WO2019117578A1 - Ppo의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및 /또는 증진을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Ppo의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및 /또는 증진을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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안영옥
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한윤정
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    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management

Definitions

  • compositions and methods for imparting and / or enhancing herbicide tolerance using mutants of PPO are provided.
  • Techniques are provided for imparting and / or enhancing resistance to herbicides of plants and / or algae using protoporphyrinogen IX oxidase mutants.
  • porphyrin synthesis pathway is the key to the chlorophyll and heme
  • protoporphyrinogen IX oxidase catalyzes the oxidation of protoporphyrinogen IX to protoporphyrin IX into protoporphyrin IX do.
  • PPO protoporphyrinogen IX oxidase
  • protoporphyrinogen IX is released from the normal porphyrin synthesis pathway and then transferred from the chloroplast to the cytoplasm and rapidly oxidized to protoporphyrin IX, (Sangryo), which is a highly active species in the presence of the plant, causing rapid plant cell death.
  • herbicides that inhibit PPO activity have been developed and, depending on the chemical structure, pyrimidinediones, diphenyl-ethers,
  • phenylpyr azoles N-phenylphthalimides, thiadiazoles, o> cadi azoles, triazinones, triazolidinones, tr i azol inones), oxazolidinedione series
  • Algae are photosynthetic organisms, The compound can be converted into energy capable of being synthesized.
  • algae can fix carbon by photosynthesis and remove greenhouse gases from the atmosphere by converting carbon dioxide into sugar, starch, lipids, fats, or other biomolecules.
  • large-scale cultivation of algae can produce a variety of substances such as industrial enzymes, therapeutic compounds and proteins, nutrients, commercial materials and fuel materials.
  • Patent Document 1 United States Patent Application Publication No. US 6,308,458 (Oct. 30, 2001)
  • Patent Document 2 United States Patent Application Publication No. US 6,808,904 (Oct. 26, 2004)
  • Patent Document 3 US Patent Application Registration No. US 7, 563, 950 (2009.07.21)
  • Patent Document 4 International Patent Application Publication No. WO02011 / 085221 (July 14, 2011)
  • Non-Patent Document 1 Li X, Volrath SL, Chi Locott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an ef fi cient select ion marker for agrobacter ium tume faci ion of mai ze. Pl ant Physiol. 133: 736-747, 2003
  • the PP0 gene is isolated from various organisms, and that this gene and its amino acid variants exhibit broad herbicide resistance to protoporphyrinogen IX oxidase (PPO) activity inhibiting herbicides, Algae) can be conferred herbicide tolerance and / or enhanced tolerance.
  • PPO protoporphyrinogen IX oxidase
  • One example is the combination of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 with the PP0 activity inhibiting herbicide 2019/117578 1 »(: 1 ⁇ ⁇ 2018/015654
  • amino acids located at the binding site with the activity inhibiting herbicide of SEQ ID NO: 1 are each independently deleted or corresponding Or an amino acid sequence having at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence homology with the amino acid sequence substituted with the other amino acid do.
  • Amino acid residues located at a binding site with the herbicidal activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 are selected from the group consisting of amino acids 140, 209, 213, 215, 0216, and 360 , 3362, 386, 89, 99, 1402, and 422,
  • polypeptide of SEQ ID NO: 3 (For example, amino acids located at the binding site with the herbicide inhibiting activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 3) of SEQ ID NO: 3 (for example, the ashes of the polypeptide of SEQ ID NO: 3) involved in interaction with the inhibitory herbicide, Or an amino acid sequence having at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: do.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 3 Amino acids located at the binding site with the inhibitory herbicide may be selected from the group consisting of 1 to 95, 164, 1168, 70, 0171, 1311, 313, 329, 32, 42, 1345, and 13456.
  • Another example provides a polynucleotide encoding the polypeptide variant.
  • Another example provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • Another example provides a recombinant cell comprising said recombinant vector. Another example is
  • polypeptides having the above polypeptide variants and polypeptides having a sequence homology of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more thereof Polynucleotides;
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 may comprise the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 3 may comprise the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: But is not limited thereto.
  • the herbicide may be a herbicide that inhibits protoporphyrinogen IX oxidase.
  • the herbicide may be selected from the group consisting of pyrimidinediones, diphenyl ethers, phenylpyrazoles, N-phenylphthalimides, phenylesters, Thiadiazoles, oxadiazoles, triazinones, triazol inones, oxazolidinediones, and the like.
  • oxazol idinediones and other herbicides.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the herbicide may be selected from the group consisting of butafenaci 1,
  • aclonifen acifluorfen, bifenox, ethoxyfen, lactofen, chlomethoxyfen, chlornitrofen, fluoroglucopene-
  • fluoroglycofen-ethyl halosafen
  • pyraflufen-ethyl fluazolate
  • flumioxazin cinidon-ethyl
  • Flumiclorac-pentyl Flumiclorac-pentyl
  • fluthiacetate fluoroglycofen-ethyl
  • fluazolate flumioxazin
  • cinidon-ethyl Flumiclorac-pentyl
  • fluthiacetate fluthiacetate
  • the plant means a multicellular eukaryote having photosynthesis, which may be monocotyledonous or dicotyledonous, herbaceous plant or woody plant.
  • Algae means single-celled organisms that undergo photosynthesis, and may be prokaryotic or eukaryotic.
  • the plant or bird is genetically engineered to further comprise a second herbicide resistant polypeptide or a gene encoding the same, wherein a broader range of herbicide resistance to the second herbicide is conferred and / or promoted Lt; / RTI >
  • the plant or algae genetically engineered to further contain the second herbicide-resistant polypeptide or the gene encoding the second herbicide-resistant polypeptide may further comprise a second herbicide-resistant polypeptide or a second herbicide-resistant polypeptide encoded by the composition for imparting tolerance to and / Gene of the present invention.
  • the composition for imparting and / or enhancing resistance to herbicides may further comprise a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the same.
  • the second herbicide includes, but is not limited to, a cell division inhibiting herbicide, a photosynthetic inhibiting herbicide, an amino acid synthesis inhibiting herbicide, a pigment inhibiting herbicide and a cell membrane inhibiting herbicide.
  • the second herbicide is selected from the group consisting of glyphosate, glufosinate, di camba, 2,4-D (2,4-
  • the second herbicide-resistant polypeptide may be glyphosate resistant 5-eno1pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (GOPS), glyoxal oxidase (GOX), glyphosate-N- acetyltransferase (GAT)
  • Glyphosate decarboxylase glyphosinate herbicide tolerant phosphatothricin-N-acetyltransferase (PAT): dicaraba monooxygenase resistant: 2,4-D herbicide tolerant 2,4-D monooxygenase or AAD (aryloxyalkanoate (ALS) inhibitor sulfonylurea herbicide tolerant ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), or AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxy
  • the gene encoding the second herbicide-resistant polypeptide may be a glyphosate herbicide-resistant cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2 mepsps, goxv247, gat4601 or gat4621 genes; Glufosinate herbicide resistant bar, pat or pat (SYN) genes; Dicamba herbicide resistant dmo gene; 2,4-D herbicide resistant AAD-1, AAD-12 gene; ALS inhibitory sulfonylurea herbicide tolerant ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, SurA or SurB;
  • transformants, clones, or progeny thereof which are transformed with the polynucleotides and conferred and / or enhanced resistance to herbicides of herbicide tolerant plants and / or algae.
  • Another example provides a method for producing plants or algae conferred and / or enhanced resistance to herbicides, comprising transforming said polynucleotides into plants and / or algae.
  • Another example is the use of the polynucleotide in plants and / or birds Providing a method of conferring and / or enhancing tolerance to herbicides of plants and / or birds, including the step of transforming.
  • the transformation may be carried out on algae, and / or cells, protoplasts, calluses, dullerenes, seeds, cotyledons, shoots, or whole bodies of plants.
  • the transformant may be a bird, a plant cell, a protoplast, a callus, a hypocotyl, a seed, a cotyledon, a shoot, or a whole body.
  • Another example is selected from the group comprising at least one selected from the group consisting of the polypeptide, the polypeptide variant, the polynucleotide encoding the polypeptide, the recombinant vector comprising the polynucleotide, and the recombinant vector comprising the recombinant vector And applying an effective amount of a herbicide to the plantation to inhibit protoporphyrinogen IX oxidase.
  • the present invention also provides a method for controlling weeds in a field.
  • the step of applying an effective amount of a herbicide that inhibits protoporphyrinogen IX oxidase to the plant matter may be carried out sequentially or simultaneously with an effective amount of a herbicide that inhibits two or more protoporphyrinogen IX oxidases .
  • the plant is genetically engineered to further contain a second herbicide resistant polypeptide or a gene encoding the same, wherein an effective amount of the herbicide and the second herbicide inhibiting protoporphyrinogen IX oxidase in the plant is sequentially Or at the same time.
  • Another example is selected from the group comprising at least one selected from the group consisting of the polypeptide, the polypeptide variant, the polynucleotide encoding the polypeptide, the recombinant vector comprising the polynucleotide, and the recombinant vector comprising the recombinant vector Comprising applying to the culture medium an algae comprising at least one of the protoporphyrinogen IX oxidase inhibitors, and applying an effective amount of a herbicide inhibiting protoporphyrinogen IX oxidase to the culture medium .
  • Techniques are provided for imparting and / or enhancing tolerance to herbicides in plants or algae.
  • giving resistance to the plant or algae-free it is resistant to "give resistance to herbicides in plants or algae and / or promote or” plant or resistance increase of the herbicide of the bird 'is a herbicide, or a herbicide Enhancing tolerance to tolerant plants or algae, or both.
  • the term "comprising of a sequence” or “comprising a sequence” is used to mean all the cases where the sequence is included, and includes sequences other than the sequence described It is not interpreted as the road of exclusion.
  • amino acids of SEQ ID NO: 1 e.g., amino acids located at the binding site with the PP0 activity inhibiting herbicide of SEQ ID NO: 1 that are involved in the interaction of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 with the PPO activity inhibiting herbicide Or an amino acid sequence having at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: A polypeptide variant consisting of a sequence; And
  • amino acids of SEQ ID NO: 3 e.g., amino acids located at the binding site with the PP0 activity inhibiting herbicide of Ser. No. 3
  • amino acids of SEQ ID NO: 3 e.g., amino acids located at the binding site with the PP0 activity inhibiting herbicide of Ser. No. 3
  • the polynucleotide may be designed to include codons optimized for the cells to be transduced among the codons encoding each amino acid. The optimization codon can be easily understood by those skilled in the art (see, for example, "http: //www.genscr ipt .com / codon-opt .html",
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 may comprise the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 3 may comprise the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: But is not limited thereto.
  • a transformant having resistance to a herbicide transformed with a polynucleotide encoding a variant of said polypeptide or polypeptide may be designed to include codons optimized for the cells to be transduced among the codons encoding each amino acid.
  • the optimization codon can be readily understood by those skilled in the art (for example, "http: // www. Genscr ipt. Com / codon-opt.
  • a method for producing a plant or a bird having resistance to a herbicide which comprises transforming the polynucleotide into a cell, a protoplast, a callus, a hypocotyl, a seed, a cotyledon, a shoot, / RTI >
  • the polypeptides of SEQ ID NOS: 1 and 3 provided herein are proteins derived from microorganisms and are herbicide tolerant proteins having resistance to inhibitory herbicides. Specifically, a genus Chlorella protocheids 1) 0 protein derived from the protein The amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of the gene encoding the same is shown in SEQ ID NO: 2, respectively. Further, there is provided a resulting ⁇ Mai small (377 to ⁇ ») Rhodococcus Santos, this The amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the gene encoding the same is shown in SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the polypeptide and polypeptide variants described above are herbicide tolerant ash) proteins or herbicide resistant It can also be expressed as a protein variant.
  • herbicide-tolerant ash) or variant thereof &quot refers to a herbicide-tolerant 0 protein or a herbicide resistant egg 0 protein variant , a herbicide resistant protein coding gene, A protein variant coding gene, or both.
  • amino acid variations Deletion, addition and / or insertion of one or more amino acids selected from the amino acid residues of the interaction site between the protein and the herbicide.
  • Such a protein having the amino acid mutation may maintain the enzyme activity before the mutation .
  • amino acids of SEQ ID NO: 1 are each independently deleted or replaced with the original amino acid at the corresponding position (that is, the amino acid at the corresponding position in the wild type) Or an amino acid sequence having at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence homology with said amino acid sequence.
  • amino acid residue substituted with an amino acid refers to the ancestral mushroom 140 (" 140th position mushroom ") of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Quot ;, interpreted in the same manner), ⁇ 209 ⁇ 213, Show 215, 0216, ⁇ 360,
  • variants of the polypeptide are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 140, F209, V213,815, 0216, 3,603, 3362, 3,386, 89,99, 1402 and 422 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: More than species, each
  • Amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues selected from the group consisting of amino acid residues selected from the group consisting of SEQ ID NO: Lt; / RTI >
  • the variant of the polypeptide has an amino acid sequence of 422.4? (The amino acid residue at the 422nd position is replaced by ⁇ 0 ⁇ 1); The expression of the following amino acid mutation is interpreted in the same way), ⁇ 4221, ⁇ 4220, 422 ⁇ 4221, ⁇ 4221, Show 215 Show 215 ( : Show 2151, ⁇ 36, At least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% amino acid sequence comprising at least one amino acid mutation selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2133, 386, 13891, 14021,
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 422/1, 4221, 4220, 422/4221, or 4221, and the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 215, 2151, ⁇ 3601, ⁇ ? 209 213 (:, ⁇ 2135, 386 13891,
  • the tomb 140 Show + ⁇ 42, yo 14 (+ ⁇ 422, 209 yo + 422! ⁇ 1, ⁇ 2130 + ⁇ 4221, ⁇ 2130 + ⁇ 4221,
  • polypeptide of SEQ ID NO: 3 is related to the interaction with the? 0 activity inhibitory herbicide (the polypeptide of SEQ ID NO: 3 Amino acid residues in the amino acid sequence of the wild-type locus), or an amino acid sequence in which at least 95%, 96% or more of the amino acid sequence is replaced with another amino acid , 97% or more, 98% or more, or 99% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 3 or an amino acid residue substituted with another amino acid with respect to the original amino acid at that position for example, amino acids located at the binding site with the? 0 activity inhibiting herbicide of the polypeptide of SEQ ID NO: the amino acid sequence of the third at least one selected
  • eunseo column number from the group consisting of I 95, ⁇ 164, 1168, four of 70, followed 71, 1311, 313, ⁇ 329 32, 42, 1 jong or more selected from the group consisting of 1345 and 1365 .
  • the variant of the polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 164, 1168, SEQ ID NO: 70, 0171, 1311, 313, 329, 32, 42, 1345 and 365 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: Each independently,
  • the variant of the above polypeptide may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence of 13651, 13651, 13651, 13651, 13 ⁇ 45 64 11680, 11683, 70 At least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% amino acid sequence comprising at least one amino acid mutation selected from the group consisting of SEQ ID NO: Or an amino acid sequence having sequence homology. More specifically, the variant of the polypeptide has, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • 1 to 95% of the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1111 + wash 17 (+13111 ⁇ 1 tag 3321 + 1365 or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% Or may include an amino acid sequence having homology.
  • the peptide may be a polypeptide having an amino acid sequence (for example, an amino acid sequence as described above or an amino acid sequence having an amino acid mutation (Such as in a plant, in a plant cell or in a cell culture, in a plant tissue, etc.), in an algae, and / or in a test tube, of a polypeptide having an amino acid sequence of about 5 Herbicide tolerance while maintaining an enzyme activity of at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% , And the above-mentioned sequence homologous substrate can be used as the herbicide tolerant herbicide-resistant protein or variant described in the present specification satisfies the above conditions (having
  • the herbicide-tolerant ash) protein variant can be used as a herbicide- Characterized by exhibiting enhanced herbicide tolerance compared to the wild type.
  • polypeptide (herbicide-resistant PP0 protein) and the polypeptide variant (herbicide-resistant PP0 protein variant) may be a polypeptide comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, And a variation exhibiting biological equivalent activity.
  • the additional mutation may be an amino acid substitution that does not entirely alter the activity of the molecule, and such amino acid substitutions are known in the art.
  • the additional substitution is selected from the group consisting of amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Allaig, Ala / Thr, Ser / Asn, , Thr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg,
  • the herbicide resistant PP0 protein variant is a variant of the herbicide resistant PP0 protein, wherein at least one amino acid is selected from the group consisting of phosphorylat ion, sul fat ion, acyl at ion, glycosylat ion, methyl at ion, And may be modi fi fi cation with at least one member selected from the group consisting of farnesylate and the like.
  • the herbicide-resistant PPO protein variant may include a protein variant having increased structural stability or increased protein activity due to amino acid variation and / or modification of the protein.
  • sequence homology &quot refers to a similarity to a wild type (wi ld type) or reference amino acid sequence or base sequence, and is defined as 60% or more, 65% or more, 70
  • said herbicide resistant PP0 protein comprises an amino acid residue that is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% Or a biologically equivalent activity with a variant thereof.
  • Such a proteinaceous animal may contain the same active site as the target protein.
  • the herbicide-resistant PP0 protein or mutants thereof can be obtained by extraction and purification from nature in a manner well known in the art. Alternatively, it can be obtained as a recombinant protein using a gene recombination technique.
  • a nucleic acid encoding a herbicide-resistant PP0 protein or a mutant thereof is inserted into an appropriate expression vector, the vector is transformed into a host cell, the host cell is cultured to express the desired protein, And recovering the herbicide resistant PPO protein or mutant thereof from the host cell.
