CN100537764C - 除草剂代谢蛋白质,其基因及其应用 - Google Patents

除草剂代谢蛋白质,其基因及其应用 Download PDF

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CN100537764C CNB028256425A CN02825642A CN100537764C CN 100537764 C CN100537764 C CN 100537764C CN B028256425 A CNB028256425 A CN B028256425A CN 02825642 A CN02825642 A CN 02825642A CN 100537764 C CN100537764 C CN 100537764C
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Abstract

本发明提供例如，编码选自以下蛋白质组的除草剂代谢蛋白质的DNA。该DNA可以例如用于生产抗除草剂植物。<蛋白质组>一种蛋白质，其包含在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列，一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含与在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，215，216，218，222或224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

Description

除草剂代谢蛋白质，其基因及其应用
技术领域
本发明涉及具有代谢除草化合物能力的蛋白质(除草剂代谢蛋白质)，其基因及其应用。
背景技术
当使用时除草剂是以需要量的稀释液利用。存在过量剩余的情形。还存在其中施用的除草剂在它施用片刻后残留在土壤或植物残体中的情形。最初，假定已经检查这些除草剂的安全性，这些少量的剩余溶液或残余物对环境或此后栽培的作物产生小的影响。然而，如果存在将包含的除草化合物转化为一种低除草活性的化合物的方法，那么例如可以根据需要进行钝化上述剩余溶液或残余物的处理。
另外，在使用除草剂的情形中，存在难以将栽培植物与近似种的杂草区别以选择性地仅控制杂草的情形。因而，需要开发赋予靶植物除草剂抗性的新方法。
发明内容
在这种情形下，本发明人深入研究，结果已经发现通过与特定的蛋白质反应可以将原卟啉原氧化酶(在下文中，有时称为“PPO”)抑制型的除草化合物转化为低除草活性的化合物，其导致本发明的完成。
即，本发明提供：
1.编码除草剂代谢蛋白的DNA，其中所述蛋白质选自：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，
Figure C02825642D00121
并包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含与在SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：219，SEQID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：223或SEQ IDNO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)，砖红色链霉菌(Streptomycestestaceus)，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)，灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus)，热淡天蓝链霉菌(Streptomycesthermocoerulescens)，黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)，津岛链霉菌(Streptomyces tsusimaensis)，球团产色链霉菌(Streptomycesglomerochromogenes)，橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)，三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)，苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)，玫瑰变红链霉菌(Streptomycesroseorubens)，鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)，斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)或塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)的染色体DNA；
2.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列选自：
(a1)在SEQ ID NO：6中表示的核苷酸序列；
(a2)在SEQ ID NO：7中表示的核苷酸序列；
(a3)在SEQ ID NO：8中表示的核苷酸序列；
(a4)在SEQ ID NO：109中表示的核苷酸序列；
(a5)在SEQ ID NO：139中表示的核苷酸序列；
(a6)在SEQ ID NO：140中表示的核苷酸序列；
(a7)在SEQ ID NO：141中表示的核苷酸序列；
(a8)在SEQ ID NO：142中表示的核苷酸序列；
(a9)在SEQ ID NO：143中表示的核苷酸序列；
(a10)在SEQ ID NO：225中表示的核苷酸序列；
(a11)在SEQ ID NO：226中表示的核苷酸序列；
(a12)在SEQ ID NO：227中表示的核苷酸序列；
(a13)在SEQ ID NO：228中表示的核苷酸序列；
(a14)在SEQ ID NO：229中表示的核苷酸序列；
(a15)在SEQ ID NO：230中表示的核苷酸序列；
(a16)在SEQ ID NO：231中表示的核苷酸序列；
(a17)在SEQ ID NO：232中表示的核苷酸序列；
(a18)在SEQ ID NO：233中表示的核苷酸序列；
(a19)在SEQ ID NO：234中表示的核苷酸序列；
(a20)一种核苷酸序列，其编码蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列与在SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：109中任何一个表示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；和
(a21)一种核苷酸序列，其编码蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列与在SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：225，SEQID NO：226，SEQ ID NO：227，SEQ ID NO：228，SEQ ID NO：229，SEQ IDNO：230，SEQ ID NO：231，SEQ ID NO：232，SEQ ID NO：233或SEQ IDNO：234中任何一个表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
3.按照上述1的DNA，其包含编码所述蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列，其中在所述核苷酸序列中的密码子使用是在来自引入DNA的宿主细胞物种的基因中密码子使用±4％的范围内并且所述核苷酸序列的GC含量是至少40％和至多60％；
4.包含在SEQ ID NO：214中表示的核苷酸序列的DNA；
5.包含在SEQ ID NO：368中表示的核苷酸序列的DNA；
6.包含在SEQ ID NO：393中表示的核苷酸序列的DNA；
7.一种DNA，其中具有编码胞内细胞器转运信号序列的核苷酸序列的DNA连接在按照上述1的框内DNA的上游；
8.一种DNA，其中按照上述1的DNA和在宿主细胞中起作用的启动子可操作地(operably)连接；
9.包含按照上述1的DNA的载体；
10.一种产生载体的方法，其包含将按照上述1的DNA插入可在宿主中复制的载体的步骤；
11.一种转化体，其中将按照上述1的DNA引入宿主细胞；
12.按照上述11的转化体，其中所述宿主细胞是微生物细胞或植物细胞；
13.一种产生转化体的方法，其包含将按照上述1的DNA引入宿主细胞的步骤；
14.一种产生具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的方法，所述方法包含培养按照上述11的转化体和回收产生的所述蛋白质的步骤；
15.按照上述1的DNA在生产具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质中的应用；
16.一种给予植物除草剂抗性的方法，所述方法包含将按照上述1的DNA引入植物细胞和在其中表达的步骤；
17.一种多核苷酸，其具有按照上述1的DNA的部分核苷酸序列或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；
18.一种检测编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的方法，所述方法包含检测在杂交中与探针杂交的DNA的步骤，其使用按照上述1的DNA或按照上述17的多核苷酸作为探针；
19.一种检测编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的方法，所述方法包含检测在以按照上述17的多核苷酸作为引物的聚合酶链式反应中扩增的DNA的步骤；
20.按照上述19的方法，其中引物中至少一种选自包含在SEQ IDNO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的多核苷酸组成的组和包含在SEQ ID NO：129中显示的核苷酸序列的多核苷酸；
21.一种获得编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的方法，所述方法包含回收通过按照上述18或19的方法检测的DNA的步骤；
22，一种筛选含有编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的细胞的方法，所述方法包含通过按照上述18或19的方法从试验细胞中检测所述DNA的步骤；
23.一种除草剂代谢蛋白，其选自：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌，斯堡链霉菌或塔氏糖多孢菌的染色体DNA；
24.一种识别除草剂代谢蛋白的抗体，所述除草剂代谢蛋白选自由下式物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEO ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌，斯堡链霉菌或塔氏糖多孢菌的染色体DNA；
25.一种检测除草剂代谢蛋白的方法，所述方法包含：
(1)将试样与识别所述蛋白质的抗体接触的步骤和
(2)检测由所述接触产生的、所述蛋白质和所述抗体的复合体的步骤，其中所述蛋白质选自由下式物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌，斯堡链霉菌或塔氏糖多孢菌的染色体DNA；
26.一种分析或检测试剂盒，其包含按照上述24的抗体；
27.一种编码铁氧还蛋白的DNA，所述铁氧还蛋白选自由下式物质组成的组：
(B1)包含在SEQ ID NO：12中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B2)包含在SEQ ID NO：13中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B3)包含在SEQ ID NO：14中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B4)包含在SEQ ID NO：111中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B5)包含与在SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQID NO：111中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的铁氧还蛋白；
(B6)包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列的铁氧还蛋白，其中所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQID NO：111中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
(B7)包含在SEQ ID NO：149中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B8)包含在SEQ ID NO：150中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B9)包含在SEQ ID NO：151中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B10)包含在SEQ ID NO：152中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B11)包含在SEQ ID NO：153中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B12)一种铁氧还蛋白，其包含与在SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQ IDNO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251或SEQ ID NO：253中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：252或SEQ IDNO：254中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(B13)一种铁氧还蛋白，其包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：150，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQ IDNO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：254中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
(B14)包含在SEQ ID NO：245中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B15)包含在SEQ ID NO：247中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B16)包含在SEQ ID NO：248中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B17)包含在SEQ ID NO：249中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B18)包含在SEQ ID NO：250中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B19)包含在SEQ ID NO：251中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B20)包含在SEQ ID NO：252中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B21)包含在SEQ ID NO：253中表示的氨基酸序列的蛋白质；和
(B22)包含在SEQ ID NO：254中表示的氨基酸序列的蛋白质；
28.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列选自由下述物质组成的组：
(b1)在SEQ ID NO：15中表示的核苷酸序列；
(b2)在SEQ ID NO：16中表示的核苷酸序列；
(b3)在SEQ ID NO：17中表示的核苷酸序列；
(b4)在SEQ ID NO：112中表示的核苷酸序列；
(b5)在SEQ ID NO：154中表示的核苷酸序列；
(b6)在SEQ ID NO：155中表示的核苷酸序列；
(b7)在SEQ ID NO：156中表示的核苷酸序列；
(b8)在SEQ ID NO：157中表示的核苷酸序列；
(b9)在SEQ ID NO：158中表示的核苷酸序列；
(b10)在SEQ ID NO：255中表示的核苷酸序列；
(b11)在SEQ ID NO：257中表示的核苷酸序列；
(b12)在SEQ ID NO：258中表示的核苷酸序列；
(b13)在SEQ ID NO：259中表示的核苷酸序列；
(b14)在SEQ ID NO：260中表示的核苷酸序列；
(b15)在SEQ ID NO：261中表示的核苷酸序列；
(b16)在SEQ ID NO：262中表示的核苷酸序列；
(b17)在SEQ ID NO：263中表示的核苷酸序列；
(b18)在SEQ ID NO：264中表示的核苷酸序列；和
(b19)一种核苷酸序列，其与在SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQID NO：17，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：155，SEQ IDNO：156，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：255，SEQ IDNO：257，SEQ ID NO：258，SEQ ID NO：259，SEQ ID NO：260，SEQ IDNO：261，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：263或SEQ ID NO：264中任何一个表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性
29.一种包含按照上述28的DNA的载体；
30.一种转化体，其中将按照上述28的DNA引入宿主细胞；
31.一种铁氧还蛋白，其选自由下述物质组成的组：
(B1)包含在SEQ ID NO：12中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B2)包含在SEQ ID NO：13中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B3)包含在SEQ ID NO：14中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B4)包含在SEQ ID NO：111中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B5)包含与在SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQID NO：111中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的铁氧还蛋白；
(B6)包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列的铁氧还蛋白，其中所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQID NO：111中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
(B7)包含在SEQ ID NO：149中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B8)包含在SEQ ID NO：150中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B9)包含在SEQ ID NO：151中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B10)包含在SEQ ID NO：152中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B11)包含在SEQ ID NO：153中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B12)一种铁氧还蛋白，其包含与在SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQ IDNO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251或SEQ ID NO：253中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：252或SEQ IDNO：254中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(B13)一种铁氧还蛋白，其包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：150，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQ IDNO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：254中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
(B14)包含在SEQ ID NO：245中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B15)包含在SEQ ID NO：247中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B16)包含在SEQ ID NO：248中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B17)包含在SEQ ID NO：249中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B18)包含在SEQ ID NO：250中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B19)包含在SEQ ID NO：251中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B20)包含在SEQ ID NO：252中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(B21)包含在SEQ ID NO：253中表示的氨基酸序列的蛋白质；和
(B22)包含在SEQ ID NO：254中表示的氨基酸序列的蛋白质；
32.一种包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列选自由下述物质组成的组：
(ab1)在SEQ ID NO：9中表示的核苷酸序列；
(ab2)在SEQ ID NO：10中表示的核苷酸序列；
(ab3)在SEQ ID NO：11中表示的核苷酸序列；
(ab4)在SEQ ID NO：110中表示的核苷酸序列；
(ab5)在SEQ ID NO：144中表示的核苷酸序列；
(ab6)在SEQ ID NO：145中表示的核苷酸序列；
(ab7)在SEQ ID NO：146中表示的核苷酸序列；
(ab8)在SEQ ID NO：147中表示的核苷酸序列；
(ab9)在SEQ ID NO：148中表示的核苷酸序列；
(ab10)在SEQ ID NO：235中表示的核苷酸序列；
(abll)在SEQ ID NO：236中表示的核苷酸序列；
(ab12)在SEQ ID NO：237中表示的核苷酸序列；
(ab13)在SEQ ID NO：238中表示的核苷酸序列；
(ab14)在SEQ ID NO：239中表示的核苷酸序列；
(ab15)在SEQ ID NO：240中表示的核苷酸序列；
(ab16)在SEQ ID NO：241中表示的核苷酸序列；
(ab17)在SEQ ID NO：242中表示的核苷酸序列；
(ab18)在SEQ ID NO：243中表示的核苷酸序列；和
(ab19)在SEQ ID NO：244中表示的核苷酸序列；
33.包含按照上述32的DNA的载体；
34.一种转化体，其中将按照上述32的DNA引入宿主细胞；
35.按照上述34的转化体，其中所述宿主细胞是微生物细胞或植物细胞；
36.一种生产转化体的方法，其包含将按照上述32的DNA引入宿主细胞的步骤；
37.一种生产具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的方法，所述方法包含培养按照上述34的转化体和回收产生的所述蛋白质的步骤；
38.一种控制杂草的方法，其包含将化合物施用于表达至少一种除草剂代谢蛋白的植物的栽培区域的步骤，所述除草剂代谢蛋白选自由下述物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属(Streptomyces)或糖多孢菌属(Saccharopo1yspora)微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性，
其中所述化合物是式(I)的化合物：
Figure C02825642D00291
其中在式(I)中，G表示在下列G-1至G-9中任何一个表示的基团：
Figure C02825642D00292
其中在G-1至G-9中，
X表示氧原子或硫原子；
Y表示氧原子或硫原子；
R1表示氢原子或卤原子；
R2表示氢原子，C1-C8烷基，C1-C8卤代烷基，卤原子，羟基，-OR9基团，-SH基团，-S(O)pR9基团，-COR9基团，-CO2R9基团，-C(O)SR9基团，-C(O)NR11R12基团，-CONH2基团，-CHO基团，-CR9＝NOR18基团，-CH＝CR19CO2R9基团，-CH2CHR19CO2R9基团，-CO2N＝CR13R14基团，硝基，氰基，-NHSO2R15基团，-NHSO2NHR15基团，-NR9R20基团，-NH2基团或苯基，其可以被一个或多个相同或不同的C1-C4烷基取代；
p表示0，1或2；
R3表示C1-C2烷基，C1-C2卤代烷基，-OCH3基团，-SCH3基团，-OCHF2基团，卤原子，氰基，硝基或C1-C3烷氧基，其用在苯环上可以被选自卤原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OR28基团，NR11R28基团，SR28基团，氰基，CO2R28基团和硝基中的至少一个取代基取代的苯基取代；
R4表示氢原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基；
R5表示氢原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，环丙基，乙烯基，C2炔基，氰基，-C(O)R20基团，-CO2R20基团，-C(O)NR20R21基团，-CHR16R17CN基团，-CR16R17C(O)R20基团，-CR16R17CO2R20基团，-CR16R17C(O)NR20R21基团，-CHR16OH基团，-CHR16OC(O)R20基团或-OCHR16OC(O)NR20R21基团，或当G表示G-2或G-6时，R4和R5可以表示与它们结合的碳原子一起的C＝O基团；
R6表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C2-C6烷氧基烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；
R7表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，卤原子，-S(O)2(C1-C6烷基)或-C(＝O)R22基团；
R8表示氢原子，C1-C8烷基，C3-C8环烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8卤代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C3-C8烷氧基烷氧基烷基，C3-C8卤代炔基，C3-C8卤代烯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8卤代烷基磺酰基，C3-C8烷氧羰基烷基，-S(O)2NH(C1-C8烷基)基团，-C(O)R23基团或可在苯环上被R24取代的苄基；
R9表示C1-C8烷基，C3-C8环烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8卤代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C2-C8烷基硫代烷基，C2-C8烷基亚磺酰基烷基，C2-C8烷基磺酰基烷基，C4-C8烷氧基烷氧基烷基，C4-C8环烷基烷基，C4-C8环烷氧基烷基，C4-C8烯氧基烷基，C4-C8炔氧基烷基，C3-C8卤代烷氧基烷基，C4-C8卤代烯氧基烷基，C4-C8卤代炔氧基烷基，C4-C8环烷基硫代烷基，C4-C8烯基硫代烷基，C4-C8炔基硫代烷基，用在环上可以被至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基取代的苯氧基取代的C1-C4烷基，用在环上可以被至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基取代的苄氧基取代的C1-C4烷基，C4-C8 trialkylsyrylalkyl基团，C2-C8氰烷基，C3-C8卤代环烷基，C3-C8卤代烯基，C5-C8烷氧基烯基，C5-C8卤代烷氧基烯基，C5-C8烷基硫代烯基，C3-C8卤代炔基，C5-C8烷氧基炔基，C5-C8卤代烷氧基炔基，C5-C8烷基硫代炔基，C2-C8烷基羰基，在环上可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，-OR28基团，-NR11R28基团，-SR28基团，氰基，-CO2R28基团和硝基的取代基取代的苄基，-CR16R17COR10基团，-CR16R17CO2R20基团，-CR16R17P(O)(OR10)2基团，-CR16R17P(S)(OR10)2基团，-CR16R17C(O)NR11R12基团，-CR16R17C(O)NH2基团，-C(＝CR26R27)COR10基团，-C(＝CR26R27)CO2R20基团，-C(＝CR26R27)P(O)(OR10)2基团，-C(＝CR26R27)P(S)(OR10)2基团，-C(＝CR26R27)C(O)NR11R12基团，-C(＝CR26R27)C(O)NH2基团，或在Q-1至Q-7表示的环中的任何一个：
Figure C02825642D00311
其在环上可以被至少一种选自卤原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，C2-C6炔基，C3-C6卤代炔基，C2-C8烷氧基烷基，-OR28基团，-SR28基团，-NR11R28基团，C3-C8烷氧羰基烷基，C2-C4羧基烷基，-CO2R28基团和氰基的取代基取代；
R10表示C1-C6烷基，C2-C6烯基，C3-C6炔基或四氢呋喃基团；
R11和R13独立地表示氢原子或C1-C4烷基；
R12表示C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6卤代烯基，C3-C6卤代炔基，在环上可以被至少一种取代基取代的苯基，所述取代基选自卤原子，C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，或-CR16R17CO2R25基团；或，
R11和R12一起可以表示-(CH2)5-，-(CH2)4-，或-CH2CH2OCH2CH2-，或者如果是那样的话，产生的环可以用选自C1-C3烷基，苯基和苄基的取代基取代；
R14表示C1-C4烷基或在环上可以用选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基取代的苯基；或，
R13和R14可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C8环烷基；
R15表示C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基或C3-C6烯基；
R16和R17独立地表示氢原子或C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C4烯基，C2-C4卤代烯基，C2-C4炔基，C3-C4卤代炔基；或，
R16和R17可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C6环烷基，或者如此形成的环可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基取代；
R18表示氢原子，C1-C6烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；
R19表示氢原子，C1-C4烷基或卤原子；
R20表示氢原子，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6卤代烯基，C3-C6卤代炔基，在环上可以用至少一种取代基取代的苯基，所述取代基选自卤原子，C1-C4烷基和-OR28基团，或-CR16R17CO2R25基团；
R21表示氢原子，C1-C2烷基或-CO2(C1-C4烷基)基团；
R22表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或NH(C1-C6烷基)基团；
R23表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C6烷氧基，NH(C1-C6烷基)基团，苄基，C2-C8二烷基氨基或可以用R24取代的苯基；
R24表示C1-C6烷基，1-2个卤原子，C1-C6烷氧基或CF3基团；
R25表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6烯基，C3-C6卤代烯基，C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基；
R26和R27各自独立地表示氢原子，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C4烯基，C2-C4卤代烯基，C2-C4炔基，C3-C4卤代炔基，-OR28基团，-NHR28基团，或-SR28基团；或，
R26和R27可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C8环烷基，或每个如此形成的环可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基取代；和
R28表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6烯基，C3-C6卤代烯基，C3-C6炔基，C3-C6卤代炔基，C2-C4羧基烷基，C3-C8烷氧羰基烷基，C3-C8卤代烷氧羰基烷基，C5-C9烯氧基羰基烷基，C5-C9卤代烯氧基羰基烷基，C5-C9炔氧基羰基烷基，C5-C9卤代炔氧基羰基烷基，C5-C9环烷氧基羰基烷基或C5-C9卤代环烷氧基羰基烷基；
39.一种控制杂草的方法，其包含将化合物施用于表达至少一种蛋白质的植物的栽培区域的步骤，所述蛋白质选自由下述物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌，斯堡链霉菌或塔氏糖多孢菌的染色体DNA；
40.一种评估细胞对式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含：
(1)将所述化合物与表达至少一种除草剂代谢蛋白的细胞接触的步骤，所述除草剂代谢蛋白选自由下式物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体DNA；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(2)评估在上述步骤(1)中对接触化合物的细胞的损伤程度的步骤；
41.按照上述40的方法，其中所述细胞是微生物细胞或植物细胞；
42.选择抗式(I)化合物的细胞的方法，所述方法包含基于在按照上述40的方法中评估的抗性，选择细胞的步骤；
43.通过按照上述42的方法选择的抗除草剂的细胞，或其培养物；
44.一种评估植物对式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含：
(1)将所述化合物与表达至少一种除草剂代谢蛋白的植物接触的步骤，所述除草剂代谢蛋白选自由下述物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(2)评估对在步骤(1)中描述的接触化合物的植物的损伤程度的步骤；
45.一种选择抗式(I)化合物的植物的方法，所述方法包含基于在按照上述44的方法中评估的抗性，选择植物的步骤；
46.一种由按照上述45的方法选择的抗除草剂植物，或其后代；
47.一种处理式(I)化合物的方法，所述方法包含在含有电子供体的电子传递体系的存在下将所述化合物与至少一种除草剂代谢蛋白反应，所述除草剂代谢蛋白选自由下述物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；
48.按照上述47的方法，其中通过将所述化合物与转化体接触将所述化合物与所述除草剂代谢蛋白反应，在所述转化体中将编码所述除草剂代谢蛋白的DNA引入宿主细胞中能使它在所述细胞中表达的位置；
49.除草剂代谢蛋白在处理式(I)化合物中的应用，所述除草剂代谢蛋白选自由下述物质组成的组：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
50.编码除草剂代谢蛋白的多核苷酸在处理式(I)化合物中的应用，所述除草剂代谢蛋白选自由下述物质组成的组
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
附图简述
图1显示用于获得本发明DNA(A1)和本发明DNA(B1)的PCR引物的退火位点。每个数字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID号。箭头表示具有以其SEQ ID号表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位点和从引物DNA聚合酶反应的延伸方向。虚线表示通过使用引物的PCR扩增的DNA。粗线表示邻近DNA插入位点的载体区域，该载体用来生产染色体DNA文库。
图2显示用于获得本发明DNA(A2)和本发明DNA(B2)的PCR引物的退火位点。每个数字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID号。箭头表示具有以其SEQ ID号表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位点和从引物DNA聚合酶反应的延伸方向。虚线表示通过使用引物的PCR扩增的DNA。粗线表示邻近DNA插入位点的载体区域，该载体用来生产染色体DNA文库。
图3显示用于获得本发明DNA(A4)和本发明DNA(B4)的PCR引物的退火位点。每个数字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID号。箭头表示具有以其SEQ ID号表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位点和从引物DNA聚合酶反应的延伸方向。虚线表示通过使用引物的PCR扩增的DNA。粗线表示邻近DNA插入位点的载体区域，该载体用来生产染色体DNA文库。然而，由57表示的寡核苷酸引物是与邻近用来产生染色体DNA文库的载体的DNA插入位点的区域退火的引物，未能与本发明的DNA(A4)退火。
图4显示质粒pKSN2的限制性酶切图。
图5显示质粒pCRrSt12的限制性酶切图。
图6显示质粒pCR657ET的限制性酶切图。
图7显示质粒pCR657FET的限制性酶切图。
图8显示质粒pCR657Bs的限制性酶切图。
图9显示质粒pCR657FBs的限制性酶切图。
图10显示质粒pUCrSt12的限制性酶切图。
图11显示质粒pUCrSt657的限制性酶切图。
图12显示质粒pUCrSt657F的限制性酶切图。
图13显示质粒pUCCR16G6-p/t的限制性酶切图。
图14显示通过将由在SEQ ID NO：89中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO：90中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸退火产生的接头NotI-EcoRI的结构。
图15显示质粒pUCCR16G6-p/tΔ的限制性酶切图。
图16显示通过将由在SEQ ID NO：91中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO：92中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸退火产生的接头HindIII-NotI的结构。
图17显示质粒pNdG6-ΔT的限制性酶切图。
图18显示质粒pSUM-NdG6-rSt657的限制性酶切图。
图19显示质粒pSUM-NdG6-rSt657F的限制性酶切图。
图20显示质粒pKFrSt12的限制性酶切图。
图21显示质粒pKFrSt12-657的限制性酶切图。
图22显示质粒pKFrSt12-657F的限制性酶切图。
图23显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-657的限制性酶切图。
图24显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-657F的限制性酶切图。
图25显示通过将由在SEQ ID NO：98中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO：99中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸退火产生的接头HindIII-NotI-EcoRI的结构。
图26显示质粒pBI121S的限制性酶切图。
图27显示质粒pBI-NdG6-rSt-657的限制性酶切图。
图28显示质粒pBI-NdG6-rSt-657F的限制性酶切图。
图29显示质粒pBI-NdG6-rSt12-657的限制性酶切图。
图30显示质粒pBI-NdG6-rSt12-657F的限制性酶切图。
图31显示质粒pCR923Sp的限制性酶切图。
图32显示质粒pNdG6-rSt12的限制性酶切图。
图33显示质粒pSUM-NdG6-rSt-923的限制性酶切图。
图34显示质粒pKFrSt12-923的限制性酶切图。
图35显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-923的限制性酶切图。
图36显示质粒pBI-NdG6-rSt-923的限制性酶切图。
图37显示质粒pBI-NdG6-rSt12-923的限制性酶切图。
图38显示质粒pCR671ET的限制性酶切图。
图39显示质粒pCR671Bs的限制性酶切图。
图40显示质粒pUCrSt671的限制性酶切图。
图41显示质粒pSUM-NdG6-rSt-671的限制性酶切图。
图42显示质粒pKFrSt12-671的限制性酶切图。
图43显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-671的限制性酶切图。
图44显示质粒pBI-NdG6-rSt-671的限制性酶切图。
图45显示质粒pBI-NdG6-rSt12-671的限制性酶切图。
图46显示通过用琼脂糖凝胶电泳检测通过PCR扩增的DNA的结果，该PCR使用具有本发明DNA(A)的部分核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。泳道1，7，8，12，19，26，27，32，37，42和47表示DNA标记(ф174/HaeIII消化)的电泳。其它泳道表示表20和21所示样品的电泳。
图47显示通过将由在SEQ ID NO：134中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO：135中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸退火产生的接头的结构。
图48显示质粒pUCrSt657soy的限制性酶切图。
图49显示质粒pSUM-NdG6-rSt-657soy的限制性酶切图。
图50显示质粒pKFrSt12-657soy的限制性酶切图。
图51显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy的限制性酶切图。
图52显示质粒pBI-NdG6-rSt-657soy的限制性酶切图。
图53显示质粒pBI-NdG6-rSt12-657soy的限制性酶切图。
图54显示质粒pUCrSt1584soy的限制性酶切图。
图55显示质粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy的限制性酶切图。
图56显示质粒pKFrSt12-1584soy的限制性酶切图。
图57显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy的限制性酶切图。
图58显示质粒pBI-NdG6-rSt-1584soy的限制性酶切图。
图59显示质粒pBI-NdG6-rSt12-1584soy的限制性酶切图。
图60显示质粒pUCrSt1609soy的限制性酶切图。
图61显示质粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy的限制性酶切图。
图62显示通过将由在SEQ ID NO：402中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO：403中表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸退火产生的接头EcoT22I-12aa-EcoT22I的结构。
图63显示质粒pUCrSt12-1609soy的限制性酶切图。
图64显示质粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy的限制性酶切图。
图65显示质粒pBI-NdG6-rSt-1609soy的限制性酶切图。
图66显示质粒pBI-NdG6-rSt12-1609soy的限制性酶切图。
下面解释在上图所述的缩写：
DNA A1：本发明DNA(A1)
DNA A2：本发明DNA(A2)
DNA A3：本发明DNA(A3)
DNA A4：本发明DNA(A4)
DNA B1：本发明DNA(B1)
DNA B2：本发明DNA(B2)
DNA B4：本发明DNA(B4)
DNA A1S：本发明DNA(A1)S
DNA A23S：本发明DNA(A23)S
DNA A25S：本发明DNA(A25)S
tac p：tac启动子
rrnB t：rrnB终止子
ColE1 ori：质粒ColE1的复制起点
Ampr：氨苄青霉素抗性基因
RuBPCssCTT：编码大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的叶绿体转运肽的核苷酸序列
12aa：编码成熟蛋白的12个氨基酸的核苷酸序列，其在大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的叶绿体转运肽之后
Kmr：卡那霉素抗性基因
F1 ori：质粒F1的复制起点
CR16G6p：CR16G6启动子
CR16t：CR16终止子
CR16tΔ：其中将限制酶ScaI的限制位点下游的核苷酸序列从CR16终止子中去除的DNA
CR16G6pΔ：其中将限制酶NdeI的限制位点上游的核苷酸序列从CR16G6终止子中去除的DNA
NOSp：胭脂碱合酶基因的启动子
NPTII：卡那霉素抗性基因
NOSt：胭脂碱合酶基因的终止子
GUS：β-葡糖醛酸糖苷酶基因
RB：T-DNA的右边缘序列
LB：T-DNA的左边缘序列
NdeI，HindIII，BspHI，EcoRI，BamHI，EcoT221，SphI，KpnI，SacI，BglII，NotI，ScaI：各种限制酶的限制酶切位点
实施本发明的最好方式
以下详细解释本发明。
选自下列蛋白质组合(下文有时称为本发明蛋白质(A))的除草剂代谢蛋白具有将式(II)化合物(下文有时称为“化合物(II)”)转化为式(III)化合物(下文有时称为“化合物(III)”)的能力。
<蛋白质组合>
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和
(A28)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板为暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌，斯堡链霉菌或塔氏糖多孢菌的染色体DNA。
作为本发明蛋白质(A)的具体实例，提及：
包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A1)”)；
包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A2)”)；
包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A3)”)；
包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A4)”)；
包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A11)”)；
包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A12)”)；
包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A13)”)；
包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A14)”)；
包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A15)”)；
包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A16)”)；
包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A17)”)；
包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A18)”)；
包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A19)”)；
包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A20)”)；
包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A21)”)；
包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A22)”)；
包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A23)”)；
包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A24)”)；和
包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(A25)”)；
例如，通过将式(I)的PPO抑制型除草化合物(下文有时称为“化合物(I)”)与本发明蛋白质(A)反应，能够将该化合物转化成具有低除草活性的化合物。
另外，在将化合物(I)转化为低除草活性的化合物的处理中，还可以利用选自下列组合的除草剂代谢蛋白(下文有时称为“本发明蛋白质(A)”)：
(A1)包含在SEQ ID NO：1中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A2)包含在SEQ ID NO：2中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A3)包含在SEQ ID NO：3中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A4)包含在SEQ ID NO：108中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A5)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交；
(A8)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并包含由可通过聚合酶链式反应扩增的DNA所编码的氨基酸序列，所述聚合酶链式反应使用包含在SEQ ID NO：129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO：124至128中任何一个表示的核苷酸序列的引物，并且模板为属于链霉菌属或糖多孢菌属微生物的染色体；
(A9)包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A11)包含在SEQ ID NO：159中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A12)包含在SEQ ID NO：160中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A13)包含在SEQ ID NO：136中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A14)包含在SEQ ID NO：137中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A15)包含在SEQ ID NO：138中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A16)包含在SEQ ID NO：215中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A17)包含在SEQ ID NO：216中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A18)包含在SEQ ID NO：217中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A19)包含在SEQ ID NO：218中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A20)包含在SEQ ID NO：219中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A21)包含在SEQ ID NO：220中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A22)包含在SEQ ID NO：221中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A23)包含在SEQ ID NO：222中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A24)包含在SEQ ID NO：223中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A25)包含在SEQ ID NO：224中表示的氨基酸序列的蛋白质；
(A26)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含与在SEQ IDNO：159，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221或SEQ IDNO：223中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：218，SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
(A27)一种蛋白质，其具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码在SEQ ID NO：159，SEQ IDNO：160，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ IDNO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：223或SEQ ID NO：224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
作为本发明蛋白质(A)的实例，可以提及以上所述的本发明蛋白质A。另外，作为其它实施例，可以提及包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明的蛋白质(A9)”)和包含在SEQID NO：5中表示的氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明的蛋白质(A10)”)。
在上述蛋白质组合中在(A5)，(A6)，(A7)，(A8)，(A26)，(A27)或(A28)中表示的蛋白质的氨基酸序列中，从在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列中可以观察到的差异是例如某些氨基酸的缺失，替换，和插入。这些差异包括例如来自包含在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列的上述蛋白质在细胞中接受的加工的缺失。另外，包括自然发生的多态性变异，其是由例如获得蛋白质的生物的物种，个体等的差异导致；由通过例如定点诱变法，随机诱变法，诱变处理等人工引入的遗传突变引起的氨基酸缺失，替换，和插入。
经受这些缺失，替换和插入的氨基酸的数量可以在本发明蛋白质(A)能够发展将化合物(II)转化成化合物(III)的能力的范围内。另外，作为氨基酸的替换，可以提及例如替换成在疏水性，电荷，pK，立体结构特征等方面相似的氨基酸。作为这些替换，具体地例如提及下列各组内的替换：(1)甘氨酸和丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)丝氨酸和苏氨酸；(5)赖氨酸和精氨酸；(6)苯丙氨酸和酪氨酸；等。
另外，在本发明蛋白质(A)中，优选存在于对准SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中357号氨基酸的半胱氨酸的位点的半胱氨酸是保守的(未经受缺失或替换)：该半胱氨酸的实例包括在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中350号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中344号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：108所示氨基酸序列中360号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中359号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：5所示氨基酸序列中355号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：159所示氨基酸序列中358号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：160所示氨基酸序列中374号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：136所示氨基酸序列中351号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO：137所示氨基酸序列中358号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQID NO：138所示氨基酸序列中358号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ IDNO：222所示氨基酸序列中347号氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ IDNO：224所示氨基酸序列中347号氨基酸所示的半胱氨酸等。
作为人工导致这些氨基酸缺失，插入或替换(下文有时共同称为氨基酸修饰)的方法，例如提及包含在编码在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一个表示的氨基酸序列的DNA上进行定点诱变，和然后通过常规方法使该DNA表达的步骤的方法。作为定点诱变方法，例如提及应用琥珀突变(缺口双链体法，Nucleic Acids Res.，12，9441-9456(1984))方法，一种通过使用引物的PCR引入突变等的方法。另外，作为人工修饰氨基酸的方法，例如提及包含在编码在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的任何一个氨基酸序列的DNA上进行随机诱变，然后通过常规方法使该DNA表达的步骤的方法。作为随机诱变法，例如提及通过将编码上述氨基酸序列中任何一个的DNA用作模板和通过应用可以扩增每个全长DNA的引物对，在用作底物的dATP，dTTP，dGTP和dCTP中每一个的浓度不同于通常的条件下或在其中促进聚合酶反应的Mg2+浓度增加到高于通常的条件下进行PCR的方法。作为这些PCR方法，例如提及在Method in Molecular Biology，(31)，1994，97-112中描述的方法。另外，可以提及在PCT专利申请公开号WO00/09682中描述的方法。
在本发明中，“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的同源性和同一性。该“序列同一性”可以通过在测试序列的全区域比较两个序列，每个以最优状态对比来确定。同样，插入或缺失(例如缺口)可以用于测试核苷酸序列或氨基酸序列的最优对比。该序列同一性可以通过使用程序如FASTA(Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4，2444-2448(1988))，BLAST(Altschul等，Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990))，CLUSTAL W(Thompson，Higgins & Gibson，Nucleic AcidResearch，22，4673-4680(1994a))等的同源性分析进行的产生对比的步骤计算。这些程序例如可以典型地在日本DNA数据库(在日本信息生物学和DNA数据库中心运行的国际数据库)的网页(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上利用。另外，序列同一性可以通过使用可商购的序列分析软件来确定。具体地例如，可以使用GENETYX-WIN第5版(Software DevelopmentCompany，Ltd.)通过Lipman-Pearson法(Lipman，DJ.和Pearson，W.R.，Science，227，1435-1441，(1985))的同源性分析产生对比来计算它。
关于(A7)所述的“严谨条件”，可以提及例如在按照如Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatis，T.，Molecular Cloning第二版，Cold SpringHarbor Press所述的常规方法进行的杂交中杂交物在45℃下在包含6xSSC(使包含1.5M NaCl和0.15M柠檬酸三钠的溶液为10xSSC)的溶液中形成和然后在50℃下用2xSSC(Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)洗涤杂交物的条件。可以例如从2xSSC(低严谨条件)的条件至0.2xSSC的条件(高严谨条件)中选择洗涤步骤中的盐浓度。可以例如从室温(低严谨条件)至65℃(高严谨条件)中选择洗涤步骤中的温度。备选地，盐浓度和温度都可以改变。
作为“在严谨条件下与包含编码在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3或SEQ ID NO：108中任何一个表示的氨基酸的核苷酸序列的DNA杂交”的DNA，具体地例如可以提及包含编码在SEQ ID NO：1，2，3，4，5，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含在SEQ ID NO：6，7，8，78，84，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一个表示的核苷酸序列的DNA等。还可提及包含与在SEQ ID NO：6，7，8，78，84，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一个表示的核苷酸序列具有至少约60％同一性的核苷酸序列的DNA。
作为通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文称为“SDS-PAGE”)鉴定的分子量，本发明蛋白质(A)的分子量约为30,000-60,000，典型地约40,000-50,000(比得上例如由在SEQ ID NO：1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一个表示的氨基酸序列组成的蛋白质)。另外，只要将化合物(II)转化为化合物(II)的能力未消除，本发明蛋白质(A)可以用作向其氨基末端上游或其羧基末端下游添加氨基酸序列的蛋白质。
作为本发明蛋白质(A)代谢式(I)的PPO抑制型除草化合物的能力的标志，可以提及将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力。该能力例如可以通过在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下将化合物(II)与本发明蛋白质(A)反应和通过检测产生的化合物(III)来证实。
“包含电子供体的电子传递体系”是指其中氧化还原链式反应发生和电子从电子供体转移至本发明蛋白质(A)的系统。作为电子供体，例如提及辅酶NADPH，NADH等。例如，作为可构成从NADPH至本发明蛋白质(A)的电子传递体系的蛋白质，提及铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+还原酶，NADPH-细胞色素P-450还原酶，等。
为了证实将化合物(II)转化为化合物(III)的能力，例如将包含本发明蛋白质(A)，β-NADPH，铁氧还蛋白，铁氧还蛋白-NADP+还原酶和用放射性同位素标记的化合物(II)的约pH7的反应溶液在约30℃下温育约10分钟至1小时。随后，在通过加入盐酸使反应溶液变成酸性以后，用乙酸乙酯萃取。在将回收的乙酸乙酯层进行薄层层析(下文称为“TLC”)后，进行放射自显影，通过检测标记的化合物(III)可以证实将化合物(II)转化为化合物(III)的能力。
为了制备本发明蛋白质(A)，例如首先，按照常规遗传工程方法(例如，在Sambrook，J.，Frisch，E.F.，Maniatis，T.；Molecular Cloning第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press中描述的方法)获得编码本发明蛋白质(A)的DNA(下文有时共同称为“本发明DNA(A)”)。
作为本发明DNA(A)的实例，可以提及编码本发明蛋白质(A)的DNA(以下有时称为“本发明DNA(A)”)。作为本发明DNA(A)的具体实例，可以提及：
编码包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A1)”)；
编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A2)”)；
编码包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A3)”)；
编码包含SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A4)”)；
编码包含SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A11)”)；
编码包含SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A12)”)；
编码包含SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A13)”)；
编码包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A14)”)；
编码包含SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A15)”)；
编码包含SEQ ID NO：215所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A16)”)；
编码包含SEQ ID NO：216所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A17)”)；
编码包含SEQ ID NO：217所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A18)”)；
编码包含SEQ ID NO：218所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A19)”)；
编码包含SEQ ID NO：219所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A20)”)；
编码包含SEQ ID NO：220所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A21)”)；
编码包含SEQ ID NO：221所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A22)”)；
编码包含SEQ ID NO：222所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A23)”)；
编码包含SEQ ID NO：223所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A24)”)；
编码包含SEQ ID NO：224所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(A25)”)；等。
另外，作为本发明DNA(A)的更具体的实例，可以提及：
包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：110所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：139所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：144所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：140所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：145所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：141所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：146所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：142所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：147所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：143所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：148所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：225所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：235所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：226所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：236所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：227所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：237所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：228所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：238所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：229所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：239所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：230所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：240所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：231所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：241所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：232所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：242所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：233所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：243所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：234所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：244所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA；
编码具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质并且与在SEQ ID NO：6，7，8或109中任何一个表示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的DNA；
编码具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质并且与在SEQ ID NO：139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一个表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的DNA；等。
另外，作为本发明DNA(A)的实例，除了以上本发明DNA(A)以外，提及：
包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA，所述蛋白质包含在SEQ ID NO：4中表示的氨基酸序列(下文有时称为“本发明DNA(A9)”)；
包含SEQ ID NO：78所示核苷酸序列的DNA；
包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA，所述蛋白质包含在SEQ ID NO：5中表示的氨基酸序列(下文有时称为“本发明DNA(A10)”)；
包含SEQ ID NO：84所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO：85所示核苷酸序列的DNA；等。
本发明DNA(A)例如，可以是从自然界中克隆的DNA或者可以是通过如定点诱变法，随机诱变法已经将核苷酸的缺失，替换或插入引入从自然界中克隆的DNA的DNA，和可以是人工合成的DNA。随后，本发明蛋白质(A)可以通过按照常规遗传工程方法表达获得的本发明DNA(A)来生产或获得。这样，可以制备本发明蛋白质(A)。
例如通过以下方法制备本发明DNA(A)。首先，通过常规遗传工程方法如在Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press；和Current Protocols in MolecularBiology(1987)，John Wiley & Sons公司中描述的那些，从微生物中制备染色体DNA，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)，Streptomycescarbophilus，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，浅灰链霉菌ATCC 11796，Streptomycescarbophilus SANK62585，灰褐链霉菌IFO 12870t，热淡天蓝链霉菌IFO14273t，黑胡桃链霉菌IFO 13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。接下来，在用限制酶如Sau3AI部分消化染色体DNA以后，回收约2kb的DNA。按照在“Molecular Cloning：A LaboratoryManual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和“Current Protocolsin Molecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司中描述的常规遗传工程方法将回收的DNA克隆到载体中。作为载体，具体地例如，可以利用pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara Shuzo Company)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech Company)，pKK331-1A(AmershamPharmacia Biotech Company)，等。通过从获得的克隆中提取质粒可以获得染色体DNA文库。
本发明DNA(A)可以通过在下述条件下将探针与获得的染色体DNA文库杂交和通过检测和回收与探针特异性结合的DNA而获得。探针可以是由约至少20个核苷酸组成的DNA，所述核苷酸包含编码在SEQ IDNO：1，2，3或108中任何一个表示的氨基酸序列的核苷酸序列。作为可以用作探针的DNA的具体实例，提及包含在SEQ ID NO：6，7，8或109中任何一个表示的核酸的DNA；包含在SEQ ID NO：6，7，8或109中任何一个表示的核酸序列的部分核苷酸序列的DNA；包含与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA；等。
用放射性同位素，荧光染色等标记用作探针的DNA。为了用放射性同位素标记DNA，例如可以使用Boehringer或Takara shuzo Company的随机标记试剂盒。另外，通过进行PCR可以制备用32P标记的DNA。将用于探针的DNA用作模板。用(α-32P)dCTP交换典型地用在PCR反应溶液中的dCTP。另外，当用荧光染色标记DNA时，例如可以使用DIG-High PrimeDNA labeling和Detection Starter试剂盒II(Roche Company)。
接下来说明制备探针的具体实例。例如，通过将从如上所述的暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA或染色体DNA文库用作模板，通过将由SEQ ID NO：93所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：94所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物，和通过如下述实例所述使用例如PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)按照附装的手册进行PCR，可以获得包含SEQ ID NO：6所示的全长核苷酸序列、用洋地黄毒苷标记的DNA。类似地，通过将从如上所述的暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA或染色体DNA文库用作模板，可以获得包含在SEQ IDNO：6中表示的从核苷酸57至核苷酸730的核苷酸序列、用洋地黄毒苷标记的DNA。作为引物，使用由SEQ ID NO：130所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：131所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸进行PCR。另外，通过将从如上所述的塔氏糖多孢菌JCM 9383t制备的染色体DNA或染色体DNA文库用作模板，可以获得包含SEQ ID NO：7所示的全长核苷酸序列、用洋地黄毒苷标记的DNA。作为引物，使用由SEQ IDNO：61所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸进行PCR。另外，通过将从如上所述的砖红色链霉菌ATCC 21469制备的染色体DNA或染色体DNA文库用作模板，可以获得包含SEQ ID NO：8所示的全长核苷酸序列、用洋地黄毒苷标记的DNA。作为引物，使用由SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸进行PCR。另外，通过将从如上所述的砖红色链霉菌ATCC 21469制备的染色体DNA或染色体DNA文库用作模板，可以获得包含在SEQ ID NO：8中表示的从核苷酸21至核苷酸691的核苷酸序列、用洋地黄毒苷标记的DNA。作为引物，使用由SEQ ID NO：132所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO：133所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸进行PCR。
使探针与染色体DNA文库杂交的方法可包括菌落杂交和噬菌斑杂交，可以选择与文库制备所用载体的类型相容的适当方法。当所用文库是使用质粒载体构建时，进行菌落杂交。具体地，首先，通过将文库的DNA引入其中用于构建文库的载体可以复制的微生物获得转化体。稀释获得的转化体，涂布在琼脂平板上和培养直至菌落出现。当将噬菌体载体用于构建文库，进行噬菌斑杂交。具体地，首先，在侵染可能的条件下，将其中用于产生文库的噬菌体载体可以复制的微生物与文库的噬菌体混合。然后将混合物进一步与软琼脂混合。然后将该混合物涂布在琼脂平板上。随后，培养混合物直至噬菌斑出现。
接下来，在任一上述杂交的情形中，将膜放置在其中进行上述培养的琼脂板表面，将转化体的菌落或噬菌斑中的噬菌体颗粒转移到膜上。在碱处理膜后，进行中和处理。然后将从转化体或噬菌体颗粒洗脱的DNA固定在膜上。更具体地，例如在噬菌斑杂交的事件中，通过将硝化纤维膜或尼龙膜，具体地例如Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech Company)放置在琼脂板上并等待1分钟将噬菌体颗粒吸收在膜上。将膜浸泡在碱性溶液(1.5M NaCl和0.5N NaOH)中约3分钟以溶解噬菌体颗粒和将噬菌体DNA洗脱到膜上。然后将膜浸泡在中和溶液(1.5M NaCl和0.5Mtris-HCl缓冲液pH 7.5)中约5分钟。在洗涤溶液(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，0.2M tris-HCl缓冲液pH 7.5)中洗涤膜约5分钟，例如通过在真空中在约80℃下温育约90分钟将噬菌体DNA固定在膜上。
通过使用如此制备的膜，使用上述DNA作为探针进行杂交。例如可以按照“Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版(1989)”，ColdSpring Harbor Laboratory Press等中的描述进行杂交。
尽管可提供各种温度条件和试剂进行杂交，将如上所述制备的膜在42℃至65℃下浸泡和保持在以50μl-200μl/1cm2膜的比率制备的预杂交液中1小时至4小时。预杂交液例如可以包含450mM至900mM NaCl和45mM至90mM柠檬酸钠，包含浓度为0.1％-1.0％的十二烷基硫酸钠(下文称为“SDS”)，和包含浓度为0μg/ml-200μg/ml的变性的非特异性DNA，并可以有时包含各自浓度为0％-0.2％的清蛋白，phycol和聚乙烯吡咯烷酮。随后，例如将膜在42℃至65℃下浸泡和保持在以50μl-200μl/1cm2膜的比率制备的杂交液中12小时至20小时。杂交液是例如预杂交液和以上述制备方法获得的探针(相对数量为1.0 x 104cpm-2.0 x 106cpm/1cm2膜)的混合物，该预杂交液可以包含450mM至900mMNaCl和45mM至90mM柠檬酸钠，包含浓度为0.1％-1.0％的SDS，和包含浓度为0μg/ml-200μg/ml的变性的非特异性DNA，并可以有时包含各自浓度为0％-0.2％的清蛋白，phycol和聚乙烯吡咯烷酮。随后，移开膜并使用包含15mM-300mM NaCl，1.5mM-30mM柠檬酸钠和0.1％-1.0％SDS的42℃-65℃洗涤液进行5分钟至15分钟的洗涤约2-4次。此外，在用2 x SSC溶液(300mMNaCl和30mM柠檬酸钠)轻轻漂洗后，将膜干燥。通过将膜进行放射自显影检测探针在膜上的位置，鉴定膜上与所用探针杂交的DNA的位置。备选地，预杂交和杂交可以使用可商购的杂交试剂盒，如使用包含在DIG-HighPrime DNA Labeling & Detection Starter试剂盒II(Roche)中的杂交液进行。在杂交后，例如，在包含0.1％SDS的2 x SSC中在室温下洗涤膜两次5分钟，接着在包含0.1％SDS的0.5 x SSC中在65℃下洗涤膜两次15分钟。通过再用包含在试剂盒中的检测液处理洗涤的膜和通过检测膜上探针的位置来检测在膜上与所用探针杂交的DNA的位置。
在原始的琼脂培养基上鉴定对应于膜上检测的DNA的位置的克隆，其可以被挑取来分离携带那些DNA的克隆。
可以按照“Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols in MolecularBiology”(1987)，John Wiley & Sons Incorporated等所述的常规遗传工程方法将按照以上获得的本发明DNA(A)克隆到载体中。作为载体，具体地例如，可以使用pUCA119(Takara Shuzo Company)，pTVA118N(TakaraShuzo Company)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen Company)，pTrc99A(Pharmacia Company)，pKK331-1A(Pharmacia Company)等。
