JP3210960B2 - Ｃ４植物の光合成酵素を発現するｃ３植物体 - Google Patents
Ｃ４植物の光合成酵素を発現するｃ３植物体Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、C4光合成経路を
構成する酵素の遺伝子（以下、C4光合成遺伝子）を有
し、このC4光合成遺伝子を高発現するC3植物に関する。
構成する酵素の遺伝子（以下、C4光合成遺伝子）を有
し、このC4光合成遺伝子を高発現するC3植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物は、その光合成炭酸固定経路におけ
る二酸化炭素の初期固定産物の種類から、C3植物、C4植
物および多肉植物型光合成(CAM)植物とに分類される。
地球上の植物の90％以上はC3植物に属し、例えば、イ
ネ、ムギ等の農業的に有用な植物が含まれる。このC3植
物の光合成経路は、カルビン経路とも呼ばれており、こ
の経路でCO2固定に関与する酵素は、リブロース-1,5-二
リン酸カルボキシラーゼである。この酵素は、CO2に対
する親和性が低く、逆に酸素に対する親和性が高いため
に、CO2固定反応、ひいては光合成反応の効率が低い。
る二酸化炭素の初期固定産物の種類から、C3植物、C4植
物および多肉植物型光合成(CAM)植物とに分類される。
地球上の植物の90％以上はC3植物に属し、例えば、イ
ネ、ムギ等の農業的に有用な植物が含まれる。このC3植
物の光合成経路は、カルビン経路とも呼ばれており、こ
の経路でCO2固定に関与する酵素は、リブロース-1,5-二
リン酸カルボキシラーゼである。この酵素は、CO2に対
する親和性が低く、逆に酸素に対する親和性が高いため
に、CO2固定反応、ひいては光合成反応の効率が低い。
【０００３】他方で、C4植物は、この非効率的なCO2固
定反応を克服すべく進化した植物であり、 CO2を濃縮す
る機構を有し、高い光合成能を有している。このC4植物
の光合成経路におけるCO2固定に関与する酵素は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである。この酵
素は、酸素による活性阻害を受けず、CO2の固定化能が
高い。
定反応を克服すべく進化した植物であり、 CO2を濃縮す
る機構を有し、高い光合成能を有している。このC4植物
の光合成経路におけるCO2固定に関与する酵素は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである。この酵
素は、酸素による活性阻害を受けず、CO2の固定化能が
高い。
【０００４】CAM植物は、乾燥した環境に適応した光合
成系を有しており、この光合成系は、C3光合成の一種の
進化した形態と考えられている。
成系を有しており、この光合成系は、C3光合成の一種の
進化した形態と考えられている。
【０００５】C3植物にC4植物の光合成機能を付与するこ
とにより、農業的に有用なC3植物（例えば、イネ）の光
合成能、物質生産能が大きく改善されることが期待され
る。そこで、C4光合成遺伝子をC3植物に導入する試み
が、いくつかなされている。例えば、C3植物の葉組織で
高発現するプロモーター（例えば、クロロフィルa/b結
合タンパク質遺伝子プロモーターあるいは、カリフラワ
ーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター）にC4植物
の光合成遺伝子（ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ(PEPC)遺伝子）を結合して組換えDNAを作成し、C
3植物であるタバコに導入した報告があるが、C3植物内
でのPEPC活性は、高く見積もっても、2-3倍増加するに
すぎなかった（Kogamiら、Transgenic Research 3: 287
-296(1994)）。他方で、C4光合成遺伝子のプロモーター
の作用を検討する目的で、大腸菌のβ-グルクロニダー
ゼ(GUS)遺伝子とPEPC遺伝子の5'隣接領域（プロモータ
ー領域）との融合遺伝子をC3植物であるタバコに導入し
て、GUS遺伝子を高レベルで発現させた例が報告されて
いる（Matsuokaら、Plant Physiol. 111:949-957 (199
6)）。しかし、C4光合成遺伝子の発現調節領域（プロモ
ーター活性領域）を有するトウモロコシのPEPCゲノム遺
伝子をタバコに導入したが、そのPEPC活性はほんの2〜3
倍に増加したにすぎないという報告もある（Hudspeth
ら、Plant Physiol.98:458-464(1992)）。従って、現実
に光合成に関与する酵素の遺伝子が高発現した例は報告
されておらず、C3植物内でC4植物の光合成遺伝子を高度
に発現させ、C3植物の光合成能力を高める技術が期待さ
れている。
とにより、農業的に有用なC3植物（例えば、イネ）の光
合成能、物質生産能が大きく改善されることが期待され
る。そこで、C4光合成遺伝子をC3植物に導入する試み
が、いくつかなされている。例えば、C3植物の葉組織で
高発現するプロモーター（例えば、クロロフィルa/b結
合タンパク質遺伝子プロモーターあるいは、カリフラワ
ーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター）にC4植物
の光合成遺伝子（ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ(PEPC)遺伝子）を結合して組換えDNAを作成し、C
3植物であるタバコに導入した報告があるが、C3植物内
でのPEPC活性は、高く見積もっても、2-3倍増加するに
すぎなかった（Kogamiら、Transgenic Research 3: 287
-296(1994)）。他方で、C4光合成遺伝子のプロモーター
の作用を検討する目的で、大腸菌のβ-グルクロニダー
ゼ(GUS)遺伝子とPEPC遺伝子の5'隣接領域（プロモータ
ー領域）との融合遺伝子をC3植物であるタバコに導入し
て、GUS遺伝子を高レベルで発現させた例が報告されて
いる（Matsuokaら、Plant Physiol. 111:949-957 (199
6)）。しかし、C4光合成遺伝子の発現調節領域（プロモ
ーター活性領域）を有するトウモロコシのPEPCゲノム遺
伝子をタバコに導入したが、そのPEPC活性はほんの2〜3
倍に増加したにすぎないという報告もある（Hudspeth
ら、Plant Physiol.98:458-464(1992)）。従って、現実
に光合成に関与する酵素の遺伝子が高発現した例は報告
されておらず、C3植物内でC4植物の光合成遺伝子を高度
に発現させ、C3植物の光合成能力を高める技術が期待さ
れている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は上記の問題
点を解決するためのものであり、その目的とするところ
は、C3植物内でC4植物の光合成遺伝子を高発現させるこ
とにある。
点を解決するためのものであり、その目的とするところ
は、C3植物内でC4植物の光合成遺伝子を高発現させるこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記のように、C4植物ト
ウモロコシ（イネ科）の光合成経路を構成するゲノム遺
伝子(PEPC)をC3植物であるタバコ（ナス科）に導入する
試みがなされた例があるが、発現効率が低かった。しか
し、本願発明者らは、C3植物と進化系統学的に近縁なC4
植物の光合成経路を構成する酵素の発現調節領域とC4光
合成経路を構成する酵素の構造遺伝子とを同時にC3植物
に導入することにより、C4植物の光合成経路を構成する
酵素の発現効率が大きく向上することを見いだして、本
願発明を完成させたものである。
ウモロコシ（イネ科）の光合成経路を構成するゲノム遺
伝子(PEPC)をC3植物であるタバコ（ナス科）に導入する
試みがなされた例があるが、発現効率が低かった。しか
し、本願発明者らは、C3植物と進化系統学的に近縁なC4
植物の光合成経路を構成する酵素の発現調節領域とC4光
合成経路を構成する酵素の構造遺伝子とを同時にC3植物
に導入することにより、C4植物の光合成経路を構成する
酵素の発現効率が大きく向上することを見いだして、本
願発明を完成させたものである。
【０００８】本願発明は、進化系統学的に近縁なC4植物
の遺伝子を発現するC3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子であって、該C4植物の光合成経路を構成する酵素
の遺伝子の発現調節領域および該C4植物の光合成経路を
構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNAを有し、該C4
植物の光合成経路を構成する酵素を高度に発現するC3植
