra realização, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção, em relação a um vegetal do tipo selvagem, compreendem uma quantidade aumentada de, ou um perfil aprimorado, de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: progoitrina; isotiocianatos; indóis (produtos da hidrólise de glucosinolato); glutationa; carotenoides, tais como o beta-caroteno, licopeno e carotenoides de xantofila, tais como a luteína e zeaxantina; fenólicos que compreendem os flavonoides, tais como os flavonóis (por exemplo, a quercetina, rutina), os flavanos / taninos (tais como as procianidinas que compreendem a cumarina, proantocianidinas, catequinas e antocianinas); flavonas; fitoestrógenos, tais como coumestans, lignanas, resveratrol, isoflavonas, por exemplo, genisteína, daidzeína e gliciteína; lactonas de ácido resor^cíclico; compostos organossulfurados; fitoesteróis; terpenóides tais como o carnosol, ácido rosmarínico, glicirrizina e saponinas; clorofila; clorofilina, açúcares, antocianinas e baunilha.

[0227] Em outras realizações, os vegetais de tolerância aos

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149/266 herbicidas da presente invenção, em relação a um vegetal do tipo selvagem, compreendem uma quantidade aumentada de, ou um perfil aprimorado, de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: vincristina, vinblastina, taxanos (por exemplo, o taxol (paclitaxel), bacatina III, 10-desacetilbacatina III, 10-desacetiltaxol, xilosilaxol, 7-epitaxol, 7-epibacatina III, 10-desacetilcefalino, 7epicefalomanina, taxotere, cefalomanina, cefalomanina de xilosil, taxagifina, taxagifina de 8-benzoiloxil, taxusina de 9-acetiloxi, taxusina de 9-hidroxi, taiwanxam, taxano, taxano lb, taxano Ic, taxano Id, paclitaxel GMP, 9-diidro 13acetilbacatina III, 10-desacetil-7-epitaxol, tetraidrocanabinol (THC), canabidiol (CBD), genisteína, diadzeína, codeína, morfina, quinina, shikonina, ajmalacina, serpentina e similares.

[0228] Em outros aspectos, um método para o tratamento de um vegetal da presente invenção é fornecido.

[0229] Em algumas realizações, o método compreende o contato do vegetal com uma composição agronomicamente aceitável. Em uma realização, a composição agronomicamente aceitável compreende um herbicida auxínico A. I.

[0230]Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a preparação de uma semente descendente. O método compreende o plantio de uma semente ou capaz de produzir um vegetal da presente invenção. Em uma realização, o método ainda compreende o crescimento de um vegetal descendente da semente; e colher uma semente descendente do vegetal descendente. Em outras realizações, o método ainda compreende a aplicação de uma composição herbicida de herbicidas ao vegetal descendente.

[0231] Em outra realização, a presente invenção se refere às partes de colheita do vegetal transgênico, de acordo com a presente invenção. De preferência, as partes de colheita compreendem o ácido nucléico de PPO ou proteína de PPO da presente invenção. As partes de colheita podem ser as

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150/266 sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o ácido nucléico de PPO ou proteína de PPO ou suas partes. As partes de preferência dos vegetais de soja são os grãos de soja que compreendem o ácido nucléico de PPO ou proteína de PPO.

[0232] Em outra realização, a presente invenção se refere aos produtos derivados de um vegetal transgênico, de acordo com a presente invenção, suas partes ou suas partes de colheita. Um produto de vegetal de preferência é a forragem, farinha de sementes, óleo ou sementes revestidas com o tratamento de sementes. De preferência, a farinha e/ou óleo compreendem os ácidos nucléicos de PPO ou proteínas de PPO.

[0233] Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a produção de um produto, cujo método compreende:

(a) cultivar os vegetais da presente invenção ou obteníveis através dos métodos da presente invenção; e (b) produzir dito produto a partir de ou através dos vegetais da presente invenção e/ou partes, por exemplo, as sementes desses vegetais.

[0234] Em uma outra realização, o método compreende as etapas:

(a) de cultivar os vegetais da presente invenção;

(b) de remover as partes de colheita, conforme definido acima, dos vegetais; e (c) de produzir dito produto a partir de ou através de partes de colheita da presente invenção.

[0235]O produto pode ser produzido no local, em que o vegetal foi cultivado, os vegetais e/ou suas partes podem ser removidas do local, em que os vegetais foram cultivados para a produção do produto. Normalmente, o vegetal é cultivado, as partes de colheita desejadas são removidas do vegetal, se possível em ciclos repetidos, e o produto é produzido das partes de colheita do vegetal. A etapa de cultivar o vegetal pode ser realizada apenas uma vez de

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151/266 cada vez que os métodos da presente invenção são realizados, enquanto se possibilita os tempos repetidos das etapas de produção do produto, por exemplo, através da remoção repetida de partes de colheita dos vegetais da presente invenção e, caso necessário, o processamento adicional destas partes para alcançar o produto. Também é possível que a etapa de crescimento dos vegetais da presente invenção seja repetida e os vegetais ou partes de colheita sejam armazenadas até que a produção do produto, por conseguinte, seja realizada uma vez para os vegetais ou partes dos vegetais acumuladas. Além disso, as etapas de cultivar os vegetais e produzir o produto podem ser realizadas com uma sobreposição no tempo, até mesmo simultaneamente em ampla extensão ou sequencialmente. Em geral, os vegetais são cultivados por algum tempo antes do produto ser produzido.

[0236] Em uma realização, os produtos produzidos através de ditos métodos da presente invenção são os produtos de vegetais tais como, mas não limitados a um gênero alimentício, ingrediente alimentar, suplemento alimentício, suplemento alimentar, fibra, cosmético e/ou farmacêutico. Os gêneros alimentícios são considerados como as composições utilizadas para a nutrição e/ou para a suplementação nutricional. Os ingredientes alimentares para os animais e os suplementos alimentares para os animais, em especial, são considerados os gêneros alimentícios.

[0237] Em outra realização, os métodos da presente invenção para a produção são utilizados para a produção de produtos agrícolas tais como, mas não limitados aos extratos dos vegetais, proteínas, amino ácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e similares.

[0238] É possível que um produto de vegetal consista em um ou mais produtos agrícolas em grande extensão.

Herbicidas [0239]Conforme descrito acima, a presente invenção fornece os

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152/266 ácidos nucléicos, polipeptídeos, que conferem a tolerância dos vegetais aos herbicidas.

[0240]Em geral, o termo “herbicida” é utilizado no presente para significar um ingrediente ativo que mata, controla ou de outra maneira modifica adversamente o crescimento dos vegetais. A quantidade ou concentração de preferência do herbicida é uma “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz”. O termo “quantidade eficaz” e “concentração eficaz” significa uma quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de um vegetal, tecido de vegetal, célula de vegetal ou célula do hospedeiro similar, do tipo selvagem, mas dita quantidade não mata ou inibe tão severamente o crescimento dos vegetais de resistência aos herbicidas, tecidos de vegetal, células de vegetal e células do hospedeiro da presente invenção. Normalmente, a quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramente utilizada em sistemas de produção agrícola para matar as ervas daninhas de interesse. Tal quantidade é conhecida pelos técnicos no assunto. A atividade herbicida é exibida através de herbicidas úteis para a presente invenção quando são aplicados diretamente no vegetal ou no local do vegetal em qualquer estágio de crescimento ou antes do plantio ou emergência. O efeito observado depende das espécies dos vegetais a serem controlados, do estágio de crescimento do vegetal, dos parâmetros de aplicação da diluição e do tamanho da gota de pulverização, do tamanho das partículas dos componentes sólidos, das condições ambientais no momento da utilização, do composto específico empregado, dos adjuvantes e veículos específicos utilizados, do tipo de solo e similares, bem como a quantidade de produto químico aplicado. Estes e outros fatores podem ser ajustados conforme é conhecido no estado da técnica para promover uma ação herbicida não seletiva ou seletiva. Em geral, é de preferência aplicar o herbicida pós-emergência a vegetação indesejada relativamente imatura para alcançar o controle máximo de ervas daninhas.

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153/266 [0241] O termo um vegetal de “tolerância ao herbicida” ou “resistência ao herbicida”, significa que um vegetal que é tolerante ou resistente a, pelo menos um herbicida a um nível que normalmente iria matar ou inibir o crescimento de um vegetal normal ou do tipo selvagem. O termo “proteína do tipo selvagem de tolerância ao herbicida ou proteína de PPO mutada” ou “proteína do tipo selvagem de resistência ao herbicida ou proteína de PPO mutada”, significa que tal proteína de PPO exibe maior atividade de PPO, em relação à atividade de PPO de uma proteína do tipo selvagem de PPO, quando na presença de, pelo menos, um herbicida que é conhecido por interferir com a atividade de PPO e a uma concentração ou nível do herbicida que é conhecido por inibir a atividade de PPO da proteína do tipo selvagem de PPO mutada. Além disso, a atividade de PPO de uma proteína de PPO mutada de tolerância ao herbicida ou resistência ao herbicida pode ser referida no presente como a atividade de PPO de “tolerância ao herbicida” ou “resistência ao herbicida”.

[0242]Os exemplos de herbicidas que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, isto é, aos quais os vegetais, de acordo com a presente invenção, são tolerantes / resistentes, são os compostos conhecidos pelos técnicos no assunto como os herbicidas inibidores de PPO. Os exemplos de herbicidas inibidores de PPO estão descritos em detalhes a seguir.

[0243] Em geral, se os herbicidas inibidores de PPO (também referidos como compostos A) e/ou os compostos herbicidas B, conforme descritos no presente, que podem ser utilizados no contexto da presente invenção, forem capazes de formar os isômeros geométricos, por exemplo, os isômeros E/Z, é possível utilizar ambos, os isômeros puros e suas misturas, nas composições úteis para a presente invenção. Se os herbicidas inibidores de PPO A e/ou os compostos herbicidas B, conforme descritos no presente, possuírem um ou mais centros de quiralidade e, como consequência, estiverem presentes como enantiômeros ou diastereômeros, é possível utilizar ambos, os

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154/266 enantiômeros e diastereômeros puros e suas misturas, nas composições, de acordo com a presente invenção. Se os herbicidas inibidores de PPO A e/ou os compostos herbicidas B descritos no presente possuírem os grupos funcionais ionizáveis, também podem ser empregados na forma dos seus sais agricolamente aceitáveis. Em geral, são adequados os sais desses cátions e os sais de adição de ácido daqueles ácidos cujos cátions e ânions, respectivamente, não apresentam nenhum efeito adverso na atividade dos compostos ativos. Os cátions de preferência são os íons de metal alcalino, de preferência de lítio, sódio e potássio, dos metais alcalino terrosos, de preferência, de cálcio e magnésio, e dos metais de transição, de preferência, de manganês, cobre, zinco e ferro, e ainda de amônio e amônio substituído, em que de um a quatro átomos de hidrogênio são substituídos por alquila C1-C4, hidroxi-alquila C1-C4, alcóxi Ci-C4-alquila C1-C4, hidroxi-alcóxi Ci-C4-alquila C1-C4, fenila ou benzila, de preferência, 0 amônio, metilamônio, isopropilamônio, dimetilamônio, diisopropilamônio, trimetilamônio, heptilamônio, dodecilamônio, tetradecilamônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrabutilamônio, 2hidroxietilamônio (sal de olamina), 2-(2-hidroxiet-1-oxi)et-1-ilamônio (sal de diglicolamina), di(2-hidroxiet-1-il)-amônio (sal de diolamina), tris(2hidroxietil)amônio (sal de trolamina), tris(2-hidroxipropil)amônio, benziltrimetilamônio, benziltrietilamônio, Ν,Ν,Ν-trimetiletanolamônio (sal de colina), além disso, os íons de fosfônio, íons de sulfônio, de preferência, 0 tri(alquila Ci-C4)sulfônio, tais como 0 trimetilsulfônio e sulfoxônio, de preferência, 0 tri(alquila Ci-C4)sulfoxônio, e finalmente os sais de aminas polibásicas, tais como a N,N-bis-(3-aminopropil)metilamina e dietilenotriamina. Os ânions dos sais de adição de ácido úteis principalmente são 0 cloreto, brometo, fluoreto, iodeto, hidrogenossulfato, metilsulfato, sulfato, diidrogenofosfato, hidrogenofosfato, nitrato, bicarbonato, carbonato, hexafluorosilicato, hexafluorofosfato, benzoato e também os ânions de ácidos alcanóicos C1-C4, de

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155/266 preferência, o formato, acetato, propionato e butirato.

[0244]Os herbicidas inibidores de PPO A e/ou os compostos herbicidas B, conforme descritos no presente que possuem um grupo carboxila, podem ser empregues na forma do ácido, na forma de um sal adequado à agricultura conforme mencionado acima, ou por conseguinte, na forma de um derivados agricolamente aceitável, por exemplo, como as amidas, tais como as mono e di-alquilamidas Ci-Ce ou arilamidas, como os ésteres, por exemplo, como os ésteres de alila, ésteres de propargila, ésteres de alquila C1-C10, ésteres de alcoxialquila, ésteres de ((tetraidrofurano-2)-il)metil) de tefurila e também como os tioésteres, por exemplo, como os ésteres de alquiltio C1-C10. As monoe di-alquilamidas C1-C6, de preferência são a metila e as dimetilamidas. As arilamidas, de preferência, por exemplo, são as anilidas e as 2-cloroanilidas. Os ésteres de alquila, de preferência, por exemplo, são os ésteres de metila, de etila, de propila, de isopropila, de butila, de isobutila, de pentila, de mexila (1metil-hexila), meptila (1 -metil-heptila), heptila, octila ou iso-octila (2-etil-hexila). Os ésteres de alcóxi Ci-C4-alquila C1-C4, de preferência são os ésteres de etila de alcóxi C1-C4 de cadeias lineares ou ramificadas, por exemplo, 0 éster de 2metoxietila, 2-etoxietila, 2-butoxietila (butotila), 2-butoxipropila ou 3butoxipropila. Um exemplo de um éster de alquiltio C1-C10 de cadeia linear ou ramificada é 0 éster de etiltio.

[0245]Os exemplos de herbicidas inibidores de PPO que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são 0 acifluorfeno, acifluorfensódio, aclonifeno, azafenidina, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacila, carfentrazona, carfentrazon-etila, clometoxifena, cinidon-etila, fluazolato, flufenpir, flufenpir-etila, flumiclorac, flumiclorac-pentila, flumioxazina, fluoroglicofeno, fluoroglicofen-etila, flutiacet, flutiacet-metila, fomesafeno, halosafen, lactofeno, oxadiargil, oxadiazona, oxifluorfeno, pentoxazona, profluazol, piraclonila, piraflufena, piraflufen-etila, saflufenacila, sulfentrazona,

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156/266 tidiazimina, tiafenacila, clornitrofeno, flumipropina, fluoronitrofeno, flupropacila, furiloxifeno, nitrofluorfeno, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -metil-6-trif luorometil-2,4dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100), N-etil-3-2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil- 1Hpirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9), N-tetraidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4(trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 915396-43-9), Netil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometil-fenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452099-05-7), N-tetraidro-fenoururil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 -carboxamida (CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo[1,3,5]triazinan-2,4-diona (CAS 451484-50-7), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 I trifludimoxazina), 2-(2,2,7-trifluoro-3oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7-tetraidro-isoindol1,3-diona (CAS 1300118-96-0), 1-metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-tri-fluoro-3-oxo-

4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-7/-/-pirimidina-2,4-diona, (E)-4[2-cloro-5-[4-cloro-5-(difluorometoxi)-//-/-metil-pirazol-3-il]-4-fluoro-fenoxi]-3metoxi-but-2-enoato de metila [CAS 948893-00-3], 3-[7-cloro-5-fluoro-2(trif luorometi I) - 7 /-/-benzi m idazol-4-i I]-1 -meti I-6-(trif luorometi I) - //-/-pirimidina-2,4diona (CAS 212754-02-4) e

- as uracilas de Fórmula III

- em que

- R³⁰ e R³¹, independentemente entre si, são o F, Cl ou CN;

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157/266

- R³² é o O ou S;

- R³³ é ο Η, F, Cl, CH₃ou OCH3;

- R³⁴ é ο CH ouN;

- R³⁵ é 0 O ou S;

- R³⁶ é 0 H, CN, CH₃, CF3, OCH3, OC2H5, SCH3, SC2H5, (CO)OC₂H₅ou CH2R³⁸,

- em que R³⁸ é 0 F, Cl, OCH3, SCH3, SC2H5, CH2F, CH₂Br ou CH2OH;

- e

- R³⁷ é 0 (alquila Ci-C6)amino, (dialquila Ci-C6)amino, (NH)OR³⁹, OH, OR⁴⁰ ou SR⁴⁰

- em que R³⁹ é 0 CH3, C2H5 ou fenila; e

- R⁴⁰, independentemente entre si, alquila Ci-Ce, alquenila C2-C6, alquinila C3-C6, haloalquila Ci-Ce, alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alcóxi Ci-Ce-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, cianoalquila C2-C6, alcóxi Ci-C4-carbonil-alquila C1-C4, alquila Ci-C4-carbonil-amino, alquilssulfinila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquilssulfonila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, dialcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquilcarbonilóxi Ci-Ce-alquila C1-C6, fenil-carbonil-alquila Ci-Ce, tri(alquila Ci-Csj-silil-alquila Ci-Ce, tri(alquila Ci-C3)-silil-alquenila Ci-Ce, tri(alquila C1 -Csj-silil-alquinila Ci-Ce, tri(alquila C1C3)-silil-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, dimetilamino, tetraidropiranila, tetraidrofuranilalquila C1-C3, fenil-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, fenil-alquila C1-C3, piridil-alquila C1-C3, piridila, fenila,

- as piridilas e fenilas, independentemente entre si, são substituídas por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C3 ou haloalquila C1-C2;

- cicloalquila C3-C6 ou cicloalquila Cs-Ce-alquila C1-C4,

- em que as cicloalquilas, independentemente entre si, são não substituídas ou substituídas por um a cinco substituintes selecionados a partir do

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158/266 grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C3 e haloalquila C1-C2;

- incluindo os seus sais de metal alcalino agricolamente aceitáveis ou sais de amônio.

[0246]Os herbicidas inibidores de PPO de preferência que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são:

- 0 acifluorfeno, acifluorfen-sódio, azafenidina, bencarbazona, benzfendizona, butafenacila, carfentrazon-etila, cinidon-etila, flufenpir-etila, flumiclorac-pentila, flumioxazina, fluoroglicofen-etila, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargil, oxadiazona, oxifluorfeno, pentoxazona, piraflufen-etila, saflufenacil, sulfentrazona, tiafenacil, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-(tetraidroxpirimidin-3-il)fenoxi]-2piridiloxi]-acetato (CAS 353292-31-6; S-3100), N-etil-3-(2,6-dicloro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9), Ntetraidro-fenouril-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452099-05-7), Ntetraidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometil-fenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 carboxamida (CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tio-oxo[1,3,5]triazinan-2,4-diona (CAS 451484-50-7), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), 2-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7-tetraidro-isoindol-1,3-diona (CAS 1300118-96-0);

-metil-6-trifluoro-metil-3-(2,2,7-tri-fluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il)-//-/-pirimidina-2,4-diona (CAS 1304113-05-0), 3-[7-cloro-

5-fluoro-2-(trifluorometil)-//-/-benzimidazol-4-il]-1 -metil-6-(trifluorometil)- 1Hpirimidina-2,4-diona (CAS 212754-02-4);

- as uracilas de Fórmula III.1 (correspondendo às uracilas de

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159/266

Fórmula III, em que R³⁰ é o F, R³¹ é o Cl, R³² é o O; R³³ é o H; R³⁴ é o CH; R³⁵ é o O e R³⁷ é o OR⁴⁰);

>40

- em que

- R³⁶ é o OCH3, OC2H5, SCH3 ou SC2H5;

- R⁴⁰ é a alquila Ci-Ce, alquenila C2-C6, alquinila C3-C6, haloalquila

C1-C6, alcoxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alcoxi Ci-Ce-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, ciano alquila C1-C3, fenil-alquila C1-C3, piridil-alquila C1-C3, cicloalquila C3-C6 ou cicloalquila Cs-Ce-alquila C1-C4;

- em que as cicloalquilas são não substituídas ou substituídas por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C3 e haloalquila C1-C2;

- as uracilas de Fórmula III.2 (correspondendo às uracilas de

Fórmula III, em que R³⁰ é 0 F; R³¹ é 0 Cl; R³² é 0 O; R³³ é 0 H; R³⁴ é 0 N, R³⁵ é 0

O e R³⁷ é 0 OR⁴⁰ com R⁴⁰ é a alquila Ci-Ce).

CH, F₃C N

Cl θ'Οι -Ce-alkyl

III.2, [0247]Os herbicidas inibidores de PPO especialmente de preferência que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são:

- 0 acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, carfentrazon-etila,

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160/266 cinidon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargil, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, tiafenacil, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-

6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona (CAS 451484-50-7), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4- diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-iI)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina) e 2-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo [1,4]oxazina-6-il)-4,5,6,7-tetraidro-isoindol-1,3-diona (CAS 1300118-96-0), 1metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-tri-fluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il)-7/-/-pirimidina-2,4-diona (CAS 1304113-05-0),

- as uracilas de Fórmula III.1.1 (correspondendo às uracilas de Fórmula III, em que R³⁰ é o F, R³¹ é o Cl, R³² é o O; R³³ é ο H; R³⁴ é o CH; R³⁵ é o O, R³⁶ é o OCH₃ e R³⁷ é 0 OR⁴⁰);

- em que

- R⁴⁰ é a alquila Ci-Ce, alquenila C2-C6, alquinila C3-C6, haloalquila

C1-C6, alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alcóxi Ci-Ce-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, cianoalquila C1-C3, fenil-alquila C1-C3, piridil-alquila C1-C3, cicloalquila C3-C6 ou cicloalquila Cs-Ce-alquila C1-C4,

- as cicloalquilas são não substituídas ou substituídas por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C3 e haloalquila C1-C2;

- de preferência, é 0 CH3, CH2CH2OC2H5, CH2CHF2, cicloexila, (1

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161/266 metilciclopropil)metila ou CH2(piridina-4-il);

- as uracilas de Fórmula III.2.1 (correspondendo às uracilas de Fórmula III, em que R³⁰ é o F; R³¹ é o Cl; R³² é o O; R³³ é ο H; R³⁴ é ο N; R³⁵ é o O e R³⁷ é o OR⁴⁰ com R⁴⁰ é o CH₃)

ch₃ F₃C N 0	o^Ar^001-*³
Mr	. o A ⁰ V 111.2.1,
F	II I JJ Cl

- e

- as uracilas de Fórmula III.2.2 (correspondendo às uracilas de

Fórmula III, em que R³⁰ é o F; R³¹ é o Cl; R³² é o O; R³³ é ο H; R³⁴ é ο N; R³⁵ é o O e R³⁷ é o OR⁴⁰ com R⁴⁰ é o C2H5)

Ç^H3 F₃C N 0
	. o A ⁰ V III.2.2,
o F	II I jj Cl

[0248]Os herbicidas inibidores de PPO especialmente de preferência são os herbicidas inibidores de PPO.1 a A. 14 listados abaixo na

Tabela A:

	Tabela A
B-1	acifluorfeno
B-2	butafenacila
B-3	carfentrazon-etila
B-4	cinidon-etila
B-5	flumioxazina
B-6	flutiacet-metila
B-7	fomesafeno

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162/266

B-8 lactofeno

B-9 oxadiargila

B-10 oxifluorfeno

B-11 saflufenacil

B-12 sulfentrazona

B-13 [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -metil-6trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS

353292-31-6)

B-14 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinana-2,4-diona (CAS 125883672-4 / trifludimoxazina)

B-15 Tiafenacil [0249]Outros herbicidas inibidores de PPO de preferência incluem aqueles descritos na publicação WO 2016/120116, cujo teor está incorporado no presente como referência na sua totalidade.