  • the protein may be expressed in a selected host cell and then subjected to conventional biochemical separation techniques such as treatment with a protein precipitant (salting-out method), centrifugation, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, (Gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. In order to separate proteins having high purity, two or more of them may be used in combination.
  • the herbicide-resistant PPO nucleic acid molecules can be isolated or prepared using standard molecular biology techniques, such as chemical synthesis or recombinant methods, or commercially available.
  • the provided PP0 protein / nucleic acid molecule or variants thereof may be identified by a herbicide tolerance verification system using PP0 deficient E. coli BT3 (A PP1), representative PP0 activity inhibiting herbicides , And it has been confirmed that transit peptid (TP) can be expressed in the chloroplast of a plant.
  • the PP0 protein / nucleic acid molecule can be used for plant expression Can be expressed in monocotyledonous plants such as dicotyledonous plants or rice such as Arabidopsis thaliana ecotype Columbi aO, and even if the transformed plant is treated with PP0 activity inhibiting herbicide, It was confirmed that it was possible to grow. In addition, through heritability test, it was confirmed that the herbicide tolerance trait was successfully transferred to the next generation.
  • PP0 protein or variants thereof provided herein can be used to confer and / or enhance the herbicide resistance of plants or algae.
  • polypeptide comprising the above-described polypeptide variant or an amino acid sequence having 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99%
  • Herbicides as used herein refer to active ingredients that kill or control plants or algae, or adversely affect the growth of plants or algae. Further, to herbicide resistance is normally kill the normal or wild-type plants or algae herein, or even processing of herbicides that normally inhibit its growth, the top or the degree inhibition of plant or algae growth, or deterioration as compared to plants or algae for wild-type removal And the growth of plants or algae is continuously carried out.
  • the herbicides include herbicides which inhibit plant or algae protoporphyrinogen IX oxidase (PP). Such PP0 inhibitory herbicides may be pyrimidinedione based
  • pyrimidinediones diphenyl-ethers, phenylpyrazoles, N-phenylphthalimides, phenylesters, thiadiazoles, oxadiazole-based compounds, (c < adiazoles), triazinone, triazol inones, oxazol idinediones and other herbicides.
  • the pyrimidinedione herbicides include butafenacil, saf lufenaci 1, benzf end i zone and tiafenaci 1, It is not limited.
  • the diphenyl ether herbicide is selected from the group consisting of fomesafen, oxyf luorfen, acloni fen, acif luorfen, bi fenox, ethoxy fen But are not limited to, lactofen, chlomethoxyfen, chlorni trofen, fluorourclycofen-ethyl and halosafen.
  • Phenylpyrazole-based herbicides include, but are not limited to, pyraf lufen-ethyl and fuuazolate.
  • the phenylphthalimide herbicides include, but are not limited to, flumioxazin, cinidon-ethyl, and fumiclorac-pentyl. 2019/117578 1 »(: 1/10/06 018/015654
  • Phenylester herbicides include phenopylate (2,4-dichloropheny 1 1-pyrrol idinecarboxylate) and carbamate analogues of phenoxypyrate (such as 0-phenylpyrrol idino- and piperidinocarbamate analogues ("Uj jana B. Nandihal 40 (10) 1993-2000, 1992. "Duke, Duke, and Stephen Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of 0-phenyl pyrrol idino- and piperidinocarbamate herbicides, J. Agric. )), And the like, but are not limited thereto.
  • the carbamate analog of the phenoxypyrate is pyrrolidine-1-carboxyl ic acid phenyl ester (CAS No. 55379 ⁇ 71-0), 1-pyrrolidine 2-chlorophenyl ester (CAS No. 143121-06-6), 4-chlorophenyl pyrrolidine (1-carboxylate) -l-carboxylate: CAS No. < / RTI >
  • Thiadiazole-based herbicides include, but are not limited to, fluthiacet and Thidi azimin.
  • Oxadiazole-based herbicides include, but are not limited to, oxadi argyl and oxadi azone.
  • Triazinone herbicides include, but are not limited to, trifluidiminzine.
  • the triazolidinone herbicides include, but are not limited to, carfentrazone, sul fentrazone and azafenidin.
  • the oxazolidinedione herbicide includes, but is not limited to, pentoxazone solvate ; 0X320116) .
  • herbicides include, but are not limited to, pyraconyl 1), flufenpyir-ethyl (group 1 11 61 p 1 - 61 : 1 17 1) and profluazole (1 20 1).
  • Herbicide tolerance provided herein The gene or a variant thereof may be introduced into plants or birds by various methods known in the art, and preferably expression vectors for plant or avian transformation can be used.
  • suitable promoters to be contained in the vector may be any of those conventionally used in the art for transgenic introduction into plants, for example, SP6 promoter, T7 promoter, T3 promoter, PM promoter , Maize ubiquitin promoter, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (nos) promoter, pigwort mosaic virus 35S promoter, water crane basiliform virus promoter, combellinella yellowmovirus promoter, ribulose- 1,5-bis-phosphate-carboxylic la dehydratase small subunit (ssRUBISCO) mineral oil conductivity promoter, rice cytosolic trio seuposeu sulfate isomerase dehydratase (TPI) promoter, a kinase transferase (APRT) promoter of Arabidopsis view adenine phospholipids of " , An octopine synthase promoter, and a blue copper binding protein (BCB) promoter
  • the vector may also comprise a poly A signal sequence which results in a 3'-terminal polyadenylation, for example from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (NOS 3 ' end, the octopine synthase terminator from the Octopine synthase gene of Agrobacterium tumefaciens, the 3'end of the protease inhibitor I or H gene of tomato or potato, the CaMV 35S terminator, the rice a-amylase But is not limited to, a RAmyle terminator and a phaseol in terminator.
  • a chloroplast-specific promoter In the case of algae transformation, a chloroplast-specific promoter, a nuclear promoter, an invariant promoter, or an inducible promoter may be used as a promoter.
  • the herbicide resistant PP0 gene or variant thereof provided herein may be operably linked to a 5'UTR or 3 'UTR and designed to function in the nucleus of the bird.
  • the vector may further comprise a transcription control sequence suitable for avian transformation.
  • the recombinant gene conferring herbicide tolerance may be incorporated into the genome or chloroplast genome of the nucleus in a host alga, but is not limited thereto.
  • the vector may link a transit peptide necessary for targeting to the chloroplast to the PP0 gene or a 5 1 -position of the variant thereof, in order to express the herbicide resistant PP0 gene or its variant in the chloroplast.
  • the vector may optionally further comprise a gene encoding a selectable marker as a reporter molecule.
  • selectable markers include antibiotics such as neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, (Glyphosate, glucosinide, phosphinotricin, etc.) resistance gene, and the like, but are not limited thereto.
  • a recombinant vector for plant expression does not contain Agrobacterium iAgrobacterium binary vector, cointegration vector or T-DNA site, but a general vector designed to be expressed in a plant can be used.
  • the binary vector is composed of LB (left border) and RB (right) which are necessary for movement in a Ti (tumor inducing) plasmid border) and a plasmid having a gene necessary for transferring a target nucleotide.
  • a vector containing a promoter region and a polyadenylation signal sequence for expression in a plant can be used in the plasmid.
  • Agrobacterium as a transformation strain for introducing the recombinant vector into a plant .
  • the aci & ri1 ⁇ 2rmedi ated transformat ion wherein Agrobacterium Tome Pacific Enschede ⁇ Agrobacterium tumefaciens) or Agrobacterium rayijo to Ness (Agrobacterhm rhizogenes) may be used.
  • electroporation, particle bombardment, polyethylene glycol-mediated uptake, and the like are used to transform the recombinant plasmid into a plant Lt; / RTI >
  • Transgenic plants into which the gene has been introduced in the above manner can be regenerated into plants by a process such as callus induction, rooting and soil purification using standard techniques known in the art.
  • Plants to be transformed in this specification include not only mature plants but also plant cells capable of developing into mature plants (including suspension cultured cells), protoplasts, callus, hypocotyl, seeds seeds, cotyledons, shoots, and the like.
  • the category of the transformant of the present invention includes not only the transformant into which the gene is introduced but also its clones or offspring 0 ⁇ generation, T 2 generation, T 3 generation, T 4 generation, T 5 generation.
  • Also included within the scope of the transgenic plants of the present invention are, for example, plants in which herbicide resistant traits are inherited as silent or oily progeny of the PP0 gene or a variant thereof.
  • Plants to which the present invention can be applied are not particularly limited, Or a twin-leaf plant. It can also be an herbal or woody plant.
  • the monocotyledonous plants may be selected from the group consisting of A1 ismataceae, Hydrocharitaceae, Jimcaginaceae, Scheuchzeriaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Zosteraceae, Li 1 iaceae,
  • the species are: Haemodoraceae, Agavaceae, Amaryl 1 idaceae, Dioscoreaceae, Pontederiaceae, Iridaceae, Burmanniaceae, Juncaceae,
  • the dicotyledonous plants may be selected from the group consisting of Staphylococcus aureus, Diapensiaceae, Clethraceae, Pyrolaceae,
  • Acanthaceae Poploniaceae, Convolvulaceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Labiatae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Acanthaceae, Pedal iaceae, Orobanchaceae. Gesneriaceae, Lent ibulariaceae,
  • Fagaceae Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, SantaIaceae, Loranthaceae, It is believed that this species is a member of the family Polygonaceae, Phytolaccaceae, Nyctaginaceae, Aizoaceae, Portulacaceae, Caryophyl laceae, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Cactaceae, Magnol iaceae, Illiciaceae, Lauraceae, Cercidiphyl laceae, Ranunculaceae, Berber idaceae, (Lardizabalaceae), new sand dune (Menispermaceae), Nymphaeaceae, Ceratophyl laceae, Cabombaceae, Saururaceae, Piperaceae, Chloranthaceae, Ar istolochiaceae, Act inidiaceae, Camelliaceae, Theaceae, Guttiferae, D
  • Simaroubaceae Mel iaceae, Polygalaceae, Anacardiaceae, Aceraceae, Sapindaceae, Hippocastanaceae, Sabiaceae, Bacillus thuringiensis, (Balsaminaceae), Aqui fol iaceae, Celastraceae, Staphyleaceae, Buxaceae, Empetraceae, Rhanmaceae, and Grapeaceae.
  • the plant is selected from the group consisting of food crops including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, red bean, oats and millet; Vegetable crops including cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, squash, onions, onions and carrots; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, forage, grass, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut, rapeseed, grass and castor; Fruit trees, including pine, palm oil and eucalyptus; rosaceae, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, chrysanthemum, Flowers including lilies and toolpipes; And feed crops including raglass, red clover, orchardgrass, alfalfa, tall fescue and perennialla grass, but are not limited thereto.
  • Vegetable crops including cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon
  • the plant may be selected from the group consisting of Arabidopsis, potato, eggplant, cigarette, pepper, tomato, burdock, chard kiss, lettuce, bellflower, spinach, modern sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, , Dicotyledonous plants such as cucumber, amber, pak, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, or pea; And terminal plants such as rice, wheat, barley, corn, sorghum and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the algae to which the present invention can be applied is not particularly limited and may be a prokaryotic alga or an eukaryotic alga.
  • algae can be cyanobacteria, green algae, red algae, brown algae, macroalgae or microalgae.
  • Cyanobacteria include the Chroococcales (e.g., Aphanocapsa,
  • Microcystis, Radiocyst is, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, fforonichinia), Gloeobacter, Cyanobacterium, Cyanobacterium, Cyanobacterium, Cyanobacteria, Cyanobacteria, ia gates, Nostocales gates (eg, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae) Osci 1 lator iales statement (eg, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix,
  • Pseudomonas Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudomonas, Schizothr ix, Spirul ina,
  • Pleurocapsales eg Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpel, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanier ia, Xenococcus
  • Prochlorales gates or Stigonematales gates eg Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerel la , Hapalosiphon, Mast igocladopsis, Mast igocladus, Nostochopsis, St igonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, West iel lopsis).
  • birds include Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales,
  • Dunal iel la, Scenedesmus, Chlorel la, or Hematococcm Other examples of birds include Phaeodactylum tr icornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp. , Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas reinhardtii, Chaetoceros muelleri, Navicula saprophiata, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus,
  • Nannochloropsis sal ina Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudet icus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chui i, Pavlova spp. , Aphanocapsa spp. , Synechosyst is spp. , Nannochloris spp. And the like.
  • the present invention is not limited to the above-mentioned species, and algae belonging to various species and species can be included.
  • Plants or birds into which the herbicide-resistant PP0 or variants thereof provided herein are introduced may exhibit resistance to two or more PP0 inhibiting herbicides.
  • the techniques provided herein can be used to control weeds or to remove unwanted aquatic organisms by sequential or simultaneous use of two or more PP0 inhibiting herbicides.
  • One example is a herbicide-resistant PP0 protein, a variant thereof, 2019/117578 1 »(: 1 ⁇ ⁇ 2018/015654
  • the herbicide tolerant protein, the mutant thereof, or the gene encoding the same may be used in combination with the second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the second herbicide-resistant polypeptide.
  • the present invention can be used to control weeds and / or to remove unwanted aquatic organisms by sequential or simultaneous use of two or more different herbicides, including sequestering herbicides, in any order.
  • the herbicide having a different mechanism of action from the inhibitory herbicide is referred to as "the second herbicide ".
  • One example is a herbicide-tolerant protein, a mutant thereof, or a gene encoding the same, And a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the herbicide-resistant polypeptide, or a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the herbicide-resistant polypeptide.
  • Another example is a herbicide-tolerant protein, a mutant thereof, or a gene encoding the herbicide-tolerant protein described above; Resistant to a herbicide of a plant or an avian species, including a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the same,
  • Encoding gene And transforming the second herbicide-resistant polypeptide or the gene encoding the same into a bird, a cell, a protoplast, a callus, a hypocotyl, a seed, a cotyledon, a shoot or a whole plant of a plant.
  • a method for producing plants or algae is provided.
  • herbicide-resistant proteins described above, variants thereof, Encoding gene
  • an effective amount of a herbicide and a second herbicide which inhibit protoporphyrinogen IX oxidase in the plantation are administered simultaneously or in sequence to a plant containing a second herbicide resistant polypeptide or a gene encoding the same,
  • the method comprising the step of applying weeds sequentially in the field, regardless of whether they are weeded or not.
  • Another example is a herbicide-resistant PP0 protein or a gene encoding the herbicide-resistant PP0 protein described above; And a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding said herbicide-resistant polypeptide, or a gene encoding said second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding said herbicide-resistant polypeptide,
  • the method comprising the steps of sequentially applying, regardless of order, a method for removing undesired aquatic organisms from a culture medium.
  • the plant or alga may further include a second herbicide-resistant polypeptide or a gene encoding the second herbicide-resistant polypeptide and may be imparted with and / or enhanced resistance to the second herbicide.
  • the second herbicide may include, but is not limited to, a cell division inhibiting herbicide, a photosynthetic inhibiting herbicide, an amino acid synthesis inhibiting herbicide, a pigment inhibiting herbicide, a cell membrane inhibiting herbicide and / or combinations thereof.
  • the second herbicide is selected from the group consisting of glyphosate, glufosinate, di camba, 2,4-D (2,4-
  • acetylsalicylic acid A second photosystem II inhibiting herbicide, a phenylurea herbicide, a pigment inhibiting herbicide, a bromoxyni 1 herbicide, and / or combinations thereof. no.
  • the second herbicide resistant polypeptide may be glyphosate herbicide resistant EPSPS (glyphosate resistant 5-eno 1 pyr uvy 1 sh two mat e-3-phosphatase synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT - acetyl transferase or glyphosate decarboxylase; glyphosinate herbicide tolerant PAT (phosphinothricin-acetyltransferase): dikamba herbicide resistant DMO (di camba monooxygenase);
  • 2,4-D herbicide-tolerant 2,4-D monooxygenase or AAD ary 1 oxya 1 kanoat e di oxygenase: ALS inhibiting sul fonylurea herbicide tolerant ALS (acetol actate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), or
  • Atahase [Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit; A second photosystem II herbicide resistant photosystem II protein D1; a phenylurea herbicide resistant cytochrome P450 (cytochrome P450); a plastid inhibitory herbicide resistant HPPD (hy droxyphenyl pyruvate dioxygenase); a bromosynil herbicide tolerant nitrile Rabbit, rabbit, rabbit, rabbit, rabbit, rabbit, rabbit, rabbit, rabbit and rabbit.
  • the gene encoding the second herbicide-resistant polypeptide may be a glyphosate herbicide-resistant cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2 mepsps, goxv247, gat4601 or gat4621 genes; Glufosinate herbicide resistant bar, pat or pat (SYN) genes; Dicamba herbicide resistant dmo gene; 2,4-D herbicide resistant AAD-1, AAD-12 gene; ALS, inhibitor of ALS inhibiting sulphonylurea herbicide ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, SurA or SurB; second photosystem II inhibitory herbicide resistant psbA gene ; Phenylurea herbicide resistant CYP76B1 gene; Isoxaflutol herbicide resistant HPPDPF W336 gene; Bromoxynil herbicide resistant bx
  • the herbicide-tolerant PP0 protein mutant or the gene encoding the herbicide-resistant PP0 protein according to the present invention can be applied to plants or algae to impart and / or enhance superior herbicide tolerance traits and to economically control weeds through selective control using herbicides Unwanted aquatic organisms can be removed.
