BR112020011954A2 - composição e método para conferir e/ou intensificar tolerância de herbicidas usando variantes de protoporfirinogênio ix oxidase de cianobactérias - Google Patents

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Abstract

É fornecida uma tecnologia para conferir tolerância intensificada e/ou intensificação de tolerância a um herbicida de uma planta e/ou alga usando variantes de aminoácidos de protoporfirinogênio IX oxidase derivada de procariontes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA CONFERIR E/OU INTENSIFICAR
TOLERÂNCIA DE HERBICIDAS USANDO VARIANTES DE PROTOPORFIRINOGÊNIO IX OXIDASE DE CIANOBACTÉRIAS” [Campo técnico]
[001] São fornecidas variantes de PPO de uma protoporfirinogênio IX oxidase derivada de um procarionte, e tecnologia para conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas usando as mesmas. [Fundamentos da Técnica]
[002] Uma via biossintética de porfirina serve para a síntese de clorofila e heme, que desempenham papéis vitais no metabolismo das plantas, e ocorre no cloroplasto. Nessa via, a protoporfirinogênio IX oxidase (daqui por diante referida PPO; EC: 1.3.3.4) catalisa a oxidação de protoporfirinogênio IX à protoporfirina IX. Após a oxidação do protoporfirinogênio IX à protoporfirina IX, a protoporfirina IX se liga ao magnésio pela Mg-quelatase para sintetizar a clorofila ou liga-se ao ferro pela Fe-quelatase para sintetizar o heme.
[003] Portanto, quando a atividade de PPO é inibida, a síntese de clorofilas e heme é inibida e o substrato protoporfirinogênio IX deixa a via biossintética normal da porfirina, resultando na rápida exportação de protoporfirinogênio IX do cloroplasto para o citoplasma, e no acúmulo citoplasmático de protoporfirina IX oxidada por peroxidases inespecíficas e auto-oxidação. A protoporfirina IX acumulada gera oxigênio singleto altamente reativo (?O>z) na presença de moléculas de luz e oxigênio que destroem a membrana celular e levam rapidamente à morte celular da planta. Com base nesse princípio, herbicidas que inibem a atividade da PPO foram desenvolvidos. Até agora, havia 10 famílias de herbicidas inibidores da PPO, incluindo pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N- fenilftalimidas, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinadionas e outros herbicidas, que são classificados de acordo com suas estruturas químicas.
[004] Adicionalmente, a fim de evitar os efeitos desses herbicidas no crescimento das culturas durante o uso dos herbicidas, é necessário fornecer tolerância aos herbicidas para as culturas.
[005] Enquanto isso, as algas são organismos fotossintéticos que podem converter energia luminosa em energia química que pode ser usada para sintetizar vários compostos úteis. Por exemplo, as algas podem fixar carbono por fotossíntese e converter dióxido de carbono em açúcar, amido, lipídios, gorduras ou outras biomoléculas, removendo assim gases de efeito estufa da atmosfera. Além disso, o cultivo em larga escala de algas pode produzir uma variedade de substâncias, tais como, enzimas industriais, compostos e proteínas terapêuticas, nutrientes, materiais comerciais e combustíveis.
[006] No entanto, no caso de cultivo em larga escala de algas em um biorreator ou em um lago aberto ou fechado, a contaminação pode ocorrer por organismos competentes indesejados, por exemplo, algas, fungos, rotíferos ou zooplânctons indesejados.
[007] Assim, é necessária uma tecnologia para colher plantas e/ou algas desejadas em larga escala, tratando herbicidas em uma concentração que inibiria o crescimento de organismos competentes sem tolerância de herbicidas, depois de conferir tolerância a herbicida às plantas e/ou algas desejadas.
[Referências]
[008] (Documento pertencente à patente 1) US 6.308.458 (30.10.2001)
[009] (Documento pertencente à patente 2) US 6.808.904 (26/10/2004)
[0010] (Documento pertencente à patente 3) US 7.563.950 (2007.07.21)
[0011] (Documento pertencente à patente 4) WO2011/085221 (2011.07.14)
[0012] (Documento não pertencente à patente 1) Li X, Volrath SL, Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Desenvolvimento de protoporfirinogênio IX oxidase como um marcador de seleção eficiente para a transformação de milho mediada por agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 133: 736-747, 2003. [Divulgação] [Problema Técnico]
[0013] Nessa divulgação, verificou-se que os genes PPO do tipo hemY derivados de procariontes e mutantes dos mesmos mostram uma ampla tolerância a herbicida aos herbicidas inibidores do protoporfirinogênio IX oxidase (PPO), sugerindo que o gene da PPO do tipo hemY pode conferir e/ou intensificar tolerância a herbicida quando é introduzido em uma planta e/ou algas.
[0014] Uma modalidade fornece uma variante de polipeptídeo compreendendo: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende a exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais de aminoácidos selecionados de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados em sítios de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 interagindo com o herbicida inibidor da PPO), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%
de identidade com a sequência de aminoácidos.
[0015] O pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 envolvido na interação com um herbicida inibidor da PPO, pode ser pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R85, F156, V160, Al62, Gl163, V305, C307, F324, L327, L337, 1340, e F360, da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0016] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, a variante compreendendo: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende a exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácido(s) selecionado(s) de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados em sítios de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 interagindo com o herbicida inibidor da PPO), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0017] O pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 afetando a interação com um herbicida inibidor da PPO, SEQ
ID NO: 3, pode ser pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em R88, F160, V164, Al66, Gl67, V304, c306, F323, L326, L336, 1339, e F359, da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0018] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo.
[0019] Outra modalidade fornece um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo.
[0020] Outra modalidade fornece uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.
[0021] Outra modalidade fornece uma composição para conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas, compreendendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste em: uma variante de polipeptídeo tendo modificação para SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com 95% ou mais, 96% ou mais 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou identidade de sequência superior com a variante de polipeptídeo; um polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo ou o polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais identidade de sequência com a variante de polipeptídeo; um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo;
e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.
[0022] Em uma modalidade concreta, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 pode compreender a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 pode compreender a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 4; mas os polinucleotídeos podem não estar limitados aos mesmos.
[0023] O herbicida pode ser um herbicida que inibe uma atividade do protoporfirinogênio IX oxidase.
[0024] Por exemplo, o herbicida pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N-fenilftalimidas, fenilésteres, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinadionas e outros herbicidas, mas não estar limitado aos mesmos.
[0025] Em uma modalidade específica, o herbicida pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em tiafenacil, butafenacil, saflufenacil, benzfendizona, fomesafen, oxifluorfen, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifen, lactofen, clometoxifenen, clornitrofen, fluoroglicofen-etil, fluazolato, flumioxazin, cinidon-etil, flumiclorac--pentil, fluthiacet, tidiazimin, oxadiargil,
oxadiazon, carfentrazona, sulfentrazona, trifludimoxazin, azafenidin, pentoxazona, piraclonil, flufenpir-etil, profluazol, fenopilato (2, 4-diclorofenil 1- pirrolidinacarboxilato), análogos de carbamato de fenopilato (por exemplo, análogos de O-fenilpirrolidina e piperidinacarbamato (referir-se “Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992”)), sais aceitáveis em agricultura e combinações dos mesmos, mas não se limitando aos mesmos.
[0026] A planta pode se referir a um organismo eucariótico multicelular tendo capacidade fotossintética, que pode ser uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, ou pode ser uma planta herbácea ou lenhosa. As algas podem se referir a organismos unicelulares tendo capacidade fotossintética, que podem ser algas procarióticas ou algas eucarióticas.
[0027] Em uma modalidade, as plantas ou as algas podem ser manipuladas geneticamente, a fim de compreender adicionalmente um segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância de herbicidas, em que a tolerância a herbicida ao segundo herbicida pode ser conferida e/ou intensificada. As plantas ou algas, que são manipuladas geneticamente para compreender o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância de herbicidas, pode ser preparada usando o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância de herbicidas, além da composição acima mencionada para conferir e/ou intensificar a tolerância de herbicidas. Assim, uma composição para conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida pode compreender adicionalmente o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida.
[0028] Exemplos do segundo herbicida podem compreender herbicidas inibidores da divisão celular, herbicidas inibidores da fotossíntese, herbicidas inibidores da síntese de aminoácidos, herbicidas inibidores de plastídios, herbicidas inibidores da membrana celular e semelhantes, mas não se limitam aos mesmos.
[0029] Em uma modalidade específica, o segundo herbicida pode ser exemplificado por glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), isoxaflutol, herbicida inibidor da ALS (acetolactato sintase), herbicida inibidor do fotossistema II, ou herbicida à base de fenilureia, herbicida à base de bromoxinil ou combinações dos mesmos, mas não se limitam aos mesmos.
[0030] Por exemplo, o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado por pelo menos um selecionado do grupo que consiste em EPSPS tolerante a herbicida glifosato (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase resistente a glifosato), GOX (glifosato oxidase), GAT (glifosato oxidase), GAT (glifosato-N-acetiltransferase) ou glifosato descarboxilase); PAT tolerante a herbicida glufosinato (fosfinotricina-N-acetiltransferase); DMO tolerante a herbicida dicamba (dicamba monooxigenase); 2,4- D monooxigenase ou AAD (ariloxialcanoato dioxigenase tolerante a herbicida 2,4-D; ALS (acetolactato sintase) tolerante a herbicida com base em sufonilureia inibidor de ALS, AHAS (aceto-hidroxiácido sintase) ou AtAHASL (subunidade grande de aceto-hidroxiácido sintase de Arabidopsis thaliana); proteína Dl do fotossistema II tolerante a herbicida, que inibe o fotossistema II; citocromo P450 tolerante a herbicida à base de fenilureia; HPPD tolerante a herbicida inibidor de plastídeos (hidroxifenilpiruvato dioxigenase); nitrilase tolerante a herbicida bromoxinil; e combinações dos mesmos, mas não limitado aos mesmos.
[0031] Além disso, o gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado por pelo menos um selecionado do grupo que consiste no gene cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 ou gat4621 tolerante a herbicida; gene bar, pat ou pat (SYN) tolerante a herbicida glufosinato; gene dmo tolerante a herbicida dicamba; gene AAD-l1, AAD-12 tolerante a herbicida 2,4-D; ALS tolerante a herbicida à base de sulfonilureia que inibe ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-l, Csrl-2, SurA ou SurB; gene psbA tolerante a herbicida inibidor do fotossistema II; gene CYP76B1l tolerante a herbicida fenilureia; gene HPPDPF W336 tolerante a herbicida isoxaflutol e gene bxn tolerante a herbicida bromoxinil; e combinações dos mesmos, mas não limitado aos mesmos.
[0032] Outra modalidade fornece um transformante de plantas e/ou algas tendo tolerância de herbicidas, que é transformada com o polinucleotídeo, ou um clone ou progênie do mesmo.
[0033] Outra modalidade fornece um método para preparar uma planta transgênica ou uma alga transgênica tendo tolerância a herbicida ou tolerância a herbicida intensificada, compreendendo uma etapa de transformação de plantas e/ou algas com o polinucleotídeo.
[0034] Outra modalidade fornece um método para conferir ou aumentar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas, compreendendo uma etapa de transformação de plantas e/ou algas com o polinucleotídeo.
[0035] A transformação pode ser realizada em uma alga e/ou uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.
[0036] O transformante pode ser uma alga e/ou uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.
[0037] Outra modalidade fornece um método para controlar ervas daninhas em uma terra de cultivo compreendendo: fornecer uma planta para a terra de cultivo, em que a planta compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste no polipeptídeo, a variante do polipeptídeo, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, um polinucleotídeo que codifica a variante, um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e um célula recombinante que compreende o vetor recombinante; e aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase nas terras de cultivo.
[0038] Em uma modalidade específica, a etapa de aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase às terras de cultivo pode ser realizada aplicando uma quantidade eficaz de pelo menos dois herbicidas inibidores da protoporfirinogênio IX oxidase sequencialmente ou simultaneamente.
[0039] Em outra modalidade, a planta pode ser manipulada geneticamente de modo a compreender adicionalmente um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida e uma quantidade eficaz do herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase e o segundo herbicida pode ser aplicado sequencialmente ou simultaneamente.
[0040] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo indesejado de um meio de cultura, compreendendo fornecer uma alga a um meio de cultura, em que as algas compreendem pelo menos um selecionado do grupo que consiste no polipeptídeo, a variante do polipeptídeo, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, um polinucleotídeo que codifica a variante, um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante; e aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase ao meio de cultura.
[Solução Técnica]
[0041] É fornecida uma tecnologia que confere «e/ou intensifica a tolerância a herbicida de plantas ou algas.
[0042] Como usado nesse documento, "conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas ou algas” ou “intensificar a tolerância a herbicida de plantas ou algas'” pode ser interpretado como conferindo tolerância a herbicida a uma planta ou algas que não têm tolerância a herbicida e/ou fortalecer mais a tolerância a herbicida de plantas ou algas que tenham tolerância de herbicidas.
