CN103261424A - 对除草剂具有增强的耐受性的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于控制植物栽培场所的非期望植物的方法。该方法包括步骤：在所述场所提供包含至少一个核酸的植物，其中所述核酸包含编码野生型或突变原卟啉原氧化酶（PPO）的核苷酸序列，其中通过向所述场所施用有效量的苯并

Description

对除草剂具有增强的耐受性的植物
发明领域
本发明一般涉及赋予植物对除草剂具有农业水平耐受性的方法。特别地，本发明涉及对“苯并嗪酮衍生物”除草剂具有增强的耐受性的植物。更具体地，本发明涉及通过诱变和杂交育种以及转化而获得对“苯并
Figure BDA00003354044200015
嗪酮衍生物”除草剂增强的耐受性的方法和植物。
发明背景
自20世纪60年代以来，抑制原卟啉IX生物合成中关键酶原卟啉原氧化酶(在下文中称为Protox或PPO；EC:1.3.3.4)的除草剂己用于选择性杂草控制。PPO催化叶绿素和血红素生物合成中最后的共同步骤，即将原卟啉原IX氧化成原卟啉IX(Matringe等，1989.Biochem.1.260:231)。PPO抑制性除草剂包括许多不同结构类别的分子(Duke等，1991.Weed Sci.39:465；Nandihalli等，1992.Pesticide Biochem.Physiol.43:193；Matringe等，1989.FEBS Lett.245:35；Yanase和Andoh，1989.Pesticide Biochem.Physiol.35:70)。这些除草剂化合物包括二苯基醚类(diphenylethers)(例如，乳氟禾草灵(lactofen)，5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸(+-)-2-乙氧基-1-甲基-2-氧代乙基酯；氟锁草醚(acifluorfen)，5-[2-氯-4-(三氟甲基)-苯氧基]-2-硝基苯甲酸；其甲酯；或乙氧氟草醚(oxyfluorfen)，2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟苯))；
Figure BDA00003354044200011
二唑类(oxidiazoles)(例如，草酮(oxidiazon)，3-{2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基}-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-
Figure BDA00003354044200013
二唑啉-2-(3H)-酮)；环状亚胺类(cyclic imides)(例如，S-23142，N-[4-氯-2-氟-5-炔丙氧基苯基]-3,4,5,6-四氢苯邻二甲酰亚胺；氯酞酰亚胺(chlorophthalim)，N-(4-氯苯基)-3,4,5,6.四氢苯邻二甲酰亚胺)；苯基吡唑类(phenyl pyrazoles)(例如，TNPP-乙基，2-{1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基}丙酸乙酯；M&B39279)；吡啶衍生物(例如LS82-556)；以及phenopylate及其O-苯基吡咯烷与哌啶氨基甲酸酯的类似物。这些化合物中的许多竞争性抑制该酶催化的正常反应，看起来起底物类似物的作用。
PPO抑制性除草剂的施用导致叶绿体和线粒体中原卟啉原IX的积累，据认为，所积累的原卟啉原IX泄露到胞液中并在那里被过氧化物酶氧化。当暴露于光下时，原卟啉IX导致胞液中单线态氧的形成和其它活性氧类的形成，这可以引起脂质过氧化作用和膜破裂，从而导致细胞迅速死亡(Lee等，1993.Plant Physiol.102:881)。
不是所有的PPO酶都对抑制植物PPO酶的除草剂敏感。大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)PPO酶(Sasarmen等，1993.Can.J.Microbiol.39:1155；Dailey等，1994.J.Biol.Chem.269:813)对这些除草剂抑制剂具有抗性。单细胞藻类雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)对苯基亚胺(phenylimide)除草剂S-23142具有抗性的突变体已被报道(Kataoka等，1990.J.Pesticide Sci.15:449；Shibata等，1992.于Research in Photosynthesis中，卷III，N.Murata编辑，Kluwer:Netherlands，第567-70页)。这些突变体中的至少一种看起来具有改变的PPO活性，其不仅对用于筛选突变体的除草剂抑制剂具有抗性，而且对其它类别的原卟啉原氧化酶(protox)抑制剂也具有抗性(Oshio等，1993.Z.Naturforsch.48c:339；Sato等，1994.于ACSSymposium on Porphyric Pesticides中，S.Duke编辑，ACS Press:Washington,D.C.)。对抑制剂S-21432具有抗性的突变烟草细胞系也已被报道(Che等，1993.Z.Naturforsch.48c:350)。营养缺陷型大肠杆菌突变体已用于确认所克隆的植物PPOs的除草剂抗性。
现有3种主要策略可用于使植物耐受除草剂，即(1)使用可以将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物的酶(例如，赋予对溴苯腈(bromoxynil)或basta的耐受性的酶(EP242236、EP337899))，将除草剂脱毒；(2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代谢物敏感性较低的功能性酶，例如耐受草甘膦(glyphosate)的酶(EP293356、Padgette S.R.等，J.Biol.Chem.,266,33,1991)；或(3)过表达敏感性酶，使得鉴于此酶的动力学常数，在植物中生产相对于除草剂足够的靶酶量，以致尽管存在其抑制剂，但仍有足够的功能性酶可用。第三种策略用于成功获得对PPO抑制剂具有耐受性的植物已有描述(见例如，US5,767,373或US5,939,602，及其专利族成员)。此外，US2010/0100988和WO2007/024739公开了编码具有酶促活性的氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列对PPO抑制剂除草剂具有抗性，特别是对3-苯基尿嘧啶抑制剂特异的PPO突变体。
迄今为止，现有技术尚未描述过含有至少一个野生型或突变的PPO核酸的苯并
Figure BDA00003354044200032
嗪酮衍生物除草剂耐受性植物。现有技术亦尚未描述过在PPO基因来源的基因组以外的基因组上含有突变的苯并
Figure BDA00003354044200033
嗪酮衍生物除草剂耐受性作物植物。因此，本领域需要鉴定来自其它基因组及物种的苯并
Figure BDA00003354044200034
嗪酮衍生物除草剂耐受基因。本领域亦需要对除草剂(例如苯并嗪酮衍生物除草剂)具有增强的耐受性、以及含有至少一个野生型和/或突变的PPO核酸的作物。亦需要控制作物附近的杂草生长的方法。当向具有作物的区域或向作物施用除草剂时，这些组合物及方法将允许使用喷药技术。
发明概要
通过本发明解决技术问题，本发明涉及在植物栽培场所控制非期望植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在该场所提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含编码野生型原卟啉原氧化酶(PPO)或突变原卟啉原氧化酶(mut-PPO)的核苷酸序列，所述植物对苯并
Figure BDA00003354044200031
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性，
b)向该场所施用有效量的所述除草剂。
此外，本发明涉及通过使用由如下核酸编码的野生型或mut-PPO鉴定苯并
Figure BDA00003354044200041
嗪酮衍生物除草剂的方法，所述核酸包含核苷酸序列SEQ IDNO:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43或45或其变体。
所述方法包括以下步骤：
a)产生包含编码mut-PPO的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-PPO；
b)向a)的转基因细胞或植物及相同品种的对照细胞或植物施用苯并嗪酮衍生物除草剂；
c)在施用所述测试化合物之后，测定转基因细胞或植物及对照细胞或植物的生长或生存力，以及
d)选择使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低的测试化合物。
另一目的涉及鉴别编码对苯并
Figure BDA00003354044200042
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)生成mut-PPO编码核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸并用苯并
Figure BDA00003354044200043
嗪酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物，筛选所得的mut-PPO编码核酸群体，
c)比较由所述mut-PPO编码核酸群体提供的苯并
Figure BDA00003354044200044
嗪酮衍生物除草剂耐受性水平与由对照PPO编码核酸提供的苯并嗪酮衍生物除草剂耐受性水平，
d)选择至少一种mut-PPO编码核酸，所述核酸较之对照PPO编码核酸提供对苯并
Figure BDA00003354044200046
嗪酮衍生物除草剂显著增加的耐受性水平。
在优选的实施方案中，较之由对照PPO编码核酸提供的对苯并嗪酮衍生物除草剂的耐受性，步骤d)中选出的mut-PPO编码核酸提供至少2倍的对苯并嗪酮衍生物除草剂的耐受性。
抗性或耐受性可通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并且比较所述转基因植物与对照植物，加以测定。
另一目的涉及鉴别含有编码对苯并
Figure BDA00003354044200051
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的核酸的植物或藻类之方法，该方法包括：
a)在植物细胞或绿藻的培养物中鉴定有效量的苯并
Figure BDA00003354044200052
嗪酮衍生物除草剂，
b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，
c)使所述经诱变处理的细胞群体与a)中鉴定的有效量的苯并
Figure BDA00003354044200053
嗪酮衍生物除草剂接触，
d)选择在这些测试条件下存活的至少一个细胞，
e)对来自d)中选出的细胞的PPO基因进行PCR扩增及测序并且将这些序列分别与野生型PPO基因序列进行比较。
在优选的实施方案中，诱变剂为甲基磺酸乙酯。
另一目的涉及编码mut-PPO的分离的核酸，该核酸可通过如上定义的方法鉴定。
在另一实施方案中，本发明涉及由野生型或mut-PPO核酸转化的、或己经被突变(以便获得表达，优选地过表达，野生型或mut-PPO核酸的植物)的植物细胞，其中所述核酸在该植物细胞中的表达导致，较之植物细胞的野生型品种，对苯并
Figure BDA00003354044200054
嗪酮衍生物除草剂的增强的抗性或耐受性。
在另一实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的植物细胞的植物，其中核酸在植物中的表达导致，较之野生型品种的植物，该植物对苯并
Figure BDA00003354044200055
嗪酮衍生物除草剂的增强的抗性。
本发明的植物可为转基因或非转基因植物。
优选地，核酸在植物中的表达导致，较之野生型品种的植物，该植物对苯并
Figure BDA00003354044200056
嗪酮衍生物除草剂的增强的抗性。
在另一实施方案中，本发明涉及由包含本发明的植物细胞的转基因植物生产的种子，其中就较之野生型品种的种子增强的对苯并嗪酮衍生物除草剂的抗性而言，该种子是纯种的(true breeding)。
在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞，与野生型品种的植物细胞相比，对苯并
Figure BDA00003354044200061
嗪酮衍生物除草剂具有增强的抗性，所述方法包括用包含野生型或mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物的方法，其包括：(a)用包含野生型或mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞，以及(b)从植物细胞产生对苯并
Figure BDA00003354044200062
嗪酮衍生物除草剂具有增强的抗性的植物。
优选地，表达盒还包含在植物中具有功能的转录起始调控区及翻译起始调控区。
在另一实施方案中，本发明涉及使用本发明的mut-PPO作为选择标记。本发明提供鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括：a)提供经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含编码如下文所述的本发明mut-PPO多肽的分离核酸，其中该多肽用作选择标记，且其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可任选地还包含分离的目的核酸；b)使经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种苯并
Figure BDA00003354044200063
嗪酮衍生物抑制性化合物接触；c)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制剂或抑制性化合物影响；以及d)鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
本发明还涉及含有本文所述的突变的经纯化的mut-PPO蛋白质，所述蛋白质可以用于分子建模研究中以设计对除草剂耐受性的进一步改良。蛋白质纯化方法为熟知的，且可容易地使用市售产品或采用例如于Protein Biotechnology,Walsh和Headon(Wiley,1994)中的专门设计的方法来达成。
附图简述
图1显示糙果苋(Amaranthus tuberculatus)(A.tuberculatus)、糙果苋抗性(A.tuberculatus_R)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)长(A.thaliana_2)、菠菜(Spinacia oleracea)短(S.oleracea_2)、烟草(Nicotianatabacum)短(N.tabacum_2)、大豆(Glycine max)(Glycine_max)、拟南芥短(A.thaliana_1)、烟草长(N.tabacum_1)、雷氏衣藻长(C.reinhardtii_1)、玉蜀黍(Zea mays)(Z.mays)、稻(Oryza sativa)(O.sativa_1)、马铃薯(Solanum tuberosum)(S.tuberosum)、黄瓜(Cucumis sativus)(C.sativus)、菊苣(Cichorium intybus)(C.intybus_1)、菠菜长(S.oleracea_1)、Polytomella属物种Pringsheim198.80(Polytomella)PPO序列的氨基酸序列比对。以浅灰色、灰色和黑色标示保守的区域。
图2显示选择对苯并
Figure BDA00003354044200071
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的雷氏衣藻株。(A)涂布于无选择试剂的固体培养基上的经诱变处理的细胞。(B)涂布于含有1x10-7M苯并
Figure BDA00003354044200072
嗪酮衍生物1.a.35的固体培养基上的经诱变处理的细胞。对苯并
Figure BDA00003354044200073
嗪酮衍生物除草剂具有抗性的细胞形成集落(圈出并编号为33,34,35和36)，而易感细胞不能生长。平板A上集落数量较平板B上的多，表明平板B上的集落对苯并
Figure BDA00003354044200074
嗪酮衍生物1.a.35具有抗性。
图3显示如图2中所示经选择的对苯并
Figure BDA00003354044200075
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的雷氏衣藻株的再生长。(A)在无选择试剂的液体培养基中的野生型细胞。(B)在含有递增的苯并
Figure BDA00003354044200076
嗪酮衍生物1.a.35(1x10-9至5x10-6M)的液体培养基中的野生型细胞。(C)在无选择试剂的液体培养基中的经诱变处理的细胞。(D1,D2,E1,E2)在含有递增的苯并
Figure BDA00003354044200077
嗪酮衍生物1.a.35(1x10-9至5x10-6M)的液体培养基中的经诱变和经选择的株。对苯并
Figure BDA00003354044200078
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的株培养至较暗的颜色，指示其生长。而易感株不生长，保持浅色。含有正在生长的细胞的液体培养基中的较高细胞密度是形成较暗颜色的原因。较低密度的培养物显出颜色较浅或完全透明。
序列表
表1
Figure BDA00003354044200081
Figure BDA00003354044200091
发明详述
冠词“a”和“an”在本文中使用以指1个或1个以上(即,至少一个)该冠词的语法对象。例如，“要素(an element)”意指一或多个要素。
如本文所用，措词“包含”或其变体“包括”或“含有”应理解为意指，包括所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。
本发明涉及在植物栽培场所控制非期望的植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在该场所提供包含至少一个核酸的植物，所述核酸包含编码野生型原卟啉原氧化酶或突变的原卟啉原氧化酶(mut-PPO)的核苷酸序列，所述植物对苯并嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性，
b)向该场所施用有效量的所述除草剂。
术语“控制非期望的植物”应理解为意指，灭杀杂草和/或否则阻滞或抑制杂草的正常生长。杂草在最广泛意义上理解，意指生长在不期望其出现的地方的所有那些植物。本发明之杂草包括例如双子叶及单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、猪殃殃属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛藤菊属(Galinsoga)、黎属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、Emex、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)及蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristylis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、翦股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)及阿披拉草属(Apera)。此外，本发明的杂草可包括例如生长于非期望位置的作物植物。例如，若玉米植物在大豆植物田地中是不希望的，则在主要包含大豆植物的田地中的自生玉米植物可被视为杂草。
术语“植物”以其最广泛意义加以使用，其涉及有机体物质，且意欲涵盖属于植物界成员的真核生物，植物的实例包括但不限于，维管束植物、蔬菜、粮食、花卉、乔木、草本植物、灌木、草类、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌及藻类等，以及用于无性繁殖的植物克隆、分枝及部分(例如插枝、piping、芽、根茎、地下茎、丛(clump)、冠(crown)、球茎、球根、块茎、根茎、组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”进一步涵盖整个植物、植物祖先及后代、以及植物部分，包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、肉茎、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞、及植物的任何其它己知器官、组织和细胞、以及组织和器官，其中每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。术语“植物”亦涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉及小孢子，同样，每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。
尤其适用于本发明方法中的植物包括属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属(Acerspp.)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostis stolonifera)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、固沙草(Ammophilaarenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)[双低油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)])、Cadabafarinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐属(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、龙爪稷(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia unifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或Sojamax)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属(Momordica spp)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musaspp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntiaspp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、(例如稻(Oryzasativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属(Phaseolusspp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salix sp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、白芥属(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、Triticum macha、普通小麦(Triticumsativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizania palustris)、枣属(Ziziphus spp.)、苋(amaranth)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brusselssprouts)、卷心菜(cabbage)、双低油菜(canola)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻(flax)、无头甘蓝(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、稻(rice)、大豆(soybean)、草莓(strawberry)、甜菜(sugar beet)、甘蔗(sugar cane)、向日葵(sunflower)、蕃茄(tomato)、西葫芦(squash)、茶树(tea)及藻类(algae)等等。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例尤其包括大豆、向日葵、双低油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、蕃茄、马铃薯或烟草。更优选地，植物为单子叶植物，例如甘蔗。更优选地，植物为谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高梁或燕麦。
