JP2002528036A - 遺伝子操作による植物へのｐｐｏ阻害性除草剤耐性付与法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤に対する耐性を作物用植物に付与する方法を提供する。耐性はポルフィリン性除草剤に耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするクローン化DNAを発現するように植物を遺伝子操作することによって付与される。そのような耐性作物用植物を栽培すれば、それら作物用植物の圃場にこれらの除草剤を使用することが可能になる。これは雑草管理をより簡単に、また、より効率よくし、これら農業用除草剤の価値を増大させるはずである。さらに本発明は、遺伝子操作法によって調製された除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を用いて本発明方法により、プロトポルフィリノーゲンオキダーゼ阻害性除草剤に対して耐性となった植物、藻類、植物細胞および藻類細胞を提供する。また、本発明はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に対する試験化合物の阻害効果を評価する方法ならびに試験化合物のなかからプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。ポルフィリン性除草剤に耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素をコードする好ましいクローン化DNA断片も記述される。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（PPO；EC1.3.3.4）阻害性 除草剤に対する耐性を植物に付与するDNA断片、これらDNA断片を含むプラスミド および微生物に関する。また本発明は、PPOをコードする遺伝子操作されたDNA断 片を使って植物および植物細胞に耐性を付与する方法に関する。本発明のさらな る側面は、PPO阻害性除草剤に対する耐性が付与された植物および植物細胞であ る。本発明のもうひとつの側面は、PPO活性に対する化合物の阻害効果を評価す る方法であって、該化合物に対して耐性または感受性のPPOをコードする遺伝子 の存在のみを相違点とする微生物系を使用する方法に関する。 関連技術の説明 ある種の市販除草剤とその他の入手可能な除草剤にその活性成分として使用さ れている一群の広く知られた化合物は、光の存在下に除草活性を示すが、暗所で は除草活性を示さない。そのためこれらの除草剤は光依存性除草剤という一般名 で呼ばれることになった。最近、これらの除草剤が植物と藻類で高レベルのポル フィリン蓄積を誘導することが示され、したがって現在これらは「ポルフィリン 蓄積型除草剤」（続・医薬品の開 発第18巻：農薬の開発II，第16章，16-1節，岩村ほか編、東京・廣川書店）また は単に「ポルフィリン性除草剤（porphyric herbicide）」と呼ばれている。単 離されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをポルフィリン蓄積型除草剤が 阻害することは、Matringeら（Biochem J.260:231（1989）およびFEBS Lett.245 :35（1989））によって報告された。したがってポルフィリン性除草剤はPPO阻害 性除草剤とも呼ばれる。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは細菌や酵母な どの微生物、藻類を含む植物、および動物に広く認められる。この酵素はヘム生 合成経路とクロロフィル生合成経路の両方に共通な最後の酸化段階、すなわちプ ロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化を触媒する（Matrin geら，Biochem J.260:231（1989））。 細菌のPPOは細胞質に局在していると考えられ、細菌のPPOをコードする遺伝子 はEscherichia coli（大腸菌）（GenBankアクセッション番号X-68660：ECHEMGA ；Sasarmanら，Can.J.Microbiol.39:1155（1993））とBacillus subtilis（枯草 菌）（GenBankアクセッション番号M97208：BACHEMEHY，Dailyら，J.Biol.Chem.2 69:813（1994））から単離されている。ミトコンドリアPPOをコードするマウス （GenBankアクセッション番号U25114:MMU25114）、ヒト（GenBankアクセッショ ン番号D38537：HUMPOXおよびU26446：HSU26446）および酵母（WardおよびVolrat h，WO95/34659，1996）の遺伝子が単離されている。クロロプラストPPOをコード する遺伝子もArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）とトウモロコシから単離 されている（WardおよびVolrath，WO95/346569，1996）。 高等植物と同様に、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii（クラミドモナス ・レイ ンハーティ（コナミドリムシの一種））はPPO阻害性除草剤への感受性が高い。 しかし、RS-3と呼ばれる突然変異株（Kataokaら，J.Pesticide Sci.15:449（199 0））はPPO阻害剤に特異的に耐性を示す。この耐性は単一の優性核突然変異によ ってもたらされる（Satoら，Porphyric Pesticides:Chemistry,Toxicology and Pharmaceutical 1994アメリカ化学会（ワシントンD.C.））。さらに、RS-3突然変異株から単離さ れたクロロプラスト断片中のPPO活性は、PPO阻害剤に対する感受性が、野生型C. reinhardtii由来の同様のクロロプラスト断片より有意に低かった（Shibataら， Academic Publishers（オランダ・ドルロレヒト））。 ほとんどの作物用植物はPPO阻害性除草剤に対して耐性を示さないので、その ような作物が栽培されている場合はこれらの化合物を農地に使用できない。もし PPO阻害性除草剤に耐性な作物用植物を開発することができれば、その生長期の 雑草防除にそのような除草剤を使用できる。これは作物管理を容易にし、農業用 途におけるそれら除草剤の価値を高めるだろう。そのため、PPO阻害性除草剤ま たはポルフィリン蓄積性除草剤に対する耐性を作物用植物に付与する方法を開発 することが望ましい。 発明の要約 この目的を達成するため、本発明者らは、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhard tiiの突然変異株であってRS-3と呼ばれPPO阻害性除草剤に特異的耐性を示す株を 研究 した。そして本発明者らは、RS-3突然変異株の全核DNAから構築されたゲノムDNA ライブラリーからPPO阻害性除草剤耐性を担う遺伝子を含有するクローンを単離 し、植物または藻類の細胞にPPO阻害性除草剤に対する耐性を付与するDNA断片の 単離に成功した。さらに本発明者らは、これらのDNA断片がPPO遺伝子配列を含有 すること、ならびにRS-3突然変異株に由来するそのDNA断片が、植物PPO蛋白質の 高度に保存されたドメイン内にアミノ酸置換をもたらす一塩基対置換を持つこと を明らかにした。このようにして本発明者らは、PPO酵素に特定のアミノ酸置換 をもたらす遺伝子操作されたPPO遺伝子を導入することによって植物または藻類 にPPO阻害性除草剤耐性を付与する方法を確立することができた。 本発明の目的は、藻類を含む植物または植物細胞にPPO阻害性除草剤に対する 耐性を付与する方法であって、あるDNA断片もしくはその生物学的機能等価物ま たはそのDNA断片を含有するプラスミドを、藻類を含む植物または植物細胞に導 入することからなる方法を提供することであり、ここに該DNA断片または該生物 学的機能等価物は発現され、次の特徴を持つ： （1）該DNA断片は植物PPO活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部 をコードする； （2）該DNA断片は、配列番号1または配列番号2または配列番号3に示すアミノ 酸配列をコードする核酸に関して、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーショ ン法によって検出および単離されうる相同配列を持ち、遺伝子操作法により配列 番号1または配列番号2または配列番号3のVal13に対応するアミノ酸が別のアミノ 酸で人 工的に置換されているタンパク質をコードする； （3）該DNA断片は、植物または藻類の細胞内で発現された場合、その植物また は藻類の細胞内でPPO阻害性除草剤に対する耐性を付与する能力を持つ。 本発明のもうひとつの目的は、上述の方法によって耐性が付与された植物また は植物細胞を提供することである。 本発明のさらなる目的は、PPO阻害性除草剤に対する耐性が付与された植物細 胞を選択する方法であって、PPO阻害性除草剤に対する耐性が本方法によって付 与された植物細胞の集団を、感受性植物細胞の生育を通常阻害する量のPPO阻害 性除草剤で処理することからなる方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、上述の方法によってPPO阻害性除草剤に対する耐性 が付与された作物用植物の圃場においてPPO阻害性除草剤に感受性の植物を防除 する方法であって、PPO阻害性除草剤を該PPO阻害性除草剤感受性植物の生育を阻 害するのに有効な量で適用することからなる方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、次に挙げる特徴を持つDNA断片またはその生物学的 機能等価物を提供することである： （1）該DNA断片は植物PPO活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部 をコードする； （2）該DNA断片は、配列番号1または配列番号2または配列番号3に示すアミノ 酸配列をコードする核酸に関して、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーショ ン法によって検出および単離されうる相同配列を持つ； （3）該DNA断片は、遺伝子操作法により配列番号1または配列番号2または配列 番号3のVal13に対応するアミノ酸が異なるアミノ酸で人工的に置換されているタ ンパク質をコードする； （4）該DNA断片は、植物または藻類の細胞内で発現された場合、その植物また は藻類の細胞内でPPO阻害性除草剤に対する耐性を付与する能力を持つ。 本発明のさらなる目的は、上述のDNA断片またはその生物学的機能等価物を含 むプラスミドと、そのプラスミドを保持する微生物を提供することである。 本発明のさらなる目的は、PPOに対する試験化合物の阻害効果を評価する方法 であって、（a）PPO阻害剤感受性のPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝 子を含有している感受性微生物と、耐性トランスフォーマント微生物とを、試験 化合物の存在下に培養し（この方法において、その耐性トランスフォーマント微 生物は、配列番号1または配列番号2または配列番号3のVal13に対応するアミノ酸 が別のアミノ酸に遺伝子操作法により人工的に置換されていてPPO阻害剤に対し て耐性なPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝子が存在する点だけが該感 受性微生物と異なっている）、（b）感受性微生物と耐性微生物の両方の生育を 評価することによってPPOに対するその試験化合物の阻害効果を決定することか らなる方法を提供することである。この方法には次の方法が含まれる： （1）（a）試験化合物の存在下に、PPO阻害剤感受性のPPO活性を持つタンパク 質をコードする遺伝子を持つ感受性微生物と、遺伝子操作法により配列番号1ま たは配列番号2または配列番号3のVal13に対応するアミノ酸が別のアミノ酸に人 工的に置換 されていてPPO阻害剤に対して耐性なPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝 子が存在する点が該微生物とは異なる微生物とを培養し、（b）耐性微生物が生 育する特定の用量で感受性微生物の生育だけを阻害する化合物を同定することか らなるPPO阻害剤選択法；および （2）PPO阻害剤感受性のPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を持つ 感受性微生物と、配列番号1または配列番号2または配列番号3のVal13に対応する 位置に遺伝子操作法によって導入されたアミノ酸置換を持っていてPPO阻害剤に 対して耐性なPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝子が存在する点だけが 該感受性微生物とは異なる耐性トランスフォーマント微生物とを培養し、（b） 感受性微生物と耐性微生物の生育をどちらも阻害する化合物を同定することから なる、PPOを阻害しない化合物の選択法。 図面の簡単な説明 図1（a）〜1（e）は、ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を付与するクロ ーン化DNA断片の制限部位地図である。各断片のサイズは図1（e）に数字（kb） で示してある。XhoI部位とHindIII部位は図1（a）〜図1（d）に示されている。P stI部位とPmaCI部位は図1（a）だけに示されている。略号：B，BamHI；S，SalI ；P，PstI；X，XhoI；E，EcoRI；H，HindIII；K，KpnI；C，ClaI。 図1（a）：Xho/PmaC2.6と呼ばれる2.6kb DNA断片。 図1（b）：Xho3.4と呼ばれる3.4kb DNA断片。 図1（c）：Hind10.0と呼ばれる10.0kb DNA断片。 図1（d）：Eco13.8と呼ばれる13.8kb DNA断片。 図1（e）：RS-3突然変異株由来のコスミドクローン2955（Cos2955）が保有す る約40.4kbのDNA断片。 図2は、インサートとしてCos2955のEco13.8断片を持つpBSプラスミドの構造を 示す略図である。制限部位間の距離（kb）はインサート上の数字によって示され ている。 図3は、インサートとしてEco13.8のXho/PmaC2.6断片を持つpBSプラスミドの構 造を示す図である。制限部位間の距離（kb）はインサート上の数字によって示さ れている。 発明の詳細な説明 本明細書で使用する用語に関して、「DNA断片」という用語は、本発明のPPO阻 害性除草剤耐性付与法で使用しうるDNA断片だけでなく、それら断片の縮重異性 体および遺伝的に等価な改変体をも指す。ここに「縮重異性体」とは、そのヌク レオチド塩基配列が元の断片と縮重した関係にある異性体、すなわち、元の断片 と同じアミノ酸配列をコードする全ての核酸断片（対応するmRNAもしくは対応す るcDNAまたは対応するPCR産物を含む）を意味すると解される。ここに「遺伝的 に等価な改変体」とは、塩基の変化、付加または欠失を受けていてもよいが本質 的に元の断片と同じ固有の遺伝情報（すなわち植物と植物細胞にPPO阻害性除草 剤耐性を付与する能力）を持つDNA断片を意味すると解される。 本発明の実施態様で使用される植物またはそれ自身が本発明の実施態様である 植物は、藻類、単子葉類、双子葉類のいずれであってもよい。これらのタイプの 植物に適用できる遺伝子操作法は当技術分野で知られている。 「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤」または「PPO阻害性 除草剤」という表現は、「ポルフィリン蓄積型」または「ポルフィリン性除草剤 」、すなわち植物に高レベルのポルフィリンを蓄積させ、施用されると光の存在 下に感受性植物を殺す化合物（感受性植物から単離されるプロトポルフィリンオ キシダーゼ（PPO）活性をin vitroで阻害する化合物を含む）を指す。PPOを阻害 する除草剤には、その分子構造上様々な種類がある（Dukeら，Weed Sci.39:465 （1991）；Nandihaliら，Pesticide Biochem.Physiol.43:193（1992）；Matring eら，FEBS Lett.245:35（1989）；YanaseおよびAndoh，Pesticide Biochem.Phys iol. 35:70（1989）；Andersonら，ACS Symposium Series，Vol.559，Porphyric Pesticides ，S.O.DukeおよびC.A.Rebeiz編，18〜34頁（1994））。これらの除草 剤には、例えばオキサジアゾン、［N-（4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパルギルオ キシ）フェニル-］3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド（以下、化合物Aという） 、ならびにアシフルオルフェン（acifluorfen）、ラクトフェン（lactofen）、 フォメサフェン（fomesafen）およびオキシフルオルフェン（oxyfluorfen）など のジフェニルエーテル系除草剤が含まれる。また、一般式X-Qで示される種類の 除草剤も重要である（ここにＱはであり、Xはに相当する）。 特に興味深い除草剤の例は、ならびに次に挙げるものである： ［2-クロロ-5-（シクロヘキサ-1-エン-1,2-ジカルボキシイミド）-4-フルオロフ ェノキシ］酢酸ペンチル、 7-フルオロ-6-［（3,4,5,6-テトラヒドロ）フタルイミド］-4-（2-プロピニル） -1,4-ベンゾオキサジン-3（2H）-オン、 6-［（3,4,5,6-テトラヒドロ）フタルイミド］-4-（2-プロピニル）-1,4-ベンゾ オキサジン-3-（2H）-オン、 2-［7-フルオロ-3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオ キサジン-6-イル］ペルヒドロイミダゾ［1,5-a］ピリジン-1,3-ジオン、 2-［（4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパルギルオキシ）フェニル］ペルヒドロ-1H- 1,2,4-トリアゾロ［1,2-a］ピリダジン-1,3-ジオン、 2-［7-フルオロ-3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオ キサジン-6-イル］5,6,7,8-1,2,4-トリアゾロ［4,3-a］ピリジン-3H-オン、 2-［3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオキサジン-6- イル］-1-メチル-6-トリフルオロメチル-2,4（1H,3H）-ピリミジンジオン、 2-［6-フルオロ-2-オキソ-3-（2-プロピニル）-2,3-ジヒドロベンズチアゾール- 5-イル］-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド、 1-アミノ-2-［3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオキ サジン-6-イル］-6-トリフルオロメチル-2,4（1H,3H）-ピリミジンジオン およびこれら化合物の類縁体。 