KR102085133B1 - 제초제에 대한 내성이 증가된 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 재배지에서 원치않는 식생을 방제하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 야생형 프로토포피리노겐 옥시다제 (PPO), 또는 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 돌연변이화된 프로토포피리노겐 옥시다제 (PPO)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 식물을 식물 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 지역에 유효량의 상기 제초제를 적용하는 단계를 포함한다. 본 발명은 추가로 야생형 또는 돌연변이화된 PPO 효소를 포함하는 식물, 및 상기 식물을 수득하는 방법을 개시한다.

Description

제초제에 대한 내성이 증가된 식물 {PLANTS HAVING INCREASED TOLERANCE TO HERBICIDES}
본 발명은 일반적으로 제초제에 대한 농업 수준의 내성을 식물에 부여하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 "벤족사지논-유도체" 제초제에 대한 내성이 증가된 식물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 돌연변이유발 및 교배 육종 및 형질전환에 의해 "벤족사지논-유도체" 제초제에 대한 내성이 증가된 식물을 수득하는 방법 및 수득된 식물에 관한 것이다.
프로토포피린 IX의 생합성에서 중요한 효소인 프로토포피리노겐 옥시다제 (이하 프로톡스 또는 PPO; EC: 1.3.3.4로 지칭)를 억제시키는 제초제가 잡초의 선택적 방제를 위해 1960년대 이후로 계속 사용되어 왔다. PPO는 프로토포피리노겐 IX의 프로토포피린 IX로의 산화인, 엽록소 및 헴 생합성 중 마지막의 공통 단계를 촉매화시킨다 (문헌 [Matringe et al. 1989. Biochem. 1. 260:231]). PPO-억제 제초제로는 구조상 상이한 부류의 분자를 다수 포함한다 (문헌 [Duke et al. 1991. Weed Sci. 39: 465]; [Nandi-halli et al. 1992. Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193]; [Matringe et al. 1989. FEBS Lett. 245: 35]; [Yanase and Andoh. 1989. Pesticide Biochem. Physiol. 35:70]). 이러한 제초성 화합물로는 디페닐에테르 (예컨대, 락토펜, (±)-2-에톡시-1-메틸-2-옥소에틸 5-{2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시}-2-니트로벤조에이트; 아시플루오르펜, 5-{2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시}-2-니트로벤조산; 그의 메틸 에스테르; 또는 옥시플루오르펜, 2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)-4-(트리플루오로벤젠)}, 옥시디아졸, (예컨대, 옥시디아존, 3-{2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐}-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-(3H)-온), 시클릭 이미드 (예컨대, S-23142, N-(4-클로로-2-플루오로-5-프로파길옥시페닐)-3,4,5,6-테트라히드로프탈이미드; 클로로프탈림, N-(4-클로로페닐)-3,4,5,6-테트라히드로프탈이미드), 페닐 피라졸 (예컨대, TNPP-에틸, 에틸 2-{1-(2,3,4-트리클로로페닐)-4-니트로피라졸릴-5-옥시}프로피오네이트; M&B 39279), 피리딘 유도체 (예컨대, LS 82-556), 및 페노필레이트 및 그의 O-페닐피롤리디노- 및 피페리디노카르바메이트 유사체를 포함한다. 상기 화합물들 다수는 겉보기상 기질 유사체로서 작용하면서, 효소에 의해 촉매화되는 정상적인 반응을 경쟁적으로 억제시킨다.
PPO-억제 제초제를 적용시키면 엽록체 및 미토콘드리아에 프로토포피리노겐 IX이 축적되게 되며, 이는 시토졸로 누출되어 여기서, 퍼옥시다제로 산화된다. 빛에 노출되었을 때, 프로토포피린 IX는 시토졸에서 일중항 산소를 형성하게 되고, 활성산소종을 형성하게 되는데, 이는 지질 과산화 및 막 파괴를 일으켜 세포를 빠르게 사멸시킬 수 있다 (문헌 [Lee et al. 1993. Plant Physiol. 102: 881]).
모든 PPO 효소가 식물 PPO 효소를 억제시키는 제초제에 대해 감수성인 것은 아니다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) PPO 효소 (문헌 [Sasarmen et al. 1993. Can. J. Microbiol. 39: 1155]; [Dailey et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:813]), 둘 모두는 상기 제초성 억제제에 대해 내성을 띤다. 페닐이미드 제초제 S-23142에 대해 내성을 띠는 단세포 조류 클라미도모나스 레인하드티이(Chlamydomonas reinhardtii)의 돌연변이체가 보고되었다 (문헌 [Kataoka et al. 1990. J. Pesticide Sci. 15: 449]; [Shibata et al. 1992. In Research in Photosynthesis, Vol. III, N. Murata, ed. Klu-wer:Netherlands. pp. 567-70]). 상기 돌연변이체 중 하나 이상은 상기 돌연변이체의 선별이 이루어졌던 제초성 억제제에 대해서 뿐만 아니라, 다른 부류의 프로톡스 억제제에 대해서도 내성을 띠는 변경된 PPO 활성을 가지는 것으로 나타났다 (문헌 [Oshio et al. 1993. Z. Naturforsch. 48c: 339]; [Sato et al. 1994. In ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C.]). 돌연변이체 담배 세포주 또한 억제제 S-21432에 대해 내성을 띠는 것으로 보고되었다 (문헌 [Che et al. 1993. Z. Naturforsch. 48c: 350]). 클로닝된 식물 PPO의 제초제 내성을 확인하는 데 영양요구성 E. 콜라이 돌연변이체가 사용되어 왔다.
식물이 제초제에 대해 내성을 띠도록 만드는 데에는 3가지 주된 전략법, 즉, (1) 제초제, 또는 그의 활성 대사산물을 비독성 생성물로 형질전환시키는 효소, 예를 들어, 브로모크시닐에 대해 또는 바스타에 대한 내성을 위한 효소로 제초제를 해독시키거나 (EP242236, EP337899); (2) 표적 효소를, 제초제, 또는 그의 활성 대사산물에 대해 덜 감수성인 기능적 효소로, 예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 위한 효소로 돌연변이화시키거나 (EP293356, [Padgette S. R. et al., J.Biol. Chem., 266, 33, 1991]); 또는 (3) 해당 효소의 반응속도상수를 고려하여 제초제에 대해 충분한 정도의 양으로 표적 효소를 식물에서 생산하기 위해, 그의 억제제의 존재에도 불구하고 기능적 효소를 충분히 가지도록 하기 위해 감수성 효소를 과다발현시키는 접근법이 이용가능하다. 3번째 전략법은 PPO 억제제에 대해 내성을 띠는 식물을 성공적으로 수득하기 위한 것으로서 기술된 바 있다 (예컨대, US5,767,373 또는 US5,939,602, 및 그의 특허 계열의 구성원 참조). 추가로, US 2010/0100988 및 WO 2007/024739에는 아미노산 서열이 PPO 억제제 제초성 화학물질, 특히, PPO 돌연변이체에 대해 특이적인 3-페닐우라실 억제제에 대해 내성을 띠도록 하는 효소 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다.
현재까지는 선행 기술에서 하나 이상의 야생형 또는 돌연변이화된 PPO 핵산을 함유하는 벤족사지논-유도체 제초제 내성 식물이 기술된 바 없다. PPO 유전자의 유래된 된 게놈 이외의 게놈 상에 돌연변이를 포함하는 벤족사지논-유도체 제초제 내성 농작물 역시 선행 기술에서는 기술된 바 없다. 그러므로, 당업계에서는 추가의 게놈 및 종으로부터 벤족사지논-유도체 제초제 내성 유전자를 확인하는 것이 요구되고 있다. 당업계에서는 또한 제초제, 예컨대, 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성이 증가되고, 하나 이상의 야생형 및/또는 돌연변이화된 PPO 핵산을 함유하는 농작물 및 농작물도 요구되고 있다. 또한, 상기 농작물 또는 농작물 부근의 잡초 성장을 방제하는 방법도 요구되고 있다. 상기 조성물 및 방법을 통해 농작물 또는 농작물을 포함하는 구역에 제초제를 적용할 때, 스프레이 오버 기법을 사용할 수 있게 될 것이다.
발명의 개요
상기 문제는,
a) 야생형 프로토포피리노겐 옥시다제 (PPO), 또는 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 돌연변이화된 프로토포피리노겐 옥시다제 (mut-PPO)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 식물을 식물 재배지에 제공하는 단계,
b) 상기 지역에 유효량의 상기 제초제를 적용하는 단계를 포함하는, 식물 재배지에서 원치않는 식생을 방제하는 방법에 관한 것인 본 발명에 의해 해결된다.
추가로, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 야생형 또는 mut-PPO를 사용하여 벤족사지논-유도체 제초제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은
a) mut-PPO를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 세포 또는 식물을 생성하고, 여기서 mut-PPO가 발현되는 것인 단계;
b) 벤족사지논-유도체 제초제를 a)의 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 같은 품종의 대조군 세포 또는 식물에 적용하는 단계;
c) 상기 시험 화합물의 적용 후, 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 대조군 세포 또는 식물의 성장 또는 생존능을 측정하는 단계, 및
d) 트랜스제닉 세포 또는 식물의 성장과 비교하여 대조군 세포 또는 식물의 성장을 감소시키는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
또 다른 목적은
a) mut-PPO 코딩 핵산 라이브러리를 생성하는 단계,
b) 세포 또는 식물에서 상기 핵산을 각각 발현시키고, 상기 세포 또는 식물을 벤족사지논-유도체 제초제로 처리하여, 생성된 mut-PPO 코딩 핵산 집단을 스크리닝하는 단계,
c) 상기 mut-PPO 코딩 핵산 집단에 의해 제공되는 벤족사지논-유도체 제초제-내성 수준을 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 벤족사지논-유도체 제초제-내성 수준과 비교하는 단계,
d) 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 것과 비교하여, 벤족사지논-유도체에 대해 현저히 증가된 수준의 내성을 제공하는 하나 이상의 mut-PPO 코딩 핵산을 선별하는 단계를 포함하는, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 mut-PPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단계 d)에서 선별된 mut-PPO 코딩 핵산은 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 것과 비교하여, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 2배 이상만큼 더 큰 내성을 제공한다.
저항성 또는 내성은 단계 a)의 라이브러리의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생성하고, 상기 트랜스제닉 식물을 대조군 식물과 비교함으로써 측정될 수 있다.
또 다른 목적은
a) 식물 세포 또는 녹조류 배양물 중에서 유효량의 벤족사지논-유도체 제초제를 확인하는 단계,
b) 상기 식물 세포 또는 녹조류를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
c) 상기 돌연변이유발된 세포 집단을 a)에서 확인된 유효량의 벤족사지논-유도체 제초제와 접촉시키는 단계,
d) 상기 시험 조건에서 살아남은 하나 이상의 세포를 선별하는 단계,
e) 각각 d)에서 선별된 세포로부터의 PPO 유전자의 PCR 증폭 및 서열 분석을 수행하고, 상기 서열을 야생형 PPO 유전자 서열과 비교하는 단계를 포함하는, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 mut-PPO를 코딩하는 핵산을 함유하는 식물 또는 조류를 확인하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이유발제는 에틸메탄술포네이트이다.
또 다른 목적은 상기 정의된 방법에 의해 확인가능한 것인, mut-PPO를 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포에서 핵산의 발현을 통해 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성 또는 내성이 상기 식물 세포의 야생형 품종과 비교하여 증가된 것인, 야생형 또는 mut-PPO 핵산에 의해 형질전환된 식물 세포, 또는 야생형 또는 mut-PPO 핵산을 발현, 바람직하게는 과다발현하는 식물을 수득하도록 돌연변이화된 식물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포에서 핵산의 발현을 통해 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 식물의 저항성이 상기 식물의 야생형 품종과 비교하여 증가된 것인, 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 식물에 관한 것이다.
본 발명의 식물은 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물일 수 있다.
바람직하게, 식물에서 핵산의 발현을 통해 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 식물의 저항성이 상기 식물의 야생형 품종과 비교하여 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로서, 여기서 종자는 상기 종자의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성의 증가를 위한 순수 육종인 종자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포를 야생형 또는 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물 세포의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 트랜스제닉 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 식물 세포를 야생형 또는 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 식물 세포로부터 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 식물을 생성하는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 발현 카세트는 추가로 식물에서 기능성인 전사 개시 조절 영역 및 번역 개시 조절 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 선별가능한 마커로서 본 발명의 mut-PPO를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 a) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부는 이하 기술되는 본 발명의 mut-PPO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하며, 폴리펩티드는 선별 마커로서 사용되고, 상기 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부는 임의적으로 관심의 대상이 되는 추가의 단리된 핵산을 포함할 수 있는 것인 단계; b) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 하나 이상의 벤족사지논-유도체 억제 화합물과 접촉시키는 단계; c) 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부가 억제제 또는 억제 화합물에 의해 영향을 받는지 여부를 측정하는 단계; 및 d) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 확인 또는 선별하는 단계를 포함하는, 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 확인 또는 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 제초제 내성에 대한 추가 개선을 디자인하는 분자 모델링 연구에서 유용한, 본원에 기술된 돌연변이를 포함하는 정제된 mut-PPO 단백질로 구현된다. 단백질 정제 방법은 주지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Protein Biotechnology, Walsh and Headon (Wiley, 1994)]에 기술되어 있는 바와 같이, 특히 디자인된 방법 또는 상업적으로 이용가능한 제품을 이용하여 쉽게 달성될 수 있다.
도 1은 아마란투스 투베르쿨라투스(Amaranthus tuberculatus) (A. 투베르쿨라투스), 아마란투스 투베르쿨라투스 저항성 (A. 투베르쿨라투스_R), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 장쇄 (A. 탈리아나_2), 스피나시아 오레라세아(Spinacia oleracea) 단쇄 (S. 오레라세아_2), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 단쇄 (N. 타바쿰_2), 글리신 맥스(Glycine max) (글리신_맥스), 아라비돕시스 탈리아나 단쇄 (A. 탈리아나_1), 니코티아나 타바쿰 장쇄 (N. 타바쿰_1), 클라미도모나스 레인하드티이 장쇄 (C. 레인하드티이_1), 제아 메이스(Zea mays) (Z. 메이스), 오리자 사티바(Oryza sativa) (O. 사티바_1), 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) (S. 투베로숨), 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus) (C. 사티부스), 시코리움 인티부스(Cichorium intybus) (C. 인티부스_1), 스피나시아 오레라세아 장쇄 (S. 오레라세아_1), 폴리토멜라 종 프링스하임 198.80(Polytomella sp . Pringsheim 198.80) (폴리토멜라) PPO 서열의 아미노산 서열 정렬을 나타내는 것이다. 보존 영역은 옅은 회색, 회색 및 검은색으로 표시되어 있다.
도 2는 클라미도모나스 레인하드티이 계통의 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대한 저항성에 관한 선별을 보여주는 것이다. (A) 선별제를 함유하지 않는 고체 배지 상에 플레이팅된 돌연변이유발된 세포. (B) 1x10-7 M 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 고체 배지 상에 플레이팅된 돌연변이유발된 세포. 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성을 띠는 세포는 콜로니를 형성한 반면 (동그라미와 번호 33, 34, 35 및 36으로 표시), 감수성 세포는 성장하지 못하였다. B와 비교하여 플레이트 A 상에 더 많은 개수의 콜로니가 존재한다는 것은 플레이트 B 상의 콜로니가 벤족사지논-유도체 I.a.35에 대해 저항성을 띤다는 것을 나타내는 것이다.
도 3은 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대해 저항성을 띠는, 도 2에서 제시된 바와 같은 선별된 클라미도모나스 레인하드티이 계통의 재성장을 보여주는 것이다. (A) 선별제를 함유하지 않는 액체 배지 중의 야생형 세포. (B) 1x10-9-5x10-6 M로) 증가식으로 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 액체 배지 중의 야생형 세포. (C) 선별제를 함유하지 않는 액체 배지 중의 돌연변이유발된 세포. (D1, D2, E1, E2) (1x10-9-5x10-6 M로) 증가식으로 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 액체 배지 중의 돌연변이유발된 및 선별된 계통. 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대해 저항성을 띠는 계통은 배양을 통해 더 진한 색상을 띠게 되었는데, 이는 성장되었음을 표시하는 것이다. 감수성 계통은 배양되지 못했고, 옅은 색상 그대로 유지되었다. 세포가 성장함에 따라 액체 배지 중 세포가 고밀도화되는 것이 더 진한 색상을 띠는 것의 원인이 되었다. 보다 낮은 저밀도 배양물은 더 옅게 보이거나, 완전히 투명하게 보였다.
서열 목록
<표 1>
Figure 112013063433423-pct00001

Figure 112013063433423-pct00002
"하나"라는 것 (관사 "a" 및 "an")은 1개의 또는 1개를 초과하는 (즉, 하나 이상의) (관사의) 문법적인 대상을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 일례로, "한 요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "포함하는," 또는 파생어, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"이라는 단어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은
a) 야생형 프로토포피리노겐 옥시다제 (PPO), 또는 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 돌연변이화된 프로토포피리노겐 옥시다제 (mut-PPO)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 식물을 식물 재배지에 제공하는 단계,
b) 상기 지역에 유효량의 상기 제초제를 적용하는 단계를 포함하는, 식물 재배지에서 원치않는 식생을 방제하는 방법에 관한 것이다.
"원치않는 식생의 방제"라는 용어는 잡초를 사멸시키고거나, 다르게는 잡초의 정상적인 성장을 지연시키거나 억제시킨다는 의미로서 이해하여야 한다. 가장 광범위한 의미에서, 잡초는 원치않는 것이 해당 위치에서 성장하는 것인 모든 식물을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 잡초로는 예를 들어, 쌍자엽 및 단자엽 잡초를 포함한다. 쌍자엽 잡초로는 시나피스(Sinapis), 레피디움(Lepidium), 갈륨(Galium), 이포모에아(Ipomoea), 폴리고눔(Polygonum), 세스바니아(Sesbania), 암브로시아(Ambrosia), 시르시움(Cirsium), 카르두우스(Carduus), 손추스(Sonchus), 솔라눔(Solanum), 로리파(Rorippa), 로탈라(Rotala), 린데르니아(Lindernia), 라미움(Lamium), 베로니카(Veronica), 아부틸론(Abutilon), 에멕스(Emex), 마투라(Datura), 비올라(Viola), 갈레오프시스(Galeopsis), 파파베르(Papaver), 센타우레아(Centaurea), 트리폴리움(Trifolium), 라눈쿨루스(Ranunculus) 및 타락사쿰(Taraxacum) 속의 잡초를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단자엽 잡초로는 에치노클로아(Echinochloa), 세타리아(Setaria), 파니쿰(Panicum), 디기타리아(Digitaria), 플레움(Phleum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 엘레우신(Eleusine), 브라키아리아(Brachiaria), 롤리움(Lolium), 브로무스(Bromus), 아베나(Avena), 시페루스(Cyperus), 소르굼(Sorghum), 아그로피론(Agropyron), 시노돈(Cynodon), 모노초리아(Monochoria), 핌브리스티슬리스(Fimbristyslis), 사기타리아(Sagittaria), 엘레오카리스(Eleocharis), 스키르푸스(Scirpus), 파스팔룸(Paspalum), 이스카에뭄(Ischaemum), 스페노클레아(Sphenoclea), 닥틸로크테니움(Dactyloctenium), 아그로스티스(Agrostis), 알로페쿠루스(Alopecurus) 및 아페라(Apera) 속의 잡초를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 본 발명의 잡초로는 예를 들어, 원치않는 위치에서 성장하고 있는 농작물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지배적으로는 대두를 포함하는 밭에서 자발(volunteer) 옥수수 식물은, 옥수수 식물이 대두 식물 밭에서 원치않는 것일 경우, 잡초인 것으로 간주될 수 있다.
"식물"이라는 용어는 유기 물질과 관련되는 바, 가장 광범위한 의미로 사용되며, 식물계의 구성원이 진핵 유기체를 포함하는 것으로 하면, 그의 예로는 관다발 식물, 채소류, 곡물, 꽃, 교목, 허브, 관목, 풀, 덩굴 식물, 양치 식물, 선류, 진균 및 조류 등 뿐만 아니라, 무성 번식에 사용되는 식물의 클론, 자손, 및 일부 (예컨대, 꺾꽂이 순, 파이핑, 새싹, 근경, 지하경, 덤불, 근두, 구근, 구경, 괴경, 근경, 조직 배양물에서 제조된 식물/조직 등)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "식물"이라는 용어는 추가로 전체 식물, 식물의 조상 및 자손, 및 종자, 새싹, 줄기, 잎, 뿌리 (괴경 포함), 꽃, 낱꽃, 과실, 작은 꽃자루, 화경, 수술, 꽃밥, 암술머리, 암술대, 씨방, 꽃잎, 꽃받침, 심피, 근단, 근관, 근모, 엽모, 종자모, 화분립, 소포자, 자엽, 배축, 상배축, 물관부, 체관부, 연조직, 배젖, 동반 세포, 공변 세포, 및 식물의 임의의 다른 공지된 기관, 조직 및 세포, 및 조직 및 기관 (상기 언급된 것들은 각각 관심의 대상이 되는 유전자/핵산을 포함한다)을 비롯한 식물의 일부를 포함한다. "식물"이라는 용어는 또한 식물 세포, 현탁 배양물, 캘러스 조직, 배아, 분열 조직부, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자를 포함하고, 추가로, 상기 언급된 것들은 각각 관심의 대상이 되는 유전자/핵산을 포함한다.
본 발명의 방법에서 특히 유용한 식물은 녹색 식물(Viridiplantae) 상과에 속하는 모든 식물, 특히, 그 중에서도 아세르 아종(Acer spp .), 악티니디아 아종(Actinidia spp.), 아벨모스쿠스 아종(Abelmoschus spp .), 아가베 사이잘라나(Agave sisalana), 아그로피론 아종(Agropyron spp .), 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 알리움 아종(Allium spp .), 아마란투스 아종, 암포필라 아레나리아(Ammophila arenaria), 아나나스 코모수스(Ananas comosus), 안노나 아종(Annona spp .), 아피움 그라베올렌스(Apium graveolens), 아라키스(Arachis spp.), 아르토카르푸스 아종(Artocarpus spp.), 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 아베나 아종(Avena spp.) (예컨대, 아베나 사티바(Avena sativa), 아베나 파투아(Avena fatua), 아베나 비잔티나(Avena byzantina), 아베나 파투아 변종 사티바(Avena fatua var . sativa), 아베나 하이브리다(Avena hybrida)), 아베르호마 카람볼라(Averrhoa carambola), 밤부사 종(Bambusa sp .), 베닌카사 히스피다(Benincasa hispida), 베르톨레시아 엑셀사(Bertholletia excelsa), 베타 불가리스(Beta vulgaris), 브라시카 아종(Brassica spp.) (예컨대, 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파 아종(Brassica rapa ssp .) [카놀라, 평지, 순무 평지]), 카다바 파리노사(Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 칸나 인디카(Canna indica), 칸나비스 사티바(Cannabis sativa), 캡시쿰 아종(Capsicum spp.), 카렉스 엘라타(Carex elata), 카리카 파파야(Carica papaya), 카리싸 마크로카르파(Carissa macrocarpa), 카르야 아종(Carya ssp .), 카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius), 카스타네아 아종(Castanea spp.), 세이바 펜탄드라(Ceiba pentandra), 키코리움 엔디비아(Cichorium endivia), 신나모뭄 아종(Cinnamomum spp.), 시트럴러스 라나투스(Citrullus lanatus), 시트러스 아종(Citrus spp.), 코코스 아종(Cocos spp.), 코페아 아종(Coffea spp.), 콜로카시아 에스쿨렌타(Colocasia esculenta), 콜라 아종(Cola spp.), 코르코루스 종(Corchorus sp .), 코리안드럼 사티붐(Coriandrum sativum), 코릴루스 아종(Corylus spp.), 크라타에구스 아종(Crataegus spp .), 크로쿠스 사티부스(Crocus sativus), 쿠쿠르비타 아종(Cucurbita spp .), 쿠쿠미스 아종(Cucumis spp .), 키나라 아종(Cynara spp .), 다우쿠스 카로타(Daucus carota), 데스모디움 아종(Desmodium spp .), 디모카르푸스 론간(Dimocarpus longan), 디오스코레아 아종(Dioscorea spp .), 디오스피로스 아종(Diospyros spp .), 에키노콜라 아종(Echinochloa spp .), 엘라에이스(Elaeis) (예컨대, 엘라에이스 귀네엔시스(Elaeis guineensis), 엘라에이스 올레이페라(Elaeis oleifera), 엘레우신 코라카나(Eleusine coracana), 에라그로스티스 테프(Eragrostis tef), 에리안투스 종(Erianthus sp .), 에리오보트리야 자포니카(Eriobotrya japonica), 유칼립투스 종(Eucalyptus sp .), 유제니아 우니플로라(Eugenia uniflora), 파고피룸 아종(Fagopyrum spp .), 파구스 아종(Fagus spp .), 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea), 피쿠스 카리카(Ficus carica), 포르투넬라 아종(Fortunella spp .), 프라가리아 아종(Fragaria spp .), 징코 빌로바(Ginkgo biloba), 글리신 아종 (예컨대, 글리신 맥스, 소자 히스피다(Soja hispida) 또는 소자 맥스(Soja max)), 고시피움 힐수툼(Gossypium hirsutum), 헬리안투스 아종(Helianthus spp .) (예컨대, 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus), 헤메로칼리스 풀바(Hemerocallis fulva), 히비스쿠스 아종(Hibiscus spp .), 호르데움 아종(Hordeum spp .) (예컨대, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas), 주글란스 아종(Juglans spp .), 락투카 사티바(Lactuca sativa), 라티루스 아종(Lathyrus spp .), 렌스 쿨리나리스(Lens culinaris), 리눔 우시타시뭄(Linum usitatissimum), 리치 치넨시스(Litchi chinensis), 로투스 아종(Lotus spp .), 루프 아쿠탄굴라(Luffa acutangula), 루피누스 아종(Lupinus spp .), 루줄라 실바티카(Luzula sylvatica), 리코페르시콘 아종(Lycopersicon spp .) (예컨대, 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum), 리코페르시콘 리코페르시쿰(Lycopersicon lycopersicum), 리코페르시콘 피리포르메(Lycopersicon pyriforme)), 마크로틸로마 아종(Macrotyloma spp .), 말루스 아종(Malus spp .), 말피기아 에마르기나타(Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나(Mammea americana), 만기페라 인디카(Mangifera indica), 마니호트 아종(Manihot spp .), 마닐카라 자포타(Manilkara zapota), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 멜리로투스 아종(Melilotus spp .), 멘타 아종(Mentha spp .), 미스칸투스 시넨시스(Miscanthus sinensis), 모모르디카 아종(Momordica spp .), 모루스 니그라(Morus nigra), 무사 아종(Musa spp .), 니코티아나 아종, 올레아 아종(Olea spp .), 오푼티아 아종(Opuntia spp .), 또는 니토푸스 아종(nithopus spp .), 오리자 아종 (예컨대, 오리자 사티바, 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)), 파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스(Passiflora edulis), 파스티나카 사티바(Pastinaca sativa), 펜니세툼 종(Pennisetum sp .), 페르세아 아종(Persea spp .), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 팔라리스 아룬디나세아(Phalaris arundinacea), 파세오루스 아종(Phaseolus spp .), 플레움 프라텐세(Phleum pratense), 포에닉스 아종(Phoenix spp .), 프라그니테스 오스트랄리스(Phragmites australis), 피살리스 아종(Physalis spp .), 피누스 아종(Pinus spp .), 피스타시아 베라(Pistacia vera), 피숨 아종(Pisum spp .), 포아 아종(Poa spp .), 포풀루스 아종(Populus spp .), 프로소피스 아종(Prosopis spp .), 프루누스 아종(Prunus spp .), 프시디움 아종(Psidium spp .), 푸니카 그라나툼(Punica granatum), 피루스 콤무니스(Pyrus communis), 쿠에르쿠스 아종(Quercus spp.), 라파누스 사티부스(Raphanus sativus), 레움 라바르바룸(Rheum rhabarbarum), 리베스 아종(Ribes spp .), 리시누스 콤무니스(Ricinus communis), 루부스 아종(Rubus spp .), 사카룸 아종(Saccharum spp .), 살릭스 종(Salix sp .), 삼부쿠스아중(Sambucus spp .), 세카레 세레알레(Secale cereale), 세사뭄 아종(Sesamum spp.), 시나피스 아종, 솔라눔 아종 (예컨대, 솔라눔 투베로숨, 솔라눔 인테그리폴리움(Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)), 소르굼 비콜라(Sorghum bicolor), 스피나시아 아종, 시지기움 아종(Syzygium spp .), 타게테스 아종(Tagetes spp .), 타마린두스 인디카(Tamarindus indica), 테오브로마 카카오(Theobroma cacao), 트리폴리움 아종(Trifolium spp .), 트립사쿰 닥틸로이데스(Tripsacum dactyloides), 트리티코세카레 림파우이(Triticosecale rimpaui), 트리티쿰 아종 (예컨대, 트리티쿰 에스티붐(Triticum aestivum), 트리티쿰 두룸(Triticum durum), 트리티쿰 투르기둠(Triticum turgidum), 트리티쿰 히베르눔(Triticum hybernum), 트리티쿰 마차(Triticum macha), 트리티쿰 사티붐(Triticum sativum), 트리티쿰 모노콕쿰(Triticum monococcum) 또는 트리티쿰 불가레(Triticum vulgare)), 트로패올룸 미누스(Tropaeolum minus), 트로패올룸 마주스(Tropaeolum majus), 바키니움 아종( Vaccinium spp .), 비시아 아종(Vicia spp .), 비그나 아종(Vigna spp .), 비올라 오도라타(Viola odorata), 비티스 아종(Vitis spp.), 제아 메이스, 지자니아 팔루스트리스(Zizania palustris), 지지푸스 아종(Ziziphus spp .), 아마란스, 아티초크, 아스파라거스, 브로콜리, 브르셀 스프라우트, 양배추, 카놀라, 당근, 콜리플라워, 체리, 콜라드 그린즈, 아마, 케일, 편두, 평지, 오크라, 양파, 감자, 벼, 대두, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 토마토, 호박, 차 및 조류을 포함하는 목록으로부터 선택되는 먹이 또는 사료 콩과 식물, 관상용 식물, 식용 작물, 교목 또는 관목을 비롯한, 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 식물은 농작물이다. 농작물의 예로는 특히 대두, 해바라기, 카놀라, 알팔파, 평지씨, 목화, 토마토, 감자 또는 담배를 포함한다. 추가로 바람직하게, 식물은 단자엽 식물, 예컨대, 사탕수수이다. 추가로 바람직하게, 식물은 실리얼, 예컨대, 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 수수 또는 귀리이다.
바람직한 실시양태에서, 식물은 앞서 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 야생형 또는 mut-PPO 트랜스진을 도입하고, 이를 과다발현함으로써 식물을 재조합적으로 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되었다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 식물은 앞서 계내에서 식물 세포를 돌연변이유발하여 mut-PPO를 발현하는 식물 세포를 수득하는 방법에 의해 제조되었다.
