CN1193047A - 表达c4植物光合酶的c3植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有C4光合作用途径中所涉及的酶的基因并且以高水平表达C4光合作用基因的C3植物。更具体地说,所说的C3植物包含这样的DNA,该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区,和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因。所说的C3植物以高水平表达由所说结构基因编码的酶。

Description

表达C4植物光合酶的C3植物
本发明涉及一种C3植物，这种植物包含C4光合作用途径中所涉及的酶的基因(此后称为C4光合作用基因)，并以高水平表达C4光合作用基因。
基于在二氧化碳的光合固定中的初始固定产物的种类，植物分成C3植物、C4植物和景天酸代谢(CAM)植物。地球上百分之九十或更多的植物属于C3植物，这包括，例如，农业上重要的植物(如水稻和大麦)。C3植物的光合途径也称为加尔文途径，在这一途径中二氧化碳的光合固定所涉及的酶是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶。这种酶对二氧化碳具有低的亲和性，对氧气具有高的亲和性。因此，光合反应以及二氧化碳的光合固定的效率在C3光合途径中是低的。
C4植物是那些进化得克服了二氧化碳低效光合固定的植物。C4植物具有浓缩二氧化碳的机制和高的光合能力，C4植物光合途径中二氧化碳的光合固定所涉及的酶是烯醇丙酮酸磷酸羧化酶。这种酶具有高的光合固定二氧化碳的能力，其活性不受氧气抑制。
CAM植物具有适合于干燥环境的光合系统，该光合系统被认为是C3光合系统的一种进化的形式。
可以预期，通过向C3植物提供C4植物的光合功能，农业上重要的C3植物(例如水稻)的光合能力和生产力可以得到极大地提高。已有把C4光合作用基因引入C3植物的一些尝试。
为了表达C4植物的光合作用基因，已使用了连接到其上的叶绿素a/b结合蛋白质启动子或花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。例如，Kogami等，转基因研究3：237-96(1994)报道：将可以在C3植物的叶片组织中高水平表达的(CaMV)35S启动子连接到C4植物的光合作用基因(烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)基因)上，以产生重组DNA，然后将重组DNA引入C3植物烟草；然而，在C3植物中的PEPC活性至多仅增加2至3倍。另外，Matsuoka等，植物生理学，111：949-957(1996)报道：为了研究C4光合作用基因启动子的功能，将大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因和PEPC基因的5’-侧翼区(启动子区)的融合基因引入烟草，由此GUS基因以高水平表达。Hudspeth等，植物生理学，98：458-464(1992)也报道：将包含表达控制区(启动子区)的玉米PEPC基因组基因作为C4光合作用基因引入烟草；然而，PEPC活性仅增加2至3倍。
这样，本发明的发明人清楚地了解到，在日本专利申请9-56742(本申请要求了该申请的优先权)之前，尚没有报道指出在光合作用中所涉及的酶以高水平表达。因此，需要在C3植物中以高水平表达C4植物的光合作用基因，从而增强C3植物光合能力的技术。
本发明旨在克服上述的问题，其目的是在C3植物中以高水平表达C4植物的光合作用基因。
如以上所述，已有尝试将C4植物玉米(早熟禾科(poaceae))光合途径中所涉及的PEPC基因组基因引入C3植物烟草(茄科)中导致低表达效率的例子。本发明人发现，通过将含有(a)系统发育上与C3植物相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)系统发育上与C3植物相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因的这样一种基因引入到C3植物中，C4植物的光合途径中所涉及的酶的表达效率得到极大的提高，进而完成了本发明。
本发明的表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
一种产生表达系统发育上相关的C4植物之基因的C3植物的方法包括以下步骤：
用含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物细胞；使转化的C3植物细胞再生为C3植物；其中所说的再生的C3植物以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
在本发明的一个实施方案中，所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物是单子叶植物。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物是双子叶植物。
