KR20190072433A - Ppo의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

미생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제(Protoporphyrinogen IX oxidase)의 아미노산 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류(algae)의 제초제에 대한 보다 강화된 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 보다 증진시키는 기술이 제공된다.

Description

PPO의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법{Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using PPO Variants}
프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase)의 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류 (Algae)의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 기술이 제공된다.
포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴 (Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO; EC:1.3.3.4)는 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)로부터 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴 (Heme)이 합성된다.
따라서, PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되면, 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 단일항산소 (singlet oxygen, 1O2)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여, PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 10개 계통의 제초제가 사용되고 있다.
또한, 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 내성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다.
한편, 조류 (Algae)는 광합성 생물로서, 빛에너지를 다양한 유용 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당, 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써, 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한, 조류의 대규모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질, 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있다.
그러나, 생물반응기 (bioreactor) 또는 공개된 또는 폐쇄된 연못에서 조류를 대규모로 배양하는 경우, 원하지 않는 경쟁 생물들, 예를 들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류 (rotifer) 또는 동물성 플랑크톤들에 의하여 오염이 발생할 수 있다.
따라서, 원하는 식물 및/또는 조류에 제초제 내성을 부여한 후, 제초제 내성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여, 원하는 식물 및/또는 조류를 대규모로 수확할 수 있는 기술이 필요하다.
미국특허출원 등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30) 미국특허출원 등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26) 미국특허출원 등록공보 US 7,563,950 (2009.07.21) 국제특허출원 공개공보 WO2011/085221 (2011.07.14)
Li X, Volrath SL, Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant Physiol. 133:736-747, 2003
본 명세서에서, 다양한 생물로부터 PPO 유전자를 분리하여 이 유전자 및 이의 아미노산 변이체가 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (PPO) 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타냄이 입증되어, 이를 식물 및/또는 조류 (Algae)에 발현시키면 제초제 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 증진시킬 수 있음이 제안된다.
일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는
서열번호 1의 폴리펩타이드의 변이체, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체, 및 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드 변이체, 및 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제초제는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제일 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논계 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타 제초제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone), 티아페나실 (tiafenacil), 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로르니트로펜 (chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜 (halosafen), 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트 (fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl), 플루티아셋 (fluthiacet), 티디아지민 (thidiazimin), 옥사디아길 (oxadiargyl), 옥사디아존 (oxadiazon), 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone), 트리플루디목사진 (trifludimoxazin), 아자페니딘 (azafenidin), 펜톡사존 (pentoxazone), 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸 (profluazol), 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino-and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992 참조)), 이들의 농약적으로 허용가능한 염들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식물은 광합성을 하는 다세포 진핵 생물을 의미하는 것으로, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이거나, 초본 식물 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 조류 (Algae)는 광합성을 하는 단세포 생물을 의미하는 것으로, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다.
일 예에서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작되며 상기 제2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 내성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다. 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 식물 또는 조류는 상기한 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물에 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함시킨 것을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 따라서, 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것일 수 있다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막 저해성 제초제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨 (isoxaflutole), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제 또는 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자 및 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제 내성 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 형질전환체, 이의 클론, 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 형질 전환은 조류, 및/또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)에 대하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 예로, 상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
식물 또는 조류에 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다.
본 명세서에서, '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진' 또는 '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 증진' 이란 제초제에 내성이 없는 식물 또는 조류에 대하여 내성을 부여하는 것, 또는 제초제에 내성을 지닌 식물 또는 조류에 대하여 그 내성을 보다 향상시키는 것, 또는 이 모두를 포괄하는 광범위한 의미로 해석된다.
본 명세서에서, '서열로 이루어진' 또는 '서열을 포함하는' 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두 의미하기 위하여 사용되며, 기재된 서열 이외의 서열을 포함하는 것을 배제하고자 하는 의도로 해석되지 않는다.
일 예에서,
서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체; 및
서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체
로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다.
다른 예에서, 서열번호 1 또는 3의 폴리펩타이드의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입 될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서,
서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체, 또는 상기 폴리펩타이드 변이체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드 변이체 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제에 대한 내성을 가진 형질전환체가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 식물전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법이 제공된다.
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 서열번호 1 및 3의 폴리펩타이드는 미생물로부터 유래하는 PPO 단백질로서, PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질이다. 구체적으로, 아우제노클로렐라 프로토테코이데스 (Auxenochlorella protothecoides)에서 유래한 PPO 단백질이 제공되며, 이를 ApPPO1으로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 1로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 각각 나타낸다. 또한, 마이소코커스 산투스 (Myxococcus xanthus)에서 유래한 PPO가 제공되며, 이를 MxPPO로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 4로 각각 나타낸다.
본 명세서에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 변이체는 각각 PPO 계열 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체로도 표현될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바로서, "제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체"는 상기한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체, 제초제 내성 PPO 단백질 암호화 유전자 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체 암호화 유전자, 또는 이들 모두를 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 PPO 단백질과 제초제 간 상호작용 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이를 갖는 PPO 단백질은 변이 전의 효소 활성을 유지하는 것일 수 있다.
상기 PPO 단백질의 변이체를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드 (ApPPO1)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (서열번호 1의 폴리펩타이드 (ApPPO1)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)는 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 R140 ("140번째 위치의 R(Arg)"을 의미; 이하의 아미노산 잔기의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), A(Ala) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, Y422M (422번째 위치의 아미노산 잔기가 Y(Tyr)에서 M(Met)으로 치환됨을 의미함; 이하의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), Y422L, Y422C, Y422V, Y422I, Y422T, A215L, A215C, A215I, V360M, R140A, F209A, V213C, V213S, F386V, L389T, I402T, V360I, V360L, 및 S362V로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, Y422M, Y422L, Y422C, Y422V, Y422I, Y422T, A215L, A215C, A215I, V360M, R140A, F209A, V213C, V213S, F386V, L389T, I402T, V360I, V360L, S362V, R140A+Y422I (140번째 잔기의 R에서 A로의 치환 및 422번째 잔기의 Y에서 I로의 치환을 모두 포함; 이하의 2가지 이상의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), R140A+Y422T, R140A+Y422M, F209A+Y422M, V213C+Y422I, V213C+Y422T, V213C+Y422M, A215C+Y422I, A215C+Y422T, A215C+Y422M, A215L+Y422I, A215L+Y422T, A215L+Y422M, V360M+Y422M, F386V+Y422M, V360M+Y422I, L389T+Y422M, I402T+Y422M, V360I+Y422I, V360I+S362V, S362V+Y422I, R140A+V213C+Y422I, R140A+V213C+Y422M, R140A+A215C+Y422I, R140A+A215L+Y422M, V213C+A215C+Y422I, V213C+A215L+Y422M, V360I+S362V+Y422I, A215C+V360M+Y422M, A215L+V360M+Y422M, A215I+V360M+Y422M, V213C+A215C+Y422M, V213C+A215L+Y422M, R140A+V213C+A215C+Y422I, 또는 R140A+V213C+A215L+Y422M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드 (MxPPO)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (서열번호 3의 폴리펩타이드 (MxPPO)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)은 서열번호 3의 아미노산 서열 중의 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열 중의 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), A(Ala) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서, M365T, M365L, M365C, M365V, M365I, R95A, V164A, I168C, I168S, A170C, A170L, A170I, I311M, F329V, L332T, 및 I345T로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서, M365T, M365L, M365C, M365V, M365I, R95A, V164A, I168C, I168S, A170C, A170L, A170I, I311M, F329V, L332T, I345T, R95A+M365I, R95A+M365V, I168C+M365I, I168C+M365V, A170C+M365I, A170C+M365V, A170L+M365I, A170L+M365V, I311M+M365I, I311M+M365V, L332T+M365I, L332T+M365V, V164A+M365I, F329V+M365I, I345T+M365I, A170C+I311M, A170L+I311M, A170I+I311M, I168C+A170C, I168C+A170L, R95A+I168C+M365I, R95A+I168C+M365V, R95A+A170C+M365I, R95A+I311M+M365I, R95A+I311M+M365V, R95A+L332T+M365I, R95A+L332T+M365V, I168C+A170C+M365V, I168C+I311M+M365I, I168C+I311M+M365V, I168C+L332T+M365I, I168C+L332T+M365V, A170C+I311M+M365I, A170C+L332T+M365V, I311M+L332T+M365I, I311M+L332T+M365V, R95A+I168C+A170C+M365I, R95A+I168C+A170C+M365V, R95A+A170C+I311M+M365V, R95A+A170C+L332T+M365I, R95A+I168C+I311M+M365V, R95A+I168C+L332T+M365I, R95A+I311M+L332T+M365I, R95A+I311M+L332T+M365V, I168C+A170C+I311M+M365I, I168C+A170C+L332T+M365V, A170C+I311M+L332T+M365I, R95A+I168C+A170C+I311M+M365V, R95A+I168C+A170C+L332T+M365I, R95A+I168C+ I311M+L332T+M365V, I168C+A170C+I311M+L332T+M365V, 또는 R95A+I168C+A170C+I311M+L332T+M365V의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 변이체, 또는 이들과 서열 상동성 (예컨대, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 서열 상동성 판단의 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (예컨대, 앞서 설명한 아미노산 서열 또는 아미노산 변이를 갖는 PPO 단백질)와 동등 정도의 효소 활성, 예컨대, 식물 내 (식물체 내, 식물 세포 또는 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등), 조류 내, 및/또는 시험관내에서 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있으며, 상기와 같은 서열 상동성 기재는 본 명세서에 기재된 제초제 내성 PPO 단백질 또는 변이체가 상기 조건 (효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유)을 만족하는 범위의 모든 서열 변이를 포함할 수 있음을 명확하게 하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서 사용된 아미노산의 명명을 아래의 표에 정리하였다:
Figure pat00001
상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 효소 활성은 유지하면서, 야생형과 비교하여 증진된 제초제 내성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 폴리펩타이드 (제초제 내성 PPO 단백질) 및 폴리펩타이드 변이체 (제초제 내성 PPO 단백질 변이체)는 앞서 설명한 바와 같은 서열번호 1 또는 서열번호 3, 또는 앞서 설명한 바와 같은 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있고, 이러한 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 예에서, 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아실화 (acylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "서열 상동성"이란 야생형 (wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 제초제 내성 PPO 단백질 변이체의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이의 변이체와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다.
상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을 조합하여 이용할 수 있다.
상기 제초제 내성 PPO 핵산 분자 (PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드)는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
구체적인 실시예에서, 상기 제공된 PPO 단백질/핵산분자 또는 이들의 변이체들은 PPO가 결핍된 대장균 BT3(
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PPO)를 이용한 제초제 내성 검증 시스템을 통하여, 화학 구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타낸다는 것이 검증되었으며, 트랜지트 펩타이드 (transit peptide, TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PPO 단백질/핵산분자는 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0)와 같은 쌍자엽 식물 또는 벼와 같은 단자엽 식물에서 발현이 가능하며, 이와 같이 형질전환된 식물체에 PPO 활성 저해 제초제를 처리하더라도 식물이 발아 및/또는 생장 가능한 것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 내성 형질이 다음 세대로 성공적으로 전달되는 것이 확인되었다.
따라서, 본 명세서에서 제공하는 PPO 단백질 또는 이들의 변이체들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 내성을 부여 및/또는 증진시키는 데 사용될 수 있다.
일 예는
(1) 앞서 설명한 폴리펩타이드 변이체 또는 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
(4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제초제란, 식물 또는 조류를 사멸시키거나 방제하거나, 또는 식물 또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성이란, 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도, 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (PPO) 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PPO 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논계 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 제초제를 예시할 수 있다.
