BR122024000155A2

BR122024000155A2 - Métodos e composições para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas com o uso de protoporfirinogênio ix oxidase de várias cianobacterias ou variantes das mesmas

Info

Publication number: BR122024000155A2
Application number: BR122024000155-1A
Authority: BR
Inventors: Soon-Kee Sung; Young Ock Ahn; Joo Yong Woo; Joonseon YOON; Hanul KIM; Myoung-Ki HONG; Joonghyuk PARK
Original assignee: Farmhannong Co., Ltd.
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2024-02-27
Also published as: BR112021025163A2; AR119171A1; WO2020251313A2; UY38750A; ZA202200275B; CA3143319A1; CN114008196A; US20230175004A1; KR20200143294A; KR102390913B1; AU2020292093A1; WO2020251313A3

Abstract

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA CONFERIR E/OU AUMENTAR A TOLERÂNCIA A HERBICIDAS COM O USO DE PROTOPORFIRINOGÊNIO IX OXIDASE DE VÁRIAS CIANOBACTERIAS OU VARIANTES DAS MESMAS” Trata-se de protoporfirinogênio IX oxidases derivadas de vários organismos ou variantes dos mesmos e usos dos mesmos para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas de uma planta e/ou alga.

Description

Campo da Técnica

[001] Trata-se de protoporfirinogênio IX oxidases derivadas de vários organismos ou variantes dos mesmos e usos dos mesmos para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas de uma planta e/ou alga.

Fundamentos da Técnica

[002] Uma via biossintética da porfirina serve para a síntese de clorofila e heme, que desempenham papéis vitais no metabolismo da planta, e a mesma ocorre no cloroplasto. Nessa via, a protoporfirinogênio IX oxidase (doravante no presente documento, denominada como PPO; EC:1.3.3.4) catalisa a oxidação de protoporfirinogênio IX para protoporfirina IX. Após a oxidação do protoporfirinogênio IX para protoporfirina IX, a protoporfirina IX se liga ao magnésio por Mg quelatase para sintetizar a clorofila, ou se liga ao ferro por Fe quelatase para sintetizar a heme.

[003] Portanto, quando a atividade de PPO é inibida, a síntese de clorofilas e heme é inibida e o substrato protoporfirinogênio IX deixa a via biossintética da porfirina normal, resultando na rápida exportação de protoporfirinogênio IX do cloroplasto para o citoplasma, e o acúmulo citoplasmático de protoporfirina IX oxidado por peroxidases inespecíficas e auto-oxidação. A protoporfirina IX acumulada gera oxigênio singlete altamente reativo (1O2) na presença de luz e moléculas de oxigênio que destroem a membrana celular e levam rapidamente à morte das células vegetais. Com base nesse princípio, foram desenvolvidos herbicidas que inibem a atividade de PPO. Até agora, houve 10 famílias de herbicidas inibidores de PPO, incluindo pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N- fenilftalimidas, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinodionas e outros herbicidas, que são classificados de acordo com suas estruturas químicas.

[004] Além disso, a fim de prevenir os efeitos desses herbicidas no crescimento das culturas ao usar os herbicidas, há uma necessidade de fornecer tolerância a herbicidas para as culturas.

[005] Enquanto isso, as algas são organismos fotossintéticos que podem converter a energia da luz em energia química, que pode ser usada para sintetizar vários compostos úteis. Por exemplo, as algas podem fixar carbono por fotossíntese e converter dióxido de carbono em açúcar, amido, lipídios, gorduras ou outras biomoléculas, removendo assim os gases de efeito estufa da atmosfera. Além disso, o cultivo em grande escala de algas pode produzir uma variedade de substâncias, como enzimas industriais, compostos terapêuticos e proteínas, nutrientes, materiais comerciais e materiais combustíveis.

[006] No entanto, no caso de cultivo em grande escala de algas em um biorreator ou em uma lagoa aberta ou fechada, pode ocorrer contaminação por organismos competentes indesejáveis, por exemplo, algas, fungos, rotíferos ou zooplâncton indesejados.

[007] Assim, é necessária uma tecnologia para colher plantas e/ou algas desejadas em grande escala, tratando-se herbicidas em uma concentração que inibiria o crescimento de organismos competentes sem tolerância a herbicidas, após conferir tolerância a herbicidas às plantas e/ou algas desejadas. (Documento de patente 1) US 6.308.458 (2001.10.30)

Revelação de Invenção Problema Técnico

[008] Nesta revelação, foi constatado que os genes PPO do tipo hemY derivados de procariotas e variantes dos mesmos mostram uma ampla tolerância a herbicidas para herbicidas inibidores da protoporfirinogênio IX oxidase (PPO), sugerindo assim que o gene PPO do tipo hemY pode conferir e/ou aumentar tolerância a herbicida quando é introduzido em uma planta e/ou alga.

[009] Uma modalidade fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0010] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de aminoácidos que tem modificação na SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 que interage com o herbicida inibidor de PPO), ou (2) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos (1).

[0011] Por exemplo, o pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 envolvido na interação com um herbicida inibidor de PPO pode ser pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, e I408, da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0012] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de aminoácidos que tem modificação na SEQ ID NO: 2, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 que interage com o herbicida inibidor de PPO), ou (2) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos (1).

[0013] Por exemplo, o pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 envolvido na interação com um herbicida inibidor de PPO pode ser pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, e I408, da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0014] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de aminoácidos que tem modificação na SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 que interage com o herbicida inibidor de PPO), ou (2) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos (1).

[0015] Por exemplo, o pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 envolvido na interação com um herbicida inibidor de PPO pode ser pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, e I408, da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[0016] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo.

[0017] Outra modalidade fornece um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo. O vetor recombinante pode ser usado como um vetor de expressão para expressar o polinucleotídeo em uma célula hospedeira adequada.

[0018] Outra modalidade fornece uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante.

[0019] Outra modalidade fornece uma composição para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicida de uma planta e/ou alga, que compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: (1) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 1, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 2, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 3, e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo; (2) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo de (1); (3) um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo de (2) e (4) uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante de (3).

[0020] Em uma modalidade concreta, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 80, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 81; o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 82; mas os polinucleotídeos não podem estar limitados aos mesmos. Os polinucleotídeos podem compreender várias sequências de ácido nucleico capazes de codificar a sequência de aminoácidos de acordo com a degenerescência do códon.

[0021] O herbicida pode ser um herbicida inibidor da atividade da protoporfirinogênio IX oxidase.

[0022] Por exemplo, o herbicida pode ser pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N- fenilftalimidas, ésteres fenílicos, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinodionas e outros herbicidas, mas não está limitado aos mesmos.

[0023] Em uma modalidade específica, o herbicida pode ser pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em tiafenacil, butafenacil, saflufenacil, benzfendizona, fomesafen, oxyfluorfen, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifen, lactofen, clometoxifen, clornitrofen, fluoroglicofen-etila, halosafen, piraflufen-etila, fluazolato, flumioxazin, cinidon-etila, flumiclorac- pentila, flutiaceto, tidiazimin, oxadiargil, oxadiazon, carfentrazona, sulfentrazona, trifludimoxazin, azafenidin, pentoxazona, piraclonil, flufenpir-etila, profluazol, fenopilato (2,4-diclorofenil 1-pirrolidinocarboxilato), análogos de carbamato de fenopilato (por exemplo, O- fenilpirrolidino) e análogos de piperidinocarbamato (consultar “Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino-and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992”)), sais agricolamente aceitáveis do mesmo e combinações dos mesmos; mas não se limita a isso.

[0024] A planta pode se referir a um organismo eucariótico multicelular que tem capacidade fotossintética, que pode ser uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, ou pode ser uma planta herbácea ou uma planta lenhosa. As algas podem se referir a organismos que tem capacidade fotossintética, que podem ser algas eucarióticas.

[0025] Em uma modalidade, a planta ou alga pode ser manipulada geneticamente a fim de compreender adicionalmente um segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida, de modo que a tolerância a herbicida ao segundo herbicida pode ser conferida e/ou aumentada. A planta ou alga, que é geneticamente manipulada a fim de compreender o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida, pode ser preparada com o uso do segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida além da composição mencionada acima para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicida. Assim, uma composição para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicida pode compreender adicionalmente o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida.

[0026] Exemplos do segundo herbicida podem compreender herbicidas inibidores de divisão celular, herbicidas inibidores de fotossíntese, herbicidas inibidores da síntese de aminoácidos, herbicidas inibidores de plastídios, herbicidas inibidores de membrana celular e similares, mas não está limitado aos mesmos.

[0027] Em uma modalidade específica, o segundo herbicida pode ser exemplificado por glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D (ácido 2,4-Diclorofenoxiacético), isoxaflutol, herbicida inibidor de ALS (acetolactato sintase), herbicida inibidor de fotossistema II ou herbicida à base de fenilureia, herbicida à base de bromoxinil ou combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[0028] Por exemplo, o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado por pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em EPSPS tolerante a herbicida glifosato (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase resistente ao glifosato), GOX (glifosato oxidase), GAT (glifosato-N-acetiltransferase) ou glifosato descarboxilase; PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferase) tolerante a herbicida glufosinato; DMO (dicamba mono- oxigenase) tolerante a herbicida dicamba; 2,4-D mono- oxigenase ou AAD (ariloxialcanoato dioxigenase) tolerante a herbicida 2,4-D; ALS (acetolactato sintase) tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS, AHAS (aceto-hidroxiácido sintase) ou AtAHASL (subunidade grande de Arabidopsis thalianaaceto-hidroxiácido sintase); proteína D1 de fotossistema II tolerante a herbicida inibidor de fotossistema II; citocromo P450 tolerante a herbicida à base de fenilureia; HPPD (hidroxifenilpiruvato dioxigenase) tolerante a herbicida inibidor de plastídios; nitrilase tolerante a herbicida de bromoxinil e combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[0029] Além disso, o gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado por pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em gene cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 ou gat4621 tolerante a herbicida glifosato; gene bar, pat ou pat (SYN) tolerante a herbicida glufosinato; gene dmo tolerante a herbicida dicamba; gene AAD-1, AAD-12 tolerante a herbicida 2,4-D;, ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1- 1, Csr1-2, SurA ou SurB tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS; gene psbA tolerante a herbicida inibidor de fotossistema II; gene CYP76B1 tolerante a herbicida de fenilureia; gene HPPDPF W336 tolerante a herbicida isoxaflutol e gene bxn tolerante a herbicida bromoxinil; e combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[0030] Outra modalidade fornece um transformante de uma planta e/ou alga que tem tolerância a herbicida, que é transformada com o polinucleotídeo, ou um clone ou progênie do mesmo.

