JP5719784B2 - ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび/またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼをコードする構築物を含む形質転換植物 - Google Patents
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配列番号16
TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTGATTTCTAAATTTGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACAGATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGAGTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTGGTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTATCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAGTTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCATTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
配列番号17
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTACTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCATTTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATTAAATATTTCTGACGTGATATACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTTTGTTTATTTTTGGATTAGACATTTATGGACAAGTTAATGCGCTATTGTGACTATTACCAGAAAATAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGTGAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGGTCAACAAATAAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGATAAATGTTTCTGCAACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGTTTATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTTTGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGTTGTTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGTAAAATCATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACTGGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGTAGAGACAGTACCAACTATGGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATACAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAGATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAAACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGGTAAAACAATTGTTATTTCTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATTAACAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAAAAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATATATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTATGGAAATCGATACAACAAAACGCTGCCTTGTAACACATGTTTGTAGGCTATTAACATGATCTGTAATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAGTTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGTTTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
配列番号18
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
配列番号19
MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKKRSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGSTTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALATLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVFVNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCNRYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGKDGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPDIWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVILLACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPTKYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKTEIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSLRRRFSLLVLSF
配列番号20
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAAGCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACGTTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACCATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGCCATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTTACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGTAGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGAAACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAGATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAAGTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATACGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTTAAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGTTGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAATAGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGACGAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTTGGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACTATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATTCGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTTGCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTACCAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCATTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTTTCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTGACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTATTTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGTGGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGTTTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTTGACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAATGTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATATTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTTTAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTCATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGAACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAACCGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTTGGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAAAAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTCCTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTTTTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTTTGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTG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配列番号21
ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
配列番号22
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
配列番号23
MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
配列番号24
MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTGLHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
i)第1または第2の局面に係る遺伝子構築物あるいは第3の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ii)形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
i)第1または第2の局面に係る遺伝子構築物あるいは第3の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ii)形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
一連のSAG12−PPDKおよびPCK発現ベクターを、図3に示すように作製し、次いで、形質転換した植物においてPPDKおよびPCKの発現を増加させるそれらの能力を分析した。一実施形態では、本構築物は、PCKまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつPPDKをコードしないものであってもよい。別の実施形態では、本構築物は、PPDKまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつPCKをコードしないものであってもよい。ただし、さらに別の局面では、本構築物は、PCKまたはその機能的な変異体もしくは断片およびPPDKまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするものであってもよい。後述するように、最初にシロイヌナズナのPPDK遺伝子のgDNAを単離する。
シロイヌナズナ生態型Columbia 0からのgDNAを、推奨されている手順に従ってDNeasy植物ミニキット(DNeasy Plant Mini Kit)(Qiagen社)を用いて葉から抽出した。gDNAを、表1にまとめたプライマー配列を用いる下記のようなPCR反応のための鋳型として使用した。
全RNAを7日齢のシロイヌナズナの子葉から抽出した。リボヌクレアーゼを含まない機器を用いて氷上でRNAの抽出を行い、ピロ炭酸ジエチル(DEPC、Sigma−Aldrich社)で処理した水を用いて溶液を調製した。水1リットルにつきDEPC1mlを添加し、混合物を換気フード内で一晩撹拌した後、加圧滅菌した。TriPure単離試薬(Roche社)を用いてRNAを抽出した。乳鉢と乳棒を用いて組織200mgを液体窒素中で粉砕し、TriPure単離試薬1mlを添加し、推奨されている手順を続けた。RNAペレットは、60℃まで10分間予熱した無傷のRNA溶液(RNA Secure)(Ambion社)20μlに再懸濁した。試料を、13,000rpmで、4℃で5分間遠心分離し、上澄みを清潔な1.5mlのマイクロ遠心分離管に移し、汚染性の破片を除去した。