另外，按照上述获得的本发明DNA(A)的核苷酸序列可以通过在F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson，Proceeding of National Academy of ScienceU.S.A.(1977)74：5463-5467中所述的双脱氧终止法分析。在核苷酸序列分析的样品制备中，可以使用可商购试剂，如Perkin Elmer公司的ABI PRISM染料终止循环测序简易反应试剂盒。
还可以如下制备本发明DNA(A)。可以通过进行PCR扩增本发明DNA(A)。PCR可以使用如上所述从微生物制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO12735，浅灰链霉菌ATCC 11796，Streptomyces carbophilus SANK62585，灰褐链霉菌IFO 12870t，热淡天蓝链霉菌IFO 14273t，黑胡桃链霉菌IFO13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO 13682T，鲁地链霉菌IFO15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。PCR还可使用包含编码SEQ ID NO：1，2，3，4，5，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一个所示氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端至少约20个核苷酸的寡核苷酸，和包含与编码上述氨基酸序列中任何一个的核苷酸序列邻进3’末端或3’末端下游的至少约20个核苷酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸。PCR可以在下述条件下进行。在上述用于PCR的引物的5’末端侧，可以增加限制酶识别序列。
更具体地例如，通过使用从暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：52所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA等。备选地，通过使用包含SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQID NO：53所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以扩增包含SEQ ID NO：9(包含编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从塔氏糖多孢菌JCM 9383t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：61所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：62所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的DNA等。备选地，通过使用包含SEQ ID NO：61所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：63所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以扩增包含SEQ IDNO：10(包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从不产色链霉菌IFO 12735制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：119所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：120所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的DNA等。备选地，通过使用包含SEQ ID NO：119所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：121所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以扩增包含SEQID NO：110(包含编码SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从黑胡桃链霉菌IFO 13445制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：165所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：166所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含SEQ ID NO：144(包含编码SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从津岛链霉菌IFO 13782制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：171所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：172所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含SEQ ID NO：145(包含编码SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从热淡天蓝链霉菌IFO 14273t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：177所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：178所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含SEQ ID NO：146(包含编码SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从球团产色链霉菌IFO 13673t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：183所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：184所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含SEQ ID NO：147(包含编码SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用从橄榄产色链霉菌IFO 12444制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：184所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：185所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含SEQ ID NO：148(包含编码SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
当将其中将染色体DNA引入载体的DNA文库用作模板时，例如，还可通过使用包含选自编码SEQ ID NO：1，2，3，4，5，108，159，160，136，137或138中所示任何一个氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如包含编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列5’末端侧至少约20个核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸)，和包含与邻近用于构建文库的载体DNA插入位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列的至少约20个核苷酸的寡核苷酸作为引物进行PCR来扩增本发明DNA(A)。在如上所述用于PCR的引物的5’末端侧，可以加入限制酶识别序列。
关于上述这种PCR的条件，具体地例如，可以提及以下条件：保持97℃ 2分钟，然后重复10个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，然后72℃ 2分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着68℃ 30秒，和接着72℃ 2分钟(依次每个循环增加20秒)；和然后保持在72℃7分钟。PCR可以使用50μl的反应溶液，其包含50ng染色体DNA，包含上述配对的2种引物各自300nM，包含5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，包含5.0μl 10x ExpandHF缓冲液(包含MgCl2，Roche Molecular Biochemicals Company)和包含0.75μl Expand HiFi酶混合物(Roche Molecular Biochemicals Company)。
备选地，可以提及以下条件：保持97℃ 2分钟，然后重复30个循环，一个循环包括97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒，然后保持反应溶液在72℃4分钟。PCR可以使用50μl的反应溶液，其包含250ng染色体DNA，包含上述配对的2种引物各自200nM，包含5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物)，5.0μl 10x ExTaq缓冲液(包含MgCl2，Takara Shuzo Company)和包含0.5μl ExTaq聚合酶(Takara ShuzoCompany)。
备选地，例如基于在SEQ ID NO：6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特别高的区域的核苷酸序列，可以设计和制备用作引物的寡核苷酸。本发明DNA(A)还可以通过使用获得的寡核苷酸作为引物和染色体DNA或染色体DNA文库来进行PCR而获得。可以如上所述从微生物中制备染色体DNA或染色体DNA文库，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，Streptomycescarbophilus，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，浅灰链霉菌ATCC 11796，Streptomycescarbophilus SANK62585，灰褐链霉菌IFO 12870t，热淡天蓝链霉菌IFO14273t，黑胡桃链霉菌IFO 13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。关于“在SEQ ID NO：6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特别高的区域”，例如，提及对应于SEQ ID NO：6所示核苷酸序列中核苷酸290-315，458-485，496-525或1046-1073中每一个所示区域的区域。关于基于这些核苷酸序列区域设计的引物，例如，可以提及包含SEQ IDNO：124-129中任何一个所示核苷酸序列的引物。
SEQ ID NO：124；基于对应于以上核苷酸290-315所示区域的区域的核苷酸序列；
SEQ ID NO：125；基于对应于以上核苷酸458-485所示区域的区域的核苷酸序列；
SEQ ID NO：126；基于对应于以上核苷酸458-485所示区域的区域的核苷酸序列；
SEQ ID NO：127；基于对应于以上核苷酸496-525所示区域的区域的核苷酸序列；
SEQ ID NO：128；基于对应于以上核苷酸496-525所示区域的区域的核苷酸序列；和
SEQ ID NO：129；基于对应于以上核苷酸1046-1073所示区域的区域的核苷酸序列。
例如，通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对作为引物扩增约800bp的DNA。通过使用包含SEQ ID NO：125所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对作为引物扩增约600bp的DNA。通过使用包含SEQ ID NO：126所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对作为引物扩增约600bp的DNA。通过使用包含SEQ ID NO：127所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对作为引物扩增约580bp的DNA。另外，通过使用包含SEQ ID NO：128所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对作为引物扩增约580bp的DNA。
关于PCR条件，具体地例如，提及以下条件：保持95℃1分钟；重复30个循环，一个循环包括保持94℃ 15秒，接着60℃ 30秒，然后72℃1分钟；然后保持在72℃ 5分钟。可以使用25μl的反应溶液，其包含10ng染色体DNA，包含2种引物各自200nM，包含0.5μ1 dNTP混合物(4种dNTP每种10mM的混合物)，包含5μl 5x GC基因组PCR反应缓冲液，其包含5μl 5M GC-Melt和包含0.5μl Advantage-GC基因组聚合酶混合物(Clontech Company)。
通过回收如上所述扩增的DNA，可以获得包含本发明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA。接下来，基于获得的“包含本发明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA”具有的核苷酸序列，设计和制备包含所述核苷酸序列至少约20个核苷酸的部分核苷酸序列的寡核苷酸，或包含与所述核苷酸序列至少约20个核苷酸的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸。通过进行PCR可以获得包含延伸如上所述获得的“包含本发明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA”的3’末端下游或5’末端上游的本发明DNA(A)的部分核苷酸序列的DNA。PCR可以使用如上所述基于“包含本发明DNA(A)的部分核苷酸序列的DNA”的核苷酸序列制备的寡核苷酸和包含与用于构建上述文库的载体的DNA插入位点相邻区域的核苷酸序列的至少约20个核苷酸的寡核苷酸或者包含与其核苷酸序列互补的核苷酸序列的至少约20bp的寡核苷酸的配对作为引物。PCR可以例如使用从微生物中制备的染色体DNA文库作为模板，如上所述该微生物具有将化合物(II)转化为化合物(III)的能力。通过连接这种包含本发明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA，可以获得本发明DNA(A)。在该生产方法中，可以使用可商购试剂盒，如Universal Genome Walker(Clontech Company)。备选地，通过基于如上所述连接本发明DNA(A)的部分核苷酸序列获得的本发明DNA(A)的全长核苷酸序列制备引物，通过使用该引物和通过使用如上述染色体DNA文库作为模板来进行PCR可以获得本发明DNA(A)。
例如，通过使用由黑胡桃链霉菌IFO 13445制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核昔酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：139的核苷酸316-1048(编码SEQ IDNO：159所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，依照上述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：144(包含编码SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：149所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由津岛链霉菌IFO 13782制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：140的核苷酸364-1096(编码SEO IDNO：160所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：145(包含编码SEQ ID NO：150所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由热淡天蓝链霉菌IFO 14273t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ I DNO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：141的核苷酸295-1027(编码SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：146(包含编码SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由球团产色链霉菌IFO 13673t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：142的核苷酸316-1048(编码SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：147(包含编码SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由橄榄产色链霉菌IFO 12444制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：143的核苷酸316-1048(编码SEQID NO：138所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：148(包含编码SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由玫瑰变红链霉菌IFO 13682T制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：232的核苷酸289-1015(编码SEQ ID NO：222所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：242(包含编码SEQ ID NO：232所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：252所示氨基酸序列的核昔酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通过使用由斯堡链霉菌IFO 13446T制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板和通过使用包含SEQ ID NO：124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物来进行PCR，可以制备包含SEQ ID NO：234的核苷酸289-1015(编码SEQ IDNO：224所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。基于获得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述获得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通过连接产生的DNA可以获得包含SEQ ID NO：244(包含编码SEQ ID NO：234所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：254所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
通过按照“Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols in MolecularBiology”(1987)，John Wiley & Sons公司等所述的常规遗传工程方法可以将通过使用上述PCR获得的本发明DNA(A)克隆于载体中。具体地例如，可以通过使用质粒载体如Strategene公司的pBluescript II或包含于Invitrogen公司的TA克隆试剂盒中的质粒载体进行克隆。
另外，例如如下所述可以制备本发明DNA(A)。首先，设计核苷酸序列。该核苷酸序列编码由本发明DNA(A)编码的蛋白质的氨基酸序列。该核苷酸序列具有至多60％和至少40％，优选至多55％和至少45％的GC含量。编码上述蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列中密码子使用在来自引入本发明DNA(A)的宿主细胞物种的基因中密码子使用±4％的范围内。通过按照常规遗传工程方法制备具有设计的核苷酸序列的DNA，可以获得本发明DNA(A)。
例如，以下面所述方法可以设计编码本发明蛋白质(A1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和具有至多55％和至少45％GC含量的核苷酸序列，其中编码上述蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列中的密码子是在大豆基因中密码子使用±4％的范围内。首先，例如，比较编码可以获自暗产色链霉菌IFO 12898的本发明蛋白质(A1)氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：6)中的密码子使用(表22和表23)和大豆密码子使用(表24和表25)。基于比较的结果，将核苷酸替代加入SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，以使GC含量至多55％和至少45％并且密码子使用是在大豆密码子使用±4％的范围内。作为该核苷酸替代，选择不导致氨基酸替代的核苷酸替代。例如，编码亮氨酸的CTG密码子的使用在大豆基因中为1.22％和在SEQ IDNO：6所示核苷酸序列中为7.09％。同样，例如将从SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核苷酸106，163，181，226，289，292，544，1111，和1210起始的CTG密码子中的每一个替代成CTT密码子；将从核苷酸211，547和1084起始的CTG密码子中的每一个替代成CTA密码子；将从核苷酸334起始的CTG密码子替代成TTA密码子；将从核苷酸664，718，733，772，835，1120和1141起始的CTG密码子中的每一个替代成TTG密码子；和将从核苷酸787起始的CTG密码子替代成TTA密码子。如此设计的核苷酸序列的一个序列在SEQ ID NO：214中表示，其中密码子的使用在表26和表27中显示。在SEQ ID NO：214所示的核苷酸序列中，例如，编码亮氨酸的CTG密码子的使用是1.71％并且在大豆密码子使用(1.22％)±4％的范围内。按照如Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatis，T.；Molecular Cloning第二版，Cold Spring Harbor Press所述定点诱变法，可以通过将核苷酸替代引入具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA制备包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。备选地，通过使用以下实施例46中所述PCR的DNA合成方法可以制备具有SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。
类似地，SEQ ID NO：368所示核苷酸序列是设计编码本发明蛋白质(A23)的氨基酸序列(SEQ ID NO：222)和具有至多55％和至少45％GC含量的核苷酸序列的实例，其中编码上述蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列中的密码子使用是在大豆基因密码子使用±4％的范围内。另外，SEQ ID NO：393所示核苷酸序列是设计编码本发明蛋白质(A25)的氨基酸序列(SEQID NO：224)和具有至多55％和至少45％GC含量的核苷酸序列的实例，其中编码上述蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列中的密码子使用是在大豆基因密码子使用±4％的范围内。
按照如Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatis，T.；“Molecular Cloning第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Press；“Current Protocols inMolecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司等所述常规遗传工程方法将如此获得的本发明DNA(A)克隆到载体中。作为载体，具体地例如，可以利用pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara ShuzoCompany)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Pharmacia Company)，pKK331-1A(Pharmacia Company)，等。
另外，如此获得的本发明DNA(A)的核苷酸序列可以通过F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson，Proceeding of National Academy of Science U.S.A.(1977)74：5463-5467所述的双脱氧终止法分析。
以下述方法用作为标记的将化合物(II)转化为化合物(III)的能力可以证实由上述方法获得的本发明DNA(A)编码的本发明蛋白质(A)的代谢式(I)PPO抑制型除草化合物的能力。首先，如下所述，将所述DNA插入载体以使它连接在可以在宿主细胞中起作用的启动子的下游，并导入宿主细胞获得转化体。接下来，在包含电子供体如辅酶NDAPH的电子传递体系的存在下，将转化体的培养物或获自破坏培养物的提取物与化合物(II)反应。分析从中产生的反应产物以检测化合物(III)。如此，可以检测具有代谢化合物(II)和产生化合物(III)的能力的转化体，确定该转化体具有编码具有该能力的蛋白质的本发明DNA(A)。更具体地例如，制备由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成的30μl反应溶液，其包含上述转化体的培养物或提取物，电子供体如终浓度约2mM的β-NADPH，终浓度约2mg/ml的来源于菠菜的铁氧还蛋白，终浓度约0.1U/ml的铁氧还蛋白还原酶和3ppm用放射性同位素标记的化合物(II)。将反应液在约30℃至40℃下温育10分钟至1小时。在该温育后，加入3μl2N HCl和90μl乙酸乙酯，搅拌并在8,000g下离心以回收上清液。在真空中干燥上清液以后，将残余物溶解在乙酸乙酯中并在TLC硅胶板上展开获得的溶液。通过放射自显影分析TLC板。通过鉴定对应于用放射性同位素标记的化合物(III)的斑点可以证实将化合物(II)转化为化合物(III)的能力。
使用本发明DNA(A)或包含所述DNA的部分核苷酸序列或与部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸，通过进行如上所述的杂交或PCR可以进一步搜索编码具有将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的蛋白质的DNA或具有该DNA的微生物。
具体地例如，进行如上所述的杂交和鉴定与探针杂交的DNA。使用本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的部分核苷酸序列或与部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为探针，和来源于天然微生物的基因组DNA进行杂交，例如，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌；所述微生物属于糖多孢菌属，如塔氏糖多孢菌；等。作为可以用作探针的DNA的具体实例，可以提及包含SEQ ID NO：6，7，8，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234任一个所示的全长核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核苷酸57-730所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的核苷酸21-691所示核苷酸序列的DNA；等。
备选地，如上所述可以进行PCR和可以检测扩增的DNA。PCR使用包含本发明DNA(A)的部分核苷酸序列或与部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸。PCR使用来源于天然微生物的基因组DNA作为模板，例如，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌；所述微生物属于糖多孢菌属，如塔氏糖多孢菌；等。作为引物，可以提及基于如上所述“在SEQ ID NO：6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特别高的区域”的核苷酸序列设计的引物。作为引物更具体的实例，提及包含SEQ ID NO：124至128中任何一个所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO：129所示核苷酸序列的引物的配对。
回收如此检测的DNA。当回收的DNA不包含本发明DNA(A)的全长核苷酸序列时，以上述方式将该DNA使用和制备成对应于全长核苷酸序列的DNA。将获得的DNA导入宿主细胞以产生转化体。通过使用获得的转化体的培养物和以上述方法测量将化合物(II)转化为化合物(III)的能力可以评估由导入转化体的DNA编码的蛋白质将化合物(II)转化为化合物(III)的能力。
为了在宿主细胞中表达本发明DNA(A)，将本发明DNA(A)导入宿主细胞中能够使它在所述细胞中表达的位置。通过将本发明DNA(A)导入“能使它表达的位置”，它是指将本发明DNA(A)导入宿主细胞以使它处于与指导从其核苷酸序列转录和翻译的核苷酸序列相邻的位置(即例如，促进本发明蛋白质(A)和编码本发明蛋白质(A)的RNA生产的核苷酸序列)。
为了将本发明DNA(A)导入宿主细胞以使它位于能使它表达的位置，例如，将其中本发明DNA(A)和在宿主细胞中起作用的启动子可操作连接的DNA导入宿主细胞。这里术语“可操作连接”是指其中本发明DNA(A)与启动子连接以致当将DNA导入宿主细胞中时它在启动子的控制下表达的情形。
当宿主细胞是微生物细胞时，作为起作用的启动子，例如可以提及大肠杆菌乳糖操纵子的启动子，大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子，T7噬菌体启动子或在大肠杆菌中起作用的人造启动子，如tac启动子或trc启动子等。另外，可以利用在属于链霉菌属或糖多孢菌属的微生物的染色体中原来位于本发明DNA(A)上游的启动子。
当宿主细胞是植物细胞时，作为起作用的启动子，例如提及T-DNA衍生的组成型启动子，如胭脂碱合酶基因的启动子和章鱼碱合酶基因启动子；植物病毒衍生的启动子如花椰菜花叶病毒衍生的19S和35S启动子；可诱导的启动子如苯丙氨酸氨裂解酶基因的启动子，查耳酮合酶基因的启动子和致病相关的蛋白质基因的启动子；日本未审查的专利公开号2000-166577所述的植物启动子。另外，可以将在植物细胞中起作用的终止子连接到其中在植物细胞中起作用的启动子和本发明DNA(A)被可操作连接的DNA上。在该情形中，通常优选将终止子连接到本发明DNA(A)的下游。作为起作用的终止子，例如提及T-DNA衍生的组成型终止子如胭脂碱合酶基因(NOS)的终止子；植物病毒衍生的终止子如葱属病毒GV1或GV2的终止子；在日本未审查的专利公开号2000-166577中所述的植物终止子；等。
当导入本发明DNA(A)以使DNA处于能使它表达的位置时，例如可以使用含有编码转运至胞内细胞器的信号的核苷酸序列的DNA，其连接到本发明DNA(A)的上游以使可读框在框内。通过连接“以使可读框在框内”它是指将对胞内细胞器的转运信号的序列的可读框和本发明DNA(A)的可读框连接形成一个连续的可读框。作为提供蛋白质在植物细胞的胞内细胞器中转运和定位的转运信号序列，例如可以提及如美国专利5,717,084所述、来源于位于植物叶绿体中的蛋白质的胞质前体的转运信号，由美国专利RE36449所述的各种转运信号序列形成的嵌合序列。更具体地，提及来源于大豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的叶绿体转运肽，其按照下面实施例15所述方法可以获得。
典型地，可以将本发明DNA(A)，如上所述连接含有编码对胞内细胞器的转运信号的核苷酸序列的DNA的本发明DNA(A)，或其中该DNA与在宿主细胞中起作用的启动子可操作连接的DNA，各自可被插入在宿主细胞中可用的载体中，将这导入宿主细胞。当使用已经具有在宿主细胞中起作用的启动子的载体时，可以将本发明DNA(A)插入存在于载体中的启动子的下游以使所述启动子和本发明DNA(A)可以可操作连接。
作为载体，具体地当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，例如，可以提及pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara Shuzo Company)，pBluescript II(Strategene Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech Company)，pKK331-1A(AmerchamPharmacia Biotech Company)，pET11d(Novagen)等。通过使用包含选择性标记(例如赋予对抗生素的抗性的基因如卡那霉素抗性基因，新霉素抗性基因等)的载体，它是方便的，因为可以将选择性标记的表型用作指示物来选择导入本发明DNA的转化体。
关于将本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的载体导入宿主细胞的方法，当宿主细胞是微生物，例如大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，发酵单胞菌属物种(Zymomonas sp.)，乳酸菌，乙酸菌，葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)，链霉菌属物种(Streptomyces sp.)，糖多孢菌属物种(Saccharopolyspora sp.)，或酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces ponmbe)，真菌如曲霉属(Aspergillus)等时，可以提及在Shin Seikagaku Zikken Kouza(Nippon-Seikagaku-Kai eds.，Tokyo Kagaku Dozin)，17卷，Biseibutu-Zikken-Hou中所述方法。备选地，例如可以使用在Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatis，T.；“Molecular Cloning第二版”Cold SpringHarborPress(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)或在“Current Protocols in Molecualr Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司中所述的氯化钙法或在“Methods in Electroporation：Gene Pulser/E.coliPulser System”，Bio-Rad Laboratories(1993)中所述的电穿孔法。
例如通过如上所述选择包含在已经插入本发明DNA(A)的载体中的选择性标记的表型作为指示物可以选择其中已经导入本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的载体的转化体。另外，通过从转化体中制备DNA和然后用制备的DNA进行在例如“Molecular Cloning第二版”，Cold SpringHarbor Press(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)(如证实限制酶位点，DNA测序，DNA杂交，PCR等)所述的遗传工程分析方法可以证实转化体是否包含本发明DNA(A)或含本发明DNA(A)的载体。
当宿主细胞是植物细胞时，可以提及植物类型，例如，双子叶植物如烟草，棉花，油菜籽，甜菜，拟南芥，油菜(canola)，亚麻，向日葵，马铃薯，苜蓿，莴苣，香蕉，大豆，豌豆，荚果，松树，杨树，苹果，葡萄，橙子，柠檬，其它柑橘属水果，杏，胡桃和其它坚果；单子叶植物如玉米，水稻，小麦，大麦，黑麦，燕麦，高梁，甘蔗和草；等。关于导入本发明DNA(A)的细胞可以使用植物组织，植物体，培养的细胞，种子等。
关于将本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的载体导入宿主细胞的方法，提及方法如用农杆菌感染(日本审查专利公开号2-58917和日本未审查专利公开号60-70080)，电穿孔到原生质体中(日本未审查专利公开号60-251887和日本未审查专利公开号5-68575)或基因枪法(日本未审查专利公开号5-508316和日本未审查专利公开号63-258525)。
在这些情形中，例如，通过与包含本发明DNA(A)的载体同时将选自潮霉素磷酸转移酶基因，新霉素磷酸转移酶基因和氯霉素转乙酰酶基因的选择性标记导入植物细胞，可以用选择性标记的表型作为指示物选择已经导入本发明DNA的转化体。可以将选择性标记基因和本发明DNA(A)插入相同的载体和导入。还可同时导入包含选择性标记基因的载体和包含本发明DNA(A)的载体。通过用包含式(I)PPO抑制型除草化合物的培养基培养和通过分离其中可增加的克隆也可以选择已经导入本发明DNA(A)的转化体。通过从转化体中制备DNA和然后用制备的DNA进行例如在“Molecular Cloning第二版”，Cold Spring Harbor Press(MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)中描述的遗传工程分析方法(如证实限制酶位点，DNA测序，DNA杂交，PCR等)可以证实转化体是否包含本发明DNA(A)。通过插入到包含在胞内细胞器如叶绿体中的DNA可以将导入植物细胞中的本发明DNA(A)保持在除了包含在核中的DNA以外的细胞中的位置。
从如此获得的转化的植物细胞，通过在Shokubutu-Idenshi-Sosa-Manual：Transgenic-Shokubutu-No-Iukurikata(Uchimiya，Kodansha-Scientific，1990)，27-55页所述的植物细胞培养方法再生植物体可以获得已经导入本发明DNA(A)的转基因植物。另外，通过将靶类型的植物与已经导入本发明DNA(A)的转基因植物交配以使本发明DNA(A)导入靶类型植物的染色体中，可以产生已经导入本发明DNA(A)的靶植物类型。
具体地，例如，通过Model-Shokubutu-No-Jikken-Protocol：Ine，Shiroinunazuna-Hen(Supervisors：Koh SHIMAMOTO和Kiyotaka OKADA，Shujun-sha，1996)，第四章所述的方法可以获得其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的水稻或拟南芥。另外，通过按照日本未审查的专利公开号3-291501所述方法用基因枪导入大豆体细胞胚可以获得其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的大豆。同样，通过按照Fromm，M.E.，等Bio/Technology，8；第838页(1990)所述方法用基因枪导入玉米体细胞胚可以获得其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的玉米。通过按照TAKUMI等，Journal ofBreeding Society(1995)，44：Extra卷1，第57页所述常规方法用基因枪将基因导入无菌培养的小麦未成熟盾盖可以获得其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的小麦。同样，通过按照HAGIO，等，Journal of Breeding Society(1995)，44；Extra卷1，第67页所述常规方法用基因枪导入无菌培养的大麦未成熟盾盖可以获得其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的大麦。
通过在它的细胞内将所述除草化合物转化成低除草活性的化合物，其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的转化体可以减轻由化合物(I)导致的植物损伤。具体地例如，通过在期望植物的播种之前将表达本发明蛋白质(A)的微生物散布在期望栽培的植物的栽培区域，残余在土壤中的除草化合物可以被代谢，可以减轻对期望植物的损伤。另外，通过使期望的各种植物表达本发明蛋白质(A)，赋予所述植物将式(I)的PPO抑制型除草化合物代谢成低活性的化合物的能力。结果，减轻植物中来自除草化合物的植物损伤，赋予对所述化合物的抗性。
例如通过培养包含本发明DNA(A)的细胞可以制备本发明蛋白质(A)。关于该细胞，提及表达本发明DNA(A)和具有生产本发明蛋白质(A)的能力的微生物，如从自然界分离的包含本发明DNA(A)的微生物菌株，通过用试剂或紫外线处理等处理由天然菌株衍生的突变株。更具体地例如，提及属于链霉菌属的微生物，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，浅灰链霉菌ATCC11796，Streptomyces carbophilus SANK62585，灰褐链霉菌IFO 12870t，热淡天蓝链霉菌IFO 14273t，黑胡桃链霉菌IFO13445，津岛链霉菌IFO13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO 13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。另外，可以提及其中已经导入本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的载体的转化体。具体地例如，提及其中将与tac启动子，trc启动子，lac启动子或t7噬菌体启动子可操作连接的本发明DNA(A)导入大肠杆菌的转化体。作为更多的具体实例，提及在下述实施例中描述的大肠杆菌JM109/pKSN657，大肠杆菌JM109/pKSN657F，大肠杆菌JM109/pKSN923，大肠杆菌JM109/pKSN923F，大肠杆菌JM109/pKSN11796，大肠杆菌JM109/pKSN11796F，大肠杆菌JM109/pKSN671，大肠杆菌JM109/pKSN671F，大肠杆菌JM109/pKSNCA，大肠杆菌JM109/pKSN646，大肠杆菌JM109/pKSN646F，大肠杆菌JM109/pKSN849AF，大肠杆菌JM109/pKSN1618F，大肠杆菌JM109/pKSN474F，大肠杆菌JM109/pKSN1491AF，大肠杆菌JM109/pKSN1555AF，大肠杆菌JM109/pKSN1584F，大肠杆菌JM109/pKSN1609F等。
作为培养上述包含本发明DNA(A)的微生物的培养基，可以使用通常用于培养微生物的那些中的任何一种，其包含碳源和氮源，如果适当的话有机和无机盐。可以加入血红素前体的化合物，如氨基乙酰丙酸。
作为碳源，例如提及糖类如葡萄糖，果糖，蔗糖和糊精；糖醇如甘油和山梨糖醇；和有机酸如延胡索酸，柠檬酸和丙酮酸；等。上面所列碳源加入培养基的量通常是基于培养基总量的约0.1％(w/v)至约10％(w/v)。
作为氮源，例如提及无机酸的铵盐如氯化铵，硫酸铵和磷酸铵；有机酸的铵盐如延胡索酸铵和柠檬酸铵；有机氮源如肉膏，酵母提取物，麦芽汁，大豆粉，玉米浆，棉籽粉，干酵母，酪蛋白水解物；以及氨基酸。在以上所列那些中，有机酸的铵盐，有机氮源和氨基酸也可以通常用作碳源。加入氮源的量通常是基于培养基总量的约0.1％(w/v)至约10％(w/v)。
作为无机盐，例如，提及磷酸盐如磷酸钾，磷酸氢二钾，磷酸钠，磷酸氢二钠；氯化物如氯化钾，氯化钠，氯化钴六水合物；硫酸盐如硫酸镁，硫酸铁七水合物，硫酸锌七水合物，硫酸锰三水合物；等。加入的量通常是基于培养基总量的约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)。
在培养保持连接于T7噬菌体启动子下游的本发明DNA(A)和其中编码T7RNA聚合酶(λDE3溶原菌)的核昔酸序列连接于lac UV5启动子下游的DNA的转化体的情形中，典型地可以加入少量例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(以下称为“IPTG”)作为诱导物诱导本发明蛋白质(A)的生产。在培养已经导入DNA的转化体情形中，也可以将IPTG加入培养基，所述DNA中本发明DNA(A)与一类由乳糖诱导的启动子如tac启动子，trc启动子和lac启动子可操作连接。
可以按照通常用于培养微生物的方法，包括液相培养如旋转振荡培养，往复式振荡培养，小型发酵(小型发酵罐培养)和罐培养；或固相培养，培养包含本发明DNA(A)的微生物。当使用小型发酵罐时，通常以每分钟约0.1至约2倍培养液体积的通风速率将无菌空气导入小型发酵罐。实施培养的温度可以在允许微生物生长的范围内变化，通常为约15℃至约40℃，培养基的pH为约6至约8。培养时间可以根据培养条件变化，通常约为1天至约10天。
通过包含本发明DNA(A)的微生物生产的本发明蛋白质(A)可以以各种形式用于处理式(I)的PPO抑制型除草化合物，如生产本发明蛋白质(A)的微生物的培养物，生产本发明蛋白质(A)的微生物细胞，通过处理该细胞得到的材料，微生物的无细胞提取物，未完全纯化的蛋白质，纯化的蛋白质等。上述通过处理细胞获得的材料包括例如冻干细胞，丙酮干燥细胞，磨碎的细胞，细胞的自溶物，超声处理的细胞，碱处理的细胞，有机溶剂处理的细胞等。备选地，可以按照已知方法如使用吸附在无机载体如硅胶或陶瓷材料，多糖衍生物如DEAE-纤维素，合成聚合物如Amberite IRA-935(商品名，由Rohm和Haas制备)等之上的载体结合法，和使用包含在聚合物如聚丙烯酰胺，含硫多糖凝胶(例如角叉藻聚糖凝胶)，藻酸胶，琼脂胶等的网状基质中的包含法来固定上述各种形式中任何一种本发明蛋白质(A)，然后用于处理上述除草化合物。
作为从包含本发明DNA(A)的微生物的培养物中纯化本发明蛋白质(A)的方法，可以使用常规用于纯化蛋白质的方法。例如可以提及下列方法。
首先，通过离心等从微生物的培养物中收获细胞，然后通过超声处理，DYNOMILL处理，FRENCH PRESS处理等物理破裂，或通过使用表面活性剂或细胞裂解酶如溶菌酶化学破裂细胞。从如此获得的产生的裂解物中，通过离心，膜过滤等去除不溶物以制备无细胞提取物，其然后通过任何适当的分离和纯化方法，如阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤层析等分级，由此纯化本发明蛋白质(A)。用于该层析的支持材料包括例如树脂载体如与羧甲基(CM)，二乙氨基乙基(DEAE)，苯基或丁基连接的纤维素，葡聚糖和琼脂糖。也可以使用可商购的已经填充任何载体的柱子，如Q-Sepharose FF，Phenyl-Sepharose HP，PD-10和HiLoad26/10Q Sepharose HP(商品名，来自Amersham Pharmacia Biotech)，TSK-gel G3000SW(商品名，TOSOH CORPORATION)。
提供纯化本发明蛋白质(A)的一个实例。
通过离心收获产生本发明蛋白质(A)的微生物细胞，然后悬浮在缓冲液如0.1M磷酸钾(pH7.0)中。超声处理混悬液以破裂细胞，在约40,000g下离心如此获得的产生的裂解物约30分钟以获得上清液，其然后在150，000g下离心约1小时以回收上清液(无细胞提取物)。将获得的无细胞提取物进行硫酸铵分级分离以获得在45％-饱和硫酸铵的存在下可溶解和在55％-饱和的硫酸铵下沉淀的级分。在使用PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)用不包含硫酸铵的缓冲液如1M磷酸钾交换级分的溶剂后，将产生的级分上样到例如HiLoad 26/10 Q SepharoseHP柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)上。用20mM双三丙烷(bistripropane)和NaCl线性梯度洗脱柱子而获得一系列洗脱物级分。回收显示在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下将化合物(II)转化为化合物(III)的活性的级分。接下来，在通过使用例如PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)交换级分中的缓冲液以后，将回收的级分上样到Bio-Scale Ceramic，例如羟磷灰石，I型柱子CHT10-I(BioRad Company)上。在用缓冲液A(包含1.5mM CaCl2的2mM磷酸钾缓冲液；pH7.0)洗涤柱子以后，用缓冲液A和线性梯度的缓冲液B(包含0.03mM CaCl2的100mM磷酸钾缓冲液)洗脱柱子以获得一系列洗脱物级分。回收显示在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下将化合物(II)转化为化合物(III)的活性的级分。在通过使用例如PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)交换级分中的缓冲液以后，通过例如超滤(microcon滤器装置microcon-30；Millipore公司)浓缩回收的级分。将产生的级分例如注射到HiLoad 16/60 Superdex柱75pg柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)中和用包含0.15M NaCl(pH7.0)的0.05M磷酸钾缓冲液洗脱而获得一系列洗脱物级分。回收显示在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下将化合物(II)转化为化合物(III)的活性的级分。根据需要通过用SDS-PAGE分离可以纯化本发明蛋白质(A)。
通过以上述方法纯化本发明蛋白质(A)，接着将获得的本发明蛋白质(A)用作免疫抗原，可以产生识别本发明蛋白质(A)的抗体(下文有时称为“本发明抗体(A)”)。
具体地例如，用以上述方法纯化的本发明蛋白质(A)作为抗原免疫动物。例如，为了免疫动物如小鼠，仓鼠，豚鼠，小鸡，大鼠，兔子，狗等，使用在例如W.H.Newsome，J.Assoc.Off.Anal.Chem.70(6)1025-1027(1987)中描述的常规免疫方法至少施用抗原一次。作为给药计划，例如提及在7至30天的间隔，优选12至16天的间隔给药2或3次。其剂量是例如每次给药约0.05mg-2mg抗原。给药途径可选自皮下给药，皮内给药，腹膜内给药，静脉内给药，和肌内给药，静脉内，腹膜内或皮下注射是典型的给药方式。典型地在溶于适当的缓冲液中后使用抗原，所述缓冲液例如磷酸钠缓冲液或生理盐水，其包含至少一种通常使用的佐剂如完全弗氏佐剂(Aracel A，Bayol F和死结核杆菌(tubercule bacillus)的混合物)，RAS[MPL(单磷酰基类脂A)+TDM(合成trehalose dicorynomycolate)+CWS(细胞壁骨架)佐剂系统]或氢氧化铝。然而，取决于给药途径或病症，可以不使用上述佐剂。“佐剂”是经与抗原一起给药后增强非特异性针对抗原的免疫反应的物质。在喂养施用抗原的动物0.5-4个月后，从例如动物的耳静脉中采样少量血液和测量抗体效价。当抗体效价提高时，根据情形再施用抗原适当的次数。例如，可以以约100μg-1000μg的剂量再一次使用抗原。在最后一次给药1或2个月以后，以通常方式从免疫动物中收集血液。通过常规技术如通过离心或用硫酸铵或用聚乙二醇沉淀，层析如凝胶过滤层析，离子交换层析和亲和层析，等将血液分级，可以获得作为多克隆抗血清的本发明抗体(A)。另外，可以将抗血清例如在56℃下温育30分钟以使补体系统失活。
备选地，化学合成包含本发明蛋白质(A)部分氨基酸序列的多肽并作为免疫抗原施用于动物，由此产生本发明抗体(A)。关于用作免疫抗原使用的多肽的氨基酸序列，从本发明蛋白质(A)的氨基酸序列中选择与其它蛋白质的氨基酸序列具有尽可能低同源性的氨基酸序列。通过常规方法化学合成由所选氨基酸序列组成的、10个氨基酸至15个氨基酸长度的多肽，并例如使用MBS等与载体蛋白如Limulus plyhemus血蓝蛋白交联，然后如上所述用于免疫动物如兔子。
然后将产生的本发明抗体(A)与试样接触，然后通过常规免疫学方法检测试样中蛋白质与上述抗体的复合体，从而检测试样中的本发明蛋白质(A)或包含其部分氨基酸的多肽。具体地例如，如以下实施例45或73所述可以通过使用本发明抗体(A)的蛋白质印迹分析评估在检查试样中本发明蛋白质(A)的存在或定量本发明蛋白质(A)。
另外，例如，按照常规免疫学方法，通过将本发明抗体(A)与试验细胞或由试验细胞制备的试样接触，接着检测上述抗体和试验细胞或由试验细胞制备的试样中的蛋白质的复合体，可以检测表达本发明蛋白质(A)的细胞。通过如此检测表达本发明蛋白质(A)的细胞，还可以从多种细胞中选择表达本发明蛋白质(A)的细胞。使用本发明抗体(A)还可以克隆或选择包含本发明蛋白质(A)的克隆。例如，通过从表达本发明蛋白质(A)的细胞中提取基因组DNA，接着将基因组DNA插入表达载体可以产生基因组文库。将基因组文库导入细胞。从获得的细胞组中，以上述方法使用本发明抗体(A)选择表达本发明蛋白质(A)的细胞。
可以将包含本发明抗体(A)的试剂盒用来如上所述检测本发明蛋白质(A)或分析，检测或寻找表达本发明蛋白质(A)的细胞。本发明的试剂盒可以包含除了本发明抗体(A)以外的上述分析方法所需的试剂，可以含有与本发明抗体(A)一起使用的试剂。
通过将式(I)的PPO抑制型除草化合物在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下与本发明蛋白质(A)反应，将上述化合物代谢和转化成低除草活性的化合物。具体地例如，通过在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下将化合物(II)与本发明蛋白质(A)反应，化合物(II)被转化成化合物(III)，其显示基本上没有除草活性。在该情形中的蛋白质(A)的实例是本发明蛋白质(A)。可以使用本发明蛋白质(A)的一个变体，可以一起使用多个变体。
式(I)的化合物是具有尿嘧啶结构的化合物。作为具体的实例，可以提及化合物(II)或式(IV)至(IX)中任何一个的化合物(下文分别称为化合物(IV)至化合物(IX))。按照在日本未审查的专利公开号2000-319264中所述方法可以合成化合物(II)和化合物(IX)，按照美国专利5183492所述方法可以合成化合物(IV)和化合物(V)，按照美国专利5674810所述方法可以合成化合物(VI)，按照日本未审查专利公开号3-204865所述方法可以合成化合物(VII)，按照日本未审查专利公开号6-321941所述方法可以合成化合物(VIII)。
Figure C02825642D00881
Figure C02825642D00891
另外，作为式(I)化合物的具体实例，可以提及式(X)至(XVII)中任何一项的化合物(以下分别称为化合物(X)至化合物(XVII))。
通过使化合物存在于反应，所述反应中在包含电子供体如辅酶NADPH的电子传递体系的存在下标记放射性同位素的化合物(II)与本发明蛋白质(A)反应，和检测作为标志的标记的化合物(II)至标记的化合物(III)的转化反应被本发明蛋白质(A)的竞争性抑制，能够选择可以是本发明蛋白质(A)的代谢反应底物的化合物。当测定来自试验化合物的竞争性抑制的存在时，典型地将试验化合物加至1-100倍标记化合物(II)的摩尔浓度的量。
可以例如在包含无机酸的盐如碱金属磷酸盐如磷酸钠和磷酸钾；或有机酸的盐如碱金属的乙酸盐如乙酸钠和乙酸钾等的含水缓冲液中进行化合物(I)与本发明蛋白质(A)的反应。在代谢反应液中式(I)化合物的浓度典型地为至多约30％(w/v)和优选约0.001％(w/v)至20％(w/v)。包含电子供体如NADPH的电子传递体系或者本发明蛋白质(A)的量可以例如根据反应时间而变化。反应温度选自典型地约10℃-70℃的范围，优选约20℃-50℃。反应液的pH选自典型地约4-12的范围，优选约5-10。反应时间可以根据需要变化，典型地约1小时至10天。
另外，可以在包含本发明DNA(A)的细胞中进行化合物(I)与本发明蛋白质(A)的反应。作为包含本发明DNA(A)的细胞，例如提及具有表达本发明DNA(A)和生产本发明蛋白质(A)的微生物，如从自然界中分离的包含本发明DNA(A)的那些微生物的菌株，通过用化学品或紫外线处理衍生于该微生物菌株的突变株，其中将本发明DNA(A)或包含本发明DNA(A)的载体导入宿主细胞的转化的微生物细胞。另外，提及导入本发明DNA(A)的转化的植物细胞或导入本发明DNA(A)的转化植物的细胞。在该情形中，可以将式(I)化合物直接加到包含本发明DNA(A)的细胞或可以加至细胞培养基或与细胞接触的土壤中以便进入细胞。包含电子供体如NADPH的电子传递体系可以是原来存在于细胞中的系统和可以从细胞外部加入。
例如通过检测由化合物(I)代谢产生的化合物可以证实由本发明蛋白质(A)导致的化合物(I)的代谢。具体地例如，如上所述可以用HPLC分析或TLC分析检测由代谢化合物(II)产生的化合物(III)。
另外，基于在化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应后反应溶液中的除草活性相比较低于化合物(I)未与本发明蛋白质(A)反应的情形，可以证实由本发明蛋白质(A)导致的化合物(I)的代谢。作为检验除草活性的方法，例如提及其中将上述反应溶液施用于杂草如稗(Echinochloacrus-galli)，大穗看麦娘(Alopercurus myosuroides)，Ivyleaf morningglory(Ipomoea hederacea)和苘麻(Abutilon theophrasti)和检查除草效果的方法；或其中将杂草在施用上述反应溶液的土壤样品上栽培和检查除草效果的方法；等。另外，提及其中可以将上述反应溶液点在从植物采取的叶盘上和检查由反应溶液导致的植物损伤(变白)的存在的方法。
另外，通过检测作为标记的、在化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应后的反应溶液中的PPO抑制活性相比较低于其中化合物(I)未与本发明蛋白质(A)反应的反应溶液中的活性，可以证实本发明蛋白质(A)导致的化合物(I)的代谢。PPO是催化原卟啉原IX向原卟啉IX(以下称为“PPIX”)转化的酶。例如，在将上述反应溶液加入PPO反应系统中以后，加入PPO的底物—原卟啉原IX并在黑暗中在30℃下温育约1-2小时。随后，使用HPLC等测量在各个温育的溶液中PPIX的量。当在加入化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应后的反应溶液的系统中PPIX的量超过在加入化合物(I)未与本发明蛋白质(A)反应后的反应溶液的系统中的PPIX量时，确定化合物(I)已经由本发明蛋白质(A)代谢。作为PPO，可以使用从植物等中纯化的蛋白质或来自植物的叶绿体级分。当使用叶绿体级分时，可以将氨基乙酰丙酸而不是原卟啉原IX用于PPO反应系统中。氨基乙酰丙酸是叶绿素-血红素生物合成途径中原卟啉原IX的前体。在下面实施例42中给出一个更具体的实例。
通过如此与本发明蛋白质(A)反应，可以进行式(I)PPO抑制型除草化合物的处理，其导致化合物代谢和转化成低除草活性的化合物。通过在植物栽培区域上喷洒所述化合物的处理可以减轻来自所述化合物的植物损伤，具体地例如，喷洒在植物栽培区域上和保留在植物残体或土壤等之中的化合物与本发明蛋白质(A)反应。
作为可以用来使化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应的“包含电子供体的电子传递体系”，例如可以提及包含NADPH，铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+还原酶的系统。
作为在系统中提供“包含电子供体的电子传递体系”使化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应的方法，例如提及将来源于植物如菠菜的NADPH，铁氧还蛋白和来源于植物如菠菜的铁氧还蛋白-NADP+还原酶加入上述反应系统的方法。另外，可以将可以从微生物如大肠杆菌中制备、包含对于本发明蛋白质(A)反应体系中的电子传递体系有作用的成分的级分加到所述反应体系中。为了制备该级分，例如在通过离心等从微生物的培养物中收获细胞以后，通过超声处理，DYNOMILL处理，FRENCH PRESS处理等物理破裂或通过使用表面活性剂或细胞裂解酶如溶菌酶化学破裂细胞。从如此获得的产生的裂解物中，通过离心，膜过滤等去除不溶物以制备无细胞提取物。可以将无细胞提取物作为包含对于本发明蛋白质(A)的反应体系中电子传递体系有作用的成分的级分用于交换上述铁氧还蛋白。另外，当可以将电子从电子供体传递到本发明蛋白质(A)的系统存在于该细胞中时，如同其中本发明蛋白质(A)与化合物(I)的反应是在细胞如微生物或植物细胞中进行的情形，可以不重新加入电子传递体系。
作为铁氧还蛋白，例如可以使用来源于微生物的铁氧还蛋白(下文有时共同称为“本发明蛋白质(B)”)，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，浅灰链霉菌ATCC11796，热淡天蓝链霉菌IFO 14273t，黑胡桃链霉菌IFO 13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO13434T，玫瑰变红链霉菌IFO 13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。具体地例如，可以提及选自以下组合的铁氧还蛋白(下文有时称为“本发明蛋白质(B)”)。
<蛋白质组合>
(B1)包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B1)”)；
(B2)包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B2)”)；
(B3)包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B3)”)；
(B4)包含SEQ ID NO：111所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B4)”)；
(B5)包含与SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQID NO：111中任何一个所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的铁氧还蛋白；
(B6)包含与编码SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEO ID NO：111中任何一个所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的铁氧还蛋白；
(B7)包含SEQ ID NO：149所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B7)”)；
(B8)包含SEQ ID NO：150所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B8)”)；
(B9)包含SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B9)”)；
(B10)包含SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B10)”)；
(B11)包含SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的蛋白质(下文有时称为“本发明蛋白质(B11)”)；
(B12)一种铁氧还蛋白，其包含与在SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQ IDNO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251，或SEQ ID NO：253中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：252或SEQID NO：254中表示的氨基酸序列的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(B13)一种铁氧还蛋白，其包含与编码SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：150，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ IDNO：245，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ IDNO：250，SEQ ID NO：251，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253或SEQ IDNO：254所示氨基酸序列的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(B14)包含SEQ ID NO：245所示氨基酸序列的蛋白质；
(B15)包含SEQ ID NO：247所示氨基酸序列的蛋白质；
(B16)包含SEQ ID NO：248所示氨基酸序列的蛋白质；
(B17)包含SEQ ID NO：249所示氨基酸序列的蛋白质；
(B18)包含SEQ ID NO：250所示氨基酸序列的蛋白质；
(B19)包含SEQ ID NO：251所示氨基酸序列的蛋白质；
(B20)包含SEQ ID NO：252所示氨基酸序列的蛋白质；
(B21)包含SEQ ID NO：253所示氨基酸序列的蛋白质；和
(B24)包含SEQ ID NO：254所示氨基酸序列的蛋白质。
按照在Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Current Protocols in Molecular Biology(1987)，John Wiley & Sons公司等中描述的常规遗传工程方法，基于编码在SEQ ID NO：12，13，14，111，149，150，151，152，153，245，247，248，249，250，251，252，253或254中表示的本发明蛋白质(B)的氨基酸序列的核苷酸序列可以获得编码本发明蛋白质(B)的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B)”)。
作为编码本发明蛋白质(B)的DNA(下文有时共同称为“本发明DNA(B)”)，提及
编码包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B1)”)；
编码包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B2)”)；
编码包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B3)”)；
编码包含SEQ ID NO：111所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B4)”)；
编码包含与SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：111中任何一个所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的铁氧还蛋白的DNA；
编码铁氧还蛋白的DNA，所述铁氧还蛋白包含与编码SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQIDNO：14或SEQ ID NO：111中任何一个所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；
编码包含SEQ ID NO：149所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B7)”)；
编码包含SEQ ID NO：150所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B8)”)；
编码包含SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B9)”)；
编码包含SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B10)”)；
编码包含SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(下文有时称为“本发明DNA(B11)”)；
编码铁氧还蛋白的DNA，所述铁氧还蛋白包含与在SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：245，SEQID NO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251，或SEQ ID NO：253中任何一个表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或与在SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：252或SEQID NO：254中任何一个表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
编码铁氧还蛋白的DNA，所述铁氧还蛋白包含与编码SEQ IDNO：149，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：152，SEQ IDNO：153，SEQ ID NO：245，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：248，SEQ IDNO：249，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：251，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：254任一个所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
编码包含SEQ ID NO：245所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：247所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：248所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：249所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：250所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：251所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：252所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；
编码包含SEQ ID NO：253所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；和
编码包含SEQ ID NO：254所示氨基酸序列的蛋白质的DNA。
作为本发明DNA(B)的更具体的实例，可以提及包含SEQ ID NO：15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一个所示核苷酸序列的DNA或包含与SEQ IDNO：15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一个所示核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的DNA。
按照在制备本发明DNA(A)的方法中所述条件，通过实施以包含其核苷酸序列的部分核苷酸序列的DNA作为引物进行PCR的方法或其中将该DNA用作探针的杂交方法可以制备该DNA。
具体地例如，通过使用从暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：105所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：53所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的DNA。
另外，通过使用从塔氏糖多孢菌JCM 9383t制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：106所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：63所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的DNA。
另外，通过使用从砖红色链霉菌ATCC 21469制备的染色体DNA或染色体DNA文库作为模板，和通过使用包含SEQ ID NO：107所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：72所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR可以制备包含编码SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的DNA。
另外，通过以由包含编码SEQ ID NO：12，13，14，111，149，150，151，152或153中任何一个所示氨基酸序列的核苷酸序列的约至少20个核苷酸组成的DNA作为探针，在上述条件下与染色体DNA文库杂交，接着检测和回收与所述探针特异性结合的DNA可以获得本发明DNA(B)。如上所述可以从微生物中制备染色体DNA文库，所述微生物属于链霉菌属，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，热淡天蓝链霉菌IFO14273t，黑胡桃链霉菌IFO 13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO 13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属的微生物，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。作为可以用作该探针的DNA的具体实例，提及包含SEQ ID NO：15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一个所示核苷酸序列的DNA；包含这些核苷酸序列的部分核苷酸序列的DNA；或包含与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA。
为了用宿主细胞表达本发明DNA(B)，例如按照在“Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版(1989)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press；“Current Protocols in Molecular Biology(1987)”，John Wiley & Sons，公司等中所描述的常规遗传工程方法，制备其中本发明DNA(B)和在宿主细胞中起作用的启动子可操作连接的DNA，并导入宿主细胞中。通过从转化体中制备DNA和然后用制备的DNA进行例如在“Molecular Cloning第二版”，Cold Spring Harbor Press(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)中所述的遗传工程分析方法(如证实限制酶位点，DNA测序，DNA杂交，PCR等)，可以证实获得的转化体是否包含本发明DNA(B)。
通过将其中本发明DNA(B)和在宿主细胞中起作用的启动子可操作连接的DNA导入包含本发明DNA(A)的细胞，可以在相同的细胞中表达本发明DNA(B)和本发明DNA(A)。
例如通过培养包含本发明DNA(B)的细胞可以制备本发明蛋白质(B)。作为这种细胞，提及表达本发明DNA(B)和具有产生本发明蛋白质(B)的能力的微生物，如从自然界分离的包含本发明DNA(B)的微生物菌株，通过用试剂或紫外线等处理由所述天然菌株衍生的突变株。例如，提及属于链霉菌的微生物，如暗产色链霉菌，砖红色链霉菌，不产色链霉菌，浅灰链霉菌，热淡天蓝链霉菌，黑胡桃链霉菌，津岛链霉菌，球团产色链霉菌，橄榄产色链霉菌，装饰链霉菌，灰色链霉菌，羊毛链霉菌，三泽链霉菌，苍白色链霉菌，玫瑰变红链霉菌，鲁地链霉菌和斯堡链霉菌，更具体地，暗产色链霉菌IFO 12898，砖红色链霉菌ATCC 21469，不产色链霉菌IFO 12735，浅灰链霉菌ATCC 11796，热淡天蓝链霉菌IFO 14273t，黑胡桃链霉菌IFO 13445，津岛链霉菌IFO 13782，球团产色链霉菌IFO13673t，橄榄产色链霉菌IFO 12444，装饰链霉菌IFO 13069t，灰色链霉菌ATCC 10137，灰色链霉菌IFO 13849T，羊毛链霉菌IFO 12787T，三泽链霉菌IFO 13855T，苍白色链霉菌IFO 13434T，玫瑰变红链霉菌IFO 13682T，鲁地链霉菌IFO 15875T和斯堡链霉菌IFO 13446T，等；或属于糖多孢菌属，如塔氏糖多孢菌，更具体地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。另外，可以提及其中已经导入本发明DNA(B)的转化体。具体地例如，提及其中已将与tac启动子，trc启动子，lac启动子或T7噬菌体启动子可操作连接的本发明DNA(B)导入大肠杆菌的转化体。作为更多的具体实例，提及在下述实施例中描述的大肠杆菌JM109/pKSN657FD，大肠杆菌JM109/pKSN923FD，大肠杆菌JM109/pKSN671FD等。
按照通常用于培养微生物的方法可以培养包含本发明DNA(B)的微生物，更具体地，按照在培养包含本发明DNA(A)的微生物的方法中的上述条件进行。
例如，通过包含本发明DNA(B)的微生物生产的本发明蛋白质(B)可以各种形式在本发明蛋白质(A)的反应体系中使用，如生产本发明蛋白质(B)的微生物的培养物，生产本发明蛋白质(B)的微生物细胞，通过处理该细胞得到的材料，微生物的无细胞提取物，未完全纯化的蛋白质，纯化的蛋白质等。上述通过处理细胞获得的材料包括例如冻干细胞，丙酮干燥细胞，磨碎的细胞，细胞的自溶物，超声处理的细胞，碱处理的细胞，有机溶剂处理的细胞等。备选地，可以按照已知方法如使用吸附在合成聚合物等之上的载体结合法，和使用包含于聚合物网状基质中的包含法可以固定上述各种形式中任何一种的本发明蛋白质(B)，然后用于本发明蛋白质(A)的反应体系。
作为从包含本发明DNA(B)的微生物的培养物中纯化本发明蛋白质(B)的方法，可以使用常规用于纯化蛋白质的方法。例如可以提及下列方法。
首先，通过离心等从微生物的培养物中收获细胞，然后通过超声处理等物理破裂，或通过使用表面活性剂或细胞裂解酶如溶菌酶化学破裂细胞。从如此获得的产生的裂解液中，通过离心，膜过滤等去除不溶物以制备无细胞提取物，其然后通过任何适当的分离和纯化方法，如阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤层析等分级，由此纯化本发明蛋白质(B)。通过用SDS-PAGE分离如此获得的级分，可以进一步纯化本发明蛋白质(B)。
可以证实本发明蛋白质(B)作为铁氧还蛋白的功能是在化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应的反应体系中作为从铁氧还蛋白-NADP+还原酶到本发明蛋白质(A)的电子转运蛋白的功能。具体地例如，通过加入本发明蛋白质(B)和NADPH，铁氧还蛋白-NADP+还原酶和本发明蛋白质(A)于化合物(I)与本发明蛋白质(A)反应的反应体系中，接着检测化合物(II)向化合物(III)的转化可以证实。
在本发明控制杂草的方法中，将化合物(I)施用于表达本发明蛋白质(A)的植物的栽培区域。该植物可以表达本发明蛋白质(A)的一个变体或可以表达本发明蛋白质(A)的多个变体。作为本发明蛋白质(A)，例如，可以提及本发明蛋白质(A)。作为已经导入本发明DNA(A)的转基因植物可以获得表达本发明蛋白质(A)的植物。该导入包括以上述方式将本发明DNA(A)导入植物细胞以使DNA处于能使它表达的位置，接着从获得的转化细胞再生植物。导入植物细胞的本发明DNA(A)可以在其上游连接编码向胞内细胞器的转运信号的核苷酸序列，以使可读框在框内。
其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的植物在它的细胞内将化合物(I)代谢成低除草活性的化合物。结果，降低植物中来自除草化合物的植物损伤和赋予对所述化合物的抗性。因此，其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的植物即使在将化合物(I)施用于其栽培区域的情形中也可以生长良好。通过栽培所述植物和施用上述除草组合物于栽培区域可以有效去除除了其中已经导入本发明DNA(A)和表达本发明蛋白质(A)的植物以外的杂草。可以改善上述植物的产率，改善品质，减小所用除草剂的量和节省劳动。
通过将表达编码本发明蛋白质(A)的基因的细胞与所述化合物或所述除草组合物接触和评估对细胞的损伤程度，可以进行表达本发明蛋白质(A)的细胞对式(I)化合物或包含所述化合物的除草组合物的抗性评估。
具体地，为了评估表达本发明蛋白质(A)的微生物细胞对化合物(I)或包含化合物(I)的除草组合物的抗性，可以制备表达植物PPO和本发明蛋白质(A)的转化的大肠杆菌。该制备包括另外将本发明DNA(A)导入例如可以用来评估PPO活性抑制和已经在日本专利申请11-102534中描述的转化的大肠杆菌，更具体地其中将美国专利号5939602等所述的植物PPO基因有效地导入大肠杆菌BT3菌株和表达PPO基因的转化的大肠杆菌。如F.Yamamoto，H.Inokuti，H.Ozaki，(1988)Japanese Journal ofGenetics，63卷，第237-249页所述，大肠杆菌BT3菌株在PPO基因中有缺陷和没有增殖能力。通过在包含0-1.0ppm的化合物(I)或含所述化合物的除草组合物的液体培养基中在37℃下振荡培养产生的转化大肠杆菌约18-24小时和用600nm的光密度测量所述转化的大肠杆菌的增殖可以评估对化合物或除草组合物的抗性。作为本发明蛋白质(A)，例如可以提及本发明蛋白质(A)。
作为评估表达本发明蛋白质(A)的植物对式(I)化合物或包含所述化合物的除草组合物的抗性程度的方法，提及将除草组合物施用于植物和测量植物生长程度的方法。为了更定量的证实，例如首先将植物的几片叶子浸到包含各种浓度的化合物(I)的水溶液中，或者将化合物(I)的水溶液喷洒在植物的数片叶子上，接着在室温下在光线中放置于琼脂培养基上。在数天后，按照Mackenney，G.，J.Biol.Chem.，140；第315页(1941)所述方法从植物叶子中提取叶绿素以测定叶绿素的含量。具体地例如，采取植物的叶子并沿着主叶脉等分成2片。将除草组合物散布在叶片之一的整个表面上。另一叶片留下未处理。将这些叶片放在包含0.8％琼脂的MS培养基上并在室温在光线中放置7天。然后，用杵和研钵在5ml80％丙酮水溶液中研磨每个叶片以提取叶绿素。用80％丙酮水溶液稀释提取液10倍和按照Mackenney，G.，J.Biol.Chem.，140；第315页(1941)所述方法在750nm，663nm和645nm下测量吸光度以计算总叶绿素含量。通过显示处理的叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的总叶绿素含量的百分点可以比较评估对化合物(I)的抗性的程度。作为本发明蛋白质(A)，例如，可以提及本发明蛋白质(A)。
基于评估对化合物(I)或包含化合物(I)的除草组合物的抗性程度的上述方法，可以选择显示对化合物(I)或包含化合物(I)的除草组合物的抗性的植物或植物细胞。例如，选择从将化合物(I)或包含该化合物的除草组合物喷洒到植物栽培区域中未看到损伤的植物，或通过在化合物(I)的存在下培养仍连续生长的植物细胞。具体地例如，将土壤装填到具有例如10cm直径和10cm深度的塑料盆中。播种植物的种子并在温室中培养。通过混合5份包含化合物(I)的除草组合物，6份苏乳播(sorpol)3005X(Toho化学品)和89份二甲苯制备乳剂。用包含0.1％(v/v)粘着剂的水以1公顷1000L的比例稀释特定量的乳剂并用喷枪均匀地散布在来自上面在上述盆中培养的植物的叶子的所有面上。在温室中培养植物16天后，研究对植物的损伤。可以选择其中未观察到损伤的植物或其中损伤减轻的植物。进一步，通过交配这些选择的植物可以获得后代植物。
实施例
使用以下实施例更详细地解释本发明，但本发明不限于这些实施例。
在以下所示条件下进行实施例1，41和42中含量分析的HPLC和化合物的分级纯化。
(HPLC分析条件1)
柱：          SUMIPAX ODS211(Sumika Chemical Analysis Service)
柱温：        35℃
流速：        1ml/分钟
检测波长：    UV 254nm
洗脱剂A：     0.01％TFA水溶液
洗脱剂B：     乙腈
洗脱条件：    将样品注射到用90％洗脱剂A和10％洗脱剂B的溶剂混合物平衡的柱中。然后流动90％洗脱剂A和10％洗脱剂B的溶剂混合物5分钟。这接着流动洗脱剂A和洗脱剂B的溶剂混合物20分钟，同时将洗脱剂B的比例从10％增加到90％。然后流动10％洗脱剂A和90％洗脱剂B的溶剂混合物8分钟。
实施例1 通过微生物的化合物(II)的代谢
(1)化合物(II)的代谢
在ISP2琼脂培养基(1.0％(w/v)麦芽汁，0.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)葡萄糖，2.0％(w/v)琼脂，pH7.3)中培养表1和2所示的各种微生物。将菌环量的每种微生物加入TGY培养基(0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)葡萄糖，0.01％(w/v)KH2PO4，pH7.0)并在30℃下振荡温育2-4天。将十分之一毫升(0.1ml)获得的培养物在包含100ppm化合物(II)的3ml孢子形成肉汤(0.1％(w/v)肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示1％葡萄糖，pH7.1)中在30℃下振荡温育7-8天。将五十微升(50μl)2N HCl加入产生的培养物中并用3ml乙酸乙酯提取它。在HPLC上分析获得的乙酸乙酯层。减小化合物(II)的浓度(23.9分钟的柱保留时间)，在21.6分钟和22.2分钟的保留时间检测到化合物的新峰(各自称为代谢物(I)和代谢物(II))。结果在表1和2中显示。
表1
 