본원에 개시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 핵산은 그의 게놈 내에 제초제-내성 야생형 또는 mut-PPO 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 제초제 내성을 증가시키는 데 있어서 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 상기 유전자는 하기 기술되는 바와 같이, 내인성 유전자 또는 트랜스진일 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 원하는 표현형을 가지는 식물을 생성하기 위해 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 조합으로 적층될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 예를 들어, (미국 특허 번호 제5,366,892호; 제5,747,450호; 제5,737,514호; 제5,723,756호; 제5,593,881호; 및 문헌 [Geiser et al (1986) Gene 48: 109]에 기술되어 있는 바와 같은) 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소 단백질과 같이, 살충 및/또는 곤충살충 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 다른 폴리뉴클레오티드로 적층될 수 있다. 생성된 조합물은 또한 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 다중 카피를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 식물은 예를 들어, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT), 시토크롬 P450, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT), 아세토히드록시산 신타제 (AHAS; EC 4.1.3.18, 이는 또한 아세토락테이트 신타제 또는 ALS로도 알려져 있다), 히드록시페닐 피루베이트 디옥시게나제 (HPPD), WO 02/068607에 개시되어 있는 피토엔 데세츄라제 (PD) 및 디캄바 분해 효소, 또는 WO 2008141154 또는 WO 2005107437에 개시되어 있는 페녹시아세트산- 및 페녹시프로피온산-유도체 분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 제초제 내성 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 포함한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 바, "제초제"라는 용어는 식물을 사멸시키거나, 방제하거나, 또는 다르게는 그의 성장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 의미한다. 제초제의 바람직한 양 또는 농도는 "유효량" 또는 "유효 농도"이다. "유효량" 및 "유효 농도"란, 각각 유사한 야생형, 식물, 식물 조직, 식물 세포를 사멸시키거나, 그의 성장을 억제시키기에는 충분하지만, 상기 양이 본 발명의 제초제-저항성 식물, 식물 조직, 식물 세포, 및 숙주 세포를 심하게 사멸시키거나, 그의 성장을 억제시키기지는 않는 것인 양 및 농도인 것으로 한다. 전형적으로, 제초제의 유효량은 농업 생산 시스템에서 관심의 대상이 되는 잡초를 사멸시키기 위해 통상적으로 사용되는 양이다. 상기 양은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 제초성 활성은 본 발명의 벤족사지논-유도체 제초제가 임의의 성장 단계에, 또는 식목 또는 발아 이전에 식물에 또는 식물이 있는 장소에 직접 적용되었을 때에 그에 의해 나타난다. 관찰되는 효과는 방제하고자 하는 식물 종, 식물 성장 단계, 희석 및 분무 액적 크기에 관한 적용 파라미터, 고체 성분의 입자 크기, 사용 시점의 환경 조건, 사용되는 구체적이 화합물, 사용되는 구체적인 아주반트 및 담체, 토양 유형 등 뿐만 아니라, 적용되는 화학물질의 양에 따라 달라진다. 상기 및 다른 인자들은 비선택적 또는 선택적인 제초성 작용을 촉진시키기 위하여 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 조정될 수 있다. 일반적으로, 잡초를 최대로 방제하기 위해서는 벤족사지논-유도체 제초제를 발아 후에 상대적으로 미성숙한 원치않는 식생에 적용하는 것이 바람직하다.
"제초제-내성" 또는 "제초제-저항성" 식물이란, 정상 또는 야생형 식물을 정상적으로 사멸시키거나, 그의 성장을 정상적으로 억제시키는 수준의 하나 이상의 제초제에 대해 내성 또는 저항성을 띠는 식물인 것으로 한다. "제초제-내성 mut-PPO 단백질" 또는 "제초제-저항성 mut-PPO 단백질"이란, PPO 활성을 방해하는 것으로 알려져 있는 하나 이상의 제초제가 야생형 mut-PPO 단백질의 PPO 활성을 억제시키는 것으로 알려져 있는 농도 또는 수준으로 존재할 때, 상기와 같은 mut-PPO 단백질이 야생형 mut-PPO 단백질의 PPO 활성에 비하여 더 높은 PPO 활성을 보인다는 것으로 한다. 추가로, 상기 제초제-내성 또는 제초제-저항성 mut-PPO 단백질의 PPO 활성은 본원에서 "제초제-내성" 또는 "제초제-저항성" PPO 활성인 것으로 언급될 수 있다.
본 발명의 "벤족사지논-유도체 제초제"는 하기 도시된 화학식 I의 벤족사지논을 포함한다:
<화학식 I>
Figure 112013063433423-pct00003
상기 식에서,
R1은 수소 또는 할로겐이고;
R2는 할로겐이고;
R3은 수소 또는 할로겐이고;
R4는 수소, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-할로알케닐, C3-C6-알키닐, C3-C6-할로알키닐, C1-C6-알콕시 또는 C3-C6-시클로알킬-C1-C6-알킬이고;
R5는 수소, NH2, C1-C6-알킬 또는 C3-C6-알키닐이고;
R6은 수소 또는 C1-C6-알킬이고;
W는 O 또는 S이고;
Z는 O 또는 S이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 "벤족사지논-유도체 제초제"는 하기 도시된 화학식 I의 벤족사지논:
A) 하기 화학식 I의 하나 이상의 벤족사지논:
<화학식 I>
Figure 112013063433423-pct00004
(상기 식에서,
R1은 수소 또는 할로겐이고;
R2는 할로겐이고;
R3은 수소 또는 할로겐이고;
R4는 수소, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-할로알케닐, C3-C6-알키닐, C3-C6-할로알키닐, C1-C6-알콕시 또는 C3-C6-시클로알킬-C1-C6-알킬이고;
R5는 수소, NH2, C1-C6-알킬 또는 C3-C6-알키닐이고;
R6은 수소 또는 C1-C6-알킬이고;
X는 O 또는 S이고;
Y는 O 또는 S이다); 및
B) b1) 내지 b15) 부류의 제초제:
b1) 지질 생합성 억제제;
b2) 아세토락테이트 신타제 억제제 (ALS 억제제);
b3) 광합성 억제제;
b4) 프로토포피리노겐-IX 옥시다제 억제제,
b5) 표백제 제초제;
b6) 에놀피루빌 시키메이트 3-포스페이트 신타제 억제제 (EPSP 억제제);
b7) 글루타민 신테타제 억제제;
b8) 7,8-디히드로프테로에이트 신타제 억제제 (DHP 억제제);
b9) 유사분열 억제제;
b10) 초장쇄 지방산의 합성의 억제제 (VLCFA 억제제);
b11) 셀룰로스 생합성 억제제;
b12) 디커플러 제초제;
b13) 옥신 제초제;
b14) 옥신 수송 억제제; 및
b15) 브로모부티드, 클로르플루레놀, 클로르플루레놀-메틸, 신메틸린, 쿠밀루론, 달라폰, 다조메트, 디펜조쿠아트, 디펜조쿠아트-메틸술페이트, 디메티핀, DSMA, 딤론, 엔도탈 및 그의 염, 에토벤자니드, 플람프로프, 플람프로프-이소프로필, 플람프로프-메틸, 플람프로프-M-이소프로필, 플람프로프-M-메틸, 플루레놀, 플루레놀-부틸, 플루르프리미돌, 포사민, 포사민-암모늄, 인다노판, 인다지플람, 말레산 히드라지드, 메플루이디드, 메탐, 메틸 아지드, 메틸 브로마이드, 메틸-딤론, 메틸 요오다이드, MSMA, 올레산, 옥사지클로메폰, 펠라르곤산, 피리부티카르브, 퀴노클라민, 트리아지플람, 트리디판 및 6-클로로-3-(2-시클로프로필-6-메틸페녹시)-4-피리다지놀 (CAS 499223-49-3) 및 그의 염 및 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 제초제; 및
C) 독성완화제로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 활성 화합물을 포함한다.
본 발명에 유용한 벤족사지논-유도체 제초제는 또한 하나 이상의 화학식 I의 벤족사지논 및 상기 정의된 바와 같은 제초제 B 및 독성완화제 C로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 화합물을 포함하는 제초 유효량의 활성 화합물 조합물, 및 또한 하나 이상의 액체 및/또는 고체 담체, 및/또는 하나 이상의 계면활성제, 및 원하는 경우, 작물 보호용 조성물에 통상 사용되는 하나 이상의 추가의 보조제를 포함하는 제초 활성 작물 보호용 조성물 형태의 조성물일 수 있다.
추가로, 본 발명에 유용한 벤족사지논-유도체 제초제는 또한 하나 이상의 화학식 I의 벤족사지논 및 제초제 B 및 독성완화제 C로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 활성 화합물을 포함하는 활성 화합물 조합물, 및 하나 이상의 고체 또는 액체 담체, 및/또는 하나 이상의 계면활성제, 및 원하는 경우, 작물 보호용 조성물에 통상 사용되는 하나 이상의 추가의 보조제를 포함하는 1-성분 조성물로서 제제화된 작물 보호용 조성물 형태의 조성물일 수 있다.
추가로, 본 발명에 유용한 벤족사지논-유도체 제초제는 또한 하나 이상의 화학식 I의 벤족사지논, 고체 또는 액체 담체, 및/또는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 제1 성분, 및 제초제 B 및 독성완화제 C로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 활성 화합물, 고체 또는 액체 담체, 및/또는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 제2 성분를 포함하며, 여기서 추가로 상기 두 성분은 모두 추가로 작물 보호용 조성물에 통상 사용되는 하나 이상의 추가의 보조제 또한 포함할 수 있는 것인, 2-성분 조성물로서 제제화된 작물 보호용 조성물 형태의 조성물일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 화학식 I의 벤족사지논이 예를 들어, E/Z 이성질체와 같은 기하 이성질체를 형성할 수 있다면, 본 발명에 따른 조성물에 순수한 이성질체 및 그의 혼합물, 둘 모두를 사용할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 화학식 I의 벤족사지논이 하나 이상의 키랄 중심을 가지고, 결과적으로, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 경우, 본 발명에 따른 조성물에 순수한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체, 및 그의 혼합물, 둘 모두를 사용할 수 있다.
변수 R1 내지 R6의 정의에서 언급되는 유기 모이어티는 예컨대, 할로겐이라는 용어처럼, 개별 군 구성원의 개별적인 열거에 대한 집합적 용어이다. 할로겐이라는 용어는 각각의 경우에, 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘를 의미한다. 모든 탄화수소 쇄, 즉, 모든 알킬은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 접두사 Cn-Cm은 각각의 경우에, 상기 기 내에 존재하는 탄소 원자의 가능한 개수를 나타내는 것이다.
상기 의미의 예로는 하기의 것들이 있다:
- C1-C4-알킬, 및 또한 C3-C6-시클로알킬-C1-C4-알킬의 C1-C4-알킬 모이어티: 예를 들어, CH3, C2H5, n-프로필, 및 CH(CH3)2 n-부틸, CH(CH3)-C2H5, CH2-CH(CH3)2 및 C(CH3)3;
- C1-C6-알킬 및 또한 C1-C6-알콕시-C1-C6-알킬의 C1-C6-알킬 모이어티: 상기 언급된 C1-C4-알킬, 및 또한 예를 들어, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, n-헥실, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸-1-메틸프로필 또는 1-에틸-2-메틸프로필, 바람직하게, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸, n-부틸, 1,1-디메틸에틸, n-펜틸 또는 n-헥실;
- C1-C4-할로알킬: 플루오린, 염소, 브로민 및/또는 아이오딘에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환된, 상기 언급된 C1-C4-알킬 라디칼, 예를 들어, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로-플루오로메틸, 디클로로플루오로메틸, 클로로디플루오로메틸, 브로모메틸, 요오도메틸, 2-플루오로에틸, 2-클로로에틸, 2-브로모에틸, 2-요오도에틸, 2,2-디플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 2-클로로-2-플루오로에틸, 2-클로로-2,2-디플루오로에틸, 2,2-디클로로-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 펜타플루오로에틸, 2-플루오로프로필, 3-플루오로프로필, 2,2-디플루오로프로필, 2,3-디플루오로프로필, 2-클로로프로필, 3-클로로프로필, 2,3-디클로로프로필, 2-브로모프로필, 3-브로모프로필, 3,3,3-트리플루오로프로필, 3,3,3-트리클로로프로필, 2,2,3,3,3-펜타플루오로프로필, 헵타플루오로프로필, 상기 언급된 C1-C3-할로알킬 라디칼, 및 또한 예를 들어, 1-(플루오로메틸)-2-플루오로에틸, 1-(클로로메틸)-2-클로로에틸, 1-(브로모메틸)-2-브로모에틸, 4-플루오로부틸, 4-클로로부틸, 4-브로모부틸, 노나-플루오로부틸, 1,1,2,2,-테트라플루오로에틸 및 1-트리플루오로메틸-1,2,2,2-테트라플루오로에틸;
- C1-C6-할로알킬: 상기 언급된 C1-C4-할로알킬, 및 또한 예를 들어, 5-플루오로펜틸, 5-클로로펜틸, 5-브로모펜틸, 5-요오도펜틸, 운데카플루오로펜틸, 6-플루오로헥실, 6-클로로헥실, 6-브로모헥실, 6-요오도헥실 및 도데카플루오로헥실;
- C3-C6-시클로알킬 및 또한 C3-C6-시클로알킬-C1-C4-알킬의 시클로알킬 모이어티; 3 내지 6개의 고리 구성원을 가지는 모노시클릭 포화 탄화수소, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실;
- C3-C6-알케닐: 예를 들어, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-메틸에테닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-메틸-1-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-메틸-2-프로페닐, 2-메틸-2-프로페닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-메틸-1-부테닐, 2-메틸-1-부테닐, 3-메틸-1-부테닐, 1-메틸-2-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-메틸-3-부테닐, 2-메틸-3-부테닐, 3-메틸-3-부테닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 1,2-디메틸-1-프로페닐, 1,2-디메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-프로페닐, 1-에틸-2-프로페닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 1-메틸-1-펜테닐, 2-메틸-1-펜테닐, 3-메틸-1-펜테닐, 4-메틸-1-펜테닐, 1-메틸-2-펜테닐, 2-메틸-2-펜테닐, 3-메틸-2-펜테닐, 4-메틸-2-펜테닐, 1-메틸-3-펜테닐, 2-메틸-3-펜테닐, 3-메틸-3-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-메틸-4-펜테닐, 2-메틸-4-펜테닐, 3-메틸-4-펜테닐, 4-메틸-4-펜테닐, 1,1-디메틸-2-부테닐, 1,1-디메틸-3-부테닐, 1,2-디메틸-1-부테닐, 1,2-디메틸-2-부테닐, 1,2-디메틸-3-부테닐, 1,3-디메틸-1-부테닐, 1,3-디메틸-2-부테닐, 1,3-디메틸-3-부테닐, 2,2-디메틸-3-부테닐, 2,3-디메틸-1-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-3-부테닐, 3,3-디메틸-1-부테닐, 3,3-디메틸-2-부테닐, 1-에틸-1-부테닐, 1-에틸-2-부테닐, 1-에틸-3-부테닐, 2-에틸-1-부테닐, 2-에틸-2-부테닐, 2-에틸-3-부테닐, 1,1,2-트리메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-메틸-2-프로페닐, 1-에틸-2-메틸-1-프로페닐 및 1-에틸-2-메틸-2-프로페닐;
- C3-C6-할로알케닐: 플루오린, 염소, 브로민 및/또는 아이오딘에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환된, 상기 언급된 C3-C6-알케닐 라디칼, 예를 들어, 2-클로로-프로프-2-엔-1-일, 3-클로로프로프-2-엔-1-일, 2,3-디클로로프로프-2-엔-1-일, 3,3-디클로로프로프-2-엔-1-일, 2,3,3-트리클로로-2-엔-1-일, 2,3-디클로로부트-2-엔-1-일, 2-브로모프로프-2-엔-1-일, 3-브로모프로프-2-엔-1-일, 2,3-디브로모프로프-2-엔-1-일, 3,3-디브로모프로프-2-엔-1-일, 2,3,3-트리브로모-2-엔-1-일 또는 2,3-디브로모부트-2-엔-1-일;
- C3-C6-알키닐: 예를 들어, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 1-메틸-2-프로피닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 1-메틸-2-부티닐, 1-메틸-3-부티닐, 2-메틸-3-부티닐, 3-메틸-1-부티닐, 1,1-디메틸-2-프로피닐, 1-에틸-2-프로피닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐, 5-헥시닐, 1-메틸-2-펜티닐, 1-메틸-3-펜티닐, 1-메틸-4-펜티닐, 2-메틸-3-펜티닐, 2-메틸-4-펜티닐, 3-메틸-1-펜티닐, 3-메틸-4-펜티닐, 4-메틸-1-펜티닐, 4-메틸-2-펜티닐, 1,1-디메틸-2-부티닐, 1,1-디메틸-3-부티닐, 1,2-디메틸-3-부티닐, 2,2-디메틸-3-부티닐, 3,3-디메틸-1-부티닐, 1-에틸-2-부티닐, 1-에틸-3-부티닐, 2-에틸-3-부티닐 및 1-에틸-1-메틸-2-프로피닐;
- C3-C6-할로알키닐: 플루오린, 염소, 브로민 및/또는 아이오딘에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환된, 상기 언급된 C3-C6-알키닐 라디칼, 예를 들어, 1,1-디플루오로프로프-2-인-1-일, 3-클로로프로프-2-인-1-일, 3-브로모프로프-2-인-1-일, 3-요오도프로프-2-인-1-일, 4-플루오로부트-2-인-1-일, 4-클로로부트-2-인-1-일, 1,1-디플루오로부트-2-인-1-일, 4-요오도부트-3-인-1-일, 5-플루오로펜트-3-인-1-일, 5-요오도펜트-4-인-1-일, 6-플루오로헥스-4-인-1-일 또는 6-요오도헥스-5-인-1-일;
- C1-C4-알콕시 및 또한 히드록시카르보닐-C1-C4-알콕시, C1-C6-알콕시카르보닐-C1-C4-알콕시의 C1-C4-알콕시 모이어티: 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 1-메틸에톡시 부톡시, 1-메틸프로폭시, 2-메틸프로폭시 및 1,1-디메틸에톡시;
- C1-C6-알콕시 및 또한 C1-C6-알콕시카르보닐-C1-C4-알콕시의 C1-C6-알콕시 모이어티: 상기 언급된 C1-C4-알콕시, 및 또한 예를 들어, 펜톡시, 1-메틸부톡시, 2-메틸부톡시, 3-메톡실부톡시, 1,1-디메틸프로폭시, 1,2-디메틸프로폭시, 2,2-디메틸프로폭시, 1-에틸프로폭시, 헥속시, 1-메틸펜톡시, 2-메틸펜톡시, 3-메틸펜톡시, 4-메틸펜톡시, 1,1-디메틸부톡시, 1,2-디메틸부톡시, 1,3-디메틸부톡시, 2,2-디메틸부톡시, 2,3-디메틸부톡시, 3,3-디메틸부톡시, 1-에틸 부톡시, 2-에틸부톡시, 1,1,2-트리메틸프로폭시, 1,2,2-트리메틸 프로폭시, 1-에틸-1-메틸프로폭시 및 1-에틸-2-메틸프로폭시.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 변수가 서로 독립적으로, 또는 서로 조합하여 하기의 의미를 가지는 것인 화학식 I의 벤족사지논-유도체 또한 바람직하다:
R1은 수소이고;
R1은 또한 바람직하게, 할로겐, 특히 바람직하게, F 또는 Cl, 특히 바람직하게, F이고;
R2는 F이고;
R3은 수소 또는 F, 바람직하게, 수소이고;
R3은 또한 바람직하게, F이고;
R4는 C3-C6-알키닐 또는 C3-C6-할로알키닐, 바람직하게, C3-알키닐 또는 C3-할로알키닐, 특히 바람직하게, CH2C≡CH, CH2C≡CCl 또는 CH2C≡CBr이고;
R4는 또한 바람직하게, C3-C6-알키닐 또는 C3-C6-시클로알킬-C1-C6-알킬, 특히 바람직하게, 프로파르길 또는 시클로프로필메틸이고;
R4는 또한 바람직하게, C3-C6-알키닐, 바람직하게, C3-알키닐; 특히 바람직하게, CH2C≡CH이고;
R4는 또한 바람직하게, C3-C6-할로알키닐, 바람직하게, C3-할로알키닐, 특히 바람직하게, CH2C≡CCl 또는 CH2C≡CBr이고;
R5는 NH2, C1-C6-알킬 또는 C3-C6-알키닐; 바람직하게, C1-C6-알킬이고; 더욱 바람직하게, C1-C4-알킬; 가장 바람직하게, CH3이고;
R6은 C1-C6-알킬; 바람직하게, C1-C4-알킬; 가장 바람직하게, CH3이고;
W는 O이고;
W는 또한 바람직하게, S이고;
Z는 O이고;
Z는 또한 바람직하게, S이다.
(R2가 F이고, R5 및 R6이 CH3이고, W가 O이고, Z가 S인 화학식 I에 상응하는) 하기 화학식 I.a의 벤족사지논이 특히 바람직하다:
<화학식 I.a>
Figure 112013063433423-pct00005
상기 식에서, 변수 R1, R3, 및 R4는 상기 정의된 것과 같은 의미, 특히 바람직한 의미를 가진다.
하기 열거된 하기 표 A의 화학식 I.a.1 내지 I.a.48의 벤족사지논-유도체가 가장 바람직하며, 여기서 변수 R1, R3, 및 R4는 함께 표 A의 한 줄로 제시된 의미를 가지고 (벤족사지논 I.a.1 내지 I.a.54); 여기서, 변수 R1, R2, R3, 및 R4는 서로 조합으로도, 그 뿐만 아니라, 각각의 경우에 단독으로도 본 발명에 따른 화합물에 대해 특히 중요하다.
<표 A>
Figure 112013063433423-pct00006
Figure 112013063433423-pct00007
특히 바람직하게, 성분 A로서의 본 발명에 따른 조성물의 일부인 화학식 I의 벤족사지논은 상기 정의된 화학식 I.a.35의 벤족사지논이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 방법에 유용한 조성물은 성분 A로서 하기 화학식 I.a.35의 벤족사지논을 함유한다.
<화학식 I.a.35>
Figure 112013063433423-pct00008
상기 기술된 벤족사지논-유도체 및 조성물은 유럽 특허 출원 09163242.2에 상세하게 개시되어 있으며, 특히, 1페이지부터 7페이지까지의 개시 내용은 벤족사지논-유도체에 관해 언급하고 있고, 그의 가능한 치환기는 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명의 벤족사지논-유도체는 대개 최상으로 더 폭넓은 바람직하지 못한 식생을 방제하기 위해 하나 이상의 다른 제초제와 함께 적용된다. 다른 표적화 제초제와 함께 사용될 경우, 본 발명에서 청구하는 화합물은 다른 제초제 또는 제초제들과 함께 제제화될 수 있거나, 다른 제초제 또는 제초제들과 함께 탱크에서 혼합될 수 있거나, 또는 다른 제초제 또는 제초제들과 함께 순차적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 제초성 화합물은 추가로, 농작물이 그에 대해 천연적으로 내성을 띠거나, 상기 언급한 바와 같이, 하나 이상의 추가의 트랜스진의 발현을 통해 저항성을 띠는 것인, 추가의 제초제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 제초제 중 일부는 술폰아미드, 예컨대, 메토술람, 플루메트술람, 클로란술람메틸, 디클로술람, 페녹스술람 및 플로라술람, 술포닐우레아, 예컨대, 클로리무론, 트리베누론, 술포메투론, 니코술푸론, 클로르술푸론, 아미도술푸론, 트리아술푸론, 프로술푸론, 트리토술푸론, 티펜술푸론, 술포술푸론 및 메트술푸론, 이미다졸리논, 예컨대, 이마자퀸, 이마자픽, 이마제타피르, 이마자피르, 이마자메타벤즈 및 이마자목스, 페녹시알칸산, 예컨대, 2,4-D, MCPA, 디클로르프로프 및 메코프로프, 피리디닐옥시아세트산, 예컨대, 트리클로피르 및 플루록시피르, 카르복실산, 예컨대, 클로피랄리드, 피클로람, 아미노피랄리드 및 디캄바, 디니트로아닐린 예컨대, 트리플루랄린, 베네핀, 벤플루랄린 및 펜디메탈린, 클로로아세트아닐리드, 예컨대, 알라클로르, 아세토클로르 및 메톨라클로르, 세미카르바존 (옥신 수송 억제제), 예컨대, 클로르플루레놀 및 디플루펜조피르, 아릴옥시페녹시프로피오네이트, 예컨대, 플루아지포프, 할록시포프, 디클로포프, 클로디나포프 및 페녹사프로프 및 글리포세이트, 글루포시네이트, 아시플루오르펜, 벤타존, 클로마존, 플루미클로락, 플루오메투론, 포메사펜, 락토펜, 리누론, 이소프로투론, 시마진, 노르플루라존, 파라쿠아트, 디우론, 디플루페니칸, 피콜리나펜, 시니돈, 세톡시딤, 트랄콕시딤, 퀸메락, 이속사벤, 브로목시닐, 메트리부진 및 메소트리온을 비롯한, 다른 일반 제초제를 포함한다.
예를 들어, 본 발명을 수행하는 데 유용한 벤족사지논-유도체 제초제는 글리포세이트 및 글루포시네이트와 함께 글리포세이트-내성 또는 글루포시네이트-내성 작물 상에 사용될 수 있다.
