CN101998988A - 赋予除草剂抗性的细胞色素p450基因 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将除草剂抗性或耐受性赋予植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包括转基因植物、植物细胞、组织、和种子，它们已经单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地用编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化。具体地，细胞色素P450或其变体赋予对HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、和其它类型的除草剂的抗性或耐受性。别的多肽也可以赋予对除草剂(包括HPPD抑制剂类和其它除草剂)的抗性或耐受性。还提供了用于生成和使用本发明的除草剂抗性或耐受性植物、植物细胞、组织和种子的方法。

Description

赋予除草剂抗性的细胞色素P450基因
发明领域
本发明涉及除草剂耐受性植物和除草剂在此类植物上的应用。更具体地，本发明涉及用于产生商业植物的基因，所述商业植物对某些抑制羟基苯丙酮酸/盐双加氧酶(hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD)的除草剂类型以及其它类型的除草剂是有抗性的。具体地，本发明涉及通过表达某些细胞色素P450基因来在植物中降解此类除草剂。
发明背景
细胞色素P450(P450)单加氧酶是微生物、植物和动物中存在的遍在血红素蛋白。由大量且不同的一组同工酶组成，P450介导使用众多化合物作为底物的大批氧化反应，并且包括牵涉生物合成过程诸如类苯基丙烷、脂肪酸、和类萜生物合成的反应；天然产物的代谢；和对外来物质(异生素)的解毒。参见例如，Schuler(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15：235-284(1996)。在典型的P450催化反应中，氧分子(O2)的一个原子被掺入底物中，而另一个原子被还原成水。经由对NADPH的氧化来提供电子。对于大多数真核P450，NADPH：细胞色素P450还原酶(膜结合黄素蛋白)将必需的2个电子从NADPH转移至细胞色素P-450(Bolwell等(1994)Phytochemistry 37：1491-1506；Mizutani和Ohta(1998)Plant Physiol.，16，357-367)。
已知植物细胞色素P450牵涉对多种杀虫剂的代谢和解毒以及初级和次级代谢产物的生物合成。已经经由传统的化学技术(Shuler(1996)Crit.Rev.Plant.Sci.15：235-284；Bolwell等(1994)Phytochemistry 37：1491-1506；Frear等(1969)Phytochemistry 8：2157-2169)及通过在植物中对哺乳动物或细菌基因的研究(Shiota等(1994)Plant Physiol.106：17-23；O’Keefe等(1994)PlantPhysiol.105：473-482)而收集了大量证据。
最近，已经成功克隆了内源植物P450，在异源系统中成功表达、表征和测定(Siminszky等(1999)PNAS(USA)96：1750-1755)。例如，自菊芋(Jerusalem artichoke，Helianthus tuberosus)克隆CYP76B1(Robineau等(1998)Plant Physiol.，118：1049-1056)。发现此异生素诱导型细胞色素P450是可强烈诱导的，并且催化对多种苯脲除草剂的快速氧化N-脱烷基化以产生非植物毒性代谢物。CYP76B1基因在烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥属(Arabidopsis)中的异源表达导致除草剂氧化的速率增加，并且单独足以产生20倍对利谷隆(linuron)(一种通过单一脱烷基化而解毒的化合物)的耐受性水平，而且对异丙隆(isoproturon)或绿麦隆(chlortoluron)(其需要连续催化步骤来解毒)的耐受性也增加10倍(Didierjean等(2002)Plant Physiol.130：179-189)。
Frear等(1969)Phytochemistry 8：2157-2169证明了定位于棉花幼苗微粒体级分中的混合功能氧化酶代谢灭草隆(monuron)。积累了进一步的证据，其支持P450牵涉对代表数种不同类型的化合物的许多除草剂的代谢和解毒(综述于Bolwell等(1994)Phytochemistry 37：1491-1506；Shuler(1996)Crit.Rev.Plant.Sci.15：235-284)。同样地，例如，某些抑制HPPD的除草剂诸如硝磺草酮(mesotrione)(Hawkes等(2001)Proc.Brighton Pest Cont Conf-Weeds，BCPC，563-568)和topramezone(Grossmann和Ehrhardt(2007)Pest Mgmt.Sci.63：429-439)的作物/杂草选择性主要依赖于细胞色素P450型酶的活性。
