MX2011009047A

MX2011009047A - Plantas transgenicas que comprenden constructos que codifican para fosfoenolpiruvato carboxicinasa y/o piruvato ortofosfato dicinasa.

Info

Publication number: MX2011009047A
Application number: MX2011009047A
Authority: MX
Inventors: Julian Michael Hibberd; Lucy Elisabeth Taylor; Anna Elizabeth Leiss
Original assignee: Cambridge Advanced Tech
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2011-11-02
Also published as: US9260720B2; AU2010217392A1; GB0903346D0; SG173866A1; WO2010097623A1; CA2753759A1; US20120125355A1; EP2401379A1; CN102428186A; JP5719784B2; KR20110137326A; JP2012518995A; CL2011002093A1; HK1165486A1; ZA201107018B; AP2011005897A0; NZ595398A; EP2401379B1; CN102428186B; BRPI1007835A2

Abstract

La invención proporciona constructos genéticos que comprenden un promotor específico de senescencia unido de manera operativa al menos a una secuencia que codifica al menos para un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) y/o actividad de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK). Los constructos tienen la habilidad de causar, en plantas transgénicas, la removilización del nitrógeno durante la senescencia foliar, de manera que el nitrógeno puede ser transportado de las hojas a otras regiones de las plantas. La invención proporciona células vegetales y plantas transformadas con estos constructos, métodos para producir las plantas transgénicas y métodos para aumentar el grado de removilización de nitrógeno y el índice de crecimiento en las plantas senescentes. La invención también proporciona hojas de la planta cosechadas, por ejemplo, hojas de tabaco que se han transformado con los constructos genéticos y artículos de tabaco que contienen estas hojas cosechadas.

Description

PLANTAS TRANSGENICAS QUE COMPRENDEN CONSTRUCTOS QUE CODIFICAN PARA FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXICINASA Y/O PIRUVATO ORTOFOSFATO DICINASA La presente invención se relaciona con constructos genéticos usados en la preparación de plantas transgénicas . Los constructos pueden tener la habilidad de causar una removilización (remobilisation) del nitrógeno durante la senescencia foliar, de manera que el nitrógeno puede ser transportado de las hojas a otras regiones de la planta. La invención abarca células vegetales transformadas con estos constructos y también a las plantas transgénicas como tales. La invención también se relaciona con métodos para producir las plantas transgénicas y con métodos para aumentar el grado de removilización de nitrógeno en las plantas senescentes. La invención también se relaciona con las hojas de la planta cosechadas, por ejemplo, hojas de tabaco que se han transformado con los constructos genéticos y se relaciona con los artículos de tabaco que contienen estas hojas cosechadas.

La senescencia foliar es una fase del desarrollo de las plantas en el que las células tienen distintos cambios metabólicos y estructurales antes de la muerte celular. Estudios fisiológicos y genéticos indican que la senescencia es un proceso bastante regulado. La evolución 7254.2 de una hoja a través de la senescencia es visiblemente notable por la pérdida de clorofila y el consecuente amarilleo que resulta de la desintegración de los cloroplastos . La disminución de los niveles de clorofila en las hojas, característica de esta etapa de cambio, se puede medir, por ejemplo, por extracción con disolvente y determinación espectrofotométrica o por un medidor de contenido de clorofila. La disminución del contenido de clorofila foliar en comparación con un contenido de clorofila foliar registrado previamente para la misma planta, que se desarrolle, de preferencia, en condiciones constantes, indica senescencia.

Estudios moleculares indican que la senescencia está asociada con cambios en la expresión génica. Los niveles de ARNm que codifican para proteínas que participan en la fotosíntesis disminuyen durante la senescencia, mientras que hay un aumento de los niveles de ARNm que codifican para proteínas que se cree participan en la senescencia. La senescencia es un proceso bastante organizado regulado por genes conocidos como genes asociados a la senescencia (SAGs - Senescence Associated Genes). La senescencia foliar implica la degradación de proteínas, ácidos nucleicos y membranas y el subsecuente transporte de nutrientes que se deriva de esta degradación a otras regiones de la planta, como el desarrollo de semillas, hojas u órgano de almacenamiento. Un problema de la senescencia de las plantas es que muchos minerales y nutrientes útiles que están presentes en las hojas senescentes se quedaran en éstas y será una pérdida efectiva en cuanto las hojas mueran. Por ejemplo, el nitrógeno presente en las hojas senescentes, que puede estar en la forma de grupos amino en los aminoácidos, se desperdiciará si no se desplaza de las hojas que están muriendo .

Por lo tanto, aumentar la removilización en plantas, en especial cuando se vuelven senescentes, podría tener importantes aplicaciones en la producción de cultivos. En primer lugar, el nitrógeno removilizado de las hojas, se puede transportar a las hojas más jóvenes y también a las semillas en desarrollo. Al aumentar la eficiencia de la salida del nitrógeno de las hojas senescentes podría, por lo tanto, aumentar potencialmente el suministro de nitrógeno a las semillas y a las partes más jóvenes de la planta y en consecuencia aumentar el rendimiento del cultivo y la eficiencia en el uso del nitrógeno. Esto es, a todas luces, una meta valiosa cuando la población mundial está aumentando pero el rendimiento de los cultivos no se incrementa lo suficiente para satisfacer la demanda. Un cultivo que es un blanco potencial es el de Brassica napus (semilla de nabo oleaginosa), el cual tiene baja eficiencia de nitrógeno debido a la escasa removilización del nitrógeno del tejido vegetativo. Otro cultivo que puede ser un blanco es el trigo, ya que son muchos los beneficios potenciales al aumentar el contenido de proteína en el grano. El contenido de proteína en el grano no sólo afecta el valor nutritivo del trigo sino que determina el uso del grano y por lo tanto el valor comercial. Por ejemplo, aumentar el contenido de proteína en el grano da como resultado un mayor volumen en el pan. Por otra parte, la capacidad para aumentar la removilización del nitrógeno podría ser muy útil en la industria del tabaco porque es sabido que el nitrógeno residual en las hojas de tabaco contribuye a la formación de nitrosaminas .

Son conocidas las enzimas fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PECPCK o PCK) [EC 4.1.1.49] y piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) [EC 2.7.9.1]. La piruvato ortofosfato dicinasa está presente en procariotas y en eucariotas y se conserva en términos de secuencia y estructura terciaria entre bacterias y plantas superiores (Pocalyko et al., 1990, Biochemistry, 29, 10757-10765). La enzima cataliza la fosforilación reversible del piruvato para formar fosfoenolpiruvato (Carroll et al., 1990, Federation of European Biochemical Societies, 274, 178-180; Hatch & Slack, 1968, Biochemical Journal, 106, 141-146), en la siguiente reacción: piruvato + Pi + ATP = PEP + PPi + AMP. En las plantas C3 y C4, el gen PPDK tiene una estructura inusual, con dos transcritos que se derivan del mismo gen. El transcrito más grande codifica para una proteína cloroplástica en la que el primer exón codifica un péptido transitorio de cloroplasto, mientras que el transcrito más corto se transcribe de un promotor separado dentro del primer intrón del transcrito más grande y por lo tanto, carece del primer exón que codifica el péptido transitorio de cloroplasto. Este transcrito más corto genera una isoforma citosólica de PPDK. Esta estructura génica se ha reportado en maíz, arroz, especies C3 y C4 de Flaveria y Arabidopsis thalíana.

La fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) cataliza una reacción reversible entre ADP, dióxido de carbono y fosfoenolpiruvato para formar ATP y oxalacetato según la siguiente reacción: oxalcetato + ATP = PEP + ADP + C02. Se ha demostrado que el PCK está presente en el citosol de las células de una amplia gama de tejidos vegetales. Estos incluyen semillas en desarrollo, tricomas y raíces, En las plantas el PCK se presenta en tejidos en los que es elevado el metabolismo de compuestos nitrogenados.

Los inventores construyeron varios constructos genéticos en los cuales los genes que codifican para las enzimas PCK y/o PPDK se colocaron solos o juntos bajo el control de un promotor para determinar el efecto, si lo hubiera, de la sobreexpresión de estos genes en la removilización del nitrógeno en hojas senescentes.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un constructo genético que comprende un promotor especifico de senescencia unido de manera operativa por lo menos a una secuencia codificante, que codifica al menos para un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) y/o actividad de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK).

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un constructo génico que comprende un promotor unido de manera operativa por lo menos a una secuencia codificante que codifica para al menos un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) y actividad de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK).

Los inventores creen que las dos enzimas PCK y PPDK podrían tener una función en la interconversión de varios aminoácidos durante la removilización del nitrógeno de las hojas durante la senescencia. Aunque los inventores no desean limitarlo a la hipótesis, una ruta bioquímica especulativa que ilustra cómo pueden afectar la PCK y la PPDK la removilización del nitrógeno se ilustra en la Figura 18. Por lo tanto, ellos consideran que estimular la sobreexpresión de estas dos enzimas en una planta, ya sea de manera independiente o simultánea, durante la senescencia podría desempeñar una función en la removilización del nitrógeno.

Como resultado de sus estudios, los inventores encontraron en forma sorprendente que los constructos según la invención, que codifican para PCK y/o PPDK, dieron como resultado un aumento en los índices de removilización del nitrógeno a partir de las hojas senescentes. Los inventores supusieron que el nitrógeno se puede desplazar de las hojas senescentes en la forma de aminoácidos a las partes más jóvenes de la planta, por ejemplo, a las semillas de la planta. Por otra parte, los inventores también observaron un aumento en la cantidad de crecimiento vegetativo (el cual corresponde a un aumento en el rendimiento del cultivo), cuando estas enzimas se sobreexpresaron en hojas senescentes. Los inventores creen que los constructos según la invención serán útiles en la preparación de una planta transgénica, la cual podría presentar un aumento en los índices de removilización del nitrógeno a partir de hojas senescentes y/o un aumento en el índice de crecimiento.

El promotor en los constructos genéticos del primero o el segundo aspecto de la invención puede ser capaz de inducir ARN polimerasa que se una y comience a transcribir la o las regiones codificantes que codifican para el o los polipéptidos que tienen actividad PCK y/o PPDK.

El promotor presente en el constructo del segundo aspecto de la invención, puede ser constitutivo, no constitutivo o específico de tejido. Ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (completo o trunco), el promotor de rubisco, el promotor de píastoeianina de chícharo, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de unión r/b de clorofila, el promotor de glutenina de alto peso molecular, el promotor de a, ß-gliadina, el promotor de hordeína o el promotor de patatina.

El promotor presente en el constructo del segundo aspecto puede ser un promotor específico de senescencia.

Un "promotor específico de senescencia" (SAG) puede ser un promotor que está asociado con el control de la expresión de un gen asociado a senescencia. Por lo tanto, el promotor puede restringir la expresión de una secuencia codificante (es decir, un gen) a la cual está unido de manera operativa prácticamente en forma exclusiva en tejido en senescencia. Por lo tanto, un promotor específico de senescencia puede ser un promotor capaz de promover de manera preferencial la expresión de un gen en un tejido vegetal y en forma regulada en cuanto a la evolución de manera que la expresión de una región codificante de proteína 3' ocurra prácticamente sólo cuando V el tejido vegetal está desarrollando senescencia. Se apreciará que la senescencia tiende a ocurrir en las partes más viejas de la planta, como las hojas viejas y no en las partes más jóvenes de la planta, como las semillas.

Un ejemplo de una planta que se sabe expresa varios genes asociados con senescencia es la Arabidopsis . Por consiguiente, el promotor en un constructo según el primero o el segundo aspecto, se puede aislar de un gen asociado con senescencia en la Arabidopsis. Gepstein et al. (The Plant Journal, 2003, 36, 629-642) realizaron un estudio detallado de los SAG y sus promotores utilizando la Arabidopsis como modelo. El constructo genético puede contener un promotor de cualquiera de los SAG descritos en este articulo. Por ejemplo, un promotor adecuado se puede seleccionar a partir de un grupo formado por SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 y SAG18 o una variante funcional o un fragmento funcional de los mismos.

Los promotores preferidos son los promotores SAG12 y SAG13. En un modo, el promotor es un promotor SAG12 , el cual será conocido para los técnicos experimentados, o una variante o fragmento funcional del mismo (Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113:313-319). La secuencia de ADN que codifica para el promotor SAG12 aquí se denomina SEQ ID NO. 16, y es la siguiente: TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTA AAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCT AATTATAGCATTG ATTTCTAAATITGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGA ACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTT GTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATAT GATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACA GATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGA GTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTT TTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTG GTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTAT CGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTG TTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAG TTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCA TTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTT ATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCT CTTT GTG AAG AAACT ACTA ATCAC ATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTG AA ATGC AGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGA TTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTC TTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATA GAGATTC G TAGATGAAATTGGTGGG AACATC TTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATAT CGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTG ATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCAC GAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAA AAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACA AGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTA TACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTT AATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAAT CTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATAT AAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAAT AACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTG AACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCAT TTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAAT CACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTAC CCTTCTGAAGT ATCAAATT AGAGC AAAGTCATT ACT GG SEQ ID NO:16 Por lo tanto, el promotor en el constructo de la invención puede comprender una secuencia nucleotidica prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 16, o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. La secuencia del promotor SAG12 se puede obtener de la Arabidopsis thaliana, según se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,689,042. Esta secuencia promotora se puede observar en cada uno de los constructos genéticos según la invención, como se muestra en la Figura 3. En modalidades en las que el promotor es SAG12, se apreciará que el promotor puede comprender cada una de las bases 1-2093 de la SEQ ID NO. 16. Sin embargo, las variantes funcionales o fragmentos funcionales del promotor también se pueden usar en los constructos genéticos de la invención.

Una "variante funcional o fragmento funcional de un promotor" puede ser un derivado o una porción del promotor que sea funcionalmente suficiente para iniciar la expresión de cualquier región codificante que esté unida a él de manera operativa. Por ejemplo, en modos en donde el promotor tiene como base el SAG12, los técnicos experimentados apreciarán que la SEQ ID NO. 16 se puede modificar o que se pueden requerir sólo porciones del SAG12 para que aún asi se iniciara la expresión génica en el constructo.

Las variantes funcionales y los fragmentos funcionales del promotor se pueden identificar con facilidad al evaluar si la trancriptasa se une o no a una región promotora putativa y luego conducir a la transcripción de la región codificante en el polipéptido que tiene actividad PC y/o PPDK. Como alternativa, estas variantes y fragmentos funcionales se pueden examinar realizando mutagénesis en el promotor, cuando esté asociado con una región codificante y evaluar si puede o no llevarse a cabo la expresión génica.

El constructo genético del primer aspecto puede ser capaz de ocasionar, durante la senescencia, la expresión de al menos un polipéptido que presente actividad PCK y/o PPDK. Por lo tanto, el constructo genético puede comprender al menos una secuencia codificante, la cual codifica (i) una fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), o una variante funcional o fragmento funcional de la misma y/o (ii) una piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK), o una variante o fragmento funcional de la misma.

Según se describe en los ejemplos, los inventores han desarrollado una gama de constructos genéticos con base en polipéptidos que tienen actividades de PCK y/o PPDK y estos se muestran en las Figuras 3.

En un primer modo del constructo genético según el primer aspecto, el promotor puede inducir la expresión de una secuencia codificante que codifica un polipéptido que presenta actividad de PCK. En la presente, se le denomina "constructo PCK" y se muestra en la Figura 3. Por consiguiente en el primer modo, el constructo genético puede comprender el promo'tor específico de senescencia y una secuencia codificante que codifica para una fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), o una variante o fragmento funcional de la misma. El constructo genético puede no codificar para un polipéptido que tenga actividad de PPDK.

En un segundo modo del constructo según el primer aspecto, el promotor puede inducir la expresión de una secuencia codificante que codifica para un polipéptido que presenta actividad de PPDK. En la presente, éste se denomina "constructo PPDK" y se muestra en la Figura 3. En el segundo modo, el constructo genético puede comprender el promotor específico de senescencia y una secuencia codificante que codifica para una piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK), o una variante o fragmento funcional de la misma. El constructo genético puede no codificar para un polipéptido que tenga actividad PCK.

En un tercer modo del constructo según el primer aspecto, el promotor puede inducir la expresión de una sola secuencia codificante que codifica para un polipéptido que presenta tanto actividad de PCK como de PPDK. Éste se denomina "constructo 1 PCK/PPDK" . En el tercer modo, el constructo genético puede comprender el promotor específico de senescencia y una secuencia codificante que codifica (i) fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), o una variante o fragmento funcionales de la misma, y (ü) piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK), o una variante o fragmento funcionales de la misma. El constructo del tercer modo puede codificar para un transcrito único que presenta actividad doble, es decir, actividad enzimática de PC y PPDK. La región codificante de PCK se puede ubicar en el lado 3' de la región codificante de PPDK. Sin embargo, de preferencia, la región codificante de PCK está ubicada en el lado 5' de la región codificante de PPDK.