[0043] Como usado nesse documento, 'consistindo em uma sequência” ou 'compreendendo uma sequência" pode ser usado para cobrir ambos os casos de compreender a sequência descrita e/ou necessariamente compreender a sequência, mas não se destina a excluir a compreensão de outra sequência que não seja a sequência descrita.
[0044] Uma modalidade fornece uma variante de polipeptídeo que é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em:
[0045] uma variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais de aminoácidos selecionados de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados nos sítios de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 interagindo com o herbicida inibidor da PPO), ou um sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de 95% ou mais 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais com a sequência de aminoácidos; e
[0046] uma variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO:
3, em que a modificação compreende exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais de aminoácidos selecionados de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados nos sítios de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 interagindo com o herbicida inibidor da PPO) ou um sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de 95% ou mais 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais com a sequência de aminoácidos.
[0047] Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou 3, um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante. O polinucleotídeo pode ser projetado de modo a compreender um códon que é otimizado para uma célula a ser transformada. O códon otimizado pode ser facilmente conhecido por um habilitado na técnica (por exemplo, referir-se “http://www.genscript.com/codon- opt.html”, “http://sg.idtdna.com/CodonOpt“, etc.).
[0048] Outra modalidade fornece uma composição para conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas, compreendendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste em:
uma variante de polipeptídeo tendo modificação para SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou identidade de sequência maior que a variante de polipeptídeo; um Ppolinucleotideo que codifica a variante de polipeptídeo ou o polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais identidade de sequência com a variante de polipeptídeo; um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo; e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.
[0049] Em uma modalidade concreta, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 pode compreender a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 pode compreender a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 4; mas os polinucleotídeos podem não estar limitados aos mesmos.
[0050] Em outra modalidade, é fornecido um transformante de plantas e/ou algas com tolerância de herbicidas, que é transformada com o polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. o polinucleotídeo pode ser projetado para compreender um códon que é otimizado para uma célula a ser transformada. O códon otimizado pode ser facilmente conhecido por uma pessoa habilitada na técnica (por exemplo, refere-se a “http://www.genscript.com/codon-opt.html”, “http://sg.idtdna.com/CodonOpt”, etc.), etc.).
[0051] Outra modalidade fornece um método para preparar uma planta transgênica ou uma alga transgênica tendo tolerância a herbicida ou tolerância a herbicida intensificada, compreendendo uma etapa de transformação de uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta ou alga, com o polinucleotídeo.
[0052] Outra modalidade fornece um método para conferir ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas, compreendendo uma etapa de transformação de uma célula, protoplastos, calos, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta ou alga, com o polinucleotídeo.
[0053] Os polipeptídeos da SEQ ID NO: 1 e 3 descritos nesse documento são proteínas PPO derivadas de um procarionte (por exemplo, cianobactéria), e são proteínas PPO tolerantes a herbicida tendo tolerância a herbicida(s) inibidor(es) de PPO. Especificamente, é fornecida uma proteína PPO que é derivada de Spirulina subsalsa, e é designada como CyPPOl6,
e sua sequência de aminoácidos é representada por SEQ ID NO: 1, e uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica os mesmos é representada por SEQ ID NO: 2. Além disso, é fornecida uma PPO derivada de cepa NK55a de Thermosynechococcus sp., e é designada como CyPPO1l7, e sua sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO: 3, e uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica os mesmos é representada por SEQ ID NO: 4.
[0054] Nesse documento, o polipeptídeo e variantes do polipeptídeo podem ser expressados respectivamente como proteína PPO tolerante a herbicida ou variante de proteína PPO tolerante a herbicida tendo tolerância a um ou mais herbicida(s) inibidor (es) de PPO. Adicionalmente, como usado nesse documento, a expressão “uma PPO tolerante a herbicida ou sua variante" pode ser usada para se referir à proteína PPO tolerante a herbicida acima ou variante de proteína PPO tolerante a herbicida, um gene de codificação de proteína PPO tolerante a herbicida ou um gene que codifica a variante da proteína PPO tolerante a herbicida ou todos eles.
[0055] As proteínas PPO derivadas de cianobactérias possuem excelentes atividades enzimáticas em comparação com as proteínas PPO de planta, e são capazes de conferir tolerância aos herbicidas inibidores da PPO. Além disso quando as proteínas PPO derivadas de cianobactérias são modificadas por mutação (variação) de aminoácidos dentro de uma faixa capaz de manter suas atividades enzimáticas gerais, sua tolerância de herbicidas inibidores da PPO pode ser mais intensificada em comparação com as proteínas PPO do tipo selvagem. Essa mutação de aminoácidos pode compreender a substituição, exclusão, adição e/ou introdução de um ou mais de aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos de sítios de interação das proteínas PPO, em que as proteínas PPO interagem com herbicidas.
[0056] A variante da proteína PPO será descrita em mais detalhes a seguir.
[0057] Uma modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, que é uma variante de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (CyPPOl6), a variante compreendendo: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 1 (CyPPOl6), em que a modificação compreende a exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais de aminoácidos selecionados de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados em sítios de ligação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (CyPPOl6) interagindo com herbicida inibidor da PPO), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%
de identidade com a sequência de aminoácidos.
[0058] o resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 1 a ser excluído ou substituído por outro aminoácido diferente do aminoácido original (por exemplo, pelo menos um resíduo selecionado do grupo que consiste em aminoácidos posicionados em sítios de ligação a herbicidas inibidores da PPO do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1) pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em R85 (referindo-se a “R(Arg) na 85º posição; a expressão dos seguintes resíduos de aminoácidos é interpretada dessa maneira), F156, V160 Al62, Gl63, V305, C307, F324, L327, L337, 1340 e F360 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0059] Em uma modalidade específica, a variante do polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO: 1, em que um ou mais resíduo(s) de aminoácidos selecionado(s) do grupo que consiste em R85, F156, VI160, Al62, G163, V305, C307, F324, L327, L337, 1340, e F360 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 são respectivamente excluídas ou substituídas ou substituídas por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), Ví(Val), I(Ile), T(Thr), Lí(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), Fí(Phe), P(Pro), Wí(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Yí(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys), e semelhantes, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem (por exemplo , um ou mais resíduo(s) de aminoácidos selecionado(s do grupo que consiste em R140, F209, V213, A215, G216, V360, 5362, F386, L389, L1L399, T402, e Y422 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é(são) respectivamente e independentemente substituído (s) por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), A(Ala), e semelhantes, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0060] Por exemplo, a variante do polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: l1, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em F360M (referindo-se a um(a) mutante ou mutação em que “o resíduo de aminoácido na 360º posição é substituído de F(Phe) para Mí(Met)”; a expressão das seguintes mutações de aminoácidos é interpretada dessa maneira), F360L, F3601, F360C, F360V, F360T, V305I, V305L, Al62L, Al62C, Al621, V305M, R85A, F156A, V160C, V160S, F324V, L327T, e I340T, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0061] Mais especificamente, a variante do polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em mutações de aminoácidos de F360M, F360L, F360I, F360C, F360V, F360T, V3051I, V305L, Al62L, Al62C, Al621I, V305M, R85A, F156A, V160C, V160S, F324V, L327T, I340T, R85A+F360M (referindo-se a um(a) mutante ou mutação que compreende toda a substituição do 85º resíduo de R para A e substituição do 360º resíduo de F para M; a expressão das duas ou mais mutações de aminoácidos a seguir é interpretada dessa maneira), R85A+F360V, R85A+F3601, F156A+F360M, V160C+F360M, V160C+F3601, V160C+F360V, Al 62C+F360M, Al62C+F3601, Al62C+F360V, Al62L+F360M, Al62L+F3601, Al62L+F360V, V305M+F360M, V305M+F3601, V305M+F360V, F324V+F360M, L327T+F360M, L327T+F3601, L327T+F360V, I1340T+F360M, R85A+V160C+F3601, R85A+A1l62L+F360M, R85A+V305M+F3601, R85A+L327T+F360M, V160C+Al62L+F3601, V160C+V305M+F360M, V160C+L327T+F360I, Al62L+V305M+F360M, Al62C+L327T+F360M, V305M+L327T+F360M, .Al62C+V305M+F360M, Al62I+V305M+F360M, V160C+Al62C+F360M, V160C+Al62L+F360M, R85A+V160C+Al62L+F3601, R85A+V160C+V305M+F360M,
R85A+V160C+L327T+F3601, R85A+Al62C+L327T+F360M, R85A+A1l62L+V305M+F360M, R85A+V305M+L327T+F360M, V160C+Al62L+V305M+F3601, V160C+Al62C+L327T+F360M, Al62C+V305M+L327T+F360M, R85A+V160C+Al62C+L327T+F360M, R85A+V160C+Al62L+V305M+F360M, V160C+A1l62C+V305M+L327T+F360M, ou R85A+V160C+Al62C+V305M+L327T+F360M, na sequência de ácidos de sequência de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0062] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, que é uma variante de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 (CyPPOl17), a variante compreendendo: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 3 (CyPPOl7), em que a modificação compreende a exclusão e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais de aminoácidos selecionados de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 com um herbicida inibidor da PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos posicionados em sítios de ligação do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 (CyPPOl7) interagindo com herbicida inibidor da PPO), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0063] O resíduo de aminoácido do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 a ser excluído ou substituído por outro aminoácido diferente do aminoácido original (por exemplo, pelo menos um resíduo selecionado do grupo que consiste em aminoácidos posicionados nos sítios de ligação à herbicidas inibidores da PPO de polipeptídeo de SEQ ID NO: 3), pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em R88, F160, V164 Al66, Gl67, V304, C306, F323, L326, L336, 1339, e F359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0064] Em uma modalidade específica, a variante do polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 3, em que um ou mais resíduo(s) de aminoácidos selecionado(s) do grupo que consiste em R88, F160, V164, Al66, Gl67, V304, C306, F323, L326, L336, 1339 e F359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 são respectivamente e independentemente excluídas ou substituídas por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Mí(Met), VíVal), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), Wí(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr) D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys), e semelhantes, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem (por exemplo, um ou mais resíduo(s) de aminoácidos selecionado(s) do grupo que consiste em R88, F160, V164, Al66, Gl167, V304, C306, F323, L326, L336, 1339 e F359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 é (são) respectivamente e substituído independentemente por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), VíVal), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), A(Ala), e similares, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0065] Por exemplo, a variante do polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos tendo modificação na SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em F359M, F359C, F359L, F359I, F359V, F359T, V304T, V304L, Al66L, Al66C, Al661, V304M, R88A, F160A, V164C, V164S, F323V, L326T, e 1339T, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0066] Mais especificamente, a variante do polipeptídeo pode compreender:
uma sequência de aminoácidos com modificação na SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em mutações de aminoácidos de F359M, F359C, F359L, F3591I, F359V, F359T, V3041I, V304L, Al66L, Al66C, Al66I, V304M, R88A, F160A, V164C, V1648S, F323V, L326T, 1339T, R88A+F3591, R88A+F359V, R88A+F359M, VI164C+F3591, V164C+F359V, V164C+F359M, Al66L+F3591, Al66L+F359V, Al66L+F359M, Al66C+F3591, Al66C+F359V, Al 66C+F359M, F160A+F359M, V304M+F3591, V304M+F359V, V304M+F359M, F323V+F359M, L326T+F3591, L326T+F359V, L326T+F359M, 1I339T+F359M, R88A+V164C+F3591, R88A+A1l66L+F359M, R88A+V304M+F3591, R88A+L326T+F359M, VIG64C+Al66L+F3591T, V164C+V304M+F359M, V1I64C+L326T+F3591, Al66L+V304M+F359M, AlG66L+L326T+F3591T, V304M+L326T+F359M, Al66C+V304M+F359M, .AlG66I+V304M+F359M, VI64C+Al66C+F359M, V164C+Al66L+F359M, R88A+V164C+Al66L+F3591, R88A+V164C+V304M+F3591, R88A+V164C+L326T+F359M, R88A+Al66L+V304M+F3591, R88A+Al66L+L326T+F359M, R88A+V304M+L326T+F359M, V164C+Al66L+V304M+F3591, V164C+Al66L+L326T+F359M, Al66L+V304M+L326T+F3591, R88A+V164C+Al66L+V304M+F3591T, R88A+V164C+Al66L+L326T+F359M, V164C+Al66L+V304M+L326T+F359M, ou R88A+V164C+Al66C+V304M+L326T+F359M, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.
