KR100917574B1

KR100917574B1 - 톡소플라빈 분해 효소를 선별 마커로 이용한 형질전환 감자식물체 제조

Info

Publication number: KR100917574B1
Application number: KR1020070116491A
Authority: KR
Inventors: 전재흥; 김현순; 김미선; 민성란; 정원중; 문제선; 황인규; 정혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-11-15
Filing date: 2007-11-15
Publication date: 2009-09-15
Also published as: KR20090050189A

Abstract

본 발명은 톡소플라빈 분해 효소 (toxoflavin lyase: tflA)로 이루어진, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커, 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 감자 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 감자 식물체 및 이의 종자, 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하여 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법 및 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

톡소플라빈 분해 효소, 벡터, 식물 선별, 감자

Description

톡소플라빈 분해 효소를 선별 마커로 이용한 형질전환 감자 식물체 제조{Toxoflavin lyase enzyme as a marker for selecting transformant of potato plant}

본 발명은 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커로서의 톡소플라빈 분해 효소에 관한 것으로서, 구체적으로는 톡소플라빈 분해 효소 (toxoflavin lyase: tflA)로 이루어진, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커, 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 감자 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 감자 식물체 및 이의 종자, 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하여 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법 및 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

발현 벡터는 선택성 마커 유전자를 포함하지 않는 세포의 성장을 저해함으로써 형질전환 세포를 선발하는 하나 이상의 유전자 마커를 포함한다. 식물 형질전환에 대해 통상적으로 이용되는 선택 마커 유전자의 대부분은 박테리아로부터 분리되었으며, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택성 화학 물질을 대사적으로 독성을 분해하는 효소를 코딩한다.

가장 널리 이용되는 식물 형질전환 선택성 마커 유전자는 Tn5로부터 분리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(nptII) 유전자이며, 또 다른 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.

많은 선택성 마커가 형질전환된 식물 조직을 선발하기 위해 이용되어 왔지만, 독성 화학 물질을 이용한 상기 선발 시스템은 단점 또는 한계를 가질 수 있다. 첫째, 화학물질 선발로부터 정상적인 생존가능한 형질전환 식물을 직접 회복하는 것이 어려울 수 있다는 것이다. 둘째, 모든 선택 마커 시스템이 모든 조직 및 모든 식물 종에 작동하는 것은 아니라는 것이다. 셋째, 선택을 가능하게 하기 위하여 첨가되어야 하는 몇몇 화합물은 항생물질이다. 항생물질 또는 제초제에 내성을 부여하는 유전자의 전파는 병원체에 내성을 부여할 위험을 피하기 위해 가능한한 많이 최소화되어야 한다. 넷째, 선택을 가능하게 하기 위하여 첨가되어야 하는 몇몇 화합물은 비교적 고가이므로, 더 저렴한 선택 마커를 필요로 한다.

상기와 같은 종래 기술을 바탕으로, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 선별 마커를 연구하던 중, 본 발명자들은 톡소플라빈을 분해하는 효소 tflA(toxoflavin lyase)를 이용함으로써 간단하고 편리하게 감자 식물 형질전환체를 선별하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 톡소플라빈 분해 효소 (toxoflavin lyase: tflA)로 이루어진, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 감자 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 감자 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하여 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 기존의 비싼 항생제 대신 값싼 톡소플라빈을 이용하여 감자 형질전환 식물을 선별할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톡소플라빈 분해 효소 (toxoflavin lyase: tflA)로 이루어진, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커를 제공한다. 톡소플라빈 분해 효소 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환시키고, 상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 증식시키면 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환된 감자 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소가 발현되어 배지 중의 톡소플라빈을 분해하므로, 톡소플라빈 함유 배지에서 생존할 수 있다. 그러나, 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환되지 않은 감자 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소가 발현되지 않아 배지 중의 톡소플라빈을 분해하지 못하므로, 톡소플라빈 함유 배지에서 생존할 수 없게 된다. 이러한 방식으로, 톡소플라빈 분해 효소는 감자 식물의 형질전환 여부를 선별할 수 있는 선별 마커(selection marker)로 활용될 수 있는 것이다.

