CN102428186A - 包含编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和/或丙酮酸正磷酸双激酶的构建体的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性启动子的遗传构建体，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和/或丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。所述构建体具有在转基因植物叶衰老期间引起氮素再动员的能力，使得氮可从叶转移到植物的其它部位。本发明提供用这类构建体转化的植物细胞以及植物、产生转基因植物的方法和提高衰老植物的氮素再动员速度和生长速度的方法。本发明还提供已用遗传构建体转化的收获的植物叶，例如烟草叶，以及包含这类收获的植物叶的吸烟制品。

Description

包含编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和/或丙酮酸正磷酸双激酶的构建体的转基因植物

本发明涉及用于制备转基因植物的遗传构建体。该构建体在叶衰老期间具有引起氮素再动员的能力，使得氮可从叶转移到植物的其它部位。本发明提供用这种构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在衰老植物中提高氮素再动员(nitrogen remobilisation)的速度的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含这类收获的植物叶的吸烟制品。

叶衰老是植物发育的一个阶段，期间，细胞在细胞死亡前经历独特的代谢和结构变化。生理学和遗传学研究表明衰老是一个被高度调节的过程。叶经过衰老的进程因由叶绿体解体所造成的叶绿素丧失并随之变黄而十分明显。例如，可通过溶剂提取和分光光度测定或通过叶绿素含量测定仪，测量这个发育阶段特有的下降的叶叶绿素水平。与对同一植物(优选生长在恒定条件下)所记录的较早的叶叶绿素水平相比，叶叶绿素水平下降表明衰老。

分子研究表明，衰老与基因表达的改变有关。编码参与光合作用的蛋白质的mRNA水平在衰老期间下降，而编码被认为参与衰老的蛋白质的基因的mRNA水平升高。衰老是一个极有组织的过程，受称为衰老相关基因(SAG)的基因调节。叶衰老包括蛋白质、核酸和膜的降解，以及由这种降解所致的营养物随后转运到植物的其它部位，例如发育中的种子、叶或贮藏器官。植物衰老的一个问题是衰老叶中存在的许多有用的矿物质和营养物将保留在叶中，随着叶死亡，实际上会损失掉。例如，衰老叶中存在的氮(可呈氨基酸上的氨基形式)，如果不离开垂死的叶，则将会浪费掉。

因此，在植物中，尤其在它们变衰老时，加强氮素再动员在作物生产中可具有重要应用。首先，从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此，氮从衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应，从而提高作物产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus)(油料种子油菜)，其由于营养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦，因为增加籽粒蛋白含量的潜在益处非常大。籽粒蛋白含量不仅仅影响小麦的营养价值，而且还决定籽粒使用率，并由此决定市场价值。例如，籽粒蛋白含量增加引起面包体积加大。同样，在烟草工业中提高氮素再动员的能力可能十分有用，因为已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。

酶烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK或PCK)[EC 4.1.1.49]和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)[EC 2.7.9.1]是已知的。PPDK存在于原核生物和真核生物两者中，就序列和三级结构而言，在细菌和高等植物之间是保守的(Pocalyko等，1990，Biochemistry，29，10757-10765)。该酶在下列反应中催化丙酮酸的可逆磷酸化形成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(Carroll等，1990，Federation of EuropeanBiochemical Societies，274，178-180；Hatch和Slack，1968，BiochemicalJournal，106，141-146)：丙酮酸+Pi+ATP＝PEP+PPi+AMP。在C3和C4植物两者中，PPDK基因具有独特的结构，其中由同一基因产生两种转录物。较长的转录物编码叶绿体蛋白质，其第一外显子编码叶绿体转运肽，而较短的转录物由较长转录物的第一内含子内的独立启动子转录，因此缺乏编码叶绿体转运肽的第一外显子。这种较短的转录物产生PPDK的胞质同工型。已在玉米、水稻、C3和C4黄花菊属(Flaveria)品种和鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)中报道了这种基因结构。

烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)在下列反应中催化ADP、二氧化碳和磷酸烯醇丙酮酸之间形成ATP和草酰乙酸的可逆反应：草酰乙酸+ATP＝PEP+ADP+CO₂。研究表明，PCK存在于多种植物组织细胞的细胞溶胶中。这些组织包括发育中的种子、藻丝和根。在植物中，PCK出现在其中含氮化合物代谢高的组织中。

本发明人构建了多个遗传构建体，其中将编码酶PCK和/或PPDK的基因单独或共同置于启动子的控制下，以便测定这些基因的过表达对衰老叶中的氮素再动员有哪些作用(如果有的话)。

根据本发明的第一个方面，提供包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性启动子的遗传构建体，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和/或丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。

根据本发明的第二个方面，提供包含与至少一个编码序列有效连接的启动子的遗传构建体，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。

本发明人认为在衰老期间，PCK和PPDK两种酶可在叶的氮素再动员期间各种氨基酸的互变中起作用。虽然本发明人不希望受假设的束缚，但是在图18中举例说明了说明PCK和PPDK可如何影响氮素再动员的推测的生化途径。因此，本发明人认为在衰老期间，单独或同时刺激植物内的这两种酶的过表达可在氮素再动员中起作用。

作为他们研究的结果，本发明人预料不到地发现，编码PCK和/或PPDK的本发明的构建体，引起衰老叶氮素再动员速度的提高。本发明人假设，氮可以氨基酸的形式从衰老叶移送到植物的较幼嫩部分，例如植物种子。此外，本发明人还发现，当这些酶在衰老叶中过表达时，营养性植物生长的量提高(这相当于作物产量提高)。因此本发明人认为，本发明的构建体可用于制备转基因植物，所述转基因植物可能能够显示衰老叶的氮素再动员速度提高和/或生长速度提高。

第一个方面或第二个方面的遗传构建体中的启动子可能能够诱导RNA聚合酶与编码具有PCK和/或PPDK活性的至少一种多肽的至少一个编码区结合并开始转录。

存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是组成型、非组成型或组织特异性的。合适启动子的实例包括花椰菜花叶病毒35S启动子(完整启动子或截短启动子)、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α，β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子或patatin启动子。

存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是衰老特异性启动子。

“衰老特异性启动子”(SAG)可以是与控制衰老相关基因的表达有关的启动子。因此，该启动子可基本上唯一地在渐老组织中限制与之有效连接的编码序列(即基因)的表达。因此，衰老特异性启动子可以是这样的启动子，其能够在植物组织中以发育调节的方式优先促进基因表达，使得3’蛋白质编码区的表达基本上只在植物组织正在经历衰老时发生。应理解的是，衰老趋于发生在植物较老的部分(例如较老的叶)，而不发生在植物较幼嫩的部分，例如种子。

已知表达多种衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥(Arabidopsis)。因此，第一个方面或第二个方面的构建体中的启动子可从拟南芥的衰老相关基因中分离出。Gepstein等人(The PlantJournal，2003，36，629-642)使用拟南芥作为模型对SAG及其启动子进行了详细研究。遗传构建体可包含得自该论文所公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18或者其功能变体或功能片段。

优选的启动子是SAG12和SAG13启动子。在一个实施方案中，启动子是技术人员已知的SAG12启动子或者其功能变体或片段(Gan和Amasino，1997，Plant Physiology，113：313-319)。编码SAG12启动子的DNA序列在本文中称为SEQ ID No.16，见下：

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SEQ ID NO：16

因此，本发明构建体中的启动子可包含基本上如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列或者其功能变体或功能片段。SAG12启动子序列可获自鼠耳芥，参见US 5,689,042。这个启动子序列可存在于本发明的每个遗传构建体中，如图3所示。在启动子是SAG12的实施方案中，应理解的是，启动子可包含SEQ ID No：16的碱基1-2093中的每一个。然而，启动子的功能变体或功能片段也可用于本发明的遗传构建体。

“启动子的功能变体或功能片段”可以是启动子的衍生物或部分，其在功能上足以启动与之有效连接的任何编码区的表达。例如，在启动子是以SAG12为基础的实施方案中，技术人员应了解的是可对SEQ ID No：16进行修饰，或者可能只需要SAG12启动子的部分，使之仍可启动构建体的基因表达。

可通过评价转录酶是否与推定的启动子区结合，然后引起编码区转录成具有PCK和/或PPDK活性的多肽，来容易地鉴定启动子的功能变体和功能片段。或者，可通过在与编码区结合时对启动子进行诱变，并评价是否可产生基因表达，来检测这类功能变体和片段。

在衰老期间，第一个方面的遗传构建体可能能够引起至少一种具有PCK活性和/或PPDK活性的多肽的表达。因此，遗传构建体可包含至少一个编码序列，其编码(i)烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)或者其功能变体或片段，和/或(ii)丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或者其功能变体或片段。如实施例中所述，本发明人开发出以具有PCK和/或PPDK活性的多肽为基础的一系列遗传构建体，这些遗传构建体示于图3。

在第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案中，启动子可诱导编码具有PCK活性的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为“PCK构建体”，见图3。因此，在第一个实施方案中，遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)或者其功能变体或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有PPDK活性的多肽。

在第一个方面的构建体的第二个实施方案中，启动子可诱导编码具有PPDK活性的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为“PPDK构建体”，见图3。在第二个实施方案中，遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或者其功能变体或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有PCK活性的多肽。

在第一个方面的构建体的第三个实施方案中，启动子可诱导编码既具有PCK活性又具有PPDK活性的多肽的单一编码序列的表达。这称为“PCK/PPDK构建体1”。在第三个实施方案中，遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码(i)烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)或者其功能变体或片段以及(ii)丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或者其功能变体或片段的编码序列。第三个实施方案的构建体可编码具有双重活性(即PCK和PPDK酶促活性两者)的单一转录物。PCK编码区可位于PPDK编码区的3’侧。然而，优选PCK编码区位于PPDK编码区的5’侧。

在第一个方面的构建体的第四个实施方案中，启动子可诱导以下序列的表达：(i)编码具有PCK活性的第一多肽的第一编码序列，和(ii)编码具有PPDK活性的第二多肽的第二编码序列。这称为“PCK/PPDK构建体2”。因此，在第四个实施方案中，遗传构建体可包含至少一个衰老特异性启动子和(i)编码PCK或者其功能变体或片段的第一编码序列，以及(ii)编码PPDK或者其功能变体或片段的第二编码序列，即编码两种转录物，一种酶一种转录物。

如实施例6中所述，本发明人发现在宿主细胞中过表达PCK或PPDK(例如通过用“PCK构建体”或“PPDK构建体”转化)引起在衰老叶中氮素再动员加强。此外，他们发现PCK和PPDK单一构建体导致营养生长增加。

如实施例8中所述，本发明人发现在宿主细胞中同时过表达PCK和PPDK两者(例如通过用“PCK构建体”和“PPDK构建体”两者转化)在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出乎意料地有效。因此，氮可被转运到衰老叶以外(例如作为转运氨基酸)。合适的转运氨基酸可以是谷氨酰胺和/或天冬酰胺。此外，在衰老期间同时过表达PCK和PPDK还可提高生长速度，这可导致营养生长增加。因此，第一个方面的构建体可包含编码PCK和PPDK两者或者其功能变体或片段的编码序列。

应理解的是，第二个方面的构建体包含编码PCK和PPDK两者或者其功能变体或片段的编码序列。可作为具有双重活性的单一多肽，或作为两个多肽，一个具有PCK活性，另一个具有PPDK活性，来编码两种酶。

烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)或者其功能变体或片段和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或者其功能变体或片段各自可来源于任何合适的来源，例如植物。每种酶的编码序列可来源于合适的植物源，例如来自拟南芥。因此，编码具有PCK活性的多肽的编码序列可来源于拟南芥。此外，编码具有PPDK活性的多肽的编码序列可来源于拟南芥属(Arabidopsis spp.)、玉蜀黍属(Zea spp.)、黄花菊属(Flaveria spp.)或白花菜属(Cleome spp.)。编码具有PPDK活性的多肽的编码序列可来源于鼠耳芥、玉米(Zea mays)、Flaveriatrinervia、黄顶菊(Flaveria bidentis)、Flaveria brownie或白花菜(Cleome gynandra)。

据认为在鼠耳芥中有三种编码PCK的基因。本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)的一个实施方案的基因组DNA序列(包括内含子和外显子)作为SEQ ID No：17：

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ATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATC

ATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGAT

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TTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTC

TGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAG

GAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG

SEQ ID No：17

本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)的cDNA序列(仅外显子)作为SEQ ID No：18：

ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGA

CCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGAC

GATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAA

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GAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACG

AGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCA

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GTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTT

TATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCG

ACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCT

ACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACAT

ACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTT

GTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCA

GCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAG

CTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAAT

CGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAA

ATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATG

CATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAA

GATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACT

GATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCG

AACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGAT

ATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACC

AGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATT

GAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTT

CTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACC

ATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAG

GAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACA

AAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTC

AACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACT

AGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACC

GAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGAC

CCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGT

CTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA

CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG

SEQ ID No：18

因此，编码具有PCK活性的多肽的编码序列可包含基本上如SEQ ID No：17或SEQ ID No.18所示的核酸序列或者其功能变体或片段。

本文如下提供拟南芥PCK的多肽序列作为SEQ ID No：19：

MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKK

RSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGS

TTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALA

TLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVF

VNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCN

RYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGK

DGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPD

IWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVIL

LACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPT

KYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKT

EIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSL

RRRFSLLVLSF

SEQ ID No：19

因此，具有PCK活性的多肽可包含基本上如SEQ ID No：19所示的氨基酸序列或者其功能变体或片段。

据认为拟南芥至少有两种形式的PPDK，叶绿体形式和胞质形式，这两种形式由同一基因编码，其中该基因5′端的少量剪接变化产生了这两种形式。本文如下提供编码两种形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)的基因组DNA序列(包括内含子和外显子)作为SEQ ID No：20：

ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGG

ATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTT

CCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAG

ACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAA

GCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACG

TTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACC

ATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGC

CATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTT

ACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGT

AGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGA

AACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAG

ATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAA

GTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATA

CGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTT

AAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGT

TGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAAT

AGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGAC

GAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTT

GGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACT

ATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATT

CGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTT

GCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCG

AGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTAC

CAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCA

TTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGA

GATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAG

TATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCT

TCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCG

CTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTT

TCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTG

ACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTAT

TTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGT

GGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGT

TTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCT

CAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCT

GGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGT

GATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTT

GACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTG

AAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGC

TGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTT

CCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAAT

GTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCG

ATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGG

AACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTT

CTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTC

AGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATA

TTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAA

TGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACA

TTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTT

TAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGA

GATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGT

TGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACAT

CTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTC

ATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGA

ACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAAC

CGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAT

TGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGC

GTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCT

CAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACG

CAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGG

TTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTT

GGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAA

AAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAAC

GGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATT

TGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTC

CTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGG

CGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCT

TTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGA

TTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAG

GATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGAC

ATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTT

TTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGG

TTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTG

GACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGA

TAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTT

TGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAG

GCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCG

TCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTC

AGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGG

TCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT

GAGGTAAATGTAACAAGACACAAAATGTGTTTTAGGCACTTGAAACCATGTTGCTATTTGCTAA

GTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACG

ACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCT

CGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCT

ATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGATCAGCAAGG

TGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTT

GGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTG

ACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGTAATTGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTA

CAACACTATTGTATAACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT

TGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA

SEQ ID No：20

本文如下提供编码胞质形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)的cDNA序列作为SEQ ID No：21：

ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAG

TCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTG

CCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAG

CTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATT

GGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCC

ATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTC

GTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTT

GATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAG

AGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAG

GAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCA

GATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCG

AGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAAC

ATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACT

AGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTT

TGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTG

GATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATC

TTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTG

TGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTT

GATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAA

CATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTG

GTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCG

GAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACA

AGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGA

ATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGT

TCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAAT

GAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCA

TTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATC

AGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAA

AACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATG

TTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTG

AGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTT

CCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACA

ATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATT

GTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAG

AAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTAT

CCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGAC

CAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTG

GGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCAT

ACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT

GAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACG

TTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATC

TTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATG

GCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACAT

GGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGT

TCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA

SEQ ID No：21

本文如下提供编码叶绿体形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)的cDNA序列作为SEQ ID No：22：

ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGT

ACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCA

AACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGT

TTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCC

ATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATG

AAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCG

GTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAA

AAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGAC

ATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCC

GCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTC

GTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTT

CTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTA

GAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTC

AAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCT

TCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGC

CCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTT

AACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTC

ACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAG

GTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGAT

TTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAAC

ATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGA

TTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCA

GTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCT

CAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAA

GTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACG

GCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAG

ACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGA

GGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGT

TGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATT

AATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAA

GCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCA

ATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGG

AAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAA

ATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCA

GTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTG

CTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTA

ACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAAC

ATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATA

GAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCG

TATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAG

GACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAA

TTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGT

CATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCA

GATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATG

ACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGA

ATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAG

ATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAA

CATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCT

TGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA

SEQ ID No：22

因此，编码具有PPDK活性的多肽的编码序列可包含基本上如SEQ ID No：20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22所示的核酸序列或者其功能变体或片段。

本文如下提供胞质形式的拟南芥PPDK的多肽序列作为SEQID No：23：

MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKK

LPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVV

VGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLK

ELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVN

IQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDL

DTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAV

DMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTA

EEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGC

SEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAI

RRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAV

RKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNI

VHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQD

QGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIAD

EIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKM

ATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA

SEQ ID No：23

本文如下提供叶绿体形式的拟南芥PPDK的多肽序列作为SEQ ID No：24：

MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTG

LHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLS

VPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGA

AISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKL

ERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDS

PRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQ

VWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEER

LWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREK

VVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARG

GMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQ

ALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQ

MFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPV

TIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGIS

YPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKG

HTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKG

ILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVS

CSPFRVPIARLAAAQVVVA

SEQ ID No：24

因此，具有PPDK活性的多肽可包含基本上如SEQ ID No：23或SEQ ID No.24所示的氨基酸序列或者其功能变体或片段。因为几乎唯一地在包含编码PPDK的基因组DNA的细胞系中，观察到最大的PPDK丰度，因此似乎内含子可能对PPDK表达具有积极作用。因此，在一个实施方案中，构建体可包含编码PPDK和/或PCK的基因的cDNA。

本发明的遗传构建体可呈表达盒的形式，其可适用于在宿主细胞中表达至少一个编码序列。本发明的遗传构建体无需整合到载体中便可导入宿主细胞。例如，可将可以是核酸分子的遗传构建体掺入脂质体或病毒颗粒内。或者，可通过合适的方法(例如直接胞吞摄取)将纯化的核酸分子(例如不含组蛋白的DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballistic bombardment)，将遗传构建体直接导入宿主受试者(例如植物)的细胞。或者，可使用基因枪将本发明的遗传构建体直接导入宿主细胞中。或者，可将遗传构建体包含在用于在合适的宿主细胞中表达的重组载体内。

因此，在第三个方面，提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体的重组载体。

重组载体可以是质粒、黏粒或噬菌体。这类重组载体高度可用于用本发明的遗传构建体转化宿主细胞和复制其中的表达盒，。技术人员应了解的是，本发明的遗传构建体可与的许多类型的骨架载体组合用于表达目的。骨架载体可以是二元载体(binary vector)，例如可在大肠杆菌(E.coli)和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)两者中复制的二元载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，例如pBIN19。然而，优选的骨架载体以pBINPLUS为基础(F.A.van Engelen等，Transgenic Research(1995)4，288-290)且具有SAG12启动子的BNP1380000001。

除启动子(例如衰老相关启动子)以外，重组载体还可包括多种其它功能元件和至少一个编码序列(编码PCK和/或PPDK)。例如，可设计重组载体，使得载体在宿主细胞的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下，在重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可设计重组载体，使得重组载体整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想有利于目标整合(例如通过同源重组)的DNA序列。

重组载体还可包含编码在克隆方法中可用作选择标记的基因的DNA，即能够选出已被转染或转化的细胞，并且能够选出包含整合异源DNA的载体的细胞。载体还可包含参与调节编码序列的表达或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞某一组成部分(例如叶绿体)的DNA。因此，第三个方面的载体可包含至少一个选自以下的其它元件：选择标记基因(例如抗生素抗性基因)、多肽终止信号和蛋白质靶向序列(例如叶绿体转运肽)。

合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因，例如赋予卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II、hyg-B)抗性的基因；除草剂抗性基因，例如赋予草丁膦和磺胺类除草剂抗性的基因(分别为bar和suI；EP-A-242246、EP-A-0249637)；以及筛选标记，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GB2197653)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记基因可受第二启动子(其可以不是衰老相关启动子)控制，所述第二启动子允许在细胞(其可在种子中或不在种子中)中表达，从而允许在植物发育的任何阶段选出含有标记的细胞或组织。合适的第二启动子是土壤杆菌属(Agrobacterium)的胭脂氨酸合成酶基因的启动子和来源于编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以采用任何其它合适的第二启动子。

可采用图1中描述的克隆方法，制备本发明的遗传构建体的各个实施方案，可将该方法概括如下。可使用合适的引物，通过PCR从基因组或cDNA模板扩增编码PCK和PPDK的基因的基因组形式和cDNA形式。可采用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。然后，可将PCR产物与合适的载体连接用于克隆目的，例如pCR4 Blunt-TOPO载体(Invitrogen)。可使包含PCR产物的载体在合适的宿主(例如大肠杆菌)中生长。然后使用合适的引物通过PCR筛选大肠杆菌菌落，并用合适的引物对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片段进行测序。

可培养携带TOPO-cDNA(PCK或PPDK)或TOPO-gDNA(PCK或PPDK)的大肠杆菌菌落以产生适量的各种质粒，然后可对质粒进行纯化。随后可消化质粒释放编码PPDK或PCK的DNA片段，然后可将该片段克隆至包含合适启动子(例如SAG启动子)的载体，例如pBNP质粒。所得PPDK构建体称为BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA，所得PCK构建体称为pALBNP1(cDNA)和pALBNP2(gDNA)。

第三个方面的载体的实施方案基本上可如图3所示。

在第四个方面，提供提高试验植物叶中的PCK和/或PPDK浓度至高于培养在相同条件下的野生型植物中相应的PCK和/或PPDK浓度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

在第五个方面，提供降低试验植物叶中的氮浓度至低于培养在相同条件下的野生型植物中相应的氮浓度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

在第六个方面，提供与培养在相同条件下的野生型植物相应的生长速度相比提高试验植物的生长速度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

实施例中给出了测定植物叶中的氮水平和植物生长速度的方法。第四个方面、第五个方面或第六个方面的方法可包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个方面的载体转化试验植物细胞。可通过任何合适的方法将遗传构建体或载体导入宿主细胞。

在第七个方面，提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个方面的重组载体的细胞。

细胞可以是植物细胞。因为本发明人已观察到，PCK和/或PPDK两者在宿主细胞中过表达在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出乎意料地有效，所以第七个方面的细胞可包含一个或多个第一个方面或第二个方面的构建体或者一个或多个第三个方面的载体，使得PCK和/或PPDK两者均过表达。

例如，宿主细胞可只用第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案(即PCK构建体)转化。或者，宿主细胞可只用第二个方面的遗传构建体的第二个实施方案(即PPDK构建体)转化。在另一个实施方案中，宿主细胞可用第一个方面的遗传构建体的第一和第二个实施方案转化，使得PCK和PPDK两者在宿主细胞中表达。或者，宿主细胞可用第一个方面的构建体的第三或第四个实施方案(即PCK/PPDK构建体1或2)转化，使得PCK和PPDK两者在宿主细胞中表达。还设想宿主细胞可用第二个方面的编码PCK和PPDK两者的构建体转化。

细胞可采用已知技术用本发明的遗传构建体或载体转化。用于将遗传构建体导入宿主细胞的合适方法可包括通过本领域已知方法(例如EP-A-0116718和EP-A-0270822所述方法)，利用土壤杆菌属所携带的卸甲Ti-质粒载体。另一种方法可以是转化植物原生质体，这涉及先除去细胞壁并导入核酸，然后重整细胞壁。随后可使转化细胞生长成植物。