微生物菌株 化合物(II)的浓度(ppm) 代谢物(I)的峰面积(x10<sup>4</sup>) 代谢物(II)的峰面积(x10<sup>4</sup>)
可可链霉菌阿苏亚种(Streptomycescacaoiasoensis)IFO 13813         77.8 3.43 3.57
灰褐链霉菌IFO 12870t 49.5 7.96 9.86
装饰链霉菌IFO 13069t 65.3 4.30 5.00
热淡天蓝链霉菌IFO 14273t 51.7 7.47 9.16
玫瑰产色链霉菌(Streptomycesroseochromogenes)ATCC 13400 81.9 0.71 0.82
淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)ATCC 11924       89.6 1.02 1.50
灰色链霉菌ATCC 10137 65.6 6.19 1.30
灰色链霉菌ATCC 11429 30.3 12.8 15.6
灰色链霉菌ATCC 12475 51.1 0.52 2.27
灰色链霉菌ATCC 15395 75.2 1.91 2.26
红色糖多孢菌(Streptomyceserythreus)ATCC 11635      54.6 4.94 6.05
疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)IFO 3111                           88.3 3.28 4.40
灰色链霉菌IFO 3102 22.6 14.4 18.5
小串链霉菌(Streptomyces caternulae)IFO 12848                          85.3 3.81 1.59
春日链霉菌(Streptomyceskasugaensis)ATCC 15714  92.4 1.08 0.91
龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)ATCC 10970                      70.9 2.30 2.87
不产色链霉菌IFO 12735 0.0 15.9 21.8
利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)IFO 13058                        62.0 5.48 6.69
表2
 
微生物菌株 化合物(II)的浓度(ppm) 代谢物(I)的峰面积(x10<sup>4</sup>) 代谢物(II)的峰面积(x10<sup>4</sup>)
暗产色链霉菌IFO 12898 46.4 8.28 10.5
阿富汗链霉菌(Streptomycesafghaniensis)IFO 12831     80.6 2.54 3.59
八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)IFO 12782     83.9 4.99 2.91
银样链霉菌丰中变种(Streptomycesargenteolus var.toyonakensis)ATCC21468                           13.0 14.9 19.2
砖红色链霉菌ATCC 21469 18.4 11.6 14.4
浅绛红链霉菌(Streptomycespurpurascens)ATCC 25489   70.9 5.37 6.11
灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)ATCC 14511 53.9 3.00 3.97
春日链霉菌IFO 13851 66.3 12.1 12.6
银样链霉菌丰中变种ATCC 21468t 90.1 2.75 3.01
玫瑰产色链霉菌ATCC 13400t 71.8 4.66 4.00
黑胡桃链霉菌IFO 13445 12.8 21.9 24.9
Streptomyces rosechromogenusATCC 21895                  74.2 4.14 5.87
粪生链霉菌(Streptomycesfimicarius)ATCC 21900   46.5 8.33 11.3
教酒链霉菌(Streptomyceschartreusis)ATCC 21901  61.1 3.70 3.94
球孢链霉菌球孢亚种(Streptomycesglobisporus subsp.globisporus)ATCC21903                           79.9 2.86 2.52
浅灰链霉菌ATCC 11796 0 14.4 19.9
 