[0250]0utro herbicida inibidor de PPO de preferência inclui aqueles descritos na publicação WO 2017/202768, cujo teor está incorporado no presente como referência na sua totalidade.

[0251] Mais especificamente, dito herbicida inibidor de PPO descrito na publicação WO 2017/202768 se refere a uma uracilpiridina de Fórmula (I)

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163/266

- em que os substituintes possuem os seguintes significados:

- R¹ é o hidrogênio, NH2, alquila Ci-Ce ou alquinila Ca-Ce;

- R² é 0 hidrogênio, alquila Ci-Ce ou haloalquila Ci-Ce;

- R³ é 0 hidrogênio ou alquila Ci-Ce;

- R⁴ é 0 H ou halogênio;

- R⁵ é 0 halogênio, CN, NO2, NH2, CF₃ ou C(=S)NH₂;

- R⁶ é 0 H, halogênio, CN, alquila C1-C3, haloalquila C1-C3, alcóxi C1-C3, haloalcóxi C1-C3, alquiltio C1-C3, (alquila Ci-C3)amino, di(alquila C1C3)amino, alcóxi Ci-Ca-alquila C1-C3, alcoxicarbonila C1-C3;

- R⁷ é 0 H, halogênio, alquila C1-C3, alcóxi C1-C3;

- R⁸ é 0 OR⁹, SR⁹, NR¹⁰R¹¹, NR⁹OR⁹, NR⁹S(O)2R¹⁰ ou NR⁹S(O)2NR¹⁰R¹¹, em que

- R⁹ é 0 hidrogênio, alquila Ci-Ce, alquenila C3-C6, alquinila C3-C6, haloalquila Ci-Ce, haloalquenila C3-C6, haloalquinila C3-C6, cianoalquila Ci-Ce, alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alcóxi Ci-Ce- alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, di(alcóxi C1Ce)alquila Ci-Ce, haloalcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquenilóxi Ca-Ce-alquila Ci-Ce, haloalquenilóxi Ca-Ce-alquila Ci-Ce, alquenilóxi Ca-Ce-alcóxi Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquiltio Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquilssulfinila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquilssulfonila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alquilcarbonila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alcoxicarbonila Ci-Cealquila Ci-Ce, haloalcoxicarbonila Ci-Ce-alquila Ci-Ce, alqueniloxicarbonila C3Ce-alquila Ci-Ce, alquiniloxicarbonila Ca-Ce-alquila Ci-Ce, amino, (alquila C1Ce)amino, di(alquila Ci-C6)amino, (alquilcarbonila Ci-C6)amino, amino-alquila C1-C6, (alquila Ci-C6)amino-alquila Ci-Ce, di(alquila Ci-C6)amino-alquila Ci-Ce, aminocarbonil-alquila Ci-Ce, (alquila Ci-C6)aminocarbonil-alquila Ci-Ce,

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164/266 di(alquila Ci-C6)aminocarbonil-alquila Ci-Ce,

- -N=CR¹²R¹³, em que R¹² e R¹³, independentemente entre si, são o H, alquila C1-C4 ou fenila;

- cicloalquila C3-C6, cicloalquila Ca-Ce-alquila Ci-Ce, heterociclil C3Ce, heterociclil Ca-Ce-alquila Ci-Ce, fenila, fenil-alquila C1-C4 ou uma heteroarila com 5 ou 6 membros,

- em que cada anel cicloalquila, heterociclila, fenila ou heteroarila pode ser substituído por um a quatro substituintes selecionados a partir de R¹⁴ou um carbociclo com 3 a 7 membros,

- em que carbociclo opcionalmente possui, além dos átomos de carbono, um ou dois membros do anel selecionados a partir do grupo que consiste em

- -N(R¹²)-, -N=N-, -C(=O)-, -O- e -S- e

- em que carbociclo é opcionalmente substituído por um a quatro substituintes selecionados a partir de R¹⁴;

- em que R¹⁴ é 0 halogênio, NO2, CN, alquila C1-C4, haloalquila C1C4, alcóxi C1-C4 ou alcoxicarbonila C1-C4;

- R¹⁰, R¹¹, independentemente entre si, são 0 R⁹, ou em conjunto formam um carbociclo com 3 a 7 membros,

- que carbociclo opcionalmente possui, além dos átomos de carbono, um ou dois membros do anel selecionados a partir do grupo que consiste em -N(R¹²)-, -N=N-, -C(=O)-, -O- e -S-, e

- n é de 1 a 3;

- Q é 0 CH2, O, S, SO, SO2, NH ou (alquila C1-C3);

- W é 0 O ou S;

-Xéo NH, NCH₃, OouS;

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165/266

- Y é o O ou S;

- Ζ é a fenila, piridila, piridazinila, pirimidinila ou pirazinila,

- cada um dos quais é opcionalmente substituído por 1 a 4 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, CN, alquila Ci-Ce, haloalquila Ci-Ce, alcoxi Ci-Ce, haloalcóxi Ci-Ce;

- incluindo os seus sais ou derivados agricolamente aceitáveis, desde que os compostos de Fórmula (I) possuam um grupo carboxila.

[0252]Os herbicidas inibidores de PPO descritos acima que são úteis para realizar a presente invenção são frequentemente melhor aplicados em conjunto com um ou mais outros herbicidas para obter o controle de uma variedade maior de vegetação indesejada. Por exemplo, os herbicidas inibidores de PPO ainda podem ser utilizados em conjunto com os herbicidas adicionais aos quais o vegetal de cultura é naturalmente tolerante, ou aos quais é resistente através da expressão de um ou mais transgenes adicionais, conforme mencionado acima, ou aos quais é resistente por meio da mutagênese e métodos de reprodução, conforme descrito. Quando utilizados em conjunto com outros herbicidas de direcionamento, os herbicidas inibidores de PPO, aos quais o vegetal da presente invenção se tornou resistente ou tolerante, podem ser formulados com o outro herbicida ou herbicidas, tanque misturado com o outro herbicida ou herbicidas, ou sequencialmente aplicado com o outro herbicida ou herbicida.

[0253]Os componentes adequados para as misturas, por exemplo, são selecionados dos herbicidas da classe de (b1) a (b15):

(B) herbicidas da classe de (b1) a (b15);

(b1) inibidores da biossíntese de lipídeos;

(b2) inibidores da sintase de acetolactato (inibidores ALS);

(b3) inibidores da fotografiassíntese;

(b4) inibidores da oxidase de protoporfirinogenio-IX;

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166/266 (b5) herbicidas branqueadores;

(b6) inibidores da sintase de enolpiruvil chiquimato-3-fosfato (inibidores EPSP);

(b7) inibidores da glutamina sintetase;

(b8) inibidores da sintase de 7,8-diidropteroato (inibidores DHP);

(b9) inibidores da mitose;

(b10) inibidores da síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa (inibidores VLCFA);

(b11) inibidores da biossíntese de celulose;

(b12) herbicidas de desacoplamento;

(b13) herbicidas de auxina;

(b14) inibidores do transporte da auxina; e (b15) outros herbicidas selecionados a partir do grupo que consiste em bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metila, cinmetilina, cumilurona, dalapon, dazomet, difenzoquat, difenzoquat-metilssulfato, dimetipina, DSMA, dimrona, endotal e seus sais, etobenzanid, flamprop, flamprop-isopropila, flamprop-metila, flamprop-M-isopropila, flamprop-M-metila, flurenol, flurenolbutila, flurprimidol, fosamina, fosamina-amônio, indanofano, indaziflam, hidrazida maleica, mefluidida, metam, metiozolina (CAS 403640-27-7), azida de metila, brometo de metila, dimrona de metila, iodeto de metila, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargônio, piributicarb, quinoclamina, triaziflam, tridifano e 6-cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (CAS 499223-49-3) e seus sais e ésteres;

- incluindo os seus sais ou derivados.

[0254]Os exemplos de herbicidas B, que podem ser utilizados em combinação com os herbicidas inibidores de PPO, de acordo com a presente invenção são os seguintes:

(b1) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de lipídeo:

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167/266

- os herbicidas ACC tais como o aloxidim, aloxidim-sódio, butroxidim, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargila, cicloxidim, cihalofop, cialofop-butila, diclofop, diclofop-metila, fenoxaprop, fenoxaprop-etila, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etila, fluazifop, fluazifop-butila, fluazifop-P, fluazifop-P-butila, haloxifop, haloxifop-metila, haloxifop-P, haloxipop-P-metila, metamifop, pinoxadeno, profoxidim, propaquizafop, quizalofop, quizalofop-etila, quizalofop-tefurila, quizalofop-P, quizalofop-P-etila, quizalofop-P-tefurila, setoxidim, tepraloxidim, tralcóxidim;

-4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-72-6); 4-(2',4'-dicloro-4ciclopropil[ 1,1 '-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-45-3); 4-(4’-cloro-4-etil-2’-fluoro[1,1 ’-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1033757-93-5); 4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,1 bifenil]-3-il)-2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3,5-(4H, 6H)-diona (CAS 1312340-84-3); 5-(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6tetrametil-2/-/-piran-3-ona (CAS 1312337-48-6); 5-(acetiloxi)-4-(2',4'-dicloro-4ciclopropil-[1,1’-bifenil]-3-ll)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3-ona; 5(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil2/-/-piran-3-ona (CAS 1312340-82-1); 5-(acetiloxi)-4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,Tbifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametiI-2H-p\ran-3-ona (CAS 1033760-55-2); éster de metila de ácido carbônico 4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-

3- il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il (CAS 1312337-51-1); éster de metila de ácido carbônico 4-(2’,4’-dicloro-4-ciclopropil-[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il; éster de metila de ácido carbônico

4- (4'-cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/piran-3-il (CAS 1312340-83-2); éster de metila de ácido carbônico 4-(2',4'dicloro-4-etil[1,1 '-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il (CAS 1033760-58-5); e herbicidas não ACC, tais como o benfuresato, butilato,

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168/266 cicloato, dalapon, dimepiperato, EPTC, esprocarb, etofumesato, flupropanato, molinato, orbencarb, pebulato, prosulfocarb, TCA, tiobencarb, tiocarbazil, trialato e vernolato;

(b2) a partir do grupo dos inibidores de ALS:

as ureias de sulfonila tais como a amidossulfurona, azimssulfurona, benssulfurona, benssulfuron-metila, clorimurona, clorimuron etila, clorssulfurona, cinossulfurona, ciclossulfamurona, etametssulfurona, etametssulfuron-metila, etoxissulfurona, flazassulfurona, flucetossulfurona, flupirssulfurona, flupirssulfuron-metilssódio, foramssulfurona, halossulfurona, halossulfuron-metila, imazossulfurona, iodossulfurona, iodossulfuronmetilssódio, iofenssulfurona, iofensulfuron-sódio, mesossulfurona, metazossulfurona, metssulfurona, metsulfuron-metila, nicossulfurona, ortossulfamurona, oxassulfurona, primissulfurona, primissulfuron-metila, proipirissulfurona, prossulfurona, pirazossulfurona, pirazossulfuron-etila, rimssulfurona, sulfometurona, sulfometuron-metila, sulfossulfurona, tifenssulfurona, tifenssulfuron-metila, triassulfurona, tribenurona, tribenuronmetila, trifloxissulfurona, triflussulfurona, triflussulfuron-metila e tritossulfurona,

- as imidazolinonas tais como o imazametabenz, imazametabenzmetila, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina e imazetapir, os herbicidas de triazolopirimidina e sulfonanilidas tais como o cloransulam, cloransulam-metila, di-closulam, flumetsulam, florasulam, metosulam, penoxisulam, pirimissulfano e piroxsulam;

- os pirimidinilbenzoatos tais como o bispiribac, bispiribac-sódio, piribenzoxim, piriftalid, piriminobac, piriminobac-metila, piritiobac, piritiobacsódio, éster do ácido-1 -metiletila 4-[[[2-[(4,6-dimetoxi-2pirimidinil)oxi]fenil]metil]amino]-benzóico (CAS 420138-41 -6), éster de propila do ácido 4-[[[2-[(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)oxi]fenil]metil]amino]benzóico (CAS 420138-40-5), N-(4-bromofenil)-2-[(4,6-dimetoxi-2Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 375/498

169/266 pirimidinil)oxi]benzenometanamina (CAS 420138-01-8)

- os herbicidas de sulfonilaminocarbonil-triazolinona tais como a flucarbazona, flucarbazon-sódio, propoxicarbazona, propoxicarbazon-sódio, tiencarbazona e tiencarbazon-metila e triafamona;

- entre estas, uma realização de preferência da presente invenção se refere a essas composições que compreendem, pelo menos um herbicida de imidazolinona;

(b3) do grupo dos inibidores da fotografiassíntese:

- a amicarbazona, inibidores do fotografiassistema II, por exemplo, os herbicidas de triazina, incluindo a clorotriazina, triazinonas, triazindionas, metiltiotriazinas e piridazinonas tais como a ametrina, atrazina, cloridazona, cianazina, desmetrina, dimetametrina, hexazinona, metribuzina, prometona, prometrina, propazina, simazina, simetrina, terbumeton, terbutilazina, terbutrina e trietazina, ureia de arila tais como clorobromurona, clortolurona, cloroxurona, dimefurona, diurona, fluometurona, isoproturona, isourona, linurona, metamitrona, metabenztiazurona, metobenzurona, metoxurona, monolinurona, neburona, sidurona, tebutiurona e tiadiazurona, os carbamatos de fenila tais como o desmedifam, carbutilat, fenemedifam e fenmedifam-etila, os herbicidas de nitrila tais como o bromofenoxim, bromoxinila e os seus sais e ésteres, ioxinila e os seus sais e ésteres, os uracilas tais como o bromacil, lenacil e terbacil, e bentazona e bentazona de sódio, piridato, piridafol, pentanoclor e propanila e os inibidores do fotografiassistema I, tais como o diquat, diquat-dibrometo, paraquat, paraquat-dicloreto e paraquat-dimetilssulfato. Entre estas, uma realização de preferência da presente invenção se refere àquelas composições que compreendem, pelo menos um herbicida de ureia de arila. Entre estas, também uma realização de preferência da presente invenção se refere àquelas composições que compreendem, pelo menos um herbicida de triazina. Entre estas, também uma realização de preferência da presente invenção se refere

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170/266 àquelas composições que compreendem, pelo menos um herbicida de nitrila;

(b4) a partir do grupo dos inibidores da oxidase protoporfirinogenioIX:

- o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, azafenidina, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacila, carfentrazona, carfentrazon-etila, clometoxifeno, cinidon-etila, fluazolato, flufenpir, flufenpir-etila, flumiclorac, flumiclorac-pentila, flumioxazina, oxifluorfeno, fluoroglicofen-etila, flutiaceto, flutiaceto-metila, fomesafeno, halosafeno, lactofeno, oxadiargila, oxadiazona, oxadiazona, oxifluorfeno, pentoxazona, profluazol, piraclonila, piraflufeno, piraflufen-etila, saflufenacil, sulfentrazona, aclonifena, tiafenacila, [3-[2-cloro-4fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), N-etil-3-(2,6-dicloro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9), Ntetraidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 -carboxamida (CAS 452099-05-7), Ntetraidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 carboxamida (CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimeti l-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), 2-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7tetraidroisoindol-1,3-diona, 1 -metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)- 7 /-/-pi ri m idi n-2,4-diona de 1 metila (CAS 1304113-05-0), (E)-4-[2-cloro-5-[4-cloro-5-(difluorometóxi)-//-/metil-pirazol-3-il]-4-fluoro-fenoxi]-3-metoxi-but-2-enoato de metila (CAS 94889300-3) e 3-[7-cloro-5-fluoro-2-(trifluorometil)- //-/-benzimidazol-4-il]-1 -metil-6(trifluorometil)-7/-/-pirimidin-2,4-diona (CAS 212754-02-4);

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 377/498

171/266 (b5) a partir do grupo dos herbicidas branqueadores:

- os inibidores de PDS: a beflubutamida, diflufenicana, fluridona, flurocloridona, flurtamona, norflurazona, picolinafeno, e 4-(3-trifluorometilfenoxi)2-(4-trifluorometilfenil)pirimidina (CAS 180608-33-7), os inibidores de HPPD: benzobiciclona, benzofenap, clomazona, isoxaflutol, mesotriona, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifeno, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona e biciclopirona, branqueadores, alvo desconhecido: o aclonifen, amitrol e flumeturona;

(b6) a partir do grupo dos inibidores da sintase de EPSP:

- o glifosato, glifosato de isopropilamônio, gliposato de potássio e glifosato de trimésio (sulfosato);

(b7) a partir do grupo dos inibidores da glutamina sintetase:

- os bilanafós (bialafós), bilanafós de sódio, glufosinato, glufosinato-P e glufosinato de amônio;

(b8) a partir do grupo dos inibidores da sintase de DHP:

- o asulam;

(b9) a partir do grupo dos inibidores de mitose:

- os compostos do grupo K1: as dinitroanilinas, tais como a benfluralina, butralina, dinitramina, etalfluralina, flucloralina, orizalina, pendimetalina, prodiamina e trifluralina, os fosforamidatos, tais como os amiprofos, amiprofos-metila, e butamifos, os herbicidas de ácido benzóico tais como o clortal, clortal-dimetila, as piridinas tais como o ditiopir e tiazopir, as benzamidas, tais como a propizamida e tebutam; os compostos do grupo K2: a clorprofame, profame e carbetamida; entre estes, os compostos de grupo K1, em especial, as dinitroanilinas são de preferência;

(b10) a partir do grupo dos inibidores de VLCFA:

- as cloroacetamidas como o acetoclor, alaclor, butaclor, dimetacloro, dimetenamida, dimetenamida-P, metazacloro, metolacloro,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 378/498

172/266 metolaclor-S, petoxamida, pretilaclor, propacloro, propisocloro e tenilcloro, as oxiacetanilidas como o flufenaceto e mefenacet, as acetanilidas como a difenamida, naproanilida e napropamida, as tetrazolinonas tais como a fentrazamida, e outros herbicidas, tais como os anilofos, cafenstrol, fenoxassulfona, ipfencarbazona, piperofos, piroxassulfona e os compostos de isoxazolina de Fórmulas 11.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 e II.9

II.3 II.4

II.5

H,C

H₃C

- os compostos de isoxazolina de Fórmula (l)l que são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, a partir das publicações WO 2006/024820, WO 2006/037945, WO 2007/071900 e WO 2007/096576;

- entre os inibidores de VLCFA, é dada preferência às cloroacetamidas e oxiacetamidas;

(b11) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de celulose:

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 379/498

173/266

- a clortiamida, diclobenila, flupoxam, indaziflam, triaziflam, isoxabeno, e 1 -cicloexil-5-pentafluorfeniloxi-1⁴-[1,2,4,6]tiatriazin-3-ilamina;

(b12) a partir do grupo dos herbicidas desacopladores:

- o dinoseb, dinoterb e DNOC e seus sais;

(b13) a partir do grupo dos herbicidas de auxina:

- 2,4-D e seus sais e ésteres tais como o clacifos, 2,4-DB e os seus sais e ésteres, aminociclopiraclor e os seus sais e ésteres, aminopiralid e os seus sais, tais como a aminopiralid, tris(2-hidroxipropil)amônio e os seus ésteres, benazolina, benazolin-etila, clorambeno e os seus sais e ésteres, clomeprop, clopiralid e os seus sais e ésteres, dicamba e os seus sais e ésteres, diclorprop e seus sais e ésteres, diclorprop-P e seus sais e ésteres, fluroxipir, fluroxipirbutometil, fluroxipir-meptil, halauxifeno e seus sais e ésteres (CAS 943832-608); MCPA e seus sais e ésteres, MCPA-tioetila, MCPB e seus sais e ésteres, mecoprop e seus sais e ésteres, mecoprop-P e seus sais e ésteres, picloram e seus sais e ésteres, quinclorac, quinmerac, TBA (2,3,6) e seus sais e ésteres; triclopir e seus sais e ésteres;

(b14) a partir do grupo dos inibidores do transporte da auxina: o diflufenzopir, diflufenzopir-sódio, naptalam e naptalam-sódio; e (b15) a partir do grupo dos outros herbicidas: bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metila, cinmetilina, cumilurona, ciclopirimorato (CAS 499223-49-3 e seus sais e ésteres, dalapon, dazomet, difenzoquato, difenzoquat-metilsulfato, dimetipina, DSMA, dimrona, endotal e os seus sais, etobenzanid, flamprop, flamprop-isopropila, flamprop-metila, flamprop-Misopropila, flamprop-M-metila, flurenol, flurenol-butila, flurprimidol, fosamina, fosamin-amônio, indanofano, indaziflam, hidrazida maleica, mefluidida, metam, metiozolina (CAS 403640-27-7), azida de metila, brometo de metila, dimrona de metila, iodeto de metila, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargônico, piributicarb, quinoclamina, triaziflam e tridifano.