认为差别的除草剂代谢P450活性代表使某些作物物种能够比其它作物或多杂草物种更耐受特定除草剂的机制之一。以下专利和申请收集对于细胞色素P450在除草剂耐受性方面的应用的背景理解有用的信息(美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；及PCT专利申请公开文本号WO2007000077)。还可参见U.S.6,649,814和6,300,544，其公开内容涉及细胞色素P450单加氧酶用于获得对昆虫、螨、或线虫类有抗性或具有改善的营养价值的转基因植物。
已知用于提供对HPPD除草剂有耐受性的植物的方法，其包括用包含编码HPPD酶的区域的多核苷酸转化植物材料(参见例如，美国申请公开文本号2004/0058427；PCT申请WO98/20144；PCT申请WO 02/46387；还可参见美国申请公开文本号2005/0246800，其涉及大豆品种具有相对HPPD耐受性的鉴定和标记)。然而，迄今通常尚未认可的是，细胞色素P450酶在与HPPD酶组合表达，或者在耐受性背景中表达，或者单独在经转化的植物中表达时可以提供额外水平的或商业水平的对HPPD抑制剂和其它除草剂的耐受性。虽然给定的HPPD酶可以提供有用水平的对同一HPPD抑制剂除草剂的耐受性的，但是它可能完全不足以提供商业水平的对不同的、更想要的HPPD抑制剂除草剂的耐受性，所述不同的、更想要的HPPD抑制剂除草剂例如可以控制不同杂草谱，更便宜地获得或提供环境益处。不仅有特定的HPPD酶和编码其的多核苷酸，本发明提供了增强适合于提供商业上有用水平的对特定HPPD抑制剂除草剂化学的抗性的HPPD酶的效果的手段，其经由使用降解某些、下文规定的、HPPD抑制剂除草剂化学的细胞色素P450酶来实现。另外，这些细胞色素P450酶的表达还提供了以下手段，即其降低持久存在于植物组织中的母体活性除草剂的量，因此降低由于向食物或饲料作物的应用而进入食物和饲料链的母体除草剂残基的总量。
另外，本文中所公开的基因还提供了一种用于提供对多种异生素的抗性的备选方法，所述异生素包括除草剂，并包括诸如具有非HPPD作用模型的磺酰脲类(Sulfonylureas)的一些类型。
发明概述
提供了用于将除草剂抗性或耐受性赋予植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包括转基因植物、植物细胞、组织、和种子，它们已经单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地用编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化。具体地，细胞色素P450或其变体赋予对HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类(Benzothiadiazinones)、磺酰脲类、和其它类型的除草剂(包括例如咪唑啉酮类(Imidazolinones)、三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸类(Pyrimidinylthiobenzoates)、三唑啉酮类(Triazolinones)、生长素类(Auxins)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类(Acetyl-coenzyme ACarboxylase inhibitors)、光系统II(PSII)抑制剂类(Photosystem II inhibitors)、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类(Protoporphyrinogen Oxidase(PPO)inhibitors)、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类(Phytoene Desaturaseinhibitors)、二硝基苯胺类(Dinitroanalines)、和乙酰胺类)以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯(Difenzoquat)和异噁草酮(Clomazone)的抗性或耐受性。别的多肽也可以赋予对除草剂(包括HPPD抑制剂类和其它除草剂)的抗性或耐受性。还提供了用于生成和使用本发明的除草剂抗性或耐受性植物、植物细胞、组织和种子的方法。
本发明提供了SEQ ID NO：2、4、和6中所示基因序列，其编码在植物中表达时能够降解HPPD除草剂类的某些除草剂的细胞色素P450酶。本发明还涉及过表达SEQ ID NO：2、4、和6中所示P450的经转化植物，用于在植物中过表达所述基因的遗传构建体，并涉及向HPPD抗性植物，特别是田地中的作物植物过多应用HPPD类除草剂(单独地和与其它除草剂组合地两者)以进行杂草控制而不损害作物植物。本发明还涵盖在同一植物中组合P450基因与赋予对其它除草剂的抗性的基因，例如赋予对草甘膦(glyphosate)的抗性的EPSPS基因(例如，具有对草甘膦的天然耐受性的EPSPS基因)，和赋予对草铵膦(glufosinate)的抗性的膦丝菌素乙酰基转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)基因(PAT和BAR基因，记载于美国专利号5,561,236和5,276,268)。此外，本发明还提供了具有降低的HPPD除草剂残留水平的植物。
附图简述