상기 개시 내용에 이미 포함되어 있지 않다면, 본 발명을 수행하는 데 유용한 벤족사지논-유도체 제초제는 추가로 하기의 화합물과 함께 사용될 수 있다:
b1) 지질 생합성 억제제:
ACC-제초제, 예컨대, 알록시딤, 알록시딤-나트륨, 부트록시딤, 클레토딤, 클로디나포프, 클로디나포프-프로파르길, 시클록시딤, 시할로포프, 시할로포프-부틸, 디클로포프, 디클로포프-메틸, 페녹사프로프, 페녹사프로프-에틸, 페녹사프로프-P, 페녹사프로프-P-에틸, 플루아지포프, 플루아지포프-부틸, 플루아지포프-P, 플루아지포프-P-부틸, 할록시포프, 할록시포프-메틸, 할록시포프-P, 할록시포프-P-메틸, 메타미포프, 피녹사덴, 프로폭시딤, 프로파퀴자포프, 퀴잘로포프, 퀴잘로포프-에틸, 퀴잘로포프-테푸릴, 퀴잘로-포프-P, 퀴잘로포프-P-에틸, 퀴잘로포프-P-테푸릴, 세톡시딤, 테프랄록시딤 및 트랄콕시딤, 및 비-ACC 제초제, 예컨대, 벤푸레세이트, 부틸레이트, 시클로에이트, 달라폰, 디메피페레이트, EPTC, 에스프로카르브, 에토푸메세이트, 플루프로파네이트, 몰리네이트, 오르벤카르브, 페불레이트, 프로술포카르브, TCA, 티오벤카르브, 티오카르바질, 트리알레이트 및 베르놀레이트로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b2) ALS 억제제:
술포닐우레아, 예컨대, 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 벤술푸론-메틸, 클로리무론, 클로리무론-에틸, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에타메트술푸론-메틸, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루세토술푸론, 플루피르술푸론, 플루피르술푸론-메틸-나트륨, 포람술푸론, 할로술푸론, 할로술푸론-메틸, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 요오도술푸론-메틸-나트륨, 메조술푸론, 메타조술푸론, 메트술푸론, 메트술푸론-메틸, 니코술푸론, 오르토술파무론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프리미술푸론-메틸, 프로피리술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 피라조술푸론-에틸, 림술푸론, 술포메투론, 술포메투론-메틸, 술포술푸론, 티펜술푸론, 티펜술푸론-메틸, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리베누론-메틸, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리플루술푸론-메틸 및 트리토술푸론, 이미다졸리논, 예컨대, 이마자메타벤즈, 이마자메타벤즈-메틸, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸 및 이마제타피르, 트리아졸로피리미딘 제초제 및 술폰아미드, 예컨대, 클로란술람, 클로란술람-메틸, 디클로술람, 플루메트술람, 플로라술람, 메토술람, 페녹스술람, 피리미술판 및 피록스술람, 피리미디닐벤조에이트, 예컨대, 비스피리박, 비스피리박-나트륨, 피리벤족심, 피리프탈리드, 피리미노박, 피리미노박-메틸, 피리티오박, 피리티오박-나트륨, 4-[[[2-[(4,6-디메톡시-2-피리미디닐)옥시]페닐]메틸]아미노]-벤조산-1-메틸에틸 에스테르 (CAS 420138-41-6), 4-[[[2-[(4,6-디메톡시-2-피리미디닐)옥시]페닐]메틸]아미노]-벤조산 프로필 에스테르 (CAS 420138-40-5), N-(4-브로모페닐)-2-[(4,6-디메톡시-2-피리미디닐)옥시]벤젠메타민 (CAS 420138-01-8) 및 술포닐아미노카르보닐-트리아졸리논 제초제, 예컨대, 플루카르바존, 플루카르바존-나트륨, 프로폭시카르바존, 프로폭시카르바존-나트륨, 티엔카르바존 및 티엔카르바존-메틸로 이루어진 군으로부터의 화합물. 이들 중, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 이미다졸리논 제초제를 포함하는 조성물에 관한 것이다;
b3) 광합성 억제제:
아미카르바존, 광계 II 억제제, 예컨대, 트리아진 제초제, 예컨대, 클로로트리아진, 트리아지논, 트리아진디온, 메틸티오트리아진 및 피리다지논, 예컨대, 아메트린, 아트라진, 클로리다존, 시아나진, 데스메트린, 디메타메트린, 헥사지논, 메트리부진, 프로메톤, 프로메트린, 프로파진, 시마진, 시메트린, 터부메톤, 터부틸라진, 터부트린 및 트리에타진, 아릴 우레아, 예컨대, 클로로브로무론, 클로로톨루론, 클로록수론, 디메푸론, 디우론, 플루오메투론, 이소프로투론, 이소우론, 리누론, 메타미트론, 메타벤즈티아주론, 메토벤주론, 메톡수론, 모노리누론, 네부론, 시두론, 테부티우론 및 티아디아주론, 페닐 카르바메이트, 예컨대, 데스메디팜, 카르부틸레이트, 펜메디팜, 펜메디팜-에틸, 니트릴 제초제, 예컨대, 브로모페녹심, 브로목시닐 및 그의 염 및 에스테르, 이옥시닐 및 그의 염 및 에스테르, 우라실, 예컨대, 브로마실, 레나실 및 터바실 및 벤타존 및 벤타존-나트륨, 피리다트레, 피리다폴, 펜타노클로르 및 프로파닐, 및 광계 I의 억제제, 예컨대, 디쿠아트, 디쿠아트-디브로마이드, 파라쿠아트, 파라쿠아트-디클로라이드 및 파라쿠아트-디메틸술페이트로 이루어진 군으로부터의 화합물. 이들 중, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 아릴 우레아 제초제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 유사하게, 이들 중, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 트리아진 제초제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 유사하게, 이들 중, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 니트릴 제초제를 포함하는 조성물에 관한 것이다;
b4) 프로토포피리노겐-IX 옥시다제 억제제:
아시플루오르펜, 아시플루오르펜-나트륨, 아자페니딘, 벤카르바존, 벤즈펜디존, 비페녹스, 부타페나실, 카르펜트라존, 카르펜트라존-에틸, 클로메톡시펜, 시니돈-에틸, 플루아졸레이트, 플루펜피르, 플루펜피르-에틸, 플루미클로락, 플루미클로락-펜틸, 플루미옥사진, 플루오로글리코펜, 플루오로글리코펜-에틸, 플루티아세트, 플루티아세트-메틸, 포메사펜, 할로사펜, 락토펜, 옥사디아르길, 옥사디아존, 옥시플루오르펜, 펜톡사존, 프로플루아졸, 피라클로닐, 피라플루펜, 피라플루펜-에틸, 사플루페나실, 술펜트라존, 티디아지민, 에틸 [3-[2-클로로-4-플루오로-5-(1-메틸-6-트리플루오로메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-3-일)페녹시]-2-피리딜옥시]아세테이트 (CAS 353292-31-6; S-3100), N-에틸-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복스아미드 (CAS 452098-92-9), N-테트라히드로푸르푸릴-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복스아미드 (CAS 915396-43-9), N-에틸-3-(2-클로로-6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복스아미드 (CAS 452099-05-7), N-테트라히드로푸르푸릴-3-(2-클로로-6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복스아미드 (CAS 45100-03-7) 및 3-[7-플루오로-3-옥소-4-(프로프-2-인일)-3,4-디히드로-2H-벤조[1,4]옥사진-6-일]-1,5-디메틸-6-티옥소-[1,3,5]트리아지난-2,4-디온으로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b5) 표백제 제초제:
PDS 억제제: 베플루부타미드, 디플루페니칸, 플루리돈, 플루로클로리돈, 플루르타몬, 노르플루라존, 피콜리나펜, 및 4-(3-트리플루오로메틸페녹시)-2-(4-트리플루오로메틸페닐)피리미딘 (CAS 180608-33-7), HPPD 억제제: 벤조비시클론, 벤조페나프, 이속사플루톨, 메소트리온, 피라술포톨, 피라졸리네이트, 피라족시펜, 술코트리온, 테푸릴트리온, 템보트리온, 토프라메존 및 비시클로피론, 표백제, 미공지 표적: 아클로니펜, 아미트롤, 클로마존 및 플루오메투론으로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b6) EPSP 신타제 억제제:
글리포세이트, 글리포세이트-이소프로필암모늄 및 글리포세이트-트리메시움 (술포세이트)로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b7) 글루타민 신타제 억제제:
빌라나포스 (비아라포스), 빌라나포스-나트륨, 글루포시네이트, 글루포시네이트-P 및 글루포시네이트-암모늄으로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b8) DHP 신타제 억제제:
아술람로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b9) 유사분열 억제제:
K1 군의 화합물: 디니트로아닐린, 예컨대, 벤플루랄린, 부트랄린, 디니트라민, 에탈플루랄린, 플루클로랄린, 오리잘린, 펜디메탈린, 프로디아민 및 트리플루랄린, 포스포르아미데이트, 예컨대, 아미프로포스, 아미프로포스-메틸, 및 부타미포스, 벤조산 제초제, 예컨대, 클로르탈, 클로르탈-디메틸, 피리딘, 예컨대, 디티오피르 및 티아조피르, 벤즈아미드, 예컨대, 프로피자미드 및 테부탐; K2 군의 화합물: 클로르프로팜, 프로팜 및 카르베타미드로 이루어진 군으로부터의 화합물, 이들 중 K1 군의 화합물, 특히, 디니트로아닐린이 바람직하다;
b10) VLCFA 억제제:
클로로아세트아미드, 예컨대, 아세토클로르, 알라클로르, 부타클로르, 디메타클로르, 디메테나미드, 디메테나미드-P, 메타자클로르, 메톨라클로르, 메톨라클로르-S, 페톡사미드, 프레틸라클로르, 프로파클로르, 프로피소클로르 및 테닐클로르, 옥시아세트아닐리드, 예컨대, 플루페나세트 및 메페나세트, 아세트아닐리드, 예컨대, 디페나미드, 나프로아닐리드 및 나프로파미드, 테트라졸리논, 예컨대, 펜트라자미드, 및 다른 제초제, 예컨대, 아닐로포스, 카펜스트롤, 페녹사술폰, 이프펜카르바존, 피페로포스, 피록사술폰 및
하기 화학식 II의 이속사졸린 화합물:
<화학식 II>
Figure 112013063433423-pct00009
(상기 식에서, R7, R8, R9, R10, W, Z 및 n은 하기 의미를 가지고:
R7, R8, R9, R10은 서로 독립적으로 수소, 할로겐 또는 C1-C4-알킬이고;
X는 산소 또는 NH이고;
Y는 탄소 고리 구성원 이외에도, 고리 구성원으로서 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는, 1, 2, 또는 3개의 동일하거나 상이한 헤테로원자를 함유하는 페닐 또는 모노시클릭 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-원 헤테로시클릴이고, 여기서 페닐 및 헤테로시클릴은 비치환되거나, 또는 할로겐, C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알킬 및 C1-C4-할로알콕시로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 치환기 Ryy를 보유하고;
Y는 바람직하게는 탄소 고리 구성원 이외에도, 고리 구성원으로서 1, 2, 또는 3개의 질소 원자를 함유하는 페닐 또는 5- 또는 6-원 방향족 헤테로시클릴 (헤트아릴)이고, 여기서 페닐 및 헤트아릴은 비치환되거나, 또는 1, 2, 또는 3개의 치환기 Ryy를 보유하고;
n은 0 또는 1이다)로 이루어진 군으로부터의 화합물이고,
화학식 II의 이속사졸린 화합물 중,
R7, R8, R9, R10은 서로 독립적으로 H, F, Cl 또는 메틸이고;
X는 산소이고;
n은 0 또는 1이고;
Y는 페닐, 피라졸릴 또는 1,2,3-트리아졸릴이고, 마지막에 언급된 3개의 라디칼은 비치환되거나, 또는 1, 2, 또는 3개 치환기 Ryy, 특히 하기 라디칼:
Figure 112013063433423-pct00010
(여기서, R11은 할로겐, C1-C4-알킬 또는 C1-C4-할로알킬이고;
R12는 C1-C4-알킬이고;
R13은 할로겐, C1-C4-알콕시 또는 C1-C4-할로알콕시이고;
R14는 할로겐, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬 또는 C1-C4-할로알콕시이고;
m은 0, 1, 2 또는 3이고;
#은 CR13R14 기에의 부착점을 나타낸다) 중 하나인 것인 화학식 II의 이속사졸린 화합물이 바람직하고,
화학식 II의 이속사졸린 화합물 중,
R7은 수소이고;
R8은 플루오린이고;
R9는 수소 또는 플루오린이고;
R10은 수소 또는 플루오린이고;
X는 산소이고;
Y는 하기 화학식 Y1, Y2, Y3 또는 Y4의 라디칼 중 하나이고:
Figure 112013063433423-pct00011
(여기서, #은 CR9R10 기에의 부착점을 나타낸다)
n은 0 또는 1, 특히, 1인 것인 화학식 II의 상기 이속사졸린 화합물이 특히 바람직하고,
이들 중, 하기 화학식 II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 및 II.9의 이속사졸린 화합물이 특히 바람직하고:
Figure 112013063433423-pct00012
화학식 II의 이속사졸린 화합물은 예컨대, WO 2006/024820, WO 2006/037945, WO 2007/071900 및 WO 2007/096576으로부터 알려져 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있으며;
VLCFA 억제제 중 클로로아세트아미드 및 옥시아세트아미드, 특히 피록사술폰이 바람직하고;
b11) 셀룰로스 생합성 억제제:
클로르티아미드, 디클로베닐, 플루폭삼, 이속사벤, 1-시클로헥실-5-펜타플루오르페닐옥시-14-[1,2,4,6]티아트리아진-3-일아민 및 하기 화학식 III의 피페라진 화합물:
<화학식 III>
Figure 112013063433423-pct00013
(상기 식에서,
A는 페닐 또는 피리딜이고, 여기서 Ra는 A의, 탄소 원자에의 부착점에 오르토 위치로 부착되고;
Ra는 CN, NO2, C1-C4-알킬, D-C3-C6-시클로알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, O-D-C3-C6-시클로알킬, S(O)qRy, C2-C6-알케닐, D-C3-C6-시클로알케닐, C3-C6-알케닐옥시, C2-C6-알키닐, C3-C6-알키닐옥시, NRARB, 트?-C1-C4-알킬실릴, D-C(=O)-Ra1, D-P(=O)-(Ra1)2, 페닐, 나프틸, 3- 내지 7-원 모노시클릭 또는 9- 또는 10-원 비시클릭 포화, 불포화 또는 방향족 헤테로시클 (이는 탄소 또는 질소를 통해 부착되고, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하고, 이는 Raa 및/또는 Ra1 군에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환될 수 있고, Ra가 탄소 원자에 부착되는 경우, 추가로 할로겐에 의해 치환될 수 있다)이고;
Ry는 C1-C6-알킬, C3-C4-알케닐, C3-C4-알키닐, NRARB 또는 C1-C4-할로알킬이고, q는 0, 1 또는 2이고;
RA, RB는 서로 독립적으로 수소, C1-C6-알킬, C3-C6-알케닐 및 C3-C6-알키닐이고; 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, RA, RB는 또한 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유할 수 있는 5- 또는 6-원 포화, 부분적으로 또는 전체적으로 불포화 고리를 형성할 수 있고, 여기서 고리는 1 내지 3개의 Raa 기에 의해 치환될 수 있고;
D는 공유 결합, C1-C4-알킬렌, C2-C6-알케닐 또는 C2-C6-알키닐이고;
Ra1은 수소, OH, C1-C8-알킬, C1-C4-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, C2-C8-알케닐, C5-C6-시클로알케닐, C2-C8-알키닐, C1-C6-알콕시, C1-C4-할로알콕시, C3-C8-알케닐옥시, C3-C8-알키닐옥시, NRARB, C1-C6-알콕시아미노, C1-C6-알킬술포닐아미노, C1-C6-알킬아미노술포닐아미노, [디-(C1-C6)알킬아미노]술포닐아미노, C3-C6-알케닐아미노, C3-C6-알키닐아미노, N-(C2-C6-알케닐)-N-(C1-C6-알킬)아미노, N-(C2-C6-알키닐)-N-(C1-C6-알킬)아미노, N-(C1-C6-알콕시)-N-(C1-C6-알킬)아미노, N-(C2-C6-알케닐)-N- (C1-C6-알콕시)아미노, N-(C2-C6-알키닐)-N-(C1-C6-알콕시)-아미노, C1-C6-알킬술포닐, 트리-C1-C4-알킬실릴, 페닐, 페녹시, 페닐아미노 또는 5- 또는 6-원 모노시클릭 또는 9- 또는 10-원 비시클릭 헤테로시클 (이는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 시클릭 기는 비치환되거나, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 Raa 기로 치환된다)이고;
Raa는 할로겐, OH, CN, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, S(O)qRy, D-C(=O)-Ra1 및 트리-C1-C4-알킬실릴이고;
Rb는 서로 독립적으로 수소, CN, NO2, 할로겐, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C2-C4-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, 벤질 또는 S(O)qRy이고,
Rb는 인접한 고리 원자에 부착된 Ra 또는 Rb 기와 함께 또한, 탄소 원자 이외에도, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자를 함유할 수 있는 5- 또는 6-원 포화 또는 부분적으로 또는 전체적으로 불포화 고리를 형성할 수 있고, 여기서 고리는 Raa에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환될 수 있고;
p는 0, 1, 2 또는 3이고;
R15는 수소, OH, CN, C1-C12-알킬, C3-C12-알케닐, C3-C12-알키닐, C1-C4-알콕시, C3-C6-시클로알킬, C5-C6-시클로알케닐, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, C(=O)R25, CON RARB, 페닐 또는 5- 또는 6-원 모노시클릭 또는 9- 또는 10-원 비시클릭 방향족 헤테로시클 (O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 시클릭 기는 D1을 통해 부착되고, 이는 비치환되거나, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 Raa 기, 및 또한 하기 부분적으로 또는 전체적으로 Raa-치환된 기: C1-C4-알킬, C3-C4-알케닐, C3-C4-알키닐, C1-C4-알콕시, C3-C6-시클로알킬, C5-C6-시클로알케닐, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, C(=O)R25, CONRARB에 의해 치환된다)이고;
R15는 바람직하게 수소, OH, CN, C1-C12-알킬, C3-C12-알케닐, C3-C12-알키닐, C1-C4-알콕시, C3-C6-시클로알킬, C5-C6-시클로알케닐, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, C(=O)R25, CONRARB, 페닐 또는 5- 또는 6-원 모노시클릭 또는 9- 또는 10-원 비시클릭 방향족 헤테로시클 (O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 시클릭 기는 D1을 통해 부착되고, 이는 비치환되거나, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 Raa 기, 및 또한 하기 부분적으로 또는 전체적으로 Raa-치환된 기: C1-C4-알킬, C3-C4-알케닐, 및 C3-C4-알키닐에 의해 치환된다)이고;
R25는 수소, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시 또는 C1-C4-할로알콕시이고;
D1은 카르보닐 또는 D 기이고;
여기서, R15 기, Ra 기 및 그의 서브치환기에서, 탄소 쇄 및/또는 시클릭 기는 1, 2, 3 또는 4개의 치환기 Raa 및 Ra1을 보유할 수 있고;
R16은 C1-C4-알킬, C3-C4-알케닐 또는 C3-C4-알키닐이고;
R17은 OH, NH2, C1-C4-알킬, C3-C6-시클로알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C4-히드록시알킬, C1-C4-시아노알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시-C1-C4-알킬 또는 C(=O)R25이고;
R18은 수소, 할로겐, C1-C4-알킬 또는 C1-C4-할로알킬이거나, 또는 R18 및 R19는 함께 공유 결합이고;
R19, R20, R21, R22은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, OH, CN, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C2-C6-알케닐, C2-C6-알키닐, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, C3-C6-시클로알킬, C3-C6-시클로알케닐 및 C3-C6-시클로알키닐이고;
R23, R24는 서로 독립적으로 수소, 할로겐, OH, 할로알킬, NRARB, NRAC(O)R26, CN, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C2-C4-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, 0-C(O)R26, 페녹시 또는 벤질옥시이고, R23 기, 및 R24 기에서, 탄소 쇄 및/또는 시클릭 기는 1, 2, 3 또는 4개의 치환기 Raa를 보유할 수 있고;
R26은 C1-C4-알킬 또는 NRARB이다)로 이루어진 군으로부터의 화합물이고;
화학식 III의 피페라진 화합물의 이속사졸린 화합물 중,
A는 페닐 또는 피리딜이고, 여기서 Ra는 A의, 탄소 원자에의 부착점에 오르토 위치로 부착되고;
Ra는 CN, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시 또는 D-C(=O)-Ra1이고;
Ry는 d-Ce-알킬, C3-C4-알케닐, C3-C4-알키닐, NRARB 또는 C1-C4-할로알킬이고, q는 0, 1 또는 2이고;
RA, RB는 서로 독립적으로 수소, C1-C6-알킬, C3-C6-알케닐 및 C3-C6-알키닐이고; 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, RA, RB는 또한 탄소 원자 이외에도, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유할 수 있는 5- 또는 6-원 포화, 부분적으로 또는 전체적으로 불포화 고리를 형성할 수 있고, 여기서 고리는 1 내지 3개의 Raa 기에 의해 치환될 수 있고;
D는 공유 결합, C1-C4-알킬렌이고;
Ra1은 수소, OH, C1-C8-알킬, C1-C4-할로알킬, C3-C6-시클로알킬이고;
Raa는 할로겐, OH, CN, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, S(O)qRy, D-C(=O)-Ra1 및 트리-C1-C4-알킬실릴이고;
Rb는 서로 독립적으로 CN, NO2, 할로겐, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C2-C4-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, 벤질 또는 S(O)qRy이고,
Rb는 인접한 고리 원자에 부착된 Ra 또는 Rb 기와 함께 또한, 탄소 원자 이외에도, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자를 함유할 수 있는 5- 또는 6-원 포화 또는 부분적으로 또는 전체적으로 불포화 고리를 형성할 수 있고, 여기서 고리는 Raa에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환될 수 있고;
p는 0, 또는 1이고;
R15는 수소, C1-C12-알킬, C3-C12-알케닐, C3-C12-알키닐, C1-C4-알콕시 또는 C(=O)R25이고, Raa 기에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 치환될 수 있고;
R15는 바람직하게 수소, C1-C12-알킬, C3-C12-알케닐, C3-C12-알키닐, C1-C4-알콕시 또는 C(=O)R25이고;
R25는 수소, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시 또는 C1-C4-할로알콕시이고; 여기서, R15 기, Ra 기 및 그의 서브치환기에서, 탄소 쇄 및/또는 시클릭 기는 1, 2, 3 또는 4개의 치환기 Raa 및 Ra1을 보유할 수 있고;
R16은 C1-C4-알킬이고;
R17은 OH, NH2, C1-C4-알킬, C3-C6-시클로알킬, C1-C4-할로알킬 또는 C(=O)R25이고;
R18은 수소이거나, 또는 R18 및 R19는 함께 공유 결합이고;
R19, R20, R21, R22은 서로 독립적으로 수소이고;
R23, R24는 서로 독립적으로 수소, 할로겐 또는 OH인 화학식 III의 피페라진 화합물이 바람직하고,
b12) 디커플러 제초제:
디노세브, 디노테르브 및 DNOC 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b13) 옥신 제초제:
2,4-D 및 그의 염 및 에스테르, 2,4-DB 및 그의 염 및 에스테르, 아미노피랄리드 및 그의 염, 예컨대, 아미노피랄리드-트리스(2-히드록시프로필)암모늄 및 그의 에스테르, 베나졸린, 베나졸린-에틸, 클로람벤 및 그의 염 및 에스테르, 클로메프로프, 클로피랄리드 및 그의 염 및 에스테르, 디캄바 및 그의 염 및 에스테르, 디클로르프로프 및 그의 염 및 에스테르, 디클로르프로프-P 및 그의 염 및 에스테르, 플루록시피르, 플루록시피르-부토메틸, 플루록시피르-멥틸, MCPA 및 그의 염 및 에스테르, MCPA- 티오에틸, MCPB 및 그의 염 및 에스테르, 메코프로프 및 그의 염 및 에스테르, 메코프로프-P 및 그의 염 및 에스테르, 피클로람 및 그의 염 및 에스테르, 퀸클로락, 퀸메락, TBA (2,3,6) 및 그의 염 및 에스테르, 트리클로피르 및 그의 염 및 에스테르, 및 아미노시클로피라클로르 및 그의 염 및 에스테르로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b14) 옥신 수송 억제제:
디플루펜조피르, 디플루펜조피르-나트륨, 나프탈람 및 나프탈람-나트륨으로 이루어진 군으로부터의 화합물;
b15) 다른 제초제: 브로모부티드, 클로르플루레놀, 클로르플루레놀-메틸, 신메틸린, 쿠밀루론, 달라폰, 다조메트, 디펜조쿠아트, 디펜조쿠아트-메틸술페이트, 디메티핀, DSMA, 딤론, 엔도탈 및 그의 염, 에토벤자니드, 플람프로프, 플람프로프-이소프로필, 플람프로프- 메틸, 플람프로프-M-이소프로필, 플람프로프-M-메틸, 플루레놀, 플루레놀-부틸, 플루르프리미돌, 포사민, 포사민-암모늄, 인다노판, 인다지플람, 말레산 히드라지드, 메플루이디드, 메탐, 메틸 아지드, 메틸 브로마이드, 메틸-딤론, 메틸 요오다이드, MSMA, 올레산, 옥사지클로메폰, 펠라르곤산, 피리부티카르브, 퀴노클라민, 트리아지플람, 트리디판 및 6-클로로-3-(2-시클로프로필-6-메틸페녹시)-4-피리다지놀 (CAS 499223-49-3) 및 그의 염 및 에스테르로 이루어진 군으로부터의 화합물.
또한, 독성완화제와 함께 화학식 I의 벤족사지논을 적용시키는 것이 유용할 수 있다. 독성완화제는 원치않는 식물에 대한 화학식 I의 벤족사지논의 제초 작용에는 중요한 영향을 미치지 않으면서, 유용한 식물에 대한 손상은 막거나 감소시키는 화학 화합물이다. 이는 파종 이전에 (예컨대, 종자 처리물, 새싹, 또는 묘목 상에), 유용한 식물의 발아 이전 적용 또는 발아 후 적용에 적용될 수 있다.
추가로, 독성완화제 C, 벤족사지논 I 및/또는 제초제 B는 동시에 또는 연속적으로 적용될 수 있다.
적합한 독성완화제는 예컨대, (퀴놀린-8-옥시)아세트산, 1-페닐-5-할로알킬-1H-1,2,4-트리아졸-3-카르복실산, 1-페닐-4,5-디히드로-5-알킬-1H-피라졸-3,5-디카르복실산, 4,5-디히드로-5,5-디아릴-3-이속사졸 카르복실산, 디클로로아세트아미드, 알파-옥시미노페닐아세토니트릴, 아세토페논옥심, 4,6-디할로-2-페닐피리미딘, N-[[4-(아미노카르보닐)페닐]술포닐]-2-벤조산 아미드, 1,8-나프탈산 무수물, 2-할로-4-(할로알킬)-5-티아졸 카르복실산, 포스포르티올레이트 및 N-알킬-O-페닐카르바메이트 및 그의 농업상 허용되는 염 및 그의 농업상 허용되는 유도체, 상기 아미드, 에스테르, 및 티오에스테르 (단, 이들은 산성 기를 가진다)이다.
바람직한 독성완화제 C의 예로는 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시오메트리닐, 시프로술파미드, 디클로르미드, 디시클로논, 디에톨레이트, 펜클로르아졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴아졸, 이속사디펜, 메펜피르, 메페네이트, 나프탈산 무수물, 옥사베트리닐, 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 (MON4660, CAS 71526-07-3) 및 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 (R-29148, CAS 52836-31-4), 및 N-(2-메톡시벤조일)-4-[(메틸아미노카르보닐)아미노]벤젠술폰아미드 (CAS 129531-12-0)이다.
특히 바람직한 독성완화제 C는 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시프로술파미드, 디클로르미드, 펜클로르아졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴아졸, 이속사디펜, 메펜피르, 나프탈산 무수물, 옥사베트리닐, 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 (MON4660, CAS 71526-07-3) 및 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 (R-29148, CAS 52836-31-4), 및 N-(2-메톡시벤조일)-4-[(메틸아미노카르보닐)아미노]벤젠술폰아미드 (CAS 129531-12-0)이다.
특히 바람직하게, 독성완화제 C는 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시프로술파미드, 디클로르미드, 펜클로르아졸, 펜클로림, 푸릴아졸, 이속사디펜, 메펜피르, 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 (MON4660, CAS 71526-07-3) 및 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 (R-29148, CAS 52836-31-4), 및 N-(2-메톡시벤조일)-4-[(메틸아미노카르보닐)아미노]벤젠술폰아미드 (CAS 129531-12-0)이다.
특히 바람직하게, 성분 C로서 본 발명에 따른 조성물의 구성 성분인 독성완화제 C는 상기 정의된 바와 같은 독성완화제 C; 특히, 하기 표 C에 열거된 독성완화제 C.1-C.13이다:
<표 C>
Figure 112013063433423-pct00014
b1) 군 내지 b15) 군의 활성 화합물 B 및 활성 화합물 C는 공지된 제초제 및 독성완화제이며, 예를 들어, 문헌 [The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/)]; [Farm Chemicals Handbook 2000 volume 86, Meister Publishing Company, 2000]; [B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide [Herbicides], Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995]; [W. H. Ahrens, Herbicide Handbook, 7th edition, Weed Science Society of America, 1994]; 및 [K. K. Hatzios, Herbicide Handbook, Supplement for the 7th edition, Weed Science Society of America, 1998]을 참조할 수 있다. 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 [CAS No. 52836-31-4]은 또한 R-29148로서 지칭된다. 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 [CAS No. 71526-07-3]은 또한 AD-67 및 MON 4660으로서 지칭된다. 추가로, 제초 활성 화합물은 WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117, WO 97/41118 및 WO01/83459로부터, 및 또한 문헌 [W. Kraemer et al. (ed.) "Modern Crop Protection Compounds", Vol. 1, Wiley VCH, 2007] 및 상기 문헌에서 인용되는 문헌으로부터 공지되어 있다.
본 발명의 화합물은, 처리되는 작물에 대해 선택적이고, 사용되는 적용률로 상기 화합물에 의해 방제되는 잡초의 범위를 보완하는 것인 제초제와 함께 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 추가로, 본 발명의 화합물 및 다른 상보적 제초제를 조합 제제로서 또는 탱크 믹스로서 동시에 적용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
"mut-PPO 핵산"이라는 용어는 야생형 PPO 핵산으로부터 돌연변이화되고, 그가 발현되는 식물에게 증가된 벤족사지논-유도체 제초제 내성을 부여하는 것인 서열을 가지는 PPO 핵산을 의미한다. 추가로, "돌연변이화된 프로토포피리노겐 옥시다제 (mut-PPO)"라는 용어는 야생형 1차 서열 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46의 아미노산, 또는 그의 변이체, 유도체, 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그가 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것을 의미한다. "돌연변이화된 아미노산"이라는 표현은 하기에서 또 다른 아미노산으로 치환된 아미노산을 지정하고, 이로써 단백질 1차 서열 중 돌연변이 부위를 지정하는 데 사용될 것이다.
바람직한 실시양태에서, PPO 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1, 25, 37 또는 39의 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
추가로, PPO 뉴클레오티드 서열이 이하 정의되는 바와 같은 서열 번호 1, 25, 37 또는 39의 상동체, 파라로그 및 오르토로그를 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
서열 (예컨대, 폴리펩티드 또는 핵산 서열, 예컨대, 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열)과 관련하여 "변이체"라는 용어는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것으로 한다. 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 경우, 변이체는 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여 천연 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 예컨대, 이러한 천연적으로 발생된 대립형질 변이체는 주지된 분자 생물학 기법을 사용하여, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 하이브리드화 기법을 사용함으로써 확인될 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 생성된 것과 같은 합성적으로 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 오픈 리딩 프레임의 경우, 천연 단백질을 코딩할 뿐만만 아니라, 천연 단백질과 비교하여 아미노산 치환을 가지는 폴리펩티드를 코딩한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45의 뉴클레오티드 서열과 30, 40, 50, 60, 내지 70% 이상, 예컨대, 바람직하게, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 내지 79%, 일반적으로, 80% 이상, 예컨대, 81%-84%, 85% 이상, 예컨대, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 내지 98% 및 99%의 뉴클레오티드 "서열 동일성을 가질 것이다. "변이체" 폴리펩티드란, 천연 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 단부에의 결실 (이른바 절단) 또는 하나 이상의 아미노산의 부가에 의해; 천연 단백질 중 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가; 또는 천연 단백질 중 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46의 단백질로부터 유도된 폴리펩티드인 것으로 한다. 상기 변이체는 예를 들어, 유전자 다형성으로부터, 또는 조작으로부터 생성될 수 있다. 그러한 조작 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자 및 폴리펩티드는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열과, 또는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46에 기재된 아미노산 서열과 충분히 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, "충분히 동일하다"라는 용어는 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 충분한 또는 최소 개수로 동일하거나 등가인 (예컨대, 유사한 측쇄를 가지는 경우) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 포함함으로써 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통된 구조 도메인 및/또는 공통된 기능적 활성을 가진다는 것을 의미한다.
"서열 동일성"은 최적으로 정렬된 두 DNA 또는 아미노산 서열의 성분, 예컨대, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬 창 전역에 걸친 불변 정도를 의미한다. 시험 서열과 참조 서열의 정렬된 세그먼트에 대한 "동일성 분율"은 정렬된 두 서열이 공유하는 동일한 성분의 개수를 참조 서열 세그먼트, 즉, 전체 참조 서열, 또는 참조 서열 중 정의된 보다 작은 부분에 있는 성분의 총 개수로 나눈 것이다. "동일성 백분율(%)"은 동일성 분율 X 100이다. 비교창을 정령하기 위한 최적의 서열 정렬은 당업자에게 주지되어 있고, 이는 도구, 예컨대, 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 국부 상동성 알고리즘, 니들맨(Needleman) 및 운치(Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 퍼어슨(Pearson) 및 립맨(Lipman)의 유사성 검색 방법, 및 바람직하게, 예컨대, GCG (위스콘신 패키지(Wisconsin Package), 액셀리스 인코퍼레이티드(Accelrys Inc.: 미국 매사추세츠주 벌링톤)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 상기 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 수행될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(들)," "핵산 서열(들)," "뉴클레오티드 서열(들)," "핵산(들)," "핵산 분자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그 둘 모두의 조합이든, 임의 길이의 비분지형의 중합체 형태인 뉴클레오티드를 의미한다.
단백질의 "유도체"는 변형되지 않는 해당 단백질과 비교하여 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하고, 그의 유도 기점이 되는 변형되지 않는 단백질과과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 가지는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다.
단백질의 "상동체"는 변형되지 않는 해당 단백질과 비교하여 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하고, 그의 유도 기점이 되는 변형되지 않는 단백질과과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 가지는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다.
결실이란 단백질로부터 하나 이상의 아미노산이 제거되는 것을 의미한다.
삽입이란 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질 중의 사전 결정된 부위로 도입되는 것을 의미한다. 삽입은 N-말단 및/또는 C-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산의 서열내 삽입도 포함할 수 있다. 일반적으로, 아미노산 서열 내의 삽입은 N- 또는 C-말단 융합보다 대략적으로 약 1 내지 10개 잔기 정도만큼 작을 것이다. N- 또는 C-말단 융합 단백질 또는 펩티드의 예로는 효소의 두 하이브리드 시스템에서 사용되는 것과 같은 전사 활성인자의 결합 도메인 또는 활성화 도메인, 파지 코트 단백질, (히스티딘)-6-태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-태그, 단백질 A, 말토스-결합 단백질, 디히드로폴레이트 리덕타제, 태그*100 에피토프, c-myc 에피토프, FLAG®-에피토프, lacZ, CMP (칼모듈린-결합 펩티드), HA 에피토프, 단백질 C 에피토프 및 VSV 에피토프를 포함한다.