塔氏糖多孢菌JCM 9383T 82.9 5.83 7.71
链霉菌属物种SANK 62585 54.6 2.30 3.44
(2)代谢物(I)和代谢物(II)的结构测定
将灰色链霉菌ATCC 11429的冷冻原种加入3ml微生物培养基(0.7％(w/v)聚胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1.0％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)K2HPO4，pH7.2)并在试管中振荡温育过夜以获得预培养物。将该预培养物加入包含100ppm浓度的化合物(II)的300ml微生物培养基中。将这以每管3ml分到100个小试管中，并在30℃下振荡温育6天。在通过加入HCl将250ml的该培养物调节至pH2以后，用250ml乙酸乙酯萃取它。从乙酸乙酯层中去除溶剂。将残余物溶解于3ml丙酮中并点至TLC硅胶板上(TLC硅胶板60F254，20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)。用甲苯，甲酸和甲酸乙酯的5:7:1(v/v/v)混合物展开TLC板。取Rf值为0.58左右的硅胶。用丙酮萃取TLC板的该内容物。从萃取层中去除丙酮。将残余物溶解于10ml乙腈中和用HPLC分级分离。回收仅包含代谢物(I)和代谢物(II)的级分以获得3.7mg代谢物(下文称为“代谢物A”)。
进行代谢物A的质谱分析。代谢物A具有比化合物(II)小14的质量。另外，从H-NMR分析，确定代谢物(A)是具有式(III)所示结构的化合物。
(3)化合物(III)的除草活性测试
将土壤装填到具有10cm直径和10cm深度的圆塑料盆中。在温室中播种和培养稗，大穗看麦娘，Ivyleaf morningglory 10天。将五(5)份测试化合物，6份苏乳播3005X(Toho化学品公司)和89份二甲苯充分混合以产生乳剂。用包含0.1％(v/v)粘着剂的水以1公顷1000L的比例稀释特定量的乳剂并用喷枪均匀地散布在来自上面在上述盆中培养的植物的叶子的所有面上。在温室中培养植物16天后，研究测试化合物的除草活性。结果在表3中表示。
表3
Figure C02825642D01061
将土壤装填到具有10cm直径和10cm深度的圆塑料盆中。播种稗，大穗看麦娘，Ivyleaf momingglory。将五(5)份测试化合物，6份苏乳播3005X(Toho化学品公司)和89份二甲苯充分混合以产生乳剂。用包含0.1％(v/v)粘着剂的水以1公顷1000L的比例稀释特定量的乳剂并用喷枪均匀地散布在土壤的表面上。在温室中培养植物19天后，研究除草活性。结果在表4中表示。
表4
在上面表3和4中，将除草活性的强度逐步表示为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，和10。数字“0”表示其中用于测试的植物检查时萌芽或生长与未处理施用比较并显示完全或基本上没有差异的情形。数字“10”表示其中植物完全枯萎或者萌芽或生长完全被抑制的情形。
实施例2 本发明蛋白质(A1)的制备
(1)细胞粗提物的制备
将暗产色链霉菌IFO 12898的冷冻原种加入500ml三角烧瓶中的100ml A培养基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，pH7.0)并在30℃下旋转振荡温育1天以获得预培养物。将八毫升(8ml)预培养物加入200ml A培养基中并在30℃下在500ml带挡板的摇瓶中旋转振荡温育2天。通过将产生的培养物离心(3,000g，5分钟)回收细胞沉淀。将这些细胞沉淀悬浮在包含100ppm化合物(II)的100ml B培养基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口烧瓶中往复振荡温育16小时。通过将10L产生的培养物离心(3,000g，5分钟)回收细胞沉淀。用1L 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤产生的细胞沉淀2次以提供162g细胞沉淀。
以1g细胞沉淀2ml将这些细胞沉淀悬浮在0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，向其中加入1mM PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA和1mM二硫垂陶耳(dithiotritol)。通过用弗氏压碎器(1000kg/cm2)(OhtakeSeisakusho)反复破裂细胞2次获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(40,000xg，30分钟)以后，回收上清液并在150,000xg下离心1小时以回收上清液(以下称为“细胞粗提物”)。
(2)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的测定
制备0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)的30μl反应液，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下称为“组分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例2(1)中回收的细胞粗提物。将反应溶液保持在30℃下1小时。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表5中显示。
表5
Figure C02825642D01081
(3)细胞粗提物的分级分离
将硫酸铵加入在实施例2(1)中获得的细胞粗提物至45％饱和的量。在冰冷却的条件下搅拌后，通过在12,000x g下离心10分钟回收上清液。在将硫酸铵加入到获得的上清液至55％饱和的量和在冰冷却的条件下搅拌以后，通过在12,000x g下离心10分钟回收沉淀。用27.5ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)溶解沉淀。将该溶液进行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)洗脱以回收38.5ml包含蛋白质的级分(以下称为“45-55％硫酸铵级分”)。
(4)本发明蛋白质(A1)的分离
将在实施例2(3)中制备的45-55％硫酸铵级分注射到HiLoad 26/10QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下来，在106ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)流进柱子以后，以NaCl线性梯度(NaCl的梯度是0.001415M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.375M，流速为3ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.21M-0.22M的NaCl浓度下洗脱的25ml级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
将回收的级分进行PD10柱(Amersham Phamacia Biotech Company)，用缓冲液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0)洗脱，以便回收包含蛋白质的级分。接下来，将级分注射于Bio-Scale Ceramic羟磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。将三十毫升(30ml)缓冲液A流进柱子。随后，缓冲液A和线性梯度的缓冲液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸钾缓冲液；线性梯度从100％缓冲液A开始在100分钟期间增加至50％缓冲液B，流速为2ml/分钟)一起流动以分级回收在17％-20％的缓冲液B的浓度下洗脱的级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
使用超滤膜(Microcon YM-30，Millipore Company)将回收的级分浓缩20倍并注射到HiLoad 16/60Superdex 75pg柱(Amersham PharmaciaBiotech Company)中。包含0.15M NaCl(pH7.0)的五十毫摩尔(50mM)磷酸钾缓冲液流进(流速1ml/分钟)柱子。以每个2ml将洗脱物分级。将在56ml-66ml的洗脱体积下洗脱的级分各自分级回收。用10％-20％SDS-PAGE分析在每个级分中包含的蛋白质。
类似于实施例2(2)，在组分A，组分B，组分C和用14C标记的组合物(II)的存在下，加入和保持回收的级分而不是在实施例2(2)所述反应溶液中的细胞粗提物。将保持以后的反应溶液TLC分析以检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的强度。观察到在上述SDS-PAGE中移动至47kDa位置的蛋白质在依次加入的级分条带的浓度方面具有平行于对应于化合物(III)的斑点的强度波动的波动。从SDS-PAGE凝胶中回收所述蛋白质并用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Company，Procise494HT，脉冲液相方法)进行氨基酸序列分析。结果，提供在SEQ ID NO：18中表示的氨基酸序列。另外，在用胰蛋白酶消化上述蛋白质以后，在质谱仪(ThermoQuest Company，离子阱质谱仪LCQ，柱：LC PackingsCompany PepMap C18 75μm x 150mm，溶剂A：0.1％HOAc-H2O，溶剂B：0.1％HOAc-甲醇，梯度：从用95％溶剂A和5％溶剂B的混合物洗脱开始在30分钟内增加到100％溶剂B的浓度的线性梯度，流速：0.2μl/分钟)上分析获得的消化物。结果，提供在SEQ ID NO：19中表示的氨基酸序列。
实施例3 获得本发明DNA(A1)
(1)暗产色链霉菌IFO 12898的染色体DNA的制备
在50mlYEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将暗产色链霉菌IFO 12898在30℃下振荡温育1天至3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡温育1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚，氯仿和异戊醇的混合物萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿和异戊醇的混合物萃取一次以回收水层。通过从水层中乙醇沉淀获得染色体DNA。
(2)暗产色链霉菌IFO 12898的染色体DNA文库的制备
用1单位限制酶Sau3AI在37℃下消化在实施例3(1)中制备的九百四十三纳克(943ng)染色体DNA60分钟。用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离获得的消化液。从凝胶中回收约2.0kbp的DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用Prep-A-GeneR DNA纯化试剂盒(Bio-Rad公司)纯化DNA以获得10μl包含目标DNA的溶液。将一微升(1μl)DNA溶液，98ng用限制酶BmHI消化和用去磷酸化处理的质粒载体pUC118和11μl来自连接试剂盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下温育过夜。使用5μl连接溶液转化大肠杆菌DH5α。将大肠杆菌在30℃下振荡培养过夜。从获得的培养基中，回收大肠杆菌。提取质粒以提供染色体DNA文库。
(3)本发明DNA(A1)的分离
通过将在实施例3(1)中制备的染色体DNA用作模板进行PCR(图1)。作为引物，使用具有SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对1”)。基于编码SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的核苷酸序列设计SEQ IDNO：35所示核苷酸序列。另外，基于与编码SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列设计SEQ ID NO：36所示核苷酸序列。通过加入2种每种总计200nM的引物，250ng上述染色体DNA，0.5μldNTP混合物(4种dNTP每种10mM的混合物；Clontech公司)，5μl 5xGC基因组PCR反应缓冲液(Clontech公司)，1.1μl25mMMg(OAc)2，5μl 5MGC-Melt(Clontech公司)和0.5μl Advantage-GC基因组聚合酶混合物(Clontech公司)和蒸馏水，PCR反应溶液总计25μl。PCR的反应条件是在保持在95℃1分钟后，重复30个循环，一个循环包括保持在94℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟，然后保持在72℃ 5分钟。在保持后，将反应溶液进行4％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约150bp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(AppliedBiosystems日本公司)作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：9中表示的核苷酸序列的核苷酸36至132所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列编码在SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的氨基酸12至23中表示的氨基酸序列。在这点上，期望所述DNA编码本发明蛋白质(A1)的一部分。
接下来，类似上面用Advantage-GC基因组聚合酶混合物(Clontech公司)和通过将在实施例3(2)中制备的染色体DNA用作模板进行PCR。使用具有SEQ ID NO：37所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对2”)或具有SEQID NO：39所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对3”)作为引物。
接下来，通过PCR扩增具有其中3’末端延伸过SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核苷酸132所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。通过将使用引物对2获得的反应溶液作为模板溶液和通过使用具有SEQ ID NO：41所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对4”)作为引物进行PCR。类似地，通过PCR扩增具有其中5’末端延伸过SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核苷酸36所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。通过将使用引物对3获得的反应溶液作为模板溶液和通过使用具有SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对5”)作为引物进行PCR。类似于上面，将使用引物对4扩增的2kb DNA和使用引物对5扩增的150bp DNA克隆到TA克隆载体pCR2.1中。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)和SEQ ID NO：43-50所示寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。作为将通过使用引物对4扩增的2kbp DNA的核苷酸序列测序的结果，提供在SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核苷酸133至1439中所表示的核苷酸序列。另外，作为将通过使用引物对5扩增的150bp DNA的核苷酸序列测序的结果，提供在SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核苷酸1至35中所表示的核苷酸序列。作为连接获得的核苷酸序列的结果，获得在SEQ ID NO：9中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1227个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码408个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)以及由201个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码66个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。由SEQ ID NO：6所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)组成的蛋白质的分子量据计算为45213Da。另外，由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列包含从本发明蛋白质(A1)的N末端氨基酸测序测定的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)和用质谱分析从胰蛋白酶消化片段的氨基酸测序测定的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。由SEQID NO：15所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)组成的蛋白质的分子量据计算为6818Da。
实施例4 本发明蛋白质(A1)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明蛋白质(A1)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例3(1)中从暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA用作模板和通过使用Expand High Fidelity PCR System(RocheMolecular Biochemicals Company)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ IDNO：51所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：52所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对19”)或具有SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：53所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对20”)。通过加入2种每种总计300nM的引物，50ng上述染色体DNA，5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，5.0μl 10x Expand HF缓冲液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后；重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 2分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着68℃ 30秒，接着72℃ 2分钟(其中每个循环增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分钟。在保持后，将反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。从经历使用引物对19的反应溶液的凝胶中回收包含约1.2kbp的DNA的凝胶区域。从经历使用引物对20的反应溶液的凝胶中回收包含约1.5kbp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用作为引物的-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO：43所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：46所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将含有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的质粒命名为pCR657和将含有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的质粒命名为pCR657F。
另外，将具有SEQ ID NO：134所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQID NO：135所示核苷酸序列的寡核苷酸一起退火以提供接头(图47)。用HindIII和XmnI消化质粒pKSN24R2(Akiyoshi-ShibaTa M.等，Eur.J.Biochem.224：P335(1994))。将接头插入获得的约3kb的DNA。将获得的质粒命名为pKSN2(图4)。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR657和pCR657F中的每一个。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从进行pCR657消化产物的凝胶中切割包含约1.2kbp DNA的凝胶区域。从进行pCR657F消化产物的凝胶中切割包含约1.5kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所示试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的每种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A1)的约1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN657。另外，将其中编码本发明蛋白质(A1)的约1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN657F。将上述质粒pKSN657和pKSN657F中的每一个导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体分别命名为JM109/pKSN657和JM109/pKSN657F。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A1)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN657，JM109/pKSN657F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养物转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100rml TB培养基中并在26℃下培养。当OD660到达约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养17小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1Mtris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mMPMSF的上述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量为3，占空因数(dutycycle)30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson Sonic Power Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN657中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN657提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN657F中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN657F提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用考马斯蓝(以下称为“CBB”)染色。结果，在大肠杆菌pKSN657提取物和大肠杆菌pKSN657F提取物中都检测到比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，其位于对应于47kDa分子量的电泳位置。在大肠杆菌pKSN657F提取物中检测到比大肠杆菌pKSN657提取物更强烈的条带。显示大肠杆菌JM109/pKSN657F比大肠杆菌JM109/pKSN657更高程度地表达本发明蛋白质(A1)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下1小时。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，0.2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例4(2)中回收的上清液级分。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μ1乙酸乙酯加入和搅拌到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(FujiFilm Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表6中显示。
表6
Figure C02825642D01161
Figure C02825642D01171
实施例5 本发明蛋白质(A2)的制备
(1)细胞粗提物的制备
将塔氏糖多孢菌JCM9383t的冷冻原种加入10ml试管中的10ml A培养基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，pH 7.0)并在30℃下振荡温育1天以获得预培养物。将八毫升(8ml)预培养物加入200ml A培养基中并在30℃下在500ml带挡板的摇瓶中旋转培养2天。通过将10L产生的培养物离心(3,000g，10分钟)回收细胞沉淀。将这些细胞沉淀悬浮在包含100ppm化合物(II)的100ml B培养基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口烧瓶中往复振荡温育20小时。通过将10L产生的培养物离心(3,000xg，10分钟)回收细胞沉淀。用1L0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤产生的细胞沉淀2次以提供119g细胞沉淀。
以1g细胞沉淀2ml将这些细胞沉淀悬浮在0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。加入一毫摩尔(1mM)PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽和1mM二硫垂陶耳。通过用弗氏压碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反复破裂混悬液2次获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(40,000xg，30分钟)以后，回收上清液并在150,000xg下离心1小时以回收上清液(以下称为“细胞粗提物”)。
(2)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的测定
制备0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)的30μl反应溶液，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下称为“组分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例5(1)中回收的细胞粗提物。将反应体系保持在30℃下1小时。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表7中显示。
表7
Figure C02825642D01181
(3)细胞粗提物的分级分离
将硫酸铵加入在实施例5(1)中获得的细胞粗提物至45％饱和的量。在冰冷却的条件下搅拌，通过在12,000xg下离心10分钟回收上清液。在将硫酸铵加入获得的上清液至55％饱和的量和在冰冷却的条件下搅拌以后，通过在12,000xg下离心10分钟回收沉淀。用32.5ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)溶解沉淀。将该溶液进行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)洗脱以回收45.5ml包含蛋白质的级分(以下称为“45-55％硫酸铵级分”)。
(4)本发明蛋白质(A2)的分离
将在实施例5(3)中制备的45-55％硫酸铵级分注射到HiLoad26/10QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下来，在100ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)流进柱子以后，以NaCl线性梯度(NaCl的梯度是0.004M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.5M，流速为8ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.25M-0.26M的NaCl浓度下洗脱的30ml级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用缓冲液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)洗脱，以便回收包含蛋白质的级分。接下来，将级分注射于Bio-Scale Ceramic羟磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。将二十毫升(20ml)缓冲液A流进柱子。随后，缓冲液A和线性梯度的缓冲液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸钾缓冲液；线性梯度从100％缓冲液A开始在100分钟期间增加至50％缓冲液B，流速为2ml/分钟)一起流动以分级回10ml收在23％-25％的缓冲液B的浓度下洗脱的级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
使用超滤膜(Microcon YM-30，Millipore Company)将回收的级分浓缩至约770μl并注射到HiLoad 16/60 Superdex 75pg柱(AmershamPharmacia Biotech Company)中。包含0.15M NaCl(pH 7.0)的五十毫摩尔(50mM)磷酸钾缓冲液流进(流速1ml/分钟)柱子。以每个2ml将洗脱液分级。将在61ml左右的洗脱体积下洗脱的级分各自分级回收。用10％-20％SDS-PAGE分析在每个级分中包含的蛋白质。
类似于实施例5(2)，在组分A，组分B，组分C和用14C标记的化合物(II)的存在下，加入和保持回收的级分而不是在实施例5(2)所述反应溶液中的细胞粗提物。将保持以后的反应溶液TLC分析以检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的强度。观察到在上述SDS-PAGE中移动至47kDa位置的蛋白质在依次加入的级分条带的浓度方面具有平行于对应于化合物(III)的斑点的强度波动的波动。从SDS-PAGE凝胶中回收所述蛋白质并用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Company，Procise494HT，脉冲液相方法)进行氨基酸序列分析以测序N末端氨基酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：20中表示的氨基酸序列。另外，在用胰蛋白酶消化上述蛋白质以后，在质谱仪(ThermoQuest Company，离子阱质谱仪LCQ，柱：LC Packings Company PepMap C18 75μm x 150mm，溶剂A：0.1％HOAc-H2O，溶剂B：0.1％HOAc-甲醇，梯度：从用95％溶剂A和5％溶剂B的混合物洗脱开始在30分钟内增加到100％溶剂B的浓度的线性梯度，流速：0.2μl/分钟)上分析获得的消化物。结果，提供在SEQ IDNO：21中表示的氨基酸序列。
实施例6 获得本发明DNA(A2)
(1)塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色体DNA的制备
在50mlYEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将塔氏糖多孢菌JCM 9383t在30℃下振荡温育1天至3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mMEDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞沉淀1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mMNaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡温育1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚·氯仿·异戊醇萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿·异戊醇萃取一次以回收水层。通过乙醇沉淀水层获得染色体DNA。
(2)塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色体DNA文库的制备
用0.78U限制酶Sau3AI在37℃下消化在实施例5(1)中制备的十九微克(19μg)染色体DNA 60分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳分离获得的消化液。从凝胶中回收约2.0kbp的DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)纯化DNA并用乙醇沉淀浓缩以获得10μl包含目标DNA的溶液。将八微升(8μl)DNA溶液，100ng用限制酶BamHI消化和用去磷酸化处理的质粒载体pUC118和12μl来自连接试剂盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下保持3小时。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α。将大肠杆菌转化体在37℃下在包含50mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜。从琼脂培养基中回收获得的菌落。提取质粒并称为染色体DNA文库。
(3)本发明DNA(A2)的分离
通过将在实施例6(1)中制备的染色体DNA用作模板用Expand HiFiPCR系统(Boehringer Manheim Company)进行PCR(图2)。作为引物，使用具有SEQ ID NO：54所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：55所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对6”)。基于编码SEQ ID NO：20所示N末端氨基酸序列的核苷酸序列设计SEQ ID NO：54所示核苷酸序列。另外，基于与编码SEQ ID NO：21所示内部氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列设计SEQ ID NO：55所示核苷酸序列。通过加入300ng上述染色体DNA，2种每种总计7.5pmol的引物，0.2μldNTP混合物(4种dNTP每种2mM的混合物)，2.5μl 10x缓冲液(包含MgCl2)，0.19μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计25μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后，重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 1分钟(其中每个循环增加保持在72℃下20秒)；然后保持在72℃ 7分钟。在保持后，将反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约800bp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(AppliedBiosystems日本公司)进行测序反应。用DNA测序仪373A(AppliedBiosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：10中表示的核苷酸序列的核苷酸36至819所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核苷酸37-60编码部分SEQ ID NO：20所示氨基酸序列。在这点上，期望所述DNA编码本发明蛋白质(A2)的一部分。
接下来，通过将在实施例6(2)中制备的染色体DNA用作模板和类似上面用Expand HiFi PCR系统进行PCR。使用具有SEQ ID NO：56所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对7”)作为引物。通过使用这些引物进行PCR，扩增具有其中5’末端延伸过SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核苷酸36所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。另外，使用具有SEQ ID NO：58所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：59所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对8”)作为引物。通过使用这些引物进行PCR，扩增具有其中3’末端延伸过SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核苷酸819所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。将使用引物对7扩增的1.3kb DNA和使用引物对8扩增的0.4kb DNA每个克隆到TA克隆载体pCRII-TOPO中。使用Qiagen Tip 20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)和SEQ ID NO：60所示寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。作为将通过使用引物对7扩增的1.3kb DNA的核苷酸序列测序的结果，提供在SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核苷酸1至35中所表示的核苷酸序列。另外，作为将通过使用引物对8扩增的0.4kb DNA的核苷酸序列测序的结果，提供在SEQ IDNO：10所示核苷酸序列的核苷酸819至1415中所表示的核苷酸序列。作为连接获得的核苷酸序列的结果，获得在SEQ ID NO：10中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1206个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码401个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)以及由198个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码65个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。由SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)组成的蛋白质的分子量据计算为43983Da。另外，由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列包含从本发明蛋白质(A2)的N末端氨基酸测序测定的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)和用质谱分析从胰蛋白酶消化片段的氨基酸测序测定的氨基酸序列(SEQ IDNO：21)。由SEQ ID NO：16所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：13)组成的蛋白质的分子量据计算为6707Da。
实施例7 本发明蛋白质(A1)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明蛋白质(A2)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例6(1)中从塔氏糖多孢菌JCM 9383t制备的染色体DNA用作模板和通过使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：61所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：62所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对21”)或具有SEQ ID NO：61所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：63所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对22”)。通过加入2种每种总计300nM的引物，50ng上述染色体DNA，5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，5.0μl10xExpandHF缓冲液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后；重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟(其中每个循环增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分钟。在保持后，将反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。从经历利用引物对21的反应溶液的凝胶中回收包含约1.2kbp的DNA的凝胶区域。从经历利用引物对22的反应溶液的凝胶中回收包含约1.4kbp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiagen Tip 20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。接着，按照所述试剂盒附带的说明书，使用作为引物的-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO：56所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：64所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的质粒命名为pCR923和将具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的质粒命名为pCR923F。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化质粒pCR923和pCR923F中的每一个。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从进行pCR923消化产物的凝胶中切割包含约1.2kbp DNA的凝胶区域。从进行pCR923F消化产物的凝胶中切割包含约1.4kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara ShuzoCompany)连接用NdeI和HindIII消化的每种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A2)的约1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN923。另外，将其中编码本发明蛋白质(A2)的约1.4kbpDNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN923F。将上述质粒pKSN923和pKSN923F中的每一个导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体分别命名为JM109/pKSN923和JM109/pKSN923F。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A2)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN657，JM109/pKSN657F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养物转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。当OD660到达约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养17小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1Mtris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mM PMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量为3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN923中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN923提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN923F中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN923F提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用CBB染色。结果，在大肠杆菌pKSN923提取物和大肠杆菌pKSN923F提取物中都检测到比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，其位于对应于47kDa分子量的电泳位置。证实大肠杆菌JM109/pKSN923和大肠杆菌JM109/pKSN923F表达本发明蛋白质(A2)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，0.2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例7(2)中回收的上清液级分。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cmx 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表8中显示。
表8
实施例8 本发明蛋白质(A10)的制备
(1)细胞粗提物的制备
将浅灰链霉菌ATCC 11796的冷冻原种加入500ml带挡板烧瓶中的250ml B培养基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％(w/v)牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)并在30℃下旋转振荡温育3天以获得预培养物。将四十毫升(40ml)预培养物加入400ml B培养基中并在30℃下在1L三角烧瓶中旋转振荡温育24小时。在停止培养后，让培养物沉降。去除仅二百二十毫升(220ml)上清液。将类似制备的二百二十毫升(220ml)新鲜培养基加入剩余的220ml培养基以总计440ml。向其中加入化合物(II)至100ppm的量。在30℃下在1L三角烧瓶中旋转振荡温育细胞40小时。通过将2.6L产生的培养物离心(3,000g，5分钟)回收细胞沉淀。用1L 0.1MPIPES-NaOH缓冲液(pH6.8)洗涤产生的细胞沉淀以提供26g细胞沉淀。
以1g细胞沉淀3ml将这些细胞沉淀悬浮在0.1M PIPES-NaOH缓冲液(pH6.8)中，加入1mM PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mMEDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽A和1mM二硫垂陶耳。通过用弗氏压碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反复破裂混悬液2次获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(40,000xg，30分钟)以后，回收上清液并在150,000xg下离心1小时以回收上清液(以下称为“细胞粗提物”)。
(2)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的测定
制备0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)的30μl反应溶液，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下称为“组分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例8(1)中回收的细胞粗提物。将反应溶液保持在30℃下1小时。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和搅拌到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(FujiFilm Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表9中显示。
表9
Figure C02825642D01281
(3)细胞粗提物的分级分离
将硫酸铵加入在实施例8(1)中获得的细胞粗提物至45％饱和的量。在冰冷却的条件下搅拌，通过在12,000xg下离心10分钟回收上清液。在将硫酸铵加入获得的上清液至55％饱和的量和在冰冷却的条件下搅拌以后，通过在12,000xg下离心10分钟回收沉淀。用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)溶解沉淀至10ml的量。将该溶液进行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)洗脱以回收14ml包含蛋白质的级分(以下称为“45-55％硫酸铵级分”)。
(4)本发明蛋白质(A10)的分离
将在实施例8(3)中制备的45-55％硫酸铵级分注射到MonoQHR 10/10柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下来，在16ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)流进柱子以后，与线性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.00625M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.5M，流速为4ml/分钟)一起流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.28M-0.31M的NaCl浓度下洗脱的15ml级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用缓冲液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)洗脱，以便回收包含蛋白质的级分。接下来，将级分注射于Bio-Scale Ceramic羟磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。将五十毫升(50ml)缓冲液A流进柱子。随后，缓冲液A和线性梯度的缓冲液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸钾缓冲液；线性梯度从100％缓冲液A开始在40分钟期间增加至50％缓冲液B，流速为5ml/分钟)一起流动以分级回收在16％-31％的缓冲液B的浓度下洗脱的级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。在10％-20％SDS-PAGE上分析包含在每个级分中的蛋白质。
类似于实施例8(2)，在组分A，组分B，组分C和用14C标记的组合物(II)的存在下，加入和保持回收的级分而不是在实施例8(2)所述反应溶液中的细胞粗提物。将保持以后的反应溶液TLC分析以检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的强度。观察到在上述SDS-PAGE中移动至47kDa位置的蛋白质在依次加入的级分条带的浓度方面具有平行于对应于化合物(III)的斑点的强度波动的波动。从SDS-PAGE凝胶中回收所述蛋白质和用胰蛋白酶消化。在质谱仪(ThermoQuest Company，离子阱质谱仪LCQ，柱：LC Packings Company PepMap C18 75μm x 150mm，溶剂A：0.1％ HOAc-H2O，溶剂B：0.1％HOAc-甲醇，梯度：从用95％溶剂A和5％溶剂B的混合物洗脱开始在30分钟内增加到100％溶剂B的浓度的线性梯度，流速：0.2μl/分钟)上分析获得的消化物。结果，提供在SEQ ID NO：22-34的每一个和任一个中表示的氨基酸序列。
实施例9 浅灰链霉菌ATCC 11796的染色体DNA的制备
在50ml YEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将浅灰链霉菌ATCC 11796在30℃下振荡温育1天至3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡温育1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚·氯仿·异戊醇萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿·异戊醇萃取一次以回收水层。通过乙醇沉淀水层获得染色体DNA。
实施例10 获得编码本发明DNA(A10)的DNA和在大肠杆菌中的表达
(1)产生具有本发明DNA的转化的大肠杆菌
通过将在实施例9中从浅灰链霉菌ATCC 11796制备的染色体DNA用作模板和通过使用Expand High Fidelity PCR系统(Roche MolecularBiochemicals Company)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：79所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：80所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对23”)或具有SEQ ID NO：79所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：81所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对24”)。通过加入2种每种总计300nM的引物，50ng上述染色体DNA，5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，5.0μl 10 x ExpandHF缓冲液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计25μl。PCR的反应条件是在保持在97℃2分钟后；重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 2分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着68℃ 30秒，接着72℃ 2分钟(其中每个循环增加保持在72℃下20秒)；然后保持在72℃ 7分钟。在保持后，将反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。从使用引物对23的反应溶液进行的凝胶中回收包含约1.2kbp DNA的凝胶区域。从使用引物对24的反应溶液进行的凝胶中回收包含约1.5kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到克隆载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。接下来，按照所述试剂盒附带的说明书，使用作为引物的-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)，M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO：82所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：83所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(AppliedBiosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将含有SEQ ID NO：84所示核苷酸序列的质粒命名为pCR11796和含有SEQ ID NO：85所示核苷酸序列的质粒命名为pCR11796F。在SEQ ID NO：85中表示的所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1221个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码406个氨基酸残基(在SEQ ID NO：5中表示的氨基酸序列)的核苷酸序列(SEQ ID NO：84)以及由210个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码69个氨基酸残基的核苷酸序列。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR11796和pCR11796F中的每一个。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从进行pCR11796消化产物的凝胶中切割包含约1.2kbp DNA的凝胶区域。从进行pCR11796F消化产物的凝胶中切割包含约1.5kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara ShuzoCompany)连接用NdeI和HindIII消化的每种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A10)的约1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：84所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN11796。另外，将其中编码本发明蛋白质(A10)的约1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：85所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN11796F。将上述质粒pKSN11796和pKSN11796F中的每一个导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体分别命名为JM109/pKSN11796和JM109/pKSN11796F。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A10)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN11796，JM109/pKSN11796F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养物转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。当OD660到达约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养17小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mMPMSF的上述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN11796中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN11796提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN11796F中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN11796F提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用考马斯蓝(以下称为“CBB”)染色。结果，在大肠杆菌pKSN11796提取物和大肠杆菌pKSN11796F提取物中都检测到比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，其位于对应于45kDa分子量的电泳位置。在大肠杆菌pKSN11796F提取物中鉴定比在大肠杆菌pKSN11796提取物更强烈的条带。显示大肠杆菌JM109/pKSN11796F比大肠杆菌JM109/pKSN11796更高程度地表达本发明蛋白质(A10)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例10(2)中回收的上清液级分。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表10中显示。
表10
Figure C02825642D01331
Figure C02825642D01341
实施例11 获得本发明DNA(A3)
(1)砖红色链霉菌ATCC 21469的染色体DNA的制备
在50ml YEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将砖红色链霉菌ATCC 21469在30℃下振荡温育1天至3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚·氯仿·异戊醇萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿·异戊醇萃取一次以回收水层。通过乙醇沉淀水层获得染色体DNA。
(2)本发明DNA(A3)的分离
通过将在实施例11(1)中制备的染色体DNA用作模板进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：65所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQID NO：66所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对9”)。通过加入250ng上述染色体DNA，2种每种总计200nM的引物，4μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物)，5μl 10 x ExTaq缓冲液，0.5μlExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是保持在97℃ 2分钟；重复30个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒；然后保持在72℃ 4分钟。在保持后，将反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约1.4kbp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：68所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：69中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1188个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码395个氨基酸残基的核苷酸序列以及由195个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码64个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQID NO：17)。由SEQ ID NO：17所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的分子量据计算为6666Da。
实施例12 本发明蛋白质(A3)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明DNA(A3)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例11(1)中制备的染色体DNA用作模板和通过使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)在如上类似的条件下进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：70所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：71所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对10”)或具有SEQ ID NO：70所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：72所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对11”)。按照上述方法将通过使用引物对10扩增的1.2kb DNA和使用引物对11扩增的1.5kbDNA克隆到TA克隆载体pCR2.1中。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：68所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，证实用引物对10扩增的DNA克隆的质粒含有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。证实用引物对11扩增的DNA克隆的质粒含有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列。在SEQID NO：11中显示的所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1188个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码395个氨基酸残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)以及由195个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码64个氨基酸残基的核苷酸序列。由SEQ ID NO：8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列组成的蛋白质的分子量据计算为43752Da。至于获得的质粒，将含有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的质粒命名为pCR671和将含有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的质粒命名为pCR671F。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR671和pCR671F中的每一个。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从进行pCR671消化产物的凝胶中切割包含约1.2kbp DNA的凝胶区域。从进行pCR671F消化产物的凝胶中切割包含约1.5kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的每种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A3)的约1200bp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN671。另外，将其中编码本发明蛋白质(A3)的约1400bp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN671F。将上述质粒pKSN671和pKSN671F中的每一个导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体分别命名为JM109/pKSN671和JM109/pKSN671F。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A3)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN671，JM109/pKSN671F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养物转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。当OD660到达约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养17小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mMPMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN671中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN671提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN671F中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN671F提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下1小时。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例12(2)中回收的上清液级分组成。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和搅拌到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F25420cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表11中显示。
表11
实施例13 获得本发明DNA(A9)
(1)Streptomyces carbophilus SANK 62585的染色体DNA的制备
在50ml YEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将Streptomyces carbophilus SANK 62585(FERM BP-1145)在30℃下振荡温育1天。然后回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚·氯仿·异戊醇萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿·异戊醇萃取一次以回收水层。通过乙醇沉淀水层获得染色体DNA。
(2)本发明DNA(A9)的分离
通过将在实施例13(1)中制备的染色体DNA用作模板进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：74所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：75所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对12”)或具有SEQ ID NO：76所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：77所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对13”)。通过加入2种每种总计200nM的引物，250ng上述染色体DNA，4μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq缓冲液，0.5μl ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是保持在95℃ 2分钟；重复30个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒，然后保持在72℃ 4分钟。在保持后，将反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。从使用引物对12的PCR反应溶液进行的凝胶中回收包含约500bp的DNA的凝胶区域。从使用引物对13的PCR反应溶液进行的凝胶中回收包含约800bp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：68所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，通过使用引物对12的PCR获得的DNA提供在SEQID NO：78所示核苷酸序列的核苷酸1-498中表示的核苷酸序列。通过使用引物对13的PCR获得的DNA提供在SEQ ID NO：78所示核苷酸序列的核苷酸469-1233中表示的核苷酸序列。将含有在SEQ ID NO：78中表示的核苷酸1-498的核苷酸序列的质粒命名为pCRSCA1。将含有在SEQ IDNO：78中表示的核苷酸469-1233的核苷酸序列的质粒命名为pCRSCA2。
实施例14 本发明蛋白质(A9)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明DNA(A9)的转化大肠杆菌的产生
使用在实施例13(2)中获得的质粒，用NdeI和NcoI消化上述质粒pCRSCA1并用NdeI和NcoI消化pCRSCA2。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从pCRSCA2消化产物进行的凝胶中切割包含约500bp DNA的凝胶区域。从pCRSCA2消化产物进行的凝胶中切割包含约800bp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的两种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A9)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：78所示核苷酸序列的质粒命名为pKSNSCA。
(2)本发明蛋白质(A9)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSNSCA在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10mlTB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将获得的培养物转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养以使OD660为0.2。当OD660到达约2.0时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至200μM的终浓度，进一步培养5小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mM PMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSNSCA中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSNSCA提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例14(2)中回收的上清液级分。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和搅拌到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表12中显示。
表12
Figure C02825642D01411
实施例15 大豆RuBPC基因的分离
在播种大豆(cv.Jack)后，在27℃下培养大豆30天和收集叶子。用液氮冷冻十分之二克(0.2g)至0.3g收集的叶子并用研钵和杵磨碎。随后，按照附带的手册使用RNA提取溶剂ISOGEN(Nippon Gene Company)从磨碎的产物中提取总RNA。进一步，通过按照附带的手册进行程序使用用于RT-PCR的Superscript第一条链合成系统(Invitrogen Company)合成cDNA。具体地，通过使用由试剂盒提供的寡(dT)12-18引物作为引物和总大豆RNA作为模板和通过向其中加入由试剂盒提供的逆转录酶合成第一条链cDNA。接下来，通过PCR扩增编码后面有成熟蛋白12个氨基酸的大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(以下将核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶称为“RuBPC”)小亚基叶绿体转运肽的DNA(以下，大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽有时称为“rSt”；编码后面有成熟蛋白12个氨基酸的大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的DNA称为“本发明rSt12 DNA”)。PCR使用获得的cDNA作为模板和具有SEQ ID NO：86所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：87所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。PCR使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Company)。通过保持94℃ 3分钟1次；进行30个循环，一个循环包括保持98℃ 25秒和然后68℃ 1分钟；和保持72℃ 10分钟1次来进行PCR。通过将扩增的DNA插入质粒pCR2.1(Invitrogen Company)PCR产物克隆位点中获得质粒pCRrSt12(图5)。接下来，将质粒导入大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞中和选择抗氨苄青霉素菌株。另外，通过使用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪373S(PE Applied Biosystems Company)测定包含在所选抗氨苄青霉素菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：88中表示的核苷酸序列。证实质粒pCRrSt12包含本发明rSt12DNA。
实施例16 用于直接导入的包含本发明DNA(A1)的叶绿体表达质粒的构建
(1)本发明DNA(A1)的分离
通过PCR扩增包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA。通过使用放线菌属暗产色链霉菌IFO 12898的基因组DNA作为模板和通过使用由SEQ ID NO：93所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：94所示核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物进行PCR。另外，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA。通过使用由SEQ ID NO：93所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和SEQ ID NO：95所示寡核苷酸序列作为引物进行PCR。所述PCR使用Expand High Fidelity PCR System(BoehringerCompany)。在保持97℃2分钟1次以后；进行10个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 1分钟(其中每个循环在72℃的保持增加20秒)；然后保持72℃ 7分钟来进行PCR。通过将扩增的DNA插入pCR2.1(Invitrogen Company)的PCR产物克隆区域产生质粒pCR657ET(图6)和pCR657FET(图7)。此外，除了使用由SEQ ID NO：96所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO：94所示核苷酸序列组成的寡核苷酸以外，以类似于上述方法的程序获得质粒pCR657Bs(图8)。再进一步，除了使用由SEQ ID NO：96所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：97所示核苷酸序列组成的寡核苷酸以外，以类似于上述方法的程序获得质粒pCR657FBs(图9)。接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Shuzo Company)并选择抗氨苄青霉素的细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在抗氨苄青霉素菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pCR657ET和pCR657Bs含有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。证实质粒pCR657FET和pCR657FBs含有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。
(2)用于直接导入的包含本发明DNA(A1)的叶绿体表达质粒的构建-部分(1)
构建包含嵌合DNA的质粒作为用基因枪法将本发明DNA(A1)导入植物的质粒，所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列(以下有时称为“编码叶绿体转运肽的序列”)之后而没有密码子框的变化。
首先，用限制酶HindIII和KpnI消化pCRrSt12。分离包含本发明rSt12DNA的DNA。另外，通过用限制酶HindIII和KpnI消化从质粒载体pUC19(Takara Shuzo Company)中去除约40bp DNA获得约2640bp的DNA。接下来，用牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo Company)将DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入从pCRrSt12获得的、包含本发明rSt12DNA的DNA，获得pUCrSt12(图10)。接下来，通过用限制酶EcoT22I和SacI消化质粒pCR657ET和pCR657FET中的每一个分离包含本发明DNA(A1)的DNA。将获得的DNA中的每一个插入pUCrSt12的EcoT22I限制位点和SacI限制位点之间以获得包含嵌合DNA的质粒pUCrSt657(图11)和pUCrSt657F(图12)，所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶EcoRI消化pBICR16G6PT(在日本未审查的专利2000-166577中描述)以分离约3kb的DNA。(以下，将包含在上面日本未审查专利所述的DNA中的启动子称为“CR16G6启动子”。另外，将包含在上面日本未审查专利所述的DNA中的终止子称为“CR16G6终止子”。)在用限制酶EcoRI消化质粒载体pUC19(Takara Shuzo Compnay)以后用牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo Company)将所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入获自pBICR16G6PT的3kb DNA以获得质粒pUCCR16G6-p/t(图13)。用限制酶HindIII和ScaI消化pUCCR16G6-p/t以分离包含CR16G6启动子的DNA。另外，通过用限制酶HindIII和EcoRI消化质粒载体pUC19(Takara Shuzo Company)，去除51bp的DNA和获得由2635bp组成的剩余DNA。接下来，用牛小肠碱性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)将所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入包含获自pUCCR16G6-p/t的CR16G6启动子的上述DNA和NotI-EcoRI接头(图14)以获得pUCCR12G6-p/tΔ(图15)，所述NotI-EcoRI接头获自将由SEQ IDNo：89所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID No：90所示核苷酸序列组成的寡核苷酸退火。用限制酶NdeI和EcoRI消化pUCCR12G6-p/tΔ以分离含有CR16t终止子的部分核苷酸序列的DNA。另外，用限制酶HindIII和EcoRI消化质粒载体pUC19(Takara Shuzo Company)以获得2635bp的DNA。用牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo Company)将所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入具有获自pUCCR12G6-p/tΔ的CR16t终止子的部分核苷酸序列的上述DNA和HindIII-NotI接头(图16)以获得pNdG6-ΔT(图17)，所述HindIII-NotI接头获自将由SEQ IDNo：91所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID No：92所示核苷酸序列组成的寡核苷酸退火。
接下来，通过用限制酶BamHI和SacI消化质粒pUCrSt657和pUCr657F中的每一个，分离包含嵌合DNA的DNA，在嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将DNA插入质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt-657(图18)和质粒pSUM-NdG6-rSt-657F(图19)中的每一个。
(3)用于直接导入的具有本发明DNA(A1)的叶绿体表达质粒的构建-部分(2)
构建包含嵌合DNA的质粒作为用基因枪法将本发明DNA(A1)导入植物的质粒，所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。首先，在用限制酶BspHI消化质粒载体pKF19(Takara Shuzo Company)以后，通过使用KOD DNA聚合酶(Toyobo Corporation)将核苷酸加入双链缺口将DNA末端平端化。通过用T4DNA连接酶将得到的DNA自身环化获得质粒pKF19ΔBs。用限制酶HindIII和KpnI消化在实施例1中获得的pCRrSt12。分离包含本发明rSt12DNA的DNA。用限制酶HindIII和KpnI消化质粒pKF19ΔBs以获得约2160bp的DNA。用牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo Cormpany)将所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入包含获自pCRrSt12的本发明rSt12DNA的DNA以获得pKFrSt12(图20)。接下来，用限制酶BspHI和SacI消化在实施例16(1)中获得的质粒pCR657Bs和PCR657FBs中的每一个以分离包含本发明DNA(A1)的DNA。将这些DNA中的每一个插入质粒pKFrSt12的BspHI限制位点和SacI限制位点之间以获得质粒pKFrSt12-657(图21)和质粒pKFrSt12-657F(图22)，其包含嵌合DNA，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，用BamHI和SacI消化质粒pKFrSt12-657和pKFrSt12-657F中的每一个以获得包含本发明DNA(A1)的DNA。将这些DNA中的每一个插入在实施例16(2)中获得的质粒pNdG6-ΔT的BglII限制位点和SacI限制位点之间，以获得质粒pSUM-NdG6-rSt12-657(图23)和pSUM-NdG6-rSt12-657F(图24)，其中嵌合DNA连接在启动子CR16G6的下游，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
实施例17 将本发明DNA(A1)导入大豆
(1)增殖体细胞胚的制备
在将大豆(栽培品种：Fayette和Jack)荚浸于1％次氯酸钠溶液灭菌以后，取出未成熟种子。将种皮从种子上剥离以除去具有2-5mm直径的未成熟胚。用解剖刀切割获得的未成熟胚的胚轴以制备未成熟子叶。将未成熟子叶分成2个子叶部分。将每个子叶部分分别放于体细胞胚发育培养基中。体细胞胚发育培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶加入设定为pH7.0和其中加入已180μM 2，4-D和30g/L蔗糖的Murashige-Skoog培养基(在Murashige T.和Skoog F.，Physiol.Plant(1962)15，第473页；以下称为“MS培养基”)。在放置1个月以后，将形成的球形胚移植到体细胞胚生长培养基中。体细胞胚生长培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶加入设定为pH5.8和其中加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培养基。其后以2-3周的间隔将球形胚移植到新鲜的体细胞胚生长培养基中5-8次。使用上述体细胞胚发育培养基和体细胞胚生长培养基的各自培养条件是23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃。
(2)将基因导入增殖体细胞胚
在将实施例17(1)所获球形胚移植到新鲜的体细胞胚生长培养基中和培养2-3天以后，将球形胚用于导入基因。将质粒pSUM-NdG6-rSt657，pSUM-NdG6-rSt657F，pSUM-NdG6-rSt12657和pSUM-NdG6-rSt12657F包被在直径1.0μm的金颗粒上以进行使用基因枪法的基因导入。对于1mg金颗粒的质粒的量为1.66μg。在导入基因后，将胚进一步培养2-3天。培养条件各自为23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃。
(3)用潮霉素选择体细胞胚
将在实施例17(2)获得的导入基因以后的球形胚移植到体细胞胚选择培养基。体细胞胚选择培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶和15mg/L潮霉素加入设定为pH5.8和其中已加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培养基。此后以2-3周的间隔将存活的球形胚移植至新鲜的体细胞选择培养基5-8次。在那时，体细胞胚选择培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶和30mg/L潮霉素加入设定为pH5.8和其中加入90μM 2，4-D和30g/L蔗糖的MS培养基。使用上述体细胞胚选择培养基的培养条件各自为23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃。
(4)用化合物(II)选择体细胞胚
将在实施例17(2)获得的导入基因以后的球形胚移植到体细胞胚选择培养基。体细胞胚选择培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶和0.1mg/L化合物(II)加入设定为pH5.8和其中已加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培养基。此后以2-3周的间隔将存活的球形胚移植至新鲜的体细胞选择培养基5-8次。在那时，体细胞胚选择培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶和0.3-1mg/L化合物(II)加入设定为pH5.8和其中已加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培养基。使用上述体细胞胚选择培养基的培养条件各自为23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃。
(5)从体细胞胚的植物再生
将在实施例17(3)或17(4)中选择的球形胚移植到发育培养基中并在23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃下培养4周。发育培养基是固体培养基，其中将0.8％(w/v)琼脂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，用于植物组织培养)加入设定为pH5.8和其中已加入60g/L麦芽糖的MS培养基。其后6-8周获得白色至黄色子叶类型的胚。将这些子叶类型的胚移植至发芽培养基中并培养2周。发芽培养基是固体培养基，其中将0.2％(w/v)脱乙酰吉兰糖胶加入设定为pH5.8和其中已加入30g/L蔗糖的MS培养基。结果，可以获得已经长出叶子和具有根的大豆。
(6)再生植物的顺应和培养
将在实施例17(5)中获得的大豆移植到耕土并在23小时光照和1小时黑暗和全天23-25℃的孵化室中顺应。两(2)周以后，将生根的植物转移至直径为9cm的盆中并在室温下培养。在室温下的培养条件是全天自然光23℃-25℃。两至四(2-4)个月以后，收集大豆种子。
(7)对除草化合物(II)的抗性评估
收集再生植物的叶子并沿主叶脉等分成2片。将化合物(II)散布在叶片之一的整个表面上。另一叶片留下未处理。将这些叶片放在包含0.8％琼脂的MS培养基上并在室温下放置于光线中7天。然后，用杵和研钵在5ml80％丙酮水溶液中研磨每个叶片以提取叶绿素。用80％丙酮水溶液稀释提取液10倍和按照Mackenney，G.，J.Biol.Chem.(1941)140；第315页所述方法在750nm，663nm和645nm下测量吸光度以计算总叶绿素含量。通过显示处理的叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的总叶绿素含量的百分位数可以比较评估对化合物(II)的抗性的程度。
接着，将土壤填塞至直径为10cm和深度为10cm的塑料盆中。播种上述植物的种子并在温室中培养。通过混合5份化合物(II)，6份苏乳播(sorpol)3005X(Toho化学品)和89份二甲苯制备乳剂。用包含0.1％(v/v)粘着剂的水以1公顷1000L的比例稀释特定量的乳剂并用喷枪均匀地散布在来自上面在上述盆中培养的植物的叶子的所有面上。在温室中培养植物16天后，研究对植物的损伤，评估对化合物(II)的抗性。
实施例18 用于农杆菌属导入的具有本发明DNA(A1)的叶绿体表达质粒的构建
构建用农杆菌法将本发明DNA(A1)导入植物的质粒。首先，在用限制酶NotI消化二元质粒(binary plasmid)载体pBI121(ClontechCompany)以后，通过使用DNA聚合酶I(Takara Shuzo Corporation)将核苷酸加入双链缺口将DNA末端平末端化。将T4DNA连接酶用于自身环化。在用限制酶EcoRI消化获得的质粒以后，通过使用DNA聚合酶I(Takara Shuzo Corporation)将核苷酸加入双链缺口将DNA末端平末端化。将T4DNA连接酶用于自身环化以获得质粒pBI121ΔNotIEcoRI。在用HindIII消化质粒以后，用牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo Company)将获得的DNA的5’DNA末端去磷酸化。向其中插入通过将由SEQ ID NO：98所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：99所示核苷酸序列组成的寡核苷酸退火而获得的HindIII-NotI-EcoRI接头(图25)。通过自身环化得到二元质粒载体pBI121S(图26)。所述质粒具有HindIII-NotI-EcoRI接头以其中HindIII限制位点，NotI限制位点，和EcoRI限制位点从接近β-葡糖醛酸酶的位置依次排列的方向插入的结构。
接下来，用限制酶HindIII和EcoRI消化质粒pSUM-NdG6-rSt-657和pSUM-NdG6-rSt-657F中的每一个，以从其每一个获得嵌合DNA，其中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将这些DNA插入上述二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt-657(图27)和pBI-NdG6-rSt-657F(图28)。另外，将上述质粒pSUM-NdG6-rSt12-657和pSUM-NdG6-rSt12-657F中的每一个用限制酶HindIII和EcoRI消化，以从每一个中获得嵌合DNA，其中本发明DNA(A1)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将这些DNA插入上述二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt12-657(图29)和pBI-NdG6-rSt12-657F(图30)。
实施例19 将本发明DNA(A1)导入烟草
使用在实施例18中获得的质粒pBI-NdG6-rSt-657，质粒pBI-NdG6-rSt-657F，质粒pBI-NdG6-rSt12-657和质粒pBI-NdG6-rSt12-657F，用农杆菌法将本发明DNA(A1)导入烟草。
首先，分别将质粒pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657、和pBI-NdG6-rSt12-657F导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(Clontech Company)。通过将产生的转化体在含有300mg/L链霉素，100mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基(0.5％酵母提取物，1.0％细菌用胰蛋白胨，0.5％NaCl)中培养和通过选择抗性克隆，分离含有pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657或pBI-NdG6-rSt12-657F的转化的农杆菌菌株。
然后，按照植物基因操作手册(Hirofumi UCHIMIYA，Kodan-shaScientific，1992)所述方法，将基因导入烟草。将含有上述质粒的农杆菌属菌株各自在28℃下在含有300mg/L链霉素，100mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB培养基中培养过夜，然后将无菌培养的烟草的叶片浸入液体培养基中。种植叶片并在室温下光照中在包含0.1mg/L萘乙酸和1.0mg/L苄氨基嘌呤的MS琼脂培养基(MS无机盐，MS维生素，3％蔗糖和0.8％琼脂，在Murashige T.和Skoog F.，Physiol.Plant.(1962)15，第473页中描述)中培养2天。然后，用无菌水洗涤叶片并在含有0.1mg/L萘乙酸，1.0mg/L苄氨基嘌呤和500mg/L头孢噻肟的MS琼脂培养基上培养7天。接下来，移植叶片并在含有0.1mg/L萘乙酸，1.0mg/L苄氨基嘌呤，500mg/L头孢噻肟和100mg/L卡那霉素的MS琼脂培养基中培养。培养连续进行4个月，同时以4周的间隔将叶片转移至相同组成的新鲜培养基。在那时，移植从叶片发育的不固定的芽并生根于包含300mg/L头孢噻肟和50mg/L卡那霉素的MS琼脂培养基中以获得再生体。将再生体移植并培育在包含50mg/L卡那霉素的MS琼脂培养基中，以分别获得其中已经导入pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657或pBI-NdG6-rSt12-657F的T-DNA区域的转基因烟草。
另外，用农杆菌法将在实施例18中获得的质粒pBI121S导入烟草。除了使用质粒pBI121S而不是pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657和pBI-NdG6-rSt12-657F以外，类似于上面分离含有pBI121S的转化的农杆菌属菌株。接下来，利用所述转化的农杆菌属，类似于上述获得已经导入质粒pBI121S的T-DNA区域的转基因烟草。
从转基因烟草取三(3)片叶子。将每片叶子分成4片，其中每片5-7mm宽。将每片叶子种植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养的第7天，观察每个叶片的除草损伤。来自导入对照DNA(质粒pBI121S的T-DNA区域)的烟草的叶片变白和枯萎。与此对比，来自导入本发明DNA(A1)(质粒pBI-NdG6-rSt-657，质粒pBI-NdG6-rSt12-657，pBI-NdG6-rSt-657F或pBI-NdG6-rSt12-657F的T-DNA区域)的烟草的叶片连续生长。
实施例20 将本发明DNA导入植物
构建用于以基因枪法和农杆菌法导入本发明DNA(A2)的质粒。首先，通过PCR扩增具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的本发明DNA(A2)。通过将放线菌属塔氏糖多孢菌JCM 9383t的基因组DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：100所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：101所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。所述PCR使用Expand HighFidelityPCR System(Boehringer Company)。在保持97℃ 2分钟1次以后；重复10个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 60秒；然后进行15个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 1分钟(其中每个循环在72℃的保持增加20秒)；和然后保持72℃ 7分钟来进行PCR。通过将扩增的DNA插入pCR2.1-TOPO(Invitrogen Company)的PCR产物克隆区域产生质粒pCR923Sp(图31)。接下来，将质粒导入大肠杆菌JM109感受态细胞(TakaraShuzo Company)并选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪373S(PE Applied Biosystems Company)测定包含在抗氨苄青霉素菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pCR923Sp具有SEQ IDNO：7所示核苷酸序列。
用限制酶BamHI和SacI消化在实施例16(3)中设计的质粒pKFrSt12以分离包含本发明rSt12DNA的DNA。将所述DNA插入在实施例16(2)中获得的pNdG6-ΔT的BglII限制位点和SacI限制位点之间以获得质粒pNdG6-rSt12(图32)。用限制酶SphI和KpnI消化质粒pCR923Sp以获得包含本发明DNA(A2)的DNA。用限制酶SphI和KpnI消化质粒pNdG6-rSt12以去除编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基成熟蛋白质的12个氨基酸的DNA。在该位置，将包含从质粒pCR923Sp获得的本发明DNA(A2)的上述DNA插入以获得pSUM-NdG6-rSt-923(图33)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，用限制酶SphI消化质粒pCR923Sp。在用KOD DNA聚合酶将获得的DNA平末端化以后，将所述DNA用限制酶KpnI进一步消化以分离含有本发明DNA(A2)的DNA。用限制酶BspHI消化在实施例16(3)中产生的质粒pKFrSt12。在用KOD DNA聚合酶将获得的DNA平末端化以后，将所述DNA用限制酶KpnI进一步消化以去除约20bp的DNA。在该处，将包含从质粒pCR923Sp获得的含本发明DNA(A2)的上述DNA插入以获得包含嵌合DNA的质粒pKFrSt12-923(图34)，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A2)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。用限制酶SphI和KpnI消化pKFrSt12-923以获得嵌合DNA，其中本发明DNA(A2)和编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基成熟蛋白的开始12个氨基酸的DNA连接。用限制酶SphI和KpnI消化质粒pNdG6-rSt12以去除编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基成熟蛋白的12个氨基酸的DNA。在该位置，将获自质粒pKFrSt12-923的上述嵌合DNA插入以获得质粒pSUM-NdG6-rSt12-923(图35)，其中CR16G6启动子已经从中连接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中包含本发明DNA(A2)的所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的序列之后而没有密码子框的变化。
使用获得的质粒pSUM-NdG6-rSt-923和pSUM-NdG6-rSt12-923，以与实施例17所述方法相同的程序用基因枪法将本发明DNA(A2)导入大豆。
用限制酶HindIII和EcoRI消化上述质粒pSUM-NdG6-rSt-923以分离包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本发明DNA(A2)的所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列之后而没有密码子框的变化。如在实施例18中产生pBI-NdG6-rSt657，将包含获自质粒pSUM-NdG6-rSt-923的嵌合DNA的上述DNA插入二元载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得pBI-NdG6-rSt-923(图36)。另外，用HindIII和EcoRI消化上述质粒pSUM-NdG6-rSt12-923以分离包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本发明DNA(A2)的所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的序列之后而没有密码子框的变化。将获自pSUM-NdG6-rSt12-923的嵌合DNA插入二元载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得pBI-NdG6-rSt12-923(图37)。
将质粒pBI-NdG6-rSt-923和pBI-NdG6-rSt12-923中的每一个导入根癌农杆菌LBA4404。将产生的转化体培养在包含300μg/ml链霉菌，100μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中。选择转化体以分离具有pBI-NdG6-rSt1-923或pBI-NdG6-rSt12-923的农杆菌属菌株。
用具有pBI-NdG6-rSt-923的农杆菌属菌株和具有pBI-NdG6-rSt12-923的农杆菌属菌株中的每一个感染无菌培养烟草的叶片。在类似于在实施例19中描述的方法的程序下获得已经导入本发明DNA(A2)的烟草。
从获得的转基因烟草中取三(3)片叶子。将每片叶子分成4片，其中每片5-7mm宽。将每片叶子种植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养的第7天，观察每个叶片的除草损伤。来自导入对照DNA(质粒pBI121S的T-DNA区域)的烟草的叶片变白和枯萎。与此对比，来自导入本发明DNA(A2)(质粒pBI-NdG6-rSt-923或质粒pBI-NdG6-rSt12-923的T-DNA区域)的烟草的叶片连续生长。
实施例21 将本发明DNA(A3)导入烟草
构建以基因枪法和农杆菌法将本发明DNA(A3)导入植物的质粒。
首先，通过PCR扩增具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的本发明DNA(A3)。通过将放线菌属砖红色链霉菌ATCC 21469的基因组DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：102所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：103所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。所述PCR使用Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Company)。在保持97℃ 2分钟1次以后；重复10个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持97℃ 15秒，接着60℃ 30秒和接着72℃ 1分钟(其中每个循环在72℃的保持增加20秒)；和然后保持72℃ 7分钟来进行PCR。通过将扩增的DNA插入pCR2.1(Invitrogen Company)的PCR产物克隆区域产生质粒pCR671ET(图38)。另外，除了将由SEQ ID NO：104所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：103所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物以外，以类似于上述方法的程序获得质粒pCR671Bs(图39)。接下来，将质粒导入大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo Company)并选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在抗氨苄青霉素菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pCR671ET和pCR671Bs具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。
用限制酶EcoT22I和KpnI消化质粒pCR671ET以分离包含本发明DNA(A3)的DNA。将所述DNA插入EcoT22I限制位点和KpnI限制位点之间以获得包含嵌合DNA的质粒pUCrSt671(图40)，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A3)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列之后而没有密码子框的变化。用限制酶NheI和KpnI消化质粒pUCrSt671以分离包含本发明DNA(A3)的DNA。用限制酶NheI和KpnI消化在实施例16(2)中获得的质粒pNdG6-rSt12以去除约80bp的DNA。在该位置，将上述包含获自质粒pUCrSt671的本发明DNA(A3)的DNA插入以获得pSUM-NdG6-rSt-671(图41)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A3)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BspHI和KpnI消化质粒pCR671Bs以分离包含本发明DNA(A3)的DNA。将所述DNA插入在实施例16(3)中获得的pKFrSt12的BspHI限制位点和KpnI限制位点之间以获得包含嵌合DNA的质粒pKFrSt12-671(图42)，其中本发明DNA(A3)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的序列之后而没有密码子框的变化。用限制酶NheI和KpnI消化在实施例20中获得的质粒pNdG6-rSt12以去除约80bp的DNA。在该处，插入上述包含获自质粒pKFrSt12-671的本发明DNA(A3)的DNA以获得pSUM-NdG6-rSt12-671(图43)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A3)紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的序列之后而没有密码子框的变化。
使用获得的质粒pSUM-NdG6-rSt-671和pSUM-NdG6-rSt12-671，以与实施例17所述方法相同的程序用基因枪法将本发明DNA(A3)导入大豆。
用限制酶HindIII和EcoRI消化上述质粒pSUM-NdG6-rSt-671以分离嵌合DNA，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A3)紧连在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列之后而没有密码子框的变化。将包含获自质粒pSUM-NdG6-rSt-671的嵌合DNA的上述DNA插入实施例18中获得的二元载体质粒pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得pBI-NdG6-rSt-671(图44)。另外，用限制酶HindIII和EcoRI消化上述质粒pSUM-NdG6-rSt12-671以分离包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本发明DNA(A3)的所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的序列之后而没有密码子框的变化。将获自质粒pSUM-NdG6-rSt12-671的嵌合DNA插入二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得pBI-NdG6-rSt12-671(图45)。
将质粒pBI-NdG6-rSt-671和pBI-NdG6-rSt12-671中的每一个导入根癌农杆菌LBA4404。将产生的转化体培养在包含300μg/ml链霉菌，100μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中。选择转化体以分离具有pBI-NdG6-rSt-671或pBI-NdG6-rSt12-671农杆菌菌株。
用具有pBI-NdG6-rSt-671的农杆菌菌株和具有pBI-NdG6-rSt12-671的农杆菌菌株中的每一个感染无菌培养烟草的叶片。在类似于在实施例19中描述的方法的程序下获得已经导入本发明DNA(A3)的烟草。
从转基因烟草中取三(3)片叶子。将每片叶子分成4片，其中每片5-7mm宽。将每片叶子种植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养的第7天，观察每个叶片的除草损伤。
实施例22 本发明蛋白质(B1)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明DNA(B1)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例3(1)中从暗产色链霉菌IFO 12898制备的染色体DNA用作模板进行PCR。通过加入300ng上述染色体DNA，4μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq缓冲液，0.5ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)，蒸馏水和具有SEQ ID NO：105所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：53所示核苷酸序列的寡核苷酸每种200nM，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后；重复25个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒；然后保持72℃ 4分钟。按照所述载体附带的说明书将在保持后的反应溶液和载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)连接并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。使用由SEQ IDNO：67所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：68所示核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物，按照所述试剂盒附带的说明书，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将具有SEQ IDNO：15所示核苷酸序列的质粒命名为pCR657FD。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR657FD。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切割包含约200bp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(B1)的约200bp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN657FD。将质粒pKSN657FD导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN657FD。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(B1)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN657FD和大肠杆菌JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养基转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。OD660到达约0.5以后三十(30)分钟，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养20小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mM PMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN657FD中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN657FD提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用CBB染色。结果，在大肠杆菌pKSN657FD提取物中检测到比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，其位于对应于7kDa分子量的电泳位置。显示大肠杆菌JM109/pKSN657FD表达本发明蛋白质(B1)。
(3)将本发明蛋白质(B1)应用于将化合物(II)转化为化合物(III)的反应体系
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，9μl在实施例22(2)中回收的大肠杆菌pKSN657FD提取物，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和15μl在实施例4(2)中回收的大肠杆菌pKSN657F提取物(以下称为“组分D”)组成。另外，制备其中加入2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)替代大肠杆菌pKSN657FD提取物的反应溶液和不加任何东西替代大肠杆菌pKSN657FD提取物的反应溶液。类似地保持这些反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cmx 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表13中显示。
表13
Figure C02825642D01591
实施例23 本发明蛋白质(B2)在大肠杆菌中的表达
(1)含有本发明DNA(B2)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例6(1)中从塔氏糖多孢菌JCM9383t制备的染色体DNA用作模板进行PCR。通过加入300ng上述染色体DNA，4μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq缓冲液，0.5ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)，蒸馏水和具有SEQ ID NO：106所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：63所示核苷酸序列的寡核苷酸每种200nM，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后；重复25个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒；然后保持72℃ 4分钟。按照所述载体附带的说明书将在保持后的反应溶液和载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)连接并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。使用由SEQ IDNO：67所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：68所示核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物，按照所述试剂盒附带的说明书，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪373A(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将具有SEQ IDNO：16所示核苷酸序列的质粒命名为pCR923FD。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化质粒pCR923FD。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切割包含约200bp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(B2)的约200bp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN923FD。将质粒pKSN923FD导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN923FD。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(B2)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN923FD和大肠杆菌JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养基转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。OD660到达约0.5以后三十(30)分钟，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养20小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mMPMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN923FD中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN923FD提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用CBB染色。通过在对应于7kDa分子量的电泳位置在大肠杆菌pKSN923FD提取物中检测比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，可以证实大肠杆菌表达本发明蛋白质(B2)。
(3)将本发明蛋白质(B2)应用于将化合物(II)转化为化合物(III)的反应体系
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，9μl在实施例23(3)中回收的大肠杆菌pKSN923FD提取物，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和15μl在实施例4(2)中回收的大肠杆菌pKSN657F提取物(以下称为“组分D”)。另外，制备其中加入2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(SigmaCompany)替代大肠杆菌pKSN923FD提取物的反应溶液和不加任何东西替代大肠杆菌pKSN923FD提取物的反应溶液。类似地保持这些反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。通过证实化合物(III)在包括组分A，大肠杆菌pKSN923FD提取物，组分C和组分D的反应中产生，可以证实在将化合物(II)转化为化合物(III)的反应体系中可以使用本发明蛋白质(B2)代替来源于菠菜的铁氧还蛋白。
实施例24 本发明蛋白质(B3)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(B3)的转化大肠杆菌的产生
除了将在实施例11(1)中从砖红色链霉菌ATCC 21469制备的染色体DNA用作模板和将具有SEQ ID NO：107所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：72所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外，类似于实施例23(1)所述方法进行PCR。类似于实施例23(1)所述方法，使用获得的反应溶液获得具有SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的质粒pCR671FD。
接下来，利用所述质粒，类似于实施例23(1)所述方法获得其中将本发明DNA(B3)插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间的质粒pKSN671FD。通过将质粒导入大肠杆菌JM109，可以获得具有本发明DNA(B3)的大肠杆菌JM109/pKSN671FD。
(2)本发明蛋白质(B3)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
使用大肠杆菌JM109/pKSN671FD，类似于实施例23(2)所述方法回收上清液级分(以下称为“大肠杆菌pKSN671FD级分”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用CBB染色。结果，通过在对应于7kDa分子量的电泳位置在大肠杆菌pKSN671FD提取物中检测比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，可以证实大肠杆菌表达本发明蛋白质(B3)。
(3)将本发明蛋白质(B3)应用于将化合物(II)转化为化合物(III)的反应体系
除了使用在实施例24(2)中回收的大肠杆菌pKSN671FD提取物以外，类似于实施例23(3)所述方法证实对应于用14C标记的化合物(III)的斑点(Rf值0.24和0.29)。通过证实在包括组分A，大肠杆菌pKSN671FD提取物，组分C和组分D的反应中产生化合物(III)，可以证实在将化合物(II)转化为化合物(III)的反应体系中可以使用本发明蛋白质(B3)代替来源于菠菜的铁氧还蛋白。
实施例25本发明蛋白质(A4)的制备
(1)细胞粗提物的制备
将不产色链霉菌IFO 12735的冷冻原种加入大试管中的10ml A培养基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，pH7.0)并在30℃下振荡温育1天以获得预培养物。将八毫升(8ml)预培养物加入200mlA培养基中并在30℃下在500ml带挡板的摇瓶中旋转振荡温育2天。通过将产生的培养物离心(3,000xg，10分钟)回收细胞沉淀。将这些细胞沉淀悬浮在包含100ppm化合物(II)的100mlB培养基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口烧瓶中往复振荡温育20小时。通过将2L产生的培养物离心(3,000g，10分钟)回收细胞沉淀。用1L0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤产生的细胞沉淀2次以提供136g细胞沉淀。
以1g细胞沉淀1ml—2ml将这些细胞沉淀悬浮在0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，向细胞混悬液中加入一毫摩尔(1mM)PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mMEDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽和1mM二硫垂陶耳。通过用弗氏压碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反复破裂混悬液2次获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(40,000xg，30分钟)以后，回收上清液并在150,000xg下离心1小时以回收上清液(以下称为“细胞粗提物”)。
(2)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的测定
制备由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成的30μl反应溶液，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2.4mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，0.5mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和15μl在实施例25(1)中回收的细胞粗提物。将反应溶液保持在30℃下1小时。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cmx 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。结果在表14中显示。
表14
Figure C02825642D01641
(3)细胞粗提物的分级分离
将硫酸铵加入在实施例25(1)中获得的细胞粗提物至45％饱和的量。在冰冷却的条件下搅拌以后，通过在12,000xg下离心30分钟回收上清液。在将硫酸铵加入获得的上清液至55％饱和的量和在冰冷却的条件下搅拌以后，通过在12,000xg下离心10分钟回收沉淀。用12.5ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)溶解沉淀。将该溶液进行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)洗脱以回收17.5ml包含蛋白质的级分(以下称为“45-55％硫酸铵级分”)。
(4)本发明蛋白质(A4)的分离
将在实施例25(3)中制备的45-55％硫酸铵级分注射到HiLoad26/10QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下来，在100ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)流进柱子以后，以线性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.004M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-1M，流速为4ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.12M-0.16M的NaCl浓度下洗脱的30ml级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(AmershamPhamacia Biotech Company)和用20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用缓冲液A(包含1.5mMNaCl的2mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0)洗脱，以便回收包含蛋白质的级分。接下来，将级分注射于Bio-Scale Ceramic羟磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。将二十毫升(20ml)缓冲液A流进柱子。随后，缓冲液A和线性梯度的缓冲液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸钾缓冲液；线性梯度从100％缓冲液A开始在100分钟期间增加至50％缓冲液B，流速为2ml/分钟)一起流动以分级回收在4％-6％的缓冲液B的浓度下洗脱的级分。进一步，将回收的级分进行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。
将类似量的包含2.0M硫酸铵的0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入和混合到回收的级分中。然后将回收的级分注射到1ml RESOURSE PHE柱(Amersham Pharmacia Biotech Cdmpany)中。在流动包含1M硫酸铵的5ml 0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)以后，0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和线性梯度的硫酸铵(硫酸铵的浓度梯度是0.1M/分钟，NaCl浓度的范围是1M-0M，流速是2ml/分钟)一起流动以分级回收在约0.4M-0.5M的硫酸铵浓度下洗脱的级分。在10％-20％ SDS-PAGE上分析在每个级分中包含的蛋白质。
类似于实施例25(2)，代替实施例25(2)所述的反应溶液中的细胞粗提物，在组分A，组分B，组分C和用14C标记的组分(II)的存在下，加入和保持回收的级分。将保持以后的反应溶液TLC分析以检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的强度。从凝胶中回收在上述SDS-PAGE中移动至约45kDa位置的所述蛋白质并用蛋白质测序仪(AppliedBiosystems Company，Procise 494HT，脉冲液相方法)进行氨基酸序列分析以将N末端氨基酸序列测序。结果，提供在SEQ ID NO：113中表示的氨基酸序列。
实施例26 获得本发明DNA(A4)
(1)不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA的制备
在50ml YEME培养基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)细菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麦芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中将不产色链霉菌IFO 12735在30℃下振荡培养1天至3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，以每200mg细胞1ml将它重悬浮在缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，10mMNaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。将细胞混悬液在30℃下振荡1小时。另外，加入0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K。将细胞混悬液在55℃下温育3小时。用酚·氯仿·异戊醇萃取细胞混悬液2次以回收每个水层。接下来，用氯仿·异戊醇萃取一次以回收水层。通过乙醇沉淀水层获得染色体DNA。
(2)不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA文库的制备
用3.2U限制酶Sau3AI在37℃下消化在实施例26(1)中制备的三十八微克(38μg)染色体DNA 60分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳分离获得的消化液。从凝胶中回收约2.0kbp的DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)纯化DNA并用乙醇沉淀浓缩以获得20μl包含目标DNA的溶液。将八微升(8μl)DNA溶液，100ng用限制酶BamHI消化和用去磷酸化处理的质粒载体pUC118和16μl来自连接试剂盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下保持3小时。使用连接溶液转化大肠杆菌DH5α，并涂布在包含50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上以在37℃下培养过夜。从琼脂培养基中回收获得的菌落。提取质粒。将获得的质粒称为染色体DNA文库。
(3)本发明DNA(A4)的分离
通过将在实施例26(2)中制备的染色体DNA用作模板进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：114所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对。基于SEQ ID NO：113所示氨基酸序列设计SEQ ID NO：114所示核苷酸序列。将Expand HiFiPCR系统(Boehringer Manheim Company)用来制备反应溶液。通过加入2.5μl上述染色体DNA文库，2种每种总计7.5pmol的引物，0.2μl dNTP混合物(4种dNTP每种2mM的混合物)，0.2μl的10x缓冲液(包含MgCl2)，0.38μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计25μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 2分钟后，重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着65℃ 30秒，接着72℃ 1分钟(其中每个循环保持在72℃增加20秒)；然后保持在72℃7分钟。在保持后，将2.5μl反应溶液用作模板溶液以进行第二次PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：115所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对。基于SEQ IDNO：113所示氨基酸序列设计SEQ ID NO：115所示核苷酸序列。类似于上述方法，将ExpandHiFi PCR系统(Boehringer Manheim Company)用来进行PCR。将保持后的反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约800bp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到TA克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：67所示核苷酸序列的引物和使用具有SEQ ID NO：68所示核苷酸序列的引物，用Big Dye终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：110中表示的核苷酸序列的核苷酸57至832所示的核苷酸序列。在提供的核苷酸序列中，SEQ ID NO：110所示核苷酸序列的核苷酸58-60编码SEQ ID NO：113所示氨基酸序列的氨基酸20。
接下来，在上述条件下，将在实施例26(2)中制备的染色体DNA文库用作模板用Expand HiFi PCR系统(Boehringer Manheim Company)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：116所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：59所示核苷酸序列的寡核苷酸的引物配对。将约1.4kb的扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO中。利用Qiagen Tip20(Qiagen Company)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：67所示核苷酸序列的引物和使用具有SEQ ID NO：68所示核苷酸序列的引物，用Big Dye终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：110中表示的核苷酸序列的核苷酸1至58所示的核苷酸序列。
进行从SEQ ID NO：110所示核苷酸序列的核苷酸832表示的核苷酸3’末端延伸下游的DNA的克隆。具体地，用200U限制酶HincII在37℃下过夜消化在实施例26(1)中制备的13μg不产色链霉菌IFO 12735染色体DNA。在酚提取后，通过乙醇沉淀纯化DNA。将获得的DNA用来产生20μl水溶液。将其四微升(4μl)，1.9μl的15μM基因组步行连接物(Genome Walker Adaptor)，1.6μl 10x连接缓冲液和0.5μl 6U/μl T4连接酶混合和在16℃下保持过夜。其后，保持70℃5分钟和加入72μl蒸馏水以提供基因组步行(Genome Walker)文库。通过将所述文库用作模板进行PCR。通过加入1μl基因组步行文库和每个总计200nM的引物AP1(Universal Genome Walker试剂盒提供)和具有SEQ ID NO：117所示核苷酸序列的寡核苷酸，加入1μldNTP混合物(4种dNTP每种10mM的混合物)，10μl的5x GC基因组PCR缓冲液，2.2μl25mMMg(OAc)2，10μl5M GC-Melt和1μl Advantage-GC基因组聚合酶混合物和加入蒸馏水，提供总计50μl的PCR反应溶液。PCR的反应条件是在保持在95℃1分钟后；进行7个循环，一个循环包括保持在94℃ 10秒，然后72℃ 3分钟；36个循环，一个循环包括保持94℃ 10秒和然后68℃ 3分钟；和保持68℃ 7分钟。用蒸馏水将保持后的反应溶液稀释50倍。将该PCR产物称为第一PCR产物并用作模板来进行另一PCR。通过加入1μl第一PCR产物和每个总计200nM的引物AP2(Universal Genome Walker试剂盒提供)和具有SEQ ID NO：118所示核苷酸序列的寡核苷酸，加入1μl dNTP混合物(4种dNTP每种10mM的混合物)，10μl的5x GC基因组PCR缓冲液，2.2μl 25mMMg(OAc)2，10μl 5M GC-Melt和1μl Advantage-GC基因组聚合酶混合物和加入蒸馏水，提供总计50μl的PCR反应溶液。PCR的反应条件是在保持在95℃ 1分钟后；进行5个循环，一个循环包括保持在94℃ 10秒，然后72℃ 3分钟；20个循环，一个循环包括保持94℃10秒和然后68℃ 3分钟；和保持68℃ 7分钟。将保持以后的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约1300bp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用QiagenTip20(Qiagen公司)从大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用SEQ ID NO：67所示的寡核苷酸和SEQ ID NO：68所示的寡核苷酸作为引物，用Big Dye终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：110中表示的核苷酸序列的核苷酸644至1454所示的核苷酸序列。作为将所有分析的核苷酸连接的结果，提供在SEQ ID NO：110中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1236个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码411个氨基酸残基(SEQ ID NO：108)的核苷酸序列(SEQ ID NO：109)以及由192个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码63个氨基酸残基(SEQID NO：111)的核苷酸序列(SEQ ID NO：112)。由SEQ IDNO：109所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：108)组成的蛋白质的分子量据计算为45465Da。另外，由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列包含从本发明蛋白质(A4)的N末端氨基酸测序所测定的氨基酸序列(SEQ ID NO：113)。由SEQ ID NO：112所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：111)组成的蛋白质的分子量据计算为6871Da。
实施例27 本发明蛋白质(A4)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A4)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例26(1)中从不产色链霉菌IFO 12735制备的染色体DNA用作模板和通过使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：119所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：120所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对25”)或具有SEQ ID NO：119所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：121所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对(以下称为“引物对26”)。通过加入2种每种总计300nM的引物，50ng上述染色体DNA，5.0μldNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，5.0μl 10x Expand HF缓冲液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃2分钟后；重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟(其中每个循环增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分钟。在保持后，将反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。从经历使用引物对25的反应溶液的凝胶回收包含约1.3kbp的DNA的凝胶区域。从经历使用引物对26的反应溶液的凝胶中回收包含约1.6kbp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。接下来，按照所述试剂盒附带的说明书，使用SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123所示寡核苷酸作用引物，用Big Dye终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将具有SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的质粒命名为pCR646和将具有SEQ ID NO：110所示核苷酸序列的质粒命名为pCR646F。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化质粒pCR646和pCR646F中的每一个。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从进行pCR646消化产物的凝胶中切割包含约1.3kbp DNA的凝胶区域。从进行pCR646F消化产物的凝胶中切割包含约1.6kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从每个回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本1(Takara ShuzoCompany)连接用NdeI和HindIII消化的每种获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A4)的约1.3kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN646。另外，将其中编码本发明蛋白质(A4)的约1.6kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：110所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN646F。将上述质粒pKSN646和pKSN646F中的每一个导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体分别命名为JM109/pKSN646和JM109/pKSN646F。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A4)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
将大肠杆菌JM109/pKSN646，JM109/pKSN646F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨苄青霉素的10ml TB培养基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氢钾，72mM磷酸氢二钾)中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养基转移至包含50μg/ml氨苄青霉素的100ml TB培养基中并在26℃下培养。当OD660到达约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟后，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养17小时。
从每个培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1mMPMSF的上述缓冲液中。将获得的细胞混悬液在输出量3，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(1,200xg，5分钟)后回收上清液和离心(150,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN646中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN646提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN646F中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN646F提取物”，将从大肠杆菌JM109/pKSN2中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液级分并用CBB染色。结果，通过在大肠杆菌pKSN646提取物和大肠杆菌pKSN646F提取物中都检测到比大肠杆菌pKSN2提取物显著更强烈的条带，其位于对应于45kDa分子量的电泳位置，可以证实本发明蛋白质(A4)在大肠杆菌中表达。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和18μl在实施例27(2)中回收的上清液级分。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C的至少一种组分的反应溶液。将三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收75μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。将其五微升(5.0μl)点到硅胶TLC板(TLC硅胶板60F254 20cm x 20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6:1:2的混合物展开TLC板约1小时。然后让溶剂蒸发。将TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)过夜。接着，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。检查对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。可以证实化合物(III)在包含组分A，组分B，组分C和大肠杆菌pKSN646提取物的反应溶液中，或在包含组分A，组分B，组分C和大肠杆菌pKSN646F的反应溶液中的生产。
实施例28 与本发明蛋白质相关的序列同一性
通过使用GENETYX-WIN第五版(Software Development Company)分析与本发明蛋白质和本发明DNA相关的序列同一性。通过用Lipman-Pearson法(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science，227，1435-1441，(1985))进行同源性分析产生对比。
关于本发明蛋白质(A1)至(A4)的氨基酸序列，确定彼此之间和对最高同源性的已知蛋白质的序列同一性。结果在表15中表示。
表15
 