  • 1 is a cleavage map of pET303-CT-Hi s vector.
  • Fig. 2 shows the transformation of ApPPOl wi ld type gene (represented by ApPPOlWT) or ApPPOl mutant gene which causes a single amino acid mutation to PP3-deficient BT3 E. coli (PK)), and then ti afenaci l was transfected with 0 uM (mi cromol (control), 50 uM, and 100 uM (top), respectively, and pure lufenacil were treated at 0 uM (control), 50 uM, and 100 uM, Of the cells.
  • Fig. 2 shows the transformation of ApPPOl wi ld type gene (represented by ApPPOlWT) or ApPPOl mutant gene which causes a single amino acid mutation to PP3-deficient BT3 E. coli (PK)), and then ti afenaci l was transfected with 0 uM (mi cromol (control), 50 uM, and 100 uM (top), respectively, and pure
  • FIG. 3 shows the results of transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant genes causing a single amino acid mutation into PP0-deficient BT3 Escherichia coli (APPO), followed by treatment with flumi husbandin at 0 uM (control), 50 uM, and 200 uM (Top) and sulfentrazone (0 uM, control, 5 uM, and 25 uM, respectively).
  • FIG. 4 shows the results of transfection of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant gene which causes a single amino acid mutation in PP0-deficient BT3 Escherichia coli (APPO), and the expression of fomesafen (top) and acifluorfen (bottom)
  • FIG. 5 shows the results of transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant genes causing a single amino acid mutation to PP0-deficient BT3 Escherichia coli (A PH3), pyraclonil in a concentration of 0 uM (control), 5 uM and 25 uM (Top) and pentojcazone, respectively, at 0 uM (control), 5 uM, and 10 uM, respectively.
  • FIG. 5 shows the results of transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant genes causing a single amino acid mutation to PP0-deficient BT3 Escherichia coli (A PH3), pyraclonil in a concentration of 0 uM (control), 5 uM and 25 uM (Top) and pentojcazone, respectively, at 0 uM (control), 5 uM, and 10 uM, respectively.
  • FIG. 5 shows the results of transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPO
  • FIG. 6 shows the results of transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant genes causing PPO-deficient BT3 Escherichia coli (APPO) with ApPPOl mutant genes, followed by addition of pyraf lufen-ethyl at 0 uM (control), 5 uM, and 10 uM Of the cells treated with each concentration.
  • APPO PPO-deficient BT3 Escherichia coli
  • FIGS. 7 to 12 illustrate the results of the transformation of ApPPOl wild type gene or ApPPOl mutant genes causing two or more amino acid mutations into PP0 E. coli (APPO), PPi-deficient BTi3, and tiifenacil at 0 uM (control) (Control), 200 uM, and 400 uM, respectively, when flumi ⁇ iazin was treated with 0 uM (control), 50 uM, and 100 uM, respectively, , Respectively.
  • Fig. 13 shows the results of transformation of MxPPO wild type gene (represented by MxPPO WT) or MxPPO mutant genes causing a single amino acid mutation in PP0-deficient BT3 Escherichia coli (APP (1)), tifenacil at 0 uM (control), 200 uM, and (Control), 50 uM, and 100 uM, respectively, when treating pure lufenaci I at concentrations of 0 uM (control), 100 uM, and 200 uM, and flumioxazin, respectively, , Respectively.
  • FIGS. 18 to 20 show transformation of MxPPO wi ld type gene or MxPPO mutant gene causing two or more amino acid mutations to BT03-deficient BT3 Escherichia coli (A PP0), and then sul fentrazone was added to 0 uM (control), 200 uM, and 1000 uM, respectively.
  • 21 and 22 show the transformation of MxPPO wi ld type gene or MxPPO mutant gene which causes 4 or more amino acid mutation to BT3 E. coli (PPO) deficient in PPO, and then f lumioMzin was added at 0 uM (control), 400 uM, and 1000 uM, respectively.
  • 25 is a cleavage map of the P MAL-c2x vector.
  • FIG. 26 is a photograph showing seed germination results after 6 days after seeding the transgenic Arabidopsis thaliana (T 2) into which a mutant gene of ApPPOl was inserted in a medium containing herbicide.
  • FIG. 27 is a photograph showing seed germination results after 6 days of inoculation of wild-type or mutant transgenic Arabidopsis thaliana (T 2) of MxPPO in a herbicide-containing medium.
  • Example 1 Acquisition of amino acid information of PP0 interacting with herbicide through analysis of PP0-herbicide complex structure
  • the PP0 gene encoding Myoscoccus Santos' PP0 protein (MxPPO; SEQ ID NO: 3)
  • the PP0 gene ⁇ MxPPOS-named was isolated from Mycobacterium Santos and sequence-optimized to prepare a gene having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8 .
  • tiafenaci 1, safulfenaci 1, flumiraazin, or sul fentrazone were used as ApPPOl, MxPPO protein and PP0 inhibitory herbicide.
  • Binding information of CyPPOlO and herbicide was superimposed on the structure of ApPPOl and MxPPO to obtain the structure information of each protein and herbicide.
  • CyPPOlO Combination information of CyPPOlO and herbicide was confirmed by the following procedure.
  • the gene encoding CyPPOlO protein (SEQ ID NO: 6) was inserted into pET29b vector
  • CyPPOlO protein was expressed using E. coli.
  • the purified CyPPOlO protein was purified by nickel affinity chromatography.
  • the purified CyPPOlO protein was added with 1 mM tiafenaci 1, safulfenaci 1, flumioxazin, or sul fentrazone at a concentration of 1 mM each, and CyPPOlO and tiafenaci 1, saflufenaci 1, flumioxazin , Or sul fentrazone.
  • a mutation gene of ApPPOl and MxPPO was prepared by mutating the amino acid sequence of the ApPPOl and MxPPO amino acid sequences that interact with the herbicide obtained in Example 1 above.
  • ApPPOl and MxPPO genes were synthesized by codon optimization (Minami Cosmo).
  • the primers of Table 2 were used to carry out PCR under the following conditions to isolate and amplify the PP0 gene:
  • the amplified gene products and pET303-CT His vector (VT0163; Novagen; see Fig. 1) were digested with Xbal and Xhol and then ligated with pET303-ApPP (l) and pET303_MxPPO respectively.
  • ApPPOl and MxPPO cloned in the pET303_CT His vector were used as templates and PCR was carried out using the primers shown in Tables 4 and 5 below to prepare mutant genes of ApPPOl and MxPPO.
  • the mutated PP0 gene obtained in Example 2 was transformed into BT3 Escherichia coli (BT3 (PP3) deficient in PP0) and then cultured in the environment treated with the PP0 inhibitory herbicide to confirm the inhibition of the growth of the transformed E. coli .
  • BT3CAPP0 was obtained from Hokkaido University (Japan) and is a hemoglobin-resistant PP0-deficient E. coli strain resistant to kanamycin ("Watanabe N, Che FS, Iwano M, Takayama S, Yoshida S, . Dual-targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons. J. Biol. Chem. 276 (23): 20474-20481, 2001; Che FS, Watanabe N, Iwano
  • Plasmids containing pET303-ApPP01 and pET303_MxPPO plasmids and mutant genes prepared in Example 2 were transformed into BT3 competent cells by thermal shock method and cultured in LB agar medium containing carbenicillin (Gold Biotechnology) .
  • the BT3 transformants with the respective genes inserted were inoculated with LB broth (LPSS, 3 ml) in a single colony and cultured for 12 hours.
  • the 50-100 fd of the culture was added to fresh LB broth and ODsoo was 0.5-1 ,
  • the culture was diluted with LB broth, the absorbance was adjusted to 0.5, and then diluted 4 times with LB broth 1/10, to prepare a coliform culture supernatant.
  • a medium containing herbicide was prepared by mixing LB 25 g / l, Bacto agar 15 g / l, carbenicillin (100 ug / ml) and various herbicides by concentration (final 0-4,000 uM).
  • the above herbicide stocks are all herbicides dissolved in DMSO.
  • the prepared transformant E. coli culture dilution was added to the herbicide-containing LB agar medium at 10 ⁇ and cultured at 37 ° C and light condition (Table 7, Table 9, Table 10, Figures 2 to 6, 13 to 20) Cultured for 16-20 hours under the same conditions (Table 11, Figs. 7 to 12, Figs. 21 to 24), and the degree of growth of the transformed Escherichia coli including each gene was visually confirmed, and the PP0 inhibitory herbicide Were evaluated.
  • the wild type herbicide tolerance level was indicated as “- ", and the higher the tolerance level was, the more the” +++++ " Based on the degree of growth of the transformed E. coli of wi ld type PP0 at the final treatment concentration of the treated herbicide, the level is 1 to 9 times higher than the wi ld type PP0, The ship level is '+++'
  • Figs. 2 to 12 wild type or variants of ApPPOl
  • Figs. 13 to 24 wild type or mutant of MxPPO
  • Five columns of each concentration show the result of 10 times dilution of the culture solution of E. coli.
  • PP0 protein is low in water solubility, but when it is expressed with MBP (maltose binding protein) and fus ion protein (MBP-PTO), it is confirmed that water soluble protein is stably expressed, and the following wild type and mutant proteins are expressed with MBP And expressed in the form of a fusion protein.
  • MBP maltose binding protein
  • MBP-PTO fus ion protein
  • PMAL-c2x-ApPP01 and pMAL-c2x-MxPP0 were prepared under the following conditions in order to express wild-type genes and mutant genes of ApPPOI and MxPPO.
  • the specific experimental procedure is as follows:
  • the amplified gene products and the pMAL-c2x vector were digested with BamHI and Sail and then ligated with pMAL-c2x-MxPP0 (SEQ ID NO: 2) using T4 DNA ligase respectively.
  • PCR was performed under the following conditions using the primers shown in Tables 4 and 5 to prepare mutant genes of ApPPOI and MxPPO.
  • the prepared mutant plasmids were transformed into BL2ICodonP1us (DE3) E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured under the following conditions to express the inserted PP0 gene:
  • Incubation temperature 23 ° C, shaking culture at 200 rpm;
  • Extraction buffer Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 200 mM NaCl) 5 ml buffer / g cel 1;
  • the supernatant obtained by centrifugation was diluted with a column buffer at a ratio of 1: 6.
  • each eluant was determined by eluting the MBP-PPO protein with a column buffer containing 20 mM maltose, which was about 2 volumes based on the column volume, (collecting each fraction into a 1.5 ml tube). Elution was terminated if no more protein was detected.
  • Protoporphyrinogen IX (Protoporphyrinogen IX), a substrate for the PP0 protein, was synthesized. This process was performed in a space where nitrogen gas was streamed. 9 mg of protoporphyrin IX was dissolved in 20 ml of 20% (v / v) EtOH and stirred for 30 minutes under dark conditions. The obtained protoporphyrin IX solution was placed in a 15 ml screw tube in an amount of 800 and the nitrogen gas was flushed for 5 minutes. 1.5 g of sodium amalgam was added thereto, followed by vigorous shaking for 2 minutes. The lid was opened to exhaust the hydrogen gas in the tube. Thereafter, the lid was closed and incubated for 3 minutes.
  • protoporphyrinogen IX solution was filtered using a syringe and a cellulose membrane filter.
  • 2M MOPS [3_ (N morpholino) propanesulfonic acid] was added in an amount of about 300 /
  • reaction mixture (10 ml standard: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0); 50 mM NaCl; 0.04% (v / v) Tween 20; 40 mM glucose (0.072 g), 5 units glucose oxidase (16.6 mg), and 10 units catalase (1 id)).
  • the reaction mixture 180 was placed in 96-well plates,
  • PP0 protein the product from which the MBP-fusion protein was purified 20 was added and the surface was covered with about 50 mineral oil.
  • the fluorescence of protoporphyrin IX was measured using a Mi croplate reader (Hidexjfct sense) (exci tat ion: 405 nm; emi ssion: 633 nm).
  • the tube containing the protoporphyrinogen IX solution was opened in air to oxidize the solution for 12 hours or more.
  • the IC 50 value was determined as the concentration of the herbicide which inhibits the activity of PPO enzyme by 50% before addition of the herbicide by adding the herbicide to the above-mentioned concentration of the herbicide at the above-mentioned concentration.
  • Arabidopsis transformation was performed by constructing a binary vector with 0RF of Bar gene (glufosinate resistance gene), a selection marker, and 0RF of ApPPOl mutant, MxPPO, and MxPPO mutant genes, respectively. Bar gene was also used to confirm the effect of PP0 inhibiting herbicide when crossing herbicides with different mechanism of action, and also used to verify whether the transgenic gene is stable in later stages. For expression of Bar gene, NOS promoter and E9 terminator for transcription termination were used.
  • the CaMV35S promoter and the NOS terminator were used to express ApPPO1 mutants, MxPPO, and MxPPO variants in plants, respectively.
  • the ApPPOl mutant, MxPPO, and MxPPO mutant genes were inserted using Xhol and BamHI restriction enzymes.
  • hemagglutinin (M) tag was inserted on the 3 'end of PP0 gene using BamHI and Sad restriction enzymes to identify the expressed protein.
  • the NOS terminator was inserted after the HA tag to induce transcription termination of the PP0 gene.
  • the transit peptid (TP) (SEQ ID NO: 88) of the AtPPOl gene was inserted at the 5 'end of the PP0 gene using Xbal and Xhol restriction enzymes.
  • Each of the vectors prepared above was transformed into the competent cell of Agrobacterium tumefaciens GV3101 by the freeze-thaw method.
  • GV3101 competent cel 1 strain GV3101 was cultured in 5 ml LB medium a for 12 hours at 30 ° C and 200 rpm. The culture was inoculated into 200 ml of LB medium and cultured at 30 ° C and 200 rpm for 3 to 4 hours and centrifuged at 3000 xg and 4 ° C for 20 minutes. The pellet was washed with sterile distilled water and resuspended in 20 ml LB medium. 200 aliquots were prepared by snap freezing in liquid nitrogen and stored in ultra low temperature.
  • Each transformed Agrobacterium was cultured and screened in an antibiotic medium (LB agar containing spectinomycin). The selected colonies were designated LB broth. Agrobacterium cells were harvested from this culture and suspended in a 5% (w / v) sucrose solution at a concentration of 0.8 (OD) 0.8. Then, 0.05% (v / v) Silwet L-77 ). Using the floral dipping method, transformed Arabidopsis thaliana was transformed into Co 1-0 ecotype Arabidopsis wild type and seeds (1 ⁇ ) were harvested 1 ⁇ 2 months later.
  • Transformants were selected using Bar gene inserted for selection of transgenic plants.
  • the obtained Ti seeds were cultured in 1/2 MS medium supplemented with 50 uM glufoskiate (2.25 g / l MS salt, 10 g / l sucrose, 7 g / l Agar). After 7 days of sowing, surviving individuals were selected and transplanted into soil and grown to obtain Ti plants.
  • tiafenaci 1 solution (1 ⁇ M tiafenacil + 0.05% (w / v) was added to a 40 x 60 cm area (0.24 m 2 ) v / v) Silwet L_77.
  • the wild type Arabidopsis (Co 1-0 ecotype) was killed by treatment with tiafenacil in the same concentration and amount as above. After 4 to 7 days after the treatment with tiafenacil as described above, PP0 inhibitory herbicide tolerance of each transformant was determined.
  • T 2 seed Surviving plants expressed the resistance continuously harvest the seeds were raised in (T 2 seed), the T 2 seeds were added to 50 uM glufosinate 1/2 MS medium (2.25g / l MS salt, 10g / l sucrose, 7g / l Agar) and grown for 6 ⁇ 7 days.
  • T 2 Herbicide tolerance was tested against the Arabidopsis transformants (T 2) in which genes coding for ApPPOl mutants (Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L + Y422M), MxPPO, or MxPPO variant (M365I) were inserted.
  • T 2 in which a mutant gene encoding the ApPPOl mutant (Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L + Y422M), MxPPO or MxPPO mutant (M365I) MS, and the herbicide tolerance of the plants was determined by germination after 6 days of growth. Wild-type Arabidopsis (Col-0 ecotype) was used as a control. The results obtained are shown in Fig. 26 (ApPPOl mutant) and Fig. 27 (MxPPO wild type and MxPPO mutant) 2019/117578 1 »(: 1/10/06 018/015654
  • FIG. 27 shows the germination rate and survival rate of transformants of Pseudo- 0 mutants superior to those of wild-type transformants.

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Abstract

미생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase)의 아미노산 변이체를 이용하여 식물 및 /또는 조류 (algae)의 제초제에 대한 보다 강화된 내성을 부여하거나 및 /또는 내성을 보다 증진시키는 기술이 제공된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
PP0의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물및 방법
【기술분야】
프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyr inogen IX oxidase)의 변이체를 이용하여 식물 및/또는조류 (Algae)의 제초제에 대한 내성을부여 및/또는증진시키는기술이 제공된다.
【배경기술】
포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴
(Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서， 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyr inogen IX oxidase , 이하 PPO； EC: 1.3.3.4)는프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyr inogen IX)로부터 프로토포르피린 IX (Protoporphyr in IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chel atase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴 (Heme)이 합성된다.
따라서， PP0의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고， 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되면， 광과산소분자의 존재 하에서 활성이 높은단일항산소 (s inglet oxygen, 幻ᄅ)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여， PP0 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며， 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyr imidinediones) , 디페닐에테르계 (diphenyl -ethers) , 페닐피라졸계
(phenylpyr azoles) , 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthal imides) , 티아디아졸계 (thi adi azoles) , 옥사디아졸계 (o>cadi azoles ) , 트리아지논 (tr i azinone) , 트리아졸리논계 (tr i azol inones) , 옥사졸리딘디온계
(oxazol idinediones) 및 기타의 10개 계통의 제초제가사용되고있다.