在优选的实施方案中，植物先己由重组制备植物的方法、通过引入及过表达野生型或mut-PPO转基因而产生，下文将更详细地描述。
在另一优选的实施方案中，植物先已由包括原位诱变植物细胞以获得表达mut-PPO的植物细胞的方法产生。
如本文所公开的，本发明核酸可用于增强植物对除草剂的耐受性，其中所述植物在其基因组中包含编码野生型或mut-PPO蛋白质（耐受除草剂）的基因。此基因可为内源基因或转基因，如下文所述。另外，在某些实施方案中，本发明核酸可与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的核酸可与任何其它编码杀农害和/或杀昆虫活性多肽(诸如苏云金芽孢杆菌毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892;5,747,450;5,737,514;5,723,756;5,593,881；及Geiser等(1986)Gene48:109中))的多核苷酸堆叠。产生的组合也可包括目的多核苷酸之任一的多个拷贝。
在特别优选的实施方案中，植物包含至少一种另外的异源核酸，所述异源核酸包含编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列，所述酶选自例如5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦乙酰基转移酶(GAT)、细胞色素P450、膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)、乙酰羟酸合酶(AHAS;EC4.1.3.18，亦称为乙酰乳酸合酶或ALS)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、八氢蕃茄红素去饱和酶(PD)、及麦草畏(dicamba)降解酶，如WO02/068607中所公开，或苯氧乙酸及苯氧丙酸衍生物降解酶，如WO2008141154或WO2005107437中公开。
一般而言，在本文中使用的术语“除草剂”意指灭杀植物、控制或以其它方式不利地改变植物生长的活性成分。除草剂的优选量或浓度为“有效量”或“有效浓度”。“有效量”及“有效浓度”分别意指足以灭杀类似的、野生型的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长的量及浓度，但该量不会灭杀本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞及宿主细胞、或不会同样严重地抑制其生长。典型地，除草剂的有效量为常规用于农业生产系统中灭杀目的杂草的量。此量为一般技术人员所知。当在植物的任何生长阶段或在种植或出苗前直接向植物或植物的场所施用本发明的苯并
Figure BDA00003354044200151
嗪酮衍生物除草剂时，本发明的苯并
Figure BDA00003354044200152
嗪酮衍生物除草剂表现出除草活性。所观测到的效果取决于待控制的植物物种、植物生长阶段、施用参数——稀释及喷雾液滴大小、固体组分的粒子大小、使用时的环境条件、所用的特定化合物、所用的特定助剂及载体、土壤类型等、以及所施用的化学品的量。这些及其它因子可如本领域技术人员所知的加以调整以促进非选择性或选择性除草作用。一般而言，优选在出苗后对相对不成熟的非期望植物施用苯并
Figure BDA00003354044200162
嗪酮衍生物除草剂，以达到对杂草的最大控制。
“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”植物意指，植物对处于通常将灭杀正常或野生型植物或抑制其生长的水平的至少一种除草剂具有耐受性或抗性。“除草剂耐受性mut-PPO蛋白或“除草剂抗性mut-PPO蛋白”意指，当存在至少一种己知干扰PPO活性的除草剂且该除草剂处于己知将抑制野生型PPO蛋白的PPO活性的浓度或水平时，相对于野生型mut-PPO蛋白的PPO活性而言，此mut-PPO蛋白显示较高PPO活性。此外，此除草剂耐受性或除草剂抗性mut-PPO蛋白的PPO活性在本文中可称为“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”PPO活性。
本发明的“苯并嗪酮衍生物除草剂”涵盖下式I的苯并
Figure BDA00003354044200164
嗪酮：
Figure BDA00003354044200161
其中
R1为氢或卤素；
R2为卤素；
R3为氢或卤素；
R4为氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、C1-C6烷氧基或C3-C6环烷基-C1-C6烷基；
R5为氢、NH2、C1-C6烷基或C3-C6炔基；
R6为氢或C1-C6烷基；和
W为O或S；
Z为O或S。
在另一个优选实施方案中，本发明的“苯并
Figure BDA00003354044200172
嗪酮衍生物除草剂”涵盖下式I的苯并
Figure BDA00003354044200173
嗪酮：
A)至少一种式I的苯并
Figure BDA00003354044200174
嗪酮：
Figure BDA00003354044200171
其中
R1为氢或卤素；
R2为卤素；
R3为氢或卤素；
R4为氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、C1-C6烷氧基或C3-C6环烷基-C1-C6烷基；
R5为氢、NH2、C1-C6烷基或C3-C6炔基；
R6为氢或C1-C6烷基；和
X为O或S；
Y为O或S；
以及至少一种选自如下的其它活性化合物：
B)b1)-b15)类除草剂：
b1)脂质生物合成抑制剂；
b2)乙酰乳酸合酶抑制剂(ALS抑制剂)；
b3)光合作用抑制剂；
b4)原卟啉原-IX氧化酶抑制剂，
b5)漂白除草剂；
b6)烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶抑制剂(EPSP抑制剂)；
b7)谷氨酰胺合成酶抑制剂；
b8)7,8-二氢蝶酸合成酶抑制剂(DHP抑制剂)；
b9)有丝分裂抑制剂；
b10)非常长链脂肪酸合成抑制剂(VLCFA抑制剂)；
b11)纤维素生物合成抑制剂；
b12)去偶除草剂(decoupler herbicides)；
b13)植物生长素除草剂；
b14)植物生长素运输抑制剂；和
b15)选自溴丁酰草胺(bromobutide)、氯甲丹(chlorflurenol)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、甲胂钠(DSMA)、香草隆(dymron)、敌草腈(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-M-isopropyl)、麦草伏(flamprop-M-methyl)、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、膦铵素(fosamine)、膦铵素(fosamine-ammonium)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、抑芽丹(maleic hydrazide)、氟草磺(mefluidide)、威百亩(metam)、叠氮甲烷(methyl azide)、溴甲烷(methyl bromide)、苯丙隆(methyl-dymron)、碘甲烷(methyl iodide)、甲胂一钠(MSMA)、油酸(oleicacid)、氯
Figure BDA00003354044200181
嗪草(oxaziclomefone)、壬酸(pelargonic acid)、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)、灭草环(tridiphane)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪醇(CAS499223-49-3)及其盐和酯的其它除草剂；
以及
C)安全剂。
用于本发明的苯并嗪酮衍生物除草剂还可以是除草活性作物保护组合物形式的组合物，其包含除草有效量的如上所定义的包含至少一种式I的苯并嗪酮和至少一种选自除草剂B的其它化合物和安全剂C的活性化合物组合、以及至少一种液体和/或固体载体和/或一种或多种表面活性剂、及需要的话，一种或多种常用于作物保护组合物的其它助剂。
此外，用于本发明的苯并
Figure BDA00003354044200192
嗪酮衍生物除草剂还可以是作物保护组合物形式的组合物，其被配制成单组分组合物，包含含有至少一种式I的苯并
Figure BDA00003354044200193
嗪酮和至少一种选自除草剂B的其它活性化合物和安全剂C的活性化合物组合、以及至少一种固体或液体载体和/或一种或多种表面活性剂、及需要的话一种或多种常用于作物保护组合物的其它助剂。
此外，用于本发明的苯并嗪酮衍生物除草剂还可以是作物保护组合物形式的组合物，其被配制成双组分组合物，包含含有至少一种式I的苯并
Figure BDA00003354044200195
嗪酮、固体或液体载体和/或一种或多种表面活性剂的第一组分、以及包含至少一种选自除草剂B的其它活性化合物和安全剂C、固体或液体载体和/或一种或多种表面活性剂的第二组分，其中这两种组分还可额外包含常用于作物保护组合物的其它助剂。
若本文所述的式I的苯并
Figure BDA00003354044200196
嗪酮能够形成几何异构体，例如E/Z异构
体，则纯异构体及其混合物均可以在本发明组合物中使用。
若本文所述的式I的苯并
Figure BDA00003354044200197
嗪酮具有一个或多个手性中心且因此以对映体或非对映体存在，则纯对映体和非对映体及其混合物均可以在本发明组合物中使用。
在变量R1-R6的定义中提到的有机结构部分如术语卤素是对各基团成员的单独列举的统称。术语卤素在每种情况下均表示氟、氯、溴或碘。所有烃链，即所有烷基，可以是直链或支链的，前缀Cn-Cm在每种情况下表示该基团中的可能碳原子数。
该类含义的实例是：
-C1-C4烷基以及C3-C6环烷基-C1-C4烷基的C1-C4烷基结构部分：例如CH3、C2H5、正丙基、CH(CH3)2、正丁基、CH(CH3)-C2H5、CH2-CH(CH3)2和C(CH3)3；
-C1-C6烷基以及C1-C6烷氧基-C1-C6烷基的C1-C6烷基结构部分：如上所述的C1-C4烷基、以及例如正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基或1-乙基-2-甲基丙基，优选甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1,1-二甲基乙基、正戊基或正己基；
-C1-C4卤代烷基：被氟、氯、溴和/或碘部分或全部取代的如上所述的C1-C4烷基，例如氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯一氟甲基、一氯二氟甲基、溴甲基、碘甲基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、2-碘乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氯-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、五氟乙基、2-氟丙基、3-氟丙基、2,2-二氟丙基、2,3-二氟丙基、2-氯丙基、3-氯丙基、2,3-二氯丙基、2-溴丙基、3-溴丙基、3,3,3-三氟丙基、3,3,3-三氯丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、七氟丙基，如上所述的C1-C3卤代烷基以及例如1-(氟甲基)-2-氟乙基、1-(氯甲基)-2-氯乙基、1-(溴甲基)-2-溴乙基、4-氟丁基、4-氯丁基、4-溴丁基、九氟丁基、1,1,2,2-四氟乙基和1-三氟甲基-1,2,2,2-四氟乙基；
-C1-C6卤代烷基：如上所述的C1-C4卤代烷基、以及例如5-氟戊基、5-氯戊基、5-溴戊基、5-碘戊基、十一氟戊基、6-氟己基、6-氯己基、6-溴己基、6-碘己基和十二氟己基；
-C3-C6环烷基以及C3-C6环烷基-C1-C4烷基的环烷基结构部分：具有3-6个环成员的单环饱和烃，如环丙基、环丁基、环戊基和环己基；
-C3-C6链烯基：例如1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基；
-C3-C6卤代链烯基：被氟、氯、溴和/或碘部分或完全取代的如上所述的C3-C6链烯基，例如2-氯丙-2-烯-1-基、3-氯丙-2-烯-1-基、2,3-二氯丙-2-烯-1-基、3,3-二氯丙-2-烯-1-基、2,3,3-三氯丙-2-烯-1-基、2,3-二氯丁-2-烯-1-基、2-溴丙-2-烯-1-基、3-溴丙-2-烯-1-基、2,3-二溴丙-2-烯-1-基、3,3-二溴丙-2-烯-1-基、2,3,3-三溴丙-2-烯-1-基或2,3-二溴丁-2-烯-1-基；
-C3-C6炔基：例如1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1,1-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、2-甲基-4-戊炔基、3-甲基-1-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-1-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、1,1-二甲基-2-丁炔基、1,1-二甲基-3-丁炔基、1,2-二甲基-3-丁炔基、2,2-二甲基-3-丁炔基、3,3-二甲基-1-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基和1-乙基-1-甲基-2-丙炔基；
-C3-C6卤代炔基：被氟、氯、溴和/或碘部分或完全取代的如上所述的C3-C6炔基，例如1,1-二氟丙-2-炔-1-基、3-氯丙-2-炔-1-基、3-溴丙-2-炔-1-基、3-碘丙-2-炔-1-基、4-氟丁-2-炔-1-基、4-氯丁-2-炔-1-基、1,1-二氟丁-2-炔-1-基、4-碘丁-3-炔-1-基、5-氟戊-3-炔-1-基、5-碘戊-4-炔-1-基、6-氟己-4-炔-1-基或6-碘己-5-炔-1-基；
-C1-C4烷氧基以及羟基羰基-C1-C4烷氧基、C1-C6烷氧羰基-C1-C4烷氧基的C1-C4烷氧基结构部分：例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基和1,1-二甲基乙氧基；
-C1-C6烷氧基以及C1-C6烷氧羰基-C1-C4烷氧基的C1-C6烷氧基结构部分：如上所述的C1-C4烷氧基、以及例如戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲氧基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1,1,2-三甲基丙氧基、1,2,2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基和1-乙基-2-甲基丙氧基。
根据本发明的优选实施方案，还优选式I的苯并嗪酮衍生物，其中各变量相互独立地或相互结合地具有下列含义：
R1为氢；
还优选为卤素，特别优选F或Cl，尤其优选F；
R2为F；
R3为氢或F，优选氢；
也优选为F；
R4为C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基，优选C3炔基或C3卤代炔基，特别优选CH2C≡CH，CH2C≡CCl或CH2C≡CBr；
也优选为C3-C6炔基或C3-C6环烷基-C1-C6烷基，特别优选炔丙基或环丙基甲基；
也优选为C3-C6炔基，优选C3炔基；特别优选CH2C≡CH；
也优选为C3-C6卤代炔基，优选C3卤代炔基，特别优选CH2C≡CCl或CH2C≡CBr；
R5为NH2、C1-C6烷基或C3-C6炔基；优选C1-C6烷基；更优选C1-C4烷基；最优选CH3；
R6为C1-C6烷基；优选C1-C4烷基；最优选CH3；
W为O，
也优选为S；
Z为O，
也优选为S。
特别优选式I.a的苯并
Figure BDA00003354044200233
嗪酮(对应于其中R2为F，R5和R6为CH3，W为O且Z为S的式I)，
Figure BDA00003354044200231
其中变量R1、R3和R4具有如上所定义的含义，尤其是优选含义。
最优选下表A所列的式I.a.1-I.a.48的苯并
Figure BDA00003354044200241
嗪酮衍生物，其中变量R1、R3和R4一起具有在表A的一行中所给的含义(苯并
Figure BDA00003354044200242
嗪酮I.a.1-I.a.54)；并且其中变量R1、R2、R3和R4的定义不仅相互结合地而且在每种情况下单独地对于本发明化合物特别重要：
表A
No. R1 R3 R4
I.a.1. H H H
I.a.2. H H CH3
I.a.3. H H C2H5
I.a.4. H H CH2-C2H5
I.a.5. H H CH(CH3)2
I.a.6. H H CH2-CH2-(CH3)2
I.a.7. H H CH2-CH=CH2
I.a.8. H H CH2C≡CH
I.a.9. H H CH2C≡C-Br
I.a.10. H F H
I.a.11. H F CH3
I.a.12. H F C2H5
I.a.13. H F CH2-C2H5
I.a.14. H F CH(CH3)2
I.a.15. H F CH2-CH2-(CH3)2
I.a.16. H F CH2-CH=CH2
I.a.17. H F CH2C≡CH
I.a.18. H F CH2C≡C-Br
I.a.19. F H H
I.a.20. F H CH3
I.a.21. F H C2H5
I.a.22. F H CH2-C2H5
I.a.23. F H CH(CH3)2
I.a.24. F H CH2-CH2-(CH3)2
I.a.25. F H CH2-CH=CH2
I.a.26. F H CH2C≡CH
I.a.27. F H CH2C≡C-Br
I.a.28. F F H
I.a.29. F F CH3
I.a.30. F F C2H5
I.a.31. F F CH2-C2H5
I.a.32. F F CH(CH3)2
I.a.33. F F CH2-CH2-(CH3)2
I.a.34. F F CH2-CH=CH2
I.a.35. F F CH2C≡CH
I.a.36. F F CH2C≡C-Br
I.a.37. Cl H H
I.a.38. Cl H CH3
I.a.39. Cl H C2H5
I.a.40. Cl H CH2-C2H5
I.a.41. Cl H CH(CH3)2
I.a.42. Cl H CH2-CH2-(CH3)2
I.a.43. Cl H CH2-CH=CH2
I.a.44. Cl H CH2C≡CH
I.a.45. Cl H CH2C≡C-Br
I.a.46. Cl F H
I.a.47. Cl F CH3
I.a.48. Cl F C2H5
I.a.49. Cl F CH2-C2H5
I.a.50. Cl F CH(CH3)2
I.a.51. Cl F CH2-CH2-(CH3)2
I.a.52. Cl F CH2-CH=CH2
I.a.53. Cl F CH2C≡CH
I.a.54. Cl F CH2C≡C-Br
尤其优选作为组分构成本发明组合物一部分的式I苯并嗪酮是如上所定义的式I.a.35的苯并
Figure BDA00003354044200252
嗪酮。
根据本发明的特别优选实施方案，用于本发明方法的组合物包含式I.a.35的苯并
Figure BDA00003354044200253
嗪酮作为组分A。
Figure BDA00003354044200261
上述苯并
Figure BDA00003354044200262
嗪酮衍生物和组合物详细公开于欧洲专利申请09163242.2中，尤其将第1至7页中涉及苯并嗪酮衍生物及其可能的取代物的公开就其全部内容通过参考引用并入本文。
本发明的苯并
Figure BDA00003354044200264
嗪酮衍生物常常最好连同一种或多种其它除草剂一起施用，以获得对较广泛多种的非期望植物的控制。当连同其它靶向除草剂一起使用时，本发明化合物可与该其它除草剂(一种或多种)配制在一起、与该其它除草剂(一种或多种)桶混、或与该其它除草剂(一种或多种)相继地施用。
本发明的除草化合物可与另外的除草剂联合使用，其中作物植物天然耐受所述另外的除草剂、或通过表达如上提及的一种或多种另外的转基因而对所述另外的除草剂具有抗性。一些可与本发明化合物联合使用的除草剂包括磺酰胺类，例如唑草磺胺(metosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、唑嘧磺胺盐(cloransulam-methyl)、唑嘧磺胺(diclosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)及双氟磺草胺(florasulam)；磺酰脲类(sulfonylureas)，例如氯嘧黄隆(chlorimuron)、苯黄隆(tribenuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、烟嘧黄隆(nicosulfuron)、绿黄隆(chlorsulfuron)、磺氨黄隆(amidosulfuron)、醚苯黄隆(triasulfuron)、氟丙黄隆(prosulfuron)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)及甲黄隆(metsulfuron)；咪唑啉酮类(imidazolinones)，例如灭草喹(imazaquin)、甲基咪草烟(imazapic)、咪草烟(imazethapyr)、灭草烟(imzapyr)、咪草酯(imazamethabenz)及咪草啶酸(imazamox)；苯氧基链烷酸类，例如2,4-D、MCPA、2,4-滴丙酸(dichlorprop)及2甲4氯丙酸(mecoprop)；吡啶基氧基乙酸类，例如绿草定(triclopyr)及氟草烟(fluroxypyr)；羧酸类(carboxylic acids)，例如二氯皮考啉酸(clopyralid)、毒莠定(picloram)、氨草啶(aminopyralid)及麦草畏(dicamba)；二硝基苯胺类(dinitroanilines)，例如氟乐灵(trifluralin)、氟草胺(benefin)、氟草胺(benfluralin)及胺硝草(pendimethalin)；乙酰氯苯胺类(chloroacetanilides)，例如甲草胺(alachlor)、乙草胺(acetochlor)及异丙甲草胺(metolachlor)；缩氨基脲类(semicarbazones)(生长素转运抑制剂)，例如氯甲丹(chlorflurenol)及二氟吡隆(diflufenzopyr)；芳氧基苯氧丙酸酯类，例如吡氟禾草灵(fluazifop)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、氯甲草(diclofop)、炔草酯(clodinafop)及
Figure BDA00003354044200271
唑禾草灵(fenoxaprop)；以及其它常见除草剂，包括草甘膦(glyphosate)、草铵膦(glufosinate)、氟锁草醚(acifluorfen)、噻草平(bentazon)、异
Figure BDA00003354044200272
草酮(clomazone)、氟烯草酸(fumiclorac)、伏草隆(fluometuron)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、异丙隆(isoproturon)、西玛津(simazine)、达草灭(norflurazon)、对草快阳离子(paraquat)、敌草隆(diuron)、吡氟草胺(diflufenican)、氟吡酰草胺(picolinafen)、吲哚酮草酯(cinidon)、稀禾定(sethoxydim)、肟草酮(tralkoxydim)、喹草酸(quinmerac)、异草胺(isoxaben)、溴苯腈(bromoxynil)、赛克津(metribuzin)及甲基磺草酮(mesotrione)。
例如用于实施本发明的苯并嗪酮衍生物除草剂可与草甘膦及草铵膦联合用于草甘膦耐受性或草铵膦耐受性作物。
除非已包括在以上公开内容中，否则用于实施本发明的苯并
Figure BDA00003354044200275
嗪酮衍生物除草剂还可以与以下化合物联合使用：
b1)选自如下的脂质生物合成抑制剂：ACC除草剂类，如枯杀达(alloxydim)、枯杀达(alloxydim-sodium)、丁氧环酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、炔草酯(clodinafop)、炔草酯(clodinafop-propargyl)、噻草酮(cycloxydim)、氰氟草酯(cyhalofop)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、氯甲草(diclofop)、禾草灵(diclofop-methyl)、
Figure BDA00003354044200281
唑禾草灵(fenoxaprop)、
Figure BDA00003354044200282
唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)、高
Figure BDA00003354044200283
唑禾草灵(fenoxaprop-P)、高
Figure BDA00003354044200284
唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P-butyl)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、吡氟氯禾灵(haloxyfop-methyl)、精吡氟氯禾灵(haloxyfop-P)、精吡氟氯禾灵(haloxyfop-P-methyl)、
Figure BDA00003354044200285
唑酰草胺(metamifop)、唑啉草酯(pinoxaden)、环苯草酮(profoxydim)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop)、喹禾灵(quizalofop-ethyl)、喹禾灵(四氢糠基酯)(quizalofop-tefuryl)、精喹禾灵(quizalofop-P)、精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl)、精喹禾灵(四氢糠基酯)(quizalofop-P-tefuryl)、稀禾定(sethoxydim)、醌肟草(tepraloxydim)和肟草酮(tralkoxydim)，以及非ACC除草剂类，如呋草黄(benfuresate)、苏达灭(butylate)、草灭特(cycloate)、茅草枯(dalapon)、哌草丹(dimepiperate)、扑草灭(EPTC)、禾草畏(esprocarb)、乙呋草黄(ethofumesate)、四氟丙酸(flupropanate)、草达灭(molinate)、坪草丹(orbencarb)、克草猛(pebulate)、苄草丹(prosulfocarb)、TCA、杀草丹(thiobencarb)、丁草威(tiocarbazil)、野麦畏(triallate)和灭草猛(vernolate)；
b2)选自如下的ALS抑制剂：磺酰脲类，如磺氨黄隆(amidosulfuron)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron-methyl)、氯嘧黄隆(chlorimuron)、氯嘧黄隆(chlorimuron-ethyl)、绿黄隆(chlorsulfuron)、醚黄隆(cinosulfuron)、环丙黄隆(cyclosulfamuron)、胺苯黄隆(ethametsulfuron)、胺苯黄隆(ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(flazasulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟定黄隆(flupyrsulfuron)、氟定黄隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、甲酰氨磺隆(foramsulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron)、吡氯黄隆(halosulfuron-methyl)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘甲黄隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、甲基二磺隆(mesosulfuron)、metazosulfuron、甲黄隆(metsulfuron)、甲黄隆(metsulfuron-methyl)、烟嘧黄隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环丙氧黄隆(oxasulfuron)、氟嘧黄隆(primisulfuron)、氟嘧黄隆(primisulfuron-methyl)、propyrisulfuron、氟丙黄隆(prosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、嘧黄隆(sulfometuron-methyl)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron-methyl)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron)、苯黄隆(tribenuron-methyl)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)，咪唑啉酮类如咪草酯(imazamethabenz)、咪草酯(imazamethabenz-methyl)、咪草啶酸(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)和咪草烟(imazethapyr)，三唑并嘧啶类除草剂和磺酰苯胺类如唑嘧磺胺酸(cloransulam)、唑嘧磺胺盐(cloransulam-methyl)、唑嘧磺胺(diclosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑草磺胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)、pyrimisulfan和啶磺草胺(pyroxsulam)，嘧啶基苯甲酸酯类如双嘧苯甲酸(bispyribac)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、嘧苯草肟(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalid)、肟啶草(pyriminobac)、肟啶草(pyriminobac-methyl)、嘧硫苯甲酸(pyrithiobac)、嘧硫苯甲酸钠(pyrithiobac-sodium)、4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯基]甲基]氨基]苯甲酸1-甲基乙基酯(CAS420138-41-6)、4-[[[2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯基]甲基]氨基]苯甲酸丙基酯(CAS420138-40-5)、N-(4-溴苯基)-2-[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基)氧基]苯甲胺(CAS420138-01-8)以及磺酰氨基羰基三唑啉酮类除草剂如氟酮磺隆(flucarbazone)、氟酮磺隆钠(flucarbazone-sodium)、丙苯磺隆(propoxycarbazon)、丙苯磺隆钠(propoxycarbazon-sodium)、thiencarbazone和thiencarbazone-methyl。其中本发明的优选实施方案涉及包含至少一种咪唑啉酮类除草剂的组合物；
b3)选自如下的光合作用抑制剂：胺唑草酮(amicarbazone)，光合系统II抑制剂，例如三嗪类除草剂，包括氯代三嗪类、三嗪酮类、三嗪二酮类、甲硫基三嗪类和哒嗪酮类除草剂，如莠灭净(ametryn)、莠去津(atrazine)、杀草敏(chloridazone)、草净津(cyanazine)、敌草净(desmetryn)、戊草津(dimethametryn)、六嗪同(hexazinone)、赛克津(metribuzin)、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、扑灭津(propazin)、西玛津(simazin)、西草净(simetryn)、甲氧去草净(terbumeton)、特丁津(terbuthylazin)、去草净(terbutryn)和草达津(trietazin)；芳基脲类如氯溴隆(chlorobromuron)、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、丁隆(dimefuron)、敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、异丙隆(isoproturon)、异
Figure BDA00003354044200302
隆(isouron)、利谷隆(linuron)、苯嗪草(metamitron)、噻唑隆(methabenzthiazuron)、色满隆(metobenzuron)、甲氧隆(metoxuron)、绿谷隆(monolinuron)、草不隆(neburon)环草隆(siduron)、丁唑隆(tebuthiuron)和赛二唑素(thidiazuron)，苯基氨基甲酸酯类如异苯敌草(desmedipham)、卡草灵(karbutilat)、苯敌草(phenmedipham)、乙苯敌草(phenmedipham-ethyl)，腈类除草剂如杀草全(bromofenoxim)、溴苯腈(bromoxynil)及其盐和酯、碘苯腈(ioxynil)及其盐和酯，尿嘧啶类如除草定(bromacil)、环草定(lenacil)和特草定(terbacil)，以及噻草平(bentazon)和噻草平(bentazon-sodium)，达草止(pyridatre)、pyridafol、蔬草灭(pentanochlor)和敌稗(propanil)，以及光合系统I抑制剂如敌草快阳离子(diquat)、敌草快(diquat-dibromide)、对草快阳离子(paraquat)、对草快(paraquat-dichloride)和对草快(paraquat-dimetilsulfate)。其中，本发明的优选实施方案涉及包含至少一种芳基脲类除草剂的组合物。其中，本发明的同样优选实施方案涉及包含至少一种三嗪类除草剂的组合物。其中，本发明的同样优选实施方案涉及包含至少一种腈类除草剂的除草剂。
b4)选自如下的原卟啉原-IX氧化酶抑制剂：氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚(acifluorfen-sodium)、唑啶炔草(azafenidin)、bencarbazone、双苯嘧草酮(benzfendizone)、治草醚(bifenox)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟酮唑草(carfentrazone)、氟酮唑草(carfentrazone-ethyl)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸(flumiclorac)、酰亚胺苯氧乙酸戊酯(flumiclorac-pentyl)、氟
Figure BDA00003354044200311
嗪酮(flumioxazin)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、达草氟(fluthiacet)、达草氟(fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、炔丙唑草(oxadiargyl)、草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、戊
Figure BDA00003354044200314
唑草(pentoxazone)、氟唑草胺(profluazol)、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草酯(pyraflufen)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、嘧啶肟草醚(saflufenacil)、磺胺草唑(sulfentrazone)、噻二唑胺(thidiazimin)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS353292-31-6；S-3100)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS452098-92-9)、N-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS452099-05-7)、N-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(CAS452100-03-7)和3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]
Figure BDA00003354044200315
嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷(triazinan)-2,4-二酮；
b5)选自如下的漂白除草剂：PDS抑制剂：氟丁酰草胺(beflubutamid)、吡氟草胺(diflufenican)、氟草同(fluridone)、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮(flurtamone)、达草灭(norflurazon)、氟吡酰草胺(picolinafen)和4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(CAS180608-33-7)，HPPD抑制剂：苯并双环酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、异氟草(isoxaflutole)、甲基磺草酮(mesotrione)、pyrasulfotole、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、磺草酮(sulcotrione)、tefuryltrione、tembotrione、topramezone和bicyclopyrone，漂白剂，未知目标：苯草醚(aclonifen)、杀草强(amitrole)、异草酮(clomazone)和flumeturon；
b6)选自如下的EPSP合酶抑制剂：草甘膦、草甘膦异丙胺盐(glyphosate-isopropylammonium)和草硫膦(glyphosate-trimesium)(sulfosate)；
b7)选自如下的谷氨酰胺合酶抑制剂：双丙氨酰膦(bilanaphos(bialaphos))、双丙氨酰膦(bilanaphos-sodium)、草铵膦、草铵膦(glufosinate-P)和草铵膦(glufosinate-ammonium)；
b8)选自如下的DHP合酶抑制剂：黄草灵(asulam)；
b9)选自如下的有丝分裂抑制剂：K1组的化合物：二硝基苯胺类如氟草胺(benfluralin)、地乐胺(butralin)、敌乐胺(dinitramine)、丁氟消草(ethalfluralin)、氟消草(fluchloralin)、黄草消(oryzalin)、胺硝草(pendimethalin)、氨基丙氟灵(prodiamine)和氟乐灵(trifluralin)，氨基磷酸酯类如胺草磷(amiprophos)、甲基胺草磷(amiprophos-methyl)和草胺磷(butamiphos)，苯甲酸类除草剂如敌草索(chlorthal)、敌草索(chlorthal-dimethyl)，吡啶类如氟硫草定(dithiopyr)和噻氟啶草(thiazopyr)，苯甲酰胺类如拿草特(propyzamide)和丙戊草胺(tebutam)；K2组的化合物：氯苯胺灵(chlorpropham)、苯胺灵(propham)和长杀草(carbetamide)；其中优选K1组化合物，尤其优选二硝基苯胺类；
b10)选自如下的VLCFA抑制剂：氯乙酰胺类如乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、克草胺(dimethachlor)、噻吩草胺(dimethanamid)、精噻吩草胺(dimethenamid-P)、吡草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(metolachlor-S)、烯草胺(pethoxamid)、丙草胺(pretilachlor)、扑草胺(propachlor)、异丙草胺(propisochlor)和噻醚草胺(thenylchlor)，羟基乙酰苯胺类(oxyacetanilide)如氟噻草胺(flufenacet)和苯噻草胺(mefenacet)，乙酰苯胺类如草乃敌(diphenamid)、萘丙胺(naproanilide)和草萘胺(napropamide)，四唑啉酮类如四唑酰草胺(fentrazamide)以及其它除草剂如莎稗磷(anilofos)、唑草胺(cafenstrole)、fenoxasulfone、ipfencarbazone、哌草磷(piperophos)、派罗克杀草砜(pyroxasulfone)；和式II的异
Figure BDA00003354044200332
唑啉化合物：
Figure BDA00003354044200331
其中R7、R8、R9、R10、W、Z和n具有下列含义：
R7、R8、R9、R10相互独立地为氢、卤素或C1-C4烷基；
X为氧或NH；
Y为苯基或除了碳环成员外还含有1、2或3个选自氧、氮和硫的相同或不同杂原子作为环成员的单环5、6、7、8、9或10元杂环，其中苯基和杂环基未被取代或带有1、2或3个选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基和C1-C4卤代烷氧基的取代基Ryy；
优选苯基或除了碳环成员外还含有1、2或3个氮原子作为环成员的5或6元芳族杂环基(杂芳基)，其中苯基和杂芳基未被取代或带有1、2或3个取代基Ryy；以及
n为0或1；
在式II的异
Figure BDA00003354044200333
唑啉化合物中，优选如下式II的异
Figure BDA00003354044200334
唑啉化合物，其中
R7、R8、R9、R10相互独立地为H、F、Cl或甲基；
X为氧；
n为0或1；和
Y为苯基、吡唑基或1,2,3-三唑基，其中后提到的三个基团未被取代或带有1、2或3个取代基Ryy，尤其是下列基团之一：
Figure BDA00003354044200341
其中
R11为卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R12为C1-C4烷基；
R13为卤素、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基；
R14为卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4卤代烷氧基；
m为0、1、2或3；和
#表示与基团CR13R14的连接点；
在式II的异
Figure BDA00003354044200343
唑啉化合物中，尤其优选如下式II的异
Figure BDA00003354044200344
唑啉化合物，其中
R7为氢；
R8为氟；
R9为氢或氟；
R10为氢或氟；
X为氧；
Y为式Y1、Y2、Y3或Y4的基团之一：
Figure BDA00003354044200342
其中#表示与基团CR9R10的连接点；
n为0或1，尤其是1；以及
其中尤其优选式II.1、II.2、II.3、II.4、II.5、II.6、II.7、II.8和II.9的异
Figure BDA00003354044200353
唑啉化合物：
Figure BDA00003354044200351
式II的异
Figure BDA00003354044200352
唑啉化合物在现有技术中是已知的，例如由WO2006/024820，WO 2006/037945，WO 2007/071900和WO 2007/096576已知；
在VLCFA抑制剂中，优选氯代乙酰胺类和羟基乙酰胺类，尤其是派罗克杀草砜(pyroxasulfone)；
b11)选自如下的纤维素生物合成抑制剂：草克乐(chlorthiamid)、敌草腈(dichlobenil)、胺草唑(flupoxam)、异
Figure BDA00003354044200362
草胺(isoxaben)、1-环己基-5-五氟苯氧基-14-[1,2,4,6]硫杂三嗪-3-基胺和式III的哌嗪化合物：
Figure BDA00003354044200361
其中
A为苯基或吡啶基，其中Ra连接在A与碳原子的连接点的邻位；
Ra为CN、NO2、C1-C4烷基、D-C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、O-D-C3-C6环烷基、S(O)qRy、C2-C6链烯基、D-C3-C6环烯基、C3-C6链烯氧基、C2-C6炔基、C3-C6炔氧基、NRARB、三-C1-C4烷基甲硅烷基、D-C(=O)-Ra1、D-P(=O)(Ra1)2、苯基、萘基、经由碳或氮连接的3-7元单环或9或10元双环饱和、不饱和或芳族杂环（其含有1、2、3或4个选自O、N和S的杂原子且可以被基团Raa和/或Ra1，以及若Ra与碳原子连接，则额外地卤素部分地或完全地取代）；
Ry为C1-C6烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、NRARB或C1-C4卤代烷基以及q为0、1或2；
RA、RB相互独立地为氢、C1-C6烷基、C3-C6链烯基和C3-C6炔基；RA、RB还可以与它们所连接的氮原子一起形成5或6元饱和、部分或完全不饱和环（除了碳原子外，还可以含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子），该环可以被1-3个基团Raa取代；
D为共价键、C1-C4亚烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；
Ra1为氢、OH、C1-C8烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、C2-C8链烯基、C5-C6环烯基、C2-C8炔基、C1-C6烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C3-C8链烯氧基、C3-C8炔氧基、NRARB、C1-C6烷氧氨基、C1-C6烷基磺酰氨基、C1-C6烷基氨基磺酰氨基、[二-(C1-C6)烷基氨基]磺酰氨基、C3-C6链烯基氨基、C3-C6炔基氨基、N-(C2-C6链烯基)-N-(C1-C6烷基)氨基、N-(C2-C6炔基)-N-(C1-C6烷基)氨基、N-(C1-C6烷氧基)-N-(C1-C6烷基)氨基、N-(C2-C6链烯基)-N-(C1-C6烷氧基)氨基、N-(C2-C6炔基)-N-(C1-C6烷氧基)氨基、C1-C6烷基磺酰基、三-C1-C4烷基甲硅烷基、苯基、苯氧基、苯基氨基或含有1、2、3或4个选自O、N和S的杂原子的5或6元单环或9或10元双环杂环，其中该环状基团未被取代或被1、2、3或4个基团Raa取代；
Raa为卤素、OH、CN、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、S(O)qRy、D-C(=O)-Ra1和三-C1-C4烷基甲硅烷基；
Rb相互独立地为氢、CN、NO2、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、苄基或S(O)qRy，
Rb与基团Ra或连接于相邻原子的Rb一起还可以形成除了碳原子外还可以含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子的5或6元饱和或部分或完全不饱和环，该环可以部分或完全被Raa取代；
p为0、1、2或3；
R15为氢、OH、CN、C1-C12烷基、C3-C12链烯基、C3-C12炔基、C1-C4烷氧基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、NRARB、S(O)nRy、S(O)nNRARB、C(=O)R25、CONRARB、苯基或含有1、2、3或4个选自O、N和S的杂原子的5或6元单环或9或10元双环芳族杂环，其中环状基团经由D1连接、且未被取代或被1、2、3或4个基团Raa以及下列部分或完全被Raa取代的基团取代：C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、C1-C4烷氧基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、NRARB、S(O)nRy、S(O)nNRARB、C(=O)R25、CONRARB；
优选为氢、OH、CN、C1-C12烷基、C3-C12链烯基、C3-C12炔基、C1-C4烷氧基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、NRARB、S(O)nRy、S(O)nNRARB、C(=O)R25、CONRARB、苯基或含有1、2、3或4个选自O、N和S的杂原子的5或6元单环或9或10元双环芳族杂环，其中环状基团经由D1连接、且未被取代或被1、2、3或4个基团Raa以及下列部分或完全被Raa取代的基团取代：C1-C4烷基、C3-C4链烯基和C3-C4炔基；
R25为氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基；
D1为羰基或基团D；
其中在基团R15、Ra及其子取代基中，碳链和/或环状基团可以带有1、2、3或4个取代基Raa和/或Ra1；
R16为C1-C4烷基、C3-C4链烯基或C3-C4炔基；