物体、C3植物組織、またはC3植物種子に関する。
の遺伝子を発現するC3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子であって、該C4植物の光合成経路を構成する酵素
の遺伝子の発現調節領域および該C4植物の光合成経路を
構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNAを有し、該C4
植物の光合成経路を構成する酵素を高度に発現するC3植
物体、C3植物組織、またはC3植物種子に関する。
【０００９】好適な実施態様においては、前記C4植物が
単子葉植物であり、C3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子が、単子葉植物の植物体、植物組織、または植物
種子である。
単子葉植物であり、C3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子が、単子葉植物の植物体、植物組織、または植物
種子である。
【００１０】また、好適な実施態様においては、前記C4
植物が双子葉植物であり、前記C3植物体、C3植物組織、
またはC3植物種子が双子葉植物の植物体、植物組織、ま
たは植物種子である。
植物が双子葉植物であり、前記C3植物体、C3植物組織、
またはC3植物種子が双子葉植物の植物体、植物組織、ま
たは植物種子である。
【００１１】さらに好適な実施態様においては、前記C4
植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領
域およびC4植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝
子を含有するDNAがC4植物のゲノム遺伝子である。
植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領
域およびC4植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝
子を含有するDNAがC4植物のゲノム遺伝子である。
【００１２】より好適な実施態様においては、前記C4植
物のゲノム遺伝子が、イネ科植物のゲノム遺伝子であ
り、前記C3植物がイネ科植物、イネ科植物組織、または
イネ科植物種子である。
物のゲノム遺伝子が、イネ科植物のゲノム遺伝子であ
り、前記C3植物がイネ科植物、イネ科植物組織、または
イネ科植物種子である。
【００１３】最も好適な実施態様においては、前記C4植
物のゲノム遺伝子が、トウモロコシのホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼのゲノム遺伝子であり、前記
C3イネ科植物がイネである。
物のゲノム遺伝子が、トウモロコシのホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼのゲノム遺伝子であり、前記
C3イネ科植物がイネである。
【００１４】さらに、本願発明は、進化系統学的に近縁
なC4植物の光合成経路を構成する酵素を高度に発現させ
るC3植物体、C3植物組織、またはC3植物種子の作成方法
であって、進化系統学的に近縁なC4植物の光合成経路を
構成する酵素の遺伝子の発現調節領域および該C4植物の
光合成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNA
でC3植物の細胞を形質転換する工程；該形質転換された
C3植物細胞をC3植物組織またはC3植物体に再生する工
程；を含み、C3植物種子の場合には、さらに、該C3植物
体から種子を取得する工程；を含む。
なC4植物の光合成経路を構成する酵素を高度に発現させ
るC3植物体、C3植物組織、またはC3植物種子の作成方法
であって、進化系統学的に近縁なC4植物の光合成経路を
構成する酵素の遺伝子の発現調節領域および該C4植物の
光合成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNA
でC3植物の細胞を形質転換する工程；該形質転換された
C3植物細胞をC3植物組織またはC3植物体に再生する工
程；を含み、C3植物種子の場合には、さらに、該C3植物
体から種子を取得する工程；を含む。
【００１５】好適な実施態様においては、前記C4植物が
単子葉植物であり、C3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子が、単子葉植物の植物体、植物組織、または植物
種子である。
単子葉植物であり、C3植物体、C3植物組織、またはC3植
物種子が、単子葉植物の植物体、植物組織、または植物
種子である。
【００１６】また、好適な実施態様においては、前記C4
植物が双子葉植物であり、前記C3植物体、C3植物組織、
またはC3植物種子が双子葉植物の植物体、植物組織、ま
たは植物種子である。
植物が双子葉植物であり、前記C3植物体、C3植物組織、
またはC3植物種子が双子葉植物の植物体、植物組織、ま
たは植物種子である。
【００１７】さらに好適な実施態様においては、前記C4
植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領
域およびC4植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝
子を含有するDNAがC4植物のゲノム遺伝子である。
植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領
域およびC4植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝
子を含有するDNAがC4植物のゲノム遺伝子である。
【００１８】より好適な実施態様においては、前記C4植
物のゲノム遺伝子が、イネ科植物のゲノム遺伝子であ
り、前記C3植物がイネ科植物、イネ科植物組織、または
イネ科植物種子である。
物のゲノム遺伝子が、イネ科植物のゲノム遺伝子であ
り、前記C3植物がイネ科植物、イネ科植物組織、または
イネ科植物種子である。
【００１９】最も好適な実施態様においては、前記C4植
物のゲノム遺伝子が、トウモロコシのホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼのゲノム遺伝子であり、前記
C3イネ科植物がイネである。
物のゲノム遺伝子が、トウモロコシのホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼのゲノム遺伝子であり、前記
C3イネ科植物がイネである。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を詳しく説明す
る。
る。
【００２１】（定義）本願明細書で「進化系統学的に近
縁な」というときは、分類学的に近縁関係にあることを
いい、例えば、同じ科に属することを意味する。
縁な」というときは、分類学的に近縁関係にあることを
いい、例えば、同じ科に属することを意味する。
【００２２】本願明細書で「植物」というときは、植物
体、植物細胞、植物組織、および種子を含む。
体、植物細胞、植物組織、および種子を含む。
【００２３】C3植物というときには、C3光合成経路でCO
2を固定する植物をいい、イネ、コムギ、オオムギ等の
単子葉植物、およびダイズ、ジャガイモ、サツマイモ等
の双子葉植物が含まれる。
2を固定する植物をいい、イネ、コムギ、オオムギ等の
単子葉植物、およびダイズ、ジャガイモ、サツマイモ等
の双子葉植物が含まれる。
【００２４】C4植物は、C4光合成経路でCO2を固定する
植物であり、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム等の
単子葉植物、フラベリア、アマランサスなどの双子葉植
物が含まれる。
植物であり、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム等の
単子葉植物、フラベリア、アマランサスなどの双子葉植
物が含まれる。
【００２５】「C4光合成経路を構成する酵素」は、C4植
物の光合成に関与する酵素をいい、炭酸脱水酵素(CA)、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、ピ
ルビン酸オルソホスフェートジキナーゼ(PPDK)、マレー
トデヒドロゲナーゼ(MDH)、リンゴ酸酵素、アラニン−
オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)等が挙げられ
る。これらの酵素の遺伝子の発現調節領域および構造遺
伝子は、本願発明に用いられ得る。
物の光合成に関与する酵素をいい、炭酸脱水酵素(CA)、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、ピ