在本发明的另一个实施方案中，所说的DNA是C4植物的基因组基因。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物是C3早熟禾科植物。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
本发明也涉及用本发明的方法可获得的C3植物和C3植物部分。
在本发明的一个实施方案中，本发明的C3植物部分是蔬菜(vegetable)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的C3植物的部分是果实。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的C3植物的部分是花。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的C3植物的部分是种子。
本发明的表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物组织包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物组织以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
本发明的产生表达系统发育上相关的C4植物之基因的C3植物组织的方法包括以下步骤：用含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物的细胞；使转化的C3植物细胞再生为C3植物组织；其中所说的再生的C3植物组织以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
在本发明的一个实施方案中，所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物组织是单子叶植物组织。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物组织是双子叶植物组织。
在本发明的另一个实施方案中，所说的DNA是C4植物的基因组基因。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物组织是C3早熟禾科植物组织。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
本发明的表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物种子包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物种子至少在发芽和生长后以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
本发明的产生表达系统发育上相关的C4植物之基因的C3植物种子的方法包括以下步骤：用含有(a)系统发育上相关的C4植物光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物的细胞；使转化的C3植物细胞再生为C3植物；并且从所说的C3植物获得种子；其中所说的再生的C3植物种子至少在发芽和生长后以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
在本发明的一个实施方案中，所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物种子是单子叶植物种子。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物种子是双子叶植物种子。
在本发明的另一个实施方案中，所说的DNA是C4植物的基因组基因。
在本发明的另一个实施方案中，所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且其中所说的C3植物是C3早熟禾科植物。
在本发明的另一个实施方案中，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
这样，本文所描述的本发明可以给出以下的优点：(1)提供有效地表达C4光合基因的C3植物及其组织和种子，(2)通过赋予C3植物以C4光合能力进一步提供提高C3植物光合能力的技术基础。
对本领域技术人员而言，在参照附图阅读和理解以下详细描述后，本发明的这些和其它优点会很清楚。
图1是显示包含PEPC基因的DNA片段的限制酶图，其中线的较宽的部分代表外显子。
图2是显示包含PEPC基因的DNA片段的大约8Kb的碱基序列的图。
图3是图2的继续。
图4是图3的继续。
图5是显示双向载体pIG121-Hm的图。
图6是显示表达载体PEPC genome/pBIH2的结构的图。
图7是显示转基因水稻植物的PEPC活性的图。
以下参照附图通过说明性的例子描述本发明。
本文所使用的术语″系统发育上相关的″指具有某些系统发育相关性，例如，属于相同的科、相同的目或相同的纲。
本文所使用的术语″植物″包括(除非以其它方式指明)植物体、植物器官、植物组织、植物细胞和种子。植物细胞的例子包括愈伤组织。植物器官的例子包括根、叶片、花等。
术语″C3植物″指在光合作用的C3途径中固定二氧化碳的植物，包括单子叶植物(如水稻、小麦和大麦)以及双子叶植物(如大豆、马铃薯和甘薯)。
