KR19980079629A

KR19980079629A - 씨4 식물의 광합성 효소를 발현하는 씨3 식물

Info

Publication number: KR19980079629A
Application number: KR1019980001489A
Authority: KR
Inventors: 마코토 마츠오카; 미쑤에 토쿠토미; 세이이치 토키; 모리스 선벤 쿠
Original assignee: 나카가하라 마사히로; 농림수산성농업생물자원연구소
Priority date: 1997-03-11
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 1998-11-25
Also published as: DE69827317T2; EP0874056B1; NZ329550A; HK1015824A1; EP0874056A1; JP3210960B2; US20040197915A1; CA2219962C; CA2219962A1; US6831217B1; JPH10248419A; KR100275200B1; CN1193047A; DE69827317D1; AU693754B1

Abstract

C3 식물이 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 유전자를 지니고 높은 수준의 C4 광합성 유전자를 발현시키는 것이다. 더욱 상세히는 C3 식물이 (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지니고 있다. C3 식물은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 발현시킨다.

Description

씨4 식물의 광합성 효소를 발현하는 씨3 식물

본 발명은 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 유전자(이하 C4 광합성 유전자라 칭함)를 지니고, 높은수준의 C4 광합성 유전자를 발현하는 C3식물에 관한 것이다.

식물은 CO₂의 광합성 고정경로에서 초기 고정생성물의 종류에 따라 C3 식물, C4 식물 그리고 크라슐라신산 대사(crassulacean acid metabolism : CAM) 식물로 분류된다. 지구상에 존재하는 90% 이상이 C3 식물에 속하는 것으로 벼와 보리같은 농업에 중요한 식물들이 이에 해당한다. C3 식물의 광합성 과정은 또한 캘빈 과정(Calvin pathway)이라고 불리워지는데, 이 과정에서 CO₂의 광합성 고정에 관여하는 효소가 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실레이즈(ribulose-1,5- bisphosphate carboxyl ase)이다. 이 효소는 CO₂와는 낮은 친화도를 나타내며 O₂와는 높은 친화도를 나타낸다. 그러므로, CO₂의 광합성 고정 뿐만아니라 광합성 반응의 효율도 C3 광합성 경로에서 낮아진다.

C4 식물은 그러한 비효율적인 CO₂의 광합성 고정을 극복하기위해 진화되어진 것이다. C4 식물은 CO₂를 농축하기위한 과정과 높은 광합성 능력을 지닌다. C4식물의 광합성 경로에서 CO₂의 광합성 고정에 관여하는 효소는 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(phosphoenolpyruvate carboxylase)이다. 이 효소는 O₂에 의해 저해되는 작용없이 높은 수준으로 CO₂의 광합성 고정을 하게 한다.

CAM 식물들은 건조한 환경에 적합한 광합성 시스템을 지니며, 그 광합성 시스템은 C3 광합성 시스템에서 진화된 일련의 과정으로 간주되고 있다.

C3 식물에 C4 식물의 광합성 능력을 부여하는 것에 따라, 농업적으로 유용한 C3 식물들 (예를 들면, 벼)의 광합성 능력과 물질 생산성은 상당히 향상될 것으로 기대된다. C4 광합성 유전자를 C3 식물에서 도입시키기 위해 몇가지 시도가 행해졌다.

C4 식물의 광합성 유전자를 발현하기 위해, 클로로필 a/b 결합 단백질 프로모우터 또는 칼리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모우터가 이용되어 진다. 예를들면, Kogami 등, Transgenic Research 3: 287-296 (1994)의 논문에서는, C3 식물의 잎 조직에서 높은 수준으로 발현되어질 수 있는 CaMV 35S 프로모우터를 C4 식물의 광합성 유전자(포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(PEPC)유전자)와 결합시켜 재조합 DNA를 생산하고, 그 재조합 DNA를 담배(tobacco)와 같은 C3 식물에 도입되도록 한다. 그러나 C3 식물에서 PEPC 활성은 단지 최대 2∼3배로 증가될 뿐이다. 또 다른 Matsuoka 등, Plant Physiol. 111:949-957 (1996)의 논문에서는, C4 광합성 유전자의 프로모우터 기능을 연구할 목적으로,E.coli로부터의 β-글루쿠로니데이즈(GUS) 유전자와 PEPC 유전자의 5'-측면부위(프로모우터 부분)를 융합하여 담배(tobacco)로 도입시킴을 보고 하였으며, 이때 GUS 유전자는 높은 수준으로 발현되었다. 역시 Hudspeth 등, Plant Physiol. 98:458-464 (1992)의 논문에서는, C4 광합성 유전자로서 발현 대조 부위(프로모우터 부위)를 포함하는 옥수수의 PEPC 게놈 유전자를 담배(tobacco)로 도입하였으나 PEPC 활성은 단지 2∼3배로 증가될 뿐이었다.

따라서, 본 발명자들은 본 출원의 우선권으로 주장하는 일본특허출원 평9-56742호 출원 전에는, 광합성에 관련된 효소를 높은 수준으로 발현시키는 어떠한 예시자료도 없었다. 따라서 본 발명은 C3 식물에서 높은 수준으로 C4 식물의 광합성 유전자가 발현되어 그로부터 C3 식물의 광합성 능력이 향상된다는 기술에 대한 청구이다.