R17为OH、NH2、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C4羟基烷基、C1-C4氰基烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基或C(=O)R25；
R18为氢、卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基，或者R18和R19一起为共价键；
R19、R20、R21、R22相互独立地为氢、卤素、OH、CN、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C3-C6环烷基、C3-C6环烯基和C3-C6环炔基；
R23、R24相互独立地为氢、卤素、OH、卤代烷基、NRARB、NRAC(O)R26、CN、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、O-C(O)R26、苯氧基或苄氧基，其中在基团R23和R24中碳链和/或环状基团可以带有1、2、3或4个取代基Raa；
R26为C1-C4烷基或NRARB；
在式III哌嗪化合物中，优选如下式III的哌嗪化合物，其中
A为苯基或吡啶基，其中Ra连接在A与碳原子的连接点的邻位；
Ra为CN、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或D-C(=O)-Ra1；
Ry为C1-C6烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、NRARB或C1-C4卤代烷基以及q为0、1或2；
RA、RB相互独立地为氢、C1-C6烷基、C3-C6链烯基和C3-C6炔基；RA、RB还可以与它们所连接的氮原子一起形成除了碳原子外还可以含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子的5或6元饱和、部分或完全不饱和环，该环可以被1-3个基团Raa取代；
D为共价键或C1-C4亚烷基；
Ra1为氢、OH、C1-C8烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基；
Raa为卤素、OH、CN、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、S(O)qRy、D-C(=O)-Ra1和三-C1-C4烷基甲硅烷基；
Rb相互独立地为CN、NO2、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、苄基或S(O)qRy，
Rb与基团Ra或连接于相邻原子的Rb一起还可以形成除了碳原子外还可以含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子的5或6元饱和或部分或完全不饱和环，该环可以部分或完全被Raa取代；
p为0或1；
R15为氢、C1-C12烷基、C3-C12链烯基、C3-C12炔基、C1-C4烷氧基或C(=O)R25，其可以部分或完全被Raa基团取代；
优选为氢、C1-C12烷基、C3-C12链烯基、C3-C12炔基、C1-C4烷氧基或C(=O)R25；
R25为氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基；
其中在基团R15、Ra及其子取代基中，碳链和/或环状基团可以带有1、2、3或4个取代基Raa和/或Ra1；
R16为C1-C4烷基；
R17为OH、NH2、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基或C(=O)R25；
R18为氢，或者R18和R19一起为共价键；
R19、R20、R21、R22相互独立地为氢；
R23、R24相互独立地为氢、卤素或OH；
b12)选自如下的去偶剂除草剂：地乐酚(dinoseb)、地乐消酚(dinoterb)以及二硝甲酚(DNOC)及其盐；
b13)选自如下的植物生长素除草剂：2,4-D及其盐和酯、2,4-DB及其盐和酯、氨草啶(aminopyralid)及其盐如氨草啶铵盐(aminopyralid-tris(2-hydroxypropyl)ammonium)及其酯、草除灵(benazolin)、草除灵(benazolin-ethyl)、草灭平(chloramben)及其盐和酯、稗草胺(clomeprop)、二氯皮考啉酸(clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(dicamba)及其盐和酯、2,4-滴丙酸(dichlorprop)及其盐和酯、高2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)及其盐和酯、氟草烟(fluroxypyr)、氟草烟(fluroxypyr-butometyl)、氟氯胺啶(fluroxypyr-meptyl)、MCPA及其盐和酯、2甲4氯乙硫酯(MCPA-thioethyl)、MCPB及其盐和酯、2甲4氯丙酸(mecoprop)及其盐和酯、高2甲4氯丙酸(mecoprop-P)及其盐和酯、毒莠定(picloram)及其盐和酯、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹草酸(quinmerac)、TBA(2,3,6)及其盐和酯、绿草定(triclopyr)及其盐和酯以及aminocyclopyrachlor及其盐和酯；
b14)选自如下的植物生长素转运抑制剂：二氟吡隆(diflufenzopyr)、二氟吡隆(diflufenzopyr-sodium)、抑草生(naptalam)和抑草生(naptalam-sodium)；
b15)选自如下的其它除草剂：溴丁酰草胺(bromobutide)、氯甲丹(chlorflurenol)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、甲胂钠(DSMA)、香草隆(dymron)、敌草腈(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-M-isopropyl)、麦草伏(flamprop-M-methyl)、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、膦铵素(fosamine)、膦铵素(fosamine-ammonium)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、抑芽丹(maleic hydrazide)、氟草磺(mefluidide)、威百亩(metam)、叠氮甲烷(methyl azide)、溴甲烷(methylbromide)、苯丙隆(methyl-dymron)、碘甲烷(methyl iodide)、甲胂一钠(MSMA)、油酸(oleic acid)、氯
Figure BDA00003354044200411
嗪草(oxaziclomefone)、壬酸(pelargonicacid)、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)、灭草环(tridiphane)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪醇(CAS499223-49-3)及其盐和酯。
此外，可能有用的是与安全剂组合施用式I的苯并
Figure BDA00003354044200414
嗪酮。安全剂是防止或降低对有用植物的损害但不对式I的苯并嗪酮在不希望的植物上的除草作用具有显著影响的化合物。它们可以在播种之前施用(例如在种子处理时、在枝或秧苗上)或在有用植物的出苗前或出苗后施用。
此外，安全剂C、苯并
Figure BDA00003354044200413
嗪酮I和/或除草剂B可以同时或依次施用。
合适的安全剂例如是(喹啉-8-氧基)乙酸类、1-苯基-5-卤代烷基-1H-1,2,4-三唑-3-羧酸、1-苯基-4,5-二氢-5-烷基-1H-吡唑-3,5-二羧酸、4,5-二氢-5,5-二芳基-3-异
Figure BDA00003354044200421
唑羧酸、二氯乙酰胺类、α-肟基苯基乙腈、苯乙酮肟类、4,6-二卤代-2-苯基嘧啶类、N-[[4-(氨基羰基)苯基]磺酰基]-2-苯甲酰胺类、1,8-萘二甲酸酐、2-卤代-4-卤代烷基-5-噻唑羧酸、硫代磷酸酯类和N-烷基-O-苯基氨基甲酸酯类及其可农用盐和可农用衍生物如酰胺、酯和硫酯，条件是它们具有酸基。
优选安全剂C的实例是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、抑害腈(cyometrinil)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、dicyclonon、dietholate、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草安(flurazole)、肟草安(fluxofenim)、解草呋(furilazole)、双苯
Figure BDA00003354044200425
唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、mephenate、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)、解草腈(oxabetrinil)、4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-
Figure BDA00003354044200422
唑烷(R-29148，CAS52836-31-4)，以及N-(2-甲氧基苯甲酰基)-4-[(甲基氨基羰基)氨基]苯磺酰胺(CAS129531-12-0)。
尤其优选的安全剂C是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草安(flurazole)、肟草安(fluxofenim)、解草呋(furilazole)、双苯
Figure BDA00003354044200423
唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)、解草腈(oxabetrinil)、4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-
Figure BDA00003354044200424
唑烷(R-29148，CAS52836-31-4)，以及N-(2-甲氧基苯甲酰基)-4-[(甲基氨基羰基)氨基]苯磺酰胺(CAS129531-12-0)。
特别优选的安全剂C是解草酮(benoxacor)、喹氧乙酸(cloquintocet)、cyprosulfamide、抑害胺(dichlormid)、解草唑(fenchlorazole)、解草啶(fenclorim)、解草呋(furilazole)、双苯
Figure BDA00003354044200431
唑酸(isoxadifen)、吡咯二酸(mefenpyr)、4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-
Figure BDA00003354044200432
唑烷(R-29148，CAS52836-31-4)，以及N-(2-甲氧基苯甲酰基)-4-[(甲基氨基羰基)氨基]苯磺酰胺(CAS129531-12-0)。
作为组分C构成本发明组合物的组分的特别优选的安全剂C是如上定义的安全剂C；特别是以下表C中所列的安全剂C.1-C.13：
表C
Figure BDA00003354044200433
b1)-b15)组的活性化合物B和活性化合物C是已知的除草剂和安全剂，例如参见The Compendium of Pesticide Common Names(http://www.alanwood.net/pesticides/)；Farm Chemicals Handbook2000，第86卷，Meister Publishing Company，2000；B. Hock，C.Fedtke，R.R.Schmidt，Herbizide[除草剂]，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1995；W.H.Ahrens，Herbicide Handbook，第7版，WeedScience Society of America，1994以及K.K.Hatzios，HerbicideHandbook，第7版增补，Weed Science Society of America，1998。2,2,5-三甲基-3-二氯乙酰基-1,3-
Figure BDA00003354044200442
唑烷[CAS号52836-31-4]也称为R-29148。4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷[CAS号71526-07-3]也称为AD-67和MON4660。其它除草活性化合物由WO96/26202，WO97/41116，WO97/41117，WO97/41118和WO01/83459以及
Figure BDA00003354044200441
等(编辑)“Modern Crop Protection Compounds”，第1卷，Wiley VCH，2007及其中所引用的文献已知。
通常优选组合使用本发明化合物和对所处理的作物具有选择性且补充本发明化合物在所用施用量下所控制的杂草谱的除草剂。另外通常优选以组合制剂或桶混剂(tank mix)形式同时施用本发明化合物及其它互补除草剂。
术语“mut-PPO核酸”指具有从野生型PPO核酸突变而来的序列的PPO核酸，其赋予表达其的植物增加的“苯并
Figure BDA00003354044200443
嗪酮衍生物除草剂”耐受性。此外，术语“突变的原卟啉原氧化酶(mut-PPO)”指，替换野生型一级序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46或其变体、衍生物、同源物、直向同源物或旁系同源物中的氨基酸替换为另外的氨基酸。表述“被突变的氨基酸”将在下文中用于表示被另一氨基酸替换的氨基酸，从而指示蛋白质一级序列中的突变位点。
在优选的实施方案中，PPO核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、25、37或39或其变体或衍生物的序列。
此外，本领域技术人员将理解的是，PPO核苷酸序列涵盖SEQ IDNO:1、25、37或39的同源物、旁系同源物及直向同源物，如下文所定义。
就序列(例如多肽或核酸序列，诸如本发明的转录调控核苷酸序列)而言，术语“变体”旨在表示基本上相似的序列。对于包含开放阅读框的核苷酸序列，变体包括由于遗传密码简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。诸如这些变体的天然存在的等位基因变体可使用熟知分子生物学技术，例如用聚合酶链反应(PCR)及杂交技术来鉴别。变体核苷酸序列亦包括源自合成的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变所生成的核苷酸序列，针对开放阅读框，编码天然蛋白质的序列、以及编码相对于天然蛋白质具有氨基酸替换的多肽的核苷酸序列。一般而言，本发明的核苷酸序列变体将与核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45具有至少30、40、50、60至70%，例如优选地71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，一般而言至少80%，例如81%-84%、至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%至98%及99%的核苷酸“序列同一性”。“变体”多肽意指通过在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或多个位点处替换一个或多个氨基酸，而源自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46的蛋白质的多肽。此类变体可由例如遗传多态性或人为操作产生。此类操作的方法通常在本领域中是已知的。
应认识到，本发明的多核苷酸分子及多肽涵盖包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45中示出的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46中示出的氨基酸序列足够相同的核苷酸或氨基酸序列的多核苷酸分子及多肽。在本文中使用术语“足够相同”指，第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的或最小数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的侧链)的氨基酸残基或核苷酸，使得第一与第二氨基酸或核苷酸序列具有共同结构域和/或共同功能活性。
“序列同一性”指两个最佳比对的DNA或氨基酸序列在整个组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗中无变化的程度。对于测试序列与参考序列的比对区段，“同一性分数”为两个比对序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小的规定部分)中的组分总数。“同一性百分比”为同一性分数乘以100。用于比对比较窗口的最佳序列比对为本领域技术人员所熟知且可通过工具(例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法)来实施，且优选通过这些算法的计算机化工具来实施，例如作为GCG.Wisconsin包(Accelrys Inc.Burlington,Mass.)的一部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA。
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，指核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者之组合)的任何长度的聚合的未分支形式。
蛋白质的“衍生物”涵盖相对于所讨论的未经修饰的蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入且与其所来源的该未经修饰的蛋白质具有相似的生物及功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未经修饰的蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入且与其所来源的该未经修饰的蛋白质具有相似的生物及功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶。
缺失指从蛋白质移除一个或多个氨基酸。
插入指将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点。插入可包含N端和/或C端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般而言，氨基酸序列内的插入将比N端或C端融合小，约1至10个残基的数量级。N端或C端融合蛋白或肽的实例包括如酵母双杂交系统中使用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体衣壳蛋白、(组氨酸)-6标签、谷胱甘肽S转移酶标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位及VSV表位。
替换指用具有相似性质(诸如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α螺旋结构或β片层结构的倾向性)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换通常为单残基替换，但可为簇集的(取决于施加在多肽上的功能限制)且可在1至10个氨基酸的范围内；插入将通常为约1至10个氨基酸残基的数量级。氨基酸替换优选为保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(编辑)。
表2：保守氨基酸替换的实例
残基 保守替换 残基 保守替换
Ala Ser Leu Ile;Val
Arg Lys Lys Arg;Gln
Asn Gln;His Met Leu;Ile
Asp Glu Phe Met;Leu;Tyr
Gln Asn Ser Thr;Gly
Cys Ser Thr Ser;Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp;Phe
His Asn;Gln Val Ile;Leu
Ile Leu,Val
使用本领域熟知的肽合成技术(诸如固相肽合成等)，或通过重组DNA操作，可容易地进行氨基酸替换、缺失和/或插入。操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。例如，在DNA中的预定位点处进行替换突变的技术为本领域技术人员所熟知，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，其较之天然存在形式的蛋白质(诸如目的蛋白质)的氨基酸序列，可包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”亦涵盖肽、寡肽、多肽，其较之天然存在形式的多肽的氨基酸序列，包含天然存在的经改变(糖基化、酰基化、异戊二烯基化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或经非天然改变的氨基酸残基。衍生物较之其所源于的氨基酸序列，亦可包含一个或多个非氨基酸取代基或添加物，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报告分子或其它配体(诸如结合以便于其检测的报告分子)、以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列的非天然存在的氨基酸残基。此外“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽(诸如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白)的融合物(关于标签肽的综述，参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。
“直向同源物”及“旁系同源物”涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。直向同源物的非限制性实例列表显示于表1中。
本领域熟知，旁系同源物及直向同源物在给定位点处可共有具有适合氨基酸残基的独特结构域，诸如用于特定底物的结合袋或用于与其它蛋白质相互作用的结合基序。
术语“结构域”是指在进化相关蛋白的质序列比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其它位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”通过在蛋白质同源物家族的比对序列中其高度的保守性而鉴定，其能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是结构域的高度保守的部分，但也可以包括仅仅部分的结构域，或者可以是位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。
存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94;第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology)Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编辑,53-61页,AAAIPress,Menlo Park;Hulo等,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002))。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res31:3784-3788(2003))。结构域或基序也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定。
为比较而进行序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找两序列之间匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。同源物可以例如，使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等,(2003)BMC Bioinformatics,10:29.2003Jul10;4:29.MatGAT:anapplication that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1);195-7)。
本发明的发明人已惊人地发现，通过替换一个或多个关键氨基酸残基，较之具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46的野生型PPO酶的活性，可显著增加除草剂耐受性或抗性。mut-PPO的优选替换为增加植物的除草剂耐受性、但基本上不影响该氧化酶的生物活性的替换。