第八个方面，提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体的转基因植物。

第八个方面的转基因植物可包括十字花科(Brassicaceae)，例如芸苔属(Brassica spp.)。植物可以是欧洲油菜(油料种子油菜)。

第八个方面的转基因植物的其它实例包括禾本科(Poales)，例如Triticeae spp。植物可以是小麦属(Triticum spp.)(小麦)。提高小麦的籽粒蛋白含量可导致包含小麦的食品(例如面包)的体积增加。

第八个方面的合适转基因植物的其它实例包括茄科(Solanaceae)植物，其包括例如曼陀罗、茄子、茄参(mandrake)、颠茄(deadly nightshade、belladonna)、辣椒(capsicum、paprika、chillipepper)、马铃薯和烟草。合适的茄科属的一个实例是烟草属(Nicotiana)。烟草属合适的品种可称为烟草植物，简称烟草。用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物的各种方法是已知的，均可用于本发明。

例如，可如下转化烟草。采用基本上按Horsch等(Science 227：1229-1231，1985)所述的叶盘共培养方法转化烟草(Nicotianatabacum)。可从7周大的烟草植物采摘最幼嫩的两片扩展叶，可在8％Domestos^TM中进行表面灭菌10分钟后，用无菌蒸馏水洗涤6次。可用6号木塞钻孔器切取叶盘，并放于含有合适二元载体(按照本发明)的土壤杆菌悬液中约2分钟。可在两张无菌滤纸间将叶盘轻轻吸干。可将10个叶盘放在LS 3％蔗糖+2μM BAP+0.2μMNAA平板上，然而将其在生长室中培育2天。可将叶盘转移到补充了500g/l凯福隆和100g/l卡那霉素的LS+3％蔗糖+2μM BAP+0.2μM NAA的平板中。2周后，可将叶盘转移到上述培养基的新平板上。再过2周后，可将叶盘转移到含有补充了500mg/l凯福隆和100mg/l卡那霉素的LS+3％蔗糖+0.5μM BAP的平板上。每两周可将叶盘转移到新鲜培养基中。在芽出现时，可切下芽，并将芽转移到补充了500mg/l凯福隆的LS+3％蔗糖的广口瓶中。大约4周后，可将广口瓶中的芽转移到LS+3％蔗糖+250mg/l凯福隆中。再过3-4周后，可将植物转移到LS+3％蔗糖(无抗生素)，并生根。一旦植物生根，便将其转移到温室的土壤中。

在第九个方面，提供获自第八个方面的转基因植物的植物繁殖产品(plant propagation product)。

“植物繁殖产品”可以是取自植物中的任何植物物质，自其可产生其它植物。植物繁殖产品可适宜为种子。

在本发明的第十个方面，提供产生转基因植物的方法，所述转基因植物以比培养在相同条件下的相应野生型植物高的速度再动员氮素，所述方法包括以下步骤：

i)用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细胞；和

ii)从转化细胞再生植物。

在第十一个方面，提供产生具有比培养在相同条件下的相应野生型植物快的生长速度的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细胞；和

ii)从转化细胞再生植物。

优选且有利的是，本发明的方法不会损害所产生的试验植物的健康或适应性。优选所述方法包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化试验植物，优选植物叶。本发明人观察到，在宿主细胞中过表达PCK和PPDK两者有效诱导在衰老叶中的氮素再动员。因此，优选的是，第十个方面和第十一个方面的方法包括用本发明的一个或多个构建体转化试验植物使得PCK和PPDK两者过表达。例如，试验植物可用本发明第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案(即PCK构建体)转化，并再用第一个方面的构建体的第二个实施方案(即PPDK构建体)转化。因此，这两个构建体的转化导致两种酶的过表达。或者，试验植物可用本发明第一个方面的构建体的第三或第四个实施方案转化，每个所述构建体都编码PCK和PPDK。或者，试验植物可用本发明第二个方面的构建体转化，其既编码PCK又编码PPDK。

本发明人观察到，已用编码PCK和PPDK两者的构建体转化的试验植物的植物叶显示在开始衰老时氮素再动员增加，使得该叶中的氮浓度下降。此外，本发明人观察到营养生长速度增加。虽然本发明人不受假说束缚，但是本发明人认为叶中氮浓度的降低可诱导生长速度提高，从而诱导作物产量提高。

在本发明的第十二个方面，提供与采自培养在相同条件下的野生型植物的收获叶中相应的氮水平相比含有较低氮水平的收获叶，其中所述叶自第八个方面的转基因植物收获，或者由第十个方面或第十一个方面的方法产生。

在本发明的第十三个方面，提供包含获自突变体烟草植物的氮降低的烟草的吸烟制品，所述突变体能够降低衰老叶中的氮浓度。

氮降低的烟草可包括其中氮浓度小于培养在相同条件下的野生型植物中的相应浓度的烟草。这类吸烟制品可包含获自突变型烟草植物的烟草，所述烟草植物可用本发明第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化。

本文使用的术语“吸烟制品”可包括可点燃抽吸的产品，例如不论是以烟草、烟草衍生物、膨胀烟丝、再造烟叶为基料还是以烟叶代用品为基料的卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，以及加热无燃烧产品。

应理解的是，本发明提供基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸序列或核酸序列(包括其功能变体或功能片段)的任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物。术语“基本上的氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”，可以是与本文提及的任一个序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列有至少40％序列同一性的序列，例如与SEQ IDNo.17规定的基因(其编码PCK酶的一个实施方案)有40％同一性，或与SEQ ID No.19规定的多肽(即PCK酶的一个实施方案)有40％同一性，或与SEQ ID No.21规定的基因(其编码PPDK酶的一个实施方案)有40％同一性，或与SEQ ID No.23规定的多肽(即PPDK酶的一个实施方案)有40％同一性。

还设想了与所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列：大于65％、更优选大于70％、甚至更优选大于75％、还更优选大于80％的序列同一性。优选氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的任何序列有至少85％同一性，更优选与本文提及的任何序列有至少90％同一性、甚至更优选至少92％同一性、甚至更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97％同一性、甚至更优选至少98％同一性和最优选至少99％同一性。

技术人员应了解如何计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列间的百分比同一性，首先必须准备好2个序列的比对，接着计算序列同一性值。2个序列的百分比同一性可根据以下方面采用不同的值：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同的程序中执行)，或来自3D比较的结构比对；和(ii)比对方法所采用的参数，例如局部与整体比对、所采用配对计分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如功能型和常数。

如果完成了比对，则有许多不同的计算2个序列之间的百分比同一性的方法。例如，可将相同的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)突出端以外的等同位置的数目。此外，应理解的是，百分比同一性还是强烈地长度依赖性的。因此，序列对越短，可预期偶尔发生的序列同一性越高。

因此，应理解的是，蛋白质或DNA序列的准确比对是一个复杂过程。常用的多重比对程序ClustalW(Thompson等，1994，NucleicAcids Research，22，4673-4680；Thompson等，1997，Nucleic AcidsResearch，24，4876-4882)是用于产生本发明蛋白质或DNA的多重比对的优选方法。ClustalW的合适参数可为如下：对于DNA比对：空位开发罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开发罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，GAPDIST＝4。本领域技术人员应清楚，对于最佳序列比对可能需要改变这些参数和其它参数。

优选然后按(N/T)*100由这类比对计算出2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性计算值，其中N为序列具有相同残基的位置的数目，T为所比较的包括空位但不包括突出端的位置总数。因此，用于计算2个序列之间的百分比同一性的最优选的方法包括(i)应用ClustalW程序，采用一组合适参数(例如上述参数)准备序列比对；和(ii)将N值和T值代入下列公式：序列同一性＝(N/T)*100。

用于鉴定类似序列的备选方法为本领域技术人员所知。例如，基本相似的核苷酸序列可由与SEQ ID Nos.16、17、18、20、21、22所示序列或其互补序列在严格条件下杂交的序列编码。所谓严格条件，意指核苷酸在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃与滤器结合的DNA或RNA杂交，接着在0.2x SSC/0.1％SDS中于约20-65℃洗涤至少一次。或者，基本相似的多肽可因至少1个但少于5、10、20、50或100个氨基酸而不同于SEQ ID Nos.19、23或24所示序列。

由于遗传密码的简并性所致，显然，任何核酸序列可在基本上不影响由其编码的蛋白质的序列的情况下被改变或变动，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是以下核苷酸变体，其具有通过编码相同氨基酸的不同密码子在序列内的取代从而产生沉默改变(silent change)而改变的序列。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过不同密码子的取代而改变的全部或部分序列的变体，所述密码子编码与其取代的氨基酸具有类似生物物理学性质的侧链的氨基酸以产生保守改变。例如小的非极性疏水氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应理解的是，氨基酸可被具有相似生物物理学性质的氨基酸置换，技术人员已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。

本文所述的全部特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或所公开的任何方法或过程的全部步骤都可以任何组合与任何上述方面组合，其中这些特征和/或步骤的至少一些是互为排斥的组合除外。

为了更好地理解本发明，并显示可如何实施本发明的实施方案，现参照附图举例说明，其中：

图1表示用于克隆遗传构建体BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA的方案，其中：(a)拟南芥PPDK胞质同工型的cDNA和基因组DNA形式的PCR扩增；(b)插入克隆载体pCR 4Blunt-TOPO；(c)用AvrII和BamHI限制性内切核酸酶消化克隆载体(左侧)以释放PPDK，以及含有靶标SAG12的载体pBNP(右侧)；(d)将PPDK与pBNP连接，琼脂糖凝胶显示通过用AvrII和BamHI对构建体的限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段；和(e)通过土壤杆菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型Columbia 0中；

图2a表示用于构建本发明表达载体的质粒pCR4BLUNT-TOPO，图2b是利用AvrII和BamHI消化将编码PPDK的cDNA或gDNA插入pCR4BLUNT-TOPO的一览表；

图3a表示含有SAG12启动子的质粒pBNP，图3b是利用AvrII和BamHI消化将PPDK插入片段(cDNA或gDNA)导入pBNP中，以及利用XbaI和SacI消化将PCK插入片段(cDNA或gDNA)导入pBNP产生本发明实施方案的载体的一览表；

图4表示通过蛋白质印迹选择转基因SAG12-PPDK鼠耳芥细胞系。上图表示SAG12-PPDK cDNA细胞系，下图表示SAG12-PPDKgDNA细胞系；

图5表示从第五周起野生型、ΔPPDK和5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系的PPDK丰度的定量测定；

图6表示在(b)K326和(c)Burley 21烟草品系中对SAG12-PPDK(cDNA和gDNA)的选择；

图7表示在K326烟草成熟叶中PPDK的过表达；

图8表示鼠耳芥的不同细胞系即野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA随时间而变化的莲座叶丛照片；

图9表示第9周的拟南芥繁殖组织质量；

图10表示自播种后第3周到第9周野生型和SAG12-PPDgDNA植物总的植物鲜质量(即莲座叶丛加繁殖组织)；

图11第7周时野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA植物叶中的氮含量；

图12表示野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDK植物单粒种子的氮含量；

图13表示野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA拟南芥细胞系叶中的总游离氨基酸含量；

图14表示不同烟草细胞系的种子质量，零拷贝＝野生型，G4(gDNA)、G10、G8和C10(cDNA)是SAG12-PPDK品系；

图15表示不同烟草细胞系的种子氮含量，零拷贝＝野生型，G4(gDNA)、G10、G8和C10(cDNA)是SAG12-PPDK品系；

图16为PCK/PPDK双重插入片段的蛋白质印迹结果。所有品系都显示与SAG12启动子活性相关的较高水平的PCK，尤其在第7周；

图17表示与对照7相比，转化植物中PCK和PPDK两者的表达导致莲座叶丛质量增加；和

图18表示假设的生化途径，表明了可通过转运氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的PCK-和PPDK-依赖性形成产生氮素再动员。

实施例

实施例1-SAG12启动子拟南芥PPDK植物转化构建体的产生

如图3所示，制备一系列的SAG12PPDK和PCK表达载体，然后分析其在转化植物中提高表达PPDK和PCK的能力。在一个实施方案中，构建体可编码PCK或者其功能变体或片段，而不编码PPDK。在另一个实施方案中，构建体可编码PPDK或者其功能变体或片段，而不编码PCK。然而，在又一个实施方案中，构建体可编码PCK或者其功能变体或片段以及PPDK或者其功能变体或片段。首先，如下所述分离鼠耳芥PPDK基因的基因组DNA。