따라서 본 발명은 상기한 문제점들은 해결하고, C3 식물 내에서 C4식물의 광합성 유전자를 높은 수준으로 발현시킴을 제공하기 위한 것이다.

상기한 바와 같이, 옥수수(포아세 : poaceae) C4식물의 광합성 경로를 포함하는 PEPC 게놈 유전자를 C3 식물인 담배(솔라나세 : solanaceae)에 도입시킨 시도가 있었으나 낮은 발현 효율을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 (a) 계통발생학적으로 C3 식물과 관련되는 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 발현 조절 영역(expression control region)과 (b) 계통발생학적으로 C3 식물과 관련되는 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자(structural gene)를 C3 식물에 도입하므로써, C4 광합성 경로를 포함하는 효소의 발현 효율이 높게 향상되었으며, 따라서 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 PEPC 유전자를 함유하는 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타내는 다이아그램으로, 선의 넓은 영역은 엑손(exon)을 표시한다.

도 2는 PEPC 유전자를 함유하는 약 8 Kb DNA 단편의 염기 서열을 나타내는 다이아그램이다.

도 3은 도 2의 연속도면이다.

도 4는 도 3의 연속도면이다.

도 5는 바이너리 벡터(binary vector) pIG121-Hm을 나타내는 다이아그램이다.

도 6은 발현 벡터 PEPC게놈/pBIH2의 구조를 나타내는 다이아그램이다.

도 7은 형질전환된 벼 식물의 PEPC 활성을 나타내는 다이아그램이다.

본 발명에 따르면, 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 유전자를 발현하는 C3 식물은 (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지니고 있으며, 이때 C3 식물은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 발현시킨다.

본 발명에 따른 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물을 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물에 도입 재발생 시킨다. 이때 재생된 C3 식물은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 발현시킨다.

본 발명의 한 실시태양은 C4 식물이 단자옆 식물이고, C3 식물도 단자옆 식물이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 식물이 쌍자옆 식물이고, C3 식물도 쌍자옆 식물이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 DNA가 C4 식물의 게놈 유전자이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물도 C3 포아세우스 식물이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어지는 C3 식물과 C3 식물의 일부에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 따른 C3 식물의 일부가 채소이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명에 따른 C3 식물의 일부가 과일이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명에 따른 C3 식물의 일부가 꽃이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명에 따른 C3 식물의 일부가 종자이다.

본 발명에 따른 C4 식물과 계통발생학적으로 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 조직은 (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 함유하는 DNA를 포함하고, 이때 C3 식물 조직은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 발현시킨다.

본 발명에 따른 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 조직을 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물 조직에 도입 재발생 시킨다. 이때 재생된 C3 식물 조직은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 발현시킨다.

본 발명의 한 실시태양은 C4 식물이 단자옆 식물이고, C3 식물 조직도 단자옆 식물 조직이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 식물이 쌍자옆 식물이고, C3 식물 조직도 쌍자옆 식물 조직이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물 조직도 C3 포아세우스 식물 조직이다.

본 발명에 따른 C4 식물과 계통발생학적으로 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 종자는 (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 함유하는 DNA를 포함하고, 이때 C3 식물 종자는 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 적어도 발아 및 증식시킬 수 있도록 발현시킨다.

본 발명에 따른 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 종자를 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물 종자에 도입 재발생 시킨다. 이때 재생된 C3 식물 종자는 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 적어도 발아 및 증식시킬 수 있도록 발현시킨다.

본 발명의 한 실시태양은 C4 식물이 단자옆 식물이고, C3 식물 종자도 단자옆 식물 종자이다.

본 발명의 또다른 실시태양은 C4 식물이 쌍자옆 식물이고, C3 식물 종자도 쌍자옆 식물 종자이다.

따라서 여기서 기술된 본 발명은 (1) C4 광합성 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 C3 식물 뿐만 아니라 이의 조직 및 종자를 제공하고, (2) C4 광합성 능력을 C3 식물에 공여하므로써 C3 식물의 광합성 능력을 향상시킬 수 있는 기술적 기반을 제공한다.

본 발명의 다른 이점들은 다음 발명의 상세한 설명과 이에 동반되는 도면들에 의거 당 분야의 통상의 지식을 가진 자가 명백하게 인식하게 될 것이다.

본 발명을 하기 실시예와 도면에 의해 더욱 상세히 설명한다.

[정의]

본 발명에서 사용되는 계통발생학적으로 관련된 이라는 용어는 분류학적으로 근연관계가 있는 것을 나타내는 것으로, 예를 들면 동일한 과, 동일한 목 또는 동일한 강에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 식물 이라는 용어는 달리 지적하지 않으면 식물체, 식물기관, 식물 조직, 식물 세포, 그리고 종자이다. 식물 세포의 한 예는 캘러스(callus)를 포함한다. 또한 식물 기관의 예는 뿌리, 잎, 꽃과 같은 것들을 포함한다.