바람직하게는, 상기 tflA는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 tflA는 서열번호 1로 표시된 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, tflA 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직 하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 감자 식물 발현 벡터를 제공한다. 상기 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 벡터는 도 1에 기재된 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당 한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 페투인 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 감자 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 감자 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 감자 식물체를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 식물체는 톡소플라빈 분해 효소를 발현한다. 본 발명은 또한, 감자 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환 감자 식물의 선별 방법은 본 발명에 따른 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 감자이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함한다. 상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 증식시키면 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환된 감자 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소가 발현되어 배지 중의 톡소플라빈을 분해하므로, 톡소플라빈 함유 배지에서 생존할 수 있다. 그러나, 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환되지 않은 감자 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소가 발현되지 않아 배지 중의 톡소플라빈을 분해하지 못하므로, 톡소플라빈 함유 배지에서 생존할 수 없게 된다. 이러한 방식으로, 톡소플라빈 분해 효소는 감자 식물의 형질전환 여부를 선별할 수 있는 선별 마커(selection marker)로 활용될 수 있는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 증식시키는 단계; 및

상기 형질전환된 감자 식물 세포로부터 형질전환 감자 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법을 제공한다.

감자 식물 세포를 형질전환하는 방법은 전술한 바와 같으며, 형질전환 감자 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: tflA 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터의 제조

감자에 형질전환시키기 위한 플라스미드 벡터 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS (도 1의 B)를 제조하였다.

선별 마커로 하이그로마이신(hygromycin)을 사용하는 pCAMBIA1304 벡터(CAMBIA GPO Box3200)에서 XhoⅠ제한효소로 하이그로마이신 저항성 유전자를 제거한 후, 서열번호 1로 기재되는 감자의 톡소플라빈 유전자 서열을 기반으로 감자의 cDNA로부터 PCR 합성하여 서열을 확인한 후 이를 CaMV 35S 프로모터에 정방향으로 결합시켜 제조하였다. 이 때, tflA를 코딩하는 유전자인 tflA는 XhoⅠ 제한효소부위를 이용하여 결합하였는데, 제한효소부위를 도입하는 방법은 다음의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법에 의해 수행하였다. 먼저, CaMV35S 프로모터와 CaMV35S 폴리A 사이에 발현되도록 양 프라이머의 말단 부위에 인위적으로 5' 말단과 3' 말단의 XhoⅠ제한효소부위를 첨가하였다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝에 이용될 벡터에 도입될 수 있게 tflA 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다.

상기와 같이 제조된 각 벡터의 플라스미드 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 도입하고 식물의 형질전환에 사용하였다. 또한, 형질전환의 기본 조건을 조사하기 위하여 리포터 유전자가 GUS인 pCAMBIA1304 플라스미드를 이용하였다.

실시예 2: 톡소플라빈 농도에 따른 감자의 내성 정도 확인

톡소플라빈 농도에 따른 감자의 내성 정도를 확인하기 위해, 15일 정도 배양 용기내에서 배양한 잎을 절단하여 각각 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산(naphthalenacetic acid, NAA), 0.1 ㎎/ℓ의 지베렐린(gibberelin, GA₃), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴(Zeatin) 및 선별 물질로 0, 0.1, 0.2, 1, 2, 5 ㎎/ℓ의 톡소플라빈이 들어 있는 식물 재분화 배지(PR 배지)에 배양하였다. 0-2 ㎎/ℓ의 톡소플라빈 PR 배지에서는 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 그러나 이 농도보다 높은 톡소플라빈 PR 배지에서는 캘러스 생성이 거의 없고 한 달 후부터 눈에 띄게 갈변현상이 나타났다 (도 2).