En un cuarto modo del constructo según el primer aspecto, el promotor puede inducir la expresión de (i) una primera secuencia codificante que codifica para un primer polipéptido, el cual presenta actividad de PCK, y (ii) una segunda secuencia codificante que codifica para un segundo polipéptido, el cual presenta actividad de PPDK. Éste se denomina "constructo 2 PCK/PPDK". Por consiguiente, en el cuarto modo, el constructo genético puede comprender al menos un promotor especifico de senescencia y (i) una primera secuencia codificante que codifica para PCK, o una variante o fragmento funcionales de la misma, y (ii) una segunda secuencia codificante que codifica para PPDK, o una variante o fragmento funcionales de la misma, es decir, se codifican dos transcritos, uno para cada enzima.

Como se describe en el Ejemplo 6, los inventores han encontrado que sobreexpresar PCK o PPDK en una célula hospedera (por ejemplo, por transformación ya sea con el "constructo PCK" o con el "constructo PPDK") ocasionó un aumento en la removilización del nitrógeno en hojas senescentes. Por otra parte, encontraron que los constructos PCK y PPDK solos, dieron como resultado un incremento del crecimiento vegetativo.

Según se describe en el Ejemplo 8, los inventores han encontrado que sobreexpresar de manera simultánea tanto PCK como PPDK en una célula hospedera (por ejemplo, por transformación con los dos constructos el "constructo PCK" y el "constructo PPDK" ) es sorpresivamente eficaz para inducir la removilización del nitrógeno en hojas senescentes. En consecuencia, el nitrógeno se puede transportar a partir de las hojas senescentes, por ejemplo, como aminoácidos de transporte. Los aminoácidos de transporte adecuados pueden ser glutamina y/o asparagina.

Por otra parte, sobreexpresar de manera simultánea PCK y PPDK durante la senescencia también puede aumentar el índice de crecimiento, lo cual puede dar como resultado un incremento en el crecimiento vegetativo. De este modo, el constructo del primer aspecto puede comprender una secuencia codificante que codifica tanto PCK como PPDK, o una variante o fragmento funcionales de la misma.

Se apreciará que el constructo del segundo aspecto comprende una secuencia codificante que codifica para PCK y PPDK, o una variante o fragmento funcionales de la misma. Las dos enzimas se puede codificar como un solo polipéptido que tiene doble actividad o como dos polipéptidos , uno que tiene actividad de PCK y el otro que tiene actividad de PPDK.

La fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) o una variante o fragmento funcionales de la misma y la piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) o una variante o fragmento funcionales de la misma, pueden derivarse de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, una planta. La secuencia codificante de cada enzima se puede derivar de una fuente vegetal adecuada, por ejemplo, de la Arabidopsis . Por lo tanto, la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad de PCK, puede derivarse de la Arabidopsis. Por otra parte, la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad de PPDK, puede derivarse de Arabidopsis spp. , Zea spp. , Flaveria spp. o Cleome spp. La seca codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad de PPDK, puede derivarse de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Flaveria trinervia, Flaveria bidentis, Flaveria brownie o Cleome gynandra .

Se cree que existen tres genes en A. thaliana que codifican para PCK. La secuencia de ADN genómico (que incluye intrones y exones) que codifica para un modo de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 17, en la forma siguiente: ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGG TGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGAIAGTGG TCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCT ACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGA AGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTA CTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCAT TTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATIAAATATTTCTGACGTGATA TACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTT TGTTTATTTTTGGAT AGACATTTATGGACAAGT AATGCGCT??TG1GACTATTACCAGAAAA TAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGT GAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCC GGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATICTA C TTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATC TTTCGCCTGCAGGTCAAC AA AAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGAT AATGT??CTGC ACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAG TATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTG GTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGG AAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGT T ATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATA CTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTT TGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGT G TTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATC AAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGT!AAAAT CATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACT GGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGG GGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATT TTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCAT1ACATGACTTCGTCCAC TAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAA ATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTC ATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGT AGAGACAGTACCAACTA GGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATA CAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAG ATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGT CTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTC GAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATC TGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAA ACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTT GATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGT ACAGGTAAAACAATTGT ATTT CTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATT CAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAG AACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCAC ACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCT GAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAA AAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATAT ATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGT GCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCAC AAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTAT GGAAATCGATACAAC AAACGCTGCCTTG AACACATGTTTGTAGGCTATTAAC??GATCTG A ATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATC ATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGAT TTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAG TTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGT TTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTC TGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAG GAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG SEQ ID No:17 La secuencia de ADNc (sólo exones) que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 18, en la forma siguiente: ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGA CCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGAC GATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAA CGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGC TTTGCCGCCGTCTCC GAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACG AGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCA ACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCT GTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTT TATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCG ACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCG GTTGTTAGAGATGCT ACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACAT ACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTT GTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCA GCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAG CTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAAT CGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAA ATGGTIATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATG CATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAA GATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACT GATCAC ACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCG AACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGAT ATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACC AGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATT GAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTT CTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACC ATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAG GAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACA AAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTC AACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACT AGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACC GAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGAC CCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGT CTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG SEO ID No: 18 Por consiguiente, la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad de PCK, puede comprender una secuencia de ácido nucleico prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 17 o en la SEQ ID NO. 18, o una variante o fragmento funcionales de la misma.

La secuencia polipeptídica de la PCK de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 19, en la forma siguiente: MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMP ITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKK RSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKWRGDPAEKKTDGS TTFAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALA TLSGA TGRAPRD RVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVF VNDQYLNWDPE RIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCN RYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSWHYLMPKRRILSLHSGCNMGK DGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPD IWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSD SVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTN IL LACDAFGVLPPVS LNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPT KYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYK T EIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAH DTLV LGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSL RRRFSLLVLSF SEO ID No: 19 Por consiguiente, el polipéptido que tiene actividad de PCK puede comprender una secuencia de aminoácidos prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 19, o una variante o fragmento funcionales de la misma.

Se cree que la Arabidopsis tiene al menos dos formas de PPDK, una forma cloroplástica y una forma citosólica, las dos codificadas por el mismo gen con variaciones menores de corte y empalme en el extremo 5 ' del gen que da lugar a las dos formas. La secuencia de ADN genómico (que incluye intrones y exones) que codifica para las dos formas de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 20, en la forma siguiente: ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGG GTGTTCCGT CGG ATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTT CCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAG ACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAA GCCTTTCCATTTCAA CATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACG TTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACC ATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGC CATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGAT AATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTT ACTCTTGTTT AACAATCGAACGGTTCAAACTAA ACAC CATGTGATGTGAGATC TTTCGGT AGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGA AACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTG AATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAG ATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAA GTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAG ATA CGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTT AAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGT TGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAAT AGCATCGG AGTGGCAGA AGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGAC GAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTT GGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGT TTTTTGATGACG ATCCATCAAAACT ATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATT CGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTT GCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCG AGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTAC CAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCA TTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGA GATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAG TATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTT GAAGGTCTTAGCT TCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCG CTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTT TCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTG ACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTT ATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGT AT TTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGT GGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGT TTATC ATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCT CAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCT GGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGT GATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGG AACTTGCATGACAAGAAAATTCTTT GACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTG AAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGC TGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTT CCITCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAAT GTT AAACGGGGT AATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGG GCTAGCGATTGAAGCGGTATTCG ATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGG AACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTT CTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTT A GGCGAGTTTCTAGTTAA GCTC AGGTTTGGCATC ATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATA TTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAA TGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACA TTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTT TAGTAA T AAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGA ATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGA GATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGT TGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACAT CTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTC A AACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGA ACTAATGGGTT AAGACGTT AGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACG AAC CGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAT TGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGC GTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCT CAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACG CAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGG TTGGGGAAAA1GTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTT GGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAA AAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAAC GGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATT TGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTC CTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGG CGAATGCGGATACACCTGAAGACGCC TTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCT TTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGA TTGTT GTATCCAAATGT TAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTC TTGGAGCAGATAG GATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGAC ATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTT TTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGG TTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTG GACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGA TAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTT TGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAG GCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCG TCAATGCAGGACCAAGGTGT ACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTC AGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGG TCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT G GGTAAATGTAACAAGACAC AAATGTGTTTTAGGC CTTG AACCATGTTGCT TTTGCTAA GTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACG ACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCT CGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCT ATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGAICAGCAAGG TGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTT GGGATATGTGG G AC TGGAGG GATCC TCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTG ACTATGTCTCTTGITCTCCTTTCAGGTAA TGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTA CAACACTATTGTA1AACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT TGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGC?GCTCAAGTAGTTGTTGCATGA SEQ ID No:20 La secuencia de ADNc que codifica para la forma citosólica de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 21, en la forma siguiente: ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAG TCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTG CCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAG CTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATT GGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCC ATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTC GTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTT GATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAG AGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAG GAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCA GATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCG AGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAAC ATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACT AGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTT CTAGTTAATGCTCAGGTT TGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTG GATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATC TTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGA AT GAATTCACAGT CAAGAAGAGAGATTG TGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTT GATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAA CATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTG GTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCG GAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACA AGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGA ATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGT TCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAAT GAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCA TTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATC AGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAA AACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATG TTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTG AGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCITCTCTCGACATCTTGCTT CCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACA ATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATT GTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAG AAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTAT CCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGAC CAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTG GGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCAT ACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT GAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACG TTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATC TTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATG GCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACAT GGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGT TCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA SEQ ID No:21 La secuencia de ADNc que codifica para la forma cloroplástica de la piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 22, de la forma siguiente: ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGT ACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCA AACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGT TTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCC ATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATG AAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCG GTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAA AAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGAC ATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCC GCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTC GTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTT CTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTA GAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTC AAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCT TCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGC CCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTT AACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACAIGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTC ACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAG GTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGAT TTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAAC ATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGA TTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCA GTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCT CAA.CATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAA GTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACG GCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAG ACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGA GGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGT TGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATT AATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAA GCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCA ATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGG AAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAA ATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCA GTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTG CTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTA ACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAAC ATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATA GAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCG TATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAG GACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAA TTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGT CATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCA GATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATG ACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGA ATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAG ATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAA CATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCT TGTTCTCCTTTCAGGGTTCGAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA SEO ID No:22 Por consiguiente, la secuencia codificante que codifica para un polipéptido que tiene actividad de PPDK, puede comprender una secuencia de ácido nucleico prácticamente como la que se establece en las SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 ó SEQ ID NO. 22, o una variante o fragmento funcionales de la misma, La secuencia polipeptidica de la forma citosólica de PPDK de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 23, en la forma siguiente: MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKK LPEGLWEEILEGLSFIERDIGASIJADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVV VGLAA SGERFAYDSFRRFLDMFGDWMGIPHAKFEEKLERMKER GV NDTDLSAADLK ELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRAN YRSINQITGLKGTAVN IQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDL DTMKRFMPEAYAELVENCNILERRYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAV DMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKWAKGLPASPGAAVGQVVFTA EEAEA HSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAWARGWGKCCIAGC SEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMS ADAI RRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNWFGLVFKFFGADRIKAV RKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNI VHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQD QGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIAD EIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIK ATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQWVA SEQ ID No:23 La secuencia polipeptidica de la forma cloroplástica de la PPDK de Arabidopsis se proporciona aquí como SEQ ID NO. 24, en la forma siguiente: MTSMIV TTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSI KTG LHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGN G SLLGG GANLAEMASIGLS VFPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADFSKPLLLSVRSGA AIS PGMMDTVLNLGLNDQVWGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDWMGIPHAKFEEKL ERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDS DS PRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQ VWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTM RFMPEAYAELVENCNILERHY DMMDIEFTVQEER LWMLQCRAG RTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREK WAKGLPASPGAAVGQWFTAEEAEAWHSQG TVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARG GMTSHAAWARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGE ISM GSTGEVILGKQ ALAPPALSPDLETF SWADAIRRLKVMANADTPEDAI AR NGAQGIGLCRTEHMIVCIQ MFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRA DGLPV TIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGIS YPELTE QARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKG HTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLA G ILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSL VGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVS CSPFRVPI RLAAAQVVVA SEQ ID No:24 Por consiguiente, el polipéptido que tiene actividad de PPDK puede comprender una secuencia de aminoácidos prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 23 o SEQ ID NO. 24, o una variante o fragmento funcionales de la misma. Puesto que la mayor abundancia de PPDK se observó casi exclusivamente en lineas celulares que alojan ADN genómico que codifica para PPDK, al parecer los intrones pueden tener un efecto positivo en la expresión de PPDK. Asi, en un modo, el constructo puede comprender el ADNc de genes que codifican para PPDK ylo PCK.

Los constructos genéticos de la invención pueden estar en la forma de un casette de expresión, el cual pueda ser adecuado para la expresión de al menos una secuencia codificante en una célula hospedera. El constructo genético de la invención se puede introducir en una célula hospedera sin que se incorpore en un vector. Por ejemplo, el constructo genético, que puede ser una molécula de ácido nucleico, se puede incorporar dentro de un liposoma o de una partícula viral. Como alternativa, se puede insertar directamente en una célula hospedera por un medio adecuado una molécula de ácido nucleico purificada (por ejemplo, ADN libre de histonas o ADN desnudo), por ejemplo, captación endocitótica directa. El constructo genético se puede introducir de manera directa en las células de un individuo hospedero (por ejemplo, una planta) por transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión de protoplastos o bombardeo balístico. Como alternativa, los constructos genéticos de la invención se pueden introducir directamente en una célula hospedera por medio de un disparador de partículas. Como otra alternativa, el constructo genético se puede alojar dentro de un vector recombinante , para expresión en una célula hospedera adecuada.

Por lo tanto, en un tercer aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende el constructo genético según el primero o el segundo aspecto.

El vector recombinante puede ser un plásmido, cósmido o fago. Estos vectores recombinantes son bastante útiles para transformar células hospederas con el constructo genético de la invención y para replicar allí el casette de expresión. El técnico experimentado observará que los constructos genéticos de la invención se pueden combinar con muchos tipos de vector esqueleto (backbone vector) para fines de expresión. El vector esqueleto puede ser un vector binario, por ejemplo, uno que pueda replicar tanto en E. coli como en Agrobacterium tumefaciens. Por ejemplo, un vector adecuado puede ser un plásmido pBIN, como el pBINl9. Sin embargo, un vector esqueleto preferido es BNP1380000001, el cual tiene como base el pBINPLUS (F.A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290) y aloja al promotor SAG12.

Los vectores recombinantes pueden incluir una variedad de otros elementos funcionales además del promotor (por ejemplo, un promotor asociado con senescencia) y el o las secuencias codificantes (que codifican para PCK y/o PPDK). Por ejemplo, el vector recombinante se puede diseñar de tal manera que se replique en forma autónoma en el citosol de la célula hospedera. En este caso, es posible que se requieran elementos que inducen o regulan la replicación de ADN en el vector recombinante. Como alternativa, el vector recombinante se puede diseñar de tal manera que se integre en el genoma de una célula hospedera. En este caso, se prevén secuencias de ADN que favorezcan la integración buscada (por ejemplo, por recombinación homologa ) .

El vector recombinante también puede comprender ADN que codifica para un gen que se puede usar como marcador seleccionable en el proceso de clonación, es decir, que permita la selección de células que se han transfectado o transformado y que permita la selección de células que alojan vectores que incorporan ADN heterólogo. El vector puede comprender también ADN que participe en la expresión reguladora de la secuencia codificante o que dirija el polipéptido expresado a una cierta parte de la célula hospedera, por ejemplo, el cloroplasto. Por lo tanto, el vector del tercer aspecto comprende al menos un elemento adicional seleccionado a partir del grupo formado por: un gen marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos); una señal de terminación de polipéptido; y una secuencia dirigida a una proteína (por ejemplo, una proteína de tránsito a cloroplasto).

Ejemplos de genes marcadores adecuados incluyen genes de resistencia a antibióticos como los que confieren resistencia a la kanamicina, geneticina (G418) e higromicina (npt-II, hyg-B); genes de resistencia a herbicida como los que confieren resistencia a herbicidas a base de fosfinotricina y sulfonamida (bar y sul, respectivamente; EP-A-242246, EP-A-0249637 ) ; y marcadores de selección como beta-glucuronidasa (GB2197653), luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). El gen marcador se puede controlar mediante un segundo promotor (el cual puede ser un promotor que no tiene relación con la senescencia), que permita la expresión en células, que puede estar o no en la semilla y que por ello permite la selección de células o tejido que contenga el marcador en cualquier etapa de desarrollo de la planta. Los segundos promotores adecuados son el promotor del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium y el promotor derivado del gen que codifica para el transcrito 35S del virus mosaico de coliflor (CaMV). Sin embargo, se puede usar cualquier otro segundo promotor adecuado.