图1显示了一种DNA构建体，其包含：1)如下盒，其具有在上游启动子(例如，Rubisco启动子区的小亚基，包括5’非翻译前导序列)和下游胭脂氨酸合酶3’终止子序列可操作表达控制下的经修饰燕麦属(Avena)HPPD基因；2)如下DNA序列，其编码在上游拟南芥或大豆多聚遍在蛋白启动子和5’非翻译前导序列和来自组蛋白基因的下游3’终止子序列可操作控制下的玉米nsf1蛋白序列(SEQ ID NO：2)。
图2显示了涉及在本发明中使用的细胞色素P450酶的多核苷酸和氨基酸序列的列表。
图3显示了含有CYP72A1编码区的二元载体17107的图谱。
图4显示了含有NSF编码区的二元载体17108的图谱。
发明详述
总论
本发明涉及重组DNA技术，并且具体地，涉及如下转基因植物的产生：(i)在与非转基因样(类)植物相比时展示出对除草剂的实质(substantial)抗性或实质耐受性的转基因植物；和(ii)在同样地与此类非转基因样植物相比时具有增强的将某些除草剂转化成氧化代谢物的能力的转基因植物。本发明还涉及在产生所述转基因植物中使用时，或者在由所述转基因植物产生时的核苷酸序列(及其表达产物)等。本发明的组合物包括转基因植物、植物细胞、组织、和种子，它们已经单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地用编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化。具体地，细胞色素P450或其变体赋予对HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、和其它类型的除草剂(包括例如咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺类)以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯和异噁草酮的抗性或耐受性。别的多肽也可以赋予对除草剂(包括HPPD抑制剂类和其它除草剂)的抗性或耐受性。还提供了用于生成和使用本发明的除草剂抗性或耐受性植物、植物细胞、组织和种子的方法。
在本发明的上下文内，术语羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(HPPD)、4-羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(4-HPPD)和对羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(p-HPPD)是同义的。
如本文中所使用的，对除草剂具有实质“耐受性”的植物在它们经受所述除草剂时提供如下剂量/响应曲线，其在与由类似经历的非耐受样植物所提供的剂量/响应曲线相比时转向右侧。此类剂量/响应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“百分比杀死或损伤”，“除草效果”等。典型地，耐受性植物会需要为非耐受样植物至少2倍的除草剂来产生给定的除草效果。对除草剂具有实质“抗性”的植物在经受通常由农业界采用来杀死耕地中的杂草的浓度和比率的除草剂时展现出很少(若有的话)坏死的、溶解的、褪绿病的或其它损害。
如本文中所使用的，“非转基因样植物”指与转基因植物类似或相同但其不含有赋予除草剂抗性的转基因的植物。
如本文中所使用的，术语“赋予”指向植物提供特征或性状，诸如除草剂耐受性或抗性和/或其它想要的性状。
这里所公开的是一种用于给予对如下除草剂耐受的作物植物(谷物/玉米(corn)、稻、玉米(maize)、小麦、大麦、大豆、油菜/芸苔、棉花等)的方法：通过抑制羟苯基丙酮酸盐双加氧酶(HPPD)起作用的除草剂，或其它除草剂诸如苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类，及其它种类的除草剂，包括例如咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺，以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯和异噁草酮。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指1个/种或超过1个/种(即至至少1个/种)该冠词的语法对象。举例而言，“元件”指一个或多个元件。贯穿整篇说明书，单词“包含”(包括，含有)会理解成意指包括规定的元件、整数或步骤、或一组元件、整数或步骤，但是不排除任何其它元件、整数或步骤、或一组元件、整数或步骤。
细胞色素P450序列
提供了细胞色素P450序列，其赋予除草剂耐受性或抗性。此类序列包括SEQ ID NO：1、3、和5中所示氨基酸序列，及其变体。还提供的是编码此类氨基酸序列的多核苷酸序列，包括SEQ ID NO：2、4、和6。
依照本公开内容的方法，用编码能够氧化某些HPPD抑制剂及还有，任选地，其它类型的除草剂的细胞色素P450酶(CYP酶)的基因转化作物植物。基因盒包含启动子和终止子区域及任选地，其它元件(诸如内含子、转录增强子、翻译增强子等)以便在作物植物中提供有效量的P450酶的表达。任选地，对编码P450酶的结构基因进行密码子优化以除去对表达不利的特征，并对密码子选择进行优化以在特定的作物中表达(参见例如，美国专利号6,051,760；EP 0359472；EP 80385962；EP 0431829；及Perlak等(1991)PNASUSA 88：3324-3328；本文通过提及而将它们完全收录)。在某些实施方案中，选择P450酶，因为其能够氧化“其它”除草剂，包括烟嘧磺隆(nicosulfuron)和/或苯达松(bentazon)，和/或因为能够氧化HPPD抑制剂除草剂硝磺草酮和/或磺草酮(sulcotrione)。在另一个实施方案中，选择P450酶，因为其氧化HPPD抑制剂，包括但不限于硝磺草酮、SYN449280、异噁氟草(Isoxaflutole)、特灭酮(Tembotrione)、Topramezone、匹拉沙托(Pyrasulfatole)、磺草酮、吡唑特(Pyrazolynate)、苄草唑(Pyrazoxyfen)、氯草酮(Isoxachlortole)、吡草酮(Benzofenap)、和苯并双环酮(Benzobicyclon)。