실시예 3 : 광도 및 톡소플라빈 농도에 따른 재분화율 확인

15일 정도 배양 용기 내에서 배양한 감자 잎을 절단하여 각각 0.01 ㎎/L의 나프탈렌초산(naphthalenacetic acid, NAA), 0.1 ㎎/L의 지베렐린(gibberelin, GA₃), 2.0 ㎎/L의 제아틴(Zeatin) 및 선별 물질로 0, 3, 7 ㎎/L의 톡소플라빈이 들어 있는 식물 재분화 배지(PR 배지)에 배양하였다. 또한, 각각을 Dark, 6.5, 77, 145, 259 umol photon/m²s 의 광도 조건하에 배양하였다. 그 결과, dark 상태에서 재분화율이 가장 낮았고, 일반적으로 배양하는 77umol photon/m²s 광도 조건에 비해 145 umol photon/m²s에서 재분화율이 떨어지는 것을 알 수 있었고, 또한 고광도에서 재분화율이 145 umol photon/m²s에 비해 높아지는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 톡소플라빈은 빛에 의존적임을 확인하였다 (도 4).

실시예 4: 선별 유전자로서 tflA 유전자의 효용성 확인

<4-1> 아그로박테리아를 이용한 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS의 형질전환

감자의 잎을 잘라 재분화 전배지에서 6시간동안 배양한 후, pCAMBIA1301-GPT-GUS를 포함한 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105와 각각 15분 동안 공동 배양하여 형질전환하였다. 상기의 형질전환된 잎 절편을 1일에서 7일 동안 2,4-D(2,4-dichlororophenoxy acetic acid)가 들어있는 캘러스 유도 배지 (C·C 배지)에서 배양하였다. 이 때 캘러스 유도 배지는 MS 배지에 3%의 수크로오스(서당), 0.8% 한천 및 2.0 ㎎/ℓ의 2,4-D를 첨가하고, 배지의 pH를 5.8로 조정한 배지를 사용하였다. 그 후, 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산, 1000 ㎎/ℓ의 카베니실린(Carbenicillin disodium), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴 및 선별 물질로 각각 7, 10, 15, 20, 30 mg/L의 톡소플라빈이 들어 있는 식물 재분화 배지(PR 배지)로 옮겨주었다 (도 5). 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 상기 소식물체를 분리가 가능할 정도까지 배양한 다음, MS 기본배지로 옮겨 주어 정상 식물과 동일한 과정으로 증식시켰다.

이렇게 형질전환시킨 톡소플라빈 식물체와 기존에 선별마커들이 들어간 형질전환 식물체들과의 재분화율과 형질전환율을 비교 분석한 결과, tflA이 들어간 식물체에서 빠른 재분화율을 보였고 카나마이신(Kanamycin)을 선별마커로 가진 식물체에서 형질전환율이 62.5%로 가장 높았으나, tflA이 들어간 식물체 역시 다른 선별마커들과 비슷한 양상의 형질전환율을 보여 충분히 선별마커로 사용가능함을 확인하였다 (도 3).

<4-2> 톡소플라빈 농도에 따른 형질전환 식물체의 내성 정도 확인

음성대조군과 형질전환된 식물체의 톡소플라빈 내성정도를 알아보기 위해 0, 0.3, 1, 3, 10, 30 mg/L 톡소플라빈이 포함된 멸균수에 같은 면적으로 자른 후 담가두었다. 3일 후 음성대조군은 3mg/L 톡소플라빈이 포함된 용액에서 손상이 심해 잎이 하얗게 탈색되는 것을 확인하였고, 형질전환된 식물체에서 음성대조군과 비교해 눈에 띄게 톡소플라빈에 내성도가 높은 것을 확인하였다 (도 7).