Los diferentes modos de los constructos genéticos de la invención se pueden preparar mediante el procedimiento de clonación ilustrado en la Figura 1, que se puede resumir en la forma siguiente. Las versiones genómicas y de ADNc de los genes que codifican para PCK y PPDK se pueden amplificar a partir de moldes genómicos o de ADNc por PCR con cebadores adecuados. Los productos PCR se pueden analizar por medio de electroforesis en gel de agarosa. Los productos PCR se pueden ligar después a un vector adecuado para clonación, por ejemplo, el vector pCR4 Blunt-TOPO ( Invitrogen) . Los vectores que alojan a los productos PCR se pueden desarrollar en un hospedero adecuado, como E. coli. Las colonias de E. coli después se podrán tamizar por PCR con cebadores adecuados y los insertos en plásmidos que muestren el patrón correcto de digestión con enzimas de restricción se podrán secuenciar mediante cebadores adecuados.

Las colonias de E. coli que portan TOPO-ADNc (PCK o PPDK) o TOPO-gADN (PCK o PPDK) se pueden cultivar para producir una cantidad adecuada de cada plásmido, el cual puede purificarse después. Los plásmidos se podrán someter a digestión para liberar un fragmento de ADN que codifique PPDK o PCK que después se puede clonar en un vector que aloje un promotor adecuado, por ejemplo, un promotor SAG, por ejemplo, un plásmido pBNP. Los constructos PPDK resultantes se denominaron BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA y los constructos PCK resultantes se denominaron pALBNPl (CADN ) y pALBNP2 (gADN).

Los modos del vector según el tercer aspecto de la invención pueden ser prácticamente como se establece en las Figuras 3.

En un cuarto aspecto, se proporciona un método para aumentar la concentración de PCK y/o PPDK en una hoja de una planta de prueba, por arriba de la concentración correspondiente de PCK y/o PPDK en una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta en la planta de prueba para lograr mayores niveles de PCK y/o PPDK en las hojas de la planta después del comienzo de la senescencia.

En un quinto aspecto, se proporciona un método para disminuir la concentración de nitrógeno en las hojas de una planta de prueba por debajo de la concentración de nitrógeno correspondiente a una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta en la planta de prueba para lograr mayores niveles de PCK y/o PPDK en las hojas de la planta después del comienzo de la senescencia.

En un sexto aspecto, se proporciona un método para aumentar el índice de crecimiento de una planta de prueba comparado con el correspondiente índice de crecimiento de una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta en la planta de prueba para lograr mayores niveles de PCK ylo PPDK en las hojas de la planta después del comienzo de la senescencia.

Los métodos para determinar el nivel de nitrógeno en las hojas de la planta y los índices de crecimiento, se establecen en los ejemplos. Los métodos del cuarto, quinto o sexto aspectos pueden consistir en transformar una célula de la planta de prueba con un constructo genético según el primero o segundo aspecto o un vector según el tercer aspecto. El constructo genético o el vector se pueden introducir en una célula hospedera por cualquier medio que sea adecuado.

En un séptimo aspecto, se proporciona una célula que comprende el constructo genético según el primero o el segundo aspecto, o el vector recombinante según el tercer aspecto.

La célula puede ser una célula vegetal. Ya que los inventores han observado que la sobreexpresión de PCK y/o PPDK en una célula hospedera es sorprendentemente eficaz para inducir la removilización de nitrógeno en hojas senescentes, la célula de séptimo aspecto puede comprender uno o más constructos del primer o segundo aspecto, o uno o más vectores del tercer aspecto, de manera que la PCK y/o PPDK se sobreexpresen.

Por ejemplo, la célula hospedera se puede transformar sólo con el primer modo del constructo genético del primer aspecto (es decir, del constructo PCK). Como alternativa, la célula hospedera se puede transformar sólo con el segundo modo del constructo genético del segundo aspecto (es decir, el constructo PPDK). En otro modo, la célula hospedera se puede transformar con el primero y el segundo modo del constructo genético del primer aspecto, de manera que tanto la PCK como la PPDK se expresen en la célula hospedera. La célula hospedera, como alternativa, se puede transformar con el tercero o cuarto modos del constructo del primer aspecto (es decir, constructos 1 ó 2 PCK/PPDK), de manera que tanto la PCK como la PPDK se expresen en la célula hospedera. También se prevé que la célula hospedera se pueda transformar con el constructo del segundo aspecto, el cual codifica tanto para PCK como para PPDK.

La célula se puede transformar con el constructo genético del vector según la invención mediante las técnicas conocidas. Los medios adecuados para introducir el constructo genético en la célula hospedera pueden incluir el uso de un vector Ti-plásmido desarmado que sea portado por Agrobacterium mediante los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, según se describe en los documentos EP-A-0116718 y EP-A-0270822. Otro método puede consistir en transformar un protoplasto vegetal, el cual primero incluye retirar la pared celular e introducir el ácido nucleico y luego restaurar la pared celular. La célula transformada se puede desarrollar después en una planta.

En un octavo aspecto, se proporciona una planta transgénica que comprende el constructo genético según el primero o el segundo aspecto, o el vector según el tercer aspecto.

La planta transgénica según el octavo aspecto puede incluir a la familia Brassicaceae , como Brassica spp. La planta puede ser Brassica napus (nabo de semilla oleaginosa) .

Otros ejemplos de plantas transgénicas según el octavo aspecto incluyen a la familia Poales, como Triticeae spp. La planta puede ser Triticum spp. (trigo). Aumentar el contenido de prote na en el grano de trigo puede dar como resultado el incremento en el volumen de productos alimenticios constituidos por trigo, como el pan.

Otros ejemplos de plantas transgénicas adecuadas según el octavo aspecto, incluyen la familia de plantas Solanaceae que incluye, por ejemplo, estramonio o toloache (jimson weed) , berenjena (eggplant) , mandrágora (Mandrake), belladona (deadly nightshade) , capsicum (paprika, chile (chilli pepper)), papa y tabaco. Un ejemplo de un género adecuado de Solanaceae es la Nicotiana. Especies adecuadas de Nicotiana pueden ser la planta de tabaco o simplemente tabaco. Se conocen varios métodos para transformar plantas con el constructo genético del primer o segundo aspecto, o el vector del tercer aspecto, y pueden utilizarse en la presente invención.

Por ejemplo, el tabaco se puede transformar de la manera siguiente. La Nicotiana tabacum se transforma mediante el método de cultivo concurrente de disco foliar (leaf disk co-cultivation) , básicamente como lo describe Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985). Se pueden tomar de plantas de tabaco de 7 semanas de edad, las dos hojas expandidas más jóvenes y se pueden esterilizar en la superficie en Domestos® 8% durante 10 minutos y lavarse 6 veces con agua destilada. Los discos foliares se pueden cortar con un sacacorchos del Núm. 6 y colocarse en la suspensión de Agrobacterium que contiene los vectores binarios apropiados (según la invención), durante alrededor de dos minutos. Los discos se pueden secar con cuidado entre dos hojas de papel filtro estéril. Se pueden colocar 10 discos en placas LS con sacarosa 3 % + 2 µ? BAP + 0 . 2 µ NAA, las cuales después se incubarán durante dos días en el cuarto de crecimiento. Los discos se pueden transferir a placas LS con sacarosa 3 % + 2 µ? BAP + 0 . 2 µ? NAA suplementadas con 500 g/1 de claforan y 100 g/ 1 de kanamicina. Después de dos semanas, los discos se pueden transferir a placas nuevas con el medio ya mencionado. Después de otras dos semanas, los discos foliares se pueden transferir a placas que contienen LS + sacarosa 3 % + 0 . 5 µ? BAP suplementado con 500 mg/ 1 de claforan y 100 mg/ 1 de kanamicina. Los discos foliares se pueden transferir cada dos semanas a medio nuevo. A medida que aparecen los brotes o retoños, se extirpan y se transfieren a frascos de LS + sacarosa 3 % suplementada con 500 mg/ 1 de claforan. Los brotes en los frascos se pueden transferir a LS + sacarosa 3 % + 250 mg/ 1 de claforan después de alrededor de 4 semanas. Después de otras 3 a 4 semanas, las plantas se pueden transferir a LS + sacarosa 3 % (sin antibióticos) y enraizarse. Una vez que las plantas enraizan se pueden transferir a la tierra en el invernadero.

En un noveno aspecto, se proporciona un producto de propagación vegetal susceptible de obtenerse a partir de la planta transgénica según el octavo aspecto.

Un "producto de propagación vegetal" puede ser cualquier materia vegetal extraída de una planta a partir de la cual se pueden producir más plantas. De preferencia, el producto de propagación será una semilla.

En un décimo aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una planta transgénica que removiliza nitrógeno en un mayor grado que la correspondiente planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consta de los siguientes pasos: i) transformar una célula vegetal con el constructo genético según el primero o el segundo aspecto o el vector según el tercer aspecto; y ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

En un décimo primer aspecto, se proporciona un método para producir una planta transgénica que tiene mayor grado de crecimiento que la correspondiente planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consta de los siguientes pasos: i) transformar una célula vegetal con el constructo genético según el primero o el segundo aspecto o el vector según el tercer aspecto; y ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada .

De preferencia y en forma ventajosa, los métodos según la invención no comprometen la salud o el buen estado de la planta de prueba que se genera. De preferencia, los métodos consisten en transformar la planta de prueba y de preferencia sus hojas con el constructo genético del primero o el segundo aspecto o el vector del tercer aspecto. Los inventores han observado que la sobreexpresión de PCK y PPDK en una célula hospedera, es eficaz para inducir la removilización del nitrógeno en hojas senescentes. Por lo tanto, se prefiere que los métodos del décimo y onceavo aspectos consistan en transformar la planta de prueba con uno o más constructos de la invención para que tanto PCK como PPDK se sobreexpresen. Por ejemplo, la planta de prueba se puede transformar con el primer modo del constructo genético del primer aspecto de la invención (es decir, el constructo PCK) y además el segundo modo del constructo del primer aspecto (es decir, el constructo PPDK) . Por lo tanto, la transformación de estos dos constructos da como resultado la sobreexpresión de las dos enzimas. Como alternativa, la planta de prueba se puede transformar con el tercero o cuarto modos del constructo del primer aspecto de la invención, cada uno de los cuales que codifica para PCK y PPDK. Como alternativa, la planta de prueba se puede transformar con el constructo del segundo aspecto de la invención, el cual que codifica tanto para PCK como para PPDK.

Los inventores han observado que una hoja de la planta de prueba que se ha transformado con el o los constructos que codifican para PCK y PPDK muestra incrementos en la removilización del nitrógeno cuando aparece la senescencia de manera que la concentración de nitrógeno diminuye en esa hoja. Por otra parte, observaron un aumento en el índice de crecimiento vegetativo. Aunque no lo limitan a la hipótesis, los inventores creen que la disminución de nitrógeno en las hojas puede inducir un aumento en el índice de crecimiento y por consiguiente en el rendimiento del cultivo.

En un decimosegundo aspecto de la invención, se proporciona una hoja cosechada que contiene un nivel de nitrógeno más bajo que el nivel correspondiente de nitrógeno en una hoja cosechada de una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, en donde la hoja se cosecha a partir de la planta transgénica según el octavo aspecto o se produce por el método según el aspecto décimo o decimoprimero.

En un décimo tercer aspecto de la invención, se proporciona un artículo para fumar que contiene tabaco reducido en nitrógeno, obtenido de una planta de tabaco imitante, esta mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrógeno en hojas senescentes.

El tabaco reducido en nitrógeno puede incluir tabaco en el que la concentración de nitrógeno es menor que la correspondiente concentración en una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones. Este artículo para fumar puede contener tabaco obtenido a partir de una planta de tabaco mutante que pudo haber sido transformada con un constructo genético según el primero o el segundo aspecto de la invención o un vector según el tercer aspecto.

En el sentido que se utiliza en la presente, el término "artículo para fumar" puede incluir productos que se fuman, como tabaco para enrollar, cigarros, puros y cigarrillos de tabaco, derivados de tabaco, tabaco expandido, tabaco reconstituido o sustitutos de tabaco y también productos que no se consumen por combustión.

Se observará que la invención abarca cualquier ácido nucleico o péptido o variante, derivado o análogo de los mismos, que contenga prácticamente las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de cualquiera de las secuencias mencionadas aquí, incluidas las variantes funcionales o fragmentos funcionales de las mismas. Los términos "prácticamente la secuencia de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido" , "variante funcional" y "fragmento funcional", se refiere a una secuencia que tenga al menos 40% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos de cualquiera de las secuencias mencionadas aquí, por ejemplo, 40% de identidad con el gen identificado como SEQ ID NO. 17 (que codifica para un modo de la enzima PCK) o 40% de identidad con el polipéptido identificado como SEQ ID NO. 19 (es decir, un modo de la enzima PCK) o 40% de identidad con el gen identificado como SEQ ID NO. 21 (que codifica para un modo de la enzima PPDK) o 40% de identidad con el polipéptido identificado como SEQ ID NO. 23 (es decir, un modo de la enzima PPDK).

También se prevén las secuencias de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido con una identidad de secuencia que sea mayor de 65%, con más preferencia mayor de 70%, aun con más preferencia mayor de 75% y todavía con mayor preferencia mayor de 80% de identidad de secuencia respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas en la presente. De preferencia la secuencia de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido tiene al menos 85% de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas, con más preferencia al menos 90% de identidad, aun con mayor preferencia al menos 92% de identidad, aun con más preferencia al menos 95% de identidad, aun con más preferencia al menos 97% de identidad, aun con más preferencia al menos 98% de identidad y con la máxima preferencia al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas aquí.

El técnico experimentado sabrá cómo calcular el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido. Para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido, primero se tiene que preparar una alineación de las dos secuencias y después el cálculo del valor de identidad de secuencia. El porcentaje de identidad para las dos secuencias puede tener diferentes valores dependiendo de. (i) el método utilizado para alinear las secuencias, por ejemplo, Clustalw, BLAST, FASTA, Smith-Waterman ( implementado en diferentes programas) o alineación estructural por comparación en 3D; y (ü) los parámetros utilizados por el método de alineación, por ejemplo, alineación global frente a local, la matriz de puntuación de par utilizada (por ejemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet, etc.) y penalización por gap, por ejemplo, forma funcional y constantes.

Una vez hecha la alineación, existen diferentes maneras de calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Por ejemplo, uno es dividir el número de identidades entre: (i) la secuencia más larga o la más corta; (ii) la longitud de la alineación; (iii) la longitud media de la secuencia; (iv) el número de posiciones no-gap; o (iv) el número de posiciones de equivalencia excluyendo salientes. Por otra parte, se apreciará que el porcentaje de identidad también es muy dependiente de la longitud. Por lo tanto, mientras más corto es un par, mayor es la identidad de secuencia que se puede esperar que suceda por casualidad.

Por consiguiente, se apreciará que la alineación exacta de una proteína o secuencias de ADN es un proceso complejo. El popular programa de alineación múltiple ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) es una forma preferida para generar alineación múltiple de proteínas o ADN según la invención. Los parámetros adecuados para ClustalW pueden ser los siguientes: para alineación de ADN: penalización Gap Open Penalty = 15.0, penalización Gap Extensión Penalty = 6.66 y Matrix = Identidad. Para alineación de proteínas: penalización Gap Open Penalty = 10.0, penalización Gap Extensión Penalty = 0.2 y Matrix = Gonnet. Para alineación de ADN y proteína: ENDGAP = -1 y GAPDIST = 4. Los expertos en la técnica sabrán que puede ser necesario variar estos y otros parámetros para óptima alineación de secuencia.

De preferencia, el cálculo del porcentaje de identidades de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido se calcula entonces a partir de una alineación como (N/T)*100, en donde N es el número de posiciones en las que las secuencias comparten un residuo idéntico y T es el número total de posiciones comparadas incluidos los gaps pero excluyendo las salientes ( overhangs) . Por lo tanto, el método de máxima preferencia para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias consiste en (i) preparar una alineación de secuencia utilizando el programa Clustal con un grupo adecuado de parámetros, por ejemplo, como los que se establecieron en lo anterior; y (ii) insertar los valores de N y T en la siguiente fórmula: Identidad de secuencia = (N/T)*100.