ルビン酸オルソホスフェートジキナーゼ(PPDK)、マレー
トデヒドロゲナーゼ(MDH)、リンゴ酸酵素、アラニン−
オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)等が挙げられ
る。これらの酵素の遺伝子の発現調節領域および構造遺
伝子は、本願発明に用いられ得る。
【００２６】本願明細書で「高度に発現する」とは、C3
植物内にC4植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子を
導入したときに、導入後のC3植物緑葉粗抽出液中の酵素
の比活性（単位蛋白質量当たりの活性）が、導入前のC3
植物内の酵素の比活性の少なくとも10倍以上であること
をいう。好ましくは40倍以上、より好ましくは75倍以
上、最も好ましくは100倍以上である。
植物内にC4植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子を
導入したときに、導入後のC3植物緑葉粗抽出液中の酵素
の比活性（単位蛋白質量当たりの活性）が、導入前のC3
植物内の酵素の比活性の少なくとも10倍以上であること
をいう。好ましくは40倍以上、より好ましくは75倍以
上、最も好ましくは100倍以上である。
【００２７】本願明細書で「発現調節領域」というとき
は、構造遺伝子の発現を調節する配列を有する領域をい
う。発現調節領域には、例えば、転写調節配列、転写後
調節配列、および/または転写終結配列等が含まれる
が、これらに限定されない。「転写調節配列」は、プロ
モーター、リプレッサー、アクチベーター、エンハンサ
ーなどの配列を含む。「転写後調節配列」は、一次転写
産物が、転写後プロセッシング（例えば、poly A付加、
キャップ構造の生成、スプライシング等）を受けるとき
に関与する配列を含む。「転写終結配列」は、ターミネ
ーター等の転写の終結に関与する配列を含む。これらの
発現調節領域は、その特性に応じて、構造遺伝子の上
流、あるいは下流に分離して配置され得る。なお、イン
トロンも、発現調節領域に相当する。
は、構造遺伝子の発現を調節する配列を有する領域をい
う。発現調節領域には、例えば、転写調節配列、転写後
調節配列、および/または転写終結配列等が含まれる
が、これらに限定されない。「転写調節配列」は、プロ
モーター、リプレッサー、アクチベーター、エンハンサ
ーなどの配列を含む。「転写後調節配列」は、一次転写
産物が、転写後プロセッシング（例えば、poly A付加、
キャップ構造の生成、スプライシング等）を受けるとき
に関与する配列を含む。「転写終結配列」は、ターミネ
ーター等の転写の終結に関与する配列を含む。これらの
発現調節領域は、その特性に応じて、構造遺伝子の上
流、あるいは下流に分離して配置され得る。なお、イン
トロンも、発現調節領域に相当する。
【００２８】「C4植物の光合成経路を構成する酵素遺伝
子の発現調節領域およびC4植物の光合成経路を構成する
酵素の構造遺伝子を含有するDNA」というときには、こ
のDNAは、発現調節領域と酵素の構造遺伝子との組換えD
NA配列、発現調節領域と酵素の構造遺伝子とを含むゲノ
ム遺伝子配列、または、この組換えDNA配列あるいはゲ
ノム遺伝子配列を含む発現ベクターを意味する。このDN
Aには、化学合成したDNAも含まれる。
子の発現調節領域およびC4植物の光合成経路を構成する
酵素の構造遺伝子を含有するDNA」というときには、こ
のDNAは、発現調節領域と酵素の構造遺伝子との組換えD
NA配列、発現調節領域と酵素の構造遺伝子とを含むゲノ
ム遺伝子配列、または、この組換えDNA配列あるいはゲ
ノム遺伝子配列を含む発現ベクターを意味する。このDN
Aには、化学合成したDNAも含まれる。
【００２９】構造遺伝子というときは、酵素タンパク質
部分をコードするDNA(イントロンを含んでいてもよい)
およびmRNAからのcDNAを含む。
部分をコードするDNA(イントロンを含んでいてもよい)
およびmRNAからのcDNAを含む。
【００３０】発現ベクターは、「C4植物の光合成経路を
構成する酵素遺伝子の発現調節領域およびC4植物の光合
成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNA」が
組み込まれ、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されて
いる核酸配列をいう。この発現ベクターには、導入され
るC4植物の発現調節領域以外の、発現調節配列（例え
ば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の
種々の調節エレメント）が含まれ得る。この発現調節配
列がC4植物の発現調節にも用いられ得る。
構成する酵素遺伝子の発現調節領域およびC4植物の光合
成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するDNA」が
組み込まれ、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されて
いる核酸配列をいう。この発現ベクターには、導入され
るC4植物の発現調節領域以外の、発現調節配列（例え
ば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の
種々の調節エレメント）が含まれ得る。この発現調節配
列がC4植物の発現調節にも用いられ得る。
【００３１】（C4植物の光合成経路を構成する酵素の発
現調節領域および構造遺伝子の単離）本願発明において
は、進化系統学的に近縁なC4植物とC3植物とを用いる。
好ましくは、同じ科に属する植物である。より好適に
は、C4単子葉植物の遺伝子を用いる場合には、C3単子葉
植物に形質転換するか、C4双子葉植物の遺伝子を用いる
場合には、C3双子葉植物に形質転換する。
現調節領域および構造遺伝子の単離）本願発明において
は、進化系統学的に近縁なC4植物とC3植物とを用いる。
好ましくは、同じ科に属する植物である。より好適に
は、C4単子葉植物の遺伝子を用いる場合には、C3単子葉
植物に形質転換するか、C4双子葉植物の遺伝子を用いる
場合には、C3双子葉植物に形質転換する。
【００３２】C4植物の光合成経路を構成する酵素の構造
遺伝子は、周知の方法で単離され得る。この酵素の構造
遺伝子の転写産物であるmRNAを単離し、これからcDNAを
作成する。このcDNAを用いて、ゲノムDNAをスクリーニ
ングし、この酵素の発現調節領域を取得し得る。トウモ
ロコシのPEPCを含む約8Kbのゲノム遺伝子断片はすでに
単離されており（Eur. J. Biochem. 181:593-598, 198
9）、このゲノム遺伝子断片は、PEPC構造遺伝子の上流
および下流、ならびにイントロンという発現調節領域を
含んでいるので、そのまま用いられ得る。
遺伝子は、周知の方法で単離され得る。この酵素の構造
遺伝子の転写産物であるmRNAを単離し、これからcDNAを
作成する。このcDNAを用いて、ゲノムDNAをスクリーニ
ングし、この酵素の発現調節領域を取得し得る。トウモ
ロコシのPEPCを含む約8Kbのゲノム遺伝子断片はすでに
単離されており（Eur. J. Biochem. 181:593-598, 198
9）、このゲノム遺伝子断片は、PEPC構造遺伝子の上流
および下流、ならびにイントロンという発現調節領域を
含んでいるので、そのまま用いられ得る。
【００３３】別のC4光合成経路を構成する遺伝子、PPDK
ゲノム遺伝子（トウモロコシ）もまた、単離されており
（Matsuokaら、J. Biol. Chem. 265:16772-16777(199
0)）、本願発明に用いられ得る。このPPDKゲノム遺伝子
の発現調節領域は、PEPCと類似性があり、これらの発現
調節領域は、本願発明に用いられ得る。さらに、NADP-
リンゴ酸酵素のゲノム遺伝子も単離されており(Rotherm
elら、 J. Biol. Chem.264:19587-19592, 1989)、この
ゲノム遺伝子の発現調節領域および構造遺伝子も本願発
明に用いられ得る。
ゲノム遺伝子（トウモロコシ）もまた、単離されており
（Matsuokaら、J. Biol. Chem. 265:16772-16777(199
0)）、本願発明に用いられ得る。このPPDKゲノム遺伝子
の発現調節領域は、PEPCと類似性があり、これらの発現
調節領域は、本願発明に用いられ得る。さらに、NADP-
リンゴ酸酵素のゲノム遺伝子も単離されており(Rotherm
elら、 J. Biol. Chem.264:19587-19592, 1989)、この
ゲノム遺伝子の発現調節領域および構造遺伝子も本願発
明に用いられ得る。
【００３４】これらのC4光合成経路を構成する酵素（例