[0031] Outra modalidade fornece um método para preparar uma planta transgênica ou uma alga transgênica que tem tolerância a herbicida ou tolerância a herbicida aumentada, que compreende uma etapa de transformar uma planta e/ou alga com o polinucleotídeo.

[0032] Outra modalidade fornece um método para conferir ou aumentar a tolerância a herbicida de uma planta e/ou alga, que compreende uma etapa de transformar uma planta e/ou alga com o polinucleotídeo.

[0033] A transformação pode ser realizada para uma alga e/ou uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.

[0034] O transformante pode ser uma alga e/ou uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta. O transformante pode compreender uma progênie (por exemplo, gerações T1~T8) obtida a partir do primeiro transformante.

[0035] Outra modalidade fornece um método para controlar ervas daninhas em uma terra de cultivo, que compreende:

[0036] fornecer uma planta para a terra de cultivo, em que a planta compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste no polipeptídeo, na variante de polipeptídeo, em um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, em um polinucleotídeo que codifica a variante de polipeptídeo, em um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e em uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante; e aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase à terra de cultivo (ou à planta).

[0037] Em uma modalidade específica, a etapa de aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase à terra de cultivo (ou à planta) pode ser realizada aplicando-se uma quantidade eficaz de pelo menos dois herbicidas inibidores de protoporfirinogênio IX oxidase sequencial ou simultaneamente.

[0038] Em outra modalidade, a planta pode ser geneticamente manipulada a fim de compreender adicionalmente um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida e uma quantidade eficaz do herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase e o segundo herbicida pode ser aplicado sequencial ou simultaneamente.

[0039] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo indesejado de um meio de cultura, que compreende fornecer uma alga a um meio de cultura, em que a alga compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste no polipeptídeo, na variante de polipeptídeo, em um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, em um polinucleotídeo que codifica a variante, em um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo e em uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante; e aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase ao meio de cultura.

Solução para o Problema

[0040] É fornecida uma tecnologia para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas de plantas ou algas.

[0041] Tal como usado no presente documento, 'conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicida de plantas ou algas' ou 'aumentar a tolerância a herbicida de plantas ou algas' pode ser interpretado como conferir tolerância a herbicida a uma planta ou algas que não têm tolerância a herbicida, e/ou fortalecer adicionalmente a tolerância a herbicidas de uma planta ou algas que têm tolerância a herbicidas.

[0042] Como usado no presente documento, 'consistir em uma sequência', 'consistir essencialmente em uma sequência'ou 'compreender uma sequência'pode ser usado a fim de cobrir ambos os casos de compreender a sequência descrita e/ou necessariamente compreender a sequência, mas não se destina a excluir compreender sequência adicional além da sequência descrita.

[0043] Como usado no presente documento, o termo 'uma proteína ou polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos identificada pela SEQ ID NO' e 'um gene ou polinucleotídeo que compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico identificada pela SEQ ID NO' pode se referir a uma proteína (ou polipeptídeo) ou gene (ou polinucleotídeo), que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico, ou que tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94 %, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico com a manutenção de sua atividade e/ou função inerente.

[0044] Uma modalidade fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0045] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo que é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em: uma variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem modificação para a SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos; uma variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem modificação para a SEQ ID NO: 2, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos; e uma variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem modificação para a SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de aminoácidos envolvidos na interação de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir de aminoácidos posicionados em locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0046] Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, ou a variante de polipeptídeo; um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo; e uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante. O polinucleotídeo pode ser projetado de modo a compreender um códon que é otimizado para uma célula a ser transformada. O códon otimizado pode ser facilmente conhecido por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, consultar "http://sg.idtdna.com/CodonOpt", etc.).

[0047] Outra modalidade fornece uma composição para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicida de uma planta e/ou alga, que compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: (5) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 1, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 2, uma variante de polipeptídeo que tem modificação para SEQ ID NO: 3, e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo; (6) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo de (1); (7) um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo de (2) e (8) uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante de (3).

[0048] Em uma modalidade concreta, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 80, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 81; o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 82; mas os polinucleotídeos não podem estar limitados aos mesmos. Os polinucleotídeos podem compreender várias sequências de ácido nucleico capazes de codificar a sequência de aminoácidos de acordo com a degenerescência do códon.

[0049] Em outra modalidade, é fornecido um transformante de uma planta e/ou alga com tolerância a herbicida, sendo que o transformante é transformado com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo. O polinucleotídeo pode ser projetado de modo a compreender um códon que é otimizado para uma célula a ser transformada. O códon otimizado pode ser facilmente conhecido por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, consultar "http://sg.idtdna.com/CodonOpt", etc.).

[0050] Outra modalidade fornece um método para preparar uma planta transgênica ou uma alga transgênica com tolerância a herbicida ou tolerância a herbicida aprimorada, que compreende uma etapa de transformar uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta ou alga, com o polinucleotídeo.

[0051] Outra modalidade fornece um método para conferir ou aumentar a tolerância a herbicida de uma planta e/ou alga, que compreende uma etapa de transformar uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta ou alga, com o polinucleotídeo.

[0052] Doravante no presente documento, a presente invenção é descrita mais especificamente: Os polipeptídeos de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 descritas no presente documento são proteínas PPO derivadas de cianobactérias com tolerância a um herbicida inibidor (ou herbicidas inibidores) de PPO.

[0053] Especificamente, uma proteína PPO (que compreende no de Acesso ao GenBank CP032152.1) que é derivada da cepa Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCTE542 é fornecida e é designada como CyPPO19 no presente documento, e sua sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO: 1, e uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica a mesmo é representada por SEQ ID NO: 80.

[0054] Além disso, é fornecida uma proteína PPO (no de Acesso ao GenBank RMH63851.1) que é derivada da cepa Cyanobacteria bacterium J003, e é designada como CyPPO20, e sua sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO: 2, e uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica a mesmo é representada por SEQ ID NO: 81.

[0055] Além disso, é fornecida uma proteína PPO (no de Acesso ao GenBank BAY51976.1) que é derivada da cepa Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134, e é designada como CyPPO18, e sua sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO: 3, e uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica a mesma é representada por SEQ ID NO: 82.

[0056] No presente documento, o polipeptídeo e variantes do polipeptídeo também podem ser expressos respectivamente como proteína PPO tolerante a herbicida ou variante de proteína PPO tolerante a herbicida com tolerância a um herbicida inibidor (ou herbicidas inibidores) de PPO. Além disso, como usado no presente documento, o texto "um PPO tolerante a herbicida ou sua variante" pode ser usado de modo a se referir à proteína PPO tolerante a herbicida ou variante de proteína PPO tolerante a herbicida, um gene que codifica proteína PPO tolerante a herbicida, ou um gene que codifica variante de proteína PPO tolerante a herbicida, ou uma combinação dos mesmos.

[0057] Proteínas PPO derivadas de cianobactérias podem possuir excelentes atividades enzimáticas em comparação com proteínas PPO derivadas de plantas e capazes de conferir tolerância a herbicidas inibidores de PPO. Além disso, quando as proteínas PPO derivadas de cianobactérias são modificadas por (variação) mutação de aminoácidos dentro de uma faixa capaz de manter suas atividades enzimáticas globais, sua tolerância aos herbicidas inibidores de PPO pode ser aumentada adicionalmente em comparação com aquelas de proteínas PPO de tipo selvagem. Tal mutação de aminoácido pode compreender substituição, deleção, adição e/ou adição de um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácidos de locais de interação das proteínas PPO onde as proteínas PPO interagem com herbicidas.

[0058] A variante da proteína PPO será descrita em mais detalhes a seguir.

[0059] Uma modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, que é uma variante de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 (CyPPO19), sendo que a variante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com modificação para SEQ ID NO: 1, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original (isto é, um aminoácido correspondente de um tipo selvagem) em um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos aminoácidos da SEQ ID NO: 1 envolvidos na interação com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos posicionados nos locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0060] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, que é uma variante de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 (CyPPO20), sendo que a variante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com modificação para SEQ ID NO: 2, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original (isto é, um aminoácido correspondente de um tipo selvagem) em um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos aminoácidos da SEQ ID NO: 2 envolvidos na interação com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos posicionados nos locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0061] Outra modalidade fornece uma variante de polipeptídeo, que é uma variante de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 (CyPPO18), sendo que a variante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com modificação para SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende a deleção e/ou substituição por um aminoácido diferente de um aminoácido original (isto é, um aminoácido correspondente de um tipo selvagem) em um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos aminoácidos da SEQ ID NO: 3 envolvidos na interação com um herbicida inibidor de PPO (por exemplo, pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos posicionados nos locais de ligação do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 que interage com herbicida inibidor de PPO), ou uma sequência de aminoácidos que tem 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0062] O aminoácido da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 (por exemplo, pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos posicionados em locais de ligação a herbicidas inibidores de PPO do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) para ser deletado e/ou substituído por outro aminoácido que é diferente do aminoácido original pode ser pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em N59 (com referência a "N(Asn) na 59aposição; a expressão dos seguintes resíduos de aminoácidos é interpretada dessa maneira), S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360 e I408, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, ou todos dentre R89, V165, A167, V305, L327, F360 e I408, da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0063] Em uma modalidade específica, a variante de polipeptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos com modificação para a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, em que um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360 e I408 (por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou todos dentre R89, V165, A167, V305, L327, F360 e I408) da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 são respectiva e independentemente deletados ou substituídos por um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys), e similares, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem (por exemplo, substituído por um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), R(Arg), W(Trp), e similares, que é diferente do aminoácido na posição correspondente no tipo selvagem); ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0064] Por exemplo, a variante de polipeptídeo pode compreender: (a) uma sequência de aminoácidos com modificação na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, em que a modificação compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou todas as mutações de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (i) F360M (com referência a uma variante ou mutação em que "o resíduo de aminoácido na 360aposição é substituído de F(Phe) para M(Met)"; a expressão das seguintes mutações de aminoácidos é interpretada dessa maneira), F360V, F360I, F360T ou F360L, (ii) A167C, A167L ou A167I, (iii) V305M ou V305L, (iv) R89A, (v) V165S ou V165C, (vi) L327T e (vii) I408R ou I408W, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; ou (b) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos (a).