Los expertos en la técnica tendrán conocimiento de métodos alternativos para identificar secuencias similares. Por ejemplo, una secuencia nucleotldica prácticamente similar será codificada por una secuencia que se hibride a las secuencias que se presentan en las SEQ ID Núm. 16, 17, 18, 20, 21, 22 o sus complementos en condiciones rigurosas. Con condiciones rigurosas, nos referimos a que el nucleótido se híbrida al ADN unido a filtro ( filter-bound) o al ARN en cloruro de sodio 3x/citrato de sodio (SSC) a una temperatura alrededor de 45°C seguido de al menos un lavado en SSC 0.2x/SDS 0.1% a una temperatura alrededor de 20 a 65°C. Como alternativa, un polipéptido prácticamente similar puede ser diferente en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 o 100 aminoácidos de las secuencias que se muestran en las SEQ ID NO. 19, 23 o 24.

Debido a la degeneración del código genético, es evidente que cualquier secuencia de ácido nucleico podría variar o cambiar sin que esto afecte de manera considerable la secuencia de la proteína codificada por ella y se obtenga así una variante funcional de la misma. Las variantes de nucleótido adecuadas son aquellas que tienen una secuencia alterada por la sustitución de diferentes codones que codifican para el mismo aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Otras variantes adecuadas son aquellas que tienen secuencias nucleotídicas homólogas pero que comprenden toda o porciones de secuencia que son alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican para un aminoácido con una cadena lateral de propiedades biofísicas similares a las del aminoácido que sustituye, con lo cual se obtiene un cambio conservativo. Por ejemplo, los aminoácidos hidrofóbicos no polares pequeños incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina y metionina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares, grandes, incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen serina, treonina, ciste na, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo tanto, se podrá apreciar cuáles aminoácidos pueden ser sustituidos con aminoácidos que tengan propiedades biofísicas similares y el técnico experimentado tendrá conocimiento de las secuencias nucleotídicas que codifican para estos aminoácidos .

Todas las particularidades descritas aquí (incluidas las reivindicaciones, resumen y dibujos adjuntos) y/o todos los pasos de cualquier método o proceso así expuesto, se pueden combinar con cualquiera de los aspectos en cualquier combinación con excepción de las combinaciones en las que al menos alguna de estas particularidades y/o pasos sean recíprocamente excluyentes.

Para una mejor comprensión de la invención y para mostrar cómo se pueden llevar a la práctica los modos de la misma, se hará referencia ahora, a manera de ejemplo, a las figuras adjuntas, en las que: La Figura 1 muestra el protocolo utilizado para clonar los constructos genéticos, BNP-PPDKcDNA y BNP- PPDKgDNA: (a) amplificación PCR de las formas de ADNc y genómico de la isoforma cistólica de Arabidopsis PPDK; (b) inserción en el vector de clonación pCR 4Blunt-T0P0; (c) digestión con endonucleasa de restricción del vector de clonación (a la izquierda) para liberar PPDK y el vector pBNP que contiene el promotor SAG12 como blanco, con Avrll y BamHI (a la derecha); (d) ligación de PPDK a pBNP y un gel de agarosa que muestra fragmentos de ADN producidos por digestión con endonucleasa de restricción de constructos con Avrll y BamHI; y (e) constructos introducidos en Arabidopsis ecotipo Columbia 0 por transformación mediada por Agrobacterium; la Figura 2a muestra el plásmido pCR4BLUNT-TOPO usado para la construcción de vectores de expresión según la invención y la Figura 2b es una tabla que resume que el ADNc que codifica para PPDK o gADN se insertó en pCR4BLUNT-TOPO utilizando el producto de digestión de Avrll y BamHI; la Figura 3a muestra el plásmido pBNP que contiene el promotor SAG12 y la Figura 3b es una tabla que resume que los insertos de PPDK (ADNc o ADNg) se introdujeron en pBNP utilizando digestos Avrll y BamHI y que los insertos de PCK (ADNc o ADNg) se introdujeron en pBNP utilizando digestos Xbal y Sacl, obteniéndose vectores según los modos de la invención; la Figura 4 muestra la selección de líneas celulares transgénicas SAG12-PPDK Arabidopsis thaliana por transferencia Western. Las líneas celulares SAG12-PPDK cDNA se muestran en la parte superior y las líneas celulares SAG12-PPDK gDNA se muestran en la parte inferior; la Figura 5 muestra la cuantificación de la abundancia de PPDK en líneas tipo silvestre, APPDK y cinco lineas independientes SAG12-PPDKgDNA a partir de cinco semanas en adelante; la Figura 6 muestra la selección de SAG12-PPDK (cDNA y gDNA) en líneas de tabaco (b) K326 y en (c) Burley 21. la Figura 7 muestra la sobreexpresión de PPDK en hojas maduras de tabaco K326; la Figura 8 muestra fotos de rosetas de varias líneas celulares de Arabidopsis thaliana, es decir, tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgDNA frente al tiempo; la Figura 9 muestra la masa de tejido reproductivo de Arabidopsis en la semana nueve; la Figura 10 muestra la masa fresca total de la planta (es decir, roseta más tejido reproductivo) de plantas tipo silvestre y SAG12-PPDKgDNA a partir de la semana tres a la nueve después de la siembra; la Figura 11 muestra el contenido de nitrógeno en hojas de tipo silvestre de plantas tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgDNA a la semana siete; la Figura 12 muestra el contenido de nitrógeno de semillas individuales de plantas tipos silvestre, APPDK y SAG12-PPDK; la Figura 13 muestra el contenido total de aminoácidos libres en las hojas de líneas celulares tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgDNA Arabidopsis; la Figura 14 muestra la masa de semillas de varias líneas celulares de tabaco, copia cero = tipo silvestre, G4 (gDNA), G10, G8 y CIO (cDNA) son líneas SAG12-PPDK; la Figura 15 muestra el contenido de nitrógeno en la semilla de varias líneas celulares de tabaco, copia cero = tipo silvestre, G4 (gDNA), G10, G8 y CIO (cDNA) son líneas SAG12-PPDK; la Figura 16 muestra los resultados de la transferencia Western para insertos dobles PCK/PPDK. Todas las líneas muestran niveles más altos de PCK en especial en la semana 7 que se correlacionan con la actividad del promotor SAG12 ; la Figura 17 muestra que la expresión de PCK y PPDK en plantas transformadas da lugar a un aumento en la masa de rosetas en comparación con el control 7; y la Figura 18 muestra una vía bioquímica propuesta que indica que la removilización del nitrógeno puede ocurrir a través de la formación dependiente de PCK y PPDK de los aminoácidos de transporte asparagina y glutamina.

Ejemplos Ejemplo 1 - Generación de constructos de transformación vegetal promotor SAG12 Arabidopsis PPDK Se generó una serie de vectores de expresión SAG12 PPDK y PCK, como se muestra en la Figura 3 y luego se analizaron respecto a su habilidad para aumentar la expresión de PPDK y PCK en plantas transformadas. En un modo, los constructos pueden codificar para PCK o una variante o fragmento funcionales de la misma y no para PPDK. En otro modo, los constructos pueden codificar para PPDK o una variante o fragmento funcionales de la misma y no para PCK. Sin embargo, en otro modo más, los constructos pueden codificar para PCK o una variante o fragmento funcionales de la misma y para PPDK o una variante o fragmento funcionales de la misma. En primer lugar, se aisló el ADN genómico para el gen PPDK de Arabidopsis thaliana, tal como se describe a continuación.

Aislamiento de ADN genómico El ADN genómico (gDNA) de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbra 0 se extrajo de la hojas por medio del estuche DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) y según el protocolo recomendado. El ADN genómico se usó como molde para reacciones PCR como se describe adelante utilizando las secuencias cebadoras resumidas en la Tabla 1.

Tabla 1: Secuencias cebadoras Cebador Secuencia SEQ ID NO.

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc El ARN total se extrajo de cotiledones de Arabidopsis de 7 días de edad. Las extracciones de ARN se realizaron sobre hielo utilizando un equipo libre de RNasa y se hicieron las soluciones con agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma-Aldrich) . Se adicionó 1 mL de DEPC por 1 litro de agua, la mezcla se agitó durante la noche en una campana y luego se colocó en la autoclave. El ARN se extrajo con reactante TriPure isolation Reagent (Roche). 200 mg de tejido se molieron en mortero y en atmósfera de nitrógeno líquido, se adicionó 1 mL de reactante TriPure Isolation Reagent y se procedió conforme al protocolo recomendado. El glóbulo de ARN se resuspendió en 20 µ? de RNA Secure (Ambion) precalentado a 60°C durante 10 minutos. La muestra se centrifugó a 4°C durante 5 minutos a 13000 rpm y el sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi limpio para eliminar la materia de desecho contaminante.

La cantidad y la pureza del ARN se determinaron por espectrofotometría haciendo las lecturas a 260 y 280 nm (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory) en un espectrofotómetro Eppendorf Biophotometer . El ARN también se analizó en electroforesis en gel de agarosa con agarosa 1.5% (p/v) (Melford Laboratories) en 0.5 x TBE. Las muestras se suspendieron en amortiguador de la muestra ARN lx y se sometió a electroforesis a 80 V con 0.5 x TBE como amortiguador de corrida. El amortiguador de la muestra de ARN a una concentración de trabajo 4x contenía 0.002% (p/v) de bromuro de etidio ( Sigma-Aldrich) , 2x TBE (amortiguador 2x Tris-borato-EDTA (2x TBE) contenía 180 mM de Tris-HCl, 180 mM de ácido bórico y 8 mM de EDTA pH 8.3, Ficoll 400 13% (Sigma-Aldrich), 0.01% de azul bromofenol y 7M de Ures (Fisher Scientific).

La transcripción inversa de ARN para sintetizar ADNc se realizó con 2 µg de ARN, 1 µg de cebador Oligo dT(15) (Roche), amortiguador de virus lx Moloney Murine Leukaemia Virus (MMLV) (Promega), 0.4 mM dNTPs (Bioline), 40 unidades de inhibidor Recombinant RNasin Ribonuclease (Promega), 200 unidades de transcriptasa inversa MMLV (Promega) y agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 25 µ?. La muestra se incubó a 42 °C durante 1 hora.

Amplificación de Arabidopsis PPDK Las versiones de ADNc y ADN genómico del gen que codifica para la isoforma citosólica de PPDK se amplificaron a partir de los moldes de ADNc o ADN genómico por PCR utilizando un cebador de avance (forward primer) (AtCytFWD-AvrlI . SEQ ID NO. 1) que contenía el sitio de restricción Avrll y un cebador inverso (reverse primer) (AtCytREV-BaTiHl ) . SEQ ID NO. 2) que contenía en sitio de restricción BamHI, los cuales se muestran en la Tabla 1. La mezcla de reacción PCR contenía amortiguador 1 x HF (NEB), 2 mM de cloruro de magnesio (MgCl2, NEB), 0.5 mM de dNTPs (Bioline), 100 ng de molde (ADNc o ADN genómico), 0.5 µ? de cada cebado y 1 unidad de ADN polimerasa Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). El ciclo térmico se realizó en un equipo Techne Thermal Cycler con un paso de desnaturalización inicial de 98°C durante 30 segundos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos, con un paso de extensión final de 72°C durante 5 minutos.

Una vez que el ADNc y ADNg de PPDK Arabidopsis se habían aislado y preparado, se utilizaron para generar varios constructos según el protocolo que se resume en la Figura 1. Las formas de ADNc y ADN genómico de la forma citosólica de PPDK Arabidopsis se fusionaron con el promotor SAG12 inducido por senescencia en un vector pBNP con la finalidad sobreexpresar PPDK durante la senescencia. (a) Amplificación por PCR de las formas ADNc y ADN genómico de la isoforma citosólica de PPDK Arabidopsis utilizando cebadores que contienen sitios de restricción Avrll y Bairiñl, que generan productos 2.4 y 4.3 kb, respectivamente. (b) Inserción en el vector de clonación pCR 4Blunt-TOPO. Los insertos PPDK se secuenciaron en su totalidad y se encontró que eran idénticos a las secuencias esperadas . (c) Digestión con endonucleasa de restricción del vector de clonación y el vector de destino pBNP con Avrll y Bamñl . (d) Ligación en BNP y gel de agarosa que muestra fragmentos de ADN producidos por la digestión con endonucleasa de restricción de constructos con Avrll y Baití l. Los tamaños de banda esperados fueron 14.8 kb y 2.4 kb para el constructo ADNc y 14.8 kb y 4.4 kb para el constructo de ADNg. (e) Constructos introducidos en Arabidopsis ecotipo Columbra 0 por transformación mediada por Agrobacterium. Los constructos se secuenciaron a través de los sitios de ligación. El gen nptll codifica para neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a kanamicina en plantas. LB y RB: los bordes izquierdo y derecho, respectivamente, de T-DNA; nos Pro: promotor de nopaline synthase; nos t: terminador de nopaline synthase; SAG12 Pro: promotor del gen SAG12 Arabidopsis.

Con relación a la Figura 1, la generación de constructos se describirá con detalle a continuación: Clonación en el vector pCR 4Blunt-TOPO Los productos PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v), bromuro de etidio 0.5 µg mi-1 (Sigma-Aldrich) en 0.5 x TBE. Las muestras se suspendieron en 1 x amortiguador de muestra de ADN (DNA Sample Buffer a una concentración de trabajo 6x que contenía 50 mM de Tris ( hidroximetil ) aminometano (Tris-HC1, Melford Laboratories), 60% de glicerol y 0.25% de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich) y se sometió a electroforesis a 80 V con 0.5 x TBE como amortiguador de corrida.

La banda PPDK ADNc de 2.6 kb y la banda ADN genómico PPDK de 4.4 kb se purificaron con QIAQuick PCR Purification Kit (Qiagen) según el protocolo recomendado y se eluyeron con 30 µ? de agua grado biología molecular (BDH Laboratory Supplies). Los productos PCR se ligaron (blunt-end) en el vector pCR 4Blunt-TOPO (Invitrogen) según el protocolo recomendado. La reacción de clonación (2 µ?) se transformó en 50 µ? de E. coli con eficiencia de subclonación DH5a (Invitrogen) según el procedimiento recomendado. Las células de E. coli transformadas se cultivaron a 37°C durante la no cargada en agar Luria-Bertani (LB) (Luria Bertani Broth (medio LB)) que contenía 10 g l"1 de Bacto-Tryptone (BD), 5 g l"1 de Bacto-Yeast Extract (Oxoid) y 85 mM de cloruro de sodio (Fisher Scientific). El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de sodio 10 M antes de introducirlo a la autoclave. El agar LB se hizo adicionando agar (BD) 1.5% (p(v) al medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina (Melford Laboratories).

Las colonias de E. coli se tamizaron por medio de PCR utilizando amortiguador 1 x NH4 (Bioline), 2.5 mM de MgCl2 (Bioline), 0.5 mM dNTPs (Bioline), 0.3 µ de cada cebador (AtCytFWD-Av.rH y AtCytREV-BamHI ) , es decir, SEQ ID NO. 1 y 2 y 0.5 unidades de BioTaq Na Polimerasa (Bioline). El ciclo térmico se realizó con un paso de desnaturalización inicial de 95°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 4 minutos 30 segundos, con un paso de extensión final de 72°C durante 5 minutos. Los productos PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) como en lo anterior. Las colonias que contenían el inserto deseado se cultivaron durante la noche en un incubador con agitación a 37°C en 5 mi de medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina. El ADN plásmido se extrajo con el estuche QIAPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen) según el protocolo recomendado. El ADN se sometió a digestión con 10 unidades de Bamül (NEBI) en 1 x amortiguador BairiRl a 37°C durante 1 hora. Los digestos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) como en lo anterior. Los insertos en los plásmidos que mostraron el patrón correcto del digesto enzimático de restricción se secuenciaron utilizando los cebadores AtCytFWD-AvrlI (SEQ ID NO. 1), AtPPDKSeqFl (SEQ ID NO. 3), AtPPDKSeqF2 (SEQ ID NO. 4), AtPPDKSeqRl (SEQ ID NO. 5), AtPPDKASeqR2 (SEQ ID NO. 6) y AtCytREV-BajnHI (SEQ ID NO. 2), que se muestran en la Tabla 1, por medio de un equipo 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) . Las secuencias se analizaron en BioEdit (Ibis Biosciences).

Estos constructos se denominaron TOPO-PPDKcDNA y TOPO-PPDKgDNA y se ilustran en las Figuras 2a y 2b.

Clonación de constructos pBNP El PPDK se ligó en el vector binario BNP1380000001 bajo el control del promotor SAG12 inducido por senescencia. El plásmido esqueleto BNP1380000001 que conten a el SAG12, tiene como base pBINPLUS (F.A. van Engelen et al., Transgenic Research (1995) 4, 288-290) y se ilustra en la Figura 3a. Primero, se usaron colonias de E. coli portadoras de TOPO-cDNA o TOPO-gDNA para inocular 25 mi de medio LB que conten a 50 g mi"1 de kanamicina. Estos cultivos se incubaron durante la noche en un incubador de agitación a 37°C y el ADN plásmido se extrajo con el estuche Plasmid Midi Kit (Qiagen) según el protocolo recomendado el vector pBNPl380000001 se purificó a partir de 100 mi de cultivo que conten a 50 g mi"1 de kanamicina con el estuche Plasmid Midi Kit.