因此，在本发明的另一目的中，PPO酶、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的关键氨基酸残基被任何其它氨基酸替换。
在优选的实施方案中，PPO酶、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的关键氨基酸残基被表2中描述的保守氨基酸替换。
本领域技术人员将理解的是，位于以下提及的氨基酸位置的紧邻位置的氨基酸亦可被替换。因此，在另一实施方案中，SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的变体包含mut-PPO，其中距关键氨基酸±3、±2或±1个氨基酸位置的氨基酸被任何其它氨基酸替换。
基于本领域熟知的技术，可开发高度特征性的序列模式，通过该模式可搜寻具有所需活性的其它mut-PPO候选者。
本发明也涵盖：通过应用合适的序列模式，搜索其它mut-PPO候选者。本领域读者将理解的是，本发明序列模式不受所述模式的两个相邻氨基酸残基之间的精确距离限制。以上模式中两相邻氨基酸之间的距离各自可以例如彼此独立地变化多达±10、±5、±3、±2或±1个氨基酸位置而基本上不影响所需活性。
与根据本发明获得的基于晶体学数据对各单个氨基酸残基的所述以上功能及空间分析一致，可鉴定以本发明的潜在有用mut-PPO候选者为特征的独特的部分氨基酸序列。
在特别优选的实施方案中，SEQ ID NO:2的mut-PPO中的变异或衍生物选自以下表3a，SEQ ID NO:2的mut-PPO中的组合氨基酸替换选自表3b。
表3a：(序列ID No:2、26、38、40)：单氨基酸替换
Figure BDA00003354044200511
Figure BDA00003354044200521
表3b：SEQ ID NO:2(组合的氨基酸替换)
Figure BDA00003354044200522
应理解的是，除以上表3中提及的氨基酸外，任何氨基酸亦可用作替代。在本领域中容易获得测试此类突变体的功能性的试验，且分别描述于本发明的实施例章节中。
在优选的实施方案中，氨基酸序列在一个或多个以下位置处不同于SEQ ID NO:2的PPO的氨基酸序列：128、175、209、210、295、296、334、353、382、384、397、398、399、400、402、403、404、405、420、439。
这些氨基酸位置处的差异的实例包括但不限于以下之一者或多者：位置128的氨基酸不是精氨酸；位置175的氨基酸不是甘氨酸；位置209的氨基酸不是甘氨酸；位置210的氨基酸不是甘氨酸；位置295的氨基酸不是亮氨酸；位置296的氨基酸不是丝氨酸；位置334的氨基酸不是亮氨酸；位置353的氨基酸不是苯丙氨酸；位置382的氨基酸不是甘氨酸；位置384的氨基酸不是亮氨酸；位置397的氨基酸不是亮氨酸，位置398的氨基酸不是甘氨酸，位置399的氨基酸不是苏氨酸，位置400的氨基酸不是亮氨酸，位置402的氨基酸不是丝氨酸，位置403的氨基酸不是丝氨酸，位置404的氨基酸不是甲硫氨酸，位置405的氨基酸不是甲硫氨酸，位置420的氨基酸不是苯丙氨酸，位置439的氨基酸不是苯丙氨酸。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的PPO酶包含以下之一者或多者：位置128的氨基酸为Leu,Ala,Val,Ile,Phe,Trp,Asp,或Asn；位置175的氨基酸为缺失,Ala,Val,Pro,Leu,Ile,Met,Ser,或Thr；位置209的氨基酸为缺失,Ala,Val,Pro,Leu,Ile,Met,Ser,或Thr；位置210的氨基酸为缺失,Ala,Val,Pro,Leu,Ile,Met,Ser,或Thr；位置295的氨基酸为Ser,Met,Ala,Val,Asp,Asn或Thr；位置296的氨基酸为Leu,Met,Gly,Val,Asp,Asn或Thr；位置334的氨基酸为Val,Ile,Phe,Tyr,Asn,Asp,或Thr；位置353的氨基酸为Tyr,Leu,Val,Ile,或Asn；位置382的氨基酸为Ala,Ser,Thr,Cys,Val,或Asp；位置384的氨基酸为Ala,Val,Ile,Asn,Asp,或Thr；位置397的氨基酸为Ala,Val,Ile,Asn,Asp,或Thr；位置398的氨基酸为Ala,Ser,Thr,Cys,Val,或Asp；位置399的氨基酸为Ser,Cys,Met,Ala,或Asn；位置400的氨基酸为Ala,Val,Ile,Phe,Asn,Asp,或Thr；位置402的氨基酸为Gly,Ala,Cys,Asp,或His；位置403的氨基酸为Gly,Ala,Cys,Asp,或His；位置404的氨基酸为Ser,Cys,Thr,Gly,或Ala；位置405的氨基酸为Leu,Ala,Val,Gly,Cys,或Ser；位置420的氨基酸为Met,Cys,Ile,Tyr,Trp,Leu,或Thr；位置439的氨基酸为Tyr,Trp,Ala,Val,或Ile。
在另一个优选的实施方案中，氨基酸序列在位置389上不同于SEQID NO:26的PPO的氨基酸序列。优选地，位置389的氨基酸不是缬氨酸。更优选地，位置389的氨基酸不是甲硫氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、或组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，氨基酸序列在一个或多个以下位置上不同于SEQ ID NO:38的PPO的氨基酸序列：220、305、426。优选地，位置220的氨基酸不是丙氨酸，位置305的氨基酸不是丝氨酸，位置426的氨基酸不是酪氨酸。
更优选地，位置220的氨基酸是缺失的,Val,Thr,Leu,Cys,Ile,或Met；位置305的氨基酸是Leu,Ala,Val；位置426的氨基酸是Met,Cys,Ile,Leu,或Thr。
在另一个优选的实施方案中，氨基酸序列在一个或多个以下位置上不同于SEQ ID NO:40的PPO的氨基酸序列：178、179、372、392。优选地，位置178的氨基酸不是丙氨酸，位置179的氨基酸不是甘氨酸，位置372的氨基酸不是苯丙氨酸，位置392的氨基酸不是苯丙氨酸。
更优选地，位置178的氨基酸是缺失的,Ala,Val,Pro,Leu,Ile,Met,Ser,或Thr；位置179的氨基酸是缺失的,Ala,Val,Pro,Leu,Ile,Met,Ser,或Thr；位置372的氨基酸是Met,Cys,Ile,Tyr,Trp,Phe,Leu,或Thr；位置392的氨基酸是Met,Cys,Ile,Tyr,Trp,或Leu。
鉴别SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45的同源物、直向同源物及旁系同源物（诸如表1中描述的那些）之间所共有的保守区及基序，在本领域技术人员的知识范畴内。在鉴别了可能代表合适的结合基序的保守区后，可选择对应于表3a和3b中所列氨基酸的氨基酸，将其用任何其它氨基酸，优选地用如表2中所示的保守氨基酸，且更优选地用表3a和3b的氨基酸，替换。
此外，本发明涉及：通过使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45或其变体或衍生物的核酸编码的mut-PPO、鉴别苯并
Figure BDA00003354044200551
嗪酮衍生物除草剂的方法。
所述方法包括步骤：
a)生成包含编码mut-PPO的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-PPO；
b)对a)的转基因细胞或植物以及对相同品种的对照细胞或植物，施用苯并嗪酮衍生物除草剂；
c)施用所述苯并
Figure BDA00003354044200553
嗪酮衍生物除草剂之后，测定转基因细胞或植物及该对照细胞或植物的生长或生存力，和
d)选择使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低的“苯并
Figure BDA00003354044200554
嗪酮衍生物除草剂”。
“对照细胞”或“相似的、野生型的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指，缺乏本文公开的除草剂抗性特征和/或本发明特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，使用术语“野生型”不意欲暗示，该植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNA、和/或不具有与本文公开的除草剂抗性特征不同的除草剂抗性特征。
另一目的涉及鉴别编码对苯并
Figure BDA00003354044200555
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)生成mut-PPO编码核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸且用苯并
Figure BDA00003354044200561
嗪酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物来筛选所得mut-PPO编码核酸的群体，
c)比较由所述mut-PPO编码核酸群体提供的苯并
Figure BDA00003354044200562
嗪酮衍生物除草剂耐受性水平与由对照PPO编码核酸提供的苯并嗪酮衍生物除草剂耐受性水平，
d)选择至少一种mut-PPO编码核酸，较之对照PPO编码核酸，其提供显著增加的苯并嗪酮衍生物除草剂耐受性水平。
在优选的实施方案中，较之由对照PPO编码核酸提供的对苯并
Figure BDA00003354044200565
嗪酮衍生物除草剂的抗性或耐受性，步骤d)中选出的mut-PPO编码核酸提供至少2倍的细胞或植物对苯并
Figure BDA00003354044200566
嗪酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。
在另一个优选的实施方案中，较之由对照PPO编码核酸提供的对苯并嗪酮衍生物除草剂的抗性或耐受性，步骤d)中选出的mut-PPO编码核酸提供至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍的细胞或植物对苯并嗪酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。
可通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物或宿主细胞，优选植物细胞，并比较所述转基因植物与对照植物或宿主细胞，优选植物细胞，以测定抗性或耐受性。
另一目的涉及鉴别含有核酸的植物或藻类的方法，所述核酸包含编码对苯并
Figure BDA00003354044200569
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型或mut-PPO的核苷酸序列，所述方法包括：
a)于植物细胞或绿藻的培养物中鉴定导致所述细胞死亡的有效量的苯并嗪酮衍生物除草剂，
b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，
c)使所述经诱变的细胞群体与a)中鉴定的有效量的苯并
Figure BDA000033540442005611
嗪酮衍生物除草剂接触，
d)选择在这些测试条件下存活的至少一个细胞，
e)从d)中选择的细胞，PCR扩增及测序PPO基因，且将该序列与野生型PPO基因序列进行比较。
在优选的实施方案中，所述诱变剂为甲基磺酸乙酯(EMS)。
本领域技术人员熟知的许多方法可用于从多种不同的潜在来源生物(包括微生物、植物、真菌、藻类、混合培养物等)以及DNA的环境来源(诸如土壤)获得用于鉴定编码mut-PPO的核苷酸序列的合适候选核酸。这些方法尤其包括制备cDNA或基因组DNA文库，使用合适地简并的寡核苷酸引物，使用基于己知序列的探针或互补测定试验(例如在酪氨酸上生长)、以及使用诱变和改组以提供重组的或改组的mut-PPO编码序列。
包含候选及对照PPO编码序列的核酸可在酵母、细菌宿主菌株、藻类或高等植物(诸如烟草或拟南芥)中表达，且根据经转化的株或植物在不同浓度的所选苯并
Figure BDA00003354044200571
嗪酮衍生物除草剂存在下的可见指标表型，筛选PPO编码序列的固有耐受性的相对水平。与这些指标表型(棕色形成、生长抑制、除草效应等)相关的剂量反应及剂量反应的相对迁移可以方便地表达为：例如GR50(用于生长降低50%的浓度)或MIC(最低抑制浓度)值，其中值的增加对应于表达的PPO的固有耐受性的增加。例如，在基于细菌(诸如大肠杆菌(E.coli))转化的相对快速试验系统中，各mut-PPO编码序列可例如作为在可控制启动子(诸如lacZ启动子)的表达控制下的DNA序列而表达，并且例如通过使用合成的DNA，适当考虑密码子使用之类的问题，以便获得不同PPO序列的尽可能相当的表达水平。可将表达包含可选的候选PPO序列的核酸的菌株铺于含不同浓度的所选苯并
Figure BDA00003354044200572
嗪酮衍生物除草剂的平板上（任选地在补充了酪氨酸的培养基中），并基于对棕色褐黄病色素形成的抑制的程度及MIC，估计表达的PPO酶的固有耐受性的相对水平。
在另一实施方案中，将候选核酸转化至植物材料中以产生转基因植物，再生为形态学正常的可育植物，接着测量所述可育植物对所选苯并
Figure BDA00003354044200581
嗪酮衍生物除草剂的差异耐受性。使用合适的选择标记物(诸如卡那霉素)、二元载体(诸如来自农杆菌属(Agrobacterium))、以及（例如自烟草叶盘）植物再生的许多合适的转化方法为本领域熟知。任选地，同样地用表达对照PPO的核酸来转化对照植物群体。备选地，未转化的双子叶植物(诸如拟南芥或烟草)可用作对照，因为其在任何情况下都表达其自身内源性PPO。可以基于在一系列不同除草剂浓度下的植物损伤、分生组织漂白症状等，以常规方式，评估一系列原代植物转化事件或其子代对上述苯并
Figure BDA00003354044200582
嗪酮衍生物的除草剂耐受性水平的平均值及分布。这些数据可表示为例如源自剂量/应答曲线的GR50值，在所述剂量/应答曲线中“剂量”绘制在x轴上且“百分比杀伤”、“除草效应”、“萌发的绿色植物的数目”等绘制在y轴上，其中GR50值增加对应于表达的PPO的固有耐受性水平增加。除草剂可合适地在出苗前或出苗后施用。
另一目的涉及编码mut-PPO的经分离的核酸，其中核酸可通过如上定义的方法鉴定。
在另一实施方案中，本发明涉及被野生型或mut-PPO核酸转化的植物细胞、或已被突变的植物细胞（以便获得表达野生型或mut-PPO核酸的植物），其中该核酸在植物细胞中的表达导致，较之植物细胞的野生型品种，增加的对苯并
Figure BDA00003354044200583
嗪酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。
术语“表达”或“基因表达”意指，特定基因(一个或多个)或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别意指，基因(一个或多个)或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，加上或不加上mRNA随后翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录及所得mRNA产物的加工。
为了获得所需效果，即植物对本发明的苯并嗪酮衍生物除草剂具有耐受性或抗性，应理解的是，可以通过本领域技术人员已知的方法及手段，“过表达”至少一种核酸。
如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”意指，超出原始野生型表达水平之外的任何表达形式。用于增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，其包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可将用作启动子或增强子元件的经分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(典型地上游)，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，可通过突变、缺失、和/或替换在体内改变内源性启动子(参见Kmiec,US5,565,350;Zarling等,WO9322443)，或可将经分离的启动子以适当的方向及距本发明基因的距离引入植物细胞中，以控制基因的表达。
如果期望多肽表达，则通常期望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷酸化区可源于天然基因、来自多种其它植物基因、或来自T-DNA。欲添加的3'端序列可源于例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者可选地源于另一植物基因，或次优选地源于任何其它真核生物基因。
也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。
本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。
外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1882)Nature296,72-74;Negrutiu I.等,(1987)Plant Mol.Biol.8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等,(1985)Bio/Technol3,1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等,(1986)Mol.Gen Genet202:179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等,(1987)Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for GeneTransfer,在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，
Figure BDA00003354044200611
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页。
除了转化体细胞（其之后不得不再生为完整植株），还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).MolGen Genet208:274-289;Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和JShell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[NatureBiotechnology22(2),225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21,20-28给出。最近报道了其它生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,NatureBiotechnology22(2),225-229)。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者
Figure BDA00003354044200621
和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子（酌情在灭菌后），从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。
DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。
优选地，野生型或mut-PPO核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45所示的多核苷酸、或其变体或衍生物；b)编码如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46所示的多肽或其变体或衍生物的多核苷酸；c)包含a)或b)的任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及d)与a)至c)之任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
优选地，核酸在植物中的表达导致，较之野生型品种的植物，该植物对苯并嗪酮衍生物除草剂的抗性增加。
在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的植物细胞的植物，优选转基因植物，其中核酸在该植物中的表达导致，较之植物的野生型品种，该植物对苯并
Figure BDA00003354044200632
嗪酮衍生物除草剂的抗性增加。
本文中所述的植物可为转基因作物植物或非转基因植物。
出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：
(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或
(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)(a)和(b)
不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为指在原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然组合——经非天然的合成（“人工”）方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US5,565,350或WO00/15815中。
因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在所述植物的基因组中,本发明方法中所用的核酸不位于其天然基因座上，其中所述核酸可以进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。此外，术语“转基因”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，该重组多核苷酸的全部或部分被稳定整合到染色体中或是稳定的染色体外元件，这样其可以被传递至后续世代。出于本发明目的，术语“重组多核苷酸”指，己通过遗传工程而改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括与异源序列连接或接合的任何克隆的多核苷酸(一个或多个)。术语“重组”并不指，由天然发生的事件(诸如自发突变)造成的、或由非自发诱变以及之后的选择性育种造成的多核苷酸的改变。
含有由非自发诱变及选择性育种而产生的突变的植物在本文中称为非转基因植物且包括在本发明中。在植物为转基因植物且包含多个mut-PPO核酸的实施方案中，这些核酸可源于不同基因组或相同基因组。可选地，在植物为非转基因植物且包含多个mut-PPO核酸的实施方案中，这些核酸位于不同基因组或相同基因组上。
在某些实施方案中，本发明涉及通过突变育种产生的除草剂抗性植物。此类植物包含编码mut-PPO的多核苷酸且对一或多种“苯并嗪酮衍生物除草剂”具有耐受性。此类方法可涉及例如将植物或种子暴露于诱变剂，尤其是化学诱变剂，诸如甲基磺酸乙酯(EMS)，及选择对至少一或多种苯并
Figure BDA00003354044200652
嗪酮衍生物除草剂具有增加的耐受性的植物。
然而，本发明不限于通过涉及化学诱变剂EMS的诱变方法生产的除草剂耐受性植物。本领域中已知的任何诱变方法皆可用于生产本发明的除草剂抗性植物。此类诱变方法可涉及例如使用任何一或多种以下诱变剂：辐射，诸如X射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(例如在原子反应堆中由铀235核裂变产生的产物)、β辐射(例如由诸如磷32或碳14等放射性同位素发射的)、及紫外辐射(优选地从2500至2900nm)；及化学诱变剂，诸如碱基类似物(例如5-溴尿嘧啶)、相关化合物(例如8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如链黑菌素)、烷基化试剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、亚乙基胺类、硫酸酯类、磺酸酯类、砜类、内酯类)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。亦可通过使用组织培养方法以选择包含除草剂抗性突变的植物细胞、然后从其再生除草剂抗性植物，以产生除草剂抗性植物。参见例如美国专利号5,773,702和5,859,348，两者就其全部内容以引用的方式并入本文中。突变育种的其它详情可见于"Principals ofCultivar Development"Fehr,1993Macmillan Publishing Company中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