구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone) 및 티아페나실 (tiafenacil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
디페닐에테르계 제초제는 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로르니트로펜 (chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜 (halosafen) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트 (fluazolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐에스테르계 (phenylesters) 제초제는 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate) 및 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992" 참조)) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 페노필레이트의 카바메이트 유사체는 피롤리딘-1카르복실산 페닐 에스테르 (pyrrolidine-1-carboxylic acid phenyl ester; CAS No. 55379-71-0), 1-피롤리딘카르복실산, 2-클로로페닐 에스테르 (1-Pyrrolidinecarboxylicacid, 2-chlorophenyl ester; CAS No. 143121-06-6), 4-클로로페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chlorophenyl pyrrolidine-1-carboxylate: CAS No. 1759-02-0), 카르밤산, 디에틸-, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (carbamic acid, diethyl-, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester (9CI); CAS No. 143121-07-7), 1-피롤리딘카르복시산, 2,4-디클로로-5-하이드로페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 2,4-dichloro-5-hydroxyphenyl ester; CAS No. 143121-08-8), 2,4-디클로로-5-(메톡시카르보닐)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(methoxycarbonyl)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-94-9), 2,4-디클로로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-96-1), 1-피페리딘카르복실산, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (1-Piperidinecarboxylic acid, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester; CAS No. 87374-78-5), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 87365-63-7), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 4,4-디플루오로피페리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl 4,4-difluoropiperidine-1-carboxylate; CAS No. 138926-22-4), 1-피롤리딘카르복실산, 3,3-디클루오로-, 2,4-디클로로-5-(2-프로핀-1-일옥시)페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 3,3-difluoro-, 2,4-dichloro-5-(2-propyn-1-yloxy)phenyl ester; CAS No. 143121-10-2), 4-클로로-2-플루오로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chloro-2-fluoro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-98-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
티아디아졸계 제초제는 플루티아셋 (fluthiacet) 및 티디아지민(Thidiazimin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길 (oxadiargyl) 및 옥사디아존(Oxadiazon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아지논계 제초제는 트리플루디목사진(trifludimoxazin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone) 및 아자페니딘 (azafenidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존 (pentoxazone)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타의 제초제는 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸 (profluazol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공하는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.
식물체 형질전환의 경우, 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseolin) 터미네이터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 조류 형질전환의 경우, 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터, 핵 프로모터, 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 5'UTR 또는 3'UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PPO 유전자 또는 이의 변이체의 5'-위치에 연결시킬 수 있다.
또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducing) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB (left border)와 RB (right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.
상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 (Agrobacterium -mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporation), 입자 총법 (particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함), 원형질체 (protoplast), 캘러스 (callus), 배축 (hypocotyl), 종자 (seed), 자엽 (cotyledon), 신초 (shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손 (T1 세대, T2 세대, T3 세대, T4 세대, T5 세대, 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, PPO 유전자 또는 이의 변이체가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 내성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 및/또는 괴근과 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 모두 포함하여 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 초본 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae), 난초과 (Orchidaceae)의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과 (돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과 (Clethraceae), 노루발과 (Pyrolaceae), 진달래과 (Ericaceae), 자금우과 (Myrsinaceae), 앵초과 (Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과 (Ebenaceae), 때죽나무과 (Styracaceae), 노린재나무과 (Symplocaceae), 회목과 (Symplocaceae), 물푸레나무과 (목서과, Oleaceae), 마전과 (Loganiaceae), 용담과 (Gentianaceae), 조름나물과 (Menyanthaceae), 협죽도과 (마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과 (Asclepiadaceae), 꼭두서니과 (Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과 (Convolvulaceae), 지치과 (Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 가지과 (Solanaceae), 현삼과 (Scrophulariaceae), 능소화과 (Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과 (Acanthaceae), 참깨과 (Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과 (Gesneriaceae), 통발과 (Lentibulariaceae), 파리풀과 (Phrymaceae), 질경이과 (Plantaginaceae), 인동과 (Caprifoliaceae), 연복초과 (Adoxaceae), 마타리과 (Valerianaceae), 산토끼꽃과 (Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과 (Compositae), 소귀나무과 (Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과 (Salicaceae), 자작나무과 (Betulaceae), 너도밤나무과 (참나무과, Fagaceae), 느릅나무과 (Ulmaceae), 뽕나무과 (Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과 (Santalaceae), 겨우살이과 (Loranthaceae), 마디풀과 (여뀌과, Polygonaceae), 자리공과 (상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과 (Nyctaginaceae), 석류풀과 (Aizoaceae), 쇠비름과 (Portulacaceae), 석죽과 (Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과 (Amaranthaceae), 선인장과 (Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과 (Illiciaceae), 녹나무과 (Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과 (Ranunculaceae), 매자나무과 (Berberidaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과 (Ceratophyllaceae), 어항마름과 (Cabombaceae), 삼백초과 (Saururaceae), 후추과 (Piperaceae), 홀아비꽃대과 (Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae), 다래나무과 (Actinidiaceae), 차나무과 (동백나무과, Theaceae), 물레나물과 (Guttiferae), 끈끈이주걱과 (Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과 (Capparidaceae), 십자화과 (겨자과, Cruciferae), 플라타너스과 (버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과 (금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과 (돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과 (Saxifragaceae), 두충과 (Eucommiaceae), 돈나무과 (Pittosporaceae), 장미과 (Rosaceae), 콩과 (Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과 (Geraniaceae), 한련과 (Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과 (Linaceae), 대극과 (Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과 (Rutaceae), 소태나무과 (Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과 (Polygalaceae), 옻나무과 (Anacardiaceae), 단풍나무과 (단풍과, Aceraceae), 무환자나무과 (Sapindaceae), 칠엽수과 (Hippocastanaceae), 나도 밤나무과 (Sabiaceae), 봉선화과 (물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과 (Aquifoliaceae), 노박덩굴과 (화살나무과, Celastraceae), 고추나무과 (Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과 (Empetraceae), 갈매나무과 (Rhamnaceae), 포도과 (Vitaceae), 담팔수과 (Elaeocarpaceae), 피나무과 (Tiliaceae), 아욱과 (Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과 (서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과 (Flacourtiaceae), 제비꽃과 (Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과 (Tamaricaceae), 물별과 (Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과 (Cucurbitaceae), 부처꽃과 (배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과 (Punicaceae), 바늘꽃과 (Onagraceae), 개미탑과 (Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과 (산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과 (오갈피나무과, Araliaceae), 산형과 (미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예로, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 마초, 목초, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 소나무, 팜오일 및 유칼립투스를 포함하는 목본류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체 예로, 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물; 및 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등의 단자엽 식물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다. 예를 들어, 조류는 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 갈조류, 대형조류 (macroalgae) 또는 미세조류 (microalgae)일 수 있다.
시아노박테리아류로는, Chroococcales 문 (예, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria 문, Nostocales 문 (예, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales 문 (예, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales 문 (예, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales 문, 또는 Stigonematales 문 (예, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) 등을 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella, 또는 Hematococcm 를 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp., Nannochloris spp. 등을 예시할 수 있다. 그러나, 상기 열거한 종류들에 제한 되는 것은 아니며, 그 외 다양한 속 및 종에 속하는 조류들이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 2 종 이상의 PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 기술은 2 종 이상의 PPO 저해 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자는, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자와 조합하여 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 작용기전이 상이한 2 종 이상의 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 PPO 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순서에 상관없이 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하, PPO 저해 제초제와 작용기전이 상이한 제초제를 "제2의 제초제"라고 지칭한다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법을 제공한다.
예컨대, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제 (예를 들어, 이미다졸리디논, 설포닐우레아, 트리아졸피리미딘, 설포아닐라이드, 피리미딘 티오벤조에이트 등), 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제, 색소체 저해성 제초제, 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자; 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물 또는 조류에 적용함으로써 보다 우수한 제초제 내성 형질을 부여 및/또는 증진시키고, 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.
도 1은 pET303-CT-His벡터의 개열지도이다.
도 2는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 (ApPPO1WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM(micromolar)(control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단), 및 saflufenacil을 0 uM(control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우(하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 3은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, flumioxazin을 0 uM (control), 50 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 sulfentrazone을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 4는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, fomesafen (상단)과 acifluorfen (하단)을 각각 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 5는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraclonil을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 pentoxazone을 0 uM (control), 5 uM, 및 10 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 6은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 uM (control), 5 uM, 및 10 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 7 내지 도 12는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 ApPPO1 wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 ApPPO1 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control), 50 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, flumioxazin을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, 및 sulfentrazone 을 0 uM (control), 200 uM, 및 400 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 13은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 (MxPPO WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control), 200 uM, 및 2000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, saflufenacil을 0 uM (control), 100 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, 및 flumioxazin을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 14는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM(micromolar)(control) 및 2000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 15 내지 도 17은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, flumioxazin을 0 uM (control), 200 uM, 및 400 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 18 내지 도 20은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, sulfentrazone을 0 uM (control), 200 uM, 및 1000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 21 및 도 22는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 또는 4개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, flumioxazin을 0 uM (control), 400 uM, 및 1000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 23 및 도 24는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 MxPPO wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 MxPPO 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, sulfentrazone을 0 uM (control), 2000 uM, 및 4000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 25는 pMAL-c2x 벡터의 개열지도이다.
도 26은 ApPPO1의 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대(T2)를 제초제가 포함된 배지에 파종한 6일 후 종자 발아 결과를 보여주는 사진이다.
도 27은 MxPPO의 야생형 또는 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대(T2)를 제초제가 포함된 배지에 파종한 6일 후 종자 발아 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PPO -제초제 복합체 구조 분석을 통한 제초제와 상호작용하는 PPO의 아미노산 정보 획득
Genbank database를 이용하여 아우제노클로렐라 프로토테코이데스 (Auxenochlorella protothecoides) 및 마이소코커스 산투스 (Myxococcus xanthus)의 PPO 유전자 서열 정보를 이용하였다. 아우제노클로렐라 프로토테코이데스의 PPO 단백질 (ApPPO1; 서열번호 1)을 암호화하는 유전자로서, 아우제노클로렐라 프로토테코이데스에서 PPO 유전자 (ApPPO1로 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다. 마이소코커스 산투스의 PPO 단백질 (MxPPO; 서열번호 3)을 암호화하는 유전자로서, 마이소코커스 산투스에서 PPO 유전자 (MxPPO로 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다. PPO 단백질과 제초제의 결합 구조 정보를 확보하기 위해, ApPPO1, MxPPO 단백질과 PPO 저해 제초제로 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 사용하였다. CyPPO10 (써모시네코코커스 에롱가투스 BP-1 (Thermosynechococcus elongatus BP-1) 의 PPO 단백질; 서열번호 5)의 구조 정보와 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 를 이용하여 ApPPO1 의 homology model 을 만들었고 RCSB protein data bank (https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 로부터 MxPPO의 구조 정보를 사용하였다 (PDB ID: 2IVE).
CyPPO10 과 제초제 (tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone)의 결합 정보를 ApPPO1 및 MxPPO의 구조에 superimpose 하여 각 단백질과 제초제가 결합하는 구조 정보를 확보하였다.
CyPPO10 과 제초제의 결합 정보는 다음의 과정으로 확인하였다. CyPPO10의 단백질을 암호화하는 유전자 (서열번호 6)을 pET29b vector (Catalog Number: 69872-3; EMD Biosciences)에 클로닝하고, 대장균을 사용하여 CyPPO10 단백질을 발현시켰다. 발현된 CyPPO10 단백질을 니켈 친화 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였고, 정제된 CyPPO10 단백질에 각 1 mM 농도의 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 첨가하여 CyPPO10 와 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 이 결합한 결정을 획득하였다. 단백질-제초제 결합 결정체를 방사광가속기를 이용하여 2.4Å 해상도의 CyPPO10과 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 결합체의 X-ray 회절데이터를 확보하고, 분자수준의 삼차원 구조를 규명하였다. 이러한 과정을 통해 CyPPO10 단백질 내의 제초제와 결합하는 아미노산 위치에 대한 정보를 획득하였다.