本発明のPPO阻害性除草剤耐性付与法で使用されうるDNA断片またはその等価物 は次の特徴を持つ：（1）該DNA断片は植物PPO活性を持つタンパク質またはその タンパク質の一部をコードする；（2）該DNA断片は、配列番号1または配列番号2 または配列番号3で特定されるアミノ酸配列をコードする核酸と相同な配列であ って、従来のDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション法によって単離され うる配 列を持ち、また該DNA断片は、配列番号1または配列番号2または配列番号3のVal1 3に対応する位置にアミノ酸置換（例えばメチオニンによる置換）を持ち配列番 号1または配列番号2または配列番号3で特定される相同アミノ酸配列を持つタン パク質をコードする；（3）該DNA断片は植物または植物細胞にPPO阻害性除草剤 に対する耐性を付与する能力を持つ。 本発明のPPO阻害性除草剤耐性付与法で使用されうるDNA断片は、例えば配列番 号4または配列番号5または配列番号6に従ってヌクレオチド配列を人工的に合成 することによって構築できる。しかし、より一般的には、それらは次の方法で調 製される：（1）PPO活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコード するDNA断片を単離し、PPO阻害性除草剤に耐性なRS-3と呼ばれる単細胞緑藻Chla mydomonas reinhardtiiの突然変異株由来の供与DNAを使用して既知の形質転換法 により感受性野生型細胞にPPO阻害性除草剤耐性を付与する；（2）上述の突然変 異体から単離されたDNA断片中に認められる突然変異を同定する；（3）本発明に 記述する方法を含む既知の方法で、PPO活性を持つタンパク質またはそのタンパ ク質の一部をコードするDNA断片（「PPO遺伝子」という）を単離し、RS-3株のPP O阻害性除草剤耐性突然変異を含む配列番号4に対応する該PPO遺伝子のヌクレオ チド配列ドメインを同定する；（4）コードされるタンパク質にRS-3株のPPO阻害 性除草剤耐性突然変異に認められたものと等価なアミノ酸変化をもたらす特定の 塩基対置換を、指定部位突然変異誘発法などの既知の分子生物学技術によって、 該PPO遺伝子に導入する。別法として、アミノ酸配列番号1または配列番号2また は配列番号3をコードする核酸（例えば配列番号 4または配列番号5または配列番号6）に相同なドメインを持つDNA断片を、既知の DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼージョン法もしくは既知のPCR法によって 単離してもよい。次にRS-3株のPPO阻害性除草剤耐性突然変異に認められたよう なアミノ酸変化をもたらす塩基対置換を、上述したようなDNA断片に導入するこ とができる。一部の態様では、その相同DNAドメインが、配列番号4または配列番 号5または配列番号6から選択される配列とは異なるヌクレオチドを1つまたは2つ だけ持つだろう。本発明のいくつかの態様では、PPO遺伝子のヌクレオチド配列 が、配列番号4で表される部分配列中の1〜6ヌクレオチドが異なる点を除いて、 野生型C.reinhardtiiのPPO遺伝子の配列と同一である。その相違は、配列番号1 のアミノ酸配列に対して好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個が変化す る突然変異をコードするだろう。 本発明のいくつかの態様では、PPO遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号5に よって表される部分配列中の1〜6ヌクレオチドが異なる点を除いて、野生型A.th alianaのPPO遺伝子の配列と同一である。その相違は、配列番号2のアミノ酸配列 に対して好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個が変化する突然変異をコ ードするだろう。 本発明のいくつかの態様では、PPO遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号6に よって表される部分配列中の1〜6ヌクレオチドが異なる点を除いて、野生型Zea mays（トウモロコシ）のPPO遺伝子の配列と同一である。その相違は、配列番号3 のアミノ酸配列に対して好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個が変化す る突然変 異をコードするだろう。 突然変異株RS-3は、クラミドモナスジェネティクスセンター（Chlamydomonas Genetics Center；所在地：米国27708-1000ノースカロライナ州ダラム、デュー ク大学、ボックス91000、植物学科、DCMBグループ）に登録番号GB-2674として保 存されている。したがって突然変異株RS-3は許可があれば公に分譲されうる。核 酸配列番号4を含有する2.6kb DNA断片（配列番号10、図1の（a））は、その2.6k b DNA断片を含有する13.8kb DNA断片（図1の（d））を持つプラスミド（図2）か ら、そのプラスミドを制限酵素XhoIで消化し、3.4kb DNA断片（図1の（b））を アガロースゲル電気泳動によって単離し、その3.4kb断片を制限酵素PmaCIで消化 し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離することによって容易に調製で きる。後述するように、プラスミドpBS-Eco13.8を含有する宿主微生物もブダペ スト条約に基いて寄託されており、したがって自由に入手できる。この微生物が 保持するプラスミドは従来の技術で容易に抽出できる。 配列番号4または配列番号5または配列番号6によって示される核酸配列は、そ れぞれChlamydomonas reinhardtii、Arabidopsis thalianaおよびトウモロコシ 由来のクロロプラスト中に局在すると考えられるPPOタンパク質をコードする遺 伝子の配列の一部である。これらの配列は植物クロロプラストPPO酵素間で高度 に保存されたアミノ酸ドメインに相当する。したがって、PPO活性を持つタンパ ク質をコードするDNA断片を単離し、その断片について配列番号4または配列番号 5または配列番号6と相同性を持つドメインを同定することにより、PPO阻害性除 草剤に対する耐性を持つように 修飾して本発明方法で使用することのできるDNA断片を得ることが可能である。 次に、アミノ酸配列番号1または配列番号2または配列番号3のVal13の位置にアミ ノ酸置換（例えばValからMetへの置換）をもたらす特定の塩基対置換（例えば配 列番号4のG37からA37（GTGからATG）への置換）を導入することができる。 PPO活性を持つタンパク質をコードする該DNA断片は、例えば次の方法で得るこ とができる：（1）関心ある植物材料からcDNAライブラリーを調製し、（2）PPO 活性が欠損している突然変異型宿主生物にその活性を供給できるクローンを同定 する。上述したcDNA発現ライブラリーのスクリーニングに使用でき、かつ、その PPO活性欠損突然変異体を入手しうるか容易に作出しうる好適な宿主生物には、E .coli（Sasarmanら，J.Gen.Microbiol.113:297（1979））、Salmonella typhimu rium（ネズミチフス菌）（Xuら，J.Bacteriol.174:3953（1992））およびSaccha romyces cerevisiae（サッカロミセス・セレビシェ）（Camadroら，Biochem.Bio phys.Res.Comm. 106:724（1982））などがあるが、これらに限られるわけではな い。このようにして得られたDNA断片は、その発現時に受容植物細胞にPPO阻害性 除草剤耐性を付与するために、任意の既知の形質転換法で導入することができる 。該DNA断片は、それだけを、または除草剤耐性PPOコード配列を含むそのDNA断 片と、そのPPOコード配列に作動しうるように連結されたプロモーター（とくに 植物内で活性なプロモーター）および/またはその配列に作動しうるように連結 されたシグナル配列（ここに該シグナル配列は上記DNA断片によってコードされ るタンパク質をクロロプラストに向かわせる能力を持つものとする）を含んでな るキメラ遺伝子コンストラクトの形で、植物または藻類の細胞 に導入できる。別法として、該DNA断片またはキメラ遺伝子コンストラクトをプ ラスミドまたは他のベクターの一部として植物細胞に導入することもできる。 改変されたPPOコード配列の存在ゆえにPPO阻害性除草剤に対して耐性な植物細 胞は、その植物細胞の集団を、非形質転換植物細胞の生育を通常阻害する量のPP O阻害性除草剤を含有する培地で生育することによって単離できる。該DNA断片ま たはそのDNA断片を含有するキメラ遺伝子が形質転換に選択的なマーカーに連結 されている場合は、まずその選択マーカーを利用して形質転換細胞を単離するこ とができる。次に、上述したように、その形質転換細胞からPPO阻害性除草剤耐 性細胞が単離される。 このようにして得られたPPO阻害性除草剤耐性細胞は、既知の植物細胞および 組織培養法によって増殖されうる。PPO阻害性除草剤耐性植物は、そのようにし て得られた植物細胞および組織培養から、やはり既知の方法を使用して、植物を 再生することによって得ることができる。 本発明のさらなる応用可能範囲は下記の実施例から明らかになるだろう。しか し下記の実施例は本発明の好ましい態様を示すものではあるが、それらは例示を 目的として記載されるに過ぎないと理解すべきある。本発明の様々な変法や変更 態様はこの詳細な説明から当業者には明らかになるであろうし、それらの変更態 様は請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれると見なされるべきで ある。 一般的方法 アラビドプシスバイオロジカルリソースセンター（Arabidopsis Biological R esource Center（ABRC）；米国43210オハイオ州コロンバス、ニールアベニュー1735）、 ノッティンガムアラビドプシスストックセンター（Nottingham Arabidopsis Sto ck Center（NASC）；英国NG72RDノッティンガム、ユニバーシティパーク、ノッ ティンガム大学生命科学科）または仙台シロイヌナズナ種子保存センター（日本 980仙台市青葉山、宮城教育大学生物学科）などの保存センターから入手したAra bidopsis thalianaなどの関心ある種の葉と茎を含む植物組織を液体窒素で凍結 した後、ワーリングブレンダーで機械的に、または乳鉢と乳棒を使ってホモジナ イズする。液体窒素を蒸発させた後、そのホモジネートからRNAを抽出すること ができる。この操作には市販のRNA抽出用キットを使用できる。従来のエタノー ル沈殿法によりその抽出物から全RNAを回収する。次に、このようにして得た全R NAから、市販のオリゴdTカラムなどといった従来の方法で、ポリA RNA画分を分 離する。このようにして得たポリA RNA画分から標準的な方法に従ってcDNAを合 成する。この操作には市販のcDNA合成用キットを使用できる。このようにして得 られたcDNAは、そのcDNAに適当なアダプター（例えばEcoRIアダプター）をT4 DN Aリガーゼで連結した後、適当な制限酵素（EcoRIなど）で消化された発現ベクタ ー（好ましくはλgt11などのλファージベクター）にクローニングされる。この 操作にはcDNAライブラリー調製用の市販キットを使用でき、またin vitroパッケ ージング用および形質導入用の市販キットも使用できる。 このようにして得たcDNAライブラリーを増幅した後、例えばMiyamotoら（J.Mo l.Biol. 219:393（1991））やNishimuraら（Gene 133:109（1993））によって記 述さ れているPPO遺伝子（hemG遺伝子座）について欠失を持つE.coliの突然変異株（ 例えばSASX38株；Sasarmanら，J.Gen.Microbiol.113:297（1979））を、該cDNA ライブリーに感染させ、次いでLB平板などの適当な寒天培地平板に接種して、2 日間培養する。宿主細胞はそのhemG−表現型（PPO遺伝子を欠く）ゆえに制限さ れた生育を示し、寒天平板上で小さなコロニーを形成するが、（例えばArabidop sis PPOをコードする）cDNAからPPO活性を発現する形質転換細胞は非形質転換細 胞より速い生育を示して相対的により大きなコロニーを形成する。これらのより 大きいコロニーを単離することにより、植物PPOをコードするcDNAを保持したE.c oli宿主細胞を得ることができる。 次に、そのクローン化DNAを含有するベクターを回収する。例えば、UV光にば く露され溶菌した宿主細胞からλファージを回収する。最長のインサートを持つ クローンを陽性cDNAクローンとして単離するために、回収されたベクターを従来 の方法（例えば渡辺および杉浦「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：クロ ーニングとシークエンシング」180〜189頁，農村文化社（1989）））に従って分 析する。 このようにして得たcDNAクローンのインサートは、標準的な方法（例えばShor tら，Nucleic Acids Research 16:7583（1988））に従って、そのベクターから 回収し、市販のプラスミドベクター（例えばpUC118やpBluescript）にサブクロ ーニングできる。このようにプラスミドベクターに再クローニングされたインサ ートの一連の欠失体は、標準的な方法（例えばVieiraおよびMessing，Methods i n Enzymol. 153:3（1987））に従って調製できる。インサートまたはインサート の一部を含有するそれら クローンはジデオキシ連鎖終結法（例えばSangerら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A . 74:5463（1977））によるヌクレオチド配列の決定に使用される。この配列決定 作業には市販のキットを使用できる。 このようにして得られたDNA断片（好ましくは配列番号4〜6などのPPOコード配 列の保存されたドメインを含むDNA断片の一部）は、PPO活性を持つタンパク質ま たはそのタンパク質の一部をコードする他のDNA断片を単離するために、興味あ るゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーをスクリーニングする際のプ ローブとして使用できる。また、配列番号4〜6などのPPOコード配列の保存され たドメインは、適当なプライマーを使用して既知のPCR法（例えばPCR Protocols .a Guide to ンディエゴ））によって増幅でき、PPOコード配列の保存されたドメインに相当 するそのPCR産物は、PPO活性を持つタンパク質全体またはそのタンパク質の一部 をコードする他のDNA断片を単離するために、関心あるゲノムDNAライブラリーま たはcDNAライブラリーをスクリーニングする際に使用できる。 また、PPO活性を持つタンパク質をコードするDNA断片は、Molecular Cloning コールドスプリングハーバー））に記述されているような従来の遺伝子操作法を 用いて、PPO阻害性除草剤に対して耐性な突然変異細胞から単離することもでき る。例えば、 ニア州サンディエゴ））の610〜613頁に記述されているようなプロトコルに従っ て、 その除草剤耐性がPPOを除草剤耐性にする突然変異によってもたらされている単 細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのRS-3突然変異株からゲノムDNAを抽出でき る。すなわち、C.reinhardtii細胞を溶解し、そのDNAをプロテアーゼと界面活性 剤（SDSやサルコシルなど）との処理によって抽出する。次に、ゲノムDNAを遠心 分離やフェノール-クロロホルム抽出などを含む従来の技術で抽出することによ ってタンパク質を除去した後、そのDNAをエタノール沈殿によって回収する。こ のようにして得たDNAをヨウ化ナトリウム-臭化エチジウム密度勾配遠心法によっ てさらに精製し、核ゲノムDNAに相当する最下部の主要バンドを回収する。この ようにして得た核ゲノムDNAを適当な制限酵素（例えばSau3AI）で部分消化する 。このようにして得たDNA断片の両端にT4 DNAリガーゼを用いてリンカーまたは アダプターを結合する。必要なら、過剰の遊離リンカーまたはアダプターはゲル ろ過によって除去でき、次いでそれら断片を適当な市販のコスミドベクターまた はλファージ由来のファージベクターに挿入することができる。in vitroパッケ ージング法で生成したファージ粒子をE.coliにトランスフェクトし、固体培地で コロニーまたはプラークを形成させる。ハイブリッドコスミドを保持する個々の E.coliクローンを単離し維持することによってインデックスト（indexed）ゲノ ムDNAライブラリーを得ることができ（例えばZhangら，Plant Mol.Biol.24:663 （1994））、また混合物中のE.coliクローンまたはファージ粒子を単離および維 持するための従来の方法により該ライブラリーを保存しておくこともできる。 PPO阻害性除草剤に対する耐性を付与するrs-3突然変異を保持する遺伝子配列 を含 有するゲノムクローンは、PPO遺伝子によってコードされる推定アミノ酸配列に 対応するように合成されたオリゴヌクレオチドプローブでそのゲノムDNAライブ ラリーをスクリーニングすることにより、そのライブラリーから単離できる。こ のプローブは放射性同位体または蛍光タグで標識でき、コロニーハイブリダイゼ ーション法で目的のDNA断片を含有するゲノムDNAクローンを同定するために使用 できる（Sambrook （ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））。別法として、Chlamydomona s reinhardtiiのポルフィリン性除草剤感受性株をこの生物に通常使用される形 質転換技術（例えばKindle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1228（1990）；Boyn tonおよびGillham，Methods in Enzymol.,Recombinant DNA,Part H,217:510，Wu 編， ラリー由来のゲノムDNAで形質転換して、ポルフィリン性除草剤に対する耐性を 付与できる核ゲノムDNA断片を含有するハイブリッドコスミドを単離することに より、該DNA断片を含有するゲノムクローンをスクリーニングすることもできる だろう。