除以上定义外，除非上下文另外明确指示，术语“植物”意欲涵盖处于成熟或发育的任何阶段的作物植物，以及取自任何此类植物或源于任何此类植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。
本发明的植物包含至少一个mut-PPO核酸或过表达的野生型PPO核酸，且较之植物的野生型品种，其具有对苯并嗪酮衍生物除草剂的增加的耐受性。本发明的植物可以具有来自不同基因组的多个野生型或mut-PPO核酸，因为这些植物可含有1个以上的基因组。例如，植物可以含有两个基因组，通常称为A基因组及B基因组。因为PPO为所需的代谢酶，故认为每个基因组皆具有至少一个编码PPO酶的基因(即至少一个PPO基因)。如本文所用，术语“PPO基因座”指PPO基因在基因组上的位置，且术语“PPO基因”及“PPO核酸”指编码PPO酶的核酸。每个基因组上的PPO核酸的核苷酸序列与另一基因组上的PPO核酸的核苷酸序列不同。本领域技术人员可通过本领域技术人员己知的遗传杂交和/或测序方法或外切核酸酶消化方法，确定每个PPO核酸的起源基因组。
本发明包括包含1个、2个、3个或更多的mut-PPO等位基因的植物，其中较之植物的野生型品种，该植物对苯并
Figure BDA00003354044200662
嗪酮衍生物除草剂的耐受性增加。mut-PPO等位基因可包含选自以下的核苷酸序列：如SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45中定义的多核苷酸、或其变体或衍生物；编码如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46中定义的多肽或其变体或衍生物、同源物、直向同源物、旁系同源物的多核苷酸；包含以上提及的多核苷酸之任一的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与以上提及的多核苷酸之任一互补的多核苷酸。
等位基因或等位基因变体为位于相同的染色体位置的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然多态性品系中SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。
术语“品种”(variety)指一个物种内的一组植物，其通过共有一组共同的特征或性状而被定义，其中该组共同的特征或性状被本领域技术人员接受为足以将一个栽培种(cultivar)或品种与另一个栽培种或品种区分开来。任何术语都不意味，任何给定的栽培品种或品种的所有植物将在整个基因或分子水平上遗传相同、或任何给定的植物将在所有基因座为纯合的。当一个栽培品种或品种自花受粉时，如果所有子代皆含有特定性状，则认为该栽培品种或品种就该特定性状而言为“纯种(true breeding)”的。术语“育种品系”(breeding line)或“品系”(line)指一个栽培种内通过共有一组共同的特征或性状而被定义的一组植物，其中该组特征或性状被本领域技术人员接受为足以将一个育种品系或品系与另一育种品系或品系区分开来。任一术语均不暗示，任何给定的育种品系或品系中的所有植物将在整个基因或分子水平上遗传相同、或任何给定的植物将在所有基因座均为纯合的。当一个品系或育种品系自花受粉时，如果所有子代皆含有一个特定性状，则认为该育种品系或品系就该特定性状而言为“纯种”的。在本发明中，性状来自植物或种子的PPO基因中的突变。
包含编码mut-PPO多肽的多核苷酸的本发明除草剂抗性植物亦可用于通过涉及有性繁殖的常规植物育种来增加植物的除草剂抗性的方法中。方法包括使作为第一植物的本发明除草剂抗性植物与第二植物杂交，所述第二植物可以与第一植物对相同的除草剂(一种或多种)具有抗性或不具有抗性、或可以与第一植物抵抗不同的除草剂(一种或多种)。第二植物可为当与第一植物杂交时能够产生可存活的子代植物(即种子)的任何植物。典型地，但并非一定地，第一植物与第二植物是相同物种。方法可任选地包括选择包含第一植物的mut-PPO多肽及第二植物的除草剂抗性特征的子代植物。当与第一或第二植物或两者比较时，通过本发明此方法产生的子代植物对除草剂具有增加的抗性。当第一及第二植物对不同除草剂具有抗性时，子代植物将具有组合的第一及第二植物的除草剂耐受性特征。本发明方法可另外包括使第一次杂交的子代植物与和第一或第二植物具有相同品系或基因型的植物回交一代或多代。可选地，第一次杂交或任何随后杂交的子代可与第三植物杂交，该第三植物与第一或第二植物为不同品系或基因型。本发明亦提供用至少一个本发明的多核苷酸分子、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子及非人宿主细胞。此类经转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子及非人宿主细胞对至少一种除草剂，在该除草剂的杀伤未转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞或抑制其生长的水平，具有增强的耐受性或抗性。优选地，本发明的经转化植物、植物组织、植物细胞及种子为拟南芥及作物植物。
应理解的是，除mut-PPO核酸外，本发明植物亦可包含野生型PPO核酸。考虑苯并
Figure BDA00003354044200681
嗪酮衍生物除草剂耐受性品系可仅在多个PPO同工酶中的一个中含有突变。因此，本发明包括除一个或多个野生型PPO核酸外还包含一或多个mut-PPO核酸的植物。
在另一实施方案中，本发明涉及由包含本发明的植物细胞的转基因植物产生的种子，其中就相对于该种子的野生型品种具有增加的苯并
Figure BDA00003354044200682
嗪酮衍生物除草剂抗性而言，该种子是纯种的。
在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物细胞的方法，该转基因植物细胞，较之该植物细胞的野生型品种，具有对苯并嗪酮衍生物除草剂的增加的抗性，所述方法包括用包含mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物的方法，其包括：(a)用包含mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞，及(b)从植物细胞产生具有对苯并
Figure BDA00003354044200691
嗪酮衍生物除草剂的增加的抗性的植物。
因此，本发明的mut-PPO核酸可以提供于表达盒中用于在目的植物中表达。所述盒将包括有效连接于本发明的mut-PPO核酸序列的调控序列。如本文所用的术语“调控元件”指，能够调控有效连接的多核苷酸的转录的多核苷酸。其包括但不限于，启动子、增强子、内含子、5'UTR及3'UTR。就“有效连接”而言，其指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始且介导对应于该第二序列的DNA序列转录。一般而言，有效连接意指所连接的核酸序列为毗邻的，以及当需要连接两个蛋白质编码区时，为毗邻且在同一阅读框中的。盒可另外含有至少一种待共转化入生物中的额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供该额外基因(一个或多个)。
提供带多个限制性位点的此表达盒，所述限制性位点可以用于插入mut-PPO核酸序列在调控区的转录调控下。表达盒可另外含有可选择标记基因。
表达盒可以以5'-3'转录方向包括在植物中具有功能的转录及翻译起始区(即启动子)、本发明的mut-PPO核酸序列、及转录和翻译终止区(即终止区)。对于植物宿主和/或本发明的mut-PPO核酸序列而言，启动子可为天然的或类似物、或外源的或异源的。另外，启动子可为天然序列或可选地为合成序列。当启动子对于植物宿主而言为“外源”或“异源”的时，其意指启动子不存在于该启动子所引入的天然植物中。当启动子对于本发明的mut-PPO核酸序列而言为“外源”或“异源”的时，其意指启动子对于有效连接的本发明mut-PPO核酸序列而言不是天生的或天然存在的启动子。如本文所用，嵌合基因包含有效连接于转录起始区的编码序列，所述转录起始区对编码序列而言是异源的。
尽管可能优选使用异源启动子表达本发明的mut-PPO核酸，但可以使用天然启动子序列。此构建体改变植物或植物细胞中mut-PPO蛋白质的表达水平。由此，改变该植物或植物细胞的表型。
终止区可以就转录起始区而言是天然的，可以就有效连接的目的mut-PPO序列而言是天然的，可以就植物宿主而言是天然的，或可以源于另一来源(即对于启动子、目的mut-PPO核酸序列、植物宿主、或其任何组合而言为外源或异源的)。合适的终止区可从根癌农杆菌的Ti质粒获得，诸如章鱼碱合酶及胭脂碱合酶终止区。亦参见Guerineau等(1991)MoI.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon等(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen等(1990)Plant Cell2:1261-1272;Munroe等(1990)Gene91:151-158;Ballas等(1989)NucleicAcids Res.17:7891-7903;和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。适当时，可对基因（一个或多个）进行优化以增加其在经转化的植物中的表达。即，可使用植物偏好的密码子来合成基因，以改进表达。关于宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。本领域中可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见例如美国专利号5,380,831,和5,436,391,以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，以引用的方式并入本文中。
己知其它序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括：消除假的多聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的编码序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其它经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至通过参考宿主细胞中表达的已知基因而计算出的该给定细胞宿主的平均水平。可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。用于增强基因表达的核苷酸序列亦可用于植物表达载体中。它们包括玉米Adhl、intronl基因的内含子(Callis等，Genesand Development1:1183-1200,1987)、及来自烟草花叶病毒(TobaccoMosaic virus)(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)及苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Virus)的前导序列(W-序列)(Gallie等，Nucleic Acid Res.15:8693-8711,1987和Skuzeski等，Plant MoI.Biol.15:65-79,1990)。己证实来自玉米的shrunken-1基因座的第一内含子可增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，且Gallie等(Plant Physiol.106:929-939,1994)也己经证明内含子可以用于在组织特异的基础上调控基因表达。为了进一步增强或优化mut-PPO基因表达，本发明的植物表达载体也可含有包含基质附着区(MAR)的DNA序列。然后，用此经修饰的表达系统转化的植物细胞可表现出本发明核苷酸序列的过表达或组成性表达。
表达盒可另外在表达盒构建体中包含5'前导序列。此前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列为本领域所知并且包括：细小核糖核酸病毒(picornavirus)前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Stein等，(1989)Proc.Natl.Acad.ScL USA86:6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus))(Gallie等，(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))(Virology154:9-20)、及人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等，(1991)Nature353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等，(1987)Nature325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)，于Molecular Biology of RNA,Cech编辑(Liss,New York),第237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)((Lommel等，(1991)Virology81:382-385)。也见Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84:965-968。还可以利用已知可增强翻译的其它方法，例如内含子等。
在制备表达盒时，可操作多种DNA片段，以提供处于正确方向及酌情地处于正确阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可涉及其它操作以提供方便限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等。出于此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再替换，例如转换及颠换。
许多启动子可用于实施本发明。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性或其它启动子组合用于在植物中的表达。此类组成性启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子及公开于W099/43838和美国专利号6,072,050中的其它组成性启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等，(1985)Nature313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等，(1990)Plant Cell2:163-171)；泛素(Christensen等，(1989)Plant MoI.Biol.12:619-632及Christensen等，(1992)Plant MoI.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等，(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成性启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；及6,177,611。
组织偏好性启动子可用于靶向增强特定植物组织内的mut-PPO表达。此类组织偏好性启动子包括但不限于叶偏好性启动子、根偏好性启动子、种子偏好性启动子及茎偏好性启动子。组织偏好性启动子包括Yamamoto等，(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等，(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等，(1997)MoI.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等，(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等，(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等，(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等，(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524；Yamamoto等，(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等，(1993)Plant MoI Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka e/[alpha]/.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等，(1993)Plant J.4(3):495-505。必要时，此类启动子可经修饰用于弱表达。在一个实施方案中，将目的核酸靶向叶绿体以表达。以此方式，当中目的核酸不直接插入到叶绿体中时，表达盒将额外含有叶绿体靶向序列，该序列包含编码将目的基因产物导向叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。此类转运肽为本领域所知。就叶绿体靶向序列而言，“有效连接”意指编码转运肽的核酸序列(即叶绿体靶向序列)与本发明的mut-PPO核酸连接，以使得两个序列邻接且位于同一阅读框中。参见例如VonHeijne等，(1991)Plant MoI.Biol.Rep.9:104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等，(1986)Science233:478-481。尽管本发明的mut-PPO蛋白包括天然的叶绿体转运肽，但可通过将叶绿体靶向序列与编码本发明的成熟mut-PPO蛋白的核苷酸序列的5'端有效连接，使本领域技术中已知的任何叶绿体转运肽与本发明的成熟mut-PPO蛋白的氨基酸序列融合。叶绿体靶向序列为本领域已知，其包括核酮糖1,5二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等，(1996)Plant MoI.Biol.30:769-780；Schnell等，(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342)；5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810)；色氨酸合成酶(Zhao等，(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等，(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363)；分支酸合成酶(Schmidt等，(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457)；及集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等，(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999)。还参见VonHeijne等，(1991)Plant MoI.Biol.Rep.9:104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；及Shah等，(1986)Science233:478-481。
用于叶绿体转化的方法为本领域已知。参见例如Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.ScL USA87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有可选择标记物的DNA和经同源重组使DNA靶向质体基因组。另外，可利用组织偏好性表达核编码的质体导向的RNA合成酶，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。此类系统己报导于McBride等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中。为在叶绿体中表达，可以对待靶向叶绿体的目的核酸加以优化，以解决植物细胞核与该细胞器之间的密码子使用差异。据此，可使用叶绿体偏好性密码子合成目的核酸。参见例如美国专利号5,380,831，其以引用的方式并入本文中。
在优选的实施方案中，mut-PPO核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45所示的多核苷酸、或其变体或衍生物；b)编码如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46所示的多肽或其变体或衍生物的多核苷酸；c)包含a)或b)之任一的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及d)与a)至c)之任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
优选地，表达盒还包含在植物中具有功能的转录起始调控区及翻译起始调控区。
尽管本发明的多核苷酸可用作可选择标记基因用于植物转化，但本发明的表达盒可包括用于选择经转化的细胞的另一可选择标记基因。可选择标记基因，包括本发明的那些，可以用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)及潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物(诸如草胺磷(glufosinate ammonium)、溴苯腈(bromoxynil)、咪唑啉酮类(imidazolinones)、及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D))的抗性的基因。一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christophers on等，(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA89:6314-6318；Yao等，(1992)Cell71:63-72；Reznikoff(1992)MoI Microbiol6:2419-2422；Barkley等，(1980)于The Operon,第177-220页中；Hu等，(1987)Cell48:555-566；Brown等，(1987)Cell49:603-612；Figge等，(1988)Cell52:713-722；Deuschle等，(1989)Proc.Natl Acad.AcL USA86:5400-5404；Fuerst等，(1989)Proc.Natl Acad.ScL USA86:2549-2553；Deuschle等，(1990)Science248:480-483；Gossen(1993)博士论文,University of Heidelberg；Reines等，(1993)Proc.Natl Acad.ScL USA90:1917-1921；Labow等，(1990)MoI Cell Biol10:3343-3356；Zambretti等，(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA89:3952-3956；Bairn等，(1991)Proc.Natl Acad.ScL USA88:5072-5076；Wyborski等，(1991)NucleicAcids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics MoI Struc.Biol10:143-162；Degenkolb等，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等，(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)博士论文,University of Heidelberg；Gossen等，(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA89:5547-5551；Oliva等，(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等，(1988)Nature334:721-724。这些公开内容以引用的方式并入本文中。可选择标记基因的以上列表不意在构成限制。任何可选择标记基因均可用于本发明中。
本发明还提供包含含有如上所述mut-PPO核酸的表达盒的经分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达导致，较之宿主细胞的野生型品种，对苯并
Figure BDA00003354044200751