本发明蛋白质(A1) 本发明蛋白质(A2) 本发明蛋白质(A3) 本发明蛋白质(A4) 最高同源性的已知蛋白质* 
本发明蛋白质(A1) 100％ 47％ 64％ 48％ 73％AAC25766
本发明蛋白质(A2) 47％ 100％ 48％ 51％ 52％CAB46536
本发明蛋白质(A3) 64％ 48％ 100％ 46％ 67％AAC25766
本发明蛋白质(A4) 48％ 51％ 46％ 100％ 50％CAB46536
*序列同一性在顶部显示，提供的蛋白质在Entrez数据库(由生物技术信息中心提供，http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登记号在底部显示。
关于具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的本发明DNA(A1)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的本发明DNA(A2)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的本发明DNA(A3)的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的本发明DNA(A4)的核苷酸序列，确定彼此之间和对最高同源性的已知基因的序列同一性。结果在表16中表示。
表16
 
SEQ ID NO：6[本发明   SEQ ID NO：7[本发明  SEQ ID NO：8[本发明   SEQ ID NO：109[本发明   最高同源性的已知基因*         
 
DNA(A1)] DNA(A2)] DNA(A3)] DNA(A4)]
SEQ ID NO：6[本发明DNA(A1)]   100％ 61％ 74％ 62％ 77％AF072709
SEQ ID NO：7[本发明DNA(A2)]  61％ 100％ 64％ 65％ 66％Y18574
SEQ ID NO：8[本发明DNA(A3)]  74％ 64％ 100％ 63％ 75％AF072709
SEQ ID NO：109[本发明DNA(A4)]  62％ 65％ 63％ 100％ 64％Y18574
*序列同一性在顶部显示，提供的基因在Entrez数据库(由生物技术信息中心提供，http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登记号在底部显示。
关于本发明蛋白质(B1)至(B4)的氨基酸序列，确定彼此之间和对最高同源性的已知蛋白质的序列同一性。结果在表17中表示。
表17
 
本发明蛋白质(B1) 本发明蛋白质(B2) 本发明蛋白质(B3) 本发明蛋白质(B4) 最高同源性的已知蛋白质* 
本发明蛋白质(B1) 100％ 45％ 78％ 41％ 76％AAC25765
 
本发明蛋白质(B2) 45％ 100％ 40％ 41％ 60％AAF71770
本发明蛋白质(B3) 78％ 40％ 100％ 40％ 73％AAC25765
本发明蛋白质(B4) 41％ 41％ 40％ 100％ 55％AAA26824
*序列同一性在顶部显示，提供的蛋白质在Entrez数据库(由生物技术信息中心提供，http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登记号在底部显示。
关于具有SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的本发明DNA(B1)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的本发明DNA(B2)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的本发明DNA(B3)的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：112所示核苷酸序列的本发明DNA(B4)的核苷酸序列，确定彼此之间和对最高同源性的已知基因的序列同一性。结果在表18中表示。
表18
 
SEQ ID NO：15[本发明DNA(B1)]  SEQ ID NO：16[本发明DNA(B2)]  SEQ ID NO：17[本发明DNA(B3)]  SEQ ID NO：112[本发明DNA(B4)]  最高同源性的已知基因*         
SEQ ID NO：15[本发明DNA(B1)]   100％ 60％ 80％ 59％ 84％AF072709
SEQ ID NO：16[本发明DNA(B2)]  60％ 100％ 60％ 59％ 66％M32238
SEQ ID NO： 80％ 60％ 100％ 65％ 79％
 
17[本发明DNA(B3)] AF072709
SEQ ID NO：112[本发明DNA(B4)] 59％ 59％ 65％ 100％ 66％M32239
*序列同一性在顶部显示，提供的基因在Entrez数据库(由生物技术信息中心提供，http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登记号在底部显示。
实施例29 使用具有本发明DNA(A)的部分核苷酸序列的寡核苷酸作为引物的PCR
通过将在实施例2中制备的暗产色链霉菌IFO 12898的染色体DNA；在实施例5中制备的塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色体DNA；在实施例9中制备的浅灰链霉菌ATCC 11796的染色体DNA；在实施例11中制备的砖红色链霉菌ATCC 21469的染色体DNA；在实施例26中制备的不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA中的每一个；和类似于实施例2所述方法制备的灰褐链霉菌IFO 12870t的染色体DNA，热淡天蓝链霉菌IFO14273t和黑胡桃链霉菌IFO 13445中的每一个用作模板进行PCR。作为引物，使用表19所示5对引物。在表19中显示通过使用基于SEQ ID NO：6的核苷酸序列的每个引物对的PCR扩增的DNA的预测大小。
表19
 