编码在本发明中使用的细胞色素P450酶的经优化基因的例子包括玉米nsf1(SEQ ID NO：1)、玉米CYP72A1(SEQ ID NO：3)、和稻CYP81A6(SEQ IDNO：5)。编码在本发明中使用的细胞色素P450酶的其它感兴趣多核苷酸包括但不限于编码玉米nsf1(SEQ ID NO：2)、玉米CYP72A1(SEQ ID NO：4)、和稻CYP81A6(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列的多核苷酸。
可以使用本领域中已知的方法来鉴定编码在本发明中使用的细胞色素P450酶的别的多核苷酸序列，其基于它们赋予对感兴趣的除草剂的抗性或耐受性的能力来实现。例如，将候选P450基因转化入合适的酵母菌株中，在其中表达，并基于它们在体外氧化测试除草剂的能力来选择(参见Siminszky等(1999)PNAS(USA)96：1750-1755)。合适的酵母菌株包括诸如WAT11或WAT21，其还包含合适的植物细胞色素P450能力的还原酶(例如如DenisPompon和Phillipe Urban所描述的)。诱导合适的一段时间后(例如，取决于转化载体中所使用的诱导型启动子，用半乳糖)，使细胞增长、收获、破碎、通过惯常的手段来制备微粒体级分，并用NADPH测定氧化经14C标记的硝磺草酮的能力。任选地，使用培养中的全部细胞来实施测定法。容易检测具有烯己二酮环的4和5个羟基修饰的氧化产物，并通过例如RP HPLC或TLC来与未修饰的母体分开(参见Hawkes等2001，BCPC conference Weeds，第563页)。
或者，在烟草、拟南芥、玉米或其它容易转化的、除草剂敏感的植物中表达候选P450酶，并对所得的转化体植物评估它们对HPPD抑制剂(类)(如记载于Didierjean等(2002)Plant Physiol.130：179-189中的)或其它感兴趣的除草剂的耐受性。任选地，用除草剂处理植物，或自植物采集的组织样品，并进行测定以便评估母体除草剂向氧化代谢降解产物的代谢转化速率。例如，使用经放射性标记的硝磺草酮，以及以下文献中所描述的分析方法：Hawkes等2001，BCPC conference Weeds，第563页；Alferness和Wiebe(2002)J.Agric.Food Chem.，50：3926-3934和/或Gledhill等(2004)Xenobiotica 31，733-747。适合于在作物植物中表达细胞色素P450编码序列的基因构建体包含细胞色素P450编码序列上游的植物合适的启动子和5’前导序列(例如CMV35S启动子或肌动蛋白启动子区域)和细胞色素P450编码序列下游的合适的终止子序列(以确保多聚腺苷酸化(例如nos基因3’序列)。任选地，构建体可以包含别的序列诸如翻译和转录增强子和/或修饰DNA序列以在宿主植物中最佳的表达。
如本文中所使用的，有意义的氧化速率定义为足以在转基因植物中提供对给定底物除草剂的耐受性明显(大于约2X)增加的催化速率，其中相对于类似处理的非转基因对照植物，所述转基因植物表达给定的P450酶达多至0.2％的总细胞蛋白。
在本公开内容的一个实施方案中，编码合适的P450酶的基因选自通过标准方法(例如使用来自Stratagene的λ-ZAPII载体试剂盒)自玉米或稻植物的3-7天龄幼苗制备的玉米或稻cDNA文库。任选地，合适的候选P450编码序列选自用1-50ppm硝磺草酮或其它HPPD抑制剂，或用烟嘧磺隆进行的约24h处理内诱导的那些P450。另外，合适的候选P450编码序列选自玉米组织中用安全水平的cyprosulfamide、双苯噁唑酸(isoxadifen)和/或CGA24678进行的24h处理内诱导的那些P450；或者在其它谷类中用解毒喹(cloquintacet)和/或mefenpyr处理后诱导的那些P450。这可以容易地通过经由Northern印迹分析、差别展示分析，和/或用包含针对感兴趣植物物种的所有或大多数P450基因的探针的RNA芯片测量(相对的)转录物水平来实现。或者，通过PCR和例如用于检测包含细胞色素P450特征性血红素结合区的克隆的经放射性标记的核苷酸的掺入来筛选文库。例如可以使用用于血红素基序区的简并5’引物(Ohbayashi等1993)，以及设计用于聚A尾的3’引物(参见Persans等(2001)Plant physiol.，125：1126)。使用如此生成的、经标记的PCR产物来再筛选所述文库以回收全长cDNA，然后对所述全长cDNA测序。通过例如上文的方法或本领域中已知的其它方法(参见US6380465和US6121512及其中所引用的所有参考文献；参见Persans等(2001)Plant physiol.，125：1126)来获得候选P450基因，然后经由表达它们的方法来选择，并测定它们在合适的测试系统中对特别是硝磺草酮或其它HPPD抑制剂(类)或烟嘧磺隆的氧化(或提供抗性)的能力。