嗪酮衍生物除草剂的增加的耐受性。如本文所用，术语“载体”指能够转运己经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其指其中可连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中额外的DNA片段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入所述载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合于该宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，因为质粒为最常用形式的载体。然而，本发明旨在包括起等价功能的其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达本发明核酸的形式包含本发明的核酸，这意指重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调控序列，其有效连接于待表达的核酸序列上。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成性表达的那些调控序列、及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调控序列。本领域技术人员将理解的是，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需要的多肽的表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞中以由此生产由本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽(例如mut-PPO多肽、融合多肽等)。
在本发明的优选的实施方案中，mut-PPO多肽在植物及植物细胞(诸如单细胞植物细胞(诸如藻类)(见Falciatore等,1999,MarineBiotechnology1(3):239-251及其中的参考文献)及高等植物的植物细胞(例如种子植物，诸如作物植物))中表达。可通过任何手段将mut-PPO多核苷酸“引入”植物细胞中，所述手段包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染、生物射弹等。
适用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的方法可见于Sambrook等，(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)及其它实验室手册，诸如Methods in MolecularBiology,1995,第44卷，Agrobacterium protocols,编辑：Gartland和Davey,Humana Press,Totowa,New Jersey。由于增加的苯并
Figure BDA00003354044200771
嗪酮衍生物除草剂耐受性是希望遗传进入广泛多种植物(如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽及双低油菜、木薯、胡椒、向日葵及万寿菊、茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子及蕃茄)、野豌豆属物种(Vicia species)、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种(Salix species)、乔木(油棕、椰子)、多年生草本植物及饲料作物)中的一般性状，所以这些作物植物也是遗传工程改造的优选的靶植物，构成本发明的另一实施方案。在优选的实施方案中，植物为作物植物。饲料作物包括但不限于小麦草(Wheatgrass)、金丝雀虉草(Canarygrass)、无芒雀麦(Bromegrass)、Wildrye Grass、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿(Alfalfa)、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂种车轴草(Alsike Clover)、红花苜蓿(Red Clover)及草木樨(Sweet Clover)。
在本发明一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移，将mut-PPO多核苷酸转染到植物中。本领域技术人员已知的一种转化方法为，将开花植物浸入农杆菌溶液中，其中该农杆菌含有mut-PPO核酸，随后对经转化的配子进行育种。可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株，进行农杆菌介导的植物转化。可通过标准的转化及再生技术进行转化(Deblaere等，1994,Nucl.Acids.Res.13:4777-4788；Gelvin,Stanton B.和Schilperoort,Robert A,Plant Molecular Biology Manual,第2版，Dordrecht:Kluwer Academic Publ.,1995.-in Sect.,Ringbuc ZentraleSignatur:BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick,Bernard R.和Thompson,John E.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,BocaRaton:CRC Press,1993360S.,ISBN0-8493-5164-2)。例如，油菜籽可经由子叶或下胚轴转化而加以转化(Moloney等，1989,Plant Cell Report8:238-242；De Block等，1989,Plant Physiol.91:694-701)。用于农杆菌及植物选择的抗生素的使用取决于用于转化的二元载体和农杆菌菌株。油菜籽选择通常使用卡那霉素作为可选择植物标记物来进行。可使用例如由Mlynarova等，1994,Plant Cell Report13:282-285所述的技术，对亚麻进行农杆菌介导的基因转移。此外，可使用例如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述的技术，进行大豆的转化。可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取，或经由碳化硅纤维技术，实现玉米转化。(参见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的一个具体实例见于美国专利号5,990,387中，小麦转化的一个具体实例见于PCT申请号WO93/07256中。
根据本发明，若引入的mut-PPO多核苷酸掺入到非染色体自主复制子中或整合到植物染色体中，则其可稳定地维持于植物细胞中。可选地，引入的mut-PPO多核苷酸可存在于染色体外非复制性载体上，且瞬时表达或具有瞬时活性。在一个实施方案中，可构建同源重组微生物，其中mut-PPO多核苷酸整合到染色体中，制备含有至少一部分PPO基因的载体，在该PPO基因部分中己引入缺失、添加或替换，由此以改变(例如在功能上破坏)内源性PPO基因和创造mut-PPO基因。为了经由同源重组创造点突变，DNA-RNA杂交体可用于称为chimeraplasty的技术中(Cole-Strauss等，1999,Nucleic Acids Research27(5):1323-1330及Kmiec,1999,Gene therapy American Scientist87(3):240-247)。小麦属物种中的其它同源重组方法也是本领域熟知的且被考虑在本文中使用。
在同源重组载体中，mut-PPO基因在其5’及3’末端可以侧接PPO基因的额外核酸分子，以允许在载体携带的外源性mut-PPO基因与微生物或植物中的内源性PPO基因之间发生同源重组。该额外的侧翼PPO核酸分子的长度足以导致与内源性基因成功地同源重组。典型地，在载体中包括数百碱基对至多达数千碱基对的侧翼DNA(在5'和3'端)(同源重组载体的描述参见例如Thomas,K.R.,和Capecchi,M.R.,1987,Cell51:503；或展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)中基于cDNA的重组参见Strepp等，1998,PNAS,95(8):4368-4373)。然而，因为mut-PPO基因通常与PPO基因在极少氨基酸处不同，所以侧翼序列并非是始终需要的。将同源重组载体引入微生物或植物细胞中(例如经由聚乙二醇介导的DNA引入)，并使用本领域已知的技术选择其中引入的mut-PPO基因己与内源性PPO基因同源重组的细胞。
在另一实施方案中，可产生含有选择的系统的重组微生物，所述系统允许所引入的基因的受调控的表达。例如，在载体上包括mut-PPO基因且将该基因置于lac操纵子控制下，可以允许mut-PPO基因仅在IPTG存在下表达。此调控系统为本领域所熟知。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，其中己引入本发明的重组表达载体。术语“宿主细胞”及“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解的是，此术语不仅指特定的主题细胞，也适用于此类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而出现在后继世代中，所以此子代实际上可能不与母细胞完全相同，但其仍然包括在如本文中所使用的术语的范畴内。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，mut-PPO多核苷酸可表达于细菌细胞(诸如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum))、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌中。其它适合的宿主细胞为本领域技术人员所知。
本发明的宿主细胞(诸如培养的原核或真核宿主细胞)可用于生产(亦即表达)mut-PPO多核苷酸。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞来生产mut-PPO多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中己引入编码mut-PPO多肽的重组表达载体，或其基因组中己引入编码野生型或mut-PPO多肽的基因)直至mut-PPO多肽产生。在另一个实施方案中，方法还包括从培养基或宿主细胞分离mut-PPO多肽。本发明的另一方面涉及经分离的mut-PPO多肽及其生物活性部分。当通过重组DNA技术生产时，“经分离的”或“经纯化的”多肽或其生物活性部分不含一些细胞物质，或当经化学合成时其不含化学前体或其它化学物质。措辞“基本不含细胞物质”包括mut-PPO多肽的制品，其中多肽与天然或重组生产该多肽的细胞的一些细胞组分分离。在一个实施方案中，措辞“基本不含细胞物质”包括mut-PPO多肽的制品，其具有少于约30%(以干重计)的非mut-PPO物质(在本文中亦称为“污染性多肽”)、更优选少于约20%的非mut-PPO物质、还更优选少于约10%的非mut-PPO物质、和最优选少于约5%的非mut-PPO物质。
当重组生产mut-PPO多肽或其生物活性部分时，其优选地也基本不含培养基，即培养基占少于约20%、更优选少于约10%、且最优选少于约5%的多肽制品体积。措辞“基本不含化学前体或其它化学物质”包括mut-PPO多肽制品，其中多肽与多肽合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离。在一个实施方案中，措辞“基本不含化学前体或其它化学物质”包括mut-PPO多肽制品，其具有少于约30%(以干重计)的化学前体或非mut-PPO化学物质、更优选少于约20%的化学前体或非mut-PPO化学物质、还更优选少于约10%的化学前体或非mut-PPO化学物质、且最优选少于约5%的化学前体或非mut-PPO化学物质。在优选的实施方案中，经分离的多肽或其生物活性部分缺乏来自mut-PPO多肽所源自的同一生物的污染性多肽。典型地，此多肽通过例如在其它植物中或在微生物(诸如谷氨酸棒状杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中重组表达mut-PPO多肽来生产。
如上所述，本发明教导了用于使作物植物或种子较之其野生型品种具有增加的苯并嗪酮衍生物耐受性的组合物及方法。在优选的实施方案中，作物植物或种子的苯并
Figure BDA00003354044200811
嗪酮衍生物耐受性是增加的，使得该植物或种子可忍受优选地约1-1000g ai ha-1、更优选20-160g ai ha-1、且最优选40-80g ai ha-1的苯并
Figure BDA00003354044200812
嗪酮衍生物除草剂施用。如本文所使用的，“忍受”苯并
Figure BDA00003354044200813
嗪酮衍生物除草剂施用意为植物不由此施用而被杀灭或损伤。
此外，本发明提供涉及使用至少一种以上详细描述的苯并嗪酮衍生物除草剂的方法。
在这些方法中，可通过本领域技术中己知的任何方法施用苯并
Figure BDA00003354044200815
嗪酮衍生物除草剂，所述方法包括但不限于种子处理、土壤处理及叶处理。在施用之前，可将苯并
Figure BDA00003354044200816
嗪酮衍生物除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉剂、散剂、糊剂及颗粒剂。使用形式取决于具体的预期目的；在各情况下，应确保根据本发明的化合物细而均匀分布。
通过提供对苯并
Figure BDA00003354044200817
嗪酮衍生物除草剂具有增加的耐受性的植物，可以使用多种制剂来保护植物免遭杂草损害，以增强植物生长并且降低对养分的竞争。苯并嗪酮衍生物除草剂可单独用于出苗前、出苗后、种植前及种植时防治本文所述作物植物的周围区域中的杂草，或可使用含有其它添加剂的苯并
Figure BDA00003354044200819
嗪酮衍生物除草剂制剂。苯并嗪酮衍生物除草剂亦可用作种子处理剂。可用于苯并嗪酮衍生物除草剂制剂中的添加剂包括其它除草剂、去污剂、助剂、铺展剂(spreading agent)、粘着剂、稳定剂等。苯并
Figure BDA000033540442008112
嗪酮衍生物除草剂制剂可为湿或干制剂，可包括但不限于可流动粉剂、可乳化浓缩物及液体浓缩物。苯并
Figure BDA000033540442008113
嗪酮衍生物除草剂及除草剂制剂可根据常规方法，例如通过喷雾、灌溉、撒布等，施用。
合适的制剂详述于PCT/EP2009/063387和PCT/EP2009/063386中，其以引用的方式并入本文中。
也应当理解的是，上述内容涉及本发明的优选实施方案，可在不脱离本发明范畴的情况下在其中作出多种改变。通过以下实施例来对本发明进行进一步说明，所述实施例不应理解为以任何方式对本发明的范畴构成限制。相反，应明确理解的是，可采用多种其它的实施方案、修改方案及等价方案，在阅读本文说明书之后，本领域技术人员可以想到这些实施方案、修改及等价方案，而不脱离本发明的精神和/或随附的权利要求的范围。
实施例
实施例1：定点诱变苋属植物(Amaranthus)PPO
克隆苋属植物PPO
通过Geneart(Geneart AG,Regensburg,Germany)合成和克隆糙果苋(Amaranthus tuberculatus)的PPO易感和抗性同种型及突变组合的编码序列(SEQ ID No:1,3,5,7)。
通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中提取质粒，并通过DNA测序进行确认。
表达和纯化重组的野生型和突变PPO
(摘自:Franck E.Dayan,Pankaj R.Daga,Stephen O.Duke,Ryan M.Lee,Patrick J.Tranel,Robert J.Doerksen.在原卟啉原氧化酶α-8螺旋中的甘氨酸缺失对生物化学和结构造成的影响(Biochemical and structuralconsequences of a glycine deletion in theα-8helix of protoporphyrinogenoxidase).Biochimica et Biophysica Acta1804(2010),1548-56)
将pRSET载体中的克隆转化至大肠杆菌BL21(DE3)-pLysS菌株中。在250mL含100μg mL-1羧苄青霉素的LB中生长细胞，于37℃摇动过夜。用1L含抗生素的LB稀释培养物，在37℃摇动生长2小时，用1mM IPTG诱导，在25℃再摇动生长5小时。1600×g离心收获细胞，用0.09%NaCl洗涤，在-80℃保存。
在50mM磷酸钠pH7.5,1M NaCl,5mM咪唑,5%甘油,和1μgmL-1亮抑酶肽中，使用弗氏压碎器(French press)在140MPa裂解细胞。裂解后，加入0.5U benzonase(Novagen,EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ)和PMSF(终浓度为1mM)。通过在3000×g离心，清除细胞碎片。在用20mM磷酸钠pH8.0,50mM NaCl,5mM咪唑,5mMMgCl2,0.1mM EDTA,和17%甘油平衡了的镍活化的Hitrap螯合HP柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.,Piscataway,NJ)上，纯化带His标签的PPO蛋白质。
用250mM咪唑洗脱PPO。在用20mM磷酸钠缓冲液,pH7.5,5mM MgCl2,1mM EDTA,和17%甘油平衡了的PD-10柱(GE HealthcareBio-Sciences Corp.,Piscataway,NJ)上，对活性蛋白脱盐。从每升培养物获得约10mg纯的PPO，将其于-20℃保存直至在测定中使用。
PPO活性测定试验
PPO酶测定试验(非重组)。如前所述(Grossmann等2010)，从在暗处生长的玉米、龙葵(black nightshade)、牵牛花(morning glory)、和苘麻(velvetleaf)幼苗的胚芽鞘或芽(150g鲜重)提取PPO蛋白质(EC1.3.3.4)。在收获前，使幼苗在光下变绿2小时，以便以低叶绿素浓度在类囊体级分中达到最高比酶活力。在高叶绿素浓度下将发生显著的荧光猝灭，这限制了可用于测试的绿色类囊体的数量。采用1:4的鲜重/体积比以Braun搅拌器对植物材料进行冷匀浆。匀浆缓冲液由三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl(50mM;pH7.3),蔗糖(0.5M),氯化镁(1mM),乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)和牛血清白蛋白(2g L-1)组成。通过4层Miracloth过滤，于10000x g下离心5分钟后获得粗的质体制备物，将其重悬于匀浆缓冲液中后于150x g下离心2分钟以去除粗的细胞碎片。将上清液在4000x g下离心15分钟，将沉淀级分重悬于1ml包含Tris-HCl(50mM;pH7.3),EDTA(2mM),亮抑酶肽(2μM),抑胃酶肽(2μM)和甘油(200ml L-1)的缓冲液中，在-80℃保存直至使用。以牛血清白蛋白作为标准，测定酶提取物中的蛋白质。通过监测在初速度条件下从化学还原的原卟啉原IX形成Proto的速率，对PPO活性进行荧光计测定。测定混合物由总体积为200μl的Tris-HCl(100mM;pH7.3),EDTA(1mM),二硫苏糖醇(5mM),吐温80(0.085%),原卟啉原IX(2μM),和40μg提取的蛋白质组成。通过在22℃加入底物原卟啉原IX来起始反应。在二甲亚砜(DMSO)溶液中配制嘧啶肟草醚(Saflufenacil)、氟嗪酮(flumioxazin)和氟丙嘧草酯(butafenacil)(在本测定中0.1mM浓度的DMSO)，以浓度0.005pM至5μM加入测定混合物中后进行孵育。使用POLARstar Optima/Galaxy(BMG)，通过在405nm处激发和在630nm处监测发射，直接监测来自测定混合物的荧光。在热失活提取物存在时的非酶促活性可以忽略。以相对于未处理对照的抑制百分比，表示由除草剂诱导的酶活性抑制。通过使用非线性回归分析，将值拟合剂量反应公式，计算达到50%酶抑制所需的化合物摩尔浓度(IC50值)。
PPO酶测定试验(重组)。Proto购自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)。根据Jacobs和Jacobs(N.J.Jacobs,J.M.Jacobs,Assayfor enzymatic protoporphyrinogen oxidation,a late step in heme synthesis,Enzyme28(1982)206–219)的方法制备Protogen。在含0.1mM EDTA,0.1%吐温20,5μM FAD,和500mM咪唑的100mM磷酸钠pH7.4中进行测定。测量存在150μM Protogen时如下PPO抑制物的剂量反应曲线：氟锁草醚(acifluorfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、苯并
Figure BDA00003354044200842
嗪酮1.a.35、或优选的苯并嗪酮衍生物(其中X为O或S，R4为氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、C1-C6烷氧基或C3-C6环烷基-C1-C6烷基，R5为氢、NH2、C1-C6烷基或C3-C6炔基，R6为氢或C1-C6烷基，或其组合)。将激发和发射带宽分别设为1.5和30nm。所有测定重复2次或3次，使用POLARstar Optima/Galaxy(BMG)、通过在405nm处激发和在630nm处监测发射、进行测量。
具有替换的PPO酶的剂量反应(IC50)值大于野生型(不具有替换的)PPO酶的IC50值(表4a和4ab)。这表明，这些具有替换的PPO酶对苯并
Figure BDA00003354044200852
嗪酮和对某些所测试的苯并
Figure BDA00003354044200853
嗪酮衍生物具有固有抗性。该具有替换的PPO酶dG210和R128L是在糙果苋中发现的已知的经替换的PPO酶，其被证实负责植物体内对多种PPO除草剂的PPO抗性(Dayanet al.,2010,Biochimica et Biophysica Acta,1804:1548)。这表明，列出的比dG210或R128L具有更高IC50值的其它经替换的PPO酶也是负责植物体内对多种PPO除草剂的抗性的经替换的PPO酶，所述除草剂包括所列出的苯并
Figure BDA00003354044200855
嗪酮1.a.35(表4a)和苯并
Figure BDA00003354044200854
嗪酮衍生物(表4b)。与野生型PPO酶相比较，所有经替换的PPO酶都显示出相当的酶活性、每分钟荧光单位变化(FU/min)(表4a)。此外，经替换的PPO酶的所有活性值均大于经替换的PPO酶dG210。经替换的PPO酶dG210的活性足以使其在植物体内发挥作用。这表明，所指出的所有其它经替换的PPO酶也具有在植物体内发挥功能的足够活性。
表4a：野生型和经氨基酸替换的PPO酶对于抑制剂苯并
Figure BDA00003354044200856
嗪酮1.a.35的IC50(M)值。
Figure BDA00003354044200851
表4b：野生型和经氨基酸替换的PPO酶对于所列的苯并
Figure BDA00003354044200862
嗪酮衍生物的IC50(M)值。
Figure BDA00003354044200861
实施例2：筛选经诱变处理的藻类细胞以鉴定除草剂耐受性克隆和PPO基因中导致耐受性的突变。
为了在PPO基因中产生赋予苯并
Figure BDA00003354044200863
嗪酮衍生物除草剂抗性的突变，可以使用化学或UV诱变。尤其是诸如雷氏衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)或斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)等单细胞生物对鉴定除草剂抗性显性突变是有用的。
在TAP培养基(Gorman and Levine(1965)PNAS54:1665-1669)中于100rpm,22℃和30μmol Phot*m-2*s-2光照下持续振摇，繁殖雷氏衣藻株CC-503和CC-1691(Duke University,Durham,USA)的藻细胞。如前所述(Boger and Sandmann,(1993)，于Target assays for modernherbicides and15related phytotoxic compounds中,Lewis Publishers)，在藻类培养基中，于与用于雷氏衣藻所提到的相同培养条件下，繁殖斜生栅藻(University of Gottingen,Germany)。在450μmol Phot*m-2*s-2光照下进行化合物筛选。
如Loppes(1969,20Mol Gen Genet104:172-177)所述，用0.14M甲基磺酸乙酯(EMS)对雷氏衣藻或斜生栅藻的敏感株进行突变处理1小时。通过在含有低至致死浓度(取决于化合物在特定藻类株系中的活性)的目的苯并嗪酮衍生物除草剂的固体营养液平板上筛选经诱变处理的细胞，鉴定耐受性株系。