基因组DNA的分离

按照推荐的方案，使用DNeasy植物微型试剂盒(DNeasy PlantMini Kit)(Qiagen)从叶中提取鼠耳芥生态型Columbia 0的基因组DNA(gDNA)。使用表1概括的引物序列，将基因组DNA用作下述PCR反应的模板。

表1：引物序列

引物	序列	SEQ ID No.
			AtCytFWD-AvrII	AAT CCT AGG ATG ATG CAG CGA GTA TTC ACC	1
AtCytREV-BamHI	AAT GGA TCC TCA TGC AAC AAC TAC TTG AGC AGC	2
			AtPPDKexon15FWD	CCT CGC CAA AGG AAT CTT AC	7
AtPPDKSeqF1	CTT GGC TTG AAC GAC CAA GTC	3
			AtPPDKSeqF2	GGT TGC AGG GAT AGG AAC ACC	4
AtPPDKSeqR1	CGT CTG ATT GCA TCA GCC CAG	5
			AtPPDKSeqR2	CCT GAG GAG TTC CTA CAA GTG	6
BNP-1271F	TGC CTG CTT GCC GAA TAT C	10
			BNP-1291TV	CAG AAA AGC GGC CAT TTT CCA CCA	12
BNP-1334R	CCG GCC CAC AGT CGA TGA	11
			BNP-nostREV	CAA GAC CGG CAA CAG GAT TCA	8
BNP-SAG12FWD	ACC CCA TCT CAG TAC CCT TCT G	9
			NtCyc-184F	CTC AAC CTT CCA CCG TGT GAT	13
NtCyc-267T	TCT ACG GTG CCA AAT TCG CCG A	15
			NtCyc-316R	ACC GGT GTG CTT CCT CTT GAA	14
AtPCK-XbaI-FOR	ATTTCTAGAATGTCGGCCGGTAACGGAAATG	25
			AtPCK-SacI-REV	ATTGAGCTCCTAAAAGATAGGACCAGCAGCG	26

RNA的分离和cDNA的合成

由7天大的拟南芥子叶提取总RNA。使用不含RNA酶的装置在冰浴上进行RNA提取，用焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma-Aldrich)处理的水制备溶液。每1升水加入1ml DEPC，在通风橱中将混合物搅拌过夜，然后高压灭菌。使用TriPure分离试剂(TriPure Isolation Reagent)(Roche)提取RNA。将200mg组织在液氮用研钵和研杵研磨，加入1mlTriPure分离试剂，并按照所推荐的方案进行。将RNA沉淀重新悬浮于预加热至60℃达10分钟的20μl RNA Secure(Ambion)中。在4℃下将样品以13,000rpm离心5分钟，将上清液转移到干净的1.5ml微量离心管中以除去污染的碎片。

利用Eppendorf Biophotometer分光光度计，通过在260和280nm下读取读数，用分光光度法测定RNA的量和纯度(Maniatis等，1982，Molecular cloning：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory)。还使用1.5％(w/v)琼脂糖(Melford Laboratories)于0.5x TBE中，利用琼脂糖凝胶电泳对RNA进行检查。将样品悬浮于1x RNA样品缓冲液中，使用0.5x TBE作为运行缓冲液，在80V下进行电泳。4x工作浓度的RNA样品缓冲液包含0.002％(w/v)溴化乙锭(Sigma-Aldrich)、含有180mM Tris-HCl、180mM硼酸和8mM EDTA(pH 8.3)的2x TBE(2x Tris-硼酸-EDTA缓冲液(2x TBE)、13％菲可400(Ficoll 400)(Sigma-Aldrich)、0.01％溴酚蓝和7M脲(Ficher Scientific)。

使用2μg RNA、1μg寡聚dT(15)引物(Roche)、1x莫洛尼鼠白血病毒(MMLV)缓冲液(Promega)、0.4mM dNTPs(Bioline)、40单位重组RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega)、200单位MMLV反转录酶(Promega)和不含核酸酶的水至25μl的最终体积，来进行RNA反转录以合成cDNA。将样品在42℃下温育1小时。

拟南芥PPDK的扩增

使用表1所示的含有AvrII限制位点的正向引物(AtCytFWD-AvrII，SEQ ID No.1)和含有BamHI限制位点的反向引物(AtCytREV-BamHI，SEQ ID No.2)，通过PCR由基因组或cDNA模板扩增编码PPDK的胞质同工型的基因的基因组形式和cDNA形式。PCR反应混合物包含1x HF缓冲液(NEB)、2mM氯化镁(MgCl₂，NEB)、0.5mM dNTPs(Bioline)、100ng模板(cDNA或基因组DNA)、0.5μM各引物和1单位Phusion高保真DNA聚合酶(PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase)(NEB)。使用Techne热循环仪(TechneThermal Cycler)，以98℃30秒钟的起始变性步骤，接着98℃10秒钟、55℃30秒钟和72℃2分钟的30个循环以及72℃5分钟的最终延伸步骤，进行热循环。

一旦分离/制成拟南芥PPDK的cDNA和gDNA，便采用图1概述的方案，将其用来产生各种构建体。将拟南芥PPDK的胞质同工型的cDNA和基因组DNA形式与pBNP载体中的衰老诱导型SAG12启动子融合，从而在衰老期间过表达PPDK。

(a)使用含有AvrII和BamHI限制位点的引物，对拟南芥PPDK的胞质同工型的cDNA和基因组DNA形式进行PCR扩增，分别产生2.4和4.3kb产物。

(b)插入克隆载体pCR 4Blunt-TOPO中。对PPDK插入片段进行整体测序，发现与预期序列相同。

(c)用AvrII和BamHI对克隆载体和目标载体pBNP进行限制性内切核酸酶消化。

(d)与BNP连接，琼脂糖凝胶显示通过用AvrII和BamHI对构建体的限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段。预期cDNA构建体的条带大小为14.8kb和2.4kb，gDNA构建体的为14.8kb和4.4kb。

(e)通过土壤杆菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型Columbia 0中。跨连接位点对构建体进行测序。编码新霉素磷酸转移酶的基因nptII赋予植物卡那霉素抗性。LB和RB：分别为T-DNA的左缘和右缘；nos Pro：胭脂氨酸合成酶启动子；nos t：胭脂氨酸合成酶终止子；SAG12Pro：拟南芥SAG12基因的启动子。

下面将参照图1详细描述构建体的产生：

克隆至pCR4 Blunt-TOPO载体

使用1％(w/v)琼脂糖、0.5μg ml^-1溴化乙锭(Sigma-Aldrich)在0.5xTBE中，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检查。将样品悬浮于1xDNA样品缓冲液(6x工作浓度的DNA样品缓冲液，包含50mM Tris(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，Melford Laboratories)、60％甘油和0.25％(w/v)溴酚蓝(Sigma-Aldrich)，使用0.5x TBE作为运行缓冲液，在80V下进行电泳。

按照推荐的方案，使用QIAQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)，对2.6kb的PPDK cDNA条带和4.4kb的PPDK基因组DNA条带进行了纯化，并使用30μl分子生物级水(BDH Laboratory Supplies)洗脱。按照推荐的方案，使PCR产物连接(平端)至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中。按照推荐的方法，将克隆反应物(2μl)转化至50μl亚克隆效率DH5a大肠杆菌(sub-cloning efficiency DH5a E.coli)(Invitrogen)。在包含10g l^-1细菌用胰蛋白胨(BD)、5g l^-1细菌用酵母提取物(Oxoid)和85mM氯化钠(Fisher Scientific)的Luria-Bertani(LB)琼脂(Luria Bertani培养液(LB培养液)中使转化的大肠杆菌细胞于37℃生长过夜。在高压灭菌前用10M氢氧化钠调节pH至7.0。通过将1.5％(w/v)琼脂(BD)加入含有50μg ml^-1卡那霉素(Melford Laboratories)的LB培养液中来制备LB琼脂。

使用1x NH₄缓冲液(Bioline)、2.5mM MgCl₂(Bioline)、0.5mMdNTPs(Bioline)、0.3μM各引物(AtCytFWD-AvrII和AtCytREV-BamHI)即SEQ ID No 1和2以及0.5单位BioTaq NA聚合酶(Bioline)，通过PCR筛选大肠杆菌菌落。以95℃5分钟的起始变性步骤，接着95℃30秒钟、55℃30秒钟和72℃4分30秒的30个循环以及72℃5分钟的最终延伸步骤，进行了热循环。如上所述使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，对PCR产物进行了检查。在37℃的振荡培养箱中，使含有所需插入片段的菌落在5ml含有50μg ml^-1卡那霉素的LB培养液中生长过夜。按照推荐的方案，使用QIAPrep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。DNA用含10单位BamHI(NEB1)的1x BamHI缓冲液于37℃消化1小时。如上所述使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳对消化物进行了检查。使用表1所示引物AtCytFWD-AvrII(SEQ ID No.1)、AtPPDKSeqF1(SEQ ID No.3)、AtPPDKSeqF2(SEQ ID No.4)、AtPPDKSeqR1(SEQ ID No.5)、AtPPDKSeqR2(SEQ ID No.6)和AtCytREV-BamHI(SEQ ID No.2)，应用3730DNA分析仪(AppliedBiosystems)，对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片段进行了测序。用BioEdit(Ibis Biosciences)对序列进行了分析。

这些构建体称为TOPO-PPDKcDNA和TOPO-PPDKgDNA，如图2a和图2b所示。

pBNP构建体的的克隆

将PPDK连接至衰老诱导型启动子SAG12控制下的BNP1380000001二元载体中。含有SAG12的骨架质粒BNP1380000001基于pBINPLUS(F.A.van Engelen等，Transgenic Research(1995)4，288-290)，如图3a所示。首先，使用携带TOPO-cDNA或TOPO-gDNA的大肠杆菌菌落接种25ml含有50μg ml^-1卡那霉素的LB培养液。将这些培养物在振荡的37℃培养箱中温育过夜，按照推荐的方案，使用质粒Midi试剂盒(Plasmid Midi Kit)(Qiagen)提取质粒DNA。使用质粒Midi试剂盒，从100ml含有50μg ml^-1卡那霉素的培养物中纯化出pBNP1380000001载体。

然后，通过限制性内切酶AvrII和BamHI对这些质粒进行消化。将消化反应物于37℃温育过夜，消化反应物包含2μg DNA(BNP)或4μg DNA(TOPO-PPDKcDNA和TOPO-PPDKgDNA)、1x缓冲液2、10单位AvrII和10单位BamHI。使用结晶紫样品缓冲液(250μM结晶紫(Hopkin and Williams)和30％(w/v)蔗糖(Fisher Scientific))，并将含有25μM结晶紫的0.5x TBE用作运行缓冲液，使用0.8％(w/v)琼脂糖、0.5x TBE和25μM结晶紫(Hopkin and Williams)在50V下进行电泳约2小时，通过结晶紫琼脂糖凝胶电泳对样品进行分离(Rand，1996，在凝胶电泳期间，结晶紫可用来观察DNA条带，并改进克隆效率。Elsevier Trends Journals Technical Tips Online)。将按照推荐的方案采用QIAQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)的凝胶条带提取法，用来提取14.4kb BNP、2.6kb PPDK cDNA和4.4kb PPDK基因组DNA片段。利用使用溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，检查片段，并确定相对于HyperLadder I(Bioline)的量。

由于基因组DNA片段(4.4kb)和TOPO骨架(3.9kb)的大小相似，因此对凝胶提取的基因组DNA片段进行磷酸酶处理以防止与任何污染的TOPO骨架连接。将虾碱性磷酸酶(SAP，1单位，Roche)加入含1μg凝胶提取的基因组DNA片段的1x去磷酸化缓冲液(Roche)中，将反应物于37℃温育30分钟，然后于65℃灭活10分钟。使用10∶1摩尔比的cDNA或基因组DNA片段与消化的BNP、1x连接缓冲液(NEB)和1单位T4DNA连接酶(NEB)进行连接反应。按照推荐的方案，将连接反应物于16℃温育过夜，将2μl用来转化文库效率的DH5_E.coli(library-efficiency DH5_E.coli)(Invitrogen)。