PPDKの細胞質基質のイソ型をコードする遺伝子のgDNAおよびcDNA型を、表1に示すAvrII制限部位を含む順方向プライマー(AtCytFWD−AvrII、配列番号1)およびBamHI制限部位を含む逆方向プライマー(AtCytREV−BamHI、配列番号2)を用いるPCRによって、gDNAまたはcDNAの鋳型から増幅した。PCR反応混合物は、1×HF緩衝液(NEB社)、2mMの塩化マグネシウム(MgCl2、NEB社)、0.5mMのdNTPs(Bioline社)、100ngの鋳型(cDNAまたはgDNA)、0.5μMの各プライマーおよび1単位のPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NEB社)を含有していた。熱循環は、98℃で30秒間の最初の変性工程、次いで、98℃で10秒間、55℃で30秒間および72℃で2分間の30サイクル、72℃で5分間の最終的な伸長工程によって、Techneサーマルサイクラー(Techne Thermal Cycler)を用いて行った。
(a)AvrIIおよびBamHI制限部位をそれぞれ含み、かつ2.4および4.3kb産物を産生するプライマーを用いる、シロイヌナズナのPPDKの細胞質基質のイソ型のcDNAおよびgDNA型のPCR増幅。
(b)クローニングベクターpCR 4Blunt-TOPOへの挿入。PPDK挿入断片全体を配列決定し、予想した配列と同一であることが分かった。
(c)AvrIIおよびBamHIによるクローニングベクターおよび目的ベクターpBNPの制限エンドヌクレアーゼ消化。
(d)BNPへの連結反応、および構築物のAvrIIおよびBamHIによる制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたDNA断片を示すアガロースゲル。予想されたバンドの大きさは、cDNA構築物では14.8kbおよび2.4kb、gDNA構築物では14.8kbおよび4.4kbであった。
(e)アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってシロイヌナズナ生態型Columbia 0に導入された構築物。構築物は、連結反応部位全体にわたって配列決定した。遺伝子nptIIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、植物中にカナマイシン耐性を付与する。LBおよびRB:T−DNAの左右それぞれの境界;nos Pro:ノパリンシンターゼプロモーター;nos t:ノパリンシンターゼターミネーター;SAG12 Pro:シロイヌナズナSAG12遺伝子のプロモーター。
PCR産物を、0.5×TBEに溶かした1%(w/v)のアガロース、0.5μgml−1の臭化エチジウム(Sigma−Aldrich社)を使用するアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。試料を、1×DNA試料緩衝液(6×作業濃度のDNA試料緩衝液は、50mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス−HCl、Melford Laboratories社)、60%のグリセリンおよび0.25%(w/v)のブロモフェノールブルー(Sigma−Aldrich社)を含有していた)に懸濁し、泳動用緩衝液として0.5×TBEを用いる80Vの電気泳動に供した。
PPDKを、老化誘発プロモーターSAG12の制御下でBNP1380000001バイナリーベクターに連結させた。SAG12を含む骨格プラスミド(BNP1380000001)は、pBINPLUS(F. A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290)に基づくものであり、図3aに示す。最初に、TOPO−cDNAまたはTOPO−gDNAを保有する大腸菌のコロニーを使用して、50μgml−1のカナマイシンを含む25mlのLB培地に植菌した。これらの培養物を37℃の振盪培養器内で一晩培養し、推奨されている手順に従ってプラスミドミディキット(Plasmid Midi Kit)(Qiagen社)を用いてプラスミドDNAを抽出した。プラスミドミディキットを用いて、50μgml−1のカナマイシンを含む100mlの培養物からpBNP1380000001ベクターを精製した。
アグロバクテリウムチュメファシエンスのGV3101−R株を、電気穿孔によって、図3に示すプラスミドBNP−PPDKcDNAおよびBNP−PPDKgDNAで形質転換した。それらの調製については、実施例1に記載されている。
形質転換した植物からの種子は、Harrison et al. (2006), Plant Methods, 2, 19に従って、50μgml−1のカナマイシン(Dufecha Biochemie社)に関して選択した。抗生物質抵抗性を示すT1植物は結実するまで成長し、自己授粉した。この種子を上記のように選択し、3:1の耐性:非耐性比を示すT2系統を、導入遺伝子の単一コピーを保有するものとして選択した。これらの植物は再び自己授粉し、上記のように選択した。100%の耐性を示す子孫(T3)を産生したT2系統をホモ接合性として選択し、全ての実験に使用した。メンデル遺伝学を使用して、導入遺伝子に対してホモ接合性であり、かつ単一の導入遺伝子コピーを含むT2世代植物を選択した。SAG12−PPDKcDNAおよびSAG12−PPDKgDNAで形質転換した各植物に対して、5種類の独立した単一の挿入断片のホモ接合性系統を選択した。
形質転換受容性アグロバクテリウムチュメファシエンス株LBA4404を、実施例2に記載されているように電気穿孔法によって、プラスミドBNP、BNP−PPDKcDNAおよびBNPPPDKgDNAで形質転換した。電気穿孔後、電気穿孔した細胞に1mlのLB培地を添加し、次いで、その細胞を、50μgml−1カナマイシンおよび100μgml−1スペクチノマイシン(Sigma−Aldrich社)を含むLB寒天上に移す前に、28℃の振盪培養器内で2時間培養した。28℃で2日間の培養後、1つのコロニーを使用して、50μgml−1カナマイシンおよび100μgml−1スペクチノマイシンを含む50mlのLB培地に植菌した。この培養物を、28℃の振盪培養器内で3日間培養した。プラスミドDNAを抽出し、制限酵素消化によって分析し、50μlの培養物を使用して、50μgml−1のカナマイシンおよび100μgml−1のスペクチノマイシンを含む50mlのLB培地に植菌した。この培養物を、28℃の振盪培養器内で一晩培養した。