术语″C4植物″指在光合作用的C4途径中固定二氧化碳的植物，包括单子叶植物(如玉米，甘蔗和高粱)以及双子叶植物(如Flaveria和Amaranthus)。
术语″光合作用的C4途径所涉及的酶″指在C4植物的光合作用中所涉及的酶。非限制性地，该酶包括，例如，碳酸酐酶(CA)、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶、丙氨酸草酰乙酸转氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)。这些酶的基因的表达控制区和这些酶的结构基因可以用于本发明中。
与酶的表达关联的术语“以高水平”本文用于指在C3植物绿叶粗提物中的酶的比活性(每单位蛋白量的活性)在将光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因引入到C3植物中后至少是在引入所说的基因前的C3植物中的酶的比活性的7倍，该比活性优选地是至少10倍，较优选地是至少40倍，更优选地是至少75倍，最优选地是至少100倍。
本文所使用的术语″表达控制区″指包含控制结构基因表达的序列的区域。非限制性地，表达控制区包括，例如，转录控制序列、转录后控制序列和/或转录终止序列。内含子也符合表达控制区。
″转录控制序列″的例子包括一些序列，例如启动子、阻遏物、激活物和增强子。″转录后控制序列″包括待转录后加工(例如添加polyA，产生帽结构，剪接等)的初级转录物中所涉及的元件。″转录终止序列″包括在转录终止中所涉及的元件，如终止子。这些表达控制区可以单独地位于结构基因的上游或下游，取决于其性质。
术语″含有在光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因的表达控制区和在光合作用的C4途径中所涉及的酶的结构基因的DNA″指一种包含一种酶的表达控制区和结构基因的重组DNA序列、一种包含一种酶的表达控制区和结构基因的基因组基因序列或者包含重组DNA序列或基因组基因序列的表达载体。这种DNA也包括化学合成的DNA。
结构基因包括编码酶的蛋白质部分的DNA(可以包含内含子)和来自mRNA的cDNA。
表达载体指一种核酸序列，在其中″含有在光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因的表达控制区和在光合作用的C4途径中所涉及的酶的结构基因的DNA″被引入和可操作地连接到宿主细胞中。表达载体可以包含不同于光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因的表达控制区的表达控制序列(例如，各种调节元件，如启动子、增强子和终止子)。表达控制序列可以用于控制结构基因的表达。在光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因的表达控制区和在光合作用的C4途径中所涉及的酶的结构基因的分离
按照本发明，使用在系统发育上相关联的C3植物和C4植物。优选地，在利用C4单子叶植物的基因的情况下，基因被引入C3单子叶植物中，在利用C4双子叶植物的基因的情况下，基因被引入C3双子叶植物中。更优选地是，其中所说的C4植物和C3植物属于相同的科。
可以用公知的方法分离参与光合作用的C4途径的酶的结构基因。分离mRNA(其是酶的结构基因的转录物)，并且利用分离的mRNA产生cDNA。通过利用cDNA筛选基因组DNA，可以获得酶的表达控制区。大约8Kb的包含玉米PEPC基因的基因组基因片段已被分离到(欧洲生物化学杂志，181：593-598，1989)。基因组基因片段包括PEPC的结构基因的上游和下游区和内含子(即表达控制区)，以便它可以以其本来的形式使用。
在光合作用的C4途径中所涉及的另一个基因，PPDK基因组基因(玉米)也已被分离(Matsuoka等，生物化学杂志，265：16772-16777(1990))，其可以用于本发明。PPDK基因组基因的表达控制区具有与PEPC基因组基因的表达控制区的相似性，这一表达控制区可以用于本发明中。此外，NADP-苹果酸酶的基因组基因也已被分离(Rothermel等，生物化学杂志，264：19587-9592，1989)，其表达控制区和这一基因组基因的结构基因可以用于本发明中。
通过利用光合作用的C4途径中所涉及的任何酶的基因的表达控制区，可以表达光合作用的C4途径所涉及的任何酶的结构基因。所说的酶包括碳酸酐酶(CA)、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶、丙氨酸草酰乙酸转氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)等。
苹果酸脱氢酶或丙氨酸草酰乙酸转氨酶的结构基因可以用本领域技术人员公知的方法分离，包括以下步骤：分离和纯化任何这些酶；测定酶的部分氨基酸序列；基于从测定的氨基酸序列推导的核苷酸序列制备探针；利用探针筛选cDNA文库或基因组文库。这些酶的表达控制区也可以用于本发明。如果所形成的编码酶的基因组基因包括表达控制区和结构基因，该基因组基因可以以其本来的形式使用。光合作用的C4途径所涉及的酶的基因的表达控制区可以在与另一个植物基因的表达区的序列比较中测定。