将转化的大肠杆菌转移到含有50μg ml^-1卡那霉素的LB琼脂中，并于37℃温育过夜。使用1x NH₄缓冲液、2.5mM MgCl₂、0.5mMdNTPs、0.3μM的表1所示的各引物(AtPPDKexon15FWD(SEQ ID No.7)和BNPnostREV(SEQ ID No.8)和0.5单位BioTaq DNA聚合酶，通过PCR筛选大肠杆菌菌落。以95℃5分钟的起始变性步骤，接着95℃30秒钟、55℃30秒钟和72℃3分钟的30个循环以及72℃5分钟的最终延伸步骤，进行了热循环。如上应用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检查。在37℃振荡培养箱中，使含有所需插入片段的菌落在5ml含有50μg ml^-1卡那霉素的LB培养液中生长过夜。按照推荐的方案，使用QIAPrep Spin Miniprep试剂盒提取质粒DNA。将DNA用含10单位BamHI和10单位StuI的1x BamHI缓冲液于37℃消化1小时后，如上所述进行了1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。选出具有正确限制性内切酶消化谱的分别由cDNA和基因组DNA连接产生的一个菌落，并使用上述表1所示引物BNP-SAG12FWD(SEQ ID No.9)进行了测序。

这些构建体称为BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA，如图3a和图3b所示。

实施例2-鼠耳芥用BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA进行转化

使用下列质粒通过电穿孔转化根癌土壤杆菌菌株GV3101-R：图3所示BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA，实施例1中描述了所述质粒的制备。

从含有25mg l^-1利福平(Sigma-Aldrich)的LB培养液的培养物中制备电转感受态(Electrocompetent)土壤杆菌属，所述培养物生长在30℃下，且采用Eppendorf Biophotometer分光光度计在600nm下测定的光密度为0.4-0.6。将500ml的培养物以4000g离心15分钟，弃去上清液后，将细胞重新悬浮于500ml冷的10％甘油(Fisher Scientific)中。使用250ml甘油，接着10ml甘油和最终2ml甘油重复离心和重新悬浮。将细胞等分成50μl等分样品，在液氮中速冻，并保存在-80℃下。使用BioRad Gene Pulser进行电穿孔。将质粒DNA(200ng)加入预先冷却的电穿孔小槽(Gene Pulser Cuvette，BioRad)中的50μl上述土壤杆菌细胞中，将细胞在冰浴上温育5分钟。采用脉冲2.5mV、阻抗400ohm和电容25μF以及1ml SOC(Super Optimal Broth，Catabolite Repression包含20g/l细菌用胰蛋白胨、5g/l细菌用酵母提取物、85mM氯化钠和250mM氯化钾)，对该小槽进行电穿孔。用10M氢氧化钠调节至pH 7.0后高压灭菌。用前加入无菌氯化镁到10mM的终浓度，并加入无菌葡萄糖(Fisher Scientific)至20mM的终浓度。将细胞在振荡培养箱中于30℃温育2小时后，转移到含有50μgml^-1卡那霉素和50μg ml^-1利福平的LB琼脂中。

在30℃下温育2天后，通过PCR，然后通过限制性内切酶消化来筛选菌落。将PCR筛选呈阳性且具有预期的限制酶切消化谱的菌落接种到5ml含有50μl ml^-1卡那霉素和50μl ml^-1利福平的LB培养液中，并在振荡培养箱中于30℃温育过夜。次日，将600μl该培养物用来接种到500ml上述LB培养液，在振荡培养箱中于30℃温育30小时后用于花序浸渍(floral dipping)。

将4周大的拟南芥植物用于花序浸渍。将所有构建体转化成野生型生态型Columbia 0。将上述制备的土壤杆菌培养物在4℃下以5,000g离心15分钟，将细胞沉淀重新悬浮于250ml无菌5％蔗糖(FisherScientific)溶液(w/v)和0.05％Silwett L-77(OSi Specialties)中。轻轻搅动同时，将植物浸入细胞悬液约10秒钟，然后盖上薄膜(clingfilm)，避开直射光24小时。在此之后，使植物恢复到正常生长方案，收获种子。

转基因鼠耳芥的选择

按照Harrison等人((2006)，Plant Methods，2，19)的方法，在50μgml^-1卡那霉素(Dufecha Biochemie)中选出转化植物的种子。使具有抗生素抗性的T1植物生长至结籽并自花授粉。如上所述选出种子，并选出具有3∶1抗性∶非抗性比的T2品系作为携带单一拷贝的转基因。再次使这些植物自花授粉，并如上选择。选出产生100％抗性子代(T3)的T2品系作为纯合品系，并用于所有实验。应用孟德尔遗传学原理选出对于转基因而言是纯合的并包含单一转基因拷贝的T2代植物。对于用SAG12-PPDKcDNA和SAG12-PPDKgDNA转化的植物，各选出5个独立的单一插入片段纯合品系。

实施例3-用BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA转化烟草。

使用质粒BNP、BNP-PPDKcDNA和BNPPPDKgDNA，如实施例2所述通过电穿孔转化电转感受态根癌土壤杆菌菌株LBA4404。电穿孔后，将1ml LB培养液加入经电穿孔的细胞中，然后将其在振荡培养箱中于28℃温育2小时后，转移到含有50μg ml^-1卡那霉素和100μgml^-1大观霉素(Sigma-Aldrich)的LB琼脂中。在28℃下温育2天后，将一个菌落用来接种50ml含有50μg ml^-1卡那霉素和100μg ml^-1大观霉素的LB培养液。将该培养物在振荡培养箱中于28℃温育3天。通过限制性内切酶消化，提取质粒DNA并进行分析，将50μl培养物用于接种50ml含有50μg ml^-1卡那霉素和100μg ml^-1大观霉素的LB培养液中。将该培养物在振荡培养箱中于28℃温育过夜。

将烟草栽培品种Burley 21和K326自种子生长，从8周大的植物上切取最幼嫩的叶，在8％(v/v)Domestos浓漂白液(Domestos thickbleach)(Domestos)中灭菌10分钟后，在无菌蒸馏水中漂洗。使用6号木塞钻孔器钻取叶盘，然后将叶盘放入25ml土壤杆菌培养物中2分钟。然后将叶盘面朝下放入含有2.2μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)和0.27μM a-萘乙酸(NAA)的MS培养基上。将这些培养基放入22℃生长室中2天。然后将叶盘转移到含有500μg ml^-1凯福隆(clarofan)(RousselLaboratories)(非共培育对照)或500μg ml^-1凯福隆和100μg ml^-1卡那霉素的上述选择性MS培养基中。每14天将叶盘转移到上述新鲜的选择性MS培养基中，持续6周。然后从叶盘上取出愈伤组织和芽块，并放入含有0.5μM BAP、500μg ml^-1凯福隆和100μg ml^-1卡那霉素的LS培养基上。2周后，将芽转移到装有含0.5μM BAP、500μg ml^-1凯福隆和无卡那霉素的LS培养基的150ml广口瓶中。

在随后的3周后，将优势芽转移到含有250μg ml^-1凯福隆和无BAP或卡那霉素的LS培养基上。再过3周后，通过将芽尖转移到无抗生素或BAP的LS培养基，来进一步清洗芽。当长出充足的根时，将植物转移到温室的土壤中。

转基因烟草的选择

采用定量PCR(Q-PCR)确定T0和T1植物的转基因拷贝数。可能的话，选择单一插入片段T0和纯合的T1植物用于分析。对转基因检测，使用表1所示的引物BNP-1271F(SEQ ID No.10)和BNP-1334R(SEQ ID No.11)，并使用退火至nptII转基因上的Vic/TAMARA标记的探针BNP1291TV(SEQ ID No.12)。对于内部定量，使用引物NtCyc-184F(SEQ ID No.13)和NtCyc-316R(SEQ ID No.14)，并使用退火至编码亲环蛋白的内源基因的FAM/TAMARA标记的探针NtCyc-267T(SEQ ID No.15)。通过比较Ct方法(Comparitive Ct method，ΔΔCt方法，Bubner和Baldwin(2004)，Plant Cell Reports，23，263-271)进行定量。反应混合物包含1x Universal Master Mix(ABI)、0.9μM各引物、0.2μM各探针(对于BNP和NtCyc引物和探针采用单独的反应)以及约500ng基因组DNA模板，其按照推荐的方案，使用DNeasy植物微型试剂盒(Qiagen)从叶组织提取。在7900HT快速实时PCR系统(7900HT Fast Real-Time PCR System，Applied Biosystems)中以95℃10分钟的起始变性步骤，接着95℃15秒钟和60℃1分钟的40个循环进行热循环。运用所提供的SDS2.2软件(Applied Biosystems)对数据进行分析。

在转化的T0代K326和Burley 21烟草的组织培养中再生后，应用定量PCR(Q-PCR)选择携带转基因单一拷贝的植物。选择单一插入片段植物以降低转基因沉默的可能性。使用与编码新霉素磷酸转移酶的nptII转基因互补的寡核苷酸进行Q-PCR。该基因存在于转移到构建体pBNP、BNP-PPDKcDNA和BNP-PPDKgDNA的植物基因组中的T-DNA的左缘和右缘之间。用pBNP转化的植物只用作空载体对照，以确保通过组织培养的再生在用空载体转化的植物和用含有PPDK编码序列的载体转化的植物之间是一致的。在再生和证实发生了成功转化的Q-PCR检查之后，弃去这些植物。

对于每个构建体(SAG12-PPDKcDNA和SAG12-PPDKgDNA)和各栽培品种(K326和Burley 21)，选择了6种植物。不可能只选出单一插入片段植物，因此如果无法获得6种单一插入片段植物时，则选出具有可能的最低拷贝数的植物。使这些植物自花授粉，并收获种子。

对于各种选出的T0植物，使14个子代生长，重复Q-PCR以选出纯合植物。纯合植物的使用应确保转基因在后代中的稳定性。对于各T0亲本，选出4个携带转基因的子代。然而，对于每个T0亲本不可能总是选出纯合子代。如果亲本拷贝数高于2，则选择具有较低拷贝数的植物以降低转基因沉默的可能性，而且还简化了T2代纯合子的选择(如有必要)。这样，对于各构建体和各栽培品种，选择具有低转基因拷贝数的得自5个独立品系的4个生物重复(biological replicate)(同胞)用于所有的其它实验。

实施例4-转化拟南芥植物中PPDK蛋白的检测和定量测定 蛋白质提取

在液氮下，使用微型研杵(micropestle)在1.5ml微量离心管中研磨拟南芥叶组织(100mg)，加入400μl提取缓冲液(磷酸钾缓冲液(加蛋白酶抑制剂混合物(PIC，Sigma))。按照推荐的方案，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂(Bio-Rad)，通过Bradford测定法测定蛋白质浓度(Jones等，1989，Journal of Chemical Ecology，15，979-992)。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

在含有10％(v/v)丙烯酰胺(37.5∶1丙烯酰基∶双丙烯酰基，SevernBiotech Ltd)、50％(v/v)免疫印迹分离缓冲液(参见2.10节)、0.05％(w/v)过二硫酸铵(APS，AnalaR)和0.05％(v/v)N，N，N’N’四甲基乙二胺(TEMED，Severn Biotech Ltd)的分离胶中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质。成层胶包含5％上述丙烯酰胺、50％(v/v)免疫印迹成层缓冲液、0.06％(w/v)APS和0.1％(v/v)TEMED。使用1x免疫印迹样品缓冲液(66mM Tris-HCl、10％(v/v)甘油、0.7mM SDS、0.7Mβ-巯基乙醇(BDH Laboratory Supplies)和0.05％(w/v)溴酚蓝和免疫印迹运行缓冲液(25mM Tris-HCl、0.29mM甘氨酸(Fisher Scientific)和3.5mM SDS，以70mA的电流对20μg提取的蛋白质进行电泳1小时30分钟。

同时运行一式两份胶。第一份用于免疫印迹分析(下文中予以描述)，第二份按照推荐的方案，用GelCode Blue Safe蛋白质染料(ThermoScientific)染色。使用凝胶干燥膜(Gel Drying Film)(Promega)将已染色的凝胶干燥。

免疫印迹分析

使用Protean Extra-Thick印迹纸(Blot Paper)(Bio-Rad)和免疫印迹转移缓冲液(48mM Tris-HCl、39mM甘氨酸、1.3mM SDS和20％(v/v)甲醇(Fisher Scientific))，在Semi-Dry Blotter(Bio-Ra d)上以15V达1小时将用于免疫印迹分析的凝胶中的蛋白质转印到Protan BA83硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell)上。在印迹证实蛋白质转印后，将丽春红染料(0.5％(w/v)丽春红S(Fluka)和1％(w/v)冰醋酸(FisherScientific))涂在膜上，然后将膜在蒸馏水中漂洗。