C3 식물의 광합성 경로에서 C0₂를 고정하는 식물로 언급되어진 C3 식물 이라는 용어는 콩, 감자, 고구마와 같은 쌍자옆 식물 뿐만 아니라, 벼, 밀, 보리와 같은 단자옆 식물을 포함한다.

C4 식물의 광합성 경로에서 C0₂를 고정하는 식물로 언급되어진 C4 식물 이라는 용어는 플라베리아(Flaveria), 아마란터스(Amaranthus)와 같은 쌍자옆 식물 뿐만 아니라, 옥수수, 사탕수수, 수수와 같은 단자옆 식물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 C4 경로의 광합성을 구성하는 효소 라는 용어는 C4 식물의 광합성을 구성하는 효소로 언급되어 진다. 비록 그것만으로 제한된 것은 아니고, 예를 들면 카르보닉 안하이드레이즈(carbonic anhydrase : CA), 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(phosphoenolpyruvate carboxylase : PEPC), 파이루베이트(pyruvate), 오르쏘포스페이트 다이카이네이즈(orthophosphate dikinase : PPDK), 말레이트 디하이드로게네이즈(malate dehydrogenase : MDH), 말릭(malic) 효소, 알라닌 옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼레이즈(alanine oxaloacetate aminotransferase), 포스포에놀파이루베이트 카르복시카이네이즈(phosphoenolpyruvate carboxykiase : PEPCK)와 같은 효소들도 포함한다. 이들 효소들을 위한 유전자의 발현 조절 영역과 구조 유전자가 본 발명에서 이용되어 진다.

효소의 발현과 관련되어 본 발명에서 사용되는 높은 수준으로 라는 용어는 C4 경로의 광합성을 구성하는 효소 유전자를 C3 식물로 도입한 후, C3 식물의 생잎 조 추출물에서 효소의 특이적 활성(단위 단백질량 대비 활성)과 관련된 것으로, 그 유전자를 도입하기 전보다 C3 식물에서 적어도 7배의 효소의 특이적 활성을 갖는다. 특이적 활성도는 바람직하게는 적어도 10배 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40배 이상, 더욱더 75배 이상, 가장 높게 바람직하게는 100배 이상까지 특이적 활성도를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 발현 조절 영역 이라는 용어는 구조 유전자의 발현을 조절하는 서열을 함유하는 영역이다. 비록 그것만으로 제한된 것은 아니고, 발현 조절 영역은 전사 조절 서열, 전사후 조절 서열, 및/또는 전사 종결 서열을 포함한다. 인트론(intron) 역시 발현 조절 영역에 포함된다.

예시에 나타난 전사 조절 서열 이라는 용어는 프로모우터, 억제제 (repress or), 촉진제(activator) 및 증진제(enhancer)와 같은 몇 가지 서열을 포함한다. 전사후 조절 서열 이라는 용어는 전사후 과정(예를 들면, 폴리-A 추가, cap 구조의 발생, 접합(splicing)등)을 지배하는 1차 전사에 관여하는 부분을 포함한다. 전사 종결 서열 이라는 용어는 터미네이터(terminator)와 같은 전사의 종결에 관여하는 부분을 포함한다. 이들 발현 조절 영역은 그들의 성질에 따라, 구조 유전자의 상부 또는 하단에 각각 분리되어져 위치해있을 수 있다.

C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA 라는 용어는 효소의 발현 조절 영역과 구조 유전자를 포함하는 재조합 DNA 서열, 효소의 발현 조절 영역과 구조 유전자를 포함하는 게놈 유전자 서열, 또는 그 게놈 유전자 서열 또는 재조합 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 말하는 것이다. 이 DNA는 또한 화학적으로 합성되어진 DNA를 포함한다.

구조 유전자는 효소의 단백질 부분을 암호화하는 DNA(인트론을 포함할 수도 있음)와 mRNA 로부터의 cDNA를 포함한다.

발현 벡터는 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA 핵산 서열로 언급되는 것이며, 숙주 세포내에서 조작될 수 있도록 도입되고 연결된 것이다. 발현 벡터는 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 다른 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모우터, 증진제, 터미네이터와 같은 다양한 조절제)을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 구조 유전자의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다.

[C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자의 분리]

본 발명에 따라 계통발생학적으로 서로 연관된 C4 식물과 C3 식물의 이용된다. 바람직하게는 C4 단자옆 식물의 유전자를 사용하는 경우에는 그 유전자를 C3 단자옆 식물로 도입하고, C4 쌍자옆 식물의 유전자를 사용하는 경우에는 그 유전자를 C3 쌍자옆 식물로 도입한다. 더욱 바람직하게는 C4 식물과 C3 식물이 같은 과에 속하는 경우이다.

C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자는 잘 알려진 방법으로 분리되어질 수 있다. mRNA는 효소의 구조 유전자 전사로 분리되어지고, cDNA는 분리되어진 mRNA를 이용하여 생산되어진다. 게놈 DNA는 cDNA를 이용하여 스크린(screen)되어 지며, 효소의 발현 조절 영역을 수득할 수 있다. 옥수수의 PEPC 유전자를 포함하는 약 8 Kb 의 게놈 유전자 단편은 이미 분리되어졌다(Eur. J. Biochem. 181: 593-598, 1989). 게놈 유전자 단편은 PEPC 구조 유전자의 상부와 하단 및 인트론(예를 들면, 발현 조절 영역)을 포함하고, 그 상태로 사용하기 위해 사용된다.