上述したプロトコルの一つで同定されたハイブリッドコスミドクローン の制限地図は、いくつかある標準的方法のいずれを使っても決定できる。種々の 制限断片をpBluescriptベクターにサブクローニングし、常態では感受性であるC hlamydomonas株にポルフィリン性除草剤耐性を付与したサブクローンを同定する 。後述する一例では、PPO阻害性除草剤に対して耐性なPPO酵素の一部をコードし 感受性野生型細胞にPPO阻害性除草剤耐性を付与できる2.6kb DNA断片と、このDN A断片を含有するプラスミドが単離 される。このDNA断片とプラスミドを出発物質として、そのDNA断片のヌクレオチ ド配列を、MaxamおよびGilbertの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:560（197 7））か、Sangerの方法（SangerおよびCoulson，J.Mol.Biol.94:411（1975）；S angerら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463（1977））またはこの方法の改良 法で決定する。 このようにして得られた除草剤耐性PPO酵素をコードするDNA断片中の除草剤耐 性突然変異は、感受性野生型遺伝子の対応する配列を決定し、両配列を比較する ことによって同定できる。対応する野生型遺伝子は上述したような数種類の方法 によって単離できる。別法として、このようにして得た除草剤耐性PPO遺伝子を コードするゲノムDNA断片のエクソン配列は、その配列を、そのタンパク質産物 がクロロプラストに局在するPPO遺伝子の既知配列と比較することによって決定 できる。例えば、PPO活性を持つタンパク質とクロロプラスト指向性シグナルペ プチドとをコードするArabidopsisおよびトウモロコシの各cDNA配列を既知配列 として使用できる。次に、Chlamydomonas reinhardtiiの高G+C含量核DNA用に開 発された後述のようなPCR法によって、そのエクソンを野生型ゲノムDNAから増幅 できる。関心あるエクソンに対応する増幅されたDNA断片の野生型配列は、ds DN Aサイクルシークエンシングシステム（GIBCO BRL,Life Technologies社）などの 市販の配列決定用キットで決定できる。 標準的な形質転換法を用いて、RS-3突然変異株から単離されたDNA断片が感受 性細胞にPPO除草剤耐性を付与することを示すことができる。また、そのDNA断片 が、 クロロプラスト中に局在すると思われるPPO活性を持つタンパク質またはそのタ ンパク質の一部をコードすることも示すことができる。さらに、そのDNA断片に は、クロロプラストPPOタンパク質コード配列の保存されたドメイン内にある配 列番号4の配列を持つヌクレオチドが含まれ、配列番号4の塩基G37は、RS-3突然 変異株由来のDNA断片ではＡに置換されており（すなわちGTG→ATG）、したがっ て配列番号1のVal13はこの除草剤耐性PPOタンパク質ではMetに変化している。 後述するように、PPO活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコ ードするＤＮＡ断片の配列を、該タンパク質がChlamydomonasのRS-3突然変異株 から単離されるDNA断片にコードされるPPOタンパク質と同様の様式で除草剤耐性 になるように変化させる方法はいくつかある。例えば、RS-3突然変異株中の除草 剤耐性PPOに認められるものと等価なアミノ酸変化は、KramerとFritsが記述した ギャップトデュプレックス法（Methods in Enzymol.154:350（1987））や、Kunk el（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:488（1995））またはKunkelら（Methods in Enzymol. 154:367（1987））が記述した方法に必要であれば適当な改良を加えた 指定部位突然変異誘発法によって、人工的に作成することができる。 別法として、上述のようにして得られる除草剤感受性PPOをコードするDNA断片 を、in vivo突然変異誘発法（例えばMiller，Experiments in Molecular Geneti cs , Laboratory（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））に従って突然変異 させる こともできる。標準的なin vitro突然変異誘発法も使用できる（例えばShortie ら，Methods in Enzymol.100:457（1983）；Kadonagaら，Nucleic Acid Researc h 13:1733（1985）；Hutchinsonら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:710（1986） ；Shortieら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:1588（1982）；Shiraishiら，Gene 64:313（1988））。RS-3突然変異体と等価なアミノ酸変化を含む突然変異させ た断片は、それがin vivoでPPO除草剤耐性を付与するかどうかを知るために、単 離して調べることができる。突然変異させた遺伝子のPPO阻害性除草剤耐性を調 べるには、野生型Chlamydomonas reinhardtiiの細胞などといった除草剤感受性 細胞を標準的な方法によりその突然変異PPO遺伝子で形質転換し、PPO阻害性除草 剤耐性がその突然変異PPO遺伝子によって付与されるかどうかを調べればよい。 このようにして得た除草剤耐性PPO遺伝子は、それだけで、またはキメラDNAコ ンストラクトの形で、植物または藻類の細胞に導入できる。キメラDNAコンスト ラクト中の除草剤耐性PPO遺伝子には、植物中で活性なプロモーターを作動しう るように融合できる。植物または植物細胞中で機能しうるプロモーター（すなわ ち植物細胞中でPPOなどの付随する構造遺伝子の発現を駆動しうるもの）の例に は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）19Sまたは35SプロモーターとCaMV二 重プロモーター（Mitsuharaら，Plant Ce1l Physiol.37:49（1996））、ノパリ ンシンテターゼプロモーター（Fraleyら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4803（ 1983））；病原体関連（pathogen related；PR）タンパク質プロモーター（Resu lts and Problems in Cell 179頁、Somssich著「Plant Promoters and Transcription Factors」1994）；リ ブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ssuRUBISCO）をコードす る遺伝子のプロモーター（Brogheら，Biotechnology 1:55（1983））、イネのア クチンプロモーター（McElroyら，Mol.Gen.Genet.231:150（1991））およびトウ モロコシのユビキチンプロモーター（EP 0 342926；Taylorら，Plant Cell Rep. 12:491（1993））がある。発現されたPPO酵素の望ましい作用部位への輸送を指 示するために、キメラDNAコンストラクト中の除草剤耐性PPOコード配列にシグナ ルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列を融合できる。シグナ ルペプチドの例には、例えばPR-1、PR-2などの植物の感染特異的（PR；pathogen esis-related）タンパク質に連結しているもの（例えばPayneら，Plant Mol.Bio l. 11:89（1988）を参照されたい）がある。トランジットペプチドの例には、Von Heijneら，Plant Mol.Biol.Rep.9:104（1991）やMazurら，Plant Physiol.85:1 110（1987）やVorstら，Gene 65:59（1988）に記述されているようなクロロプラ ストトランジットペプチドがある。 コンストラクトはさらに、形質転換に選択的なマーカーをコードする配列を含 んでもよい。選択マーカーの例には、除草剤耐性、抗生物質耐性または薬剤耐性 （例えばハイグロマイシン（GritzおよびDavies，Gene 25:179（1983））、カナ マイシン（Mazodierら，Nuc.Acid.Res.13:195（1985））、G418（Colbere-Garap inら，J.Mol.Biol.150:1（1981））、ストレプトマイシン（ShuyおよびWalter，J.Bacteriol. 174:5604（1992））、スペクチノマイシン（Taitら，Gene 36:97（ 1985））、メトトレキセート（Andrewsら，Gene 35:217（1985））、グリフォセ ート（Comaiら，Science 221:370（1983））、ホスフィノスリシン（Thompsonら，EMBO J.6:2519 （1987）、DeBlockら，EMBO J.6:2513（1987））などに対する耐性）を与えるペ プチドがある。これらのマーカーは、そのキメラDNAコンストラクトで形質転換 された細胞を非形質転換細胞のバックグラウンドから選択するために使用できる 。他の有用なマーカーは、可視的な呈色反応によって容易に検出されうるペプチ ド酵素、例えばルシフェラーゼ（Owら，Science 234:856（1986））、β-グルク ロニダーゼ（Jeffersonら，Proc.Natl.Acad.Sci.83:8447（1986））、β-ガラク トシダーゼ（Kalninsら，EMBO J,2:593（1983）、Casadabanら，Methods Enzymo l. 100:293（1983））などである。 除草剤耐性PPO遺伝子または除草剤耐性PPO遺伝子を含むキメラDNAコンストラ クトは、宿主細胞に形質転換され複製されうるベクターに挿入することができる 。好適な宿主細胞の例にはE.coli、酵母などがある。好適なベクターの例には、 pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121（すべてClontech社（カリフォルニア州パ ロアルト）製）、pBluescript（Stratagene社（カリフォルニア州ラホーヤ）） 、pFLAG（International Biotechnologies社（コネティカット州ニューヘーヴン ））、pTrcHis（Invitrogen社（カリフォルニア州ラホーヤ））またはそれらプ ラスミドの誘導体がある。 このようにして得た、除草剤耐性PPO遺伝子またはキメラDNAコンストラクトを 含むプラスミドベクターもしくはそのベクター中に含まれるインサートは、Agro bacterium（アグロバクテリウム）トランスフェクション法（特公平2-58917号公 報）、プロトプラストを用いるエレクトロポレーション法（特開昭60-251887号 公報お よび特開平5-68575号公報）または粒子銃法（特表平5-508316号公報および特開 昭63-258525号公報）によって植物細胞に導入できる。得られた形質転換植物細 胞は、従来の植物細胞および組織培養法に従って単離、培養できる。除草剤耐性 植物は、例えば内宮著「植物遺伝子操作マニュアル−トランスジェニック植物の 作り方」（27〜55頁，1990，講談社サイエンティフィク，ISBN4-06-1535137C304 5）に記述されているような既知の方法に従って、培養細胞または培養組織から 再生できる。 該DNA断片またはそのDNA断片を含むキメラ遺伝子またはそのDNA断片を含むプ ラスミドが形質転換用の選択マーカーを含有する場合は、そのマーカーを利用し て形質転換細胞を単離することができ、PPO阻害性除草剤耐性を持つように形質 転換された細胞は上述のように単離できる。 このようにして調製した除草剤耐性PPO遺伝子のPPO阻害性除草剤耐性付与能力 は、その遺伝子を除草剤感受性細胞（例えば野生型Chlamydomonas reinhardtii 細胞）に標準的形質転換法で導入し、そこでその遺伝子を発現させることによっ て、調べることができる。別法として、（1）PPO遺伝子を欠く微生物に除草剤耐 性PPO遺伝子を導入し、（2）PPO活性を発現して通常の寒天培地上で非形質転換 細胞よりもよく生育する形質転換体を選択し、（3）培地に添加したPPO阻害性除 草剤の形質転換体の生育に対する活性を試験し、（4）除草剤耐性PPO遺伝子によ って救出される形質転換体の除草剤許容度を、除草剤感受性PPO遺伝子によって 救出されるものと比較することによって、除草剤耐性を決定してもよい。 また本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に対する試験化合 物の阻 害効果を評価する方法と、試験化合物のなかからPPOを阻害するものを選択する 方法を具体化する。これらの方法では遺伝子操作法によって作成される上述の除 草剤耐性PPO遺伝子またはその誘導体を利用する。 PPOに対するある化合物の阻害効果を評価する方法は、（a）試験化合物の存在 下に微生物を培養する段階を含む。培養される微生物は「感受性微生物」と「耐 性微生物」である。感受性微生物は、高等植物、動物、微生物などに由来するPP O阻害性除草剤感受性のPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を発現する 。「感受性微生物」には、PPOを欠く突然変異体へのPPO阻害性除草剤感受性PPO 遺伝子の導入後に生育能を回復する形質転換体と、PPO阻害性除草剤感受性PPO遺 伝子を持つ非形質転換体が含まれる。「耐性微生物」は、PPO阻害剤に耐性なPPO 活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を持つ。耐性微生物は、試験化合物（ 例えばポルフィリン性除草剤に分類される化合物）の存在下に、活性なPPOを欠 く突然変異体への本発明DNA断片の導入後に生育能を回復する形質転換体として 作出される。感受性微生物と耐性微生物の両方の生育を評価することによって、 PPOに対するその試験化合物の阻害活性を決定する。 PPO阻害性除草剤を選択する方法は、感受性微生物と耐性微生物（これらは感 受性微生物がPPO阻害剤感受性のPPO活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を 保持することを相違点とする）を培養する段階を含む。耐性微生物は、PPOを欠 く突然変異体に本発明の耐性付与法で使用されるDNA断片またはその等価物を導 入した後に生育能を回復する形質転換体として作出される。その感受性微生物と 耐性微生物を試験化合 物（例えばポルフィリン性除草剤に分類される化合物）の存在下で培養し、ある 特定の用量で感受性微生物の生育だけを阻害し、耐性微生物の生育を許す化合物 を同定する。 PPOを阻害しない除草剤を選択する方法は、感受性微生物と耐性微生物を試験 化合物（例えばポルフィリン性除草剤に分類される化合物）の存在下で培養し、 感受性微生物と耐性微生物の両方の生育を阻害する化合物を同定することからな る。 本発明方法によってPPO阻害性除草剤に対して耐性になった作物用植物は、PPO 阻害性除草剤感受性植物の生育を阻害するのに有効な量のPPO阻害性除草剤を適 用することによってそれら除草剤に感受性である植物を防除するために、PPO阻 害性除草剤の存在下に栽培することができる。適用されるPPO阻害性除草剤の例 は、上記一般式X-Qで示される除草剤群と、具体的に名前を挙げた上述の化合物 である。 以下、具体例を挙げて、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（PPO）活性 に対する試験化合物の阻害効果を評価する方法をさらに説明する。 まず、導入された除草剤感受性PPO遺伝子をlacZプロモーターの制御下にE.col iで発現させるためのベクターを、pUC118などの市販プラスミドベクターの多重 クローニング部位に該遺伝子を挿入することによって調製する。そのようにして 調製したプラスミドを例えばPPO遺伝子（hemG遺伝子座）を欠くE.coliの突然変 異株（例えばSASX38株）に導入する。次にそのE.coli細胞を、アンピシリンとIP TGを含むLB寒天平板に接種し、約2日間培養して、コロニーを形成する除草剤感 受性形質転換体を得る。除草剤感受性PPO遺伝子は、天然の除草剤感受性遺伝子 をクローニングするか、元々耐性なPPO遺伝子を遺伝子操作法で操作して除草剤 感受性PPO酵素を作成するこ とによって得ることができる。除草剤感受性E.coli形質転換体は、プロトポルフ ィリノーゲンオキシダーゼ活性に対する試験化合物の阻害効果を評価する方法で 、陰性対照として使用できる。もちろん、除草剤感受性PPO遺伝子を持つ非形質 転換天然微生物も、この目的での陰性対照として使用できる。 あるいは、除草剤耐性PPO遺伝子をlacZプロモーターの制御下にE.coliで発現 させるためのベクターを、pUC118などの市販プラスミドベクターの多重クローニ ング部位に該遺伝子を挿入することによって調製する。そのようにして調製され たプラスミドを、例えば活性なPPO遺伝子（hemG遺伝子座）を欠くE.coliの突然 変異株（例えばSASX38株）に導入する。次にそのE.coli細胞を、アンピシリン、 IPTGおよび除草剤を含むLB寒天平板に接種し、約2日間培養して、コロニーを形 成する除草剤耐性形質転換体を得る。該除草剤耐性PPO遺伝子は、天然の除草剤 耐性遺伝子をクローニングするか、遺伝子操作法でPPO遺伝子を操作して除草剤 耐性PPO酵素をコードする遺伝子を作成することによって得ることができる。天 然の除草剤耐性PPO遺伝子の例は、Nishimuraら，J.Biol.Chem.270:8076（1995） に記載のヒトPPO遺伝子と、Sasarmanら，Can.J.Microbiol.39:1155（1993）に記 載のE.coli PPO遺伝子である。除草剤耐性耐性E.coli形質転換体は、プロトポル フィリンオキシダーゼ活性に対する試験化合物の阻害効果を評価するための本方 法において、陽性対照として使用できる。 除草剤感受性形質転換体と除草剤耐性形質転換体の両方を、ある範囲の濃度の 試験化合物（例えばポルフィリン性除草剤に分類される化合物）を含むLB寒天平 板などの寒天培地で、個別に約2日間培養する。試験化合物による両種類の形質 転換体の生育阻害 は、寒天平板における両種類の形質転換体のコロニー形成に対する試験化合物の 効果を観察することによって測定できる。