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 380/498

174/266 [0255]Os herbicidas B, de preferência, que podem ser utilizados em combinação com os herbicidas inibidores de PPO, de acordo com a presente invenção são:

(b1) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de lipídeo:

- o cletodim, clodinafop-propargila, cicloxidim, cialofop-butila, diclofop-metila, fenoxaprop-P-etila, fluazifop-P-butila, haloxifop-P-metila, metamifop, pinoxadeno, profoxidim, propaquizafop, quizalofop-P-etila, quizalofop-P-tefurila, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, 4-(4'-cloro-4ciclopropil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3(6H)ona (CAS 1312337-72-6); 4-(2',4'-dicloro-4-ciclopropil[1,1'-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-

2.2.6.6- tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-45-3); 4-(4'-cloro-4-etil-2'fluoro[1 ,T-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1033757-93-5); 4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,1 '-bifenil]-3-il)-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran3,5-(4H, 6H)-diona (CAS 1312340-84-3); 5-(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil -2/-/-piran-3-ona (CAS 1312337-48-6); 5-(aceti loxi)-4-(2',4'-dicloro-4-ciclopropi l-[ 1,1 ’-bifen i l]-3-i l)-3,6diidro-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3-ona; 5-(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-etil-2'fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil -2/-/-piran-3-ona (CAS 1312340-82-1); 5-(acetiloxi)-4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,1 ’-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-

2.2.6.6- tetrametil-2/-/-piran-3-ona (CAS 1033760-55-2); éster de metila de ácido carbônico 4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il (CAS 1312337-51-1); éster de metila de ácido carbônico 4-(2’,4’-dicloro-4-ciclopropil-[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il; éster de metila de ácido carbônico 4-(4'-cloro-4etil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il (CAS 1312340-83-2); éster de metila de ácido carbônico 4-(2',4'-dicloro-4-[1,Tbifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-iI (CAS 1033760-585); benfuresato, dimepiperato, EPTC, esprocarb, etofumesato, molinato,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 381/498

175/266 orbencarb, prosulfocarb, tiobencarb e trialato;

(b2) a partir do grupo dos inibidores de ALS:

a amidossulfurona, azimssulfurona, bensulfuron-metila, bispiribac-sódio, clorimuron-etila, clorsulfurona, cloransulam-metila, ciclosulfamurona, diclosulam, etametsulfuron-metila, etoxissulfurona, flazassulfurona, florasulam, flucarbazon-sódio, flucetossulfurona, flumetsulam, flupirsulfuron-metilssódio, foramsulfurona, halossulfuron-metila, imazametabenzo-metila, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazossulfurona, iodossulfurona, iodossulfurona-metilssódio, iofenssulfurona, iofenssulfurona de sódio, mesossulfurona, metazossulfurona, metosulam, metsulfuron-metila, nicossulfurona, ortossulfamurona, oxassulfurona, penoxsulam, primissulfuron-metila, propoxicarbazon-sódio, propirissulfurona, prossulfurona, pirazossulfuron-etila, piribenzoxim, pirimissulfana, piriftalid, piriminobac-metila, piritiobac-sódio, piroxsulam, rimsulfurona, sulfometuronmetila, sulfossulfurona, tiencarbazon-metila, tifenssulfuron-metila, triassulfurona, tribenuron-metila, trifloxissulfurona, triflussulfuron-metila, tritossulfurona e triafamona;

(b3) a partir do grupo dos inibidores da fotografiassintese:

- a ametrina, amicarbazona, atrazina, bentazona, bentazon-sódio, bromoxinila e os seus sais e ésteres, cloridazona, clortolurona, cianazina, desmedifam, diquat-dibrometo, diurona, fluometurona, hexazinona, ioxinila e os seus sais e ésteres, isoproturona, lenacil, linurona, metamitrona, metabenztiazurona, metribuzina, paraquat, dicloreto de paraquat, fenemedifam, propanila, piridato, simazina, terbutrina, terbutilazina e tidiazurona;

(b4) a partir do grupo dos inibidores da oxidase protoporfirinogenioIX:

- o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, bencarbazona, benzfendizona, butafenacila, carfentrazon-etila, cinidon-etila, flufenpir-etila, flumiclorac-pentila,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 382/498

176/266 flumioxazina, fluoroglicofen-etila, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxadiazona, oxifluorfeno, pentoxazona, piraflufen-etila, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxii]acetato (CAS 353292-31-6; S-3100), Neti 1-3-(2,6- dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 -carboxamida (CAS 452098-92-9), N-tetraidrofurfuri 1-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometiIf enoxi)-5-metil- 1Hpirazol-1-carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 -carboxamida (CAS 452099-05-7), Ntetraidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 carboxamida(CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimeti l-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), 2-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7tetraidroisoindol-1,3-diona, 1 -metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-//-/-pirimidin-2,4-diona e 3-[7cloro-5-fluoro-2-(trifluorometil)-//-/-benzimidazol-4-il]-1-metil-6-(trifluorometil)//-/-pirimidin-2,4-diona (CAS 212754-02-4);

(b5) a partir do grupo dos herbicidas branqueadores:

- o aclonifeno, beflubutamida, benzobiciclona, clomazona, diflufenicana, flurocloridona, flurtamona, isoxaflutol, mesotriona, norflurazona, picolinafeno, pirassulfotol, pirazolinato, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona e biciclopirona, 4-(3-trifluorometilfenoxi)-2-(4trifluorometilfenil)pirimidina (CAS 180608-33-7), amitrol e flumeturona;

(b6) a partir do grupo dos inibidores da sintase de EPSP:

- o glifosato, glifosato de isopropilamônio, glifosato de potássio e glifosato de trimésio (sulfosato);

(b7) a partir do grupo dos inibidores da glutamina sintetase:

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 383/498

177/266

- o glufosinato, glufosinato-P, glufosinato de amônio;

(b8) a partir do grupo dos inibidores da sintase de DHP:

- o asulam;

(b9) a partir do grupo dos inibidores de mitose:

- a benfluralina, ditiopir, etalfluralina, orizalina, pendimetalina, tiazopir e trifluralina;

(b10) a partir do grupo dos inibidores de VLCFA:

- o acetocloro, alacloro, anilofos, butacloro, cafenstrol, dimetenamida, dimetenamid-P, fentrazamida, flufenaceto, mefenaceto, metazacloro, metolacloro, S-metolacloro, naproanilida, napropamida, pretilacloro, fenoxassulfona, ipfencarbazona, tenilcloro piroxassulfona e os compostos de isoxazolina de Fórmulas 11.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 e II.9, conforme mencionado acima;

(b11) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de celulose: a diclobenila, flupoxame, isoxabeno e 1-cicloexil-5-pentafluorfeniloxi-1⁴[1,2,4,6]tiatriazin-3-ilamina;

(b13) a partir do grupo dos herbicidas de auxina:

- o 2,4-D e seus sais e ésteres, aminociclopiraclor e os seus sais e ésteres, aminopiralid e os seus sais, tais como a aminopiralid, tris(2hidroxipropil)amônio e os seus ésteres, clopiralid e os seus sais e ésteres, e dicamba os seus sais e ésteres, diclorprop-P e os seus sais e ésteres, fluroxipirmeptila, halauxifeno e seus sais e ésteres (CAS 943832-60-8), MCPA e seus sais e ésteres, MCPB e seus sais e ésteres, mecoprop-P e seus sais e ésteres, picloram e seus sais e ésteres, quinclorac, quinmerac e triclopir e seus sais e ésteres;

(b14) a partir do grupo dos inibidores do transporte da auxina: diflufenzopir e diflufenzopir-sódio;

(b15) a partir do grupo dos outros herbicidas: a bromobutida,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 384/498

178/266 cinmetilina, cumilurona, ciclopirimorato (CAS 499223-49-3) e seus sais e ésteres, dalapon, difenzoquat, difenzoquat-metilsulfato, DSMA, dimona (= daimurona), flamprop, flamprop-isopropila, flamprop-metila, flamprop-Misopropila, flamprop-M-metila, indanofano, indaziflam, metam, metilbrometo, MSMA, oxaziclomefona, piributicarb, triaziflam e tridifano.

[0256]Os herbicidas B, especialmente de preferência, que podem ser utilizados em combinação com os herbicidas inibidores de PPO, de acordo com a presente invenção são:

(b1) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de lipídeo: o clodinafop-propargila, cicloxidim, cialofop-butila, fenoxaprop-P-etila, pinoxadeno, profoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, 4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1 ,Γbifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametiI-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-726); 4-(2',4'-dicloro-4-ciclopropil[1,1 '-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2/-/piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-45-3); 4-(4’-cloro-4-etil-2’-fluoro[1,1 ’-bifenil]-3-il)5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3(6H)-ona (CAS 1033757-93-5); 4-(2',4'dicloro-4-etil[1,1'-bifenil]-3-il)-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3,5-(4H,6H)-diona (CAS 1312340-84-3); 5-(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1 '-bifeniI]-

3- il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3-ona (CAS 1312337-48-6); 5- (aceti loxi)-4-(2’, 4’-dicloro-4-ciclopropi l-[ 1,1 ’-bifen i l]-3-i l)-3,6-di idro-2,2,6,6tetrametil-2/-/-piran-3-ona; 5-(acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-2/-/-piran-3-ona (CAS 1312340-82-1); 5(acetiloxi)-4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,1 '-bifenil]-3-il)-3,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-2/-/piran-3-ona (CAS 1033760-55-2); éster de metila de ácido carbônico 4-(4'-cloro-

4- ciclopropil-2'-fluoro[1,1 '-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/piran-3-il (CAS 1312337-51-1); éster de metila de ácido carbônico 4-(2’,4’dicloro-4-ciclopropil-[1,1 '-bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/piran-3-il; éster de metila de ácido carbônico 4-(4'-cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1'bifenil]-3-il)-5,6-diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-iI (CAS 1312340-83-

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 385/498

179/266

2); éster de metila de ácido carbônico 4-(2',4'-dicloro-4-etil[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6diidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2/-/-piran-3-il (CAS 1033760-58-5); esprocarb, prosulfocarb, tiobencarb e trialato;

(b2) a partir do grupo dos inibidores de ALS: a bensulfuron-metila, bispiribac-sódio, ciclossulfamurona, diclosulam, flumetsulam, flupirsulfuronmetilssódio, foramsulfurona, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazossulfurona, iodossulfurona, iodossulfurona-metilssódio, iofenssulfurona, iofenssulfurona de sódio, mesossulfurona, metazossulfurona, nicossulfurona, penoxsulam, propoxicarbazon-sódio, propirissulfurona, pirazossulfuron-etila, piroxsulam, rimsulfurona, sulfossulfurona, tiencarbazonmetila, tritossulfurona e triafamona;

(b3) a partir do grupo dos inibidores da fotografiassíntese: a ametrina, atrazina, diurona, fluometurona, hexazinona, isoproturona, linurona, metribuzina, paraquat, dicloreto de paraquat, propanila, terbutrina e terbutilazina;

(b4) a partir do grupo dos inibidores da oxidase protoporfirinogenioIX: o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -meti l-6-trif luorometil-2,4dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100 (CAS 353292-31-6; S-3100, 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4diona, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), 2-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7-tetraidroisoindol-1,3-diona, 1 -metil-6-trif luorometil3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il) -1Hpirimidin-2,4-diona de 1-metila;

(b5) a partir do grupo dos herbicidas branqueadores: a clomazona,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 386/498

180/266 diflufenicana, flurocloridona, isoxaflutol, mesotriona, picolinafeno, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona, biciclopirona, amitrol e flumeturona;

(b6) a partir do grupo dos inibidores da sintase de EPSP: o glufosinato, glifosato de isopropilamônio e glifosato de trimésio (sulfosato);

(b7) a partir do grupo dos inibidores da glutamina sintetase: glufosinato, glufosinato-P e glufosinato-amônio;

(b9) a partir do grupo dos inibidores de mitose: a pendimetalina e trifluralina;

(b10) a partir do grupo dos inibidores de VLCFA: o acetocloro, cafenstrol, dimetenamid-P, fentrazamida, flufenaceto, mefenaceto, metazacloro, metolacloro, S-metolacloro, fenoxassulfona, ipfencarbazonae piroxassulfona; de maneira similar, é dada preferência aos compostos de isoxazolina as Fórmulas 11.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 e II.9, conforme mencionado acima;

(b11) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de celulose: o isoxabeno;

(b13) a partir do grupo dos herbicidas de auxina: o 2,4-D e os seus sais e ésteres, tais como o clacifos, e o aminociclopiraclor e os seus sais e ésteres, a aminopiralid e os seus sais e ésteres, o clopiralid e os seus sais e ésteres, a dicamba e os seus sais e ésteres, fluroxipir de meptila, quinclorac e quinmerac;

(b14) a partir do grupo dos inibidores do transporte da auxina: o diflufenzopir e diflufenzopir-sódio, (b15) a partir do grupo dos outros herbicidas: dimrona (= daimurona), indanofano, indaziflam, oxaziclomefona e triaziflam.

[0257]Além disso, pode ser útil a aplicação dos herbicidas inibidores de PPO, quando utilizados em combinação com um composto B descrito acima, em combinação com os agentes de proteção. Os agentes de proteção são os compostos químicos que previnem ou reduzem os danos em

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181/266 vegetais úteis sem possuir um amplo impacto na ação herbicida de herbicidas contra os vegetais indesejados. Eles podem ser aplicados antes da semeadura (por exemplo, no tratamento das sementes, nos rebentos ou plântulas) ou na aplicação de pré-emergência ou aplicação de pós-emergência do vegetal útil.

[0258]Além disso, os agentes de proteção C, os herbicidas inibidores de PPO e/ou os herbicidas B podem ser aplicados simultaneamente ou em sucessão.

[0259]Os agentes de proteção adequados, por exemplo, são os ácidos (quinolin-8-oxi)acéticos, ácidos 1-fenil-5-haloalquil-7/-/-1,2,4-triazol-3carboxílicos, ácidos 1 -f en i l-4,5-di idro-5-alqu i I - 7 /-/-pi razol-3,5-dicarboxílicos, ácidos carboxílicos 4,5-diidro-5,5-diaril-3-isoxazol, dicloroacetamidas, alfaoximinofenilacetonitrilas, acetofenonoximas, 4,6-di-halo-2-fenilpirimidinas, amidas N-[[4-(aminocarbonil)fenil]sulfonil]-2-benzóicas, anidrido 1,8-naftálico, ácidos carboxílicos 2-halo-4-(haloalquil)-5-tiazol, fosfortiolatos e N-alquil-Ofenilcarbamatos e seus sais agricolamente aceitáveis e seus derivados agricolamente aceitáveis tais como as amidas, ésteres, e tioésteres, desde que possuam um grupo ácido.

[0260]Os exemplos de agentes de proteção C, de preferência, são o benoxacor, cloquintocet, cietrinil, ciprosulfamida, diclormida, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, mefenato, anidrido naftálico, oxabetrinila, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4azaspiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-trimetil-3(dicloroacetil)-l ,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31 4).

[0261 ]Os agentes de proteção C especialmente de preferência são o benoxacor, cloquintocet, ciprossulfamida, diclormida, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifeno, mefenepir, anidrido naftálico, oxabetrinila, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaspiro[4,5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R-29148, CAS

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52836-31-4).

[0262] Os agentes de proteção C, especialmente de preferência, são o benoxacor, cloquintocet, ciprossulfamida, diclormida, ficlorazol, fenclorim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, anidrido naftálico, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4azaspiro[4,5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-trimetil-3(dicloroacetil)-l ,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4).

[0263]Os agentes de proteção C, também de preferência, são o benoxacor, cloquintocet, ciprossulfamida, diclormida, ficlorazol, fenclorim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaspiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetiI)-1,3-oxazolidina (R29148, CAS 52836-31-4).

[0264] Os agentes de proteção C especialmente de preferência, os quais, como o componente C, são constituintes da composição, de acordo com a presente invenção, são os agentes de proteção C conforme definidos acima; em especial, os agentes de proteção de C.1 a C.12 enumerados abaixo na Tabela C:

TabelaC

	Agente de proteção C
C.1	benoxacor
C.2	cloquintocet
C.3	ciprosulfamida
C.4	diclormid
C.5	fenclorazol
C.6	fenclorim
C.7	furilazol
C.8	isoxadifeno
C.9	mefenpir
C.10	anidrido do ácido naftálico

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Agente de proteção C

C. 11 4-(d i cio roaceti I) -1 -oxa-4azaspiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3)

C.12 2,2,5-trimetil-3-(dicloro-acetil)-1,3oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4) [0265]Os herbicidas inibidores de PPO (compostos (A) e os compostos ativos B dos grupos de (b1) a (b15) e os compostos ativos C são os herbicidas e agentes de proteção conhecidos, vide, por exemplo, The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); Farm Chemicals Handbook 2000, volume 86, Meister Publishing Company, 2000; B. Hock, C. Fedtke, R.R. Schmidt, Herbizide [Herbicides], Georg Thieme Verlag, Stuttgart de 1995; W.H. Ahrens, Herbicide Handbook, 7- edição, Weed Science Society of America, 1994; e K.K. Hatzios, Herbicide Handbook, Suplemento para a 7- edição, Weed Science Society of America, 1998. A 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina [CAS No. 52836-31-4], também é referida como R-29148. O 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4azaspiro[4.5]decano [CAS No. 71526-07-3] também é referido como AD-67 e MON 4660.

[0266]A atribuição dos compostos ativos para os respectivos mecanismos de ação é com base no conhecimento atual. Se diversos mecanismos de ação se aplicam a um composto ativo, este composto apenas foi atribuído a um mecanismo de ação.

[0267]Os compostos ativos B e C que possuem um grupo carboxila podem ser empregados sob a forma do ácido, sob a forma de um seu sal agricolamente adequado, conforme mencionado acima, ou sob a forma de um derivado agricolamente aceitável nas composições, de acordo com a presente invenção.

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184/266 [0268] No caso de dicamba, os sais adequados incluem aqueles que o contraíon é um cátion agricolamente aceitável. Por exemplo, os sais adequados de dicamba são o dicamba de sódio, dicamba de potássio, dicamba de metilamônio, dicamba de dimetilamônio, dicamba de isopropilamônio, dicamba de diglicolamina, dicamba de olamina, dicamba de diolamina, trolamina de dicamba, dicamba de N,N-bis-(3-aminopropil)metilamina e dicamba de dietilenotriamina. Os exemplos de um éster adequado são o dicamba de metila e dicamba de butotila.

[0269]Os sais adequados de 2,4-D são o 2,4-D-amônio, 2,4-Ddimetilamônio, 2,4-D-dietilamônio, 2,4-D-dietanolamônio (2,4-D-diolamina), 2,4D-trietanolamônio, 2,4-D-isopropilamônio, 2,4-D-triisopropanolamônio, 2,4-Dheptilamônio, 2,4-D-dodecilamônio, 2,4-D-tetradecilamônio, 2,4-D-trietilamônio,

2.4- D-tris(2-hidroxipropil)amônio, 2,4-D-tris(isopropil)-amônio, 2,4-D-trolamina,

2.4- D-lítio, 2,4-D-sódio. Os exemplos de ésteres adequados de 2,4-D são o 2,4D-butotila, 2,4-D-2-butoxipropila, 2,4-D-3-butoxipropila, 2,4-D-butil, 2,4-D-etila,

2.4- D-etilexila, 2,4-D-isobutila, 2,4-D-isooctila, 2,4-D-isopropila, 2,4-D-meptila,

2.4- D-metila, 2,4-D-octila, 2,4-D-pentila, 2,4-D-propila, 2,4-D-tefurila e clacifos.

[0270]0s sais adequados de 2,4-DB, por exemplo, são o 2,4-DBsódio, 2,4-DB-potássio e 2,4-DB-dimetilamônio. Os ésteres adequados de 2,4DB, por exemplo, são o 2,4-DB-butila e 2,4-DB-isoctila.

[0271 ]Os sais adequados de diclorprop, por exemplo, são diclorprop-sódio, diclorprop-potássio e diclorprop-dimetilamônio. Os exemplos de ésteres de diclorprop adequados são a diclorprop-butotila e diclorpropisoctila.

[0272]Os sais e ésteres adequados de MCPA incluem a MCPAbutotila, MCPA-butila, MCPA-dimetilamônio, MCPA-diolamina, MCPA-etila, MCPA-tioetila, MCPA-2-etilexila, MCPA-isobutila, MCPA-isoctila, MCPAisopropila, MCPA-isopropilamônio, MCPA-metila, MCPA-olamina, MCPA

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185/266 potássio, MCPA-sódio e MCPA-trolamina.

[0273] Um sal adequado de MCPB é o MCPB-sódio. Um éster adequado de MCPB é a MCPB-etila.

[0274]Os sais adequados dos clopiralid são clopiralid-potássio, clopiralid-olamina e clopiralid-tris-(2-hidroxipropil)amônio. O exemplo de ésteres adequados de clopiralid é a clopiralid-metila.

[0275]Os exemplos de um éster adequado de fluroxipir são a fluroxipir-meptila e fluroxipir-2-butoxi-1 -metiletila, em que, de preferência, é a fluroxipir-meptila.

[0276] Os sais adequados de picloram são o picloramdimetilamônio, picloram-potássio, picloram-triisopropanolamônio, picloramtriisopropilamônio e picloram-trolamina. Um éster adequado de picloram é a picloram-isoctila.

[0277] Um sal adequado de triclopir é o triclopir-trietilamônio. Os ésteres adequados de triclopir, por exemplo, são a triclopir-etila e triclopirbutotila.

[0278]Os sais e ésteres adequados de clorambeno incluem o cloramben-amônio, cloramben-diolamina, cloramben-metila, clorambenmetilamônio e cloramben-sódio. Os sais e os ésteres de 2,3,6-TBA adequados incluem o 2,3,6-TBA-dimetilamônio, 2,3,6-TBA-lítio, 2,3,6-TBA-potássio e 2,3,6TBA-sódio.

[0279]Os sais e ésteres adequados de aminopiralid incluem o aminopiralid-potássio, aminopiralid-dimetilamônio, e aminopiralid-tris(2hidroxipropil)amônio.

[0280]0s sais adequados de glifosato, por exemplo, são o glifosato de amônio, glifosato de diamônio, glifosato de dimetilamônio, glifosato de isopropilamônio, glifosato de potássio, glifosato de sódio, glifosato de trimésio, bem como os sais de etanolamina e dietanolamina, de preferência, o glifosato

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186/266 de diamônio, glifosato de isopropilamônio e glifosato de trimésio (sulfosato).

[0281] Um sal adequado de glufosinato, por exemplo, é ο glufosinato de amônio.

[0282]Um sal adequado de glufosinato-P, por exemplo, é ο glufosinato de P-amônio.

[0283]Os sais e ésteres adequados de bromoxinila, por exemplo, são o bromoxinil-butirato, bromoxinil-heptanoato, bromoxinil-octanoato, bromoxinil-potássio e bromoxinil-sódio.

[0284]Os sais e ésteres adequados de ioxonila, por exemplo, são o ioxonil-octanoato, ioxonil-potássio e ioxonil-sódio.

[0285]Os sais e ésteres adequados de mecoprop incluem a mecoprop-butotila, mecoprop-dimetilamônio, mecoprop-diolamina, mecopropetadila, mecoprop-2-etil-hexila, mecoprop-isoctila, mecoprop-metila, mecoproppotássio, mecoprop-sódio e mecoprop-trolamina.

[0286]Os sais adequados de mecoprop-P, por exemplo, são a mecoprop-P-butotila, mecoprop-P-dimetilamônio, mecoprop-P-2-etil-hexila, mecoprop-P-isobutila, mecoprop-P-potássio e mecoprop-P-sódio.

[0287] Um sal adequado de diflufenzopir, por exemplo, é o diflufenzopir-sódio.

[0288]Um sal adequado de naptalam, por exemplo, é o naptalamsódio.

[0289]Os sais e ésteres adequados de aminociclopiraclor, por exemplo, são o aminociclopiraclor-dimetilamônio, aminociclopiraclor-metila, aminociclopiraclor-triisopropanolamônio, aminociclopiraclor-sódio e aminociclopiraclor-potássio.

[0290] Um sal adequado de quinclorac, por exemplo, é o quincloracdimetilamônio.

[0291]Um sal adequado de quinmerac, por exemplo, é o

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187/266 quinclorac-dimetilamônio.

[0292] Um sal adequado de imazamox, por exemplo, é o imazamoxamônio.

[0293]Os sais adequados de imazapic, por exemplo, são o imazapic-amônio e imazapic-isopropilamônio.

[0294]Os sais adequados de imazapir, por exemplo, são o imazapir-amônio e imazapir-isopropilamônio.

[0295] Um sal adequado de imazaquina, por exemplo, é o imazaquin-amônio.

[0296]Os sais adequados de imazetapir, por exemplo, são o imazetapir-amônio e imazetapir-isopropilamônio.

[0297] Um sal adequado de topramezona, por exemplo, é o topramezon-sódio.

[0298]As realizações de preferência da presente invenção mencionadas no presente abaixo devem ser entendidas como sendo de preferência independentemente entre si ou em combinação uma com a outra.

[0299] De acordo com uma realização de preferência da presente invenção, a composição compreende como o componente B, pelo menos um, de preferência, exatamente um herbicida B.

[0300] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, pelo menos, dois, de preferência, exatamente dois herbicidas B diferentes entre si.

[0301] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, pelo menos, três, de preferência, exatamente três herbicidas B diferentes entre si.