[0067] A variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência (por exemplo, 95% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais de identidade de sequência) descrita nesse documento pode manter a atividade enzimática equivalente à de um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que é um padrão de identificação da identidade de sequência (por exemplo, a proteína PPO tendo mutação de aminoácidos descrita acima), por exemplo, 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais da atividade enzimática maior de um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que é um padrão em plantas (em uma planta inteira, em uma célula de planta ou cultura celular, em um tecido vegetal, etc.), em algas e/ou in vitro, e tendo função de conferir tolerância a herbicida. A descrição da identidade de sequência é usada para esclarecer que a variante de polipeptídeo ou a variante de proteína PPO tolerante a herbicida descrita nesse documento pode compreender qualquer mutação de sequência dentro da faixa capaz de satisfazer a condição acima (manter a atividade enzimática e possuir uma função para conferir tolerância a herbicida).
[0068] Os aminoácidos usados na descrição estão resumidos como a seguir: Código de três letras | Código de uma letra
FP A ss AE
FR DR A
[0069] A variante de polipeptídeo (variante de proteína PPO tolerante a herbicida) pode manter suas atividades enzimáticas como uma proteína PPO e exibir tolerância a herbicida aumentada em comparação com o tipo selvagem.
[0070] Além disso, a variante de polipeptídeo (variante de proteína PPO tolerante a herbicida) pode compreender mutação adicional exibindo atividade biologicamente igual a um polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com mutação de aminoácidos (s)
descrita acima. Por exemplo, a mutação adicional pode ser a substituição de aminoácidos que não altera completamente a atividade molecular, e essa substituição de aminoácidos pode ser adequadamente selecionada por uma pessoa habilitada na técnica. Em um exemplo, a substituição adicional pode ser a substituição entre os resíduos de aminoácidos Ala/Ser, Vval/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, ou Asp/Gly, mas não se limitam aos mesmos. Em alguns casos, a variante da proteína PPO tolerante a herbicida pode ser submetida a pelo menos uma modificação selecionada do grupo que consiste em fosforilação, sulfatação, acilação, glicosilação, metilação, farnesilação e semelhantes. Além disso, a variante de proteína PPO tolerante a herbicida pode ser uma que possua estabilidade estrutural aumentada ao calor, pH, etc. da proteína ou atividade de proteína aumentada por variação de aminoácidos (mutação) e/ou modificação.
[0071] O termo “identidade de sequência" refere-se ao grau de similaridade com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem ou de referência ou sequência de nucleotídeos, e qualquer proteína pode ser incluída no escopo da presente invenção, desde que inclua resíduos de aminoácidos com 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais identidade para a sequência de aminoácidos da variante da proteína PPO tolerante a herbicida como descrito acima, e mantém atividades biológicas equivalentes à variante da proteína PPO tolerante a herbicida. Tais homólogos de proteínas podem compreender um sítio ativo equivalente ao de uma proteína alvo (a variante da proteína PPO tolerante a herbicida, como descrito acima).
[0072] A proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante pode ser obtida por extração e/ou purificação da natureza por métodos bem conhecidos na técnica relevante. Alternativamente, pode ser obtido como uma proteína recombinante usando uma tecnologia de recombinação genética. No caso de usar uma tecnologia de recombinação genética, ela pode ser obtida por um processo de introdução de um ácido nucleico que codifica a proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante em um vetor de expressão apropriado, e a introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira para expressar a proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante e, em seguida, coletando a proteína PPO tolerante a herbicida expressada ou sua variante da célula hospedeira. Depois que a proteína é expressada em uma célula hospedeira selecionada, a proteína pode ser separada e/ou purificada por técnicas gerais de separação bioquímica, por exemplo, tratamento com um agente precipitante de proteínas (relargagem), centrifugação, interrupção ultrassônica,
ultrafiltração, diálise, cromatografia, tais como, cromatografia em peneira molecular (filtração em gel), cromatografia por adsorção, cromatografia por troca iônica, cromatografia por afinidade e semelhantes e, a fim de separar a proteína com uma alta pureza, esses métodos podem ser utilizados em combinação.
[0073] A molécula de ácido nucleico de PPO tolerante a herbicida (polinucleotídeo que codifica a proteína PPO ou sua variante) pode ser isolada ou preparada usando técnicas biológicas moleculares padrão, por exemplo, uma síntese química ou método de recombinação, ou como a molécula de ácido nucleico de PPO tolerante a herbicida, disponível comercialmente pode ser usado.
[0074] Nessa divulgação, verificou-se que aío)s proteínas/ácidos nucleicos da PPO exibem ampla tolerância a herbicida contra 10 famílias representativas de herbicidas inibidores da PPO classificados de acordo com suas estruturas químicas em um sistema de teste de tolerância a herbicida usando E. coli deficiente em PPO BT3(APPO). Verificou-se também que as proteínas podem ser expressadas no cloroplasto de uma planta usando um peptídeo de trânsito (TP) Adicionalmente, verificou-se que aío)s proteínas/ácidos nucleicos da PPO ou variantes dos mesmos também podem ser expressada (o0)s em um monocotiledôneo, tal como Oryza sativa, ou um dicotiledôneo, tal como o ecótipo de Arabidopsis thaliana Columbia-O0O (A. thaliana), por uma planta vetor de expressão. Mesmo quando as plantas transformadas são tratadas com herbicidas inibidores da PPO, a germinação e o crescimento das plantas são observados. Além disso, foi confirmado, por um estudo de herança, que as características tolerantes a herbicida acima podem ser herdadas com sucesso para a próxima geração.
[0075] Portanto, a proteina PPO e suas variantes fornecidas nesse documento podem ser introduzidas em uma planta ou algas, conferindo assim tolerância a herbicida à planta ou algas e/ou intensificando a tolerância a herbicida da planta ou algas.
[0076] Uma modalidade fornece uma composição para conferir e/ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas e/ou algas, compreendendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste em: (1) uma variante de polipeptídeo como descrita acima ou compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com à mesma; (2) um polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo; (3) um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo; e (4) uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.
[0077] O herbicida nesse documento refere-se a um ingrediente ativo que mata, controla ou modifica adversamente o crescimento de plantas ou algas. Adicionalmente, a tolerância a herbicida significa que, mesmo após o tratamento de um herbicida que normalmente mata uma planta normal ou do tipo selvagem ou inibe seu crescimento, a inibição do crescimento da planta é enfraquecida ou eliminada, em comparação com a planta do tipo selvagem ou normal e, portanto, a planta continua a crescer. O herbicida inclui um herbicida que inibe a protoporfirinogênio IX oxidase (PPO) de uma planta ou alga. Esse herbicida inibidor da PPO pode ser classificado em pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N- fenilftalimidas, fenilésteres, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinadionas e outros herbicidas, de acordo com suas estruturas químicas.
[0078] Como uma modalidade específica, o herbicida à base de pirimidinadiona pode incluir butafenacil, saflufenacil, benzfendizona e tiafenacil, mas não estar limitado aos mesmos.
[0079] O herbicida à base de éter difenílico pode incluir fomesafem, oxyfluorfen, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifen, lactofen, clometoxifen, clornitrofen, fluoroglicofen-etil e halosafen, mas não se limita aos mesmos.
[0080] O herbicida à base de fenilpirazol pode incluir piraflufen-etil e fluazolato, mas não se limita aos mesmos.
[0081] O herbicida à base de fenilftalimida pode incluir flumioxazin, cinidon-etil e flumiclorac-pentil, mas não se limita aos mesmos.
[0082] O herbicida de fenilésteres pode incluir fenopilato (l-pirrolidinacarboxilato de 2,4-diclorofenila) e análogos de carbamato de fenopilato (por exemplo, análogos de O-fenilpirrolidina e piperidinacarbamato (ver “Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O- phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., JJ. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992”)), e semelhantes, mas não se limitam aos mesmos. Em uma modalidade específica, o análogo de carbamato de fenopilato pode ser um ou mais selecionado(s) do grupo que consiste em éster fenílico do ácido pirrolidina-l-carboxílico (CAS Nº 55379-71-0), ácido l1-pirrolidinacarboxílico, 2-clorofenil éster (CAS 143121-06- 6), 4-clorofenil-pirrolidina-l-carboxilato (CAS Nº 1759-02- 0), ácido carbâmico, éster dietílico, 2,4-dicloro-5-(2- propiniloxi)fenil éster (9CTI) (CAS Nº 143121-07-7), ácido 1- pirrolidinacarboxílico, 2,4-dicloro-5-hidroxifenil éster (CAS Nº 143121-08-8), pirrolidina-l-carboxilato de 2,4- dicloro-5- (metoxicarbonil)fenila (CAS Nº 133636-94-9),
pirrolidina-l-carboxilato de 2,4-dicloro-5-[ (propan-2- iloxi)carbonil]fenila (CAS Nº 133636-96-1), 2,4-dicloro-5- (2-propiniloxi)fenil éster do ácido l-piperidinacarboxílico (CAS Nº 87374-78-5), pirrolidina-l-carboxilato de 2,4- dicloro-5- (prop-2-in-l1-iloxi)fenila (CAS Nº 87365-63-7), 4, 4-difluoropiperidina-l-carboxilato de 2,4-dicloro-5- (prop-2-in-l1-iloxi)fenila (CAS Nº 138926-22-4), 2,4-dicloro- 5- (2-propin-l1-iloxi)fenil éster de ácido 1- pirrolidinacarboxílico (CAS Nº 143121-10-2), pirrolidina-l1- carboxilato de 4-cloro-2-fluoro-5-[ (propan-2- iloxi)carbonil]fenila (CAS Nº 133636-98-3) e semelhantes.
[0083] O herbicida à base de tiadiazol pode incluir flutiaceto e tidiazimin, mas não se limitar aos mesmos.
[0084] O herbicida à base de oxadiazol pode incluir oxadiargil e oxadiazon, mas não se limita aos mesmos.
[0085] O herbicida à base de triazinona pode incluir trifludimoxazin, mas não estar limitado aos mesmos.
[0086] O herbicida à base de triazolinona pode incluir carfentrazona, sulfentrazona e azafenidiny mas não se limitar aos mesmos.
[0087] O herbicida à base de oxazolidinadiona pode incluir pentoxazona, mas não estar limitado ao mesmo.
[0088] O outro herbicida pode incluir piraclonil, flufenpir-etil e profluazol, mas não se limitar aos mesmos.
[0089] O gene de PPO tolerante a herbicida fornecido nesse documento pode ser introduzido em uma planta ou alga por vários métodos conhecidos na técnica e, de preferência, usando um vetor de expressão para transformação de planta ou alga.
[0090] No caso de introduzir o gene em uma planta, um promotor apropriado que pode ser incluído no vetor pode ser qualquer promotor geralmente usado na técnica para introdução do gene na planta. Por exemplo, o promotor pode incluir um promotor SP6, um promotor T7, um promotor T3, um promotor de PM, um promotor de ubiquitina de milho, um promotor 358 do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), um promotor da nopalina sintase (nos), um promotor 35S do vírus do mosaico da figueira, promotor do vírus baciliforme da cana-de-açúcar, promotor do vírus da mancha amarela da commelina, promotor indutível à luz da pequena subunidade da ribulose-l,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO), um promotor da triosefosfato isomerase citossólica do arroz (TPI), um promotor de adenina fosforibosiltransferae (APRT) de A. thaliana, um promotor de octopina sintase e um promotor de BCB (proteína de ligação de cobre azul), mas não se limita aos mesmos.
[0091] Adicionalmente, o vetor pode incluir uma sequência de sinal poli A causando poliadenilação do terminal 3' e, por exemplo, pode incluir a extremidade 3' NOS derivada de um gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens, um terminador de octopina sintase derivado de um gene da octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, extremidade 3' do gene de inibidor de protease I ou II de tomate ou batata, um terminador 35S de CaMV, um terminador de a-amilase de arroz RAmyl A, e um terminador da faseolina, mas não se limita aos mesmos.
[0092] Além disso, o caso de introduzir o gene em uma alga, um promotor específico para cloroplasto, um promotor de núcleo, um promotor constitutivo ou um promotor indutível pode ser usado para a introdução do gene nas algas como um promotor. O gene da PPO tolerante a herbicida ou sua variante fornecida nesse documento pode ser projetado de modo a ligar operacionalmente a UTR 5' ou UTR 3', expressando assim a função no núcleo de algas. Adicionalmente, o vetor pode adicionalmente compreender uma sequência reguladora da transcrição que é apropriada para a transformação de algas. Um gene recombinante que confere tolerância a herbicida pode ser integrado ao genoma do núcleo ou ao genoma do cloroplasto em uma alga hospedeira, mas não se limita aos mesmos.
[0093] Além disso, no vetor, um peptídeo de trânsito necessário para direcionar para cloroplastos pode ser ligado à extremidade 5" do gene da PPO, a fim de expressar o gene da PPO tolerante a herbicida nos cloroplastos.
[0094] Além disso, opcionalmente, o vetor pode incluir adicionalmente um marcador selecionável que codifica um gene como uma molécula repórter, e o exemplo do marcador selecionável pode incluir um gene tendo tolerância a um antibiótico (por exemplo, neomicina, carbenicilina, canamicina, espectinomicina, higromicina, bleomicina, cloranfenicol, ampicilina, etc.) ou herbicida (glifosato, glufosinato, fosfinotricina, etc.), mas não se limita aos mesmos.