えば、PEPC、PPDK、リンゴ酸酵素）遺伝子の発現調節領
域を用いて、炭酸脱水酵素(CA)、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、ピルビン酸オルソホスフ
ェートジキナーゼ(PPDK)、マレートデヒドロゲナーゼ(M
DH)、リンゴ酸酵素、アラニン−オキサロ酢酸アミノト
ランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シキナーゼ(PEPCK)の構造遺伝子等が発現され得る。
えば、PEPC、PPDK、リンゴ酸酵素）遺伝子の発現調節領
域を用いて、炭酸脱水酵素(CA)、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、ピルビン酸オルソホスフ
ェートジキナーゼ(PPDK)、マレートデヒドロゲナーゼ(M
DH)、リンゴ酸酵素、アラニン−オキサロ酢酸アミノト
ランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シキナーゼ(PEPCK)の構造遺伝子等が発現され得る。
【００３５】また、マレートデヒドロゲナーゼ、あるい
はアラニン−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼの
構造遺伝子は、当業者に周知の方法：これらの酵素を単
離、精製し、一部のアミノ酸配列を決定し、その決定し
たアミノ酸配列に基づいてプローブを作成し、ハイブリ
ダイズすること：により、単離され得る。これらの酵素
の発現調節領域もまた、本願発明に用いられ得る。得ら
れた酵素をコードするゲノム遺伝子が発現調節領域と構
造遺伝子とを含んでいれば、このゲノム遺伝子がそのま
ま用いられ得る。C4植物の光合成経路を構成する酵素の
遺伝子の発現調節領域は、他の植物遺伝子の発現領域の
配列と比較して決定され得る。
はアラニン−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼの
構造遺伝子は、当業者に周知の方法：これらの酵素を単
離、精製し、一部のアミノ酸配列を決定し、その決定し
たアミノ酸配列に基づいてプローブを作成し、ハイブリ
ダイズすること：により、単離され得る。これらの酵素
の発現調節領域もまた、本願発明に用いられ得る。得ら
れた酵素をコードするゲノム遺伝子が発現調節領域と構
造遺伝子とを含んでいれば、このゲノム遺伝子がそのま
ま用いられ得る。C4植物の光合成経路を構成する酵素の
遺伝子の発現調節領域は、他の植物遺伝子の発現領域の
配列と比較して決定され得る。
【００３６】C4植物の光合成経路を構成する酵素の発現
調節領域と構造遺伝子とを有する組換え遺伝子は、当業
者に周知の方法で作成され得る。この組換え遺伝子は、
複数の発現調節領域および/または構造遺伝子を有し得
る。
調節領域と構造遺伝子とを有する組換え遺伝子は、当業
者に周知の方法で作成され得る。この組換え遺伝子は、
複数の発現調節領域および/または構造遺伝子を有し得
る。
【００３７】得られたC4植物の光合成経路を構成する酵
素のゲノム遺伝子、または、上記で得られた組換えDNA
配列は、そのまま、またはベクターに接続して発現ベク
ターの形態で、C3植物の形質転換に用いられ得る。な
お、組み込まれる組換えDNA配列またはゲノム遺伝子は
複数でもよく、２種以上でもよい。
素のゲノム遺伝子、または、上記で得られた組換えDNA
配列は、そのまま、またはベクターに接続して発現ベク
ターの形態で、C3植物の形質転換に用いられ得る。な
お、組み込まれる組換えDNA配列またはゲノム遺伝子は
複数でもよく、２種以上でもよい。
【００３８】（発現ベクターの構築）発現ベクター作成
のためのベクターは、発現の目的、および宿主細胞に応
じて選択され得ることは、当業者に周知の事項である。
出発ベクターは、好適には、プロモーター、エンハンサ
ー、Ｔ−ＤＮＡ領域と薬剤耐性遺伝子とを有し得る。
のためのベクターは、発現の目的、および宿主細胞に応
じて選択され得ることは、当業者に周知の事項である。
出発ベクターは、好適には、プロモーター、エンハンサ
ー、Ｔ−ＤＮＡ領域と薬剤耐性遺伝子とを有し得る。
【００３９】本願発明の発現ベクター作成に用いるベク
ターには、C4植物遺伝子を発現するためのプロモーター
は必ずしも必要ではない。進化系統学的に近縁なC4植物
の発現調節領域（プロモーター）は、C3植物の発現調節
系でも機能すると考えられるからである。しかし、本願
発明に用いる発現ベクターには発現調節領域が存在する
ことが好ましい場合がある。この場合のプロモーターと
しては、例えば、タバコの感染特異的タンパク質PR1aの
などのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモ
ーター、CaMV 35Sプロモーター、ノパリン合成酵素(NO
S)のプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されな
い。
ターには、C4植物遺伝子を発現するためのプロモーター
は必ずしも必要ではない。進化系統学的に近縁なC4植物
の発現調節領域（プロモーター）は、C3植物の発現調節
系でも機能すると考えられるからである。しかし、本願
発明に用いる発現ベクターには発現調節領域が存在する
ことが好ましい場合がある。この場合のプロモーターと
しては、例えば、タバコの感染特異的タンパク質PR1aの
などのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモ
ーター、CaMV 35Sプロモーター、ノパリン合成酵素(NO
S)のプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されな
い。
【００４０】高発現のためにはエンハンサーが用いられ
得る。エンハンサーとしては、上記CaMV 35Sプロモータ
ー上流の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エ
ンハンサーは複数個用いられ得る。
得る。エンハンサーとしては、上記CaMV 35Sプロモータ
ー上流の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エ
ンハンサーは複数個用いられ得る。
【００４１】ターミネーターもまた、使用され得る。タ
ーミネーターとしては、CaMV35Sターミネーター、ノパ
リン合成酵素のターミネーター(TNOS）、タバコPR1a遺
伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定され
ない。
ーミネーターとしては、CaMV35Sターミネーター、ノパ
リン合成酵素のターミネーター(TNOS）、タバコPR1a遺
伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定され
ない。
【００４２】薬剤耐性遺伝子としては、形質転換植物の
選抜が容易であることが望ましい。ネオマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ2（NPT2)遺伝子、ハイグロマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子等が好
適に用いられ得る。薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモ
ーターは、上記植物遺伝子プロモーターが挙げられるが
これらに限定されない。好適には、構成的に高発現する
CaMV35Sプロモーターが使用され得る。なお、NPT2遺伝
子は、形質転換株、形質転換細胞の検出に有用である。
HPT遺伝子は、植物の核ゲノムに遺伝子が組み込まれた
ときに発現し、植物がハイグロマイシン抵抗性となるの
で、核ゲノムへ遺伝子が導入されたことが確認される。
選抜が容易であることが望ましい。ネオマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ2（NPT2)遺伝子、ハイグロマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子等が好
適に用いられ得る。薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモ
ーターは、上記植物遺伝子プロモーターが挙げられるが
これらに限定されない。好適には、構成的に高発現する
CaMV35Sプロモーターが使用され得る。なお、NPT2遺伝
子は、形質転換株、形質転換細胞の検出に有用である。
HPT遺伝子は、植物の核ゲノムに遺伝子が組み込まれた
ときに発現し、植物がハイグロマイシン抵抗性となるの
で、核ゲノムへ遺伝子が導入されたことが確認される。
【００４３】本願発明に用いる発現ベクター構築の出発
ベクターとして、pBI系のベクター、pUC系のベクターあ