Estos plásmidos se sometieron luego a digestión con enzimas de restricción Avrll y Ba/nHI. Los productos de digestión se incubaron durante la noche a 37°C y contenían cada uno 2 µg de ADN (BNP) o 4 de ADN (TOPO-PPDKcDNA y TOPO-PPDKgDNA) , 1 x amortiguador 2, 10 unidades de Avrll y 10 unidades de BaitíRT . Las muestras se separaron por electroforesis en gel de agarosa con violeta cristal (Rand, 1996, Crystal violet can be used to visualize DNA bands during gel electrophoresis and to improve cloning efficiency. Elsevier Trends Journals Technical Tips Online) utilizando agarosa 0.8% (p/v), 0.5 x TBE y 25 µ? de violeta cristal (Hopkin y Williams) y realizando la electroforesis a 50 V durante alrededor de 2 horas con amortiguador de muestra violeta cristal (250 µ? de violeta cristal (Hopkin y Williams) y 30% de sacarosa (p/v) (Fisher Scientific) y 0.5 x TBE con 25 µ? de violeta cristal como amortiguador de corrida. La extracción de la banda de gel se hizo con el equipo QlAQuick Gel Extraction Kit (Qiagen) según el protocolo recomendado para extraer los fragmentos 14.4 kb BNP, 2.6 kb cDNA PPDK y 4.4 kb ADN genómico PPDK. Los fragmentos se inspeccionaron y se cuantificaron con HyperLadder I (Bioline) por electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio.

Debido a los tamaños similares del fragmento de ADN genómico (4.4 kb) y del esqueleto TOPO (3.9 kb), el fragmento de ADN genómico extraído en gel se trató con fosfatasa para prevenir la ligación con algún esqueleto TOPO contaminante. Se adicionó fosfatasa alcalina de camarón (SAP, 1 unidad, Roche) a 1 µg de fragmento de ADN genómico extraído en gel en amortiguador de desfosforilación 1 x (Roche) y la reacción se incubó a 37°C durante 30 minutos y luego se inactivó a 65°C durante 10 minutos. Las reacciones de ligación se realizaron con el ADNc o el fragmento de ADN genómico con el BNP digerido en una relación molar 10:1, amortiguador de ligación 1 x (NEB) y 1 unidad de T4DNA ligasa (NEB). Las reacciones de ligación se incubaron durante la noche a 16°C y se usaron 2 µ? para transformar la E. coli eficiencia DH5 de la genoteca (Invitrogen) según el protocolo recomendado.

Las E. coli transformadas se transfirieron al agar LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina y se incubaron durante la noche a 37°C. Las colonias de E. coli se tamizaron por PCR utilizando amortiguador NH4 lx, 2.5 mM de MgCl2, 0.5 mM dNTPs, 0.3 µ de cada cebador (AtPPDKexonl5F D (SEQ ID NO. 7) y BNPnostREV (SEQ ID NO. 8)), que se muestran en la Tabla 1 y 0.5 unidades de BioTaqDNA polimerasa. El ciclo térmico se realizó con un paso de desnaturalización inicial de 95°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 3 minutos, con un paso de extensión final de 72°C durante 5 minutos. Los productos PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) como en lo anterior. Las colonias que contenían el inserto deseado se cultivaron durante la noche en un incubador con agitación a 37°C en 5 mi de medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina. El ADN plásmido se extrajo con el estuche QiAPrep Spin Miniprep Kit según el protocolo recomendado. El ADN se sometió a digestión con 10 unidades de Ba-TiHI y 10 unidades de Stul en amortiguador Bairiñl lx a 37°C durante 1 hora antes de someterse a electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) como en lo anterior. Se seleccionó una colonia resultante de cada una las ligaciones de ADNc y ADN genómico que muestran el patrón correcto de digestión enzimática de restricción y se secuenciaron con el cebador BNP-SAG12FWD (SEQ ID NO. 9), que se muestra en la Tabla 1, tal como se describió en lo anterior.

Estos constructos se denominaron BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA y se ilustran en las Figuras 3a y 3b.

Ejemplo 2 - Transformación de Arabidopsis thaliana con BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA La cepa GV3101-R de Agrobacterium tumefaciens se transformó por electroporación utilizando los siguientes plásmidos: BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA que se muestran en la Figura 3, cuya preparación se describió en el Ejemplo 1.

Agrobacterium eleetrocompetente se obtuvo a partir de cultivos de medio LB que conten a 25 mg l"1 de rifampicina (Sigma-Aldrich) , cultivada a 30°C y con una densidad óptica a 600 nm de 0.4 a 0.6, medida con un espectrofotómetro Eppendorf Biophotometer . Cultivos de 500 mi se centrif garon a 4000 g durante 15 minutos, el sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en 500 mi de glicerol 10% frío (Fisher Scientific). La centrifugación y la resuspensión se repitieron con 250 mi de glicerol, después con 10 mi y por último con 2 mi de glicerol. Las células se distribuyeron en alícuotas de 50 µ?, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. La electroporación se realizó utilizando un equipo BioRad Gene Pulser. Se adicionó ADN plásmido (200 ng) a 50 µ? de células de Agrobacterium como en lo anterior en una cubeta de electroporación previamente enfriada (Gene Pulser Cuvette, Bio Rad) y las células se incubaron en hielo durante 5 minutos. La cubeta se sometió a electroporación con un pulso de 2.5 mV, 400 ohms de resistencia y 25 µ? de capacitancia y 1 mi de medio SOC (Super Optimal Broth, Catabolite Repression que contenía 20 g/1 de Bacto-Tryptone, 5 g/1 de Bacto-Yeast Extract, 85 mM de cloruro de sodio y 250 mM de cloruro de potasio. Se usó hidróxido de sodio 10M para ajustar el pH a 7.0 antes de someter a la autoclave. Antes del uso, se adicionó cloruro de magnesio estéril hasta una concentración final de 10 mM y se adicionó glucosa estéril (Fisher Scientific) hasta una concentración final de 20 mM. Las células se incubaron en un incubador con agitación a 30°C durante 2 horas antes de transferirlas al medio de agar LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina y 50 g mi"1 de rifampicina.

Después de la incubación a 30°C durante 2 días, las colonias se tamizaron por PCR y luego por digestión con enzima de restricción. Las colonias positivas para la selección PCR y que mostraron el patrón de digestión de restricción esperado, se inocularon en 5 mi de medio LB que conten a 50 µ? mi"1 de kanamicina y 50 µ? mi"1 de rifampicina y se incubaron en un incubador con agitación a 30°C durante la noche. Al día siguiente, se usaron 600 µ? de este cultivo para inocular 500 mi de medio LB, como en lo anterior, y se incubaron en un incubador con agitación a 30°C durante 30 horas antes de utilizarse para goteo floral.

Las plantas de ñrabidopsis se usaron para goteo floral a las 4 semanas de edad. Todos los constructos se transformaron en tipo silvestre ecotipo Columbia 0. Los cultivos de Agrobacterium preparados como se describió en lo anterior se centrifugaron a 4°C durante 15 minutos a 5000 g y los glóbulos celulares se resuspendieron en 250 mi de solución de sacarosa 5% (p/v) estéril (Fisher Scientific) y Silwett L-77 0.05% (OSi Specialties ) . Las plantas se sumergieron en la suspensión celular durante alrededor de 10 segundos con agitación suave, antes de cubrirse con película plástica (cling film) y colocarse lejos de la luz directa durante 24 horas. Después de esto, las plantas se regresaron al esquema de crecimiento normal y se cosecharon las semillas.

Selección de Arabidopsis thaliana transgénica La semilla de las plantas transformadas se seleccionó en 50 ? mi"1 de kanamicina (Dufecha Biochemie) según Harrison et al. (2006), Plant Methods, 2, 19. Las plantas Ti que muestran resistencia a antibióticos se desarrollaron para siembra y autopolinización. La semilla se seleccionó como en lo anterior y las líneas T2 que muestran una relación de resistente-no resistente de 3:1 se seleccionaron como portadoras de una sola copia del transgén. Estas plantas se autopolinizaron nuevamente y se selecciona como en lo anterior. Las líneas T2 que produjeron progenie resistente 100% (T3) se escogieron como homocigotos y se utilizaron para todos los experimentos. Se usó la genética mendeliana para seleccionar plantas de la generación T2 que fueron homocigóticas para el transgén y que contenían una sola copia del transgén. Se seleccionaron cinco líneas homocigóticas de un solo inserto independiente por cada planta transformada con SAG12-PPDKcDNh y SAG12-PPDKgDNA.

Ejemplo 3 - Transformación de Nicotiana tabacum con BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA La cepa electrocompetente LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens se transformó por electroporacion tal como se describió en el Ejemplo 2 utilizando los plásmidos BNP, BNP-PPDKcDNA y BNP-PPDKgDNA. después de la electroporación, se adicionó 1 mi de medio LB a las células electroporadas , que luego se incubaron en un incubador con agitación a 28°C durante 2 horas antes de transferirse a medio agar LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina y 100 µg mi"1 de espectinomicina ( Sigma-Aldrich) . Después de la incubación a 28°C durante 2 dias, se utilizó una colonia para inocular 50 mi de medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina y 100 µg mi"1 de espectinomicina . Este cultivo se incubó en un incubador con agitación a 28°C durante 3 días. Se extrajo ADN plásmido y se analizó por digestión con enzima de restricción y se usaron 50 µ? de cultivo para inocular 50 mi de medio LB que contenía 50 µ? mi"1 de kanamicina y 100 µg mi"1 de espectinomicina. Este cultivo se incubó en un incubador con agitación a 28°C durante la noche.

Las variedades Burley 21 y K326 de Nicotiana tabacum se cultivaron a partir de semilla y las hojas más jóvenes se cortaron de plantas de 8 semanas de edad y se esterilizaron en blanqueador Domestos 8% (v/v) (Domestos) durante 10 minutos antes de enjuagarse con agua destilada estéril. Se usó un sacacorchos número 6 para cortar discos foliares que se colocaron en 25 mi de cultivo de Agrobacterium durante 2 minutos. Los discos foliares se colocaron después por el reverso sobre medio MS que contenía 2.2 µ? de 6-bencilaminopurina (BAP) y 0.27 µ de ácido a-naftalenacético (NAA) . Estos se colocaron en un cuarto de cultivo a 22°C durante dos días. Luego, los discos foliares se transfirieron a medio MS selectivo, como en lo anterior, que contenia 500 µ? mi"1 de clarofan (Roussel Laboratories) (controles no cultivados) o 500 µ? mi"1 de clarofan y 100 µg mi"1 de kanamicina. Cada 14 días durante 6 semanas, los discos foliares se transfirieron a medio MS selectivo nuevo, como en lo anterior. Los racimos de callos y brotes se retiraron de los discos y se colocaron en medio LS que contenía 0.5 µ? de BAP, 500 µg mi"1 de clarofan y 100 µ? mi"1 de kanamicina. Después de 2 semanas los brotes o retoños se transfirieron a frascos de 150 mi con medio LS que contenía 0.5 µ? de BAP, 500 µg mi"1 de clarofan y sin kanamicina.

Después de las 3 semanas siguientes, el brote dominante se transfirió a medio LS que contenía 250 µg mi"1 de clarofan y sin BAP ni kanamicina. Después de otras 3 semanas los brotes se limpiaron al transferir la punta del brote a medio LS sin antibióticos ni BAP. Cuando se generaron las suficientes raíces, las plantas se transfirieron a la tierra en invernaderos.

Selección de Nicotiana tabacum transgénica Se usó PCR cuantitativa (Q-PCR) para cuantificar el número de copia del transgén en plantas T0 y TI. En la medida de lo posible, se escogieron el inserto simple TO y las plantas Ti homocigóticas para análisis. Para detección de transgén, se utilizaron los cebadores BNP-1271F (SEQ ID NO. 10) y BNP-1334R (SEQ ID NO. 11), como se muestra en la Tabla 1 y se usó la sonda BNP1291TV (SEQ ID NO. 12) marcada con Vic/TAMARA, que se híbrida con el transgén nptll. Para cuantificación interna, se usaron los cebadores NtCyc-184F (SEQ ID NO. 13) y NtCyc-316R (SEQ ID NO. 14) y se USÓ la sonda NtCyc-267T (SEQ ID NO. 15) marcada con FAM/ AMARA que se híbrida el gen endógeno que codifica para ciclofilina. La cuantificación se hizo por el método Ct comparativo (método AACt, Bubner & Baldwin (2004), Plant Cells Reports, 23, 263-271). Las mezclas de reacción contenían Universal Master Mix 1 x (ABI), 0.9 µ? de cada cebador, 0.2 µ? de cada sonda (con reacciones individuales para cebadores y sondas BNP y NtCyt) y alrededor de 500 ng de molde de ADN genómico extraído de tejido foliar por medio de Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen) según el protocolo recomendado. El ciclo térmico se realizó en un sistema 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) con un paso de desnaturalización inicial de 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Los datos se analizaron mediante el software SDS2.2 (Applied Biosystems) que se suministró.

Después de la regeneración en el cultivo de tejido de tabaco K326 y Burley 21 generación TO transformado, se usó PCR cuantitativa (Q-PCR) para seleccionar plantas que portaran una copia única del transgén. Se seleccionaron plantas de un solo inserto para reducir la posibilidad de silenciamiento transgénico. La Q-PCR se llevó a cabo utilizando oligonucleótidos complementarios al transgén nptll, que codifica para neomicina fosfotransferasa. El gen se presentó entre los bordes derecho e izquierdo del T-DNA transferido al genoma de la planta en constructos pBNP, BNP-PPD cDNA y BNP-PPDKgDNA. Las plantas transformadas con pBNP sólo sirvieron como controles vectoriales vacíos para garantizar que la regeneración a través del cultivo de tejido fue consistente ente las plantas transformadas con el vector vacío y aquellas transformadas con los vectores que contenían la secuencia codificante PPD . Después de la regeneración y las revisiones por Q-PCR para confirmar que se había dado una transformación satisfactoria, estas plantas se desecharon.

Para cada constructo ( SAG12-PPDKcOHK y SAG12- PPDKgDHh) y cada variedad (K326 y Burley 21) se seleccionaron seis plantas. No fue posible seleccionar plantas de inserto único, ya que no había disponibles seis plantas de inserto único y entones se seleccionaron las plantas con el menor número de copias posible. Estas plantas se autopolinizaron y las semillas se cosecharon.

Por cada planta TO seleccionada, se cultivaron 14 descendientes y se repitió la determinación Q-PCR para seleccionar plantas homocigóticas . El uso de plantas homocigóticas asegura la estabilidad del transgén en generaciones futuras. Por cada progenitor TO, se seleccionaron cuatro descendientes que portaban el transgén. Sin embargo, no fue siempre posible seleccionar descendientes homocigóticos por cada progenitor TO. Sin embargo, cuando el número de copia de progenitor era mayor de dos, se seleccionaron las plantas con número de copia menores para reducir la posibilidad de silenciamiento transgénico y también para simplificar la selección de homocigóticos de la generación T2 , en caso necesario. De esta forma, por cada constructo y cada variedad se seleccionaron cuatro réplicas biológicas (hermanas) de cinco líneas independientes con números de copia transgénicos bajos para todos los experimentos posteriores.

Ejemplo 4 - Detección y cuantificación de proteina PPDK en plantas Arabidopsis transformadas Extracción de proteína El tejido foliar de Arabidopsis (100 mg) se molió en atmósfera de nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi con una micromano de mortero y se adicionaron 400 µ? de amortiguador de extracción (amortiguador de fosfato de potasio (más mezcla inhibidora de proteasa (PIC, Sigma) ) . La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford (Jones et al., 1989, Journal of Chemical Ecology, 15, 979-992) con el reactante Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad) según el protocolo recomendado.