別法として、両形質転換体タイプを様 々な濃度の試験化合物を含む液体培地で生育し、その培養物の濁度を測定するこ とによって、それらの生育を決定することもできる。プロトポルフィリノーゲン オキシダーゼ活性に対する試験化合物の阻害効果は、2種類の形質転換体の生育 を比較することによって評価できる。PPO阻害剤は、感受性形質転換体の生育を 遅くするが、耐性形質転換体の生育を遅くしない化合物である。 本明細書において「感受性」および「耐性」という用語がPPO阻害剤に関連し て使用される場合、これらの用語は、生育とそれに関連する現象に関して絶対的 な反応と相対的な反応を両方を含意する。すなわち、感受性対照と耐性対照のPP O活性に対する試験化合物の阻害効果に有意な相違が存在する場合（例えば、そ の試験化合物の存在下に個別に生育された感受性微生物と耐性微生物の生育に有 意な相違が存在する場合）は、本発明のアッセイ法で適当な濃度のPPO阻害剤を 適用することによって、PPO遺伝子によってコードされる酵素のPPO阻害剤に対す る耐性と感受性を調べることができる。また、PPO活性に対するPPO阻害剤の阻害 効果は、PPO阻害剤に対する感受性が異なるPPO酵素をコードするPPO遺伝子を保 持する2種類またはそれ以上の微生物を使って調べることができる。 本発明のさらなる応用可能範囲は、下記の実施例から明らかになるだろう。し かし下記の実施例は本発明の好ましい態様を示すものではあるが、それらは例示 を目的として記載されるに過ぎないと理解すべきある。本発明の様々な変法や変 更態様はこの詳細な 説明から当業者には明らかになるであろうし、それらの変更態様は請求の範囲に よって定義される本発明の範囲に含まれると見なすべきである。 実施例1 Arabidopsis thaliana cDNAライブラリーの構築 野生型Arabidopsis thaliana生態型コロンビア研究所株（仙台シロイヌナズナ 種子保存センター（宮城教育大学生物学科（日本980仙台市青葉山）から入手で きる）を種子から栽培し、温室で20日間の栽培後に生の葉を集める。集めた生の 葉5gを10mlの液体窒素で凍結した後、乳鉢と乳棒で細粉にすりつぶす。液体窒素 を蒸発させた後、市販のRNA抽出用キット（Extract-A-PLANT^TMRNA ISOLATION KI T；Clontech社）を使ってRNAを抽出し、その抽出物からエタノール沈殿法により 全RNA（約1mg）を回収する。次に、このようにして得た全RNAから、市販のオリ ゴdTカラム（5'→3'）を使って、約50μgのポリA＋RNA画分を分離する。該ポリA ＋RNA画分から、市販のcDNA合成キット（cDNA Synthesis System Plus；Amersha m社）を使ってcDNAを合成できる。このようにして得たcDNAに市販のT4リガーゼ （宝酒造株式会社）でEcoRIアダプターを連結した後、EcoRIで消化されたλgt11 （Stratagene社）と市販のin vitroパッケージングキット（GIGA PACK II Gold ；Stratagene社）を使用して、λファージベクター中にcDNA発現ライブラリーを 調製することができる。 実施例2 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするcDNAクローンのスクリーニ ング 実施例1で得た増幅Arabidopsis thalina cDNAライブラリーまたは市販のトウ モロコシcDNAライブラリーを使って、PPO遺伝子（hemG遺伝子座）を欠くE.coli の突然変異株（Sasarmanら，J.Gen.Microbiol.113:297（1979）に記載のSASX38 株など）を形質転換し、その細胞をLB寒天培地平板に塗布し、2日間培養する。 それら宿主細胞は、そのhemG−表現型（PPO遺伝子を欠く）ゆえに、寒天平板上 で制限された生育を示し、小さなコロニーを形成する。PPO機能が修復されてい るコロニーは、PPO cDNAによる補完ゆえに相対的により大きく、容易に単離され る。渡辺および杉浦「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：クローニングと シークエンシング」（180〜189頁，農村文化社（ISBN4-931205-05 C3045）（198 9））に記載の方法に従って、そのようなSASX38形質転換体からファージを収集 し、最長のcDNAインサートを持つクローンをPPO陽性cDNAクローンとして選択す る。 実施例3 プロトポルフィリンオキシダーゼをコードするcDNAのプラスミドベクターへの再 クローニングとヌクレオチド配列の決定 実施例2で得た陽性cDNAクローンを、Shortら，Nucleic Acids Research 16:75 83（1988）に記述されているような標準的方法に従って、プラスミドベクターpU C118（宝酒造株式会社）に再クローニングする。次に、そのプラスミドをEcoRI （宝酒造株式会社）で切断し、アガロースゲル電気泳動によってPPO cDNAの分子 サイズを決定 する。 次に、このようにして該プラスミドベクター中に再クローニングされたインサ ートの一連の欠失体は、VieiraおよびMessing，Methods in Enzymol.153:3（198 7）に記述されているような標準的方法に従って調製できる。これらの欠失体を 使用し、Sangerら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463（1977）に記述されてい るようなジデオキシ連鎖終結法により、Sequenaseバージョン2キット（U.S.Bioc hemical Corp.）を使ってcDNAインサートのヌクレオチド配列を決定する。別法 として、数種類のシークエンス用プライマーを合成して、インサートの全配列を 決定する。 実施例4 Chlamydomonas reinhardtiiゲノムDNAライブラリーの構築 単細胞藻類Chlamydomonas reinhardtii（クラミドモナスジェネティクスセン ター，GB-2674株）のポルフィリン性除草剤耐性突然変異株（RS-3）を、200μMm^-2 s^-1PAR冷白色蛍光下に振盪しながらTAP液体培地中、25℃で5日間、混合栄養法 で培養した。TAP培地は7mM NH₄Cl、0.4mM MgSO₄、0.34mM CaCl₂、25mMリン酸カ リウム、0.5mMトリス（pH7.0）、1ml/L Hutner微量元素、1ml/L氷酢酸からなり エゴ））の576〜577頁に記載）、さらに0.03μMの化合物Aをも含んだ。定常増殖 期初期の6リットルの細胞培養（7.6×10⁶細胞/ml）を収集した。細胞を遠心分離 （8,000×g、10分間、4℃）によって集め、10mMトリス-HCl、10mM EDTA、 150mM NaClからなるTEN緩衝液（pH8.0）50mlに再懸濁し、再び遠心分離し、再び 50mlのTEN緩衝液に再懸濁した。5mLの20％（w/v）SDS、5mlの20％サルコシルお よび4mlのプロテアーゼ溶液（総体積100mlの脱イオン蒸留水中、5gのプロテアー ゼ（Boehringer Mannheim No.165921）、10mlの1Mトリス-HCl（pH7.5）および0. 11gのCaCl₂からなる）を添加することにより、細胞を溶解した。その細胞溶解液 を、テフロン翼を持つ瓶中、4℃で24時間ゆっくり回転させることによって混合 した。次にフェノール-CIA（フェノールを予めTEN緩衝液で飽和させ、等量のク ロロホルム：イソアミルアルコール（24:1，v/v）とよく混合したもの）60mlを 加え、その内容物を同じ瓶中、室温で1時間回転させた。 次に水相とフェノール相を遠心分離（15,000×g、20分間、室温）によって分 離し、その水相（上相）を回収し、2体積の95％（v/v）エタノールと穏やかにし かし十分に混合し、その内容物を終夜−20℃に置くことによって、DNAを沈殿さ せた。得られた沈殿物を遠心分離（1,500×g、20分間、4℃）によって回収し、 氷冷70％（v/v）エタノールで1回洗浄した。過剰のエタノールを除去し、DNA沈 殿物を窒素気流下に室温で5分間乾燥した。 次に、乾燥した沈殿物を60mlの10mMトリス（pH7.5）に溶解し、次に挙げるも のを減光下に加えた：10倍濃度のTEN緩衝液8ml、臭化エチジウム溶液（10mg/ml ）0.4ml、10mMトリス-HCl（pH7.5）9.8mlおよびTEN緩衝液中のヨウ化ナトリウム （NaI）飽和溶液120ml。容器を穏やかに反転させることによってその内容物を混 合し、超遠心管8本のそれぞれに25mlずつ分注した。これらをBeckman 70 Tiロー ターで 遠心分離した（44,000rpm、40時間、20℃）。遠心分離後、異なる浮遊密度のク ロロプラストバンド、ミトコンドリアバンド、核rDNAバンドおよび核ゲノムDNA バンドを長波長UV照射によって可視化した。核ゲノムDNAからなる最下部の主要 バンドを、太い針の付いた注射器を使って回収した。このバンド中のDNAを同じ 条件下に二回目の超遠心分離にかけ、精製された核DNAバンドを上述のように回 収した。 1〜2体積のTEN緩衝液で飽和したイソアミルアルコールを加えた後、そのアル コール相（上相）を捨てることにより、回収された核DNAを含む溶液から臭化エ チジウムを抽出した。この操作を3回繰返した後、2.5体積の氷冷エタノールの添 加によって、臭化エチジウムが除去された核DNAを沈殿させた。回収した沈殿物 を氷冷95％（v/v）エタノールで2回洗浄し、少量の10mMトリス-HCl（pH7.5）に 再溶解し、−20℃で保存した。この試料の一部を100倍に希釈し、260nmと280nm で吸光度を測定することによってDNAの濃度と純度を定量した。 このようにして得た25μgのゲノムDNAを、50mM NaCl、10mM MgCl₂および1mMジ チオスレイトールを含む10mMトリス-HCl緩衝液（pH7.5）277μl中、37℃で15分 間、0.83単位の制限酵素Sau3AIと反応させることによって部分消化した。その反 応混合物を、トリス緩衝液（pH7.5）と平衡させた等量のフェノールで抽出した 後、等量のクロロホルムで抽出した。酢酸アンモニウム（3M）を加えて最終濃度 を0.4Mにした後、2体積の水冷95％（v/v）エタノールを添加した。この溶液を十 分に混合し、その試料を終夜−20℃で保存することにより、DNA沈殿を形成させ た。その沈殿物を卓上遠心機（10,000rpm、10分間）での遠心分離によって回収 し、70％（v/v） エタノールで洗浄し、再び遠心分離した。次に、その沈殿物を20μlのTE緩衝液 （10mMトリス-HCl、0.1mM Na₂EDTAからなる）に再懸濁し、脱イオン蒸留水70μl 、10倍濃度のCIAP緩衝液（0.5Mトリス-HCl（pH8.5）、1mM EDTAからなる）10μl およびCIAP（ウシ腸アルカリホスファターゼ）1単位を添加することにより、そ のDNAを脱リン酸化した。総体積100μlを37℃で60分間インキュベートし、0.5M EDTA（pH8.0）3μlの添加と68℃で10分間の熱処理により、反応を停止した。そ のDNAを、上述のようにフェノールおよびクロロホルム抽出にかけ、酢酸アンモ ニウムを含むエタノールの添加によって沈殿させた。 沈殿物を70％（v/v）エタノールで洗浄し、回収したDNAをTE緩衝液に最終濃度 が0.5μg/mlとなるように再溶解した。次に、市販のコスミドベクターSuperCos- 1（Stratagene社）を、その製造者が提供するSuperCos-1使用説明書に概説され ているプロトコルに従って調製した。そのベクターを制限酵素XbaIで消化し、CI APで脱リン酸化し、制限酵素BamHIで再び消化し、エタノール沈殿によって回収 し、TE緩衝液に最終濃度が1μg/mlとなるように再溶解した。調製済ゲノムDNA断 片（2.5μg）を、20μlの反応緩衝液（1mM ATP、50mMトリス-HCl（pH7.5）、7mM MgCl₂、1mMジチオスレイトールからなる）中、2単位のT4 DNAリガーゼを添加し 、4℃で終夜インキュベートすることによって、1μgの調製済SuperCos-1ベクタ ーに連結した。次に、in vitroファージパッケージングキット（Gigapack II XL ；Stratagene社）を、提供された使用説明書に概説されているプロトコルに従っ て使用することにより、上述のように作成したハイブリッドコスミド（0.5μg） をラムダファージ粒子に パッケージングした。 次に、これらのハイブリッドコスミドを保持するラムダファージ粒子を、後述 の方法によってE.coli NM554株（Stratagene社）にトランスフェクトし、50μg/ mlアンピシリンを含むLB培地（10g/L NaCl、10g/Lバクトトリプトン、5g/L酵母 エキス、pH7.5、1.5％（w/v）寒天）の平板で、それらE.coli細胞にコロニーを 形成させた。トランスフェクション法は次の通りである：（1）E.coli NM544株 の単コロニーを50mlの培地（5g/L NaCl、10g/Lバクトトリプトン、pH7.4、0.2％ （w/v）マルトース、10mM MgSO₄）に接種し、37℃で終夜激しく振盪することに よって培養した；（2）細胞を遠心分離（4,000rpm、10分間、4℃）で収集し、OD₆₀₀ が0.5となるように10mM MgSO₄に再懸濁した；（3）この細菌懸濁液25μlを、 上述のように調製したハイブリッドコスミドを保持するファージ粒子溶液の1/20 希釈液25μlと混合した。その混合物を室温で30分間静置することによってファ ージをE.coliに感染させた。次に、LB培地（200μl；10g/L NaCl、10g/Lトリプ トン、5g/L酵母エキス）を加え、アンピシリン耐性の発現を見込んで、その懸濁 液を37℃で1時間インキュベートした。次にその懸濁液を50μg/mlアンピシリン を含むLB培地平板に接種し、37℃で終夜培養してコロニーを形成させた。アンピ シリンマーカーの形質転換効率は1.7±0.1×10⁵形質転換体/μg DNAだった。こ のようにして得たハイブリッドコスミドを含むE.coliコロニーを滅菌した爪楊枝 で個別に拾い、マイクロタイタープレートのウェル（Falcon24ウェルプレート） に移した。各ウェルには、50μg/mlアンピシリンを含むLB培地0.5mLが入ってお り、そのプレートを振盪せずに37℃で24時間インキュベートした。 これにより10080個のクローンが420枚のマイクロタイタープレートから単離され た。次に、各ウェルがら187.5μlの培地を取り出し、1260本のマイクロチューブ にそれぞれ8クローンのプール（合計1.5ml）として混合した。各マイクロチュー ブ中の細菌を遠心分離（10,000rpm、5分間、室温）によってペレット化し、DNA 抽出操作にかけた。マイクロタイタープレートに残った細菌は、等量の30％（w/ v）グリセロールを加えた後、−70℃で凍結した。次にこれらのプレートを−20 ℃で保存した。 実施例5 PPO阻害性除草剤耐性遺伝子を単離するための形質転換によるChlamydomonas rei nhardtii由来ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングに使用される種々の実験法を以下に 記述する（方法A、B、C）。 A．DNA抽出 実施例4に記述したように作成したゲノムDNAライブラリーを保持するE.coliか らのコスミドDNAの抽出と、形質転換対照として使用したプラスミドpARG7.8（De buchyら，EMBO J.8:2803（1989））の抽出は、標準的抽出法（例えば Harbor Press（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））によって行なっ た。以下に具体的なプロトコルを説明する。 各マイクロチューブ中の細菌ペレットを溶液I（50mMグルコース、25mMトリス- HCl（pH8.0）、10mM EDTAからなる）I00μlに完全に懸濁し、そこに溶液II（0.2 N NaOH、1％（w/v）SDSからなる）200μlを加えた。各マイクロチューブに蓋を し、チューブを5〜6回反転させることによってその内容物を穏やかに混合し、そ のチューブを氷上において冷却した。次に、氷冷した溶液III（60mlの5M酢酸カ リウム（pH4.8）、11.5mlの氷酢酸および28.5mlの脱イオン蒸留水からなる）150 μlを加え、その内容物をよく混合し、チューブを水で5分間冷却した。次に各チ ューブを卓上遠心機（10,000rpm、2分間、4℃）で遠心し、その上清を回収した 。回収した上清に等量のフェノール：クロロホルム（1:1、pH7.5）を加え、ボル テックスにかけてその内容物を完全に混合し、そのチューブを再び卓上遠心機で 遠心し（10,000rpm、2分間、4℃）、上清を回収した。クロロホルムによる再抽 出の後、その上清に900μlのエタノールを加え、混合した。そのチューブを氷で 冷却することによってDNAを沈殿させ、その沈殿物を卓上遠心機での遠心分離（1 2,000×g、2分間、4℃）によって回収した。沈殿物を70％（w/v）エタノールで 洗浄し、遠心分離（12,000×g、2分間、4℃）で再び回収した。マイクロチュー ブの蓋を開けてエタノールを室温で10分間蒸発させることにより、過剰のエタノ ールを除去した。このように回収された沈殿物を50μlのTE緩衝液（10mMトリス- HCl（pH7.5）、0.1mM Na₂EDTAからなる）に再溶解してDNAを可溶化した。 B．ガラスビーズ法による形質転換 ガラスビーズ形質転換法を使用する場合は、Kindle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S .A. 87:1228（1990）に記述されている方法に従った。実際に使用したプロトコル を以下に 示す。 まず、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii CC-425株（アルギニン要求性ar g-2、細胞壁欠損性cw-15）を、TAP液体培地（7mM NH₄Cl、0.4mM MgSO₄、0.34mM CaCl₂、25mMリン酸カリウム、0.5mMトリス（pH7.0）、1ml/L Hutner微量元素、 Press（カリフォルニア州サンディエゴ））に記載））＋50μg/mlアルギニンで1 〜2×10⁶細胞/mlの細胞密度になるまで2日間、混合栄養法で培養した。その培養 物の遠心分離（8,000×g、10分間、20℃）によって細胞を収集し、少量のTAPに 再懸濁して最終密度を2.8×10⁸細胞/mlにした。 0.3gの滅菌ガラスビーズ（直径0.45〜0.52mm）が入った小さい滅菌チューブに 、この細胞懸濁液0.3mlと、0.5〜1.0μgのプラスミドまたは1〜2μgのライブラ リーDNA、0.1mlの20％（w/v）ポリエチレングリコール（PEG）を加え、穏やかに 混合した後、ボルテックスミキサーを使って15秒間高速でボルテックスした。そ のチューブを2分間静置した後、同じ方法でさらに15秒間ボルテックスした。 