C4 광합성 경로를 구성하는 또 다른 유전자, PPDK 게놈 유전자(옥수수)가 역시 분리되었으며(Matsuoka 등, J. Biol. Chem. 265: 16772-16777 (1990)), 본 발명에 사용될 수 있다. PPDK 게놈 유전자의 발현 조절 영역은 PEPC 게놈 유전자의 발현 조절 영역과 유사성을 지니며, 이 발현 조절 영역은 본 발명에 사용될 수 있다. 더욱이, NADP-말릭 효소의 게놈 유전자도 분리되었으며(Rothermel 등, J. Biol. Chem. 264: 19587-19592, 1989), 이 게놈 유전자의 발현 조절 영역과 구조 유전자는 본 발명에 사용될 수 있다.

C4 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역을 이용하여, C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 발현시킬 수 있다. 효소는 카르보닉 안하이드레이즈(CA), 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(PEPC), 파이루베이트, 오르쏘포스페이트 다이카이네이즈(PPDK), 말레이트 디하이드로게네이즈(MDH), 말릭 효소, 알라닌 옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼레이즈, 포스포에놀파이루베이트 카르복시카이네이즈(PEPCK)등을 포함한다.

말레이트 디하이드로게네이즈 또는 알라닌 옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼레이즈의 구조 유전자는 당 분야의 통상의 지닌 자가 다음 단계의 방법에 의해 분리할 수 있다. 이 단계는 이 어느 효소를 분리 정제하는 단계, 효소의 일부의 아미노산 서열을 결정하고, 이 결정된 아미노산 서열로부터 추론된 뉴클레오타이드 서열에 의한 프로브(probe)를 제조하고, 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝한다. 이 효소의 발현 조절 영역도 본 발명에 사용될 수 있다. 만약 효소를 암호화해서 생성된 게놈 유전자가 발현 조절 영역과 구조 유전자를 포함한다면, 이 게놈 유전자는 그대로 사용될 수 있다. C4 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역은 또다른 식물 유전자의 발현 영역 서열에 비교하여 결정된다.

C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 발현 조절 영역과 구조 유전자를 포함하는 재조합 유전자는 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 이미 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 재조합 유전자는 복수의 발현 조절 영역 및/또는 구조 유전자를 포함할 수 있다.

C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 게놈 유전자 또는 상기한 바와 같이 얻어지는 재조합 DNA 서열은 그대로 또는 발현 벡터의 형태로 C3 식물의 형질전환에 사용될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 재조합 DNA 서열 또는 게놈 유전자가 C3 식물에 도입될 수 있다. C4 광합성 경로를 구성하는 둘 또는 그 이상의 유전자를 C3 식물에 도입함으로써, 광합성 능력이 더욱 개선될 것으로 예측된다.

[발현 벡터의 구축]

발현 벡터 작성을 위한 벡터는 발현의 목적 및 숙주 세포에따라 선택될 수 있다. 출발 벡터(start vector)는 바람직하게는 프로모우터, 증진제, T-DNA 영역 및 약물 내성 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에 발현 벡터를 구축하기 위하여 사용되는 벡터는 C4 식물의 구조 유전자를 발현시키기 위해 별도의 프로모우터를 반드시 필요로 하는 것은 아니다. C4 식물에 계통발생학적으로 관련된 발현 조절 영역(예를 들면, 프로모우터)이 C3 식물의 발현 조절 영역의 역할을 한다고 간주되기 때문이다. 그러나, 본 발명에 사용되는 발현 벡터는 발현 조절 영역을 지니는 것이 바람직하다. 이 경우 프로모우터의 예로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 그의 발현이 담배의 감염 특이적 단백질 PR1a에 어떤 스트레스를 유발하는 것으로, CaMV 35S 프로모우터, 그리고 노파린 신테이즈(nopaline synthase : NOS)와 같은 것등을 함유할 수 있다.

증진제는 높은 수준의 발현을 위해 사용되어질 수 있다. 증진제로서 상기 언급된 CaMV 35S 프로모우터의 서열 상부를 포함하는 증진제 영역이 바람직하다. 다수의 증진제들이 사용될 수 있다.

또한 터미네이터가 사용될 수 있다. 비록 이들로 한정되는 것은 아니지만 터미네이터의 예로는 CaMV 35S 터미네이터, 노파린 신테이즈의 터미네이터(TNOS) 그리고 담배 PR1a 유전자의 터미네이터등을 포함한다.