<4-3> PCR을 통한 형질전환 식물체의 선별

형질전환 후 tflA 유전자가 식물내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 구체적으로, 톡소플라빈이 함유된 배지에서 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분 리한 후, 정방향 프라이머 5'-CTA GTG CTA GAG CAA GCA GAT GCG TT-3'(서열번호 3) 와 역방향 프라이머 5'-CGT TAT CCA GCT CCA TCT GTA ACG GA-3'(서열번호 4), 그리고 정방향 프라이머 5'-CGT GAA ATC AAA AAA CTC GAC GGC-3'(서열번호 5) 와 역방향 프라이머5'-AAG TCC GCA TCT TCA TGA CGA CCA-3'(서열번호 6)를 각각 PCR 반응에 이용하였다. 이 때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 도 9의 A는 톡소플라빈 형질전환 감자 식물체 #5, 6, 15, 19, 28, 34, 및 44의 tflA과 GUS 유전자의 PCR 증폭 결과를 나타내는 그림이다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 감자 식물체에서는 tflA 유전자 및 GUS 유전자 모두 PCR 산물을 관찰할 수 있었다.

실시예 5: tflA 유전자의 노던 블럿 분석

전체 RNA는 페놀/SDS 방법을 이용하여 샘플로부터 추출하였다. 전체 RNA의 25 μg을 2.2 M 포르말린이 포함된 1% 아가로스 겔로 전기영동에 의해 분리하고 나일론 막으로 옮겼다. tflA 프로브는 감자 톡소플라빈 유전자 서열 (서열번호 1)로부터 설계된 정방향 프라이머 5'-CTA GTG CTA GAG CAA GCA GAT GCG TT-3'(서열번호 3) 와 역방향 프라이머 5'-CGT TAT CCA GCT CCA TCT GTA ACG GA-3'(서열번호 4)를 주형으로 하여 클론된 감자 cDNA를 이용하여 PCR을 실시하였다. 나일론 막은 PCR DIG 프로브 합성 키트 (Roche Molecular Biochemicals)를 이용하여 디곡시제닌 (DIG)이 라벨링된 프로브로 혼성화하였다. 혼성화 완충액에서 42℃ 조건으로 16 시간동안 혼성화를 계속하여 실시하고, 막을 실온에서 5분 동안 2X SSC, 0.1% (w/v) SDS로 2회 세척하였다. 그런 다음, 68℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS로 15분 동안 세척하고 타겟 DNA를 제조처에서 제시한 방법 (Roche Molecular Biochemicals)으로 DIG 발광 감지 키트를 이용하여 확인하였다. 도 9의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 감자 식물체에서 tflA 전사체를 확인할 수 있었다.

실시예 6: GUS 염색을 통한 형질전환체 확인

리포터 유전자가 GUS인 pCAMBIA1304이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105를 이용하여 형질전환의 조건을 살펴보았다. pCAMBIA1304 플라스미드가 도입된 EHA105 아그로박테리아를 15분 동안의 공동배양을 거친 후, 캘러스 유도배지에서 1일에서 7일 동안의 각기 다르게 배양한 다음 식물 재분화 배지로 옮겨주었다. 이 때 식물 재분화 배지에 각각 7, 10, 15, 20, 30 mg/L 톡소플라빈을 처리하였고, 아그로박테리움과 공동 배양 2주 후 GUS 염색을 한 후, GUS 발현양을 살펴보았다 (도 5). 그 결과, 캘러스 유도 배지에서 7일, 10 mg/L 톡소플라빈이 포함된 배양조건에서 GUS 발현양이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 아그로박테리움과 공동배양 후 캘러스 유도배지에서 3일 동안 배양한 다음 7 mg/L 톡소플라빈이 포함된 식물 재분화 배지로 옮겨주고 Light, High light, Dark에서 2주 동안 배양 후 Light, 그리고 Dark 상태에서 각각 배양 후 GUS 염색 후 발현양을 살펴보았다 (도 6). 그 결과, Dark (암상태)에서 배양했을 경우 GUS 발현양이 가장 많은 것을 확인하였다.