치환이란 단백질의 아미노산을 유사한 특성 (예컨대, 유사한 소수성, 친수성, 항원성, α-나성형 구조 또는 β-쉬트 구조를 형성하거나 파괴하는 성형)을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 것이지만, 폴리펩티드에 대한 기능적 제한에 따라 클러스터링될 수 있고, 그 범위는 1 내지 10개의 아미노산일 수 있으며, 삽입은 보통 대략적으로 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 정도로 이루어질 것이다. 아미노산 치환은 바람직하게, 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다 (문헌 예를 들어, 문헌 [Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)] 참조).
<표 2>
Figure 112013063433423-pct00015
아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 당업계에 주지되어 있는 펩티드 합성 기법을 사용하여, 예컨대, 고체상 펩티드 합성법 등을 사용하여, 또는 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 수행될 수 있다. DNA 서열을 조작하여 단백질의 치환, 삽입 또는 결실 변이체를 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, DNA 중 사전 결정된 부위에 치환 돌연변이를 제조하는 기법은 당업자에게 주지되어 있고, 그러한 것으로 M13 돌연변이유발, T7-Gen 시험관내 돌연변이유발 (USB: 미국 오하이오주 클리블랜드), 퀴체인지(QuickChange) 부위 지정 돌연변이유발 (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 샌디에고)), PCR 매개 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 부위 지정 돌연변이유발 프로토콜을 포함한다.
"유도체"는 추가로 단백질의 천연적으로 발생된 형태, 예컨대, 관심의 대상이 되는 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때, 아미노산의 비-천연적으로 발생된 아미노산 잔기에 의한 치환, 또는 비-천연적으로 발생된 아미노산 잔기의 부가를 포함할 수 있는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 단백질의 "유도체"는 또한 폴리펩티드의 천연적으로 발생된 형태의 아미노산 서열과 비교하였을 때, 천연적으로 발생된 변경된 (당화된, 아실화된, 프레닐화된, 인산화된, 미리스토일화된, 황산화된 또는 기타) 또는 비-천연적으로 변경된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 유도체는 또한 그의 유도 기점이 되는 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 비-아미노산 치환기 또는 부가, 예를 들어, 아미노산 서열에 공유 또는 비공유적으로 결합된 리포터 분자 또는 다른 리간드, 예컨대, 그의 검출이 용이하게 이루어지도록 하기 위해 결합된 리포터 분자, 및 천연적으로 발생된 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 비-천연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 추가로, "유도체"는 또한 단백질의 천연적으로 발생된 형태와 태깅 펩티드 예컨대, FLAG, HIS6 또는 티오레독신의 융합물을 포함한다 (태깅 펩티드에 관한 리뷰를 위해, 문헌 [Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003] 참조).
"오르토로그" 및 "파라로그"는 유전자의 선조 관계를 기술하는 데 사용되는 진화적 개념을 포함한다. 파라로그는 선조 유전자의 복제를 통해 기원하는 같은 종 내의 유전자이고; 오르토로그는 종 분화를 통해 기원하는 상이한 유기체로부터의 유전자이며, 이는 또한 공통된 선조 유전자로부터 유래된 것이다. 상기와 같은 오르토로그의 예에 관한 비제한적인 목록은 표 1에 제시되어 있다. 파라로그 및 오르토로그는 주어진 부위에 적합한 아미노산 잔기를 보유하는 별개의 도메인, 예컨대, 특정 기질에 대한 결합 포켓, 또는 다른 단백질과의 상호작용을 위한 결합 모티프를 공유할 수 있는 것으로 당업계에 주지되어 있다.
"도메인"이라는 용어는 진화상 관련된 단백질의 서열 정렬에 따른 특정 위치에서 보존되는 아미노산 세트를 의미한다. 상동체 간에 다른 위치에 있는 아미노산은 상이할 수 있지만, 특정 위치에서 고도로 보존되는 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 기능에 필수적일 가능성을 지닌 아미노산을 나타낸다. 단백질 상동체 패밀리의 정렬된 서열에 그의 고도한 보존 정도에 의해 확인된 것은 의문의 임의 폴리펩티드가 앞서 확인된 폴리펩티드 패밀리에 속하는지 여부를 결정하는 데 있어서 식별자로서 사용될 수 있다.
"모티프" 또는 "컨센서스 서열"이라는 용어는 진화상 관련된 단백질의 서열 중 짧은 보존 영역을 의미한다. 모티프는 빈번하게는 고도로 보존되는 도메인 부분이지만, 이는 또한 오직 상기 도메인 부분만을 포함할 수 있거나, 또는 보존 도메인 바깥쪽에 위치할 수도 있다 (모티프의 아미노산 모두가 정의된 도메인 바깥쪽에 포함되어 있는 경우).
도메인 확인을 위한 것으로서, 예를 들어, SMART (문헌 [Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864]; [Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244]), 인터프로(InterPro) (문헌 [Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318]), 프로사이트(Prosite) (문헌 [Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequences interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)]), 또는 Pfam (문헌 [Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)])과 같은 전문가의 데이터베이스가 존재한다. 단백질 서열의 인실리코(in silico) 분석을 위한 도구 세트는 ExPASy 프로테오믹스 서버 (Swiss Institute of Bioinformatics ([Gasteiger et al., Ex-PASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)])) 상에서 이용가능하다. 도메인 또는 모티프는 또한 예컨대, 서열 정렬과 같은 통상의 기법을 사용하여 확인할 수 있다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 그러한 방법으로는 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. GAP는 매치되는 개수를 최대화하고, 갭의 개수를 최소화하는 두 서열의 전반적인 (즉, 완전한 서열에 걸쳐져 있는) 정렬을 찾아내기 위해 니들맨 및 운치의 알고리즘을 사용한다 (문헌 [(1970) J Mol Biol 48: 443-453]). BLAST 알고리즘 (문헌 [Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10])은 서열 동일성 백분율(%)을 계산하고, 두 서열 간의 유사성에 관한 통계학적 분석을 수행한다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Centre for Biotechnology Information: NCBI)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 상동체는 예를 들어, 디폴트 쌍별 정렬 파라미터를 이용하여 클러스터W(ClustalW) 다중 서열 정렬 알고리즘 (버전 1.83)을 사용함으로써, 및 백분율로 스코어링하는 방법을 사용하여 쉽게 확인할 수 있다. 전체 유사성 및 동일성 백분율(%) 또한 MatGAT 소프트웨어 패키지에서 이용가능한 방법 중 하나를 사용하여 측정될 수 있다 (문헌 [Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.]). 당업자에게 자명한 바와 같이, 보존 모티프 사이의 정렬을 최적화하기 위해 최소의 수동 편집을 수행할 수 있다. 추가로, 상동체 확인을 위해 전장의 서열을 사용하는 대신, 특정 도메인 또한 사용할 수 있다. 서열 동일성 값은 디폴트 파라미터를 사용하여 상기 언급된 프로그램을 이용함으로써 전체 핵산 또는 아미노산 서열에 걸쳐 또는 선택된 도메인 또는 보존 모티프(들)에 걸쳐 측정될 수 있다. 국부 정렬을 위해서는 스미스-워터맨 알고리즘이 특히 유용하다 (문헌 [Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7]).
본 발명자들은 놀랍게도 중요한 아미노산 잔기 중 하나 이상을 치환시킴으로써 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46을 가지는 야생형 PPO 효소의 활성과 비교하였을 때, 제초제 내성 또는 저항성을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. mut-PPO의 바람직한 치환은 식물의 제초제 내성은 증가시키지만, 옥시다제 활성의 생물학적 활성은 실질적으로는 영향을 받지 않은 상태 그대로 유지시키는 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적에서, PPO 효소, 그의 변이체, 유도체, 오르토로그, 파라로그 또는 상동체의 중요 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산에 의해 치환된다.
바람직한 실시양태에서, PPO 효소, 그의 변이체, 유도체, 오르토로그, 파라로그 또는 상동체의 중요 아미노산 잔기가 하기 표 2에 기술된 보존적 아미노산에 의해 치환된다.
하기 언급하는 아미노산 위치에 아주 근접하게 위치하는 아미노산 또한 치환될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46의 변이체, 그의 변이체, 유도체, 오르토로그, 파라로그 또는 상동체는 중요 아미노산으로부터 아미노산±3, ±2 또는 ±1 아미노산 위치가 임의의 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 mut-PPO를 포함한다.
당업계에 주지된 기법에 기초하여, 고도로 특징적인 서열 패턴이 개발될 수 있고, 그를 수단으로 하여 원하는 활성을 가지는 추가의 mut-PPO를 검색할 수 있다.
적합한 서열 패턴을 적용시켜 추가의 mut-PPO 후보물질을 검색하는 것 또한 본 발명에 의해 포함될 것이다. 본 서열 패턴이 상기 패턴의 두 인접한 아미노산 잔기 사이의 정확한 거리에 의해 제한되는 것은 아니라는 것을 당업계의 독자는 이해할 것이다. 상기 패턴에서 두 이웃 사이의 거리는 각각 원하는 활성에는 실질적으로 영향을 주지 않으면서, 예를 들어, 서로 독립적으로 최대 ±10, ± 5, ±3, ±2 또는 ±1 아미노산 위치만큼 달라질 수 있다.
본 발명에 따라 얻은 결정학적 데이터에 기초한 개별 아미노산 잔기에 관한 상기의 기능적 및 공간적 분석에 따라, 본 발명의 잠재적으로 유용한 mut-PPO 후보물질에
특징이 되는 독특한 부분 아미노산 서열을 확인할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 2의 mut-PPO의 변이체 또는 유도체는 하기 표 3a로부터 선택되고, 서열 번호 2의 mut-PPO의 조합된 아미노산 치환은 하기 표 3b로부터 선택된다.
<표 3a>
Figure 112013063433423-pct00016
Figure 112013063433423-pct00017
<표 3b>
Figure 112013063433423-pct00018
상기 표 3에서 언급된 것 이외의 임의의 아미노산도 치환기로서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 상기 돌연변이체의 관능기에 대해 시험하는 검정법은 당업계에서 쉽게 이용가능하며, 이는 각각 본 발명의 실시예 섹션에 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 하기 위치: 128, 175, 209, 210, 295, 296, 334, 353, 382, 384, 397, 398, 399, 400, 402, 403, 404, 405, 420, 439 중 하나 이상에서 서열 번호 2의 PPO의 아미노산 서열과 상이하다.
이러한 아미노산 위치에서의 상이함의 예로는, 128번 위치의 아미노산이 아르기닌 이외의 것이고; 175번 위치의 아미노산이 글리신 이외의 것이고; 209번 위치의 아미노산이 글리신 이외의 것이고; 210번 위치의 아미노산이 글리신 이외의 것이고; 295번 위치의 아미노산이 류신 이외의 것이고; 296번 위치의 아미노산이 세린 이외의 것이고; 334번 위치의 아미노산이 류신 이외의 것이고; 353번 위치의 아미노산이 페닐알라닌 이외의 것이고; 382번 위치의 아미노산이 글리신 이외의 것이고; 384번 위치의 아미노산이 류신 이외의 것이고; 397번 위치의 아미노산이 류신 이외의 것이고; 398번 위치의 아미노산이 글리신 이외의 것이고; 399번 위치의 아미노산이 트레오닌 이외의 것이고; 400번 위치의 아미노산이 류신 이외의 것이고; 402번 위치의 아미노산이 세린 이외의 것이고; 403번 위치의 아미노산이 세린 이외의 것이고; 404번 위치의 아미노산이 메티오닌 이외의 것이고; 405번 위치의 아미노산이 메티오닌 이외의 것이고; 420번 위치의 아미노산이 페닐알라닌 이외의 것이고; 439번 위치의 아미노산이 페닐알라닌 이외의 것임 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 2의 PPO 효소는, 128번 위치의 아미노산은 Leu, Ala, Val, Ile, Phe, Trp, Asp, 또는 Asn이고; 175번 위치의 아미노산은 결실되거나, Ala, Val, Pro, Leu, Ile, Met, Ser, 또는 Thr이고; 209번 위치의 아미노산은 결실되거나, Ala, Val, Pro, Leu, Ile, Met, Ser, 또는 Thr이고; 210번 위치의 아미노산은 결실되거나, Ala, Val, Pro, Leu, Ile, Met, Ser, 또는 Thr이고; 295번 위치의 아미노산은 Ser, Met, Ala, Val, Asp, Asn 또는 Thr이고; 296번 위치의 아미노산은 Leu, Met, Gly, Val, Asp, Asn 또는 Thr이고; 334번 위치의 아미노산은 Val, Ile, Phe, Tyr, Asn, Asp, 또는 Thr이고; 353번 위치의 아미노산은 Tyr, Leu, Val, Ile, 또는 Asn이고; 382번 위치의 아미노산은 Ala, Ser, Thr, Cys, Val, 또는 Asp이고; 384번 위치의 아미노산은 Ala, Val, Ile, Asn, Asp, 또는 Thr이고; 397번 위치의 아미노산은 Ala, Val, Ile, Asn, Asp, 또는 Thr이고; 398번 위치의 아미노산은 Ala, Ser, Thr, Cys, Val, 또는 Asp이고; 399번 위치의 아미노산은 Ser, Cys, Met, Ala, 또는 Asn이고; 400번 위치의 아미노산은 Ala, Val, Ile, Phe, Asn, Asp, 또는 Thr이고; 402번 위치의 아미노산은 Gly, Ala, Cys, Asp, 또는 His이고; 403번 위치의 아미노산은 Gly, Ala, Cys, Asp, 또는 His이고; 404번 위치의 아미노산은 Ser, Cys, Thr, Gly, 또는 Ala이고; 405번 위치의 아미노산은 Leu, Ala, Val, Gly, Cys, 또는 Ser이고; 420번 위치의 아미노산은 Met, Cys, Ile, Tyr, Trp, Leu, 또는 Thr이고; 439번 위치의 아미노산은 Tyr, Trp, Ala, Val, 또는 Ile인 것 중 하나 이상을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 389번 위치에서 서열 번호 26의 PPO의 아미노산 서열과 상이하다. 바람직하게, 389번 위치의 아미노산은 발린 이외의 것이다. 더욱 바람직하게, 389번 위치의 아미노산은 Met, Ala, Cys, 또는 His이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 하기 위치: 220, 305, 426번 위치 중 하나 이상의 위치에서 서열 번호 38의 PPO의 아미노산 서열과 상이하다. 바람직하게, 220번 위치의 아미노산은 알라닌 이외의 것이고, 305번 위치의 아미노산은 세린 이외의 것이고, 426번 위치의 아미노산은 티로신 이외의 것이다.
더욱 바람직하게, 220번 위치의 아미노산은 결실되거나, Val, Thr, Leu, Cys, Ile, 또는 Met이고; 305번 위치의 아미노산은 Leu, Ala, Val이고; 426번 위치의 아미노산은 Met, Cys, Ile, Leu, 또는 Thr이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 하기 위치: 178, 179, 372, 392번 위치 중 하나 이상의 위치에서 서열 번호 40의 PPO의 아미노산 서열과 상이하다. 바람직하게, 178번 위치의 아미노산은 글리신 이외의 것이고, 179번 위치의 아미노산은 글리신 이외의 것이고, 372번 위치의 아미노산은 페닐알라닌 이외의 것이고, 392번 위치의 아미노산은 페닐알라닌 이외의 것이다.
더욱 바람직하게, 178번 위치의 아미노산은 결실되거나, Ala, Val, Pro, Leu, Ile, Met, Ser, 또는 Thr이고; 179번 위치의 아미노산은 결실되거나, Ala, Val, Pro, Leu, Ile, Met, Ser, 또는 Thr이고; 372번 위치의 아미노산은 Met, Cys, Ile, Tyr, Trp, Phe, Leu, 또는 Thr이고; 392번 위치의 아미노산은 Met, Cys, Ile, Tyr, Trp, 또는 Leu이다.
예컨대, 표 1에 기술되어 있는 것과 같은, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45의 상동체, 오르토로그 및 파라로그 사이에 공유되는 보존 영역 및 모티프를 확인하는 것은 당업자는 알고 있을 것이다. 적합한 결합 모티프를 나타낼 수 있는 상기와 같은 보존 영역을 확인하였는 바, 표 3a 및 3b에 열거된 아미노산에 상응하는 아미노산을 선택하여 임의의 다른 아미노산으로, 바람직하게, 표 2에 제시된 보존적 아미노산으로, 및 더욱 바람직하게, 표 3a 및 3b의 아미노산으로 치환할 수 있다.
추가로, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 mut-PPO를 사용하여 벤족사지논-유도체 제초제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은
a) mut-PPO를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 세포 또는 식물을 생성하고, 여기서 mut-PPO가 발현되는 것인 단계;
b) 벤족사지논-유도체 제초제를 a)의 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 같은 품종의 대조군 세포 또는 식물에 적용하는 단계;
c) 상기 상기 벤족사지논-유도체 제초제의 적용 후, 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 대조군 세포 또는 식물의 성장 또는 생존능을 측정하는 단계, 및
d) 트랜스제닉 세포 또는 식물의 성장과 비교하여 대조군 세포 또는 식물의 성장을 감소시키는 "벤족사지논-유도체 제초제"를 선별하는 단계를 포함한다.
"대조군 세포" 또는 "유사한, 야생형, 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 숙주 세포"란 각각, 본원에 개시된 제초제-저항성 특징 및/또는 본 발명의 특정 폴리뉴클레오티드가 없는 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 숙주 세포인 것으로 한다. 그러므로, "야생형"이라는 용어를 사용하는 것이 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 다른 숙주 세포는 그의 게놈 중에 재조합 DNA를 포함하지 않고/거나, 본원에 개시된 것과 상이한 제초제-저항성 특징을 가지지 않는다는 것을 암시하고자 하는 것은 아니다.
또 다른 목적은
a) mut-PPO 코딩 핵산 라이브러리를 생성하는 단계,
b) 세포 또는 식물에서 상기 핵산을 각각 발현시키고, 상기 세포 또는 식물을 벤족사지논-유도체 제초제로 처리하여, 생성된 mut-PPO 코딩 핵산 집단을 스크리닝하는 단계,
c) 상기 mut-PPO 코딩 핵산 집단에 의해 제공되는 벤족사지논-유도체 제초제-내성 수준을 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 벤족사지논-유도체 제초제-내성 수준과 비교하는 단계,
d) 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 것과 비교하여, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 현저히 증가된 수준의 내성을 제공하는 하나 이상의 mut-PPO 코딩 핵산을 선별하는 단계를 포함하는, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 mut-PPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단계 d)에서 선별된 mut-PPO 코딩 핵산은 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 것과 비교하여, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 세포 또는 식물의 2배 이상만큼 더 큰 저항성 또는 내성을 제공한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 단계 d)에서 선별된 mut-PPO 코딩 핵산은 대조군 PPO 코딩 핵산에 의해 제공되는 것과 비교하여, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 세포 또는 식물의 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상만큼 더 큰 저항성 또는 내성을 제공한다.
저항성 또는 내성은 단계 a)의 라이브러리의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 숙주 세포, 바람직하게, 식물 세포를 생성하고, 상기 트랜스제닉 식물을 대조군 식물 또는 숙주 세포, 바람직하게, 식물 세포와 비교함으로써 측정될 수 있다.
또 다른 목적은
a) 식물 세포 또는 녹조류 배양물 중에서 상기 세포를 사멸에 이르게 하는 유효량의 벤족사지논-유도체 제초제를 확인하는 단계,
b) 상기 식물 세포 또는 녹조류를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
c) 상기 돌연변이유발된 세포 집단을 a)에서 확인된 유효량의 벤족사지논-유도체 제초제와 접촉시키는 단계,
d) 상기 시험 조건에서 살아남은 하나 이상의 세포를 선별하는 단계,
e) 각각 d)에서 선별된 세포로부터의 PPO 유전자의 PCR 증폭 및 서열 분석을 수행하고, 상기 서열을 야생형 PPO 유전자 서열과 비교하는 단계를 포함하는, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 야생형 또는 mut-PPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 식물 또는 조류를 확인하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 돌연변이유발제는 에틸메탄술포네이트 (EMS)이다.
미생물, 식물, 진균, 조류, 혼합 배양물 등 뿐만 아니라, DNA의 환경상 공급원, 예컨대, 토양을 비롯한, 각종의 상이한 잠재적인 공급원 유기체로부터 mut-PPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 확인하는 데 적합한 후보 핵산을 수득하는 데 당업자에게 주지된 많은 방법들이 이용가능하다. 상기 방법은 특히, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 제조, 적합한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용, 공지된 서열 또는 상보성 검정법 (예를 들어, 티로신 상에서의 성장에 대한 것)에 기반한 프로브 사용 뿐만 아니라, 재조합된 또는 셔플링된 mut-PPO 코딩 서열을 제공하기 위해 돌연변이유발 및 셔플링 사용을 포함한다.
후보 및 대조군 PPO 코딩 서열을 포함하는 핵산을 효모에서, 박테리아 숙주 균주에서, 조류에서 또는 고등 식물, 예컨대, 담배 또는 아라비돕시스에서 노출시킬 수 있고, 상이한 농도의 선택된 벤족사지논-유도체 제초제의 존재하에 형질전환된 계통 또는 식물의 시각적 지표 표현형에 따라 PPO 코딩 서열의 고유한 내성의 상대적인 수준을 스크리닝할 수 있다. 용량 반응 및 상기 지표 표현형 (갈색 발색, 성장 억제, 및 제초 효과 등)과 관련된 용량 반응의 상대적인 변화는 GR50 (성장을 50% 감소시키는 농도) 또는 MIC (최소 억제 농도) 값으로 편리하게 표현되는데, 여기서 값의 증가는 발현된 PPO의 고유한 내성 증가에 상응한다. 예를 들어, 박테리아, 예컨대, E. 콜라이의 형질전환에 기초한 상대적으로 빠른 검정 시스템에서, 각 mut-PPO 코딩 서열은 예를 들어, 제어가능한 프로모터 예컨대, lacZ 프로모터의 발현 제어하에, 상이한 PPO 서열이 가능한 한 유사한 발현 수준으로 발현될 수 있도록 하기 위해 예를 들어, 합성 DNA의 사용, 코돈 사용과 같은 이슈를 적합하게 고려함으로써 DNA 서열로서 발현될 수 있다. 대체 후보 PPO 서열을 포함하는 핵산을 발현하는 상기와 같은 계통을 임의적으로, 티로신으로 보충된 배지 중에 상이한 농도의 선택된 벤족사지논-유도체 제초제 상에 플레이팅시킬 수 있고, 갈색의 퇴자병성 색소 형성 억제 정도 및 그를 위한 MIC에 기초하여 발현된 PPO 효소의 고유한 내성의 상대적인 수준을 예측할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 후보 핵산을 식물 물질에 형질전환시켜 트랜스제닉 식물을 생성하고, 형태학상 정상적인 유성 생식성 식물로 재생한 후, 선택된 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 차별적 내성에 대해 측정한다. 적합한 선별 마커, 예컨대, 카나마이신, 예컨대, 아그로박테리움으로부터의 2원 벡터, 및 예를 들어, 담배 잎 절편으로부터의 식물 재생물을 사용하는 적합한 형질전환 방법 다수가 당업계에 주시되어 있다. 임의적으로, 유사하게 대조군 식물 집단을 대조군 PPO를 발현하는 핵산으로 형질전환시킨다. 별법으로, 형질전환되지 쌍자엽 식물, 예컨대, 아라비돕시스 또는 담배를 대조군으로서 사용할 수 있는데, 그 이유는 상기의 것은 어느 경우에서든 그 자신의 내인성 PPO를 발현하기 때문이다. 상기 기술된 벤족사지논-유도체에 대한 다양한 제1 식물 형질전환 또는 그의 자손의 제초제 내성 수준의 평균 및 분포를 다양한 범위의 상이한 농도의 제초제에서 식물 손상, 분열 조직의 백화 증상에 기초하여 일반적인 방식으로 평가한다. 상기 데이터는 예를 들어, x축 상에는 "용량"이 플롯팅되어 있고, y축 상에는 "사멸율(%)," "제초 효과," 발아된 녹색 식물의 개수" 등이 플롯팅되어 있는 용량/반응 곡선으로부터 도출된 GR50 값으로 표현될 수 있으며, 여기서 GR50 값의 증가는 발현된 PPO의 고유한 내성 수준 증가에 상응한다. 제초제는 발아 전 또는 발아 후에 적합하게 적용될 수 있다.
또 다른 목적은 상기 정의된 방법에 의해 확인될 수 있는, mut-PPO를 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 식물 세포에서 핵산의 발현을 통해 식물의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성 또는 내성이 증가되는 것인, 야생형 또는 mut-PPO 핵산에 의해 형질전환된 식물 세포, 또는 야생형 또는 mut-PPO 핵산을 발현하는 식물이 수득될 수 있도록 돌연변이화된 식물 세포에 관한 것이다.
"발현/발현하는" 또는 "유전자 발현"이라는 용어는 특이 유전자 또는 특이 유전자들, 또는 특이 유전자 구축물의 전사를 의미한다. "발현" 또는 "유전자 발현"이라는 용어는 특히 유전자 또는 유전자들, 또는 유전자 구축물이 구조 RNA (rRNA, tRNA) 또는 mRNA로 전사되는 것, 또는 이어서, 상기와 같은 RNA가 단백질로 번역되는 것을 의미한다. 상기 과정은 DNA 전사, 및 생성된 mRNA 생성물의 프로세싱을 포함한다.
원하는 효과를 얻기 위해, 즉, 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 내성 또는 저항성을 띠는 본 발명의 식물을 수득하기 위해, 하나 이상의 핵산을 당업자에게 공지된 방법 및 수단에 의해서 "과다발현"시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "발현 증가" 또는 "과다발현"이라는 용어는 원래의 야생형 발현 수준에 부가적인 임의 형태의 발현을 의미한다. 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에서 문서로 잘 입증되어 있고, 그러한 방법으로는 예를 들어, 적절한 프로모터에 의해 구동되는 과다발현, 전사 인핸서 또는 번역 인핵서의 사용을 포함한다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 상향조절시키기 위해, 프로모터 또는 인핸서 요소로서의 역할을 하는 단리된 핵산을 비-이종성 형태의 폴리뉴클레오티드의 적절한 위치에 (전형적으로 상류에) 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현 제어를 위해서 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실, 및/또는 치환에 의해 생체내에서 변경될 수 있거나 (US 5,565,350 (크믹(Kmiec)); WO9322443 (잘링(Zarling) 등) 참조), 또는 단리된 프로모터는 본 발명의 유전자로부터 적절한 거리에 적절한 방향으로 도입될 수 있다.
폴리펩티드 발현을 원하는 경우, 일반적으로는 폴리뉴클레오티드 코딩 영역의 3' 말단에 폴리아데닐화 영역을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리아데닐화 영역은 천연 유전자로부터, 다양한 다른 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA로부터 유래될 수 있다. 부가되는 3' 말단 서열은 예를 들어, 노팔린 신타제 또는 옥토파인 신타제 유전자로부터, 또는 별법으로, 또 다른 식물 유전자로부터, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵 유전자로부터 유래될 수 있다.
시토졸에 축적되는 성숙한 메세지의 양을 증가시키기 위해 인트론 서열이 또한 부분 코딩 서열의 5' 비번역 영역 (UTR) 또는 코딩 서열에 부가될 수 있다. 식물 및 동물 발현 구축물, 둘 모두에서 전사 단위에 스플라이싱가능한 인트론을 포함시킨 경우, 유전자 발현은 mRNA 및 단백질, 둘 모두의 수준이 최대 1,000배까지 증가한 것으로 나타났다 (문헌 [Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405]; [Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200]). 상기와 같은 인트론에 의한 유전자 발현 증진은 전형적으로 전사 단위의 5' 말단 가까이에 배치될 때에 가장 크다. 옥수수 인트론인 Adh1-S 인트론 1, 2, 및 6, 브론즈(Bronze)-1 인트론 사용이 당업계에 공지되어 있다. 그에 관한 일반 정보를 위해서는 문헌 [The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)]를 참조할 수 있다.
본원에서 의미하는 "도입" 또는 "형질전환"이라는 용어는 전달에 사용되는 방법에는 상관없이, 내인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 전달하는 것을 의미한다. 기관형성에 의해서든 또는 배발생에 의해서든, 후속의 클론 증식이 가능한 식물 조직을 본 발명의 유전자 구축물로 형질전환시키고, 그로부터 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 선택되는 특정 조직은 형질전환되는 특정 종에 이용가능한, 및 그에 최적인 클론 증식 시스템에 따라 달라질 것이다. 조직 표적의 예로는 잎 절편, 화분, 배아, 자엽, 배축, 대배우체, 캘러스 조직, 현 분열 조직성 조직 (예컨대, 선단 분열 조직, 곁눈, 및 뿌리 분열 조직), 및 유도된 분열 조직성 조직 (예컨대, 자엽 분열 조직 및 배축 분열 조직)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 일시적으로 또는 안정적으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 예를 들어, 플라스미드로서 비-통합된 상태로 유지될 수 있다. 별법으로, 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 이어서, 생성된 형질전환된 식물 세포를 당업자에게 공지된 방식으로 사용하여 형질전환된 식물을 재생할 수 있다.
외래 유전자를 식물 게놈 내로 전달하는 것을 형질전환이라 일컫는다. 식물 종의 형질전환은 이에 상당히 일반화된 기법이다. 이롭게도, 관심의 대상이 되는 유전자를 적합한 선조 세포 내로 도입하는 데 여러 형질전환 방법 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 식물을 형질전환시키고, 식물 조직 또는 식물 세포로 식물을 재생하는 기술된 방법을 사용하여 일시적으로 또는 안정적으로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환 방법으로는 리포좀 사용, 전기천공, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, 식물 내로 직접 DNA 주입, 입자 총 충격법, 바이러스 또는 화분을 사용하는 형질전환 및 미세주입을 포함한다. 방법은 프로토플라스트인 경우, 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (문헌 [Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74]; [Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8:363-373]); 프로토플라스트 전기천공 (문헌 [Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102]); 식물 물질 내로의 미세주입 (문헌 [Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185]); (비-통합성) 바이러스로 감염된 DNA 또는 RNA-코팅된 입자 충격법 (문헌 [Klein TM et al., (1987) Nature 327:70]) 등으로부터 선택될 수 있다. 트랜스제닉 농작물을 비롯한, 트랜스제닉 식물은 바람직하게 아그로박테리움을 매개로 한 형질전환을 통해 제조된다. 이로운 형질전환 방법은 식물체내 형질전환이다. 이를 위해, 예를 들어, 아그로박테리아가 식물 종자 상에서 작용할 수 있게 하거나, 또는 식물 분열 조직에 아그로박테리아를 접종할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질전환된 아그로박테리아 현탁액이 온전한 식물 또는 적어도 꽃 원시 세포 상에서 작용할 수 있도록 하는 것이 특히 편리한 것으로 입증되었다. 이어서, 처리된 식물의 종자를 수득할 때까지 식물을 성장시킨다 (문헌 [Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743]). 아그로박테리움을 매개로 한 벼의 형질전환 방법은 주지된 벼 형질전환 방법, 예컨대, 하기 문헌: 유럽 특허 출원 EP 1198985 A1, [Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996)]; [Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993)], [Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994)]) (상기 개시내용은 마치 전체가 기술되어 있는 것과 같이, 본원에 참고로 포함된다 중 임의 것에 기술된 것을 포함한다. 옥수수 형질전환의 경우, 바람직한 방법은 문헌 [Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996)] 또는 [Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002)] (상기 개시내용은 마치 전체가 기술되어 있는 것과 같이, 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 상기 방법은 일례로 문헌 [B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143] 및 [Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225]에 추가로 기술되어 있다. 바람직하게는 발현시키고자 하는 핵산 또는 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 데 적합한 벡터, 예를 들어, pBin19 (문헌 [Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711]) 내로 클로닝한다. 이어서, 상기 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리아는 예를 들어, 흠집이 있는 잎 또는 잘게 썰린 잎을 아그로박테리아액에 침지시킨 후, 그를 적합한 배지 중에서 배양함으로써 수행하는 것과 같이, 식물, 예컨대, 모델로서 사용되는 식물, 예컨대, 아라비돕시스 (아라비돕시스 탈리아나는 본 발명의 범주 내에서 농작물로서 간주되지 않는다) 또는 농작물, 예컨대, 일례로, 담배 식물의 형질전환을 위해 공지된 방법에 사용될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 식물의 형질전환은 예를 들어, 문헌 [Hoefgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877]에 기술되어 있거나, 특히 문헌 [F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38]로부터 공지되어 있다.