引物对 引物 引物 扩增的DNA
14 SEQ ID NO：124 SEQ ID NO：129 约800bp
15 SEQ ID NO：125 SEQ ID NO：129 约600bp
16 SEQ ID NO：126 SEQ ID NO：129 约600bp
17 SEQ ID NO：127 SEQ ID NO：129 约580bp
18 SEQ ID NO：128 SEQ ID NO：129 约580bp
通过加入200nM表19所示配对2条引物中每一种，加10ng染色体DNA，0.5μl dNTP混合物(4种dNTP每种10mM的混合物)，5μl 5xGC基因组PCR缓冲液，1.1μl 25mM Mg(OAc)2，5μl 5M GC-Melt和0.5μlAdvantage-GC基因组聚合酶混合物和加蒸馏水，PCR反应溶液总计25μl。反应条件是保持在95℃1分钟；重复30个循环，一个循环包括保持在94℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；和保持在72℃ 5分钟。用3％琼脂糖凝胶电泳分析保持后的每种反应溶液。结果在图46中和表20和表21中显示。在使用引物对14，15，16，17和18中每一个或全部的情形中以及在使用从任一菌株制备的染色体DNA作为模板的情形中观察到预测大小DNA的扩增。
表20
Figure C02825642D01771
Figure C02825642D01781
*“+”表示预测大小的DNA被检测到，“—”表示没有检测到。
表21
Figure C02825642D01791
*“+”表示预测大小的DNA被检测到，“—”表示没有检测到。
实施例30 使用由本发明DNA(A)的部分核苷酸序列和本发明DNA(A)组成的DNA作为探针的杂交
(1)探针制备
作为用洋地黄毒苷标记的探针(DIG标记的探针)生产由本发明DNA(A1)的部分核苷酸序列或本发明DNA(A1)的部分核苷酸序列组成的DNA。通过将在实施例3中制备的暗产色链霉菌IFO 12898的染色体DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：93所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：94所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物，按照附带的手册使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics GmbH Company)进行PCR。通过加入2种引物每一种总计200nM，加50ng染色体DNA，2.5μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物)，2.5μl PCR DIG混合物(用DIG标记的4种dNTP每种2.0mM的混合物)，5μl 10xPCR缓冲液和0.75μl Expand HiFi酶混合物和加蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。反应条件是在保持在95℃ 2分钟以后；重复10个循环，一个循环包括保持在95℃ 10秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 2分钟；然后进行15个循环，一个循环包括保持在95℃ 10秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 2分钟(其中每个循环保持在72℃增加20秒)；然后保持在72℃ 7分钟。将保持后的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果，证实约1.3kb的DNA的扩增。回收扩增的DNA以获得用洋地黄毒苷标记和具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA。在类似方法下，通过将暗产色链霉菌IFO12898的染色体DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：130所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：131所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物进行PCR。将通过所述PCR扩增的DNA回收以获得用洋地黄毒苷标记和具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核苷酸57-730表示的核苷酸序列的DNA。
在类似方法下，通过将在实施例6中制备的塔氏糖多孢菌JCM 9393t的染色体DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：61所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：62所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物进行PCR。回收通过所述PCR扩增的DNA以获得用洋地黄毒苷标记和具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的DNA。
另外，在类似的方法下，通过将在实施例11中制备的砖红色链霉菌ATCC 21469的染色体DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：70所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：71所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物进行PCR。回收通过所述PCR扩增的DNA以获得用洋地黄毒苷标记和具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的DNA。另外，通过将上述染色体DNA用作模板和通过将由SEQ ID NO：132所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：133所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物进行PCR。回收通过所述PCR扩增的DNA以获得用洋地黄毒苷标记和具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的核苷酸21-691表示的核苷酸序列的DNA。
(2)斑点杂交
将在实施例4中制备的pKSN657的DNA(包含本发明DNA(A1)的DNA)，在实施例7中制备的pKSN923的DNA(包含本发明DNA(A2)的DNA)，在实施例12中制备的pKSN671的DNA(包含本发明DNA(A3)的DNA)，在实施例14中制备的pKSNSCA的DNA(包含本发明DNA(A9)的DNA)和在实施例10中制备的pKSN11796的DNA(包含本发明DNA(A10)的DNA)中的每一个以100ng和10ng的量印迹到尼龙膜HybondN+(Amersham Pharmacia Company)上。用透射仪将紫外光指向获得的膜5分钟。
按照附带的手册将DIG-High Prime DNA标记和检测Starter试剂盒II(Roche Diagnostics GmbH Company)用于杂交和检测。作为探针，使用用洋地黄毒苷标记和在实施例30(1)中生产的DNA中的每一个，其在100℃保持5分钟和然后快速在冰中冷却(以下称为“DIG标记的探针”)。将印迹的上述膜在42℃下在所述试剂盒提供的2.0ml DIGEasyHyb中振荡30分钟。接下来，将2.0ml Dig Easy Hyb，5.0μl DIG标记的探针和膜密封到塑料袋中以杂交，并保持在42℃下18小时。回收膜，在室温下在包含0.1％SDS的2x SSC中振荡2次5分钟，然后在65℃下在包含0.1％SDS的0.5x SSC中振荡2次15分钟。随后，将膜在50ml洗涤缓冲液中振荡2分钟，然后在室温下在50ml封闭液中振荡30分钟，然后在2.0ml抗体溶液中振荡30分钟，然后在50ml洗涤缓冲液中振荡2次15分钟。另外，在50ml检测缓冲液中振荡5分钟以后，将膜密封在含有2.0ml显色底物的杂交袋中并保持在室温下18小时。在用10ng和100ng pKSN657，pKSN923，pKSN671，pKSNSCA和pKSN11796中每一个的每种试剂进行杂交的每种情形中检测到信号。
实施例31 获得本发明DNA(A11)
(1)黑胡桃链霉菌IFO 13445的染色体DNA的制备
在50ml YGY培养基(0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.1％(w/v)葡萄糖和0.1％(w/v)K2HPO4，pH 7.0)中将黑胡桃链霉菌IFO 13445在30℃下振荡培养3天。回收细胞。将获得的细胞悬浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YGY培养基中并进一步振荡温育1天。从培养基中回收细胞。在用蒸馏水洗涤一次以后，将它悬浮在3.5ml缓冲液B1(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM EDTA，0.5％吐温-20和0.5％Triton X-100)中。将八十微升(80μl)100μg/ml的溶菌酶溶液和100μl Qiagen蛋白酶(600mAU/ml，Qiagen Company)加入混悬液并保持在37℃1小时。接下来，加入1.2ml缓冲液B2(3M盐酸胍和20％吐温-20)，混合和保持50℃ 30分钟。将获得的细胞裂解液加入平衡在缓冲液QBT(750mM NaCl，50mM MOPS(pH7.0)，15％异丙醇和0.15％ TritonX-100)中的Qiagen基因组芯片100G(Qiagen Company)。接下来，在用7.5ml缓冲液QC(50mM MOPS(pH7.0)和15％异丙醇)洗涤芯片2次以后，通过流动5ml缓冲液QF(1.25M NaCl，50mM Tris HCl(pH 8.5)，15％异丙醇)洗脱DNA。将三和十分之五毫升(3.5ml)异丙醇混合到获得的DNA溶液中以沉淀和回收染色体DNA。在用70％乙醇洗涤以后，将回收的DNA溶解在1ml TB缓冲液中。
(2)具有本发明DNA(A11)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例31(1)中制备的染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。按照所述载体附带的说明书将扩增的DNA连接到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)和然后导入大肠杆菌TOP 10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen Company)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用具有SEQ ID NO：57所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：59所示核苷酸序列的引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(AppliedBiosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。结果，提供在SEQ ID NO：139所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例31(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：161所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1(Universal Genome Walker试剂盒(Clontech Company))，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：162所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2(UniversalGenome Walker试剂盒(Clontech Company))，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：144所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例31(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：163所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1(Universal Genome Walker试剂盒(Clontech Company))，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ IDNO：164所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2(UniversalGenome Walker试剂盒(Clontech Cormpany))，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：144所示核苷酸序列的核苷酸983至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A11)的序列分析
通过连接由实施例31(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：144中表示的核苷酸序列。存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1230个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码409个氨基酸残基(SEQ IDNO：159)的核苷酸序列(SEQ ID NO：139)以及由207个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码68个氨基酸残基(SEQ ID NO：149)的核苷酸序列(SEQ ID NO：154)。由SEQ ID NO：139所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：159)组成的蛋白质的分子量据计算为45177Da。另外，由SEQ ID NO：154所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：149)组成的蛋白质的分子量据计算为7147Da。
实施例32 本发明蛋白质(A11)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明蛋白质(A11)的转化大肠杆菌的产生
通过将在实施例31(1)中从黑胡桃链霉菌IFO13445制备的染色体DNA用作模板和通过使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：165所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：166所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对。反应溶液组成和保持类似于实施例27(1)所述情形。将保持后的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收包含约1.5kbp的DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述载体附带的说明书将获得的DNA连接到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA。按照所述试剂盒附带的说明书，使用分别具有SEQ ID NO：57，59，和186所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用染料终止循环测序FS简易反应试剂盒(Applied Biosystems日本公司)进行测序反应。测序反应使用获得的质粒DNA作为模板。用DNA测序仪3100(Applied Biosystems日本公司)分析反应产物。基于结果，将具有SEQ ID NO：144所示核苷酸序列的质粒命名为pCR849AF。
接下来，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR849AF。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切割包含约1.5kbp DNA的凝胶区域。通过按照附带的说明书使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)从回收的凝胶中纯化DNA。按照所述试剂盒附带的说明书用连接试剂盒版本2(Takara Shuzo Company)连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2并导入大肠杆菌JM109。从获得的大肠杆菌转化体制备质粒DNA。分析其结构。将其中编码本发明蛋白质(A11)的约1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间、包含SEQ ID NO：144所示核苷酸序列的质粒命名为pKSN849AF。将质粒pKSN849AF导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN849AF。另外，将质粒pKSN2导入大肠杆菌JM109。获得的大肠杆菌转化体命名为JM109/pKSN2。
(2)本发明蛋白质(A11)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN849AF和JM109/pKSN2的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN849AF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN849AF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。反应溶液由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其包含3ppm用14C标记的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(Sigma Company)和23μl在实施例32(2)中回收的上清液级分。类似于实施例4(3)，用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层进行TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN849AF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例33 获得本发明DNA(A12)
(1)津岛链霉菌IFO 13782的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备津岛链霉菌IFO 13782的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A12)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例33(1)中制备的津岛链霉菌IFO 13782染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：140所示核苷酸序列的核苷酸364至1096中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例33(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：167所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：168所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：145所示核苷酸序列的核苷酸1至392中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例33(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：169所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：170所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：145所示核苷酸序列的核苷酸1048至1480中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A12)的序列分析
通过连接由实施例33(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：145中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1278个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码425个氨基酸残基(SEQ ID NO：160)的核苷酸序列(SEQ ID NO：140)以及由198个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码65个氨基酸残基(SEQ IDNO：150)的核苷酸序列(SEQ ID NO：155)。由SEQ ID NO：140所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：160)组成的蛋白质的分子量据计算为46549Da。另外，由SEQ ID NO：155所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：150)组成的蛋白质的分子量据计算为6510Da。
实施例34 本发明DNA(A12)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A12)的转化大肠杆菌的产生
类似于实施例32(1)，除了将在实施例33(1)中从津岛链霉菌IFO13782制备的染色体DNA用作模板和将具有SEQ ID NO：171所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：172所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分别具有SEQ IDNO：57，59，171，172和187所示核苷酸序列的寡核苷酸分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将含有SEQ ID NO：145所示核苷酸序列的质粒命名为pCR1618F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1618F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得包含SEQ IDNO：145所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A12)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点(以下称为“pKSN1618F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1618F。
(2)本发明蛋白质(A12)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1618F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1618F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1618F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。除了使用在实施例34(2)中回收的上清液级分(大肠杆菌pKSN1618F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)以外，类似于实施例32(3)制备反应溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1618F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例35 获得本发明DNA(A13)
(1)热淡天蓝链霉菌IFO 14273t的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备热淡天蓝链霉菌IFO 14273t的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A13)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例35(1)中制备的热淡天蓝链霉菌IFO 14273t染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：141所示核苷酸序列的核苷酸295至1027中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例35(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：173所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：174所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：146所示核苷酸序列的核苷酸1至370中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例35(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：175所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：176所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：146所示核苷酸序列的核苷酸960至1473中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A13)的序列分析
通过连接由实施例35(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：146中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1209个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码402个氨基酸残基(SEQ ID NO：136)的核苷酸序列(SEQ ID NO：141)以及由252个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码83个氨基酸残基(SEQ IDNO：151)的核苷酸序列(SEQ ID NO：156)。由SEQIDNO：141所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQID NO：136)组成的蛋白质的分子量据计算为44629Da。另外，由SEQ ID NO：156所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：151)组成的蛋白质的分子量据计算为8635Da。
实施例36 本发明蛋白质(A13)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明蛋白质(A13)的转化大肠杆菌的产生
类似于实施例32(1)，除了将在实施例35(1)中从热淡天蓝链霉菌IFO 14273t制备的染色体DNA用作模板和将具有SEQ ID NO：177所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：178所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分别具有SEQ ID NO：57，59，173，175和188所示核苷酸序列的寡核苷酸分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：146所示核苷酸序列的质粒命名为pCR474F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR474F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得包含SEQ ID NO：146所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A13)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点(以下称为“pKSN474F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN474F。
(2)本发明蛋白质(A13)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN474F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN474F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN474F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。除了使用在实施例36(2)中回收的上清液级分(大肠杆菌pKSN474F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)以外，类似于实施例32(3)制备反应溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN474F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例37 获得本发明DNA(A14)
(1)热淡天蓝链霉菌IFO 14273t的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备热淡天蓝链霉菌IFO 14273t的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A13)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例37(1)中制备的球团产色链霉菌IFO 13673t染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：142所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例37(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：179所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：180所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：147所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例37(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：181所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：182所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：147所示核苷酸序列的核苷酸982至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A14)的序列分析
通过连接由实施例37(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：147中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1230个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码409个氨基酸残基(SEQ ID NO：137)的核苷酸序列(SEQ ID NO：142)以及由207个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码68个氨基酸残基(SEQ IDNO：152)的核苷酸序列(SEQ ID NO：157)。由SEQ ID NO：142所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：137)组成的蛋白质的分子量据计算为45089Da。另外，由SEQ ID NO：157所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)组成的蛋白质的分子量据计算为7174Da。
实施例38 本发明DNA(A14)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A14)的转化大肠杆菌的产生
类似于实施例32(1)，除了将在实施例37(1)中制备的球团产色链霉菌IFO13673t染色体DNA用作模板和将具有SEQ ID NO：183所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：184所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分别具有SEQ IDNO：57，59和189所示核苷酸序列的寡核苷酸分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：147所示核苷酸序列的质粒命名为pCR1491AF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1491AF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得包含SEQ ID NO：147所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A14)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点(以下称为“pKSN1491AF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1491AF。
(2)本发明蛋白质(A14)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1491AF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1491AF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1491AF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。除了使用在实施例38(2)中回收的上清液级分(大肠杆菌pKSN1491AF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)以外，类似于实施例32(3)制备反应溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1491AF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例39 获得本发明DNA(A15)
(1)橄榄产色链霉菌IFO12444的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备橄榄产色链霉菌IFO 12444的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A15)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例39(1)中制备的橄榄产色链霉菌IFO 12444染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：143所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例37(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的DNA作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：179所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：180所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：148所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例39(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：181所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：182所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：148所示核苷酸序列的核苷酸982至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A15)的序列分析
通过连接由实施例39(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：148中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1230个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码409个氨基酸残基(SEQ ID NO：138)的核苷酸序列(SEQ ID NO：143)以及由207个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码68个氨基酸残基(SEQ IDNO：153)的核苷酸序列(SEQ ID NO：158)。由SEQ ID NO：143所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：138)组成的蛋白质的分子量据计算为45116Da。另外，由SEQ ID NO：158所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：153)组成的蛋白质的分子量据计算为7179Da。
实施例40 本发明DNA(A15)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A15)的转化大肠杆菌的产生
类似于实施例32(1)，除了将在实施例39(1)中制备的橄榄产色链霉菌IFO12444染色体DNA用作模板和将具有SEQ ID NO：184所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：185所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRJI-TOPO(Invitrogen公司)中。用分别具有SEQ IDNO：57，59和189所示核苷酸序列的寡核苷酸分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：148所示核苷酸序列的质粒命名为pCR1555AF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1555AF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得包含SEQ ID NO：148所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A15)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点(以下称为“pKSN1555AF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1555AF。
(2)本发明蛋白质(A15)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1555AF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1555AF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1555AF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
制备30μ1的反应溶液并保持在30℃下10分钟。除了使用在实施例40(2)中回收的上清液级分(大肠杆菌pKSN1555AF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)以外，类似于实施例32(3)制备反应溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(IH)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1555AF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例41 通过本发明蛋白质(A1)的化合物的代谢
(1)质体级分的制备
将一百克(100g)萝卜绿叶种子(Takii Seed)锯到托盘中潮湿的实验室纸抹布中，在25℃下黑暗中培养6天，然后在荧光灯下培养4小时。用Nissei AM-8匀浆器(Nihonseiki Seisakusho；18,000-20,000rpm，4℃，5秒)在破裂缓冲液(1mM氯化镁，20mM N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，10mM N-2-羟乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，0.5mM EDTA，5mM半胱氨酸，0.5M蔗糖；pH7.7)中磨碎三十克(30g)新变绿的子叶。将获得的细胞裂解液通过4层尼龙gause。将获得的溶液离心(13,170xg，1分钟)。用60ml破裂缓冲液悬浮获得的残余物级分并离心(2,640xg，4℃，2分钟)。将残余物级分重悬浮在10ml破裂缓冲液中，在离心管中用高密度缓冲液(1mM氯化镁，20mMN-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，30mM N-2-羟乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，0.5mM EDTA，5mM半胱氨酸，0.6M蔗糖；pH7.7)分层，并离心(675xg，4℃，15分钟)。将残余物悬浮在3ml悬浮缓冲液(1mM氯化镁，20mM N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，30mM N-2-羟乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，0.5mM EDTA；pH7.7)中并称为质体级分。
(2)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(XII)的代谢
制备50mM磷酸钾(pH 7.0)的100μl反应溶液，其包含5ppm化合物(XII)，3mM β-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental Yeast Company)，1mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(SigmaCompany)，0.15U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(SigmaCompany)和20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分。将反应溶液保持在30℃下10分钟。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C和在实施例4(2)中制备的上清液级分的至少一种组分的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)的100μl反应溶液。将十微升(10μl)2N HCl和500μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。在8,000xg下将产生的反应溶液离心以回收490μl乙酸乙酯层。在减压下干燥乙酸乙酯层以后，将残余物溶解在100μl50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在HPLC上分析四十微升(40μl)级分溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的级分溶液称为“(XII)代谢溶液(A1)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的级分溶液称为“(XII)对照溶液(A1)”)。与从(XII)对照溶液(A1)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A1)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A1)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A1)中未检测到。对于在该峰中包含的化合物进行质谱分析。包含在该峰中的化合物的质量比化合物(XII)的质量小14。
混合二十微升(20μl)稀释32倍的上述(XII)代谢溶液(A1)和60μl在实施例41(1)中制备的质体级分。在黑暗条件下，加入20μl底物溶液(10mM腺苷三磷酸，5mM氨基乙酰丙酸，4mM谷胱甘肽还原酶和0.6mM NAD+；pH 6.5；以下，该底物溶液称为“PPO底物溶液”)并在30℃下保持1.5小时。另外，代替所述20μl稀释32倍的(XII)代谢溶液(A1)，制备加入20μl稀释32倍的(XII)对照溶液(A1)的反应溶液，类似地加入和保持PPO底物溶液。将三百(300μl)二甲亚砜-甲醇混合物(二甲亚砜：甲醇＝7:3)加入保持以后的每个反应溶液中并离心(8000xg，4℃，10分钟)。回收上清液并在以下分析条件下进行反相HPC分析以测量PPIX的量。加入(XII)代谢溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量多于加入(XII)对照溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量。
(HPLC分析条件2)
柱：SUMIPAX ODS212(Sumika Chemical Analysis Service)
流速：2ml/分钟
检测波长：荧光Ex：410nm Em：630nm
洗脱剂：甲醇和1M乙酸铵的95∶5混合物(pH5.7)
(3)通过本发明(A1)的化合物(XIII)的代谢
除了使用5ppm化合物(XIII)而不是5ppm化合物(XII)以外，类似实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液中的每一个，将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A1)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A1)”)。与从(XIII)对照溶液(A1)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A1)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A1)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A1)中未检测到。对于在该峰中包含的化合物进行质谱分析。包含在该峰中的化合物的质量比化合物(XIII)的质量小14。
混合二十微升(20μl)稀释128倍的上述(XIII)代谢溶液(A1)和60μl质体级分。在黑暗条件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小时。另外，代替所述20μl稀释128倍的(XIII)代谢溶液(A1)，制备加入20μl稀释128倍的(XIII)对照溶液(A1)的反应溶液，类似地加入和保持PPO底物溶液。类似于实施例4(2)，制备保持后的各种反应溶液并在上述分析条件2下进行反相HPLC分析以测量PPIX的量。加入(XIII)代谢溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量多于加入(XIII)对照溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量。
(4)通过本发明(A1)的化合物(XVI)的代谢
除了使用12.5ppm化合物(XVI)而不是5ppm化合物(XII)以外，类似实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液中的每一个，将获得的残余物溶解在200μl50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVI)代谢溶液(A1)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVI)对照溶液(A1)”)。与从(XVI)对照溶液(A1)检测的化合物(XVI)的浓度相比，从(XVI)代谢溶液(A1)检测的化合物(XVI)的浓度较低。另外从(XVI)代谢溶液(A1)检测到峰，其从(XVI)对照溶液(A1)中未检测到。
混合二十微升(20μl)稀释8倍的上述(XVI)代谢溶液(A1)和60μl质体级分。在黑暗条件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小时。另外，代替所述20μl稀释8倍的(XVI)代谢溶液(A1)，制备加入20μl稀释8倍的(XVI)对照溶液(A1)的反应溶液，类似地加入和保持PPO底物溶液。类似于实施例41(2)，制备保持后的各种反应溶液并在上述分析条件2下进行反相HPLC分析以测量PPIX的量。加入(XVI)代谢溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量多于加入(XVI)对照溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量。
(5)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(XVII)的代谢
除了使用12.5ppm化合物(XVII)而不是5ppm化合物(XII)以外，类似实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液中的每一个，将获得的残余物溶解在200μl50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVII)代谢溶液(A1)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例4(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVII)对照溶液(A1)”)。与从(XVII)对照溶液(A1)检测的化合物(XVII)的浓度相比，从(XVII)代谢溶液(A1)检测的化合物(XVII)的浓度较低。另外从(XVII)代谢溶液(A1)检测到峰，其从(XVII)对照溶液(A1)中未检测到。
混合二十微升(20μl)稀释32倍的上述(XVII)代谢溶液(A1)和60μl质体级分。在黑暗条件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小时。另外，代替所述20μl稀释32倍的(XVII)代谢溶液(A1)，制备加入20μl稀释32倍的(XVII)对照溶液(A1)的反应溶液，类似地加入和保持PPO底物溶液。类似于实施例41(2)，制备保持后的各种反应溶液并在上述分析条件2下进行反相HPLC分析以测量PPIX的量。加入(XVII)代谢溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量多于加入(XVII)对照溶液(A1)的反应溶液中PPIX的量。
(6)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(VI)的代谢
将大肠杆菌JM109/pKSN657F在37℃下在3ml包含50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养基转移至100ml包含50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中并在26℃下培养。当OD660达到约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟以后，加入IPTG至1mM的终浓度，进一步培养20小时。
从培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1％葡萄糖的0.1M Tris-HCl中。将化合物(VI)加入获得的细胞混悬液至100ppm的终浓度并在30℃下振荡温育。分别在振荡开始0小时和1天时，分级分离2ml细胞混悬液。每个加入五十微升(50μl)2N HCl并用2ml乙酸乙酯萃取。在反应条件1下在HPLC上分析获得的乙酸乙酯层。与从振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(VI)的浓度相比，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(VI)的浓度较低。另外，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测到峰，其在振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层中未检测到。进行包含在所述峰中的化合物的质谱分析。包含在所述峰中的化合物的质量比化合物(VI)的质量小14。
(7)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(VIII)的代谢
除了使用化合物(VIII)而不是化合物(VI)以外，按照实施例41(6)所述方法进行大肠杆菌JM109/pKSN657F的培养，细胞混悬液的制备，加入化合物(VIII)的细胞混悬液的振荡温育，从细胞混悬液的试剂制备和试剂的HPLC分析。与从振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(VIII)的浓度相比，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(VIII)的浓度较低。另外，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测到两个峰，其在振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层中未检测到。进行包含在所述峰中的化合物的质谱分析。包含在所述峰中之一的化合物的质量比化合物(VIII)的质量小14，包含在另一个峰中的化合物的质量比化合物(VIII)的质量小28。
(8)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(X)的代谢
除了使用化合物(X)而不是化合物(VI)以外，按照实施例41(6)所述方法进行大肠杆菌JM109/pKSN657F的培养，细胞混悬液的制备，加入化合物(X)的细胞混悬液的振荡培养，从细胞混悬液的试剂制备和试剂的HPLC分析。与从振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(X)的浓度相比，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(X)的浓度较低。另外，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测到两个峰，其在振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层中未检测到。进行包含在所述峰中的化合物的质谱分析。包含在所述峰中之一的化合物的质量比化合物(X)的质量小40，包含在另一个峰中的化合物的质量比化合物(X)的质量小54。
(9)通过本发明蛋白质(A1)的化合物(XI)的代谢
除了使用化合物(XI)而不是化合物(VI)以外，按照实施例41(6)所述方法进行大肠杆菌JM109/pKSN657F的培养，细胞混悬液的制备，加入化合物(XI)的细胞混悬液的振荡培养，从细胞混悬液的试剂制备和试剂的HPLC分析。与从振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(XI)的浓度相比，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(XI)的浓度较低。另外，从振荡开始后1天的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测到两个峰，其在振荡开始后0小时的细胞混悬液制备的乙酸乙酯层中未检测到。进行包含在所述峰中的化合物的质谱分析。包含在所述峰中之一的化合物的质量比化合物(XI)的质量小14，包含在另一个峰中的化合物的质量比化合物(XI)的质量小16。
实施例42 通过本发明蛋白质(A11)的化合物的代谢
(1)通过本发明化合物(A11)的化合物(X)的代谢
将大肠杆菌JM109/pKSN849AF和大肠杆菌JM109/pKSN2各自在37℃下在3ml包含50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中培养过夜。将一毫升(1ml)获得的培养基转移至100ml包含50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中并在26℃下培养。当OD660达到约0.5时，将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，继续培养。三十(30)分钟以后，加入IPTG至1mM的终浓度，进一步培养18小时。
从培养基中回收细胞，用0.1M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和悬浮在10ml包含1％葡萄糖的0.1M Tris-HCl中。将化合物(X)加入获得的细胞混悬液至25ppm的终浓度并在30℃下振荡温育。分别在振荡开始0小时和4天时，分级分离2ml细胞混悬液。每个加入五十微升(50μl)2N HCl并用2ml乙酸乙酯萃取。在反应条件1下在HPLC上分析获得的乙酸乙酯层。与从JM109/pKSN2细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(X)的浓度相比，从JM109/pKSN849AF细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测的化合物(X)的浓度较低。另外，从JM109/pKSN849AF细胞混悬液制备的乙酸乙酯层检测到3个峰，其在从JM109/pKSN2细胞混悬液制备的乙酸乙酯层中未检测到。在3个峰中，峰1在HPLC中的洗脱时间与质量比实施例41(8)中检测的化合物(X)小40的化合物的峰洗脱时间相配。另外，另一个峰的HPLC洗脱时间与质量比实施例41(8)中检测的化合物(X)小54的化合物的峰洗脱时间相配。
在干燥后，分别地，将从上述JM109/pKSN2细胞混悬液制备的1ml乙酸乙酯层和1ml从上述JM109/pKSN849AF细胞混悬液制备的乙酸乙酯层，残余物溶解在1ml二甲亚砜中(以下，将来自从JM109/pKSN849AF制备的乙酸乙酯层的溶液称为“(X)代谢溶液(A11)”；另外，将来自从JM109/pKSN2细胞混悬液制备的乙酸乙酯层的溶液称为“(X)对照溶液(A11)”)。
混合二十微升(20μl)稀释128倍的上述(X)代谢溶液(A11)和60μl质体级分。在黑暗条件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小时。另外，代替所述20μl稀释128倍的(X)代谢溶液(A11)，制备加入20μl稀释128倍的(X)对照溶液(A11)的反应溶液，类似地加入和保持PPO底物溶液。类似于实施例41(2)，制备保持后的各种反应溶液并在上述分析条件2下进行反相HPLC分析以测量PPIX的量。加入(X)代谢溶液(A11)的反应溶液中PPIX的量多于加入(X)对照溶液(A11)的反应溶液中PPIX的量。
(2)通过本发明蛋白质(A11)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A11)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A11)”)。与从(XII)对照溶液(A11)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A11)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A11)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A11)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(3)通过本发明蛋白质(A11)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A11)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A11)”)。与从(XIII)对照溶液(A11)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A11)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A11)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A11)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)(XIII)代谢溶液(A11)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(4)通过本发明蛋白质(A11)的化合物(XVI)的代谢
除了使用20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(4)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在200μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVI)代谢溶液(A11)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVI)对照溶液(A11)”)。与从(XVI)对照溶液(A11)检测的化合物(XVI)的浓度相比，从(XVI)代谢溶液(A11)检测的化合物(XVI)的浓度较低。另外从(XVI)代谢溶液(A11)检测到峰，其从(XVI)对照溶液(A11)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与在实施例41(4)中从(XVI)代谢溶液(A11)中检测到和在(XVI)对照溶液(A11)中未检测到的峰的洗脱时间相配。
(5)通过本发明蛋白质(A11)的化合物(XVII)的代谢
除了使用20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(5)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在200μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVII)代谢溶液(A11)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例32(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XVII)对照溶液(A11)”)。与从(XVII)对照溶液(A11)检测的化合物(XVII)的浓度相比，从(XVII)代谢溶液(A11)检测的化合物(XVII)的浓度较低。另外从(XVII)代谢溶液(A11)检测到峰，其从(XVII)对照溶液(A11)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与在实施例41(5)中从(XVII)代谢溶液(A1)中检测到和在(XVII)对照溶液(A1)中未检测到的峰的洗脱时间相配。
实施例43通过本发明蛋白质(A2)，(A3)，(A12)，(A13)，(A14)或(A15)或本发明蛋白质(A10)的化合物的代谢
(1)通过本发明蛋白质(A2)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例7(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例7(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A2)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例7(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A2)”)。与从(XII)对照溶液(A2)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A2)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A2)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A2)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(2)通过本发明蛋白质(A3)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例12(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例12(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A3)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例7(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A3)”)。与从(XII)对照溶液(A3)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A3)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A3)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A3)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(3)通过本发明蛋白质(A10)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例10(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例10(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A10)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例12(3)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A10)”)。与从(XII)对照溶液(A10)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A10)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A10)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A10)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(4)通过本发明蛋白质(A12)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例34(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例34(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A12)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例34(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A12)”)。与从(XII)对照溶液(A12)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A12)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A12)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A12)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(5)通过本发明蛋白质(A13)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例36(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例36(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A13)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例36(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A13)”)。与从(XII)对照溶液(A13)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A13)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A13)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A13)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(6)通过本发明蛋白质(A14)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例38(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例38(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A14)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例38(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A14)”)。与从(XII)对照溶液(A14)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A14)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A14)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A14)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(7)通过本发明蛋白质(A15)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例40(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例40(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)代谢溶液(A15)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例40(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XII)对照溶液(A15)”)。与从(XII)对照溶液(A15)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A15)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A15)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A15)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(8)通过本发明蛋白质(A2)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例7(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例7(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A2)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例7(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A2)”)。与从(XIII)对照溶液(A2)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A2)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A2)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A2)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(9)通过本发明蛋白质(A3)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例12(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例12(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A3)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例12(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A3)”)。与从(XIII)对照溶液(A3)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A3)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A3)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A3)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(10)通过本发明蛋白质(A10)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例10(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例10(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A10)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例10(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A10)”)。与从(XIII)对照溶液(A10)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A10)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A10)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A10)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(11)通过本发明蛋白质(A12)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例34(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例34(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A12)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例34(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A12)”)。与从(XIII)对照溶液(A12)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A12)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A12)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A12)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(12)通过本发明蛋白质(A13)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例36(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例36(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A13)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例36(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A13)”)。与从(XIII)对照溶液(A13)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A13)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A13)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A13)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(13)通过本发明蛋白质(A14)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例38(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例38(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A14)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例38(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A14)”)。与从(XIII)对照溶液(A14)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A14)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A14)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A14)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(14)通过本发明蛋白质(A15)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例40(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例4(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例41(3)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各种反应溶液，并将获得的残余物溶解在100μl二甲亚砜中。在上述分析条件1下在HPLC上分析获得的溶液(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例40(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)代谢溶液(A15)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例40(2)中回收的上清液级分的反应溶液的溶液称为“(XIII)对照溶液(A15)”)。与从(XIII)对照溶液(A15)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A15)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A15)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A15)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
实施例44 识别本发明蛋白质(A1)的本发明抗体(A)(以下称为“本发明抗体(A1)”)的制备
(1)表达本发明蛋白质(A1)的大肠杆菌提取物的制备
按照实施例4(2)所述方法，将表达本发明蛋白质(A1)的大肠杆菌JM109/pKSN657F预培养过夜，然后在包含50μg/ml氨苄青霉素的1L TB培养基中培养。在回收和破裂细胞以后，从获得的细胞裂解液中制备上清液级分(大肠杆菌pKSN657F提取物)。
(2)本发明蛋白质(A1)的纯化
通过将在实施例44(1)中获得的上清液级分(大肠杆菌pKSN657F提取物)依次进行Hiload HiLoad26/10Q Sepharose HP柱和然后Bio-ScaleCeramic羟磷灰石，I型柱CHT10-1柱，按照实施例2(4)所述方法纯化本发明蛋白质(A1)。在10％-20％SDS-PAGE上分析纯化的级分，以证实那些是仅为本发明蛋白质(A1)的级分。
(3)本发明抗体(A1)的制备
将在实施例44(2)中制备的本发明蛋白质(A1)溶解在0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，以使浓度为1mg/ml。将已经在42℃-43℃温育的四十微升(40μl)RAS(MPL(单磷酰基脂A)+TDM(合成海藻糖Dicorynomycolate)+CWS(细胞壁骨架)佐剂系统(Sigma Company))加入并充分混合到2ml获得的溶液中。分别将获得的混合物以每只兔子1ml施用到新西兰白兔(雌性，14周龄，平均2.4kg)上。因此，将100μl皮下注射到背部10个位置。在每3周和5周后施用第一次给药量的约1/2。在该时间期间，通过从兔子的耳静脉取血样测量抗体效价。因为抗体效价在第三次给药后增加，将第三次给药后2周的免疫兔子被从颈部放血。将获得的血液加入Separapit Tube(Sekisui Chemical Company)，在37℃下温育2小时和然后离心(3000rpm，20分钟，室温)。通过回收上清液获得抗血清(包含本发明抗体(A1))。
实施例45 通过本发明抗体(A1)检测本发明蛋白质和检测表达本发明蛋白质的细胞
通过使用在实施例44中获得的本发明抗体(A1)对每个大肠杆菌提取物进行免疫印迹。有以下提取物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(40mA，1小时)：在实施例4(2)中获得的大肠杆菌pKSN657F提取物(包含约0.5pmol本发明蛋白质(A1)，包含约0.78mg蛋白质)；在实施例4(2)中获得的大肠杆菌pKSN2提取物(包含约0.78mg蛋白质)；在实施例7(2)中获得的大肠杆菌pKSN923F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A2))；在实施例12(2)中获得的大肠杆菌pKSN671F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A3))；在实施例27(2)中获得的大肠杆菌pKSN646F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A4))；在实施例10(2)中获得的大肠杆菌pKSN11796F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A10))；在实施例14(2)中获得的大肠杆菌pKSNSCA提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A9))；在实施例32(2)中获得的大肠杆菌pKSN849AF提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A11))；在实施例34(2)中获得的大肠杆菌pKSN1618F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A12))；在实施例36(2)中获得的大肠杆菌pKSN474F提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A13))；在实施例38(2)中获得的大肠杆菌pKSN1491AF提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A14))；和在实施例40(2)中获得的大肠杆菌pKSN1555AF提取物(包含约2pmol本发明蛋白质(A15))。将PVDF膜放在凝胶上。通过用BioRad印迹装置在4℃下30V处理2小时，同时在浸渍在转移缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，10％甲醇)的条件下将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。在用TBS+吐温20溶液(50mMTris-HCl(pH 7.5)，200mM NaCl，0.05％吐温20)洗涤以后，将获得的PVDF膜在包含3％BSA的TBS+吐温20溶液中温育30分钟，然后用于与稀释30,000倍的上述抗血清在包含3％BSA的TBS+吐温20溶液中反应30分钟。在反应后，用TBS+吐温20溶液洗涤PVDF膜2次。然后将PVDF膜用于在包含3％BSA的TBS+吐温20溶液中与稀释3000倍的用碱性磷酸酶(Santa Cruz Biotechnology Company)标记的抗兔IgG山羊抗血清反应30分钟。在反应后，用TBS+吐温20溶液洗涤PVDF膜2次和浸渍在NBT-BCIP溶液(Sigma Company)中。检测到对应于本发明蛋白质(A1)，(A2)，(A3)，(A4)，(A11)，(A12)，(A13)，(A14)和(A15)以及本发明蛋白质(A9)和(A10)中每一个的条带的染色。用在实施例4(2)中获得的大肠杆菌pKSN2提取物(包含约0.78mg蛋白质)的试剂未检测到染色条带。
实施例46 其中密码子使用已经针对在大豆中表达调整的本发明DNA(A1)(以下称为“本发明DNA(A1)S”)的制备和表达
(1)本发明DNA(A1)S的制备
通过使用具有SEQ ID NO：192所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：213所示核苷酸序列的引物，按照附带的手册用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：191所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：212所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：190所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：211所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液1。
按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：195所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：210所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：194所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：209所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：193所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：208所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液2。
按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：198所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：207所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：197所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：206所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：196所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：205所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液3。
按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：201所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：204所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：200所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：203所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：199所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：202所示核苷酸序列的引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液4。
将如此获得的反应溶液1至4混合。按照附带的手册，通过将其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO：190所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：202所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。证实扩增的DNA的核苷酸序列。获得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’连接到SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’连接到SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表22和表23中显示具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的本发明DNA(A1)的密码子使用(GC含量70.58％)。在表24和表25中显示大豆的密码子使用(GC含量46.12％，由Kazusa DNA研究院出版的密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon))。在表26和表27中显示具有SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的本发明DNA(A1)的密码子使用(51.59％的GC含量)。
表22
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 0.00 TCT 0.00
TTC 3.18 TCC 1.71
TTA 0.00 TCA 0.00
TTG 1.22 TCG 2.20
CTT 0.00 CCT 0.00
CTC 3.67 CCC 4.16
CTA 0.00 CCA 0.00
CTG 7.09 CCG 2.69
ATT 0.24 ACT 0.24
ATC 4.16 ACC 2.69
ATA 0.00 ACA 0.24
ATG 2.69 ACG 1.96
GTT 0.24 GCT 0.00
GTC 3.67 GCC 7.58
GTA 0.00 GCA 0.49
GTG 3.18 GCG 3.42
表23
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.00 TGT 0.24
TAC 1.47 TGC 0.98
TAA 0.00 TGA 0.00
TAG 0.24 TGG 0.98
CAT 0.24 CGT 1.22
CAC 2.20 CGC 4.40
CAA 0.24 CGA 0.24
CAG 2.93 CGG 4.16
 
AAT 0.00 AGT 0.00
AAC 1.22 AGC 0.49
AAA 0.24 AGA 0.00
AAG 0.98 AGG 0.00
GAT 0.98 GGT 0.98
GAC 7.82 GGC 3.42
GAA 0.73 GGA 0.24
GAG 5.38 GGG 1.22
表24
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 2.03 TCT 1.71
TTC 2.09 TCC 1.21
TTA 0.82 TCA 1.45
TTG 2.21 TCG 0.44
CTT 2.36 CCT 2.00
CTC 1.66 CCC 1.01
CTA 0.82 CCA 2.05
CTG 1.22 CCG 0.40
ATT 2.61 ACT 1.78
ATC 1.64 ACC 1.49
ATA 1.27 ACA 1.51
ATG 2.27 ACG 0.41
GTT 2.67 GCT 2.81
GTC 1.24 GCC 1.69
GTA 0.73 GCA 2.27
GTG 2.20 GCG 0.59
表25
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 1.61 TGT 0.72
TAC 1.53 TGC 0.75
TAA 0.11 TGA 0.09
TAG 0.06 TGG 1.21
CAT 1.33 CGT 0.72
CAC 1.09 CGC 0.63
CAA 2.04 CGA 0.38
CAG 1.71 CGG 0.27
AAT 2.10 AGT 1.21
AAC 2.27 AGC 1.08
AAA 2.63 AGA 1.42
AAG 3.83 AGG 1.35
GAT 3.29 GGT 2.17
GAC 2.06 GGC 1.38
GAA 3.35 GGA 2.23
GAG 3.46 GGG 1.29
表26
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 1.71 TCT 0.98
TTC 1.47 TCC 0.73
TTA 0.98 TCA 0.98
TTG 2.93 TCG 0.24
CTT 3.18 CCT 2.44
CTC 2.20 CCC 1.22
CTA 0.98 CCA 2.69
CTG 1.71 CCG 0.49
 