可以用本领域技术人员公知的方法产生包含光合作用的C4途径所涉及的酶的表达控制区和结构基因的重组基因。重组基因可以具有多个表达控制区和/或结构基因。
所形成的光合作用的C4途径所涉及的酶的基因组基因或者如上所述所获得的重组DNA序列，可以以其本来的形式和以在表达载体中的形式用于转化C3植物。两个或更多个重组DNA序列或基因组基因可被掺人到C3植物中。通过向C3植物引入光合作用的C4途径中所涉及的两个或更多个基因，可以预期光合能力进一步得到改进。
表达载体的构建
本领域技术人员清楚可以选择用于构建表达载体的载体，取决于表达的目的和宿主细胞。起始载体优选地可以包括启动子、增强子、T-DNA区和药物抗性基因。
用于构建本发明的载体的载体不是不必需需要表达C4植物的结构基因的附加启动子。这是因为系统发育上相关的C4植物的表达控制区(例如启动子)被认为在C3植物的表达控制系统中起作用。然而，本发明的表达载体具有表达控制区是合乎需要的。在这种情况下，启动子的非限制性例子包括被一定的应力诱导表达的启动子，如烟草的感染特异性蛋白质PR1a、CaMV 35S启动子和胭脂氨酸合酶(NOS)的启动子。
增强子可以高水平表达。就增强子而言，包含上述CaMV 35S启动子的上游序列的增强子区是优选的。许多增强子都可以使用。
终止子也可以使用。非限制性地，终止子包括例如CaMV 35S终止子、胭脂氨酸合酶(TNOS)的终止子、烟草PRla基因的终止子。
希望的是使用使得转化植物容易选择的药物抗性基因。可以优选地使用新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因等。非限制性地，表达药物抗性基因的启动子的例子包括上述的植物基因启动子。优选地是，可以使用以高水平组成型表达的CaMV 35S启动子。NPTII基因对检测转化子或转化细胞有用。当将HPT基因引入植物核基因组时，该基因被表达，植物变成对潮霉素有抗性，因此基因向核基因组的引入得到确认。
就用于构建本发明的表达载体的起始载体而言，可以优选地使用pBI-型载体、pUC-型载体或pTRA-型载体。可以更优选地使用pBI-型双向载体，这一载体包含在一个区域(T-区)中的待引入到植物中的基因和作为标记基因的植物启动子控制下表达的NPTII基因(提供卡那霉素抗性)。pBI-型载体可以经农杆菌把感兴趣基因引入植物。pBI-型载体的例子包括pBI121、pBI101、pBI101.2和pB1101.3。优选地，可以使用pBI101和来源于它的载体。
pUC-型载体的例子包括pUC18、pUC19和pUC9。
用本领域技术人员已知的方法将含有在光合作用的C4途径中所涉及的酶的基因的表达控制区和在光合作用的C4途径中所涉及的酶的结构基因的DNA连接到载体上。例如，在使用pBI载体的情况下，载体在多克隆位点以任一适当的限制酶消化，感兴趣DNA在断裂位点插入到载体中，将形成的载体转化进大肠杆菌菌株中，选择转化子，然后回收感兴趣的表达载体。将重组DNA序列或表达载体引入C3植物细胞
非限制性地，被转化的C3植物的例子包括水稻、小麦、大麦、大豆和马铃薯。可以用本领域技术人员已知的方法制备这些植物的植物细胞。
重组DNA序列或表达载体经由农杆菌引入或直接引入到制备的植物细胞中。作为一种方法，首先经电穿孔用表达载体转化农杆菌，然后采用在植物分子生物学手册(S.B.Gelvin等，学术出版社)中所描述的方法将转化的农杆菌引入植物细胞。作为直接农杆菌的方法，例如，可以使用Nagel等的方法(微生物学通讯，67，325(1990))。就这种方法而言，为了将表达载体引入细胞，可以合适地使用电穿孔方法和基因枪方法。转基因植物细胞再生成植株或植物组织
基于药物抗性(如卡那霉素抗性)选择其中已引入重组基因或表达载体的C3植物细胞。此后，通过常规方法将细胞再生为植物组织或者植株，并且可以从植株获得种子。种子自身可以表达酶。另外，仅在种子发芽和开始生长之后，它们可以表达光合作用的C4途径所涉及的酶。
为了确认在转基因C3植物中表达光合作用的C4途径中所涉及的酶，可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，可以用引入的C4光合作用基因的部分序列为探针与从植物组织或者植物叶片抽提的DNA的Southern杂交的普通方法证实转化和表达，或者通过抽提蛋白质和测定从植物组织或者植物叶片抽提的蛋白质的活性，或者对所抽提的蛋白质进行电泳和进行凝胶测定由此获得活性印迹证实转化和表达。二氧化碳补偿点测定
可以例如按照Hudspeth等，植物生理学，98：458-464(1992)的描述采用红外气体分析仪测定转基因植物的光合活性(二氧化碳补偿点)。更具体地说，将一片新展平的叶片密封进有机玻璃室，室中的温度保持在30℃，在照明下光合活性光子通量密度为1000μmol/m2/S时经通过室的循环空气连续测定二氧化碳的浓度，当室内浓度达到平衡时确定补偿点。
在下文中，本发明将通过以玉米PEPC基因组基因作为C4植物的光合途径中所涉及的酶的表达控制区和结构基因，以水稻作为C3植物为例具体描述本发明。应当明确本发明不限于实施例。用于以下实施例的限制酶、质粒等可从Takara Shuzo Co.和Toyobo Co.获得。实施例1：玉米PEPC基因组基因的分离