次にその細胞懸濁液（1プレートあたり0.2ml）を、a）TAP培地＋1.5％（w/v） 寒天（アルギニン要求性を形質転換マーカーとして使用する場合）またはb）TAP 培地＋0.1μM化合物A＋50μg/mlアルギニン＋1.5％（w/v）寒天（ポルフィリン 性除草剤耐性を形質転換マーカーとして使用する場合）のプレート2枚に接種し 、100μMm^-2s^-1光下にコロニーを形成させた。 C．粒子銃法による形質転換 粒子銃形質転換法を使用する場合は、Boynton,J.E.とGillham,N.W.が記述した 方法（Methods in Enzymol.:Recombinant DNA,Part H,217:510（1993）およびRa ndolph-Anderson,B.ら，Bio-Rad US/EG Bulletin 2015，1〜4頁，Bio-Rad Labor atories，1996）に従った。実際に使用したプロトコルを以下に示す。 まず、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii CC-48株（アルギニン要求性arg -2）を、TAP液体培地（7mM NH₄Cl、0.4mM MgSO₄、0.34mM CaCl₂、25mMリン酸カ リウム、0.5mMトリス（pH7.0）、1ml/L Hutner微量元素、1ml/L氷酢酸からな ゴ））に記載））＋50μg/mlアルギニンで1.5〜3×10⁶細胞/mlの細胞密度になる まで2日間、混合栄養法で培養した。その培養物の遠心分離（8,000×g、10分間 、20℃）によって細胞を収集し、少量のHS培地（500mg/L NH₄Cl、20mg/L MgSO₄・ 7H₂O、10mg/L CaCl₂・2H₂O、1,440mg/L K₂HPO₄、720mg/L KH₂PO₄、1ml/L Press（カリフォルニア州サンディエゴ））に記載）に再懸濁して細胞密度を1.1 4×10⁸細胞/mlにした。この細胞懸濁液のうち1mlを、予め42℃に温めておいた1m lのHS培地＋0.2％寒天（Difcoバクトアガー）が既に入っている小さい試験管に 加えた。穏やかに混合した後、その懸濁液のうち0.7mlを直ちに、50μg/μlアン ピシリンを含むHSHA寒天培地（500mg/L NH₄Cl、20mg/L MgSO₄・7H₂O、10mg/L CaC l₂・2H₂O、1,440mg/L K₂HPO₄、720mg/L KH₂PO₄、2.4g/L無水酢酸ナトリウムおよ び1ml/L Academic Press（カリフォルニア州サンディエゴ））に記載）の平板2枚に均一 に塗布し、暗所でそれらを乾燥することにより、細胞をその平板の表面に付着さ せた。 次に、金粒子（直径0.6μm）60mgとエタノール1mlをマイクロチューブに加え 、ボルテックスミキサーを使って高速で2分間ボルテックスした。次にその金粒 子を遠心分離（10,000rpm、1分間、室温）によって回収し、この洗浄操作を3回 繰返した。次に、回収した金粒子を滅菌蒸留水1mlに懸濁した。その粒子を再び 同じ遠心分離操作によって回収し、この洗浄操作を2回繰返した。最後にその金 粒子を滅菌蒸留水1mlに再懸濁した。この粒子懸濁液50μlをマイクロチューブに 加え、そこに、そのチューブをボルテックスミキサーで撹拌しながら、5μlのDN A（2μg/μl）、50μlの2.5M CaCl₂および20μlの0.1Mスペルミジン（遊離塩基 ）を順次加えた。混合を3分間続けた後、沈殿物を遠心分離（10,000rpm、室温で 10秒間）によって回収した。沈殿した金粒子を250μlのエタノールに再懸濁し、 再び同じ遠心分離操作で回収し、最終的に60μlのエタノールに再懸濁した。上 述のように調製したChlamydomonas細胞を、このようにして得たDNA被覆金粒子で 、粒子銃を記述されているように使用して射撃した（Randolph-Anderson,B.ら，Bio-Rad US/EG Bulletin 2015 ，1〜4頁，Bio-Rad Laboratories，1996）。その 後ただちに、平板の表面をガラス棒で穏やかにこすることにより、それら細胞を 寒天平板の表面からHS液体培地1.5mlに再懸濁した。この懸濁液の半分を、次の 組成を持つ選択寒天培地の平板2枚のそれぞれに塗布した：a）アルギニン要求性 を形質転換マーカーとして使用する場合は、TA培地＋1.5％（w/v）寒天を使用し た；b）ポルフィリン蓄積型除草剤に対する耐性を形質転換マーカ ーとして使用する場合は、TAP培地＋0.3μM化合物A＋50μg/mlアルギニン＋1.5 ％（w/v）寒天を使用した。次に、その平板を100μM m^-2s^-1光下に培養してコロ ニーを形成させた。 上述の実験法を使ってゲノムDNAライブラリーをスクリーニングする。スクリ ーニング操作の詳細を、独立した第一段階、第二段階および第三段階として以下 に示す。 1．一次スクリーニング ガラスビーズ法（詳細については上記を参照されたい）を使って、単細胞緑藻 受容株Chlamydomonas reinhardtii CC-425株（アルギニン栄養性arg-2、細胞壁 欠損性cw-15）をpARG7.8（プラスミドDNA）とライブラリーDNA（48クローンから 抽出したDNAの混合物）とで形質転換した。各形質転換実験の細胞の半分（3.0× 10⁷細胞）を使って、アルギニン要求性表現型によって示される形質転換頻度を 決定した。残りの半分（3.0×10⁷細胞）は獲得されたポルフィリン性除草剤耐性 について調べた。この実験を198回繰返し、全部で、そのライブラリーのクロー ン9,504個をスクリーニングした。スクリーニングした5.8×10⁹細胞から合計7,0 46個のアルギニン要求株を得た。これらアルギニン要求株コロニーのすべてが真 の形質転換体だと仮定すると、形質転換頻度は平均1.2×10^-6になった。また、 ポルフィリン性除草剤に対して耐性を示す（すなわち化合物Ａの存在下で生育す る）1クローンを得た。このコロニーはアルギニンを欠く培地でも正常に生育で き、液体培地で培養した場合は運動性の喪失を示した。 ポルフィリン性除草剤耐性を示すコロニーをもたらしたコスミドを含有する48 クローンのDNAプール（コスミドクローン2953〜3000）をCos2953〜Cos3000と呼 ぶ。 2．二次スクリーニング 次に、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii CC-48（アルギニン要求株arg-2 ）の受容株を、粒子銃法（詳細については上記を参照されたい）により、表1に 示すDNAで形質転換した。24クローンCos2953〜Cos2976を含有するDNAプールと、 それより大きいDNAプールCos2953〜Cos3000による形質転換はどちらも表1に示す ように化合物Aに対して耐性なコロニーをもたらしたが、他の2つのCosプールとp ARG7.8では耐性形質転換体は得られなかった。これは、ポルフィリン蓄積型除草 剤耐性遺伝子がCos2953〜Cos2976プール内に含まれていなければならないことを 示している。3．三次スクリーニング 次に、受容単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii CC-48株（アルギニン要求 株 arg-2）を、粒子銃（詳細に付いては上記を参照されたい）により、DNAプールCo s2953〜Cos2976を構成する個々のクローンから既述のごとく調製したハイブリッ ドコスミドDNAで形質転換した。クローンCos2955に含まれるハイブリッドコスミ ドによる形質転換だけが、化合物Aに対して耐性なコロニーをもたらした（28コ ロニー/1.6×10⁸形質転換処理細胞）。 この結果を確認するために、Cos2955由来の精製ハイブリッドコスミドDNAをプ ラスミド精製ミニカラム法（Qiagen社）と塩化セシウム密度勾配遠心法（例えば Harbor Laboratory Press（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））の 両方を使って調製した。次に、上記と同じプロトコルを用いて形質転換実験を繰 返した。その結果、Cos2955 DNAによる形質転換が、化合物Aに対して耐性を示す 数多くのコロニ０（頻度約1×10^-6）を再現性よく生じさせることが明らかにな り、ポルフィリン性除草剤耐性遺伝子がこのハイブリッドコスミドDNAに含まれ ていなければならないことが示された。 実施例6 ハイブリダイゼーションによるDNAライブラリーからのPPO遺伝子の単離 配列番号4のヌクレオチド配列またはその一部を含むDNA断片は、Chlamydomona sまたは植物DNAライブラリーから、Sambrookら，Molecular ューヨーク州コールドスプリングハーバー））に記載のハイブリダイゼーション 法に従って、PPO遺伝子を単離するためのプローブとして使用できる。 LB-アンピシリン（50μg/ml）培地を含む150mmプレートにニトロセルロースフ イルターを置き、ChlamydomonasゲノムDNAライブラリーのコスミドプールをトラ ンスフェクトしたE.coli XL-Blue MR細胞（Stratagene社）をそのニトロセルロ ースフィルター（マスターフィルター）に塗布し、37℃で終夜培養することによ り、1プレートあたり約5×10⁵コロニーを生じさせる。各マスターフィルターの レプリカを作り、そのレプリカをPPO遺伝子プローブとのハイブリダイゼーショ ンに使用する。そのレプリカフィルターを、室温で、細菌細胞を溶解させるため の変性溶液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）、中和溶液（0.5Mトリス-HCl（pH7.4）） 、および2×SSCに浸漬したWhatman 3MM紙上に、順次それぞれ5分間置き、3MM紙 上で30分間風乾した後、減圧下に80℃で2時間乾燥することにより、DNAをニトロ セルロースに結合させる。次にそのフィルターを、ハイブリダイゼーション緩衝 液（2×PIPES緩衝液、50％脱イオンホルムアミド、0.5％（w/v）SDS、500μg/ml 変性超音波処理サケ精子DNA）中、42℃で約1時間インキュベートした後、同緩衝 液中42℃で終夜、約1×10⁶cpm/mlの標識プローブとハイブリダイズさせる。各フ ィルターを2×SSC／1％（w/v）SDS中で洗浄した後、オートラジオグラフィーに よって陽性シグナルを検出できる。これらハイブリダイゼーションプローブは、 市販のDNAラベリング用ランダムプライミングキット（宝酒造株式会社）または5 '末端ラベリングキット（MEGALABEL；宝酒造株式会社）を用いて³²Pで標識され た、配列番号4のヌクレオチド配列またはその一部を含む DNA断片からなる。陽性ハイブリダイゼーションシグナルを示す位置にあるコロ ニーをマスターフィルターからこすりとり、100μlのLB＋アンピシリン（50μg/ ml）培地に懸濁する。ニトロセルロースフィルターに100〜1000細胞を塗布し、 それをLB＋アンピシリン（50μg/ml）培地の平板（150mm）上、37℃で終夜培養 した後、そのフィルターのレプリカを作成する。次に、そのレプリカフィルター を使って上述の方法でハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、陽性クロ ーンを単離する。 実施例7 サブクローニングとヌクレオチド配列の決定による除草剤耐性PPOをコードするD NA断片の単離と同定 1．Cos2955の制限地図の作成 クローンCos2955由来のハイブリッドコスミドDNAをCsCl密度勾配遠心法によっ て精製した。その精製ハイブリッドコスミドDNA（以下Cos2955 DNAという）を制 限酵素EcoRI、SalI、BamHI、ClaI、XhoIおよびHindIIIのそれぞれで、またはそ れらを組み合せて消化し、それによって生成した断片のサイズを0.8％アガロー スゲル電気泳動（25V、15時間）によって見積もった。単消化物および二重消化 物中の各断片のサイズの分析から、図1に示す制限地図を構築した。HindIII部位 とXhoI部位は、13.8kbとそれより小さい断片で調べた。PstI部位とPmaCI部位は3 .4kb断片と2.6kb断片で調べた。3.4kb断片には5ヶ所のPstI部位と1ヶ所のPmaCI 部位が特定された。Cos2955 DNAインサートは次の制限酵素部位を含有する（出 現順；（）内は部位間の 距離（kB））：HindIII（0.8）SalI（0.2）BamHI（2.8）HindIII（5.1）XhoI（0 .9）SalI（0.2）SalI（0.1）BamHI（0.5）PstI（0.1）PstI（0.4）PstI（0.1）P stI（0.3）PmaCI（0.2）PstI（0.6）XhoI（1.4）EcoRI（3.1）ClaI（8.2）BamHI （6.6）BamHI（3.1）BamHI（4.4）ClaI。Cos2955に挿入されているDNA断片の総 分子サイズ（核酸長）は約40.4kbである。 2．2.6kb Xho/PmaCI DNA断片のサブクローニングと配列決定 Cos2955 DNAと市販のプラスミドpBluescript-II KS＋（pBS；Stratagene社）D NAを個々の制限酵素または2種類の制限酵素の適当な組み合せで消化し、フェノ ール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によって断片を回収した。必要で あればCIAPでの処理によってpBSベクターを脱リン酸化し、そのpBSベクターと消 化したコスミド2955 DNA断片とをT4 DNAリガーゼを使って連結した。このように して得たハイブリッドプラスミドをエレクトロポレーション（12.5kV/cm、4.5ms ）によってE.coli XL-Blue株の細胞に導入し、2％（w/v）X-galが塗布されてい るLB寒天平板（10g/L NaCl、10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、1.5％（w/v） 寒天からなり、1mM IPTGと50μg/mlアンピシリンをも含む）に塗布した。これら の平板から白コロニー（すなわちpBSベクターを取り込んでいるためにアンピシ リン耐性であり、そのpBSベクターのLacZ遺伝子中のクローニング部位に挿入さ れたCos2955 DNA由来のDNA断片を持つクローン）を単離した。単離したコロニー をアンピシリンの存在下で培養した後、それらコロニーからアルカリ溶菌法（Sa mbrookら，Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press （ニューヨーク州コールドス プリングハーバー），1.38〜1.39頁（1989））でプラスミドDNAを単離した。単 離したプラスミドをクローニングに使用した制限酵素で再消化してインサートを 放出させ、得られた断片のサイズを0.8％（w/v）アガロースゲル（75V、5時間） 電気泳動によって再び見積もった。所期のサイズのインサートが得られた場合は 、正しいDNA断片がクローニングされていることを確認するために、それをさら なる制限分析にかけた。このようにクローン化したDNA断片を図1に示す。Eco13. 8 DNAは次の制限酵素部位を含有する（出現順；（）内は部位間の距離（kB）； この注釈は本明細書全体に適用される）：KpnI（＜0.1）HindIII（0.8）SalI（0 .2）BamHI（2.8）HindIII（5.1）XhoI（0.9）SalI（0.2）SalI（0.1）BamHI（0. 5）PstI（0.1）PstI（0.4）PstI（0.1）PstI（0.3）PmaCI（0.2）PstI（0.6）Xh oI（1.4）EcoRI。 Eco13.8 DNA断片の総分子サイズ（核酸長）は約13.8kbである 。Hind10.0 DNAは次の制限酵素部位を含有する（出現順；（）内は部位間の距離 （kB））：KpnI（＜0.1）HindIII（5.1）XhoI（0.9）SalI（0.2）SalI（0.1）Ba mHI（0.5）PstI（0.1）PstI（０.4）PstI（0.1）PStI（0.3）PmaCI（0.2）PstI （0.6）XhoI（1.4）EcoRI。 Hind10.0 DNA断片の総分子サイズ（核酸長）は約10 .0kbである。Hind10.0断片は、制限酵素部位HindIII（0.8）SalI（0.2）BamHI（ 2.8）HindIIIを含む約3.8kbのDNA断片が欠失したEco13.8断片の誘導体である。H ind10.0断片は、Eco13.8断片をHindIIIで消化し、その消化物を連結することに よって得られた。Xho3.4 DNAは次の制限酵素部位を含有する（出現順；（）内は 部位間の距離（kB））：XhoI（0.9）SalI（0.2）SalI（0.1）BamHI（0.5）PstI （0.1）PstI（0.4）PstI（0.1）PstI（0.3）PmaCI（0.2）PstI（0.6）XhoI。 Xho3.4 DNA断片の総分子サイズ（核酸長）は約3.4kbである。Xho/PmaC2.6 DNAは 次の制限酵素部位を含有する（出現順；（）内は部位間の距離（kB））：XhoI（ 0.9）SalI（0.2）SalI（0.1）BamHI（0.5）PstI（0.1）pstI（0.4）PstI（0.1） PstI（0.3）PmaCI。Xho/PmaC2.6断片を含むプラスミドは、Xho3.4断片を含むpBS プラスミドをKpnIとPmaCIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、自己 連結させ、大腸菌を形質転換することによって得られた。この工程で、制限酵素 部位XhoI（0.6）およびPstI（0.2）を含む約0.8kbのDNA断片が除去された。Xho/ PmaC2.6DNA断片の総分子サイズ（核酸長）は約2.6kbである。 ポルフィリン性除草剤耐性突然変異rs-3を含有するクローンを同定するために 、受容Chlamydomonas reinhardtii CC-48株（アルギニン要求株arg-2）を、粒子 銃法（詳細については上記を参照されたい）により、Cos2955のpBSサブクローン に由来するDNAで形質転換した。化合物Aに対する耐性を付与できたCos2955のpBS サブクローンには、Eco13.8、Hind10.0、Xho3.4およびXho/PmaC2.6断片が含まれ ていた。これらの断片のうちXho/PmaC2.6断片が最小のサイズを持っていた。こ れらの結果から、Xho/PmaC2.6断片がポルフィリン性除草剤耐性突然変異を含有 することが確認された。 上述のEco13.8断片とXho/PmaC2.6断片が挿入されているpBSプラスミドを含有 するE.coli株は、それぞれP-563およびP-717の名称で、クラミドモナスジェネテ ィクスセンター（27708-1000ノースカロライナ州ダラム、デューク大学、ボック ス91000、リサーチドライブ、LSRCビルディング、DCMBグループ、Elizabeth H.H arris博士気付）に寄託されている。Cos2955を含有するE.coliもクラミドモナス ジ ェネティクスセンターにP-561の名称で寄託されている。