るいはpTRA系のベクターが好適に用いられ得る。pBI系
のバイナリーベクターが好適に用いられ得る。このベク
ターは、植物に導入されうる領域(T-領域)の遺伝子と、
マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現
されるNPT２遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）と
を含んでいる。pBI系のベクターはアグロバクテリウム
を介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。例えば、pB
I121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。好
適には、pBI101およびそれに由来するベクターが用いら
れ得る。
ベクターとして、pBI系のベクター、pUC系のベクターあ
るいはpTRA系のベクターが好適に用いられ得る。pBI系
のバイナリーベクターが好適に用いられ得る。このベク
ターは、植物に導入されうる領域(T-領域)の遺伝子と、
マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現
されるNPT２遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）と
を含んでいる。pBI系のベクターはアグロバクテリウム
を介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。例えば、pB
I121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。好
適には、pBI101およびそれに由来するベクターが用いら
れ得る。
【００４４】pUC系のベクターとしては、例えば、pUC1
8、pUC19、pUC9などが挙げられる。
8、pUC19、pUC9などが挙げられる。
【００４５】ベクターへのC4植物の光合成経路を構成す
る酵素の発現調節領域と構造遺伝子とを含有するDNAと
の結合は、当業者に周知の方法で作成され得る。例え
ば、pBIベクターを用いる場合には、マルチクローニン
グ部位を適切な酵素で切断し、目的のDNAを挿入し、大
腸菌に形質転換して、形質転換株を選択し、発現ベクタ
ーを回収する。
る酵素の発現調節領域と構造遺伝子とを含有するDNAと
の結合は、当業者に周知の方法で作成され得る。例え
ば、pBIベクターを用いる場合には、マルチクローニン
グ部位を適切な酵素で切断し、目的のDNAを挿入し、大
腸菌に形質転換して、形質転換株を選択し、発現ベクタ
ーを回収する。
【００４６】（C3植物細胞への組換えDNA配列あるいは
発現ベクターの導入）形質転換されるC3植物には、イ
ネ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ジャガイモ等が含まれ
るが、これらに限定されない。これらの植物体からの植
物細胞は、当業者に周知の方法で、調製され得る。
発現ベクターの導入）形質転換されるC3植物には、イ
ネ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ジャガイモ等が含まれ
るが、これらに限定されない。これらの植物体からの植
物細胞は、当業者に周知の方法で、調製され得る。
【００４７】調製された植物細胞への組換えDNA配列あ
るいは発現ベクターの導入は、アグロバクテリウムを介
する方法と直接細胞に導入する方法とがある。アグロバ
クテリウムを介する方法は、例えば、Nagelらの方法(FE
MS Microbiol. Lett., 67, 325(1990))が用いられ得
る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクト
ロポレーションによってアグロバクテリウムに形質転換
し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlan
t Molecular Biology Manual (S. B. Gelvin etal., Ac
ademic Press Publishers) に記載の方法で植物細胞に
導入する方法である。発現ベクターを直接細胞に導入す
る方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃
法がある。
るいは発現ベクターの導入は、アグロバクテリウムを介
する方法と直接細胞に導入する方法とがある。アグロバ
クテリウムを介する方法は、例えば、Nagelらの方法(FE
MS Microbiol. Lett., 67, 325(1990))が用いられ得
る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクト
ロポレーションによってアグロバクテリウムに形質転換
し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlan
t Molecular Biology Manual (S. B. Gelvin etal., Ac
ademic Press Publishers) に記載の方法で植物細胞に
導入する方法である。発現ベクターを直接細胞に導入す
る方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃
法がある。
【００４８】（組換え植物細胞の植物体または植物組織
への再生）組換え遺伝子または発現ベクターを導入され
たC3植物細胞は、まず、カナマイシン耐性等の薬剤耐性
で選択され、ついで、常法により、植物組織、植物体に
再生され、種子が取得され得る。形質転換されたC3植物
におけるC4植物の光合成経路を構成する酵素の発現の確
認には、当業者に周知の方法が用いられ得る。例えば、
イネ科植物の植物組織、植物の葉から常法に従って、DN
Aを抽出し、導入したC4光合成遺伝子の一部の配列をプ
ローブとして用いるサザーンハイブリダイゼーション、
あるいは、タンパク質を抽出して活性を測定するか、活
性染色して、形質転換および発現を確認し得る。
への再生）組換え遺伝子または発現ベクターを導入され
たC3植物細胞は、まず、カナマイシン耐性等の薬剤耐性
で選択され、ついで、常法により、植物組織、植物体に
再生され、種子が取得され得る。形質転換されたC3植物
におけるC4植物の光合成経路を構成する酵素の発現の確
認には、当業者に周知の方法が用いられ得る。例えば、
イネ科植物の植物組織、植物の葉から常法に従って、DN
Aを抽出し、導入したC4光合成遺伝子の一部の配列をプ
ローブとして用いるサザーンハイブリダイゼーション、
あるいは、タンパク質を抽出して活性を測定するか、活
性染色して、形質転換および発現を確認し得る。
【００４９】（光合成能の測定）形質転換植物の光合成
活性（CO2補償点）は、例えば、Hudspethら、Plant Phy
siol. 98:458-464(1992)の記載に従って、ADC赤外線ガ
ス分析器を用いて、測定され得る。簡潔に述べると、生
葉を、プレキシグラスチャンバー（Plexiglass chambe
r）にシールし、1000μmol/m2/sの光合成光量子流量密
度で照射下、温度を30℃に保ち、チャンバー内の空気を
攪拌しながら、連続的にCO2濃度を測定し、チャンバー
内のCO2濃度が一定になる濃度を測定する。
活性（CO2補償点）は、例えば、Hudspethら、Plant Phy
siol. 98:458-464(1992)の記載に従って、ADC赤外線ガ
ス分析器を用いて、測定され得る。簡潔に述べると、生
葉を、プレキシグラスチャンバー（Plexiglass chambe
r）にシールし、1000μmol/m2/sの光合成光量子流量密
度で照射下、温度を30℃に保ち、チャンバー内の空気を
攪拌しながら、連続的にCO2濃度を測定し、チャンバー
内のCO2濃度が一定になる濃度を測定する。
【００５０】
【実施例】以下、C4植物の光合成経路を構成する酵素の
発現調節領域と構造遺伝子とを有するDNAとしてトウモ
ロコシのPEPCのゲノム遺伝子を、C3植物としてイネを例
にあげて本願発明を具体的に説明するが、本願発明がこ
の実施例に限定されないことは言うまでもない。なお、
この実施例で使用した制限酵素、プラスミド等は宝酒造
株式会社、東洋紡績株式会社等から入手可能である。
発現調節領域と構造遺伝子とを有するDNAとしてトウモ
ロコシのPEPCのゲノム遺伝子を、C3植物としてイネを例
にあげて本願発明を具体的に説明するが、本願発明がこ
の実施例に限定されないことは言うまでもない。なお、
この実施例で使用した制限酵素、プラスミド等は宝酒造
株式会社、東洋紡績株式会社等から入手可能である。
【００５１】（実施例１：トウモロコシPEPCゲノム遺伝