형질 전환된 식물을 용이하게 선별하기 위해서 약물 내성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 Ⅱ(neomycin phospho transferase Ⅱ : NPTⅡ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼레이즈(hygromycin phosphotransferase : HPT) 유전자, 및 이와 유사한 유전자들을 바람직하게 사용할 수 있다. 비록 이들로 한정되는 것은 아니지만 약물 내성 유전자를 발현시키는 프로모우터의 예로는 상기에서 언급한 식물 프로모우터 유전자들을 포함한다. 바람직하게는 CaMV 35S 프로모우터가 높은 수준으로 발현을 구축하기 위해 사용될 수 있다. NPTⅡ 유전자는 형질 전환주 또는 형질 전환 세포의 검출에 유용하다. HPT 유전자는 식물의 핵 게놈 유전자가 도입되었을 때 발현되고, 식물은 하이그로마이신에 내성을 지니게 되고, 핵 게놈 유전자의 도입이 확인된다.

발현 벡터를 구축하기 위해 본 발명에 사용되는 출발 벡터로는, pBI-타입 벡터, pUC-타입 벡터 또는 pTRA-타입 벡터가 바람직하게 사용되어질 수 있다. 이 벡터는 식물로 도입되기 위한 영역(T-영역)내의 유전자를 함유하고, 마아커 유전자로서 식물 프로모우터의 조절하에 발현되어지는 NPTⅡ 유전자(가나마이신(kanamycin) 내성을 제공)를 포함한다. pBI-타입 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 통해 식물로 목적 유전자를 도입할 수 있다. pBI-타입 벡터의 예로는 pBI121, pBI101, pBI101.2 그리고 pBI101.3등이 있다. 바람직하게는 pBI101과 이로부터 유래된 벡터들을 사용할 수 있다.

pUC-타입 벡터의 예로는 pUC18, pUC19 및 pUC9 등을 함유한다.

C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 발현 조절 영역과 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA 는 당 분야에 통상의 지식을 가진 자가 알려진 방법에 의해 벡터에 결합시킬 수 있다. 예를 들면, pBI 벡터를 이용하는 경우에 이 벡터는 복합-클로닝 사이트에 적절한 제한 효소중 하나에 의해 절단되고, 목적 DNA는 분리된 사이트의 벡터에 삽입되고, 삽입된 벡터는 적절한 대장균 균주에 형질 전환되고, 형질 전환체는 선별되고 이때 목적 발현 벡터는 회수된다.

[재조합 DNA서열 또는 발현 벡터의 C3 식물 세포로의 도입]

비록 이들로 한정되는 것은 아니지만, 형질 전환되는 C3 식물의 예로는 벼, 밀, 보리, 콩 및 감자등을 들 수 있다. 이러한 식물의 식물 세포는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

재조합 DNA 서열 또는 발현 벡터는 아그로박테리움을 통해 또는 직접 제조된 식물 세포에 도입시킬 수 있다. 이러한 방법의 예로는, 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 발현 벡터를 우선 아그로박테리움에 형질 전환 시키고, 전환된 아그로박테리움을 S.B. Gelvin 등의 플랜트 모레큘러 바이올로지 매뉴얼(Plant Molecular Biology Manual : Academic Press Publishers)에 기재된 방법에 따라 식물 세포에 도입시킨다. 아그로박테리움을 직접 세포에 도입하는 방법으로는, Nagel 등의 Microbiol. Lett., 67, 325(1990)에 개시된 방법에 의한다. 이 방법에 따르면, 발현 벡터를 세포로 이그젬인트로듀싱(examintroducing)시키기 위하여 일렉트로포레이션법과 유전자총법(gene gun method)이 적절하게 사용될 수 있다.

[형질 전환된 식물 세포의 식물 또는 식물 조직으로의 재발생]

도입되어진 재조합 유전자 또는 발현 벡터를 갖고 있는 C3 식물 세포들은 가나마이신 내성과 같은 약물 내성에 바탕을 둔 선별 방법으로 선별된다. 그런 후, 그 세포들은 종래의 방법에 의하여 식물 또는 식물조직으로서 재발생 되어질 수 있고, 종자들은 그 식물로부터 수득되어질 수 있게된다. 종자 자체는 그 효소를 발현하게된다. 다시 말하면, 그 종자는 발아되어져 생장하기 시작한 후에야 C4 광합성 경로를 구성하는 효소를 발현할 수 있게 된다.

형질 전환된 C3 식물에서 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 발현을 확인하기위해 이 분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환과 발현은 프로브로서 C4 광합성 유전자가 도입되어진 부분 서열을 이용하여 식물 조직이나 식물 잎에서 추출되어진 DNA 에 대한 서던 하이브리디제이션(southern hybridization)에 의한 통상의 방법에 따라 확인하거나, 단백질을 추출하고 식물 조직이나 식물 잎에서 추출된 단백질의 활성을 측정 또는 상기 추출되어진 단백질을 전기 영동시키거나 겔화시켜 얻어진 활성도-염색에 의해 확인되어질 수 있다.

[C0₂보상점의 측정]

형질 전환된 식물의 광합성 능력(C0₂보상점)은 ADC 적외선(infrared) 가스 분석기를 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, Hudspeth 등, Plant Physiol. 98:458-464(1992)의 설명에 따라 행해진다. 더욱 상세히는, 새로 증폭된 잎들은 플렉시글래스 챔버(Plexiglass chamber)에 밀봉시킨다. 챔버의 온도는 약 30℃를 유지한다. CO₂농도는 1000μmole/m²/s 광합성 광량자 유량 밀도의 조사(illumination)하에, 챔버를 통한 공기 순환에 의해 연속적으로 측정되어진다. 보상점은 챔버내의 CO₂농도가 평형이 되었을 때 측정되어진다.