使用含1％(w/v)干脱脂奶粉(Marvel)和0.1％(v/v)聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20(TWEEN 20)，Sigma-Aldrich)的磷酸缓冲盐溶液(PBS：1.5mM正磷酸二氢钾(KH2PO4，AnalaR)、8.1mM正磷酸氢二钠、2.7mM氯化钾和137mM氯化钠)，每天新鲜配制用于PPDK免疫印迹分析的封闭缓冲液。使用盐酸调节至pH 7.4。在室温下，将膜在振荡器上在封闭缓冲液中温育1小时。使用1∶10,000稀释的兔抗PPDK抗体(Chris Chastain，Minnesota State University)进行初次杂交，接着在封闭缓冲液中洗涤3次各5分钟。使用1∶1000稀释的驴抗兔生物素化完整抗体(GE Healthcare)进行第二次杂交，接着如上洗涤3次。使用1∶1000稀释的链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(GE Healthcare)，进行第三次杂交，接着在含有0.1％(v/v)吐温20的PBS中洗涤3次各5分钟。

然后将膜在蒸馏水中漂洗3次。按照推荐的方案，使用WesternLightning化学发光试剂(Western Lightning Chemiluminescence Reagent)(Enhanced Luminol，Perkin Elmer)进行检测。

参照图4，图中显示通过蛋白质印迹选择转基因SAG12-PPDK拟南芥细胞系。从8周大的鼠耳芥野生型、ΔPPDK SAG12-PPDKcDNA和SAG12-PPDKgDNA植物的叶组织中提取蛋白质，并进行免疫印迹分析以选择表达较高水平PPDK的品系。重组玉米PPDK(30μg)用作阳性对照。在野生型或PPDK突变型植物(ΔPPDK)中未检测出PPDK。与SAG12-PPDKcDNA相比，SAG12-PPDKgDNA植物表达较高水平的PPDK。对5个SAG12-PPDKgDNA品系进行了全部的后续分析。

在野生型和ΔPPDK植物中无法检出PPDK，在一些SAG12-PPDKcDNA植物中可检出低水平的PPDK，而在所有SAG12-PPDKgDNA品系中均可检出PPDK。与野生型或SAG12-PPDKcDNA品系相比，在这3个品系中检测出高得多的PPDK量。因此，内含子的存在似乎对PPDK表达水平具有积极作用，选择SAG12-PPDKgDNA品系用于所有的其它实验。

对野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA植物进行了针对PPDK的免疫印迹，以测定SAG12-PPDKgDNA植物中PPDK蓄积的开始和程度。

参照图5，图中显示从第五周起野生型、ΔPPDK和5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系的PPDK丰度的定量测定。对于从第5周到第9周的每个时间点，将PPDK丰度计算为野生型的百分比。数据显示为这5个时间点的平均值。误差棒表示1SEM。将SAG12-PPDKgDNA品系按递增的PPDK丰度的顺序排列。应用ANOVA检验基因型间的差异(F＝4.775，df＝6，p＝0.001)。与野生型显著不同的品系是G12.3(p＝0.005)和G16.1(p＝0.004)。

从自播种后3周到9周以一周一次的间隔收获的叶组织中提取蛋白质。从第五周起在野生型植物中检出少量的PPDK，这证实了转录物中所观察到的增加导致蛋白质丰度的提高。在SAG12-PPDKgDNA植物中，在第5周还发现开始PPDK蓄积，但PPDK丰度高于野生型的PPDK丰度。在ΔPPDK植物中，在任何阶段都未检出PPDK蛋白。

还使允许定量测定叶蛋白质提取物中的PPDK的方法最优化。对不同量的重组玉米PPDK蛋白进行了SDS-PAGE和免疫印迹分析。应用AlphaEase成像软件计算出条带强度，并绘制标准曲线。应用SigmaPlot软件计算出回归线，该软件随后用于计算植物叶样品中的PPDK的量。由于免疫印迹检测水平可改变，因此对每个免疫印迹有必要包括至少3个标准品以供不同免疫印迹间的真实比较。用于定量测定不同提取物中的PPDK丰度的该项技术被用来选择和比较不同的转基因品系。

参照重组玉米PPDK蛋白的已知标准品，计算出每个时间点上各个品系至少4个生物重复的PPDK蛋白丰度。分析表明，从第五周起，SAG12-PPDKgDNA的PPDK丰度高于野生型的PPDK丰度。对于各SAG12-PPDKgDNA品系，从第五周起在每个时间点将PPDK丰度计算为野生型的百分比，从这些值得到的平均值对衰老期间各SAG12-PPDKgDNA品系中的PPDK蓄积进行量化。这就允许按照递增的PPDK丰度对SAG12-PPDKgDNA品系排序，如图5所示。

由于在转基因植物中大量蓄积的蛋白质可经历灭活，因此升高的蛋白质丰度并不一定意味着增加酶活性。在暗中，PPDK进行可逆的磷酸化，导致其失活。针对磷酸化形式的PPDK(磷酸-PPDK)产生的抗体，可供特异性检测无活性形式的PPDK，而之前所使用的抗体(抗PPDK)不论磷酸化状态都测出PPDK(Chastain等，2002，PlantPhysiology，128，1368-1378)。对于最初用抗PPDK抗体探测然后剥离和再探测的免疫印迹，在从播种后3周到9周的时程中，抗磷酸PPDK抗体被用来检测无活性的PPDK。

出人意料的是，在野生型植物中在多个免疫印迹上只可检出非常低水平的无活性PPDK(磷酸化PPDK)，且只在衰老的晚期检出。在SAG12-PPDKgDNA植物中，取决于使之失活的时间点，检出较高水平的PPDK。然而，尽管总PPDK的高丰度，但在PPDK丰度开始提高后不久的时间点上，检出非常少的无活性PPDK或未检出无活性PPDK。这些结果表明，虽然在SAG12-PPDKgDNA植物中可发生一些PPDK失活，但是至少在衰老早期，丰度增加的酶促活性PPDK存在于SAG12-PPDK植物中。

实施例5-转化的烟草植物中PPDK蛋白的检测和定量测定

在液氮下，使用微型研杵将烟草叶组织(100mg)在1.5ml微量离心管中研磨，加入400μl提取缓冲液(Overcoat缓冲液(PIC))。按照推荐的方案，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂(Bio-Rad)，通过Bradford测定法测定蛋白质浓度(Jones等，1989)。如实施例4所述，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对蛋白质进行分离。如实施例4所述，通过免疫印迹对蛋白质进行分析并定量测定PPDK蛋白。

对自通过剥离和于30℃避光温育而诱导衰老的K326和Burley 21T1代烟草叶提取的叶蛋白质进行了针对PPDK的免疫印迹。以这种方式诱导衰老，使得在植物达到成熟前，可鉴定出具有最高PPDK丰度的转基因品系，并弃去其它品系。在K326植物中，在3个SAG12-PPDKgDNA品系(G4、G8和G10)以及在1个SAG12-PPDKcDNA品系(C10)中，检出高丰度的PPDK。在Burley 21植物中，在4个SAG12-PPDKgDNA品系(G3、G7、G15和G23)中有丰富PPDK，但PPDK不以与K326品系一样的高丰度存在。具有最高PPDK丰度的K326和Burley 21的各4个品系均用于所有的进一步分析。由于几乎唯一在SAG12-PPDKgDNA品系中观察到最高PPDK丰度，因此似乎内含子对PPDK表达具有积极作用。

参照图6，图中显示如下对SAG12-PPDK K326和Burley 21烟草品系进行选择：

(b)选择转基因K326品系的PPDK免疫印迹。在6周大植物的绿叶中通过剥离并于30℃避光温育3天诱导衰老。提取蛋白质，并进行免疫印迹分析以选出表达较高水平的PPDK的品系。重组玉米PPDK(50μg)用作阳性对照。用各亲本T0植物的一个子代显示一个代表性免疫印迹。将亲本品系SAG12-PPDKgDNA G4、G8和G10和SAG12-PPDKcDNA品系C10的植物用于所有后续分析。

(c)与在(b)部分中对K326所进行的一样进行选择转基因Burley21品系的PPDK免疫印迹。将亲本品系SAG12-PPDKgDNA G3、G7、G15和G23的植物用于所有后续分析。

对野生型、零拷贝(阴性分离子)、SAG12-PPDKgDNA K326、SAG12-PPDKcDNA K326和SAG12-PPDKgDNA Burley 21烟草进行了针对PPDK的免疫印迹以测定PPDK表达的开始，并定量测定转化植物中PPDK过表达的程度。从3个月大植物的K326野生型和转化植物叶1(最老)至8(嫩)提取蛋白质，并进行了针对PPDK的免疫印迹。

参照图7，图中显示在K326烟草成熟叶中PPDK的过表达。根据免疫印迹计算出PPDK丰度。数据显示为零拷贝植物的10个生物重复的平均值和各SAG12-PPDK品系的4个生物重复的平均值。误差棒表示1SEM。将SAG12-PPDK品系以递增的PPDK丰度的顺序排列。使用ANOVA检验基因型间的差异(F＝6.995，df＝4，p＝0.001)。与零拷贝植物显著不同的品系是G10(p＝0.006)、G8(p＝0.003)和C10(p＝0.000)。

在野生型植物较老叶中，PPDK丰度较高，这就表明PPDK在烟草以及拟南芥衰老期间天然被增量调节。在转化的K326植物中，较老叶中的PPDK丰度也较高，且比野生型植物的高得多。在具有最高PPDK丰度的转化品系的较幼嫩叶中，PPDK的丰度也较高。对零拷贝植物(阴性分离子)和转化植物的‘成熟’叶中提取的蛋白质进行了免疫印迹。成熟叶是收获期的叶，并且是衰老晚期的叶。定量测定了PPDK丰度。与零拷贝植物相比，所有4个独立的转化品系成熟叶中的PPDK丰度较高。对于K326烟草，在衰老期间使用SAG12启动子的PPDK过表达是成功的。

实施例6-转化拟南芥植物的表型分析

拟南芥植物生长的分析

参照图8，图中清楚显示，鼠耳芥中PPDKgDNA的过表达产生具有较大莲座叶丛的植物。在播种后3、5、7和9周，给野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA植物拍照。SAG12-PPDKgDNA植物比野生型大。在PPDK植物和野生型植物之间不存在可辨别的差异。

使用Mettler Toledo AB104-S天平测定莲座叶丛和繁殖组织的鲜质量，精确到0.1mg。从利用Edwards Super Modulyo冷冻干燥器冷冻干燥过夜的样品，测定莲座叶丛组织的干质量，精确到0.1mg。

参照图9，图中显示第9周的繁殖组织质量。观察到对PPDK的剂量反应，其中PPDK丰度较高的品系具有较高的繁殖组织质量。将总繁殖组织(茎、茎生叶、花和长角果)称重。值为3个生物重复的平均值。误差棒表示1SEM。将转基因SAG12-PPDKgDNA品系以PPDK丰度递增的顺序排列。应用ANOVA检验基因型间的差异(F＝8.062，df＝6，p＝0.001)。所有SAG12-PPDKgDNA品系与野生型显著不同(G9.4p＝0.031，G5.4p＝0.000，G19.2p＝0.000，G12.3p＝0.001，G16.1p＝0.001)。具有较高PPDK丰度的品系趋于具有较高的繁殖组织质量，虽然这种趋势不是绝对的。还计算出繁殖组织占植物总鲜质量的百分比，但当应用ANOVA检验时，与野生型、ΔPPDK或SAG12-PPDKgDNA植物无显著差异(F＝0.544，df＝6，p＝0.767，数据未显示)。

然而，占植物总质量百分比的繁殖组织的比例不改变，这就表明整体来看植物较大，营养组织和繁殖组织之间的资源分配未发生改变。还在ΔPPDK植物中测定了植物总的鲜质量和繁殖组织质量，并且与野生型无显著不同。还测定了莲座叶丛干质量，对于植物总的鲜质量和繁殖组织质量，发现与野生型相比，SAG12-PPDKgDNA植物具有显著较高的质量。