[0065] Mais especificamente, a variante de polipeptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos com modificação para a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos, em que a modificação compreende a seguinte mutação de aminoácido: R89A, V165C, V165S, A167C, A167I, A167L, V305L, V305M, L327T, F360M, F360I, F360L, F360V, F360T, I408R, I408W, R89A+V165C (com referência a uma variante ou mutação que compreende toda a substituição do 89° resíduo de R para A e substituição do 165° resíduo de V para C; a expressão das seguintes duas ou mais mutações de aminoácidos é interpretada dessa maneira), R89A+V165S, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0066] Por exemplo, a variante de polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos que tem modificação na SEQ ID NO: 1, em que a modificação pode compreender uma mutação de aminoácido de R89A, V165C, V165S, A167C, A167I, A167L, V305M, V305L, L327T, F360M, F360I, F360L, F360V, F360T, A167I+V305L+L327T+F360V, A167L+V305M+I408R+F360M ou V305L+L327T+I408W+F360V, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0067] Por exemplo, a variante de polipeptídeo pode compreender: uma sequência de aminoácidos que tem modificação na SEQ ID NO: 3, em que a modificação pode compreender uma mutação de aminoácido de F360M, F360V, F360I, F360L, A167C, A167L, A167I, V305M, R89A, V165S, V165C, L327T, R89A+F360M, A167L+F360M, L327T+F360M, R89A+F360V, A167L+F360I, V305M+F360I, R89A+V165C+F360I, V165C+A167L+F360I, V165C+A167L+F360M, A167L+V305M+F360M, V165S+A167L+V305M+F360I, R89A+V165S+V305M+F360I, V165S+A167C+L327T+F360M, R89A+V165S+A167C+L327T+F360M ou R89A+V165C+A167L+V305M+F360I, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos.

[0068] O polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência) descrita no presente documento pode manter atividade enzimática equivalente à de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é um padrão de identificação de identidade de sequência (por exemplo, a proteína PPO que tem mutação de aminoácidos descrita acima), por exemplo, 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais atividade enzimática para um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que é um padrão em plantas (em uma planta inteira, em uma célula de planta ou cultura de células, em um tecido de planta, etc.), em algas e/ou in vitro, e que tem a função de conferir tolerância a herbicidas. A descrição da identidade de sequência é usada a fim de esclarecer que a proteína PPO de tolerância a herbicida (polipeptídeo) ou sua variante descrita no presente documento pode compreender qualquer mutação de sequência dentro da faixa capaz de satisfazer a condição acima (mantendo atividade enzimática e possuindo uma função para conferir tolerância a herbicida).

[0069] Os aminoácidos usados na descrição são resumidos da seguinte forma:Aminoácido Código de 3 letras Código de 1 letra Alanina Ala A Isoleucina Ile I Leucina Leu L Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Triptofano Trp W Valina Val V Aspargina Asn N Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Glicina Gly G Serina Ser S Treonina Thr T Tirosina Tyr Y Ácido aspártico Asp D Ácido glutâmico Glu E Arginina Arg R Histidina His H Lisina Lys K

[0070] A variante de polipeptídeo (variante da proteína PPO tolerante a herbicida) pode manter suas atividades enzimáticas como uma proteína PPO e exibir tolerância a herbicida aumentada em comparação com o tipo selvagem.

[0071] Além disso, o polipeptídeo (proteína PPO tolerante a herbicida) e a variante de polipeptídeo (variante de proteína PPO tolerante a herbicida) podem compreender mutação adicional que exibe atividade biologicamente igual a um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem mutação (ou mutações) de aminoácidos descrita acima. Por exemplo, a mutação adicional pode ser a substituição de aminoácidos que não altera inteiramente a atividade molecular, e tal substituição de aminoácidos pode ser adequadamente selecionada por uma pessoa versada na técnica relevante. Em um exemplo, a substituição adicional pode ser a substituição entre os resíduos de aminoácidos Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu ou Asp/Gly, porém não se limita aos mesmos. Em alguns casos, a variante de proteína PPO tolerante a herbicida pode ser submetida a pelo menos uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em fosforilação, sulfatação, acilação, glicosilação, metilação, farnesilação e similares. Além disso, a variante da proteína PPO tolerante a herbicida pode ser uma que tem estabilidade estrutural aumentada para calor, pH, etc. da proteína, ou atividade de proteína aumentada por variação (mutação) e/ou modificação de aminoácidos.

[0072] O termo "identidade de sequência"se refere ao grau de semelhança com o tipo selvagem ou sequência de aminoácidos de referência ou sequência de nucleotídeos, e qualquer proteína pode ser incluída no escopo da presente invenção, desde que inclua resíduos de aminoácidos com 60% ou superior, 65% ou superior, 70% ou superior, 75% ou superior, 80% ou superior, 85% ou superior, 90% ou superior, 95% ou superior, 98% ou superior, ou 99% ou superior de identidade com a sequência de aminoácidos da variante de proteína PPO tolerante a herbicida, conforme descrito acima, e retenha atividades biológicas equivalentes à variante de proteína PPO tolerante a herbicida. Esses homólogos de proteína podem compreender um local ativo equivalente ao de uma proteína alvejada. Tal comparação de identidade pode ser conduzida visualmente ou com a ajuda de programas de comparação prontamente disponíveis. A identidade entre duas ou mais sequências pode ser calculada como uma porcentagem (%) com o uso de um programa de análise disponível online. O alinhamento de sequências para comparação de sequências pode ser conduzido por qualquer método convencional conhecido na técnica relevante e, por exemplo, o método convencional pode incluir, porém sem limitação, GAP, BESTFIT, BLAST e Clustal Omega.

[0073] A proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante pode ser obtida por extração e/ou purificação da natureza por métodos bem conhecidos na técnica relevante. Alternativamente, a mesma pode ser obtida como uma proteína recombinante com o uso de uma tecnologia de recombinação de genes. No caso de usar uma tecnologia de recombinação de genes, a mesma pode ser obtida por um processo de introdução de um ácido nucleico que codifica a proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante em um vetor de expressão apropriado e a introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira para expressar a proteína PPO tolerante a herbicida ou sua variante, e então coletar a proteína PPO tolerante a herbicida expressa ou sua variante da célula hospedeira. Após a proteína ser expressa em uma célula hospedeira selecionada, a proteína pode ser separada e/ou purificada por técnicas gerais de separação bioquímica, por exemplo, tratamento com um agente de precipitação de proteína (relargagem), centrifugação, ruptura ultrassônica, ultrafiltração, diálise, cromatografia tal como cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade e similares, e a fim de separar a proteína com uma pureza alta, esses métodos podem ser usados em combinação.

[0074] A molécula de ácido nucleico de PPO tolerante a herbicida (polinucleotídeo que codifica a proteína PPO ou sua variante) pode ser isolada ou preparada com o uso de técnicas de biologia molecular padrão, por exemplo, uma síntese química ou método de recombinação, ou como a molécula de ácido nucleico de PPO tolerante a herbicida, pode ser usada uma disponível comercialmente.

[0075] Nessa revelação, as proteínas/ácidos nucleicos PPO ou variantes dos mesmos exibiram ampla tolerância a herbicidas contra 10 famílias representativas de herbicidas inibidores de PPO classificados de acordo com suas estruturas químicas em um sistema de teste de tolerância a herbicidas com o uso de E. coli BT3 deficiente em PPO (ΔPPO) Também foi constatado que as proteínas podem ser expressas no cloroplasto de uma planta com o uso de um peptídeo de trânsito (TP). Além disso, foi constatado que as proteínas/ácidos nucleicos PPO ou variantes dos mesmos também podem ser expressos em uma monocotiledônea, tal como Oryza sativa, ou uma dicotiledônea, tal como Arabidopsis thalianaecótipo Columbia-0 (A. thaliana), por um vetor de expressão de planta. Mesmo quando as plantas transformadas são tratadas com herbicidas inibidores de PPO, a germinação e o crescimento das plantas são observados. Além disso, foi confirmado, por um estudo de herança, que as características tolerantes a herbicidas acima podem ser herdadas com sucesso para a próxima geração.

[0076] Portanto, a proteína PPO e suas variantes fornecidas no presente documento podem ser introduzidas em uma planta ou alga, conferindo assim tolerância a herbicida à planta ou alga e/ou aumentando a tolerância a herbicida da planta ou alga.

[0077] Uma modalidade fornece uma composição para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas de plantas e/ou algas, que compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: (1) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, uma variante de polipeptídeo do mesmo como descrito acima, e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo; (2) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a variante de polipeptídeo de (1); (3) um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo de (2) e (4) uma célula recombinante que compreende o vetor recombinante de (3).

[0078] O herbicida no presente documento se refere a um ingrediente ativo que mata, controla ou de outra forma modifica adversamente o crescimento de plantas ou algas. Além disso, a tolerância a herbicida significa que mesmo após o tratamento de um herbicida que normalmente mata uma planta normal ou de tipo selvagem ou normalmente inibe o crescimento da mesma, a inibição do crescimento da planta é enfraquecida ou eliminada, em comparação com aquela do tipo normal ou selvagem planta e, portanto, a planta continua a crescer. O herbicida inclui um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase (PPO) de uma planta ou uma alga. Esse herbicida inibidor de PPO pode ser classificado em pirimidinadionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N- fenilftalimidas, ésteres fenílicos, tiadiazóis, oxadiazóis, triazinona, triazolinonas, oxazolidinodionas e outros herbicidas, de acordo com suas estruturas químicas.