이어서, 온전한 식물로 재생되어야 하는 체세포 형질전환 이외에도, 식물 분열 조직 세포, 및 특히, 생식 세포로 발생되는 상기와 같은 세포도 또한 형질전환시킬 수 있다. 이러한 경우, 형질전환된 생식 세포는 천연 식물 발생을 따르고, 이로써 트랜스제닉 식물이 생성된다. 따라서, 예를 들어, 아라비돕시스의 종자를 아그로박테리아로 처리하고, 종자를, 특정 비율이 형질전환되어 트랜스제닉인 발생 식물로부터 수득단다 (문헌 [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289]; [Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]). 대체 방법은 개화의 반복된 제거, 및 형질전환된 아그로박테리아와 로제트 중심의 절개 부위와의 인큐베이션에 기초하며, 이를 통해 형질전환된 종자는 유사하게 시간상 후속 시점에 수득할 수 있다 (문헌 [Chang (1994). Plant J. 5: 551-558]; [Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370]). 그러나, 특히 효과적인 방법은 예컨대, "꽃 침지(floral dip)" 방법과 같은, 진공 침윤 방법을 통해 그를 변형시키는 것이다. 아라비돕시스의 진공 침윤의 경우, 감압하에서 온전한 식물을 아그로박테리아 현탁액으로 처리하는 반면 (문헌 [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199]), "꽃 침지" 방법의 경우에는 발생 중인 꽃 조직을 계면활성제로 처리된 아그로박테리아 현탁액과 함께 잠깐 동안 인큐베이션시킨다 (문헌 [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]). 양쪽 경우 모두에서 특정 비율의 트랜스제닉 종자를 수거하고, 이들 종자는 상기 기술된 선별 조건하에서 성장시킴으로써 비-트랜스제닉 종자로부터 구별될 수 있다. 추가로, 색소체의 안정한 형질전환은 색소체가 대부분의 작물에서 모계 유전되기 때문에, 화분을 통한 트랜스진의 유동의 위험이 감소되어 있거나, 제거되어 있다는 점에서 이롭다. 엽록체 게놈의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]에 체계적으로 제시되어 있는 과정에 의해 달성된다. 간략하면, 형질전환시키고자 하는 서열을 엽록체 게놈과 상동성인 측면에 위치하는 서열 사이에 있는 선별가능한 마커 유전자와 함께 클로닝시킨다. 상기의 상동성인 측면 서열이 플라스톰으로의 부위 특이 통합을 지시한다. 색소체 형질전환은 다수의 상이한 식물 종에 대해 기술되어 있고, 그에 관한 개요는 문헌 [Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21;312 (3):425-38] 또는 [Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28]에 제공되어 있다. 추가의 생물공학적 진전을 통해 일시적으로 공동 통합되는 마커 유전자에 의해 제조될 수 있는, 마커 무함유 색소체 형질전환체 형태가 최근 보고되었다 (문헌 [Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229]). 유전적으로 변형된 식물 세포는 당업자에게 잘 알려져 있는 모든 방법을 통해 재생될 수 있다. 적합한 방법은 상기 언급된 (S.D. Kung and R. Wu, Potrykus) 또는 (Hoefgen and Willmitzer)의 공개 문헌에서 살펴볼 수 있다.
일반적으로, 형질전환 후, 식물 세포 또는 세포 군집은 관심의 대상이 되는 유전자와 함께 공동으로 전달된 식물-발현가능한 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 마커의 존재에 대해 선별되고, 이어서, 형질전환된 물질은 전체 식물로 재생된다. 형질전환된 식물을 선별하기 위해서 형질전환된 식물이 형질전환되지 않은 식물로부터 구별될 수 있도록 형질전환에서 수득된 식물 물질을 대체로는 선별 조건에 가한다. 예를 들어, 상기 기술된 방식으로 수득된 종자를 식목할 수 있고, 초기 성장기 이후, 분무함으로써 적합한 선별에 이용한다. 추가의 가능성은 종자를 성장시키는 데 있는데, 적절할 경우, 멸균 후, 형질전환된 종자만이 식물로 성장할 수 있도록 적합한 선별제를 사용하여 아가 플레이트 상에서 종자를 성장시킬 수 있다. 별법으로, 예컨대, 상기 기술된 것과 같은 선별가능한 마커의 존재에 대해 형질전환된 식물을 스크리닝한다.
DNA 전달 및 재생 후, 추정상으로 형질전환된 식물을 또한 예를 들어, 써던 분석법을 이용함으로써 관심의 대상이 되는 유전자의 존재, 카피수 및/또는 게놈 조직화에 대하여 평가할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 새로 도입된 DNA의 발현 수준은 노던 및/또는 웨스턴 분석법을 사용함으로써 모니터링할 수 있으며, 상기 두 기법은 모두 당업계의 숙련가에게 주지되어 있는 것이다.
생성된 형질전환된 식물을 다양한 수단, 예컨대, 클론 번식 또는 고전적 육종 기법에 의해 번식시킬 수 있다. 예를 들어, 제1세대 (또는 T1) 형질전환된 식물을 자가 수정시킬 수 있고, 동형접합성 제2세대 (또는 T2) 형질전환체를 선별한 후, T2 식물을 고전적 육종 기법을 통해 추가로 번식시킬 수 있다. 생성된 형질전환된 유기체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이는 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예컨대, 발현 카세트를 포함하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 조직과 형질전환되지 않은 조직으로 이루어진 접목 (예컨대, 식물에서, 형질전환되지 않은 어린 가지에 접목된 형질전환된 근경)일 수 있다.
바람직하게, 야생형 또는 mut-PPO 핵산은 a) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45에 제시된 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체 또는 유도체; b) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46에 제시된 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; c) a) 또는 b) 중 어느 것의 60개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) a) 내지 c) 중 어느 것의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, 식물에서의 핵산의 발현을 통해 식물의 야생형 품종과 비교하여 식물의 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물에서의 핵산의 발현을 통해 식물의 야생형 품종과 비교하여 식물의 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가되는 것인, 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 식물, 바람직하게, 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.
본원에 기술된 식물은 트랜스제닉 농작물 또는 비-트랜스제닉 식물일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 서열, 발현 카세트, 유전자 구축물 또는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 핵산 서열, 발현 카세트 또는 벡터로 형질전환된 유기체와 관련하여 "트랜스제닉," "트랜스진" 또는 "재조합"이란
(a) 본 발명의 방법에 유용한 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는
(b) 본 발명에 따른 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 유전자 제어 서열(들), 예를 들어, 프로모터, 또는
(c) a) 및 b)가 그의 천연 유전적 환경에 위치하지 않거나, 재조합 방법에 의해 변형이 되며, 상기 변형은 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역전 또는 삽입의 형태를 취할 수 있는 것인 재조합 방법에 의해 이루어지는 모든 구축을 의미한다. 천연 유전적 환경이란 원 식물내 천연 게놈 또는 염색체 유전자좌 또는 게놈 라이브러리 내의 존재를 의미하는 것으로 이해된다. 게놈 라이브러리의 경우, 핵산 서열의 천연 유전적 환경은 바람직하게는 적어도 부분적으로 유지된다. 환경은 적어도 한쪽에서 핵산 서열의 측면에 위치하고, 그의 서열 길이는 50 bp 이상, 바람직하게, 500 bp 이상, 특히 바람직하게, 1,000 bp 이상, 가장 바람직하게, 5,000 bp 이상이다. 해당 발현 카세트가 비-천연, 합성 ("인공") 방법, 예컨대, 돌연변이유발 처리에 의해 변형되었을 때, 상기 정의된 바와 같은 천연적으로 발생된 발현 카세트 - 예를 들어, 핵산 서열의 천연 프로모터와, 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 핵산 서열의 천연적으로 발생된 조합이 트랜스제닉 발현 카세트가 된다. 적합한 방법은 예를 들어, US 5,565,350 또는 WO 00/15815에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적을 위한 트랜스제닉 식물은 상기와 같이, 본 발명의 방법에서 사용되는 핵산은 상기 식물의 게놈 중의 그의 천연 유전자좌에 존재하지 않고, 핵산은 상동성 방식으로 또는 이종성 방식으로 발현될 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 그러나, 언급한 바와 같이, 트랜스제닉은 또한 본 발명에 따른, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 핵산이 식물의 게놈 중의 그의 천연 위치에 있지만, 서열이 천연 서열과 관련해서는 변형되어 있고/거나, 천연 서열의 조절 서열이 변형되어 있는 것을 의미한다. 트랜스제닉은 바람직하게 본 발명에 따른 핵산이 게놈내 비천연 유전자좌에서 발현되는 것, 즉, 핵산의 상동성 또는 바람직하게는 이종성 발현이 일어난다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 트랜스제닉 식물은 본원에 언급되어 있다. 추가로, "트랜스제닉"이라는 용어는 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드 모두 또는 그 일부를 포함하는, 임의의 식물, 식물 세포, 캘러스, 식물 조직, 또는 식물의 일부를 의미한다. 많은 경우에 있어서, 재조합 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 그 일부는 염색체 또는 안정한 잉여 염색체 요소 내로 안정하게 통합됨으로써 대대로 전해지게 된다. 본 발명의 목적을 위해, "재조합 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 유전 공학에 의해 변경, 재배열, 또는 변형된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그 예로는 임의의 클로닝된 폴리뉴클레오티드, 또는 이종성 서열에 연결 또는 결합된, 임의의 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "재조합"이라는 용어는 천연적으로 발생된 이벤트, 예컨대, 자연 돌연변이로부터, 또는 비-자연 돌연변이유발에 이은 선택 육종으로부터 발생되는 폴리뉴클레오티드 변경을 의미하는 것이 아니다.
비-자연 돌연변이유발 및 선택 육종에 기인하여 발생된 돌연변이를 포함하는 식물을 본원에서는 비-트랜스제닉 식물로서 지칭하고, 이는 본 발명에 포함된다. 식물이 트랜스제닉이고, 다중 mut-PPO 핵산을 포함하는 실시양태에서, 핵산은 상이한 게놈으로부터 또는 동일한 게놈으로부터 유래될 수 있다. 별법으로, 식물이 비-트랜스제닉이고, 다중 mut-PPO 핵산을 포함하는 실시양태에서, 핵산은 상이한 게놈 상에 또는 동일 게놈 상에 위치한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이 육종에 의해 제조된 제초제-저항성 식물을 포함한다. 상기 식물은 mut-PPO를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 하나 이상의 "벤족사지논-유도체 제초제"에 대해 내성을 띤다. 상기 방법은 예를 들어, 식물 또는 종자를 돌연변이유발원, 특히, 화학적 돌연변이유발원, 예컨대, 에틸 메탄술포네이트 (EMS)에 노출시키고, 적어도 하나 이상의 벤족사지논-유도체 제초제에 대하여 증강된 내성을 가지는 식물에 대하여 선별하는 것을 포함할 수 있다.
그러나, 본 발명은 화학적 돌연변이유발원 EMS를 포함하는, 돌연변이유발 방법에 의해 제조된 제초제-내성 식물로 제한되지 않는다. 본 발명의 제초제-저항성 식물을 제조하는 데 당업계에 공지된 임의의 돌연변이유발 방법이 사용될 수 있다. 상기와 같은 돌연변이유발 방법으로는 예를 들어, 하기 돌연변이유발원: 방사선, 예컨대, X선, 감마선 (예컨대, 코발트 60 또는 세슘 137), 중성자 (예컨대, 원자로에서 우라늄 235에 의한 핵 분열의 생성물), 베타 방사선 (예컨대, 방사성 동위 원소, 예컨대, 인 32 또는 탄소 14로부터 방출된 것), 및 자외선 (바람직하게, 2,500 내지 2,900 nm), 및 화학적 돌연변이유발원, 예컨대, 염기 유사체 (예컨대, 5-브로모-우라실), 관련 화합물 (예컨대, 8-에톡시 카페인), 항생제 (예컨대, 스트렙토니그린 ), 알킬화제 (예컨대, 황 머스타드, 질소 머스타드, 에폭시드, 에틸렌아민, 술페이트, 술포네이트, 술폰, 락톤), 아지드, 히드록실아민, 아질산, 또는 아크리딘 중 임의의 하나 이상의 것을 사용하는 것을 포함한다. 제초제-저항성 식물은 또한 조직 배양 방법을 사용하여 제초제-저항성 돌연변이를 포함하는 식물 세포에 대해 선별한 후, 그로부터 제초제-저항성 식물을 재생함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,773,702호 및 제5,859,348호 (상기 두 특허 모두는 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)를 참조할 수 있다. 돌연변이 육종에 관한 추가의 상세한 설명은 문헌 ["Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company] (상기 개시내용은 본원에서 참고로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다. 상기 정의 이외에도, "식물"이라는 용어는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 임의 성숙 또는 발생 단계의 농작물 뿐만 아니라, 상기의 임의 식물로부터 채취 또는 유래된 임의 조직 또는 기관 (식물의 일부)를 포함하는 것으로 한다. 식물의 일부는 줄기, 뿌리, 꽃, 배주, 수술, 잎, 배아, 분열 조직부, 캘러스 조직, 꽃밥 배양물, 배우체, 포자체, 화분, 소포자, 프로토플라스트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식물은 하나 이상의 mut-PPO 핵산 또는 과다발현된 야생형 PPO 핵산을 포함하고, 식물의 야생형 품종과 비교하여 증가된 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성을 가진다. 본 발명의 식물은 1 초과의 게놈을 포함할 수 있기 때문에, 이들은 상이한 게놈으로부터의 다중 야생형 또는 mut-PPO 핵산을 가질 수 있다. 예를 들어, 식물은 보통 A 및 B 게놈으로 지칭되는 2개의 게놈을 포함한다. PPO는 필요한 대사 효소이기 때문에, 각 게놈은 PPO 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자 (즉, 하나 이상의 PPO 유전자)를 가지는 것으로 추정된다. 본원에서 사용되는 바, "PPO 유전자 유전자좌"라는 용어는 게놈 상의 PPO 유전자의 위치를 의미하고, "PPO 유전자" 및 "PPO 핵산"이라는 용어는 PPO 효소를 코딩하는 핵산을 의미한다. 각 게놈 상의 PPO 핵산은 그의 뉴클레오티드 서열에 있어서 또 다른 게놈 상의 PPO 핵산과 차이를 보인다. 당업자는 당업계에 공지되어 있는 유전자 교차 및/또는 서열 분석 방법 또는 엑소뉴클레아테 분해 방법을 통해 각 PPO 핵산의 기원 게놈을 결정할 수 있다.
본 발명은 식물의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성이 증가되어 있는, 1, 2, 3개 초과의 mut-PPO 대립형질을 포함하는 식물을 포함한다. mut-PPO 대립형질은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45"에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체 또는 유도체, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46"에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 유도체, 상동체, 오르토로그, 파라로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것의 60개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
"대립형질" 또는 "대립형질 변이체"는 같은 염색체 위치에 위치하는 주어진 유전자의 대체 형태이다. 대립형질 변이체는 단일 뉴클레오티드 다형태 (SNP) 뿐만 아니라, 소형 삽입/결실 다형성 (INDEL)을 포함한다. (INDEL)의 크기는 보통 100 bp 미만이다. SNP 및 INDEL인 대부분의 유기체의 천연적으로 발생된 다형태 계통에서 가장 큰 서열 변이체 세트를 형성한다.
"품종"이라는 용어는 당업자에 의해 한 재배종 또는 품종을 또 다른 재배종 또는 품종과 구별 짓기에 충분한 것으로서 인정되는 공통된 특징 또는 소질 세트를 공유하는 정의되는 한 종 내의 식물 군을 의미한다. 임의의 주어진 재배종 또는 품종의 모든 식물이 전체 유전자 또는 분자 수준에서 유전적으로 동일하다거나, 또는 임의의 주어진 식물이 모든 유전자좌에서 동형접합성이라는 것을 암시하는 것은 아니다. 순수 육종 재배종 또는 품종이 자가 수분되었을 때, 자손들 모두가 특정 소질을 포함하는 경우라면, 재배종 또는 품종은 상기 소질에 대해 "순수 육종"인 것으로 간주된다. "육종 계통" 또는 "계통"이라는 용어는 당업자에 의해 한 육종 계통 또는 계통을 또 다른 육종 계통 또는 계통과 구별 짓기에 충분한 것으로서 인정되는 공통된 특징 또는 소질 세트를 공유하는 정의되는 한 재배종 내의 식물 군을 의미한다. 임의의 주어진 육종 계통 또는 계통의 모든 식물이 전체 유전자 또는 분자 수준에서 유전적으로 동일하다거나, 또는 임의의 주어진 식물이 모든 유전자좌에서 동형접합성이라는 것을 암시하는 것은 아니다. 순수 육종 계통 또는 육종 계통이 자가 수분되었을 때, 자손들 모두가 특정 소질을 포함하는 경우라면, 육종 계통 또는 계통은 상기 소질에 대해 "순수 육종"인 것으로 간주된다. 본 발명에서, 소질은 식물 또는 종자의 PPO 유전자 중의 돌연변이로부터 발생한다.
mut-PPO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 제초제-저항성 식물 또한 유성 생식을 포함하는 통상적인 식물 육종을 통해 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법에서 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 상기 방법은 본 발명의 제초제-저항성 식물인 제1 식물을, 제1 식물과 동일한 제초제 또는 제초제들에 대해 저항성을 띠거나 저항성을 띠지 않을 수 있거나, 또는 제1 식물과 상이한 제초제 또는 제초제들에 대해 저항성을 띨 수 있는 제2 식물에 교배시키는 것을 포함한다. 제2 식물은 제1 식물과 교배되었을 때 생존가능한 자손 식물 (즉, 종자)을 생산할 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 전형적으로는 제1 및 제2 식물은 동일한 종이다. 상기 방법은 임의적으로 제1 식물의 mut-PPO 폴리펩티드를 포함하고, 제2 식물의 제초제 저항성 특징을 포함하는 자손 식물에 대해 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 방법에 의해 생산된 자손 식물은 제1 또는 제2 식물 중 어느 하나, 또는 그 둘 모두와 비교하였을 때 증가된 제초제에 대한 저항성을 가진다. 제1 및 제2 식물이 상이한 제초제에 대하여 저항성을 띠는 경우, 자손 식물은 제1 및 제2 식물의 조합된 제초제 내성 특징을 가지게 될 것이다. 본 발명의 방법은 추가로 제1 교배의 자손 식물을 제1 또는 제2 식물과 동일한 계통 또는 유전자형의 식물에 역교배시키는 하나 이상의 세대를 포함할 수 있다. 별법으로, 제1 교배 또는 임의의 후속 교배의 자손을 제1 또는 제2 식물과 상이한 계통 또는 유전자형의 제3 식물에 교배시킬 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 발현 카세트, 또는 형질전환 벡터로 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자, 및 비-인간 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자, 및 비-인간 숙주 세포는 각각 형질전환되지 않은 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 비-인간 숙주 세포를 사멸시키거나, 그의 성장을 억제시키는 제초제의 수준에서 하나 이상의 제초제에 대해 강화된 내성 또는 저항성을 가진다. 바람직하게, 본 발명의 형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 세포, 및 종자는 아라비돕시스 탈리아나 및 농작물이다.
본 발명의 식물은 mut-PPO 핵산 이외에도 야생형 PPO 핵산을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 벤족사지논-유도체 제초제 내성 계통은 다중의 PPO 동종효소 중 오직 하나에만 돌연변이를 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 그러므로, 본 발명은 하나 이상의 야생형 PPO 핵산 이외에도 하나 이상의 mut-PPO 핵산을 포함하는 식물을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명 본 발명의 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로서, 여기서 종자는 상기 종자의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성의 증가를 위한 순수 육종인 것인 종자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포를 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물 세포의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 트랜스제닉 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 식물 세포를 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 식물 세포로부터 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 식물을 생성하는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
그 결과, 본 발명의 mut-PPO 핵산은 관심의 대상이 되는 식물에서의 발현을 위한 발현 카세트로 제공된다. 카세트는 본 발명의 mut-PPO 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 것이다. 본원에서 사용되는 바, "조절 요소"라는 용어는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이는 프로모터, 인핸서, 인트론, 5' UTR, 및 3' UTR을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "작동가능하게 연결된"이라는 것은 프로모터 서열이 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시시키고 매개하는, 프로모터와 제2 서열 간의 기능적인 연결인 것으로 한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 것이라는 것은 연결된 핵산 서열들이 인접해 있고, 두 단백질 코딩 영역을 연결시키는 것이 필요한 경우에는 인접해 있고, 동일한 리딩 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 카세트는 추가로 유기체 내로 함께 공동 형질전환시키고자 하는 하나 이상의 추가의 유전자를 함유할 수 있다. 별법으로, 추가의 유전자(들)는 다중 발현 카세트들 상에서 제공될 수 있다.
상기와 같은 발현 카세트에는 mut-PPO 핵산 서열이 조절 영역의 전사 조절하에 있도록 그를 삽입하기 위한 다수의 제한 부위가 제공된다. 발현 카세트는 선별가능한 마커 유전자를 추가로 함유할 수 있다.
발현 카세트는 발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로 전사 및 번역 개시 영역 (즉, 프로모터), 본 발명의 mut-PPO 핵산 서열, 및 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 포함할 것이다. 프로모터는 식물 숙주 및/또는 본 발명의 mut-PPO 핵산 서열에 대해 천연 또는 유사성, 또는 외래 또는 이종성일 수 있다. 추가로, 프로모터는 천연 서열일 수 있거나, 별법으로 합성 서열일 수 있다. 프로모터가 식물 숙주에 대해 "외래" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 도입되는 천연 식물에서 이러한 프로모터가 발견되지 않는다는 것을 의미한다. 프로모터가 본 발명의 mut-PPO 핵산 서열에 대해 "외래" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 작동가능하게 연결된 본 발명의 mut-PPO 핵산 서열에 대한 천연 또는 천연 발생 프로모터가 아니라는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 키메라 유전자는 코딩 서열에 이종성인 전사 개시 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다.
이종성 프로모터를 사용하여 본 발명의 mut-PPO 핵산을 발현시키는 것이 바람직할 수 있지만, 천연 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 이같은 구축물은 식물 또는 식물 세포에서의 mut-PPO 단백질의 발현 수준을 변화시킬 것이다. 따라서, 식물 또는 식물 세포의 표현형이 변경된다.
종결 영역은 전사 개시 영역과 천연일 수 있거나, 작동가능하게 연결된, 관심의 대상이 되는 mut-PPO 서열과 천연일 수 있거나, 식물 숙주와 천연일 수 있거나, 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다 (즉, 프로모터, 관심의 대상이 되는 mut-PPO 핵산 서열, 식물 숙주 또는 그의 임의의 조합에 대해 외래 또는 이종성). A. 투메파시엔스의 Ti-플라스미드, 예컨대, 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역으로부터 편리한 종결 영역이 이용가능하다. 또한, 문헌 [Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144]; [Proudfoot (1991) Cell 64:671-674]; [Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149]; [Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272]; [Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158]; [Ballas t al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903]; 및 [Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639]를 참조할 수 있다. 적절할 경우, 유전자(들)이 형질전환된 식물에서의 발현 증가를 위해 최적화될 수 있다. 즉, 발현 개선을 위해 식물이 선호하는 코돈을 사용하여 유전자들을 합성할 수 있다. 예를 들어, 숙주가 선호하는 코돈 사용에 관한 논의를 위해 문헌 [Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11]을 참조할 수 있다. 식물이 선호하는 유전자를 합성하기 위한 방법은 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,380,831호, 및 제5,436,391호, 및 문헌 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498] (이들은 본원에 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다.
세포성 숙주에서의 유전자 발현을 증진시키는 추가의 서열 변형이 공지되어 있다. 이러한 것으로는 가성(spurious) 폴리아데닐화 신호, 엑손-인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포존-유사 반복부를 코딩하는 서열, 및 유전자 발현에 해로울 수 있는, 특징이 잘 규명되어 있는 다른 서열의 제거를 포함한다. 숙주 세포에서 발현되는 공지된 유전자를 참고로 하여 계산된 바와 같이, 서열의 G-C 함량은 주어진 세포성 숙주에 대해 평균인 수준으로 조정될 수 있다. 가능한 경우, 예상되는 헤어핀 2차 mRNA 구조를 회피하기 위해 서열이 변형된다. 유전자 발현을 증진시키기 위한 뉴클레오티드 서열 또한 식물 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 것으로는 옥수수 AdhI, 인트론I 유전자의 인트론 (문헌 [Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987]), 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 옥수수 황화 반점 바이러스 및 알팔파 모자이크 바이러스로부터의 리더 서열 (W-서열) (문헌 [Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987] 및 [Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990])을 포함한다. 옥수수의 쉬룬켄트(shrunkent)-1 유전자좌로부터의 제1 인트론이 키메라 유전자 구축물에서 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 미국 특허 번호 제5,424,412호 및 제5,593,874호에는 유전자 발현 구축물에서의 특정 인트론의 사용이 개시되어 있고, 문헌 [Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994]에서는 또한 인트론이 조직 특이적으로 유전자 발현을 조절하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. mut-PPO 유전자 발현을 추가로 증진시키거나 최적화하기 위해, 본 발명의 식물 발현 벡터는 또한 매트릭스 부착 영역 (MAR)을 함유하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 그러면, 상기와 같이 변형된 발현 시스템으로 형질전환된 식물 세포는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 과다발현 또는 구성적 발현을 나타낼 수 있다.
발현 카세트는 추가로 발현 카세트 구축물 내에 5' 리더 서열을 함유할 수 있다. 그러한 리더 서열은 번역을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있고, 이는 피코나바이러스 리더, 예를 들어, EMCV 리더 (엔세팔로미오카르디티스 5' 비-코딩 영역) (문헌 [Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130]); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (문헌 [Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238]), MDMV 리더 (옥수수 왜소 모자이크 바이러스) (문헌 [Virology 154:9-20]), 및 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (문헌 [Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94]); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA (AMV RNA 4)로부터의 비-번역 리더 (AMV RNA 4) (문헌 [Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625]); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (문헌 [Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256]); 및 옥수수 황화 반점 바이러스 리더 (MCMV) (문헌 [Lommel et al. (1991) Virology 81 :382-385])를 포함한다. 문헌 [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968] 또한 참조할 수 있다. 번역을 증진시키는 것으로 알려져 있는 다른 방법, 예를 들어, 인트론 등이 사용될 수 있다.
발현 카세트의 제조에서, DNA 서열을 적절한 배향으로, 적합할 경우, 적절한 리딩 프레임 내에 제공하기 위해 다양한 DNA 단편들이 조작될 수 있다. 이를 위해, DNA 단편들을 연결하기 위해 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있거나, 또는 편리한 제한 부위, 과잉 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공하기 위해 다른 조작이 포함될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 시험관내 돌연변이유발, 프라이머 수복, 제한, 어닐링, 재치환, 예컨대, 전이 및 전환이 포함될 수 있다.
다수의 프로모터가 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 원하는 결과를 기초로 하여 프로모터가 선택될 수 있다. 핵산은 구성적 프로모터, 조직-선호형 프로모터 또는 식물에서의 발현을 위한 다른 프로모터와 조합될 수 있다. 상기와 같은 구성적 프로모터로는 예를 들어, WO 99/43838 및 미국 특허 번호 제6,072,050호에 개시되어 있는 Rsyn7 프로모터 및 다른 구성적 프로모터의 코어 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (문헌 [Odell et al. (1985) Nature 313:810-812]); 벼 액틴 (문헌 [McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171]); 유비퀴틴 (문헌 [Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632] 및 [Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]); pEMU (문헌 [Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588]); MAS (문헌 [Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730]); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 제5,659,026호) 등을 포함한다. 다른 구성적 프로모터로는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,608,149호; 제5,608,144호; 제5,604,121호; 제5,569,597호; 제5,466,785호; 제5,399,680호; 제5,268,463호; 제5,608,142호; 및 제6,177,611호의 것을 포함한다.
조직-선호형 프로모터를 사용하여 특정 식물 조직 내에서 증진된 mut-PPO 발현을 표적화할 수 있다. 그러한 조직-선호형 프로모터로는 잎-선호형 프로모터, 뿌리-선호형 프로모터, 종자-선호형 프로모터, 및 줄기-선호형 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 조직-선호형 프로모터로는 문헌 [Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265]; [Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803]; [Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343]; [Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168]; [Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341]; [Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535]; [Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524]; [Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778]; [Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196]; [Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138]; [Matsuoka el al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590]; 및 [Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505]의 것을 포함한다. 상기 프로모터는 필요할 경우, 약한 발현을 위해 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 핵산은 발현을 위해 엽록체로 표적화될 수 있다. 이러한 방식에서, 관심의 대상이 되는 핵산이 엽록체 내로 직접적으로 삽입되지 않는 경우, 발현 카세트는 관심의 대상이 되는 유전자 생성물을 엽록체로 지시하는 엽록체 운반 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엽록체-표적화 서열을 추가로 함유할 것이다. 상기와 같은 운반 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 엽록체-표적화 서열과 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 것은 두 서열이 인접해 있고, 동일한 리딩 프레임 내에 있도록, 운반 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (즉, 엽록체-표적화 서열)이 본 발명의 mut-PPO 핵산에 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 참조할 수 있다. 본 발명의 mut-PPO 단백질이 천연 엽록체 운반 펩티드를 포함하지만, 엽록체-표적화 서열을 본 발명의 성숙한 mut-PPO 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 작동가능하게 연결시킴으로써 당업계에 공지된 임의의 엽록체 운반 펩티드가 본 발명의 성숙한 mut-PPO 단백질의 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 엽록체 표적화 서열은 당업계에 공지되어 있고, 이는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 (Rubisco) (문헌 [de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780]; [Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342]); 5-(에놀피루빌)시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) (문헌 [Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810]); 트립토판 신타제 (문헌 [Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087]); 플라스토시아닌 (문헌 [Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363]); 코리스메이트 신타제 (문헌 [Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457]); 및 집광 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) (문헌 [Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999])의 엽록체 소형 서브유닛을 포함한다. 또한, 문헌 [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 참조한다.