さらにE.coli XL1-Blue /Eco13.8株は、ブダペスト条約に基き、1995年7月19日にアメリカンタイプカル チャーコレクション（American Type Culture Collection；米国20852メリーラ ンド州ロックビル、パークローンドライブ12301）に寄託され、ATCC69870の受託 番号を割り当てられている。 上述のようにして得たXho/PmaC2.6DNA断片とXho3.4DNA断片のヌクレオチド配 列は、α³⁵S-dATPまたはα³²S-dATPラベルを使ってSanger酵素配列決定法（Sequ enaseバージョン2.0キット；USB社）で決定された（配列番号10および配列番号1 9を参照されたい）。 実施例8 PPO阻害性除草剤に対して耐性なChlamydomonas reinhardtiiの自然突然変異株の 単離 単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii CC-125株（野生型）を、細胞密度が約 3×10⁶細胞/mlになるまで、実施例5に記述したようにTAP液体培地で2日間、混合 栄養法で培養した。培養物の遠心分離（8,000×g、10分間、20℃）によって細胞 を集め、細胞密度が1×10⁸細胞/mlとなるように少量のHS培地（実施例5に記載） に再懸濁した。その細胞懸濁液のうち各1mlを、予め42℃に温めておいたHS培地 ＋0.2％寒天（Difcoバクトアガー）1mlを既に含む各小試験管に加えた。穏やか に混合した後、その懸濁液のうち各0.7mlをTAP寒天（TAP培地＋0.3μM化合物A＋ 1.5％（w/v）寒 天からなる）のペトリ平板2枚にそれぞれ塗布し、それらを暗所で乾燥すること により、平板の表面に細胞を付着させた。次に、それらの平板を100μM m^-2s^-1 光下に2週間インキュベートした。この方法で、0.3μＭの化合物Aを含むTAP平板 のいくつかに正常な緑色のコロニーが同定されるまで、十分な数の野生型細胞を スクリーニングした。このスクリーニング法は突然変異誘発処理した野生型細胞 から除草剤耐性突然変異株を単離する際にも適用できる。突然変異誘発処理を施 していない野生型細胞に由来し0.3μMの化合物Aを含むTAP平板上で選択された緑 色コロニーを少量のHS液体培地に移した。この細胞懸濁液を数倍に希釈し、単コ ロニーが得られるように除草剤含有TAP平板に塗布した。耐性な単コロニーを再 単離し、それをクラミドモナスジェネティクスセンター（実施例7に記載）にGB- 2951の名称で寄託した。 Shibataらが記述した方法（Research in Photosynthesis，VolIII，567〜570 頁， て、数種類の除草剤に対するGB-2951の耐性を、様々な濃度の当該化合物を含むT AP液体培地でこの株を生育させることによって試験した。RS-3突然変異株GB-267 4と同様に、GB-2951も化合物Aを含むPPO阻害性除草剤とアシフルオルフェンメチ ル（acifluorfenmethyl）に対する耐性を示したが、他の作用機序を持つ除草剤 （例えばジウロンやパラコート）には野生型株CC-125と同様に感受性だった。さ らにGB-2951を野生型株CC-124と交配し、数組の四分子をHarrisが記述している ような方法 ォルニア州サンディエゴ））に従って単離した。全ての四分子が2つの除草剤（ 化合物 A）感受性子孫と2つの除草剤耐性子孫に分離した。また、GB-2951とRS-322（RS- 3とCC-124の交配に由来するポルフィリン性除草剤耐性分離株）の交配で得られ る四分子は、除草剤感受性子孫をもたらさなかった。これらの結果はGB-2951が 、ポルフィリン性除草剤耐性を生じる単一の核遺伝子突然変異を持ち、その突然 変異がRS-3中の突然変異（rs-3と呼ぶ）に極めて類似する特徴を持ち、rs-3遺伝 子座またはそのすぐ近くに位置することを示している。 実施例9 野生型Chlamydomonas reinhardtiiからの除草剤感受性PPO遺伝子の単離 実施例4に記述したような方法に従って、Chlamydomonas reinhardtiiゲノムDN Aライブラリーを野生型株CC-125から構築する。各クローンは、実施例4に記述し たようなインデックストライブラリーとして個別に保存するか、そのライブラリ ーを Harbor Laboratory Press（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー））が 記述しているようにクローンの集団として保存することができる。別法として、 Rochaixらが記述した方法（Plant Molecular Biology,A Practical Approach，S haw編，第10章，253〜275頁（1988））に従ってChlamydomonas reinhardtiiの野 生型株CC-125からmRNAを抽出し、実施例1に記述したような方法に従ってcDNAラ イブラリーを構築する。そのcDNAライブラリーのスクリーニングには、配列番号 4またはその一部の塩基配列を含むDNA断片（例えばXho3.4断片をBamHIで消化す ることによって 得られる1.2kb DNA断片）をプローブとして使用できる。実施例7に記述したよう な方法に従って陽性クローンを検出し単離する。単離したクローンのDNAインサ ートのヌクレオチド配列を決定し、それを配列番号4と比較することにより、そ のクローンが所期の野生型遺伝子に相当することを確認する。 実施例10 PPO遺伝子によってコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列の分析 Arabidopsis thalianaとトウモロコシに由来するcDNAの既知配列（WO95/34659 ）（それぞれ配列番号11と配列番号13）に基き、遺伝子分析ソフトウェアGENETY X（SDC Software Development社）を使って、実施例7で得たChlamydomonas由来 のXho/PmaC2.6ゲノムDNA（配列番号10参照）に対し、アミノ酸配列分析を行なっ た。Arabidopsis thalianaおよびトウモロコシ由来の既知cDNAによってコードさ れるPPO酵素タンパク質は、それぞれ配列番号11および配列番号13に示すように 、537アミノ酸残基および483アミノ酸残基からなる。Chlamydomonas由来のXho/P maC2.6ゲノム配列を分析したところ、Arabidopsis thalianaとトウモロコシに由 来するcDNAによってコードされるPPOタンパク質と相同な約160アミノ酸（それぞ れ59％および62％同一）をコードする4つのエクソンの存在が明らかになった。 配列番号1、配列番号2および配列番号3は、該4つのChlamydomonas reinhardtii エクソンの一部とArabidopsis thalianaおよびトウモロコシcDNAの対応する部分 とにコードされるPPOタンパク質ドメインの相同な一次アミノ酸配列を示す。（ アミノ酸 同一性：Chlamydomonas reinhardtii-Arabidopsis thaliana，57％；トウモロコ シ−Chlamydomonas reinhardtii，60％）。配列番号4、配列番号5および配列番 号6は、それぞれタンパク質配列番号1、配列番号2および配列番号3に対応するDN A配列を示す（ヌクレオチド同一性：Chlamydomonas reinhardtii-Arabidopsis t haliana，51％；トウモロコシ−Chlamydomonas reinhardtii，54％）。 実施例11 除草剤耐性PPO遺伝子中のPPO阻害性除草剤耐性突然変異の同定 Chlamydomonas reinhardtiiの野生型株または除草剤耐性突然変異株に由来す るゲノムDNAもしくはそれらゲノムに由来するクローン化DNA断片をテンプレート とし、Arabidopsis thaliana cDNA配列から推定されるエクソンドメインを、Chl amydomonas由来のG＋C高含有核DNA配列を増幅するために開発された後述のPCR法 で増幅した。増幅された断片の塩基配列を決定し、それらの配列を野生型株と2 種の耐性突然変異株の間で比較した。 PPO阻害性除草剤に対して耐性なC.reinhardtiiのRS-3（GB-2674）株とRS-4（G B-2951）株および除草剤感受性野性株（CC-407とCC-125）から、実施例4に記述 した方法と同様の方法で、ゲノムDNAを単離した。7-デアザ-2'-デオキシグアノ シン三リン酸（7-デアザ-dGTP）を含む下記の反応混合物（100μl）を調製した （PCR ニア州サンディエゴ））の54頁、Innis著「PCR with 7-deaza-2'-triphosphate （翻 訳：7-デアザ-2'-デオキシグアノシン三リン酸を用いるPCR）」）。この反応混 合物の組成は次の通りだった：各200μMのdATP、dCTP、dTTP、NaまたはLi塩（Pr omega社またはBoehringer社）；150μM 7-デアザ-dGTP Li塩（Boehringer社）； 50μM dGTP NaまたはLi塩（Promega社またはBoehringer社）；1.5mM酢酸マグネ シウム（Perkin-Elmer社）；トリシン、酢酸カリウム、グリセロールおよびDMSO を含む1×XLバッファーII（Perkin-Elmer社）；0.2μMの各プライマー；約500ng の全ゲノムミニプレップDNA。プライマーとして使用するため、Xho/PmaC2.6断片 （配列番号10）中の第1エクソン配列の5'末端と第2エクソン配列の3'末端に隣接 するイントロン領域に対応する次の合成オリゴヌクレオチドを合成した：エクソ ン1および2を含む699bp産物増幅用のプライマー1A（¹⁶⁷CCGTC TACCA GTTT CTTG^{1 84} ；配列番号15）およびプライマー2B（⁸⁶⁵TGGAT CGCTT TGCTC AG⁸⁴⁹；配列番号 18）。プライマーとして使用するため、Xho/PmaC2.6断片（配列番号10）中の第3 エクソン配列の5'末端とXho3.4断片（配列番号19）中に存在する第5エクソン配 列の3'末端に隣接するイントロン領域に対応する次の合成オリゴヌクレオチドを 合成した：エクソン3、4および5を含む1085bp産物増幅用のプライマー3A（¹⁶⁹⁸T TCCA CGTCT TCCAC CTG¹⁷¹⁵；配列番号20）およびプライマー5B（²⁷⁸²CGGCA TTTA C CAGCT AC²⁷⁶⁶；配列番号24）。 サーマルサイクラー中の反応混合物に、その温度が90℃に達した後、3単位のr Tth DNAポリメラーゼXL（Perkin-Elmer社）を加えた。次の条件でPCR産物を増幅 した：93℃で3分間（1サイクル）；93℃で1分間，47℃で1分間、72℃で3分間、1 サイクル毎に1秒延長（35サイクル）；72℃で10分間（1サイクル）。反応生成物 を0.8％アガロースゲルで分析し、イソプロパノール沈殿で精製し、dsDNAサイク ルシークエンシングシステム（GIBCO-BRL社）により、³²Pまたは³³P γ ATP（NE N）を使って標識された末端を持つ次に示すプライマーを使用して配列決定した ：エクソン1はプライマー1A（上記参照）とプライマー1B（⁵⁰⁶ATACA ACCGC GGGA T ACGA⁴⁸⁸；配列番号16）を使用して1A/2B PCR産物から配列決定した；エクソン 2はプライマー2A（⁵⁷⁷ACTTT GTCTG GTGCT CC⁵⁹³；配列番号17）とプライマー2B （上記参照）を使用して1A/2B PCR産物から配列決定した。野生型株（CC-407とC C-125）のエクソン1のDNA配列が得られた（配列番号4）。これに相当するRS-3（ GB-2674）突然変異株とRS-4（GB-2951）突然変異株の塩基配列は、Arabidopsis PROTOX遺伝子（配列番号11）中のbp1108に相当する配列番号4の37番目のbpに野 生型から突然変異体への同じG→A変異を持つことがわかった。これは、Arabidop sis PROTOX遺伝子（配列番号11）中のVal365に相当する野生型C.reinhardtiiのV al13にVal→Met置換をもたらす。Xho/PmaC2.6断片中の他のエクソンの野生型ヌ クレオチド配列と突然変異体ヌクレオチド配列の両方を、本質的に上記と同じ方 法で決定した。エクソン2はプライマー2A（⁵⁷⁷ACTTT GTCTG GTGCT CC⁵⁹³；配列 番号17）とプライマー2B（上記参照）を使用して1A/2B PCR産物から配列決定し た。エクソン3はプラィマー3A（上記参照）とプライマー3B（¹⁹¹⁴CTAGG ATCTA G CCCA TC¹⁸⁹⁸；配列番号21）を使用して3A/5B PCR産物から配列決定した。エクソ ン4はプライマー4A（²¹²²CTGCA TGTGT AACCC CTC²¹³⁹；配列番号22）と プライマー4B（²⁴¹⁶GACCT CTTGT TCATG CTG²³⁹⁹；配列番号23）を使用して3A/5B PCR産物から配列決定した。いずれの場合も、突然変異型配列と野生型配列は同 じであることがわかった。 実施例12 指定部位突然変異誘発による除草剤耐性PPO遺伝子の作成 除草剤感受性植物PPO遺伝子に塩基置換を導入してその修飾遺伝子によって生 産されるタンパク質がPPO阻害性除草剤に対して耐性を示すようにするには、Kra merら（Nucleic Acids Research 12:9441（1984））またはKramerおよびFrits（Method sin Enzymol. 154:350（1987））が記述したギャップトデュプレックス法 などの従来の指定部位突然変異誘発法を使用できる。PPO遺伝子中の配列番号1の アミノ酸配列をコードするエクソン内で（配列番号1の）Val13がMetで置換され るように合成オリゴヌクレオチドを設計する。 例えば、実施例2で得た陽性クローンを、Shortらが記述した方法（Nucleic Ac ids Research 16:7583（1988））に従って、該クローンによってコードされるタ ンパク質が発現されうるようにファージベクターM13 tv19（宝酒造株式会社）に 再クローニングする。該ファージベクターをテンプレートとし、市販の指定部位 突然変異誘発系キット（Mutan-G；宝酒造株式会社）を使用する。配列番号7（Ar abidopsis thaliana cDNA用）、配列番号8（トウモロコシcDNA用）または配列番 号9（両者共用）の一部に相当する合成オリゴヌクレオチドの5'末端を市販のキ ット（MEGALABEL；宝酒 造株式会社）でリン酸化し、それを使ってギャップトデュプレックスファージDN Aの相補鎖でのオリゴヌクレオチド合成をプライムすることにより、該除草剤耐 性突然変異を導入する。in vitroで合成された相補的突然変異鎖を持つDNAを、H anahan（J.Mol.Biol.166:557（1983））やSambrookら（Molecular Cloning，第2 版，1.74〜 州コールドスプリングハーバー））が記述しているような標準的方法に従って、 E.coli BMH71-18（mutS）（宝酒造株式会社）に導入する。次に、そのファージ をプラーク形成のためにE.coli MV1184（宝酒造株式会社）に接種する。そのよ うにして形成され Spring Harbor Laboratory Press（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー ））が記述しているような標準的方法にしたがって一本鎖DNAを調製し、そのcDN Aドメインの塩基配列を、Sangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463（1977 ））が記述したようなジデオキシ連鎖終結法に従い、Sequenaseバージョン2キッ ト（U.S.Biochemical Corp.）を使用して決定する。次に、突然変異誘発に使用 した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を持つクローンを選択する。 実施例13 PPO活性に対する試験化合物の阻害効果の評価と新しいPPO阻害剤の同定 実施例2または9で得た除草剤感受性PPO酵素をコードするcDNAを含有するプラ スミドベクターを、内因性PPO遺伝子（hemG遺伝子座）が欠失しているE.coliの 突 然変異体SASX38株に導入し、実施例2の方法に従って除草剤感受性形質転換体を 選択する。同様にして、実施例12の方法に従って、配列番号1、配列番号2および 配列番号3のVal13の位置にバリンからメチオニンへの置換をもたらす塩基対変化 を持つ除草剤耐性PPOをコードするcDNAを得る。該cDNAをプラスミドベクターpUC 118（Nishimuraら，J.Biol.Chem.270:8076（1995））に再クローニングし、その プラスミドベクターをE.coli SASX38に導入して、除草剤耐性形質転換体を得る 。感受性形質転換体と耐性形質転換体の両者を、所定の濃度の化合物Aを添加し たLB＋アンピシリン寒天培地に個別に接種し、2日間培養する。次にコロニー形 成を調べて、この除草剤の存在下での感受性形質転換体と耐性形質転換体の生育 を評価する。除草剤感受性PPOをコードするcDNAを持つE.coli株（感受性形質転 換体）の生育は、特定の濃度の化合物Aを含むLB＋アンピシリン培地では、化合 物Aを欠く培地での生育と比較して強く抑制される。これに対し、除草剤耐性PPO をコードするcDNAを持つE.coli株（耐性形質転換体）は、その濃度の化合物Aを 添加した培地でも化合物Aを含まない培地でも同じレベルの生育を示す。したが って、遺伝的にPPO遺伝子中の一塩基対置換だけの相違する該耐性形質転換体と 比較した該感受性形質転換体の生育阻害は、そのPPO酵素に対するこの化合物の 阻害効果によって生じる。既に同定されているPPO阻害剤の相対効力の決定のみ ならずPPO阻害活性を持つ新しい化合物（試験化合物）の同定も、感受性PPO遺伝 子と耐性PPO遺伝子を持つ上述のE.coli形質転換体の培地にそれらを添加し、該 感受性形質転換体と該耐性形質転換体の相対的生育速度に対するそれら化合物の 効果を比較することによって達成される。 実施例14 エレクトロポレーションおよび粒子銃形質転換用のPPO遺伝子含有発現ベクター の構築 この実施例では、PPO遺伝子を植物または植物組織培養細胞に直接導入するた めの発現ベクターについて記述する。既知のトウモロコシPPO cDNA（MzProtox-1 またはMzProtox-2）を含有するプラスミドpWDC-4またはpWDC-3（WO95/134659） から、PPOコード配列に相当する約1.75kbまたは2.1kbの断片を、Sambrookら（Mo lecular Cloning ，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press（ニューヨー ク州コールドスプリングハーバー），5.3〜6.3頁（1989））が記述しているよう な従来の方法に従って、市販の制限酵素を使って切り出す。