또한， 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을미치지 않게 하기 위해서는재배 대상작물에 상기 제초제들에 대한 내성을부여할필요성이 대두되어 왔다.
한편, 조류 (Algae)는 광합성 생물로서， 빛에너지를 다양한 유용 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당， 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써， 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한， 조류의 대규모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질， 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할수 있다.
그러나, 생물반응기 (bioreactor)또는공개된또는폐쇄된 연못에서 조류를대규모로배양하는경우， 원하지 않는경쟁 생물들, 예를들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류 (rot i fer) 또는 동물성 플랑크톤들에 의하여 오염이 발생할수 있다.
따라서, 원하는 식물 및/또는 조류에 제초제 내성을 부여한 후， 제초제 내성이 없는경쟁 생물들의 성장을저해할수 있는농도로 제초제를 처리하여, 원하는 식물 및/또는 조류를 대규모로 수확할 수 있는 기술이 필요하다.
［선행기술문헌］
［특허문헌］
(특허문헌 1)미국특허출원등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30)
(특허문헌 2) 미국특허출원등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26)
(특허문헌 3)미국특허출원등록공보 US 7, 563, 950 (2009.07.21) (특허문헌 4)국제특허출원공개공보 W02011/085221 (2011.07.14)
［비특허문헌］
(비특허문헌 l)Li X, Vol rath SL, Chi lcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyr inogen oxidase as an ef f i cient select ion marker for agrobacter ium t ume faci ensued i at ed transformat ion of mai ze. Pl ant Physiol . 133： 736-747, 2003
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
본명세서에서， 다양한생물로부터 PP0유전자를분리하여 이 유전자 및 이의 아미노산 변이체가 프로토포르피리노겐 IX옥시다아제 (PP0) 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타냄이 입증되어， 이를 식물 및/또는 조류 (Algae)에 발현시키면 제초제 내성을 부여하거나 및/또는내성을증진시킬수있음이 제안된다.
일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 PP0 활성 저해 제초제와의 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 （예컨대， 서열번호 1의 폴리펩타이드의 灰） 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열또는이와 95%이상， 96%이상， 97%이상， 98%이상, 또는 99%이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 的 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 1의 아미노산서열 중묘140, 209， ¥213, 쇼215， 0216, ¥360, 3362, 386, 89, 99, 1402및 422로 이루어진 군에서 선택된 하나이상일 수 있다.
다른 예는서열번호 3의 폴리펩타이드와
Figure imgf000005_0001
저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 （예컨대， 서열번호 3의 폴리펩타이드의 灰） 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상， 또는 99% 이상의 서열 상동성을갖는 아미노산서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의
Figure imgf000005_0002
저해 제초제와의 결합부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 3의 아미노산서열 중 1?95， ¥164 , 1168 , 사70 , 0171 , 1311 , ¥313 , ?329 , 32 , 42 , 1345및 ¾1365로이루어진군에서 선택된 1종이상일수있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를제공한다 .
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른예는상기 재조합벡터를포함하는재조합세포를제공한다. 다른예는
서열번호 1의 폴리펩타이드의 변이체, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체, 및 이들과 95% 이상, 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상， 또는 99% 이상의 서열상동성을갖는폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드변이체， 및 이들과 95%이상， 96%이상， 97%이상， 98%이상， 또는 99%이상의 서열 상동성을 갖는폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 ;
상기 폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합벡터 ; 및
상기 재조합벡터를포함하는재조합세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한내성 부여 및/또는증진용조성물을제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고， 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일수있으나, 이에 제한되는것은아니다.
상기 제초제는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제일수있다.
구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyrimidinediones)， 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers) , 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles) , 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthal imides) , 페닐에스테르계 (phenylesters)， 티아디아졸계 (thiadiazoles)， 옥사디아졸계 (oxadiazoles)， 트리아지논계 (triazinone) , 트리아졸리논계 (triazol inones) , 옥사졸리딘디온계
(oxazol idinediones) 및 기타 제초제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실 (butafenaci 1 ) , 사플루페나실
(saflufenaci 1 ) , 벤즈펜디존 (benzfendizone) , 티아페나실 (t iafenaci 1 )， 포메사펜 (fomesafen) , 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen) , 아클로니펜
(aclonifen) , 아시플루오르펜 (acifluorfen) , 비페녹스 (bifenox) , 에톡시펜 (ethoxyfen) , 락토펜 (lactofen) , 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen)， 클로르니트로펜 (chlornitrofen) , 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen- ethyl ) , 할로사펜 (halosafen) , 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl ) , 플루아졸레이트 (fluazolate) , 플루미옥사진 (flumioxazin) , 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl) , 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl )， 플루티아셋
(fluthiacet)， 티디아지민 (thidiazimin)， 옥사디아길 (oxadiargyl ) , 옥사디아존 (oxadiazon) , 카펜트라존 · (carfentrazone) , 설펜트라존
(sulfentrazone) , 트리플루디목사진 (trifludimoxazin) , 아자페니딘 (azafenidin) , 펜톡사존 (pentoxazone) , 피라클로1k (pyracloni 1 ) , 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl) , 프로플루아졸 (profluazol ) , 페노필레이트 (phenopyl ate; 2 , 4-di chi oropheny 1 1- pyrrol idinecarboxylate) , 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대 , 0- pheny 1 pyrrol idi no- and piper idinocarbamate analoges ( "Uj j ana B.
Nandihal 1 i , Mary V. Duke, Stephen 0. Duke, Rel at ionships between molecul ar propert ies and biologi cal act ivi t ies of 0-phenyl pyrrol idino- and piper idinocarbamate herbi cides . , J . Agr i c. Food Chem . , 40(10) 1993-2000, 1992 참조))， 이들의 농약적으로 허용가능한 염들， 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
상기 식물은 광합성을 하는 다세포 진핵 생물을 의미하는 것으로, 단자엽 식물또는쌍자엽 식물이거나， 초본식물또는목본식물일 수 있다. 상기 조류 (Algae)는 광합성을 하는 단세포 생물을 의미하는 것으로， 원핵 (Prokaryot i c)조류또는진핵 (Eukaryot i c)조류일수 있다.
일 예에서， 상기 식물또는조류는 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는유전자를더욱포함하도록유전적으로조작되며 상기 제 2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 내성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다. 상기 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는유전자를더욱포함하도록유전적으로조작된 식물또는조류는 상기한 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물에 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함시킨 것을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 따라서, 제초제에 대한내성 부여 및/또는 증진용 조성물은 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를더욱포함하는것일수 있다.
구체 예로， 상기 제 2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제， 광합성 저해성 제초제， 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막저해성 제초제를포함하나, 이에 제한되는것은아니다.
구체 예로, 상기 제 2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate) , 글루포시네이트 (glufosinate)， 디캄바 (di camba) , 2,4-D (2,4-
Di chlorophenoxyacet i c acid) , 이속사들루톨 ( i soxaf lutole) , ALS (acetol actate synthase) 저해성 제초제， 제 2광계 (photosystem I I) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제 또는 브로목시닐
(bromoxyni 1 )계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 았으나, 이에 제한되는것은아니다. 구체 예로， 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-eno1pyruvy1shikimate-3-phosphate synthase) , GOX (glyphosate oxidase) , GAT (glyphosate-N- acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase) : 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N- acetyltransferase) : 디캄바 제초제 내성 DM0 (dicaraba monooxygenase) : 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase)； ALS저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase) , AHAS (acetohydroxyacid synthase) , 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit)； 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1； 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD Qiydroxyphenylpyruvate dioxygenase) : 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase)； 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나， 이에 제한되는 것은아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps , epsps (AG), mepsps , 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar , pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바제초제 내성 dmo유전자; 2,4-D제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, SurA또는 SurB； 제2광계
(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자 및 브로목시닐 제초제 내성 bxn유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종이상을예시할수있으나， 이에 제한되는것은아니다.
다른예는상기 폴리뉴클레오타이드로형질전환된， 제초제 내성 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 형질전환체， 이의 클론, 또는자손을제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는단계를포함하는, 제초제에 대한내성이 부여 및/또는증진된 식물또는조류를제조하는방법을제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는단계를포함하는, 식물 및/또는조류의 제초제에 대한내성을 부여 및/또는증진시키는방법을제공한다.
상기 형질 전환은 조류, 및/또는 식물의 세포, 원형질체， 캘러스， 배축， 종자, 자엽， 신초， 또는 전체 (whol e body)에 대하여 수행되는 것일 수있다.
상기 형질전환체는조류， 또는식물의 세포， 원형질체, 캘러스， 배축, 종자， 자엽, 신초， 또는전체 (whole body)일수있다.
다른 예는， 상기 폴리펩타이드， 폴리펩타이드 변이체， 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터， 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는， 재배지에서 잡초를방제하는방법을제공한다.
구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는， 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로또는동시에 적용하여 수행되는것일수있다.
다른 예로， 상기 식물은 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고， 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제 2의 제초제의 유효량을순차적으로또는동시에 적용하는것일수 있다.
다른 예는， 상기 폴리펩타이드， 폴리펩타이드 변이체， 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
【과제의 해결수단】
식물 또는 조류에 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다. 본명세서에서， ’식물또는조류의 제초제에 대한내성 부여 및/또는 증진 또는 ’식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 증진' 이란 제초제에 내성이 없는 식물또는조류에 대하여 내성을부여하는 것， 또는 제초제에 내성을지닌식물또는조류에 대하여 그내성을보다향상시키는것， 또는 이 모두를포괄하는광범위한의미로해석된다.
본 명세서에서 , ’서열로 이루어진 ' 또는 ’서열을 포함하는’ 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두의미하기 위하여 사용되며， 기재된서열 이외의 서열을포함하는 것을 배제하고자하는의도로해석되지 않는다.
일 예에서,
서열번호 1의 폴리펩타이드와 PP0활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 （예컨대， 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PP0 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상， 96% 이상， 97%이상， 98%이상, 또는 99%이상의 서열 상동성을갖는아미노산서열로 이루어진폴리펩타이드변이체; 및
서열번호 3의 폴리펩타이드와 PP0활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 （예컨대, 서쬘번호 3의 폴리펩타이드의 PP0 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상， 96% 이상, 97%이상， 98%이상， 또는 99%이상의 서열 상동성을갖는아미노산서열로 이루어진폴리펩타이드변이체
로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다.
다른 예에서， 서열번호 1 또는 3의 폴리펩타이드의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입 될 세포에 최적화된 （opt imi zed） 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화코돈은 이 발명이 속하는기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 （예컨대, "http：//www.genscr ipt .com/codon-opt .html "，
"ht tp： //sg . i dt dna . com/ CodonOpt "등참조) .
다른예에서,
서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체， 또는 상기 폴리펩타이드변이체와 95%이상， 96%이상， 97%이상, 98%이상, 또는 99% 이상의 서열상동성을갖는폴리펩타이드폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드변이체또는이와 95%이상， 96%이상, 97%이상， 98%이상, 또는 99%이상의 서열 상동성을갖는폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 ;
상기 폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합벡터; 및
상기 재조합벡터를포함하는재조합세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한내성 부여 및/또는증진용조성물을제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.
다른 예에서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된， 제초제에 대한 내성을 가진 형질전환체가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는코돈들중에서 형질도입될 세포에 최적화된 (opt imi zed) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http: //www. genscr ipt . com/codon-opt .html "，
"ht t p： / /sg . i dt dna . com/ CodonOpt "등참조 ) .
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스， 배축, 종자， 자엽， 신초, 또는식물전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법이 제공된다.
다른 예에서， 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포， 원형질체， 캘러스， 배축， 종자, 자엽， 신초또는식물 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
증진시키는방법을제공한다.
이하, 본발명을보다상세하게 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 서열번호 1 및 3의 폴리펩타이드는 미생물로부터 유래하는 단백질로서， 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 ??0 단백질이다. 구체적으로， 아우제노클로렐라 프로토테코이데스
Figure imgf000012_0001
， / 크）에서 유래한 1）0 단백질이 제공되며, 이를
Figure imgf000012_0002
명명하고， 이의 아미노산 서열을 서열번호 1로， 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 각각 나타낸다 . 또한， 마이소코커스 산투스 （分» 에 377 ）에서 유래한 的가 제공되며, 이를
Figure imgf000012_0003
명명하고， 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로， 이를암호화하는유전자의 염기서열을서열번호 4로각각나타낸다. 본명세서에서， 앞서 설명한폴리펩타이드및 폴리펩타이드변이체는 각각 ᄄ） 계열 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 灰）단백질 또는 제초제 내성
Figure imgf000012_0004
단백질 변이체로도 표현될 수 있다. 또한， 본 명세서에 사용된 바로서 , "제초제 내성 灰）또는 이의 변이체”는상기한제초제 내성 0단백질 또는 제초제 내성 卵0단백질 변이체, 제초제 내성 的단백질 암호화 유전자 또는 제초제 내성
Figure imgf000012_0005
단백질 변이체 암호화 유전자， 또는 이들모두를의미하기 위하여 사용될수있다.
이러한 아미노산 변이는
Figure imgf000012_0006
단백질과 제초제 간 상호작용 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는삽입을포함하는 것일 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이를 갖는 0단백질은변이 전의 효소활성을유지하는것일수 있다.
상기 的단백질의 변이체를보다구체적으로설명하면다음과같다.
Figure imgf000012_0007
제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 （서열번호 1의 폴리펩타이드 （쇼? ?01）의 ™ 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는해당위치의 원래의 아미노산 （즉, 야생형의 해당위치의 아미노산）과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상， 97%이상, 98%이상， 또는 99%이상의 서열상동성을갖는아미노산서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의
Figure imgf000013_0001
활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)는서열번호 1의 아미노산 서열 중의 묘140 (” 140번째 위치의 요)"을의미; 이하의 아미노산잔기의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), ¥209 ¥213, 쇼215， 0216, ¥360,
3362, 386, 89， 99, 1402 및 422로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 묘140, F209, V213 八215， 0216, ¥360, 3362, ?386, 89, 99, 1402 및 422로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 각각
Figure imgf000013_0002
군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산서열또는 이와 95%이상， 96%이상, 97%이상， 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서알을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서， 422¾! (422번째 위치의 아미노산 잔기가 ¥0^1)에서 으로 치환됨을 의미함; 이하의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨)， ¥4221, ¥4220, 422 ¥4221 , ¥4221, 쇼215ᄂ 쇼215(：， 쇼2151， ¥36 ， 財40 ?209 ¥2130, ¥2133, 386 13891, 14021, ¥3601 , 360ᄂ 및 336 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상， 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상， 또는 99%이상의 서열 상동성을갖는아미노산서열을포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 422¾1, ¥4221, ¥4220, 422 ¥4221 , ¥4221, 쇼215ᄂ 쇼215(：， 쇼2151, ¥3601, 볘 ?209 213(：， ¥2135, 386 13891,
14021, ¥3601, 360ᄂ 3362¥, 요140쇼+ 4221 (140번째 잔기의 요에서 쇼로의 치환 및 422번째 잔기의 에서 I로의 치환을 모두 포함; 이하의 2가지 이상의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), 2019/117578 1»(：1^1{2018/015654
묘140쇼+¥42 ， 요14（ +¥422， 209요+ 422!\1， ¥2130+¥4221 , ¥2130+¥4221,
¥2130+¥4221, 쇼21ᄄ+ 4221， 쇼21ᄄ+ 4221, 쇼2150+74221 쇼2151 4221， 쇼21比+¥42 ， 요2151 422¾1， 36(¾+¥422 386¥+ 422 ， ¥36(¾+ 4221 , 8 +¥422， 140 +¥422¾1， 3601+ 4221 , ¥3601+3362 5362¥+¥4221， 요140쇼代21況+¥4221 , 4( 2130+¥4221, 1?14( +요21於+¥4221， 犯40쇼+쇼215 4221， y213C+A215C+Y422l , ¥21洗+쇼21比+¥4221, ¥3601+336 + 4221， 쇼21於代36(¾+¥422¾1， 쇼2151^36(»4221 쇼2151 3_+¥422¾1, ¥2130^2150+¥4221, ¥21洗+쇼2151^42211， 4（ 2130+쇼21於+¥4221， 또는 財40쇼代21洗+쇼21比+¥4221의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산서열 또는 이와 95%이상， 96%이상, 97%이상， 98%이상， 또는 99%이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 포함하는 것일수있다.
다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드 的）와 ??0 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 （서열번호 3의 폴리펩타이드 ⑴의 的 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들）로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는해당위치의 원래의 아미노산 （즉， 야생형의 해당위치의 아미노산）과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상， 97%이상， 98%이상， 또는 99%이상의 서열 상동성을갖는아미노산서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 （예컨대， 서열번호 3의 폴리펩타이드의 ??0 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상）은서열번호 3의 아미노산 서열 중의 요95， ¥164, 1168, 사70， 따71， 1311, 313, ¥329 32, 42, 1345및 1365로이루어진군에서 선택된 1종이상일수 있다.