엽록체의 형질전환 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530]; [Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917]; [Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606]을 참조할 수 있다. 상기 방법은 선별가능한 마커를 함유하는 DNA의 입자 총 전달, 및 상동 재조합을 통한 색소체 게놈으로의 DNA의 표적화에 의존한다. 추가로, 핵에 의해 코딩되고 색소체로 지시되는 RNA 폴리머라제의 조직-선호형 발현에 의한 침묵 색소체-보유 트랜스진의 트랜스활성화에 의해 색소체 형질전환이 달성될 수 있다. 상기 시스템은 문헌 [McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305]에서 보고된 바 있다. 엽록체로 표적화시키고자 하는 관심의 대상이 되는 핵산은 식물 핵과 이러한 기관 사이의 코돈 사용에서의 차이를 처리하기 위해 엽록체에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다. 상기 방식에서, 엽록체-선호형 코돈을 사용하여 관심의 대상이 되는 핵산을 합성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,380,831호 (본원에 참고로 포함된다)를 참조할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, mut-PPO 핵산은 a) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 또는 45에 제시된 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체 또는 유도체; b) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 또는 46에 제시된 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; c) a) 또는 b) 중 어느 것의 60개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) a) 내지 c) 중 어느 것의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, 발현 카세트는 식물에서 기능성인 전사 개시 조절 영역 및 번역 개시 조절 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 식물 형질전환을 위한 선별가능한 마커 유전자로서의 용도가 있는 것으로 발견되었지만, 본 발명의 발현 카세트는 형질전환된 세포의 선별을 위해 또 다른 선별가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 것들을 비롯한, 선별가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선별을 위해 사용된다. 마커 유전자로는 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 것 뿐만 아니라, 제초제 화합물, 예컨대 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 문헌 [Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511]; [Christophers on et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318]; [Yao et al. (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff (1992) Mol Microbiol 6:2419-2422]; [Barkley et al (1980) in The Operon, pp. 177-220]; [Hu et al (1987) Cell 48:555-566]; [Brown et al (1987) Cell 49:603-612]; [Figge et al (1988) Cell 52:713-722]; [Deuschle et al (1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404]; [Fuerst et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:2549-2553]; [Deuschle et al (1990) Science 248:480-483]; [Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 1917-1921]; [Labow et al (1990) Mol Cell Biol 10:3343-3356]; [Zambretti et al (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:3952-3956]; [Bairn et al (1991) Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:5072-5076]; [Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653]; [Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol Struc. Biol 10: 143-162]; [Degenkolb et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595]; [Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104]; [Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg]; [Gossen et al (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:5547-5551]; [Oliva et al (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919]; [Hlavka et al (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin)]; [Gill et al (1988) Nature 334:721-724]를 참조할 수 있다. 상기 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 선별가능한 마커 유전자들의 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 선별가능한 마커 유전자가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 숙주 세포에서의 벡터의 발현으로 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성이 숙주 세포의 야생형 품종과 비교하여 증가된 것인, 상기 기술된 mut-PPO 핵산을 함유하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 그가 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 그로 결찰될 수 있는, 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있는 것인 바이러스 벡터라는 것이 있다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예컨대, 박테리아 복제 기점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터 (비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본원에서는 "발현 벡터"라고 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터인 바, 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스, 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 것으로 한다.
본 발명 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함하는데, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용하고자 하는 숙주 세포에 기초하여 선택된 것으로서, 발현시키고자 하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 조절 서열로는 다수의 숙주 세포 유형에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것, 및 오직 특정 숙주 세포에서만 또는 특정 조건하에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포로 도입될 수 있고, 이로써 본원에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 융합 폴리펩티드 또는 펩티드 (예컨대, mut-PPO 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 등)를 비롯한, 폴리펩티드 또는 펩티드를 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, mut-PPO 폴리펩티드는 식물 및 식물 세포, 예컨대, 단세포 식물 세포 (예컨대, 조류) (문헌 [Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251] 및 상기 문헌에 포함되어 있는 참조 문헌 참조) 및 고등 식물 (예컨대, 종자식물, 예컨대, 농작물)로부터의 식물 세포에서 발현된다. mut-PPO 폴리뉴클레오티드는 형질감염, 형질전환 또는 형질도입, 전기천공, 입자 충격, 아그로감염(agroinfection), 바이오리스틱 등을 비롯한, 임의의 수단에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
식물 세포를 비롯한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 적합한 방법은 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)] 및 다른 실험실 매뉴얼, 예컨대, 문헌 [Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey]에서 살펴볼 수 있다. 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성 증가가 광범위한 품종의 식물, 예컨대, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 라이밀, 벼, 보리, 대두, 땅콩, 목화, 평지씨 및 카놀라, 마니호트, 후추, 해바라기 및 타게테스, 가지과 식물, 예컨대, 감자, 담배, 가지, 및 토마토, 비시아(Vicia) 종, 완두, 알팔파, 관목 식물 (커피, 코코아, 차), 살릭스(Salix) 종, 교목 (오일 팜, 코코넛), 다년생 풀, 및 사료 작물로 유전되기를 원하는 일반적인 소질인 바, 상기 농작물 또한 본 발명의 추가의 한 실시양태로서 바람직한 유전자 조작용 표적 식물이다. 바람직한 실시양태에서, 식물은 농작물이다. 사료 작물로는 위트그래스(Wheatgrass), 카나리그래스(Canarygrass), 브로민그래스(Bromegrass), 와일드라이 그래스(Wildrye Grass), 블루그래스(Bluegrass), 오차드그래스(Orchardgrass), 알팔파, 살포인(Salfoin), 버어드-풋 트리포일(Birds-foot Trefoil), 앨사이크 클로버(Alsike Clover), 레드 클로버(Red Clover), 및 스위트 클로버(Sweet Clover)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, mut-PPO 폴리뉴클레오티드의 식물로의 형질감염은 아그로박테리움 매개 유전자 전달에 의해 달성된다. 당업자에게 공지되어 있는 한 형질전환 방법은 mut-PPO 핵산을 함유하는 것인 아그로박테리아의 용액 내로 화훼를 침적시킨 후, 형질전환된 생식 세포를 육종하는 것이다. 아그로박테리움 매개 식물 형질전환은 예를 들어, GV3101 (pMP90) (문헌 [Koncz and Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396]) 또는 LBA4404 (클론테크(Clontech)) 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를를 사용하여 수행될 수 있다. 형질전환은 표준 형질전환 및 재생 기법을 사용하여 수행될 수 있다 (문헌 [Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788]; [Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht:Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur:BT11-P ISBN 0-7923-2731-4]; [Glick, Bernard R. and Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2]). 예를 들어, 평지씨는 자엽 또는 배축 형질전환을 통해 형질전환될 수 있다 (문헌 [Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8:238-242]; [De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91:694-701]). 아그로박테리움 및 식물 선별을 위해 항생제를 사용하는 것은 형질전환을 위해 사용되는 2원 벡터 및 아그로박테리움 균주에 따라 달라진다. 평지씨 선별은 일반적으로는 선별가능한 식물 마커로서 카나마이신을 사용하여 수행된다. 아마로의 아그로박테리움 매개 유전자 전달은 예를 들어, 문헌 [Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285]에 기술되어 있는 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 추가로, 대두의 형질전환은 예를 들어, 유럽 특허 번호 0424 047, 미국 특허 번호 제5,322,783호, 유럽 특허 번호 0397 687, 미국 특허 번호 제5,376,543호, 또는 미국 특허 번호 제5,169,770호에 기술되어 있는 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 옥수수의 형질전환은 입자 충격, 폴리에틸렌 글리콜 매개 DNA 흡수에 의해, 또는 탄화규소 섬유 기법에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7] 참조). 옥수수의 형질전환에 관한 구체적인 예는 미국 특허 번호 제5,990,387호에서 살펴볼 수 있고, 밀의 형질전환에 관한 구체적인 예는 PCT 출원 번호 WO 93/07256에서 살펴볼 수 있다.
본 발명에 따라, 도입된 mut-PPO 폴리뉴클레오티드가 비-염색체 자율 레플리콘 내로 혼입되거나, 식물 염색체 내로 통합된다면, 이는 식물 세포에서 안정하게 유지될 수 있다. 별법으로, 도입된 mut-PPO 폴리뉴클레오티드는 염색체외 비-복제 벡터 상에 존재할 수 있고, 일시적으로 발현되거나, 일시적으로 활성을 띨 수 있다. 한 실시양태에서, mut-PPO 폴리뉴클레오티드가 염색체 내로 통합되어 있는 상동 재조합 미생물이 생성될 수 있고, 내인성 PPO 유전자를 변경, 예컨대, 기능적으로 파괴시키고, mut-PPO 유전자를 형성하기 위해 결실, 부가 또는 치환이 도입되어 있는 PPO 유전자의 적어도 일부를 포함하는 벡터가 제조된다. 상동 재조합을 통해 점 돌연변이를 생성하기 위해, DNA-RNA 하이브리드가 키메라플라스티(chimeraplasty)로 알려져 있는 기법에서 사용될 수 있다 (문헌 [Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330] 및 [Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247]). 트리티쿰 종에서의 다른 상동 재조합 방법 또한 당업계에 주지되어 있고, 본원에서의 사용을 위해 고려된다.
상동 재조합 벡터에서, 미생물 또는 식물에서 상기 벡터가 보유하는 외인성 mut-PPO 유전자와 내인성 PPO 유전자 사이의 상동 재조합이 이루어질 수 있도록 하기 위해 mut-PPO 유전자는 그의 5' 및 3' 단부가 PPO 유전자의 추가의 핵산 분자의 측면에 위치할 수 있다. 추가의 측면에 위치하는 PPO 핵산 분자의 길이는 내인성 유전자와 상동 재조합이 성공적으로 이루어질 수 있도록 하는 데 충분한 길이이다. 전형적으로, 수백 염기쌍에서부터 최대 킬로베이스까지의 측면 DNA (5' 및 3' 단부, 둘 모두)가 벡터에 포함된다 (예컨대, 상동 재조합 벡터 설명에 관해서는 문헌 [Thomas, K. R., 및 Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503] 또는 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)에서의 cDNA 기반 재조합에 관해서는 문헌 [Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373) 참조). 그러나, mut-PPO 유전자는 보통 극소수의 아미노산에서만 PPO 유전자와 차이가 나기 때문에, 측면 서열이 항상 필요한 것은 아니다. 상동 재조합 벡터는 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 매개 DNA를 통해) 미생물 또는 식물 세포 내로 도입되고, 도입된 mut-PPO 유전자가 내인성 PPO 유전자와 상동성으로 재조합되어 있는 세포는 당업계에 공지된 기법을 사용함으로써 선별된다.
또 다른 실시양태에서, 도입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 선택된 시스템을 포함하는 재조합 미생물이 제조될 수 있다. 예를 들어, lac 오페론의 제어하에 위치하도록 mut-PPO 유전자를 벡터 상에 포함시킴으로써 오직 IPTG의 존재하에서만 mut-PPO 유전자가 발현되도록 할 수 있다. 상기 제어 시스템은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정 대상체 세포를 의미할 뿐만 아니라, 이는 상기 세포의 자손 또는 잠재적인 자손에도 적용됨을 이해할 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 사실상 상기와 같은 자손은 모체 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 이는 여전히 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 범주내 포함된다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, mut-PPO 폴리뉴클레오티드는 박테리아 세포, 예컨대, C. 글루타미쿰(C. glutamicum), 곤충 세포, 진균 세포, 또는 포유동물 세포 (예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 COS 세포), 조류, 섬모충류, 식물 세포, 진균 또는 다른 미생물, 예컨대, C. 글루타미쿰에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 숙주 세포, 예컨대, 배양물 중 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 mut-PPO 폴리뉴클레오티드를 제조하는 데 (즉, 발현시키는 데) 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 mut-PPO 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 mut-PPO 폴리펩티드가 제조될 때까지 적합한 배지 중에서 (mut-PPO 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있거나, 야생형 또는 mut-PPO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 게놈이 도입되어 있는 것인) 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 배지 또는 숙주 세포로부터 mut-PPO 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 단리된 mut-PPO 폴리펩티드, 및 그의 생물학적으로 활성인 일부에 관한 것이다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부가 재조합 DNA 기법에 의해 제조되었을 경우에는 그에 세포 물질 중 일부가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 그에 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않는다. "실질적으로 세포 물질이 존재하지 않는다"라는 표현은 폴리펩티드가 폴리펩티드의 천연적 또는 재조합적 제조가 이루어진 세포의 세포 성분 중 일부로부터 분리된 것인, mut-PPO 폴리펩티드 표본을 포함한다. 한 실시양태에서, "실질적으로 세포 물질이 존재하지 않는다"라는 표현은 비-mut-PPO 물질 (이는 또한 본원에서 "오염 폴리펩티드"로도 지칭된다)을 약 30% (건식 중량%) 미만으로, 더욱 바람직하게, 비-mut-PPO 물질을 약 20% 미만으로, 더욱더 바람직하게, 비-mut-PPO 물질을 약 10% 미만으로, 및 가장 바람직하게, 비-mut-PPO 물질을 약 5% 미만으로 포함하는 mut-PPO 폴리펩티드 표본을 포함한다.
mut-PPO 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부가 재조합적으로 제조된 경우, 또한 바람직하게는 실질적으로 배양 배지가 존재하지 않고, 즉, 배양 배지가 폴리펩티드 표본 부피의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게, 약 10% 미만, 및 가장 바람직하게, 약 5% 미만을 나타낸다. "실질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않는다"라는 표현은 폴리펩티드가 폴리펩티드의 합성에 관여하는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 것인, mut-PPO 폴리펩티드 표본을 포함한다. 한 실시양태에서, "실질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않는다"라는 표현은 화학 전구체 또는 비-mut-PPO 화학물질을 약 30% (건식 중량%) 미만으로, 더욱 바람직하게, 화학 전구체 또는 비-mut-PPO 화학물질을 약 20% 미만으로, 더욱더 바람직하게, 화학 전구체 또는 비-mut-PPO 화학물질을 약 10% 미만으로, 및 가장 바람직하게, 화학 전구체 또는 비-mut-PPO 화학물질을 약 5% 미만으로 포함하는 mut-PPO 폴리펩티드 표본을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부에는 mut-PPO 폴리펩티드의 유래된 동일의 유기체로부터의 오염 폴리펩티드가 존재하지 않는다. 전형적으로, 상기 폴리펩티드는 미생물, 예컨대, C. 글루타미쿰, 섬모충류, 조류, 또는 진균 이외의 식물에서, 또는 상기와 같은 미생물 중에서 예를 들어, mut-PPO 폴리펩티드의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 식물 또는 종자의 야생형 품종과 비교하여 농작물 또는 종자의 벤족사지논-유도체 내성을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 교시한다. 바람직한 실시양태에서, 농작물 또는 종자의 벤족사지논-유도체 내성이 증가됨에 따라 식물 또는 종자는 바람직하게, 대략 1-1,000 g ai/ha, 더욱 바람직하게, 20-160 g ai/ha, 및 가장 바람직하게, 40-80 g ai/ha로 적용된 벤족사지논-유도체 제초제를 견딜 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 적용된 벤족사지논-유도체 제초제를 "견디다"라는 것은 식물이 상기 적용에 의해 사멸되지도 않고, 손상되지도 않는다는 것을 의미한다.
추가로, 본 발명은 상기 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 벤족사지논-유도체 제초제의 사용을 포함하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 벤족사지논-유도체 제초제는 종자 처리, 토양 처리, 및 엽면 처리를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 적용될 수 있다. 적용하기 전에 벤족사지논-유도체 제초제를 통상의 제제로, 예를 들어, 액제, 에멀젼, 현탁제, 분진, 분제, 페이스트 및 과립제로 전환시킬 수 있다. 사용 형태는 의도되는 특정 목적에 좌우되며; 각각의 경우에, 본 발명에 따른 화합물의 미세하고 균일한 분포가 보장되어야 한다.
벤족사지논-유도체 제초제에 대한 내성이 증가된 식물을 제공함으로써, 식물 성장을 강화시키고 영양분에 대한 경쟁을 감소시키도록 잡초로부터 식물을 보호하기 위해 광범위한 제제가 사용될 수 있다. 벤족사지논-유도체 제초제는 본원에 기술된 농작물을 둘러싼 구역에서 발아 이전, 발아 이후, 식목 이전 및 식목시 잡초 방제를 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 다른 첨가물을 함유하는 벤족사지논-유도체 제초제 제제가 사용될 수 있다. 벤족사지논-유도체 제초제는 또한 종자 처리물로서도 사용될 수 있다. 벤족사지논-유도체 제초제 제제 중에서 발견되는 첨가물로는 다른 제초제, 계면활성제, 아주반트, 확산제, 점착제, 안정화제 등을 포함한다. 벤족사지논-유도체 제초제는 습식 또는 건식 제제일 수 있고, 유동성 분제, 유화성 농축물 및 액체 농축물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 벤족사지논-유도체 제초제 및 제초제 제제는 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 분무, 관주, 살분 등에 의해 적용될 수 있다.
적합한 제제는 PCT/EP2009/063387 및 PCT/EP2009/063386 (이는 본원에서 참고로 포함된다)에 상세하게 기술되어 있다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이며, 그 안에서 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 다수로 변형될 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다. 본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예시되는데, 이는 어느 방식으로든 그의 범주에 대해 제한하는 것으로 해석되서는 안된다. 그와는 반대로, 다양한 다른 실시양태, 변형 및 그의 등가물에 의존할 수 있으며, 본원의 설명 판독 후에는 그러한 것이 본 발명의 범주로부터 및/또는 첨부된 특허청구범위의 범주로부터 벗어나지 않는 것으로 당업자에게 제안될 수 있음을 명확하게 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1 : 아마란투스 PPO의 부위 지정 돌연변이유발
아마란투스 PPO 의 클로닝
PPO-감수성 및 -저항성 이소폼, 및 돌연변이체 조합에 대한 아마란투스 투베르쿨라투스 코딩 서열 (서열 번호 1, 3, 5, 7)을 합성하고, 진아트(Geneart) (진아트 아게(Geneart AG: 독일 레겐스부르크)에 의해 클로닝하였다.
플라스미드 소량 분리법(minipreparation)을 수행함으로써 E. 콜라이 TOP10으로부터 플라스미드를 단리시키고, DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
재조합 야생형 및 돌연변이체 PPO 의 발현 및 정제
(문헌 [Franck E. Dayan, Pankaj R. Daga, Stephen O. Duke, Ryan M. Lee, Patrick J. Tranel, Robert J. Doerksen. Biochemical and structural consequences of a glycine deletion in the α-8 helix of protoporphyrinogen oxidase. Biochimica et Biophysica Acta 1804 (2010), 1548-56]으로부터 얻음)
pRSET 벡터 중의 클론을 E. 콜라이의 BL21 (DE3)-pLysS 균주로 형질전환시켰다. 세포를 37℃에서 밤새도록 진탕시키면서, 100 ㎍/mL의 카르베니실린을 포함하는 250 mL의 LB 중에서 성장시켰다. 배양물을 항생제를 포함하는 1 L의 LB 중에 희석시키고, 37℃에서 2 h 동안 진탕시키면서 성장시키고, 1 mM IPTG로 유도하고, 25℃에서 5추가의 5시간 동안 진탕시키면서 성장시켰다. 1,600 x g로 원심분리하여 세포를 수거하고, 0.09% NaCl로 세척하고, -80℃에서 보관하였다.
140 MPa로 프렌치(French) 프레스를 사용하여 세포를 50 mM 인산나트륨 (pH 7.5), 1 M NaCl, 5 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 및 1 ㎍/mL 류펩틴 중에 용해시켰다. 용해시킨 후, 0.5 U의 벤조나제 (노바겐(Novagen), EMD 케미칼즈, 인코포레이티드(EMD Chemicals, Inc.: 미국 뉴저지주 깁스타운) 및 PMSF (최종 농도 1 mM)를 첨가하였다. 3,000 x g로 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다. 20 mM 인산나트륨 (pH 8.0), 50 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 및 17% 글리세롤로 평형화된, 니켈로 활성화된 하이트랩 킬레이팅 HP 칼럼(Hitrap Chelating HP column) (GE 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.: 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 His-태깅된 PPO 단백질을 정제하였다.
PPO를 250 mM 이미다졸로 용리시켰다. 20 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5), 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA 및 17% 글리세롤로 평형화된 PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션: 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 활성 단백질을 탈염시켰다. 배양물 1 ℓ씩을 대략 10 mg의 순 PPO에 제공하고, 검정법에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
PPO 활성 검정법
PPO 효소 검정법 (비-재조합). 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Grossmann et al. 2010]) 암실 성장 옥수수, 까마중, 나팔꽃, 및 어저귀 묘목의 자엽초 또는 새싹 (150 g 생중량)으로부터 PPO 단백질 (EC 1.3.3.4)을 추출하였다. 수거하기 전, 낮은 엽록소 농도에서 틸라코이드 분획 중에서 최고로 특이적인 효소 활성을 달성하기 위해 묘목을 광 존재하에 2시간 동안 녹화시켰다. 높은 엽록소 농도에서는 유의적으로 형광이 소광되는데, 이는 시험에 사용될 수 있는 녹색 틸라코이드의 양을 제한하는 것이었다. 생중량 대 부피의 비를 1:4로 하여 브라운 블렌더(Braun blender)를 이용하여 식물 물질을 냉균질화시켰다. 균질화용 완충제는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트리스)-HCl (50 mM; pH 7.3), 수크로스 (0.5 M), 염화마그네슘 (1 mM), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (1 mM) 및 우혈청 알부민 (2 g/L)으로 구성되었다. 4층으로 된 미라클로스(Miracloth)를 통해 여과한 후, 10,000 x g로 5 min 동안 원심분리한 후, 조 색소체 표본을 수득하고, 균질화용 완충제 중에 재현탁시킨 후, 150 x g로 2 min 동안 원심분리하여 조 세포 파쇄물을 제거하였다. 상청액을 4,000 x g로 15 min 동안 원심분리하고, 펠릿 분획을 트리스-HCl (50 mM; pH 7.3), EDTA (2 mM), 류펩틴 (2 μM), 펩스타틴 (2 μM) 및 글리세롤 (200 ml/L)을 함유하는 1 ml의 완충제 중에 재현탁시키고, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 표준으로서 우혈청 알부민을 포함하는 효소 추출물 중에서 단백질을 측정하였다. 초기 속도 조건하에서 화학적으로 환원된 프로토포피리노겐 IX로부터의 프로토 형성 속도를 모니터링함으로써 PPO 활성을 형광광도법으로 검정하였다. 검정용 혼합물은 총 부피 200 ㎕ 중 트리스-HCl (100 mM; pH 7.3), EDTA (1 mM), 디티오트레이톨 (5 mM), 트윈(Tween) 80 (0.085%), 프로토포피리노겐 IX (2 μM), 및 40 pg의 추출 단백질로 구성되었다. 22℃에서 기질 프로토포피리노겐 IX를 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 디메틸 술폭시드 (DMSO) 용액 (검정법에서 DMSO의 농도 0.1 mM) 중에서 사플루페나실, 플루미옥사진 및 부타페나실을 제조하고, 0.005 pM 내지 5 μM의 농도로 검정용 혼합물에 첨가한 후, 인큐베이션시켰다. POLAR스타 옵티마/갤럭시(POLARstar Optima/Galaxy) (BMG)를 사용하여 405 nm의 여기 및 630 nm의 모니터링 방출로 검정용 혼합물로부터 직접 형광을 모니터링하였다. 열-불활성화된 추출물 존재하의 비-효소적 활성은 무시할 수 있는 것이었다. 제초제에 의해 유도된 효소 활성 억제를 비처리된 대조군에 대해 상대적인 억제율(%)로 표현하였다. 효소를 50% 억제시키는 데 필요한 화합물의 몰 농도 (IC50 값)는 비-선형 회귀 분석법을 사용하여 용량-반응식에 값을 피팅함으로써 계산하였다.
PPO 효소 검정법 (재조합). 프로토를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 위스콘신주 밀워키)로부터 구입하였다. 문헌 [Jacobs and Jacobs (N.J. Jacobs, J.M. Jacobs, Assay for enzymatic protoporphyrinogen oxidation, a late step in heme synthesis, Enzyme 28 (1982) 206-219)]에 따라 프로토겐을 제조하였다. 0.1 mM EDTA, 0.1% 트윈 20, 5 μM FAD, 및 500 mM 이미다졸을 포함하는 100 mM 인산나트륨 (pH 7.4) 중에서 검정법을 수행하였다. 150 μM 프로토겐의 존재하에서 PPO 억제제 아시플루오르펜, 락토펜, 벤족사지논 I.a.35, 또는 바람직한 벤족사지논-유도체 (여기서, X는 O 또는 S이고, R4는 수소, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C3-C6-시클로알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-할로알케닐, C3-C6-알키닐, C3-C6-할로알키닐, C1-C6-알콕시 또는 C3-C6-시클로알킬-C1-C6-알킬이고, R5는 수소, NH2, C1-C6-알킬 또는 C3-C6-알키닐, R6은 수소 또는 C1-C6-알킬, 또는 그의 조합이다)와의 용량 반응 곡선을 측정하였다. 여기 및 방출 대역폭을 각각 1.5 및 30 nm로 설정하였다. 모든 검정은 2중 또는 3중으로 수행하고, POLAR스타 옵티마/갤럭시 (BMG)를 사용하여 405 nm의 여기 및 630 nm의 모니터링 방출로 측정하였다.
치환된 PPO 효소에 대한 용량 반응 (IC50) 값이 야생형 (비-치환된) PPO 효소에 대한 IC50 값보다 더 컸다 (하기 표 4a 및 4ab). 이는, 상기와 같은 치환된 PPO 효소가 벤족사지논에 대해 및 시험된 벤족사지논-유도체 중 일부에 대해 고유한 저항성을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이다. 치환된 PPO 효소 dG210 및 R128L은 아마란투스 투베르쿨라투스 내에서 발견된 공지의 치환된 PPO 효소이며, 이는 다양한 PPO 제초제에 대한 식물체내 PPO 저항성을 담당하는 것으로 나타났다 (문헌 [Dayan et al., 2010, Biochimica et Biophysica Acta, 1804:1548]). 이는 벤족사지논 I.a.35 (표 4a) 및 열거된 벤족사지논-유도체 (표 4b)를 비롯한, IC50 값이 dG210 또는 R128L보다 더 높은, 열거된 다른 치환된 PPO 효소 또한 다양한 PPO 제초제에 대한 식물체내 저항성을 담당하는 치환된 PPO 효소라는 것을 나타낸다. 모든 치환된 PPO 효소는 유사한 효소 활성, 즉, 야생형 PPO 효소와의 비교로 분당 형광 단위 (FU/min) 변화를 보였다 (표 4a). 추가로, 치환된 PPO 효소에 대한 모든 활성 값은 치환된 PPO 효소 dG210보다 더 컸다. 치환된 PPO 효소 dG210은 식물체내 기능을 위해서도 충분한 활성을 띠었다. 이는 명시된 모든 다른 치환된 PPO 효소 또한 식물체내 기능을 위해서 충분한 활성을 띤다는 것을 나타낸다.
<표 4a>
Figure 112013063433423-pct00019
<표 4b>
Figure 112013063433423-pct00020
실시예 2: 제초제 내성 클론 및 PPO 유전자 중 원인적 돌연변이 확인을 위한 돌연변이유발된 조류 세포의 스크리닝
PPO 유전자 중 벤족사지논-유도체 제초제 저항성을 부여하는 돌연변이를 생성하기 위해, 화학적 또는 UV 돌연변이유발을 사용할 수 있다. 특히, 제초제 저항성에서 우성 돌연변이를 확인하는 데에는 단세포 유기체, 예컨대, 클라미도모나스 레인하드티이 또는 세네데스무스 오블리쿠우스(Scenedesmus obliquus)가 유용하다.
100 rpm으로 22℃에서 일정하게 진탕시키고, 30 μmol Phot/㎡/s2 광 조사함으로써 TAP 배지 (문헌 [Gorman and Levine (1965) PNAS 54: 1665-1669]) 중에서 클라미도모나스 레인하드티이 계통 CC-503 및 CC-1691 조류 세포 (듀크 대학(Duke University: 미국 더럼))를 증식시켰다. 클라미도모나스에 대해 언급한 바와 같은 배양 조건하에서 앞서 기술된 바와 같은 조류 배지 (문헌 [Boger and Sandmann, (1993) In: Target assays for modern herbicides and 15 related phytotoxic compounds, Lewis Publishers]) 중에서 세네데스무스 오블리쿠우스 (괴팅겐 대학(University of Gottingen: 독일))를 증식시켰다. 화합물 스크리닝은 450 μmol Phot/㎡/s2 조사에서 수행하였다.
감수성인 클라미도모나스 레인하드티이 또는 세네데스무스 오블리쿠우스 계통을 문헌 [Loppes (1969, 20 Mol Gen Genet 104: 172-177)]에 기술되어 있는 바와 같이, 1 h 동안 0.14 M 에틸메탄술포네이트 (EMS)로 돌연변이화시켰다. 특이 조류 계통 중에서의 화합물의 활성에 따라 저농도 내지 치사 농도로 관심의 대상이 되는 벤족사지논-유도체 제초제를 함유하는 고체 영양 용액 플레이트 상에서 돌연변이유발된 세포를 스크리닝함으로써 계통을 확인하였다.
DNA 올리고뉴클레오티드를 사용하는 표준 PCR 기법에 의해 주형으로서 게놈 DNA 또는 DNA 카피로부터 야생형 및 저항성 클라미도모나스 레인하드티이로부터의 PPO 유전자 증폭을 수행하였다. 서열 정렬 도구 얼라인 X(Align X) (벡터 NTI 어드밴스 소프트웨어 버전 10.3(Vector NTI Advance Software Version 10.3), 인비트로겐(Invitrogene, 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 사용하여 야생형 및 돌연변이체 PPO 서열을 비교함으로써 돌연변이를 확인하였다.
도 2는 클라미도모나스 레인하드티이 계통의 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대한 저항성에 관한 선별을 보여주는 것이다. (A) 선별제를 함유하지 않는 고체 배지 상에 플레이팅된 돌연변이유발된 세포. (B) 1x10-7 M 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 고체 배지 상에 플레이팅된 돌연변이유발된 세포. 벤족사지논-유도체 제초제에 대해 저항성을 띠는 세포는 콜로니를 형성한 반면 (동그라미와 번호 33, 34, 35 및 36으로 표시), 감수성 세포는 성장하지 못하였다. B와 비교하여 플레이트 A 상에 더 많은 개수의 콜로니가 존재한다는 것은 플레이트 B 상의 콜로니가 벤족사지논-유도체 I.a.35에 대해 저항성을 띤다는 것으로 나타내는 것이다.