[0079] Como uma modalidade específica, o herbicida à base de pirimidinadiona pode incluir butafenacil, saflufenacil, benzfendizona e tiafenacil, mas não está limitado aos mesmos.

[0080] O herbicida à base de éter difenílico pode incluir fomesafen, oxifluorfen, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifen, lactofen, clometoxifen, clornitrofen, fluoroglicofen-etila e halosafen, mas não se limita aos mesmos.

[0081] O herbicida à base de fenilpirazol pode incluir piraflufen-etila e fluazolato, mas não está limitado aos mesmos.

[0082] O herbicida à base de fenilftalimida pode incluir flumioxazin, cinidon-etila e flumiclorac-pentila, mas não está limitado aos mesmos.

[0083] O herbicida de ésteres fenílicos pode incluir fenopilato (1-pirrolidinocarboxilato de 2,4-diclorofenila) e análogos de carbamato de fenopilato (por exemplo, O- fenilpirrolidino- e análogos de piperidinocarbamato (consultar “Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992”)), e similares, porém, mas não está limitado aos mesmos. Em uma modalidade específica, o carbamato análogo de fenopilato pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em éster fenílico de ácido pirrolidina-1-carboxílico (CAS no 55379-71-0), ácido 1-pirrolidinocarboxílico, éster 2-clorofenílico (CAS no 143121-06-6), pirrolidina-1—carboxilato de 4-clorofenila (CAS no 1759-02-0), ácido carbâmico, éster fenílico de dietil-,2,4-dicloro-5-(2-propiniloxi) (9CI) (CAS no 14312107-7), ácido 1-pirrolidinocarboxílico, éster 2,4-dicloro-5- hidroxifenílico (CAS no 143121-08-8), pirrolidina-1- carboxilato de 2,4-dicloro-5-(metoxicarbonil)fenila (CAS no 133636-94-9), pirrolidina-1-carboxilato de 2,4-dicloro-5- [(propan-2-iloxi)carbonil]fenila (CAS no 133636-96-1), ácido 1-piperidinocarboxílico, éster 2,4-dicloro-5-(2- propiniloxi)fenílico (CAS no 87374-78-5), pirrolidina-1- carboxilato de 2,4-dicloro-5-(prop-2-in-1-iloxi)fenila (CAS no 87365-63-7), 4,4-difluoropiperidina-1-carboxilato de 2,4- dicloro-5-(prop-2-in-1-iloxi)fenila (CAS no 138926-22-4), ácido 1-pirrolidinocarboxílico, éster 3,3-difluoro-,2,4- dicloro-5-(2-propin-1-iloxi)fenílico (CAS no 143121-10-2), pirrolidina-1-carboxilato de 4-cloro-2-fluoro-5-[(propan-2- iloxi)carbonil]fenila (CAS no 133636-98-3) e similares.

[0084] O herbicida à base de tiadiazol pode incluir flutiaceto e tidiazimina, mas não está limitado aos mesmos.

[0085] O herbicida à base de oxadiazol pode incluir oxadiargil e oxadiazon, mas não está limitado aos mesmos.

[0086] O herbicida à base de triazinona pode incluir trifludimoxazin, mas não está limitado ao mesmo.

[0087] O herbicida à base de triazolinona pode incluir carfentrazona, sulfentrazona e azafenidin, mas não está limitado aos mesmos.

[0088] O herbicida à base de oxazolidinodiona pode incluir pentoxazona, mas não está limitado à mesma.

[0089] O outro herbicida pode incluir piraclonil, flufenpir-etila e profluazol, mas não está limitado aos mesmos.

[0090] O gene PPO tolerante a herbicida ou suas variantes fornecidas no presente documento podem ser introduzidos em uma planta ou alga por vários métodos conhecidos na técnica e, de preferência, com o uso de um vetor de expressão para transformação de planta ou alga.

[0091] No caso de introdução do gene em uma planta, um promotor apropriado que pode ser incluído no vetor pode ser qualquer promotor geralmente usado na técnica para introdução do gene na planta. Por exemplo, o promotor pode incluir um promotor SP6, um promotor T7, um promotor T3, um promotor PM, um promotor ubiquitina de milho, um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), um promotor da nopalina sintase (nos), um promotor 35S do vírus do mosaico da figueira, um promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar, um promotor do vírus do mosqueado amarelo da commelina, um promotor indutível por luz da subunidade pequena de ribulose-l,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO), um promotor de triosefosfato isomerase (TPI) citosólico de arroz, um promotor de adenina fosforibosiltransfera (APRT) de A. thaliana, um promotor de octopina sintetase e um promotor de BCB (proteína de ligação de cobre azul), mas não está limitado aos mesmos.

[0092] Além disso, o vetor pode incluir uma sequência de sinal poli A que provoca poliadenilação do terminal 3' e, por exemplo, pode incluir a extremidade 3' do NOS derivada de um gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens, um terminador da octopina sintetase derivado de um gene da octopina sintetase de Agrobacterium tumefaciens, gene do inibidor I ou II da extremidade 3’ de protease de tomate ou batata, um terminador CaMV 35S, um terminador de α-amilase RAmy1 A de arroz e um terminador de faseolina, mas não está limitado aos mesmos.

[0093] Além disso, no caso de introdução do gene em uma alga, o promotor específico do cloroplasto, o promotor do núcleo, o promotor constitutivo ou o promotor induzível podem ser usados para a introdução do gene nas algas como um promotor. O gene PPO tolerante a herbicida ou sua variante fornecida no presente documento pode ser projetado para se ligar operacionalmente a UTR 5’ ou UTR 3', expressando assim a função no núcleo de algas. Além disso, o vetor pode compreender adicionalmente uma sequência reguladora da transcrição que é apropriada para a transformação de algas. Um gene recombinante que confere tolerância a herbicida pode ser integrado ao genoma do núcleo ou ao genoma do cloroplasto em uma alga hospedeira, mas não está limitado aos mesmos.

[0094] Além disso, no vetor, um peptídeo de trânsito necessário para alvejar os cloroplastos pode ser ligado à extremidade 5’ do gene PPO ou suas variantes a fim de expressar o gene PPO tolerante a herbicida ou suas variantes nos cloroplastos.

[0095] Além disso, opcionalmente, o vetor pode incluir adicionalmente um gene que codifica um marcador selecionável como uma molécula repórter e exemplo do marcador selecionável pode incluir um gene com tolerância a um antibiótico (por exemplo, neomicina, carbenicilina, canamicina, espectinomicina, higromicina, bleomicina, cloranfenicol, ampicilina, etc.) ou herbicida (glifosato, glufosinato, fosfinotricina, etc.), mas não está limitado aos mesmos.

[0096] Além disso, o vetor recombinante para expressão em planta pode incluir um vetor binário Agrobacterium, um vetor de cointegração ou um vetor geral que não tem região T-DNA, mas é projetado para ser expresso na planta. Desses, o vetor binário se refere a um vetor contendo dois sistemas de vetores separados que abrigam um plasmídeo responsável pela migração que consiste na borda esquerda (LB) e na borda direita (RB) no plasmídeo Ti (indução de tumor), e o outro plasmídeo para transferência de gene alvo, e o vetor pode incluir uma região promotora e uma sequência de sinal de poliadenilação para expressão em plantas.

[0097] Quando o vetor binário ou vetor de cointegração é usado, uma cepa para transformação do vetor recombinante na planta é preferencialmente Agrobacterium (transformação mediada por Agrobacterium). Para essa transformação, podem ser usados Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Além disso, quando o vetor que não tem região T- DNA é usado, eletroporação, bombardeio de partículas, absorção mediada por polietilenoglicol e similares podem ser usados para a introdução do plasmídeo recombinante na planta.

[0098] A planta transformada com o gene pelo método acima pode ser rediferenciada em uma planta através da indução de calos, rizogênese e aclimatação do solo, com o uso de uma técnica padrão conhecida na arte relevante.

[0099] A planta submetida a transformação no presente documento pode cobrir não apenas uma planta madura, mas também uma célula vegetal (contendo uma célula cultivada em suspensão), um protoplasto, um calo, um hipocótilo, uma semente, um cotilédone, um broto e similares, que podem crescer e se tornar uma planta madura.

[00100] Além disso, o escopo do transformante pode incluir um transformante em que o gene é introduzido, bem como um clone ou descendência do mesmo (geração T1, geração T2, geração T3, geração T4, geração T5, geração T6, geração T7, geração T8 ou quaisquer gerações subsequentes). Por exemplo, a planta transformada também inclui uma planta que tem os traços de tolerância a herbicida herdados como progênie sexual e assexuada da planta transformada com o gene fornecido no presente documento. O escopo da presente invenção também inclui todas as variantes e variantes que mostram as características da planta transformada inicial, juntamente com todos os produtos de hibridização e fusão da planta transformada com o gene fornecido no presente documento. Além disso, o escopo da presente invenção também inclui uma parte da planta, como uma semente, uma flor, um caule, um fruto, uma folha, uma raiz, um tubérculo e/ou uma raiz tuberosa, que é originada de uma planta transformada que é transformada previamente pelo método da presente invenção, ou uma descendência da mesma, e é composta por pelo menos uma parte das células transformadas.

[00101] A planta, à qual a presente invenção é aplicada, não está particularmente limitada a, mas pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Além disso, a planta pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em plantas herbáceas e plantas lenhosas. A planta monocotiledônea pode incluir plantas pertencentes às famílias Alismataceae, Hydrocharitaceae, Juncaginaceae, Scheuchzeriaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Zosteraceae, Liliaceae, Haemodoraceae, Agavaceae, Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Pontederiaceae, Iridaceae, Burmanniaceae, Juncaceae, Commelinaceae, Eriocaulaceae, Gramineae (Poaceae), Araceae, Lemnaceae, Sparganiaceae, Typhaceae, Cyperaceae, Musaceae, Zingiberaceae, Cannaceae, Orchidaceae e similares, mas não está limitado às mesmas.