일 구체예에서， 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산서열 중의 묘95, ¥164, 1168,사70, 0171, 1311, ¥313, 329, 32, 42， 1345및 365로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각독립적으로，
Figure imgf000014_0001
比라）， 1¾6）， 1）（ 0）， 奸대）， 쇼 ）， 이이 ， （｝½1 ， 0夕10,［）^31））， 묘½111）, 용）,
Figure imgf000014_0002
등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 （예컨대, 1（161）, \^ 1）， 1（11 ， 1（1^）, 1（丄611）, 0^5）, 比 ）,사시3） 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환）된 아미노산서열 또는 이와 95%이상, 96%이상， 97%이상， 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대， 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서， 13651, ¾1365ᄂ ]\1365（:, ]«365 1^3651, 1¾5 64 11680, 11683, 70（， 쇼17（止, 쇼1701， 131視， ¥329\ , 13321, 및 134況로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서，
13651, 1\136比, 13650, 1\1365人 13651 , 요95 64 11680, 1168 사70（:， 70ᄂ 701, 131 ， ¥329^, 13321, 13451, 요95쇼+1«3651， 1¾5쇼+1\1365入
11680+13651, 116洗+1\1365 사7況+1\13651， / 7（犯+1365 사701세13651 , 701 1«365 131 +1\13的 I, 131 +¾1365 13321+13651 , 3況+1\1365
\，164요+1«3651， 32^+1¾3651， 13451+13651 , 쇼17況+131 , 사701>131 ,
^701+13111 11680^1700, 116洗+사70ᄂ 1썽5쇼+116洗+13651 , 요95쇼+116洗+1365 요95쇼+사7ᄄ+1\13況 I， 요95쇼+131 +¾13651， 요95쇼+131］ +ᅵ\1365 묘95쇼此33 + 3651， 1썽5쇼札33 +1365¥， 116洗+쇼17（犯+1\1365
11680+131^+13651, 116洗+1311¾ 1365 11680+13321+13651,
11680 3321+1犯65 , 사7此+13111\1+1\13651 , 700此33 +1狀65¥ ,
1311¾1札33況+¾13651 , 131111+13321+^365^ , 1¾5쇼+116洗+사7（犯+1«3651， 요95쇼+116洗+ 7（＞¾3651 묘95쇼+ 7於+131 +1\1365 요95쇼+산7（犯札3321+1\13651 , 요95쇼+ 11680+13111 1365¥， 요95쇼+116洗4丄3321+1\13651， 요95쇼+1311¾1札33幻'+1«3651 , 요95쇼+1311¾1札33況+1\1365 116洗+사7於+1311¾1+1\13651 ,
116洗+사7於札3321+¾1365人 사7吹+1311¾1 33 +13651， 묘95쇼+116於+ 7（犯+131 +1«365 묘95쇼+116洗+사7於札3321+1\13651 , 1?95쇼+11680+ 1311¾1札3321+1365 11680^1700+13111+13321+1365¥, 또는
1?95요+116洗+쇼17（ +13111\1札3321+1365의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열또는 이와 95%이상， 96%이상， 97%이상, 98%이상， 또는 99%이상의 서열상동성을갖는아미노산서열을포함하는것일수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 변이체， 또는 이들과 서열 상동성 （예컨대， 95% 이상， 96% 이상, 97% 이상， 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성）을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 서열 상동성 판단의 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 （예컨대, 앞서 설명한 아미노산 서열 또는 아미노산 변이를 갖는
Figure imgf000016_0001
단백질）와동등정도의 효소활성， 예컨대， 식물내 （식물체 내， 식물세포 또는 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등）， 조류 내， 및/또는 시험관내에서 기준이 되는아미노산서열을갖는폴리펩타이드의 5%이상, 10%이상， 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상， 70% 이상， 80% 이상， 90% 이상， 또는 95% 이상의 효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있으며, 상기와 같은 서열 상동성 기재는 본 명세서에 기재된 제초제 내성 ᄄ） 단백질 또는 변이체가 상기 조건 （효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유）을 만족하는 범위의 모든서열 변이를포함할수 있음을명확하게 하기 위하여 사용된다. 본명세서에서 사용된 아미노산의 명명을아래의 표에 정리하였다:
Figure imgf000016_0002
상기 제초제 내성 灰） 단백질 변이체는 효소 활성은 유지하면서， 야생형과비교하여 증진된제초제 내성을나타내는것을특징으로한다.
또한， 상기 폴리펩타이드 (제초제 내성 PP0단백질) 및 폴리펩타이드 변이체 (제초제 내성 PP0 단백질 변이체)는 앞서 설명한 바와 같은 서열번호 1또는서열번호 3， 또는 앞서 설명한바와같은아미노산변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대， 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있고， 이러한 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 예에서， 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser , Val/I le, Asp/Glu, Thr/Ser , Al a八｝ ly, Al a/Thr , Ser/Asn, Al a/Val , Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,
Asp/Asn, Leu/I le, Leu/Val , Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은아니다. 경우에 따라서， 상기 제초제 내성 PP0 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 인산화 (phosphorylat ion) , 황화 (sul fat ion) , 아실화 (acyl at ion) , 당화 (glycosylat ion) , 메틸화 (methyl at ion) , 파네실화 ( farnesylat ion) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로수식 (modi f i cat ion) 될 수도 있다. 또한, 상기 제초제 내성 PP0 단백질 변이체는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를포함할수있다.
용어 "서열 상동성”이란 야생형 (wi ld type) 또는 기준이 되는 아미노산서열 또는 염기 서열과의 유사한정도를나타내기 위한것으로서 , 제초제 내성 PP0단백질 변이체의 아미노산서열과 60%이상, 65%이상， 70% 이상， 75%이상， 80%이상, 85%이상, 90%이상， 95% 이상, 96%이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서， 상기 제초제 내성 PP0 단백질 또는 이의 변이체와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과동일한활성 부위를포함할수있다.
상기 제초제 내성 PP0단백질 또는 이들의 변이체는당분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는， 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 내성 PP0 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 내성 PP0 단백질 또는 이들의 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법) , 원심분리， 초음파 파쇄， 한외여과, 투석법， 분자체 크로마토그래피 (겔여과)， 흡착크로마토그래피， 이온교환 크로마토그래피， 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을조합하여 이용할수있다.
상기 제초제 내성 PP0핵산분자 (PP0단백질 또는 이들의 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드)는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나， 시판되는것을사용할수있다.
구체적인실시예에서， 상기 제공된 PP0단백질/핵산분자또는 $들의 변이체들은 PP0가 결핍된 대장균 BT3( A PP⑴를 이용한 제초제 내성 검증 시스템을통하여， 화학구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PP0활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타낸다는 것이 검증되었으며, 트랜지트 펩타이드 (trans i t pept ide , TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PP0 단백질/핵산분자는 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 {Arabidopsis t ha liana ecotype Columbi a-O)와 같은 쌍자엽 식물 또는 벼와 같은 단자엽 식물에서 발현이 가능하며， 이와 같이 형질전환된 식물체에 PP0활성 저해 제초제를처리하더라도식물이 발아및/또는 생장가능한것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 내성 형질이 다음 세대로성공적으로전달되는것이 확인되었다.
따라서， 본명세서에서 제공하는 PP0단백질또는이들의 변이체들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 내성을 부여 및/또는증진시키는데사용될수 있다.
일 예는
(1) 앞서 설명한 폴리펩타이드 변이체 또는 이들과 95% 이상， 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상， 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을포함하는폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드， (3)상기 폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합벡터, 및
(4)상기 재조합벡터를포함하는재조합세포ᄀ
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한내성 부여 및/또는증진용조성물을제공한다.
본명세서에서 제초제란, 식물또는조류를사멸시키거나방제하거나， 또는 식물 또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성이란， 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도 , 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 IX옥시다아제 (PP⑴ 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PP0 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계
(pyrimidinediones) , 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers) , 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles) , 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthal imides) , 페닐에스테르계 (phenylesters) , 티아디아졸계 (thiadiazoles)， 옥사디아졸계 (c«adiazoles) , 트리아지논계 (tr iazinone)， 트리아졸리논계 (triazol inones) , 옥사졸리딘디온계 (oxazol idinediones) 및 기타의 제초제를예시할수 있다.
구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실 (butafenaci l ) , 사플루페나실 (saf lufenaci 1 ) , 벤즈펜디존 ( benzf end i zone) 및 티아페나실 (t iafenaci 1 )을포함하나, 이에 제한되지 않는다.
디페닐에테르계 제초제는 포메사펜 (fomesafen) , 옥시플루오르펜 (oxyf luorfen) , 아클로니펜 (acloni fen) , 아시플루오르펜 (aci f luorfen) , 비페녹스 (bi fenox) , 에톡시펜 (ethoxy fen) , 락토펜 (lactofen) , 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen) , 클로르니트로펜 (chlorni trofen) , 플루오로글리코펜-에틸 (f luoroglycofen-ethyl ) 및 할로사펜 (halosafen) 을포함하나， 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸 (pyraf lufen-ethyl ) 및 플루아졸레이트 (f luazolate)를포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (f lumioxazin) , 시니돈- 에틸 (cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸 ( f lumiclorac-pentyl )을 포함하나， 이에 제한되지 않는다. 2019/117578 1»(：1/10公018/015654
페닐에스테르계 (phenylesters) 제초제는 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dich1oropheny1 1-pyrrol idinecarboxylate) 및 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대， 0-phenylpyrrol idino- and piperidinocarbamate analoges ("Uj jana B. Nandihal 1 i , Mary V. Duke, Stephen 0. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of 0-phenyl pyrrol idino- and piperidinocarbamate herbicides . , J . Agric. Food Chem. , 40(10) 1993-2000, 1992" 참조)) 등을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서， 상기 페노필레이트의 카바메이트 유사체는 피롤리딘-1카르복실산 페닐 에스테르 (pyrrol idine-l-carboxyl ic acid phenyl ester; CAS No. 55379ᅳ71-0)， 1_ 피롤리딘카르복실산， 2 -클로로페닐 에스테르 (1-Pyrrol idinecarboxyl icacid， 2-chlorophenyl ester； CAS No. 143121-06-6)， 4-클로로페닐 피롤리딘-1- 카르복실레이트 (4-chlorophenyl pyrrol idine-l-carboxylate： CAS No.
1759-02-0)， 카르밤산， 디에틸-， 2,4-디클로로-5-(2프로피닐옥시)페닐 에스테르 (carbamic acid, diethyl-, 2,4-dich1oro~5-(2- propynyloxy)phenyl ester (9CI)； CAS No. 143121-07-7) , 1- 피롤리딘카르복시산， 2,4 -디클로로-5 -하이드로페닐 에스테르 (1- pyrrol idinecarboxyl icacid, 2,4-dichioro-5-hydroxypheny1 ester； CAS No. 143121-08-8), 2,4-디클로로-5_(메톡시카르보닐)페닐 피롤리딘-1- 카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(methoxycarbonyl )phenyl pyrrol idine-l- carboxylate; CAS No. 133636-94-9 )， 2，4-디클로로-5-[(프로관-2- 일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-
[ (propan-2-yloxy)carbonyl ]phenyl pyrrol idine-l-carboxylate； CAS No . 133636-96-1), 1-피페리딘카르복실산， 2,4-디클로로-5-(2- 프로피닐옥시 )페닐 에스테르 (1-Piperidinecarboxyl ic acid, 2,4_dichloro- 5-(2-propyny1oxy)pheny1 ester； CAS No. 87374-78-5) , 2，4-디클로로-5-
(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro_5- (prop-2-yn-1-y1oxy)pheny1 pyrrol idine-l-carboxylate； CAS No. 87365-63- 7)， 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 4,4-디플루오로피페리딘- 1-카르복실레이트 (2,4-dichloro_5-(prop-2-yn-l-yloxy)phenyl 4,4- di fluoropiperidine-l-carboxylate； CAS No. 138926-22-4) , 1- 피롤리딘카르복실산， 3，3 -디클루오로 2，4 -디클로로-5_(2-프로핀-1- 일옥시 )페닐 에스테르 (1-pyrrol idinecarboxyl icacid, 3,3_di fluoro-， 2,4- di chloro-5-( 2-pr opyn- 1-y 1 oxy ) pheny 1 ester； CAS No. 143121-10-2)， 4 - 클로로- 2 -플루오로- 5 - [ (프로판- 2 -일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘- 1- 카르복실레이트 (4-chloro-2-f luoro-5 - [(propan-2-yl oxy) carbonyl ] phenyl pyrrol idine-l-carboxy l ate ; CAS No . 133636-98-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수 있다.
티아디아졸계 제초제는 플루티아셋 (f luthi acet ) 및 티디아지민 (Thidi azimin)을포함하나， 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길 (oxadi argyl ) 및 옥사디아존 (Oxadi azon)을포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아지논계 제초제는 트리플루디목사진 (tr i f ludimoMzin)을 포함하나， 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존 (carfentrazone) , 설펜트라존 (sul fentrazone) 및 아자페니딘 (azafenidin)을 포함하나， 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존 해!； 0X320116)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타의 제초제는 피라클로닐 1 )， 플루펜피르-에틸 (군 111£61피 1—61:1171 ) 및 프로플루아졸 ( 1 201 )을 포함하나， 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공하는 제초제 내성
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유전자 또는 이의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.
식물체 형질전환의 경우， 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는， 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며， 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터， PM프로모터， 옥수수의 유비퀴틴 프로모터， 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터， 피그워트 모자이크바이러스 35S프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스프로모터， 콤멜리나 엘로우모틀 바이러스 프로모터， 리불로오스- 1,5 -비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI ) 프로모터， 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터'， 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
또한, 상기 벡터는 3’-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며 , 예를 들어 , 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3 ' end) , 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator ) , 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 H 유전자의 3 ' 말단부분, CaMV 35S터미네이터， 벼 a -아밀라아제 RAmyl A 터미네이터 및 파세올린 (phaseol in) 터미네이터를포함할수있으나, 이에 제한되는것은아니다.
또한, 조류형질전환의 경우， 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터， 핵 프로모터， 항시성 프로모터 또는유도성 프로모터를사용할수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PP0 유전자 또는 이의 변이체는 5’UTR 또는 3 ' UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한， 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나， 이에 제한되는것은아니다.
또한， 상기 벡터는 제초제 내성 PP0 유전자 또는 이의 변이체를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PP0유전자또는이의 변이체의 51 -위치에 연결시킬수 있다. 또한, 상기 벡터는 선택적으로， 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며， 선택 표지의 예로서 항생제 (예: 네오마이신， 카베니실린， 카나마이신, 스펙티노마이신， 하이그로마이신, 블레오마이신， 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글리포세이트， 글루포시네이트， 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할수있으나, 이에 제한되는것은아니다.
또한， 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 iAgrobacterium) 바이너리 벡터， 코인테그레이션 벡터 (cointegrat ion vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducing) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB ( left border)와 RB (r ight border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며， 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는벡터를사용할수 있다.
상기에서 바이너리 벡터 또는코인테그레이션 벡터를사용하는경우， 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 0 roZ?aci&ri½rmedi ated transformat ion) , 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 {Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterhm rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporat ion) , 입자 총법 (part icle bombardment ) , 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol- medi ated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로유전자가도입된 형질전환식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도， 발근 및 토양 순화와 같은 과정을거쳐 식물체로재분화시킬수 있다.