一种用于选择合适的P450酶的备选方法是经由对牵涉对感兴趣除草剂的抗性的P450基因的遗传作图。若基于差别P450响应存在具有对除草剂的耐受性的品系和具有对除草剂的抗性的品系，则这是有可能的。以对候选CYP基因(可经由序列同源性和通过其特征性血红素基序容易识别的；参见Bortiri等(2006)Current Opinion in Plant Biology 9：164-171)的精微结构QTL作图和测序为例。例如，甜玉米(例如Merit)的某些品系和杂种对硝磺草酮易感，并且经由与耐受性品种的常规杂交研究和标志物的使用，有可能绘制与此易感性有关的QTL的图谱。我们先前已经显示了，经处理的玉米植物中硝磺草酮水平随着时间降低，这是由于基于P450的降解机制。Merit植物似乎在此降解步骤中有缺陷。如此，预期与差别响应有关的QTL含有降解硝磺草酮的一种或多种P450基因。若基因组序列存在绘图间隔，则可以鉴定候选CYP基因。或者，对包含QTL的BACS(细菌人工染色体克隆)进行测序，并鉴定候选CYP基因。通过比较耐受性和敏感性品种中的P450等位基因序列，鉴定出候选CYP基因(并且是特别容易地，若例如在敏感性品种中有明显的基因缺损和/或表达缺乏)。
例如，与本发明有关，已知少量玉米品系对硝磺草酮敏感，而少量对烟嘧磺隆敏感。这2组部分重叠(参见HortScience(2005)40：1801-1805和表1中列表)。表1是基于用硝磺草酮和烟嘧磺隆筛选玉米品系(Syngenta，Toulouse，FR)。仅显示了通过筛选约400种品系得到的具有最高耐受性和最高敏感性的品系。
表1.对硝磺草酮或烟嘧磺隆的耐受性和对硝磺草酮和烟嘧磺隆的敏感性之间存在广义相关性*。
Figure GPA00001010481400101
Figure GPA00001010481400111
*用于评分的等级：1至9等级，其中1＝最具抗性的品系而9＝最易感的品系。无阴影框是对硝磺草酮(
Figure GPA00001010481400112
)最具抗性的基因型。阴影框是对硝磺草酮(
Figure GPA00001010481400113
)最易感的基因型。
**
Figure GPA00001010481400114
(硝磺草酮)处理：浓度等于60g活性物/ha，在V2阶段喷洒，喷洒后10天评分。
***
Figure GPA00001010481400115
(烟嘧磺隆)处理：浓度等于24g活性物/ha，在V2阶段喷洒，喷洒后10天评分。
遗传分析指明，赋予对硝磺草酮和烟嘧磺隆耐受性/易感性的基因在玉米基因组中紧密连锁。M.Williams等(2006，Corn Genetics Conference，Asiloma)，使用基于克隆办法的图谱来克隆定位于bin 5.01中的调节(condition)玉米植物的烟嘧磺隆响应的P450基因，即nsf1基因。具有对硝磺草酮和磺草酮(硝磺草酮的一种紧密的同系物)的易感性的玉米品系中的一处硝磺草酮耐受性QTL已经被绘制至玉米基因组位置bin 5.01。我们从B73 BAC b0159B4对此基因进行测序，并推导出氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。第2种和第3种P450基因定位于含有此nsf1的BAC上(基因160842和136090)。SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8是自这2种P450基因推导出的氨基酸序列。
如此，上文的所有3种P450基因是能够降解硝磺草酮的候选P450基因。另外，序列列表(图2)中所列出的所有基因/P450酶是在本发明中使用的候选基因。
如此，合适的P450基因选自包含可通过上文所描述的方法获得的上文的候选细胞色素P450基因和包括那些来自玉米和来自稻及还有其它物种(包括例如长春花(Catharanthus roseus)(SEQ ID NO：9；还可参见序列列表，图2))的候选细胞色素P450基因的列表。
一旦鉴定出一种能够降解这些除草剂的P450基因，本领域技术人员还可以基于基因组同线性和序列相似性找到别的基因候选。在一个实施方案中，可以通过使用基于上文所记录的细胞色素P450核苷酸序列的序列进行的杂交或PCR来获得别的基因候选。
在PCR办法中，可以设计在PCR反应中使用的寡核苷酸引物以从自任何感兴趣植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。一般而言，用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域中已知的。参见例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)。还可参见Innis等编(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；及Innis和Gelfand编(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。
在杂交技术中，使用整个或部分已知多核苷酸作为探针，其选择性与存在于来自选定生物体的一群克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)中的其它相应多核苷酸杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团诸如32p，或任何其它可检测的标志物来标记。一般而言，用于制备用于杂交和用于构建cDNA和基因组文库的探针的方法是本领域中已知的，并披露于Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)。