도 3은 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대해 저항성을 띠는 선별된 클라미도모나스 레인하드티이 계통의 재성장을 보여주는 것이다. (A) 선별제를 함유하지 않는 액체 배지 중의 야생형 세포. (B) 1x10-9-5x10-6 M로) 증가식으로 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 액체 배지 중의 야생형 세포. (C) 선별제를 함유하지 않는 액체 배지 중의 돌연변이유발된 세포. (D1, D2, E1, E2) 1x10-9-5x10-6 M로) 증가식으로 벤족사지논-유도체 I.a.35를 함유하는 액체 배지 중의 돌연변이유발된 및 선별된 계통. 벤족사지논-유도체 I.a.35 제초제에 대해 저항성을 띠는 계통은 배양을 통해 더 진한 색상을 띠게 되었는데, 이는 성장되었음을 표시하는 것이다. 감수성 계통은 배양되지 못했고, 옅은 색상 그대로 유지되었다. 세포가 성장함에 따라 액체 배지 중 세포가 고밀도화되는 것이 더 진한 색상을 띠는 것의 원인이 되었다. 보다 낮은 저밀도 배양물은 더 옅게 보이거나, 완전히 투명하게 보였다.
실시예 3: 제초제 내성 식물 및 PPO 유전자 중 원인적 돌연변이 확인을 위한 EMS 돌연변이유발된 아라비돕시스 탈리아나 집단의 스크리닝
EMS로 처리된 아라비돕시스 탈리아나 식물의 M2 집단을 리힐르 시즈(Lehle Seeds, 미국 텍사스주 라운드 록)으로부터 입수하였다. 화합물 활성에 따라 벤족사지논-유도체 제초제 (0.1 내지 500 μM) 및 0.5% 겔화제 겔라이트(Gelrite)®를 함유하는 반 강도의 무라시게 스쿠그(murashige skoog) 양액 상에 아라비돕시스 종자를 플레이팅하여 스크리닝을 수행하였다. 최대 3주 동안 22℃에서 16:8h의 명:암 주기로 성장 챔버에서 플레이트를 인큐베이션시켰다. 표백성이 덜 강렬한 표현형을 보이는 내성 식물을 토양에 식목하고, 온실 조건하에서 성숙해질 때까지 성장시켰다. 로제트 식물 단계에서 벤족사지논-유도체 제초제 내성 식물로부터 잎 절편을 수거하고, DN이지 식물용 미니 키트(DNeasy Plant Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen: 독일 힐덴))를 사용하여 게놈 DNA를 단리시키거나, RN이지 식물용 미니 키트(RNeasy Plant Mini Kit) (퀴아젠: 독일 힐덴))를 사용하여 전체 mRNA를 단리시켰다.
각 올리고뉴클레오티드를 사용하여 게놈 DNA로부터 표준 PCR 기법에 의해 PPO 서열을 증폭시켰다. mRNA로부터 PPO를 증폭시키기 위해, 수퍼스크립트 III 리버스 트랜스크립타제(Superscript III Reverse Transcriptase) (인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 시험관에서 DNA 카피를 합성하였다. 표준 서열분석 플라스미드에 PCR 생성물을 클로닝한 후, 표준 서열분석 기법에 의해 돌연변이화된 PPO 유전자의 DNA 서열을 확인하였다. 서열 정렬 도구 얼라인 X (벡터 NTI 어드밴스 소프트웨어 버전 10.3, 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 야생형 및 돌연변이체 PPO 서열을 비교함으로써 돌연변이를 확인하였다.
실시예 4. 야생형 또는 돌연변이화된 PPO 서열을 가지는 벤족사지논-유도체 제초제 내성 식물 조작
올호프트(Olhoft) 등 (미국 특허 2009/0049567)에 의해 기술된 바와 같은 방법에 의해 벤족사지논-유도체 제초제 내성 대두 (글리신 맥스) 식물을 제조하였다. 돌연변이화된 PPO 서열을 문헌 [Sambrook et al. (Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기술된 바와 같이 표준 클로닝 기법을 사용하여, 유비퀴틴 프로모터 (PcUbi) 및 노팔린 신타제 종결인자 (NOS) 서열 사이에 저항성 마커 유전자 카세트 (AHAS) 및 돌연변이화된 PPO 서열 (GOI로 마킹됨)을 함유하는 2원 벡터에 클로닝하였다. 식물 형질전환을 위해 2원 플라스미드를 아그로박테리움 투메파시엔스로 도입하였다. 플라스미드 구축물을 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 묘목 외식편 제1절에 있는 대두의 액생 분열조직 세포 내로 도입하였다. 접종 및 아그로박테리아와의 공동 배양 후, 외식편을 새싹 도입 배지로 옮겨 놓았다. 이어서, 외식편을 3주 동안 1-3 μM 이마자피르 (아스날(Arsenal))를 포함하는 새싹 유도 배지로 옮겨 놓고 형질전환된 세포를 선별하였다. 이어서, 제1절에 건강한 캘러스/새싹 패드를 포함하는 외식편을, 새싹이 신장될 때까지 또는 외식편이 사멸할 때까지, 1-3 μM 이마자피르를 함유하는 새싹 신장용 배지로 옮겨 놓았다. 트랜스제닉 식물소체를 착근시키고, 트랜스진 존재에 대해 택맨(TaqMan) 분석법으로 분석하고, 토양으로 옮기고, 온실에서 성숙해질 때까지 성장시켰다. 맬엘버(McElver) 및 신(Shngh) (WO 2008/124495)에 의해 기술된 방법에 의해 옥수수 식물의 형질전환을 수행하였다. 돌연변이화된 PPO 서열을 함유하는 식물 형질전환 벡터 구축물을 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 옥수수 미성숙 배아로 도입하였다.
3-4주 동안 0.5-1.5 μM 이마제타피르로 보충된 선별 배지 중에서 형질전환된 세포를 선별하였다. 트랜스제닉 식물소체를 식물 재생용 배지 상에서 재생시키고, 이후 착근시켰다. 트랜스제닉 식물소체를 트랜스진 존재에 대해 택맨 분석법으로 분석한 후, 화분재배용 혼합물로 옮겨 심고, 온실에서 성숙해질 때까지 성장시켰다. 맬엘버 및 신 (WO 2008/124495)에 의해 기술된 꽃 침지 방법에 의해 아라비돕시스 탈리아나를 돌연변이화된 PPO 서열로 형질전환시켰다. 펭(Peng) 등 (US 6653529)에 의해 기술된 프로토플라스트 형질전환에 의해 오리자 사티바 (벼)의 형질전환을 수행하였다. 돌연변이화된 PPO 서열을 함유하는 대두, 옥수수, 벼 및 아라비돕시스 탈리아나의 T0 또는 T1 트랜스제닉 식물을 온실 연구로 PPO 유도 제초제에 대한 개선된 내성에 대하여 시험하였다.
실시예 5. 기능적 보완 및 스크리닝 검정법
(문헌 [William L. Patzoldt, Aaron G. Hager, Joel S. McCormick, 및 Patrick J. Tranel. A codon deletion confers resistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase. PNAS 103 (33), 12329-34] 또한 참조).
PPO 라이브러리 생성:
PPO 유전자 (진아트 아게: 독일 레겐스부르크)의 무작위 돌연변이유발 (오류 빈발 PCR) 또는 포화 돌연변이유발에 의해 PPO 유전자 라이브러리를 생성하고, 생체내 스크리닝을 위해 발현 벡터 (pBAD-TOPO)로 클로닝하였다. 추가로, 단축 버전의 야생형 및 돌연변이체 PPO 유전자를 pBAD-TOPO 발현 벡터 (인비트로겐)로 클로닝하여 두번째 ATG 코돈에서 번역이 개시되도록 하였다. 리보솜 결합 부위 (AGGA) 및 ATG 출발 코돈, 둘 모두를 포함하는 전방향 프라이머 5-CAGGAATAAGTAATGGGCAACATTTCTGAG-3, 및 종결 코돈을 포함하는 역방향 프라이머 5-GAAGAATTACGCGGTCTTCTCATC-3을 사용하여 PPO cDNA를 PCR 증폭시켰다. 감수성 및 추정 저항성 PPO 플라스미드를 사용하여 해리 데일리(Harry Dailey) (조지아 대학(University of Georgia: 미국 조지아주 아테네)로부터 기증받은, E. 콜라이의 hemG 돌연변이체 균주 SASX38을 형질전환시켰다. SASX38 E. 콜라이 균주를 20 ㎍/ml 헤마틴으로 보충된 LB 배지 중에 유지시켰다. SASX38의 형질전환된 콜로니, 및 형질전환되지 않은 대조군을 단독의 LB 배지 상에서, 또는 20 ㎍/ml 헤마틴으로 또는 PPO 억제제 락토펜 및 0.01 내지 500 μM 범위의 벤족사지논-유도체로 보충된 LB 배지 상에서 성장할 수 있는 능력에 대하여 시험하고, 37℃에서 14 hr 동안 인큐베이션시켰다.
보완 및 스크리닝 검정법은 에스케리키아 콜라이의 hemG (PPO) 돌연변이체 균주, SASX38 (문헌 [Sasarman, A., Chartrand, P., Lavoie, M., Tardif, D., Proschek, R. & Lapointe, C. (1979) J. Gen. Microbiol. 113, 297-303])을 사용하여 PPO 제초제 반응에 대한 PPO 돌연변이의 효과를 평가하였다. 외인성 헴을 보충받지 않은 경우, 또는 PPO의 대체 공급원으로 구제되지 않은 경우에 SASX38 균주는 매우 느리게 성장하였다. 추가로, 야생형 E. 콜라이는 천연적으로 PPO 억제제에 대하여 내성을 띠기 때문에, SASX38 균주를 사용함으로써 A. 투베르쿨라투스로부터의 야생형 및 돌연변이체 PPO의 제초제 감수성을 상대적으로 직접적인 방식으로 검정할 수 있었다. E. 콜라이 균주 SASX38을 야생형 및 돌연변이체 PPO를 코딩하는 플라스미드 구축물로 형질전환시켰다. 구축물을 통해 E. 콜라이 균주 SASX38의 성장을 구제할 수 있었는데, 이는 PPO 유전자가 기능성 단백질을 코딩하였다는 것을 나타내는 것이다. 그러나, 성장 배지를 벤족사지논-유도체 제초제로 보충하였을 때, 야생형 PPO로 형질전환된 E. 콜라이의 성장은 현저하게 억제된 반면, 일부 돌연변이체 PPO로 형질전환된 E. 콜라이의 성장은 억제되지 않았다.
실시예 6. 조직 배양 조건
식물 조직 (예컨대, 옥수수, 벼 조직) that is 내성 to 프로토포피리노겐 옥시다제 억제 제초제 (예컨대, 사플루페나실, 비페녹스, 디우론, 락토펜, 부타페나실)에 대해 내성을 띠는 식물 조직 (예컨대, 옥수수, 벼 조직)을 단리시키고, 특징을 규명하기 위한 목적으로 시험관내 조직 배양 돌연변이유발 검정법이 개발되었다. 검정법은 시험관내 조직 배양물에서 발견된 체세포클론 변이를 사용하였다. 체세포클론 변이로부터 유래된 자연 돌연변이를 화학적 돌연변이유발에 의해, 그리고 이어서, 제초제의 농도를 증가시켜 가면서 단계식 선별에 의해 강화시킬 수 있다.
본 발명은 재생가능한 취성 배발생 옥수수 또는 벼 캘러스의 성장을 촉진하기 위한 조직 배양 조건을 제공한다. 캘러스는 각각 제아 메이스 및 자포니카 (타이페이 309, 니폰베어(Nipponbare), 고시히까리(Koshihikari))을 포함하는 4개의 상이한 옥수수 또는 벼 재배종 및 인디카 (인디카 1) 품종로부터 개시되었다. 대략 1 min 동안 70% 에탄올 중에서, 이어서, 20분 동안 20% 시판용 크로록스(Clorox) 표백제 중에서 종자 표면을 멸균시켰다. 멸균수로 종자를 세정하고, 캘러스 유도 배지 상에서 플레이팅하였다. 다양한 캘러스 유도 배지를 시험하였다. 시험된 배지에 대해 열거된 성분은 하기 표 5에 제시되어 있다.
<표 5>
Figure 112013063433423-pct00021
Figure 112013063433423-pct00022
실시예 7. 제초제-내성 캘러스 선별
일단 조직 배양 조건을 결정되고 나면, 사플루페나실, 비페녹스, 디우론, 락토펜, 부타페나실, 아시플루오르펜, 벤족사지논-유도체 제초제를 이용한 사멸 곡선에서의 조직 생존 분석을 통해 선별 조건을 추가로 확립하였다. 조직내 제초제 축적 뿐만 아니라, 세포 및 배양 배지 중에서의 그의 지속성 및 안정성을 신중히 고려하였다. 상기 실험을 통해, 돌연변이화된 물질의 초기 선별을 위한 준치사량을 확립하였다. 선별 배지 중 사플루페나실, 비페녹스, 디우론, 락토펜, 부타페나실, 아시플루오르펜 및 벤족사지논-유도체 제초제의 출발 용량을 확립한 후, 독성 용량의 존재하에서 왕성하게 성장하는 세포를 회수할 때까지 매회 이동시마다 PPO 억제제의 농도를 증가시켜 가면서 단계식으로 조직을 선별하였다. 매 3-4주마다 생성된 캘러스를, 선별제를 포함하는 R001M으로 추가로 계대배양하였다. 사멸 곡선 및 연속 배양의 관찰 결과에 의해 측정된 바, 선택압이 독성 수준을 초과할 때까지 4-5회의 계대배양 동안 26,000개 초과의 캘러스가 선별되었다. 별법으로, 천천히 진탕시키고, 매주 계대배양하면서, MS711R 중 캘러스로부터의 액체 배양을 개시하였다. 일단 액체 배양물이 확립되고 나면, 각 계대배양시마다 플라스크에 직접 선별제를 첨가하였다. 2-4회차의 액체 선별 후, 추가로 성장시키기 위해 배양물을 필터를 걸쳐 고체 R001M 배지 상으로 옮겨 놓았다.
실시예 8. 식물 재생
내성 조직을 재생시키고, PPO 유전자 서열 돌연변이에 대해 분자적으로, 및/또는 선별제의 존재하에 변경된 PPO 활성에 대해 생화학적으로 특징을 규명하였다. 추가로, 테트라피롤 생합성 및또는 대상 경로에 직접 및/또는 간접적으로 관여하는 유전자를 또한 서열 분석하여 돌연변이의 특징을 규명하였다. 최종적으로, 운명 (예컨대, 대사, 전위, 수송)을 바꾼 효소 또한 서열 분석하여 돌연변이의 특징을 규명하였다.
제초제 선별 후, 10 - 14일 동안 R025M, 약 2주 동안 R026M, 잘 형성된 새싹이 발생할 때까지 R327M, 및 온실로 옮길 수 있도록 새싹이 잘 착근될 때까지 R008S로 이루어진 배지 요법을 사용하여 캘러스를 재생시켰다. 광 존재하에 재생을 수행하였다. 재생 동안에는 선별제를 포함하지 않았다.
일단 튼실하게 뿌리를 내리고 나면, M0 재생체를 사각형 또는 둥근 모양의 화분에 옮겨 심고 온실로 옮겨 놓았다. 이식물이 온실 조건에 적응할 때까지 이를 투명 플라스틱 컵 하에 유지시켰다. 광주기가 14시간으로 유지되도록 빛을 보충해주면서 600 W의 고압 나트륨 광을 이용하면서 27℃/21℃ (80°F/70°F)의 광주기/암주기로 온실을 설정하였다. 날씨에 의존하여 필요에 따라 식물을 물을 주고, 매일 비료를 주었다.
실시예 9. 서열 분석
옮겨 심기 위해 분리된 클론 식물로부터 잎 조직을 수집하고, 개체로서 분석하였다. 제조사의 지시에 따라 위자드® 96 마그네틱 DNA 식물계용 키트(Wizard® 96 Magnetic DNA Plant System kit) (프로메가(Promega), 미국 특허 번호 제6,027,945호 & 제6,368,800호)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 적절한 전방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 단리된 DNA를 PCR 증폭시켰다. 핫스타 Taq DNA 폴리머라제(Hotstar Taq DNA Polymerase) (퀴아젠)을 사용하여 하기와 같은 터치다운 열순환 프로그램을 이용함으로써 PCR 증폭을 수행하였다: 96℃에서 15 min 동안, 이어서, 35회 순환 (96℃에서 30 sec; 매 순환마다 58℃-0.2℃에서 30 sec; 72℃에서 3 min 및 30 sec), 72℃에서 10 min.
PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 농도 및 단편 크기에 대해 확인하였다. PCR 프라이머 (DNA 랜드마크스(DNA Landmarks), 엔텔레콘(Entelechon))를 사용하여 정방향 서열에 의해 탈인산화된 PCR 생성물을 분석하였다. 크로마토그램 트레이스 파일 (.scf)을 벡터 NTI 어드밴스 10™ (인비트로겐)를 사용하여 야생형 유전자에 대해 상대적인 돌연변이에 대하여 분석하였다. 서열 정보에 기초하여 수개의 개체에서 돌연변이를 확인하였다. 디폴트 설정을 이용하여 대표 크로마토그램 및 상응하는 얼라인X 정렬 상에서 서열 분석을 수행하고, 제2 호(call) 피크로 편집하였다.
실시예 10. 제초제-내성 입증
선별된 돌연변이체 및 이탈물을 작은 화분으로 옮겨 심었다. 야생형 재배종을 종자로부터 발아시키고, 이것이 대조군으로서의 역할을 하였다.
옮겨 심은 후 약 3주가 경과하였을 때, 0.1% 메틸화된 종자 오일로 보충된 사플루페나실 (BAS 800H) 또는 벤족사지논-유도체 I.a.35를 트랙 분무기로 M0 재생체에 분무하였다. 식물이 온실 조건에 적응한 후, 추가의 사플루페나실 (BAS 800H) 또는 벤족사지논-유도체 I.a.35를 서브세트에 분무하였다. 일단 분무하고 나면, 식물을 24시간 동안 건조 조건으로 유지시킨 후, 다시 물을 주고 비료를 주었다. 분무를 받은 식물의 사진을 촬영하고, 처리 후 1 및 2주째에 제초제에 따른 손상에 대하여 등급화하였다.
실시예 11. 조직 배양물을 사용한 제초제 선별
상기 명시된 바와 같이 작성된 용도 및 사멸 곡선용 배지를 선별하였다. 선별을 위해, 상이한 기법이 사용되었다. 단계식 선별법을 적용하거나, 즉시 치사 수준의 제초제를 적용하였다. 어느 경우든, 모든 캘러스를 매회 새회차의 선별을 위해 옮겨 놓았다. 매 주기를 3-5주로하여 4-5회에 걸친 배양 주기로 선별을 수행하였다. 캘러스를 나일론 막 위에 놓고 쉽게 이동할 수 있게 하였다 (200 ㎛ 공극 시트, 바이오디자인(Biodesign: 미국 메인주 사코)). 막을 100 x 20 mm 페트리 디쉬에 맞게 절단하고, 오토클레이빙한 후, 모든 플레이트마다 25-35개의 캘러스 (평균 중량/캘러스 = 22 mg)를 사용하였다. 추가로, 한 세트의 캘러스는 매주 계대배양하면서 액체 배양 배지 중에서 선별한 후, 반고체 배지 중에서 추가로 선별하였다.
사플루페나실 (BAS 800H) 또는 벤족사지논-유도체 I.a.35를 사용하여 돌연변이체 세포주를 선별하였다. 재생가능한 돌연변이체 세포주를 생성하는 캘러스의 비율(%), 또는 사용된 조직 (g)에 의해 측정되는 세포주의 개수에 기초하였을 때, 돌연변이체 수득률은 높았다. 전반적으로, 해안 파스팔룸과 비교해 볼 때, 돌연변이 빈도는 5배, 메이지와 비교해 볼 때는 2배였다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> PLANTS HAVING INCREASED TOLERANCE TO HERBICIDES <130> PF71580 <150> US 61/423604 <151> 2010-12-16 <150> EP 10195296.8 <151> 2010-12-16 <160> 46 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Amaranthus tuberculatus <400> 1 atggtaattc aatccattac ccacctttca ccaaaccttg cattgccatc gccattgtca 60 gtttcaacca agaactaccc agtagctgta atgggcaaca tttctgagcg ggaagaaccc 120 acttctgcta aaagggttgc tgttgttggt gctggagtta gtggacttgc tgctgcatat 180 aagctaaaat cccatggttt gagtgtgaca ttgtttgaag ctgattctag agctggaggc 240 aaacttaaaa ctgttaaaaa agatggtttt atttgggatg agggggcaaa tactatgaca 300 gaaagtgagg cagaggtctc gagtttgatc gatgatcttg ggcttcgtga gaagcaacag 360 ttgccaattt cacaaaataa aagatacata gctagagacg gtcttcctgt gctactacct 420 tcaaatcccg ctgcactact cacgagcaat atcctttcag caaaatcaaa gctgcaaatt 480 atgttggaac catttctctg gagaaaacac aatgctactg aactttctga tgagcatgtt 540 caggaaagcg ttggtgaatt ttttgagcga cattttggga aagagtttgt tgattatgtt 600 atcgaccctt ttgttgcggg 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Leu Trp Arg Lys His Asn Ala Thr Glu Leu Ser 165 170 175 Asp Glu His Val Gln Glu Ser Val Gly Glu Phe Phe Glu Arg His Phe 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Val Asp Tyr Val Ile Asp Pro Phe Val Ala Gly Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Asp Pro Gln Ser Leu Ser Met His His Thr Phe Pro Glu 210 215 220 Val Trp Asn Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Phe Ala Gly Leu Ile 225 230 235 240 Gln Ser Thr Leu Leu Ser Lys Lys Glu Lys Gly Gly Glu Asn Ala Ser 245 250 255 Ile Lys Lys Pro Arg Val Arg Gly Ser Phe Ser Phe Gln Gly Gly Met 260 265 270 Gln Thr Leu Val Asp Thr Met Cys Lys Gln Leu Gly Glu Asp Glu Leu 275 280 285 Lys Leu Gln Cys Glu Val Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Gln Lys Gly Ile 290 295 300 Pro Ser Leu Gly Asn Trp Ser Val Ser Ser Met Ser Asn Asn Thr Ser 305 310 315 320 Glu Asp Gln Ser Tyr Asp Ala Val Val Val Thr Ala Pro Ile Arg Asn 325 330 335 Val Lys Glu Met Lys Ile Met Lys Phe Gly Asn Pro Phe Ser Leu Asp 340 345 350 Phe Ile Pro Glu Val Thr Tyr Val Pro Leu Ser Val Met Ile Thr Ala 355 360 365 Phe Lys Lys Asp Lys Val 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tgttgttggt gctggagtta gtggacttgc tgctgcatat 180 aagctaaaat cccatggttt gagtgtgaca ttgtttgaag ctgattctag agctggaggc 240 aaacttaaaa ctgttaaaaa agatggtttt atttgggatg agggggcaaa tactatgaca 300 gaaagtgagg cagaggtctc gagtttgatc gatgatcttg ggcttcgtga gaagcaacag 360 ttgccaattt cacaaaataa aagatacata gctagagccg gtcttcctgt gctactacct 420 tcaaatcccg ctgcactact cacgagcaat atcctttcag caaaatcaaa gctgcaaatt 480 atgttggaac catttctctg gagaaaacac aatgctactg aactttctga tgagcatgtt 540 caggaaagcg ttggtgaatt ttttgagcga cattttggga aagagtttgt tgattatgtt 600 attgaccctt ttgttgcggg tacatgtggt ggagatcctc aatcgctttc catgcaccat 660 acatttccag aagtatggaa tattgaaaaa aggtttggct ctgtgtttgc cggactaatt 720 caatcaacat tgttatctaa gaaggaaaag ggtggagaaa atgcttctat taagaagcct 780 cgtgtacgtg gttcattttc atttcaaggt ggaatgcaga cacttgttga cacaatgtgc 840 aaacagcttg gtgaagatga actcaaactc cagtgtgagg tgctgtcctt gtcatataac 900 cagaagggga tcccctcact agggaattgg tcagtctctt ctatgtcaaa taataccagt 960 gaagatcaat cttatgatgc tgtggttgtc actgctccaa ttcgcaatgt caaagaaatg 1020 aagattatga aatttggaaa tccattttca cttgacttta ttccagaggt gacgtacgta 1080 cccctttccg ttatgattac tgcattcaaa aaggataaag tgaagagacc tcttgagggc 1140 ttcggagttc ttatcccctc taaagagcaa cataatggac tgaagactct tggtacttta 1200 ttttcctcca tgatgtttcc tgatcgtgct ccatctgaca tgtgtctctt tactacattt 1260 gtcggaggaa gcagaaatag aaaacttgca aacgcttcaa cggatgaatt gaagcaaata 1320 gtttcttctg accttcagca gctgttgggc actgaggacg aaccttcatt tgtcaatcat 1380 ctcttttgga gcaacgcatt cccattgtat ggacacaatt acgattctgt tttgagagcc 1440 atagacaaga tggaaaagga tcttcctgga tttttttatg caggtaacca taagggtgga 1500 ctttcagtgg gaaaagcgat ggcctccgga tgcaaggctg cggaacttgt aatatcctat 1560 ctggactctc atatatacgt gaagatggat gagaagaccg cgtaa 1605 <210> 4 <211> 534 <212> PRT <213> Amaranthus tuberculatum <400> 4 Met Val Ile Gln Ser Ile Thr His Leu Ser Pro Asn Leu Ala Leu Pro 1 5 10 15 Ser Pro Leu Ser Val Ser Thr Lys Asn Tyr Pro Val Ala Val Met Gly 20 25 30 Asn Ile Ser Glu Arg Glu Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val 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ccaaaccttg cattgccatc gccattgtca 60 gtttccacca agaactaccc agtagctgta atgggcaaca tttctgagcg ggaagaaccc 120 acttctgcta aaagggttgc tgttgttggt gctggagtta gtggacttgc tgctgcatat 180 aagctaaaat cccatggttt gagtgtgaca ttgtttgaag ctaattctag agctggaggc 240 aaacttaaaa ctgttaaaaa agatggtttt atttgggatg agggggcaaa tactatgaca 300 gaaagtgagg cagaggtctc gagtttgatc gatgatcttg ggcttcgtga gaagcaacag 360 ttgccaattt cacaaaataa aagatacata gctagagacg gtcttcctgt gctactacct 420 tcaaatcccg ctgcactact cacgagcaat atcctttcag caaaatcaaa gctgcaaatt 480 atgttggaac catttctctg gagaaaacac aatgctactg aactttctga tgagcatgtt 540 caggaaagcg ttggtgaatt ttttgagcga cattttggga aagagtttgt tgattatgtt 600 attgaccctt ttgttgcggg tacatgtgga gatcctcaat cgctttccat gtaccataca 660 tttccagaag tatggaatat tgaaaaaagg tttggctctg tgtttgctgg actaattcaa 720 tcaacattgt tatctaagaa ggaaaagggt ggagaaaatg cttctattaa gaagcctcgt 780 gtacgtggtt cattttcatt tcaaggtgga atgcagacac ttgttgacac aatgtgcaaa 840 cagcttggtg aagatgaact caaactccag tgtgaggtgc tgtccttgtc 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ctagtgacgt tcatctatat acaactttta ttggtgggag taggaaccag 1320 gaactagcca aagcttccac tgacgaatta aaacaagttg tgacttctga ccttcagcga 1380 ctgttggggg ttgaaggtga acccgtgtct gtcaaccatt actattggag gaaagcattc 1440 ccgttgtatg acagcagcta tgactcagtc atggaagcaa ttgacaagat ggagaatgat 1500 ctacctgggt tcttctatgc aggtaatcat cgaggggggc tctctgttgg gaaatcaata 1560 gcatcaggtt gcaaagcagc tgaccttgtg atctcatacc tggagtcttg ctcaaatgac 1620 aagaaaccaa atgacagctt ataa 1644 <210> 10 <211> 547 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 Met Gly Leu Ile Lys Asn Gly Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Gly Ile Ser 1 5 10 15 Trp Asn Phe Ala Ala Val Phe Phe Ser Thr Tyr Phe Arg His Cys Phe 20 25 30 Arg Leu Val Arg Asp Phe Asp Ser Glu Leu Leu Gln Ile Ala Met Ala 35 40 45 Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala Val Ser Gly Lys Arg 50 55 60 Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys 65 70 75 80 Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Asp Gly Arg 85 90 95 Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gln Asn 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cctcaaaact gagtatgaaa 720 gcagcatttg ggaaagtttg gaagttggaa gaaactggtg gtagcattat tggaggaacc 780 tttaaagcaa taaaggagag atccagtaca cctaaagcgc cccgcgatcc gcgtttacct 840 aaaccaaaag gacagacagt tggatcattc aggaagggtc tcagaatgct gccggatgca 900 atcagtgcaa gattgggaag caaattaaaa ctatcatgga agctttctag cattactaag 960 tcagaaaaag gaggatatca cttgacatac gagacaccag aaggagtagt ttctcttcaa 1020 agtcgaagca ttgtcatgac tgtgccatcc tatgtagcaa gcaacatatt acgtcctctt 1080 tcggttgccg cagcagatgc actttcaaat ttctactatc ccccagttgg agcagtcaca 1140 atttcatatc ctcaagaagc tattcgtgat gagcgtctgg ttgatggtga actaaaggga 1200 tttgggcagt tgcatccacg tacacaggga gtggaaacac taggaacgat atatagttca 1260 tcactcttcc ctaaccgtgc cccaaaaggt cgggtgctac tcttgaacta cattggagga 1320 gcaaaaaatc ctgaaatttt gtctaagacg gagagccaac ttgtggaagt agttgatcgt 1380 gacctcagaa aaatgcttat aaaacccaaa gctcaagatc ctcttgttgt gggtgtgcga 1440 gtatggccac aagctatccc acagtttttg gttggtcatc tggatacgct aagtactgca 1500 aaagctgcta tgaatgataa tgggcttgaa gggctgtttc ttgggggtaa ttatgtgtca 1560 ggtgtagcat tggggaggtg tgttgaaggt gcttatgaag ttgcatccga ggtaacagga 1620 tttctgtctc ggtatgcata caaatga 1647 <210> 12 <211> 548 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 12 Met Thr Thr Thr Pro Ile Ala Asn His Pro Asn Ile Phe Thr His Gln 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Pro Leu Ala Phe Leu Asn Arg Thr Ser Phe Ile Pro 20 25 30 Phe Ser Ser Ile Ser Lys Arg Asn Ser Val Asn Cys Asn Gly Trp Arg 35 40 45 Thr Arg Cys Ser Val Ala Lys Asp Tyr Thr Val Pro Ser Ser Ala Val 50 55 60 Asp Gly Gly Pro Ala Ala Glu Leu Asp Cys Val Ile Val Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Val Met Ser Ala Asn Tyr Pro Asn 85 90 95 Leu Met Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Thr 100 105 110 Val Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln 115 120 125 Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Ala Val Asp Cys Gly Leu Lys Asp 130 135 140 Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Lys 145 150 155 160 Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe 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gaatgcccaa 540 gaaagtgtgg ctgagttttt tgagcggcat tttgggaaag agtttgttga ttatttaatt 600 gatccttttg tcgcgggtac aagtggtgga gatcctcaat ctctttctat gcgtcatgca 660 tttccagaat tatggaatat tgagaacagg tttggttcag tgatttctgg attcattcag 720 tctaaactgt catccaagaa ggaaaagggt ggagaaaagc aatcttctaa taagaagcca 780 cgtgtacgtg gttcgttttc ttttcagggt ggaatgcaga cactagttga cactatatgc 840 aaagagtttg gtgaagatga actcaaactc cagtctgagg ttctttcatt gtcatacagc 900 cataatggaa gccttacatc agagaattgg tcagtgtctt ctatgtcaaa cagcaccatc 960 caagatcaac catatgatgc tgtcgttgtg accgccccaa tcaataatgt caaagaactg 1020 aagattatga aagtggaaaa cccattttct cttgacttca ttccagaggt gagctgtcta 1080 cccctctctg ttattattac tacattcaag aagaccaatg tgaagagacc tcttgagggt 1140 tttggtgttc ttgtaccctc taatgagcaa cataatgggc tgaagactct tggtactttg 1200 ttttcctcaa tgatgtttcc tgatcgtgct ccctctgatg tgtatctata cactaccttt 1260 gttggaggta gcagaaatag agaacttgca aaagcttcaa cggatgaact gaagcaaata 1320 gtttcttctg acctccagca gctgttgggc accgagggcg aacctacttt tgtgaatcat 1380 ttttactgga gcaaagcatt ccctctttat ggacgcaatt acgactcagt tcttagagca 1440 atagagaaga tggaaaggga ccttcctgga cttttttacg caggtaacca taagggtgga 1500 ctgtctgtgg gaaagtcaat agcctctgga tacaaagctg ccgagcttgc gatatcctat 1560 ctcgagtcta acaagatgac cgaggagact atataa 1596 <210> 18 <211> 531 <212> PRT <213> Spinacia <400> 18 Met Val Ile Leu Pro Val Ser Gln Leu Ser Thr Asn Leu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Leu Val Ser Pro Thr Lys Asn Asn Pro Val Met Gly Asn Val Ser Glu 20 25 30 Arg Asn Gln Val Asn Gln Pro Ile Ser Ala Lys Arg Val Ala Val Val 35 40 45 Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Asn 50 55 60 Gly Leu Asn Val Thr Leu Phe Glu Ala Asp Ser Arg Ala Gly Gly Lys 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Val Lys Asp Gly Leu Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn 85 90 95 Thr Met Thr Glu Ser Asp Glu Glu Val Thr Ser Leu Phe Asp Asp Leu 100 105 110 Gly Ile Arg Glu Lys Leu Gln Leu Pro Ile Ser Gln Asn Lys Arg Tyr 115 120 125 Ile Ala Arg Asp Gly Leu Pro Val Leu Leu Pro Ser Asn Pro Val Ala 130 135 140 Leu Leu Lys 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cctcctcctc atcgccgtca tttttatttt taaaccgtac gaatttcatt 120 ccttactttt ccacctccaa gcgcaatagt gtcaattgca atggctggag aacacgatgt 180 tccgttgcca aggattatac agttcctccc tcggaagtcg acggtaatca gttcccggag 240 ctggattgtg tggtagttgg agcaggaatt agtggactct gcattgctaa ggtgatttcg 300 gctaattatc ccaatttgat ggtgacggag gcgagggatc gtgccggtgg aaacataacg 360 acggtggaaa gagatggata cttatgggaa gaaggtccta acagtttcca gccttcggat 420 cctatgttga caatggctgt agattgtgga ttgaaggatg atttggtgtt gggagatcct 480 gatgcgcctc gctttgtctt gtggaaggat aaactaaggc ctgttcccgg caagctcact 540 gatcttccct tctttgattt gatgagtatc cctggcaagc tcagagctgg ttttggtgcc 600 attggccttc gcccttcacc tccaggttat gaggaatcag ttgagcagtt cgtgcgtcgt 660 aatcttggtg cagaagtctt tgaacgtttg attgaaccat tttgttctgg tgtttacgcc 720 ggtgacccct caaaattgat tatgaaagca gcatttggga aagtgtggaa gctagaacaa 780 actggtggta gcattattgg gggaaccttt aaagcaatta aggagagatc cagtaaccct 840 aaaccgcctc gtgatccgcg tttaccaaca ccaaaaggac aaactgttgg atcatttagg 900 aagggtctga gaatgctgcc 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tggtggcggc ggcgaacccg ttgaaggagg tggattaccc gccagtagcg 1200 ttggtcgttc tttcgtacga cgtcgactcg atttccgcca tacaccgcgt gagtcacgtg 1260 gctcatggcc tcagcggctt tggccaactc caccctcgcc cagagggtct ccgtacatta 1320 ggaaccattt acggcagtac attatttccc aaccgttccc ccgtagctcg tacgacgctt 1380 ttaaatttcg ttggtggatc caccgaccgt gcagtggggt ccgcggatcc aatggctttg 1440 gcgatggagg tggatctgga tctgaaaaag agcgggttga tccgagaggg agctgcgaag 1500 ccagaagtcc tcggggtgaa agtatatcca aaggctattc ctcagtttga tattggtcat 1560 ttggatcgag tggaaaaggc caaaatgatg ttaaagaacg aaaggggggg tgcagattgg 1620 agtggggtca aattggcggg aaattatgtg tgcggcgtcg cagtgggcag atgcatagaa 1680 tttggattcg