상기 얻어진 CyPPO10 단백질 내의 제초제와 결합하는 아미노산 위치에 대한 정보를 통해서 ApPPO1 및 MxPPO 단백질의 제초제 저항성을 부여하는 아미노산 변이 위치에 대한 정보를 얻었다.
그 결과, ApPPO1 단백질 (서열번호 1)에서는 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422 위치의 아미노산이 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과 상호작용하고 있고, MxPPO 단백질 (서열번호 3)에서는 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365 위치의 아미노산이 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과 상호작용하는 것으로 판단하였다.
실시예 2. PPO 변이체의 제조
PPO 저해 제초제 내성을 높이기 위하여 ApPPO1, MxPPO 아미노산 서열 중 상기 실시예 1에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하여 ApPPO1 및 MxPPO의 변이 유전자를 제작하였다. 먼저, BT3 E. coli 에서 효율적인 제초제 저항성 스크리닝을 위해 ApPPO1, MxPPO 유전자를 코돈 최적화 (codon optimization)하여 합성하였다 (㈜코스모진텍).
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
표 2의 프라이머를 이용, 다음의 조건 하에서 PCR 을 수행하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다:
PCR 반응액 조건
Template (ApPPO1 또는 MxPPO의 합성 DNA) 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 uM) 1 ㎕
reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/ ㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 ℃ 4분 1 cycle
94 ℃ 30초 25 cycles
56 ℃ 30초
72 ℃ 1.5분
72 ℃ 5분 1 cycle
4 ℃ 5분 1 cycle
pET303-CT His 벡터 클로닝을 위한 프라이머 서열 정보
균주 프라이머 서열 서열번호
Auxenochlorella protothecoides ApPPO1_XbaIF CCCCTCTAGAATGGCCGAGTACGACGTTGT 9
ApPPO1_XhoIR CCCCCTCGAGGGTTGCCAGACTTTTAACGT 10
Myxococcus xanthus MxPPO_XbaIF CCCCTCTAGAATGCACCATATGCCCCGAAC 11
MxPPO_XhoIR CCCCCTCGAGAGGCGCGTGTGATGTATTAC 12
상기 증폭한 유전자 products와 pET303-CT His vector (VT0163; Novagen; 도 1 참조)를 XbaI, XhoI 으로 절단한 후, T4 DNA ligase (RBC, 3 units/㎕)를 이용하여 pET303-ApPPO1과 pET303-MxPPO plasmid를 각각 제작하였다.상기 pET303-CT His vector에 클로닝 한 ApPPO1과 MxPPO을 template으로 하여, 아래 표 4 및 표 5의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 ApPPO1과 MxPPO의 변이 유전자를 제작하였다.
PCR 반응액 조건
Template 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 uM) 1 ㎕
reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 ℃ 2분 1cycle
94 ℃ 30초 17~25cycles
65 ℃ 40초
72 ℃ 6~7분
72 ℃ 5분 1cycle
4 ℃ 5분 1cycle
ApPPO1 변이 유전자 제작용 프라이머 list
ApPPO 아미노산 변이 프라이머 서열 서열번호
Y422M F CTCTTGTCACTTTATGGGGGGGCTACCAACAC 　13
　 R CCCCCATAAAGTGACAAGAGCAGCACCTTTCC 　14
Y422L F CTCTTGTCACTTTTTGGGGGGGCTACCAACAC 　15
　 R CCCCCAAAAAGTGACAAGAGCAGCACCTTTCC 　16
Y422C F TCTTGTCATGTTTTGGGGGGGCTACCAACAC 　17
　 R CCCCCAAAACATGACAAGAGCAGCACCTTTCC 　18
Y422V F CTCTTGTCAGTTTTTGGGGGGGCTACCAACAC 　19
　 R CCCCCAAAAACTGACAAGAGCAGCACCTTTC 　20
Y422I F CTCTTGTCAATTTTTGGGGGGGCTACCAACAC 　21
　 R CCCCAAAAATTGACAAGAGCAGCACCTTTCC 　22
Y422T F GTGCTGCTCTTGTCAACCTTTGGGGGGGCTACC 　23
　 R GGTAGCCCCCCCAAAGGTTGACAAGAGCAGCAC 　24
A215L F GGGTTTACCTCGGCGACCCGGCTAAGTTGAG 　25
　 R GTCGCCGAGGTAAACCCCGCTGCAAAACGGC 　26
A215C F GGGTTTACTGCGGCGACCCGGCTAAGTTGAG 　27
　 R GTCGCCGCAGTAAACCCCGCTGCAAAACGGC 　28
V360M F CCCTCCCATGGCATCTGTAGCATTATCTTACC 　29
　 R TACAGATGCCATGGGAGGGTAATAGATAGAGC 　30
R140A F GATCCGAAGGCGCCCGCGTACGTTTATTGGGGTG 　31
　 R CACCCCAATAAACGTACGCGGGCGCCTTCGGATC 　32
F209A F CGACTTATAGAGCCGGCGTGCAGCGGGGTTTAC 　33
　 R GTAAACCCCGCTGCACGCCGGCTCTATAAGTCG 　34
V213C F CCGTTTTGCAGCGGGTGCTACGCCGGCGACCCG 　35
　 R CGGGTCGCCGGCGTAGCACCCGCTGCAAAACGG 　36
F386V F GGTCACCTAGCGGGCGTGGGCCAGCTACACCCTC 　37
　 R GAGGGTGTAGCTGGCCCACGCCCGCTAGGTGACC 　38
L389T F GCGGGCTTTGGCCAGACCCACCCTCGTACTCAG 　39
　 R CTGAGTACGAGGGTGGGTCTGGCCAAAGCCCGC 　40
I402T F CACCACTCTGGGCACTACCTATGCCTCAAGCTTA 　41
　 R TAAGCTTGAGGCATAGGTAGTGCCCAGAGTGGTG 　42
V360I F CTATTACCCTCCCATCGCATCTGTAGCATTATC 　43
　 R GATAATGCTACAGATGCGATGGGAGGGTAATAG 　44
V360L F TACCCTCCCCTCGCATCTGTAGCATTATCTTAC 　45
　 R CAGATGCGAGGGGAGGGTAATAGATAGAGC 　46
S362V F TACCCTCCCGTCGCAGTTGTAGCATTATCTTAC 　47
　 R GTAAGATAATGCTACAACTGCGACGGGAGGGTA 　48
V213C+A215C F TTGCAGCGGGTGCTACTGCGGCGACCCGGCTAAGT 　49
　 R ACTTAGCCGGGTCGCCGCAGTAGCACCCGCTGCAA 　50
V213C+A215L F TTGCAGCGGGTGCTACCTTGGCGACCCGGCTAAGT 　51
　 R ACTTAGCCGGGTCGCCAAGGTAGCACCCGCTGCAA 　52
MxPPO 변이 유전자 제작용 프라이머 list
MxPPO 아미노산 변이 프라이머 서열 (5'-> 3') 서열번호
M365T F ACTCATGTACGGTGGGGGGTGCAAGACAACC 53
R CCCCACCGTACATGAGTATAAGACACGCCCAC 54
M365L F TACTCATGTCTGGTGGGGGGTGCAAGACAACC 55
R CCCACCAGACATGAGTATAAGACACGCCCAC 56
M365C F TACTCATGTTGCGTGGGGGGTGCAAGACAACC 57
R CCCCCACGCAACATGAGTATAAGACACGCCC 58
M365V F TACTCATGTGTGGTGGGGGGTGCAAGACAACC 59
R CCCCCCACCACACATGAGTATAAGACACGCCC 60
M365I F GTCTTATACTCATGTATCGTGGGGGGTGCAAGAC 61
R GTCTTGCACCCCCCACGATACATGAGTATAAGAC 62
R95A F GCAAAGAGAGCTTATGTCTACACGCGAGGACG 63
R GTAGACATAAGCTCTCTTTGCAGCCGGATCGGC 64
V164A F TAGATGCAGCGCAGACAGGGATATATGCCGG 65
R CTGTCTGCGCTGCATCTAATAGAACTTGGG 66
I168C F CAGACAGGGTGCTATGCCGGAGATGTTGAGC 67
R TCCGGCATAGCACCCTGTCTGCACTGCATCTAA 68
A170C F GGGATATATTGCGGAGATGTTGAGCAATTATC 69
R ACATCTCCGCAATATATCCCTGTCTGCACTGC 70
A170L F GGGATATATCTCGGAGATGTTGAGCAATTATC 71
R ACATCTCCGAGATATATCCCTGTCTGCACTGC 72
I311M F TGCCCCCATGGCTGTAGTTCATCTCGGATTC 73
R AACTACAGCCATGGGGGCATAGGCGATACC 74
F329V F CGATGGGGTCGGTTTTTTAGTGCCGGCGGAGG 75
R AAAAAACCGACCCCATCGGGCGCCGGTAAAG 76
L332T F TTCGGTTTTACAGTGCCGGCGGAGGAACAG 77
R CCGGCACTGTAAAACCGAACCCATCGGGCGC 78
I345T F GGGTGCCACTCATGCTTCCACGACTTTCCCG 79
R GAAGCATGAGTGGCACCCAACATCCTTCGCTG 80
I168C+A170C F GTGCAGACAGGGTGCTATTGCGGAGATGTTGAG 81
R CTCAACATCTCCGCAATAGCACCCTGTCTGCAC 82
상기 얻어진 PCR 용액 10 ㎕ 에 DpnI (NEB) 1 ㎕ 을 처리하고, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 DH5α competent cell (Biofact)에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린(Gold Biotechnology) 이 포함된 LB agar 배지에 배양하였다. 상기 형질전환된 DH5α cell에서 plasmid를 추출하여 sequence를 확인하였다 (㈜코스모진텍).
실시예 3. PPO 및 이의 변이체의 PPO 저해 제초제 내성 검증 (대장균에서 실험)
상기 실시예 2에서 얻어진 변이 PPO 유전자를 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(
Figure pat00003
PPO))에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. BT3(
Figure pat00004
PPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신(kanamycin)에 내성을 가지는 균주이다 ("Watanabe N,　Che FS,　Iwano M,　Takayama S,　Yoshida S,　Isogai A. Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons. J. Biol. Chem. 276(23):20474-20481, 2001; Che FS,　Watanabe N,　Iwano M,　Inokuchi H,　Takayama S,　Yoshida S,　Isogai A. Molecular characterization and subcellular localization of protoporphyrinogen oxidase in spinach chloroplasts. Plant Physiol.　 124(1):59-70, 2000." 참조).
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
상기 실시예 2에서 제작된 pET303-ApPPO1 과 pET303-MxPPO plasmid 및 각각의 변이 유전자들이 포함된 plasmid를 BT3 competent cell에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린(Gold Biotechnology) 이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자가 삽입된 BT3 형질전환체는 LB broth (LPSS, 3 ml)에 단일 콜로니를 접종하여 12시간 배양하고, 이 배양액 50~100 ㎕를 새로운 LB broth에 계대하여 흡광도 (OD600)가 0.5~1이 될 때까지 배양하고 이 배양액을 LB broth로 희석하여 흡광도를 0.5로 일정하게 맞춰준 후, LB broth로 1/10배씩 4번 희석하여 형질전환 대장균 배양 희석액을 준비하였다.
LB 25g/l, Bacto agar 15g/l, 카베니실린 (100 μg/ml) 및 다양한 제초제를 농도별 (최종 0~4,000 uM)로 혼합하여 제초제를 포함하는 배지를 준비하였다. 상기 제초제 stock은 모두 DMSO를 이용하여 제초제를 용해한 것이다.