본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은， 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함)， 원형질체 (protopl ast) , 캘러스 (cal lus) , 배축 (hypocotyl ) , 종자 (seed) , 자엽 (cotyledon) , 신초 (shoot)등을모두포함하는의미로서 이해된다. 또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론또는자손 0\세대， T2세대， T3 세대, T4세대， T5세대， 또는그 이상)을포함하며， 예를들어, PP0유전자또는 이의 변이체가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 내성 형질이 유전된 식물들도본발명의 형질전환식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께， 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물， 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자， 꽃， 줄기, 과실， 잎, 뿌리， 괴경, 및/또는 괴근과같은식물의 일부도본발명의 범주에 포함된다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는쌍자엽 식물을 모두포함하여 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 초본 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물은 택사과 (A1 ismataceae) , 자라풀과 (Hydrocharitaceae) , 지채과 (Jimcaginaceae)， 장지채과 (Scheuchzeriaceae) , 가래과 (Potamogetonaceae)， 나자스말과 (Najadaceae) , 거머리말과 (Zosteraceae) , 백합과 (Li 1 iaceae) , 지모과
(Haemodoraceae) , 용설란과 (Agavaceae) , 수선화과 (Amaryl 1 idaceae) , 마과 (Dioscoreaceae) , 물옥잠과 (Pontederiaceae) , 붓꽃과 (Iridaceae) , 버먼초과 (Burmanniaceae) , 골풀과 (Juncaceae) , 닭의장풀과
(Commel inaceae) , 곡정초과 (Eriocaulaceae) , 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae) , 천남성과 (Araceae) , 개구리밥과 (Lemnaceae) , 폭삼릉과
(Sparganiaceae) , 부들과 (Typhaceae) , 사초과 (방동사니과, Cyperaceae) , 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae) , 홍초과 (Cannaceae), 난초과 (Orchidaceae)의 식물을포함할수있으나， 이에 제한되는것은아니다. 상기 쌍자엽 식물은 암매과 (돌매화나무과, Diapensiaceae) , 매화오리나무과 (Clethraceae) , 노루발과 (Pyrolaceae) , 진달래과
(Ericaceae) , 자금우과 (Myrsinaceae) , 앵초과 (Primulaceae) , 갯질경이과 (Plumbaginaceae) , 감나무과 (Ebenaceae) , 때죽나무과 (Styracaceae) , 노린재나무과 (Symplocaceae) , 회목과 (Symplocaceae) , 물푸레나무과
(목서과， Oleaceae), 마전과 (Loganiaceae) , 용담과 (Gentianaceae) , 조름나물과 (Menyanthaceae) , 협죽도과 (마삭나무과， Apocynaceae) , 박주가리과 (Asclepiadaceae) , 꼭두서니과 (Rubiaceae) , 꽃고비과
(Polemoniaceae) , 메꽃과 (Convolvulaceae )， 지치과 (Boraginaceae) , 마편초과 (Verbenaceae) , 꿀풀과 (Labiatae), 가지과 (Solanaceae) , 현삼과 (Scrophulariaceae) , 능소화과 (Bignoniaceae) , 쥐꼬리망초과 (Acanthaceae) , 참깨과 (Pedal iaceae) , 열당과 (Orobanchaceae) . 제스네리아과 (Gesneriaceae) , 통발과 (Lent ibulariaceae) , 파리풀과
(Phrymaceae) , 질경이과 (Plantagkiaceae) , 인동과 (Caprifol iaceae)， 연복초과 (Adoxaceae) , 마타리과 (Valerianaceae) , 산토끼꽃과
(Dipsacaceae) , 초롱꽃과 (Campanulaceae) , 국화과 (Compositae) , 소귀나무과 (Myricaceae) , 가래나무과 (Juglandaceae) , 버드나무과
(Sal icaceae) , 자작나무과 (Betulaceae) , 너도밤나무과 (참나무과,
Fagaceae) , 느릅나무과 (Ulmaceae) , 뽕나무과 (Moraceae), 쐐기풀과 (Urt icaceae) , 단향과 (SantaIaceae) , 겨우살이과 (Loranthaceae)， 마디풀과 (여뀌과, Polygonaceae)， 자리공과 (상륙과， Phytolaccaceae) , 분꽃과 (Nyctaginaceae) , 석류풀과 (Aizoaceae) , 쇠비름과 (Portulacaceae) , 석죽과 (Caryophyl laceae) , 명아주과 (Chenopodiaceae) , 비름과 (Amaranthaceae) , 선인장과 (Cactaceae) , 목련과 (Magnol iaceae)， 붓순나무과 (Illiciaceae), 녹나무과 (Lauraceae) , 계수나무과 (Cercidiphyl laceae) , 미나리아재비과 (Ranunculaceae) , 매자나무과 (Berber idaceae) , 으름덩굴과 (Lardizabalaceae) , 새모래덩굴과 (방기과, Menispermaceae) , 수련과 (Nymphaeaceae) , 붕어마름과 (Ceratophyl laceae) , 어항마름과 (Cabombaceae) , 삼백초과 (Saururaceae) , 투주과 (Piperaceae) , 홀아비꽃대과 (Chloranthaceae) , 쥐방울덩굴과 (Ar istolochiaceae) , 다래나무과 (Act inidiaceae) , 차나무과 (동백나무과， Theaceae) , 물레나물과 (Guttiferae)， 끈끈이주걱과 (Droseraceae) , 양귀비과
(Papaveraceae) , 풍접초과 (Cappar idaceae) , 십자화과 (겨자과, Cruci ferae) , 플라타너스과 (버즘나무과， Platanaceae) , 조록나무과 (금루매과, Hamamel idaceae) , 꿩의비름과 (돌나물과， Crassulaceae) , 범의귀과 (Saxi fragaceae) , 두충과 (Eucommiaceae) , 돈나무과 (Pittosporaceae) , 장미과 (Rosaceae), 콩과 (Leguminosae) , 괭이밥과 (Oxal idaceae) , 쥐손이풀과 (Geraniaceae) , 한련과 (Tropaeolaceae) , 남가새과 (Zygophyl laceae)， 아마과 (Linaceae), 대극과 (Euphorb iaceae) , 별이끼과 (Cal 1 itrichaceae) , 운향과 (Rutaceae), 소태나무과
(Simaroubaceae) , 멀구슬나무과 (Mel iaceae) , 원지과 (Polygalaceae) , 옻나무과 (Anacardiaceae) , 단풍나무과 (단풍과， Aceraceae) , 무환자나무과 (Sapindaceae) , 칠엽수과 (Hippocastanaceae) , 나도 밤나무과 (Sab iaceae) , 봉선화과 (물봉선과, Balsaminaceae) , 감탕나무과 (Aqui fol iaceae) , 노박덩굴과 (화살나무과， Celastraceae) , 고추나무과 (Staphyleaceae) , 회양목과 (Buxaceae), 시로미과 (Empetraceae) , 갈매나무과 (Rhanmaceae) , 포도과 (Vitaceae), 담팔수과 (Elaeocarpaceae) , 피나무과 (Til iaceae), 아욱과 (Malvaceae) , 벽오동과 (Stercul iaceae) , 팥꽃나무과 (서향나무과, Thyme laeaceae) , 보리수나무과 (Elaeagnaceae) , 이나무과 (Flacourt iaceae)， 제비꽃과 (Violaceae) , 시계꽃과 (Passif loraceae) , 위성류과 (Tamar icaceae) , 물별과 (Elat inaceae) , 베고니아과 (Begoniaceae) , 박과 (Cucurbitaceae) , 부처꽃과 (배롱나무과, Lythraceae) , 석류나무과 (Punicaceae) , 바늘꽃과 (Onagraceae)， 개미탑과 (Haloragaceae)， 박쥐나무과 (Alangiaceae) , 증증나무과 (산수유나무과 , Cornaceae) , 두릅나무과 (오갈피나무과， Aral iaceae) , 산형과
(미나리과) (Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는것은아니다.
구체예로,상기 식물은벼， 밀， 보리， 옥수수， 대두， 감자， 팥,귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이， 양배추, 참외, 호박， 파， 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼， 담배， 목화, 마초， 목초， 참깨, 사탕수수， 사탕무우， 들깨, 땅콩, 유채， 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무， 복숭아, 양다래， 포도， 감귤， 감， 자두, 살구 및 바나나를 포함하는과수류;소나무， 팜오일 및 유칼립투스를포함하는목본류;장미, 글라디올러스, 거베라， 카네이션， 국화， 백합 및 툴립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스， 레드클로버， 오차드그라스， 알팔파， 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 구체 예로， 상기 식물은 애기장대， 감자, 가지， 담배, 고추, 토마토， 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지， 시금치， 근대, 고구마， 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리， 배추, 양배추， 갓무, 수박, 참외， 오이， 호박， 박, 딸기， 대두， 녹두, 강낭콩， 또는 완두등의 쌍자엽 식물; 및 벼， 밀， 보리， 옥수수,수수등의 단자엽 식물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나， 이에 제한되는것은아니다.
본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵 (Prokaryotic)조류 또는 진핵 (Eukaryotic)조류일 수 있다. 예를 들어， 조류는 시아노박테리아， 녹조류， 홍조류, 갈조류, 대형조류 (macroalgae) 또는미세조류 (microalgae)일수 있다.
시아노박테리아류로는, Chroococcales 문 (예, Aphanocapsa,
Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus ,
Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece , Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, J ohannesbapt i st i a , Mer ismopedia, Microcystis, Radiocyst is , Rhabdoderma , Snowella, Synechococcus , Synechocystis, Thermosynechococcus , fforonichinia) , Gloeobacter ia 문， Nostocales 문 (예， Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae) , Osci 1 lator iales 문 (예， Arthronema, Arthrospira, Blennothrix,
Cr inal ium, Geit ler inema, Halomicronema, Halospirul ina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothr ix, Lyngbya , Microcoleus ,Osci 1 lator ia, Phormidium, PIanktothr i coi des , Planktothr ix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothr ix, Spirul ina,
Starria, Symploca, Tr ichodesmium, Tychonema) , Pleurocapsales 문 (예， Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpel la, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanier ia, Xenococcus) , Prochlorales 문, 또는 St igonematales 문 (예， Capsosira, Chlorogloeopsis , Fischerel la, Hapalosiphon, Mast igocladopsis , Mast igocladus , Nostochopsis , St igonema , Symphyonema , Symphonemopsis , Umezakia, West iel lopsis)등을예시할수있다.
조류의 다른 예로， Chlorophyta, Chlamydomonas， Volvacales,
Dunal iel la, Scenedesmus , Chlorel la, 또는 Hematococcm를 예시할수 있다. 조류의 다른예로， Phaeodactylum tr icornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp. , Chaetoceros muelleri, Navicula saprophi la, Nitzschia communis , Scenedesmus dimorphus , Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardt i i , Chlorel la vulgaris , Haematococcus pluvial is, Neochloris oleoabundans , Synechococcus elongatus ,
Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus , Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus , Nannochloropsis oculata,
Nannochloropsis sal ina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudet icus , Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chui i , Pavlova spp. , Aphanocapsa spp. , Synechosyst is spp. , Nannochloris spp. 등을 예시할수 있다. 그러나， 상기 열거한종류들에 제한되는것은아니며， 그 외 다양한속및 종에 속하는조류들이 포함될수있다.
본명세서에서 제공되는제초제 내성 PP0또는이의 변이체가도입된 식물또는조류는 2종 이상의 PP0저해 제초제에 대하여 내성을나타낼수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 기술은 2 종 이상의 PP0 저해 제초제를순차적으로， 또는동시에 사용함으로써 잡초를방제하거나원하지 않는수생 생물을제거하는데사용될수 있다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PP0 단백질， 이의 변이체， 또는 이를 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계， 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를방제하는방법을제공한다.
Figure imgf000028_0001
암호화하는유전자를포함하는조류를 배양배지에 제공하는단계 , 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는， 배양배지에서 원하지 않는수생 생물들을제거하는방법을제공한다.
또한, 본명세서에서 제공하는제초제 내성 ᄄ）단백질, 이의 변이처 또는 이를 암호화하는 유전자는 , 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를암호화하는유전자와조합하여 사용될수있다.
Figure imgf000028_0002
제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 ™ 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순서에 상관없이 순차적으로， 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하， 저해 제초제와 작용기전이 상이한제초제를 "제 2의 제초제"라고지칭한다.
일 예는 상술한 제초제 내성 的 단백질， 이의 변이체 , 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는유전자를포함하는, 식물또는조류의 제초제에 대한내성 부여 및/또는증진용조성물을제공한다.
다른 예는상술한제초제 내성 的단백질 , 이의 변이체， 또는 이를 암호화하는 유전자 ; 및 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는， 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을
Figure imgf000028_0003
암호화하는 유전자; 및 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체， 캘러스, 배축， 종자， 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한내성을가지는식물또는조류를제조하는방법을제공한다. 다른 예는상술한제초제 내성 단백질， 이의 변이체， 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제 2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를포함하는， 재배지에서 잡초를방제하는방법을제공한다 .
다른 예는 상술한 제초제 내성 PP0 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계， 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제 2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를포함하는， 배양배지에서 원하지 않는수생 생물을 제거하는방법을 제공한다.
예컨대, 상기 식물 또는 조류는 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제 2의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는증진된 것일수있다.
예컨대, 상기 제 2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제， 아미노산합성 저해성 제초제， 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제 및/또는 이들의 조합을 포함하나， 이에 제한되는 것은아니다. 구체 예로， 상기 제 2의 제초제는글리포세이트 (glyphosate) , 글루포시네이트 (glufos inate) , 디캄바 (di camba) , 2,4-D (2,4-
D i ch 1 or ophenoxyace t i c acid) , ALS (acetol actate synthase) 저해성 제초제 (예를 들어, 이미다졸리디논， 설포닐우레아， 트리아졸피리미딘， 설포아닐라이드， 피리미딘 티오벤조에이트 등)， 제 2광계 (photosystem I I) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제， 색소체 저해성 제초제, 브로목시닐 (bromoxyni 1 )계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
예컨대， 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resi stant 5-eno 1 pyr uvy 1 sh i k i mat e-3-phosphat e synthase) , GOX (glyphosate oxidase) , GAT (glyphosate-N- acetyl transferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase)； 글루포시네이트 제초제 내성 PAT ( phosph i no t hr i c i n-N- acetyltransferase) : 디캄이바 제초제 내성 DM0 (di camba monooxygenase) ;
2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD ( ary 1 oxya 1 kanoat e di oxygenase) : ALS저해성 설포닐우레아 (sul fonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetol actate synthase) , AHAS (acetohydroxyacid synthase) , 또는
AtAHASL [Arabidopsis t ha liana acetohydroxyacid synthase large subuni t) ; 제 2광계 저해성 제초제 내성 광계 I I (photosystem I I) 단백질 D1； 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450)； 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD ( hy dr oxyphenyl pyruvate di oxygenase)； 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (ni tr i l ase)； 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나， 이에 제한되는 것은아니다.
또한, 상기 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG) , mepsps, 2mepsps , goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar , pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바제초제 내성 dmo유전자; 2,4-D제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csrl, Csrl-1, Csrl-2, SurA 또는 SurB； 제 2광계 (photosystem I I) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자; 브로목시닐 제초제 내성 bxn유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할수 있으나， 이에 제한되는 것은아니다. 【발명의 효과】
본 발명에서 제공하는 제초제 내성 PP0 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물 또는 조류에 적용함으로써 보다 우수한 제초제 내성 형질을 부여 및/또는 증진시키고， 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 pET303-CT-Hi s벡터의 개열지도이다.
도 2는 PP0가결핍된 BT3대장균 (ᅀ PK))에 ApPPOl wi ld type유전자 (ApPPOlWT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후， t i afenaci l을 0 uM(mi cromol ar)(control ) , 50 uM, 및 100 uM의 농도로 각각처리한 경우 (상단) , 및 saf lufenaci l을 0 uM(control ) , 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포생장정도를각각보여주는사진이다. 도 3은 PP0가결핍된 BT3대장균 (APP0)에 ApPPOl wild type유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨후, flumi¥cazin을 0 uM (control ) , 50 uM,및 200 uM의 농도로각각 처리한 경우 (상단)및 sulfentrazone을 0 uM (control ) , 5 uM, 및 25 uM 의 농도로각각처리한경우 (하단)의 세포 생장정도를보여주는사진이다. 도 4는 PP0가결핍된 BT3대장균 (APP0)에 ApPPOl wild type유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, fomesafen (상단)과 acifluorfen (하단)을 각각 0 uM (control ) ,
5 uM, 및 25 uM의 농도로각각처리한 경우의 세포 생장정도를보여주는 사진이다.
도 5는 PP0가결핍된 BT3대장균 ( A PH3)에 ApPPOl wild type유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraclonil을 0 uM (control ) , 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한경우 (상단)및 pentojcazone을 0 uM (control ) , 5 uM, 및 10 uM의 농도로각각처리한경우 (하단)의 세포생장정도를보여주는사진이다. 도 6은 PP0가결핍된 BT3대장균 (APP0)에 ApPPOl wild type유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraf lufen-ethyl을 0 uM (control ) , 5 uM, 및 10 uM 의 농도로 각각처리한경우의 세포생장정도를보여주는사진이다.
도 7내지 도 12는 PP0가결핍된 BT3대장균 (APP0)에 ApPPOl wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 ApPPOl 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control ) , 50 uM, 및 200 uM의 농도로각각처리한경우, flumi¥iazin을 0 uM (control ) , 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우， 및 sulfentrazone 을 0 uM (control), 200 uM, 및 400 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를보여주는사진이다.
도 13은 PP0가결핍된 BT3대장균 (APP⑴에 MxPPO wild type유전자 (MxPPO WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control ) , 200 uM, 및 2000 uM의 농도로각각처리한경우, saf lufenaci I을 0 uM (control ) , 100 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, 및 flumioxazin을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를보여주는사진이다. 도 14는 PP0가결핍된 BT3대장균 ( A PP0)에 MxPPO wi ld type유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환시킨 후, t i afenaci l을 0 uM(mi cromol ar)(control ) 및 2000 uM의 농도로각각처리한경우의 세포생장정도를보여주는사진이다.
도 15내지 도 17은 PP0가결핍된 BT3 대장균 ( A PTO)에 MxPPO wi ld type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환시킨 후， f lumioxazin을 0 uM (control ) , 200 uM, 및 400 uM의 농도로각각처리한경우의 세포 생장정도를보여주는사진이다. 도 18내지 도 20은 PP0가결핍된 BT3 대장균 ( A PP0)에 MxPPO wi ld type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, sul fentrazone을 0 uM (control ) , 200 uM, 및 1000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 21 및 도 22는 PP0가 결핍된 BT3 대장균 (ᅀ PP0)에 MxPPO wi ld type 유전자 또는 4개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환시킨 후， f lumioMzin을 0 uM (control ) , 400 uM, 및 1000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 23 및 도 24는 PP0가 결핍된 BT3 대장균 (ᅀ PP0)에 MxPPO wi ld type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환시킨 후, sul fentrazone을 0 uM (control ) , 2000 uM, 및 4000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 25는 PMAL-c2x벡터의 개열지도이다.
도 26은 ApPPOl의 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대 (T2)를 제초제가 포함된 배지에 파종한 6일 후 종자 발아 결과를 보여주는 사진이다.
도 27은 MxPPO의 야생형 또는 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대 (T2)를 제초제가 포함된 배지에 파종한 6일 후 종자 발아 결과를 보여주는사진이다.