aaattgcgga gaacttggcg caggaattgg cgagaaaaaa atag 1734 <210> 28 <211> 577 <212> PRT <213> Polytomella <400> 28 Met Ser Ser Ser Ala Leu Arg Leu Leu Cys Gly Arg Thr Ser Phe Phe 1 5 10 15 Asn Leu Cys Gln Lys Tyr Pro Pro Ser Phe Leu Ser Gln Leu Ser Thr 20 25 30 Leu Asn Phe Ser Thr His Ser Pro Phe Asp Ser Thr Tyr Asp Val Val 35 40 45 Val Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 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ctaactccca acacaagcgt tacattgtca aagatggagc accagcactg 420 attccttcgg atcccatttc gctgatgaaa agcagtgttc tttctacaaa atcaaagatt 480 gcgttatttt ttgaaccatt tctctacaag aaagctaaca caagaaaccc tggaaaagta 540 tctgatgagc atttgagtga gagtgttggg agcttctttg aacgccactt cggaagagaa 600 gttgttgact atcttattga tccatttgta gctggaacaa gtgcaggaga tccagagtca 660 ctatctattt gtcatgcatt cccagcactg tggaatttgg aaagaaaata tggttcagtt 720 gttgttggtg ccatcttgtc taagctaaca gctaaaggtg atccagtaaa gacaagacgt 780 gattcatcag cgaaaagaag gaatagacgc gtgtcgtttt catttcatgg tggaatgcag 840 tcactaataa atgcacttca caatgaagtt ggagatgata atgtgaagct tggtacagaa 900 gtgttgtcat tggcgtgtac attagatgga gcccctgcac caggcgggtg gtcaatttct 960 gatgattcga aggatgctag tggcaaggac cttgctaaaa accaaacctt tgatgctgtt 1020 ataatgacag ctccattgtc aaatgtccag aggatgaagt tcacaaaagg tggagctcct 1080 tttgttctag actttcttcc taaggtggat tatctaccac tatctctcat ggtgactgct 1140 tttaagaagg aagatgtcaa gaaacctctg gaaggatttg gcgtcttaat accctacaag 1200 gaacagcaaa aacatggtct 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aaaccccaaa 780 ccgccgaggg atccccgcct tccaacgcca aaggggcaga cagttgcatc tttcaggaag 840 ggtctgacta tgctcccgga tgctattaca tctaggttgg gtagcaaagt caaactttca 900 tggaagttga caagcattac aaagtcagac aacaaaggat atgcattagt gtatgaaaca 960 ccagaagggg tggtctcggt gcaagctaaa actgttgtca tgaccatccc atcatatgtt 1020 gctagtgata tcttgcggcc actttcaagt gatgcagcag atgctctgtc aatattctat 1080 tatccaccag ttgctgctgt aactgtttca tatccaaaag aagcaattag aaaagaatgc 1140 ttaattgacg gagagctcca gggtttcggc cagctgcatc cgcgtagtca gggagttgag 1200 actttaggaa caatatatag ctcatcactc tttccaaatc gtgctccagc tggaagggtg 1260 ttacttctga actacatagg aggttctaca aatacaggga ttgtttccaa gactgaaagt 1320 gagctggtag aagcagttga ccgtgacctc aggaagatgc tgataaatcc taaagcagtg 1380 gaccctttgg tccttggcgt ccgggtatgg ccacaagcca taccacagtt cctcattggc 1440 catcttgatc atcttgaggc tgcaaaatct gccctgggca aaggtggtta tgatggattg 1500 ttcctcggag ggaactatgt tgcaggagtt gccctgggcc gatgcgttga aggtgcatat 1560 gagagtgcct cacaaatatc tgactacttg accaagtacg cctacaagtg a 1611 <210> 34 <211> 536 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 34 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Ala Thr Ala Thr Ser Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ala Pro Pro Leu Arg Ile Arg Asp Ala Ala Arg Arg Thr Arg Arg Arg 20 25 30 Gly His Val Arg Cys Ala Val Ala Ser Gly Ala Ala Glu Ala Pro Ala 35 40 45 Ala Pro Gly Ala Arg Val Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly 50 55 60 Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Gly Val 65 70 75 80 Gly Asp Val Leu Val Thr Glu Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile 85 90 95 Thr Thr Ala Glu Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro 100 105 110 Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser 115 120 125 Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe 130 135 140 Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp 145 150 155 160 Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly 165 170 175 Leu Gly Ala Leu Gly Val Arg Ala Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser 180 185 190 Val Glu Asp Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly 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ccatgatgtt tcccgatcgt 1140 gctccatctg acatgtgtct ctttactaca tttgtcggag gaagcagaaa tagaaaactt 1200 gcaaacgctt caacggatga attgaagcaa atagtttctt ctgaccttca gcagctgttg 1260 ggcactgagg acgaaccttc atttgtcaat catctctttt ggagcaacgc attcccgttg 1320 tatggacaca attacgattc tgttttgaga gccatagaca agatggaaaa ggatcttcct 1380 ggattttttt atgcaggtaa ccataagggt ggactttcag tgggaaaagc gatggcctcc 1440 ggatgcaagg ctgcggaact tgtaatatcc tatctggact ctcatatata tgtgaagatg 1500 gatgagaaga ccgcgtaa 1518 <210> 36 <211> 505 <212> PRT <213> Amaranthus <400> 36 Met Gly Asn Ile Ser Glu Arg Asp Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu 20 25 30 Lys Ser His Gly Leu Asn Val Thr Leu Phe Glu Ala Asp Ser Arg Ala 35 40 45 Gly Gly Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Asp Gly Phe Ile Trp Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ala Glu Val Ser Ser Leu Ile 65 70 75 80 Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Leu Pro Ile Ser Gln Asn 85 90 95 Lys Arg Tyr Ile Ala Arg 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Tyr Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser Arg Asn Arg Glu 385 390 395 400 Leu Ala Lys Ala Ser Arg Thr Glu Leu Lys Glu Ile Val Thr Ser Asp 405 410 415 Leu Lys Gln Leu Leu Gly Ala Glu Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asn His 420 425 430 Leu Tyr Trp Ser Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Gly His Asn Tyr Asp Ser 435 440 445 Val Leu Asp Ala Ile Asp Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Leu Phe 450 455 460 Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Leu Ser 465 470 475 480 Ser Gly Cys Asn Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu Ser Val 485 490 495 Ser Thr Asp Ser Lys Arg His Cys 500 <210> 41 <211> 1509 <212> DNA <213> Glycine max <400> 41 atggcttcct ctgcaacaga cgataaccca agatctgtaa aaagagtagc tgttgttggt 60 gctggggtaa gtgggcttgc tgcggcttac aaattgaaat cacatggtct ggatgtcact 120 gtatttgaag ctgagggaag agctggaggg aggttgagaa gtgtttctca ggatggtcta 180 atttgggatg agggagctaa tacaatgact gaaagtgaaa ttgaggttaa aggtttgatt 240 gatgctcttg gacttcaaga aaagcagcag tttccaatat cacagcataa gcgctatatt 300 gtgaaaaatg gggcaccact tctggtaccc acaaatcctg ctgcactact gaagagtaaa 360 ctgctttctg cacaatcaaa gatccatctc atttttgaac catttatgtg gaaaagaagt 420 gacccctcta atgtgtgtga tgaaaattct gtggaaagtg taggcaggtt ctttgaacgt 480 cattttggaa aagaggttgt ggactatctg attgatcctt ttgttggggg cactagtgca 540 gcagatcctg aatctctctc tatgcgccat tctttcccag agctatggaa tttggagaaa 600 aggtttggct ccattatagc cggggcattg caatctaagt tattcgccaa aagggaaaaa 660 actggagaaa ataggactgc actaagaaaa aacaaacaca agcgtggttc gttttctttc 720 cagggtggga tgcagacact gacagataca ttgtgcaaag agcttggcaa agacgacctt 780 aaattaaatg aaaaggtttt gacattagct tatggtcatg atggaagttc ctcttcacaa 840 aactggtcta ttactagtgc ttctaaccaa agtacacaag atgttgatgc agtaatcatg 900 acggctcctc tatataatgt caaggacatc aagatcacaa aaaggggaac tccctttcca 960 cttaattttc ttcccgaggt aagctacgtg ccaatctcag tcatgattac taccttcaaa 1020 aaggagaatg taaagagacc tttggaggga tttggagttc ttgttccttc taaagagcaa 1080 aaaaatggtt taaaaaccct tggtacactt ttttcctcta tgatgttccc agatcgtgca 1140 cctagtgatt tatatctcta taccaccttc attggcggaa ctcaaaacag ggaacttgct 1200 caagcttcaa ctgacgagct taggaaaatt gttacttctg acctgagaaa gttgttggga 1260 gcagaggggg aaccaacatt tgttaaccat ttctattgga gtaaaggctt tcctttgtat 1320 ggacgtaact atgggtcagt tcttcaagca attgataaga tagaaaaaga tcttcccgga 1380 tttttctttg caggtaacta caaaggtgga ctctcagttg gcaaagcaat agcctcaggc 1440 tgcaaagcag ctgatcttgt gatatcctac ctcaactctg cttcagacaa cacagtgcct 1500 gataaatga 1509 <210> 42 <211> 502 <212> PRT <213> Glycine <400> 42 Met Ala Ser Ser Ala Thr Asp Asp Asn Pro Arg Ser Val Lys Arg Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu 20 25 30 Lys Ser His Gly Leu Asp Val Thr Val Phe Glu Ala Glu Gly Arg Ala 35 40 45 Gly Gly Arg Leu Arg Ser Val Ser Gln Asp Gly Leu Ile Trp Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ile Glu Val Lys Gly Leu Ile 65 70 75 80 Asp Ala Leu Gly Leu Gln Glu Lys Gln Gln Phe Pro Ile Ser Gln His 85 90 95 Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asn Gly Ala Pro Leu Leu Val Pro Thr Asn 100 105 110 Pro Ala Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Leu Ser Ala Gln Ser Lys Ile 115 120 125 His Leu Ile Phe Glu Pro Phe Met Trp Lys Arg Ser Asp Pro Ser Asn 130 135 140 Val Cys Asp Glu Asn Ser Val Glu Ser Val Gly Arg Phe Phe Glu Arg 145 150 155 160 His Phe Gly Lys Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe Val Gly 165 170 175 Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Glu Ser Leu Ser Met Arg His Ser Phe 180 185 190 Pro Glu Leu Trp Asn Leu Glu Lys Arg Phe Gly Ser Ile Ile Ala Gly 195 200 205 Ala Leu Gln Ser Lys Leu Phe Ala Lys Arg Glu Lys Thr Gly Glu Asn 210 215 220 Arg Thr Ala Leu Arg Lys Asn Lys His Lys Arg Gly Ser Phe Ser Phe 225 230 235 240 Gln Gly Gly Met Gln Thr Leu Thr Asp Thr Leu Cys Lys Glu Leu Gly 245 250 255 Lys Asp Asp Leu Lys Leu Asn Glu Lys Val Leu Thr Leu Ala Tyr Gly 260 265 270 His Asp Gly Ser Ser Ser Ser Gln Asn Trp Ser Ile Thr Ser Ala Ser 275 280 285 Asn Gln Ser Thr Gln Asp Val Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Lys Asp Ile Lys Ile Thr Lys Arg Gly Thr Pro Phe Pro 305 310 315 320 Leu Asn Phe Leu Pro Glu Val Ser Tyr Val Pro Ile Ser Val Met Ile 325 330 335 Thr Thr Phe Lys Lys Glu Asn Val Lys Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly 340 345 350 Val Leu Val Pro Ser Lys Glu Gln Lys Asn Gly Leu Lys Thr Leu Gly 355 360 365 Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ser Asp Leu 370 375 380 Tyr Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gly Gly Thr Gln Asn Arg Glu Leu Ala 385 390 395 400 Gln Ala Ser Thr Asp Glu Leu Arg Lys Ile Val Thr Ser Asp Leu Arg 405 410 415 Lys Leu Leu Gly Ala Glu Gly Glu Pro Thr Phe Val Asn His Phe Tyr 420 425 430 Trp Ser Lys Gly Phe Pro Leu Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Ser Val Leu 435 440 445 Gln Ala Ile Asp Lys Ile Glu Lys Asp Leu Pro Gly Phe Phe Phe Ala 450 455 460 Gly Asn Tyr Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Ile Ala Ser Gly 465 470 475 480 Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Asn Ser Ala Ser Asp 485 490 495 Asn Thr Val Pro Asp Lys 500 <210> 43 <211> 1205 <212> DNA <213> Cucumis sativus <400> 43 agcttccaac cttccgatcc tattctcacc atggtggtgg atagtggctt aaaagatgat 60 ttagttctgg gagacccaga tgcacctcga tttgtattgt ggaatggaaa gctcagacca 120 gtgcctgcga aacctaatga tctacctttc tttgacctga tgagcattgg tggaaaaatc 180 agagcaggct ttggtgccct gggcattcgc cctcctcctc caggtcgaga ggaatcagtt 240 gaagaatttg tccgtcggaa ccttggcaat gaagtttttg aacgtttgat agagccattt 300 tgttctggtg tatacgctgg tgacccttca aagctaagca tgaaagcagc ttttggtaag 360 gtttggaggc tagagcaaaa tggtggtagt attattggtg ggactttcaa agcacttcaa 420 gaaaggaata aaactaccaa accaccaaga gatccgcgtc taccaaagcc taagggccaa 480 actgttggat cttttcggaa aggacttacc atgttgccaa atgctatttc tacttgtttg 540 gggagtaaag taaaagtatc ttggaagcta tctagtatca gtaaagtgga tgacggaggt 600 tatagtttga catacgaaac accagaagga ctagtctcca tactaagcag aagtgtcatc 660 atgacggttc cttcttatat tgctggcact ctgttgcgtc caatctcggg gaaagctgca 720 gatgcacttt caaaatttta ttatccacca gttgcatcag tgaccatatc atatccaaaa 780 ggagcaatta ggaaagaatg cttgattgat ggtgaactaa aggggtttgg tcaattgcac 840 cctcgtagcc agggggtgac tactttggga actatataca gctcatcact ttttcctaat 900 cgagcgccag atggaagggt attgctcttg aactacattg gaggggctac taatactgga 960 attctttctc agacagagag cgagctcata gaagtagttg atcgggattt aagaaaaatc 1020 ctcataaacc caaacgcaga ggatcctcta ccattgagcg tgagggtgtg gccacaagcc 1080 attccacagt tcttgattgg ccatctcgat gttctagaca ccgccaaggc cggactgaga 1140 gaggctggaa tggaggggct atttttaggt ggaaactatg tatgcggtgt ggccttgggg 1200 agatg 1205 <210> 44 <211> 401 <212> PRT <213> Cucumis <400> 44 Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Ile Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly 1 5 10 15 Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val 20 25 30 Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ala Lys Pro Asn Asp Leu 35 40 45 Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe 50 55 60 Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val 65 70 75 80 Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asn Glu Val Phe Glu Arg Leu 85 90 95 Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu 100 105 110 Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Gln Asn Gly 115 120 125 Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Leu Gln Glu Arg Asn Lys 130 135 140 Thr Thr Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln 145 150 155 160 Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asn Ala Ile 165 170 175 Ser Thr Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Val Ser Trp Lys Leu Ser Ser 180 185 190 Ile Ser Lys Val Asp Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro 195 200 205 Glu Gly Leu Val Ser Ile Leu Ser Arg Ser Val Ile Met Thr Val Pro 210 215 220 Ser Tyr Ile Ala Gly Thr Leu Leu Arg Pro Ile Ser Gly Lys Ala Ala 225 230 235 240 Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ser Val Thr Ile 245 250 255 Ser Tyr Pro Lys Gly Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu 260 265 270 Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Thr Thr 275 280 285 Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Asp 290 295 300 Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly 305 310 315 320 Ile Leu Ser Gln Thr Glu Ser Glu Leu Ile Glu Val Val Asp Arg Asp 325 330 335 Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro Asn Ala Glu Asp Pro Leu Pro Leu 340 345 350 Ser Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Ile Gly His 355 360 365 Leu Asp Val Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gly Leu Arg Glu Ala Gly Met 370 375 380 Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Cys Gly Val Ala Leu Gly 385 390 395 400 Arg <210> 45 <211> 1521 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 45 atggccgcct ccgacgaccc ccgcggcggg aggtccgtcg ccgtcgtcgg cgccggcgtc 60 agtgggctcg cggcggcgta caggctgagg aagcgcggcg tgcaggtgac ggtgttcgag 120 gcggccgaca gggcgggtgg gaagatacgg accaactccg agggcgggtt catctgggac 180 gaaggggcca acaccatgac agagagtgaa ttggaggcaa gcaggcttat tgacgatctt 240 ggcctacaag gcaaacagca gtatcctaac tcacaacaca agcgttacat tgtcaaagat 300 ggagcaccaa cactgattcc ctcagatccc attgcgctca tgaaaagcac tgttctttct 360 acaaaatcaa agctcaagct atttctggaa ccatttctct atgagaaatc tagcagaagg 420 acctcgggaa aagtgtctga tgaacattta agtgagagtg tgatttttct gtgtatatgt 480 agagataatc aggttgttga ttatcttatt gatccatttg tggctggaac aagcggagga 540 gatcctgagt cattatcaat tcgtcatgca tttccagcat tatggaattt ggagaataag 600 tatggctctg tcattgctgg tgccatcttg tccaaactat ccactaaggg tgattcagtg 660 aagacaggag gtgcttcgcc agggaaagga aggaataaac gtgtgtcatt ttcatttcat 720 ggtggaatgc agtcactaat agatgcactt cacaatgaag ttggagatgg taacgtgaag 780 cttggtacag aagtgttgtc attggcatgt tgctgtgatg gagtctcttc ttctggtggt 840 tggtcaattt ctgttgattc aaaagatgct aaagggaaag atctcagaaa gaaccaatct 900 ttcgatgctg ttataatgac tgctccattg tctaatgtcc agaggatgaa gtttacaaaa 960 ggtggagttc cctttgtgct agactttctt cctaaggtcg attatctacc actatctctc 1020 atggtaacag cttttaagaa ggaagatgtc aaaaaaccat tggaaggatt tggtgccttg 1080 ataccctata aggaacagca aaagcatggt ctcaaaaccc ttgggaccct cttctcctcg 1140 atgatgtttc cagatcgagc tcctaatgat caatatctat atacatcttt cattgggggg 1200 agccataata gagacctcgc tggggctcca acggctattc tgaaacaact tgtgacctct 1260 gacctaagaa agctcttggg tgttgaggga caacctactt ttgtgaagca tgtacattgg 1320 agaaatgctt ttcctttata tggccagaat tatgatctgg tactggaagc tatagcaaaa 1380 atggagaaca atcttccagg gttcttttac gcaggaaata acaaggatgg gttggctgtt 1440 ggaaatgtta tagcttcagg aagcaaggct gctgaccttg tgatctctta tcttgaatct 1500 tgcacagatc aggacaatta g 1521 <210> 46 <211> 506 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 46 Met Ala Ala Ser Asp Asp Pro Arg Gly Gly Arg Ser Val Ala Val Val 1 5 10 15 Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu Arg Lys Arg 20 25 30 Gly Val Gln Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala Gly Gly Lys 35 40 45 Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn 50 55 60 Thr Met Thr Glu Ser Glu Leu Glu Ala Ser Arg Leu Ile Asp Asp Leu 65 70 75 80 Gly Leu Gln Gly Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His Lys Arg Tyr 85 90 95 Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Thr Leu Ile Pro Ser Asp Pro Ile Ala 100 105 110 Leu Met Lys Ser Thr Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Leu Lys Leu Phe 115 120 125 Leu Glu Pro Phe Leu Tyr Glu Lys Ser Ser Arg Arg Thr Ser Gly Lys 130 135 140 Val Ser Asp Glu His Leu Ser Glu Ser Val Ile Phe Leu Cys Ile Cys 145 150 155 160 Arg Asp Asn Gln Val Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe Val Ala Gly 165 170 175 Thr Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg His Ala Phe Pro 180 185 190 Ala Leu Trp Asn Leu Glu Asn Lys Tyr Gly Ser Val Ile Ala Gly Ala 195 200 205 Ile Leu Ser Lys Leu Ser Thr Lys Gly Asp Ser Val Lys Thr Gly Gly 210 215 220 Ala Ser Pro Gly Lys Gly Arg Asn Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe His 225 230 235 240 Gly Gly Met Gln Ser Leu Ile Asp Ala Leu His Asn Glu Val Gly Asp 245 250 255 Gly Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu Ala Cys Cys Cys 260 265 270 Asp Gly Val Ser Ser Ser Gly Gly Trp Ser Ile Ser Val Asp Ser Lys 275 280 285 Asp Ala Lys Gly Lys Asp Leu Arg Lys Asn Gln Ser Phe Asp Ala Val 290 295 300 Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Gln Arg Met Lys Phe Thr Lys 305 310 315 320 Gly Gly Val Pro Phe Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys Val Asp Tyr Leu 325 330 335 Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Glu Asp Val Lys Lys 340 345 350 Pro Leu Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ile Pro Tyr Lys Glu Gln Gln Lys 355 360 365 His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro 370 375 380 Asp Arg Ala Pro Asn Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Gly 385 390 395 400 Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ala Ile Leu Lys Gln 405 410 415 Leu Val Thr Ser Asp Leu Arg Lys Leu Leu Gly Val Glu Gly Gln Pro 420 425 430 Thr Phe Val Lys His Val His Trp Arg Asn Ala Phe Pro Leu Tyr Gly 435 440 445 Gln Asn Tyr Asp Leu Val Leu Glu Ala Ile Ala Lys Met Glu Asn Asn 450 455 460 Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Asp Gly Leu Ala Val 465 470 475 480 Gly Asn Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser 485 490 495 Tyr Leu Glu Ser Cys Thr Asp Gln Asp Asn 500 505

Claims (22)

  1. a) "벤족사지논-유도체 제초제"에 대해 저항성 또는 내성을 띠는 돌연변이화된 프로토포피리노겐 옥시다제 (mut-PPO)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 식물을 식물 재배지에 제공하는 단계, 및
    b) 상기 식물 재배지에 유효량의 상기 제초제를 적용하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 코딩된 mut-PPO는 (i) 128번 위치의 아미노산이 알라닌이고, (ii) 420번 위치의 아미노산이 메티오닌, 이소류신 또는 류신인 서열 번호 2의 변이체인, 식물 재배지에서 원치않는 식생을 방제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, a)의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1 또는 3의 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물이 제초제 내성 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 추가의 이종성 핵산을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 벤족사지논-유도체 제초제가 하나 이상의 다른 제초제와 함께 적용되는 것인 방법.
  5. 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 mut-PPO를 사용하여 벤족사지논-유도체 제초제를 확인하는 방법으로서,
    여기서 코딩된 mut-PPO는 (i) 128번 위치의 아미노산이 알라닌이고, (ii) 420번 위치의 아미노산이 메티오닌, 이소류신 또는 류신인 서열 번호 2의 변이체인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    a) mut-PPO를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 세포 또는 식물을 생성하고, 여기서 mut-PPO가 발현되는 것인 단계;
    b) 벤족사지논-유도체 제초제를 a)의 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 같은 품종의 대조군 세포 또는 식물에 적용하는 단계;
    c) 상기 제초제의 적용 후, 트랜스제닉 세포 또는 식물 및 대조군 세포 또는 식물의 성장 또는 생존능을 측정하는 단계; 및
    d) 트랜스제닉 세포 또는 식물의 성장과 비교하여 대조군 세포 또는 식물의 성장을 감소시키는 제초제를 선별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. mut-PPO를 코딩하는 단리된 핵산으로서,
    여기서 코딩된 mut-PPO는 (i) 128번 위치의 아미노산이 알라닌이고, (ii) 420번 위치의 아미노산이 메티오닌, 이소류신 또는 류신인 서열 번호 2의 변이체인, 핵산.
  8. 식물 세포에서의 핵산 발현을 통해 식물 세포의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성 또는 내성이 증가되는 것인, 제7항에 정의된 바와 같은 mut-PPO 핵산에 의해 형질전환된 트랜스제닉 식물 세포.
  9. 식물에서의 핵산 발현을 통해 식물의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 식물의 저항성이 증가되는 것인, 제8항에 정의된 바와 같은 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  10. 제7항에 정의된 바와 같은 돌연변이유발된 또는 재조합 mut-PPO를 발현하는 식물.
  11. 종자가 종자의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성의 증가를 위한 순수 육종인, 제8항에 정의된 바와 같은 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 제9항에 정의된 바와 같은 식물에 의해 생산된 종자.
  12. 식물 세포를 제7항에 정의된 바와 같은 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계를 포함하는,
    식물 세포의 야생형 품종과 비교하여 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 트랜스제닉 식물 세포를 제조하는 방법.
  13. (a) 식물 세포를 제7항에 정의된 바와 같은 mut-PPO 핵산을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 식물 세포로부터 벤족사지논-유도체 제초제에 대한 저항성이 증가된 식물을 생성하는 단계를 포함하는,
    트랜스제닉 식물을 제조하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 발현 카세트가 전사 개시 조절 영역 및 번역 개시 조절 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. i) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부가 서열 번호 1에 제시된 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하며, 폴리뉴클레오티드가 선별 마커로서 사용되는 제7항에 정의된 바와 같은 mut-PPO 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부가 추가의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 것인 단계;
    ii) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 하나 이상의 벤족사지논-유도체 제초제와 접촉시키는 단계;
    iii) 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부가 억제 제초제에 의해 영향을 받는지 여부를 측정하는 단계; 및
    iv) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 확인 또는 선별하는 단계
    를 포함하는,
    형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 일부를 확인 또는 선별하는 방법.
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