상기 준비된 형질전환 대장균 배양 희석액을 제초제 포함 LB agar 배지에 10 ㎕ 씩 떨어뜨리고, 37℃ 및 광조건 (표 7, 표 9, 표 10, 도 2 내지 도 6, 도 13 내지 도 20) 또는 암조건 (표 8, 표 11, 도 7 내지 도 12, 도 21 내지 도 24)하에서 16~20시간 동안 배양하고, 각 유전자를 포함한 형질전환 대장균들의 생장 정도를 육안으로 확인하여, 형질전환 대장균의 PPO 저해 제초제에 대한 내성을 평가하였다.
실험에 사용된 제초제를 아래의 표 6에 정리하였다:
Family 제초제
Pyrimidinedione계 제초제 tiafenacil
saflufenacil
Diphenyl ether계 제초제 fomesafen
acifluorfen
N-phenylphthalimides계 제초제 flumioxazin
Triazolinones계 제초제 sulfentrazone
Oxazolidinediones계 제초제 pentoxazone
Phenylpyrazoles계 제초제 pyraflufen-ethyl
기타 pyraclonil
상기 얻어진 ApPPO1 및 MxPPO의 변이 유전자들의 제초제 내성을 ApPPO1 및 MxPPO 야생형과 상대 평가하여 아래의 표 7 내지 표 11 및 도 2 내지 도 24 에 나타내었다:
변이 ApPPO1 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil saflufenacil flumioxazin sulfentrazone fomesafen
1 A215C (AC) + + N.T + +
2 A215L (AL) ++ ++++ ++++ +++ +++
3 V360M (VM) ++ +++ N.T + +
4 Y422T (YT) ++ ++++ +++ + +
5 Y422C (YC) ++ +++ N.T ++ ++
6 Y422M (YM) +++ +++++ +++ + +
7 Y422I (YI) ++ +++++ +++ + +
8 Y422L (YL) ++ ++++ +++ + +
WT - - - - -
No. Mutation site acifluorfen pyraclonil pentoxazone pyraflufen -ethyl
1 A215C (AC) ++ + + ++
2 A215L (AL) +++ ++ ++ +++
3 V360M (VM) ++ + + ++
4 Y422T (YT) + + ++ ++
5 Y422C (YC) ++ ++ +++ +++
6 Y422M (YM) ++ ++ ++ ++
7 Y422I (YI) + + ++ ++
8 Y422L (YL) ++ ++ ++ ++
WT - - - -
N.T (Not tested)
변이 ApPPO1 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil flumioxazin sulfentrazone
1 R140A+Y422I +++++ +++++ ++++
2 R140A+Y422T ++++ ++++ +++
3 R140A+Y422M ++++ ++++ ++++
4 V213C+Y422I ++++ +++++ +++
5 V213C+Y422T +++++ +++++ ++++
6 V213C+Y422M +++++ +++ ++
7 A215L+Y422I ++++ ++++ ++++
8 A215L+Y422T + + ++++
9 A215L+Y422M +++++ +++++ ++++
10 A215C+Y422I +++++ +++++ ++++
11 A215C+Y422T +++ +++ +++
12 A215C+Y422M +++++ +++++ ++++
13 R140A+V213C+Y422I +++++ +++++ ++++
14 R140A+V213C+Y422M +++++ +++++ ++++
15 R140A+A215C+Y422I +++++ +++++ ++++
16 R140A+A215L+Y422M +++++ +++++ ++++
17 V213C+A215C+Y422I +++++ +++++ ++++
18 V213C+A215L+Y422M +++++ +++++ ++++
19 R140A+V213C+A215C+Y422I +++++ +++++ ++++
20 R140A+V213C+A215L+Y422M +++++ +++++ ++++
WT - - -
변이 MxPPO 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil saflufenacil flumioxazin
1 A170C + +++ +
2 A170L + ++ ++
3 I311M ++ ++ ++
4 M365I + ++ ++
5 M365L + ++ ++
6 M365V + +++ ++
WT - - -
변이 MxPPO 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil flumioxazin sulfentrazone
1 R95A+ M365I N. T + +
2 R95A+M365V N. T + +
3 I168C+M365I N. T + +
4 I168C+M365V N. T + +
5 A170C+M365I N. T + +
6 A170C+M365V + ++ +
7 I311M+M365I + ++ +
8 I311M+M365V + ++ +
9 L332T+M365I N. T + +
10 L332T+M365V + + +
11 R95A+I168C+M365I N. T + +
12 R95A+I168C+M365V N. T + +
13 R95A+A170C+M365I N. T + +
14 R95A+I311M+M365I + ++ +
15 R95A+I311M+M365V N. T ++ +
16 R95A+L332T+M365I N. T + +
17 R95A+L332T+M365V N. T + +
18 I168C+A170C+M365V N. T ++ ++
19 I168C+I311M+M365I + ++ +
20 I168C+I311M+M365V + ++ +
21 I168C+L332T+M365I N. T ++ ++
22 I168C+L332T+M365V + +++ ++
23 A170C+I311M+M365I N. T ++ +
24 A170C+L332T+M365V N. T ++ ++
25 I311M+L332T+M365I + ++ ++
26 I311M+L332T+M365V + +++ ++
WT - - -
N.T(Not tested)
변이 MxPPO 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site flumioxazin sulfentrazone
1 R95A+I168C+A170C+M365V + ++
2 R95A+I168C+I311M+M365V + +++
3 R95A+I168C+L332T+M365I + ++
4 R95A+A170C+I311M+M365V + +
5 R95A+A170C+L332T+M365I + +++
6 R95A+I311M+L332T+M365I + +++
7 I168C+A170C+I311M+M365I + +
8 I168C+A170C+L332T+M365V + ++
9 A170C+ I311M+L332T+M365I + N. T
10 R95A+I168C+A170C+I311M+M365V + +++
11 R95A+I168C+A170C+L332T+M365I + +++
12 R95A+I168C+ I311M+L332T+M365V + +++
13 I168C+A170C+I311M+L332T+M365V + ++
14 R95A+I168C+A170C+I311M+L332T+M365V + +++
WT - -
N.T (Not tested)상기 표 7 내지 표 11에서, 야생형의 제초제 내성 수준을 "-"으로 표시하고, 내성 수준이 높을수록 "+"를 덧붙여 최대 "+++++"까지 등급을 정하여 평가하였다 (각 실험마다 처리한 제초제의 최종처리 농도에서 wild type PPO의 형질전환 대장균의 생장정도를 기준으로, wild type PPO 대비 1~9배 수준을 '+', 10~99배 수준을 '++', 100~999배 수준을 '+++', 1,000~9,999배 수준을 '++++', 10,000배 이상 수준을 '+++++' 로 평가함).
도 2 내지 도 12 (ApPPO1의 야생형 또는 변이체) 및 도 13 내지 도 24 (MxPPO의 야생형 또는 변이체)은 PPO 유전자 (야생형 또는 변이체)가 형질전환된 대장균의 배양 결과를 보여주는 사진으로, 상단에 기재된 농도는 제초제 처리 농도이며, 각 농도별 5개의 컬럼은 대장균 배양액을 10배씩 희석한 결과를 나타낸 것으로, 가장 왼쪽 컬럼이 OD600=0.5인 대장균 배양액의 실험 결과이고, 오른쪽으로 갈수록 10배씩 희석된 배양액의 실험 결과이다.
상기 표 7 내지 표 11 및 도 2 내지 도 24 에서 보여지는 바와 같이, ApPPO1 및 MxPPO의 변이 유전자가 도입된 형질전환체는 모두 다양한 종류의 제초제에 대하여 야생형 유전자가 도입된 형질전환체 대비 높은 수준의 제초제 내성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 4: PPO의 효소 활성 및 제초제별 IC 50 값 측정
PPO 단백질 및 특정 위치의 아미노산을 변이시킨 PPO 단백질 변이체의 효소 활성을 측정하고 PPO저해 제초제에 의한 inhibition assay를 수행하였다. PPO 단백질은 수용성이 낮지만, MBP (maltose binding protein)와 함께 fusion protein (MBP-PPO)으로 발현시킬 경우 안정적으로 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인하여, 하기의 야생형 및 변이형 단백질을 MBP와의 융합 단백질 형태로 발현시켜서 본 실험에 사용하였다.
ApPPO1 및 MxPPO의 야생형 유전자 및 변이 유전자를 발현시키기 위하여, 다음의 조건으로 pMAL-c2x-ApPPO1, pMAL-c2x-MxPPO 를 제작하였다.
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
표 13의 프라이머를 이용, 다음의 조건 하에서 PCR 을 수행하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다:
PCR 반응액 조건
Template (ApPPO1 또는 MxPPO의 합성 DNA) 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
Forward primer (10 uM) 1 ㎕
Reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/ ㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 ℃ 4분 1 cycle
94 ℃ 30초 27 cycles
56 ℃ 30초
72 ℃ 2분
72 ℃ 5분 1 cycle
4 ℃ 5분 1 cycle
pMAL-c2x 벡터에 클로닝 하기 위한 프라이머 서열 정보
균주 프라이머 서열 서열번호
Auxenochlorella protothecoides ApPPO1_BamHIF CCCCGGATCCATGGCCGAGTACGACGTTGT 83
ApPPO1_SalIR CCCCGTCGACTCAGGTTGCCAGACTTTTAACGT 84
Myxococcus xanthus MxPPO_BamHIF CCCCGGATCCATGCACCATATGCCCCGAAC 85
MxPPO_SalIR CCCCGTCGACTCAAGGCGCGTGTGATGTATTAC 86
상기 증폭한 유전자 products와 pMAL-c2x vector (도 25 참조)를 BamHI, SalI 으로 절단한 후, T4 DNA ligase (RBC, 3 units/㎕)를 이용하여 pMAL-c2x-ApPPO1과 pMAL-c2x-MxPPO plasmid를 각각 제작하였다.상기 pMAL-c2x vector에 클로닝 한 ApPPO1과 MxPPO을 template으로 하여, 표 4 및 표 5의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 ApPPO1과 MxPPO의 변이 유전자를 제작하였다.
PCR 반응액 조건
Template 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
Forward primer (10 uM) 1 ㎕
Reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
제작된 변이 plasmid 를 BL21CodonPlus(DE3) 대장균에 형질전환하였다.
상기 얻어진 형질전환 대장균을 다음의 조건으로 배양하여 삽입된 PPO 유전자를 발현시켰다:
Induction: OD600=0.2, 최종농도 0.3 mM IPTG 첨가;
발현온도: 23 ℃, 200 rpm의 진탕 배양;
발현시간: 16hrs;
배양규모: 200 ml/1,000 ml flask.
상기 배양된 형질전환 대장균에 대하여 다음의 과정으로 세포 파쇄 및 단백질 추출을 수행하였다:
추출 버퍼: Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 200 mM NaCl) 5 ml buffer/g cell;
Sonication: SONICS&MATERIALS社 VCX130 (130 watts);
15 sec ON, 10 sec OFF for 5 min on ice;
4 ℃ 및 20분 조건 하에서 원심분리 (20,000 x g); 및
상기 원심분리로 얻어진 상층액을 column buffer를 사용하여 1:6 비율로 희석하였다.