【발명을실시하기 위한형태】
이하， 본발명을실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본발명을 예시하는 것일 뿐， 본발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. PP0-제초제 복합체 구조 분석을 통한 제초제와 상호작용하는 PP0의 아미노산정보획득
Genbank database를 이용하여 아우제노클로렐라 프로토테코이데스
(Auxenochlorella protothecoides) 및 마이소코커스 산투스 (Myxococcus xanthus)으］ PP0 유전자 서열 정보를 이용하였다. 아우제노클로렐라 프로토테코이데스의 PP0 단백질 (ApPPOl; 서열번호 1)을 암호화하는 유전자로서， 아우제노클로렐라프로토테코이데스에서 PP0유전자 (JpPPOl로 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다. 마이소코커스 산투스의 PP0 단백질 (MxPPO; 서열번호 3)을 암호화하는 유전자로서 , 마이소코커스 산투스에서 PP0 유전자 {MxPPOS- 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다. PP0 단백질과 제초제의 결합 구조 정보를 확보하기 위해， ApPPOl , MxPPO 단백질과 PP0 저해 제초제로 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumiraazin, 또는 sul fentrazone을 사용하였다. CyPPOlO
(써모시네코코커스 에롱가투스 BP-1 (Thermosynechococcus elongatus BP-1) 의 PP0 단백질; 서열번호 5)의 구조 정보와 SWISS-MODEL
(https://swissmodel.expasy.org/) 를 이용하여 ApPPOl 의 homology model 을 만들었고 RCSB protein data bank
(https:/八vw. rcsb.org/pdb/home/home.do) 로부터 MxPPO의 구조 정보를 사용하였다 (卵B ID： 2IVE).
CyPPOlO 과 제초제 (t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sulfentrazone)의 결합정보를 ApPPOl 및 MxPPO의 구조에 superimpose하여 각단백질과제초제가결합하는구조정보를확보하였다.
CyPPOlO 과 제초제의 결합 정보는 다음의 과정으로 확인하였다. CyPPOlO의 단백질을 암호화하는 유전자 (서열번호 6)을 pET29b vector
(Catalog Number: 69872-3； EMD Biosciences)에 클로닝하고， 대장균을 사용하여 CyPPOlO 단백질을 발현시켰다. 발현된 CyPPOlO 단백질을 니켈 친화크로마토그래피를통해 순수분리하였고, 정제된 CyPPOlO단백질에 각 1 mM 농도의 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sul fentrazone을 첨가하여 CyPPOlO 와 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sul fentrazone 이 결합한 결정을 획득하였다. 단백질- 제초제 결합 결정체를 방사광가속기를 이용하여 2.4A 해상도의 CyPPOlO과 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sulfentrazone 결합체의 X- ray회절데이터를확보하고, 분자수준의 삼차원 구조를규명하였다. 이러한 과정을통해 CyPPOlO단백질 내의 제초제와결합하는아미노산위치에 대한 정보를획득하였다.
상기 얻어진 CyPPOlO 단백질 내의 제초제와 결합하는 아미노산 위치에 대한 정보를 통해서 ApPPOl 및 MxPPO 단백질의 제초제 저항성을 부여하는아미노산변이 위치에 대한정보를얻었다.
그결과， ApPPOl단백질 （서열번호 1）에서는 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, 1402 및 Y422 위치의 아미노산이 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과 상호작용하고 있고， MxPPO 단백질 （서열번호 3）에서는 R95, V164, 1168, A170, G171, 1311, V313, F329, L332, L342, 1345 및 M365 위치의 아미노산이 t iafenaci 1 , saflufenaci 1 , flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과상호작용하는것으로판단하였다. 실시예 2. PP0변이체의 제조
PP0저해 제초제 내성을높이기 위하여 ApPPOl, MxPPO아미노산서열 중 상기 실시예 1에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하여 ApPPOl 및 MxPPO의 변이 유전자를 제작하였다. 먼저, BT3 E. coli 에서 효율적인 제초제 저항성 스크리닝을 위해 ApPPOl, MxPPO 유전자를 코돈 최적화 （codon optimization）하여 합성하였다 （南코스모진택）.
구체적인실험 과정은다음과같다:
표 2의 프라이머를 이용， 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 PP0 유전자를분리 및증폭시켰다:
PCR반응액조건
Template （ApPPOl또는 MxPPO의 합성 DNA） 1 ¹
10X buffer 5 id
dNTP mixture（각 10 mM） 1 fd
forward primer （10 uM） 1 fd
reverse primer （10 uM） 1 id
DDW 40 fd Pfu-X (Solgent , 2.5 units/ fd ) 1 fd
Total 50 iA
【표 1】
PCR조건
Figure imgf000035_0001
【표 2]
?附303-（江바3벡터 클로닝을위한프라이머 서열정보
Figure imgf000035_0002
상기 증폭한 유전자 products와 pET303-CT His vector (VT0163； Novagen； 도 1참조)를 Xbal, Xhol 으로 절단한후， T4 DNA ligase (RBC, 3 units/ )를 이용하여 pET303-ApPP()l과 pET303_MxPPO plasmid를 각각 제작하였다.
상기 pET303_CT His vector에 클로닝 한 ApPPOl과 MxPPO을 template으로하여, 아래 표 4및 표 5의 프라이머를사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을수행하여 ApPPOl과 MxPPO의 변이 유전자를제작하였다.
PCR반응액조건
Template 1 fil
10X buffer 5 jjl
dNTP mixture (각 10 mM) 1 id
forward primer (10 uM) 1 fj見
reverse primer (10 uM) 1 fil
DDW 40 [d
Pfu-X (Solgent , 2.5 units/M) 1 fd
Total 50 id
【표 3] 2019/117578 1»（：1/10公018/015654 將1?조건
Figure imgf000036_0001
【표 4】
ApPPOl변이 유전자제작용프라이머 list
Figure imgf000036_0002
2019/117578 1»（：1/10公018/015654
Figure imgf000037_0001
【표 5]
MxPPO변이 유전자제작용프라이머 list
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
상기 얻어진 PCR 용액 10 ¹ 에 Dpnl (NEB) 1 fd 을 처리하고， 37°C에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 DH5 a competent cell (Biofact)에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린 (Gold Biotechnology) 이 포함된 LB agar 배지에 배양하였다. 상기 형질전환된 DH5 a cell에서 plasmid를추출하여 sequence를확인하였다 ((주)코스모진택). 실시예 3. PP0 및 이의 변이체의 PP0 저해 제초제 내성 검증 (대장균에서실험)
상기 실시예 2에서 얻어진 변이 PP0 유전자를 PP0가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ᅀ PP0))에 형질전환한후， PP0저해 제초제를처리한환경에서 배양하여， 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. BT3CAPP0) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며， hemG type PP0가 결여된 대장균이며 카나마이신 (kanamycin)에 내성을 가지는 균주이다 ("Watanabe N, Che FS, Iwano M, Takayama S, Yoshida S, Isogai A. Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons . J . Biol. Chem. 276(23):20474-20481, 2001; Che FS, Watanabe N, Iwano
M, Inokuchi H, Takayama S, Yoshida S, Isogai A. Molecular character i zat ion and subcel lular local i zat ion of protoporphyr inogen oxidase in spinach chloroplasts . Plant Physiol . 124(1) -59-70, 2000. " 참조) .
구체적인실험 과정은다음과같다:
상기 실시예 2에서 제작된 pET303-ApPP01 과 pET303_MxPPO plasmid 및 각각의 변이 유전자들이 포함된 plasmid를 BT3 competent cel l에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린 (Gold Biotechnology) 이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각유전자가삽입된 BT3형질전환체는 LB broth (LPSS, 3 ml )에 단일 콜로니를 접종하여 12시간 배양하고, 이 배양액 50-100 fd를 새로운 LB broth에 계대하여 흡광도 (ODsoo)가 0.5~1이 될 때까지 배양하고 이 배양액을 LB broth로 희석하여 흡광도를 0.5로 일정하게 맞춰준 후， LB broth로 1/10배씩 4번 희석하여 형질전환대장균배양희석액을준비하였다.
LB 25g/l , Bacto agar 15g/l , 카베니실린 (100 ug/ml ) 및 다양한 제초제를 농도별 (최종 0~4, 000 uM)로 혼합하여 제초제를 포함하는 배지를 준비하였다. 상기 제초제 stock은 모두 DMS0를 이용하여 제초제를 용해한 것이다.
상기 준비된 형질전환 대장균 배양 희석액을 제초제 포함 LB agar 배지에 10 ¹ 씩 떨어뜨리고， 37 °C 및 광조건 (표 7, 표 9, 표 10, 도 2 내지 도 6, 도 13내지 도 20)또는 암조건 (표公， 표 11, 도 7내지 도 12, 도 21 내지 도 24)하에서 16 20시간 동안 배양하고， 각 유전자를 포함한 형질전환 대장균들의 생장 정도를 육안으로 확인하여, 형질전환 대장균의 PP0저해 제초제에 대한내성을평가하였다.
실험에 사용된제초제를아래의 표 6에 정리하였다:
【표 6]
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0003
N .T (Not tested)
【표 8】
변이 ApPPOl단백질종류별 제초제 내성 평가
Figure imgf000040_0004
Figure imgf000041_0001
【표 9]
변이 !3。단백질종류별 제초제 내성 평가
Figure imgf000041_0002
【표 10】
종류별 제초제 내성 평가
Figure imgf000041_0003
2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
Figure imgf000042_0001
【표 11】
변이敗 단백질종류별 제초제 내성 평가
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
N .T (Not tested)
상기 표 7 내지 표 11에서， 야생형의 제초제 내성 수준을 "-”으로 표시하고, 내성 수준이 높을수록 "+"를 덧붙여 최대 "+++++’’까자 등급을 정하여 평가하였다 （각 실험마다 처리한 제초제의 최종처리 농도에서 wi ld type PP0의 형질전환 대장균의 생장정도를 기준으로, wi ld type PP0 대비 1~9배 수준을 ‘+’ , 10 99배 수준을 ‘++’ ， 100 999배 수준을 ‘+++’ ,
1,000~9,999배 수준을 ‘++++， ， 10, 000배 이상 수준을 ‘+++++’ 로 평가함）.
도 2내지 도 12 （ApPPOl의 야생형 또는 변이체） 및 도 13 내지 도 24 （MxPPO의 야생형 또는 변이체）은 PP0 유전자 （야생형 또는 변이체）가 형질전환된 대장균의 배양 결과를 보여주는 사진으로， 상단에 기재된 농도는 제초제 처리 농도이며, 각 농도별 5개의 컬럼은 대장균 배양액을 10배씩 희석한결과를나타낸 것으로， 가장왼쪽 컬럼이 0D6¥=0.5인 대장균 배양액의 실험 결과이고， 오른쪽으로 갈수록 10배씩 희석된 배양액의 실험 결과이다.
상기 표 7내지 표 11및 도 2내지 도 24에서 보여지는바와같이 , ApPPOl및 MxPPO의 변이 유전자가도입된 형질전환체는모두다양한종류의 제초제에 대하여 야생형 유전자가 도입된 형질전환체 대비 높은 수준의 제초제 내성을나타냄을확인할수 있다. 실시예 4： PP0의 효소활성 및제초제별 ICm값측정
PP0 단백질 및 특정 위치의 아미노산을 변이시킨 PP0 단백질 변이체의 효소활성을측정하고 PP0저해 제초제에 의한 inhibi t i on assay를 수행하였다. PP0 단백질은 수용성이 낮지만， MBP (mal tose binding protein)와 함께 fus ion protein (MBP-PTO)으로 발현시킬 경우 안정적으로 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인하여， 하기의 야생형 및 변이형 단백질을 MBP와의 융합단백질 형태로발현시켜서 본실험에 사용하였다.
ApPPOl 및 MxPPO의 야생형 유전자 및 변이 유전자를 발현시키기 위하여 , 다음의 조건으로 pMAL-c2x-ApPP01， pMAL-c2x-MxPP0를제작하였다. 구체적인실험 과정은다음과같다:
표 13의 프라이머를 이용， 다음의 조건 하에서 PCR을수행하여 PP0 유전자를분리 및 증폭시켰다:
PCR반응액조건
Template (ApPPOl또는 MxPPO의 합성 DNA) 1 id
10X buf fer 5 fd
dNTP mixture (각 10 mM) 1 fd
Forward pr imer (10 uM) 1 id
Reverse pr imer (10 uM) 1 id
DDW 40 id
Pfu-X (Sol gent , 2.5 uni ts/ fd) 1 fd
Total 50 fd
【표 12]
PCR조건
Figure imgf000044_0001
【표 13]
벡터에 클로닝 하기 위한프라이머 서열 정보
Figure imgf000044_0002
상기 증폭한 유전자 products와 pMAL~c2x vector (도 25 참조)를 BamHI , Sail 으로 절단한후, T4 DNA ligase (RBC, 3 units/ )를 이용하여 pMAL-c2x-ApPPC)l과 pMAL-c2x-MxPP0 plasmid를각각제작하였다.
상기 pMAL-c2x vector에 클로닝 한 ApPPOl과 MxPPO을 template으로 하여， 표 4 및 표 5의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 ApPPOl과 MxPPO의 변이 유전자를제작하였다.
PCR반응액 조건
Template 1 id
10X buffer 5 id
dNTP mixture (각 10 mM) 1 fd
Forward primer (10 uM) 1 fd
Reverse primer (10 uM) 1 jii
DDW 40 /d
Pfu-X (Solgent , 2.5 units/ ) 1 fd
Total 50 fd
제작된 변이 plasmid 를 BL2ICodonP1us(DE3) 대장균에 형질전환하였다.
상기 얻어진 형질전환 대장균을 다음의 조건으로 배양하여 삽입된 PP0유전자를발현시켰다:
Induct ion： 0D_=0.2, 최종농도 0.3 mM IPTG첨가;
발현온도: 23 °C, 200 rpm의 진탕배양;
발현시간: 16hrs；
배양규모: 200 ml/1,000 ml flask.
상기 배양된 형질전환 대장균에 대하여 다음의 과정으로 세포 파쇄 및 단백질추출을수행하였다:
추출 버퍼: Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 200 mM NaCl ) 5 ml buffer/g cel 1；
Sonication： SONICS&MATERIALS社 VCX130 (130 watts)；
15 sec ON, 10 sec OFF for 5 min on ice；
4 °C 및 20분조건하에서 원심분리 (20,000 x g); 및
상기 원심분리로 얻어진 상층액을 column buffer를 사용하여 1:6 비율로희석하였다.
상기 얻어진 단백질 추출물에 대하여 다음의 과정을 4 °C 에서 수행하여 PP0 단백질의 정제를 수행하였다. 1.5 x 15 cm column (Bio-Rad Econo Columns 1.5 x 15 cm, glass chromatography column, max. vol)에 amylose resin (New England Biolabs)을 부어 컬럼을 packing하고， 상기 얻어진 단백질 추출물을 컬럼에 0.2 ml/min의 속도로 로딩하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피 기준으로 3부피배의 column buffer로 washing 후 washing액 내의 단백질 양을 확인하여 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 washing을 종료하였다. 상기 컬럼 부피 기준으로 약 2부피배의 20 mM maltose 를 포함하는 column buffer로 MBP-PP0 단백질을 elution (1.5 ml tube에 각 fraction을분취)하면서 각 eluant의 단백질 농도를 확인하였다. 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 elution을 종료시켰다. 각 fraction을
10 의 양으로 취하여 단백질 정량 후 단백질이 검출된 fraction을 SDS- PAGE로 분석하고， 순도가 높은 fraction을 취하여 효소 활성 분석 실험에 사용하였다.
PP0 단백질의 기질인 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)를 합성하였다. 이 과정은 질소기체가 streaming 되는 공간에서 수행되었다. 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 9 mg을 20% (v/v) EtOH 20 ml에 용해시키고， dark condition에서 30분간 교반하였다. 상기 얻어진 프로토포르피린 IX 용액을 15 ml screw tube에 800 의 양으로 넣고 5분간 질소 기체를 flushing하였다. 여기에 아말감나트륨 (sodium amalgam) 1.5g을 넣고 2분간 vigorous shaking하였다. Tube 안의 수소 기체를 배출하기 위해 뚜껑을 열어두었다. 그 후， 뚜껑을 닫고 3분간 인큐베이션한 후, syringe와 cellulose membrane filter를 이용해 프로토포르피리노겐 IX 용액을 filtering하였다. 상기 얻어진 프로토포르피리노겐 IX 용액 600 에 2M MOPS [3_(N_ morphol ino)propanesulfonic acid]를 약 300 / 의 양으로 첨가하여 pH를
8.0으로 조절하였다. PP0 단백질의 효소 활성을 측정하기 위하여 다음의 조성으로 reaction mixture를준비하였다 (10 ml 기준: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0)； 50 mM NaCl； 0.04% (v/v) Tween 20； 40 mM glucose (0.072g); 5 units glucose oxidase (16.6 mg); 및 10 units catalase (1 id) ) .
상기 reaction mixture 180 를 96 well plates에 넣고앞서 정제된
PP0단백질 (상기 MBP-fusion단백질을정제한산물) 20 를 첨가하였으며， 약 50 의 mineral oil로 표면을 커버하였다. 기질인 프로토포르피리노겐 IX용액을최종농도 50 uM이 되도록 첨가하고실온에서 30분간반응시켰다. Mi croplate reader (Hidexjfct sense)를 이용하여 프로토포르피린 IX 의 형광을 측정하였다 (exci tat ion: 405 nm； emi ssion: 633 nm) . PPO 효소 활성값을 계산하기 위해， 상기 프로토포르피리노겐 IX 용액이 들어있는 튜브를 공기중에 개방하여 용액을 12시간 이상산화시켰다. 여기에 2.7 N HC1를 첨가하고 408nm에서의 흡광도 (absorbance)를 측정하였다. Standard 프로토포르피린 IX을 이용해 standard curve를 작성하고 이를 이용해 프로토포르피리노겐 IX의 농도를 cal ibrat ion하여 PP0활성을즉정하였다. 상기 얻어진 PP0 야생형 및 변이체의 효소 활성은 아래의 표 14 및 표 15와같다. 변이체 활성은야생형 대비 상대적 활성값으로표기하였다. 변이체별 PP0효소활성을 50%저해하는농도 (IC5Q)를각제초제별로 측정하였으며, 각제초제의 최종농도는아래와같이 하였다:
- 제초제 (t i afenaci 1 , f lumioxazin, 또는 sul fentrazone)의 최종농도: 0， 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 nM
IC50값은 상기한 효소 활성 측정 과정에 제초제를 상기 농도로 첨가하여 PP0 효소 활성을 제초제 첨가 전의 50%로 저해하는 제초제의 농도로구하였다.