実施例12の方法に従 い、得られた断片の末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化する（DNAブランテ ィングキット；宝酒造株式会社）。 別途、pUC19系GUS発現ベクターpBI221（Clontech社）を制限酵素SmaIとSacI（ 宝酒造株式会社）で消化して、GUSコード配列を含みCaMV 35SプロモーターとNOS ターミネーターを互いに反対の末端に持つ切り出された2.8kbp断片を回収する。 この断片の末端もT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造株式会社）で平滑末端化し、細菌 アルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社）で脱リン酸化する。 該cDNAと該ベクターの平滑末端化された断片をT4 DNAリガーゼ（DNAライゲー ションキット：宝酒造株式会社）を使って融合し、E.coli HB101株のコンピテン ト細 胞（宝酒造株式会社）に形質転換する。アンピシリン耐性クローンを選択し、プ ラスミドDNAを単離して、標準的な方法により制限分析で特徴づける。PPOコード 配列がCaMV 35SプロモーターとNOSターミネーターに関して正しい向きに挿入さ れているプラスミドクローンを、植物および植物細胞にPPO遺伝子を直接導入す るための発現ベクターとして選択する。 実施例15 Agrobacteriumによる形質転換用のPPO発現ベクターの構築 以下に、植物または植物細胞のAgrobacteriumによる形質転換用のPPO遺伝子含 有発現ベクターの構築について説明する。PPOc DNAコード配列を含むDNA断片は 、平滑末端を持つものを実施例14に記述したように調製できる。バイナリーpBIN 19系GUS発現ベクターpBI121（Clontech社）を制限酵素SmaIとSacI（宝酒造株式 会社）で消化して、GUSコード配列を切り出す。消化したプラスミドDNAの末端に あるCaMV 35Sプロモーター配列とNOSターミネーター配列を、T4 DNAポリメラー ゼ（DNAブランティングキット：宝酒造株式会社）を使って平滑末端化した後、 細菌アルカリホスファターゼで脱リン酸化する。平滑末端を持つそのcDNA断片と ベクター断片の連結後、そのキメラプラスミドをE.coli HB101株のコンピテント 細胞（宝酒造株式会社）に導入し、組換えプラスミドを持つクローンを50μg/ml カナマイシンが入っているLB培地で選択する。それらのクローンから単離したプ ラスミドDNAの制限分析を標準的な方法で行うことにより、PPOコード配列が発現 に関して正しい向きに 挿入されているクローンを同定する。次に、選択したPPO発現ベクターを三親交 配法（tri-parental mating method；GUSジーンフュージョンシステム；Clontec h社）によってAgrobacterium tumefaciens（アグロバクテリウム・ツメファシエ ンス）LBA4404株に導入する。 実施例16 PPO遺伝子発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック作物用植物の作出 実施例15のPPO遺伝子発現ベクターが導入されているAgrobacterium tumefacie ns LBA4404を使って、内宮が記述している方法（「植物遺伝子操作マニュアル」 （講談社サイエンティフィク；ISBN4-06-153513-7（1990））の27〜33頁）に従 って、タバコまたは他の感受性植物組織の無菌培養葉切片に感染させることによ り、形質転換タバコ植物体を得る。50μg/mlカナマイシンを含むMS-NB培地平板 （Murashige/Skoog培地＋0.1mg/lナフタレン酢酸＋1.0mg/Lベンジルアデニン、0 .8％寒天）で形質転換カルスを選択し、50μg/mlカナマイシンを含むMurashige/ Skoog培地平板にその耐性カルスを移すことによって、小植物体形成を誘導する 。同様に、ニンジン実生の無菌葉柄に、Pawhckiらが記述した方法（Plant Cell. Tissue and Organ Culture 31:129（1992））に従って、PPO発現ベクターを保持 する上述のAgrobacterium株を感染させ、再生させることにより、形質転換ニン ジン植物体を得る。 実施例17 混交した雑草と除草剤耐性作物用植物に対するPPO阻害性除草剤の適用に関する 雑草防除試験 面積33×23cm²、深さ11cmの平箱に高地耕土を詰める。実施例16に記述した方 法と同様の方法で開発した除草剤耐性PPO遺伝子を持つ作物用植物の種子をEchin ochloa crus-galli（ヒエ）、Abutilon theophrasti（アブーチロン・テオフラ スティ（イチビの一種））、Ipomoea hederacea（朝顔）などの雑草の種子と共 に蒔き、1〜2cmの土で覆う。100g/haに相当する量の式20と22（Rはエチル基）の 化合物を界面活性剤と液体担体の混合物（例えばドデシルベンゼンスルホン酸カ ルシウム/ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル/キシレン/シクロヘキ サノン＝1：2：4：8（v/v）の混合物）20体積に溶解し、10L/haに相当する体積 の水で希釈した後、播種後ただちに土の表面に噴霧する。試験植物を温室で処置 後27日間栽培して、試験化合物の雑草防除活性と作物用植物毒性を観察する。 除草剤耐性PPO遺伝子を持つ上述の作物用植物の種子をEchinochloa crus-gall i、Abutilon theophrastiおよびIpomoea hederaceaなどの雑草の種子と一緒に蒔 き、深さ1〜2cmの土で覆い、その植物を温室で18日間栽培する。100g/haに相当 する量の式20と22（Rはエチル基）の化合物を界面活性剤と液体担体の混合物（ 例えばドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム/ポリオキシエチレンスチリルフ ェニルエーテル/キシレン/シクロヘキサノン＝1：2：4：8（v/v）の混合物）20 体積に溶解し、10L/haに相当する体積の水で希釈した後、植物に上から噴霧する 。試験植物を温室で処置後20日間栽培して、試験化合物による雑草防除活性と作 物用植物毒性を観察する。 どちらの方法でも、除草剤耐性PPO遺伝子で形質転換された作物用植物には有 意な植物毒性は観察されないが、Echinochloa crus-galli、Abutilon theophras tiおよびIpomoea hederaceaの生育は抑制される。 ここに記述した本発明の種々の変更態様は当業者には明らかになるだろう。そ のような変更態様は添付の請求の範囲に含まれるものとする。 配列表 配列番号：1 配列の長さ：47 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Chlamydomonas reinhardtii 株名：CC-407 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..47 他の情報：配列の産物はポルフィリン性除草剤耐性ドメインである。 配列 配列番号：2 配列の長さ：46 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Arabidopsis thaliana 株名：エコタイプColumbia 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..46 他の情報：配列の産物はポルフィリン性除草剤耐性ドメインである 配列 配列番号：3 配列の長さ：46 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Zea mays 株名：B73近交系 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..46 他の情報：配列の産物はポルフィリン性除草剤耐性ドメインである 配列 配列番号：4 配列の長さ：141 配列の型：核酸 配列の種類：Genomi cDNA ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Chlamydomonas reinhardtii 株名：CC-407 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..141 他の情報：ポルフィリン性除草剤耐性ドメインをコードする 配列配列番号：5 配列の長さ：138 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Arabidopsis thaliana 株名：エコタイプColumbia 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..138 他の情報：ポルフィリン性除草剤耐性ドメインをコードする 配列 配列番号：6 配列の長さ：138 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Zea mays 株名：B73近交系 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..138 他の情報：ポルフィリン性除草剤耐性ドメインをコードする 配列 配列番号：7 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..36 他の情報：Arabidopss thaliana用オリゴヌクレチドプライマー 配列 配列番号：8 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..38 他の情報：Zea mays用オリゴヌクレチドプライマー 配列 配列番号：9 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..26 他の情報：A.thalianaとZ.maysのPPOのポルフィリン性除草剤耐性ドメインに 共通するオリゴヌクレチドプライマー。N残基はG、A、TまたはCに加えてイノシ ン（I）であってもよい。K＝GまたはT。Y＝CまたはT。S＝CまたはG。W＝Aまたは T。 配列 配列番号：10 配列の長さ：2573 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No 起源 生物名：Chlamydomonas reinhardtii 株名：RS-3 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..2573 他の情報：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする 配列 配列番号：11 配列の長さ：1704 配列の型：核酸 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No 起源 生物名：Arabidopsis thaliana 株名：エコタイプColumbia 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：16..1629 他の情報：配列の産物はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである 配列 配列番号：12 配列の長さ：537 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：No 起源 生物名：Arabidopsis thaliana 株名：エコタイプColumbia 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..537 他の情報：配列の産物はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである 配列 配列番号：13 配列の長さ：1698 配列の型：核酸 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No 起源 生物名：Zea mays 株名：B73近交系 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：2..1453 他の情報：配列の産物はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである 配列 配列番号：14 配列の長さ：483 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：No 起源 生物名：Zea mays 株名：B73近交系 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..483 他の情報：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ 配列 配列番号：15 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..18 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー1A 配列 CCGTCTACCA GTTTCTTG 配列番号：16 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..19 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー1B 配列 ATACAACCGC GGGATACGA 配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..17 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー2A 配列 ACTTTGTCTG GTGCTCC 配列番号：18 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状' 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス:Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..17 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー2B 配列 TGGATCGCTT TGCTCAG 配列番号：19 配列の長さ：3381 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No 起源 生物名：Chlamydomonas reinhardtii 株名：RS-3 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..3381 他の情報：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする 配列 配列番号：20 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..18 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー3A 配列 TTCCACGTCT TCCACCTG 配列番号：21 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..17 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー3B 配列 CTAGGATCTA GCCCATC 配列番号：22 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..18 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー4A 配列 CTGCATGTGT AACCCCTC 配列番号：23 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..18 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー4B 配列 GACCTCTTGT TCATGCTG 配列番号：24 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：1..17 他の情報：Chlamydomonas reinhardtii用オリゴヌクレオチドプライマー5B 配列 CGGCATTTAC CAGCTAC

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年２月２３日（１９９９．２．２３） 【補正内容】 35. Val13がメチオニンで置換されているか、G37がアデニンで置換されてい る請求項31〜34のいずれか一つに記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ 阻害剤選択法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/26 33/48 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｃ Ｂ (72)発明者 ギルハム・ニコラス・ダブリュー アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27705，ダーハム，ウッドバーン・ロード, 1211番 (72)発明者 ランドルフ−アンダーソン・バーバラ・エ ル アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27302，メバン，リンデイル・コート, 2705番 (72)発明者 石毛 郁治 大阪府豊中市曽根東町２―10―３―340 (72)発明者 佐藤 良 大阪府豊中市曽根東町２―10―５―301