“与...杂交”或“与...特异性杂交”指在严格条件下分子仅与特定核苷酸序列的结合、二联(duplexing)、或杂交，此时该序列存在于复杂的混合物(例如总细胞)DNA或RNA中。“基本上结合”指探针核酸和靶核酸之间的互补杂交，并包括次要错配，其可以通过降低杂交培养基的严格性来调节以实现对靶核酸序列的想要检测。
“严格杂交条件”和“严格杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如Southern和Northern杂交的上下文中是序列依赖性的，而且在不同环境参数下有所不同。较长的序列以较高的温度特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导记载于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York。一般而言，选择比特定序列在规定离子强度和pH的热熔点(Tm)低约5℃的高严格杂交和清洗条件。典型地，在“严格条件”下，探针会与其靶子序列，但不与其它序列杂交。
Tm指50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。选择等于特定探针的Tm的极严格条件。用于在Southern或Northern印迹中在滤膜上杂交具有超过100个互补残基的互补核酸的严格杂交条件的例子是50％甲酰胺及1mg肝素于42℃，其中实施杂交过夜。高度严格清洗条件的例子是0.15M NaCl于72℃达约15分钟。严格清洗条件的例子是0.2XSSC清洗于65℃达15分钟(参见Sambrook，见下文，关于SSC缓冲液的描述)。通常，高严格清洗之前有低严格清洗以除去背景探针信号。用于具有例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格清洗的例子是1X SSC于45℃达15分钟。用于具有例如超过100个核苷酸的双链体的低严格清洗的例子是4-6X SSC于40℃达15分钟。对于短探针(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常牵涉小于约1.0M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度于pH7.0至8.3，而温度通常是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现严格条件。一般而言，在特定杂交测定法中为针对无关探针所观察到的噪声比信号2X(或更高)的噪声比信号指明检测出特异性杂交。在严格条件下彼此不进行杂交的核酸仍基本上相同，若它们编码的蛋白质基本上相同。这例如在使用遗传密码容许的最大限度密码子简并性创建1个拷贝的核酸时发生。
以下是可以用于克隆核苷酸序列的杂交/清洗条件的集合的例子，所述核苷酸序列是本发明的参照核苷酸序列的同源物：优选地，参照核苷酸序列与所述参照核苷酸序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，及在2X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更想要地，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交及在1X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更想要地，仍在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交及在0.5X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，优选地，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交及在0.1X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更优选地，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交及在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃清洗。
本发明还涉及赋予对HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、和其它种类的除草剂的抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的应用。“变体”意指基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸内的一处或多处内部位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸中的一处或多处位点的一个或多个核苷酸的替代。如本文中所使用的，“天然的”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括编码上文所描述的在本发明中使用的细胞色素P450酶的那些序列(由于遗传密码的简并性)。可以通过使用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的等位基因变体，如例如用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，如上文所概述的。变体多核苷酸还包括合成方法衍生的多核苷酸，诸如那些通过例如使用定点诱变生成但仍编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450酶的。一般而言，本发明的特定多核苷酸的变体会与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。