子の単離） トウモロコシPEPCゲノム遺伝子は、文献（Eur. J. Bioc
hem. 181:593-598, 1989）に記載の方法で単離した。ト
ウモロコシ(Zea mays L. cv. Golden Cross Bantam)を
バームキュライトに植えて、培養室で30℃、4日間、暗
条件および明条件(20Klx)下で、培養した。Matsuoka
ら、Plant Physiol. 85: 942-946 (1987)の方法に従っ
て、黄化した葉から、ゲノムDNAを単離した。このゲノ
ムDNAをXbaIで切断し、10-40％の蔗糖密度勾配遠心で分
画した。得られたXbaI断片をXbaIアームを有するファー
ジλong C (Stratagene社）に組み込み、インビトロパ
ッケージングし、Matsuokaら、Plant Cell Physiol. 3
0:479-486(1989)に記載の配列5'-GTCCACGAGAAGATCCAGGG
-3'をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼ
ーションを行った（なお、このプローブを用いて単離さ
れたcDNAクローン(pPEP3055)もプローブとして用いられ
得る）。陽性クローンを単離し、ジデオキシ法を用い
て、塩基配列を決定した。全長のPEPCの構造遺伝子を含
む約8KbのXbaI-XbaI断片が得られた。得られたPEPCを含
むDNA断片の制限酵素地図を図１に、塩基配列を図２か
ら図４に示す。
子の単離） トウモロコシPEPCゲノム遺伝子は、文献（Eur. J. Bioc
hem. 181:593-598, 1989）に記載の方法で単離した。ト
ウモロコシ(Zea mays L. cv. Golden Cross Bantam)を
バームキュライトに植えて、培養室で30℃、4日間、暗
条件および明条件(20Klx)下で、培養した。Matsuoka
ら、Plant Physiol. 85: 942-946 (1987)の方法に従っ
て、黄化した葉から、ゲノムDNAを単離した。このゲノ
ムDNAをXbaIで切断し、10-40％の蔗糖密度勾配遠心で分
画した。得られたXbaI断片をXbaIアームを有するファー
ジλong C (Stratagene社）に組み込み、インビトロパ
ッケージングし、Matsuokaら、Plant Cell Physiol. 3
0:479-486(1989)に記載の配列5'-GTCCACGAGAAGATCCAGGG
-3'をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼ
ーションを行った（なお、このプローブを用いて単離さ
れたcDNAクローン(pPEP3055)もプローブとして用いられ
得る）。陽性クローンを単離し、ジデオキシ法を用い
て、塩基配列を決定した。全長のPEPCの構造遺伝子を含
む約8KbのXbaI-XbaI断片が得られた。得られたPEPCを含
むDNA断片の制限酵素地図を図１に、塩基配列を図２か
ら図４に示す。
【００５２】この約8KbのXbaI-XbaI断片の配列を解析し
た結果、以下の表１に記載のような発現調節領域を有し
ていることがわかった。
た結果、以下の表１に記載のような発現調節領域を有し
ていることがわかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】（実施例２：発現ベクターの構築）バイナ
リーベクターpIG121-Hm（図５）を、pBI101(Jefferson
ら、EMBO J. 6:3901-3907(1987)、pIG221（Ohtaら、Pla
nt Cell Physiol. 31:805-813(1990)、およびpLAN101MH
YG（Ko Shimamoto博士から贈与）を用いて構築した。こ
のベクターは、NOSプロモーターおよびターミネーター
で制御されるNPT2遺伝子、マルチクローニング部位、大
腸菌由来のβ-GUS遺伝子、および35S CaMVの制御下にあ
り、TNOSを有するHPT遺伝子を含んでいる。
リーベクターpIG121-Hm（図５）を、pBI101(Jefferson
ら、EMBO J. 6:3901-3907(1987)、pIG221（Ohtaら、Pla
nt Cell Physiol. 31:805-813(1990)、およびpLAN101MH
YG（Ko Shimamoto博士から贈与）を用いて構築した。こ
のベクターは、NOSプロモーターおよびターミネーター
で制御されるNPT2遺伝子、マルチクローニング部位、大
腸菌由来のβ-GUS遺伝子、および35S CaMVの制御下にあ
り、TNOSを有するHPT遺伝子を含んでいる。
【００５５】このベクターpIG121-Hmをまず、HindIII-S
stIで切断し、大きな断片を回収した。この切断したベ
クターに、上記で得られた約8Kbの、トウモロコシのPEP
C遺伝子XbaI-XbaI断片を連結し、大腸菌JM109に導入し
た。カナマイシン耐性株を回収して、制限酵素解析で、
正しい方向にPEPC遺伝子が導入された発現ベクターPEPC
genome/pBIH2を得た（図６）。
stIで切断し、大きな断片を回収した。この切断したベ
クターに、上記で得られた約8Kbの、トウモロコシのPEP
C遺伝子XbaI-XbaI断片を連結し、大腸菌JM109に導入し
た。カナマイシン耐性株を回収して、制限酵素解析で、
正しい方向にPEPC遺伝子が導入された発現ベクターPEPC
genome/pBIH2を得た（図６）。
【００５６】（実施例３：発現ベクターPEPCgenome/pBI
H2のイネへの導入） （Agrobacterium tumefaciensの形質転換） Agrobacterium tumefaciens EHA101(ワシントン大学Nes
ter博士から入手）を50μg/mlのカナマイシンと100μg/
mlのハイグロマイシンを含む培地中、28℃で培養し、Na
gelら(FEMS Micribiol. Lett., 67, 325(1990))の方法
に従って、細胞培養液を調製し、発現ベクターPEPCgeno
me/pBIH2をエレクトロポレーションにより上記細菌に導
入し、ハイグロマイシン耐性株を選択した。
H2のイネへの導入） （Agrobacterium tumefaciensの形質転換） Agrobacterium tumefaciens EHA101(ワシントン大学Nes
ter博士から入手）を50μg/mlのカナマイシンと100μg/
mlのハイグロマイシンを含む培地中、28℃で培養し、Na
gelら(FEMS Micribiol. Lett., 67, 325(1990))の方法
に従って、細胞培養液を調製し、発現ベクターPEPCgeno
me/pBIH2をエレクトロポレーションにより上記細菌に導
入し、ハイグロマイシン耐性株を選択した。
【００５７】（イネ細胞の形質転換とイネ個体の再生）
発現ベクターPEPCgenome/pBIH2で形質転換されたAgroba
cteriumを得、AB寒天培地(Chiltonら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA. 71:3672-3676(1974)）でコロニーを形成
させ、これをAAM培地(Hieiら、Plant J. 6:271-282(199
4))で希釈し、イネ(Oryza sativa)のカルスと３日間共
存培養した。その後、ハイグロマイシン50μg/mlを含む
培地で上記細菌を除去し、２週間ごとにハイグロマイシ
ン選択培地で継代し、形質転換したイネ細胞を選抜し、
常法により再分化した結果、３８個体の独立した形質転
換イネ個体を得た。
発現ベクターPEPCgenome/pBIH2で形質転換されたAgroba
cteriumを得、AB寒天培地(Chiltonら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA. 71:3672-3676(1974)）でコロニーを形成
させ、これをAAM培地(Hieiら、Plant J. 6:271-282(199
4))で希釈し、イネ(Oryza sativa)のカルスと３日間共
存培養した。その後、ハイグロマイシン50μg/mlを含む
培地で上記細菌を除去し、２週間ごとにハイグロマイシ
ン選択培地で継代し、形質転換したイネ細胞を選抜し、
常法により再分化した結果、３８個体の独立した形質転
換イネ個体を得た。
【００５８】（実施例４：形質転換イネにおけるPEPC遺
伝子発現の検出）得られた38個の形質転換イネ個体と非
形質転換イネ、およびトウモロコシのPEPCの発現レベル
を以下のように検討した。PEPC活性は、Edwardsら、Aus
t. J. Plant Physiol. 15:385-395(1988)に記載の方法
で測定した。PEPC酵素は、Hudspethら、Plant Physiol.