使用DNA寡核苷酸，通过标准PCR技术，以基因组DNA或拷贝DNA作为模板，自野生型和抗性雷氏衣藻扩增PPO基因。通过使用序列比对工具Align X(Vector NTI高级软件第10.3版,Invitrogene,Carlsbad,CA,USA)，比较野生型和突变的PPO序列，以鉴定突变。
图2显示选择对苯并
Figure BDA00003354044200872
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的雷氏衣藻株。(A)涂布于无选择试剂的固体培养基上的经诱变处理的细胞。(B)涂布于含有1x10-7M苯并
Figure BDA00003354044200873
嗪酮衍生物1.a.35的固体培养基上的经诱变处理的细胞。对苯并
Figure BDA00003354044200874
嗪酮衍生物除草剂具有抗性的细胞形成集落(圈出并编号为33,34,35和36)，而易感细胞不能生长。平板A上集落数量较平板B上的多，表明平板B上的集落对苯并
Figure BDA00003354044200875
嗪酮衍生物1.a.35具有抗性。
图3显示经选择的对苯并
Figure BDA00003354044200876
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的雷氏衣藻株的再生长。(A)在无选择试剂的液体培养基中的野生型细胞。(B)在含有递增的苯并嗪酮衍生物1.a.35(1x10-9至5x10-6M)的液体培养基中的野生型细胞。(C)在无选择试剂的液体培养基中的经诱变处理的细胞。(D1,D2,E1,E2)在含有递增的苯并
Figure BDA00003354044200878
嗪酮衍生物1.a.35(1x10-9至5x10-6M)的液体培养基中的经诱变处理和经选择的株系。对苯并
Figure BDA00003354044200879
嗪酮衍生物1.a.35除草剂具有抗性的株系培养至较暗的颜色，指示其生长。易感株系没有生长，保持浅色。在含有正在生长的细胞的液体培养基中较高的细胞密度是形成较暗颜色的原因。较低密度的培养物显得颜色较浅或完全透明。
实施例3.筛选经EMS诱变的拟南芥(Arabidopsis thaliana)群体以鉴定除草剂耐受性植物和鉴定PPO基因中的导致耐受性的突变。
从Lehle Seeds(Round Rock,TX,USA)获得经EMS处理的拟南芥植物的M2群体。通过将拟南芥种子种在含有0.5%凝胶剂
Figure BDA00003354044200881
及苯并
Figure BDA00003354044200882
嗪酮衍生物除草剂(0.1至500μM，取决于化合物活性)的半浓度murashige skoog营养液上，进行筛选。在22℃以16:8h的光:暗周期在生长室中孵育平板不超过3周。将显示不太强烈的漂白表型的耐受性植物种植于土壤中且在温室条件下生长至成熟。在莲座状植物阶段，从苯并嗪酮衍生物除草剂耐受性植物收集叶盘，用于用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)分离基因组DNA或用RNeasy Plant Mini Kit(Quagen,Hilden,Germany)分离总mRNA。
通过标准PCR技术，使用相应寡核苷酸从基因组DNA扩增PPO序列。对于从mRNA扩增PPO，用Superscript III逆转录酶(Invitrogene,Carlsbad,CA,USA)体外合成cDNA。在将PCR产物克隆在标准测序质粒中后，通过标准测序技术，鉴定突变的PPO基因的DNA序列。通过用序列比对工具Align X(Vector NTI高级软件第10.3版,Invitrogene,Carlsbad,CA,USA)，比较野生型与突变的PPO序列来鉴定突变。
实施例4.工程化构建含有野生型或突变的PPO序列的苯并嗪酮衍生物除草剂耐受性植物
通过Olhoft等(美国专利号2009/0049567)所述的方法，生产苯并
Figure BDA00003354044200885
嗪酮衍生物除草剂耐受性大豆(Glycine max)植物。使用如由Sambrook等(Molecular cloning(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述的标准克隆技术，将突变的PPO序列克隆到二元载体中，所述二元载体包含在泛素启动子(PcUbi)和胭脂碱合酶终止子(NOS)序列之间的抗性标记基因盒(例如AHAS)和突变的PPO序列(标为GOI)。将二元质粒引入到根癌农杆菌中用于植物转化。通过农杆菌介导的转化，将质粒构建体引入大豆幼苗外植体主节(primary node)处的腋生分生组织细胞中。在接种并与农杆菌共培养之后，将外植体转移至无选择物的芽诱导培养基中培养1周。随后将外植体转移至含有1-3μM灭草烟(imazapyr)(Arsenal)的芽诱导培养基中培养3周，以选择经转化的细胞。然后将主节处具有健康的愈伤组织/芽垫(shoot pad)的外植体转移至含有1-3μM灭草烟(imazapyr)的芽伸长培养基中，直至芽伸长或外植体死亡。使转基因小植物生根，经TaqMan分析转基因的存在，转移到土壤中，在温室中生长至成熟。通过McElver和Singh(WO2008/124495)描述的方法转化玉米植物。经由农杆菌介导的转化，将含有突变的PPO序列的植物转化载体构建体引入到玉米未成熟胚中。
在补充有0.5-1.5μM咪草烟(imazethapyr)的选择培养基上选择经转化的细胞3-4周。转基因小植物在植物再生培养基上再生并随后生根。对转基因小植物进行TaqMan分析转基因的存在，之后移植至盆栽混合物中并且在温室中生长至成熟。通过如由McElver和Singh(WO2008/124495)描述的花浸蘸法，用突变的PPO序列转化拟南芥。通过由Peng等(US6653529)描述的原生质体转化，进行稻(Oryza sativa)转化。在温室研究中，测试含有突变的PPO序列的大豆、玉米、稻及拟南芥的T0或T1转基因植物对PPO衍生除草剂的改善的耐受性。
实施例5.功能互补和筛选测定试验
(也见：William L.Patzoldt,Aaron G.Hager,Joel S.McCormick和Patrick J.Tranel.A codon deletion confers resistance to herbicidesinhibiting protoporphyrinogen oxidase.PNAS103(33),12329-34)
构建PPO文库：
通过随机诱变(易错PCR)或PPO基因的饱和诱变(Geneart AG,Regensburg,Germany)，构建PPO基因文库，克隆到表达载体(pBAD-TOPO)中用于进行体内筛选。此外，将截短形式的野生型和突变PPO基因克隆到pBAD-TOPO表达载体(Invitrogen)中，以使翻译在第二个ATG起始密码子处开始。使用包含核糖体结合位点(AGGA)及ATG起始密码子的正向引物5-CAGGAATAAGTAATGGGCAACATTTCTGAG-3和包含终止密码子的反向引物5-GAAGAATTACGCGGTCTTCTCATC-3，对PPO cDNA进行PCR扩增。使用易感的和推定具有耐受性的PPO质粒转化大肠杆菌的hemG突变株SASX38(由Harry Dailey(Universityof Georgia,Athens,GA)馈赠)。在补加有20μg*ml-1羟高铁原卟啉的LB培养基上培养SASX38大肠杆菌菌株。测试SASX38的经转化的克隆及未经转化的对照，在单独的LB培养基上、或补加20μg*ml-1羟高铁原卟啉的LB培养基上、或含0.01至500μM的PPO抑制剂乳氟禾草灵(lactofen)和苯并嗪酮衍生物除草剂的LB培养基上，于37℃孵育14小时后的生长能力。
使用大肠杆菌hemG(PPO)突变株SASX38(Sasarman,A.,Chartrand,P.,Lavoie,M.,Tardif,D.,Proschek,R.&Lapointe,C.(1979)J.Gen.Microbiol.113,297–303.)进行互补和筛选测定试验，以评估PPO突变对PPO除草剂反应的影响。SASX38菌株生长非常缓慢，除非供给外源血红素或以替代性PPO源进行挽救。此外，因为野生型大肠杆菌天然对PPO抑制剂具有耐受性，使用SASX38菌株可以对来自糙果苋的野生型和突变PPO的除草剂敏感性进行相对直接的测定。用编码野生型和突变PPO的质粒构建体转化SASX38大肠杆菌株。构建体能够挽救SASX38大肠杆菌菌株的生长，由此表明PPO基因编码功能性蛋白质。然而，在生长培养基中添加苯并
Figure BDA00003354044200902
嗪酮衍生物除草剂急剧地抑制了野生型PPO转化的大肠杆菌的生长，但不抑制某些突变PPO转化的大肠杆菌的生长。
实施例6.组织培养条件
已经开发了体外组织培养诱变测定试验来分离和表征对原卟啉原氧化酶抑制性除草剂(例如嘧啶肟草醚(saflufenacil)、治草醚(bifenox)、敌草隆(diuron)、乳氟禾草灵(lactofen)、氟丙嘧草酯(butafenacil))具有耐受性的植物组织(例如玉米和稻组织)。该测定使用在体外组织培养中发现的体细胞无性系变异。可以通过化学诱变和其后在浓度渐增的除草剂上逐步筛选，以增强源自体细胞无性系变异的自发突变。
本发明提供了用于促进可再生的脆弱胚发生玉米或稻愈伤组织生长的组织培养条件。愈伤组织起始于4个不同的玉米或稻栽培种，分别包括玉蜀黍(Zea mays)以及Japonica(Taipei309,Nipponbare,Koshihikari)和Indica(Indica1)品种。将种子在70%乙醇中处理约1分钟，随后以20%商用Clorox漂白剂处理20分钟，以对其进行表面消毒。以无菌水清洗种子，铺置于愈伤组织诱导培养基上。测试各种愈伤组织诱导培养基。所测试的培养基的成分列于表5中。
表5
Figure BDA00003354044200911
在对大量的变量进行测试后，选择R001M愈伤组织诱导培养基。在30℃于暗中保持培养物。10-14天后，将胚发生愈伤组织传代至新鲜培养基上。
实施例7.筛选除草剂耐受性愈伤组织
在确定组织培养条件后，使用嘧啶肟草醚(saflufenacil)、治草醚(bifenox)、敌草隆(diuron)、乳氟禾草灵(lactofen)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、苯并
Figure BDA00003354044200931
嗪酮衍生物除草剂，在杀伤曲线中分析组织存活，以进一步建立筛选条件。仔细考虑除草剂在组织中的累积以及其在细胞和培养基中的留存性和稳定性。通过这些实验，确立了用于突变材料最初筛选的亚致死剂量。
在建立嘧啶肟草醚(saflufenacil)、治草醚(bifenox)、敌草隆(diuron)、乳氟禾草灵(lactofen)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟锁草醚(acifluorfen)、苯并
Figure BDA00003354044200932
嗪酮衍生物除草剂在筛选培养基中的起始剂量后，以每次转移增加PPO抑制物浓度的方式逐步地筛选组织，直到重获在毒性剂量下生长旺盛的细胞。在含有筛选试剂的R001M中对所获得的愈伤组织进一步进行每3-4周的传代。对超过26,000个的愈伤组织进行4-5次传代选择，直到选择压力高于通过杀伤曲线和连续培养物的观察结果确定的毒性水平。
备选地，液体培养物在MS711R中开始于愈伤组织，期间缓慢摇动及每周传代。一旦液体培养物建立后，将筛选试剂直接加到每次传代的烧瓶中。经过2-4轮液体筛选后，将培养物转移到固体R001M培养基上的滤膜上进行进一步生长。
实施例8.再生植物
再生耐受性组织，并对其进行有关PPO基因序列突变的分子表征和/或有关在存在选择试剂下PPO活性改变的生化表征。此外，也对直接和/或间接涉及四吡咯生物合成和/或代谢路径中的基因进行测序，以表征突变。最后，对改变命运(例如代谢、转运、运输)的酶进行测序，以表征突变。
在除草剂筛选后，使用如下培养基方案再生愈伤组织：R025M培养10–14天；R026M培养约2周；R327M培养直到出现良好形成的芽；R008S培养直到芽生根良好以转移到温室。再生在光下进行。在再生期间不加入筛选试剂。
一旦形成强壮的根后，将M0再生植物移植到温室内的方形或圆形盆中。移植植物罩以透明塑料杯直到它们适应温室条件。将温室设置为日/夜周期为27℃/21℃(80°F/70°F)，用600W高压钠灯补光以维持14小时的日长。视天气，根据需要给植物浇水，和每天施肥。
实施例9.序列分析
从分开用于移植的克隆植物收集叶片组织，并单个地进行分析。使用
Figure BDA00003354044200941
96Magnetic DNA Plant System试剂盒(Promega,美国专利号6,027,945及6,368,800)，按生产商的指导，提取基因组DNA。使用合适的正向和反向引物对分离的DNA进行PCR扩增。
使用Hotstar Taq DNA聚合成酶(Qiagen)，采用如下touchdown热循环程序，进行PCR扩增：96°C15分钟；接着进行35个循环(96°C30秒；58°C–0.2°C/循环，30秒；72°C，3分30秒)，72°C，10分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的浓度和片段大小。使用PCR引物(DNA Landmarks,或Entelechon)对去磷酸化的PCR产物直接测序进行分析。使用Vector NTI Advance10TM(Invitrogen)分析色谱峰图(trace file)(.scf)，鉴定相对于野生型的突变。基于序列信息，在几个个体中鉴定突变。对代表性色谱进行序列分析，以默认设置进行相应的AlignX比对并进行编辑以识别（call）次级峰。
实施例10.证实除草剂耐受性
将筛选的突变体及逃逸株(escape)转移到小盆中。从种子萌发野生型栽培种作为对照。
在移植后约3周，使用track喷雾器(track sprayer)向M0再生植物喷洒添加有0.1%甲基化种子油的嘧啶肟草醚(saflufenacil)(BAS800H)或苯并嗪酮衍生物I.a.35。在植物适应温室条件后，对一个小组的植物再次喷洒嘧啶肟草醚(BAS800H)或苯并
Figure BDA00003354044200952
嗪酮衍生物I.a.35。喷洒后，使植物保持干旱状态24小时，之后再次浇水和施肥。对喷洒过的植物照相，在处理后1和2周评估除草剂损伤级别。
实施例11.使用组织培养进行除草剂筛选
按如上所述，选择培养基以应用和开发杀伤曲线。可以使用不同的技术进行筛选。采用逐步筛选，或采用除草剂的临致死水平。在每种情况下，对于每轮新的筛选，转移所有愈伤组织。筛选为4-5轮的培养，每轮3-5周。将愈伤组织置于尼龙膜上以便于转移(200微米孔径膜,Biodesign,Saco,Maine)。裁剪膜以适合100x20mm大小的培养皿，使用前进行高压蒸汽灭菌，每个培养皿中放置25-35块愈伤组织(每块愈伤组织的平均重量为22mg)。此外，在液体培养基中以每周传代的方式对一组愈伤组织进行筛选，然后在半固体培养基上进行进一步筛选。
使用嘧啶肟草醚(BAS800H)或苯并
Figure BDA00003354044200953
嗪酮衍生物I.a.35筛选突变体品系。根据产生可再生突变品系的愈伤组织的百分比、或根据以每克所使用组织计的品系数，获得突变体的效率是高的。总的来说，突变频率较之海滨雀稗(seashore paspalum)为5倍，较之玉米为2倍。

Claims (22)

1.用于控制植物栽培场所的非期望植物的方法，所述方法包括步骤：
a)在该场所提供包含至少一个核酸的植物，其中所述核酸包含编码对“苯并嗪酮衍生物除草剂”具有抗性或耐受性的突变原卟啉原氧化酶(mut-PPO)或野生型原卟啉原氧化酶的核苷酸序列；
b)向该场所施用有效量的所述除草剂。
2.根据权利要求1的方法，其中a)的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45的序列、或其变体或衍生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述植物包含至少一个额外的异源核酸，所述异源核酸包含编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求1至3之任一的方法，其中苯并
Figure FDA00003354044100012
嗪酮衍生物除草剂连同一种或多种其它PPO靶向除草剂一起施用。
5.通过使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45的核酸或其变体或衍生物编码的mut-PPO鉴定苯并嗪酮衍生物除草剂的方法。
6.根据权利要求5的方法，所述方法包括步骤：
a)生成包含编码mut-PPO的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-PPO；
b)对a)的转基因细胞或植物和对相同品种的对照细胞或植物施用苯并
Figure FDA00003354044100013
嗪酮衍生物除草剂；
c)测定施用所述测试化合物之后转基因细胞或植物及该对照细胞或植物的生长或生存力，及
d)选择使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低的测试化合物。
7.鉴定编码对苯并
Figure FDA00003354044100021
嗪酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)生成mut-PPO编码核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸且用苯并嗪酮衍生物处理所述细胞或植物。筛选所得的mut-PPO编码核酸群体，
c)比较由所述mut-PPO编码核酸群体提供的苯并
Figure FDA00003354044100023
嗪酮衍生物耐受性水平与由对照PPO编码核酸提供的苯并
Figure FDA00003354044100024
嗪酮衍生物耐受性水平，
d)选择至少一个mut-PPO编码核酸，其较之对照PPO编码核酸提供对苯并
Figure FDA00003354044100025
嗪酮衍生物的显著增加的耐受性水平。
8.根据权利要求7的方法，其中较之由对照PPO编码核酸提供的对苯并
Figure FDA00003354044100026
嗪酮衍生物除草剂的耐受性，步骤d)中选出的mut-PPO编码核酸提供至少2倍的对苯并
Figure FDA00003354044100027
嗪酮衍生物除草剂的耐受性。
9.根据权利要求7或8的方法，其中通过产生包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物和比较所述转基因植物与对照植物，而确定抗性或耐受性。
10.编码mut-PPO的经分离的核酸，其中该核酸可通过权利要求7至9之任一所定义的方法鉴定。
11.根据权利要求10的核酸，其中所编码的mut-PPO是SEQ ID NO:2的变体，它包括以下一者或多者：位置128的氨基酸不是精氨酸；位置175的氨基酸不是甘氨酸；位置209的氨基酸不是甘氨酸；位置210的氨基酸不是甘氨酸；位置295的氨基酸不是亮氨酸；位置296的氨基酸不是丝氨酸；位置334的氨基酸不是亮氨酸；位置353的氨基酸不是苯丙氨酸；位置382的氨基酸不是甘氨酸；位置384的氨基酸不是亮氨酸；位置397的氨基酸不是亮氨酸，位置398的氨基酸不是甘氨酸，位置399的氨基酸不是苏氨酸，位置400的氨基酸不是亮氨酸，位置402的氨基酸不是丝氨酸，位置403的氨基酸不是丝氨酸，位置404的氨基酸不是甲硫氨酸，位置405的氨基酸不是甲硫氨酸，位置420的氨基酸不是苯丙氨酸，位置439的氨基酸不是苯丙氨酸。
12.通过野生型或mut-PPO核酸转化的转基因植物细胞，其中该核酸在植物细胞中的表达导致，较之该植物细胞的野生型品种，对苯并
Figure FDA00003354044100031
嗪酮衍生物除草剂的增加抗性或耐受性。
13.权利要求12的转基因植物细胞，其中野生型或mut-PPO核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45所示的多核苷酸、或其变体或衍生物；b)编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46所示的多肽或其变体或衍生物的多核苷酸；c)包含a)或b)之任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及d)与a)至c)之任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
14.根据权利要求13的转基因植物细胞，其中b)中SEQ ID NO:2的多肽的变体包括以下一者或多者：位置175的氨基酸不是甘氨酸；位置209的氨基酸不是甘氨酸；位置210的氨基酸不是甘氨酸；位置295的氨基酸不是亮氨酸；位置296的氨基酸不是丝氨酸；位置334的氨基酸不是亮氨酸；位置353的氨基酸不是苯丙氨酸；位置382的氨基酸不是甘氨酸；位置384的氨基酸不是亮氨酸；位置397的氨基酸不是亮氨酸，位置398的氨基酸不是甘氨酸，位置399的氨基酸不是苏氨酸，位置400的氨基酸不是亮氨酸，位置402的氨基酸不是丝氨酸，位置403的氨基酸不是丝氨酸，位置404的氨基酸不是甲硫氨酸，位置405的氨基酸不是甲硫氨酸，位置420的氨基酸不是苯丙氨酸，位置439的氨基酸不是苯丙氨酸。
15.包含权利要求12至14中定义的植物细胞的转基因植物，其中所述核酸在该植物中的表达导致，较之植物的野生型品种，该植物对苯并
Figure FDA00003354044100032
嗪酮衍生物除草剂的抗性增加。
16.表达包含SEQ ID NO:2的经诱变的或重组的mut-PPO的植物，其中所述mut-PPO的氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置上不同于相应野生型植物的野生型PPO的氨基酸序列，其中位置175的氨基酸不是甘氨酸；位置209的氨基酸不是甘氨酸；位置210的氨基酸不是甘氨酸；位置295的氨基酸不是亮氨酸；位置296的氨基酸不是丝氨酸；位置334的氨基酸不是亮氨酸；位置353的氨基酸不是苯丙氨酸；位置382的氨基酸不是甘氨酸；位置384的氨基酸不是亮氨酸；位置397的氨基酸不是亮氨酸，位置398的氨基酸不是甘氨酸，位置399的氨基酸不是苏氨酸，位置400的氨基酸不是亮氨酸，位置402的氨基酸不是丝氨酸，位置403的氨基酸不是丝氨酸，位置404的氨基酸不是甲硫氨酸，位置405的氨基酸不是甲硫氨酸，位置420的氨基酸不是苯丙氨酸，位置439的氨基酸不是苯丙氨酸，其中当所述PPO在植物中表达时，使得该植物较之其相应的野生型品种对苯并
Figure FDA00003354044100041
嗪酮衍生物除草剂具有增加的耐受性。
17.由包含权利要求12至14中定义的植物细胞的转基因植物或由权利要求15或16中定义的植物产生的种子，其中就较之该种子的野生型品种具有对苯并
Figure FDA00003354044100042
嗪酮衍生物除草剂的增加的抗性而言，该种子是纯种的。
18.产生转基因植物细胞的方法，其中所述转基因植物细胞，较之该植物细胞的野生型品种，具有对苯并
Figure FDA00003354044100043
嗪酮衍生物除草剂增加的抗性，所述方法包括用包含mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞。
19.生产转基因植物的方法，其包括：(a)用包含mut-PPO核酸的表达盒转化植物细胞，及(b)从植物细胞产生对苯并
Figure FDA00003354044100044
嗪酮衍生物除草剂具有增加的抗性的植物。
20.权利要求18或19的方法，其中mut-PPO核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45所示的多核苷酸、或其变体或衍生物；b)编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、或46所示的多肽或其变体或衍生物的多核苷酸；c)包含a)或b)之任一多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及d)与a)至c)之任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
21.权利要求18至20之任一的方法，其中表达盒还包含在植物中具有功能的转录起始调控区及翻译起始调控区。
22.鉴定或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括：i)提供经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、或45所示的多核苷酸或其变体或衍生物，其中该多核苷酸编码用作选择标记的mut-PPO多肽，其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可以包含其它经分离的多核苷酸；ii)使经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种苯并
Figure FDA00003354044100051
嗪酮衍生物化合物接触；iii)确定该植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制性化合物影响；以及iv)鉴定或选择该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
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