[0095] Adicionalmente, o vetor recombinante para expressão de plantas pode incluir um vetor binário de Agrobacterium, um vetor de cointegração, ou um vetor geral que não possui região DNA-T, mas é projetado para ser expressado na planta. Deles, o vetor binário refere-se a um vetor contendo dois sistemas de vetores separados que abrigam um plasmídeo responsável pela migração que consiste na borda esquerda (LB) e na borda direita (RB) no plasmídeo Ti (indutor de tumor), e o outro plasmídeo para transferência do gene alvo, e o vetor pode incluir uma região promotora e uma sequência de sinal de poliadenilação para expressão em plantas.
[0096] Quando o vetor binário ou vetor de cointegração é usado, uma cepa para transformação do vetor recombinante na planta é preferencialmente Agrobacterium (transformação mediada por Agrobacterium). Para essa transformação, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes pode ser usado. Além disso, quando o vetor que não tem região de
DNA-T é usado, eletroporação, bombardeio de partículas, captação mediada por polietilenoglicol e semelhantes podem ser usados para a introdução do plasmídeo recombinante na planta.
[0097] A planta transformada com o gene pelo método acima pode ser rediferenciada em uma planta através da indução de calos, rizogênese e aclimatação do solo, usando uma técnica padrão conhecida na técnica relevante.
[0098] A planta submetida à transformação nesse documento pode abranger não apenas uma planta madura, mas também uma célula de planta (contendo uma célula cultivada em suspensão), um protoplasto, um calo, um hipocótilo, uma semente, um cotilédone, um broto, e semelhantes, que podem crescer para uma planta madura.
[0099] Além disso, o escopo do transformante pode incluir um transformante no qual o gene é introduzido, bem como um clone ou progênie do mesmo (geração Tl, geração T2, geração T3, geração T4, geração T5 ou quaisquer gerações subsequentes). Por exemplo, a planta transformada também inclui uma planta tendo características de tolerância a herbicida herdadas como progênie sexual e assexual da planta transformada com o gene fornecido nesse documento. O escopo da presente invenção também inclui todos os mutantes e as variantes que mostram as características da planta inicial transformada, juntamente com todos os produtos de hibridização e fusão da planta transformada com o gene fornecido nesse documento. Além disso, o escopo da presente invenção também inclui uma parte da planta, tais como, uma semente, uma flor, um caule, uma fruta, uma folha, uma raiz, um tubérculo e/ou uma raiz tuberosa, que é originária(o) de uma planta transformada que é transformada antecipadamente pelo método da presente invenção, ou uma progênie da mesma, e é composta de pelo menos uma parte das células transformadas.
[00100] A planta à qual a presente invenção é aplicada não está particularmente limitada, mas pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Além disso, a planta pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em plantas herbáceas e plantas lenhosas. A planta monocotiledônea pode incluir plantas pertencentes às famílias Alismataceae, Hydrocharitaceae, Juncaginaceae, Scheuchzeriaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Zosteraceae, Liliaceae, Haemodoraceae, Agavaceae, Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Pontederiaceae, TIridaceae, Burmanniaceae, Juncaceae, Commelinaceae, Eriocaulaceae, Gramineae (Poaceae), Araceae, Lemnaceae, Sparganiaceae, Typhaceae, Cyperaceae, Musaceae, Zingiberaceae, Cannaceae, Orchidaceae, e semelhantes, mas não se limitam às mesmas.
[00101] A planta dicotiledônea pode incluir plantas pertencentes às famílias Diapensiaceae, Clethraceae, Pyrolaceae, Ericaceae, Myrsinaceae, Primulaceae, Plumbaginaceae, Ebenaceae, Styracaceae, Symplocaceae, Symplocaceae, Oleaceae, Loganiaceae, Gentianaceae, Menyanthaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Rubiaceae, Polemoniaceae, Convolvulaceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Labiatae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Acanthaceae, Pedaliaceae, Orobanchaceae, Gesneriaceae, Lentibulariaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae, Campanulaceae, Compositae, Myricaceae, Juglandaceae, Salicaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, Santalaceae, Loranthaceae, Polygonaceae, Phytolaccaceae, Nyctaginaceae, Aizoaceae, Portulacaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Cactaceae, Magnoliaceae, Illiciaceae, Lauraceae, Cercidiphyllaceae, Ranunculaceae, Berberidaceae, Lardizabalaceae, Menispermaceae, Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Cabombaceae, Saururaceae, Piperaceae, Chloranthaceae, Aristolochiaceae, Actinidiaceae, Theaceae, Guttiferae, Droseraceae, Papaveraceae, Capparidaceae, Cruciferae, Platanaceae, Hamamelidaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Eucommiaceae, Pittosporaceae, Rosaceae, Leguminosae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Tropaeolaceae, Zygophyllaceae, Linaceae, Euphorbiaceae, Callitrichaceae, Rutaceae,
Simaroubaceae, Meliaceae, Polygalaceae, Anacardiaceae, Aceraceae, Sapindaceae, Hippocastanaceae, Sabiaceae, Balsaminaceae, Aquifoliaceae, Celastraceae, Staphyleaceae, Buxaceae, Empetraceae, Rhamnaceae, Vitaceae, Elaeocarpaceae, Tiliaceae, Malvaceae, Sterculiaceae, Thymelaeaceae, Elaeagnaceae, Flacourtiaceae, Violaceae, Passifloraceae, Tamaricaceae, Elatinaceae, Begoniaceae, Cucurbitaceae, Lythraceae, Punicaceae, Onagraceae, Haloragaceae, Alangiaceae, Cornaceae, Araliaceae, Umbelliferae (Apiaceae)), e outras semelhantes, mas não limitadas às mesmas.
[00102] Em uma modalidade específica, a planta pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em culturas alimentares, tais como, arroz, trigo, cevada, milho, soja, batata, feijão vermelho, aveia e sorgo; culturas vegetais, tais como, couve chinesa, rabanete, pimenta vermelha, morango, tomate, melancia, pepino, couve, melão oriental, abóbora, cebolinha, cebola e cenoura; culturas para uso especial, tais como, planta de ginseng, tabaco, algodão, silagem, forragem, gergelim, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, Perilla sp., amendoim, colza, grama e mamona; árvores frutíferas, tais como, macieira, pereira, maçã chinesa, pessegueiro, pé de kiwi, videira, pé de fruta citros, pé de caqui, pé de ameixa, pé de damasco e bananeira; plantas lenhosas, tais como, pinho, óleo de palma e eucalipto; culturas de flores, tais como, rosa, gladíolo, gerbera, cravo, crisântemo, lírio e tulipa; e culturas forrageiras, tais como, azevém, trevo vermelho, dáctilo- comum, alfafa, festuca-alta e azevém perene, mas não se limitam aos mesmos. Como uma modalidade específica, a planta pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em plantas dicotiledôneas, tais como, arabidopse-do-tale, batata, berinjela, tabaco, pimenta vermelha, tomate, bardana, margarida, alface, campainha da china, espinafre, acelga, batata doce, aipo, cenoura, arrabaça, salsa, couve chinesa, couve, rabanete, melancia, melão oriental, pepino, abóbora, cabaça, morango, soja, feijão mungo, feijão roxo e ervilha; e plantas monocotiledôneas, tais como, arroz, trigo, cevada, milho, sorgo e semelhantes, mas não se limitam às mesmas.
[00103] As algas, às quais a presente invenção é aplicada, não são particularmente limitadas, mas podem ser pelo menos uma alga procariótica ou/ou alga eucariótica. Por exemplo, as algas podem ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em cianobactérias, algas verdes, algas vermelhas, algas marrons, macroalgas, microalgas e semelhantes.
[00104] As cianobactérias podem incluir filos Chroococcales (por exemplo, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis,
Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobactérias, Nostocales (por exemplo, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales (por exemplo, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales (por exemplo, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales Stigonematales (por exemplo, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis Umezakia, Westiellopsis), e semelhantes.
[00105] Como outro exemplo de algas, podem ser exemplificados Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella ou Hematococcm.
[00106] Como outro exemplo de algas, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova SPpP., Aphanocapsa sSpp., Synechosystis sPpp., Nannochloris spp., e semelhantes podem ser exemplificados. No entanto, não se limita aos tipos listados acima, e algas pertencentes a outros gêneros e famílias podem estar compreendidas.
[00107] Em uma modalidade, a planta ou a alga com à PPO tolerante a herbicida ou sua variante fornecida nesse documento podem exibir tolerância contra dois ou mais herbicidas inibidores da PPO.
[00108] Portanto, a tecnologia fornecida por essa divulgação pode ser usada para controlar ervas daninhas ou remover organismos aquáticos indesejados usando pelo menos dois herbicidas inibidores da PPO sequencialmente Ou simultaneamente.
[00109] Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma terra de cultivo, compreendendo fornecer à terra de cultivo uma planta compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma que descrita acima, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase nas terras de cultivo e/ou na planta.
[00110] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo aquático indesejado de um meio de cultura, compreendendo: fornecer um meio de cultura com algas compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica o mesmo descrito acima, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase ao meio de cultura.
[00111] Além disso, a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma fornecida nesse documento pode ser usada em combinação de um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.
[00112] Portanto, a planta ou alga introduzida com a PPO tolerante a herbicida fornecida nesse documento pode exibir tolerância contra dois ou mais herbicidas que são diferentes entre si no mecanismo de ação. Na presente invenção, dois ou mais herbicidas diferentes, incluindo o herbicida inibidor da PPO, que são diferentes um do outro no mecanismo de ação, podem ser usados sequencial ou simultaneamente, controlando assim as ervas daninhas e/ou removendo organismos aquáticos indesejados. A seguir, o herbicida que é diferente do herbicida inibidor da PPO no mecanismo de ação é chamado de “segundo herbicida”.
[00113] Uma modalidade fornece uma composição para conferir ou intensificar a tolerância a herbicida de plantas ou algas, compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida acima descrita, sua variante ou um gene que codifica a mesma; e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.
[00114] Outra modalidade fornece um transformante de plantas ou algas tendo tolerância de herbicidas, ou um clone ou progênie das mesmas, compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida acima descrita, sua variante ou um gene que codifica a mesma; e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.
[00115] Outra modalidade fornece um método para preparar plantas ou algas com tolerância de herbicidas, compreendendo uma etapa de introdução da proteína PPO tolerante a herbicida acima descrita, sua variante ou um gene que codifica o mesmo e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, em uma alga, ou em uma célula, um protoplasto, um calo, um hipocótilo, uma semente, um cotilédone, um broto ou um corpo inteiro de uma planta.
[00116] Outra modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma terra de cultivo, compreendendo fornecer à terra de cultivo uma planta compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida acima descrita, sua variante ou um gene que codifica a mesma, e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica a mesma, e aplicar dosagens eficazes de herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase e do segundo herbicida nas terras de cultivo simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.
[00117] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo aquático indesejado de um meio de cultura, compreendendo fornecer um meio de cultura com algas compreendendo a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica o mesmo e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, e aplicar dosagens eficazes de herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase e o segundo herbicida ao meio de cultura simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.
[00118] Por exemplo, a planta ou a alga podem compreender —“adicionalmente o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, tendo assim adquirido e/ou tolerância intensificada contra o segundo herbicida.
[00119] Por exemplo, a planta ou a alga inclui ainda o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que o codifica, tendo, assim, uma nova e/ou tolerância intensificada contra o segundo herbicida.
[00120] Por exemplo, o segundo herbicida pode incluir herbicidas inibidores da divisão celular, herbicidas inibidores da fotossíntese, herbicidas inibidores da síntese de aminoácidos, herbicidas inibidores de plastídios, herbicidas inibidores da membrana celular e/ou quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos. O segundo herbicida pode ser exemplificado por herbicidas inibidores de glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), ALS (acetolactato sintase) (por exemplo, imidazolidinona, sulfonilureia, triazol pirimidina, sulfononanilida, pirimidina, sulfononanilida, pirimidinina tiobenzoato, etc.), herbicidas inibidores do fotossistema II, herbicidas à base de fenilureia, herbicidas inibidores de plastídeos, herbicidas à base de bromoxinil e/ou quaisquer combinações dos mesmos, mas não se limitam aos mesmos.
[00121] Por exemplo, o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado como um ou mais tipos selecionados do grupo que consiste em EPSPS tolerante a herbicida (S5S-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase tolerante a glifosato), GOX (glifosato oxidase), GAT (glifosato oxidase), GAT (glifosato -N-acetiltransferase) ou glifosato descarboxilase; PAT tolerante a herbicida glufosinato (fosfinotricina-N-acetiltransferase); DMO tolerante a herbicida dicamba (dicamba monooxigenase); 2,4- D monooxigenase ou AAD tolerante a herbicida 2,4-D (ariloxialcanoato dioxigenase); ALS tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS (acetolactato sintase), AHAS (aceto-hidroxiácido sintase) ou AtAHASL (subunidade grande de aceto-hidroxiácido sintase de Arabidopsis thaliana); proteína Dl do fotossistema II tolerante a herbicida inibido do fotossistema II; citocromo P450 tolerante a herbicida à base de fenilureia; HPPD tolerante a herbicida inibidor de plastos (hidroxifenilpiruvato dioxigenase); nitrilase tolerante a herbicida bromoxinil; e quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.