98:458-464 (1992)の記載に従って調製した。簡潔に述
べると、約0.5gの緑葉を採取し、液体窒素で急速に凍結
させ、微細粉末にすりつぶした。10倍量の抽出バッファ
ーを加えて、さらに磨砕した。抽出バッファーは、50mM
Hepes-KOH pH8.0、10mM MgCl2、1mM EDTA、10mM DTT、
10%(w/v)不溶性PVP、12.5%(v/v)グリセロール、10μMロ
イペプチン、および、1mM PMSFからなっていた。粗抽出
液をMiracloth（Calbiochem, La Jolla, CA)でフィルタ
ーした。濾液を、4℃、15,000rpm、5分間遠心分離し、
上清をPVPを含まない抽出バッファーで予め平衡化したS
ephadex G-25で脱塩した。この溶出液をプールし、酵素
活性および蛋白質量を測定した。
伝子発現の検出）得られた38個の形質転換イネ個体と非
形質転換イネ、およびトウモロコシのPEPCの発現レベル
を以下のように検討した。PEPC活性は、Edwardsら、Aus
t. J. Plant Physiol. 15:385-395(1988)に記載の方法
で測定した。PEPC酵素は、Hudspethら、Plant Physiol.
98:458-464 (1992)の記載に従って調製した。簡潔に述
べると、約0.5gの緑葉を採取し、液体窒素で急速に凍結
させ、微細粉末にすりつぶした。10倍量の抽出バッファ
ーを加えて、さらに磨砕した。抽出バッファーは、50mM
Hepes-KOH pH8.0、10mM MgCl2、1mM EDTA、10mM DTT、
10%(w/v)不溶性PVP、12.5%(v/v)グリセロール、10μMロ
イペプチン、および、1mM PMSFからなっていた。粗抽出
液をMiracloth（Calbiochem, La Jolla, CA)でフィルタ
ーした。濾液を、4℃、15,000rpm、5分間遠心分離し、
上清をPVPを含まない抽出バッファーで予め平衡化したS
ephadex G-25で脱塩した。この溶出液をプールし、酵素
活性および蛋白質量を測定した。
【００５９】結果を図７に示す。図７において、WTは、
野生型、即ち、非形質転換イネを表し、Cornは、トウモ
ロコシを表す。非形質転換イネの緑葉の粗抽出液のPEPC
の比活性を１として、相対的に表した。トウモロコシ
は、イネの約40倍の活性を有した。形質転換されたイネ
38株中４株が、トウモロコシよりも高いPEPC活性を示し
た。形質転換により約115倍もの活性を有する株が取得
できた（トウモロコシの約３倍もの活性を有してい
た）。C4植物のゲノム遺伝子をC3イネ科植物に導入する
だけで、C4植物で発現される以上のPEPC活性を発現する
ことは、驚くべきことである。
野生型、即ち、非形質転換イネを表し、Cornは、トウモ
ロコシを表す。非形質転換イネの緑葉の粗抽出液のPEPC
の比活性を１として、相対的に表した。トウモロコシ
は、イネの約40倍の活性を有した。形質転換されたイネ
38株中４株が、トウモロコシよりも高いPEPC活性を示し
た。形質転換により約115倍もの活性を有する株が取得
できた（トウモロコシの約３倍もの活性を有してい
た）。C4植物のゲノム遺伝子をC3イネ科植物に導入する
だけで、C4植物で発現される以上のPEPC活性を発現する
ことは、驚くべきことである。
【００６０】（実施例５：形質転換イネにおける光合成
の改良）実施例４で得られた、非形質転換イネ、非形質
転換イネの約７倍および約75倍のPEPC活性を有する形質
転換イネを用いて、光合成速度を測定した。結果を表２
に示す。
の改良）実施例４で得られた、非形質転換イネ、非形質
転換イネの約７倍および約75倍のPEPC活性を有する形質
転換イネを用いて、光合成速度を測定した。結果を表２
に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】非形質転換イネの約75倍のPEPC活性を有す
る形質転換イネは、補償点が約10％低下し、光合成の活
性が大きく増加したことを示している。
る形質転換イネは、補償点が約10％低下し、光合成の活
性が大きく増加したことを示している。
【００６３】
【発明の効果】進化系統学的に近縁なC4植物のC4生合成
経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領域とC4光合成
経路を構成する酵素の構造遺伝子をC3植物に導入するこ
とにより、C3植物の光合成活性が大幅に上昇する。
経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領域とC4光合成
経路を構成する酵素の構造遺伝子をC3植物に導入するこ
とにより、C3植物の光合成活性が大幅に上昇する。
【００６４】
【００６５】
【配列番号：１】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プローブ 配列： GTCCA CGAGA AGATC CAGGG 20
【図１】PEPC遺伝子を含むDNA断片の制限酵素地図を示
す図である。太い線はエクソンを示す。
す図である。太い線はエクソンを示す。
【図２】PEPC遺伝子を含む約8KbDNA断片の塩基配列を示
す図である。
す図である。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである
【図５】バイナリーベクターpIG121-Hmを示す図であ
る。
る。
【図６】発現ベクターPEPCgenome/pBIH2の構造を示す図
である。
である。
【図７】形質転換されたイネのPEPC活性を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 土岐 精一 茨城県つくば市観音台２丁目１−２ 農 林水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 モーリス スン−ベン． クウ アメリカ合衆国ワシントン州プルマン ワシントン州立大学植物学科内 (56)参考文献 特開 平８−80197（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．181（1989）ｐ．593−598
Claims (36)
- 【請求項１】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の遺伝子
を発現するＣ３植物体であって、該Ｃ４植物の光合成経
路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領域および該Ｃ４
植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有す
るゲノム遺伝子を有し、該Ｃ４植物の光合成経路を構成
する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発現される以上
に発現する、Ｃ３植物体。 - 【請求項２】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前記
Ｃ３植物体が単子葉植物の植物体である、請求項１に記
載のＣ３植物体。 - 【請求項３】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前記
Ｃ３植物体が双子葉植物の植物体である、請求項１に記
載のＣ３植物体。 - 【請求項４】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイントロ
ンを含む、請求項１ないし３いずれかの項に記載のＣ３
植物体。 - 【請求項５】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ科
植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物がＣ３イネ科
植物である、請求項４に記載のＣ３植物体。 - 【請求項６】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウモ
ロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの
ゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、請
求項５に記載のＣ３植物体。 - 【請求項７】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の光合成
経路を構成する酵素を高度に発現させるＣ３植物体の作
成方法であって、該方法は、進化系統学的に近縁なＣ４
植物の光合成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領
域および該Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素の構造
遺伝子を含有するゲノム遺伝子でＣ３植物の細胞を形質
転換する工程；および該形質転換されたＣ３植物細胞を
Ｃ３植物体に再生する工程； を含み、ここで、該Ｃ３植物体は、該Ｃ４植物の光合成
経路を構成する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発現
される以上に発現する、方法。 - 【請求項８】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前記
Ｃ３植物体が単子葉植物の植物体である、請求項７に記
載のＣ３植物体の作成方法。 - 【請求項９】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前記
Ｃ３植物体が双子葉植物の植物体である、請求項７に記
載のＣ３植物体の作成方法。 - 【請求項１０】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイント
ロンを含む、請求項７ないし９いずれかの項に記載のＣ