[0302] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende como o componente A, pelo menos um, de preferência, exatamente um herbicida inibidor de PPO, de preferência o

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188/266 acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargil, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -meti l-6-trif luorometil-2,4dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)-fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3)-oxo-4-(prop-2-inil)-

3.4- diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 125883672-4 / trifludimoxazina), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 I trifludimoxazina), e componente B, pelo menos um, de preferência, exatamente um herbicida B.

[0303] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende como o componente A, pelo menos um, de preferência exatamente um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, fluthiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargil, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -meti l-6-trif luorometil-2,4dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-

3.4- diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-iI)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 125883672-4 / trifludimoxazina), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inilo)-3,4-diidro-2/-/- benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), e pelo menos, dois, de preferência, exatamente dois herbicidas B diferentes entre si.

[0304] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende como o componente A, pelo menos um, de preferência exatamente um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila,

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189/266 flumioxazina, fluthiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargil, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1 -meti l-6-trif luorometil-2,4dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro -3-oxo-4-(prop-2-inil)-

3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 125883672-4 /trifludimoxazina), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inilo)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 I trifludimoxazina) e, pelo menos, três, de preferência exatamente três herbicidas B diferentes entre si.

[0305] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b1), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em cletodim, clodinafop-propargila, cicloxidim, cialofop-butila, fenoxaprop-P-etila, fluazifop, pinoxadeno, profoxidim, quizalofop, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, esprocarb, prosulfocarb, tiobencarb e triallato.

[0306] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de

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190/266 preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100,1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b2), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em bensulfuron-metila, bispiribac-sódio, cloransulam-metila, ciclo-sulfamurona, diclosulame, flumetsulame, flupir-sulfuron-metil-sódio, foramsulfurona, halossulfuron-metila, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquino, imazetapir, imazosulfurona, iodossulfurona, iodossulfuron-metilsódio, mesossulfuron-metila, metazosulfurona, nicossulfurona, penoxsulame, propoxicarbazona-sódio, pirazosulfuron-etila, piritiobac-sódio, piroxsulame, rimsulfurona, sulfossulfurona, tiencarbazon-metila, tifensulfuron-metila, trifloxisulfurona e tritossulfurona.

[0307] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 397/498

191/266 preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b3), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em ametrina, atrazina, bentazona, bromoxinil, diurona, fluometurona, hexazinona, isoproturona, linurona, metribuzina, paraquat, dicloreto de paraquat, prometrina, propanila, terbutrina e terbutilazina.

[0308] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b4), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em acifluorfeno, acifluorfen-sódio, azafenidina, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacila, carfentrazona, carfentrazon-etila, clomdoxifeno, cinidon-etila, fluazolato, flufenpir, flufenpir-etila, flumiclorac, flumiclorac-pentila, flumioxazina, fluoroglicofeno, fluoroglicofen-etila, flutiacet, flutiacet-metila, fomesafeno, halosafeno, lactofeno, oxadiargil, oxadiazona, oxifluorfeno, pentoxazona, profluazol, piraclonila, piraflufena, piraflufen-etila, saflufenacil, sulfentrazona, tidiazimina, tiafenacil, [3-[2-cloro-4fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 398/498

192/266

2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), N-etil-3-(2,6-dicloro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-7/-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9), N tetraidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-7/-/-pirazol-1 carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-7/-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452099-05-7), N tetraidrofenoururil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metila-7/-/-pirazol-1carboxamida (CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo [1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona, 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), 2-(2,2,7Trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7tetraidro-isoindol-1,3-diona, 1 -metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-7/-/-pirimidina-2,4-diona, (E)-4-[2cloro-5-[4-cloro-5-(difluorometoxi)-7/-/-metil-pirazol-3-il]-4-fluoro-fenoxi]-3metoxi-but-2-enoato de metila [CAS 948893-00-3], 3-[7-cloro-5-fluoro-2(trifluorometil)- 1H- benzimidazol-4-il]-1 -metil-6-(trifluorometila) -//-/-pirimidina-

2,4-diona (CAS 212754-02-4).

[0309] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 399/498

193/266

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b5), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em clomazona, diflufenicana, flurocloridona, isoxaflutol, mesotriona, picolinafena, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona, biciclopirona, amitrol e flumeturona.

[0310] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b6), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em glifosato, glifosato-isopropilamônio e glifosato-trimesio (sulfosato).

[0311] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 400/498

194/266 triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b7), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em glufosinato, glufosinato-P e glufosinato-amônio.

[0312] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100,1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2inil)-3,4-diidro-2H-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b9), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em pendimetalina e trifluralina.

[0313] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100,1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 401/498

195/266 triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina)), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b10), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em acetocloro, cafenstrol, dimetenamida-P, fentrazamida, flufenaceto, mefenaceto, metazacloro, metolacloro, S-metolacloro, fenoxasulfona e piroxasulfona. De maneira similar, é dada preferência às composições que compreendem, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto herbicida do grupo (b10), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em compostos de isoxazolina e Fórmulas 11.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 e II.9, conforme definido acima.

[0314] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 402/498

196/266 piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31 -6; S-3100,1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 I trifludimoxazina), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2inil)-3,4-diidro-2H-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b13), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em 2,4-D e seus sais e ésteres, aminociclopiracloro e seus sais e ésteres, aminopiralid e seus sais, tais como o aminopiralid-tris(2hidroxipropil)amônio e seus ésteres, clopiralid e seus sais e ésteres, dicamba e seus sais e ésteres, fluroxipir-meptila, quinclorac e quinmerac.

[0315] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila, carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b14), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em diflufenzopir e diflufenzopir-sódio.

[0316] De acordo com outra realização de preferência da presente invenção, a composição compreende, além de um herbicida inibidor de PPO, de preferência, o acifluorfeno, acifluorfen-sódio, butafenacila, cinidon-etila,

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 403/498

197/266 carfentrazon-etila, flumioxazina, flutiacet-metila, fomesafeno, lactofeno, oxadiargila, oxifluorfeno, saflufenacil, sulfentrazona, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il])-fenoxi]-2piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-dimetil-6-tioxo-3(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazin), especialmente de preferência, o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), pelo menos, um e especialmente exatamente um composto ativo herbicida do grupo (b15), em especial, selecionado a partir do grupo que consiste em dimrona (= daimurona), indanofano, indaziflam, oxaziclomefona e triaziflam.

[0317] No presente e abaixo, o termo “composições binárias” inclui as composições que compreendem um ou mais, por exemplo 1, 2 ou 3, compostos ativos do herbicida inibidor de PPO e um ou mais, por exemplo 1,2 ou 3, herbicidas B.

[0318]Nas composições binárias que compreendem, pelo menos um herbicida inibidor de PPO como o componente A e, pelo menos, um herbicida B, a proporção em peso dos compostos ativos A: B, em geral, está no intervalo a partir de 1:1.000 a 1.000:1, de preferência, no intervalo a partir de 1:500 a 500:1, em especial no intervalo a partir de 1:250 a 250:1 e especialmente de preferência, no intervalo a partir de 1:75 a 75:1.

[0319]Os herbicidas B especialmente de preferência são os herbicidas B conforme definidos acima; em especial os herbicidas de B.1 a B.229 listados abaixo na Tabela B:

Tabela B

Herbicida B

B.1 cletodim

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 404/498

198/266

	Herbicida B
B.2	clodinafop-propargila
B.3	cicloxidim
B.4	cialofop-butila
B.5	fenoxaprop-etila
B.6	fenoxaprop-P-etila
B.7	fluazifop
B.8	metamifop
B.9	pinoxadeno
B.10	profoxidim
B.11	quizalofop
B.12	setoxidim
B.13	tepraloxidim
B.14	tralkoxidim
B.15	esprocarb
B.16	etofumesato
B.17	molinato
B.18	prosulfocarb
B.19	tiobencarb
B.20	trialato
B.21	bensulfuron-metila
B.22	bispiribac-sódio
B.23	cloransulam-metila
B.24	clorsulfurona
B.25	clorimurona
B.26	ciclosulfamurona
B.27	diclosulam
B.28	florasulam

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 405/498

199/266

	Herbicida B
B.29	flumetsulam
B.30	flupirsulfuron-metil-sódio
B.31	foramsulfurona
B.32	halossulfuron-metila
B.33	imazamox
B.34	imazamox-amônio
B.35	imazapic
B.36	imazapic- amônio
B.37	imazapic-isopropilamônio
B.38	imazapir
B.39	imazapir-amônio
B.40	imazapir-isopropilamônio
B.41	imazaquin
B.42	imazaquin-amônio
B.43	imazetapir
B.44	imazetapir-amônio
B.45	imazetapir-isopropilamônio
B.46	imazossulfurona
B.47	iodosulfuron-metil-sódio
B.48	iofensulfurona
B.49	iofensulfuron-sódio
B.50	mesosulfuron-metila
B.51	metazossulfurona
B.52	metsulfuron-metila
B.53	metosulam
B.54	nicossulfurona
B.55	penoxsulam

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 406/498

200/266

	Herbicida B
B.56	propoxicarbazon-sódio
B.57	pirazosulfuron-etila
B.58	piribenzoxim
B.59	piriftalid
B.60	piritiobac-sódio
B.61	piroxsulam
B.62	propirissulfurona
B.63	rimssulfurona
B.64	sulfossulfurona
B.65	tiencarbazon-metila
B.66	tifensulfuron-metila
B.67	tribenuron-metila
B.68	trifloxisulfurona
B.69	tritosulfurona
B.70	triafamona
B.71	ametrina
B.72	atrazina
B.73	bentazona
B.74	bromoxinila
B.75	bromoxinil-octanoato
B.76	bromoxinil-heptanoato
B.77	bromoxinil-potássio
B.78	diurona
B.79	fluometurona
B.80	hexazinona
B.81	isoproturona
B.82	linurona

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 407/498

201/266

	Herbicida B
B.83	metamitrona
B.84	metribuzina
B.85	prometrina
B.86	propanila
B.87	simazina
B.88	terbutilazina
B.89	terbutrina
B.90	paraquat-diclorida
B.91	acifluorfeno
B.92	acifluorfen-sódio
B.93	azafenidina
B.94	bencarbazona
B.95	benzfendizona
B.96	bifenox
B.97	butafenacila
B.98	carfentrazona
B.99	carfentrazon-etila
B.100	clometoxifeno
B.101	cinidon-etila
B.102	fluazolato
B.103	flufenpir
B.104	flufenpir-etila
B.105	flumiclorac
B.106	flumiclorac-pentila
B.107	flumioxazina
B.108	fluoroglicofeno
B.109	fluoroglicofen-etila

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 408/498

202/266

Herbicida Β

B.110 flutiacet

B.111	flutiacet-metila
B.112	fomesafeno
B.113	halosafeno
B.114	lactofeno
B.115	oxadiargila
B.116	oxadiazona
B.117	oxifluorfeno
B.118	pentoxazona
B.119	profluazol
B.120	piraclonil
B.121	piraflufen
B.122	piraflufen-etila
B.123	saflufenacil
B.124	sulfentrazona
B.125	tidiazimin
B.126	tiafenacil
B.127	[3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31- 6)
B.128	1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2Hbenzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinano-2,4-diona (CAS 1258836- 72-4 / trifludimoxazin)

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 409/498

203/266

Herbicida Β

B.129	N-etil-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1 H-pi razol-1 carboxamida (CAS 452098-92-9)
B.130	N-tetraidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4trifluorometilfenoxi)-5-metil-1 Hpirazol-1-carboxamida (CAS 91539643-9)
B.131	N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4- trifluorometilfenoxi)-5-metil-1 Hpirazol-1-carboxamida (CAS 45209905-7)
B.132	N-tetraidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro- 4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1 Hpirazol-1-carboxamida (CAS 45210003-7)
B.133	3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4- dihidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5- dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4diona
B.134	2-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil- 3,4-dihidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il)- 4,5,6,7-tetraidro-isoindole-1,3-diona
B.135	1 -metil-6-trifluorometil-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-dihidro2H-benzo[1,4]oxazin-6-il)-1 Hpirimidine-2,4-diona
B.136	(E)-4-[2-cloro-5-[4-cloro-5-

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 410/498

204/266

	Herbicida B (difluorometoxi)-l /-/-metil-pirazol-3-il]-
B.137	4-fluoro-fenoxi]-3-metoxi-but-2enoato de metila [CAS 948893-00-3] 3-[7-cloro-5-fluoro-2-(trifluorometil)-
B.138	1 H-benzimidazol-4-il]-1 -metil-6(trifluorometil)-l H-pirimidine-2,4diona (CAS 212754-02-4) benzobiciclona
B.139	clomazona
B.140	diflufenicano
B.141	flurocloridona
B.142	isoxaflutol
B.143	mesotriona
B.144	norflurazona
B.145	picolinafeno
B.146	sulcotriona
B.147	tefuriltriona
B.148	tembotriona
B.149	topramezona
B.150	topramezon-sódio
B.151	biciclopirona
B.152	amitrol
B.153	fluometurona
B.154	glifosato
B.155	glifosato-amônio
B.156	glifosato-dimetilamônio
B.157	glifosato-isopropilamônio

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 411/498

205/266

B.158

B.159

B.160

B.161

B.162

B.163

B.164

B.165

B.166

B.167

B.168

B.169

B.170

B.171

B.172

B.173

B.174

B.175

B.176

B.177

B.178

B.179

B.180

B.181

B.182

B.183

B.184

Herbicida B glifosato-trimesio (sulfosato) glifosato-potássio glufosinate glufosinato-amônio glufosinato-P glufosinato-P-amônio pendimetalin trifluralin acetoclor butaclor cafenstrol dimetenamid-P fentrazamida flufenacet mefenacet metazaclor metolaclor S-metolaclor pretilaclor fenoxasulfona isoxabeno ipfencarbazona piroxasulfona

2,4-D

2,4-D-isobutila

2,4-D-dimetilamônio

2,4-D-N,N,N-trimetiletanolamônio

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 412/498

206/266

	Herbicida B
B.185	aminopiralid
B.186	aminopiralid-metila
B.187	aminopiralid-tris(2- hidroxipropil)amônio
B.188	clopiralid
B.189	clopiralid-metila
B.190	clopiralid-olamina
B.191	dicamba
B.192	dicamba-butotila
B.193	dicamba-diglicolamina
B.194	dicamba-dimetilamônio
B.195	dicamba-diolamina
B.196	dicamba-isopropilamônio
B.197	dicamba-potássio
B.198	dicamba-sódio
B.199	dicamba-trolamina
B.200	dicamba-N,N-bis-(3- aminopropil)metilamina
B.201	dicamba-dietilenetriamina
B.202	fluroxipir
B.203	fluroxipir-meptila
B.204	MCPA
B.205	MCPA-2-etilexila
B.206	MCPA-dimetilamônio
B.207	quinclorac
B.208	quinclorac-dimetilamônio
B.209	quinmerac

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 413/498

207/266

	Herbicida B
B.210	quinmerac-dimetilamônio
B.211	aminociclopiraclor
B.212	aminociclopiraclor-potássio
B.213	aminociclopiraclor-metila
B.214	diflufenzopir
B.215	diflufenzopir-sódio
B.216	dimrona
B.217	indanofano
B.218	indaziflam
B.219	oxaziclomefona
B.220	triaziflam
B.221	11.1
B.222	II.2
B.223	II.3
B.224	II.4
B.225	II.5
B.226	II.6
B.227	II.7
B.228	II.8
B.229	II.9

[0320] Especialmente de preferência são as composições de 1.1 a

1.229, que compreendem o acifluorfeno e a(s) substância(s), conforme definido na respectiva linha da Tabela B-1.

Tabela B-1

Composições de 1.1 a 1.229

N. do Composto Herbicida B

1.1 B.1

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 414/498

208/266

N. do Composto	Herbicida B
1.2	B.2
1.3	B.3
1.4	B.4
1.5	B.5
1.6	B.6
1.7	B.7
1.8	B.8
1.9	B.9
1.10	B.10
1.11	B.11
1.12	B.12
1.13	B.13
1.14	B.14
1.15	B.15
1.16	B.16
1.17	B.17
1.18	B.18
1.19	B.19
1.20	B.20
1.21	B.21
1.22	B.22
1.23	B.23
1.24	B.24
1.25	B.25
1.26	B.26
1.27	B.27
1.28	B.28

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 415/498

209/266

N. do Composto	Herbicida B
1.29	B.29
1.30	B.30
1.31	B.31
1.32	B.32
1.33	B.33
1.34	B.34
1.35	B.35
1.36	B.36
1.37	B.37
1.38	B.38
1.39	B.39
1.40	B.40
1.41	B.41
1.42	B.42
1.43	B.43
1.44	B.44
1.45	B.45
1.46	B.46
1.47	B.47
1.48	B.48
1.49	B.49
1.50	B.50
1.51	B.51
1.52	B.52
1.53	B.53
1.54	B.54
1.55	B.55

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 416/498

210/266

N. do Composto	Herbicida B
1.56	B.56
1.57	B.57
1.58	B.58.
1.59	B.59
1.60	B.60
1.61	B.61
1.62	B.62
1.63	B.63
1.64	B.64
1.65	B.65
1.66	B.66
1.67	B.67
1.68	B.68
1.69	B.69
1.70	B.70
1.71	B.71
1.72	B.72
1.73	B.73
1.74	B.74
1.75	B.75
1.76	B.76
1.77	B.77
1.78	B.78
1.79	B.79
1.80	B.80
1.81	B.81
1.82	B.82

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 417/498

211/266

N. do Composto	Herbicida B
1.83	B.83
1.84	B.84
1.85	B.85
1.86	B.86
1.87	B.87
1.88	B.88
1.89	B.89
1.90	B.90
1.91	B.91
1.92	B.92
1.93	B.93
1.94	B.94
1.95	B.95
1.96	B.96
1.97	B.97
1.98	B.98
1.99	B.99
1.100	B.100
1.101	B.101
1.102	B.102
1.103	B.103
1.104	B.104
1.105	B.105
1.106	B.106
1.107	B.107
1.108	B.108
1.109	B.109

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 418/498

212/266

N. do Composto	Herbicida B
1.110	B.110
1.111	B.111
1.112	B.112
1.113	B.113
1.114	B.114
1.115	B.115
1.116	B.116
1.117	B.117
1.118	B.118
1.119	B.119
1.120	B.120
1.121	B.121
1.122	B.122
1.123	B.123
1.124	B.124
1.125	B.125
1.126	B.126
1.127	B.127
1.128	B.128
1.129	B.129
1.130	B.130
1.131	B.131
1.132	B.132
1.133	B.133
1.134	B.134
1.135	B.135
1.136	B.136

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 419/498

213/266

N. do Composto	Herbicida B
1.137	B.137
1.138	B.138
1.139	B.139
1.140	B.140
1.141	B.141
1.142	B.142
1.143	B.143
1.144	B.144
1.145	B.145
1.146	B.146
1.147	B.147
1.148	B.148
1.149	B.149
1.150	B.150
1.151	B.151
1.152	B.152
1.153	B.153
1.154	B.154
1.155	B.155
1.156	B.156
1.157	B.157
1.158	B.158
1.159	B.159
1.160	B.160
1.161	B.161
1.162	B.162
1.163	B.163

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 420/498

214/266

N. do Composto	Herbicida B
1.164	B.164
1.165	B.165
1.166	B.166
1.167	B.167
1.168	B.168
1.169	B.169
1.170	B.170
1.171	B.171
1.172	B.172
1.173	B.173
1.174	B.174
1.175	B.175
1.176	B.176
1.177	B.177
1.178	B.178
1.179	B.179
1.180	B.180
1.181	B.181
1.182	B.182
1.183	B.183
1.184	B.184
1.185	B.185
1.186	B.186
1.187	B.187
1.188	B.188
1.189	B.189
1.190	B.190

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 421/498

215/266

N. do Composto	Herbicida B
1.191	B.191
1.192	B.192
1.193	B.193
1.194	B.194
1.195	B.195
1.196	B.196
1.197	B.197
1.198	B.198
1.199	B.199
1.200	B.200
1.201	B.201
1.202	B.202
1.203	B.203
1.204	B.204
1.205	B.205
1.206	B.206
1.207	B.207
1.208	B.208
1.209	B.209
1.210	B.210
1.211	B.211
1.212	B.212
1.213	B.213
1.214	B.214
1.215	B.215
1.216	B.216
1.217	B.217

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 422/498

216/266

N. do Composto	Herbicida B
1.218	B.218
1.219	B.219
1.220	B.220
1.221	B.221
1.222	B.222
1.223	B.223
1.224	B.224
1.225	B.225
1.226	B.226
1.227	B.227
1.228	B.228
1.229	B.229

[0321]Também especialmente de preferência são as composições de 2.1. a 2.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o acifluorfen-sódio.

[0322]Também especialmente de preferência são as composições de 3.1. a 3.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a azafenidina.

[0323]Também especialmente de preferência são as composições de 4.1. a 4.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a bencarbazona.

[0324]Também especialmente de preferência são as composições de 5.1. a 5.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a benzfendizona.

[0325]Também especialmente de preferência são as composições de 6.1. a 6.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o bifenóx.

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 423/498

217/266 [0326]Também especialmente de preferência são as composições de 7.1. a 7.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.227, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a butafenacila.

[0327]Também especialmente de preferência são as composições de 8.1. a 8.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a carfentrazona.

[0328]Também especialmente de preferência são as composições de 9.1. a 9.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a carfentrazon-etila.

[0329]Também especialmente de preferência são as composições de 10.1. a 10.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o clometoxifeno.

[0330]Também especialmente de preferência são as composições de 11.1. a 11.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a cinidonetila.

[0331]Também especialmente de preferência são as composições de 12.1. a 12.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o fluazolato.

[0332]Também especialmente de preferência são as composições de 13.1. a 13.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o flufenpir.

[0333]Também especialmente de preferência são as composições de 14.1. a 14.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a flufenpiretila.

[0334]Também especialmente de preferência são as composições

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 424/498

218/266 de 15.1. a 15.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o flumiclorac.

[0335]Também especialmente de preferência são as composições de 16.1. a 16.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a flumicloracpentila.

[0336]Também especialmente de preferência são as composições de 17.1. para 17.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a flumioxazina.

[0337]Também especialmente de preferência são as composições de 18.1. a 18.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o fluoroglicofeno.

[0338]Também especialmente de preferência são as composições de 19.1. a 19.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a fluoroglicofen-etila.

[0339]Também especialmente de preferência são as composições de 20.1. para 20.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o flutiaceto.

[0340]Também especialmente de preferência são as composições de 21.1. a 21.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a flutiacetometila.

[0341]Também especialmente de preferência são as composições de 22.1. a 22.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o

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219/266 fomesafeno.

[0342]Também especialmente de preferência são as composições de 23.1. a 23.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o halosafeno.

[0343]Também especialmente de preferência são as composições de 24.1. a 24.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o lactofeno.

[0344]Também especialmente de preferência são as composições de 25.1. a 25.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a oxadiargila.

[0345]Também especialmente de preferência são as composições de 26.1. a 26.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como componente A, a oxadiazona.

[0346]Também especialmente de preferência são as composições de 27.1. a 27.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o oxifluorfeno.

[0347]Também especialmente de preferência são as composições de 28.1. a 28.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a pentoxazona.

[0348]Também especialmente de preferência são as composições de 29.1. a 29.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o profluazol.

[0349]Também especialmente de preferência são as composições de 30.1. a 30.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a piraclonila.

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220/266 [0350]Também especialmente de preferência são as composições de 31.1. a 31.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o piraflufeno.