[00122] Além disso, o gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado como um ou mais de tipos selecionados do grupo que consiste no gene cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247,
gat4601 ou gat4621 tolerante a herbicida glifosato, gene bar, pat ou pat (SYN) tolerante a herbicida glufosinato; gene dmo tolerante a herbicida dicamba; gene AAD-1 ou AAD- 12 tolerante a herbicida 2,4-D; ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, SurA ou SurB tolerante a herbicida à base de sulfonilureia que inibe ALS; gene psba tolerante à herbicida inibidor do fotossistema II; gene CYPT76Bl tolerante a herbicida fenilureia; gene HPPDPF W336 tolerante a herbicida isoxaflutol; gene bxn tolerante a herbicida bromoxinil; e quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos. [Efeitos vantajosos
[00123] Uma variante da proteína PPO tolerante a herbicida ou um gene que codifica a mesma fornecida nesse documento pode ser aplicada a uma planta ou algas, conferindo assim excelentes traços de tolerância a herbicida à planta ou algas e/ou intensificando os traços de tolerância a herbicida da planta ou alga. Além disso, um controle seletivo pode ser realizado usando herbicidas, controlando economicamente assim as ervas daninhas ou removendo organismos aquáticos. [Descrição dos Desenhos]
[00124] A Fig. 1 é um mapa do vetor pET303-CT-His.
[00125] A Fig. 2 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante (BT3(APPO)) de E£E.
coli BT3 deficiente em PPO transformado com o gene do tipo selvagem CyPPOl6 (indicado por CyPPOl6WT) ou vários genes mutantes do CyPPOl6 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratado com tiafenacil a uma concentração de O uM (controle), 10 unuM, e 25 pM, respectivamente (superior), e saflufenacil na concentração de O uM (controle), 25 pM e 50 upM, respectivamente (inferior).
[00126] A Fig. 3 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl6WT, ou vários genes mutantes CyPPOl6 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com flumioxazin a uma concentração de OuM (controle), 10uM e 25pM, respectivamente (superior) e sulfentrazona à uma concentração de O uM (controle), 50 upuM e 100 uM, respectivamente (inferior).
[00127] A Fig. 4 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl6WT, ou vários genes mutantes CyPPOl6 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com fomesafen a uma concentração de O uM (controle), 50 UM e 100 pM, respectivamente (superior) e acifluorfen em uma concentração de O uM (controle), 5 uM e 10 uM, respectivamente (inferior).
[00128] A Fig. 5 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO)
transformado com CyPPOl6WT, ou vários genes mutantes de CyPPOl6 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com pentoxazona a uma concentração de O pum (controle), 5 npuM e 25 u1uM, respectivamente (superior) e piraflufen-etil em uma concentração de O uM (controle), 5 puM e 25 puM, respectivamente (inferior).
[00129] A Fig. 6 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl6WT, ou vários genes mutantes de CyPPOl6 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com piraclonil a uma concentração de O uM (controle), 50 uM e 100 UM, respectivamente.
[00130] As Figs. 7 a 17 são fotografias que mostram o nível de crescimento celular de transformantes BT3(APPO) transformados com o gene do tipo selvagem CyPPOl6 (indicado por CyPPOl6WT) ou vários genes mutantes de CyPPOl6 que levam a mutações de dois ou mais aminoácidos, como mostrado na Tabela 8, quando tratados com tiafenacil nas concentrações de O uM (controle), 50 uM e 200 uM, sulfentrazona na concentração de O uM (controle), 2000 uM e 4000 UM, e flumioxazin na concentração de O pM (controle), 25 uM e 50 upM, respectivamente.
[00131] A Fig. 18 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante (BT3(APPO)) do E. Coli BT3 deficiente em PPO transformado com o gene de CyPPOl7 do tipo selvagem (indicado por CyPPOl7WT), ou vários genes mutantes do CyPPO17 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratado com tiafenacil a uma concentração de O uM (controle), 50 1uM e 100 pM, respectivamente (superior), e saflufenacil a uma concentração de O uM (controle), 50 puM e 200 1uM, respectivamente (inferior).
[00132] A Fig. 19 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl7WT, ou vários mutantes de CyPPOl7 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com flumioxazin a uma concentração de O puM (controle), 50 UM e 100 uM, respectivamente (superior), e sulfentrazona a uma concentração de o uM (controle), 5 uM e 25 unM, respectivamente (inferior).
[00133] A Fig. 20 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl7WT, ou vários genes mutantes de CyPPOl7 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com fomesafen a uma concentração de O uM (controle), uM e 25 pM, respectivamente (superior), e acifluorfen em uma concentração de O uM (controle), 5 npM e 25 uM, respectivamente (inferior).
[00134] A Fig. 21 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl7WT, ou vários genes mutantes de
CyPPO17, levando a uma mutação de um aminoácido, quando tratado com piraclonil a uma concentração de O uM (controle), pM e 25 pM, respectivamente (superior), e pentoxazona a uma concentração de O uM (controle), 5 uM e 25 uM, respectivamente (inferior).
[00135] A Fig. 22 é uma fotografia que mostra o nível de crescimento celular do transformante BT3 (APPO) transformado com CyPPOl7WT, ou vários genes mutantes de CyPPOl17 que levam a uma mutação de um aminoácido, quando tratados com piraflufen-etil a uma concentração de O uM (controle), 5 uM e 10 uM, respectivamente.
[00136] As Figs. 23 a 33 são fotografias que mostram o nível de crescimento celular de transformantes BT3(APPO) transformados com o gene de CyPPOl7 do tipo selvagem (indicado por CyPPOl7WT), ou vários genes mutantes do CyPPO1l7 que levam a mutações de dois ou mais aminoácidos, como mostrado na Tabela 10, quando tratados com tiafenacil a uma concentração de O uM (controle), 50 uM e 200 uM, sulfentrazona na concentração de O uM (controle), 200 puM e 400 uM e flumioxazin na concentração de O pyM (controle), 100 uM e 200 uM, respectivamente.
[00137] A Fig. 34 é um mapa do vetor pMAL-c2X.
[00138] A Fig. 35 é uma fotografia que mostra os resultados observados no 3º dia após a pulverização de 1 UM de tiafenacil em A. thaliana (T7) transformado com o gene de
CyPPOl6 do tipo selvagem ou com o gene de CyPPOl17 do tipo selvagem.
[00139] A Fig. 36 é uma fotografia que mostra os resultados observados no terceiro dia após a pulverização de uM de tiafenacil em A. thaliana (T2) transformado com o gene de CyPPOl6 do tipo selvagem, gene de CyPPOl7 do tipo selvagem ou genes mutantes dos mesmos.
[Modo de invenção]
[00140] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não se destina a ser limitada por esses exemplos.
Exemplo 1. Verificação da tolerância de herbicidas de CyPPO16 e CyPPO17 isolados de procariontes
[00141] As sequências do gene da PPO foram obtidas do banco de dados de duas cepas, Spirulina subsalsa e NK55a de Thermosynechococcus sp., respectivamente. Para codificar a proteína PPO (CyPPOl6; SEQ ID NO: 1) a partir de Spirulina subsalsa, o gene da PPO designado como CyPPOl6 foi isolado a partir de Spirulina subsalsa, e otimizado para ter a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7. Para codificar a proteína PPO (CyPPOl7; SEQ ID NO: 3) de NK55a de Thermosynechococcus sp., o gene de CyPPOl6 designado como CyPPO17 foi isolado de NK55a de Thermosynechococcus sp. e otimizado para ter a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID
NO: 8. De modo a obter a estrutura de ligação de herbicida da proteína PPO, os herbicidas incluindo tiafenacil saflufenacil, flumioxazin e sulfentrazona e as proteínas PPO incluindo CyPPOl6 e CyPPOl7 foram usadas. Os modelos de homologia de CyPPOl6 e CyPPOl7 foram construídos a partir da estrutura CyPPOlO0 (a proteína PPO originada de Thermosynechococcus elongatus BP-1; SEQ ID NO: 5) usando o servidor de modelagem de estrutura de proteínas SWISS-MODEL (https://swissmodel .expasy.org/).
[00142] As informações estruturais que interagem com herbicida de cada proteína PPO foram obtidas após a sobreposição de estruturas modeladas de CyPPOl6 e CyPPOl7 com CyPPO10 ligado a herbicidas (tiafenacil, saflufenacil flumioxazin e sulfentrazona).
[00143] As informações de ligação de herbicida de CyPPO10 foram obtidas através dos seguintes procedimentos: proteína CyPPOl10 (SEQ ID NO: 5) e tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin e sulfentrazona foram examinadas como a proteína e herbicidas representativos, respectivamente. O gene que codifica a proteína CyPPOl0O (SEQ ID NO: 6) foi clonado no vetor pET29b (Número de Catálogo: 69872-3; EMD Biosciences), e a proteína CyPPO10 foi expressada em FE. coli. A proteína CyPPOl10 expressada foi purificada através de cromatografia por afinidade com níquel, à qual tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin ou sulfentrazona foram adicionados respectivamente e cristais de PPO ligados a herbicidas foram obtidos. Em seguida, os cristais foram usados para difração de raios X por acelerador de radiação sincrotron. Foram obtidos dados de difração de raios X da resolução de 2,4 À dos cristais do complexo de herbicida-CyPPO1l0, e a estrutura tridimensional foi determinada. As informações de ligação foram obtidas através da análise dos resíduos de aminoácidos do CyPPOl10 interagindo com os herbicidas.
[00144] Usando a informação de aminoácidos que interagem com herbicida derivados da estrutura dos complexos de CyPPOlO0-herbicida, foram determinadas as informações dos resíduos de aminoácidos CyPPOl6 e CyPPOl7 que possivelmente diminuem a afinidade de ligação dos herbicidas através de mutações.
[00145] Como resultados, resíduos de aminoácidos incluindo R85, F156, V160, Al62, Gl63, V305, C307, F324, L327, L337, 1340 e F360 da proteína CyPPOl6 (SEQ ID NO: 1) foram envolvidos para interagir com herbicidas inibidores da PPO, e aqueles incluindo R88, F160, V164, Al66, Gl167, V304, c306, F323, L326, L336, 1339 e F359 da proteína CyPPO17 (SEQ ID NO: 3) foram envolvidos para interagir com herbicidas inibidores da PPO.
Exemplo 2. Construção de variantes de PPO
[00146] A fim de intensificar a tolerância de CyPPOl6 e CyPPOl7 a herbicida inibidor da PPO, uma mutação(ões) na posição que interage(m) com o herbicida obtido no Exemplo 1 foi (foram) introduzida(s), respectivamente. Cada gene de PPO foi otimizado por códon e sintetizado (Cosmogenetech Co., Ltd.) para teste eficiente de tolerância a herbicida usando BT3, uma marcação com coloração de E. coli deficiente em PPO. O procedimento experimental detalhado foi como a seguir:
[00147] Usando os iniciadores listados na Tabela 2, foi realizada PCR para amplificar os genes de PPO nas seguintes condições.
Mistura de reação PCR Molde (DNA sintético de CyPPOl6 ou CyPPO17) 1 pl Tampão 10X 5 ul Mistura dANTP (10 mM cada) 1 ul Iniciador direto (10 uM) 1 nl Iniciador reverso (10 uM) 1 ul [Tabela 1] Condição da reação PCR lee | os — | os ciclos o ==
[Tabela 2] Lista de Iniciadores para clonagem de CyPPOl6 and CyPPOl17 em vetor pET303-CT-His NO. EMP EEE EEE e Gens sp. NK55a
[00148] Os produtos de PCR amplificados acima e o vetor pET303-CT-His (VTO163; Novagen; Fig. 1) foram digeridos com as enzimas de restrição XbaIl e XhoI, e ligados para construir plasmídeos pET303-CyPPOl6 e pET303-CyPPOl7 usando T4 DNA ligase (RBC, 3 unidades/ynl).
[00149] Os genes de CyPPOl6 e CyPPOl7 clonados vetor no pET303-CT-His foram mutados por mutagênese direcionada ao sítio usando iniciadores listados nas Tabelas 4 e 5, respectivamente.