本发明包括编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450的特定多核苷酸的变体，并可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评估。可以使用下文所描述的序列比对程序和算法来计算任何两种多肽之间的百分比序列同一性。若任何给定的本发明的多核苷酸对通过比较它们编码的两种多肽所共享的百分比序列同一性来评估，则两种编码的多肽之间的百分比序列同一性是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。
用于比较的序列比对方法是本领域中公知的，并且可以通过使用数学算法来实现，诸如Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全面比对算法；及Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中那样改良的。可以利用这些数学算法的计算机实现来比较序列以确定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/基因程序(购自Intelligenetics，Mountain View，California)中的CLUSTAL；ALIGN程序(第2.0版)和GCG Wisconsin遗传学软件包，第10版(购自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)中的TFASTA、GAP、BESTFIT、BLAST、和FASTA。
还可以使用如本文中别处所描述的基因诱变和基于耐受性或抗性改善的选择的基本上类似的方法来产生和选择本发明细胞色素P450基因的改善变体。
基因堆积
在某些实施方案中，编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的多核苷酸可以与任意组合的感兴趣多核苷酸序列堆积以创建具有想要的性状的植物。如本文中所使用的，性状指自特定序列或序列组衍生的表型。例如，编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的多核苷酸可以与编码赋予想要的性状的多肽的任何其它多核苷酸堆积，所述想要的性状包括但不限于对疾病、昆虫、和除草剂的抗性，对热和干旱的耐受性，缩短的作物成熟时间，改善的工业加工，诸如用于将淀粉或生物量转化成可发酵糖，和改善的农艺学质量，诸如高的油含量和高的蛋白质含量。
可以与编码除草剂抗性或耐受性细胞色素P450或其变体的多核苷酸堆积的例示性多核苷酸包括编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽具有杀虫和/或杀昆虫活性诸如其它苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(记载于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；及Geiser等(1986)Gene 48：109)、凝集素(Van Damme等(1994)Plant Mol.Biol.24：825)、pentin(记载于美国专利号5,981,722的)等；对于疾病或除草剂抗性想要的性状(例如，烟曲霉毒素(fumonisin)解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒力和疾病抗性基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酸乳酸合酶(ALS)突变体，诸如S4和/或Hra突变；草甘膦抗性(例如，5-烯醇-丙酮酸(pyrovyl)-莽草酸-3-磷酸-合酶(EPSPS)基因，其记载于美国专利号4,940,935和5,188,642；或草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)基因，其记载于Castle等(2004)Science，304：1151-1154；及美国专利申请公开文本号20070004912，20050246798，和20050060767))；草铵膦抗性(例如膦丝菌素乙酰基转移酶基因PAT和BAR，其记载于美国专利号5,561,236和5,276,268)；和对于加工产物或方法产物想要的性状诸如高油(high oil)(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(modified oil)(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶(ketothiolase)、聚羟基丁酸酯合酶、和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)的表达)；本文通过提及而收入它们的公开内容。