[0351]Também especialmente de preferência são as composições de 32.1. a 32.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a piraflufenetila.

[0352]Também especialmente de preferência são as composições de 33.1. a 33.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o saflufenacil.

[0353]Também especialmente de preferência são as composições de 34.1. a 34.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a sulfentrazona.

[0354]Também especialmente de preferência são as composições de 35.1. a 35.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a tidiazimina.

[0355]Também especialmente de preferência são as composições de 36.1. a 36.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a tiafenacila.

[0356]Também especialmente de preferência são as composições de 37.1. a 37.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a [3-[2-cloro-4fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-3-il)fenoxi]2-piridiloxi]acetato de etila (CAS 353292-31-6; S-3100).

[0357]Também especialmente de preferência são as composições de 38.1. a 38.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

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221/266

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2)-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-11)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina).

[0358]Também especialmente de preferência são as composições de 39.1. a 39.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a N-etil-3(2,6-dicloro-4-trifluoro-metilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9).

[0359]Também especialmente de preferência são as composições de 40.1. a 40.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a N-tetraidrofurfuril3-(2,6-dicloro-4-trif luorometi If enoxi)-5-meti I - 7 /-/-pi razol-1 -carboxamida (CAS

915396-43-9).

[0360]Também especialmente de preferência são as composições de 41.1. a 41.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a N-etil-3(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometil-fenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1-carboxamida (CAS 452099-05-7).

[0361]Também especialmente de preferência são as composições de 42.1. a 42.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a N-tetraidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-//-/-pirazol-1 carboxamida (CAS 452100-03-7).

[0362]Também especialmente de preferência são as composições de 43.1. a 43.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a 3-[7-fluoro3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo[1,3,5]triazinan-2,4-diona.

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222/266 [0363]Também especialmente de preferência são as composições de 44.1. a 44.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, o (E)-4-[2-cloro-5[4-cloro-5-(difluorometoxi)-7/-/-metil-pirazol-3-il]-4-fluoro-fenoxi]-3-metoxi-but-2enoato (CAS 948893-00-3).

[0364]Também especialmente de preferência são as composições de 45.1. a 45.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a 3-[7-cloro5-fluoro-2-(trifluorometil) - 7/-/-benzimidazol-4-il]-1 -metil-6-(trifluorometil)- 1Hpirimidina-2,4-diona (CAS 212754-02 -4).

[0365]Também especialmente de preferência são as composições de 46.1. a 46.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a 2-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7tetraidro-isoi ndol-1,3-diona.

[0366]Também especialmente de preferência são as composições de 47.1. a 47.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem como o componente A, a 1 -metil-6trifluoro-metil-3-(2,2,7-tri-fluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-diidro-2/-/-benzo [1,4]oxazina-6-il)-7/-/-pirimidina-2,4-diona.

[0367]Também especialmente de preferência são as composições de 48.1. a 48.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o benoxacor como o agente de proteção C.

[0368]Também especialmente de preferência são as composições de 49.1. a 49.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o cloquintocet como o agente de proteção C.

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223/266 [0369]Também especialmente de preferência são as composições de 50.1. a 50.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, a ciprossulfamida como o agente de proteção C.

[0370]Também especialmente de preferência são as composições de 51.1. a 51.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, a diclormida como o agente de proteção C.

[0371]Também especialmente de preferência são as composições de 52.1. a 52.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o fenclorazol como o agente de proteção C.

[0372]Também especialmente de preferência são as composições de 53.1. a 53.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o fenclorim como o agente de proteção C.

[0373]Também especialmente de preferência são as composições de 54.1. a 54.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o furilazol como o agente de proteção C.

[0374]Também especialmente de preferência são as composições de 55.1. a 55.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o isoxadifeno como o agente de proteção C.

[0375]Também especialmente de preferência são as composições de 56.1. a 56.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o mefenpir como o agente de proteção C.

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224/266 [0376]Também especialmente de preferência são as composições de 57.1. a 57.229, que diferem das composições correspondentes de 1.1 a

1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, o 4(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaspiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) como o agente de proteção C.

[0377]Também especialmente de preferência são as composições de 58.1. a 58.229 que diferem das composições correspondentes de 1.1 a 1.229, apenas pelo fato de compreenderem de maneira adicional, a 2,2,5-trimetil-3(dicloroacetil)-l ,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4) como o agente de proteção C.

[0378] Em geral, de preferência, é utilizar os compostos da presente invenção em combinação com os herbicidas que são seletivos para a cultura a ser tratada e que complementam o espectro de ervas daninhas controladas por estes compostos à taxa de aplicação utilizada. Ainda em geral é de preferência aplicar os compostos da presente invenção e outros herbicidas complementares ao mesmo tempo, seja como uma formulação de combinação ou como uma mistura de tanque.

[0379] Em outra realização, a presente invenção se refere a um método para a identificação de um herbicida através da utilização de uma PPO mutada codificada por um ácido nucléico que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125., 126, 127, 128 ou 130, ou uma sua variante ou derivado.

[0380] Dito método compreende as etapas:

(a) da geração de uma célula ou vegetal transgênico que compreende um ácido nucléico que codifica uma PPO mutada, em que a PPO mutada é expressa;

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225/266 (c) da determinação do crescimento ou da viabilidade da célula ou vegetal transgênico e da célula ou vegetal de controle após a aplicação de dito herbicida; e (d) da seleção de “herbicidas” que conferem o crescimento reduzido à célula ou vegetal de controle, em comparação com o crescimento da célula ou vegetal transgênico.

[0381]Conforme descrito acima, a presente invenção descreve as composições e métodos para aumentar a tolerância de um vegetal ou semente de cultura em comparação com uma variedade do tipo selvagem do vegetal ou semente. Em uma realização de preferência, a tolerância de um vegetal ou semente de cultura é aumentada de tal maneira que o vegetal ou semente pode suportar uma aplicação de herbicida de preferência de cerca de 1 a 1.000 g ai ha¹, de maior preferência, de 1 a 200 g ai ha¹, de maior preferência ainda, de 5 a 150 g ia ha^-1 e, aindade maior preferência, de 10 a 100 g ai ha^-1. Conforme utilizado no presente, “suportar” uma aplicação de herbicida significa que o vegetal não é morto ou apenas moderadamente lesado por tal aplicação. Será entendido pelo técnico no assunto que as taxas de aplicação podem variar, dependendo das condições ambientais, tais como a temperatura ou umidade, e dependendo do tipo selecionado a partir de herbicida (ingrediente ativo ai).

[0382]Os métodos de controle de ervas daninhas pós-emergentes úteis em diversas realizações no presente utilizam as taxas de aplicação de> 0,3 x de herbicidas; em algumas realizações, isto pode ser, por exemplo, > 0,3 x,> 0,4 x,> 0,5 x,> 0,6 x,> 0,7 x,> 0,8 x,> 0,9 x ou> I x de herbicidas. Em uma realização, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção possuem tolerância a uma aplicação pós-emergente de um herbicida em uma quantidade de cerca de 25 a cerca de 200 g ai/ha. Em algumas realizações, em que o vegetal de tolerância ao herbicida é uma dicotiledônea (por exemplo, a soja, algodão), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é em uma quantidade

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226/266 de cerca de 50 g ai/ha. Em outra realização, em que o vegetal de tolerância ao herbicida é uma monocotiledônea (por exemplo, o milho, arroz, sorgo), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é em uma quantidade de cerca de 200 g ai/ha. Em outras realizações, em que o vegetal de tolerância ao herbicida é uma Brassica (por exemplo, a canola), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é em uma quantidade de cerca de 25 g ai/ha. Em métodos de controle de ervas daninhas pós-emergentes, em algumas realizações, o método pode utilizar as taxas de aplicação de herbicidas a cerca de 7 a 10 dias após a emergência. Em outra realização, a taxa de aplicação pode exceder os I x herbicidas; Em algumas realizações, a taxa pode ser de até 4 x herbicidas, embora mais normalmente seja cerca de 2,5 x ou inferior, ou cerca de 2x ou inferior, ou cerca de 1x ou inferior.

[0383]Além disso, a presente invenção fornece os métodos que envolvem a utilização de, pelo menos, um herbicida, opcionalmente em combinação com um ou mais compostos herbicidas B, e, opcionalmente, um agente de proteção C, conforme descrito em detalhes acima.

[0384] Nestes métodos, o herbicida pode ser aplicado através de qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não limitado ao tratamento de sementes, tratamento do solo e tratamento foliar. Antes da aplicação, o herbicida pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo, as soluções, emulsões, suspensões, poeiras, pós, pastas e grânulos. A forma de utilização depende do propósito específico pretendido; em cada caso, deve assegurar uma distribuição fina e uniforme do composto, de acordo com a presente invenção.

[0385]Ao fornecer os vegetais com a tolerância aumentada ao herbicida, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger os vegetais de ervas daninhas, de maneira a aumentar o crescimento dos vegetais e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida pode ser

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227/266 utilizado por si só para a pré-emergência, pós-emergência, pré-plantio e plantio de controle de ervas daninhas em áreas ao redor dos vegetais cultivados descritos no presente, ou uma formulação herbicida pode ser utilizada que contém outros aditivos. O herbicida também pode ser utilizado como tratamento de sementes. Os aditivos encontrados em uma formulação de herbicida incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de dispersão, agentes aderentes, agentes estabilizantes ou similares. A formulação herbicida pode ser uma preparação úmida ou seca e pode incluir, mas não está limitada aos pós escoáveis, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. As formulações herbicidas e os herbicidas podem ser aplicados de acordo com os métodos convencionais, por exemplo, através de pulverização, irrigação, polvilhamento ou similares.

[0386]As formulações adequadas estão descritas em detalhes nas publicações PCT/EP 2009/063387 e PCT/EP 2009/063386, as quais estão incorporadas no presente como referência.

[0387]Conforme descrito no presente, os ácidos nucléicos de PPO da presente invenção encontram utilização no aumento da tolerância aos herbicidas dos vegetais que compreendem, nos seus genomas, um gene que codifica uma proteína de PPO mutante de tolerância ao herbicida. Tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene, conforme descrito acima. De maneira adicional, em determinadas realizações, os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeos de interesse de maneira a criar os vegetais com um fenótipo desejado. Por exemplo, os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos codificando os polipeptideos que possuem a atividade pesticida e/ou inseticida, tais como, por exemplo, as proteínas da toxina Bacillus thuringiensis (descritas nas patentes US 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514, 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:

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109), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), glifosato acetiltransferase (GAT), citocromo P450 monoxigenase, fosfinotricina acetiltransferase (PAT), aceto-hidroxiacido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), fitoeno desaturase (PD), protoporfirinogênio oxidase (PPO) e enzimas de degradação de dicamba conforme descrito na publicação WO 2002/068607, ou ácido fenoxiacético e enzimas de degradação derivada de ácido fenoxipropiônico, conforme descrito nas publicações WO 2008/141154 ou WO 2005/107437. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

[0388]Consequentemente, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção podem ser utilizados em conjunto com um herbicida ao qual são tolerantes. Os herbicidas podem ser aplicados aos vegetais da presente invenção utilizando quaisquer técnicas conhecidas dos técnicos no assunto. Os herbicidas podem ser aplicados em qualquer ponto do processo de cultivo do vegetal. Por exemplo, os herbicidas podem ser aplicados no pré-plantio, plantio, pré-emergência, pós-emergência ou combinações dos mesmos. Os herbicidas podem ser aplicados às sementes e secados para formar uma camada sobre as sementes.

[0389] Em algumas realizações, as sementes são tratadas com um agente de proteção, seguido por uma aplicação pós-emergente de um herbicida. Em uma realização, a aplicação pós-emergente dos herbicidas é de cerca de 7 a 10 dias após o plantio de sementes tratadas com o agente de proteção. Em algumas realizações, o protetor é cloquintoceto, diclormida, fluxofenim ou combinações dos mesmos.

Métodos para Controle de Ervas Daninhas ou Vegetação Indesejada [0390]Em outros aspectos, a presente invenção fornece um método para o controle de ervas daninhas em um local para o crescimento de

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229/266 um vegetal ou parte de vegetal do mesmo, o método compreende: a aplicação de uma composição que compreende um herbicida ao local.

[0391] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para o controle de ervas daninhas em um local para o crescimento de um vegetal, o método compreende: a aplicação de uma composição herbicida que compreende os herbicidas no local; em que o dito local é: (a) um local que contém: um vegetal ou uma semente capaz de produzir dito vegetal; ou (b) um local que deve ser após dita aplicação ser realizada para conter o vegetal ou a semente; em que o vegetal ou a semente compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

[0392]As composições herbicidas descritas no presente podem ser aplicadas, por exemplo, como tratamentos foliares, tratamentos de solo, tratamentos de sementes ou encharcamentos do solo. A aplicação pode ser realizada, por exemplo, através de pulverização, polvilhamento, difusão ou qualquer outra maneira conhecido útil no estado da técnica.

[0393] Em uma realização, os herbicidas podem ser utilizados para o controle do crescimento de ervas daninhas que podem ser encontradas crescendo nas proximidades dos vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção. Em realizações deste tipo, um herbicida pode ser aplicado a um terreno em que os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção estão a crescer nas proximidades de ervas daninhas. Um herbicida ao qual o vegetal de tolerância ao herbicida da presente invenção é tolerante, em seguida, pode ser aplicado ao terreno em uma concentração suficiente para matar ou inibir o crescimento da erva daninha. As concentrações de herbicida suficientes para matar ou inibir o crescimento de ervas daninhas são conhecidas

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230/266 no estado da técnica e estão descritas acima.

[0394]Em outras realizações, a presente invenção fornece um método para o controle de ervas daninhas na vizinhança de um vegetal de tolerância ao herbicida da presente invenção. O método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de herbicidas às ervas daninhas e ao vegetal auxínico tolerante ao herbicida, em que o vegetal apresenta tolerância aumentada ao herbicida auxínico quando comparado a um vegetal do tipo selvagem. Em algumas realizações, os vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção, de preferência, são os vegetais cultivados, incluindo, mas não limitados ao girassol, alfafa, Brassica sp., soja, algodão, cártamo, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, arroz, milho, sorgo, cevada, centeio, painço e sorgo.

[0395] Em outros aspectos, o(s) herbicida(s) (por exemplo, os herbicidas) também pode(m) ser utilizado(s) como tratamento de sementes. Em algumas realizações, uma concentração eficaz ou uma quantidade eficaz de herbicida(s), ou uma composição que compreende uma concentração eficaz ou uma quantidade eficaz de herbicida(s) pode ser aplicada diretamente às sementes antes ou durante a semeadura das sementes. As formulações de tratamento de sementes, de maneira adicional, podem compreender os ligantes e opcionalmente os corantes.

[0396]Os aglutinantes podem ser adicionados para aprimorar a adesão dos materiais ativos nas sementes após o tratamento. Em uma realização, os ligantes adequados são copolímeros em bloco EO / PO tensoativos mas também os polivinilalcoóis, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenamidas, polietilenoiminas (Lupasol(R), Polimina (R)), poliéteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilosina e copolímeros derivados destes polímeros. Opcionalmente, também os corantes podem ser incluídos na formulação. Os

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231/266 corantes ou colorantes adequados para as formulações de tratamento de sementes são Rhodamin B, Cl. pigmento vermelho 112, C.l. solvente vermelho 1, pigmento azul 15: 4, pigmento azul 15: 3, pigmento azul 15: 2, pigmento azul 15: 1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmento amarelo 13, pigmento vermelho 1 12, pigmento vermelho 48: 2, pigmento vermelho 48: 1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmento laranja 43, pigmento laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marrom 25, violeta básico 10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido 14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108.

[0397] O termo tratamento de sementes compreende todas as técnicas de tratamento de sementes adequadas conhecidas no estado da técnica, tais como tratamento de sementes, revestimento de sementes, polvilhação de sementes, imersão de sementes e peletização de sementes. Em uma realização, a presente invenção fornece um método de tratamento do solo pela aplicação, em especial na semeadora: ou de uma formulação granular contendo os herbicidas como uma composição / formulação (por exemplo, uma formulação granular), com opcionalmente um ou mais portadores agricolamente aceitáveis, sólidos ou líquidos e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é vantajosamente empregado, por exemplo, em canteiros de cereais, milho, algodão e girassol.

[0398]A presente invenção também compreende as sementes revestidas com ou contendo uma formulação de tratamento de sementes que compreende os herbicidas e, pelo menos, um outro herbicida tal como, por exemplo, um inibidor de AHAS selecionado a partir do grupo que consiste em amidossulfurona, azimsulfurona, bensulfurona, clorimuron, clorsulfurona, cinossulfurona, ciclosulfamuron, etametsulfurona, etoxisulfurona, flazasulfurona, flupirsulfurona, foramsulfurona, halosulfurona, imazosulfurona, iodossulfurona,

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232/266 mesosulfurona, metsulfurona, nicosulfurona, oxasulfurona, primisulfurona, prosulfurona, pirazosulfurona, rimsulfurona, sulfometuron, sulfossulfurona, tifensulfurona, triasulfurona, tribenurona, trifloxisulfurona, triflusulfurona, tritosulfurona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulame, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalide e piritiobac.

[0399]O termo “revestido com e/ou contendo”, em geral, significa que o ingrediente ativo está em sua maior parte na superfície do produto de propagação no momento da aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando dito produto de propagação é (re)plantado, pode absorver o ingrediente ativo.

[0400] Em algumas realizações, a aplicação de tratamento de sementes com os herbicidas ou com uma formulação que compreende os herbicidas é realizada pulverizando ou polvilhando as sementes antes da semeadura dos vegetais e antes da emergência dos vegetais.

[0401] Em outras realizações, no tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade eficaz de herbicidas ou uma formulação que compreende os herbicidas.

[0402]Em outros aspectos, a presente invenção fornece um método para o combate da vegetação indesejada ou controle de ervas daninhas que compreende o contato das sementes dos vegetais de tolerância aos herbicidas da presente invenção antes da semeadura e/ou após a prégerminação com os herbicidas. O método ainda pode compreender semear as sementes, por exemplo, no solo em um campo ou em um meio de envasamento em estufa. O método encontra utilização especial no combate à vegetação

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233/266 indesejada ou no controle de ervas daninhas na vizinhança imediata da semente. O controle da vegetação indesejada é entendido como a morte de ervas daninhas e/ou retardo ou inibição do crescimento normal das ervas daninhas. As ervas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como significando todos aqueles vegetais que crescem em locais em que são indesejados.

[0403]As ervas daninhas da presente invenção, por exemplo, incluem as ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepiclium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solarium, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecuruse Apera.

[0404]Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, os vegetais cultivados que estão crescendo em um local não desejado. Por exemplo, um vegetal de milho voluntário que esteja em um campo que predominantemente compreende os vegetais de soja pode ser considerado um erva daninha, se o vegetal de milho for indesejado no campo dos vegetais de soja.

[0405] Em outras realizações, no tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade eficaz de herbicidas ou uma formulação que compreende os

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234/266 herbicidas.

[0406]Ainda em outros aspectos, o tratamento de local, vegetais, partes dos vegetais ou sementes da presente invenção compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um A.l. Em uma realização, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um A.l. herbicida Em algumas realizações, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém os herbicidas A.L, em que a composição compreende um ou mais veículos, diluentes, excipientes, reguladores de crescimento dos vegetais agronomicamente aceitáveis e similares. Em outras realizações, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém os A.l. herbicidas, em que a composição compreende um adjuvante. Em uma realização, o adjuvante é um tensoativo, um espalhador, um adesivo, um agente penetrante, um agente de controle de deriva, um óleo vegetal, um emulsionante, um agente de compatibilidade ou combinações dos mesmos.

[0407]Também deve ser entendido que o anterior se refere às realizações de preferência da presente invenção e que podem ser realizadas numerosas alterações sem sair do âmbito da presente invenção. A presente invenção ainda é ilustrada pelos exemplos seguintes, que não devem ser interpretados de maneira alguma como impondo limitações ao seu âmbito. Pelo contrário, deve ser claramente entendido que o recurso pode ser tido, assim como diversas outras realizações, modificações e equivalentes dos mesmos, que, após ler a descrição no presente, podem sugerir aos técnicos no assunto sem se afastarem do espírito da presente invenção e/ou o âmbito das reivindicações anexas.

Exemplos [0408] Legenda para os inibidores de PPO referentes às

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235/266 uracilpiridinas, que podem ser utilizadas nos seguintes exemplos:

Uracilpiridina 1	2-[[3-[2-cloro-4-fluoro-5-[3-metil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]fenoxi]-2piridil]oxi]acetato de etila 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 2	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-2piridil]oxi]acetato de etila ácido 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 3	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-2piridil]oxi]acético 2-[2-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 4	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2piridil]oxi]fenoxi]acetato de etila ácido 2-[2-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 5	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2piridil]oxi]fenoxi]acético 2-[2-[[3-bromo-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 6	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2piridil]oxi]fenoxi]acetato 2-[2-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 7	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-4-fluorofenoxi]acetato de etila 2-[2-[[3,5-difluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 8	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2piridil]oxi]fenoxi]acetato de etila ácido 2-[2-[[3,5-difluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4-
Uracilpiridina 9	(trifluorometil)pirimidin-l -il]-2- piridil]oxi]fenoxi]acético

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	2-[2-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]fenoxi]-N-
Uracilpiridina 10	metilsulfonil-acetamida 2-[[3-[[3-cloro-6-[3,5-dimetil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-5-fluoro-2-piridil]oxi]-2-
Uracilpiridina 11	piridil]oxi]acetato de etila 2-[2-[[3-cloro-6-[3,5-dimetil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-5-fluoro-2-
Uracilpiridina 12	piridil]oxi]fenoxi]acetato de etila 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-2-
Uracilpiridina 13	piridil]oxi]acetato de alila prop-2-inil 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6- dioxo-4-(trifluorometil)pirimidin-1 -il]-2-piridil]oxi]-2-
Uracilpiridina 14	piridil]oxi]acetato 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-2-
Uracilpiridina 15	piridil]oxi]acetato de ciclopropilmetila 2,2-difluoroetil 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil- 2,6-dioxo-4-(trifluorometil)pirimidin-1 -il]-2-
Uracilpiridina 16	piridil]oxi]-2-piridil]oxi]acetato 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-dioxo-4- (trifluorometil)pirimidin-l -il]-2-piridil]oxi]-2-
Uracilpiridina 17	piridil]oxi]acetato de isobutila (2-etoxi-2-oxo-etil) 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3- metil-2,6-dioxo-4-(trifluorometil)pirimidin-1 -il]-2-
Uracilpiridina 18	piridil]oxi]-2-piridil]oxi]acetato
Uracilpiridina 19	2-metoxietil 2-[[3-[[3-cloro-5-fluoro-6-[3-metil-2,6-

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237/266 dioxo-4-(trifluorometil)pirimidin-1 -il]-2-piridil]oxi]-2piridil]oxi]acetato

Exemplo 1

Mutagênese de Local Direcionada de PPO [0409]Todas as sequências de codificação de ácido nucléico e todos os mutantes simples e duplos que codificam um polipeptideo que compreende a SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, ou 129, são sintetizados e clonados por Geneart (Geneart AG, Regensburg, Alemanha). Os mutantes de projeto racional são sintetizados por Bibliotecas aleatórias de genes PPO de Geneart. são sintetizados por Geneart. Os plasmídeos são isolados a partir de E. coli TOP10 realizando uma minpreparação de plasmídeo e confirmada por sequenciação de DNA.