[00102] A planta dicotiledônea pode incluir plantas pertencentes às famílias Diapensiaceae, Clethraceae, Pyrolaceae, Ericaceae, Myrsinaceae, Primulaceae, Plumbaginaceae, Ebenaceae, Styracaceae, Symplocaceae, Symplocaceae, Oleaceae, Loganiaceae, Gentianaceae, Menyanthaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Rubiaceae, Polemoniaceae, Convolvulaceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Labiatae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Acanthaceae, Pedaliaceae, Orobanchaceae, Gesneriaceae, Lentibulariaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae, Campanulaceae, Compositae, Myricaceae, Juglandaceae, Salicaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, Santalaceae, Loranthaceae, Polygonaceae, Phytolaccaceae, Nyctaginaceae, Aizoaceae, Portulacaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Cactaceae, Magnoliaceae, Illiciaceae, Lauraceae, Cercidiphyllaceae, Ranunculaceae, Berberidaceae, Lardizabalaceae, Menispermaceae, Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Cabombaceae, Saururaceae, Piperaceae, Chloranthaceae, Aristolochiaceae, Actinidiaceae, Theaceae, Guttiferae, Droseraceae, Papaveraceae, Capparidaceae, Cruciferae, Platanaceae, Hamamelidaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Eucommiaceae, Pittosporaceae, Rosaceae, Leguminosae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Tropaeolaceae, Zygophyllaceae, Linaceae, Euphorbiaceae, Callitrichaceae, Rutaceae, Simaroubaceae, Meliaceae, Polygalaceae, Anacardiaceae, Aceraceae, Sapindaceae, Hippocastanaceae, Sabiaceae, Balsaminaceae, Aquifoliaceae, Celastraceae, Staphyleaceae, Buxaceae, Empetraceae, Rhamnaceae, Vitaceae, Elaeocarpaceae, Tiliaceae, Malvaceae, Sterculiaceae, Thymelaeaceae, Elaeagnaceae, Flacourtiaceae, Violaceae, Passifloraceae, Tamaricaceae, Elatinaceae, Begoniaceae, Cucurbitaceae, Lythraceae, Punicaceae, Onagraceae, Haloragaceae, Alangiaceae, Cornaceae, Araliaceae, Umbelliferae (Apiaceae) e similares, mas não está limitado às mesmas.

[00103] Em uma modalidade específica, a planta pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em culturas alimentares, como arroz, trigo, cevada, milho, soja, batata, feijão vermelho, aveia e sorgo; culturas de vegetais, como repolho chinês, rabanete, pimenta vermelha, morango, tomate, melancia, pepino, repolho, melão oriental, abóbora, ânion galês, ânion e cenoura; culturas para uso especial, como ginseng, tabaco, algodão, forragem verde, forragem, gergelim, cana de açúcar, beterraba sacarina, Perilla sp., amendoim, colza, grama e mamona; árvores frutíferas, como macieira, pereira, jujuba, pessegueiro, kiwi, videira, árvore de frutas cítricas, caquizeiro, ameixeira, damasco e bananeira; plantas lenhosas como pinheiro, óleo de palma e eucalipto; culturas com flores tais como rosa, gladíolo, gérbera, cravo, crisântemo, lírio e tulipa; e culturas forrageiras, como azevém, trevo vermelho, erva de pomar, alfafa, festuca alta e azevém perene, mas não está limitada às mesmas. Como uma modalidade específica, a planta pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em plantas dicotiledôneas, como arabidopsis, batata, berinjela, tabaco, pimenta vermelha, tomate, bardana, margarida da coroa, alface, flor de balão, espinafre, acelga, batata doce, aipo, cenoura, gota d'água, salsa, couve chinesa, repolho, rabanete, melancia, melão oriental, pepino, abóbora, cabaça, morango, soja, feijão mungo, feijão comum e ervilha; e plantas monocotiledôneas, tais como arroz, trigo, cevada, milho, sorgo e similares, mas não está limitado às mesmas.

[00104] As algas, às quais a presente invenção é aplicada, não estão particularmente limitadas a, mas podem ser pelo menos uma alga procariótica ou/ou alga eucariótica. Por exemplo, as algas podem ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em cianobactérias, algas verdes, algas vermelhas, algas marrons, macroalgas, microalgas e similares.

[00105] As cianobactérias podem incluir phylums Chroococcales (por exemplo, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria, Nostocales (por exemplo, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales (por exemplo, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales (por exemplo, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales Stigonematales (por exemplo, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) e similares.

[00106] Como outro exemplo de algas podem ser exemplificadas Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella ou Hematococom.

[00107] Como outro exemplo de algas podem ser exemplificados, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp., Nannochloris spp. e similares. No entanto, as mesmas não estão limitadas aos tipos listados acima, e algas pertencentes a vários outros gêneros e famílias podem ser incluídas.

[00108] Em uma modalidade, a planta ou alga com o PPO tolerante a herbicida ou sua variante fornecida no presente documento pode exibir tolerância contra dois ou mais dos herbicidas inibidores de PPO.

[00109] Portanto, a tecnologia fornecida por esta revelação pode ser usada para controlar ervas daninhas ou remover organismos aquáticos indesejáveis com o uso de pelo menos dois herbicidas inibidores de PPO sequencial ou simultaneamente.

[00110] Uma modalidade fornece um método para controlar ervas daninhas em uma terra de cultivo, que compreende fornecer à terra de cultivo uma planta que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma, conforme descrito acima, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase à terra de cultivo e/ou à planta.

[00111] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo aquático indesejado de um meio de cultura, que compreende: fornecer um meio de cultura com algas que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma descrito acima, e aplicar uma dosagem eficaz de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase ao meio de cultura.

[00112] Além disso, a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma fornecido no presente documento pode ser usado em combinação com um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.

[00113] Portanto, a planta ou alga em que o PPO tolerante a herbicida fornecido no presente documento foi introduzido pode exibir tolerância contra dois ou mais herbicidas que são diferentes um do outro no mecanismo de ação. Na presente invenção, dois ou mais herbicidas diferentes, incluindo o herbicida inibidor de PPO, que são diferentes um do outro no mecanismo de ação, podem ser usados sequencial ou simultaneamente, controlando assim ervas daninhas e/ou removendo organismos aquáticos indesejados. Doravante, o herbicida que é diferente do herbicida inibidor de PPO no mecanismo de ação é denominado “segundo herbicida”.

[00114] Uma modalidade fornece uma composição para conferir ou aumentar a tolerância a herbicidas de plantas ou algas, que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida descrita acima, sua variante ou um gene que codifica a mesma; e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.

[00115] Outra modalidade fornece um transformante de plantas ou algas com tolerância a herbicida, ou um clone ou descendência do mesmo, que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida descrita acima, sua variante ou um gene que codifica a mesma; e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo.

[00116] Outra modalidade fornece um método para preparar plantas ou algas com tolerância a herbicida, que compreende uma etapa de introduzir a proteína PPO tolerante a herbicida descrita acima, sua variante ou um gene que codifica a mesma e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, em uma alga, ou uma célula, protoplasto, calo, hipocótilo, semente, cotilédone, broto ou corpo inteiro de uma planta.

[00117] Outra modalidade fornece um método para controlar ervas daninhas em uma terra de cultivo, que compreende fornecer à terra de cultivo uma planta que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida descrita acima, sua variante ou um gene que codifica a mesma e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, e aplicar dosagens eficazes de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase e o segundo herbicida na terra de cultivo simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem.

[00118] Outra modalidade fornece um método para remover um organismo aquático indesejado de um meio de cultura, que compreende fornecer um meio de cultura com algas que compreende a proteína PPO tolerante a herbicida, sua variante ou um gene que codifica a mesma e um segundo polipeptídeo tolerante a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, e aplicar dosagens eficazes de herbicida inibidor de protoporfirinogênio IX oxidase e o segundo herbicida ao meio de cultura simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem.

[00119] Por exemplo, a planta ou alga pode compreender adicionalmente o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, tendo assim adquirido e/ou aumentado a tolerância contra o segundo herbicida.

[00120] Por exemplo, a planta ou alga inclui adicionalmente o segundo polipeptídeo de tolerância a herbicida ou um gene que codifica o mesmo, tendo assim uma tolerância nova e/ou aumentada contra o segundo herbicida.

[00121] Por exemplo, o segundo herbicida pode incluir herbicidas inibidores de divisão celular, herbicidas inibidores de fotossíntese, herbicidas inibidores da síntese de aminoácidos, herbicidas inibidores de plastídios, herbicidas inibidores de membrana celular e/ou quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos. O segundo herbicida pode ser exemplificado por glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético), herbicidas inibidores de ALS (acetolactato sintetase) (por exemplo, imidazolidinona, sulfonilureia, triazol pirimidina, sulfonanilida, pirimidatobenzoato, etc.), herbicidas inibidores do fotossistema II, herbicidas à base de fenilureia, herbicidas inibidores de plastídio, herbicidas à base de bromoxinila e/ou quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[00122] Por exemplo, o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado como um ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em EPSPS tolerante a herbicida glifosato (5-enolpiruvilshikimato-3- fosfato sintase resistente ao glifosato), GOX (glifosato oxidase), GAT (glifosato-N-acetiltransferase) ou glifosato descarboxilase; PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferase) tolerante a herbicida glufosinato; DMO (dicamba mono- oxigenase) tolerante a herbicida dicamba; 2,4-D mono- oxigenase ou AAD (ariloxialcanoato dioxigenase) tolerante a herbicida 2,4-D; ALS (acetolactato sintase) tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS, AHAS (aceto-hidroxiácido sintase) ou AtAHASL (subunidade grande de Arabidopsis thalianaaceto-hidroxiácido sintase); proteína D1 de fotossistema II tolerante a herbicida inibidor de fotossistema II; citocromo P450 tolerante a herbicida à base de fenilureia; HPPD (hidroxifenilpiruvato dioxigenase) tolerante a herbicida inibidor de plastídios; nitrilase tolerante a herbicida de bromoxinil e quaisquer combinações dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[00123] Além disso, o gene que codifica o segundo polipeptídeo tolerante a herbicida pode ser exemplificado por como um ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em gene cp4 epsps, epsps (AG),mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 ou gat4621 tolerante a herbicida glifosato; gene bar, pat ou pat (SYN) tolerante a herbicida glufosinato; gene dmo tolerante a herbicida dicamba; gene AAD-1 ou AAD- 12 tolerante a herbicida 2,4-D;, ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM- HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA ou SurB tolerante a herbicida à base de sulfonilureia inibidor de ALS; gene psba tolerante a herbicida inibidor de fotossistema II; gene CYP76B1 tolerante a herbicida de fenilureia; gene HPPDPF W336 tolerante a herbicida isoxaflutol; gene bxn tolerante a herbicida bromoxinil e combinações dos mesmos, porém, sem limitação aos mesmos.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[00124] Variantes de proteínas PPO tolerantes a herbicidas ou genes que codificam as mesmas fornecidos no presente documento podem ser aplicados a plantas ou algas, conferindo assim excelentes características de tolerância a herbicidas às plantas ou algas e/ou aumentando as características de tolerância a herbicidas das plantas ou algas. Além disso, um controle seletivo pode ser realizado com o uso de herbicidas, desse modo, controlando economicamente as ervas daninhas ou removendo organismos aquáticos.