ATT 2.20 ACT 1.71
ATC 1.22 ACC 1.47
ATA 0.98 ACA 1.47
ATG 2.69 ACG 0.49
GTT 2.93 GCT 4.16
GTC 1.22 GCC 2.69
GTA 0.73 GCA 3.67
GTG 2.20 GCG 0.98
表27
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.73 TGT 0.73
TAC 0.73 TGC 0.49
TAA 0.00 TGA 0.00
TAG 0.24 TGG 0.98
CAT 1.47 CGT 1.47
CAC 0.98 CGC 1.47
CAA 1.71 CGA 0.73
CAG 1.47 CGG 0.49
AAT 0.73 AGT 0.73
AAC 0.49 AGC 0.73
AAA 0.49 AGA 2.93
AAG 0.73 AGG 2.93
GAT 5.38 GGT 1.71
GAC 3.42 GGC 1.22
GAA 2.69 GGA 1.96
GAG 3.42 GGG 0.98
(2)具有本发明蛋白质(A1)S的转化大肠杆菌的生产
用限制酶NdeI和HindIII消化在实施例46(1)中获得的具有SEQ IDNO：214所示核苷酸序列的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得其中具有SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间的质粒(以下称为“pKSN657soy”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN657soy。
(3)本发明蛋白质(A1)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养在实施例46(2)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN657soy和在实施例4(1)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN657中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN657soy获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN657soy提取物”和将从大肠杆菌JM109/pKSN657获得的上清液级分称为“大肠杆菌JM109/pKSN657提取物”)。在大肠杆菌pKSN657soy提取物中包含的每一蛋白质的的量的P450的量可以比得上和高于在大肠杆菌pKSN657提取物中包含的每一蛋白质的量的P450的量。
实施例47 将本发明DNA(A1)S导入植物
(1)用于直接导入的包含本发明DNA(A1)S的叶绿体表达质粒的构建-部分1
构建包含嵌合DNA的质粒作为用基因枪法将本发明DNA(A1)S导入植物的质粒，所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
首先，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。通过将在实施例46(2)中获得的pKSN657soy用作模板和通过将由SEQ IDNO：394所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：395所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。PCR使用KOD-plus(ToyoboCompany)。依照以下进行PCR：在94℃下进行保持2分钟；30个循环，一个循环包括保持94℃ 30秒，接着50℃ 30秒，接着68℃ 60秒；和最后保持在68℃ 30秒。通过按照附带手册进行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收扩增的DNA并纯化。在用限制酶EcoT22I和SacI消化纯化的DNA以后，回收包含SEQID NO：214所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在实施例16(2)中获得的质粒pUCrSt657以后，分离约2.9kbp的DNA，其具有来源于pUC19的核苷酸序列和编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列。将获得的DNA和包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的上述DNA连接以获得包含嵌合DNA的pUCrSt657soy(图48)，其中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pUCrSt657soy以分离包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入在实施例16(2)中获得的质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt-657soy(图49)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在所选氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt-657soy具有SEQ ID NO：214所示核苷酸序列。
(2)用于直接导入的具有本发明DNA(A1)S的叶绿体表达质粒的构建-部分(2)
构建用基因枪法将本发明DNA(A1)S导入植物的质粒。该质粒包含嵌合DNA，其中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。首先，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。通过将在实施例46(2)中获得的pKSN657soy用作模板和通过将由SEQ ID NO：395所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：396所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下进行PCR：在94℃下进行保持2分钟；25个循环，一个循环包括保持94℃ 30秒，接着46℃ 30秒，接着68℃ 60秒；和最后保持在68℃ 3分钟。通过按照附带手册进行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收扩增的DNA并纯化。在用限制酶SacI消化纯化的DNA以后，回收包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。
用限制酶BspHI消化在实施例16(3)中获得的质粒pKFrSt12-657。然后通过按照附带手册使用TaKaRa BKL试剂盒(TaKaRa ShuzoCompany)将DNA平末端化和将5’末端去磷酸化。接下来，在用限制酶SacI消化DNA以后，分离来源于质粒pKFrSt12的DNA。将所述DNA与用SacI消化和包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA连接，以便获得包含嵌合DNA的质粒pKFrSt12-657soy(图50)，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pKFrSt12-657soy以分离包含SEQ ID NO：214所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy(图51)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy具有SEQ ID NO：214所示核苷酸序列。
(3)将本发明DNA(A1)S导入大豆
除了用B5培养基(O.L.Gamborg等，Exp.Cell Res.(1986)50p151)的维生素来源替代MS培养基的维生素来源以外，按照实施例17(1)所述方法制备大豆(栽培品种：Fayette和Jack)的球形胚。
将获得的球形胚移植到新鲜体细胞胚生长培养基中和培养2-3天。按照实施例17(2)所述方法，将在实施例47(1)中构建的质粒pSUM-NdG6-rSt-657soy或在实施例47(2)中构建的质粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy导入所述球形胚。
(4)用潮霉素选择体细胞胚
除了用B5培养基的维生素来源替代MS培养基的维生素来源以外，按照实施例17(3)所述方法进行用潮霉素选择在实施例47(3)中获得的在基因导入后的球形胚。然而，在第二次移植后，将加入0.2(w/v)％脱乙酰吉兰糖胶的培养基或未加脱乙酰吉兰糖胶的液体培养基用作体细胞胚选择培养基。在液体培养基的情形中，培养具有每分钟90和缓的旋转。
(5)用化合物(II)选择体细胞胚
除了用B5培养基的维生素来源替代MS培养基的维生素来源以外，按照实施例17(4)所述方法进行用化合物(II)选择在实施例47(3)中获得的导入基因以后的球形胚。
(6)从体细胞胚的植物再生，顺应和培养
按照实施例17(5)所述方法，从在实施例47(4)或47(5)中选择的球形胚进行植物的再生。然而，将发育培养基中的琼脂浓度调整至0.8(w/v)％或1.0(w/v)％。另外，用B5培养基的维生素来源替代发芽培养基的MS培养基的维生素来源。
相应地用实施例17(6)所述方法将具有根和发育的叶子的植物进行顺应和培养和收获。
(7)对除草化合物(II)的抗性评估
按照实施例17(4)所述方法评估在实施例47(6)中获得的再生植物对化合物(II)的抗性程度。
(8)用于农杆菌导入的具有本发明DNA(A1)S的叶绿体表达质粒的构建
构建用农杆菌法将本发明DNA(A1)S导入植物的质粒。用限制酶NotI消化质粒pSUM-NdG6-rSt-657soy以获得嵌合DNA，其中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将所述DNA插入在实施例18中获得的上述二元质粒载体pBI121S的NotI限制位点中以获得质粒pBI-NdG6-rSt-657soy(图52)。另外，用限制酶NotI消化质粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy以分离嵌合DNA，其中本发明DNA(A1)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将该DNA插入上述二元质粒载体pBI121S的NotI限制位点中以获得质粒pBI-NdG6-rSt12-657soy(图53)。
(9)将本发明DNA(A1)S导入烟草
使用在实施例47(8)中获得的质粒pBI-NdG6-rSt-657soy和pBI-NdG6-rSt12-657soy，用农杆菌法将本发明DNA(A1)S导入烟草。
首先，按照实施例19所述方法，分别将质粒pBI-NdG6-rSt-657soy和pBI-NdG6-rSt12-657soy导入根癌农杆菌LBA4404(Clontech Company)。分离具有pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的转基因农杆菌。
然后，除了在包含25mg/L卡那霉素的LB液体培养基中在30℃下过夜培养具有上述质粒的转基因农杆菌以外，按照实施例19所述方法将所述农杆菌用来将基因导入烟草。分别获得已经整合pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的T-DNA区域的转基因烟草。
(10)使用本发明DNA(A1)S转基因烟草的叶片的抗性评估
从35株在实施例47(9)中获得的转基因烟草采集叶子。将每片叶子分成几片，其中每片5-7mm宽。将叶片种植到含有0，0.05，0.1或0.2mg/L化合物(II)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养的第11天，观察每个叶片的除草损伤。另外，将叶片种植到含有0，0.01，0.02，0.05或0.1mg/L化合物(XII)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养的第7天，观察每个叶片的除草损伤。作为对照，将20个未进行基因导入的烟草叶片(以下，称为“野生型烟草”)用于各个浓度。通过对连续生长的叶片记1分，对其中观察到化学损伤的半枯萎的叶片记0.5分，和对变白和已经枯萎的叶片记0分，测定对每组的平均分数。对于化合物(II)和化合物(XII)中每一个，本发明DNA(A1)S(质粒pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的T-DNA区域)已经导入的烟草叶片提供比野生型烟草更高的分数。
实施例48 获得本发明DNA(A16)
(1)装饰链霉菌IFO 13069t的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备装饰链霉菌IFO 13069t的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A11)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例48(1)中从装饰链霉菌IFO13069t制备的染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其序列。结果，提供在SEQ ID NO：225所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例48(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：265所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：235所示核苷酸序列的核苷酸1至501中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例48(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：267所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：268所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：235所示核苷酸序列的核苷酸1044至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A16)的序列分析
通过连接由实施例48(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：235中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1251个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码416个氨基酸残基(SEQ ID NO：215)的核苷酸序列(SEQ ID NO：225)以及由198个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码65个氨基酸残基(SEQ IDNO：245)的核苷酸序列(SEQ ID NO：255)。由SEQ ID NO：225所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：215)组成的蛋白质的分子量据计算为46013Da。另外，由SEQ ID NO：255所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：245)组成的蛋白质的分子量据计算为6768Da。
实施例49 本发明DNA(A16)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A16)的转化大肠杆菌的产生
通过使用GeneAmp High Fidelity PCR System(Applied BiosystemsJapan Company)和通过使用在实施例48(1)中从装饰链霉菌IFO 13069t制备的染色体DNA作为模板进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：269所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：286所示核苷酸序列的寡核苷酸的配对。通过加入2种每种总计200nM的引物，50ng上述染色体DNA，5.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.0mM的混合物；Clontech公司)，5μl 10x缓冲液(包含MgCl2)和0.5μl GeneAmpHF酶混合物和通过加入蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在97℃ 1分钟后，重复10个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒；然后进行15个循环，一个循环包括保持在97℃ 15秒，接着60℃ 30秒，接着72℃ 90秒(其中每个循环保持在72℃增加20秒)；和然后保持72℃ 7分钟。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)中。通过将分别具有SEQ ID NO：57，59，267，286和288所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：235所示核苷酸序列的质粒称为pCR452F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR452F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：235所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A16)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN452F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN452F。
(2)本发明蛋白质(A16)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN452F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN452F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN452F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例49(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN452F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN452F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例50 获得本发明DNA(A17)
(1)灰色链霉菌ATCC 10137的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备灰色链霉菌ATCC 10137的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A17)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例50(1)中从灰色链霉菌ATCC 10137制备的染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：226所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例50(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：270所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：271所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：236所示核苷酸序列的核苷酸1至361中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例50(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：272所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：273所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：236所示核苷酸序列的核苷酸1035至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A17)的序列分析
通过连接由实施例50(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：236中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1251个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码416个氨基酸残基(SEQ ID NO：216)的核苷酸序列(SEQ ID NO：226)以及由198个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码65个氨基酸残基(SEQ IDNO：246)的核苷酸序列(SEQ ID NO：256)。由SEQ ID NO：226所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：216)组成的蛋白质的分子量据计算为46082Da。由SEQ ID NO：256所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：246)组成的蛋白质的分子量据计算为6768Da。在SEQ IDNO：256中所示的核苷酸序列与在SEQ ID NO：255中所示核苷酸序列100％相同。在SEQ ID NO：246中表示的氨基酸序列与在SEQ ID NO：245中表示的氨基酸序列100％相同。
实施例51 本发明DNA(A17)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A17)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例50(1)的灰色链霉菌ATCC 10137中制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：274所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：275所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例32(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：57，59，274，276和277所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物测序获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：236所示核苷酸序列的质粒称为pCR608F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR608F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：236所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A17)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN608F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN608F。
(2)本发明蛋白质(A17)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN608F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN608F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN608F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例51(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN608F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN608F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例52 获得本发明DNA(A18)
(1)不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A18)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例52(1)中制备的不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA用作模板和通过使用引物对17进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：227所示核苷酸序列的核苷酸526至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例52(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：278所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：279所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：237所示核苷酸序列的核苷酸1至600中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶BalI消化在实施例52(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：163所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：164所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：237所示核苷酸序列的核苷酸983至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A18)的序列分析
通过连接由实施例52(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：237中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1230个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码409个氨基酸残基(SEQ ID NO：217)的核苷酸序列(SEQ ID NO：227)以及由207个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码68个氨基酸残基(SEQ IDNO：247)的核苷酸序列(SEQ ID NO：257)。由SEQ ID NO：227所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：217)组成的蛋白质的分子量据计算为45099Da。由SEQ ID NO：257所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：247)组成的蛋白质的分子量据计算为7193Da。
实施例53 本发明DNA(A18)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A18)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例52(1)中的不产色链霉菌IFO 12735制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：183所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：280所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRJI-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68，163，279和281所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：237所示核苷酸序列的质粒称为pCR646BF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR646BF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：237所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A18)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN646BF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN646BF。
(2)本发明蛋白质(A18)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN646BF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN646BF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN646BF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例53(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN646BF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN646BF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例54 获得本发明DNA(A19)
(1)灰色链霉菌IFO 13849T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备灰色链霉菌IFO 13849T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A19)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例54(1)中制备的灰色链霉菌IFO13849T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：228所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例54(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：282所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：283所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：238所示核苷酸序列的核苷酸1至358中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例54(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：284所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：285所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：238所示核苷酸序列的核苷酸1005至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A19)的序列分析
通过连接由实施例54(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：238中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1251个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码416个氨基酸残基(SEQ ID NO：218)的核苷酸序列(SEQ ID NO：228)以及由156个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码51个氨基酸残基(SEQ IDNO：248)的核苷酸序列(SEQ ID NO：258)。由SEQ ID NO：228所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：218)组成的蛋白质的分子量据计算为45903Da。由SEQ ID NO：258所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：248)组成的蛋白质的分子量据计算为5175Da。
实施例55 本发明DNA(A19)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A19)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例54(1)中灰色链霉菌IFO 13849T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：286所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：287所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：57，59，284，286和288所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：238所示核苷酸序列的质粒称为pCR1502F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1502F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：238所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A19)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1502F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1502F。
(2)本发明蛋白质(A19)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1502F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1502F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1502F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μ1的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例55(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1502F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1502F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例56 获得本发明DNA(A20)
(1)羊毛链霉菌IFO 12787T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备羊毛链霉菌IFO 12787T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A20)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例56(1)中制备的羊毛链霉菌IFO 12787T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：229所示核苷酸序列的核苷酸304至1036中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PmacI消化在实施例56(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：278所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：289所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：239所示核苷酸序列的核苷酸1至318中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶StuI消化在实施例56(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：290所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：291所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：239所示核苷酸序列的核苷酸969至1461中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A20)的序列分析
通过连接由实施例56(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：239中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1218个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码405个氨基酸残基(SEQ ID NO：219)的核苷酸序列(SEQ ID NO：229)以及由231个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码76个氨基酸残基(SEQ IDNO：249)的核苷酸序列(SEQ ID NO：259)。由SEQ ID NO：229所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：219)组成的蛋白质的分子量据计算为45071Da。由SEQ ID NO：259所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：249)组成的蛋白质的分子量据计算为7816Da。
实施例57 本发明DNA(A20)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A20)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例56(1)羊毛链霉菌IFO 12787T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：292所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：293所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68，188，278和290所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ IDNO：239所示核苷酸序列的质粒称为pCR1525F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1525F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：239所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A20)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1525F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1525F。
(2)本发明蛋白质(A20)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1525F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1525F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1525F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例57(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1525F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1525F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例58 获得本发明DNA(A21)
(1)三泽链霉菌IFO 13855T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备三泽链霉菌IFO 13855T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A21)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例58(1)中制备的三泽链霉菌IFO13855T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：230所示核苷酸序列的核苷酸328至1063中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例58(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：294所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：295所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：240所示核苷酸序列的核苷酸1至341中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例58(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：296所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：297所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：240所示核苷酸序列的核苷酸1017至1458中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A21)的序列分析
通过连接由实施例58(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：240中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1245个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码414个氨基酸残基(SEQ ID NO：220)的核苷酸序列(SEQ ID NO：230)以及由201个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码66个氨基酸残基(SEQ IDNO：250)的核苷酸序列(SEQ ID NO：260)。由SEQ ID NO：230所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：220)组成的蛋白质的分子量据计算为45806Da。由SEQ ID NO：260所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：250)组成的蛋白质的分子量据计算为6712Da。
实施例59 本发明DNA(A21)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A21)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例58(1)中三泽链霉菌IFO 13855T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：298所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：299所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例32(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：57，59，296和300所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：240所示核苷酸序列的质粒称为pCR1543BF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1543BF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：240所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A21)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1543BF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1543BF。
(2)本发明蛋白质(A21)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1543BF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1543BF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1543BF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例59(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1543BF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1543BF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例60 获得本发明DNA(A22)
(1)苍白色链霉菌IFO13434T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备苍白色链霉菌IFO 13434T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A22)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例60(1)中制备的苍白色链霉菌IFO1 3434T染色体DNA用作模板和通过使用引物对15进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：231所示核苷酸序列的核苷酸483至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例60(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：301所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：302所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：241所示核苷酸序列的核苷酸68至516中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例60(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：302所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：303所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：241所示核苷酸序列的核苷酸1至270中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在实施例60(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：304所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：305所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：241所示核苷酸序列的核苷酸982至1448中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A22)的序列分析
通过连接由实施例60(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：241中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1230个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码409个氨基酸残基(SEQ ID NO：221)的核苷酸序列(SEQ ID NO：231)以及由195个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码64个氨基酸残基(SEQ IDNO：251)的核苷酸序列(SEQ ID NO：261)。由SEQ ID NO：231所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：221)组成的蛋白质的分子量据计算为45050Da。由SEQ ID NO：261所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：251)组成的蛋白质的分子量据计算为6914Da。
实施例61 本发明DNA(A22)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A22)的转化大肠杆菌的产生
除了使用从实施例60(1)中苍白色链霉菌IFO 13434T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：306所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：307所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例32(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68和308所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ IDNO：241所示核苷酸序列的质粒称为pCR1558BF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1558BF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：241所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A22)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1558BF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1558BF。
(2)本发明蛋白质(A22)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1558BF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1558BF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1558BF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例61(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1558BF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1558BF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例62 获得本发明DNA(A23)
(1)玫瑰变红链霉菌IFO 13682T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备玫瑰变红链霉菌IFO 13682T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A23)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例62(1)中制备的玫瑰变红链霉菌IFO13682T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：232所示核苷酸序列的核苷酸289至1015中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例62(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：309所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：310所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：242所示核苷酸序列的核苷酸1至354中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在实施例62(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：311所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：312所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：242所示核苷酸序列的核苷酸966至1411中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A23)的序列分析
通过连接由实施例62(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：242中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1197个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码398个氨基酸残基(SEQ ID NO：222)的核苷酸序列(SEQ ID NO：232)以及由201个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码66个氨基酸残基(SEQ IDNO：252)的核苷酸序列(SEQ ID NO：262)。由SEQ ID NO：232所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：222)组成的蛋白质的分子量据计算为43624Da。由SEQ ID NO：262所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：252)组成的蛋白质的分子量据计算为6797Da。
实施例63 本发明DNA(A23)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A23)的转化大肠杆菌的产生
除了使用在实施例62(1)中玫瑰变红链霉菌IFO13682T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：313所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：314所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68，309，311和315所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：242所示核苷酸序列的质粒称为pCR1584F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1584F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：242所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A23)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1584F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1584F。
(2)本发明蛋白质(A23)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1584F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1584F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1584F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例63(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1584F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1584F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例64 获得本发明DNA(A24)
(1)鲁地链霉菌IFO 15875T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备鲁地链霉菌IFO 15875T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A24)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在制备的实施例64(1)中鲁地链霉菌IFO15875T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：233所示核苷酸序列的核苷酸322至1057中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例64(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：316所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：317所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：243所示核苷酸序列的核苷酸1至384中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶NaeI消化在实施例64(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：318所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：319所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：243所示核苷酸序列的核苷酸992至1466中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A24)的序列分析
通过连接由实施例64(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：243中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1245个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码414个氨基酸残基(SEQ ID NO：223)的核苷酸序列(SEQ ID NO：233)以及由198个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码65个氨基酸残基(SEQ IDNO：253)的核苷酸序列(SEQ ID NO：263)。由SEQ ID NO：233所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：223)组成的蛋白质的分子量据计算为45830Da。由SEQ ID NO：263所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：253)组成的蛋白质的分子量据计算为7034Da。
实施例65 本发明DNA(A24)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A24)的转化大肠杆菌的产生
除了使用在实施例64(1)中鲁地链霉菌IFO15875T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：320所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：321所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68和322所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物测序获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ IDNO：243所示核苷酸序列的质粒称为pCR1589BF。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1589BF。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：243所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A24)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1589BF”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1589BF。
(2)本发明蛋白质(A24)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1589BF和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1589BF的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1589BF提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例65(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1589BF提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1589BF提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例66 获得本发明DNA(A25)
(1)斯堡链霉菌IFO 13446T的染色体DNA的制备
根据实施例31(1)所述方法，制备斯堡链霉菌IFO 13446T的染色体DNA。
(2)具有本发明DNA(A25)部分核苷酸序列的DNA的分离
按照实施例29所述方法，通过将在实施例66(1)中制备的斯堡链霉菌IFO13446T染色体DNA用作模板和通过使用引物对14进行PCR。类似于实施例31(2)，将扩增的DNA克隆到克隆载体pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。结果，提供在SEQ ID NO：234所示核苷酸序列的核苷酸289至1015中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在实施例66(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：323所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：324所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：244所示核苷酸序列的核苷酸1至303中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PmacI消化在实施例66(1)中制备的染色体DNA。按照实施例26(3)所述方法，通过使用获得的DNA产生基因组步行文库。通过使用获得的文库作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：311所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在实施例26(3)所述条件下进行PCR以获得第一PCR产物。接下来，通过使用第一PCR产物作为模板和通过使用具有SEQ ID NO：325所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在实施例26(3)所述条件下进行PCR。分析获得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO：244所示核苷酸序列的核苷酸966至1411中所表示的核苷酸序列。
(3)本发明DNA(A25)的序列分析
通过连接由实施例66(2)所获DNA提供的核苷酸序列获得在SEQ IDNO：244中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在两个可读框(ORF)。因此，包含由1197个核昔酸(包括终止密码子)组成和编码398个氨基酸残基(SEQ ID NO：224)的核苷酸序列(SEQ ID NO：234)以及由201个核苷酸(包括终止密码子)组成和编码66个氨基酸残基(SEQ IDNO：254)的核苷酸序列(SEQ ID NO：264)。由SEQ ID NO：234所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：224)组成的蛋白质的分子量据计算为44175Da。由SEQ ID NO：264所示核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：254)组成的蛋白质的分子量据计算为6685Da。
实施例67 本发明DNA(A25)在大肠杆菌中的表达
(1)具有本发明DNA(A25)的转化大肠杆菌的产生
除了使用在实施例66(1)中斯堡链霉菌IFO13446T制备的染色体DNA作为模板和使用具有SEQ ID NO：326所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：327所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物以外，类似于实施例49(1)进行PCR。类似于实施例32(1)，从PCR反应溶液中纯化DNA并克隆到克隆载体pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通过将分别具有SEQ ID NO：67，68，311，315和323所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物测序获得的质粒DNA的核苷酸序列。基于获得的结果，将具有SEQ ID NO：244所示核苷酸序列的质粒称为pCR1609F。类似于实施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1609F。从消化产物中纯化约1.5kbp的DNA。连接用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2以获得包含SEQ ID NO：244所示核苷酸序列的质粒，其中将编码本发明蛋白质(A25)的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间(以下称为“pKSN1609F”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1609F。
(2)本发明蛋白质(A25)在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养大肠杆菌JM109/pKSN1609F和JM109/pKSN2中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将获自大肠杆菌JM109/pKSN1609F的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1609F提取物”，将获自大肠杆菌JM109/pKSN2的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN2提取物”)。
(3)将化合物(II)转化为化合物(III)的能力的检测
类似于实施例32(3)，制备30μl的反应溶液并保持在30℃下10分钟。然而，作为上清液级分，使用在实施例67(2)中制备的上清液级分(大肠杆菌pKSN1609F提取物或大肠杆菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反应溶液并将萃取层TLC分析。在展开TLC板以后，检查其上对应于用14C标记的化合物(III)的斑点的存在(Rf值0.24和0.29)。从包含大肠杆菌pKSN1609F提取物的反应溶液中检测到对应于化合物(III)的斑点。与此对比，在包含大肠杆菌pKSN2提取物的反应溶液中未检测到该斑点。
实施例68 通过本发明蛋白质(A16)，(A17)，(A18)，(A19)，(A20)，(A21)，(A22)，(A23)，(A24)或(A25)的化合物的代谢
(1)通过本发明蛋白质(A16)的化合物(XII)的代谢
制备50mM磷酸钾(pH7.0)的100μl反应溶液，其包含12.5ppm化合物(XII)，3mM p-NADPH(以下称为“组分A”)(Oriental YeastCompany)，1mg/ml来源于菠菜的铁氧还蛋白(以下称为“组分B”)(SigmaCompany)，0.15U/ml铁氧还蛋白还原酶(以下称为“组分C”)(SigmaCompany)和20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分。将反应溶液保持在30℃下10分钟。另外，类似地制备和保持未加入用于上述反应溶液组合物中的、选自组分A，组分B和组分C和在实施例49(2)中制备的上清液级分的至少一种组分的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)的100μl反应溶液。将五微升(5μl)2N HCl和100μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每种反应溶液中。用UltraFree MC 0.22μm滤器装置(MilliporeCompany)过滤在8,000xg下离心的上清液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A16)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例49(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A16)”)。与从(XII)对照溶液(A16)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A16)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A16)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A16)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(2)通过本发明蛋白质(A17)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A17)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例51(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A17)”)。与从(XII)对照溶液(A17)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A17)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A17)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A17)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(3)通过本发明蛋白质(A18)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例53(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例53(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A18)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例53(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A18)”)。与从(XII)对照溶液(A18)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A18)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A18)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A18)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(4)通过本发明蛋白质(A19)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例55(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例55(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A19)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例55(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A19)”)。与从(XII)对照溶液(A19)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A19)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A19)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A19)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(5)通过本发明蛋白质(A20)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例57(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例57(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A20)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例57(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A20)”)。与从(XII)对照溶液(A20)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A20)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A20)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A20)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(6)通过本发明蛋白质(A21)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例59(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例59(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A21)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例59(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A21)”)。与从(XII)对照溶液(A21)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A21)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A21)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A21)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(7)通过本发明蛋白质(A22)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例61(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例61(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A22)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例61(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A22)”)。与从(XII)对照溶液(A22)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A22)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A22)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A22)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(8)通过本发明蛋白质(A23)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例63(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例63(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A23)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例63(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A23)”)。与从(XII)对照溶液(A23)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A23)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A23)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A23)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(9)通过本发明蛋白质(A24)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例65(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例65(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A24)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例65(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A24)”)。与从(XII)对照溶液(A24)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A24)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A24)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A24)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(10)通过本发明蛋白质(A25)的化合物(XII)的代谢
除了使用20μl在实施例67(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例49(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(1)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例67(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)代谢溶液(A25)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例67(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XII)对照溶液(A25)”)。与从(XII)对照溶液(A25)检测的化合物(XII)的浓度相比，从(XII)代谢溶液(A25)检测的化合物(XII)的浓度较低。另外从(XII)代谢溶液(A25)检测到峰，其从(XII)对照溶液(A25)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(2)的(XII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(11)通过本发明蛋白质(A17)的化合物(XIII)的代谢
除了使用12.5ppm化合物(XIII)而不是12.5ppm化合物(XII)以外，按照实施例68(2)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在上述分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A17)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例51(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A17)”)。与从(XIII)对照溶液(A17)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A17)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A17)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A17)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(12)通过本发明蛋白质(A18)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例53(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例53(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A18)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例53(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A18)”)。与从(XIII)对照溶液(A18)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A18)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A18)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A18)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(13)通过本发明蛋白质(A19)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例55(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例55(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A19)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例55(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A19)”)。与从(XIII)对照溶液(A19)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A19)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A19)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A19)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(14)通过本发明蛋白质(A20)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例57(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例57(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A20)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例57(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A20)”)。与从(XIII)对照溶液(A20)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A20)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A20)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A20)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(15)通过本发明蛋白质(A21)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例59(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例59(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A21)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例59(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A21)”)。与从(XIII)对照溶液(A21)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A21)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A21)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A21)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(16)通过本发明蛋白质(A23)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例63(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例63(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A23)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例63(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A23)”)。与从(XIII)对照溶液(A23)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A23)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A23)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A23)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
(17)通过本发明蛋白质(A25)的化合物(XIII)的代谢
除了使用20μl在实施例67(2)中回收的上清液级分而不是20μl在实施例51(2)中回收的上清液级分以外，按照实施例68(11)所述方法制备和保持反应溶液。类似于实施例68(1)，制备保持后的每种反应溶液。在分析条件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)获得的液体滤过物(以下，将来自包含组分A，组分B，组分C和20μl在实施例67(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)代谢溶液(A25)”；另外，将来自不包含组分A，不包含组分B，不包含组分C和不包含在实施例67(2)中回收的上清液级分的反应溶液的液体滤过物称为“(XIII)对照溶液(A25)”)。与从(XIII)对照溶液(A25)检测的化合物(XIII)的浓度相比，从(XIII)代谢溶液(A25)检测的化合物(XIII)的浓度较低。另外从(XIII)代谢溶液(A25)检测到峰，其从(XIII)对照溶液(A25)中未检测到。在HPLC上所述峰的洗脱时间与质量比在实施例41(3)的(XIII)代谢溶液(A1)中检测的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脱时间相配。
实施例69 其中本发明DNA(A1)，(A2)，(A3)或(A4)是探针的杂交
(1)探针制备
按照实施例30(1)所述方法进行PCR。然而，作为模板，使用10ng在实施例26(1)中制备的不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA而不是在实施例3(1)中制备的暗产色链霉菌IFO 12898的所述50ng染色体DNA。作为引物，使用具有SEQ ID NO：328所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：329所示核苷酸序列的寡核苷酸。回收通过所述PCR扩增的DNA以产生用洋地黄毒苷标记的具有SEQ ID NO：109所示核苷酸序列的探针(以下称为“DIG标记的探针(A4)”)。
(2)质粒溶液的制备
通过使用Advantage-GC基因组聚合酶混合物(Clontech Company)和将在实施例31(1)中制备的黑胡桃链霉菌IFO 13445的染色体DNA用作模板进行PCR。作为引物，使用具有SEQ ID NO：330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸。通过加入2种每种总计200nM的引物，10ng染色体DNA，4.0μl dNTP混合物(4种dNTP每种2.5mM的混合物；Clontech公司)，10.0μl 5xGC缓冲液，2.2μl 25mMMg(OAc)2，10.0μl 5M GC-Melt和1.0μl Advantage-GC基因组聚合酶混合物(Clontech公司)和蒸馏水，PCR反应溶液总计50μl。PCR的反应条件是在保持在94℃ 1分钟后；重复7个循环，一个循环包括保持在94℃ 10秒，接着72℃ 3分钟；重复36个循环，一个循环包括94℃ 10秒，接着67℃ 3分钟；然后保持在67℃ 7分钟。通过按照所述试剂盒附带的说明书使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen公司)从PCR反应溶液中纯化DNA。按照附带的手册将获得的DNA连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen公司)并导入大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen公司)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司)从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒DNA以获得含有本发明DNA(A11)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例33(1)中制备的津岛链霉菌IFO 13782的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：332所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：333所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A12)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例35(1)中制备的热淡天蓝链霉菌IFO 14273t的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：334所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A13)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例37(1)中制备的球团产色链霉菌IFO 13673t的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A14)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例39(1)中制备的橄榄产色链霉菌IFO 12444的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A15)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例48(1)中制备的装饰链霉菌IFO 13069t的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：335所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：336所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A16)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例50(1)中制备的灰色链霉菌ATCC 10137的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：335所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：336所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A17)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例52(1)中制备的不产色链霉菌IFO 12735的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A18)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例54(1)中制备的灰色链霉菌IFO 13849T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：333所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：335所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A19)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例56(1)中制备的羊毛链霉菌IFO 12787T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：337所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A20)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例58(1)中制备的三泽链霉菌IFO 13855T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：338所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A21)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例62(1)中制备的玫瑰变红链霉菌IFO 13682T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：339所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A23)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例66(1)中制备的斯堡链霉菌IFO 13446T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：339所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A25)的质粒溶液。
另外，类似地，通过将在实施例60(1)中制备的苍白色链霉菌IFO13434T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：340所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：341所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A22)的质粒溶液。
类似地，通过将在实施例64(1)中制备的鲁地链霉菌IFO 15875T的染色体DNA用作模板和通过将具有SEQ ID NO：342所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：343所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR。类似上面将通过PCR获得的DNA连接到载体。然后转化大肠杆菌。从获得的大肠杆菌转化体中制备质粒以获得含有本发明DNA(A24)的质粒溶液。
(2)斑点杂交
将约100ng和10ng在实施例69(2)中制备的各种质粒印迹在HybondN+尼龙膜(Amersham Biosciences Company)上。质粒为：包含本发明DNA(A11)的质粒DNA，包含本发明DNA(A12)的质粒DNA，包含本发明DNA(A13)的质粒DNA，包含本发明DNA(A14)的质粒DNA，包含本发明DNA(A15)的质粒DNA，包含本发明DNA(A16)的质粒DNA，包含本发明DNA(A17)的质粒DNA，包含本发明DNA(A18)的质粒DNA，包含本发明DNA(A19)的质粒DNA，包含本发明DNA(A20)的质粒DNA，包含本发明DNA(A21)的质粒DNA，包含本发明DNA(A23)的质粒DNA，包含本发明DNA(A25)的质粒DNA。用透射仪将紫外光指向获得的膜5分钟。
按照实施例30(2)所述方法进行杂交和检测。将在实施例30(1)中制备的探针在100℃保持5分钟和然后快速在冰上冷却。作为探针，使用用洋地黄毒苷标记的具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA(以下称为“DIG标记的探针(A1)”)，用洋地黄毒苷标记的具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的DNA(以下称为“DIG标记的探针(A2)”)，用洋地黄毒苷标记的具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的DNA(以下称为“DIG标记的探针(A3)”)或在实施例69(1)中产生的DIG标记探针(A4)。在将DIG标记的探针(A1)，(A2)，(A3)或(A4)中任何一个用于杂交的情形中，对于10ng和100ng上述质粒DNA中每一个的各种试剂检测到信号。
另外，类似地，将约10ng和100ng在实施例69(2)中制备的含有本发明DNA(A22)的质粒DNA和含有本发明DNA(A24)的质粒DNA各自印迹在Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences Company)上。按照实施例30(2)进行杂交和检测。
实施例70 其中密码子使用已经针对在大豆中表达调整的本发明DNA(A23)(以下称为“本发明DNA(A23)S”)的制备
(1)本发明DNA(A23)S的制备
通过使用具有SEQ ID NO：346所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：367所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，按照附带的手册用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：345所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：366所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQID NO：344所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：365所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液1。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：349所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：364所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：348所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：363所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：347所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：362所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液2。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：352所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：361所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：351所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：360所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：350所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：359所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液3。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：355所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：358所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：354所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：357所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：353所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：356所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液4。
将如此获得的反应溶液1至4混合。按照附带的手册，通过将其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO：344所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：356所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。证实扩增的DNA的核苷酸序列。获得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’连接到SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’连接到SEQ IDNO：368所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表28和表29中显示具有SEQ ID NO：232所示核苷酸序列的本发明DNA(A23)的密码子使用(GC含量73.10％)。在表24和表25中显示大豆的密码子使用(GC含量46.12％)。在表30和表31中显示具有SEQ IDNO：368所示核苷酸序列的本发明DNA(A23)S的密码子使用(52.38％的GC含量)。
表28
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 0.00 TCT 0.00
TTC 4.01 TCC 1.50
TTA 0.00 TCA 0.00
TTG 0.00 TCG 0.50
CTT 0.00 CCT 0.00
CTC 4.26 CCC 5.76
CTA 0.00 CCA 0.00
CTG 7.77 CCG 2.26
ATT 0.00 ACT 0.00
ATC 4.51 ACC 3.76
ATA 0.00 ACA 0.00
ATG 2.26 ACG 2.76
GTT 0.00 GCT 0.25
GTC 3.51 GCC 9.27
GTA 0.00 GCA 0.75
GTG 2.51 GCG 1.75
表29
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.00 TGT 0.00
TAC 1.00 TGC 0.75
TAA 0.25 TGA 0.00
TAG 0.00 TGG 0.75
CAT 0.00 CGT 0.50
CAC 2.26 CGC 6.02
CAA 0.50 CGA 0.25
 
CAG 2.51 CGG 3.01
AAT 0.00 AGT 0.00
AAC 1.00 AGC 1.25
AAA 0.25 AGA 0.00
AAG 0.50 AGG 0.50
GAT 0.00 GGT 0.98
GAC 7.27 GGC 6.27
GAA 1.25 GGA 0.25
GAG 5.26 GGG 1.00
表30
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 2.01 TCT 0.75
TTC 2.01 TCC 0.50
TTA 1.00 TCA 0.75
TTG 3.01 TCG 0.25
CTT 3.26 CCT 3.01
CTC 2.26 CCC 1.50
CTA 1.00 CCA 3.01
CTG 1.50 CCG 0.50
ATT 2.26 ACT 2.26
ATC 1.25 ACC 1.75
ATA 1.00 ACA 2.01
ATG 2.26 ACG 0.50
GTT 2.26 GCT 4.51
GTC 1.00 GCC 2.76
GTA 0.75 GCA 3.76
GTG 2.01 GCG 1.00
表31
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.50 TGT 0.25
TAC 0.50 TGC 0.50
TAA 0.25 TGA 0.00
TAG 0.00 TGG 0.75
CAT 1.25 CGT 1.50
CAC 1.00 CGC 1.25
CAA 1.75 CGA 0.75
CAG 1.25 CGG 0.50
AAT 0.50 AGT 0.50
AAC 0.50 AGC 0.50
AAA 0.25 AGA 3.26
AAG 0.50 AGG 3.01
GAT 4.51 GGT 2.26
GAC 2.76 GGC 1.50
GAA 3.26 GGA 2.26
GAG 3.26 GGG 1.50
(2)具有本发明蛋白质(A23)S的转化大肠杆菌的生产
用限制酶NdeI和HindIII消化在实施例70(1)中获得的具有SEQ IDNO：368所示核苷酸序列的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得其中具有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间的质粒(以下称为“pKSN1584soy”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1584soy。
(3)本发明蛋白质(A23)S在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养在实施例70(2)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN1584soy和在实施例63(1)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN1584F中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN1584soy获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1584soy提取物”和将从大肠杆菌JM109/pKSN1584F获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1584F提取物”)。在大肠杆菌pKSN1584soy提取物中包含的每一蛋白质的的量的P450的量可以比得上和高于在大肠杆菌pKSN1584F提取物中包含的每一蛋白质的量的P450的量。
实施例71 其中密码子使用已经针对在大豆中表达调整的本发明DNA(A25)(以下称为“本发明DNA(A25)S”)的制备和表达
(1)本发明DNA(A25)S的制备
通过使用具有SEQ ID NO：371所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：392所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，按照附带的手册用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：370所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：391所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQID NO：369所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：390所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液1。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：374所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：389所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：373所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：383所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：372所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：387所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液2。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：377所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：386所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：376所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：385所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：375所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：384所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液3。
另外，按照附带的手册，通过使用具有SEQ ID NO：380所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：383所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。将获得的PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：379所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：382所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。另外，将PCR产物的等分部分用作类似地使用具有SEQ ID NO：378所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：381所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR的模板。将获得的反应溶液称为反应溶液4。
将如此获得的反应溶液1至4混合。按照附带的手册，通过将其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO：369所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：381所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)进行PCR。证实扩增的DNA的核苷酸序列。获得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’连接到SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’连接到SEQ IDNO：393所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表32和表33中显示具有SEQ ID NO：234所示核苷酸序列的本发明DNA(A25)的密码子使用(GC含量71.93％)。在表24和表25中显示大豆的密码子使用(GC含量46.12％)。在表34和表35中显示具有SEQ IDNO：393所示核苷酸序列的本发明DNA(A25)S的密码子使用(52.05％的GC含量)。
表32
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 0.00 TCT 0.00
TTC 3.76 TCC 1.25
TTA 0.00 TCA 0.25
TTG 0.00 TCG 0.75
CTT 0.00 CCT 0.25
CTC 4.01 CCC 4.01
CTA 0.00 CCA 0.25
CTG 9.52 CCG 2.76
ATT 0.00 ACT 0.25
ATC 4.26 ACC 4.01
ATA 0.25 ACA 0.00
ATG 2.26 ACG 1.75
GTT 0.00 GCT 0.00
GTC 3.01 GCC 8.52
GTA 0.00 GCA 0.50
GTG 2.51 GCG 3.01
表33
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.00 TGT 0.25
TAC 1.25 TGC 0.50
TAA 0.25 TGA 0.00
TAG 0.00 TGG 1.00
CAT 0.25 CGT 0.75
CAC 2.26 CGC 5.51
CAA 0.00 CGA 1.25
 
CAG 3.01 CGG 3.26
AAT 0.00 AGT 0.00
AAC 1.00 AGC 1.00
AAA 0.25 AGA 0.25
AAG 1.00 AGG 0.00
GAT 0.00 GGT 0.25
GAC 7.52 GGC 4.76
GAA 1.00 GGA 0.25
GAG 4.76 GGG 1.25
表34
 
密码子 ％ 密码子 ％
TTT 1.75 TCT 1.25
TTC 2.01 TCC 0.50
TTA 1.25 TCA 0.50
TTG 3.26 TCG 0.00
CTT 3.51 CCT 2.76
CTC 2.51 CCC 1.25
CTA 1.25 CCA 2.76
CTG 1.75 CCG 0.50
ATT 2.26 ACT 2.01
ATC 1.25 ACC 1.75
ATA 1.00 ACA 1.75
ATG 2.26 ACG 0.50
GTT 2.26 GCT 4.51
GTC 1.00 GCC 2.76
GTA 0.50 GCA 3.76
GTG 1.75 GCG 1.00
表35
 