Electroforesis en gel de poliacrilamida Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis) en un gel de resolución que contenia 10% (v/v) de acrilamida (37.5:1 acrílicorbis acrílico, Severn Biotech Ltd.), 50% (v/v) de amortiguador Inmunoblot Resolving Buffer (véase, Sección 2.10), 0.05% (p/v) de peroxidisulfato de amonio (APS , AnalaR) y 0.05% (v/v) de ?,?,?' ,?' -tetrametilendiamina (TEMED, Severn Biotech Ltd. ) . El gel de apilamiento contenía 5% de acrilamida como en lo anterior, 50% (v/v) de amortiguador Inmunoblot Stacking Buffer, 0.06% (p/v) de APS y 0.1% (v/v) de TEMED. La electroforesis se realizó en 20 µg de proteína total extraída con amortiguador Inmunoblot Sample Buffer lx (66 mM de Tris-HCl, 10% (v/v) de glicerol, 0.7 mM de SDS, 0.7 M de ß-mercaptoetanol (BDH Laboratory Supplies) y 0.05% (p/v) de azul de bromofenol y amortiguador Inmunoblot Running Buffer (25mM Tris-HCl, 0.29 mM glicina (Fisher Scientific) y 3.5 mM SDS) con una corriente de 70 mA durante 1 hora 30 minutos.

Los geles duplicados se corrieron de manera simultánea. Uno se usó para análisis por inmunotransferencia (descrito más adelante) y el segundo se tiño con GelCode Blue safe Protein Stain (Thermo Scientific) según el protocolo recomendado. Se utilizó Gel Drying Film (Promega) para secar los geles teñidos.

Análisis de inmunotransferencia Las proteínas del gel para análisis de inmunotransferencia se transfirieron a una membrana de nitrato de celulosa Protan BA83 Cellulose Nitrate Membrane (Schleicher y Schuell) utilizando papel Protean Extra-Thick Blot Paper (Bio-Rad) y amortiguador Inmunoblot Transfer Buffer (48 mM de Tris-HCl, 39 mM de glicina, 1.3 mM de SDS y 20% (v/v) de metanol (Fisher Scientific)) en un equipo Semi-Dry Blotter (Bio-Rad) a 15 V durante 1 hora. Se aplicó tinción de Ponceau (0.5% (p/v), Ponceau S (Fluka) y 1% (p/v) de ácido acético glacial (Fisher Scientific)) a la membrana después de transferir para verificar la transferencia de proteina y luego la membrana se enjuagó con agua destilada.

El amortiguador de bloqueo para el análisis de inmunotransferencia de PPDK se preparó cada día con 1 % (p/v) de leche descremada y desecada, en polvo, (Marvel) y 0 . 1 % (v/v) de monolaurato de polioxietilensorbitán (TWEEN 20 , Sigma-Aldrich) en solución salina de fosfato (PBS: 1 . 5 mM ortofosfato dihidrogenado de potasio (KH2P04 , AnalaR), 8 . 1 mM de ortofosfato hidrogenado de sodio, 2 . 7 mM de cloruro de potasio y 137 mM de cloruro de sodio. Se usó ácido clorhídrico para ajustar el pH a 7 . 4 . Las membranas se incubaron en amortiguador de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora. La hibridación primaria se realizó con una dilución 1 : 10 , 000 de anticuerpo anti-PPD de conejo (Chris Chastain, Minnesota State University) seguida de 3 lavados de 5 minutos cada uno en amortiguador de bloqueo. La hibridación secundaria se realizó con una dilución 1 : 1000 de anticuerpo completo biotinilado anti-conejo de asno (GE Healthcare) seguida de 3 lavados como en lo anterior. La hibridación terciaria se realizó con una dilución 1 : 10000 de complejo de peroxidasa de rábano biotinilada - estreptavidina (GE Healthcare) seguida de 3 lavados de 5 minutos cada uno en PBS que contenía 0 . 1 % (v/v) de TWEEN 20 .

Luego, las membranas se enjuagaron 3 veces con agua destilada. La detección se hizo con reactante Western Lightning Chemiluminescence Reagent (Enhanced Luminol, Perkin Elmer) según el protocolo recomendado.

Con relación a la Figura 4, se muestra la selección de líneas celulares SAG12-PPDK de Arabidopsis thaliana mediante transferencia Western. La proteína se extrajo de tejido foliar de plantas de ocho semanas de edad Arabidopsis tipo silvestre, APPDK SAG12-PPDKcONh y SAG12-PPDKgOHh y se sometieron a análisis de inmunotransferencia para seleccionar líneas que expresen altos niveles de PPDK. Se utilizó PPDK de maíz recombinante (30 µ?) como control positivo. No se detectó PPDK en plantas tipo silvestre o plantas imitantes PPDK (APPDK) . Las plantas SAG12-PPDKgrDNA expresaron mayores niveles de PPDK que las plantas SAG12-PPDKcDHA. Todos los análisis posteriores se realizaron en las cinco líneas SAGl2-PPDKgONA.

El PPDK no fue detectable en las plantas tipo silvestre ni en las APPDK, fue detectable en bajos niveles en algunas plantas SAG12-PPDKcOlíiA y detectable en todas las lineas SAG12-PPDKgOHA. En tres de estas líneas, se detectaron cantidades mucho mayores de PPDK en comparación con las líneas tipo silvestre o SAG12-PPDKcOlHA. Por lo tanto, la presencia de intrones parece tener un efecto positivo en los niveles de expresión de PPDK y se seleccionaron las líneas SAG12-PPDKgONA. para usarse en todos los experimentos posteriores.

Se realizó inmunotransferencia frente a PPDK en plantas tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgm& a fin de determinar la aparición y grado de acumulación de PPDK en 1antas SAG12-PPDKgO A.

Con relación a la Figura 5, se muestra la cuantificación de la abundancia de PPDK en líneas tipo silvestre, APPDK y cinco líneas independientes SAG12-PPDKgONA de la semana cinco en adelante. La abundancia de PPDK se calculó como porcentaje de tipo silvestre para cada punto de la semana cinco a la nueve. Los datos se muestran como la media de estos cinco puntos de evaluación. Las barras de error muestran el error estándar de la media (SEM - standard error mean). Las líneas SAG12-PPDKgDUK están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las diferencias entre genotipos se evaluaron con la prueba ANOVA (F = 4.775, df = 6 , p = 0.001). Las líneas significativamente diferentes del tipo silvestre fueron G12.3 (p = 0.005) y G16.1 (p = 0.004).

Las proteínas se extrajeron de tejido foliar cosechado a intervalos semanales a partir de las tres a nueve semanas después de la siembra. La PPDK se detectó en bajas cantidades en plantas tipo silvestre a partir de la semana cinco en adelante, confirmando que el aumento observado en transcritos da como resultado un aumento en la abundancia de proteína. En plantas tipo silvestre, PPDK y SAG12-PPDKgONk, la aparición de acumulación de PPDK también se observó a la semana cinco, pero la abundancia de PPDK es mayor que en la planta tipo silvestre. No se detectó proteína PPDK en ninguna etapa en las plantas APPDK.

También se optimizó un método que permite la cuantificación de PPDK en extractos de proteína foliar. Diferentes cantidades de proteína PPDK de maíz recombinante se sometieron a análisis SDS-PAGE e inmunotransferencia. La banda de intensidad se calculó con el software de imagen AlphaEase y se construyó una curva estándar. La línea de regresión se calculó mediante el software SigmaPlot que después se utilizó para calcular las cantidades de PPDK en las muestras de hojas de la planta. Puesto que los niveles de detección de inmunotransferencia pueden variar, fue necesario incluir al menos tres estándares en cada inmunotransferencia para lograr una buena comparación entre las diferentes inmunobandas . Esta técnica de cuantificación de la abundancia de PPDK en diferentes extractos, se usó para seleccionar y comparar diferentes líneas transgénicas .

La abundancia de proteína PPDK se calculó por referencia con los estándares conocidos de proteína PPDK de maíz recombinante en al menos cuatro réplicas biológicas por cada línea en cada punto de evaluación. El análisis mostró que la abundancia de PPDK en SAG12-PPDKgONA fue mayor que en las líneas tipo silvestre a partir de la semana cinco en adelante. La abundancia de PPDK se calculó como porcentaje de líneas tipo silvestre en cada punto de evaluación de la semana cinco en adelante por cada linea SAG12-PPDKgONA y la media se tomó a partir de estos valores para cuantificar la acumulación de PPDK durante el periodo de senescencia en cada línea SAG12-PPDJCgDNA. Esto permitió que las líneas SAG12-PPDKgONA se ordenaran según el incremento en la abundancia de PPDK, como se muestra en la Figura 5 .

Puesto que las proteínas que se acumulan en grandes cantidades en plantas transgénicas pueden someterse a inactivación, el aumento en la abundancia de proteína no implica necesariamente una mayor actividad enzimática. La PPDK se fosforila de manera reversible en la oscuridad, lo cual da lugar a esta inactivación. Se ha generado un anticuerpo contra la versión fosforilada de PPDK (Phospho-PPDK), que permite la detección específica de la forma inactiva de PPDK, mientras que el anticuerpo usado previamente (anti-PPDK) detecta PPDK sin tomar en cuenta el estado de fosforilación (Chastain et al., 2002 , Plant Physiology, 128 , 1368- 1378 ) . El anticuerpo anti-PhosphoPPDK se usó para detectar PPDK inactivada durante el transcurso de la semana tres a la nueve después de la siembra, en inmunobandas con introducción inicial de sondas de anticuerpo anti-PPDK extraídas después y aplicadas nuevamente .

De manera sorprendente, el PPDK inactivada ( fosforilada) fue detectable sólo a muy bajos niveles en plantas tipo silvestre en varias inmunobandas y sólo durante las últimas etapas de senescencia. En plantas SAG12-PPDKgONA., dependiendo del punto de tiempo de inactivación, se detectó PPDK a niveles más altos. Sin embargo, en puntos de evaluación inmediatamente después de la aparición del incremento en la abundancia de PPDK, se detectó muy poco o nada de PPDK inactivada a pesar de la gran abundancia de PPDK total. Estos resultados sugieren que mientras que algo de inactivación de PPDK podría ocurrir en plantas SAG12-PPDKgONh, mayor abundancia de PPDK enzimáticamente activa está presente en plantas SAG12-PPDK al menos durante las primeras etapas de senescencia.

Ejemplo 5 - Detección y cuantificación de proteína PPDK en plantas de N.tabacum transformadas El tejido foliar de N.tabacum ( 100 mg) se molió en atmósfera de nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga de 1 . 5 mi, utilizando una micromano de mortero y se adicionaron 400 µ? de amortiguador de extracción (amortiguador de fosfato de potasio (más mezcla inhibidora de proteasa (Overcoat Buffer (PIC)). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford (Jones et al., 1989 ) con el reactante Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad) según el protocolo recomendado. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) como se describe en el Ejemplo 4. Las proteínas se analizaron y la proteína PPDK se cuantificó por inmunotransferencia como se describe en el Ejemplo 4.

Se realizaron inmunotransferencias frente a PPDK en proteína foliar extraída de hojas de tabaco generación Ti K326 y Burley 21 inducidas a senescencia por corte e incubación en oscuridad a 30°C. La senescencia se indujo de esta forma para que las líneas transgénicas con la abundancia más alta de PPDK pudieran identificarse y otras líneas desecharse, antes de que las plantas llegaran a la madurez. En las plantas K326, se detectó PPDK en gran abundancia en tres líneas SAG12-PPDKgOHA (G4, G8 y G10) y en una línea SAG12-PPDKcONA (CIO). En plantas Burley 21, la PPDK fue abundante en líneas SAG12-PPDKg A (G3, G7, G15 y G23) pero no estuvo presente en gran abundancia como en las líneas K326. Cada una de las cuatro líneas de K326 y Burley 21 que tuvieron la abundancia más alta de PPDK se utilizó para todos los análisis posteriores. Puesto que la abundancia de PPDK más alta se observó casi exclusivamente en las líneas SAG12-PPDKgDNA, parece que los intrones tienen un efecto positivo en la expresión de PPDK.

Con relación a la Figura 6, se muestra la selección de las líneas SAG12-PPDK K326 y Burley 21, como sigue : (b) inmunotransferencia de PPDK para seleccionar líneas K326 transgénicas . La senescencia se indujo en hojas verdes de plantas, de seis semanas de edad, por desprendimiento e incubación en oscuridad a 30°C durante tres días. La proteína se extrajo y se sometió a análisis de inmunotransferencia para seleccionar líneas que expresen altos niveles de PPDK. Se usó PPDK de maíz recombinante (50 µg) como control positivo. Se muestra una inmunotransferencia representativa, con un descendiente de cada planta T0 progenitora. Las plantas de las líneas progenitoras SAG12-PPDKgOHA G4, G8 y G10 y de la línea SAG12-PPDKcOHh CIO, se utilizaron para los análisis posteriores . (c) inmunotransferencia de PPDK para seleccionar líneas Burley 21 transgénicas, como con K326 en la sección (b). Las plantas de las líneas progenitoras SAG12-PPDKgOU G3, G7, G15 y G23, se utilizaron para los análisis posteriores .

Se realizaron inmunotransferencias contra PPDK en tabaco tipo silvestre, copia cero (segregante negativo), SAG12-PPDKgDHh K326, SAG12-PPDKcOHh K326 y SAG12-PPDKgONA Burley 21, para determinar el comienzo de la expresión de PPDK y cuantificar el grado de sobreexpresión de PPDK en las plantas transformadas. Las proteínas se extrajeron de las hojas K326 tipo silvestre y de la planta transformada una (la más vieja) a ocho (joven) de plantas de tres meses de edad y se hicieron inmunotransferencias frente a PPDK.

Con relación a la Figura 7, se muestra la sobreexpresión de PPDK en hojas maduras de tabaco K326. La abundancia de PPDK se calculó a partir de las inmunotransferencias . Los datos se muestran como la media de 10 réplicas biológicas para plantas copia cero y cuatro réplicas biológicas por cada linea SAG12-PPDK. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDK están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las diferencias entre genotipos se evaluaron con la prueba ANOVA (F = 6.995, df = 4 , p = 0.001). Las líneas significativamente diferentes de las plantas copia cero fueron G10 (p = 0.006) y G8 (p = 0.003) y CIO (p = 0.000).

La abundancia de PPDK fue mayor en las hojas más viejas de las plantas tipo silvestre, lo que indica que la PPDK se regula de manera natural durante la senescencia en el tabaco y también en Arabidopsls. En las plantas K326 transformadas, la abundancia de PPDK también fue mayor en las hojas viejas y fue mucho mayor que en las plantas tipo silvestre. También hubo mayor abundancia de PPDK en las hojas más jóvenes de las líneas transformadas, en las que hubo la abundancia más alta de PPDK. Se realizaron inmunotransferencias en proteína extraída de hojas "maduras" de las plantas copia cero (segregantes negativos) y de plantas transformadas. Las hojas maduras son aquellas que están en la etapa cosechable y se encuentran en las etapas tardías de senescencia. Se cuantificó la abundancia de PPDK. La abundancia de PPDK fue mayor en las hojas maduras de las cuatro líneas independientes transformadas comparada con las plantas copia cero. La sobreexpresión de PPDK durante la senescencia cuando se usa el promotor SAG12 fue satisfactoria para el tabaco K326.

Ejemplo 6 - Análisis fenotípico de plantas Arabidopsis transformadas Análisis del crecimiento de la planta Arabidopsis Con relación a la Figura 8, se ve claramente que la sobreexpresión de PPDKgDNA en Arabidopsis thaliana genera plantas con rosetas más grandes. Las plantas tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgTmK se fotografiaron a las semanas tres, cinco y nueve después de la siembra. Las plantas SAG12-PPDKgONPL fueron más grandes que las de tipo silvestre. No hubo diferencia observable entre las plantas PPDK y las plantas tipo silvestre.

Las masas frescas de rosetas y tejido reproductivo se determinaron con una balanza Mettler Toledo AB104-S con una exactitud de 0.1 mg. La masa seca de tejido de rosetas se determinó a partir de muestras liofilizadas durante la noche con un liofilizador Edwards Super Modulyo Freeze Dryer con exactitud de 0.1 mg.

Con relación a la Figura 9, se muestra la masa de tejido reproductivo a la semana nueve. Se observó una respuesta a la dosis de PPDK, con mayor masa de tejido reproductivo en las lineas con mayor abundancia de PPDK. Se pesó el tejido reproductivo total (tallos, hojas caulinas, flores y silicuas). Los valores son medias de tres réplicas biológicas. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDKgONh están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las diferencias entre genotipos se evaluaron con la prueba A OVA (F = 8.062, df = 6, p = 0.001). Todas las líneas SAG12-PPDKgONA fueron significativamente diferentes del tipo silvestre (G9.4 p = 0.031, G5.4 p = 0.000, G19.2 p = 0.000, G12.3 p = 0.001, G16.1 p = 0.001). Aunque la tendencia no es absoluta, las líneas con mayor abundancia de PPDK tendieron a tener mayor masa de tejido reproductivo. También se calculó el tejido reproductivo como porcentaje de la masa vegetal fresca total, pero no fue significativamente diferente de las plantas tipo silvestre, APPDK o SAG12-PPDKgOHA cuando se evaluaron mediante ANOVA (F = 0.544, df = g, p = 0.767, no se muestran datos ) .