３植物体の作成方法。 - 【請求項１１】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ
科植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物がＣ３イネ
科植物である、請求項１０に記載のＣ３植物体の作成方
法。 - 【請求項１２】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウ
モロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、
請求項１１に記載のＣ３植物体の作成方法。 - 【請求項１３】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の遺伝
子を発現するＣ３植物組織であって、該Ｃ４植物の光合
成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領域および該
Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含
有するゲノム遺伝子を有し、該Ｃ４植物の光合成経路を
構成する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発現される
以上に発現する、Ｃ３植物組織。 - 【請求項１４】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前
記Ｃ３植物組織が単子葉植物である、請求項１３に記載
のＣ３植物組織。 - 【請求項１５】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前
記Ｃ３植物組織が双子葉植物である、請求項１３に記載
のＣ３植物組織。 - 【請求項１６】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイント
ロンを含む、請求項１３ないし１５いずれかの項に記載
のＣ３植物組織。 - 【請求項１７】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ
科植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物がＣ３イネ
科植物である、請求項１６に記載のＣ３植物組織。 - 【請求項１８】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウ
モロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、
請求項１７に記載のＣ３植物組織。 - 【請求項１９】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の光合
成経路を構成する酵素を高度に発現させるＣ３植物組織
の作成方法であって、該方法は、 進化系統学的に近縁なＣ４植物の光合成経路を構成する
酵素の遺伝子の発現調節領域および該Ｃ４植物の光合成
経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するゲ ノム遺伝
子でＣ３植物の細胞を形質転換する工程；および該形質
転換されたＣ３植物細胞をＣ３植物組織に再生する工
程； を含み、ここで、該Ｃ３植物組織は、該Ｃ４植物の光合
成経路を構成する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発
現される以上に発現する、方法。 - 【請求項２０】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前
記Ｃ３植物組織が単子葉植物の植物組織である、請求項
１９に記載のＣ３植物組織の作成方法。 - 【請求項２１】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前
記Ｃ３植物組織が双子葉植物の植物組織である、請求項
１９に記載のＣ３植物組織の作成方法。 - 【請求項２２】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイント
ロンを含む、請求項１９ないし２１いずれかの項に記載
のＣ３植物組織の作成方法。 - 【請求項２３】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ
科植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物がＣ３イネ
科植物である、請求項２２に記載のＣ３植物組織の作成
方法。 - 【請求項２４】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウ
モロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、
請求項２３に記載のＣ３植物組織の作成方法。 - 【請求項２５】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の遺伝
子を発現するＣ３植物種子であって、該Ｃ４植物の光合
成経路を構成する酵素の遺伝子の発現調節領域および該
Ｃ４植物の光合成経路を構成する酵素の構造遺伝子を含
有するゲノム遺伝子を有し、該Ｃ４植物の光合成経路を
構成する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発現される
以上に発現する、Ｃ３植物種子。 - 【請求項２６】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前
記Ｃ３植物種子が単子葉植物の種子である、請求項２５
に記載のＣ３植物種子。 - 【請求項２７】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前
記Ｃ３植物種子が双子葉植物の種子である、請求項２５
に記載のＣ３植物種子。 - 【請求項２８】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイント
ロンを含む、請求項２５ないし２７いずれかの項に記載
のＣ３植物種子。 - 【請求項２９】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ
科植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物種子がＣ３
イネ科植物の種子である、請求項２８に記載のＣ３植物
種子。 - 【請求項３０】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウ
モロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、
請求項２９に記載のＣ３植物種子。 - 【請求項３１】 進化系統学的に近縁なＣ４植物の光合
成経路を構成する酵素を高度に発現させるＣ３植物種子
の作成方法であって、該方法は、 進化系統学的に近縁なＣ４植物の光合成経路を構成する
酵素の遺伝子の発現調節領域および該Ｃ４植物の光合成
経路を構成する酵素の構造遺伝子を含有するゲノム遺伝
子でＣ３植物の細胞を形質転換する工程； 該形質転換されたＣ３植物細胞をＣ３植物体に再生する
工程；および、 該Ｃ３植物体から種子を取得する工程； を含み、ここで、該Ｃ３植物種子は、該Ｃ４植物の光合
成経路を構成する酵素の構造遺伝子を、該Ｃ４植物で発
現される以上に発現する、方法。 - 【請求項３２】 前記Ｃ４植物が単子葉植物であり、前
記Ｃ３植物種子が単子葉植物の種子である、請求項３１
に記載のＣ３植物種子の作成方法。 - 【請求項３３】 前記Ｃ４植物が双子葉植物であり、前
記Ｃ３植物種子が双子葉植物の種子である、請求項３１
に記載のＣ３植物体の作成方法。 - 【請求項３４】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子がイント
ロンを含む、請求項３１ないし３３いずれかの項に記載
のＣ３植物種子の作成方法。 - 【請求項３５】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、イネ
科植物のゲノム遺伝子であり、前記Ｃ３植物がＣ３イネ
科植物である、請求項３４に記載のＣ３植物種子の作成
方法。 - 【請求項３６】 前記Ｃ４植物のゲノム遺伝子が、トウ
モロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のゲノム遺伝子であり、Ｃ３イネ科植物がイネである、
請求項３５に記載のＣ３植物種子の作成方法。
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|---|---|---|---|
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| US09/003,072 US6831217B1 (en) | 1997-03-11 | 1998-01-05 | C3 plants expressing photosynthetic enzyme of C4 plants |
| NZ329550A NZ329550A (en) | 1997-03-11 | 1998-01-07 | C3 plant, plant tissue or seed thereof wherein the plant expresses the phosphoenolpyruvate carboxylase of a phylogenetically related c4 plant |
| DE69827317T DE69827317T2 (de) | 1997-03-11 | 1998-01-20 | C3-Pflanzen, welche photosynthetische Enzyme von C4-Pflanzen exprimieren |
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