Mistura de reação PCR Molde 1 ul Tampão 10X 5 ul Mistura dNTP (10 mM cada) 1 ul Iniciador direto (10 uM) 1 nl Iniciador reverso (10 uM) 1 ul DDW 40 ul
[Tabela 3] Condição da reação PCR [Tabela 4] Lista de Iniciadores para mutagênese de gene de CyPPOl6
NO CyPPO16 F360M [ RT eGriGcaccGccGaTCATATTGETCAGÇAGAÃTE Id [e esccGaToAAATTGGTCAGEAGATGETÇAÇEE 6 [o E cerocacccccaarGaTATICTCAGEAÇAÃTE 8 F360C
FSGOV [| e ecceatGacaTTGGTCAGEAGATGETCACEETE 22 [e eGsrTGcaccGccEaTGGTATTGETCAGEAGATE 2d vsosT [ [a162E [ R TGATCAACGTCGCCACAATACACACEGEAÇÃE [dO [E sGGAcIACGCACOCCATCGGAGGATAGTARAT BZ [E erIcCAATACACARACGCCGETAGACETCIÇTE Bd | — R | cataCACACCGGAGACCGCTGGTECEACTARAÇE ——>>]36 = | [E csacoToGccAGCATAGCAACOGGAGACARATES [38
EE [ [550 |R |GAGACAGGAGGACCAGETTGTACCAAGAGTECT Mú [44
[O E JeTIGATCARCGTCGCCACARTAGERACCGGRERCA. — |&6 | V160C+A162L|F |CGCACCATTTGTCTCCGGTTGCTATCTTGGCGACGTTGATC [47
MMA R [GATAGTTGATCAACGTCGCCAAGATAGCAACCGGAGACAAA |48 esmo E [Tabela 5] Lista de iniciadores para mutagênese de gene de CyPPO17 Mutação Sequência de Iniciadores (5'-> 3') SEQ fexeraas po É esmo |[P oaGTITITACTCARTGATCGETGERGERADA [49 | r|TGITGCICCACCGATCATIGARGTARAMÁCTTS [50 | R|mTACTICATGCATCGGTGGAGEAACAGATECE [52 [ RTAcTICATTGATCGGTGGAGCAMCAGATEÇEE MM [84 | RjTGIMTGCTCCACCGATGATTGARGTARAMAMÇTTE [56 | [| x mmGCICCAcCOATGACTGAAGEARARAÁÇTES [58 [| e cTerTGoTccacCGaTGGTTGAAGTARAMAÇãTE MM [60 | Tr cacaceccaGTETTGGATACGEAATEGEEE [62 [E TGcTGGGGATCTCCCAGATAÇACEECAGAÇÃE [68 | RR |rtrectTaGGGATCTCCGCAATACACECCAGAGAE ---ÚÚÚÚúúúúú|66 | | rlGaGTACTACACAGECCATTGTTGGATACGGRAT [68 [ R cteGccanTAMATGTACGCCEGTAGATETEÇATE [70 | RjeatacaceccaGAGACCGCAGETGCCACEABARE o [72 | | a leccaTcrocoGenTAGEAGEcAGAGAcEAAARE [74 [| RTesetaTanGGAcEcccacEceTEETETATEAS [76 | rTeccacecceTATAGTGACCCCARAGCCTGETCETACTEAÇET— [78 | | xlmaaGCAaGeTAGAcOaAGETAGTECEEAETETAÇe [80 [| rR|rTGcroGGGaTCTCCCAGATAGCAGCCAGAGACERAAGE [82 | [O TR cTGcGGaTCTCCGEAATAGCAGECAGAGAEÇÃA [84 |
[00150] Um ul de DpnI (NEB) foi tratado para cada 10 ul de produtos de PCR e incubado a 37 ºC por 30 minutos. A célula competente DH5alpha (Biofact Co., Ltd.) foi transformada com solução reacional através do método de choque térmico e foi cultivada em meio de ágar LB contendo carbenicilina (Gold Biotechnology Co., Ltd.). Depois que os plasmídeos foram preparados a partir de E. coli transformada, eles foram sequenciados (Cosmogenetech, Co., Ltd.) e confirmados como tendo mutações corretas.
Exemplo 3. Verificação da tolerância de variantes de PPO a herbicidas inibidores da PPO (teste em E. coli)
[00151] O gene CyPPO mutado obtido a partir do Exemplo 2 foi transformado na cepa BT3(APPO) que é deficiente em atividade de PPO e cultivada em meio LB com herbicida inibidor da PPO, examinando assim se o crescimento de BT3 transformado não foi inibido.
[00152] A cepa BT3 (APPO) foi fornecida pela Universidade Hokkaido (Japão) e é uma cepa de E. coli que é deficiente em PPO do tipo hemG e tem resistência à canamicina (ver “Watanabe N, Che FS, Iwano M, Takayama S, Yoshida S Isogai A. Dual targeting of spinach protoporphyrinogen IX oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons, J. Biol. Chem. 276(23) :20474-20481, 2001; Che FS, Watanabe N, Iwano M, Inokuchi H, Takayama S, Yoshida S, Isogai A. Molecular Characterization and Subcellular Localization of Protoporphyrinogen IX oxidase in Spinach Chloroplasts, Plant
Physiol.124(1):59-70, 2000”).
[00153] O procedimento experimental detalhado foi como a seguir:
[00154] as células competentes BT3 foram transformadas com os plasmídeos pET303-CyPPOl6 e pET303- CyPPO17 e aquelas com uma ou mais de mutações construídas no Exemplo 2, respectivamente, e foram cultivadas em meio de ágar LB contendo carbenicilina (Gold Biotechnology, Co., Ltd.).
[00155] Colônia única de FE. coli transformada com cada gene CyPPO foi cultivada em 3 ml de caldo LB contendo carbenicilina durante a noite, e depois foi subcultivada até a absorbância (ODçsoo) atingir 0,5 al. Em seguida, foi diluída com caldo LB a OD«oo = 0,5. Novamente, a solução diluída foi diluída em série 4 vezes por um fator de um décimo.
[00156] O meio de ágar LB (LB 25g/l, Bacto ágar 159g/1) contendo carbenicilina (100 pg/ml) e O a 4.000 ÀpM de vários herbicidas dissolvidos em DMSO foi preparado. Em seguida, 10 ul de cada solução diluída foram deixados cair na placa e cultivados a 37 ºC sob luz (Tabelas 7, e 9, Figs. 2 a 6, e 18 a 22) ou no escuro (Tabelas 8 e 10, Figs. 7 a 17, e23a 33) por 16 a 20 horas. Em seguida, a extensão da tolerância foi avaliada. Os herbicidas inibidores da PPO usados nos experimentos foram listados na Tabela 6: [Tabela 6) Herbicidas inibidores da PPO usados nos experimentos [rent O resieias Pirimidinadiona saflufenacil Éter difenílico
[00157] A extensão da tolerância a herbicida dos genes foi avaliada comparando a dos genes mutados com a do tipo selvagem. A tolerância relativa foi representada com “+” como um fator de 10 vezes. O resultado da avaliação foi listado nas Tabelas 7 a 10 e nas Figs. 2 a 33. [Tabela 7] Avaliação da tolerância a herbicida de CyPPOl6 mutada "e nº tiafenacil | saflufenacil | flumioxazin | sulfentrazona | fomesafen mutação [E see e e Fr 4 | F360v cm | | [| | Fo Fr E Ir Pose pr pe mo me |
O
E ee pes ET 1 mutação etil Fr E [2 qe a e | ss FA EE Fr [e ese e e mom Is E [se a |
FF dr N.T (Não testado) [Tabela 8] Avaliação de tolerância a herbicida de CyPPOl6 mutada e fome ame uniesco [so E [ps E so E [E pro O A [E ses E
E
22 | R85A+1327T+F360M +++++ ++4+4++ ROSASVI GOCAAL 0au+ESSO ROSASVI GOA va DAME rSAONM ROSAVI 6a aTr+ESSO ROSATA GOmAvanaMErDSOM ResasvIO OM a 2 TA FAOM VOA Samtvao Ma rabo! [es jess | ViSOcIa Saca TIA FASOM [es jess | PREGANDO Ima FaOoM
ROSAS COCA AL OALAVIOSMA ESOM VIOOErA GOI VaOaME La a TT FAÇO [Tabela 9] Avaliação de tolerância a herbicida de CyPPOl7 mutada N Sítio de tiafi il flufi il | flumi i Lf fe f o: | mutação afenacil | saflufenaci. umioxazin | sulfentrazona | fomesafen [ra o TATA peer TT ee Te A gs EE re EEE rm EF EEE
[5o. | attáCao *º | cctemvorten | pixactonta | pentoxarona [ESTEIO | [2 [ss am pj [2 enem der 1 | [a [som ema fr er e [e een Bo pj [6 rss o A pj e N.T (Não testado) [Tabela 10] Avaliação de tolerância a herbicida de CyPPOl7 mutada [1º rio eta [eim [mit Ta | 4 vissem [7 ansemeasa ff [9 [assa fe [17 [es2emessar O fa [18 [es2emeasam fe e e
19 | RBBA+V164C+F359I ++1++ +++ ++++ ROtaVI GAIA coMEasH RODAVA va DAMEnTOO
ROBAVI GAITA DOT FASON ROBATA COLAVDAMEnTOO ROTA COTA DOT+EASON ROPASVIO AMAR OT+EASOM VIOAcrA GGrA Van AMErDO O VIOAerA G6rAra2OTAFAS ALOOLIVIO AMAR DOTE Faso 38 | REBA+VIGACHALGGL+V30OAM+ | ,,,,, "ms "" F3591I 39 | RE8A+V164C+A166L+L326T+ F359M V164C+A1l66L+V304M+L326T +F359M R88A+V164C+Al66C+V304M+ 326T+F359M
[00158] Nas Tabelas 7 a 10, o nível de tolerância foi apresentado como '-” de tolerância do tipo selvagem e de variantes equivalentes ao do tipo selvagem e foi feito como +” por cada resistência de 10 vezes até “"+++++' como resistência máxima. (O nível de tolerância foi avaliado pelo nível de crescimento relativo de variantes do tipo selvagem nos meios que contêm maior concentração de herbicida; '+Y' = 1-9 vezes mais tolerância, '++'” = 10-99 vezes mais tolerância “+++/= 100-999 vezes mais tolerância,' ++++ '= 1.000-9.999 vezes mais tolerância, '+++++'= mais de 10.000 vezes mais tolerância).
[00159] As Figs. 2 a 17 mostram a tolerância do tipo selvagem de CyPPOl16 e suas variantes, e Figs. 18 a 33 mostram o tipo selvagem de CyPPO17 e suas variantes. As concentrações de herbicidas foram escritas acima nas fotografias do teste de tolerância. Uma série de diluições (ODe«0o = 0,5; 0,05; 0,005; 0,0005; 0,00005) foi feita e marcada com colorante em placas de ágar LB suplementadas com herbicidas.
[00160] Como mostrado nas Tabelas 7 a 10 e Figs. 2 a 33, todas as cepas BT3 transformadas com variantes de CyPPOl6 ou CyPPOl17 apresentaram nível de tolerância mais alto do que o do tipo selvagem contra vários herbicidas inibidores da PPO.
Exemplo 4: Medição da atividade enzimática de PPO e valor de ICso para herbicidas
[00161] As atividades enzimáticas das variantes em que os aminoácidos de certa posição da proteína PPO mutada foram medidas e o ensaio de inibição com os herbicidas inibidores da PPO foi realizado.
[00162] Embora a solubilidade da proteína PPO seja marcadamente baixa em condições aquosas, ela aumentou bastante quando a proteína de ligação à maltose (MBP) foi fundida à proteína PPO. Assim, as proteínas PPO do tipo selvagem e variantes foram expressadas como fundidas à MBP e foram usadas para experimentos.
[00163] De modo a expressar proteínas do tipo selvagem e variantes de CyPPOl6 e CyPPOl7, esses genes foram introduzidos no vetor pMAL-c2x (referir-se à Fig. 34), respectivamente.
[00164] O procedimento experimental detalhado foi como a seguir: usando os iniciadores listados na Tabela 12, foi realizada PCR para amplificar os genes de PPO nas seguintes condições.
Mistura de reação PCR Molde (DNA sintético de CyPPOl6 ou CyPPO17) 1 ul Tampão 10X 5 pl Mistura dNTP (10 mM cada) 1 ul Iniciador direto (10 uM) 1 ul Iniciador reverso (10 uM) 1 ul DDW 40 ul Pfu-X (solvente, 2,5 unidades/nl) 1 pl Total 50 ul
[Tabela 11] Condição de reação PCR [Tabela 12] Lista de Iniciadores para clonagem de CyPPOl6 e CyPPOl7 em pMAL-c2xX Cepa Iniciador Sequência SEQ
ID NO Spirulina Thermosynecho NK55a —
[00165] Os produtos de PCR amplificados e o vetor PMAL-c2x (NEB, Fig. 34) foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Sall, e ligados para construir plasmídeos PMAL-c2x-CyPPOl6 e pMAL-c2x-CyPPO17 usando T4 DNA ligase (RBC, 3 unidades/ul).