Sin embargo, la proporción de tejido reproductivo como porcentaje de la masa vegetal total fue invariable, lo que sugiere que la planta como un todo era más grande y que la ubicación de la reserva entre el tejido vegetativo y el tejido reproductivo fue inalterable. La masa fresca total y la masa de tejido reproductivo también se determinaron el las plantas APPDK y no fueron significativamente diferentes de las de tipo silvestre. La masa seca de rosetas también se determinó e igual que para la masa fresca total y la masa de tejido reproductivo, se encontró que las plantas SAG12-PPDKgOHh tenían mucha mayor masa que las de tipo silvestre.

Con relación a la Figura 10, se muestra la masa fresca total (rosetas más tejido reproductivo) de plantas tipo silvestre y SAG12-PPDKgDNA de tres a nueve semanas después de la siembra. Los datos se presentan como la media de tres réplicas biológicas para tipo silvestre y 15 réplicas biológicas (tres plantas para cada una de las cinco líneas independientes) de SAG12-PPDKgOHK. Las barras de error muestran el SEM. Las masas vegetales totales de las plantas tipo silvestre y SAG12-PPDKgOHh se compararon aplicando la prueba t de Student en cada punto de evaluación. La masa de rosetas fue significativamente mayor en las plantas SAG12-PPDKgOH¡ a la semana nueve (p = 0.032) .

No hubo diferencia significativa antes del comienzo de la sobreexpresión de PPDK debida al promotor SAG12 a la semana cinco. Las cinco líneas independientes SAG12-PPDKgOHA tuvieron un incremento en la masa seca de rosetas. Se observó respuesta a la dosis de PPDK como para la masa de tejido reproductivo, con líneas de mayor masa y contenidos mayores de PPDK. También se determinó la masa seca de rosetas en las plantas ????? y no hubo diferencia significativa respecto a las plantas tipo silvestre.

Determinación de área superficial de la hoja de Arabidopsis El área superficial de la roseta se determinó por muestreo de una sola hoja madura, normalmente de 10 hojas, determinando la masa de la hoja y de la roseta completa, como en lo anterior, y tomando fotografías de la hoja junto a una regla. El área superficial de la hoja se midió mediante el software de imagen ImageJ (National Institutes of Health) y a partir de ésta se calculó el área superficial de la roseta completa.

El área superficial de la roseta se incrementó en las plantas SAG12-PPDKgDNA después de la aparición de la sobreexpresión de PPDK. Aun cuando el área superficial fue significativamente mayor en las plantas SAG12-PPDKgOHA a las semanas seis y siete, a la semanas ocho y nueve el área superficial no fue significativamente diferente de la de las plantas tipo silvestre. Esta gran disminución en el área superficial pudo deberse a una mayor removilización de nutrientes en las plantas SAG12-PPDKgTMA en comparación con las de tipo silvestre. El área superficial en las plantas APPDK no fue significativamente diferente de las plantas tipo silvestre.

Determinación de la Carón de clorofila El contenido de clorofila se midió en unidades relativas utilizando un medidor de clorofila manual CCM-200 (Opti-Sciences ) .

Medición de fluorescencia en Arabidopsis La relación FV/FM se determinó en un fluorómetro Hansatech FMS2. Las hojas se adaptaron a la oscuridad mediante el uso de pinzas para hojas, suministradas por el fabricante, durante la noche anterior a la medición. Para determinar si se alteró o no la aparición de la senescencia en las plantas SAG12-PPDKgDHA o APPDK con relación a las plantas tipo silvestre, se midieron las relaciones FV/FM. La relación FV/FM es un estimado de la eficiencia cuántica de Photosystem II y declina cuando se presenta la fotoinhibición. Es una medida útil de la aparición de la senescencia, puesto que el declive de la fotosíntesis se presenta temprano en la senescencia, antes de que se detecte la disminución del contenido de clorofila. El valor FV/FM se midió en el transcurso de las cuatro semanas (cuando las hojas fueron lo suficientemente grandes para medir FV/FM) a las nueve semanas después de la siembra. En plantas tipo silvestre, SAG12-PPDKgOHA y APPDK, el valor FV/FM máximo se observó en la semana siete y después disminuyó, indicando que el tiempo de aparición de la senescencia fue el mismo en los tres genotipos. Sin embargo, en las plantas SAG12-PPDKgOHA. el valor FV/FM fue significativamente mayor que en las de tipo silvestre a la octava semana, lo que indica actividad fotosintética prolongada en las etapas tardías de la senescencia.

Contenido de nitrógeno El tejido para el análisis de nitrógeno se liofilizó con un equipo Edwards Super Modulyo Freeze Dryer. Tejido foliar de Arabidopsis (25 mg) o tejido foliar de tabaco (100 mg) se empacó en papel de pesar libre de nitrógeno (Elementar Analysensysteme GmbH). Se utilizó un equipo Rapid N III Nitrogen Analyzer (Elementar Analysensysteme GmbH) para medir el contenido de nitrógeno como porcentaje en peso seco, aplicando los ajustes recomendados. Se utilizó ácido aspártico (Sigma-Aldrich) como estándar. El contenido de nitrógeno foliar se determinó en plantas Arabidopsis tipo silvestre, SAG12-PPDKgOHA y APPDK en el transcurso de las semanas tres a nueve después de la siembra.

Con relación a la Figura 11, se muestra el contenido de nitrógeno en las hojas de plantas tipo silvestre, APPDK y SAG12-PPDKgONK a la semana siete. Los datos se muestran como la media de ocho réplicas biológicas para tipo silvestre y APPDK y cuatro réplicas biológicas por cada línea SAG12-PPDKgWA. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDKgONA están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las diferencias entre genotipos se evaluaron con la prueba A OVA (F = 6.047, df = 6, p = 0.000). Las plantas APPDK y todas las líneas SAG12-PPDKgONA fueron significativamente diferentes a las tipo silvestre (APPDK p = 0.004, G9.4 p = 0.000, G5.4 p = 0.000, G19.2 p = 0.001, G12.3 p = 0.007, G16.1 p = 0.006).

El nitrógeno foliar fue significativamente menor en las cinco líneas independientes SAG12-PPDKgONA comparado con el tipo silvestre de la semana siete en adelante, lo que soporta la hipótesis de que el incremento en la abundancia de PPDK durante la senescencia podría aumentar la eficiencia de removilización del nitrógeno. La expresión de PPDK y la actividad alcanzaron su máximo a la semana seis en las plantas SAG12-PPDKgDHh, lo que sugiere que ocurre un retraso entre la abundancia incrementada de PPDK y una disminución medible del nitrógeno foliar, lo cual se podría atribuir al tiempo que toma convertir los aminoácidos de proteína a aminoácidos de transporte (asparagina y glutamina) y transportarlos fuera de la hoja.

Análisis de semilla de Arabidopsis La masa de semillas individuales y el contenido de nitrógeno se midieron en semilla de plantas de A.thaliana tipo silvestre, SAG12-PPDKgONA y APPDK.

Con relación a la Figura 12, se muestra el contenido de nitrógeno de semillas individuales de plantas tipo silvestre, SAG12-PPDKgONA y APPDK. Hubo aumentos considerables en el contenido de nitrógeno de la semilla de las plantas SAG12-PPDKgOUA. Los datos se muestran como la media de ocho réplicas biológicas para tipo silvestre y APPDK y cuatro réplicas biológica para cada línea SAG12-PPDKgOHh. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDKgONK están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las diferencias entre genotipos se evaluaron con la prueba ANOVA (F = 6.704, df = 6, p = 0.000). Las líneas significativamente diferentes al tipo silvestre fueron G19.2 (p = 0.000), G12.3 (p = 0.005) y G16.1 (p = 0.002). Las líneas con mayor abundancia de PPDK tendieron a presentar mayor masa de nitrógeno en la semilla. Por consiguiente, la masa de semillas individual aumentó en las cinco líneas independientes S G12-PPDKgOHA con relación al tipo silvestre y se observó respuesta a la dosis respecto a la abundancia de PPDK, con mayor abundancia de PPDK en plantas que tenían mayor masa de semilla. También se pesó la semilla total cosechada de cada planta y no hubo diferencia significativa entre las plantas tipo silvestre y las SAG12-PPDKgüNA, de manera que el mayor tamaño de la semilla en las plantas SAG12-PPDKgDV¡A no comprometió la cosecha de semilla total.

Contenido de aminoácido libre en tejido foliar de Arabidopsis El tejido foliar (100 mg) se molió en atmósfera de nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi utilizando una micromano de mortero (Eppendorf) y se adicionaron 300 µ? de agua desionizada estéril. Las muestras se sometieron a centrifugación a 13,000 rpm a 4°C durante 5 minutos. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo Bradford (Jones et al., 1989) con el reactante Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad) según el protocolo recomendado. Las muestras para análisis de aminoácidos se prepararon con el equipo EZfaast Amino Acid Sample Testing Kit (Phenomenex) según el protocolo recomendado. Las muestras se resuspendieron en 10 mM de formiato de amonio (BDH Laboratory Supplies) en 50% de agua destilada estéril y 50% de metanol ultra puro (Romil).

Luego, las muestras se analizaron por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS) en un equipo Q Trap LC/MS/MS (Applied Biosystems/MDS SCIEX) con una columna EZfaast 250 x 3 . 0 mm AAA-MS (Phenomenex) y 10 mM de formiato de amonio en 50 % (v/v) de agua destilada estéril y 50 % (v/v) de metanol ultra puro como fase móvil. El espectrómetro de masas se usó en modo de ión positivo con las condiciones recomendadas en el estuche EZfaast Kit (Phenomenex) . Los resultados se analizaron en el software suministrado Analyst (Applied Biosystems/MDS SCIEX).

El contenido de aminoácidos libres totales se midió en hojas de plantas Arabidopsis tipo silvestre, SAG12-PPDKgONh y ????? en transcurso de las semanas tres a nueve después de la siembra.

Con relación a la Figura 13 , se muestra que el contenido de aminoácidos libres totales, aumenta en las hojas de Arabidopsis que sobreexpresan PPDK. Los datos se muestran como la media de seis réplicas biológicas para tipo silvestre y APPDK y cuatro réplicas biológicas por cada línea SAG12-PPDKgO A. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDKgDNA están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK. Las cinco líneas SAG12-PPDKgONA tienen mayor contenido de aminoácidos totales que las tipo silvestre, pero la variación es alta y la diferencia no fue significativa cuando se analizaron mediante la prueba A OVA (F = 1 . 314 , df = 6 , p = 0 . 289 ) .

En plantas SAG12-PPDKgDYiAl el contenido de aminoácidos libres total fue significativamente mayor que en las plantas tipo silvestre a la semana siete, el mismo tiempo al cual el contenido de nitrógeno foliar disminuyó significativamente respecto al tipo silvestre y una semana después de la máxima abundancia de PPDK en las hojas de las plantas SAG12-PPDKgDH . El aumento se presentó en las cinco líneas independientes SAG12-PPDKgOHh, aunque la variación fue alta y las diferencias entre las líneas individuales y el tipo silvestre no fueron significativas. Este incremento sugiere que en este punto de evaluación la producción de aminoácidos se da en mayor grado que la exportación de éstos y así los aminoácidos se acumulan en la hoja. Los aminoácidos libres totales no fueron muy diferentes en las plantas APPDK en comparación con las de tipo silvestre.

Los aminoácidos de transporte (glutamina y asparagina) también se determinaron y se expresaron como porcentaje de aminoácidos libres totales. En plantas SAG12-PPDKgDNA, el contenido de aminoácidos de transporte fue significativamente mayor que en las plantas tipo silvestre a las semanas siete y ocho. El incremento ocurrió en las cinco líneas independientes SAG12-PPDJCgDNA, aunque la variación fue alta y las diferencias entre las líneas individuales y el tipo silvestre no fueron significativas. Por lo tanto, además de un aumento en el contenido de aminoácidos libres totales en plantas SAG12-PPDKgOHPi., el contenido de aminoácidos de transporte aumentó como una preparación del total. Nuevamente, esto sugiere que la producción de asparagina y glutamina excedió la capacidad de exportación de la hoja en estos puntos de evaluación, lo que soporta la hipótesis de que un aumento en la abundancia de PPDK durante la senescencia, aumenta la eficiencia de interconversión de aminoácidos dando lugar a la formación de aminoácidos de transporte. En plantas APPDK no se observó diferencia significativa respecto al tipo silvestre.

Ejemplo 7 - Análisis fenotípico de plantas de tabaco transformadas Análisis del contenido de nitrógeno foliar en tabaco El contenido de nitrógeno foliar se midió en hojas maduras de tabaco segregante negativo y SAG12-PPDKgOH .. Las hojas maduras son aquellas que ya están aptas para cosecharlas para la producción de tabaco. El contenido de nitrógeno foliar de plantas SAG12-PPDK fue menor que el de las plantas segregantes negativos, para algunas de las cuatro líneas independientes SAG12-PPDK.

Se utilizaron hojas maduras para medir el contenido de nitrógeno foliar ya que esta hojas están en la etapa en la que se cosecharían para la producción de tabaco. Sin embargo, el hecho de que hubo poca diferencia en el contenido de nitrógeno foliar en las hojas maduras no implica necesariamente que la removilización del nitrógeno no se incremente. En el transcurso de la senescencia de plantas SAG12-PPDKgO^ Arabidopsis , el contenido de nitrógeno foliar fue significativamente menor que en el tipo silvestre, pero durante la senescencia tardía la diferencia fue mucho más pequeña. Por lo tanto, es posible que una diferencia en el contenido de nitrógeno foliar en el tabaco ocurra más pronto durante la senescencia y que la diferencia disminuya en el tiempo en que se midió el contenido de nitrógeno foliar.

Análisis del contenido de aminoácidos en la hoja de tabaco El contenido de aminoácidos se midió en hojas maduras de tabaco K326, inducido a senescencia por desprendimiento e incubación en la oscuridad a 30°C durante tres días. Esto permitió hacer comparaciones entre las mismas hojas antes y después de la inducción de senescencia. La inducción de senescencia por desprendimiento de la hoja e incubación en la oscuridad muestra el mayor traslape de los patrones de expresión génica con la senescencia relacionada con la edad.

En tabaco K326, el contenido de aminoácidos totales aumento después de la inducción de senescencia en plantas segregantes negativas y en plantas SAG12-PPDK. El incremento se calculó como porcentaje del contenido total de aminoácidos antes de la inducción de senescencia. Para la línea SAG12-PPDK CIO, el aumento fue significativamente menor que en las plantas segregantes negativas, pero ninguna otra línea SAG12-PPDK mostró una diferencia significativa con las plantas segregantes. Por lo tanto, la sobreexpresión de PPDK durante la senescencia parece tener poco efecto en el contenido total de aminoácidos después de la inducción de senescencia por oscuridad. El contenido de aminoácidos de transporte (glutamina y asparagina) también aumentó en el tabaco K326 después de la inducción de senescencia, pero el aumento se presentó tanto en segregante negativo como en las líneas SAG12-PPDK y no hubo diferencia significativa entre genotipos al grado de aumentar después de la inducción de senescencia.

Análisis de semilla de tabaco La masa de semillas individuales se midió en tabaco K326, y fue significativamente mayor en las plantas SAG12-PPDKgOVÍk y SAGl2-PPDKcOHh en comparación con las plantas segregantes negativas, para las cuatro líneas transgénicas independientes. También se midió la masa de semilla por vaina y fue significativamente mayor en las plantas SAG12-PPDKgOHh y SAG12-PPDKcONh.

Con relación a la Figura 14, se muestra que el tamaño de la semilla aumenta en el tabaco K326 SAG12-PPDK. La masa de semilla individual en K326 copia cero (plantas que son segregantes negativos para el inserto SAG12-PPDK) y plantas SAG12-PPDK, se calculó por fotografía, conteo y peso de alrededor de 1000 semillas. Los datos se muestran como la media de 10 réplicas biológicas de plantas copia cero y cuatro réplicas biológicas por cada línea SAG12-PPDK. Las barras de error muestran el SEM. Las líneas SAG12-PPDK están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK en hojas maduras. La masa de semilla es mayor en plantas SAG12-PPDK. La diferencia entre genotipos se evaluó mediante la prueba A OVA (F = 4.870, df = 4, p = 0.006). Las líneas significativamente diferentes de las plantas de copia cero fueron G8 (p = 0.005) y CIO (p = 0.002).

El porcentaje de contenido de nitrógeno de la semilla fue mayor en las cuatro líneas independientes SAG12-PPDKgDlüh y SAG12-PPDKcOHA, pero la diferencia no fue significativa. Sin embargo, la masa de nitrógeno por semilla fue significativamente mayor en las plantas SAG12-PPDKgD A y SAG12-PPDKcTN&.