用文献中所描述的方法(欧洲生物化学杂志，181：593-598，1989)分离玉米PEPC基因组基因。将玉米(Zea mays L.cv.Golden CrossBantam)植入到蛭石中。种植的玉米于30℃在黑暗下于培养室中培养4天。依据Matsuoka等的方法(植物生理学，85：942-946(1985))从黄化叶子分离基因组DNA。将这种基因组DNA用XbaI消化，并经10％至40％蔗糖密度梯度离心分级分离。将所获得的XbaI片段连接到噬菌体λong C(Stratagene，CA)的Xbal臂上，将连接的DNA体外包装。使用包装的DNA构建基因组文库。然后，采用Matsuoka等，植物细胞生理学，30：479-486(1989)中描述的序列5’-GTCCACGAGAAGATCCAGGG-3’为探针，经噬菌斑杂交筛选噬菌斑。使用这一探针分离的cDNA克隆(pPEP3055)也可以用作探针。分离阳性克隆，用双脱氧法测定该基因组克隆的核苷酸序列。获得了大约8Kb的包含全长PEPC结构基因的XbaI-XbaI片段。图1显示了包含所获得的PEPC的DNA片段的限制图，图2到图4显示了其核苷酸序列。
如表1所示，经分析，大约8Kb的Xbal-XbaI片段的序列具有表达控制区。
               表1元件                    位置             序列TATA盒          -24到-28           TATITCCAAT盒         -367到-371         CCAATSp-1结合位点    -80到-85           CCGCCC
            -48到-53           CCGCCC
            275到280(内含子1)  CCGCCG
            281到286(内含子1)  CCGCCC光效应元件      -653到-661         CCTTATCCT直接重复序列    -536到-550         CCCTCAACCACATCCTGC
            -510到-527         GACACCCTCG-CCACATCC
            -453到-470         GACGCCCTCT-CCACATCCTGC
            -378到-395         GACGCCCTCT-CCACATCCTGC
            -201到-214         CCCTCT-CCACATCC
            -30到-39           CT-CCCCATCC实施例2；表达载体的构建
使用pBI101(Jefferson等，EMBO J.6：3901-3907(1987))、pIG221(Ohta等，植物细胞生理学，31：805-813(1990))和pLAN101MHYG(由Dr.K.Shimamoto提供)构建双向载体pIG121-Hm(图5)。这一载体包含由启动子和终止子控制的NPTII基因、多克隆位点、来源于大肠杆菌的β-GUS基因、35S CaMV启动子控制下的具有TNOS的HPT基因。
首先以HindIII和SstI消化这一载体pIG121-Hm，回收大的片段。将以上获得的玉米PEPC基因的大约8Kb XbaI-XbaI片段连接到消化的载体上，其后引入大肠杆菌JM109。回收卡那霉素抗性菌株，限制酶分析发现获得了表达载体PEPC genome/pBIH2，其中以正确的方向引入了玉米PEPC基因(图6)。实施例3：将表达载体PEPCgenome/pBIH2引入水稻中根癌农杆菌的转化
于20℃下在含有50μg/毫升卡那霉素和100μg/毫升潮霉素的培养基中培养根癌农杆菌EHA101(从华盛顿的大学的Dr.Nester获得)。制备细胞悬液培养物，经电穿孔将表达载体PEPC genome/pBIH2引入上述细菌中，依据Nagel等的方法(微生物学通讯，67，325(1990))选择潮霉素抗性菌株。水稻的转化和水稻细胞的再生
获得用表达载体PEPC genome/pBIH2转化的农杆菌，在AB琼脂培养基(Chilton等，美国科学院学报，71：3672-3676(1974))上形成菌落。用AAM培养基(Hiei等，植物杂志，6：271-282(1994))稀释所形成的菌落。与水稻(Oryza sativa)的愈伤组织一起培养3天。此后，将细菌移到包含50μg/毫升潮霉素的培养基上。每两周在潮霉素选择培养基上传代培养菌落一次。用常规方法选择转基因水稻细胞并再生，结果获得了38个独立的转基因水稻个体。实施例4：转基因水稻中PEPC基因表达的检测
按照以下所述研究PEPC基因在由此获得的38个转基因水稻个体、非转基因水稻和玉米中的表达水平。用Edwards等，Aust.植物生理学杂志，15：385-395(1988)中描述的方法测量PEPC活性。依据Hudspeth等，植物生理学，98：458-464(1992)的描述制备PEPC酶。更具体地说，收获大约0.5g绿色叶片，用液氮迅速冷冻，磨成细粉。将10倍体积的抽提缓冲液添加到粉中，进一步研磨所说的粉。抽提缓冲液包含50mM Hepes-KOH(pH 8.0)、10mM MgCl2、1mMEDTA、10mM DTT、10％(W/V)不溶性PVP、12.5％(V/V)甘油、10 mM亮抑酶肽、1mM PMSF。粗提物以Miracloth(Calbiochem LaJolla，CA)过滤，滤液在4℃和15,000rpm下离心5分钟，用已由无PVP抽提缓冲液预平衡的Sephadex G-25使上清液脱盐。收集洗脱液，测量酶活性和蛋白质量。