이후로, 본 발명은 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 발현 조절 영역과 구조 유전자를 포함하는 DNA로서 옥수수 PEPC 게놈 유전자를 예로하고, C3 식물로는 벼를 이용하여 구체적으로 설명되어질 것이다. 다음 실시예들로 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 제한 효소, 플라스미드(plasmid) 및 본 실시예에 사용되는 유사 물질은 Takara Shuzo Co., Ltd 와 Toyobo Co., Ltd 로부터 구입되어진다.

[실시예 1] 옥수수 PEPC 게놈 유전자의 분리

옥수수 PEPC 게놈 유전자는 선행 문헌(Eur.J. Biochem. 181:593-598, 1989)에 기재된 방법으로 분리하였다. 옥수수(Zea mays L. cv. Golden Cross Bantam)는 버미큘리트(vermiculite)에서 생장시켰다. 생장된 옥수수는 30℃의 암조건에서 4일동안 배양 챔버에서 증식시킨다. 게놈 DNA는 Matsuoka 등의, Plant Physiol. 85:942-946 (1985)의 방법에 따라 암황화된(etiolated) 잎들에서 분리되었다. 이 게놈 DNA는 XbaI 에 의해 절단되었고, 10-40%의 설탕 밀도구배 원심분리에 의해 분획되어진다. 수득된 XbaI 단편을 XbaI 암(arm)을 지닌 파아지(phage) λong C(Stratagene, CA)에 의해 접합되어지고, 이 접합된 DNA는 생체밖(in vitro)에서 팩키쥐된다. 게놈 라이브러리(library)는 팩키쥐된 DNA를 이용하여 구축된다. 그리고 파아지 플라그(plaque)는 Matsuoka 등의, Plant Cell Physiol. 30:479-486 (1989)에 개시된 서열 5'-GTCCACGAGAAGATCCAGGG-3'의 프로브를 이용하여 플라그 하이브리디제이션에 의해 스크리닝된다. 이 프로브를 이용하여 분리된 cDNA 클론(pPEP3055)은 또한 프로브로서 이용되어질 수 있다. 양성 클론이 분리되었고, 게놈 클론의 뉴클레오타이드 서열이 디데옥시(dideoxy) 방법에 따라 결정되었다. 약 8 Kb의 전체 사슬의 PEPC 구조 유전자를 지닌 XbaI-XbaI 단편이 얻어진다. 도 1은 수득된 PEPC를 함유하는 DNA 단편의 제한 효소 지도이고, 도 2 내지 도 4는 그것의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

8Kb의 XbaI-XbaI 단편의 서열은 표 1에 나타난 바와 같이 발현 조절 영역을 지닌 것으로 분석되었다.

요소	위치	서열
TATA boxCCAAT boxSP-1 결합 부위약간 반응하는 요소직접 반복 서열	-24 ∼ -28-367 ∼ -371-80 ∼ -85-48 ∼ -53275 ∼ 280 (인트론 1)281 ∼ 286 (인트론 1)-653 ∼ -66-536 ∼ -550-510 ∼ -527-453 ∼ -470-378 ∼ -395-201 ∼ -214-30 ∼ -39	TATTTCCAATCCGCCCCCGCCCCCGCCGCCGCCCCCTTATCCTCCCTCAACCACATCCTGCGACACCCTCG-CCACATCCGACGCCCTCT-CCACATCCTGCGACGCCCTCT-CCACATCCTGCCCCTCT-CCACATCCCT-CCCCATCC

[실시예 2] 발현 벡터의 구축

바이너리(binary) 벡터는 pIG121-Hm(도 5)를 pBI101(Jefferson 등의, EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)), pIG221(Ohta 등의, Plant Cell Physiol. 31:805-813 (1990)), 그리고 pLAN101MHYG ( K. Shimamoto 박사에 의해 제공된)을 이용하여 구축된다. 이 벡터는 NOS 프로모우터와 터미네이터에 의해 조절되는 NPTⅡ 유전자, 복합-클로닝 사이트, 대장균으로부터 유래된 β-GUS 유전자 및 35S CaMV 프로모우터의 조절하에 TNOS 함유 HPT 유전자등을 함유한다.

pIG121-Hm 벡터는 처음 HindⅢ 와 SstI 에 의해 절단되고, 큰 단편을 회수했다. 약 8 Kb의 상기에서 얻어진 옥수수 PEPC 유전자의 XbaI-XbaI 단편을 절단된 벡터에 연결시키고,E.coliJM109에 도입시켰다. 가나마이신-내성 스트레인(strain)이 회수되었고, 옥수수 PEPC 유전자가 정확한 위치에 도입된 발현 벡터 PEPC게놈/pBIH2가 얻어진 것이 제한 효소 분석법에 의해 확인되었다.(도 6)

[실시예 3] 발현벡터 PEPC게놈/pBIH2 의 벼에의 도입

[아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 형질 전환]

Agrobacterium tumefaciensEHA101(University of Washington의 Nester 박사로부터 입수)를 약 28℃에서 50㎍/ml의 가나마이신과 100㎍/ml의 하이그로마이신을 함유하는 배지중에서 배양시켰다. 세포 현탁 배양액을 제조하였고, 발현 벡터 PEPC게놈/pBIH2가 상기 박테리아에 일렉트로포레이션에 의해 도입되었고, Nagel등의 방법(Microbiol. Lett., 67, 325 (1990))에 따라 하이그로마이신-내성 스트레인이 선별되었다.