Exemplo 2

Expressão e Purificação de PPO Mutante e Recombinante do Tipo Selvagem [0410](Retirado de: Franck E. Dayan, Pankaj R. Daga, Stephen O. Duke, Ryan M. Lee, Patrick J. Tranel, Robert J. Doerksen. Biochemical and structural consequences of a glycine deletion in the a-8 helix of protoporphyrinogen oxidase. Biochimica et Biophysica Acta 1804 (2010), 1.54856). Os clones em vetor pRSET são transformados em células BL21 (DE3)pLysS de E. coli. As células são cultivadas em 250 mL de LB com 100 pgmL-1 de carbenicilina, agitando durante a noite a 37^s C. As culturas são diluídas em 1 L de LB com o antibiótico e cultivadas a 37^s C, agitando durante 2 h, induzidas

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238/266 com 1 mM de IPTG e cultivadas a 25^s C, agitando durante 5 horas adicionais. As células são coletadas através da centrifugação a 1.600 ^x g, lavadas com o NaCI a 0,09% e armazenadas a -80^s C. As células são lisadas utilizando uma prensa francesa a 140 MPa em fosfato de sódio a 50 mM, pH 7,5, NaCI a 1 M, imidazol a 5 mM, glicerol a 5% e 1 ug mL-1 de leupeptina. Após a lise, são adicionados 0,5 U de benzonase (Novagen, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) e PMSF (concentração final de 1 mM). Os detritos celulares são removidos através da centrifugação a 3.000 ^x g. As proteínas de PPO marcadas com His são purificadas em uma coluna Hitrap Chelating HP ativada por níquel (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) equilibrada com o fosfato de sódio a 20 mM, pH 8,0, NaCI a 50 mM, imidazol a 5 mM, MgCb a 5 mM, EDTA a 0,1 mM e 17% de glicerol. A PPO é eluida com o imidazol a 250 mM. A proteina ativa é dessalinizada em uma coluna PD-10 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) equilibrada com um tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,5, MgCb a 5 mM, EDTA a 1 mM e 17% de glicerol. Cada litro de cultura forneceu cerca de 10 mg de PPO pura, que é armazenada a -20^s C até ser utilizada em análises.

Exemplo 3

Análise de Enzima de PPO (Não Recombinante) [0411]A proteína de PPO (EC 1.3.3.4) é extraída de coleóptilos ou rebentos (150 g de peso fresco) de sementes de milho negro, beladona negra, ipomeia e folhas de veludo conforme descrito anteriormente (Grossmann et al. 2010). Antes da colheita, as plântulas podem ficar verdes durante 2 horas à luz, de maneira a alcançar as atividades enzimáticas específicas mais elevadas nas frações dos tilacóides a baixas concentrações de clorofila. Em concentrações elevadas de clorofila ocorre um resfriamento rápido significativo da fluorescência, o que limita a quantidade de tilacóides verdes que podem ser utilizados no teste. Os materiais de vegetais são homogeneizados no frio com

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239/266 um misturador Braun utilizando uma proporção de peso fresco para volume de 1:4. O tampão de homogeneização consistiu em tris(hidroximetil)aminometano (Tris)-HCI (50 mM; pH 7,3), sacarose (0,5 M), cloreto de magnésio (1 mM), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (1 mM) e albumina de soro bovino (2 g L-1). Após a filtração através de quatro camadas de Miracloth, as preparações plastidial brutas são obtidas após a centrifugação a 10 000 x g durante 5 min e ressuspensão em tampão de homogeneização antes da centrifugação a 150 x g durante 2 min para remover os resíduos de células brutos. O sobrenadante é centrifugado a 4.000 xg durante 15 min e a fração do pellet é ressuspensa em 1 mL de um tampão contendo o Tris-HCI (50 mM; pH 7,3), EDTA (2 mM), leupeptina (2 pm), pepstatina (2 pm) e glicerol (200 mL L’¹) e armazenada a -80^sC até à sua utilização. A proteína é determinada no extrato de enzima com a albumina de soro bovino como padrão. A atividade de PPO é analisada fluorometricamente, monitorando a taxa de formação de protozoários a partir de protoporfirinogênio IX quimicamente reduzido, sob condições iniciais de velocidade. A mistura de análise consistiu em Tris-HCI (100 mM; pH 7,3), EDTA (1 mM), ditiotreitol (5 mM), Tween 80 (0,085%), protoporfirinogênio IX (2 pm) e 40 pg de proteína extraída em um volume total de 200 pl. A reação é iniciada através da adição do substrato protoporfirinogênio IX a 22^s C, saflufenacil, 1,5dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona fotografiassíntese como controle negativo são preparados em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) (concentração a 0,1 mM de DMSO na análise) e adicionados à mistura de análise em concentrações de 0,005 pM a 5 pM antes da incubação. A fluorescência é monitorada diretamente a partir da mistura de análise utilizando um POLARstar Optima / Galaxy (BMG) com excitação a 405 nm e emissão monitorada a 630 nm. A atividade não

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240/266 enzimática na presença de extrato inativado pelo calor é desprezível. A inibição da atividade enzimática induzida pelo herbicida é expressa como porcentagem de inibição em relação aos controlos não tratados. As concentrações molares do composto necessário para a inibição da enzima a 50% (valores de IC50) são calculadas ajustando os valores para a equação dose-resposta utilizando a análise de regressão não linear.

Exemplo 4

Análise de Enzima de PPO (Recombinante) [0412]O proto é adquirido de Sigma-Aldrich (Milwaukee, Wl). O protogênio é preparado de acordo com Jacobs e Jacobs (N. J. Jacobs, J.M. Jacobs, Assay for enzymatic protoporphyrinogen oxidation, a late step in heme synthesis, Enzyme 28 (1982) 206-219). As análises são realizadas em 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,4 com EDTA a0,1 mM, 0,1% de Tween 20, FAD a 5 mM, e imidazol a 500 mM. As curvas dose-resposta com os inibidores de PPO de saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona fotografiassíntese como controle negativo, e 0 MC-15608 são obtidos na presença de protogênio a 150 mM. As larguras de banda de excitação e emissão são definidas em 1,5 e 30 nm, respectivamente. Todas as análises são realizadas em duplicatas ou triplicates e medidas utilizando um POLARstar Optima / Galaxy (BMG) com excitação a 405 nm e emissão monitorada a 630 nm. As concentrações molares do composto necessário para a inibição da enzima a 50% (valores de IC50) são calculadas ajustando os valores para a equação dose-resposta utilizando a análise de regressão não linear. Os resultados são mostrados na Tabela x.

Tabela X

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Substituição de amino ácidos	NO. SEQ. ID	Atividade Normalizada (UF x min^-1 x ng-¹)	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
IC50 (M)	Fator de tolerância
Herbicida de PPO sensível ao PPO2 WC	1	40,00	1.86E-09	5,17E-10	1,00	1,00
Herbicida de PPO sensível ao PPO2 AC	2	32,00	1.78E-10	5.96E-11	0,10	0,12
dG210	3&4	3,20	1.60E-06	2.12E-09	860,26	4,09
R128L	1 &2	28,00	2.22E-07	7.73E-10	119,60	1,50
R128A, G211N, F420M	1 &2	0,33	1.00E-05	2,91 E-07	5376,63	562,54
G211D, F420M	1 &2	0,40	3.38E-07	1.32E-07	181,98	254,58
R128A, G211V, F420M	1 &2	0,49	1.00E-05	1,15E-07	5376,63	222,66
R128A, G211A, F420V	1 &2	0,62	1.00E-05	9,31 E-08	5376,63	180,06
R128A, G210S, F420M	1 &2	0,40	1.00E-05	6.83E-08	5376,63	132,20
G211N, F420M	1 &2	0,56	1.00E-05	3.55E-08	5376,63	68,62
R128A, S412N, F420M	1 &2	42,00	1.00E-05	2.43E-08	5376,63	46,93
Q119L, R128A,F420M	1 &2	25,83	1.00E-05	2.06E-08	5376,63	39,94
R128A, G211C, F420M	1 &2	12,49	1.00E-05	1.97E-08	5376,63	38,16
R128A, G211A, F420M	1 &2	6,53	1.00E-05	1.52E-08	5376,63	29,49
G211A, L397Q, F420M	1 &2	2,60	1.00E-05	1.09E-08	5376,63	21,13
G211C, F420V	1 &2	4,23	7.67E-06	6.28E-09	4125,38	12,14
G211A, F420V	1 &2	3,65	4.12E-06	5.46E-09	2215,82	10,57
R128V, G211V	1 &2	0,58	6.60E-06	2,91 E-09	3546,09	5,64
G210S, F420M	1 &2	2,22	1.00E-05	2.03E-09	5376,63	3,93
G210S, F420M	1 &2	2,13	1.00E-05	2.03E-09	5376,63	3,93
G211A, F420M	1 &2	35,95	2.76E-06	1,51 E-09	1481,85	2,93
G210C, F420M	1 &2	5,66	2.58E-06	1,44E-09	1385,04	2,78
R128A, G210S	1 &2	0,56	1.00E-05	1,34E-09	5376,63	2,60

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Substituição de amino ácidos	NO. SEQ. ID	Atividade Normalizada (UF x min^-1 x ng-¹)	Saflufenacil Trifludimoxazina	Saflufenacil Trifludimoxazina
IC50 (M)	Fator de tolerância
G211R	1 &2	1,20	1.13E-08	1.22E-09	6,09	2,36
G211V, F420M	1 &2	5,09	7.89E-06	1,21 E-09	4240,14	2,33
G211W	1 &2	0,76	2.68E-08	1,10E-09	14,41	2,13
M414Q, F420M	1 &2	17,20	2.80E-06	1.09E-09	1504,86	2,10
G210T	1 &2	1,24	1.06E-06	1.00E-09	567,63	1,94
Q119L, F420M	1 &2	46,86	1.20E-06	9.78E-10	644,80	1,89
G211C, F420M	1 &2	9,30	2.32E-06	8.62E-10	1246,07	1,67
F420M, d, V527	1 &2	18,89	1,19E-06	8,15E-10	638,14	1,58
G211D	1 &2	0,80	2.54E-08	7.53E-10	13,66	1,46
G211L	1 &2	0,66	4.27E-07	7.42E-10	229,47	1,44
d K528	1 &2	73,43		7.33E-10		1,42
G211P	1 &2	0,62	1,41 E-08	7,01 E-10	7,58	1,36
G211A	1 &2	16,81	3.86E-09	6.87E-10	2,08	1,33
G210S	1 &2	5,90	5.18E-08	6.39E-10	27,87	1,24
d M529	1 &2	70,49		6,31 E-10		1,22
S387Y, F420M	1 &2	9,28	9.92E-07	6.26E-10	533,18	1,21
D372E, F420M	1 &2	20,82	2.40E-06	6,21 E-10	1287,85	1,20
G211N	1 &2	6,00	7.47E-09	6.05E-10	4,02	1,17
S412N, F420M	1 &2	36,54	1,51 E-06	6,01 E-10	813,36	1,16
G211K	1 &2	6,25	2.43E-09	5,91 E-10	1,30	1,14
E436I, F420M	1 &2	33,28	3.06E-06	5.78E-10	1644,41	1,12
E436I, F420M	1 &2	33,29	3.06E-06	5.78E-10	1644,41	1,12
M343T, F420M	1 &2	25,24	2.77E-06	5.52E-10	1489,90	1,07
R128A, G211A	1 &2	11,92	3,71 E-07	5.39E-10	199,39	1,04
d K532	1 &2	76,24		5.33E-10		1,03
G211F	1 &2	0,81	1.79E-08	5.00E-10	9,64	0,97
Q447K	1 &2	21,00	8.82E-10	4.93E-10	0,47	0,95
d V527	1 &2	74,52		4.40E-10		0,85
G211I	1 &2	0,95	1.05E-08	4.35E-10	5,63	0,84
Q119L, R128A, Q323H, S412N	1 &2	86,12	2.12E-07	4.00E-10	114,19	0,77
G211V	1 &2	11,69	4.23E-09	3.99E-10	2,28	0,77
G211S	1 &2	2,86	2.58E-08	3.94E-10	13,87	0,76
G211A, L397Q	1 &2	2,33	5.63E-07	3.88E-10	302,70	0,75
d D530	1 &2	69,56		3,61 E-10		0,70
d E531	1 &2	77,64		3.52E-10		0,68
S387L	1 &2	7,38	6.78E-09	3.03E-10	3,64	0,59

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 449/498

243/266

Substituição de amino ácidos	NO. SEQ. ID	Atividade Normalizada (UF x min^-1 x ng-¹)	Saflufenacil Trifludimoxazina	Saflufenacil Trifludimoxazina
IC50 (M)	Fator de tolerância
S412T	1 &2	33,24	6.44E-10	2.89E-10	0,35	0,56
G210S, G211A	1 &2	3,25	4,36E-08	2.70E-10	23,43	0,52
G211T	1 &2	1,63	9,98E-08	2.67E-10	53,65	0,52
S387K	1 &2	11,21	6,21 E-09	2.57E-10	3,34	0,50
Q119L, Q323H, S412N, F420M	1 &2	51,44	1,41 E-06	2.55E-10	759,42	0,49
R128A, G211C	1 &2	4,28	3.57E-07	2.49E-10	191,74	0,48
d T533	1 &2	76,72		2.39E-10		0,46
d A534	1 &2	64,01		2.34E-10		0,45
S412L	1 &2	51,35	4.54E-10	2.27E-10	0,24	0,44
S412M	1 &2	78,96	4.46E-10	2.25E-10	0,24	0,43
G211M	1 &2	5,25	3,11 E-09	2.22E-10	1,67	0,43
S412V	1 &2	50,22	7.60E-10	2,16E-10	0,41	0,42
Q119L, Q323H, S412N	1 &2	52,00	8.24E-10	2.05E-10	0,44	0,40
Q323H, S412N	1 &2	58,70	4.79E-10	1.96E-10	0,26	0,38
S412Y	1 &2	43,26	5.39E-10	1,91 E-10	0,29	0,37
S412D	1 &2	70,61	5.92E-10	1.85E-10	0,32	0,36
S412P	1 &2	40,06	6.66E-10	1.82E-10	0,36	0,35
d S523	1 &2	56,26		1.73E-10		0,33
S412Q	1 &2	28,47	5.25E-10	1.72E-10	0,28	0,33
S412K	1 &2	95,26	3,10E-10	1.64E-10	0,17	0,32
M343T	1 &2	73,85	1.23E-09	1.64E-10	0,66	0,32
d l525	1 &2	58,17		1.59E-10		0,31
T451V	1 &2	72,24	1,01 E-09	1.59E-10	0,54	0,31
G211H	1 &2	1,78	2.94E-09	1.57E-10	1,58	0,30
S412A	1 &2	27,00	4.53E-10	1.53E-10	0,24	0,30
Q119L, R128A	1 &2	77,43	1.82E-07	1.52E-10	97,59	0,29
S412E	1 &2	65,94	5.92E-10	1,51 E-10	0,32	0,29
N431G	1 &2	53,81	7.68E-10	1.47E-10	0,41	0,28
E436I	1 &2	49,37	1.13E-09	1.47E-10	0,61	0,28
S412R	1 &2	30,41	6.97E-10	1.44E-10	0,38	0,28
Q446G	1 &2	71,53	7.40E-10	1.40E-10	0,40	0,27
S412I	1 &2	89,83	5,16E-10	1.40E-10	0,28	0,27
d Y526	1 &2	40,19		1.39E-10		0,27
d H524	1 &2	66,29		1.34E-10		0,26
S412H	1 &2	83,20	4.98E-10	1.33E-10	0,27	0,26
R335S	1 &2	58,65	8,02E-10	1,21 E-10	0,43	0,23

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 450/498

244/266

Substituição de amino ácidos	NO. SEQ. ID	Atividade Normalizada (UF x min^-1 x ng-¹)	Saflufenacil Trifludimoxazina	Saflufenacil Trifludimoxazina
IC50 (M)	Fator de tolerância
G210C, G211A	1 &2	2,78	5.80E-08	1,16E-10	31,16	0,22
S433P	1 &2	58,76	6.87E-10	1.14E-10	0,37	0,22
F345G	1 &2	43,65	7,17E-10	1.14E-10	0,39	0,22
d D522	1 &2	29,16		1.13E-10		0,22
D435S	1 &2	39,66	8.39E-10	1.13E-10	0,45	0,22
K428D	1 &2	65,87	6,17E-10	1,11 E-10	0,33	0,22
G210C, G211C	1 &2	1,07	4.42E-08	1,10E-10	23,75	0,21
M414Q	1 &2	42,49	1,15E-09	1.04E-10	0,62	0,20
G210C	1 &2	2,08	4.74E-08	9.93E-11	25,50	0,19
S412W	1 &2	21,68	5.82E-10	9.86E-11	0,31	0,19
S412F	1 &2	33,89	3,21 E-10	8.76E-11	0,17	0,17
T358D	1 &2	54,96	9.66E-10	8.33E-11	0,52	0,16
G210T, G211A	1 &2	0,61	3.67E-06	8.33E-11	1970,69	0,16
S464R	1 &2	49,36	5.35E-10	8,11 E-11	0,29	0,16
D372E	1 &2	46,86	1.02E-09	8.02E-11	0,55	0,16
S412G	1 &2	49,90	4,15E-10	7.95E-11	0,22	0,15
R128A, S412N	1 &2	55,34	1.89E-07	7.45E-11	101,43	0,14
R425H	1 &2	21,44	7,71 E-10	7,15E-11	0,41	0,14
R128A, G120C	1 &2	3,77	2.85E-06	7,15E-11	1532,53	0,14
G210S, G211C	1 &2	0,86	2.09E-08	6.99E-11	11,21	0,14
S412C	1 &2	19,62	2.69E-10	6.70E-11	0,14	0,13
S412N	1 &2	15,00	1,01 E-08	6.69E-11	5,43	0,13
Q119L, S412N	1 &2	48,64	6.43E-10	6.13E-11	0,35	0,12
K373D	1 &2	26,17	8.76E-10	4.64E-11	0,47	0,09
S387Y	1 &2	17,02	1.27E-09	4,51 E-11	0,68	0,09
E356K	1 &2	19,90	7.12E-10	4.40E-11	0,38	0,09
LQ391	1 &2	14,30	7.99E-10	3.32E-11	0,43	0,06
D372E, K373D	1 &2	14,21	5.78E-10	2.92E-11	0,31	0,06
D372E, K373D	1 &2	40,00	5.78E-10	2.92E-11	0,31	0,06
C415H	1 &2	20,35	8,15E-10	2.52E-11	0,44	0,05
M414Q, E436I	1 &2	32,72	1,19E-09		0,64	0,00
R128A, G211A, S387L, F420M	1 &2	51,20	1.00E-05		5376,63
G210T, G211C	1 &2	0,50	8.97E-06		4823,04
Q119T, G211A, F420M	1 &2	38,68	3.49E-06		1878,54
S387L, F420M	1 &2	10,44	2.95E-06		1584,85

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 451/498

245/266

Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 x ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
G210C,L397Q	1 &2	0,22	2.47E-06		1326,31
G210C, G211V	1 &2	0,18	2.13E-06		1144,05
G211A, S387L, F420M	1 &2	115,08	1.99E-06		1069,44
Q119T, F420M	1 &2	56,44	7.90E-07		424,49
R128A, S387L	1 &2	53,92	3.25E-07		174,56
K127N, R128C	1 &2	12,16	3.09E-08		16,63
S387V	1 &2	3,84	1.76E-08	2,06E-10	9,48
S387V, R425N	1 &2	5,00	1.54E-08		8,29
Y129H	1 &2	6,16	7.20E-09		3,87
Y129F	1 &2	45,06	5.57E-09		2,99
Q119T	1 &2	12,52	5.46E-09		2,93
Q119I	1 &2	6,61	4.68E-09		2,52
M343I	1 &2	21,00	4.29E-09		2,31
S387T	1 &2	18,25	4.22E-09		2,27
S387I	1 &2	5,33	4,11 E-09		2,21
M414W	1 &2	9,56	4.09E-09		2,20
D372S	1 &2	10,39	4.07E-09		2,19
d P40	1 &2	38,64	3.93E-09		2,11
G211A, S387L	1 &2	38,68	3.58E-09		1,92
D372N	1 &2	18,56	3.53E-09		1,90
G264A	1 &2	23,60	3.42E-09		1,84
E436M	1 &2	6,85	3.28E-09		1,76
Q323P	1 &2	42,67	3.25E-09		1,75
M414D	1 &2	12,70	3.20E-09		1,72
S387L, M414Q	1 &2	0,00	3.13E-09		1,68
Q119T, M414Q	1 &2	17,52	3.06E-09		1,65
S387D	1 &2	33,37	3.00E-09		1,61
Q119H	1 &2	4,52	2.98E-09		1,60
M414R	1 &2	7,32	2,91 E-09		1,56
M414A	1 &2	3,16	2.83E-09		1,52
D286G	1 &2	27,60	2.79E-09		1,50
LQ391, H392K, N393H	1 &2	36,90	2.78E-09		1,49
D372K	1 &2	22,19	2.77E-09		1,49
E436A	1 &2	21,31	2.73E-09		1,47
M343K	1 &2	23,30	2.66E-09		1,43
S387N	1 &2	4,57	2.65E-09		1,42
K248G	1 &2	52,40	2.65E-09		1,42
D372F	1 &2	15,16	2.58E-09		1,39
S387F	1 &2	9,56	2,51 E-09		1,35

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 452/498

246/266

Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 x ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
Q119A	1 &2	8,60	2,51 E-09		1,35
M343A	1 &2	46,40	2.49E-09		1,34
M414V	1 &2	24,60	2.44E-09		1,31
E436W	1 &2	14,87	2.43E-09		1,31
M343F	1 &2	64,97	2,41 E-09		1,30
S387C	1 &2	28,97	2.38E-09		1,28
M343R	1 &2	38,24	2.38E-09		1,28
E436Y	1 &2	22,32	2.34E-09		1,26
D372V	1 &2	22,28	2.25E-09		1,21
S387L, S412N, E436I	1 &2	10,80	2.25E-09		1,21
D372M	1 &2	11,96	2.23E-09		1,20
S412N, E436I	1 &2	55,60	2.19E-09		1,18
D372Y	1 &2	29,55	2.19E-09		1,18
M414Y	1 &2	41,86	2.18E-09		1,17
M343D	1 &2	109,09	2.17E-09		1,16
S387M	1 &2	17,37	2.15E-09		1,16
N126H	1 &2	43,52	2,11 E-09		1,13
M414S	1 &2	9,98	2.10E-09		1,13
M414H	1 &2	18,84	2.09E-09		1,13
M343G	1 &2	57,77	2.07E-09		1,11
D372Q	1 &2	27,27	2.07E-09		1,11
M343L	1 &2	16,36	2.06E-09		1,11
E436V	1 &2	25,92	2.06E-09		1,11
Q323K	1 &2	11,36	2.06E-09		1,11
P260R	1 &2	38,88	2.04E-09		1,10
D372P	1 &2	18,90	2.04E-09		1,10
M414N	1 &2	5,76	2.02E-09		1,09
M343S	1 &2	40,54	1.96E-09		1,05
E436F	1 &2	10,80	1.95E-09		1,05
E436G	1 &2	10,02	1.94E-09		1,04
Q323V	1 &2	37,40	1.94E-09		1,04
Q323Y	1 &2	16,92	1.94E-09		1,04
D372T	1 &2	32,59	1.94E-09		1,04
S387H	1 &2	24,32	1.93E-09		1,04
L400F	1 &2	42,92	1.93E-09		1,04
Q323N	1 &2	17,72	1,91 E-09		1,03
M414K	1 &2	10,50	1,88E-09		1,01
M414I	1 &2	7,40	1,88E-09		1,01
E436S	1 &2	19,88	1,88E-09		1,01
A104L	1 &2	37,88	1.86E-09		1,00
Q119W	1 &2	2,84	1.86E-09		1,00