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 植物または植物細胞にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草 剤に対する耐性を付与する方法であって、あるDNA断片もしくはその生物学的機 能等価物またはそのDNA断片もしくはその生物学的等価物を含有するプラスミド を植物または植物細胞に導入することを含み、該DNA断片または該生物学的機能 等価物は発現され、かつ、次の特徴を持つ： （1）該DNA断片は植物中でプロトポルフィリノーゲン活性を持つタンパク質ま たはそのタンパク質の一部をコードする； （2）該DNA断片は、配列番号1、配列番号2または配列番号3からなる群より選 択されるアミノ酸配列をコードする核酸と相同であり、配列番号1または配列番 号2または配列番号3のVal13に対応するアミノ酸が別のアミノ酸で置換されてい るタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードし、DNA-DNAまたはDNA-RNAハ イブリダイゼーション法によって検出および単離できる； （3）該DNA断片は、植物または藻類の細胞中で発現された場合、その植物また は藻類の細胞内でプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤に対する 耐性を付与する能力を持つ。 2. DNA断片もしくはその生物学的機能等価物またはそのDNA断片を含むプラス ミドが、双子葉植物においてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つ タンパク質またはそのタンパク質の一部をコードする請求項1に記載の方法。 3. 双子葉植物がArabidopsis thalianaであり、DNA断片が配列番号2のVal13 が別のアミノ酸で置換されているタンパク質をコードする請求項2に記載の方法 。 4. DNA断片が単子葉植物においてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活 性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードする請求項1に記載の 方法。 5. DNA断片がトウモロコシにおいてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ 活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードし、DNA断片が配列 番号3のVal13が別のアミノ酸で置換されているタンパク質をコードする請求項4 に記載の方法。 6. DNA断片がChlamydomonasにおいてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ 活性を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードし、該DNA断片が配 列番号1のVal13が別のアミノ酸で置換されているタンパク質をコードする請求項 1に記載の方法。 7. Val13または対応するアミノ酸がメチオニンで置換されている請求項1〜6 のいずれか一つに記載の方法。 8. 耐性を付与される植物または植物細胞が緑藻Chlamydomonasである請求項1 〜6のいずれか一つに記載の方法。 9. Val13または対応するアミノ酸がメチオニンで置換されている請求項8に記 載のプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤耐性付与法。 10. 請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法によって耐性が付与された植物 または植物細胞または緑藻。 11. プロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤に対する耐性が付与された植物 または藻類の細胞を選択する方法であって、プロトポルフィリノーゲン阻害性除 草剤に対する 耐性が請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法によって付与された植物または藻 類の細胞の集団を、除草剤感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼだけを 発現させる該植物または藻類の細胞の生育を通常遮断する量のプロトポルフィリ ノーゲン阻害性除草剤で処理することを含む方法。 12. 請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法によってプロトポルフィリノー ゲン阻害性除草剤に対する耐性が付与された作物用植物の栽培域においてプロト ポルフィリノーゲン阻害性除草剤に対する耐性を持たない植物を防除する方法で あって、該栽培域に少なくとも1種類のプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤 を該プロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤に対する耐性を持たない植物の生育 を阻害するのに有効な量で適用することを含む方法。 13. 適用されるプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤が式X-Qの化合物群か ら選択され、Qがからなる群より選択され、Xが：からなる群より選択される請求項12に記載の非耐性植物防除法。 14. 適用されるプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤が、式：の化合物、 ラクトフェン、 ［N-（4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパルギルオキシ）フェニル-3,4,5,6-テトラ ヒドロフタルイミド、 ［2-クロロ-5-（シクロヘキサ-1-エン-1,2-ジカルボキシイミド）-4-フルオロフ ェノキ シ］酢酸ペンチル、 7-フルオロ-6-［（3,4,5,6-テトラヒドロ）フタルイミド］-4-（2-プロピニル） -1,4-ベンゾオキサジン-3（2H）-オン、 6-［（3,4,5,6-テトラヒドロ）フタルイミド］-4-（2-プロピニル）-1,4-ベンゾ オキサジン-3-（2H）-オン、 2-［7-フルオロ-3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオ キサジン-6-イル］ペルヒドロイミダゾ［1,5-a］ピリジン-1,3-ジオン、 2-［（4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパルギルオキシ）フェニル］ペルヒドロ-1H- 1,2,4-トリアゾロ［1,2-a］ピリダジン-1,3-ジオン、 2-［7-フルオロ-3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオ キサジン-6-イル］5,6,7,8-1,2,4-トリアゾロ［4,3-a］ピリジン-3H-オン、 2-［3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオキサジン-6- イル］-1-メチル-6-トリフルオロメチル-2,4（1H,3H）-ピリミジンジオン、 2-［6-フルオロ-2-オキソ-3-（2-プロピニル）-2,3-ジヒドロベンズチアゾール- 5-イル］-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド、および 1-アミノ-2-［3-オキソ-4-（2-プロピニル）-3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオキ サジン-6-イル］-6-トリフルオロメチル-2,4（1H,3H）-ピリミジンジオン からなる群より選択される請求項12に記載の非耐性植物防除法。 15. 次の特徴を持つDNA断片またはその生物学的機能等価物： （1）該DNA断片は植物においてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を 持 つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードする； （2）該DNA断片は、配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群より選 択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列と相同な核酸配列とのDNA-DNAまた はDNA-RNAハイブリダイゼーションによって検出および単離されうる配列を持つ ； （3）該DNA断片は配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13に対応するア ミノ酸が別のアミノ酸で置換されているタンパク質をコードする； （4）該DNA断片は、植物または藻類の細胞内で発現された場合、その植物また は藻類の細胞においてプロトポルフィリノーゲン阻害性除草剤に対する耐性を付 与する能力を持つ。 16. DNA断片が双子葉植物においてプロトポルフィリノーゲンオキダーゼ活性 を持つタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードする請求項15に記載のDN A断片またはその生物学的機能等価物。 17. 双子葉植物がArabidopsis thalianaであり、DNA断片が、配列番号2のVal 13の別のアミノ酸による置換によってもたらされるアミノ酸配列をコードする請 求項16に記載のDNA断片またはその生物学的機能等価物。 18. 植物が単子葉植物である請求項15に記載のDNA断片またはその生物学的機 能等価物。 19. 単子葉植物がトウモロコシであり、DNA断片が、配列番号3のVal13の別の アミノ酸による置換によってもたらされるアミノ酸配列をコードする請求項18に 記載のDNA断片またはその生物学的機能等価物。 20. 植物が緑藻Chlamydomonasであり、DNA断片が配列番号1のVal13の別のア ミノ酸による置換によってもたらされるアミノ酸配列をコードする請求項15に記 載のDNA断片またはその生物学的機能等価物。 21. 該別のアミノ酸がメチオニンである請求項15〜20のいずれか一つに記載 のDNA断片またはその生物学的機能等価物。 22. DNA断片がChlamydomonasのゲノムDNAから単離されうる配列を持ち、プロ トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質またはそのタンパク質 の一部をコードし、配列番号4の37番目にあるグアニン（G37）に対応するヌクレ オチドが別のヌクレオチドで置換されている請求項20に記載のDNA断片またはそ の生物学的機能等価物。 23. 該別のヌクレオチドがアデニンである請求項22に記載のDNA断片またはそ の生物学的機能等価物。 24. 請求項15〜23のいずれか一つに記載のDNA断片またはその生物学的機能等 価物を含むプラスミド。 25. 請求項24に記載のプラスミドを保持する微生物。 26. プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに対するある化合物の阻害効果 を評価する方法であって、（a）プロトポルフィリノーゲン阻害剤感受性のプロ トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を 含有する感受性微生物と、配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13に対応 するアミノ酸が別のアミノ酸で置換されておりプロトポルフィリノーゲン阻害剤 に耐性なプロトポルフィリノ ーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子だけが該感受性微 生物とは異なる耐性微生物とを、試験化合物の存在下に培養し、（b）プロトポ ルフィリノーゲンオキシダーゼに対するその試験化合物の阻害効果を評価するた めに、該感受性微生物と耐性微生物の両方の生育を測定することを含む方法。 27. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりポルフィリン性除草剤に対して耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシ ダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を、活性なプロトポルフィリノ ーゲンオキシダーゼを欠く微生物に導入してその微生物の生育能を回復させるこ とによって耐性微生物が得られる請求項26に記載のプロトポルフィリノーゲンオ キシダーゼ阻害効果評価法。 28. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコード する耐性遺伝子を、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤感受性 のChlamydomonas株に導入することによって耐性微生物が得られる請求項26に記 載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害効果評価法。 29. 耐性を付与できる遺伝子が請求項20または22に記載のDNA断片を含む遺伝 子である請求項26のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害効果評価法。 30. Val13がメチオニンで置換されているか、G37がアデニンで置換されてい る請求項26〜29のいずれか一つに記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ 阻害効果評価法。 31. プロトポルフィリンオキシダーゼ阻害剤を同定し評価するin vivo法であ って、 （a）プロトポルフィリノーゲン阻害剤感受性のプロトポルフィリノーゲンオキ シダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を持つ感受性微生物と、配列 番号1、配列番号2または配列番号3のVal13に対応するアミノ酸が別のアミノ酸で 置換されておりプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤に耐性なプロトポ ルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の存在 だけが該感受性微生物と異なる耐性微生物とを、試験化合物の存在下に培養し、 （b）特定の用量で感受性微生物の生育だけを阻害する化合物を同定することを 含む方法。 32. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりポルフィリン性除草剤に対して耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシ ダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を、活性なプロトポルフィリノ ーゲンオキシダーゼを欠く微生物に導入してその微生物の生育能を回復すること によって耐性微生物が得られる請求項31に記載のプロトポルフィリノーゲン阻害 剤選択法。 33. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコード する遺伝子を、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤感受性のCh lamydomonas株に導入することによって耐性微生物が得られる請求項31に記載の プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤選択法。 34. プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤に耐性なプロトポルフィ リンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする該遺伝子が請求項20または 22に記載のDNA断片を含む遺伝子である請求項31のプロトポルフィリノーゲンオ キシダーゼ阻害 剤選択法。 35. （請求項30と同じである）請求項31〜34のいずれか一つに記載のプロト ポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤選択法。 36. プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を阻害しない化合物を同定 するin vivo法であって、（a）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤感 受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードす る遺伝子を含有する感受性微生物と、配列番号1、配列番号2または配列番号3のV al13に対応するアミノ酸が別のアミノ酸で置換されておりプロトポルフィリノー ゲンオキシダーゼ阻害剤に耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を 持つタンパク質をコードする遺伝子だけが該感受性微生物と異なる耐性微生物と を、試験化合物の存在下に培養し、（b）該感受性微生物と耐性微生物の両方の 生育を阻害する化合物を同定することを含む方法。 37. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりポルフィリン性除草剤に対して耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシ ダーゼ活性を持つタンパタ質をコードする遺伝子を、活性なプロトポルフィリノ ーゲンオキシダーゼ活性を欠く突然変異微生物に導入してその突然変異体の生育 能を回復することによって耐性微生物が得られる請求項36に記載のプロトポルフ ィリノーゲンオキシダーゼ活性に影響を及ぼさない化合物の同定および評価法。 38. 配列番号1、配列番号2または配列番号3のVal13が別のアミノ酸で置換さ れておりポルフィリン性除草剤に対して耐性なプロトポルフィリノーゲンオキシ ダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子をプロトポルフィリノーゲンオ キシダーゼ阻害 性除草剤感受性のChlamydomonas株に導入することによって耐性微生物が得られ る請求項36に記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に影響を及ぼさ ない化合物の同定および評価法。 39. プロトポルフィリノーゲン阻害剤に耐性なプロトポルフィリンオキシダ ーゼ活性を持つタンパク質をコードする該遺伝子が請求項20または22に記載のDN A断片を含む遺伝子である請求項36のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活 性に影響を及ぼさない化合物の同定および評価法。 40. 配列番号、配列番号2または配列番号3のVal13がMetで置換されているか 、配列番号4、配列番号5または配列番号6のG37がアデニンで置換されておりプロ トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を 導入することによって該耐性微生物が得られる請求項36〜39のいずれか一つに記 載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に影響を及ぼさない化合物の同 定および評価法。