pCAMBIA1304 플라스미드가 도입된 EHA105 아그로박테리아를 식물체에 도입 두 달 후 재분화 배지에서 나온 줄기들을 GUS 염색을 한 후, GUS 발현양을 살펴보았다 (도 8, 10, 11). 그 결과, 20 mg/L 톡소플라빈이 포함된 재분화 배지에서, 그리고 Dark에서 2주 동안 배양 후 Light로 옮겨준 상태에서 GUS 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. 이때, GUS 염색은 1 mM의 X-글루코(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-글루쿠로닉산)(X-gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic acid)과 pH 7.0로 조정한 100 mM의 Na-포스페이트(phosphate) 및 0.5 mM의 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide)를 혼합한 후, 37℃에서 하루 밤 동안 반응시켜 확인하였다.

도 1은 감자의 tflA 유전자를 CaMV 35S 프로모터에 결합시키고, GUS 염색에 의해 형질전환 조건을 개발하기 위하여 GUS 유전자가 있는 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS 식물 형질전환용 벡터를 나타내는 그림이며,

도 2는 재분화 배지에 각각의 다른 톡소플라빈 농도(0, 0.1, 0.2, 1, 2, 및 5 mg/L)를 처리했을 때의 재분화율을 나타내는 그림이며,

도 3은 다른 선별마커들과 톡소플라빈의 재분화율과 형질전환율의 비교를 나타내는 그림이고,

도 4는 각각의 다른 농도로 톡소플라빈(0, 3, 7mg/L)을 처리한 배지에서 광도에 따른 재분화율을 나타내는 그림이며,

도 5는 아그로박테리움과 공동배양을 15분 동안 한 후, 캘러스 유도배지에서 1일부터 7일 동안 배양하고, 각각의 다른 농도로 톡소플라빈을 처리한 배지로 옮겨준 후 2주 뒤에 GUS 염색을 하여 spot 수를 나타낸 그림이며,

도 6은 아그로박테리움과 공동배양한 후 캘러스 유도배지에서 3일간 배양 후 톡소플라빈 7mg/L 첨가된 배지로 옮겨주고, Light, High light, Dark에서 2주 동안 배양 후 Light, 그리고 Dark 상태에서 배양 2주 후에 GUS 염색을 하여 spot 수를 나타낸 그림이며,

도 7은 액체 톡소플라빈 0-30mg/L에서 형질전환된 식물체를 선별할 수 있는 표지를 나타내는 그림이며,

도 8은 아그로박테리움과 공동배양 2달 후 재분화된 식물체를 GUS 염색을 통 해 선별하는 그림이며 (PC는 양성대조군, NC는 음성대조군을 나타냄),

도 9는 톡소플라빈 형질전환 감자 식물체 #5, 6, 15, 19, 28, 34, 및 44의 tflA과 GUS 유전자의 PCR 증폭 결과(A) 및 노던 블롯 분석 결과(B)를 나타내는 그림이며 (MW는 분자량 마커, PC는 양성대조군, NC 및 C는 음성대조군을 나타냄),

도 10은 각각의 다른 톡소플라빈 농도에서 재분화된 식물체의 형질전환율(상단 그림)과 Dark에서 Light, 그리고 Light에서 배양했을 때의 형질전환율(하단 그림)을 나타내는 그림이고,