Breve descrição dos desenhos

[00125] A Figura 1 é um mapa do vetor pMAL-c2X.

[00126] A Figura 2 é um mapa do vetor CT-His pET303.

[00127] As Figuras 3 a 30 mostram o nível de crescimento celular de BT3 E. coli deficiente em PPO (ΔPPO) transformado com o gene CyPPO19 de tipo selvagem (indicado por CyPPO19WT), ou genes da variante CyPPO19, quando tratados com vários herbicidas em várias concentrações.

[00128] As Figuras 31 e 32 mostram o nível de crescimento celular de BT3 E. coli deficiente em PPO (ΔPPO) transformado com o gene CyPPO18 de tipo selvagem (indicado por CyPPO18WT), ou genes da variante CyPPO18, quando tratados com vários herbicidas em várias concentrações.

[00129] A Figura 33 mostra esquematicamente um vetor recombinante para preparar uma proteína de fusão em que a proteína de ligação a maltose (MBP) e a proteína PPO são fundidas.

[00130] As Figuras 34 e 35 mostram resultados observados no 7° dia após a pulverização de 1μM de tiafenacil ou 1μM de flumioxazina para A. thaliana transgênica (T2) transformada com CyPPO19 WT ou seus genes variantes (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) em comparação com A. thaliana de tipo selvagem (Col-0).

[00131] As Figuras 36 e 37 mostram resultados observados no 7° dia após a pulverização de 5μM de tiafenacil ou 5μM de flumioxazina para A. thaliana transgênica (T2) transformada com genes da variante CyPPO19 (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) em comparação com A. thaliana de tipo selvagem (Col-0).

[00132] A Figura 38 mostra um resultado observado no 7° dia após a aspersão de 1μM de tiafenacil a A. thaliana transgênica (T2) transformada com o gene CyPPO18 WT em comparação com o A. thaliana tipo selvagem (Col-0).

[00133] A Figura 39 mostra um resultado observado no 7° dia após a aspersão de 1μM de tiafenacil a A. thaliana transgênica (T2) transformada com o gene da variante CyPPO18 (L327T+F360M) em comparação com o tipo selvagem de A. thaliana (Col-0).

Modo para a Invenção

[00134] Doravante no presente documento, a presente invenção será descrita em detalhes em referência aos Exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e a invenção não se destina a ser limitada por estes Exemplos.

Exemplo 1. Isolamento de Genes PPO de Espécies Procarióticas

[00135] A informação da sequência PPO foi obtida do banco de dados de espécies Genebank incluindo Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCTE542, Cyanobacteria bacterium J003 e Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134. Genes PPO foram sintetizados (Integrated DNA Technologies). Os genes PPO foram amplificados nas condições da Tabela 2 com o uso dos iniciadores listados na Tabela 1 para cloná- los no vetor pMAL-c2X (Figura 1).

[00136] Mistura de PCR: Modelo (DNA sintético de cada um dentre CyPPO19, CyPPO20 e CyPPO18) 1 μl Tampão 10X 5 μl Mistura de dNTP (10 mM cada) 1 μl Iniciador de avanço (10 μM, consultar a Tabela 1) 1 μl Iniciador inverso (10 μM, consultar a Tabela 1) 1 μl DDW 40 μl Pfu-X (Solgent, 2,5 unidades/μl) 1 μl Total 50 μl Cada gene PPO foi designado como CyPPO19 isolado de Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCTE542, CyPPO20 de Cyanobacteria bacterium J003 e CyPPO18 de Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134. Tabela 1 Tabela 2 Condição PCRTabela 2 Condição PCR

Exemplo 2. Construção de Variantes PPO

[00137] A fim de aumentar a tolerância a herbicida inibidor de PPO de CyPPO19, CyPPO20 e CyPPO18, foi introduzida uma mutação (ou mutações) na posição que interage com o herbicida para preparar variantes de CyPPO19, CyPPO20 e CyPPO18.

[00138] O procedimento experimental detalhado foi o seguinte: Com o uso dos iniciadores listados na Tabela 3, a PCR foi realizada para amplificar os genes PPO nas condições mostradas na Tabela 4.

[00139] Mistura de reação de PCR: Modelo (DNA sintético de cada um dentre CyPPO19, CyPPO20 ou CyPPO18) 1 μl Tampão 10X 5 μl Mistura de dNTP (10 mM cada) 1 μl Iniciador de avanço (10 μM) 1 μl Iniciador inverso (10 μM) 1 μl DDW 40 μl Pfu-X (Solgent, 2,5 unidades/μl) 1 μl Total 50 μl Tabela 3 Informações de Sequência de Iniciadores para Clonagem de Genes para o Vetor CT His pET303

[00140] Os produtos de PCR amplificados acima e o vetor CT His pET303 (Invitrogen; Figura 2) foram digeridos com as enzimas de restrição XbaI e XhoI e ligados aos construtos pET303-CyPPO19 pET303-CyPPO20 e plasmídeos pET303-CyPPO18 com o uso de T4 DNA ligase (RBC, 3 unidades /μl). Variantes de CyPPO19, CyPPO20 e CyPPO18 foram construídas com o uso de genes CyPPO19, CyPPO20 e CyPPO18 clonados no vetor CT His pET303 com iniciadores listados nas Tabelas 5 a 7 nas seguintes condições. Mistura de reação de PCR Modelo 1 μl Tampão 10X 5 μl Mistura de dNTP (10 mM cada) 1 μl Iniciador de avanço (10 μM) 1 μl Iniciador inverso (10 μM) 1 μl DDW 40 μl Pfu-X (Solgent, 2,5 unidades/μl) 1 μl Total 50 μl Tabela 4 Condição de PCR Tabela 5 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO19 Tabela 6 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO20 Tabela 7 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO18 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO19 Iniciador de mutagênese CyPPO19 Tabela 6 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO20 Iniciador de mutagênese CyPPO20 Tabela 7 Lista de Iniciadores para Construção de Variante CyPPO18 Iniciador de mutagênese CyPPO18

Exemplo 3. Verificação da Tolerância a Herbicidas Inibidores de PPO de Variantes de PPO (Teste em E. Coli)

[00141] Para aumentar a resistência ao herbicida inibidor de PPO de CyPPO19 e CyPPO18, foram construídos genes variantes de PPO do exemplo 2 acima. Os mesmos foram transformados em cepa BT3 (ΔPPO) que é deficiente em atividade de PPO e cultivados em meio LB com herbicida inibidor de PPO, examinando assim se o crescimento de BT3 transformado não foi inibido.

[00142] O procedimento experimental detalhado foi o seguinte: As células competentes BT3 foram transformadas com os plasmídeos pET303-CyPPO19 (tipo selvagem), pET303-CyPPO18 (tipo selvagem) e aqueles com mutação (ou mutações) construída (consultar o exemplo 2) através do método de choque térmico e foram cultivadas em meio de ágar LB contendo ampicilina.

[00143] A colônia única transformada com cada gene CyPPO foi cultivada em 3 ml de caldo LB (LPSS) contendo ampicilina por mais de 12 horas e, em seguida, foi subcultivada em caldo LB até que a absorbância (OD600) atingisse 0,5 a 1. Em seguida, a mesma foi diluída com caldo LB até OD600 = 0,5. Novamente, a solução diluída foi diluída em série 4 vezes por um fator de um décimo.

[00144] O meio de ágar LB (LB 25g/l, ágar Bacto 12g/l) contendo ampicilina (100 μg/ml) e 0 a 2000 μM de vários herbicidas foram preparados. Os estoques de solução de herbicida foram todos preparados em DMSO.

[00145] Em seguida, 10 μl de cada solução diluída de E. coli foram colocados na placa e cultivados a 37 C no escuro por 16-20 horas. A resistência ao herbicida inibidor de PPO foi avaliada com a extensão do crescimento de E. coli contendo cada gene sendo observada.

[00146] Os herbicidas usados para os testes foram listados na Tabela 8. Tabela 8

[00147] A extensão da resistência ao herbicida foi avaliada pelo crescimento relativo de variantes em relação ao tipo selvagem e listada nas Tabelas 9 e 10 e Figuras 3 a 32. Tabela 9 Tabela 10

[00148] Nas Tabelas 9 e 10, o nível de tolerância de variantes que mostram resistência equivalente ao tipo selvagem foi apresentado como '-', e foi feito como '+' para cada 10 vezes de resistência até '+++++' como resistência máxima. As Figuras 3 a 30 e as Figuras 31 e 32 mostram o resultado do crescimento de E. coli transformado de CyPPO19 WT e suas variantes e CyPPO18 WT e suas variantes, respectivamente. As concentrações dos herbicidas foram escritas acima das fotografias do teste de tolerância. Uma série de pontos de diluição de 10 vezes foi mostrada de OD600 = 0,5 do ponto mais à esquerda para OD600 = 0,00005 do mais à direita.