상기 얻어진 단백질 추출물에 대하여 다음의 과정을 4 ℃ 에서 수행하여 PPO 단백질의 정제를 수행하였다. 1.5 x 15 cm column (Bio-Rad Econo Columns 1.5 x 15 cm, glass chromatography column, max. vol)에 amylose resin (New England Biolabs)을 부어 컬럼을 packing하고, 상기 얻어진 단백질 추출물을 컬럼에 0.2 ml/min의 속도로 로딩하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피 기준으로 3부피배의 column buffer로 washing 후 washing액 내의 단백질 양을 확인하여 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 washing을 종료하였다. 상기 컬럼 부피 기준으로 약 2부피배의 20 mM maltose 를 포함하는 column buffer로 MBP-PPO 단백질을 elution (1.5 ml tube에 각 fraction을 분취)하면서 각 eluant의 단백질 농도를 확인하였다. 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 elution을 종료시켰다. 각 fraction을 10 ㎕의 양으로 취하여 단백질 정량 후 단백질이 검출된 fraction을 SDS-PAGE로 분석하고, 순도가 높은 fraction을 취하여 효소 활성 분석 실험에 사용하였다.
PPO 단백질의 기질인 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)를 합성하였다. 이 과정은 질소기체가 streaming 되는 공간에서 수행되었다. 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 9 mg을 20% (v/v) EtOH 20 ml에 용해시키고, dark condition에서 30분간 교반하였다. 상기 얻어진 프로토포르피린 IX 용액을 15 ml screw tube에 800 ㎕의 양으로 넣고 5분간 질소 기체를 flushing하였다. 여기에 아말감나트륨 (sodium amalgam) 1.5g을 넣고 2분간 vigorous shaking하였다. Tube 안의 수소 기체를 배출하기 위해 뚜껑을 열어두었다. 그 후, 뚜껑을 닫고 3분간 인큐베이션한 후, syringe와 cellulose membrane filter를 이용해 프로토포르피리노겐 IX 용액을 filtering하였다. 상기 얻어진 프로토포르피리노겐 IX 용액 600 ㎕에 2M MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 약 300 ㎕의 양으로 첨가하여 pH를 8.0으로 조절하였다. PPO 단백질의 효소 활성을 측정하기 위하여 다음의 조성으로 reaction mixture를 준비하였다 (10 ml 기준: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0); 50 mM NaCl; 0.04% (v/v) Tween 20; 40 mM glucose (0.072g); 5 units glucose oxidase (16.6 mg); 및 10 units catalase (1 ㎕)).
상기 reaction mixture 180 ㎕를 96 well plates에 넣고 앞서 정제된 PPO 단백질 (상기 MBP-fusion 단백질을 정제한 산물) 20 ㎕를 첨가하였으며, 약 50 ㎕의 mineral oil로 표면을 커버하였다. 기질인 프로토포르피리노겐 IX 용액을 최종농도 50 uM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. Microplate reader (Hidex社 sense)를 이용하여 프로토포르피린 IX 의 형광을 측정하였다 (excitation: 405 nm; emission: 633 nm). PPO 효소 활성값을 계산하기 위해, 상기 프로토포르피리노겐 IX 용액이 들어있는 튜브를 공기중에 개방하여 용액을 12 시간 이상 산화시켰다. 여기에 2.7 N HCl를 첨가하고 408nm에서의 흡광도 (absorbance)를 측정하였다. Standard 프로토포르피린 IX을 이용해 standard curve를 작성하고 이를 이용해 프로토포르피리노겐 IX의 농도를 calibration하여 PPO 활성을 측정하였다.
상기 얻어진 PPO 야생형 및 변이체의 효소 활성은 아래의 표 14 및 표 15 와 같다. 변이체 활성은 야생형 대비 상대적 활성값으로 표기하였다.
변이체별 PPO 효소 활성을 50% 저해하는 농도(IC50)를 각 제초제별로 측정하였으며, 각 제초제의 최종 농도는 아래와 같이 하였다:
- 제초제 (tiafenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone)의 최종농도: 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 nM
IC50값은 상기한 효소 활성 측정 과정에 제초제를 상기 농도로 첨가하여 PPO 효소 활성을 제초제 첨가 전의 50%로 저해하는 제초제의 농도로 구하였다.
이와 같이 얻어진 제초제 별 IC50을 아래의 표 14 및 표 15에 나타내었다:
변이 ApPPO1 단백질 종류별 제초제 IC50 측정
No. Mutation site Activity (%) tiafenacil (nM) flumioxazin (nM) sulfentrazone (nM)
1 WT 100 21 89 348
2 R140A 88 86 202 973
3 F209A 78 69 N. T　 N. T　
4 V213C 85 81 163 526
5 A215C 89 76 N. T　 N. T　
6 A215L 76 3,456 1,552 >10,000　
7 V360M 59 75 N. T　 N. T　
8 F386V 86 368 N. T　 N. T　
9 L389T 11 716 N. T　 N. T　
10 I402T 16 488 N. T　 N. T　
11 Y422M 93 457 237 1,084
12 Y422I 91 2,974 911 1,496
13 Y422T 84 3,660 935 3,778
14 R140A + Y422M 29 1,564 332 1,977
15 F209A + Y422M 51 699 N. T　 N. T　
16 V213C + Y422M 29 840 363 1,732
17 A215C + Y422M 58 3,541 N. T　 N. T　
18 A215L + Y422M 34 >5,000 >5,000　 >10,000　
19 V360M + Y422M 8 1,162 N. T　 N. T　
20 F386V + Y422M 65 756 N. T　 N. T　
21 L389T + Y422M 15 1,956 N. T　 N. T　
22 I402T + Y422M 21 4,187 N. T　 N. T　
23 V360I + Y422I 16 3,282 N. T　 N. T　
24 S362V + Y422I 21 4,836 N. T　 N. T　
N.T (Not tested)
변이 MxPPO 단백질 종류별 제초제 IC50 측정
No. Mutation site Activity (%) tiafenacil (nM) flumioxazin (nM) sulfentrazone (nM)
1 WT 100 242 24 534
2 R95A 43 2,366 154 >10,000
3 V164A 75 367 N. T　 N. T　
4 I168C 47 550 80 1,162
5 A170C 86 1,684 546 4,571
6 A170L 40 >5,000 >5,000 >10,000　
7 I311M 87 964 58 1,228
8 F329V 91 239 N. T　 N. T　
9 L332T 87 1,005 78 4,769
10 I345T 33 2,206 N. T　 N. T　
11 M365I 82 1,379 1,327 3,388
12 M365V 77 1,980 1,593 3,590
13 M365T 52 2,772 N. T　 N. T　
14 R95A+ M365I 42 >5,000 N. T　 N. T　
15 R95A + M365V 40 >5,000 N. T　 N. T　
16 I168C + M365I 45 1,677 N. T　 N. T　
17 I168C + M365V 42 2,031 N. T　 N. T　
18 A170C + M365I 78 2,449 1,848 >10,000
19 A170C + M365V 71 2,794 N. T　 N. T　
20 A170L + M365I 33 >5,000 N. T　 N. T　
21 A170L + M365V 40 >5,000 N. T　 N. T　
22 I311M + M365I 75 3,327 N. T　 N. T　
23 I311M + M365V 71 3,368 N. T　 N. T　
24 L332T + M365I 80 2,857 N. T　 N. T　
25 L332T + M365V 68 2,591 N. T　 N. T　
26 R95A + I168C + M365I 38 3,982 N. T　 N. T　
27 R95A + A170C + M365I 41 >5,000 N. T　 N. T　
28 R95A + I311M + M365V 37 >5,000 N. T　 N. T　
29 R95A + L332T + M365I 38 >5,000 N. T　 N. T　
30 I168C + A170C + M365V 45 3,577 N. T　 N. T　
31 I168C + I311M + M365I 47 4,671 N. T　 N. T　
32 I168C + L332T + M365V 49 3,196 N. T　 N. T　
33 A170C + I311M + M365I 69 4,572 N. T　 N. T　
34 I311M + L332T + M365V 55 >5,000 N. T　 N. T　
35 R95A + I168C + A170C + M365I 33 >5,000 2,477 >10,000
36 R95A + A170C + I311M + M365V 31 >5,000 N. T　 N. T　
37 R95A + A170C + L332T + M365I 35 >5,000 N. T　 N. T　
38 R95A + I168C + I311M + M365V 37 >5,000 1,891 >10,000
39 R95A + I168C + L332T + M365I 34 >5,000 2,368 >10,000
40 R95A + I311M + L332T + M365V 29 >5,000 2,996 >10,000
41 I168C + A170C + I311M + M365I 44 >5,000 N. T　 N. T　
42 I168C + A170C + L332T + M365V 40 4,537 N. T　 N. T　
43 A170C+ I311M + L332T + M365I 52 >5,000 3,627 >10,000
44 R95A + I168C + A170C + I311M + M365V 17 >5,000 N. T　 N. T　
45 R95A + I168C + A170C + L332T + M365I 18 >5,000 N. T　 N. T　
46 R95A + I168C + I311M + L332T + M365V 12 >5,000 3,741 >10,000
47 I168C + A170C + I311M + L332T + M365V 20 >5,000 N. T　 N. T　
48 R95A + I168C + A170C + I311M + L332T + M365V 8 >5,000 >5,000　 >10,000
N.T (Not tested)상기 표 14 및 표 15에서 확인되는 바와 같이, ApPPO1과 MxPPO 모두에서 변이체의 경우에 야생형과 비교하여 tiafenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 의 IC50값이 모두 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 PPO 단백질의 특정 위치의 아미노산 변이에 의하여 제초제에 대한 내성이 증가됨을 입증하는 것이다. 본 실험 결과에서 CyPPO 단백질 변이체가 대체적으로 야생형에 비하여 감소된 효소활성을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 PPO 효소가 존재하는 식물의 엽록체 환경과 실험 조건이 동일하지 않아 CyPPO 단백질간 효소 활성의 차이가 크게 나는 것으로, 실제 식물에 형질전환 되어 엽록체에 정상적으로 발현되면 효소 활성 감소가 크지 않을 것으로 예상된다.
실시예 5. CyPPO 변이체를 이용한 애기장대 형질전환체 제작 및 제초제 내성 실험
5-1. 애기장대 형질전환 벡터 제작 및 애기장대 형질전환체 제작
애기장대 형질전환은 선별 마커인 Bar 유전자 (glufosinate 내성 유전자)의 ORF와 각각의 ApPPO1 변이체, MxPPO, 및 MxPPO 변이체 유전자의 ORF를 가진 이원벡터 (binary vector)를 제작하여 수행하였다. 또한, Bar 유전자는 PPO 저해 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 사용하였으며, 형질전환한 유전자가 후대에 안정적으로 유전되고 있는지 여부를 검증하는 데에도 사용하였다. Bar 유전자의 발현을 위하여 NOS 프로모터와 전사 종결을 위한 E9 터미네이터를 사용하였다.
ApPPO1 변이체, MxPPO, 및 MxPPO 변이체 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 CaMV35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 사용하였다. ApPPO1 변이체, MxPPO, 및 MxPPO 변이체 유전자는 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) tag을 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의 3' 말단 부위에 삽입하였다. HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 또한, 엽록체로 단백질의 이동과 발현을 유도하기 위해 AtPPO1 유전자 (서열번호 87)의 transit peptide (TP; 서열번호 88)를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의 5' 앞에 삽입하였다. 상기에서 제작한 각각의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 competent cell에 freeze-thaw 방법으로 도입하여 형질전환 시켰다. GV3101 competent cell 을 제조하기 위하여, GV3101 균주를 5 ml LB media 에 30℃ 및 200 rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200 ml LB media 에 접종하여 30℃ 및 200 rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000 xg, 4℃ 에서 20분간 원심분리 하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20 ml LB media 로 재현탁 (resuspension)하였다. 200 ㎕씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.