[벼 세포의 형질 전환 및 벼 개체의 재발생]

발현벡터 PEPC게놈/pBIH2에 의해 형질 전환되 아그로박테리움을 얻었다. 콜로니는 AB 한천 배지(Chilton 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 3672-3676 (1974))에서 형성되었다. 얻어진 콜로니를 AAM 배지(Hiei 등의, Plant J. 6: 271-282 (1994))에 희석시키고, 벼의 캘러스(Oryza sativa)와 3일간 공존 배양시켰다. 그 후, 50㎍/ml의 하이그로마이신을 함유하는 배양 배지에서 박테리아를 제거시켰다. 콜로니를 2주간 하이그로마이신 선별 배양 배지에서 계대 배양시켰다. 형질 전환된 벼 세포는 선별되고 통상의 방법에 따라 재발생되었다. 그 결과 38 개체의 독립된 형질 전환 벼 개체가 수득되었다.

[실시예 4] 형질 전환 벼에 있어서 PEPC 유전자 발현의 검출

상기에서 얻어진 형질 전환된 38 개의 벼 개체내와 비형질 전환된 벼 및 옥수수에서 PEPC 발현 수준을 연구한 결과는 다음과 같다. PEPC 활성은 Edward등의, Aust. J. Plant Physiol. 15: 385-395 (1988)에서 기재된 방법에 따라 측정되었다. PEPC 효소는 Hudspeth 등의, Plant Physiol. 98: 458-464 (1992)에 기재된 방법에 따라 준비되어졌다. 더욱 상세하게는 약 0.5g의 푸른 잎이 추수되었고, 액체 질소하에서 급속히 냉동시키고 미세한 파우더로 잘게 부수었다. 이 파우더에 10배 용량의 추출 완충액을 가하고, 다시 파우더는 분쇄시킨다. 추출 완충액은 50 mM의 Hepes- KOH (pH 8.0), 10mM의 MgCl₂, 1mM의 EDTA, 10 mM의 DTT, 10% (w/v) 불용성 PVP, 12.5% (v/v) 글리세롤(glycerol), 10 μM의 류펩틴(leupeptin) 및 1mM의 PMSF를 함유한다. 조 추출액은 Miracloth(Calbiochem, La Jolla, CA)로 여과시킨다. 여과물을 4℃에서 15,000 rpm으로 5분간 원심 분리시키고, 상등액에서 PVP-미함유 추출 완충액으로 프리(pre)-평형된 Sephadex G-25를 이용하여 탈염시킨다. 용출액을 수집하고, 그 효소 활성과 단백질 량을 측정한다.

도 7은 결과를 나타낸다. 도 7에서 WT는 야생-타입, 즉 비-형질전환 벼를 표시하며, Corn은 옥수수를 표현한다. PEPC 활성은 상대적으로 표시되며, 이 때 비-형질전환 벼의 잎에서 추출된 PEPC의 활성은 1이다. 옥수수는 비-형질 전환된 벼의 PEPC 활성에 비해 약 40배 이상 높은 활성을 나타낸다. 38 개체 중 4 개의 형질 전환 벼 개체는 옥수수보다 높은 PEPC 활성을 나타낸다. 이러한 형질 전환을 위해 벼 식물은 비-형질 전환 벼의 PEPC활성은 약 115배 이상 높게 나타난다(형질 전환 벼 식물의 PEPC 활성은 옥수수의 활성에 비해 약 4배 이상 높다). 이는 C4 식물을 게놈 유전자가 함유된 C3 포아세우스 식물의 C4 식물의 활성 보다 높은 PEPC 활성을 나타내는 것으로 놀라운 일이다.

[실시예 5] CO₂보상점 측정

광합성 CO₂보상점을 비-형질 전환 벼와 실시예 4에서 얻어진 PEPC 활성이 약 75배 및 약 7배 높은 형질 전환 벼를 이용하여 측정하였다. 표 2는 그 결과를 타나낸다.

벼의 종류	CO₂보상점(ppm)
비-형질 전환 벼보다 약 75배 높은 PEPC 활성을 갖는 형질 전환 벼비-형질 전환 벼보다 약 7배 높은 PEPC 활성을 갖는 형질 전환 벼비-형질 전환 벼	48.853.553.7

비-형질 전환된 벼에 비해 약 75배 높은 PEPC 활성을 갖는 형질 전환 벼는 약 10% 감소된 CO₂보상점을 지닌다. 더욱 향상된 광합성 능력이 예측된다.

여러 가지의 변화가 당 기술의 분야에 있어서 본 발명의 범위와 정신에 따라 행해질 수 있다. 따라서 청구범위는 본 명세서의 기재에 한정되는 것은 아니고, 넓게 해석될 수 있다.