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 453/498

247/266

Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 x ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
S108R	1 &2	41,22	1.85E-09		0,99
V53I	1 &2	28,30	1.83E-09		0,99
M343V	1 &2	24,66	1.83E-09		0,98
H65S	1 &2	25,72	1.79E-09		0,96
Q323S	1 &2	15,60	1.79E-09		0,96
Q323D	1 &2	97,37	1.78E-09		0,96
D372G	1 &2	25,12	1.75E-09		0,94
E436K	1 &2	12,71	1.72E-09		0,93
S387G	1 &2	12,56	1.72E-09		0,93
S387A	1 &2	20,13	1.68E-09		0,90
G308D	1 &2	16,52	1.65E-09		0,89
E436D	1 &2	48,58	1.64E-09		0,88
Q323M	1 &2	10,27	1.64E-09		0,88
L139I	1 &2	38,44	1.64E-09		0,88
G211A, M414Q	1 &2	60,72	1,61 E-09		0,86
Q323I	1 &2	37,28	1.60E-09		0,86
K61R	1 &2	40,92	1.59E-09		0,86
Q323E	1 &2	20,85	1.53E-09		0,82
G210A	1 &2	1,96	1,51 E-09	3.34E-11	0,81
E249D	1 &2	32,36	1,51 E-09		0,81
Q119V	1 &2	24,43	1.49E-09		0,80
Q119S	1 &2	3,24	1.49E-09		0,80
K87D	1 &2	26,40	1.48E-09		0,79
L71V	1 &2	29,80	1,47E-09		0,79
S64K	1 &2	36,44	1.46E-09		0,78
D372A	1 &2	23,84	1,44E-09		0,78
D372R	1 &2	34,71	1,44E-09		0,77
R116E	1 &2	8,74	1,42E-09		0,76
S387L, E436I	1 &2	11,12	1,41 E-09		0,76
V262K	1 &2	14,76	1,41 E-09		0,76
Q323T	1 &2	33,63	1.40E-09		0,75
Q323W	1 &2	26,80	1.39E-09		0,75
Q323G	1 &2	33,71	1.38E-09		0,74
Q119C	1 &2	16,32	1.38E-09		0,74
S412N, M414Q	1 &2	53,92	1.37E-09		0,74
E436N	1 &2	23,80	1.36E-09		0,73
G32A	1 &2	37,88	1.35E-09		0,72
d K250	1 &2	49,52	1.35E-09		0,72
M343Q	1 &2	33,34	1.32E-09		0,71
Q119T,	1 &2	16,44	1,31 E-09		0,70

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 454/498

248/266

Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 x ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
M414Q, E436I
D372I	1 &2	15,58	1.29E-09		0,69
Q119T, G211A, S387L	1 &2	9,84	1.29E-09		0,69
G252K	1 &2	20,80	1.28E-09		0,69
I257G	1 &2	39,08	1.28E-09		0,69
D372L	1 &2	7,59	1.27E-09		0,68
D372H	1 &2	20,08	1.27E-09		0,68
A255V	1 &2	53,62	1.26E-09		0,68
D453G	1 &2	56,62	1.26E-09		0,68
191L	1 &2	35,48	1,24E-09		0,66
L245T	1 &2	39,72	1.22E-09		0,66
D482G	1 &2	23,58	1,21 E-09		0,65
S387L, S412N	1 &2	6,72	1.20E-09		0,65
Q323C	1 &2	19,95	1.20E-09		0,65
M414L	1 &2	17,36	1.20E-09		0,64
Q119R	1 &2	4,29	1.20E-09		0,64
M434C	1 &2	33,31	1,19E-09		0,64
M343W	1 &2	30,46	1,19E-09		0,64
E436H	1 &2	24,43	1,18E-09		0,64
S387W	1 &2	3,31	1,16E-09		0,62
N309G	1 &2	40,04	1,15E-09		0,62
K259G	1 &2	45,70	1.14E-09		0,61
E436L	1 &2	9,44	1.13E-09		0,61
S246A	1 &2	40,08	1.12E-09		0,60
K127F	1 &2	11,84	1.12E-09		0,60
Q119T, S412N, E436I	1 &2	30,88	1.12E-09		0,60
Q119T, S412N	1 &2	41,72	1,11 E-09		0,60
Q119M	1 &2	41,27	1,11 E-09		0,60
E253G	1 &2	37,22	1,10E-09		0,59
S387E	1 &2	58,75	1,10E-09		0,59
Q119T, S387L, E436I	1 &2	4,68	1,10E-09		0,59
D88S	1 &2	24,50	1,10E-09		0,59
Q119T, E436I	1 &2	64,80	1.09E-09		0,59
L67V	1 &2	34,12	1.07E-09		0,57
N254S	1 &2	59,68	1.06E-09		0,57
V85N	1 &2	26,94	1.05E-09		0,57
Q119Y	1 &2	8,07	1.05E-09		0,57
P305S	1 &2	50,58	1.05E-09		0,56
E436R	1 &2	21,81	1.03E-09		0,55

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 455/498

249/266

Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 χ ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
M414F	1 &2	30,06	1.02E-09		0,55
M343H	1 &2	30,84	1.02E-09		0,55
K83R	1 &2	17,24	1,01 E-09		0,54
D372W	1 &2	17,84	1,00E-09		0,54
M343Y	1 &2	9,02	9.87E-10		0,53
E436C	1 &2	19,62	9.74E-10		0,52
Q323F	1 &2	22,61	9.52E-10		0,51
K127N	1 &2	8,20	9.37E-10		0,50
E436T	1 &2	15,79	9.35E-10		0,50
M343N	1 &2	38,49	9.29E-10		0,50
D372C	1 &2	25,31	9.14E-10		0,49
E103A	1 &2	26,74	9,00E-10		0,48
K127H	1 &2	7,84	8,91 E-10		0,48
Q323A	1 &2	32,81	8.75E-10		0,47
Q119F	1 &2	7,96	8.68E-10		0,47
Q291G	1 &2	24,16	8.65E-10		0,47
L82I	1 &2	18,72	8.57E-10		0,46
H391K	1 &2	39,76	8.27E-10		0,44
M414T	1 &2	19,07	8.25E-10		0,44
N392H	1 &2	18,32	8,16E-10		0,44
K127R	1 &2	19,72	8,09E-10		0,44
S76D	1 &2	25,46	8,04E-10		0,43
Q119E	1 &2	3,76	8,02E-10		0,43
K127P	1 &2	15,16	8,01 E-10		0,43
Q323R	1 &2	44,35	7.73E-10		0,42
K86S	1 &2	22,38	7.65E-10		0,41
M414C	1 &2	22,85	7.56E-10		0,41
K63S	1 &2	25,74	7.44E-10		0,40
A57V	1 &2	26,82	7,31 E-10		0,39
E224G	1 &2	19,68	7.28E-10		0,39
K127M	1 &2	25,96	7,08E-10		0,38
S387Q	1 &2	13,81	6,91 E-10		0,37
Q119K	1 &2	7,03	6.84E-10		0,37
E436Q	1 &2	13,28	6.66E-10		0,36
K127L	1 &2	16,56	6.36E-10		0,34
K127Q	1 &2	13,44	6.27E-10		0,34
M414E	1 &2	29,35	6.23E-10		0,33
Q323L	1 &2	21,44	6,19E-10		0,33
K127A	1 &2	8,08	6.14E-10		0,33
Q159K	1 &2	66,10	5.94E-10		0,32
K127V	1 &2	32,84	5.12E-10		0,28
K127G	1 &2	6,92	5,09E-10		0,27

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Substituição de amino ácidos	NO	Atividade	Saflufenacil	Trifludimoxazina	Saflufenacil	Trifludimoxazina
SEQ. ID	Normalizada
(UF x min^-1 x ng-¹)	IC50 (M)	Fator de tolerância
K127Y	1 &2	14,04	4.98E-10		0,27
K127S	1 &2	5,64	4.97E-10		0,27
K127D	1 &2	80,64	4,91 E-10		0,26
Q119L, Q323H	1 &2	114,45	4.82E-10		0,26
Y129W	1 &2	270,88	4.45E-10		0,24
K127I	1 &2	31,28	4.42E-10		0,24
K127W	1 &2	9,16	4.40E-10		0,24
V106A	1 &2	26,68	4.28E-10		0,23
Κ127Τ	1 &2	21,00	3.54E-10		0,19
K127C	1 &2	10,76	3.42E-10		0,18
K127E	1 &2	6,60	1.63E-10		0,09

Exemplo 5

Engenharia dos Vegetais Tolerantes aos Herbicidas Derivadas de PPO Possuindo Sequências de PPO do tipo Selvagem ou Mutadas [0413]Os vegetais de soja tolerante ao herbicida derivada de PPO (Glyceine max), milho (Zea mays), e canola (Brassica napus ou Brassica Rapa var. ou Brassica campestris L) são produzidas através de um método conforme descrito por Olhoft et al. (patente US 2009/0.049.567). Para a transformação de sequências de soja ou Arabidopsis thaliana, do tipo selvagem ou PPO mutada que codificam os polipeptídeos de PPO mutada que compreende a SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,45,

46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65,66,

67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86,87,

88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, são clonadas com técnicas de clonagem convencionais conforme descrito em Sambrook et al. (Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press) em um vetor binário contendo o cassete de gene marcador de resistência (AHAS) e sequência de PPO mutada (marcada como GOI) entre o promotor de ubiquitina (PcUbi) e

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251/266 sequência de terminador de nopalina-sintetase (NOS). Para a transformação do milho, as sequências do tipo selvagem ou PPO mutada são clonadas com as técnicas de clonagem padrão, conforme descrito em Sambrook etal. (Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press) em um vetor binário contendo o cassete genético marcador de resistência (AHAS) e sequência PPO mutada (marcada como GOI) entre a sequência promotora de ubiquitina de milho (ZmUbi) e terminadora de nopalina sintetase (NOS). Os plasmídeos binários são introduzidos em Agrobacterium tumefaciens para a transformação dos vegetais. As construções plasmidiais são introduzidas em células meristemáticas axilares de soja no nódulo primário de explantes de plântulas por meio transformação mediada por Agrobacterium. Após a inoculação e cocultivo com Agrobacteria, os explantes são transferidos para fotografar os meios de introdução sem seleção durante uma semana. Os explantes posteriormente são transferidos para um meio de indução de rebentos com o imazapir (Arsenal) a 1-3 μΜ durante 3 semanas para selecionar as células transformadas. Os explantes com as almofadas de calo / rebentos saudáveis no nódulo primário, em seguida, são transferidos para o meio de alongamento de rebentos contendo o imazapir de 1 a 3, até que um rebento seja alongado ou o explante morreu. As plântulas transgênicas são enraizadas, submetidas à análise TaqMan para a presença do transgene, transferidas para o solo e cultivadas até a maturidade em estufa. A transformação dos vegetais de milho é realizada através de um método descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). As construções de vetor da transformação vegetal contendo as sequências de PPO mutada são introduzidas em embriomas imaturos de milho por meio da transformação mediada por Agrobacterium.

[0414]As células transformadas são selecionadas em meio de seleção suplementado com 0,5-1,5 μΜ de imazetapir durante 3-4 semanas. As plântulas transgênicas são regeneradas em meios de regeneração dos vegetais

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252/266 e enraizadas posteriormente. As plântulas transgênicas são submetidas à análise TaqMan para a presença do transgene antes de serem transplantadas para o envasamento e cultivadas até a maturidade em estufa. As Arabidopsis thaliana são transformadas com aa sequências de PPO do tipo selvagem ou mutadas através do método de imersão floral conforme descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). Os vegetais transgênicas de Arabidopsis são submetidos à análise de TaqMan para a análise do número de locais de integração. A transformação de Oryza sativa (arroz) é realizada através de transformação de protoplastos conforme descrito por Peng et al. (patente US 6.653.529). Os vegetais transgênicos TO ou T1 de soja, milho e arroz contendo a sequência PPO mutada são testados quanto à tolerância aprimorada aos herbicidas derivados de PPO em estudos em estufa e estudos em mini-terrenos com os seguintes herbicidas inibidores de PPO: o saflufenacil, 1,5-dimetil-6tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo.

[0415]Os vegetais transgênicos de Arabidopsis thaliana são testados quanto à tolerância melhor ao saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo em placas de 48 cavidades. Por conseguinte, as sementes T2 são esterilizadas à superfície através de agitação durante 5 min em etanol + água (70 + 30 em volume), enxaguando uma vez com o etanol + água (70 + 30 em volume) e duas vezes com a água deionizada estéril. As sementes são ressuspensas em 0,1% de agar dissolvido em água (p/v). De quatro a cinco sementes por cavidade são plaqueadas em meio nutriente sólido

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253/266 que consiste de solução nutritiva de meia-força murashige skoog, pH 5,8 (Murashige e Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15 : 473-497). Os compostos são dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionados ao meio antes da solidificação (concentração final de DMSO a 0,1%). As placas de múltiplas cavidades são incubadas em uma câmara de crescimento a 22^s C, 75% de umidade relativa e 110 pmol de Phot * nr²* s^-1 com fotoperíodo de14: 10 h de luz: escuro. A inibição do crescimento é avaliada de sete a dez dias após a semeadura, em comparação com os vegetais do tipo selvagem.

[0416] Além disso, os vegetais transgênicos de T1 Arabidopsis são testados para aprimorar a tolerância aos herbicidas inibidores de PPO em estudos de estufa com os seguintes herbicidas inibidores de PPO: o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo.

[0417]Além disso, os vegetais transgênicos T2 Arabidopsis são testados para aprimorar a tolerância aos herbicidas inibidores de PPO. Os vegetais são tratados com os seguintes herbicidas na estufa: o saflufenacil, 1,5dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), uracilpiridina 2, uracilpiridina 4, uracilpiridina 1, sulfentrazona e flumioxazina + 1% de MSO. Os resultados são mostrados nas Figuras de 3 a 11.

Exemplo 6

Condições de Cultura de Tecidos [0418] Uma análise de mutagênese de cultura de tecidos in vitro foi desenvolvida para isolar e caracterizar o tecido de vegetal (por exemplo, o tecido de milho, de arroz) que é tolerante aos herbicidas inibidores da oxidase de protoporfirinogênio, (saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2), 2,7-trifluoro-3-oxo-4

Petição 870190056941, de 19/06/2019, pág. 460/498

254/266 (prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo). A análise utiliza a variação somaclonal que é encontrada na cultura de tecidos in vitro. As mutações espontâneas derivadas da variação somaclonal podem ser intensificadas por mutagênese química e seleção posterior de maneira gradual, em concentrações crescentes de herbicida.

[0419]A presente invenção fornece as condições de cultura de tecidos para encorajar o crescimento de calos friáveis, embriogênicos de milho ou arroz que são regeneráveis. Os calos são iniciados a partir de 4 cultivares diferentes de milho ou arroz, abrangendo as variedades Zea mays e Japonica (Taipei 309, Nipponbare, Koshihikari) e Indica (Indica 1), respectivamente. As sementes são esterilizadas à superfície em etanol a 70% durante cerca de 1 min seguido de 20% de branqueador comercial Clorox durante 20 minutos. As sementes são enxaguadas com água estéril e plaqueadas em meio de indução de calo. Diversos meios de indução de calos são testados. As listas de ingredientes para os meios testados são apresentadas na Tabela y.

TabelaY

Ingrediente	Fornecedor	R001M	R025M	R026M	R327M	R008M	MS711R
Vitaminas B5	Sigma					1,0 X
Sais MS	Sigma			1,0 X	1,0 X	1,0 X	1,0 X
Vitaminas MS	Sigma			1,0 X	1,0 X
Sais N6	Phytotech	4,0 g/L	4,0g/L
Vitaminas N6	Phytotech	1,0 X	1,0 X
L-Prolina	Sigma	2,9 g/L	0,5 g/L				1,2 g/L
Ácidos Casamino	BD	0,3 g/L	0,3 g/L	2 g/L
Hidrolisado de caseína	Sigma						1,0 g/L
Monoidrato de L-Asp	Phytotech						150 mg/L
Ácido nicotínico	Sigma						0,5 mg/L
HCI de Piridoxina	Sigma						0,5 mg/L
HCI de Tiamina	Sigma						1,0 mg/L

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255/266

Ingrediente	Fornecedor	R001M	R025M	R026M	R327M	R008M	MS711R
Mio-inositol	Sigma						100 mg/L
MES	Sigma	500 mg/L	500 mg/L	500 mg/L	500 mg/L	500 mg/L	500 mg/L
Maltose	VWR	30 g/L	30 g/L	30 g/L	30 g/L
Sorbitol	Duchefa			30 g/L
Sacarose	VWR					10 g/L	30 g/L
NAA	Duchefa					50 pg/L
2,4-D	Sigma	2,0 mg/L					1,0 mg/L
MgCI₂-6H₂O	VWR					750 mg/L
^pH		5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5,7
Gelrita	Duchefa	4,0 g/L				2,5 g/L
Agarosa Tipo 1	Sigma		7,0 g/L	10 g/L	10 g/L
Autoclave		15 min	15 min	15 min	15 min	15 min	20 min
Cinetina	Sigma		2,0 mg/L	2,0 mg/L
NAA	Duchefa		1,0 mg/L	1,0 mg/L
ABA	Sigma		5,0 mg/L
Cefotaxim	Duchefa		0,1 g/L	0,1 g/L	0,1 g/L
Vancomicina	Duchefa		0,1 g/L	0,1 g/L	0,1 g/L
Disulfato G418	Sigma		20 mg/L	20 mg/L	20 mg/L

[0420]0 meio de indução de calo R001M é selecionado após o teste de numerosas variações. As culturas são mantidas no escuro a 30^s C. O calo embriogênico é subcultivado em meio fresco após 10 a 14 dias.

Exemplo 7

Seleção de Calo Tolerante aos Herbicida [0421] Uma vez que as condições de cultura de tecidos são determinadas, o estabelecimento adicional de condições de seleção é estabelecido através da análise da sobrevivência do tecido em curvas de morte com o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. Consideração cuidadosa da acumulação do herbicida no tecido, bem como a sua persistência e estabilidade nas células e no meio de cultura é realizada. Através destes experimentos, uma dose sub-letal foi estabelecida para a seleção inicial

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256/266 de material mutado. Após o estabelecimento da dose inicial de saflufenacil, 1,5dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 I trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo em meio de seleção, os tecidos são selecionados a partir de maneira escalonada aumentando a concentração do inibidor de PPO com cada transferência até que as células sejam recuperadas e cresçam vigorosamente na presença de doses tóxicas. Os calos resultantes são posteriormente subcultivados a cada 3-4 semanas para R001M com agente seletivo. Mais de 26.000 calos são submetidos à seleção de 4-5 subculturas até que a pressão seletiva esteja acima dos níveis tóxicos, conforme determinado pelas curvas de morte e observações da cultura continuada. De maneira alternativa, as culturas líquidas iniciam a partir de calos em MS711R com agitação lenta e subculturas semanais. Uma vez estabelecidas as culturas líquidas, o agente de seleção é adicionado diretamente ao frasco em cada subcultura. Após 2-4 ciclos de seleção de líquido, as culturas são transferidas para os filtros em meio sólido R001M para o crescimento posterior.

Exemplo 8

Regeneração dos Vegetais [0422] O tecido tolerante é regenerado e caracterizado molecularmente para as mutações na sequência do gene de PPO e/ou bioquimicamente para a atividade alterada de PPO na presença do agente seletivo. Além disso, os genes envolvidos direta e/ou indiretamente na biossíntese do tetrapirrol e/ou nas vias metabólicas também são sequenciados para caracterizar as mutações. Finalmente, as enzimas que alteram o destino (por exemplo, o metabolismo, translocação, transporte) também são sequência para as mutações caracterizadas. Após a seleção do herbicida, os calos são

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257/266 regenerados utilizando um regime de média de R025M durante 10 a 14 dias, R026M para cerca de 2 semanas, R327M até que os brotos bem formados estejam desenvolvidos, e R008S até que os brotos estejam bem enraizados para a transferência para a estufa. A regeneração é realizada à luz. Nenhum agente de seleção é incluído durante a regeneração. Uma vez estabelecidas as raízes fortes, os regeneradores MO são transplantados para a estufa em vasos quadrados ou redondos. Os transplantes são mantidos sob um copo de plástico transparente até que estejam adaptados às condições de estufa. A estufa é ajustada para um ciclo dia / noite de 27^s C / 21^s C (80^s F / 70^s (F) com luzes de sódio de pressão elevada de 600W que complementam a luz para manter um dia de duração de 14 horas. Os vegetais são regados de acordo com a necessidade, dependendo do clima e fertilizados diariamente.

Exemplo 9

Análise de Sequência [0423]O tecido foliar é coletado dos vegetais clonais separados para o transplante e analisado como individuais. O DNA genômico é extraído utilizando um conjunto de sistema de vegetal Magnetic DNA Wizard® 96 (Promega, patentes US 6.027.945 e 6.368.800), conforme indicado pelo fabricante. O DNA isolado é amplificado por PCR utilizando o primer direto e inverso, caso adequado.

[0424]A amplificação por PCR é realizada utilizando o HotstarTaq DNA Polimerase (Qiagen) utilizando o programa de termociclagem de toque como se segue: 96^s C durante 15 min, seguido por 35 ciclos (96^s C, 30 seg; 58 a 0,20 por ciclo, 30 seg; 72, 3 min e 30 seg), 10 min a 72^SC. Os produtos de PCR são verificados quanto à concentração e tamanho do fragmento através de eletroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR desfosforilados são analisados por sequência direta utilizando os primers de PCR (DNA Landmarks ou Entelechon). Os arquivos de varredura de cromatograma (.scf) são

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258/266 analisados quanto à mutação em relação ao gene do tipo selvagem utilizando o Vetor NTI Advance 10 ™ (Invitrogen). Com base na informação de sequência, as mutações são identificadas em diversos indivíduos. A análise de sequência é realizada nos cromatogramas representativos e no alinhamento AlignX correspondente com as configurações padrão e editada para convocar os picos secundários.

Exemplo 10

Demonstração da Tolerância ao Herbicida [0425]Os vegetais transgênicos TO ou T1 de variedades de soja, milho, canola e arroz contendo as sequências de PPO1 e/ou PPO2 são testados quanto à tolerância aos herbicidas em estudos em estufa e estudos de miniterrenos com os seguintes herbicidas: o saflufenacil, 1,5-dimetiI-6- tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-ilo)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. Para o tratamento préemergência, os herbicidas são aplicados diretamente após a semeadura, por meio de bocais de distribuição fina. Os recipientes são irrigados suavemente para promover a germinação e o crescimento e, posteriormente, cobertos com as capas plásticas transparentes até que os vegetais estejam enraizados. Essa cobertura provoca a germinação uniforme dos vegetais de teste, a menos que isso tenha sido prejudicado pelos herbicidas. Para o tratamento pós-emergência, os vegetais-teste, em primeiro lugar, crescem a uma altura de 3 a 15 cm, dependendo do hábito do vegetal, e apenas em seguida são tratados com os herbicidas. Para este propósito, os vegetais de teste são semeados diretamente e cultivados nos mesmos recipientes ou, em primeiro lugar, são cultivados separadamente e transplantados para os recipientes de teste alguns dias antes do tratamento.