[00149] Conforme mostrado nas Tabelas 9 e 10 e Figuras 3 a 32, todas as cepas de BT3 transformadas com variantes de CyPPO19 ou CyPPO18 mostraram nível de tolerância significativamente maior (pelo menos 10 vezes maior) do que o tipo selvagem contra vários herbicidas inibidores de PPO.

Exemplo 4. Medição do Atividade de Enzima de PPO e Valor de IC50 para Herbicidas

[00150] As atividades enzimáticas de variantes em que os aminoácidos de certa posição da proteína PPO mutada foram medidas e o ensaio de inibição com os herbicidas inibidores de PPO foi conduzido. Embora a solubilidade de proteína PPO seja marcadamente baixa em condição aquosa, a mesma aumentou muito quando a proteína de ligação à maltose (MBP) foi fundida à proteína PPO. Assim, as proteínas PPO do tipo selvagem e variantes foram expressas como fundidas a MBP e foram utilizadas para experimentos (Figura 33).

[00151] A fim de expressar proteínas de tipo selvagem e variantes de CyPPO19 e CyPPO18 (consultar os Exemplos 1 e 2), esses genes foram introduzidos no vetor pMAL-c2X (consultar a Figura 1) e foram transformados em BL21 CodonPlus (DE3) E. coli, respectivamente.

[00152] As E. coli transformadas acima foram cultivadas nas seguintes condições para expressar proteínas PPO: Indução: OD600 = 0,2, adicionado com 0,3 mM de IPTG (concentração final); Temperatura de cultivo: 23 °C, com agitação a 200 rpm; Duração da cultura: 16 h; Volume de cultivo: Balão de 200 ml/1000 ml.

[00153] As células de E. coli transformadas cultivadas foram lisadas e as proteínas foram extraídas como se segue: Tampão de extração: Tampão da coluna (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM) 5 ml de tampão/g célula; Sonicação: SONICS&MATERIALS VCX130 (130 watts); 15 s LIGADO, 10 s DESLIGADO por 5 min no gelo; Centrifugação a 4 C por 20 minutos (20000xg); O sobrenadante obtido após a centrifugação foi diluído na razão de 1:6 com tampão de coluna.

[00154] O seguinte processo de purificação da proteína PPO foi realizado em uma câmara fria a 4 C. Resina de amilose (New England Biolabs) foi colocada em uma coluna de 1,5 x 15 cm (Bio-Rad, Econo Columns 1,5 x 15 cm, coluna de cromatografia de vidro, volume máx.), e os extratos de proteína obtidos foram carregados na coluna a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min. A coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão e a presença de proteína na solução de lavagem foi examinada. Quando a proteína não foi mais detectada, o procedimento de lavagem foi encerrado. Em seguida, a proteína MBP-PPO foi eluída com aproximadamente 2 volumes de coluna de tampão contendo maltose 20 mM. A concentração de proteína de cada eluente foi determinada e a eluição foi interrompida quando a proteína não foi mais detectada. Dez microlitros de cada fração foram investigados para quantificação de proteínas e análise de SDS-PAGE. As frações altamente puras das variantes de proteína PPO foram usadas para o ensaio enzimático.

[00155] As atividades de enzimas foram medidas com proteínas purificadas acima de tipo selvagem e variantes de CyPPO19 e CyPPO18 como que se segue: Em primeiro lugar, o protoporfirinogênio IX foi sintetizado quimicamente no laboratório. O processo geral foi realizado sob corrente de nitrogênio. Seis microgramas de protoporfirina IX foram dissolvidos em 20 ml de 20% (v/v) de EtOH e agitados no escuro durante 30 minutos. A solução de protoporfirina IX obtida foi colocada em um tubo de parafuso de 15 ml em uma quantidade de 1000 μl e lavada com gás nitrogênio por 5 minutos. A essa, foi adicionado 1 g de amálgama de sódio e agitado vigorosamente durante 2 minutos. A tampa foi aberta para evacuar o gás hidrogênio no tubo. Depois disso, a tampa foi fechada e incubada por 3 minutos. A solução de protoporfirinogênio IX foi filtrada com o uso de seringa e filtro de membrana de celulose. A 800 μl da solução de protoporfirinogênio IX obtida, foram adicionados aproximadamente 1600 μl de MOPS [ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico] 2M para ajustar o pH para 7,5. Para determinar a atividade enzimática da proteína PPO, foi preparada uma mistura de reação com a seguinte composição (com base em 10 ml): Tris-Cl 50 mM (pH 7,5); NaCl 50 mM; Tween 20 a 0,04% (v/v); Glicose 40 mM (0,072 g); 5 unidades de glicose oxidase (16,6 mg) e 10 unidades de catalase (1 μl).

[00156] Cento e oitenta microlitros de uma mistura de reação foram colocados em placas de 96 poços e 20 μl da proteína PPO purificada (produto purificado da proteína PPO fundida com MBP) acima foram adicionados. Depois que 50 μl do óleo mineral foram estratificados, a reação foi iniciada pela adição do substrato, solução de protoporfirinogênio IX, a uma concentração final de 50 μM. A reação prosseguiu à temperatura ambiente durante 30 min e a fluorescência da protoporfirina IX foi medida com o uso do Leitor de microplaca (Sense, Hidex) (excitação: 405 nm; emissão: 633 nm). Para calcular a atividade da enzima PPO, a solução de protoporfirinogênio IX foi mantida aberta ao ar por mais de 12 horas para oxidar a solução. A essa, foi adicionado HCl 2,7 N, e a absorbância a 408 nm foi medida. Uma curva padrão foi gerada com o uso de protoporfirina IX padrão, e a atividade de PPO foi medida por calibração de protoporfirina IX com o uso da curva padrão de protoporfirina IX.

[00157] A concentração dos herbicidas inibidores de PPO que inibem a atividade da enzima PPO em 50% (IC50) foi medida para cada herbicida. As concentrações finais de cada herbicida foram as seguintes: - Concentrações de tiafenacil, saflufenacil, fomesafen, flumioxazin, sulfentrazona, oxifluorfen e carfentrazona: 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2500, 5000, 10000 nM O valor de IC50, a concentração do herbicida inibidor da atividade da enzima PPO para 50%, foi calculado adicionando-se o herbicida das concentrações acima à mistura de reação.

[00158] Os valores de IC50 para cada herbicida são mostrados nas Tabelas 11 e 12 que se seguem. Tabela 11 Valores de IC50 (nM) do Tipo Selvagem e Variantes de CyPPO19 Contra Vários Herbicidas Tabela 12 Valores de IC50 (nM) do Tipo Selvagem e Variantes de CyPPO18 Contra Vários Herbicidas

[00159] (Nas Tabelas 11 e 12 acima, valor de IC50 de '5000' ou valor de IC50 de '10000' significa equivalente ou superior ao valor de IC50 de 5000 ou valor de IC50 de 10000 porque a atividade da enzima não foi inibida em 50% mesmo em cada concentração de herbicida de 5000 nM ou 10000 nM). Como mostrado nas Tabelas 11 e 12, foi demonstrado que as variantes das proteínas CyPPO mostraram valores de IC50 significativamente aumentados contra cada herbicida em comparação com o tipo selvagem. Tais resultados indicam que a tolerância a herbicida foi aumentada por substituições de aminoácidos em posições especificadas da proteína PPO. Embora os dados mostrem que as variantes da proteína CyPPO possuem atividade enzimática reduzida em comparação com o tipo selvagem, isso pode ser causado pela diferença de dobramento da proteína e hidrofobicidade entre as proteínas. A proteína PPO de origem vegetal está localizada na membrana do cloroplasto e é hidrofóbica; no entanto, a proteína PPO recombinante fundida com MBP é hidrofílica. Portanto, quando as variantes de PPO são montadas e expressas adequadamente em cloroplastos de plantas, a atividade da enzima não seria drasticamente diferente entre as variantes e o tipo selvagem. Exemplo 5. Variantes de Proteína PPO Originadas de Várias Cianobactérias, Algas ou Bactérias

[00160] Com base nas posições de mutação de CyPPO19 e CyPPO18, cujo efeito no aumento de resistência foi verificado nos exemplos 3 e 4 acima, os locais de mutação das proteínas PPO se originaram de várias cianobactérias, algas ou bactérias que têm efeito semelhante na resistência a herbicidas para variantes de CyPPO19 e CyPPO18 foram analisados por meio da análise de sua estrutura de proteína 3D e estão listados na Tabela 13: Tabela 13

Exemplo 6. Geração de Transformantes de Arabidopsis Thaliana com o Uso de CyPPOs e Variantes, e Teste de Tolerância a Herbicida Inibidor de PPO 6-1. Construção de Vetores de Transformação de A. Thaliana e Geração de Transformantes de A. Thaliana

[00161] A. thaliana foi transformada com um vetor binário que tem ORF de um marcador selecionável, gene Bar (gene tolerante ao glufosinato) e ORF de cada gene variante de CyPPO19 e CyPPO18. A planta transgênica foi examinada quanto à tolerância cruzada ao glufosinato e herbicidas inibidores de PPO. O gene bar também foi usado para examinar se o transgene foi herdado de forma estável durante as gerações. O promotor NOS e o terminador E9 foram usados para a expressão do gene bar.