Con relación a la Figura 15, se observa claramente que el contenido de nitrógeno se incrementa en el tabaco K326 SAG12-PPDK. La masa de nitrógeno en semilla individual de plantas K326 copia cero y SAG12-PPDKf se calculó a partir de los datos de masa de semilla y contenido de nitrógeno en semilla. Los datos se muestran como la media de 10 réplicas biológicas de plantas copia cero y cuatro réplicas biológicas por cada linea SAG12-PPDK. Las barras de error muestran el SEM. Las lineas SAG12-PPDK están dispuestas en orden ascendente de abundancia de PPDK en hojas maduras. La masa de nitrógeno en semilla individual es mayor en plantas SAG12-PPDK. La diferencia entre genotipos se evaluó mediante la prueba A OVA (F = 7.807, df = 4 , p = 0.001). Las líneas significativamente diferentes de las plantas de copia cero fueron G8 (p = 0.000) y CIO (p = 0.000).

Esto sugiere que el suministro de nitrógeno a las semillas aumentó en las plantas de tabaco SAG12-PPDKgOWh y SAG12-PPDKcDHh K326. En plantas K326, se observó respuesta a la dosis para PPDK . Las plantas con mayor abundancia de PPDK en las hojas maduras tenían mayor masa de semilla individual, mayor masa de semilla por vaina de semillas y mayor masa de nitrógeno en semillas individuales. Esto es un fuerte soporte de la función del PPDK en la removilización del nitrógeno, ya que el aumento en el contenido de PPDK parece estar relacionado con un aumento en el suministro de nitrógeno a la semilla.

En resumen, en el tabaco K326 SAG12-PPDK aumentó la masa de semilla individual (Figura 14) y la masa de nitrógeno por semilla (Figura 15), lo que sugiere que la removilización del nitrógeno se incrementó por la sobreexpresión de PPDK. Por lo tanto, cabria esperar un aumento en el contenido de aminoácidos de transporte en las hojas senescentes, como en las plantas Arabidopsis SAG12-PPDKgDHA. Sin embargo, en Arabidopsis se determinó el contenido de aminoácidos en hojas naturalmente senescentes, mientras que en el tabaco, la senescencia se indujo por desprendimiento de la hoja e incubación en la oscuridad. Puesto que los procesos que ocurren en la senescencia inducida por oscuridad y en la senescencia relacionada con la edad, son diferentes, es poco probable que los procesos que se dan en las hojas de tabaco sean análogos a los de las hojas de Arabidopsis .

Ejemplo 8 - Generación de plantas Arabidopsis que sobreexpresan PCK y PPDK La sobreexpresión de Arabidopsis PCK (At4g37870.1 ) durante la senescencia se logró al fusionar la región codificante y el clon genómico de PCK con el promotor 12 del gen asociado a la senescencia (SAG12) dentro del vector binario BNP1380000001, el cual se transformó en Arabidopsis thaliana, tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

La secuencia codificante At PCK se aisló primero a partir de ADNc Arabidopsis y la secuencia genómica se aisló de ADN genómico Arabidopsis mediante PCR, tal como se describe en el Ejemplo 1 con relación a PPDK. Sin embargo, los cebadores PCR se diseñaron incluyendo los codones de inicio e interrupción del gen PCK Arabidopsis thaliana (At) y también se incluyó un sitio de restricción Xbal en el cebador de avance, AtPCK-XbalFOR (SEQ ID NO. 25) y un sitio de restricción SacI en el cebador inverso, AtPCK-SacIREV (SEQ ID NO. 26), como se muestra en la Tabla 1, con la finalidad de facilitar la posterior ligación del gen en el vector BNP1380000001, lo cual se ilustra en la Figura 3a.

Los moldes de ADNc y ADN genómico usados para cada reacción PCR se prepararon según el Ejemplo 1. La mezcla de reacción PCR contenía amortiguador HF lx (NEB), 2 mM de cloruro de magnesio (NEB), 0.5 mM de dNTPs (Bioline), 100 ng de molde (ADNc o ADN genómico), 0.5 µ? de cada cebador y 1 unidad de polimerasa Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). El ciclo térmico se realizó en un equipo Techne Thermal Cycler con un paso de desnaturalización inicial de 98°C durante 30 segundos, seguido de 35 ciclos de 98°C durante 10 segundos, 60°C durante 30 segundos y un tiempo de extensión de 72°C durante 2 minutos 30 segundos para la región codificante y 4 minutos 30 segundos para el clon genómico. El último paso incluyó una extensión final a 72°C durante 10 minutos.

Estos productos PCR dieron como resultado una banda 2 kb para la secuencia codificante (ADNc) y una banda 3.5 kb para la secuencia genómica de PCK que se precipitaron con PEG. El ADN amplificado se ligó (Jlunt-end) al vector pCR 4Blunt-T0P0 (Invitrogen) según el protocolo recomendado, como se describió para PPDK en el Ejemplo 1. El plásmido se transformó después en células E. coli DH5a Library Efficiency. Se usó kanamicina (50 µg mi"1) como antibiótico selectivo. Las colonias positivas se seleccionaron por PCR de colonia con los cebadores AtPCK-XbalFOR (SEQ ID NO. 25) y AtPCK-SacIREV (SEQ ID NO. 26) para la región codificante y el clon genómico. Las colonias positivas se desarrollaron durante la noche en un incubador con agitación a 37°C en 5 mi de medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina.

El ADN plásmido se aisló con el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd. ) y se analizaron los tamaños de insertos por digestión con restricción enzimática secuencial. Esto se llevó a cabo por digestión de 1 µg de ADN con 10 unidades de Xbal y amortiguador Xbal lx a 37°C durante 2 horas y luego adicionando 10 unidades de SacI y amortiguador SacI lx a 37°C, durante la noche. El ADN plásmido que contenía los insertos correctos se secuenció utilizando AtPCK-XbalFOR/AtPCK-SacIREV. La secuencia se analizó por medio de BioEdit y la secuencia codificante AtPCK amplificada y la secuencia genómica se verificaron con BLASTX.

Con la finalidad de ligar la región codificante AtPCK y el clon genómico en el vector pBNP que se muestra en la Figura 3a, las colonias de E. coli que representan cada uno de los dos plásmidos se usaron para inocular 25 mi de medio LB que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina. Los cultivos se dejaron en agitación durante la noche a 37°C y el ADN plásmido se purificó utilizando el estuche QIAfilter plasmid midi kit (Qiagen Ltd.). El vector pBNP se purificó de modo idéntico pero a partir de 100 mi de un cultivo que contenía 50 µg mi"1 de kanamicina. Se realizó la misma digestión enzimática secuencial que describió en lo anterior, en todo el ADN plásmido purificado. 3 µg de ADN se sometieron a digestión para los plásmidos que contenían la región codificante y el clon genómico y 1 de ADN para el vector pBNP. Las muestras se separaron por electroforesis en gel con violeta cristal y los productos se purificaron con el equipo Qiaquick Gel Extraction (Qiagen Ltd) . El vector pBNP 14.4 kb se trató con fosfatasa alcalina para prevenir la autoligación y la región codificante y el clon genómico se ligaron al vector pBNP utilizando los digestos Xbal/Sacl. Células E. coli DH5a Library Efficiency se transformaron con 2 µ? de reacción de ligación y las colonias positivas se seleccionaron por PCR utilizando AtPCK-XbalFOR y AtPCK-SacIREV.

El ADN plásmido se extrajo de las colonias que contenían el inserto deseado mediante el estuche QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd. ) y después el ADN se sometió a digestión con 10 unidades de Xbal, 15 unidades de SacI y amortiguador Xbal lx a 37°C durante 2 horas. Dos colonias separadas de cada inserto de la secuencia codificante y la secuencia genómica en el vector pBNP, que mostraron el patrón esperado correcto de digestión enzimática de restricción, se seleccionaron y se secuenciaron con el cebador BNP-SAG12FWD (SEQ ID NO. 9). La secuencia se analizó con el programa BioEdit. Los constructos generados se denominaron pALBNPl (secuencia codificante) y pALBNP2 (secuencia genómica), tal como se muestra en la Figura 3b.

Se generaron cinco líneas homocigóticas de un inserto único y la sobreexpresión de PCK se verificó a través de inmunotransferencia tal como se describe en el Ejemplo 3, utilizando un anticuerpo específico para PCK. Se generó un antisuero policlonal en conejo utilizando los péptidos sintéticos diseñados contra la secuencia de aminoácidos de PCK. Las secuencias fueron (i) DEHCWTETGVSNIEG (SEQ ID NO. 27) y (Ü) CVDLSREKEPDIWNA (SEQ ID NO. 28), las cuales se sintetizaron por vía química y luego se acoplaron con hemocianina de lapa (keyhole limpet) antes de inyectarse conjuntamente en los conejos. Los resultados obtenidos con el anticuerpo se ilustran en la Figura 16, que muestra que las plantas transformadas tenían niveles elevados de proteína PCK.

Se generaron líneas celulares SAG12-PCK-PPDK por cruzamiento de transformantes SAG12-PCK simples (3)1 y (19)4 con una línea fuerte de sobreexpresión SAG12-PPDK. El análisis de las plantas que tenían elevados niveles de PCK y PPDK mostró aumento en la masa de rosetas, tal como se muestra en la Figura 17.

Por último, aunque los inventores no desean limitarlo a la hipótesis, la Figura 18 muestra una vía bioquímica especulativa que ilustra cómo la PCK y la PPDK pueden afectar la removilización del nitrógeno.

Constructos dobles PCK/PPDK Los inventores observaron que, cuando se transforman en una planta, los constructos simples de PCK y PPDK que se muestran en la Figura 3, dan como resultado índices mayores de removilización del nitrógeno de las hojas senescentes y también un aumento en la cantidad de crecimiento vegetal vegetativo (que corresponde a un aumento en el rendimiento del cultivo), cuando estas enzimas se sobreexpresan en hojas senescentes. Por lo tanto, los inventores decidieron producir dos constructos dobles en los que los genes que codifican para PCK y PPDK se insertaron juntos en pBNPl30000001 bajo el control del promotor SAG12.

El primer constructo doble se hizo al ligar el ADNg que codifica para PCK, en la dirección (es decir, el extremo 3') del fragmento de ADNg que codifica para PPDK del BNP-PPDKg DNA mediante digestión Xbal/SacI. Así, el promotor SAG12 en el plásmido fue responsable de la expresión tanto del gen PPDK como del gen PCK.

El segundo constructo doble se hizo al ligar el ADNg que codifica para PPDK, inmediatamente en la dirección del fragmento de ADNg que codifica para PCK del pALBNP2 mediante digestión Avrll/Bamñl . De nuevo, el promotor SAG12 fue responsable de la expresión tanto del gen PPDK como del gen PCK.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un constructo genético que comprende un promotor especifico de senescencia unido de manera operativa al menos a una secuencia codificante, que codifica para al menos un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) y/o actividad de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK).

2. Un constructo genético que comprende un promotor unido de manera operativa al menos a una secuencia codificante, que codifica para al menos un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK) y actividad de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK).

3. Un constructo genético según la reivindicación 2, en donde el promotor es un promotor especifico de senescencia.

4. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el promotor se aisla a partir de un gen asociado a senescencia en Arabidopsis-

5. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el promotor se selecciona a partir de un grupo que consiste en: SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 y SAG18, o una variante o fragmento funcionales del mismo, la variante o fragmento codifica para un promotor y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con cualquiera de los promotores enlistados.

6. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el promotor es un promotor SAG12, o una variante o fragmento funcionales del mismo, la variante o fragmento codifica para un promotor SAG12 y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con SAG12.

7. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el promotor comprende una secuencia nucleotídica prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 16, o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento codifica para un promotor y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 16.

8. Un constructo genético según la reivindicación 1, en donde la o las secuencias codificantes codifican para (i) una fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), o una variante o fragmento funcionales de la misma, y/o (ii) una piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK), O una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento codifica para PCK o PPDK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con PCK o PPDK.

9. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad PCK, se deriva de Arabidopsis.

10. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad PPDK, se deriva de Arabidopsis spp. , Zea spp. , Flaveria spp. o Cleome spp.

11. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad PCK, comprende una secuencia de ácido nucleico prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 17 o la SEQ ID NO. 18, o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento codifica para un polipéptido que tiene actividad PCK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO. 17 ó 18.

12. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido que tiene actividad PCK comprende una secuencia de aminoácidos prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 19, o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento comprende un polipéptido que tiene actividad PCK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 19.

13. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia codificante que codifica para el polipéptido que tiene actividad PPDK comprende una secuencia de ácido nucleico prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 20, la SEQ ID NO. 21 o la SEQ ID NO. 22, o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento codifica para un polipéptido que tiene actividad PPDK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 19.

14. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido que tiene actividad PPDK comprende una secuencia de aminoácidos prácticamente como la que se establece en la SEQ ID NO. 23 o la SEQ ID NO. 24, o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento comprende un polipéptido que tiene actividad PPDK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 23 ó 24.

15. Un constructo genético según la reivindicación 1, en donde el constructo codifica para PCK o una variante o fragmento funcionales de la misma y no para PPDK, la variante o fragmento codifica para PCK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con PCK.

16. Un constructo genético según la reivindicación 1, en donde el constructo codifica para PPDK o una variante o fragmento funcionales de la misma y no para PCK, la variante o fragmento codifica para PPDK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con PPDK.

17. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el constructo codifica para PCK o una variante o fragmento funcionales de la misma y para PPDK o una variante o fragmento funcionales de la misma, la variante o fragmento codifica para PCK o PPDK y tiene al menos 65% de identidad de secuencia con PCK o PPDK.

18. Un vector recombinante que comprende el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Un vector recombinante prácticamente como se que se ilustra en la Figura 3.

20. Un método para aumentar la concentración de PCK y/o PPDK en la hoja de una planta de prueba, por arriba de la concentración correspondiente de PCK y/o PPDK en una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta de prueba para lograr un aumento en los niveles de PCK y/o PPDK en las hojas de la planta después del inicio de la senescencia foliar.

21. Un método para disminuir la concentración de nitrógeno en las hojas de una planta de prueba, por debajo de la concentración correspondiente de nitrógeno en una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta en la planta de prueba para lograr un aumento en los niveles de PCK y/o PPDK en las hojas de la planta después del inicio de la senescencia foliar.

22. Un método para aumentar el índice de crecimiento de una planta de prueba comparado con el índice de crecimiento correspondiente de una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consiste en alterar el metabolismo de la planta en la planta de prueba para lograr un aumento en los niveles de PCK y/o PPDK en las hojas de la planta después del inicio de la senescencia foliar.

23. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde el método consiste en transformar una célula de una planta de prueba con un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o un vector según la reivindicación 18 o la reivindicación 19.

24. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el método consiste en aumentar la concentración de PCK y PPDK en las hojas de la planta, por arriba de la concentración correspondiente de PCK y PPDK en la planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones.

25. Una célula que comprende en constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector recombinante según la reivindicación 18 o la reivindicación 19.

26. Una planta transgénica que comprende el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector recombinante según la reivindicación 18 o la reivindicación 19.

27. Una planta transgénica según la reivindicación 26, en donde la planta es de la familia Brassicaceae .

28. Una planta transgénica según la reivindicación 26, en donde la planta es de la familia Poales .

29. Una planta transgénica según la reivindicación 26, en donde la planta es de la familia Solanaceae .

30. Un producto de propagación vegetal susceptible de obtenerse a partir de la planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 y que comprende el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector según la reivindicación 18 o la reivindicación 19.

31. Un producto de propagación vegetal según la reivindicación 30, en donde el producto de propagación vegetal es una semilla.

32. Un método para producir una planta transgénica que removiliza nitrógeno a mayor velocidad que la correspondiente planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consta de los siguientes pasos : i) transformar una célula vegetal con el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector según la reivindicación 18 o la reivindicación 19; y ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada .

33. Un método para producir una planta transgénica que tiene mayor índice de crecimiento que la correspondiente planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, el método consta de los siguientes pasos : i) transformar una célula vegetal con el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector según la reivindicación 18 o la reivindicación 19; y ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada .

34. Una hoja cosechada que contiene un nivel más bajo de nitrógeno que el nivel correspondiente de nitrógeno en una hoja cosechada de una planta tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones, en donde la hoja se cosecha a partir de la planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, o se produce por el método según la reivindicación 32 o la reivindicación 33 y comprende el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector según la reivindicación 18 ó 19.

35. Un artículo para fumar que contiene tabaco reducido en nitrógeno proveniente de una planta de tabaco mutante, esta mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrógeno en hojas senescentes.

36. Un artículo para fumar según la reivindicación 35, en donde el artículo para fumar está elaborado con tabaco obtenido a partir de una planta de tabaco mutante la cual se ha transformado con el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el vector según la reivindicación 18 o la reivindicación 19.