도 11은 양성대조군(PC)과 음성대조군(NC), 그리고 톡소플라빈이 형질전환된 식물체(tflA34)의 GUS 염색을 통해 형질전환된 식물체에서 GUS가 발현됨을 나타내는 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Toxoflavin lyase enzyme as a marker for selecting transformant of potato plant <130> PN07074 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 666 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 1 atgacttcga ttaaacagct tacattgtat acggccgagc ttgaccggat gctagcattt 60 tatacgaata tgcttggtgc gcagcatgtg catgagcaag cagatgcgtt tacgatccag 120 ctaggagtat cacagattca atttcgtgca gctgctgatg gaacaaagcc cttttaccat 180 attgctatca atatcgcggc aaaccatttt caagagggaa aagcctggct cagcggcttt 240 ggtgaattgc taacggaaaa tgatgaagat caggcatact ttcccttctt taacgcgtac 300 tcctgttatg tagaagaccc gtctggtaat attattgaac tcatctcgcg tcagcaagct 360 gcacctgtac tggataagcc cttctcagcg gatcagctac taagcatcgg tgagattaat 420 ataacaacca gcgatgtaga gcaagctgca acacgattaa agcaagcaga actgcctgta 480 aagctagacc agattgagcc agcaggctta aattttatcg gtgatcagga tttgttcctg 540 ctgctgggtc ctccaggacg acgctggtta ttttcagaac gcgtagccgt gatctatccg 600 ttacagatgg agctggataa cggcgtcagt ctggcgatta cagagacagg tgaactggtg 660 atctaa 666 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Paenibacillus polymyxa <400> 2 Met Thr Ser Ile Lys Gln Leu Thr Leu Tyr Thr Ala Glu Leu Asp Arg 1 5 10 15 Met Leu Ala Phe Tyr Thr Asn Met Leu Gly Ala Gln His Val His Glu 20 25 30 Gln Ala Asp Ala Phe Thr Ile Gln Leu Gly Val Ser Gln Ile Gln Phe 35 40 45 Arg Ala Ala Ala Asp Gly Thr Lys Pro Phe Tyr His Ile Ala Ile Asn 50 55 60 Ile Ala Ala Asn His Phe Gln Glu Gly Lys Ala Trp Leu Ser Gly Phe 65 70 75 80 Gly Glu Leu Leu Thr Glu Asn Asp Glu Asp Gln Ala Tyr Phe Pro Phe 85 90 95 Phe Asn Ala Tyr Ser Cys Tyr Val Glu Asp Pro Ser Gly Asn Ile Ile 100 105 110 Glu Leu Ile Ser Arg Gln Gln Ala Ala Pro Val Leu Asp Lys Pro Phe 115 120 125 Ser Ala Asp Gln Leu Leu Ser Ile Gly Glu Ile Asn Ile Thr Thr Ser 130 135 140 Asp Val Glu Gln Ala Ala Thr Arg Leu Lys Gln Ala Glu Leu Pro Val 145 150 155 160 Lys Leu Asp Gln Ile Glu Pro Ala Gly Leu Asn Phe Ile Gly Asp Gln 165 170 175 Asp Leu Phe Leu Leu Leu Gly Pro Pro Gly Arg Arg Trp Leu Phe Ser 180 185 190 Glu Arg Val Ala Val Ile Tyr Pro Leu Gln Met Glu Leu Asp Asn Gly 195 200 205 Val Ser Leu Ala Ile Thr Glu Thr Gly Glu Leu Val Ile 210 215 220 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ctagtgctag agcaagcaga tgcgtt 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 cgttatccag ctccatctgt aacgga 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 cgtgaaatca aaaaactcga cggc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 aagtccgcat cttcatgacg acca 24

Claims

서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 톡소플라빈 분해 효소 (toxoflavin lyase: tflA)로 이루어진, 감자 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커.
삭제
제1항에 있어서, 상기 tflA는 서열번호 1로 표시된 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 마커.
서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어지는 톡소플라빈 분해 효소 (tflA) 코딩 유전자를 포함하는 재조합 감자 식물 발현 벡터.
삭제
제4항에 있어서, 상기 벡터는 도 1에 기재된 pCAMBIA1304-tflA-GFP-GUS 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제4항의 벡터로 형질전환된 감자 식물체.
제4항에 따른 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법.
제4항에 따른 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 증식시키는 단계; 및

상기 형질전환된 감자 식물 세포로부터 형질전환 감자 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법.