각각의 형질전환 아그로박테리움을 항생제 배지 (spectinomycin을 포함한 LB agar)에서 배양 및 선별하였다. 상기 선별된 콜로니를 LB broth에서 액체 배양하였다. 이 배양액으로부터 아그로박테리움 cell을 harvest 한 후, 5% (w/v) sucrose 용액에 흡광도 (OD600) 0.8의 농도로 현탁한 후, 0.05% (v/v) Silwet L-77 (Momentive Performance Materials)를 첨가하였다. Floral dipping 방법으로 Col-0 ecotype 애기장대 wild type에 형질전환하여 형질전환 애기장대를 제작하고, 1~2달 후 종자 (T1)를 수확하였다.
형질전환 개체 선발을 위해 삽입된 Bar 유전자를 이용하여 형질전환 개체를 선발하였다. 상기 얻어진 T1 종자를 50 uM glufosinate가 첨가된 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt, 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하고, 파종 7일 후 생존한 개체를 선발하여 흙으로 이식하고 성장시켜 T1 식물체를 수득하였다.
이식한 T1 식물체들의 PPO 저해 제초제 내성을 판단하기 위해 3~4주 키운 후 추대 전 tiafenacil을 처리하였다. 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 tiafenacil 용액 100 ml (1 uM tiafenacil + 0.05%(v/v) Silwet L-77)을 골고루 분사하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)의 경우 상기와 동일한 농도 및 양으로 tiafenacil을 처리하면 사멸하였다. 상기와 같은 tiafenacil 처리 후 4~7일 경과 후 각 형질전환체들의 PPO 저해 제초제 내성 여부를 판별하였다.
내성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고 (T2 종자), 상기 T2 종자를 50 uM glufosinate를 첨가한 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt, 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하여 6~7일간 키운 뒤, 생존 개체를 선발하였다.
5-2. 형질전환 애기장대(T 2 )의 제초제 저항성 검증
ApPPO1 변이체 (Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L+Y422M), MxPPO, 또는 MxPPO 변이체 (M365I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 대하여 제초제 저항성을 테스트하였다.
ApPPO1 변이체(Y422I, Y422L, Y422M, Y422V, A215L+Y422M), MxPPO 또는 MxPPO 변이체(M365I)를 암호화하는 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 종자(T2)를 제초제가 포함된 1/2 MS 배지에 파종하고 6일간 생장 후 발아 정도로 식물체의 제초제 저항성을 판단하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)를 대조군으로 사용하였다. 상기 얻어진 결과를 도 26 (ApPPO1 변이체) 및 도 27 (MxPPO 야생형 및 MxPPO 변이체)에 나타내었다.
사용된 제초제 종류 및 처리 농도는 다음과 같다.
도 26: 0.1 uM tiafenacil, 0.3 uM saflufenacil, 0.1 uM flumioxazin, 1 uM sulfentrazone
도 27: 10 uM tiafenacil, 0.5 uM flumioxazin, 5 uM sulfentrazone.
대조군인 Col-0는 제초제를 포함하지 않는 1/2 MS 배지에서 정상적으로 발아하는 반면, 상기한 바와 같은 제초제를 포함한 배지에서는 정상 발아하지 못한다. 도 26은 ApPPO1 변이체의 형질전환체가 대조군인 Col-0 보다 우수한 발아율 및 생존 비율을 보여준다. 도 27은 MxPPO 변이체의 형질전환체가 Col-0 및 야생형 MxPPO의 형질전환체보다 우수한 발아율 및 생존 비율을 보여준다.
<110> FarmHannong Co., Ltd. <120> Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using PPO Variants <130> DPP20184868KR <150> 10-2017-0173634 <151> 2017-12-15 <160> 88 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (ApPPO1) of Auxenochlorella protothecoides) <400> 1 Met Trp Leu Thr Ser Ala Thr Leu Val Arg Ala Arg His Val Pro His 1 5 10 15 Ala Val Gly Lys Pro Ala Leu Gln Arg Pro Gly Gly Asp Pro Val Val 20 25 30 Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ala Ala Leu Thr Leu Glu 35 40 45 Ala Ala Gly Arg Glu Cys Val Val Leu Glu Ala Gln Asp Gly Val Gly 50 55 60 Gly Arg Val Arg Thr Asp Arg His Glu Gly Phe Leu Leu Asp Arg Gly 65 70 75 80 Phe Gln Ile Phe Leu Thr Ser Tyr Pro Glu Ala Gln Arg Leu Leu Asp 85 90 95 Tyr Asp Ser Leu Glu Leu His Pro Phe Phe Asn Gly Ala Val Val Arg 100 105 110 Thr Ala Asp Gly Ala Met His Thr Val Ala Asp Pro Phe Arg His Pro 115 120 125 Val Pro Gly Leu Leu Ser Leu Leu Asn Pro Val Gly Ser Pro Leu Asp 130 135 140 Lys Leu Arg Val Gly Leu Leu Arg Leu Arg Thr Gln Leu Thr Gly Ala 145 150 155 160 Gln Ser Leu Leu Ala Thr Ser Gln Glu Thr Thr Thr Leu Glu Arg Leu 165 170 175 Gln Ala Arg Arg Arg Thr Asp Arg Gly Ser Leu Ile Ala Glu Gly Phe 180 185 190 Ser Asp Val Met Ile Asp Ala Phe Phe Arg Pro Phe Leu Gly Gly Ile 195 200 205 Phe Phe Asp Thr Gly Leu Gln Thr Ser Ser Arg Leu Leu Leu Tyr Val 210 215 220 Leu Cys Met Leu Ala Ser Gly Ser Asn Cys Leu Pro Ala Ser Gly Ile 225 230 235 240 Gly Ala Ile Pro Glu Gln Leu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Pro Ala Leu 245 250 255 Arg Leu Asn Thr Arg Val Gln Gly Leu Thr Pro Gly Ser Gly Ser Trp 260 265 270 Glu Val Lys Leu Gly Gly Gly Glu Thr Leu His Ala Pro Ala Ala Ile 275 280 285 Val Ala Thr Glu Gly Pro Ala Ala Arg Gln Leu Leu Gly Ala Arg Leu 290 295 300 Ala Pro Asn Pro Ser Ala Glu Gly Pro Gly Val Gly Ser Ile Cys Leu 305 310 315 320 Tyr Phe Ala Met Asp Gly Asn Pro Pro Arg Ser Gly Pro Tyr Leu Phe 325 330 335 Leu Asn Gly Asp Thr Arg Thr Gly Leu Val Asn Asn Leu Cys Phe Pro 340 345 350 Ser Glu Val Val Pro Gly Tyr Ala Pro Glu Gly Gln Ser Leu Ala Ser 355 360 365 Val Ser Val Ile Gly Asp His Ala Asp Leu Asp Asp Ala Ala Leu Glu 370 375 380 Lys Arg Val Arg Gly Gln Leu Ser Ser Trp Phe Gly Val Pro Leu Thr 385 390 395 400 Asp Asn Ala Cys Phe Asn Arg Val Thr Thr Gly Ala Ala Leu Gly Gly 405 410 415 Ala Leu Gly Ala Ser Ile Gly Ser Leu Tyr Gly Thr Phe Glu Ala Phe 420 425 430 Arg Tyr Arg Ile Pro Gly Met Gln Lys Ile Arg Tyr Ile Gly Lys Thr 435 440 445 Thr Thr Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Leu Phe Leu Gly Ala Gly Ser 450 455 460 Leu Leu His Cys Gly Arg 465 470 <210> 2 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ApPPO1 coding gene) <400> 2 atggccgagt acgacgttgt gatcgtcgga gccggtatct ctgggttaac aacagcccaa 60 gcgctggcga agcagtattc tgatgctgta cctcgacttc tagtgacaga agcacgtgac 120 tgcgtaggag gtaacatcat aacgcgaaga gacggaggat accagtggga ggaaggaccg 180 aattcatttc agccctccga tgcggtattg agggctgccg tagacgcggg ggtcgccgat 240 cgtttggttc taggagatcc gaaggcgccc aggtacgttt attggggtgg gaggctccga 300 gctacgccta gtgggccgga tgttttgact ttcgatctcc taagcctatg ggggaaactg 360 agagctggac ttggcgccgc ggggttcaag gcaccattgc ccgaacgaga agagtctgtc 420 aaagagttcg tcacgagaaa tttaggagag gaggtattcc aacgacttat agagccgttt 480 tgcagcgggg tttacgccgg cgacccggct aagttgagta tgaaggccgc ttttggaaaa 540 gtttatgatc tggagaaggg gggcggatct attgtgggcg gcgtactagc tctgatgaag 600 gcacgaaaac agaagccacc agagcctagg cccgctgacc ttcctccgaa gccgaagggt 660 caaactgtcg gttcttttga taaaggatta gtcacactcc cttcagctat tgccgaggaa 720 ctgggcgacc gtgttgtaac aggctggaag ttggaaagta tcgatagatc aggtgacaga 780 ttccagttaa cctacgacac cccccagggc agaaaaaagg taagtgcacg tagcgtggct 840 ttaacagtcc cggcatatac cgcggcgtca ctgctagaga gtaggttccc taagctgggg 900 aaggccctta gctctatcta ttaccctccc gtcgcatctg tagcattatc ttaccctgag 960 acggcgatac tccctgaaag gttagggagt gatggtcacc tagcgggctt tggccagcta 1020 caccctcgta ctcagggtgt caccactctg ggcactatat atgcctcaag cttattcccg 1080 ggacgtgttc ccgagggaaa ggtgctgctc ttgtcatatt ttgggggggc taccaacacc 1140 cgtgtcgcca ccatgcccca cggggaaatc gtttcccaag tagacaagga tctgcgtaaa 1200 atgttgatac gttccgatgc ggaatccccc catactgtaa atgtaaccgt ttggcctcgt 1260 gccataccac aatttaacgt gggtcacaca gacctcattc aggaggcaaa agacgacttg 1320 gcgtctcaag gatggcaggg gctgcacctt ggagggaact acgttgctgg agtggctctt 1380 ggaaagtgca tggaagcggg atataagcag gccgctgagc tagccagtca cgttaaaagt 1440 ctggcaacct ga 1452 <210> 3 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (MxPPO) of Myxococcus xanthus) <400> 3 Met His His Met Pro Arg Thr Thr Gly Met Asn Val Ala Val Val Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ile Ser Gly Leu Ala Val Ala His His Leu Arg Ser Arg Gly 20 25 30 Thr Asp Ala Val Leu Leu Glu Ser Ser Ala Arg Leu Gly Gly Ala Val 35 40 45 Gly Thr His Ala Leu Ala Gly Tyr Leu Val Glu Gln Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Phe Leu Asp Arg Glu Pro Ala Thr Arg Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 65 70 75 80 Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys 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cgggtatcgc ctatgcgccc atcgcggtgg tgcacctggg cttcgacgcg 960 gggacacttc cggcgccgga tggctttggg ttcctggtgc cagcggagga gcagcggcgg 1020 atgctgggcg ccatccacgc gtccaccacc tttcccttcc gggccgaggg cggacgcgtg 1080 ctctattcct gcatggtggg gggcgcgcgt cagccagggc tggtggaaca ggacgaggat 1140 gcattggcgg cgctggcgcg cgaggaactg aaggcgctgg caggcgtgac ggcgcgcccc 1200 tccttcacgc gggtgttccg ctggccgctt ggcattcccc agtacaacct gggacacctg 1260 gagcgcgtgg ccgctatcga cgcggcgctg caacgcttgc ccggcctgca cctcatcggg 1320 aatgcgtaca agggcgtggg cctcaacgac tgcatccgca acgcggcgca actcgcggac 1380 gccctggtcg cggggaacac ctcccacgcc ccgtag 1416 <210> 5 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (CyPPO10) of Thermosynechococcus elongatus BP-1) <400> 5 Met Ile Glu Val Asp Val Ala Ile Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Val Ala Trp Arg Leu Gln Arg Ser Ala Pro His Tyr Ser Gly Val 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Ser Asp Arg Leu Gly Gly Asn Ile Thr Thr Gln Ala 35 40 45 Ala Glu Gly Phe Val Trp Glu Leu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Leu Gln Leu Ile Ala Glu Val Gly Leu His Ser Glu Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly Asp Arg His Leu Pro Arg Tyr Ile Tyr Trp Arg Gly Glu 85 90 95 Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Thr Arg Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser Asn 100 105 110 Leu Leu Ser Pro Trp Gly Lys Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Phe Val Pro Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Glu Ser Val Asp Ser Phe 130 135 140 Phe Arg Arg His Leu Gly Gln Glu Val Ala Glu Arg Leu Val Ala Pro 145 150 155 160 Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Phe Arg Arg Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu 180 185 190 Ile Ala Gly Ala Leu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Pro Pro Gln Pro Lys 195 200 205 Pro Pro Ala Gln Val Gln Met Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Ala Ala Leu Pro Arg Ala Ile Ala Gln Gln Leu Lys Ala 225 230 235 240 Pro Leu His Leu Gln Thr Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Glu Pro Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gln Thr Trp His Ala Arg Ser 260 265 270 Val Val Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Gln Thr Ala Glu Leu Val Ala Pro 275 280 285 Phe Gln Pro Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Thr 290 295 300 Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Leu Gly Arg Ser Val 305 310 315 320 Arg Pro Gly Phe Gly Val Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr 325 330 335 Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gln Arg Thr Pro Ala 340 345 350 Gly Trp Gln Val Phe Thr Ser Phe Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Asp 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ile Val Glu Gln Val Gln Gln Asp 370 375 380 Leu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ala Lys Ala Arg Leu Leu Gly 385 390 395 400 Met Lys Val Trp Arg Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Ile Val Gly Tyr Pro 405 410 415 Gln Gln Trp Gln Gln Val Thr His Ala Leu Thr Gln Thr Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Leu Cys Ser Asn Tyr Ala Glu Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Val 435 440 445 Glu His Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Leu Ala Gly 450 455 460 Gly Gln Ser 465 <210> 6 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aggttatctc 780 ttaaggagtg gtgaacagac ttggcacgct agatcagttg tgttggctac tccagcatac 840 caaactgctg aacttgttgc accattccag cctgctatcg ctagagcttt ggctaccata 900 ccttatccaa ctgttgcttg tgttgtgctt gcttaccctg ctggattggg tagatcagtt 960 agacctggat ttggtgtttt ggtgcctaga ggacaaggta taaggacact cggaaccatt 1020 tggtcttcat gcttattccc acaaagaact cctgctggtt ggcaggtttt tacctctttc 1080 ataggaggtg ctactgatcc tgatcttgca tcattgagag aagaggctat tgttgaacaa 1140 gtgcaacagg atctcacaag gcttcttgat cttcctgctg caaaggcaag actcttgggt 1200 atgaaggttt ggagaagggc tattccacaa tatatcgttg gttaccctca acagtggcaa 1260 caggtgacac acgctcttac ccagactcct ggtctcttct tatgttcaaa ctacgctgag 1320 ggagttgcat tgggagatag agtggaacac ggaaatagga ctgctgctgc tgtggctgct 1380 tacctcgctg gtggacaatc ataa 1404 <210> 7 <211> 1599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Optimized codon encoding ApPPO1) <400> 7 atgcccttca cgcacttaaa acccttgaac cggctgctgg gtagccccag ggctcggcat 60 ccgcatgtcg caccccaggc cgtctccgtc accaacacga gcaccacgcg 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aaaaaggtaa gtgcacgtag cgtggcttta acagtcccgg catataccgc ggcgtcactg 1020 ctagagagta ggttccctaa gctggggaag gcccttagct ctatctatta ccctcccgtc 1080 gcatctgtag cattatctta ccctgagacg gcgatactcc ctgaaaggtt agggagtgat 1140 ggtcacctag cgggctttgg ccagctacac cctcgtactc agggtgtcac cactctgggc 1200 actatatatg cctcaagctt attcccggga cgtgttcccg agggaaaggt gctgctcttg 1260 tcatattttg ggggggctac caacacccgt gtcgccacca tgccccacgg ggaaatcgtt 1320 tcccaagtag acaaggatct gcgtaaaatg ttgatacgtt ccgatgcgga atccccccat 1380 actgtaaatg taaccgtttg gcctcgtgcc ataccacaat ttaacgtggg tcacacagac 1440 ctcattcagg aggcaaaaga cgacttggcg tctcaaggat ggcaggggct gcaccttgga 1500 gggaactacg ttgctggagt ggctcttgga aagtgcatgg aagcgggata taagcaggcc 1560 gctgagctag ccagtcacgt taaaagtctg gcaacctga 1599 <210> 8 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Optimized codon encoding MxPPO) <400> 8 atgcaccata tgccccgaac aacaggaatg aacgtcgctg tcgtgggagg cggaatatcc 60 ggccttgctg tagcgcacca ccttagatcc agggggaccg acgccgtcct actggaaagc 120 tccgcccgat tgggcggagc agtgggtaca cacgcgttgg cgggttactt agtggagcaa 180 ggtccaaata gttttcttga cagggagccg gcaacgcgag ccctggctgc tgcgcttaac 240 ttagaaggcc gaataagggc agccgatccg gctgcaaaga gacgttatgt ctacacgcga 300 ggacgactcc gtagcgttcc tgccagccct cccgcctttc tggcatctga tattttaccc 360 ttaggtgcaa ggttaagagt ggccggagag ttatttagca ggcgtgcgcc cgaaggagtc 420 gatgagtccc tggccgcctt tgggcgaagg catttgggcc atagagcgac ccaagttcta 480 ttagatgcag tgcagacagg gatatatgcc ggagatgttg agcaattatc cgtggccgct 540 acgttcccca tgttagtgaa aatggaacgt gaacacaggt cacttatttt aggagcaatt 600 cgagcacaaa aggctcagag acaagcggcc cttccagcag gaacggcccc gaagctgtca 660 ggcgcgctga gtacatttga cggcggcttg caagtcctta tcgatgccct agccgcgtcc 720 cttggggacg cagcccacgt cggagccagg gtggaaggtc tggctagaga agacgggggc 780 tggaggttga tcatcgaaga acacggcaga cgagcggagt tgtcagtggc tcaagtagtg 840 ctagccgctc cagcgcacgc aactgcaaag ttgcttcgac ccttagacga tgcactggca 900 gccctagtgg caggtatcgc ctatgccccc atagctgtag ttcatctcgg attcgacgcc 960 ggaactttac cggcgcccga tgggttcggt tttttagtgc cggcggagga acagcgaagg 1020 atgttgggtg ccattcatgc ttccacgact ttcccgttca gggctgaggg tgggcgtgtc 1080 ttatactcat gtatggtggg gggtgcaaga caaccaggct tggtggagca ggacgaggac 1140 gccctcgcgg ccttagcccg agaagaattg aaagccttgg caggcgtgac ggctcgaccc 1200 agtttcacta gagtatttcg ttggcccttg ggcattcctc agtacaatct tgggcacctt 1260 gaacgtgtag ctgcaatcga tgccgccctg caacgtcttc ccggactgca tcttatagga 1320 aatgcatata agggggtggg gctcaacgac tgtattcgta acgcagctca gcttgcagat 1380 gcactggtag ctggtaatac atcacacgcg ccttag 1416 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ApPPO1_XbaIF primer) <400> 9 cccctctaga atggccgagt acgacgttgt 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ApPPO1_XhoIR primer) <400> 10 ccccctcgag ggttgccaga cttttaacgt 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (MxPPO_XbaIF primer) <400> 11 cccctctaga atgcaccata tgccccgaac 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (MxPPO_XhoIR primer) <400> 12 ccccctcgag aggcgcgtgt gatgtattac 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422M F primer) <400> 13 ctcttgtcac tttatggggg ggctaccaac ac 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422M R primer) <400> 14 cccccataaa gtgacaagag cagcaccttt cc 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422L F primer) <400> 15 ctcttgtcac tttttggggg ggctaccaac ac 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422L R primer) <400> 16 cccccaaaaa gtgacaagag cagcaccttt cc 32 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422C F primer) <400> 17 tcttgtcatg ttttgggggg gctaccaaca c 31 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422C R primer) <400> 18 cccccaaaac atgacaagag cagcaccttt cc 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422V F primer) <400> 19 ctcttgtcag tttttggggg ggctaccaac ac 32 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422V R primer) <400> 20 cccccaaaaa ctgacaagag cagcaccttt c 31 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422I F primer) <400> 21 ctcttgtcaa tttttggggg ggctaccaac ac 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422I R primer) <400> 22 ccccaaaaat tgacaagagc agcacctttc c 31 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422T F primer) <400> 23 gtgctgctct tgtcaacctt tgggggggct acc 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Y422T R primer) <400> 24 ggtagccccc ccaaaggttg acaagagcag cac 33 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A215L F primer) <400> 25 gggtttacct cggcgacccg gctaagttga g 31 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A215L R primer) <400> 26 gtcgccgagg taaaccccgc tgcaaaacgg c 31 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A215C F primer) <400> 27 gggtttactg cggcgacccg gctaagttga g 31 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A215C R primer) <400> 28 gtcgccgcag taaaccccgc tgcaaaacgg c 31 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360M F primer) <400> 29 ccctcccatg gcatctgtag cattatctta cc 32 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360M R primer) <400> 30 tacagatgcc atgggagggt aatagataga gc 32 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R140A F primer) <400> 31 gatccgaagg cgcccgcgta cgtttattgg ggtg 34 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R140A R primer) <400> 32 caccccaata aacgtacgcg ggcgccttcg gatc 34 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F209A F primer) <400> 33 cgacttatag agccggcgtg cagcggggtt tac 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F209A R primer) <400> 34 gtaaaccccg ctgcacgccg gctctataag tcg 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C F primer) <400> 35 ccgttttgca gcgggtgcta cgccggcgac ccg 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C R primer) <400> 36 cgggtcgccg gcgtagcacc cgctgcaaaa cgg 33 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F386V F primer) <400> 37 ggtcacctag cgggcgtggg ccagctacac cctc 34 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F386V R primer) <400> 38 gagggtgtag ctggcccacg cccgctaggt gacc 34 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L389T F primer) <400> 39 gcgggctttg gccagaccca ccctcgtact cag 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L389T R primer) <400> 40 ctgagtacga gggtgggtct ggccaaagcc cgc 33 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I402T F primer) <400> 41 caccactctg ggcactacct atgcctcaag ctta 34 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I402T R primer) <400> 42 taagcttgag gcataggtag tgcccagagt ggtg 34 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360I F primer) <400> 43 ctattaccct cccatcgcat ctgtagcatt atc 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360I R primer) <400> 44 gataatgcta cagatgcgat gggagggtaa tag 33 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360L F primer) <400> 45 taccctcccc tcgcatctgt agcattatct tac 33 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V360L R primer) <400> 46 cagatgcgag gggagggtaa tagatagagc 30 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (S362V F primer) <400> 47 taccctcccg tcgcagttgt agcattatct tac 33 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (S362V R primer) <400> 48 gtaagataat gctacaactg cgacgggagg gta 33 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C+A215C F primer) <400> 49 ttgcagcggg tgctactgcg gcgacccggc taagt 35 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C+A215C R primer) <400> 50 acttagccgg gtcgccgcag tagcacccgc tgcaa 35 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C+A215L F primer) <400> 51 ttgcagcggg tgctaccttg gcgacccggc taagt 35 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V213C+A215L R primer) <400> 52 acttagccgg gtcgccaagg tagcacccgc tgcaa 35 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365T F primer) <400> 53 actcatgtac ggtggggggt gcaagacaac c 31 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365T R primer) <400> 54 ccccaccgta catgagtata agacacgccc ac 32 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365L F primer) <400> 55 tactcatgtc tggtgggggg tgcaagacaa cc 32 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365L R primer) <400> 56 cccaccagac atgagtataa gacacgccca c 31 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365C F primer) <400> 57 tactcatgtt gcgtgggggg tgcaagacaa cc 32 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365C R primer) <400> 58 cccccacgca acatgagtat aagacacgcc c 31 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365V F primer) <400> 59 tactcatgtg tggtgggggg tgcaagacaa cc 32 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365V R primer) <400> 60 ccccccacca cacatgagta taagacacgc cc 32 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365I F primer) <400> 61 gtcttatact catgtatcgt ggggggtgca agac 34 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (M365I R primer) <400> 62 gtcttgcacc ccccacgata catgagtata agac 34 <210> 63 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R95A F primer) <400> 63 gcaaagagag cttatgtcta cacgcgagga cg 32 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R95A R primer) <400> 64 gtagacataa gctctctttg cagccggatc ggc 33 <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164A F primer) <400> 65 tagatgcagc gcagacaggg atatatgccg g 31 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164A R primer) <400> 66 