定量的PCR(Q−PCR)を使用して、T0およびT1植物中の導入遺伝子のコピー数を定量化した。可能であれば、単一の挿入断片T0およびホモ接合性T1植物を分析のために選択した。導入遺伝子の検出のために、表1に示すようなプライマーBNP−1271F(配列番号10)およびBNP−1334R(配列番号11)を使用し、Vic/TAMARA標識プローブBNP1291TV(配列番号12)を使用して、nptII導入遺伝子にアニールした。内部定量化のために、プライマーNtCyc−184F(配列番号13)およびNtCyc−316R(配列番号14)を使用し、FAM/TAMARA標識プローブNtCyc−267T(配列番号15)を使用して、サイクロフィリンをコードする内因性遺伝子にアニールした。定量化は、比較Ct法によるものであった(ΔΔCt method, Bubner & Baldwin (2004), Plant Cell Reports, 23, 263-271)。反応混合物は、1×ユニバーサルマスターミックス(Universal Master Mix)(ABI社)、0.9μMの各プライマー、0.2μMの各プローブ(BNPおよびNtCycプライマーおよびプローブに対して別の反応を用いる)および推奨されている手順に従ってDNeasy植物ミニキット(Qiagen社)を用いて葉の組織から抽出した約500ngのgDNA鋳型を含んでいた。熱循環は、95℃で10分間の最初の変性工程、次いで、95℃で15秒間、60℃で1分間の40サイクルによって、7900HT FastリアルタイムPCRシステム(7900HT Fast Real-Time PCR System)(Applied Biosystems社)で行った。データは、付属のSDS2.2ソフトウェア(Applied Biosystems社)を用いて分析した。
タンパク質の抽出
シロイヌナズナの葉の組織(100mg)を、マイクロ乳棒を用いて1.5mlの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、400μlの抽出緩衝液(リン酸カリウム緩衝液(+プロテアーゼ阻害剤反応混液(PIC、Sigma社)))を添加した。タンパク質の濃度は、推奨された手順に従ってBio−Radタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Protein Assay Reagent)(Bio−Rad社)を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989, Journal of Chemical Ecology, 15, 979-992)で測定した。
タンパク質は、10%(v/v)アクリルアミド(37.5:1=アクリル:ビスアクリル、Severn Biotech社)、50%(v/v)免疫ブロット分解緩衝液(セクション2.10を参照)、0.05%(w/v)ペルオキソ二硫酸アンモニウム(APS、AnalaR社)、および0.05%(v/v)N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、Severn Biotech社)を含む分解ゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE社)によって分離した。濃縮用ゲルは、上記のような5%アクリルアミド、50%(v/v)免疫ブロット濃縮用緩衝液、0.06%(w/v)APSおよび0.1%(v/v)TEMEDを含んでいた。電気泳動は、1×免疫ブロット試料緩衝液(66mMのトリス−HCl、10%(v/v)グリセリン、0.7mMのSDS、0.7Mのβ−メルカプトエタノール(BDH Laboratory Supplies社)および0.05%(w/v)ブロモフェノールブルー)および免疫ブロット泳動用緩衝液、(25mMのトリス−HCl、0.29mMのグリシン(Fisher Scientific社)および3.5mMのSDS)を用いて抽出した20μgの総タンパク質に対して70mAの電流で1時間30分間行った。
免疫ブロット分析用のゲルからのタンパク質を、Protean極厚ブロット紙(Protean Extra-Thick Blot Paper)(Bio−Rad社)、および免疫ブロット用転写緩衝液(48mMのトリス−HCl、39mMのグリシン、1.3mMのSDSおよび20%(v/v)メタノール(Fisher Scientific社))を用いて、セミドライブロッター(Semi-Dry Blotter)(Bio−Rad社)中でProtan BA83硝酸セルロース膜(Schleicher and Schuell社)に15Vで1時間転写した。タンパク質の転写を確認するために、ポンソー染色(0.5%(w/v)ポンソーS(Fluka社)および1%(w/v)氷酢酸(Fisher Scientific社))をブロットした後の膜に塗布し、次いで、その膜を蒸留水ですすいだ。
タバコの葉の組織(100mg)を、マイクロ乳棒を用いて1.5mlの微小遠心管の中で液体窒素下で粉砕し、400μlの抽出緩衝液(オーバーコート緩衝液(Overcoat Buffer)(PIC社))を添加した。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Bio−Radタンパク質アッセイ試薬(Bio−Rad社)を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。タンパク質は、実施例4に記載されているようにポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE社)によって分離した。実施例4に記載されている免疫ブロットによってタンパク質を分析し、かつPPDKタンパク質を定量化した。
(b)形質転換K326系統を選択するためのPPDK免疫ブロット。老化は、分離および暗所での30℃で3日間の培養によって6週齢の植物の緑葉において誘発された。タンパク質を抽出し、免疫ブロット分析に供して、より高濃度のPPDKを発現している系統を選択した。組み換え型トウモロコシPPDK(50μg)を陽性対照として使用した。各親のT0植物からの1つの子孫に関する1つの代表的な免疫ブロットが示されている。SAG12−PPDKgDNA親系統G4、G8およびG10から、および、SAG12−PPDKcDNA系統C10からの植物をその後の全ての分析に使用した。
(c)セクション(b)におけるK326に関して、形質転換バーレー21系統を選択するためのPPDK免疫ブロット。SAG12−PPDKgDNA親系統G3、G7、G15およびG23からの植物をその後の全ての分析のために使用した。
シロイヌナズナ植物の成長分析
図8を参照すると、シロイヌナズナにおけるPPDKgDNAの過剰発現によって、より大きなロゼットを有する植物が生産されることが明らかに示されている。播種後3、5、7および9週目に野生型、ΔPPDKおよびSAG12−PPDKgDNA植物を撮影した。SAG12−PPDKgDNA植物は野生型よりも大きかった。PPDK植物と野生型植物との間に識別可能な差はなかった。
ロゼットの表面積は、単一の成葉の試料(通常は葉10枚)を採取し、上記のように葉およびロゼット全体の質量を測定し、かつルーラーに並べてそれらの葉を撮影して測定した。葉の表面積は、ImageJソフトウェア(アメリカ国立衛生研究所)を用いて測定し、ここから、ロゼット全体の表面積を計算した。
クロロフィル含有量は、CCM−200手持ち式クロロフィル計(Opti-Sciences社)を用いて、相対的な単位で測定した。