图7显示了结果。在图7中，WT代表野生型(即非转基因水稻)，Com代表玉米。PEPC活性用比活性表示(非转基因水稻绿色叶片抽提物中的PEPC比活性为1)。玉米显示出为非转基因水稻约40倍高的PEPC活性。38个转基因水稻植物中的4个显示出比玉米更高的PEPC活性。经转化可以获得具有为非转基因水稻115倍高的PEPC活性的转基因水稻植物(转基因水稻具有为玉米3倍高的PEPC活性)。令人惊奇的是，具有引入其中的C4植物基因组基因的C3早熟禾科植物显示出高于C4植物的PEPC活性。实施例5：二氧化碳补偿点测定
采用非转基因水稻和转基因水稻(在实施例4中获得的具有为非转基因水稻约75倍和约7倍高PEPC活性的转基因水稻)测定光合二氧化碳补偿点。表2显示了结果。
                    表2
              水稻种类                    二氧化碳补偿点
                                                (ppm)具有为非转基因水稻约75倍高的PEPC活性的转基因水稻    48.8具有为非转基因水稻约7倍高的PEPC活性的转基因水稻     53.5非转基因水稻                                        53.7
具有为非转基因水稻约75倍高的PEPC活性的转基因水稻其二氧化碳补偿点降低约10％，预期会进一步改善光合能力。
在不背离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员将清楚各种其它变化，并且易于进行这些变化。因此，意欲用所附的权利要求来限定本文所描述的范围，但是权利要求应予以宽范围的解释。

Claims (41)

1.一种表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物，该植物包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
2.按照权利要求1的C3植物，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物是单子叶植物。
3.按照权利要求1的C3植物，其中所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物是双子叶植物。
4.按照权利要求1的C3植物，其中所说的DNA是C4植物的基因组基因。
5.按照权利要求4的C3植物，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且其中所说的C3植物是C3早熟禾科植物。
6.按照权利要求5的C3植物，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
7.一种产生表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物的方法，该方法包括以下步骤：
用含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物的细胞；和
使转化的C3植物细胞再生为C3植物；
其中所说的再生的C3植物以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
8.按照权利要求7的产生C3植物的方法，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且其中所说的C3植物是单子叶植物。
9.按照权利要求7的产生C3植物的方法，其中所说的C4植物是双子叶植物，其中所说的C3植物是双子叶植物。
10.按照权利要求7的产生C3植物的方法，其中所说的DNA是C4植物的基因组基因。
11.按照权利要求10的产生C3植物的方法，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且其中所说的C3植物是C3早熟禾科植物。
12.按照权利要求11的产生C3植物的方法，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
13.用权利要求7的方法获得的C3植物。
14.权利要求13的植物的一部分，其中所说的植物部分是蔬菜。
15.权利要求13的植物的一部分，其中所说的植物部分是果实。
16.权利要求13的植物的一部分，其中所说的植物部分是花。
17.权利要求13的植物的一部分，其中所说的植物部分是种子。
18.一种表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物组织，该组织包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物组织以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