[00162] A fim de expressar proteínas de CyPPO19, variantes de CyPPO19, CyPPO18 e variantes de CyPPO18 em plantas, foram usados um promotor CaMV35S e um terminador NOS. Os genes de codificação de CyPPO19, variantes de CyPPO19, CyPPO18 e variantes de CyPPO18 foram amplificados com o uso de PCR com pares de iniciadores na Tabela 14 e, em seguida, introduzidos no vetor binário com o uso das enzimas de restrição XhoI e BamHI. Tabela 14 Sequência de Iniciador

[00163] Além disso, para a confirmação da expressão de proteína, o marcador de hemaglutinina (HA) foi fundido à região do terminal 3’ do gene que codifica a proteína PPO com o uso das enzimas de restrição BamHI e SacI. Um terminador NOS foi inserido no terminal 3’ do marcador HA, para induzir a terminação da transcrição do gene PPO. Além disso, a fim de transportar a proteína para o cloroplasto, o gene do peptídeo de trânsito (TP) (SEQ ID NO: 301) do gene AtPPO1 (SEQ ID NO: 302) foi fundido à região do terminal 5' do gene que codifica a proteína PPO com o uso das enzimas de restrição XbaI e XhoI. Cada vetor construído foi transformado em célula competente de Agrobacterium tumefaciens GV3101 pelo método de congelamento-descongelamento. As células competentes de Agrobacterium GV3101 foram preparadas pelos seguintes procedimentos, a cepa GV3101 de Agrobacterium foi cultivada em 5 ml de meio LB a 30 °C, 200 rpm durante 12 horas. As células foram subcultivadas em 200 ml de meio LB a 30 C, 200 rpm por 3 a 4 horas e centrifugadas a 3000 x g a 4 C por 20 minutos. A pelota celular foi lavada com água destilada estéril e, em seguida, ressuspensa em 20 ml de meio LB. Alíquotas de 200 μl congeladas instantaneamente com nitrogênio líquido foram armazenadas em um congelador.

[00164] Cada Agrobacterium transformado foi rastreado em meio LB contendo espectinomicina. A colônia selecionada foi cultivada em caldo LB. Após a célula de Agrobacterium ter sido colhida do meio de cultura, a mesma foi ressuspensa na solução contendo sacarose a 5% (p/v) e Silwet L-77 a 0,05% (v/v) (Momentive Performance Materials Co., Ltd.) em uma absorbância (OD600) de 0,8. Pelo método de imersão floral, A. thaliana tipo selvagem (Col-0) foi transformada, e então as sementes (T1) foram colhidas após 1 a 2 meses.

[00165] As plantas transgênicas foram testadas com tolerância ao glufosinato, que foi conferida pela expressão do gene Bar no vetor binário. As sementes T1 obtidas foram semeadas em meio de 1/2 MS (2,25 g/l de sal MS, 10 g/l de sacarose, 7 g/l de ágar) suplementado com glufosinato 50 μM e as plantas sobreviventes foram selecionadas 7 dias após a semeadura. As mesmas foram, então, transplantadas para o solo e cultivadas para a obtenção de plantas T1.

[00166] A fim de examinar a tolerância a herbicida inibidor de PPO das plantas transgênicas, plantas de 3 a 4 semanas de idade foram aspergidas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil 1μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em área de 40 x 60 cm (0,24 m2). Enquanto a A. thaliana de tipo selvagem (Col-0) morreu completamente dentro de 7 dias após o tratamento com tiafenacil na mesma concentração, cada planta transgênica mostrou tolerância ao tratamento com herbicida inibidor de PPO e sobreviveu.

[00167] As sementes T2 foram colhidas de plantas transgênicas T1 tolerantes e sobreviventes e foram semeadas em meio de 1/2 MS (2,25 g/l de sal MS, 10 g/l de sacarose, 7 g/l de ágar) suplementado com glufosinato 50 μM. Uma semana depois, as plantas sobreviventes foram transplantadas para o solo.

6-2. Verificação de Tolerância a Herbicidas de Plantas de Arabidopsis Transformadas (T2)

[00168] Plantas de Arabidopsis (T2) transformadas com genes incluindo CyPPO19, variantes de CyPPO19 (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V), CyPPO18 ou variante de CyPPO18 (L327T+F360M) foram testadas quanto à sua tolerância contra herbicidas.

[00169] A fim de examinar a tolerância a herbicida inibidor de PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas de CyPPO19 WT e suas variantes (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) foram pulverizadas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil 1μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v))/(100 ml de flumioxazina 1 μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em uma área de 40 x 60 cm (0,24 m2). A tolerância a herbicida foi avaliada 7 dias após o tratamento. A planta de Arabidopsis de tipo selvagem (Col- 0) foi usada como controle.

[00170] A avaliação da tolerância de plantas transgênicas de Arabidopsis (T2) após tratamento com tiafenacil 1 μM ou flumioxazina 1 μM foi mostrada nas Figuras 34 e 35.

[00171] A fim de examinar a tolerância a herbicida inibidor de PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas de variantes de CyPPO19 (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) foram pulverizadas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil 5μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v))/(100 ml de flumioxazina 5 μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em uma área de 40 x 60 cm (0,24 m2). A tolerância a herbicida foi avaliada 7 dias após o tratamento. A planta de Arabidopsis de tipo selvagem (Col-0) foi usada como controle.

[00172] A avaliação da tolerância de plantas transgênicas de Arabidopsis (T2) após tratamento com tiafenacil 5 μM ou flumioxazina 5 μM foi mostrada nas Figuras 36 e 37.

[00173] A fim de examinar a tolerância a herbicida inibidor de PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas do tipo selvagem de CyPPO18 foram aspergidas uniformemente com herbicida (100 ml de tiafenacil 1μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em área de 40 x 60 cm (0,24 m2). A tolerância a herbicida foi avaliada 7 dias após o tratamento. A planta de Arabidopsis de tipo selvagem (Col- 0) foi usada como controle.

[00174] A avaliação da tolerância de plantas transgênicas de Arabidopsis (T2) após o tratamento com tiafenacil 1 μM foi mostrada na Figura 38.

[00175] A fim de examinar a tolerância a herbicida inibidor de PPO das plantas transgênicas, as plantas transgênicas da variante CyPPO18 (L327T+F360M) foram aspergidas uniformemente com herbicida (100ml de tiafenacil 1μM e Silwet L-77 a 0,05% (v/v)) em área de 40 x 60 cm (0,24 m2). A tolerância a herbicida foi avaliada 7 dias após o tratamento. A planta de Arabidopsis de tipo selvagem (Col- 0) foi usada como controle.

[00176] A avaliação da tolerância de plantas transgênicas de Arabidopsis (T2) após o tratamento com tiafenacil 1 μM foi mostrada na Figura 39.

[00177] Com base nos resultados mostrados nas Figuras 34 a 39, a tolerância a herbicida de plantas transgênicas foi avaliada com o Índice de lesão definido na Tabela 15. Tabela 15 Definição de Índice de Lesão

[00178] Os níveis de tolerância das plantas transgênicas foram avaliados de acordo com a definição do índice de lesão e foram mostrados nas Tabelas 16 a 19. Tabela 16 Índice de lesão de Plantas Transgênicas de CyPPO19 WT e Suas Variantes (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) Após Tratamento com Tiafenacil 1 μM ou Flumioxazina 1 μM Tabela 17 Índice de Lesão de Plantas Transgênicas de Variantes CyPPO19 (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) Após Tratamento com Tiafenacil 5μM ou Flumioxazina 5μM Tabela 18 Índice de Lesão de Plantas Transgênicas de CyPPO18 WT Após Tratamento com Tiafenacil 1μM Tabela 19 Índice de lesão de Plantas Transgênicas da Variante CyPPO18 (L327T+F360M) Após Tratamento com Tiafenacil 1μM Tabela 17 Índice de Lesão de Plantas Transgênicas de Variantes CyPPO19 (F360M, F360V, F360L, V165C+F360M, V165S+F360V) Após Tratamento com Tiafenacil 5µM ou Flumioxazina 5µMTabela 18 Índice de Lesão de Plantas Transgênicas de CyPPO18 WT Após Tratamento com Tiafenacil 1µMTabela 19 Índice de lesão de Plantas Transgênicas da Variante CyPPO18 (L327T+F360M) Após Tratamento com Tiafenacil 1µM

[00179] Conforme demonstrado pelos resultados acima, as plantas transgênicas transformadas com CyPPO19 WT ou CyPPO18 WT exibem tolerância a herbicidas aumentada em comparação com plantas não transgênicas. Além disso, as plantas transgênicas transformadas com variantes CyPPO19 ou variante CyPPO18 exibem tolerância a herbicida significativamente aumentada em comparação com plantas não transgênicas.

Claims

1. Uso de pelo menos um selecionado do grupo que consiste em (1) a (3) a seguir caracterizado pelo fato de ser para conferir ou aumentar a tolerância de uma planta ou alga a um herbicida inibidor da protoporfirinogênio IX oxidase: (1) um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 modificada, compreendendo pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (i) F360M, F360V, F360I, F360T ou F360L, (ii) A167C, A167L ou A167I, (iii) V305M ou V305L, (iv) R89A, (v) V165S ou V165C, (vi) L327T e (vii) I408R ou I408W, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; e (b) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos (a); (2) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio de (1); e (3) um vetor recombinante que expressa o polipeptídio de (2).

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo (a) consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (i) F360M, F360V, F360I, F360T ou F360L, (ii) A167C, A167L ou A167I, (iii) V305M ou V305L, (iv) R89A, (v) V165S ou V165C, (vi) L327T e (vii) I408R ou I408W, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo (a) consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo (i) F360M, F360V, F360I, F360T ou F360L, e pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (ii) A167C, A167L ou A167I, (iii) V305M ou V305L, (iv) R89A, (v) V165S ou V165C, (vi) L327T, e (vii) I408R, ou I408W, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o herbicida é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em pirimidinodionas, éteres difenílicos, fenilpirazóis, N-fenilftalimidas, ésteres fenílicos, tiadiazóis, oxadiazóis, triazolinonas, oxazolidinodionas, piraclonil, flufenpir-etila e profluazol.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o herbicida é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em butafenacil, saflufenacil, benzfendizona, tiafenacil, fomesafen, oxyfluorfen, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifen, lactofen, clometoxifen, clorintrofen, fluoroglicofen-etila, halosafen, piraflufen-etila, fluazolato, flumioxazina, cinidon-etila, flumiclorac-pentila, flutiaceto, tidiazimina, oxadiargil, oxadiazon, carfentrazona, sulfentrazona, trifludimoxazina, azafenidin, pentoxazona, piraclonil, flufenpir-etila, profluazol, fenopilato, carbamato, análogos de fenopilato e sais agricolamente aceitáveis dos mesmos.