FV/FM比を、Hansatech FMS2蛍光光度計を用いて測定した。葉は、測定前に一晩、製造業者によって提供されたリーフクリップ(leaf clip)を用いて暗順応させた。老化の開始が野生型植物に対してSAG12−PPDKgDNAまたはΔPPDK植物において変化したか否かを判定するために、FV/FM比を測定した。FV/FMは、光化学系IIの量子効率の推定値であり、光阻害が生じると減少する。クロロフィル含有量の減少が検出される前に、光合成の減少が老化の初期に生じるため、FV/FMは老化の開始の有用な基準である。FV/FMは、播種後(葉がFV/FMを測定するのに十分な程大きくなる)4週目から9週目までに経時的に測定した。野生型、SAG12−PPDKgDNAおよびΔPPDK植物のFV/FMは、7週目に最大となり、その後減少し、これは、全ての3種類の遺伝子型において老化の開始のタイミングが同じであったことを示していた。しかし、SAG12−PPDKgDNA植物のFV/FMは、8週目に野生型よりも有意に高く、これは、老化の後期段階における長期にわたる光合成作用を示していた。
窒素分析用の組織を、Edwards Super Modulyo凍結乾燥器を用いて凍結乾燥した。シロイヌナズナの葉の組織(25mg)またはタバコの葉の組織(100mg)を、窒素非含有秤量紙(Elementar Analysensysteme社)に包装した。推奨されている設定を用いて、Rapid N III窒素分析装置(Rapid N III Nitrogen Analyzer)(Elementar Analysensysteme社)を使用して乾燥重量の割合として窒素含有量を測定した。アスパラギン酸(Sigma−Aldrich社)を標準物質として使用した。葉の窒素含有量は、シロイヌナズナの野生型、SAG12−PPDKgDNAおよびΔPPDK植物において、播種後3週目から9週間目までに経時的に測定した。
個々の種子の質量および窒素含有量を、野生型、SAG12−PPDKgDNAおよびΔPPDKシロイヌナズナ植物の種子について測定した。
葉の組織(100mg)を、マイクロ乳棒(Eppendorf社)を用いて、1.5mlの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、300μlの無菌脱イオン水を添加した。試料は、13,000rpmで、4℃で5分間遠心分離にかけた。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Bio−Radタンパク質アッセイ試薬(Bio−Rad社)を用いるブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。推奨されている手順に係って、EZfaastアミノ酸試料試験キット(EZfaast Amino Acid Sample Testing Kit)(Phenomenex社)を用いるアミノ酸分析のために試料を調製した。10mMのギ酸アンモニウム(BDH laboratory supplies社)の50%無菌蒸留水と50%超高純度メタノール(Romil社)溶液に試料を再懸濁した。
タバコの葉の窒素含有量の分析
葉の窒素含有量を、陰性の分離体およびSAG12−PPDK−K326タバコの熟した葉について測定した。熟した葉は、タバコの生産のために収穫の準備ができいている葉である。4種類の独立したSAG12−PPDK系統のいくつかでは、SAG12−PPDK植物の葉の窒素含有量は陰性の分離体植物よりも低かった。
分離および暗所での30℃で3日間の培養によって老化が誘発されたK326タバコの成葉についてアミノ酸含有量を測定した。これによって、老化の誘発の前後で同じ葉を比較することができた。葉の分離および暗所での培養による老化の誘発は、重複が最大である年齢に関連する老化による遺伝子発現パターンを示す。
全ての4種類の独立した形質転換系統について、個々の種子の質量をK326タバコについて測定し、陰性の分離体植物と比較して、SAG12−PPDKgDNAおよびSAG12−PPDKcDNA植物の方が有意に高かった。莢あたりの種子の質量も測定し、SAG12−PPDKgDNAおよびSAG12−PPDKcDNA植物の方が有意に高かった。
実施例1および2に記載されているように、PCKのコード領域およびゲノムクローンを、シロイヌナズナに形質転換されたBNP1380000001バイナリーベクター中の老化関連遺伝子12(SAG12)プロモーターに融合させることによって、老化中にシロイヌナズナPCK(At4g37870.1)の過剰な発現が達成された。
本発明者らは、図3に示すPCKおよびPPDK単一構築物が、植物に形質転換されると、これらの酵素が老化した葉で過剰発現した場合に、老化した葉からの窒素の転流率の上昇、さらに栄養植物成長量の増加(作物収穫率の上昇に該当する)を引き起こすことを観察した。従って、本発明者らは、PCKおよびPPDKをコードする遺伝子がどちらもSAG12プロモーターの制御下でpBNP130000001に挿入されている2種類の二重構築物を作製することに決めた。
Claims (25)
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PCK)活性および/または細胞基質型ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ(PPDK)活性を有する少なくとも1種のポリペプチドをコードする、少なくとも1つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含む遺伝子構築物。
- 前記プロモーターがシロイヌナズナ中の老化関連遺伝子から単離されたものである、請求
項1に記載の遺伝子構築物。 - 前記プロモーターが、SAG12、SAG13、SAG101、SAG21およびSAG18またはその機能的な変異体からなる群から選択され、前記変異体がプロモーターをコードし、かつ前記列挙されているプロモーターのいずれかと少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1または2に記載の遺伝子構築物。
- 前記プロモーターがSAG12プロモーターまたはその機能的な変異体であり、前記変異体がSAG12プロモーターをコードし、かつSAG12プロモーターと少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至3いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 前記プロモーターが、配列番号16に示されているヌクレオチド配列またはその機能的な変異体を含み、前記変異体がプロモーターをコードし、かつ配列番号16と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至4いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 前記少なくとも1つのコード配列が、(i)ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PCK)またはその機能的な変異体および/または(ii)細胞基質型ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ(PPDK)またはその機能的な変異体をコードし、前記変異体がPCKまたはPPDKをコードし、かつPCKまたはPPDKと少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の遺伝子構築物。
- PCK活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列がシロイヌナズナ属に