19.按照权利要求18的C3植物组织，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物组织是单子叶植物组织。
20.按照权利要求18的C3植物组织，其中所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物组织是双子叶植物组织。
21.按照权利要求18的C3植物组织，其中所说的DNA是C4植物的基因组基因。
22.按照权利要求21的C3植物组织，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物组织是C3早熟禾科植物组织。
23.按照权利要求22的C3植物组织，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，并且所说的C3早熟禾科植物是水稻。
24.一种产生表达系统发育上相关的C4植物之基因的C3植物组织的方法，该方法包括以下步骤：
用含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物的细胞；和
使转化的C3植物细胞再生为C3植物组织；
其中所说的再生的C3植物组织以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
25.按照权利要求24的产生C3植物组织的方法，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物组织是单子叶植物组织。
26.按照权利要求24的产生C3植物组织的方法，其中所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物组织是双子叶植物组织。
27.按照权利要求24的产生C3植物组织的方法，其中所说的DNA是C4植物的基因组基因。
28.按照权利要求27的产生C3植物组织的方法，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物组织是C3早熟禾科植物组织。
29.按照权利要求28的产生C3植物组织的方法，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，并且所说的C3早熟禾科植物是水稻。
30.一种表达系统发育上相关的C4植物的基因的C3植物种子，该种子包含这样的DNA，该DNA含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因，其中所说的C3植物种子至少在发芽和生长后以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
31.按照权利要求30的C3植物种子，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物种子是单子叶植物种子。
32.按照权利要求30的C3植物种子，其中所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物种子是双子叶植物种子。
33.按照权利要求30的C3植物种子，其中所说的含有系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区和C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA是C4植物的基因组基因。
34.按照权利要求33的C3植物种子，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物种子是C3早熟禾科植物种子。
35.按照权利要求34的C3植物种子，其中所说的C4早熟禾科植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，并且所说的C3早熟禾科植物是水稻。
36.一种产生表达系统发育上相关的C4植物之基因的C3植物种子的方法，该方法包括以下步骤：
用含有(a)系统发育上相关的C4植物的光合途径中所涉及的酶的基因的表达控制区，和(b)C4植物的光合途径中所涉及的酶的结构基因的DNA转化C3植物的细胞；
使转化的C3植物细胞再生为C3植物；和
从所说的C3植物获得种子；
其中所说的再生的C3植物种子至少在发芽和生长后以高水平表达由所说结构基因编码的酶。
37.按照权利要求36的产生C3植物种子的方法，其中所说的C4植物是单子叶植物，并且所说的C3植物种子是单子叶植物种子。
38.按照权利要求36的产生C3植物种子的方法，其中所说的C4植物是双子叶植物，并且所说的C3植物种子是双子叶植物种子。
39.按照权利要求36的产生C3植物种子的方法，其中所说的DNA是C4植物的基因组基因。
40.按照权利要求39的产生C3植物种子的方法，其中所说的C4植物的基因组基因是C4早熟禾科植物的基因组基因，并且所说的C3植物种子是C3早熟禾科植物种子。
41.按照权利要求40的产生C3植物种子的方法，其中所说的C4植物的基因组基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因组基因，其中所说的C3早熟禾科植物是水稻。
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