[00166] Os genes de CyPPOl6 e CyPPOl7 clonados no vetor pMAL-c2x foram mutados por mutagênese direcionada ao sítio usando os iniciadores listados nas Tabelas 4 e 5, respectivamente.
Mistura de reação PCR Molde 1 ul Tampão 10X 5 ul Mistura dNTP (10 mM cada) 1 ul Iniciador direto (10 uM) 1 ul
Iniciador reverso (10 uM) 1 ul DDW 40 ul Pfu-X (solvente, 2,5 unidades/nl) 1 ul Total 50 ul
[00167] Em seguida, E. coli BL21 CodonPlus (DE3) foi transformado com construções.
[00168] As E. coli transformadas foram cultivadas nas seguintes condições para expressar proteínas PPO:
[00169] Indução: ODs“oo = 0,2, adição de IPTG a concentração final de 0,3 mM;
[00170] Temperatura de cultura: 23 ºC, cultura de agitação de 200 rpm;
[00171] Tempo de cultura: 16 horas;
[00172] Volume de cultura: frasco de 200 ml/1.000 ml.
[00173] Após a colheita das células, a lise celular e a extração de proteínas foram realizadas pelo seguinte processo:
[00174] Tampão de extração: Tampão da coluna (Tris- Cl 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM) 5 ml de tampão/g de célula;
[00175] Sonicação: SONICS & MATERIALS VCX130 (130 watts);
[00176] 15 s LIGADO, 10 s DESLIGADO por 5 min em gelo;
[00177] Centrifugação a 4 ºC por 20 minutos (20.000x g); e o sobrenadante obtido após a centrifugação foi diluído na razão de 1:6 com tampão de coluna.
[00178] O processo a seguir para purificação da proteína PPO foi realizado em uma câmara fria a 4 ºC. A resina de amilose (NEB) foi recheada em coluna de 1,5 x 15 cm (Bio-Rad, Colunas Econo de 1,5 x 15 cm, coluna de cromatografia em vidro, máx. de vol), e os extratos de proteínas obtidos foram carregados na coluna a uma vazão de 0,2 ml/min. A coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão e a presença de proteína na solução de lavagem foi examinada. Quando a proteína não foi mais detectada, o procedimento de lavagem foi encerrado. Em seguida, a proteína MBP-PPO foi eluída com aproximadamente 2 volumes de coluna de tampão contendo maltose 20 mM. A concentração de proteína de cada eluente foi determinada e a eluição foi interrompida quando a proteína não foi mais detectada. Dez microlitros de cada fração foram investigados para quantificação de proteínas e análise por SDS-PAGE. As frações altamente puras das variantes da proteína PPO foram usadas para o ensaio enzimático.
[00179] Como o protoporfirinogênio IX, um substrato da proteína PPO, não estava disponível comercialmente, foi sintetizado quimicamente em laboratório. O processo geral foi realizado no escuro sob fluxo de nitrogênio. Nove microgramas de protoporfirina IX foram dissolvidos em 20 ml de EtOH a 20% (v/v), e agitados sob condições escuras por 30 minutos. A solução de protoporfirina IX obtida foi colocada em um tubo de rosca de 15 ml em uma quantidade de 800 ul, e lavada com nitrogênio gasoso por 5 minutos. A isto, 1,5 g de amálgama de sódio foram adicionados e agitados vigorosamente por 2 minutos. A tampa foi aberta para esgotar o gás hidrogênio no tubo. Depois disso, a tampa foi fechada e incubada por 3 minutos. A solução da protoporfirinogênio IX foi filtrada usando seringa e filtro de membrana de celulose. A 600 ul da solução da protoporfirinogênio IX obtida, foram adicionados aproximadamente 300 ul de MOPS 2M [ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico] para ajustar o pH a 8,0. Para determinar a atividade enzimática da proteína PPO, uma mistura reacional foi preparada com a seguinte composição (com base em 10 ml): Tris-Cl 50 mM (pH 8,0); NaCl 50 mM; 0,04% (v/v) de Tween 20; Glicose 40 mM (0,072 g); 5 unidades de glicose oxidase (16,6 mg); e 10 unidades de catalase (1 ul).
[00180] Cento e oitenta microlitros de uma mistura reacional contendo a proteína PPO purificada foram colocados em placas de 96 poços e foram adicionados 20 ul de proteínas PPO purificadas. Após 50 ul do óleo mineral serem colocadas em camadas, a reação foi iniciada pela adição do substrato, solução da protoporfirinogênio IX, a uma concentração final de 50 UM. A reação prosseguiu em temperatura ambiente por 30 min e a fluorescência da protoporfirina IX foi medida usando um leitor de microplacas (Sense, Hidex) (excitação: 405 nm;
emissão: 633 nm). Para calcular a atividade enzimática de PPO, a solução da protoporfirinogênio IX foi mantida aberta ao ar durante a noite para oxidar a solução. A isso, foi adicionado HCl 2,7 N e a absorbância a 408 nm foi medida. Uma curva padrão foi gerada usando protoporfirina IX padrão, e a atividade de PPO foi medida por calibração de protoporfirina IX usando a curva padrão de protoporfirina IX.
[00181] As atividades enzimáticas do PPO obtido de tipo selvagem e variantes foram mostradas nas Tabelas 14 a
15. As atividades das variantes foram apresentadas relativamente em comparação com as do tipo selvagem.
[00182] Enquanto isso, os valores de velocidade máxima (Vmáx) de cada enzima foram determinados de modo a avaliar as características cinéticas de CyPPOl6 e CyPPOl7. A velocidade inicial da reação foi medida onde a velocidade da reação era proporcional à concentração, variando a concentração do substrato. A quantidade de protoporfirina IX produzida, o produto da reação enzimática, foi medida pelo tempo decorrido em temperatura ambiente por 20 minutos. Os valores de Vmáx foram calculados com o programa de análise de cinética enzimática pela equação de Michaelis-Menten. O AtPPOl do tipo selvagem foi usado como um controle. O resultado foi mostrado na Tabela 13:
[Tabela 13] Valores de Vmáx de CyPPOl6 e CyPPOl7 LL eres Jor — err
[00183] A partir dos resultados acima, os valores de Vmáx de CyPPOl6 e CyPPOl7 foram mais de duas vezes maiores que os de AtPPOl. Isso indica que as proteínas CyPPOl6 e CyPPO17 possuem melhor capacidade como enzima PPO do que a AtPPOl derivada de plantas.
[00184] Além disso, a concentração dos herbicidas inibidores da PPO que inibem a atividade enzimática de PPO de cada PPO tipo selvagem e variantes em 50% (ICsoº) foi medida para cada herbicida. As concentrações finais de cada herbicida foram como à seguir: - tiafenacil, flumioxazin e sulfentrazona: O, 10, 50 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000 nM.
[00185] O valor de ICso, à concentração do herbicida que inibe a atividade enzimática de PPO para 50%, foi calculada adicionando o herbicida das concentrações acima.
[00186] O valor de ICso para cada herbicida foi mostrado nas tabelas 14 e 15 a seguir.
[Tabela 14] Determinação de ICso de CyPPOl6 tipo selvagem e mutante contra vários herbicidas Pp o TRATOS () (nM) (nM) (ns) : : FREE e 7
FS N.T (Não testado) [Tabela 15) Determinação de ICso de CyPPO17 tipo selvagem e mutante contra várias herbicidas FE E FREE [0a FAO FIT TA : ; Im
: ; .
E . 7 sr Io e N.T (Não testado)
[00187] Como mostrado nas Tabelas 14 e 15, foi demonstrado que variantes das proteínas CyPPOl6 e CyPPOl7 apresentaram os valores de ICso significativamente aumentados contra cada herbicida em comparação com o tipo selvagem. Esses resultados indicam que a tolerância a herbicida foi aumentada por substituições de aminoácidos em posições especificadas da proteína PPO. Embora os dados mostrem que as variantes de proteína CyPPOl6 e CyPPOl7 possuem atividade enzimática reduzida em comparação com o tipo selvagem, isso pode ser causado pela diferença entre o ambiente de cloroplasto em que a PPO funciona e a condição de ensaio in vitro. Assim, quando as variantes de PPO são adequadamente montadas e expressadas em cloroplastos nas plantas, a atividade enzimática não seria afetada drasticamente. Exemplo 5. Geração de transformantes de Arabidopsis thaliana usando variantes de CyPPO e teste de tolerância a herbicida inibidor da PPO 5-1. Construção de vetores de transformação de A. thaliana e geração de transformantes de A. thaliana
[00188] A. thaliana foi transformado com um vetor binário tendo ORF de um marcador selecionável, gene Bar (gene tolerante a glufosinato), e ORF de cada gene mutante de CyPPOl6 e CyPPO17. A planta transgênica foi examinada quanto à tolerância cruzada a herbicidas inibidores de glufosinato e inibidores da PPO. O gene bar também foi usado para examinar se o transgene foi herdado de maneira estável durante gerações. O promotor NOS e o terminador E9 foram usados para a expressão do gene bar.
[00189] De modo a expressar proteínas de CyPPOl6, variantes de CyPPOl6, CyPPOl7, e variantes de CyPPOl7 em plantas, foram usados um promotor CaMV35S e um terminador NOS. Os genes codificadores das variantes de CyPPOl6, variantes de CyPPOl6, CyPPOl7, e variantes de CyPPOl7 foram introduzidos no vetor binário usando as enzimas de restrição XholI e BamHI. Além disso, para confirmação da expressão da proteína, a etiqueta de hemaglutinina (HA) foi fundida à região C-terminal do gene de codificação da proteína PPO usando as enzimas de restrição BamHI e SacI. Além disso, de modo a transitar a proteína para o cloroplasto, o gene do peptídeo de trânsito (TP) (SEQ ID NO: 90) do gene AtPPOl (SEQ ID NO: 89) foi fundido à região N-terminal do gene de codificação da proteína PPO usando enzimas de restrição Xbal e XhoI.
[00190] Cada vector construído foi transformado numa célula competente de Agrobacterium tumefaciens GV3101 pelo método de congelamento-descongelamento. As células competentes Agrobacterium GV3101 foram preparadas seguindo procedimentos, a cepa Agrobacterium GV3101 foi cultivada em ml de meio LB a 30 ºC, 200 rpm por 12 horas. As células foram subcultivadas em 200 ml de meio LB a 30 ºC, 200 rpm por 3 a 4 horas, e centrifugadas a 3.000x g a 4 ºC por 20 minutos. O sedimento celular foi lavado com água destilada estéril e depois recolocado em suspensão em 20 ml de meio LB. Alíquotas de 200 ul congeladas com nitrogênio líquido foram armazenadas em um congelador profundo.
[00191] Cada Agrobacterium transformado foi triado em meio LB contendo espectinomicina. A colônia triada foi cultivada em caldo LB. Após a colheita das células de Agrobacterium no meio de cultura, recolocadas em suspensão na solução contendo sacarose à 5% (p/v) e Silwet L-77 a 0,05% (v/v) (Momentive Performance Materials Co., Ltd.) a uma absorbância (ODrcoo) de 0,8. Pelo método de imersão floral, o
A. thaliana tipo selvagem (ecótipo Col-0) foi transformado, e as sementes T;, foram colhidas após 1 a 2 meses.
[00192] As plantas transgênicas foram pesquisadas com tolerância a glufosinato que foi conferida pela expressão do gene Bar no vetor binário. As sementes Tl obtidas foram semeadas em 1/2 meio MS (2,25 9g/l de sal MS, 10 g/l1 de sacarose, 7 g/l de Ágar) suplementadas com glufosinato 50 UM, e as plantas sobreviventes foram selecionadas 7 dias após a semeadura. Eles foram então transplantados para o solo e cultivados para obter plantas T1.
[00193] De modo a examinar a tolerância a herbicida inibidores da PPO das plantas transgênicas, as plantas com 4 semanas de idade foram pulverizadas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil l11uM e Silwet L-77 (v/v) a 0,05%) em uma área de 40 x 60 cm (0,24 me). Enquanto o m A. thaliana tipo selvagem (ecótipo Col-0) morreu completamente dentro de 7 dias após o tratamento, cada planta transgênica não mostrou danos ao tratamento com herbicida inibidor da PPO.
[00194] As sementes T, foram colhidas de planta transgênica T, e foram semeadas em meio 1/2 MS (2,25 g/l1 de sal MS, 10 g/l de sacarose, 7 g/l de Ágar) suplementado com glufosinato 50 uM. Uma semana depois, as plantas sobreviventes foram transplantadas para o solo.
5-2. Verificação da tolerância a herbicida de plantas
Arabidopsis transformadas (T>)
[00195] Plantas Arabidopsis (T;) transformadas com genes incluindo CyPPOl6, variantes de CyPPOl6, (F360T, F360M, F360V, Al62C+F360M), CyPPOl7 ou variantes de CyPPOl7 (F3591, F359M, F359V, V304M+F359I1) foram testadas quanto à sua tolerância de herbicidas.