密码子 ％ 密码子 ％
TAT 0.50 TGT 0.25
TAC 0.75 TGC 0.50
TAA 0.25 TGA 0.00
TAG 0.00 TGG 1.00
CAT 1.25 CGT 1.75
CAC 1.25 CGC 1.50
CAA 1.50 CGA 0.75
CAG 1.50 CGG 0.75
AAT 0.50 AGT 0.50
AAC 0.50 AGC 0.50
AAA 0.50 AGA 3.26
AAG 0.75 AGG 3.01
GAT 4.76 GGT 2.01
GAC 2.76 GGC 1.25
GAA 2.76 GGA 2.01
GAG 3.01 GGG 1.25
(2)具有本发明蛋白质(A25)S的转化大肠杆菌的生产
用限制酶NdeI和HindIII消化在实施例71(1)中获得的具有SEQ IDNO：393所示核苷酸序列的DNA。将用NdeI和HindIII消化的获得的DNA和质粒pKSN2连接以获得其中具有SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位点和HindIII位点之间的质粒(以下称为“pKSN1609soy”)。将所述质粒导入大肠杆菌JM109。将获得的大肠杆菌转化体称为JM109/pKSN1609soy。
(3)本发明蛋白质(A25)S在大肠杆菌中的表达和所述蛋白质的回收
类似于实施例4(2)，培养在实施例71(2)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN1609soy和在实施例67(1)中获得的大肠杆菌JM109/pKSN1609F中的每一个。回收细胞。制备细胞裂解液。在实施例4(2)所述方法下，从细胞裂解液中制备上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN1609soy获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1609soy提取物”和将从大肠杆菌JM109/pKSN1609F获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN1609F提取物”)。在大肠杆菌pKSN1609soy提取物中包含的每一蛋白质的的量的P450的量可以比得上和高于在大肠杆菌pKSN1609F提取物中包含的每一蛋白质的量的P450的量。
实施例72 识别本发明蛋白质(A25)的本发明抗体(A)(以下称为“本发明抗体(A25)”)的制备
(1)表达本发明蛋白质(A25)的大肠杆菌的提取物的制备
按照实施例4(2)所述方法，将在实施例71(2)中生产的大肠杆菌JM109/pKSN1609soy预培养过夜。将获得的培养基接种至包含50μg/ml氨苄青霉素的1L TB培养基中并在26℃下培养。然后将5-氨基乙酰丙酸加至500μM的终浓度，将IPTG加至1mM的终浓度，进一步培养。从培养基中回收细胞，用0.05MTris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤和然后悬浮在100ml包含1mMPMSF的所述缓冲液中。将获得的细胞培养基在输出量5，占空因数30％的条件下进行超声波仪(Sonifer(Branson Sonic PowerCompany))3次，每次10分钟，以便获得细胞裂解液。在将细胞裂解液离心(9,000xg，10分钟)后回收上清液和离心(200,000xg，70分钟)以回收上清液级分(以下，将从大肠杆菌JM109/pKSN1609soy中获得的上清液级分称为“大肠杆菌pKSN11609soy提取物”。
(2)本发明蛋白质(A25)的纯化
将在实施例72(1)中获得的上清液级分(大肠杆菌pKSN11609soy提取物)注射到Hiload HiLoad 16/10Q Sepharose HP柱(AmershamBioscience Company)中。接下来，在40ml的20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)流进柱子以后，与线性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.00125M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.375M，流速为3ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.088M-0.100M的NaCl浓度下洗脱的10ml级分。
将回收的级分进行PD10柱(Amersham Biosciences Company)，用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)洗脱以回收包含蛋白质的级分。接下来，将所述级分注射于MonoQ HR 10/10(Amersham Biosciences Company)中。将十六毫升(16ml)20mM双三丙烷缓冲液流进柱子。接下来，与线性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.001042M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.25M，流速为4ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.060M-0.069M的NaCl浓度下洗脱的8ml级分。
用20mM双三丙烷缓冲液(pH7.0)将回收的级分稀释2.5倍并注射于MonoQHR5/5柱(Amersham Biosciences Company)中。接下来，在将2ml 20mM双三丙烷缓冲液(pH 7.0)流进柱子以后，与线性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.008333M/分钟，NaCl浓度的范围是0M-0.25M，流速为1ml/分钟)流动20mM双三丙烷缓冲液以分级回收在0.073M-0.077M的NaCl浓度下洗脱的0.5ml级分。
通过使用“PAG mini Daiichi 10/20”(DaiichiPure Chemicals有限公司)用SDS-PAGE分析如此纯化的级分，以证实那些级分是主要包含本发明蛋白质(A25)的级分。
(3)本发明抗体(A25)的制备
按照实施例44(3)所述方法进行本发明抗体的制备。然而，不是使用本发明蛋白质(A1)，将在实施例72(2)中获得的本发明蛋白质(A25)用来获得含有本发明抗体(A25)的抗血清。
实施例73 通过本发明抗体(A25)检测本发明蛋白质
通过使用在实施例72(3)中获得的本发明抗体(A25)与每种大肠杆菌提取物进行免疫印迹。进行以下各项的SDS聚丙烯酰胺电泳(40mA，1小时)：在实施例49(2)中获得的大肠杆菌pKSN452F提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A16))；在实施例51(2)中获得的大肠杆菌pKSN608F提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A17))；在实施例53(2)中获得的大肠杆菌pKSN646BF提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A18))；在实施例55(2)中获得的大肠杆菌pKSN1502F提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A19))；在实施例57(2)中获得的大肠杆菌pKSN1525F提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A20))；在实施例59(2)中获得的大肠杆菌pKSN1543BF提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A21))；在实施例61(2)中获得的大肠杆菌pKSN1558BF提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A22))；在实施例63(2)中获得的大肠杆菌pKSN1584F提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A23))；在实施例65(2)中获得的大肠杆菌pKSN1589BF提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A24))；在实施例67(2)中获得的大肠杆菌pKSN1609F提取物(含有约0.5pmol本发明蛋白质(A25))；在实施例70(3)中获得的大肠杆菌pKSN1584soy提取物(含有约2pmol本发明蛋白质(A23))；在实施例71(3)中获得的大肠杆菌pKSN1609soy提取物(含有约0.5pmol本发明蛋白质(A25))；和在实施例67(2)中获得的大肠杆菌pKSN2提取物(含有约0.8mg蛋白质)。按照实施例45所述方法将所述凝胶中的蛋白质转移到PDVF膜上。按照实施例45所述方法，将在实施例45中获得的PDVF膜(以下称为“PDVF膜(A)”)和从上述方法中获得的PDVF膜(以下称为“PDVF膜(B)”)与在实施例72(3)中获得的抗血清反应。随后，按照实施例45所述方法进行与第二抗体的反应，洗涤和染色。在PDVF膜(A)上检测到对应于本发明蛋白质(A1)，(A2)，(A3)，(A4)，(A11)，(A12)，(A13)，(A14)和(A15)以及本发明蛋白质(A9)和(A10)的条带的染色。在PDVF膜(B)上检测到对应于本发明蛋白质(A16)，(A17)，(A18)，(A19)，(A20)，(A21)，(A22)，(A23)，(A24)和(A25)的条带的染色。对于PVDF膜(A)的在实施例4(2)中获得的大肠杆菌pKSN2提取物(含有0.78mg蛋白质)试剂和对于PVDF膜(B)的在实施例67(2)中获得的大肠杆菌pKSN2提取物(含有0.8mg蛋白质)试剂未检测到染色的条带。
实施例74 将本发明DNA(A23)S导入植物
(1)用于直接导入的包含本发明DNA(A23)S的叶绿体表达质粒的构建-部分1
构建包含嵌合DNA的质粒作为用基因枪法将本发明DNA(A23)S导入植物的质粒，所述嵌合DNA中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
首先，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：398所示核苷酸序列的DNA。通过将在实施例70(2)中获得的pKSN1584soy用作模板和通过将由SEQIDNO：397所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：398所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下进行PCR：在94℃下进行保持2分钟一次；20个循环，一个循环包括保持94℃ 30秒，接着53℃ 30秒，接着68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分钟。通过按照附带手册进行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收和纯化扩增的DNA。通过按照附带的手册用TaKaRa BKL试剂盒(Takara ShuzoCompany)处理获得的DNA，将DNA平末端化和5’末端磷酸化。回收包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化质粒pUC19(Takara Shuzo Company)以后，用牛小肠碱性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)将5’末端去磷酸化。通过连接产生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA产生质粒。在用限制酶EcoT22I和SacI消化获得的质粒以后，回收包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在实施例16(2)中获得的质粒pUCrSt657以后，分离约2.9kbp的DNA，其具有来源于pUC19的核苷酸序列和编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列。将获得的DNA和包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的上述DNA连接以获得包含嵌合DNA的pUCrSt1584soy(图54)，其中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pUCrSt1584soy以分离包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入在实施例16(2)中获得的质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy(图55)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，在嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy具有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列。
(2)用于直接导入的具有本发明DNA(A23)S的叶绿体表达质粒的构建-部分(2)
构建用基因枪法将本发明DNA(A23)S导入植物的质粒。该质粒包含嵌合DNA，其中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。首先，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。通过将在实施例70中获得的pKSN1584soy用作模板和通过将由SEQ ID NO：399所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：398所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下进行PCR：在94℃下进行保持2分钟一次；25个循环，一个循环包括保持94℃ 30秒，接着46℃ 30秒，接着68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分钟。通过按照附带手册进行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Cleanup(Toyobo Company)回收并纯化扩增的DNA。通过按照附带手册用TaKaRa BKL试剂盒(TaKaRaShuzo Company)处理获得的DNA，将DNA平末端化和将5’末端磷酸化。回收含有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化在实施例15(3)中获得的质粒pKF19ΔBs以后，用牛小肠碱性磷酸酶(TakaraShuzo Company)将5’末端去磷酸化。通过连接产生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA产生质粒。在用限制酶BspHI和SacI消化获得的质粒以后，回收含有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。接着用限制酶BspHI和SacI消化在实施例16(3)中获得的质粒pKFrSt12-657以分离来自质粒pKFrSt12的DNA。将所述DNA与用限制酶SacI和BspHI消化和包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA连接，以便获得包含嵌合DNA的质粒pKFrSt12-1584soy(图56)，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pKFrSt12-1584soy以分离包含SEQ ID NO：368所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy(图57)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy具有SEQ ID NO：368所示核苷酸序列。
(3)将本发明DNA(A23)S导入大豆
按照实施例47(3)所述方法制备大豆(栽培品种：Fayette和Jack)的球形胚。
将获得的球形胚移植到新鲜体细胞胚生长培养基中并培养2-3天。按照实施例17(2)所述方法，将在实施例74(1)中生产的质粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy或在实施例74(2)中生产的质粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy导入那些球形胚。
(4)用潮霉素选择体细胞胚
按照实施例47(4)所述方法进行用潮霉素选择在实施例74(3)中获得的在基因导入后的球形胚。
(5)用化合物(II)选择体细胞胚
按照实施例47(5)所述方法进行用化合物(II)选择在实施例74(3)中获得的导入基因以后的球形胚。
(6)从体细胞胚的植物再生，顺应和培养
按照实施例47(6)所述方法，从在实施例74(4)或74(5)中选择的球形胚进行植物的再生。
相应地用实施例17(6)所述方法将具有根和发育的叶子的植物进行顺应和培养并收获。
(7)对除草化合物(II)的抗性评估
按照实施例17(4)所述方法评估在实施例74(6)中获得的再生植物对化合物(II)的抗性程度。
(8)用于农杆菌导入的具有本发明DNA(A23)S的叶绿体表达质粒的构建
构建用农杆菌法将本发明DNA(A23)S导入植物的质粒。用限制酶HindIII和EcoRI消化质粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy以分离嵌合DNA，其中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将所述DNA插入在实施例18中获得的上述二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt-1584soy(图58)。另外，用限制酶NotI消化质粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy以分离嵌合DNA，其中本发明DNA(A23)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将该DNA插入上述二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt12-1584soy(图59)。
(9)将本发明DNA(A23)S导入烟草
使用在实施例74(8)中获得的质粒pBI-NdG6-rSt-1584soy和pBI-NdG6-rSt12-1584soy，用农杆菌法将本发明DNA(A23)S导入烟草。
首先，按照实施例19所述方法，分别将质粒pBI-NdG6-rSt-1584soy和pBI-NdG6-rSt12-1584soy导入根癌农杆菌LBA4404(ClontechCompany)。分离各自具有pBI-NdG6-rSt-1584soy或pBI-NdG6-rSt12-1584soy的转基因农杆菌。
然后，按照实施例47(9)所述方法将具有质粒的所述农杆菌用来将基因导入烟草，分别获得已经整合pBI-NdG6-rSt-1584soy或pBI-NdG6-rSt12-1584soy的T-DNA区域的转基因烟草。
(10)使用本发明DNA(A23)S转基因烟草的叶片的抗性评估
从35株在实施例74(9)中获得的转基因烟草采集叶子。将每片叶子分成几片，其中每片5-7mm宽。将叶片种植到包含化合物(II)或化合物(XII)的MS琼脂培养基上并在光照中在室温下培养。在培养几天后，观察每个叶片的除草损伤。作为对照，使用野生型烟草的叶片。通过对连续生长的叶片，具有化学损伤的叶片，和变白和已经枯萎的叶片记分评估转基因烟草的抗性。
实施例75将本发明DNA(A25)S导入植物
(1)用于直接导入的包含本发明DNA(A25)S的叶绿体表达质粒的构建-部分1
构建包含嵌合DNA的质粒作为用基因枪法将本发明DNA(A25)S导入植物的质粒，所述嵌合DNA中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
首先，通过PCR扩增包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA。通过将在实施例71(2)中获得的pKSN1609soy用作模板和通过将由SEQID NO：400所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：401所示核苷酸序列组成的寡核苷酸用作引物来进行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下进行PCR：在94℃下进行保持2分钟一次；20个循环，一个循环包括保持94℃ 30秒，接着53℃ 30秒，接着68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分钟。通过按照附带手册进行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收和纯化扩增的DNA。通过按照附带的手册用TaKaRa BKL试剂盒(Takara ShuzoCompany)处理获得的DNA，将DNA平末端化和5’末端磷酸化。回收包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化质粒pUC19(Takara Shuzo Company)以后，用牛小肠碱性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)将5’末端去磷酸化。通过连接产生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA产生质粒。在用限制酶EcoT22I和SacI消化获得的质粒以后，回收包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在实施例16(2)中获得的质粒pUCrSt657以后，分离约2.9kbp的DNA，其具有来源于pUC19的核苷酸序列和编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的序列。将获得的DNA和包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的上述DNA连接以获得包含嵌合DNA的pUCrSt1609soy(图60)，其中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pUCrSt1609soy以分离包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy(图61)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，在嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy具有SEQ ID NO：393所示核苷酸序列。
(2)用于直接导入的具有本发明DNA(A25)S的叶绿体表达质粒的构建-部分(2)
构建用基因枪法将本发明DNA(A25)S导入植物的质粒。该质粒包含嵌合DNA，其中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。首先，在实施例75(1)中获得的质粒pUCrSt1609soy在它的EcoT22I限制位点插入接头EcoT22I-12aa-EcoT22I(图62)，该接头是通过将由SEQ ID NO：402所示核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：403所示核苷酸序列组成的寡核苷酸退火获得。获得包含嵌合DNA的质粒pUCrSt12-1609soy(图63)，在所述嵌合DNA中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
用限制酶BamHI和SacI消化获得的质粒pUCrSt12-1609soy以分离包含SEQ ID NO：393所示核苷酸序列的DNA。将所述DNA插入实施例16(2)中获得的质粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位点和SacI限制酶位点之间以获得质粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy(图64)，其中CR16G6启动子已经连接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。
接下来，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara ShuzoCompany)和选择氨苄青霉素抗性细胞。另外，通过使用BigDye终止循环测序简易反应试剂盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA测序仪3100(PE Applied Biosystems Company)测定包含在氨苄青霉素抗性菌株中的质粒的核苷酸序列。结果，证实质粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy具有SEQ ID NO：393所示核苷酸序列。
(3)将本发明DNA(A23)S导入大豆
按照实施例47(3)所述方法制备大豆(栽培品种：Fayette和Jack)的球形胚。
将获得的球形胚移植到新鲜体细胞胚生长培养基中并培养2-3天。按照实施例17(2)所述方法，将在实施例75(1)中生产的质粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy或在实施例75(2)中生产的质粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy导入那些球形胚。
(4)用潮霉素选择体细胞胚
按照实施例47(4)所述方法进行用潮霉素选择在实施例75(3)中获得的在基因导入后的球形胚。
(5)用化合物(II)选择体细胞胚
按照实施例47(5)所述方法进行用化合物(II)选择在实施例75(3)中获得的导入基因以后的球形胚。
(6)从体细胞胚的植物再生，顺应和培养
按照实施例47(6)所述方法，从在实施例74(4)或74(5)中选择的球形胚进行植物的再生。
相应地用实施例17(6)所述方法将具有根和发育的叶子的植物进行顺应和培养并收获。
(7)对除草化合物(II)的抗性评估
按照实施例17(4)所述方法评估在实施例75(6)中获得的再生植物对化合物(II)的抗性程度。
(8)用于农杆菌属导入的具有本发明DNA(A25)S的叶绿体表达质粒的构建
构建用农杆菌法将本发明DNA(A25)S导入植物的质粒。用限制酶HindIII和EcoRI消化质粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy以获得嵌合DNA，其中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将所述DNA插入在实施例18中获得的二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt-1609soy(图65)。另外，用限制酶NotI消化质粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy以分离嵌合DNA，其中本发明DNA(A25)S紧接在编码大豆(cv.Jack)RuBPC小亚基叶绿体转运肽和编码其后成熟蛋白质的12个氨基酸的核苷酸序列之后而没有密码子框的变化。将该DNA插入上述二元质粒载体pBI121S的HindIII限制位点和EcoRI限制位点之间以获得质粒pBI-NdG6-rSt12-1609soy(图66)。
(9)将本发明DNA(A23)S导入烟草
使用在实施例75(8)中获得的质粒pBI-NdG6-rSt-1609soy和pBI-NdG6-rSt12-1609soy，用农杆菌法将本发明DNA(A25)S导入烟草。
首先，按照实施例19所述方法，分别将质粒pBI-NdG6-rSt-1609soy和pBI-NdG6-rSt12-1609soy导入根癌农杆菌LBA4404(C1ontechCompany)。分离各自具有pBI-NdG6-rSt-1609soy或pBI-NdG6-rSt12-1609soy的转基因农杆菌。
然后，按照实施例47(9)所述方法将具有质粒的所述农杆菌用来将基因导入烟草，分别获得已经整合pBI-NdG6-rSt-1609soy或pBI-NdG6-rSt12-1609soy的T-DNA区域的转基因烟草。
(10)使用本发明DNA(A25)S转基因烟草的叶片的抗性评估
从在实施例75(9)中获得的转基因烟草采集叶子。按照实施例74(10)所述方法，将该叶子用于评估转基因烟草对化合物(II)或化合物(XII)的抗性。
工业适用性
根据本发明，可以提供具有代谢PPO抑制除草化合物和将该化合物转化成低除草活性的化合物的能力的蛋白质；编码该蛋白质的DNA；和表达该蛋白质的抗除草化合物的植物。
序列独立文本
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为PCR设计的寡核苷酸引物
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SEQ ID NO：355
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SEQ ID NO：377
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：378
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SEQ ID NO：379
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：380
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：381
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：382
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：383
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：384
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：385
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：386
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：387
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：388
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：389
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：390
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SEQ IDN O：391
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SEQ ID NO：392
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SEQ ID NO：393
编码SEQ ID NO：224的氨基酸序列的设计的多核苷酸
SEQ ID NO：394
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：395
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：396
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：397
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：398
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：399
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：400
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：401
为PCR设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO：402
为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
SEQ ID NO：403
为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
PC040425-序列表
序列表
<110>住友化学工业株式会社
<120>除草剂代谢蛋白质，其基因及其应用
<130>561096
<150>JP 2001/321307
<151>2001-10-19
<150>JP 2002/167239
<151>2002-06-07
<160>403
<210>1
<211>408
<212>PRT
<213>暗产色链霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898
<400>1
Figure C02825642D03061
<210>2
<211>401
<212>PRT
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<400>2
Figure C02825642D03071
<210>3
<211>395
<212>PRT
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<400>3
Figure C02825642D03072
Figure C02825642D03081
<210>4
<211>410
<212>PRT
<213>Streptmyces carbophi lus SANK 62585
<400>4
Figure C02825642D03082
<210>5
<211>406
<212>PRT
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<400>5
Figure C02825642D03092
Figure C02825642D03101
<210>6
<211>1227
<212>DNA
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<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1227)
<400>6
<210>7
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1206)
<400>7
Figure C02825642D03112
Figure C02825642D03121
Figure C02825642D03131
<210>8
<211>1188
<212>DNA
<213>砖红色链霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1188)
<400>8
Figure C02825642D03132
<210>9
<211>1439
<212>DNA
<213>暗产色链霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1227)
<220>
<221>CDS
<222>(1239)..(1439)
<400>9
Figure C02825642D03142
Figure C02825642D03151
Figure C02825642D03161
<210>10
<211>1415
<212>DNA
<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383t
<220>
<221>CDS
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<220>
<221>CDS
<222>(1218)..(1415)
<400>10
Figure C02825642D03181
<210>11
<211>1418
<212>DNA
<213>砖红色链霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469
<220>
<221>CDS
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<220>
<221>CDS
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<400>11
Figure C02825642D03182
Figure C02825642D03191
<210>12
<211>66
<212>PRT
<213>暗产色链霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898
<400>12
<210>13
<211>65
<212>PRT
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<400>13
<210>14
<211>64
<212>PRT
<213>砖红色链霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469
<400>14
Figure C02825642D03203
<210>15
<211>201
<212>DNA
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<220>
<221>CDS
<222>(1)..(201)
<400>15
Figure C02825642D03204
<210>16
<211>198
<212>DNA
<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(198)
<400>16
Figure C02825642D03211
<210>17
<211>195
<212>DNA
<213>砖红色链霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(195)
<400>17
<210>18
<211>23
<212>PRT
<213>暗产色链霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898
<400>18
Figure C02825642D03213
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>暗产色链霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898
<400>19
Figure C02825642D03221
<210>20
<211>19
<212>PRT
<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383T
<400>20
Figure C02825642D03222
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383T
<400>21
Figure C02825642D03223
<210>22
<211>19
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>22
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>23
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>24
Figure C02825642D03226
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>25
Figure C02825642D03227
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>26
Figure C02825642D03228
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>27
Figure C02825642D03231
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>28
Figure C02825642D03232
<210>29
<211>14
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>29
Figure C02825642D03233
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>30
Figure C02825642D03234
<210>31
<211>11
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>31
Figure C02825642D03235
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>32
Figure C02825642D03236
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>33
Figure C02825642D03237
<210>34
<211>13
<212>PRT
<213>浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796
<400>34
Figure C02825642D03238
<210>35
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>35
Figure C02825642D03241
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>36
Figure C02825642D03242
<210>37
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>37
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>38
Figure C02825642D03244
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>39
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>40
Figure C02825642D03246
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>41
Figure C02825642D03247
<210>42
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>42
Figure C02825642D03251
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>43
<210>44
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>44
Figure C02825642D03253
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>45
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>46
<210>47
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>47
Figure C02825642D03256
<210>48
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>48
Figure C02825642D03257
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>49
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>50
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>51
Figure C02825642D03263
<210>52
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>52
Figure C02825642D03264
<210>53
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>53
Figure C02825642D03265
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>54
Figure C02825642D03266
<210>55
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>55
Figure C02825642D03267
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>56
Figure C02825642D03271
<210>57
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>57
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>58
Figure C02825642D03273
<210>59
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>59
Figure C02825642D03274
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>60
Figure C02825642D03275
<210>61
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>61
Figure C02825642D03276
<210>62
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>62
Figure C02825642D03277
<210>63
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>63
Figure C02825642D03281
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>64
Figure C02825642D03282
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>65
Figure C02825642D03283
<210>66
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>66
Figure C02825642D03284
<210>67
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>67
Figure C02825642D03285
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>68
Figure C02825642D03286
<210>69
<211>1418
<212>DNA
<213>砖红色链霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1188)
<220>
<221>CDS
<222>(1224)..(1418)
<400>69
Figure C02825642D03291
Figure C02825642D03301
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>70
Figure C02825642D03302
<210>71
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>71
Figure C02825642D03303
<210>72
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>72
Figure C02825642D03311
<210>73
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>73
Figure C02825642D0331181019QIETU
<210>74
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>74
<210>75
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>75
Figure C02825642D03313
<210>76
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>76
Figure C02825642D03314
<210>77
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>77
Figure C02825642D03315
<210>78
<211>1233
<212>DNA
<213>Streptmyces carbophilus SANK 62585
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1233)
<400>78
Figure C02825642D03316
Figure C02825642D03321
<210>79
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>79
Figure C02825642D03332
<210>80
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>80
Figure C02825642D03333
<210>81
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>81
Figure C02825642D03334
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>82
Figure C02825642D03335
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>83
<210>84
<211>1221
<212>DNA
<213>浅灰链霉菌(Streptmyces griseolus)ATCC 11796
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1221)
<400>84
Figure C02825642D03342
Figure C02825642D03351
<210>85
<211>1451
<212>DNA
<213>浅灰链霉菌(Streptmyces griseolus)ATCC 11796
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1221)
<220>
<221>CDS
<222>(1242)..(1451)
<400>85
Figure C02825642D03352
Figure C02825642D03361
<210>86
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>86
Figure C02825642D03372
<210>87
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>87
Figure C02825642D03373
<210>88
<211>248
<212>DNA
<213>Glycine max(L.)Merrill
<220>
<221>CDS
<222>(20)..(220)
<400>88
Figure C02825642D03374
<210>89
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>89
Figure C02825642D03382
<210>90
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>90
Figure C02825642D03383
<210>91
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>91
<210>92
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>92
<210>93
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>93
Figure C02825642D03386
<210>94
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>94
<210>95
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>95
Figure C02825642D03392
<210>96
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>96
Figure C02825642D03393
<210>97
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>97
Figure C02825642D03394
<210>98
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>98
Figure C02825642D03395
<210>99
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>99
Figure C02825642D03396
<210>100
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>100
Figure C02825642D03397
<210>101
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>101
<210>102
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>102
Figure C02825642D03402
<210>103
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>103
Figure C02825642D03403
<210>104
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>104
Figure C02825642D03404
<210>105
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>105
Figure C02825642D03405
<210>106
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>106
<210>107
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>107
Figure C02825642D03407
<210>108
<211>411
<212>PRT
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>108
Figure C02825642D03411
<210>109
<211>1236
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1236)
<400>109
Figure C02825642D03412
Figure C02825642D03421
<210>110
<211>1454
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1236)
<220>
<221>CDS
<222>(1263)..(1454)
<400>110
Figure C02825642D03432
Figure C02825642D03441
Figure C02825642D03451
<210>111
<211>63
<212>PRT
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>111
Figure C02825642D03452
<210>112
<211>192
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(192)
<400>112
<210>113
<211>20
<212>PRT
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>113
Figure C02825642D03454
<210>114
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>114
<210>115
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>115
Figure C02825642D03461
<210>116
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>116
Figure C02825642D03462
<210>117
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>117
Figure C02825642D03463
<210>118
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>118
<210>119
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>119
Figure C02825642D03465
<210>120
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>120
Figure C02825642D03466
<210>121
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>121
Figure C02825642D03467
<210>122
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>122
Figure C02825642D03471
<210>123
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>123
Figure C02825642D03472
<210>124
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>124
<210>125
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>125
Figure C02825642D03474
<210>126
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>126
Figure C02825642D03475
<210>127
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>127
Figure C02825642D03476
<210>128
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>128
Figure C02825642D03477
<210>129
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>129
Figure C02825642D03481
<210>130
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>130
Figure C02825642D03482
<210>131
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>131
<210>132
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>132
Figure C02825642D03484
<210>133
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>133
Figure C02825642D03485
<210>134
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>134
Figure C02825642D03486
<210>135
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>135
Figure C02825642D03487
<210>136
<211>402
<212>PRT
<213>热淡天蓝链霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t
<400>136
Figure C02825642D03491
<210>137
<211>409
<212>PRT
<213>球团产色链霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T
<400>137
Figure C02825642D03492
Figure C02825642D03501
<210>138
<211>409
<212>PRT
<213>橄榄产色链霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444
<400>138
Figure C02825642D03502
Figure C02825642D03511
<210>139
<211>1230
<212>DNA
<213>黑胡桃链霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<400>139
Figure C02825642D03512
Figure C02825642D03521
<210>140
<211>1278
<212>DNA
<213>津岛链霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1278)
<400>140
Figure C02825642D03531
Figure C02825642D03541
<210>141
<211>1209
<212>DNA
<213>热淡天蓝链霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1209)
<400>141
Figure C02825642D03551
<210>142
<211>1230
<212>DNA
<213>球团产色链霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<400>142
Figure C02825642D03561
Figure C02825642D03571
<210>143
<211>1230
<212>DNA
<213>橄榄产色链霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<400>143
Figure C02825642D03572
<210>144
<211>1449
<212>DNA
<213>黑胡桃链霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<220>
<221>CDS
<222>(1243)..(1449)
<400>144
Figure C02825642D03591
Figure C02825642D03601
<210>145
<211>1480
<212>DNA
<213>津岛链霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1278)
<220>
<221>CDS
<222>(1284)..(1480)
<400>145
Figure C02825642D03611
Figure C02825642D03621
<210>146
<211>1473
<212>DNA
<213>热淡天蓝链霉菌(Streptomyces thermocoerulescens)IFO 14273t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1209)
<220>
<221>CDS
<222>(1222)..(1473)
<400>146
Figure C02825642D03631
Figure C02825642D03641
<210>147
<211>1449
<212>DNA
<213>球团产色链霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<220>
<221>CDS
<222>(1243)..(1449)
<400>147
Figure C02825642D03642
<210>148
<211>1449
<212>DNA
<213>橄榄产色链霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<220>
<221>CDS
<222>(1243)..(1449)
<400>148
Figure C02825642D03671
Figure C02825642D03681
<210>149
<211>68
<212>PRT
<213>黑胡桃链霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445
<400>149
Figure C02825642D03682
<210>150
<211>65
<212>PRT
<213>津岛链霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T
<400>150
Figure C02825642D03683
<210>151
<211>83
<212>PRT
<213>热淡天蓝链霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t
<400>151
Figure C02825642D03684
<210>152
<211>68
<212>PRT
<213>球团产色链霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T
<400>152
Figure C02825642D03685
Figure C02825642D03691
<210>153
<211>68
<212>PRT
<213>橄榄产色链霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444
<400>153
Figure C02825642D03692
<210>154
<211>207
<212>DNA
<213>黑胡桃链霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(207)
<400>154
Figure C02825642D03693
<210>155
<211>198
<212>DNA
<213>津岛链霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(198)
<400>155
Figure C02825642D03694
<210>156
<211>252
<212>DNA
<213>热淡天蓝链霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(252)
<400>156
Figure C02825642D03702
<210>157
<211>207
<212>DNA
<213>球团产色链霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(207)
<400>157
Figure C02825642D03711
<210>158
<211>207
<212>DNA
<213>橄榄产色链霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(207)
<400>158
Figure C02825642D03712
<210>159
<211>409
<212>PRT
<213>黑胡桃链霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445
<400>159
Figure C02825642D03713
Figure C02825642D03721
<210>160
<211>425
<212>PRT
<213>津岛链霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T
<400>160
Figure C02825642D03722
Figure C02825642D03731
<210>161
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>161
<210>162
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>162
<210>163
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>163
Figure C02825642D03734
<210>164
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>164
Figure C02825642D03735
<210>165
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>165
Figure C02825642D03736
<210>166
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>166
Figure C02825642D03737
<210>167
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>167
<210>168
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>168
Figure C02825642D03742
<210>169
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>169
Figure C02825642D03743
<210>170
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>170
<210>171
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>171
Figure C02825642D03745
<210>172
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>172
Figure C02825642D03746
<210>173
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>173
Figure C02825642D03747
<210>174
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>174
Figure C02825642D03751
<210>175
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>175
Figure C02825642D03752
<210>176
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>176
Figure C02825642D03753
<210>177
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>177
Figure C02825642D03754
<210>178
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>178
Figure C02825642D03755
<210>179
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>179
Figure C02825642D03756
<210>180
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>180
Figure C02825642D03757
<210>181
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>181
Figure C02825642D03761
<210>182
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>182
<210>183
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>183
Figure C02825642D03763
<210>184
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>184
<210>185
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>185
Figure C02825642D03765
<210>186
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>186
Figure C02825642D03766
<210>187
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>187
Figure C02825642D03767
<210>188
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>188
Figure C02825642D03771
<210>189
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>189
Figure C02825642D03772
<210>190
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>190
Figure C02825642D03773
<210>191
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>191
Figure C02825642D03774
<210>192
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>192
<210>193
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>193
Figure C02825642D03776
<210>194
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>194
Figure C02825642D03781
<210>195
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>195
Figure C02825642D03782
<210>196
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>196
Figure C02825642D03783
<210>197
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>197
Figure C02825642D03784
<210>198
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>198
Figure C02825642D03785
<210>199
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>199
Figure C02825642D03786
<210>200
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>200
Figure C02825642D03791
<210>201
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>201
<210>202
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>202
Figure C02825642D03793
<210>203
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>203
Figure C02825642D03794
<210>204
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>204
Figure C02825642D03795
<210>205
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>205
Figure C02825642D03796
<210>206
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>206
Figure C02825642D03801
<210>207
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>207
<210>208
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>208
Figure C02825642D03803
<210>209
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>209
Figure C02825642D03804
<210>210
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>210
Figure C02825642D03805
<210>211
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>211
Figure C02825642D03806
<210>212
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>212
Figure C02825642D03807
<210>213
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>213
Figure C02825642D03811
<210>214
<211>1227
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1227)
<223>设计的编码SEQ ID No.1的氨基酸序列的多核苷酸
<400>214
Figure C02825642D03812
<210>215
<211>416
<212>PRT
<213>装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<400>215
Figure C02825642D03822
Figure C02825642D03831
<210>216
<211>416
<212>PRT
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137
<400>216
Figure C02825642D03832
<210>217
<211>409
<212>PRT
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>217
Figure C02825642D03842
Figure C02825642D03851
<210>218
<211>416
<212>PRT
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T
<400>218
Figure C02825642D03852
<210>219
<211>405
<212>PRT
<213>羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T
<400>219
Figure C02825642D03853
<210>220
<211>414
<212>PRT
<213>三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T
<400>220
Figure C02825642D03862
Figure C02825642D03871
<210>221
<211>409
<212>PRT
<213>苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T
<400>221
Figure C02825642D03872
Figure C02825642D03881
<210>222
<211>398
<212>PRT
<213>玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T
<400>222
Figure C02825642D03882
<210>223
<211>414
<212>PRT
<213>鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T
<400>223
Figure C02825642D03891
<210>224
<211>398
<212>PRT
<213>斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T
<400>224
<210>225
<211>1251
<212>DNA
<213>装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<400>225
Figure C02825642D03902
Figure C02825642D03911
Figure C02825642D03921
<210>226
<211>1251
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<400>226
Figure C02825642D03931
<210>227
<211>1230
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<400>227
Figure C02825642D03932
Figure C02825642D03951
<210>228
<211>1251
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<400>228
Figure C02825642D03952
Figure C02825642D03961
<210>229
<211>1218
<212>DNA
<213>羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1218)
<400>229
Figure C02825642D03962
Figure C02825642D03971
Figure C02825642D03981
<210>230
<211>1245
<212>DNA
<213>三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1245)
<400>230
Figure C02825642D03982
Figure C02825642D03991
<210>231
<211>1230
<212>DNA
<213>苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<400>231
Figure C02825642D03992
Figure C02825642D04011
<210>232
<211>1197
<212>DNA
<213>玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<400>232
Figure C02825642D04012
Figure C02825642D04021
<210>233
<211>1245
<212>DNA
<213>鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1245)
<400>233
Figure C02825642D04022
Figure C02825642D04031
Figure C02825642D04041
<210>234
<211>1197
<212>DNA
<213>斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<400>234
Figure C02825642D04042
Figure C02825642D04051
<210>235
<211>1454
<212>DNA
<213>装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<220>
<221>CDS
<222>(1257)..(1454)
<400>235
Figure C02825642D04052
Figure C02825642D04061
Figure C02825642D04071
<210>236
<211>1454
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<220>
<221>CDS
<222>(1257)..(1454)
<400>236
Figure C02825642D04072
Figure C02825642D04081
Figure C02825642D04091
<210>237
<211>1449
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<220>
<221>CDS
<222>(1243)..(1449)
<400>237
Figure C02825642D04092
Figure C02825642D04101
<210>238
<211>1454
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<220>
<221>CDS
<222>(1299)..(1454)
<400>238
<210>239
<211>1461
<212>DNA
<213>羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1218)
<220>
<221>CDS
<222>(1231)..(1461)
<400>239
Figure C02825642D04131
Figure C02825642D04141
<210>240
<211>1458
<212>DNA
<213>三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1245)
<220>
<221>CDS
<222>(1258)..(1458)
<400>240
Figure C02825642D04151
Figure C02825642D04161
<210>241
<211>1448
<212>DNA
<213>苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1230)
<220>
<221>CDS
<222>(1254)..(1448)
<400>241
Figure C02825642D04171
Figure C02825642D04181
<210>242
<211>1411
<212>DNA
<213>玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<220>
<221>CDS
<222>(1211)..(1411)
<400>242
Figure C02825642D04182
Figure C02825642D04191
Figure C02825642D04201
<210>243
<211>1466
<212>DNA
<213>鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1245)
<220>
<221>CDS
<222>(1269)..(1466)
<400>243
Figure C02825642D04202
Figure C02825642D04211
Figure C02825642D04221
<210>244
<211>1411
<212>DNA
<213>斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<220>
<221>CDS
<222>(1211)..(1411)
<400>244
Figure C02825642D04222
Figure C02825642D04231
<210>245
<211>65
<212>PRT
<213>装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<400>245
Figure C02825642D04241
<210>246
<211>65
<212>PRT
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137
<400>246
<210>247
<211>68
<212>PRT
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>247
Figure C02825642D04243
<210>248
<211>51
<212>PRT
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T
<400>248
<210>249
<211>76
<212>PRT
<213>羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T
<400>249
Figure C02825642D04251
<210>250
<211>66
<212>PRT
<213>三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T
<400>250
<210>251
<211>64
<212>PRT
<213>苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T
<400>251
Figure C02825642D04253
<210>252
<211>66
<212>PRT
<213>玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T
<400>252
Figure C02825642D04254
<210>253
<211>65
<212>PRT
<213>鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T
<400>253
Figure C02825642D04255
<210>254
<211>66
<212>PRT
<213>斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T
<400>254
Figure C02825642D04261
<210>255
<211>198
<212>DNA
<213>装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(198)
<400>255
Figure C02825642D04262
<210>256
<211>198
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(198)
<400>256
Figure C02825642D04263
<210>257
<211>207
<212>DNA
<213>不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(207)
<400>257
Figure C02825642D04271
<210>258
<211>156
<212>DNA
<213>灰色链霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(156)
<400>258
Figure C02825642D04272
<210>259
<211>231
<212>DNA
<213>羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(231)
<400>259
Figure C02825642D04273
Figure C02825642D04281
<210>260
<211>201
<212>DNA
<213>三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(201)
<400>260
Figure C02825642D04282
<210>261
<211>195
<212>DNA
<213>苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(195)
<400>261
Figure C02825642D04283
<210>262
<211>201
<212>DNA
<213>玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(201)
<400>262
<210>263
<211>198
<212>DNA
<213>鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(198)
<400>263
Figure C02825642D04292
<210>264
<211>201
<212>DNA
<213>斯堡链霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(201)
<400>264
Figure C02825642D04293
Figure C02825642D04301
<210>265
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>265
Figure C02825642D04302
<210>266
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>266
Figure C02825642D04303
<210>267
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>267
Figure C02825642D04304
<210>268
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>268
<210>269
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>269
Figure C02825642D04306
<210>270
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>270
Figure C02825642D04307
<210>271
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>271
<210>272
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>272
Figure C02825642D04312
<210>273
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>273
Figure C02825642D04313
<210>274
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>274
Figure C02825642D04314
<210>275
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>275
Figure C02825642D04315
<210>276
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>276
Figure C02825642D04316
<210>277
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>277
Figure C02825642D04317
<210>278
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>278
Figure C02825642D04321
<210>279
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>279
Figure C02825642D04322
<210>280
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>280
Figure C02825642D04323
<210>281
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>281
Figure C02825642D04324
<210>282
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>282
Figure C02825642D04325
<210>283
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>283
Figure C02825642D04326
<210>284
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>284
<210>285
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>285
Figure C02825642D04331
<210>286
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>286
Figure C02825642D04332
<210>287
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>287
Figure C02825642D04333
<210>288
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>288
Figure C02825642D04334
<210>289
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>289
Figure C02825642D04335
<210>290
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>290
Figure C02825642D04336
<210>291
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>291
Figure C02825642D04341
<210>292
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>292
<210>293
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>293
Figure C02825642D04343
<210>294
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>294
Figure C02825642D04344
<210>295
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>295
Figure C02825642D04345
<210>296
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>296
Figure C02825642D04346
<210>297
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>297
Figure C02825642D04347
<210>298
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>298
Figure C02825642D04351
<210>299
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>299
Figure C02825642D04352
<210>300
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>300
Figure C02825642D04353
<210>301
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>301
Figure C02825642D04354
<210>302
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>302
Figure C02825642D04355
<210>303
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>303
Figure C02825642D04356
<210>304
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>304
Figure C02825642D04357
<210>305
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>305
Figure C02825642D04361
<210>306
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>306
Figure C02825642D04362
<210>307
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>307
Figure C02825642D04363
<210>308
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>308
Figure C02825642D04364
<210>309
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>309
<210>310
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>310
Figure C02825642D04366
<210>311
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>311
<210>312
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>312
Figure C02825642D04371
<210>313
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>313
Figure C02825642D04372
<210>314
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>314
Figure C02825642D04373
<210>315
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>315
Figure C02825642D04374
<210>316
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>316
<210>317
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>317
<210>318
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>318
Figure C02825642D04377
<210>319
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>319
Figure C02825642D04381
<210>320
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>320
Figure C02825642D04382
<210>321
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>321
Figure C02825642D04383
<210>322
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为DNA测序设计的寡核苷酸引物
<400>322
Figure C02825642D04384
<210>323
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>323
Figure C02825642D04385
<210>324
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>324
Figure C02825642D04386
<210>325
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>325
Figure C02825642D04387
<210>326
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>326
Figure C02825642D04391
<210>327
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>327
Figure C02825642D04392
<210>328
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>328
Figure C02825642D04393
<210>329
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>329
Figure C02825642D04394
<210>330
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>330
Figure C02825642D04395
<210>331
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>331
Figure C02825642D04396
<210>332
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>332
<210>333
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>333
Figure C02825642D04402
<210>334
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>334
Figure C02825642D04403
<210>335
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>335
Figure C02825642D04404
<210>336
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>336
Figure C02825642D04405
<210>337
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>337
Figure C02825642D04406
<210>338
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>338
<210>339
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>339
Figure C02825642D04411
<210>340
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>340
Figure C02825642D04412
<210>341
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>341
Figure C02825642D04413
<210>342
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>342
Figure C02825642D04414
<210>343
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>343
Figure C02825642D04415
<210>344
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>344
Figure C02825642D04416
<210>345
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>345
Figure C02825642D04417
<210>346
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>346
Figure C02825642D04421
<210>347
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>347
Figure C02825642D04422
<210>348
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>348
Figure C02825642D04423
<210>349
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>349
Figure C02825642D04424
<210>350
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>350
<210>351
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>351
Figure C02825642D04426
<210>352
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>352
Figure C02825642D04431
<210>353
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>353
Figure C02825642D04432
<210>354
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>354
Figure C02825642D04433
<210>355
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>355
Figure C02825642D04434
<210>356
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>356
<210>357
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>357
Figure C02825642D04436
<210>358
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>358
Figure C02825642D04441
<210>359
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>359
Figure C02825642D04442
<210>360
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>360
Figure C02825642D04443
<210>361
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>361
Figure C02825642D04444
<210>362
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>362
Figure C02825642D04445
<210>363
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>363
Figure C02825642D04446
<210>364
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>364
Figure C02825642D04447
<210>365
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>365
<210>366
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>366
Figure C02825642D04452
<210>367
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>367
Figure C02825642D04453
<210>368
<211>1197
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<223>设计的编码SEQ ID No.222的氨基酸序列的多核苷酸
<400>368
Figure C02825642D04454
Figure C02825642D04461
<210>369
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>369
Figure C02825642D04471
<210>370
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>370
Figure C02825642D04472
<210>371
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>371
Figure C02825642D04473
<210>372
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>372
Figure C02825642D04474
<210>373
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>373
<210>374
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>374
Figure C02825642D04476
<210>375
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>375
Figure C02825642D04481
<210>376
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>376
Figure C02825642D04482
<210>377
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>377
<210>378
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>378
Figure C02825642D04484
<210>379
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>379
Figure C02825642D04485
<210>380
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>380
Figure C02825642D04486
<210>381
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>381
Figure C02825642D04491
<210>382
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>382
Figure C02825642D04492
<210>383
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>383
Figure C02825642D04493
<210>384
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>384
Figure C02825642D04494
<210>385
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>385
Figure C02825642D04495
<210>386
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>386
<210>387
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为pCR设计的寡核苷酸引物
<400>387
Figure C02825642D04497
<210>388
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>388
Figure C02825642D04501
<210>389
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>389
Figure C02825642D04502
<210>390
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>390
Figure C02825642D04503
<210>391
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>391
Figure C02825642D04504
<210>392
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>392
Figure C02825642D04505
<210>393
<211>1197
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1197)
<223>设计的编码SEQ ID No.224的氨基酸序列的多核苷酸
<400>393
Figure C02825642D04511
Figure C02825642D04521
<210>394
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>394
Figure C02825642D04522
<210>395
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>395
<210>396
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>396
Figure C02825642D04524
<210>397
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>397
Figure C02825642D04525
<210>398
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>398
Figure C02825642D04526
<210>399
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>399
Figure C02825642D04531
<210>400
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>400
Figure C02825642D04532
<210>401
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为PCR设计的寡核苷酸引物
<400>401
Figure C02825642D04533
<210>402
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>402
Figure C02825642D04534
<210>403
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为表达载体构建设计的寡核苷酸接头
<400>403
Figure C02825642D04535

Claims (42)

1.编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自下述物质组成的组：
一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：224所示；和
一种蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO：224所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中所述蛋白质具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力：
Figure C02825642C00021
2.按照权利要求1的DNA，其中所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：222或SEQ ID NO：224所示。
3.按照权利要求1的DNA，其中所述蛋白质的氨基酸序列由SEQ IDNO：232或SEQ ID NO：234所示的核苷酸序列编码。
4.按照权利要求1的DNA，其包含编码所述蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列，其中在所述核苷酸序列中的密码子使用是在来自引入所述DNA的宿主细胞物种的基因中密码子使用±4％的范围内并且所述核苷酸序列的GC含量是至少40％和至多60％。
5.按照权利要求4的DNA，其中所述核苷酸序列在SEQ ID NO：368中表示。
6.按照权利要求4的DNA，其中所述核苷酸序列在SEQ ID NO：393中表示。
7.一种DNA，其中具有编码胞内细胞器转运信号序列的核苷酸序列的DNA在框内连接在按照权利要求1的DNA的上游。
8.一种DNA，其中按照权利要求1的DNA和在宿主细胞中起作用的启动子可操作地连接。
9.包含按照权利要求1的DNA的载体。
10.一种生产载体的方法，其包含将按照权利要求1的DNA插入可在宿主细胞中复制的载体的步骤。
11.一种转化体，其中将按照权利要求1的DNA引入宿主细胞。
12.按照权利要求11的转化体，其中所述宿主细胞是微生物细胞或植物细胞。
13.一种生产转化体的方法，其包含将按照权利要求1的DNA引入宿主细胞的步骤。
14.一种生产具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的方法，所述方法包含培养按照权利要求11的转化体和回收产生的所述蛋白质的步骤。
15.按照权利要求1的DNA在生产具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质中的应用。
16.一种给予植物除草剂抗性的方法，所述方法包含将按照权利要求1的DNA引入植物细胞和在其中表达的步骤。
17.一种检测编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的方法，所述方法包含检测在杂交中与探针杂交的DNA的步骤，所述杂交使用按照权利要求1的DNA作为探针。
18.一种获得编码具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的DNA的方法，所述方法包含回收通过按照权利要求17的方法检测的DNA的步骤。
19.一种筛选具有编码一种蛋白质的DNA的细胞的方法，所述蛋白质具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力，所述方法包含通过按照权利要求17的方法从试验细胞中检测所述DNA的步骤。
20.一种蛋白质，所述蛋白质选自下述物质组成的组：
一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：224所示；和
一种蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO：224所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中所述蛋白质具有在包含电子供体的电子传递体系的存在下将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力：
21.按照权利要求20的蛋白质，其中所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO：222或SEQ ID NO：224所示。
22.一种识别按照权利要求20的蛋白质的抗体。
23.一种检测按照权利要求1的蛋白质的方法，所述方法包含：
(1)将试样物质与识别所述蛋白质的抗体接触的步骤和
(2)检测由所述接触产生的、所述蛋白质和所述抗体的复合体的步骤。
24.一种分析或检测试剂盒，其包含按照权利要求22的抗体。
25.一种包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸选自由下述物质组成的组：
在SEQ ID NO：242中表示的核苷酸序列；
和
在SEQ ID NO：244中表示的核苷酸序列。
26.包含按照权利要求25的DNA的载体。
27.一种转化体，其中将按照权利要求25的DNA引入宿主细胞。
28.按照权利要求27的转化体，其中所述宿主细胞是微生物细胞或植物细胞。
29.一种生产转化体的方法，其包含将按照权利要求25的DNA引入宿主细胞的步骤。
30.一种生产具有将式(II)化合物转化为式(III)化合物的能力的蛋白质的方法，所述方法包含培养按照权利要求27的转化体和回收产生的所述蛋白质的步骤。
31.一种控制杂草的方法，其包含将化合物施用于表达按照权利要求20的蛋白质的植物的栽培区域的步骤，
其中所述化合物是式(I)的化合物：
Figure C02825642C00051
其中在式(I)中，G表示在下列G-1至G-9中任何一个表示的基团：
Figure C02825642C00052
Figure C02825642C00061
其中在G-1至G-9中，
X表示氧原子或硫原子；
Y表示氧原子或硫原子；
R1表示氢原子或卤原子；
R2表示氢原子，C1-C8烷基，C1-C8卤代烷基，卤原子，羟基，-OR9基团，-SH基团，-S(O)pR9基团，-COR9基团，-CO2R9基团，-C(O)SR9基团，-C(O)NR11R12基团，-CONH2基团，-CHO基团，-CR9＝NOR18基团，-CH＝CR19CO2R9基团，-CH2CHR19CO2R9基团，-CO2N＝CR13R14基团，硝基，氰基，-NHSO2R15基团，-NHSO2NHR15基团，-NR9R20基团，-NH2基团或苯基，其可以被一个或多个可以相同或不同的C1-C4烷基取代；
p表示0，1或2；
R3表示C1-C2烷基，C1-C2卤代烷基，-OCH3基团，-SCH3基团，-OCHF2基团，卤原子，氰基，硝基或C1-C3烷氧基，其用在苯环上可以被至少一个取代基取代的苯基取代，所述取代基选自卤原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，OR28基团，NR11R28基团，SR28基团，氰基，CO2R28基团和硝基；
R4表示氢原子，C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基；
R5表示氢原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，环丙基，乙烯基，C2炔基，氰基，-C(O)R20基团，-CO2R20基团，-C(O)NR20R21基团，-CHR16R17CN基团，-CR16R17C(O)R20基团，-CR16R17CO2R20基团，-CR16R17C(O)NR20R21基团，-CHR16OH基团，-CHR16OC(O)R20基团或-OCHR16OC(O)NR20R21基团，或当G表示G-2或G-6时，R4和R5可以表示与它们结合的碳原子一起的C＝O基团；
R6表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C2-C6烷氧基烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；
R7表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，卤原子，-S(O)2(C1-C6烷基)或-C(＝O)R22基团；
R8表示氢原子，C1-C8烷基，C3-C8环烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8卤代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C3-C8烷氧基烷氧基烷基，C3-C8卤代炔基，C3-C5卤代烯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8卤代烷基磺酰基，C3-C8烷氧基羰基烷基，-S(O)2NH(C1-C8烷基)基团，-C(O)R23基团或可在苯环上被R24取代的苄基；
R9表示C1-C8烷基，C3-C8环烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8卤代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C2-C8烷基硫代烷基，C2-C8烷基亚磺酰基烷基，C2-C8烷基磺酰基烷基，C4-C8烷氧基烷氧基烷基，C4-C8环烷基烷基，C4-C8环烷氧基烷基，C4-C8烯基氧基烷基，C4-C8炔基氧基烷基，C3-C8卤代烷氧基烷基，C4-C8卤代烯基氧基烷基，C4-C8卤代炔基氧基烷基，C4-C8环烷基硫代烷基，C4-C8烯基硫代烷基，C4-C8炔基硫代烷基，苯氧基取代的C1-C4烷基，所述苯氧基可在环上被至少一种取代基取代，所述取代基选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基，苄氧基取代的C1-C4烷基，所述苄氧基可在环上被至少一种取代基取代，所述取代基选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基，C4-C8 trialkylsyrylalkyl基团，C2-C8氰烷基，C3-C8卤代环烷基，C3-C8卤代烯基，C5-C8烷氧基烯基，C5-C8卤代烷氧基烯基，C5-C8烷基硫代烯基，C3-C8卤代炔基，C5-C8烷氧基炔基，C5-C8卤代烷氧基炔基，C5-C8烷基硫代炔基，C2-C8烷基羰基，在环上可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基，C1-C3卤代烷基，-OR28基团，-NR11R28基团，-SR28基团，氰基，-CO2R28基团和硝基的取代基取代的苄基，-CR16R17COR10基团，-CR16R17CO2R20基团，-CR16R17P(O)(OR10)2基团，-CR16R17P(S)(OR10)2基团，-CR16R17C(O)NR11R12基团，-CR16R17C(O)NH2基团，-C(＝CR26R27)COR10基团，-C(＝CR26R27)CO2R20基团，-C(＝CR26R27)P(O)(OR10)2基团，-C(＝CR26R27)P(S)(OR10)2基团，-C(＝CR26R27)C(O)NR11R12基团，-C(＝CR26R27)C(O)NH2基团，或在Q-1至Q-7表示的环中的任何一个：
Figure C02825642C00081
其在环上可以被至少一种取代基取代，所述取代基选自卤原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C2-C6烯基，C2-C6卤代烯基，C2-C6炔基，C3-C6卤代炔基，C2-C8烷氧基烷基，-OR28基团，-SR28基团，-NR11R28基团，C3-C8烷氧羰基烷基，C2-C4羧基烷基，-CO2R28基团和氰基；
R10表示C1-C6烷基，C2-C6烯基，C3-C6炔基或四氢呋喃基团；
R11和R13独立地表示氢原子或C1-C4烷基；
R12表示C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6卤代烯基，C3-C6卤代炔基，在环上可以被至少一种取代基取代的苯基，所述取代基选自卤原子，C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，或-CR16R17CO2R25基团；或，
R11和R12一起可以表示-(CH2)5-，-(CH2)4-，或-CH2CH2OCH2CH2-，或者如果是那样的话，产生的环可以用选自C1-C3烷基，苯基和苄基的取代基取代；
R14表示C1-C4烷基或在环上可以用选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基所取代的苯基；或，
R13和R14可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C8环烷基；
R15表示C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基或C3-C6烯基；
R16和R17独立地表示氢原子或C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C4烯基，C2-C4卤代烯基，C2-C4炔基，C3-C4卤代炔基；或，
R16和R17可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C6环烷基，或者如此形成的环可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基所取代；
R18表示氢原子，C1-C6烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；
R19表示氢原子，C1-C4烷基或卤原子；
R20表示氢原子，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6卤代烯基，C3-C6卤代炔基，在环上可以用至少一种取代基取代的苯基，所述取代基选自卤原子，C1-C4烷基和-OR28基团，或-CR16R17CO2R25基团；
R21表示氢原子，C1-C2烷基或-CO2(C1-C4烷基)基团；
R22表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或NH(C1-C6烷基)基团；
R23表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C6烷氧基，NH(C1-C6烷基)基团，苄基，C2-C8二烷基氨基或可以用R24取代的苯基；
R24表示C1-C6烷基，1-2个卤原子，C1-C6烷氧基或CF3基团；
R25表示C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6烯基，C3-C6卤代烯基，C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基；
R26和R27各自独立地表示氢原子，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C4烯基，C2-C4卤代烯基，C2-C4炔基，C3-C4卤代炔基，-OR28基团，-NHR28基团，或-SR28基团；或，
R26和R27可以与它们结合的碳原子一起表示C3-C8环烷基，或每个如此形成的环可以用至少一种选自卤原子，C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基的取代基所取代；并且
R28表示氢原子，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C3-C6烯基，C3-C6卤代烯基，C3-C6炔基，C3-C6卤代炔基，C2-C4羧基烷基，C3-C8烷氧基羰基烷基，C3-C8卤代烷氧基羰基烷基，C5-C9烯基氧基羰基烷基，C5-C9卤代烯基氧基羰基烷基，C5-C9炔基氧基羰基烷基，C5-C9卤代炔基氧基羰基烷基，C5-C9环烷氧基羰基烷基或C5-C9卤代环烷氧基羰基烷基。
32.一种评估细胞对式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含：
(1)将所述化合物与表达按照权利要求20的蛋白质的细胞接触的步骤，和
(2)评估在上述步骤(1)中对接触所述化合物的细胞的损伤程度的步骤。
33.按照权利要求32的方法，其中所述细胞是微生物细胞或植物细胞；
34.选择抗式(I)化合物的细胞的方法，所述方法包含基于在按照权利要求32的方法中评估的抗性来选择细胞的步骤。
35.通过按照权利要求34的方法选择的抗除草剂的细胞，或其培养物。
36.一种评估植物对式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含：
(1)将所述化合物与表达按照权利要求20的蛋白质的植物接触的步骤，和
(2)评估在上述步骤(1)中对接触所述化合物的植物的损伤程度的步骤。
37.一种选择抗式(I)化合物的植物的方法，所述方法包含基于在按照权利要求36的方法中评估的抗性来选择植物的步骤。
38.一种由按照权利要求37的方法选择的抗除草剂植物，或其后代。
39.一种处理式(I)化合物的方法，所述方法包含在含有电子供体的电子传递体系的存在下将所述化合物与按照权利要求20的蛋白质反应。
40.按照权利要求39的方法，其中通过将所述化合物与转化体接触将所述化合物与所述蛋白质反应，在所述转化体中将编码所述蛋白质的DNA引入能使它在所述细胞中表达的位置的宿主细胞中。
41.按照权利要求20的蛋白质在处理式(I)化合物中的应用。
42.编码按照权利要求20的蛋白质的多核苷酸在处理式(I)化合物中的应用。
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原卟啉原氧化酶抑制剂研究与开发进展. 石小清等.浙江化工，第31卷第3期. 2000
原卟啉原氧化酶抑制剂研究与开发进展. 石小清等.浙江化工，第31卷第3期. 2000 *

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