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259/266 [0426] Para o teste dos vegetais TO, podem ser utilizadas as estacas. No caso dos vegetais de soja, uma estaca ideal para o corte é de cerca de 7,5 a 10 cm de altura, com pelo menos, dois nódulos presentes. Cada estaca é retirada do transformante original (vegetal mãe) e mergulhada em pó de hormona de enraizamento (ácido indol-3-butírico, IBA). A estaca, em seguida, é colocada em cunhas oásis dentro de um bio-domo. As estacas do tipo selvagem também são tomadas simultaneamente para servir como controles. As estacas são mantidas no biomato durante 5 a 7 dias e, em seguida, transplantadas para vasos e, em seguida, aclimatadas na câmara de crescimento durante dois dias adicionais. Posteriormente, as estacas são transferidas para a estufa, aclimatadas durante cerca de 4 dias e, em seguida, submetidas aos testes de pulverização, conforme indicado. Dependendo da espécie, os vegetais são mantidos de 10 a 25^s C ou de 20 a 35^s C. O período de teste se estende durante 3 semanas. Durante este tempo, os vegetais são cuidados e a sua resposta aos tratamentos individuais é avaliada. As avaliações da lesão por herbicidas são realizadas às 2 e 3 semanas após o tratamento. A lesão no vegetal é classificada em uma escala de 0% a 100%, 0% sendo sem lesão e 100% com morte completa.

[0427]Os vegetais transgênicos de Arabidopsis thaliana são testados quanto à tolerância melhor ao saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e diuron inibidor da fotografiassíntese como controle negativo, em placas de 48 cavidades. Por conseguinte, as sementes T2 são esterilizadas à superfície através de agitação durante 5 min em etanol + água (70 + 30 em volume), enxaguando uma vez com o etanol + água (70 + 30 em volume) e duas vezes com a água deionizada estéril. As sementes são ressuspensas em 0,1% de ágar dissolvido em água (p/v). De

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260/266 quatro a cinco sementes por cavidade são plaqueadas em meio nutriente sólido que consiste de solução nutritiva de meia-força murashige skoog, pH 5,8 (Murashige e Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15 : 473-497). Os compostos são dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionados ao meio antes da solidificação (concentração final de DMSO a 0,1%). As placas de múltiplas cavidades são incubadas em uma câmara de crescimento a 22^s C, 75% de umidade relativa e 110 pmol de Phot * nr²* s^-1 com fotoperíodo de 14: 10 h de luz: escuro. A inibição do crescimento é avaliada de sete a dez dias após a semeadura, em comparação com os vegetais do tipo selvagem. De maneira adicional, os vegetais transgênicos de T1 Arabidopsis são testados para aprimorar a tolerância aos herbicidas em estudos de estufa com os seguintes herbicidas: o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2ini l)-3,4-diidro -2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS

1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. Os resultados são mostrados na Tabela a seguir e nas Figuras 1 e 2.

Análise de Germinação - Germinação de transgênicos em meio contendo agente de seleção
Evento	Espécies_gene_substituição	Composto	IC50 (M)	Fator de Tolerância (não transgênico = 1,0)
	não transgênico (MC-24)	Saflufenacil	2.50E-08	1
	AMATU PPO2 wild type	Saflufenacil	1,06E-07	10
D	AMATU PPO2 G211 A F420M	Saflufenacil	2.50E-05	1.000
M	AMATU PPO2 G211 A F420M	Saflufenacil	2.50E-05	1.000
P	AMATU PPO2 G211 A F420M	Saflufenacil	7.50E-06	300
Q	AMATU PPO2 G211 A F420M	Saflufenacil	7.50E-06	300
R	AMATU PPO2 G211 A F420M	Saflufenacil	7.50E-06	300

Exemplo 11

Seleção de Herbicida Utilizando a Cultura de Tecido [0428]O meio é selecionado para a utilização e curvas de morte desenvolvidas conforme especificado acima. Para a seleção, diferentes técnicas são utilizadas. Ou uma seleção por etapas é aplicada, ou um nível letal imediato

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261/266 de herbicida é aplicado. Em ambos os casos, todos os calos são transferidos para cada nova rodada de seleção. A seleção é de 4 a 5 ciclos de cultura com 3 a 5 semanas para cada ciclo. Os calos são colocados em membranas de nylon para facilitar a transferência (folhas de 200 microns poros, Bioprojeto, Saco, Maine). As membranas são cortadas para ajustar as placas de Petri de 100 x 20 mm e são autoclavadas antes da utilização. De 25 a 35 calos (peso médio / calos sendo de 22 mg) são utilizados em cada placa. Além disso, um conjunto de callo é submetido à seleção em meio de cultura líquido com as subculturas semanais seguidas por seleção adicional em meio semissólido. As linhagens mutantes são selecionadas utilizando o saflufenacil, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina), flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. As eficiências da obtenção de mutantes é elevada, com base em uma porcentagem de calos que originou uma linhagem mutante regenerável ou um número de linhagens, conforme determinado pelo grama de tecido utilizado.

Exemplo 12

TRANSFORMAÇÃO DOS VEGETAIS INTEIROS DE MlLHO E TESTE DE TOLERÂNCIA AOS Inibidores de PPO [0429]Os embriões imaturos são transformados de acordo com o procedimento descrito em Peng et al. (WO 2006/136596). Os vegetais são testados quanto à presença do T-DNA pela análise Taqman, o alvo sendo o terminador que está presente em todas as construções. Os vegetais saudáveis são enviados para a estufa para o endurecimento e posterior teste de pulverização. Os vegetais são transplantados individualmente para o solo do MetroMix 360 em vasos de 4“. Uma vez na estufa (ciclo dia / noite de 27- C / 21 C com 14 horas de duração do dia suportado por lâmpadas de sódio de pressão

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262/266 elevada de 600 W), podem crescer durante 14 dias. Eles, em seguida, são pulverizados com um tratamento de 25 a 200 g ia/ha de saflufenacil + 1,0% em v/v de óleo de sementes metilado (MSO) e/ou de 25 a 200 g ai/ha de 1,5-dimetil6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin6-il)-1,3, 5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina) mais 1 % de MSO. Outros herbicidas inibidores de PPO também são testados de maneira similar para confirmar a resistência cruzada: a flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. As avaliações da lesão por herbicidas são realizadas aos 7,14 e 21 dias após o tratamento. As avaliações das lesões causadas por herbicidas são realizadas 2, 7, 14 e 21 dias após a pulverização para procurar as lesões nos novos pontos de crescimento e na saúde geral do vegetal. Os principais sobreviventes são transplantados para os potes de galão preenchidos com o MetroMix 360 para a produção de sementes.

[0430]Além disso, o milho transgênico T1 contendo as variantes Amtu_PPO2 é testado quanto à tolerância para a aplicação de pré-emergência de Saflufenacil. As sementes são plantadas em uma mistura de areia e um Metromix e, em seguida, imediatamente tratadas com 50 e 200 g ai/ha de Saflufenacil. As ementes e plântulas são avaliadas quanto à germinação e comprimento da raiz. Os resultados são mostrados na Figura 14.

Exemplo 13

Transformação de Soja e Teste de Tolerância ao Inibidor de PPO [0431]A soja cv Jake é transformada conforme anteriormente descrito por Siminszky et al., Phytochem Rev. 5: 445-458 (2006). Após a regeneração, os transformantes são transplantados para o solo em pequenos vasos, colocados em câmaras de crescimento (16 horas por dia / 8 horas por noite; 25^SC dia / 23^SC por noite; 65% de umidade relativa; de 130 a 150 microE m-2 s-1) e posteriormente testados quanto à presença do T-DNA através da

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263/266 análise de Taqman. Após algumas semanas, os eventos saudáveis, com cópia única positiva, são transplantados para os potes maiores e deixados crescer na câmara de crescimento. Um rebento ideal para a estaca é de cerca de 3 a 4 centímetros de altura, com pelo menos, dois nódulos presentes. Cada estaca é retirada do transformante original (vegetal mãe) e mergulhado em pó de hormona de enraizamento (ácido indol-3-butírico, IBA). A estaca, em seguida, é colocada em cunhas oásis dentro de um bio-domo. O vegetal mãe é levado à maturidade na estufa e colhido para semente. As estacas do tipo selvagem também são tomadas simultaneamente para servir como controles negativos. As estacas são mantidas no bio-domo durante 5 a 7 dias e, em seguida, transplantadas para vasos de 3 polegadas e, em seguida, aclimatadas na câmara de crescimento durante dois dias adicionais. Posteriormente, as estacas são transferidas para a estufa, aclimatadas durante cerca de 4 dias e, em seguida, pulverizadas com um tratamento de 0 a 200 g ia / ha de aflufenacil mais 1% MSO e/ou de 25 a 200 g ai/ha de 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/benzo[b][1,4]oxazin-6-lil)-1,3,5-triazinan-2,4-diona (CAS 1258836-72-4 / trifludimoxazina) mais 1 % de MSO. Outros herbicidas inibidores de PPO também são testados de maneira similar para confirmar a resistência cruzada: a flumioxazina, butafenacila, acifluorfeno, lactofeno, bifenox, sulfentrazona e inibidor de diurona da fotografiassíntese como controle negativo. As avaliações da lesão por herbicidas são realizadas 7 dias após o tratamento.

[0432]Os resultados são mostrados nas Figuras 12 e 13.

[0433]A seguir, é apresentada uma definição dos pontuações de lesão medidos acima:

- Pontuação: Descrição da lesão;

- 0: sem lesão;

- 1: Lesão mínima, apenas algumas manchas de lesão foliar ou clorose;

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264/266

- 2: Lesão mínima com a clorose ligeiramente mais forte. Os pontos gerais de crescimento permanecem sem danos;

- 3: Lesão ligeiramente mais forte no tecido foliar secundário, mas os pontos primários da folha e do crescimento ainda não estão danificados;

-4: A morfologia total do vegetal é ligeiramente diferente, com alguma clorose e necrose nos pontos secundários de crescimento e tecido foliar. As hastes estão intactas. O novo crescimento é altamente provável dentro de 1 semana;

- 5: A morfologia total do vegetal é claramente diferente, alguma clorose e necrose em algumas folhas e pontos de crescimento, mas o ponto de crescimento primário está intacto. O tecido da haste ainda está verde. O novo crescimento é altamente provável dentro de 1 semana;

- 6: Lesões fortes podem ser observadas no crescimento do novo folheto. O vegetal possui probabilidade elevada de sobreviver apenas por regeneração em diferentes pontos de crescimento. A maioria das folhas são cloróticas / necróticas, mas o tecido do caule ainda é verde. Pode apresentar o novo crescimento, mas com aparência lesada;

- 7: A maioria dos pontos de crescimento ativos é necrótica. Pode existir um único ponto de crescimento que pode sobreviver e pode ser parcialmente clorótico ou verde e parcialmente necrótico. Duas folhas ainda podem ser cloróticas com algum verde; o resto do vegetal, incluindo o caule, é necrótico;

- 8: O vegetal provavelmente morrerá e todos os pontos de crescimento serão necróticos. Uma folha ainda pode ser clorótica com algum verde. O restante do vegetal é necrótico;

-9:0 vegetal está morto; e * Não testado.

Exemplo 14

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265/266

Expressão Transiente de Proteínas em Folhas de Tabaco [0434]A expressão transiente de sequências de PPO mutada como tipo selvagem ou com mutações respectivas foi realizada conforme descrito anteriormente (Voinnet O., et al., 2003, The Plant Journal 33, 949-956). Em resumo, a clonagem da transformação de GOI e Agrobacterium (cepa: GV2260) foi realizada conforme descrito no EXEMPLO 5. As folhas jovens de Nicotiana benthamiana foram infiltradas com suspensão de Agrobacterium transgênico (OD600 de 1,0) contendo as construções de vetor binário contendo um gene GOI controlado por um promotor e sequência terminadora. 48h a 72h após a infiltração, as punções de discos de folha (0,75 cm de diâmetro) foram transferidas para as placas de 6 cavidades com a solução nutritiva média ou meia força Linsmaier-Skoog (Linsmaier e Skoog (1965) Physiol. Plant. 18: 1 GO127) ou água) contendo o herbicida de interesse em diferentes concentrações. As placas de múltiplas cavidades foram incubadas em uma câmara de crescimento a 22^s C, umidade relativa de 75% e 110 pmol Phot * nr²* s^-1 com fotoperíodo de 14:10 h luz: escuro.

Exemplo 15

Demonstração da Tolerância aos Herbicidas de Discos Foliares de Tabaco Transientemente Transformados [0435]Os discos de folha, gerados conforme descrito no EXEMPLO 14, expressando uma proteína codificada por GOI, foram submetidos à análise na tolerância aprimorada ao tratamento com herbicida. Para as análise dos danos causados por herbicidas, a fluorescência da clorofila foi identificada como marcador indicativo (Dayan e Zaccaro (2012) Pest. Biochem. Physiol. 102:189197). Além de monitorar o efeito do herbicida por inspeção visual, o rendimento fotografiassintético do fotografiassistema II foi realizado com uma máquina PAM MAXI Imaging (IMAGINE-PAM Série M, Walz, Effeltrich, Alemanha) 48 horas após o início do tratamento com o herbicida. O rendimento de PSII foi medido de

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266/266 acordo com as instruções do fabricante. Os fatores de tolerância foram calculados com base nos valores de IC50 da inibição do rendimento de PSII de discos foliares transformados versus transformados em vetores vazios. IC50 da inibição do rendimento de PSII em discos foliares transformados por vetor vazios tratados com 0 Saflufenacil ou 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3-oxo-4(prop-2-inil)-3,4-diidro-2/-/-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5-triazinan-2,4-diona durante 48 h foi medida com 1,1 * 10’⁷ M ou 1,1 * 10’⁸ M, respectivamente.

Claims

1. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptideo de PPO mutada, a expressão de dito polinucleotídeo confere a tolerância a parte vegetal ou vegetal aos herbicidas, em que dito polipeptideo de PPO mutada compreende um ou mais dos seguintes motivos.

(v) Motivo 1:

- GT[C/S]GGDP

- em que a glicina na posição 4 e/ou 5 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido (vi) Motivo 2:

- [A/S/C]PS[D/N][X][X]L

- em que a serina na posição 3 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido (vii) Motivo 3:

- [R/Q][E/D]KQQ[L/A]P

- em que a glutamina na posição 4 dentro de dito motivo de sequência do tipo selvagem correspondente é substituída por qualquer outro amino ácido (viii) Motivo 4:

- L[I/V]PSKE

2. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de PPO mutada de maneira adicional compreende um ou mais dos seguintes motivos (a) Motivo 5: SQ[N/K/H]KRYI, em que a Arg na posição 5 dentro de

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2/10 dito motivo é substituída por qualquer outro amino ácido;

(b) Motivo 6: TLGTLFSS, em que o Leu na posição 2 dentro de dito motivo é substituído por qualquer outro amino ácido;

(c) Motivo 7: [F/Y]TTF[V/I]GG, em que o Phe na posição 4 dentro de dito motivo é substituído por qualquer outro amino ácido.

3. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo de PPO mutada compreende uma combinação de motivos, dita combinação é selecionada a partir do grupo que consiste em: Motivo 5 - Motivo 1 - Motivo -2 Motivo 7; Motivo 5 - Motivo 1 - Motivo 7, Motivo 5 - Motivo 4 - Motivo 7; Motivo 3 - Motivo 5 - Motivo 7; Motivo 1 - Motivo 7; e Motivo 1 - Motivo 6 - Motivo 7.

4. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de PPO mutada compreende a sequência de ácido nucléico apresentada na SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125., 126, 127, 128 ou 130, ou um seu homólogo, variante ou derivado.

5. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de PPO mutada é uma variante funcionalque possui, além do comprimento total da variante, pelo menos, cerca de 60%, de maneira ilustrativa, pelo menos, cerca de 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% ou superior identidade de sequência de amino ácidos com a SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129.

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6. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a PPO mutada se refere a um polipeptideo de PPO cuja sequência de amino ácidos difere da respectiva sequência de amino ácidos do tipo selvagem em uma ou mais posições correspondentes às posições 32, 53, 57, 61, 63, 64, 65, 67, 71,76, 82, 83, 85,

86, 87, 88, 91,103, 104, 106, 108, 116, 119, 126, 127, 129, 139, 159, 210, 211,

224, 245, 246, 248, 249, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 262, 264, 286, 291,

305, 308, 309, 323, 335, 343, 345, 358, 372, 373, 387, 391,392, 400, 412, 414,

415, 425, 428, 431,433, 434, 435, 436, 447, 451,453, 464, 466, 482 de SEQ ID. No 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

7. SEMENTE CAPAZ DE GERMINAÇÃO EM UM VEGETAL caracterizada pelo fato de que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

8. CÉLULA DE VEGETAL OU CAPAZ DE REGENERAR UM VEGETAL caracterizada pelo fato de que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas, em que a célula de vegetal compreende o polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor.

9. CÉLULA DE VEGETAL caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor

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4/10 operável em uma célula, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

10. PRODUTO DE VEGETAL preparado a partir de um vegetal ou parte de vegetal caracterizada pelo fato de que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células dos vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

11. PROGÊNIE OU VEGETAL DESCENDENTE derivado a partir de um vegetal caracterizada pelo fato de que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, em que a progênie ou vegetal descendente compreende em, pelo menos, algumas de suas células o polinucleotídeo operavelmente ligado ao promotor, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere à descendência ou descendência a tolerância do vegetal aos herbicidas.

12. MÉTODO PARA O CONTROLE DE ERVAS DANINHAS em um local para o crescimento de um vegetal, o método caracterizada pelo fato de que compreende: (a) a aplicação de uma composição herbicida que compreende os herbicidas no local; e (b) o plantio de uma semente no local, em que a semente é capaz de produzir um vegetal que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO

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5/10 mutada codificado através de polinucleotídeo de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere a tolerância aos vegetais a herbicidas.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a composição herbicida é aplicada às ervas daninhas e ao vegetal produzido pela semente.

14. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM VEGETAL que possui a tolerância ao herbicida, o método caracterizada pelo fato de que compreende a regeneração de um vegetal a partir de uma célula de vegetal transformado com um polinucleotídeo recombinante operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetais, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas.

15. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM VEGETAL de progênie que possui tolerância ao herbicida, o método caracterizada pelo fato de que compreende: o cruzamento de um primeiro vegetal de tolerância ao herbicida com um segundo vegetal para a produção de um vegetal de progênie de tolerância ao herbicida, em que o primeiro vegetal e o vegetal de progênie compreendem em, pelo menos, algumas de suas células um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere ao polipeptídeo de PPO mutada. tolerância dos vegetais a herbicidas.

16. VEGETAL OU PARTE DE VEGETAL caracterizada pelo fato de que compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de

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6/10 vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptídeo de PPO mutada codificado através de polinucleotídeo, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, a expressão do polipeptídeo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas, em que o vegetal ou parte de vegetal ainda exibe um segundo ou terceiro traço ao herbicida.

17. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO isolada e/ou produzida de maneira recombinante e/ou sintética caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada selecionado a partir do grupo que consiste em:

(b) uma molécula de ácido nucléico, que, como resultado da degeneração do código genético, pode ser derivada de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PPO mutada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 129, ou uma sua variante, parálogo, ortólogo ou homólogo, e confere a

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7/10 tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com um correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

(c) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptideo de PPO mutada que possui 30% ou superior de identidade, de preferência, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou superior, com a sequência de amino ácidos de sequência de polipeptideo de PPO de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,

(d) molécula de ácido nucléico que híbrida com uma molécula de ácido nucléico de (a), (b) ou (c), sob condições de hibridação restringentes e confere a tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula correspondente, por exemplo, a célula de vegetal não transformada do tipo selvagem, um vegetal ou sua parte;

- em que a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada codificada difere a partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 32, 53, 57, 61,63, 64, 65, 67, 71,76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 103,

104, 106, 108, 116, 119, 126, 127, 129, 139, 159, 210,211,224, 245, 246, 248,

249, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 262, 264, 286, 291,305, 308, 309, 323,

335, 343, 345, 358, 372, 373, 387, 391,392, 400, 412, 414, 415, 425, 428, 431,

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18. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de amino ácido do polipeptideo de PPO mutada codificado difere de maneira adicional de sequência de amino ácido do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 128, 397 ou 420 de SEQ. ID Nos 1 ou 2, em que dita diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

19. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 211, 387 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

20. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 211 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

21. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 210 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

22. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 128, 412 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

23. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes

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9/10 às posições 119,128 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

24. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 211,397 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

25. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os amino ácidos nas posições correspondentes às posições 211 e 420 de SEQ ID NO: 1 ou 2 são substituídos por qualquer outro amino ácido.

26. CASSETE DE EXPRESSÃO caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico, de acordo com as reivindicações de 17 a 25, e um promotor operável em células de vegetais.

27. VETOR caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico, de acordo com as reivindicações de 17 a 25, ou o cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 26.

28. POLIPEPTIDEO DE PPO MUTADA ISOLADO, caracterizado pelo fato de que recombinante e/ou sintetizado quimicamente codificado através da molécula de ácido nucléico, de acordo com as reivindicações de 17 a 25 ou um polipeptideo que possui, pelo menos, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidade para a sequência de SEQ ID Nos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33,

97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114,115,116,117 ou 129, ou uma variante, parálogo, ortóloga ou seu homólogo, em que a sequência de amino ácidos do polipeptideo de PPO mutada difere a

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10/10 partir de sequência de amino ácidos do tipo selvagem de um polipeptideo de PPO em uma ou mais posições correspondentes às posições 32, 53, 57, 61,63, 64, 6 5, 67, 71,76, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91,103, 104, 106, 108, 116, 119, 126,

127, 129, 139, 159, 210, 211,224, 245, 246, 248, 249, 252, 253, 254, 255,257,

259, 260, 262, 264, 286, 291,305, 308, 309, 323, 335, 343, 345, 358, 372,373,

387, 391,392, 400, 412, 414, 415, 425, 428, 431,433, 434, 435, 436, 447,451,

453, 464, 466, 482 de SEQ ID NO: 1 ou 2, em que a diferença se refere a uma substituição do amino ácido nessas posições por qualquer outro amino ácido.

29. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE VEGETAL a partir do vegetal, de acordo com a reivindicação 1, o método caracterizada pelo fato de que compreende o processamento do vegetal ou de uma parte do vegetal para obter o produto de vegetal.

30. MÉTODO de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o produto de vegetal é a forragem, farinha de semente, óleo ou sementes revestidas de tratamento de sementes.

31. PRODUTO DE VEGETAL obtido de um vegetal ou parte de vegetal, caracterizado pelo fato de que que o vegetal ou parte de vegetal compreende em, pelo menos, algumas de suas células, um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor operável em células de vegetal, o promotor capaz de expressar um polipeptideo de PPO mutada codificado, pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptideo de PPO mutada que confere a tolerância do vegetal aos herbicidas, em que o vegetal ou parte de vegetal ainda exibe um segundo ou terceiro traço ao herbicida.

32. PRODUTO DE VEGETAL, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o produto é a forragem, farinha de sementes, óleo ou semente revestida de tratamento de sementes.