参照图10，图中显示播种后自第3周到第9周野生型和SAG12-PPDgDNA植物的植物总鲜质量(莲座叶丛加繁殖组织)。将数据表示为野生型的3个生物重复和SAG12-PPDKgDNA的15个生物重复(5个独立品系各3株植物)的平均值。误差棒表示1SEM。应用斯氏t检验(student’s t-test)在各个时间点，对野生型和SAG12-PPDKgDNA植物总质量进行了比较。在第9周的SAG12-PPDKgDNA植物中，莲座叶丛质量显著较高(p＝0.032)。

由于SAG12启动子所致，在第5周开始PPDK过表达前没有显著差异。所有5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系的莲座叶丛干质量都增加。至于繁殖组织质量，观察到对PPDK丰度的剂量反应，其中较高PPDK含量的品系具有较高的质量。还在ΔPPDK植物中测定了莲座叶丛干质量，与野生型植物没有显著不同。

拟南芥叶表面积的测定

通过采取单片成熟叶(通过是第10叶)样品，如上所述测定叶质量和整个莲座叶丛质量，并对放在直尺旁的叶拍照，来测定莲座叶丛的表面积。应用ImageJ软件(National Institutes of Health)测量叶表面积，并由此计算整个莲座叶丛的表面积。

在PPDK过表达开始后，在SAG12-PPDKgDNA植物中，莲座叶丛表面积增加。尽管在第六周和第七周，SAG12-PPDKgDNA植物的表面积显著较大，但在第8和9周时，表面积与野生型无显著不同。表面积的这种大的降低可能是由于与野生型相比SAG12-PPDKgDNA植物中营养物再动员增加所致。ΔPPDK植物的表面积与野生型植物无显著不同。

叶绿素浓度的测定

使用CCM-200手提式叶绿素仪(Opti-Sciences)，测定相对单位的叶绿素含量。

拟南芥的荧光测定

使用Hansatech FMS2荧光计测定了FV/FM比率。使用生产商提供的叶夹，使叶在测定前进行暗适应过夜。为了确定在SAG12-PPDKgDNA或ΔPPDK植物中衰老的开始相对于野生型植物是否改变，测定了FV/FM比率。FV/FM是光系统II的量子效率估值，当发生光抑制时便下降。其是衰老开始的有用的衡量值，因为光合作用下降发生在衰老的早期，在检出叶绿素含量下降之前。在播种后4周(当叶变大到足以测定FV/FM时)到9周的时程内测定了FV/FM。在野生型、SAG12-PPDKgDNA和ΔPPDK植物中，在第7周时FV/FM最大，随后下降，这就表明开始衰老的时机在所有3种基因型中是相同的。然而，与野生型相比，SAG12-PPDKgDNA植物中第8周的FV/FM显著较高，这就表明在衰老晚期光合活性延长。

氮含量

使用Edwards Super Modulyo冷冻干燥器将用于氮分析的组织冷冻干燥。将拟南芥叶组织(25mg)或烟草叶组织(100mg)包装在无氮称量纸(Elementar Ahalysensysteme GmbH)中。利用快速N III氮分析仪(Rapid N III Nitrogen Analyzer)(Elementar Analysensysteme GmbH)，使用推荐的设置测定氮含量占干重的百分比。将天冬氨酸(Sigma-Aldrich)用作标准品。在播种后3-9周的时程内，测定了拟南芥野生型、SAG12-PPDKgDNA和ΔPPDK植物的叶氮含量。

参照图11，图中显示第7周野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDKgDNA植物叶的氮含量。将数据表示为野生型和ΔPPDK的8个生物重复及SAG12-PPDKgDNA品系各4个生物重复的平均值。误差棒为1SEM。将SAG12-PPDKgDNA品系以PPDK丰度递增的顺序排列。应用ANOVA检验基因型间的差异(F＝6.047，df＝6，p＝0.000)。ΔPPDK植物和所有的SAG12-PPDKgDNA品系与野生型显著不同(ΔPPDK p＝0.004，G9.4p＝0.000，G5.4p＝0.000，G19.2p＝0.001，G12.3p＝0.007，G16.1p＝0.006)。

与野生型相比，在所有5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系中，自第7周后叶氮素显著较低，这就支持提高PPDK丰度在衰老期间可提高氮素再动员的效率的假说。SAG12-PPDKgDNA植物中，PPDK表达和活性在第6周达到峰值，这就表明在PPDK丰度的升高与叶氮素可测量的降低之间存在延时，这可能归因于将蛋白质氨基酸转化成转运氨基酸(天冬酰胺和谷氨酰胺)并将其运输到叶外所耗费的时间。

拟南芥种子的分析

测定了野生型、SAG12-PPDKgDNA和ΔPPDK鼠耳芥植物种子中的单粒种子质量和氮含量。

参照图12，图中表示野生型、ΔPPDK和SAG12-PPDK植物的单粒种子的氮含量。SAG12-PPDKgDNA植物的种子氮含量有显著增加。将数据表示为野生型和ΔPPDK的8个生物重复及各SAG12-PPDKgDNA品系的4个生物重复的平均值。误差棒为1SEM。SAG12-PPDKgDNA品系以PPDK丰度递增的顺序排列。应用ANOVA检验基因型间的差异(F＝6.704，df＝6，p＝0.000)。与野生型显著不同的品系为G19.2(p＝0.000)、G12.3(p＝0.005)和G16.1(p＝0.002)。具有较高PPDK丰度的品系趋于具有较高的种子氮质量。因此，与野生型相比，在所有5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系中单粒种子质量增加，并且观察到对PPDK丰度的剂量反应，其中PPDK丰度较高的植物具有较高的种子质量。还对从各植物收获的总的种子进行称重，在野生型和SAG12-PPDKgDNA植物之间无显著差异，因此增加SAG12-PPDK植物的种子大小不会损害种子总收成。

拟南芥叶组织的游离氨基酸含量

在液氮下，使用微型研杵(Eppendorf)，将叶组织(100mg)在1.5ml微量离心管中研磨，并加入300μl无菌去离子水。在4℃下，将样品以13,000rpm进行离心5分钟。按照推荐的方案，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂(Bio-Rad)，通过Bradford测定法测定蛋白质浓度(Jones等，1989)。按照推荐的方案，使用EZfaast氨基酸样品测试试剂盒(Phenomenex)，制备用于氨基酸分析的样品。将样品重新悬浮于含10mM甲酸铵(BDH实验室供应)的50％无菌蒸馏水和50％超级别甲醇(Romil)中。

然后采用Q Trap LC/MS/MS(Applied Biosystems/MDS SCIEX)与EZfaast 250x 3.0mm AAA-MS柱(Phenomenex)以及将含10mM甲酸铵的50％(v/v)无菌蒸馏水溶液和50％(v/v)超级别甲醇用作流动相，对样品进行液相色谱-质谱法(LC-MS)。按阳离子模式与EZfaast试剂盒(Phemonenex)中推荐的条件使用质谱仪。运用所供应的Analyst软件(Applied Biosystems/MDS SCIEX)对结果进行分析。

在自播种后第3周到第9周的时程内，在野生型、SAG12-PPDKgDNA和ΔPPDK拟南芥植物叶中测定了总游离氨基酸含量。

参照图13，图中显示过表达PPDK的拟南芥叶中的总游离氨基酸含量增加。将数据表示为野生型和ΔPPDK的6个生物重复及各SAG12-PPDKgDNA品系的4个生物重复的平均值。误差棒为1SEM。将SAG12-PPDKgDNA品系以PPDK丰度递增的顺序排列。与野生型相比，所有5个SAG12-PPDKgDNA品系具有较高的总氨基酸含量，但变化大，当应用ANOVA检验时差异不显著(F＝1.314，df＝6，p＝0.289)。

在第7周，即叶氮含量变得显著低于野生型的氮含量的同一时间和SAG12-PPDKgDNA植物叶中PPDK丰度最高后的一周，与野生型植物相比，SAG12-PPDKgDNA植物中的总游离氨基酸含量显著较高。在所有5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系中出现增加，尽管变化大，且各品系和野生型之间的差异不显著。这种增加表明在该时间点上，氨基酸的产生以比可发生的氨基酸输出大的速率进行，因此氨基酸在叶中蓄积。与野生型相比，ΔPPDK植物中的总游离氨基酸没有明显不同。

还测定了转运氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，用占总游离氨基酸的百分比表示。在第7周和第8周，SAG12-PPDKgDNA植物中的转运氨基酸含量显著高于野生型植物的转运氨基酸含量。增加出现在所有5个独立的SAG12-PPDKgDNA品系中，尽管变化大，且各品系和野生型之间的差异并不显著。因此，除SAG12-PPDKgDNA植物中的总游离氨基酸含量增加以外，转运氨基酸的含量还与总量成比例地增加。这再次表明，在这些时间点上，谷氨酰胺和天冬酰胺的产生超过叶的输出能力，这就支持在衰老期间升高的PPDK丰度提高导致形成转运氨基酸的氨基酸互变效率的假说。在ΔPPDK植物中，未观察到与野生型有显著差异。

实施例7-转化烟草植物的表型分析

烟草叶氮含量的分析

测定了阴性分离子和SAG12-PPDK K326烟草的成熟叶中的叶氮含量。成熟叶是已准备收获用于烟草生产的叶。对于4个独立SAG12-PPDK品系中的一些，SAG12-PPDK植物的叶氮含量低于阴性分离子植物的叶氮含量。

将成熟叶用来测定叶氮含量，因为这些叶处于可以收获用于烟草生产的阶段。然而，成熟叶中叶氮含量的差异很小的事实并不一定意味着氮素再动员不会增加。在SAG12-PPDKgDNA拟南芥植物开始衰老的时程中，叶氮含量显著低于野生型，但到衰老后期，差异小得多。因此，烟草中叶氮含量的差异有可能出现在衰老较早期，并且有可能到测定叶氮含量时该差异缩小。

烟草叶氨基酸含量的分析

测定了K326烟草成熟叶的氨基酸含量，该成熟叶通过剥离和避光于30℃温育3天来诱导衰老。这就允许对在诱导衰老之前和之后的同一叶之间进行比较。通过叶剥离和避光温育对衰老的诱导显示基因表达图式与年龄相关性衰老的最大重叠。

在K326烟草中，在诱导阴性分离子植物和SAG12-PPDK植物衰老后总氨基酸含量增加。将增加计算为诱导衰老前总氨基酸含量的百分比。对于SAG12-PPDK品系C10，增加显著小于阴性分离子植物的增加，但其它SAG12-PPDK品系与阴性分离子植物都没有显著性差异。因此在诱导暗诱导衰老后，在衰老期间PPDK的过表达似乎对总氨基酸含量几乎无影响。在诱导衰老后，K326烟草中的转运氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)含量也增加，但这种增加发生在阴性分离子和SAG12-PPDK品系两者中，而且在诱导衰老后，基因型之间在增加程度上没有显著差异。

烟草种子的分析

测定了K326烟草的单粒种子质量，对于所有4个独立的转基因品系，与阴性分离子植物相比，单粒种子质量在SAG12-PPDKgDNA和SAG12-PPDKcDNA植物中显著较高。还测定每个种子荚的种子质量，并且在SAG12-PPDKgDNA和SAG12-PPDKcDNA植物中显著较高。

参照图14，图中显示在SAG12-PPDK K326烟草中种子大小增加。通过给约1000粒种子拍照、计数和称重，来计算K326零拷贝(对于SAG12-PPDK插入片段为阴性分离子的植物)和SAG12-PPDK植物的每粒种子质量。将数据表示为零拷贝植物的10个生物重复的平均值和各SAG12-PPDK品系的4个生物重复的平均值。误差棒为1SEM。SAG12-PPDK品系以成熟叶中递增的PPDK丰度的顺序排列。SAG12-PPDK植物的种子质量较大。应用ANOVA检验基因型间的差异(F＝4.870，df＝4，p＝0.006)。与零拷贝植物显著不同的品系是G8(p＝0.005)和C10(p＝0.002)。

对于所有4个独立的SAG12-PPDKgDNA和SAG12-PPDKcDNA品系，种子的百分比氮含量较高，但是差异并不显著。然而，在SAG12-PPDKgDNA和SAG12-PPDKcDNA植物中，每粒种子的氮质量显著较高。