由来し、かつ細胞基質型PPDK活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列が、シロイヌナズナ属、トウモロコシ属、フラベリア属またはクレオメ属に由来する、請求項1乃至6いずれか1項に記載の遺伝子構築物。 - PCK活性を有する前記ポリペチドをコードする前記コード配列が、配列番号17または配列番号18に示されている核酸配列またはその機能的な変異体を含み、前記変異体がPCK活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号17または18と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至7いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- PCK活性を有する前記ポリペチドが、配列番号19に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体を含み、前記変異体がPCK活性を有するポリペプチドを含み、かつ配列番号19と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至8いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 細胞基質型PPDK活性を有するポリペチドをコードする前記コード配列が、配列番号20または配列番号21に示されている核酸配列またはその機能的な変異体を含み、前記変異体がPPDK活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号19と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至9いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 細胞基質型PPDK活性を有する前記ポリペチドが、配列番号23に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体を含み、前記変異体がPPDK活性を有するポリペプチドを含み、かつ配列番号23と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1乃至10いずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 前記構築物がPPDKまたはその機能的な変異体をコードしかつPCKをコードせず、前記変異体が細胞基質型PPDKをコードし、かつ細胞基質型PPDKと少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の遺伝子構築物。
- 請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物を含む組み換え型ベクター。
- 同じ条件で培養された野生型植物中のPCKおよび/またはPPDKの対応する濃度よりも試験植物の葉の中のPCKおよび/またはPPDKの濃度を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のPCKおよび/または細胞基質型PPDKの濃度の上昇を達成するために請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベクターによって試験植物の細胞を形質転換することによって前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
- 同じ条件で培養された野生型植物中の対応する窒素濃度よりも試験植物の葉の中の窒素濃
度を下げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のPCKおよび/または細胞基質型PPDKの濃度の上昇を達成するために請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベクターによって試験植物の細胞を形質転換することによって前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。 - 同じ条件で培養された野生型植物の対応する成長率と比較して試験植物の成長率を上げる
方法であって、葉の老化の開始後の植物の葉の中のPCKおよび/または細胞基質型PPDKの濃度の上昇を達成するために請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベクターによって試験植物の細胞を形質転換することによって前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。 - 請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載の組み換え
型ベクターを含む細胞。 - 請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載の組み換え
型ベクターを含む形質転換植物。 - 前記植物はアブラナ科、イネ科またはナス科に由来する、請求項18に記載の形質転換植
物。 - 請求項18または19に記載の形質転換植物から入手可能であり、かつ請求項1乃至12
いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベクターを含む植物繁用製
品。 - 前記植物繁殖用製品が種子である、請求項20に記載の植物繁殖用製品。
- 同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い割合で窒素を転流させる形質転換植
物を生産する方法であって、
i)請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベク
ターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ii)前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。 - 同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い成長率を有する形質転換植物を生産
する方法であって、
i)請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベク
ターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ii)前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。 - 同じ条件で栽培された野生型植物から採取した、収穫された葉の中の対応する窒素濃度よ
りも低濃度の窒素を含有する収穫された葉であって、前記葉が、請求項18または19に
記載の形質転換植物から収穫されたものまたは請求項22または23に記載の方法によっ
て生産されたものであり、かつ請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物また
は請求項13に記載のベクターを含む収穫された葉。 - 変異型タバコ植物から得られた、窒素が減少したタバコを含む喫煙物品であって、前記変異型タバコ植物が請求項1乃至12いずれか1項に記載の遺伝子構築物または請求項13に記載のベクターによって形質転換されている、老化した葉の中の窒素濃度を下げることができる喫煙物品。
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