ctgtctgcgc tgcatctaat agaacttggg 30 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I168C F primer) <400> 67 cagacagggt gctatgccgg agatgttgag c 31 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I168C R primer) <400> 68 tccggcatag caccctgtct gcactgcatc taa 33 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A170C F primer) <400> 69 gggatatatt gcggagatgt tgagcaatta tc 32 <210> 70 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A170C R primer) <400> 70 acatctccgc aatatatccc tgtctgcact gc 32 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A170L F primer) <400> 71 gggatatatc tcggagatgt tgagcaatta tc 32 <210> 72 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A170L R primer) <400> 72 acatctccga gatatatccc tgtctgcact gc 32 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I311M F primer) <400> 73 tgcccccatg gctgtagttc atctcggatt c 31 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I311M R primer) <400> 74 aactacagcc atgggggcat aggcgatacc 30 <210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F329V F primer) <400> 75 cgatggggtc ggttttttag tgccggcgga gg 32 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F329V R primer) <400> 76 aaaaaaccga ccccatcggg cgccggtaaa g 31 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L332T F primer) <400> 77 ttcggtttta cagtgccggc ggaggaacag 30 <210> 78 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L332T R primer) <400> 78 ccggcactgt aaaaccgaac ccatcgggcg c 31 <210> 79 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I345T F primer) <400> 79 gggtgccact catgcttcca cgactttccc g 31 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I345T R primer) <400> 80 gaagcatgag tggcacccaa catccttcgc tg 32 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I168C+A170C F primer) <400> 81 gtgcagacag ggtgctattg cggagatgtt gag 33 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I168C+A170C R primer) <400> 82 ctcaacatct ccgcaatagc accctgtctg cac 33 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ApPPO1_BamHIF primer) <400> 83 ccccggatcc atggccgagt acgacgttgt 30 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ApPPO1_SalIR primer) <400> 84 ccccgtcgac tcaggttgcc agacttttaa cgt 33 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (MxPPO_BamHIF primer) <400> 85 ccccggatcc atgcaccata tgccccgaac 30 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (MxPPO_SalIR primer) <400> 86 ccccgtcgac tcaaggcgcg tgtgatgtat tac 33 <210> 87 <211> 1614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Gene for AtPPO1 of Arabidopsis thaliana) <400> 87 atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60 aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120 accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggcacca ccatcacgac ggattgtgtg 180 attgtcggcg gaggtattag tggtctttgc atcgctcagg cgcttgctac taagcatcct 240 gatgctgctc cgaatttaat tgtgaccgag gctaaggatc gtgttggagg caacattatc 300 actcgtgaag agaatggttt tctctgggaa gaaggtccca atagttttca accgtctgat 360 cctatgctca ctatggtggt agatagtggt ttgaaggatg atttggtgtt gggagatcct 420 actgcgccaa ggtttgtgtt gtggaatggg aaattgaggc cggttccatc gaagctaaca 480 gacttaccgt tctttgattt gatgagtatt ggtgggaaga ttagagctgg ttttggtgca 540 cttggcattc gaccgtcacc tccaggtcgt gaagaatctg tggaggagtt tgtacggcgt 600 aacctcggtg atgaggtttt tgagcgcctg attgaaccgt tttgttcagg tgtttatgct 660 ggtgatcctt caaaactgag catgaaagca gcgtttggga aggtttggaa actagagcaa 720 aatggtggaa gcataatagg tggtactttt aaggcaattc aggagaggaa aaacgctccc 780 aaggcagaac gagacccgcg cctgccaaaa ccacagggcc aaacagttgg ttctttcagg 840 aagggacttc gaatgttgcc agaagcaata tctgcaagat taggtagcaa agttaagttg 900 tcttggaagc tctcaggtat cactaagctg gagagcggag gatacaactt aacatatgag 960 actccagatg gtttagtttc cgtgcagagc aaaagtgttg taatgacggt gccatctcat 1020 gttgcaagtg gtctcttgcg ccctctttct gaatctgctg caaatgcact ctcaaaacta 1080 tattacccac cagttgcagc agtatctatc tcgtacccga aagaagcaat ccgaacagaa 1140 tgtttgatag atggtgaact aaagggtttt gggcaattgc atccacgcac gcaaggagtt 1200 gaaacattag gaactatcta cagctcctca ctctttccaa atcgcgcacc gcccggaaga 1260 attttgctgt tgaactacat tggcgggtct acaaacaccg gaattctgtc caagtctgaa 1320 ggtgagttag tggaagcagt tgacagagat ttgaggaaaa tgctaattaa gcctaattcg 1380 accgatccac ttaaattagg agttagggta tggcctcaag ccattcctca gtttctagtt 1440 ggtcactttg atatccttga cacggctaaa tcatctctaa cgtcttcggg ctacgaaggg 1500 ctatttttgg gtggcaatta cgtcgctggt gtagccttag gccggtgtgt agaaggcgca 1560 tatgaaaccg cgattgaggt caacaacttc atgtcacggt acgcttacaa gtaa 1614 <210> 88 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Gene for Transit Peptide of AtPPO1) <400> 88 atggagttat tcttctccgt ccgacgactc aatcgcttct tccgtcgttt tcgaagccca 60 atctccgatt aaatgtttat aagcctctta gactccgttg ttcagtggcc ggtggaccaa 120 ccgtcggatc ttcaaaaatc gaaggcggag gaggc 155

Claims (23)

  1. 다음에서 선택된 폴리펩타이드:
    서열번호 1의 아미노산 서열 중 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), 및 K(Lys)로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열 중 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), 및 K(Lys)로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 1의 아미노산 서열 중 R140, F209, V213, A215, G216, V360, S362, F386, L389, L399, I402 및 Y422으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), 및 A(Ala)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열 중 R95, V164, I168, A170, G171, I311, V313, F329, L332, L342, I345 및 M365로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), 및 A(Ala)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 Y422M, Y422L, Y422C, Y422V, Y422I, Y422T, A215L, A215C, A215I, V360M, R140A, F209A, V213C, V213S, F386V, L389T, I402T, V360I, V360L, 및 S362V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서 M365T, M365L, M365C, M365V, M365I, R95A, V164A, I168C, I168S, A170C, A170L, A170I, I311M, F329V, L332T, 및 I345T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 Y422M, Y422L, Y422C, Y422V, Y422I, Y422T, A215L, A215C, A215I, V360M, R140A, F209A, V213C, V213S, F386V, L389T, I402T, V360I, V360L, S362V, R140A+Y422I, R140A+Y422T, R140A+Y422M, F209A+Y422M, V213C+Y422I, V213C+Y422T, V213C+Y422M, A215C+Y422I, A215C+Y422T, A215C+Y422M, A215L+Y422I, A215L+Y422T, A215L+Y422M, V360M+Y422M, F386V+Y422M, V360M+Y422I, L389T+Y422M, I402T+Y422M, V360I+Y422I, V360I+S362V, S362V+Y422I, R140A+V213C+Y422I, R140A+V213C+Y422M, R140A+A215C+Y422I, R140A+A215L+Y422M, V213C+A215C+Y422I, V213C+A215L+Y422M, V360I+S362V+Y422I, A215C+V360M+Y422M, A215L+V360M+Y422M, A215I+V360M+Y422M, V213C+A215C+Y422M, V213C+A215L+Y422M, R140A+V213C+A215C+Y422I, 또는 R140A+V213C+A215L+Y422M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서 M365T, M365L, M365C, M365V, M365I, R95A, V164A, I168C, I168S, A170C, A170L, A170I, I311M, F329V, L332T, I345T, R95A+M365I, R95A+M365V, I168C+M365I, I168C+M365V, A170C+M365I, A170C+M365V, A170L+M365I, A170L+M365V, I311M+M365I, I311M+M365V, L332T+M365I, L332T+M365V, V164A+M365I, F329V+M365I, I345T+M365I, A170C+I311M, A170L+I311M, A170I+I311M, I168C+A170C, I168C+A170L, R95A+I168C+M365I, R95A+I168C+M365V, R95A+A170C+M365I, R95A+I311M+M365I, R95A+I311M+M365V, R95A+L332T+M365I, R95A+L332T+M365V, I168C+A170C+M365V, I168C+I311M+M365I, I168C+I311M+M365V, I168C+L332T+M365I, I168C+L332T+M365V, A170C+I311M+M365I, A170C+L332T+M365V, I311M+L332T+M365I, I311M+L332T+M365V, R95A+I168C+A170C+M365I, R95A+I168C+A170C+M365V, R95A+A170C+I311M+M365V, R95A+A170C+L332T+M365I, R95A+I168C+I311M+M365V, R95A+I168C+L332T+M365I, R95A+I311M+L332T+M365I, R95A+I311M+L332T+M365V, I168C+A170C+I311M+M365I, I168C+A170C+L332T+M365V, A170C+I311M+L332T+M365I, R95A+I168C+A170C+I311M+M365V, R95A+I168C+A170C+L332T+M365I, R95A+I168C+I311M+L332T+M365V, I168C+A170C+I311M+L332T+M365V, 또는 R95A+I168C+A170C+I311M+L332T+M365V의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성 부여 또는 증진용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(pyrimidinediones), 페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계(thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(oxazolidinediones), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸(profluazol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(butafenacil), 사플루페나실(saflufenacil), 벤즈펜디존(benzfendizone), 티아페나실(tiafenacil), 포메사펜(fomesafen), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스(bifenox), 에톡시펜(ethoxyfen), 락토펜(lactofen), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen), 클로인트로펜(chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(halosafen), 피라플루펜-에틸(pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸(cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(fluthiacet), 티디아지민(thidiazimin), 옥사디아길(oxadiargyl), 옥사디아존(oxadiazon), 카펜트라존(carfentrazone), 설펜트라존(sulfentrazone), 아자페니딘(azafenidin), 펜톡사존(pentoxazone), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(profluazol), 페노필레이트(phenopylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체, 이들의 농약적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylurea)계 제초제, 브로목시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase);
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase);
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 DMO(dicamba monooxygenase);
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate dioxygenase);
    ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS(acetolactate synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit);
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 시토크롬 P450(cytochrome P450);
    색소체 저해성 제초제 내성 HPPD(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase);
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 cp4 epsps, epsps(AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자;
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 bar 또는 pat 유전자;
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 dmo 유전자;
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 AAD-1 또는 AAD-12유전자;
    이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자;
    설포닐 우레아 제초제 내성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB;
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 CYP76B1 유전자;
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 bxn 유전자; 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손.
  17. 제16항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체인, 형질전환체, 이의 클론 또는 자손.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 또는 증진시키는 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고,
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및
    상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법.
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