이와 같이 얻어진 제초제 별 IC5o을 아래의 표 14 및 표 15에 나타내었다:
【표 14]
변이 ApPPOl단백질종류별제초제 IC50측정
Figure imgf000047_0001
2019/117578 1»（：1/10公018/015654
Figure imgf000048_0001
N .T (Not tested)
【표 15】 변이 MxPPO단백질종류별 제초제 IC50측정
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0002
N.T (Not tested)
Figure imgf000050_0001
활성 감소가크지 않을것으로예상된다. 실시예 5. CyPPO 변이체를 이용한 애기장대 형질전환체 제작 및 제초제내성 실험
5-1. 애기장대 형질전환벡터 제작및 애기장대 형질전환체 제작
애기장대 형질전환은 선별 마커인 Bar 유전자 （glufos inate 내성 유전자）의 0RF와각각와 ApPPOl 변이체， MxPPO, 및 MxPPO 변이체 유전자의 0RF를 가진 이원벡터 （binary vector）를 제작하여 수행하였다. 또한， Bar 유전자는 PP0 저해 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 사용하였으며, 형질전환한 유전자가 후대에 안정적으로 유전되고 있는지 여부를 검증하는 데에도 사용하였다. Bar 유전자의 발현을 위하여 N0S 프로모터와 전사 종결을 위한 E9 터미네이터를사용하였다.
ApPPOl 변이체, MxPPO, 및 MxPPO 변이체 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 CaMV35S 프로모터와 N0S 터미네이터를 사용하였다.
ApPPOl 변이체， MxPPO, 및 MxPPO 변이체 유전자는 Xhol , BamHI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한， 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌 （hemagglut inin, M） tag을 BamHI , Sad 제한효소를 이용하여 PP0유전자의 3 ' 말단부위에 삽입하였다. HA tag뒤에 NOS terminator 가삽입되어 PP0 유전자의 전사종결을유도하였다. 또한， 엽록체로단백질의 이동과발현을 유도하기 위해 AtPPOl 유전자 （서열번호 87）의 transi t pept ide （TP； 서열번호 88）를 Xbal , Xhol 제한효소를 이용하여 PP0 유전자의 5' 앞에 삽입하였다. 상기에서 제작한 각각의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 {Agrobacterium tumefaciens） GV3101 competent cel l에 freeze-thaw 방법으로 도입하여 형질전환 시켰다. GV3101 competent cel l 을 제조하기 위하여， GV3101균주를 5 ml LB medi a에 30 °C 및 200 rpm조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200 ml LB medi a 에 접종하여 30 °C 및 200 rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000 xg, 4°C 에서 20분간 원심분리 하였다. 멸균 증류수로 pel let을 씻어 준 뒤 20 ml LB medi a 로 재현탁 （resuspens ion）하였다. 200 씩 al iquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한뒤， 초저온넁동고에 보관하였다.
각각의 형질전환 아그로박테리움을 항생제 배지 （spect inomycin을 포함한 LB agar）에서 배양 및 선별하였다. 상기 선별된 콜로니를 LB broth에서 액체 배양하였다. 이 배양액으로부터 아그로박테리움 cell을 harvest 한 후， 5% (w/v) sucrose 용액에 흡광도 (0D_) 0.8의 농도로 현탁한후， 0.05% (v/v) Silwet L-77 (Moment ive Performance Materials)를 첨가하였다. Floral dipping방법으로 Co 1-0 ecotype 애기장대 wild type에 형질전환하여 형질전환 애기장대를 제작하고， 1~2달 후 종자 (1\)를 수확하였다.
형질전환개체 선발을위해 삽입된 Bar 유전자를 이용하여 형질전환 개체를선발하였다.상기 얻어진 Ti종자를 50 uM glufoskiate가첨가된 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt , 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하고， 파종 7일 후 생존한 개체를 선발하여 흙으로 이식하고 성장시켜 Ti 식물체를 수득하였다.
이식한 Ti식물체들의 PP0저해 제초제 내성을 판단하기 위해 3~4주 키운후추대 전 tiafenacil을 처리하였다.40 x 60 cm면적 (0.24 m2)에 tiafenaci 1 용액 100 ml (1 uM tiafenacil + 0.05%(v/v) Silwet L_77)을 골고루 분사하였다. 야생형 애기장대 (Co 1-0 ecotype)의 경우 상기와 동일한 농도 및 양으로 tiafenacil을 처리하면 사멸하였다. 상기와 같은 tiafenacil 처리 후 4~7일 경과 후 각 형질전환체들의 PP0저해 제초제 내성 여부를판별하였다.
내성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고 (T2종자),상기 T2종자를 50 uM glufosinate를 첨가한 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt , 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하여 6~7일간 키운뒤， 생존개체를선발하였다.
5-2.형질전환애기장대 ( )의 제초제 저항성 검중
ApPPOl 변이체 (Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L+Y422M) , MxPPO, 또는 MxPPO 변이체 (M365I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 대하여 제초제 저항성을테스트하였다.
ApPPOl 변이체 (Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L+Y422M) , MxPPO 또는 MxPPO 변이체 (M365I)를 암호화하는 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 종자 (T2)를 제초제가 포함된 1/2 MS 배지에 파종하고 6일간 생장후 발아 정도로 식물체의 제초제 저항성을 판단하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)를 대조군으로 사용하였다. 상기 얻어진 결과를 도 26 (ApPPOl 변이체) 및 도 27 (MxPPO 야생형 및 MxPPO 변이체)에 2019/117578 1»（：1/10公018/015654
나타내었다.
사용된 제초제종류및 처리 농도는다음과같다.
도 26: 0.1
Figure imgf000053_0002
0.3
Figure imgf000053_0001
0.1 1 11111 0 37 ， 1 11 £111 七대
도 27: 10 3군63세， 0.5 £11111110X32111, 5 대 . 대조군인 1-0는 제초제를 포함하지 않는 1/2
Figure imgf000053_0003
배지에서 정상적으로 발아하는 반면， 상기한 바와 같은 제초제를 포함한 배지에서는 정상 발아하지 못한다. 도
Figure imgf000053_0004
변이체의 형질전환체가 대조군인
001-0 보다 우수한 발아율 및 생존 비율을 보여준다. 도 27은 !^平0 변이체의 형질전환체가 001-0 및 야생형 의 형질전환체보다 우수한 발아율및 생존비율을보여준다.

Claims

2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
【청구의 범위】
【청구항 11
다음에서 선택된폴리펩타이드:
서열번호 1의 아미노산서열중묘140， 209, ¥213,쇼215， 0216, ¥360, 5362, 386, 89， 99， 1402 및 422로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 ), ¥(¥31), 1(1 ), 1(1^),
Figure imgf000054_0001
군에서 선택되고해당위치의 원래 아미노산과상이한아미노산으로치환된 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드;
서열번호 3의 아미노산서열중 1¾5, \ 64， 1168,사70,야71， 1311, ¥313, ¥329, 32， 42, 1345 및 ¾1365로 이루어진 군에서 .선택된 하나
Figure imgf000054_0002
(}½1 ， 奸 ), £)^31))， £：½111), 요), 미 , 및 1((113)로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된아미노산서열로이루어진폴리펩타이드; 및
상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 폴리펩타이드는
서열번호 1의 아미노산서열중 1?140, 209, V213, 쇼215, 0216, ¥360, 5362, 386， 89， 1399, 1402 및 422으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각독립적으로 ), ¥ ), 1(116), 1(1^), 1八1元11), 00方3), 比라)， 및 사시크)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드;
서열번호 3의 아미노산서열중 1¾5, 64， 1168,사70, 0171, 1311, ¥313, F329, 32， 42， 1345 및 1365로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각독립적으로 ¾10此0, ¥ ¾1)，
Figure imgf000054_0003
1^(丄611)， 0(073), 라)， 및 사시 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드; 및
상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는아미노산서열로이루어진폴리펩타이드 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
로이루어진군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
【청구항 3]
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
서열번호 1의 아미노산서열에 있어서 4221¾， 422 , ¥4220, YA22Y , ¥4221 , ¥4221, 쇼215ᄂ 쇼215（：， 쇼2151， 데 요140 ?209 V213C, V213S） 386 891\ 14021, ¥3601 , V360L, 및 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
서열번호 3의 아미노산서열에 있어서 ¾13651\ 13651, 13650, 1\1365 13651 , 95 64 11680, 1168 사70（:， 사70ᄂ 사701， 131 ， F329V， 13321, 및 134 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는아미노산서열로이루어진폴리펩타이드; 및
상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드
로이루어진군에서 선택된 것인， 폴리펩타이드.
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 폴리펩타이드는
서열번호 1의 아미노산서열에 있어서 422¾1， ¥4221 , ¥4220, 422 ¥4221 , ¥4221, 쇼21比， 쇼215（：， 쇼2151， V360M） 요140 209 ¥2130, V213S, 386 13891, 14021, V360I , 360ᄂ 5362¥, 犯40요+¥4221， 1?14（ +¥4221， 묘14 +¥4221 ?209쇼+¥422¾[ ¥2130+¥4221 , ^21洗+¥4221'， ^2130+¥4221, 쇼21於+ 4221 , 쇼21ᄄ+¥4221\ 쇼21於+¥422¾1， 쇼2151^4221， 쇼2151^4221', 요215나 422¾1， V360M+Y422M, F386V+Y422M> ^360^+\4221 , 3891+¥422
14021：+\422}1, V360I+Y422I , 3601+3362¼ 8362¥+¥4221 , 壯4 代21洗+¥4221， 묘140쇼代21況+¥4221«， 요14（ +쇼21於+¥4221， 壯4 +쇼21比+¥422 2130+요2150+¥4221， ¥21洗+쇼2151>¥4221 V360I+S362V+Y422I , 쇼21於 36（»^422¾1， 쇼2151^360¾1+¥422¾1， 쇼2151代36（^422¾1，
¥21況+쇼21於+¥422 V213C+A215L+Y422M, 1?14（ +¥21洗+쇼2150+¥4221， 또는 40쇼代2130+요2151^ᅵ422^!의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진폴리펩타이드;
서열번호 3의 아미노산서열에 있어서 13651, ¾!365ᄂ 13650, !«365 113651 , 묘95 ¥164 11680, 1168 사70（:, 사70ᄂ 701， 1311¾1， ¥329^ , 13321, 13451, 요95요+¾13651 , 요95요+1\1365 116洗+1\13651， 116洗+1\1365 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
사7（^+1½3651 , 사7（光+1\1365 요1701^3651 , 사701베365 1311¾1+¾13651 131 +1\1365 13321+13651， 3況+1«365 164쇼+1«3651， ?329 +¾13651 , 134排+!\13651 7（犯+131 , 사701>1311]\1, 사701+1311 116洗+사70（：, 116洗+ 70ᄂ 요95쇼+ 116洗+1«3651 , 요95쇼+ 116於+¾!365¥ , 1?95쇼+쇼17明+1\13651 , 묘95쇼+1311 +1«3651， 1¾5쇼+131 +1«365 1¾5쇼札33況+¾13651， 1¾5쇼+ 3射+¾13況 V ,
116洗+사7吹+1\1365人 116洗+1311¾州«3的 I 11680+1311¾1+1\1365 11680+13321+13651, 116洗此33況+1\1365 사7於+13111\1+1쌔651 , 사7況 33 +1365 131 札33況+¾13651 , 1311ᅵ\1此3321+1\1365¥， 모95쇼+116洗+ 7 +¾13651 묘95쇼+ 116洗+/ 7於+136 , 1¾5쇼+사700+ 13111+1365¥ , 요95쇼+사7（犯札33 +1\13651 묘95쇼+11680+1311¾1+1\1365 묘95쇼+116洗此3321+1«3651 , 요95쇼+1311]\1札33射+}«3651， 요95요+ 131 + 3況+1\1365 116洗+/\17況+131 +¾13651 , 116洗+쇼17的此33肝+1\1365?， 사7於+1311¾1此3321+1\13651 , 요95쇼+ 11680^1700+ 13111\1+1«36 , 요95쇼+116於+쇼17的札33 +1\13況 I 요95쇼+ 11680+131 札33射+1此65¥ ,
116洗+쇼 1700+ 131 札33況+¾1365 또는 묘95 116洗+ 7於+13111\1札33況+1\1365\ᅡ의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로이루어진폴리펩타이드; 및
상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로이루어진폴리펩타이드
로이루어진군에서 선택된 것인,폴리펩타이드.
【청구항 5]
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
【청구항 6]
제 5항의 폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합벡터 .
【청구항 7]
제 6항의 재조합벡터를포함하는재조합세포.
【청구항 8]
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물또는조류（ § ）의 제초제에 대한저항성 부여 또는증진용조성물.
【청구항 9]
제 8항에 있어서, 상기 제초제는프로토포르피리노겐 IX옥시다아제를 억제하는제초제인, 조성물.
【청구항 10】
제 9항에 있어서 , 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyr imidinediones) , 페닐에테르계 ( d i pheny 1 -ether s) , 페닐피라졸계 ( pheny 1 pyr azo les) , 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthal imides) , 페닐에스테르계 (phenylesters) , 티아디아졸계 (thi adiazoles) , 옥사디아졸계 (oxadi azoles)， 트리아졸리논계 (tr i azol inones) , 옥사졸리딘디온계 (OMZO I idinediones) , 피라클로닐 (pyracloni l )， 플루펜피르-에틸 ( f lufenpyr-ethyl ) 및 프로플루아졸 (prof luazol )로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 제초제는 부타페나실 (131 3£6113＜：11 )，
Figure imgf000057_0001
농약적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
【청구항 12】
제 8항에 있어서， 상기 식물 또는 조류는 제 2의 제초제 저항성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제 2의 제초제에 대한저항성이 부여 또는증진된 것인, 조성물.
【청구항 13】
제12항에 있어서， 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate) , 디캄바(dicamba) , 2,4-D(2,4- dich1orophenoxyacet ic acid) , 이속사플루톨(isoxaflutole)，
ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제， 페닐우레아(phenylurea)계 제초제， 브로목시닐(bromoxyni 1 )계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는것인， 조성물.
【청구항 14】
제12항에 있어서， 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는
글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 EPSPS(glyphosate resistant
5-eno1pyruvy1shikimate-3-phosphate synthase) , GOX(glyphosate oxidase) , GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase)；
글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 PAT(phosphinothricin-N- acetyltransferase)；
디캄바(dicamba) 제초제 내성 DM0(dicamba monooxygenase)；
2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacet ic acid) 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제또는 AAD(aryloxya1kanoate dioxygenase)；
ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS(acetolactate synthase) , AHAS(acetohydroxyacid synthase) , 또는
AtAHASL {Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 광계 11 (photosystem II) 단백질 D1；
페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 시토크롬 M50(cytochrome 450);
색소체 저해성 제초제 내성 HPPD(hydroxypheny1pyruvate dioxygenase) ;
브로목시닐(bromoxyni 1 ) 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로이루어진군에서 선택되는 1종이상인, 조성물.
【청구항 15】
제12항에 있어서， 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
암호화하는유전자는
Figure imgf000059_0001
이들의 조합으로이루어진군에서 선택되는 1종이상인， 조성물.
【청구항 16】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드， 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는， 식물 또는 조류의 제초제에 대한내성을가지는형질전환체， 이의 클론또는자손.
【청구항 17】
제 16항에 있어서， 상기 형질전환체는 조류， 또는 식물의 세포， 원형질체， 캘러스， 배축， 종자， 자엽， 신초 또는 식물체 전체인, 형질전환체, 이의 클론또는자손.
【청구항 18】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드， 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는폴리뉴클레오타이드를조류， 또는식물의 세포, 원형질체, 캘러스， 배축, 종자， 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는단계를포함하는，
제초제에 대한내성을가지는식물또는조류의 제조방법 .
【청구항 19】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드， 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류， 또는 식물의 원형질체, 캘러스， 배축， 종자, 자엽， 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는단계를포함하는, 2019/117578 1»（：1^1{2018/015654
식물또는조류의 제초제에 대한내성을부여 또는증진시키는방법.
【청구항 20]
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드， 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는단계 , 및
상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을적용하는단계를포함하는,
재배지에서 잡초를방제하는방법 .
【청구항 21]
제 20항에 있어서， 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는， 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로또는동시에 적용하는것인, 방법.
【청구항 22]
제 20항에 있어서,
상기 식물은 제 2의 제초제 내성 폴리펩타이드또는 이를 암호화하는 유전자를더욱포함하는것이고,
상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX옥시다아제를억제하는제초제 및 제 2의 제초제의 유효량을순차적으로또는동시에 적용하는것인， 방법. 【청구항 23】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드， 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는단계， 및
상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을적용하는단계를포함하는,
배양배지에서 원하지 않는수생 생물을제거하는방법 .
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