계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 C4 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 C3 식물에 도입하는 것에 의한 C3 식물의 광합성 활성을 대폭 증진시키는 효과가 있는 것이다.

Claims

(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지니고 있으며, 이때 C3 식물은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 발현시킴을 특징으로 하는 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 유전자를 발현하는 C3 식물
제 1항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물도 단자옆 식물임을 특징으로 하는 C3 식물
제 1항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물도 쌍자옆 식물임을 특징으로 하는 C3 식물
제 1항에 있어서, DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로 하는 C3 식물
제 4항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물도 C3 포아세우스 식물임을 특징으로 하는 C3 식물
제 5항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물
(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물에 도입 재발생 시키고, 이때 재생된 C3 식물은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 발현시킴을 특징으로하는 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물의 생산 방법
제 7항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물도 단자옆 식물임을 특징으로하는 C3 식물의 생산 방법
제 7항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물도 쌍자옆 식물임을 특징으로하는 C3 식물의 생산 방법
제 7항에 있어서, DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로하는 C3 식물의 생산 방법
제 10항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물도 C3 포아세우스 식물임을 특징으로하는 C3 식물의 생산 방법
제 11항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물의 생산 방법
제 7항에 따른 방법에 의해 수득된 C3 식물
제 13항에 있어서, C3 식물의 일부가 채소임을 특징으로 하는 C3 식물
제 13항에 있어서, C3 식물의 일부가 과일임을 특징으로 하는 C3 식물
제 13항에 있어서, C3 식물의 일부가 꽃임을 특징으로 하는 C3 식물
제 13항에 있어서, C3 식물의 일부가 종자임을 특징으로 하는 C3 식물
(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 함유하는 DNA를 포함하고, 이때 C3 식물 조직은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 발현시킴을 특징으로 하는 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 유전자를 발현하는 C3 식물 조직
제 18항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물 조직도 단자옆 식물 조직임을 특징으로 하는 C3 식물 조직
제 18항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물 조직도 쌍자옆 식물 조직임을 특징으로 하는 C3 식물 조직
제 18항에 있어서, DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로 하는 C3 식물 조직
제 21항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물 조직도 C3 포아세우스 식물 조직임을 특징으로 하는 C3 식물 조직
제 22항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물 조직
(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물 조직에 도입 재발생 시키고, 이때 재생된 C3 식물 조직은 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 발현시킴을 특징으로하는 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 조직의 생산 방법
제 24항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물 조직도 단자옆 식물 조직임을 특징으로 하는 C3 식물 조직의 생산 방법
제 24항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물 조직도 쌍자옆 식물 조직임을 특징으로 하는 C3 식물 조직의 생산 방법
제 24항에 있어서, DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로 하는 C3 식물 조직의 생산 방법
제 27항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물도 C3 포아세우스 식물임을 특징으로 하는 C3 식물 조직의 생산 방법
제 28항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물 조직의 생산 방법
(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 함유하는 DNA를 포함하고, 이때 C3 식물 종자는 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화 된 효소를 적어도 발아 및 증식시킬 수 있도록 발현시킴을 특징으로 하는 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 유전자를 발현하는 C3 식물 종자
제 30항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물 종자도 단자옆 식물 종자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자
제 30항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물 종자도 쌍자옆 식물 종자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자
제 30항에 있어서, C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자
제 33항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물도 C3 포아세우스 식물임을 특징으로 하는 C3 식물 종자
제 34항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물 종자
(a) 계통발생학적으로 관련된 C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소 유전자의 발현 조절 영역과 (b) C4 식물의 광합성 경로를 구성하는 효소의 구조 유전자를 포함하는 DNA를 지닌 C3 식물의 형질전환 세포를 제조하고, 이 C3 식물의 형질전환 세포를 C3 식물에 도입 재발생 시키고, C3 식물로부터 종자를 얻고, 이때 C3 식물 종자는 높은 수준으로 구조 유전자에 의해 암호화된 효소를 적어도 발아 및 증식시킬 수 있도록 발현시킴을 특징으로하는 계통발생학적으로 C4 식물에 관련된 유전자를 발현시키는 C3 식물 종자의 생산 방법
제 36항에 있어서, C4 식물은 단자옆 식물이고, C3 식물 종자도 단자옆 식물 종자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자의 생산 방법
제 36항에 있어서, C4 식물은 쌍자옆 식물이고, C3 식물 종자도 쌍자옆 식물 종자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자의 생산 방법
제 36항에 있어서, DNA가 C4 식물의 게놈 유전자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자의 생산 방법
제 39항에 있어서, C4 식물의 게놈 유전자가 C4 포아세우스(poaceous) 식물의 게놈 유전자이고, C3 식물 종자도 C3 포아세우스 식물 종자임을 특징으로 하는 C3 식물 종자의 생산 방법
제 40항에 있어서, C4 포아세우스 식물의 게놈 유전자가 옥수수로부터 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈의 게놈 유전자이고, C3 포아세우스 식물은 벼임을 특징으로 하는 C3 식물 종자의 생산 방법