[00196] De modo a examinar a tolerância a herbicida inibidor da PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas CyPPOl6 ou CyPPOl7 do tipo selvagem foram pulverizadas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil 1 puM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em área de 40 x de 60 cm (0,24 mº). A tolerância a herbicida foi avaliada 3 dias após o tratamento. A planta Arabidopsis do tipo selvagem (ecótipo Col-0) foi usada como um controle.
[00197] As plantas transgênicas avaliadas de Arabidopsis (T:) após tratamento com tiafenacil 1 puM foram mostradas na Fig. 35.
[00198] De modo a examinar a tolerância a herbicida inibidor da PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas de variantes de CyPPOl6 ou variantes de CyPPOl7 foram uniformemente pulverizadas com herbicida (100 ml de tiafenacil 5 puM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em área de 40 x 60 cm (0,24 md). A tolerância a herbicida foi avaliada 3 dias após o tratamento. A planta Arabidopsis do tipo selvagem (ecótipo Col-0) e as plantas transgênicas CyPPOl6 do tipo selvagem ou CyPPO17 tipo selvagem foram usadas como controle.
[00199] As plantas transgênicas de Arabidopsis (T>2) após o tratamento com tiafenacil 5 uM foram mostradas na Fig. 36.
[00200] Com base nos resultados acima (Figs. 35 e 36), a tolerância a herbicida de plantas transgênicas foi avaliada com o índice de Lesão definido na Tabela 16. [Tabela 16) Definição do índice de lesões Índice de lesões | Sintoma o Sem dano 1 Ponta de folha seca 2 | Mais que 20% e menos que 30% da planta estavam queimados 2,5 | Mais que 30% e menos que 50% da planta estavam queimados 3 | Mais que 50% e menos que 70% da planta estavam queimados 4 | Mais que 70% da planta estavam queimados A planta inteira estava seca e morreu
[00201] os níveis de tolerância das plantas transgênicas foram avaliados de acordo com a definição do índice de lesões e foram mostrados nas Tabelas 17 a 19.
[Tabela 17] Índice de lesões de plantas transgênicas de CyPPOl6 do tipo selvagem e de CyPPOl7 do tipo selvagem após tratamento com tiafenacil 1 uM Col-0 CyPPOl6 do tipolcyPPOIT do tipo selvagem selvagem
Índice dels 2 2 lesões [Tabela 18] Índice de lesões de plantas transgênicas de variantes de CyPPOl6 após tratamento com tiafenacil 5 uM
Col-0 [CyPPOI6 F360I |F360M [F360V [ALI62C do tipo selvagem +F360M Índice de|s 2 2 2 2 lesões [Tabela 19) Índice de lesões de plantas transgênicas de variantes de CyPPOl7 após tratamento com tiafenacil 5 uM Col-0 [cyPPO17 F359I [F359M |F359V [v304M do tipo selvagem +F3591 Índice dels 1 2 1 lesões

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 modificada, em que um ou mais de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em R85, F156, V160, Al62, Gl163, V305, C307, F324, L327, L337, 1340, e F360 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é(são) respectivamente e independentemente excluído(s) ou substituído(s) por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), Wí(Trp), NíAsn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(AsSp), E(Glu), R(Arg), H(His), e K(Lys), que é diferente do aminoácido na posição correspondente de SEQ ID NO: 1; um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 modificada, em que um ou mais de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em R88, F160, V164, Al66, G167, V304, C306, F323, L326, L336, 1339, e F359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 é(são) respectivamente e independentemente excluído(s) ou substituído(s) por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), VíVal), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), Wí(Trp), NíAsn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), e K(Lys),
que é diferente do aminoácido na posição correspondente de SEQ ID NO: 3; e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 modificada, em que um ou mais de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em R85, F156, V160, Al62, G163, V305, C307, F324, L327, L337, 1340, e F360 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é(são) respectivamente e independentemente excluído(s) ou substituído(s) por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), e A(Ala), que é diferente do aminoácido na posição correspondente de SEQ ID NO: 1; um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 modificada, em que um ou mais de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em R88, F160, V164, Al66, G167, V304, C306, F323, L326, L336, 1339, e F359 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 é(são) respectivamente e independentemente excluído(s) ou substituído(s) por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), e A(Ala), que é diferente do aminoácido na posição correspondente de SEQ ID NO: 3; e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em F360M, F360L, F3601I F360C, F360V, F360T, V305I, V305L, Al62L, Al62C, Al621, V305M, R85A, F156A, V160C, V160S, F324V, L327T, e I340T, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em F359M, F359C, F359L, F359I1, F359V, F359T, V304I, V304L, A1l66L, Al66C, Al661I, V304M, R88A, F160A, V164C, V164S, F323V, L326T, e 1339T, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO: l, em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em mutações de aminoácidos de F360M, F360L, F360I, F360C, F360V, F360T, V3051I, V305L, Al62L, Al62C, Al621, V305M, R85A, F156A, V160C, V1608S, F324V, L327T, 1340T, R85A+F360M, R85A+F360V, R85A+F3601, F156A+F360M, V160C+F360M, V160C+F360I V160C+F360V, Al62C+F360M, Al62C+F3601, Al62C+F360V, Al62L+F360M, Al62L+F3601, Al62L+F360V, V305M+F360M, V305M+F3601, V305M+F360V, F324V+F360M, L327T+F360M, L327T+F360I, L327T+F360V, I340T+F360M, R85A+V160C+F3601, R85A+A162L+F360M, R85A+V305M+F3601, R85A+L327T+F360M, V160C+Al62L+F3601, V160C+V305M+F360M, V160C+L327T+F3601, Al62L+V305M+F360M, .Al62C+L327T+F360M, V305M+L327T+F360M, Al62C+V305M+F360M, Al62I1+V305M+F360M, V160C+Al62C+F360M, V160C+Al62L+F360M, R85A+V160C+Al62L+F3601, R85A+V160C+V305M+F360M, R85A+V160C+L327T+F3601, R85A+A1l62C+L327T+F360M, R85A+A1l62L+V305M+F360M, R85A+V305M+L327T+F360M, V160C+Al62L+V305M+F3601, V160C+Al62C+L327T+F360M, Al62C+V305M+L327T+F360M, R85A+V160C+Al62C+L327T+F360M, R85A+V160C+A1l62L+V305M+F360M,
V160C+Al62C+V305M+L327T+F360M e R85A+V160C+Al62C+V305M+L327T+F360M, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo modificação para SEQ ID NO: 3, em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em mutações de aminoácidos de F359M, F359C, F359L, F359I, F359V, F359T, V3041, V304L, Al66L, Al66C, Al661, V304M, R88A, F160A, V164C, V164S, F323V, L326T, 1339T, R88A+F3591, R88A+F359V, R88A+F359M, VI164C+F3591, V164C+F359V, V164C+F359M, Al66L+F3591, Al66L+F359V, Al66L+F359M, Al66C+F3591, Al66C+F359V, Al66C+F359M, F160A+F359M, V304M+F3591, V304M+F359V, V304M+F359M, F323V+F359M, L326T+F3591, L326T+F359V, L326T+F359M, I339T+F359M, R88A+V164C+F3591, R88A+A1l66L+F359M, R88A+V304M+F3591, R88A+L326T+F359M, VI64C+Al66L+F3591, V164C+V304M+F359M, V1I64C+L326T+F3591, Al66L+V304M+F359M, Al66L+L326T+F3591, V304M+L326T+F359M, Al66C+V304M+F359M, .Al66I+V304M+F359M, VI164C+Al66C+F359M, V164C+Al66L+F359M, R88A+V164C+Al66L+F3591, R88A+V164C+V304M+F3591, R88A+V164C+L326T+F359M, R88A+A1l66L+V304M+F3591, R88A+A1l66L+L326T+F359M, R88A+V304M+L326T+F359M, V164C+Al66L+V304M+F3591, V164C+Al66L+L326T+F359M, Al66L+V304M+L326T+F3591, R88A+V164C+Al66L+V304M+F359T, R88A+V164C+Al66L+L326T+F359M, V164C+Al66L+V304M+L326T+F359M, e
+V164C+Al66C+V304M+L326T+F359M, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
5. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Vetor recombinante caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 5.
7. Composição para conferir ou intensificar a tolerância a herbicidas de uma planta ou alga, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais selecionado(s) do grupo que consiste em: o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo; um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo; e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o herbicida é um herbicida que inibe a protoporfirinogênio IX oxidase.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o herbicida é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pirimidinedionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N-fenilftalimidas fenilésteres, tiadiazóis, oxadiazóis, triazolinonas, oxazolidinedionas, piraclonila, flufenpir-etila e profluazol.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o herbicida é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em butafenacila, saflufenacila, benzfendizona, tiafenacila, fomesafeno, oxifluorfeno, aclonifeno, acifluorfeno, bifenox, etoxifeno, lactofeno, clometoxifeno, clorintrofeno, fluoroglicofen- etila, halosafeno, piraflufen-etila, fluazolato, flumioxazina, cinidon-etila, flumiclorac-pentila, flutiaceto, tidiazimina, oxadiargila, oxadiazona, carfentrazona, sulfentrazona, azafenidina, pentoxazona, piraclonila, flufenpir-etila, profluazol, fenopilato, carbamato análogos de fenopilato, e sal agricolamente aceitável dos mesmos.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a planta ou algas compreende/compreendem adicionalmente um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, e sua tolerância ao segundo herbicida é conferida ou intensificada.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o segundo herbicida é selecionado do grupo que consiste em glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D(ácido 2,4-diclorofenoxiacético), isoxaflutol, herbicida inibidor de ALS (acetolactato sintase), herbicida inibidor de fotossistema II, herbicida à base de fenilureia, herbicida à base de bromoxinil e combinações dos mesmos.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida é um ou mais de selecionados do grupo que consistem em: EPSPS (S-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase resistente a glifosato), GOX (glifosato oxidase), GAT (glifosato-N-acetiltransferase) ou glifosato descarboxilase tolerante a herbicida de glifosato; PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferase) tolerante a herbicida de glufosinato; DMO (dicamba monooxigenase) tolerante a herbicida dicamba; 2,4-D monooxigenase ou AAD (ariloxialcanoato dioxigenase) tolerante a herbicida 2,4-D(ácido 2,47 diclorofenoxiacético); ALS (acetolactato sintase), AHAS (acetohidroxiácido sintase) ou AtAHASL (subunidade grande de acetohidroxiácido sintase de Arabidopsis thaliana) tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS (acetolactato sintase); proteína Dl do fotossistema II tolerante a herbicida inibidor do fotossistema II; Citocromo P450 tolerante a herbicida de fenilureia; HPPD tolerante a herbicida inibidor de plastídeos (hidroxifenilpiruvato dioxigenase); nitrilase tolerante a herbicida de bromoxinila; e combinações dos mesmos.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida é um ou mais de selecionados do grupo que consistem em: gene epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 ou gat4621 cp4 tolerante a herbicida de glifosato; gene BAR ou PAT tolerante a herbicida de glufosinato; gene dmo tolerante a herbicida dicamba; gene AAD-1 ou AAD-12 tolerante a herbicida 2,4-D(ácido 2,4-diclorofenoxiacético); gene W336 HPPDPF tolerante a herbicida de isoxaflutol; gene ALS, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA ou SurB tolerante a herbicida de isoxaflutol; gene psbA tolerante a herbicida inibidor do fotossistema II; gene CYP76B1l tolerante a herbicida de isoxaflutol; gene bxn tolerante a herbicida de bromoxinila; e combinações dos mesmos.
15. Transformante de uma alga tendo tolerância a herbicida, ou um clone ou progênie da mesma, caracterizado(a) pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo.
16. Transformante, clone ou progênie, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado(a) pelo fato de que o transformante é uma alga unicelular não classificada no Reino Plantae ou uma alga unicelular procariótica.
17. Método para preparar uma planta ou alga transgênica tendo tolerância a herbicida, o método caracterizado pelo fato de que a introdução do polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo em um(a) alga ou célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.
18. Método para conferir ou intensificar a tolerância a herbicidas de uma planta ou alga, o método caracterizado pelo fato de que compreende a introdução do polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo para um(a) alga ou célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.
19. Método para controlar ervas daninhas em uma terra de cultivo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer à terra de cultivo uma planta que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase na terra de cultivo ou na planta.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a etapa de aplicação de uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase às terras de cultivo é realizada aplicando uma dosagem eficaz de dois ou mais tipos de herbicidas inibidores de protoporfirinogênio IX oxidase sequencialmente ou simultaneamente.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta compreende adicionalmente um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, e a etapa de aplicação de uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase às terras de cultivo é realizada aplicando dosagens eficazes do herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase e um segundo herbicida, aplicados sequencialmente ou simultaneamente.
22. Método para remover um organismo aquático indesejado de um meio de cultura, o método caracterizado pelo fato de que: fornecer um meio de cultura com algas que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase ao meio de cultura.
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