参照图15，图中清楚表明，SAG12-PPDK K326烟草的种子氮含量增加。从种子质量和种子氮含量数据计算K326零拷贝和SAG12-PPDK植物单粒种子的氮质量。将数据表示为零拷贝植物的10个生物重复的平均值和各SAG12-PPDK品系的4个生物重复的平均值。误差棒为1SEM。SAG12-PPDK品系以成熟叶中递增的PPDK丰度的顺序排列。SAG12-PPDK植物中单粒种子的氮质量较高。应用ANOVA检验基因型之间的差异(F＝7.807，df＝4，p＝0.001)。与零拷贝植物显著不同的品系是G8(p＝0.000)和C10(p＝0.000)。

这就表明SAG12-PPDKgDNA和SAG12-PPDKcDNA K326烟草植物中供应给种子的氮增加。在K326植物中，观察到对PPDK的剂量反应。成熟叶中PPDK丰度较高的植物具有较高的种子单粒种子质量、较高的种子质量/种子荚和增加的单粒种子的氮质量。这强有力地支持PPDK的氮素再动员中的作用，因为PPDK含量增加似乎与供应给种子的氮的增加有关。

总的来说，在SAG12-PPDK K326烟草中单粒种子质量(图14)和氮质量/种子(图15)两者均增加，这就表明氮素再动员通过PPDK的过表达而增加。因此，对于拟南芥SAG12-PPDKgDNA植物，可预期渐老叶中转运氨基酸含量增加。然而，在拟南芥中测定了天然衰老叶的氨基酸含量，而在烟草中，衰老是通过叶剥离和避光温育而诱导的。由于暗诱导和年龄相关性衰老发生的过程不同，烟草叶中发生的过程未必与拟南芥叶中发生的过程类似。

实施例8-过表达PCK和PPDK的拟南芥植物的产生

通过使PCK的编码区和基因组克隆与BNP1380000001二元载体(如实施例1和2中所述将其转化到鼠耳芥中)内的衰老相关基因12(SAG12)启动子融合，来实现拟南芥PCK(At4g37870.1)在衰老期间的过表达。

如实施例1有关PPDK中所述，采用PCR，先从拟南芥cDNA中分离出At PCK编码序列，并从拟南芥基因组DNA中分离出基因组序列。另一方面，设计出PCR引物以促进基因随后与BNP1380000001载体连接(参见图3a)，所述PCR引物包括鼠耳芥(At)PCK基因的起始密码子和终止密码子，且亦如表1所示，在正向引物AtPCK-Xba IFOR(SEQ ID No.25)中包括XbaI限制位点，而在反应向引物AtPCK-SacIREV(SEQ ID No.26)中包括SacI限制位点。

按照实施例1，制备用于各PCR反应的cDNA和基因组DNA模板。PCR反应混合物包含1x HF缓冲液(NEB)、2mM氯化镁(NEB)、0.5mM dNTPs(Bioline)、100ng模板(cDNA或基因组DNA)、0.5μM各引物和1单位Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)。采用Techne热循环仪如下进行热循环：98℃30秒钟的起始变性步骤，接着35个以下循环：98℃10秒钟、60℃30秒钟以及对于编码区72℃2分30秒而对于基因组克隆4分30秒的延伸时间。最后步骤包括72℃10分钟的最后延伸。

这些PCR产物产生编码序列(cDNA)的2kb条带和PCK基因组序列的3.5kb条带，并进行了PEG沉淀。与实施例1对PPDK所述一样，按照推荐的方案，将扩增的DNA连接(平端)至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中。然后将质粒转化至文库效率(Library Efficiency)DH5α大肠杆菌细胞中。卡那霉素(50μg ml^-1)用作选择性抗生素。对于编码区和基因组克隆两者，使用引物AtPCK-Xba IFOR(SEQ IDNo.25)和AtPCK-Sac IREV(SEQ ID No.26)两者，通过菌落PCR选出阳性菌落。使阳性菌落在37℃振荡培养箱中在5ml含有50μg ml^-1卡那霉素的LB培养液中生长过夜。

使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen Ltd)，分离质粒DNA，通过依次的限制酶切消化对插入片段大小进行分析。这通过用10单位XbaI和1x XbaI缓冲液于37℃消化1μg DNA 2小时，然后加入10单位SacI和1x SacI缓冲液于37℃过夜来进行。使用AtPCK-XbaIFOR/AtPCK-Sac IREV，对含有正确插入片段的质粒DNA进行了测序。应用BioEdit分析序列，并应用BLASTX验证扩增的AtPCK编码序列和基因组序列。

为了使AtPCK编码区和基因组克隆与图3a所示的pBNP载体连接，使用分别代表两种质粒的大肠杆菌菌落接种25ml含有50μg ml^-1卡那霉素的LB培养液。将培养物于37℃振荡过夜后，使用QIAfilter质粒midi试剂盒(Qiagen Ltd)纯化质粒DNA。以相同方式但从100ml含有50μg ml^-1卡那霉素的培养物中纯化pBNP载体。对所有纯化的质粒DNA进行与上述相同的顺序酶消化。对于含有编码区和基因组克隆的质粒，消化3μg DNA，对于pBNP载体，消化1μg DNA。通过结晶紫凝胶电泳分离样品，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QiagenLtd)纯化产物。14.4kb pBNP载体产物用碱性磷酸酶处理以防止自身连接，利用XbaI/SacI消化，使编码区和基因组克隆插入片段与pBNP载体连接。将文库效率DH5α大肠杆菌细胞用2μl连接反应物转化，使用AtPCK-Xba IFOR和AtPCK-Sac IREV通过PCR筛选阳性菌落。

使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen Ltd)，从含有所需插入片段的菌落中提取质粒DNA，将DNA随后用10单位XbaI、15单位SacI和1x XbaI缓冲液于37℃消化2小时。选出pBNP载体中的编码序列和基因组序列插入片段(其具有正确的预期限制性内切酶消化谱)的各两个分离菌落，然后使用BNP-SAG12FWD引物(SEQ ID No.9)测序。应用BioEdit程序对序列进行分析。所产生的构建体称为pALBNP1(编码序列)和pALBNP2(基因组序列)，如图3b所示。

产生了5个纯合的单一插入片段品系，并通过如实施例3所述的免疫印迹法，使用PCK特异性抗体证实了PCK过表达。使用针对PCK氨基酸序列设计的合成肽，在兔中产生多克隆抗血清。序列为化学合成的(i)DEHCWTETGVSNIEG(SEQ ID No.27)，和(ii)CVDLSREKEPDIWNA(SEQ ID No.28)，然后与匙孔血蓝蛋白偶联，随后共同注射到兔中。使用抗体得到的结果见图16，图中显示转化植物具有高水平的PCK蛋白。

通过将单一SAG12-PCK转化子(3)1和(19)4与强SAG12-PPDK过表达品系杂交，产生SAG12-PCK-PPDK细胞系。对具有高水平的PCK和PPDK两者的植物的分析显示莲座叶丛质量提高，如图17所示。

最后，虽然本发明人不希望受假设的束缚，但图18表示推测的生化途径，说明了PCK和PPDK可如何影响氮素再动员。

PCK/PPDK双重构建体

本发明人观察到，当转化到植物中时，图3所示PCK和PPDK单一构建体引起衰老叶的氮素再动员速度提高，而且当这些酶在衰老叶中过表达时，营养性植物生长的量也提高(这相当于作物产量提高)。本发明人因此决定制备两种双重构建体，其中将编码PCK和PPDK的基因两者插入SAG12启动子控制下的pBNP130000001中。

利用XbaI/SacI消化，通过连接编码BNP-PPDKgDNA的PPDK编码gDNA片段下游(即3’端)的PCK的gDNA，制备了第一种双重构建体。因此，质粒中的SAG12启动子负责PPDK基因和PCK基因两者的表达。

利用AvrII/BamHI消化，通过连接编码pALBNP2的PCK编码gDNA片段直接下游的PPDK的gDNA，制备了第二种双重构建体。SAG12同样负责PPDK基因和PCK基因两者的表达。

Claims (36)

1.一种遗传构建体，所述遗传构建体包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性启动子，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和/或丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。

2.一种遗传构建体，所述遗传构建体包含与至少一个编码序列有效连接的启动子，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。

3.权利要求2的遗传构建体，其中所述启动子是衰老特异性启动子。

4.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中所述启动子从拟南芥的衰老相关基因中分离。

5.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中所述启动子选自：SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18或者其功能变体或片段。

6.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中所述启动子是SAG12启动子或者其功能变体或片段。

7.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中所述启动子包含基本上如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列或者其功能变体或片段。

8.权利要求1的遗传构建体，其中所述至少一个编码序列编码(i)烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)或者其功能变体或片段，和/或(ii)丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或者其功能变体或片段。

9.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中编码具有PCK活性的多肽的编码序列来源于拟南芥。

10.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中编码具有PPDK活性的多肽的编码序列来源于拟南芥属、玉蜀黍属、黄花菊属或白花菜属。

11.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中编码具有PCK活性的多肽的编码序列包含基本上如SEQ ID No：17或SEQ IDNo.18所示的核酸序列或者其功能变体或片段。

12.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中具有PCK活性的多肽包含基本上如SEQ ID No：19所示的氨基酸序列或者其功能变体或片段。

13.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中编码具有PPDK活性的多肽的编码序列包含基本上如SEQ ID No：20、SEQID No：21或SEQ ID No：22所示的核酸序列或者其功能变体或片段。

14.前述权利要求中任一项的遗传构建体，其中具有PPDK活性的多肽包含基本上如SEQ ID No：23或SEQ ID No.24所示的氨基酸序列或者其功能变体或片段。

15.权利要求1的遗传构建体，其中所述构建体编码PCK或者其功能变体或片段，而不编码PPDK。

16.权利要求1的遗传构建体，其中所述构建体编码PPDK或者其功能变体或片段，而不编码PCK。

17.权利要求1-14中任一项的遗传构建体，其中所述构建体编码PCK或者其功能变体或片段以及PPDK或者其功能变体或片段。

18.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求1-17中任一项的遗传构建体。

19.一种基本如图3所示的重组载体。

20.一种提高试验植物叶中的PCK和/或PPDK浓度至高于培养在相同条件下的野生型植物中相应的PCK和/或PPDK浓度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

21.一种降低试验植物叶中的氮浓度至低于培养在相同条件下的野生型植物中相应的氮浓度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

22.一种与培养在相同条件下的野生型植物的相应生长速度相比提高试验植物的生长速度的方法，所述方法包括改变试验植物的植物代谢以在叶衰老开始后使PCK和/或PPDK在植物叶中的水平得到提高。

23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述方法包括用权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或权利要求19的载体转化试验植物细胞。

24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述方法包括提高植物叶中PCK和PPDK的浓度至高于培养在相同条件下的野生型植物中相应的PCK和PPDK浓度的方法。

25.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或权利要求19的重组载体。

26.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或权利要求19的重组载体。

27.权利要求26的转基因植物，其中所述植物来自十字花科。

28.权利要求26的转基因植物，其中所述植物来自禾本科。

29.权利要求26的转基因植物，其中所述植物来自茄科。

30.一种植物繁殖产品，所述植物繁殖产品可获自权利要求26-29中任一项的转基因植物。

31.权利要求30的植物繁殖产品，其中所述植物繁殖产品是种子。

32.一种产生转基因植物的方法，所述转基因植物以比培养在相同条件下的相应野生型植物高的速度对氮进行再动员，所述方法包括以下步骤：

i)用权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或19的载体转化植物细胞；和

ii)从转化细胞再生植物。

33.一种产生转基因植物的方法，所述转基因植物的生长速度比培养在相同条件下的相应野生型植物的生长速度快，所述方法包括以下步骤：

i)用权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或19的载体转化植物细胞；和

ii)从转化细胞再生植物。

34.一种收获的叶，所述叶含有比得自培养在相同条件下的野生型植物的收获叶中相应的氮水平低的氮水平，其中所述叶从权利要求26-29中任一项的转基因植物中收获，或者通过权利要求32或权利要求33的方法产生。

35.一种吸烟制品，所述吸烟制品包含获自突变型烟草植物的氮降低的烟草，所述突变体能够降低衰老叶中的氮浓度。

36.权利要求35的吸烟制品，其中所述吸烟制品由以下烟草制成，所述烟草获自己用权利要求1-17中任一项的遗传构建体或者权利要求18或权利要求19的载体转化的突变型烟草植物。

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