如此，在一个实施方案中，编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的多核苷酸可以与编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的多肽的一种或多种多核苷酸堆积。在一个实施方案中，所述想要的性状是对HPPD抑制剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所述想要的性状是对草甘膦的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所述想要的性状是对草铵膦的抗性或耐受性。
可以通过任何方法来创建这些堆积的组合，包括但不限于通过任何常规的或顶交(topcross)方法来杂交植物，或者遗传转化。若通过遗传转化所述植物来堆积序列，则可以在任何时候且以任何顺序组合感兴趣的多核苷酸序列。例如，可以使用包含一种或多种想要的性状的转基因植物作为靶物以通过后续转化来导入别的性状。可以在共转化方案中与由任意组合的转化盒提供的感兴趣多核苷酸同时导入性状。例如，若要导入两种序列，则所述两种序列可以包含在分开的转化盒(反式)中或者包含在同一转化盒(顺式)上。序列的表达可以由相同启动子或由不同启动子驱动。在某些情况中，可能想要导入会阻抑感兴趣多核苷酸表达的转化盒。这可以与任意组合的其它阻抑盒或过表达盒组合以在植物中产生想要的性状组合。进一步认可的是，可以使用位点特异性重组系统在想要的基因组位置堆积多核苷酸序列。参见例如，WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855，和WO99/25853，本文中通过提及而它们完全收入。
在一个实施方案中，不仅用表达所述P450酶的基因转化作物植物，而且还用表达异源HPPD酶的基因转化作物植物。可以将P450基因和HPPD基因导入分开的事件中，并杂交这些事件或其后代以便在单一植株中组合所述基因。或者，在单一DNA分子内组合P450和HPPD基因两者，将所述单一DNA分子转化入作物植物中。在别的实施方案中，所述HPPD基因衍生自单子叶植物、谷类植物或，更优选，小麦、燕麦或玉米植物，并且披露于例如PCT申请WO 02/46387。任选地，可以将HPPD酶靶向至细胞位置，以增强表达/积累水平，或者以便增强活性水平。例如，所述HPPD可以经由与合适的转运肽(transit peptide)融合而靶向质体。合适于在作物植物中表达HPPD的HPPD基因、构建体、启动子区、5’前导序列、终止子等也记载于例如WO0246387，WO 0032757，和WO 9904021。任选地，可以直接将所述HPPD基因转化入目标植物的叶绿体的原质体系中，以进行高水平酶积累。
在别的实施方案中，所述HPPD基因序列编码燕麦HPPD酶序列，其在这里是SEQ ID NO：10(WO 0246387中的SEQ ID NO：4)，其中在该蛋白质的N端部分内有以下少量的序列修饰。使SEQ ID NO：10内的序列基序AATAAATASIPS缩短以阅读AATAATASIPS(SEQ ID NO：11)或改变以阅读AATAATTASIPS(SEQ ID NO：12)或改变以阅读AADAAATASIPS(SEQ IDNO：13)或进行这3种变化的任意组合。所得的酶被描述为“经修饰的燕麦HPPD”。在一个实施方案中，与编码经修饰的燕麦HPPD的基因序列组合，用编码选自下组的细胞色素P450酶的基因转化作物植物：nsf1(SEQ IDNO：1)、玉米CYP72A1(SEQ ID NO：3)、和稻CYP81A6基因(SEQ ID NO：5)。
在进一步实施方案中，修饰例如燕麦基因或另一种植物衍生的HPPD序列以增强对一种或多种HPPD抑制剂类的耐受性(参见例如美国专利申请公开文本号20080076178，本文通过提及而将其完整收入)。所得的酶被描述为“经修饰的HPPD”。可以使用本领域中已知的标准方法来在HPPD酶基因中导入变化，这导致所编码的酶对HPPD酶抑制剂类的耐受性增强。这些方法包括基因改组、定向突变、随机突变、和基因位点饱和诱变(Gene Site SaturatedMutagenesis，GSSM)。可以在生物学系统中对推定的HPPD基因突变体筛选在存在以抑制野生型酶的浓度存在的抑制剂的情况中的活性。
可以通过本领域中公知的许多方法来选择合适的抗性和功能性HPPD基因突变体。例如，在酵母中、在细菌宿主菌株中、在藻类中或在高等植物诸如烟草或拟南芥中表达通过诱变生成的候选HPPD编码序列，并依照观察到的抗性或耐受性水平，或者，经转化菌株或植物在存在不同浓度的选定HPPD抑制剂类的情况中的可见的指示表型来筛选HPPD编码序列的固有耐受性的相对水平。方便地以如下术语表述剂量响应和与这些指示表型(褐色的形成、生长抑制、除草效果等)有关的剂量响应中的相对移位：例如，GR50(50％生长减缓浓度)或MIC(最低抑制浓度)值，其中数值增加对应于所表达HPPD固有耐受性的升高。鉴定出合适的抗性和功能性基因突变体后，可以通过动力学分析，例如通过酶活性和抑制剂结合特征来进一步分析所编码的酶。
宿主生物体、指示表型和对照HPPD的许多组合会实现类似的选择范围，并且这些涵盖在本发明的范围内。例如，在基于细菌诸如大肠杆菌(E.coli)转化的相对快速的测定法系统中，可以例如以DNA序列在可控制的启动子诸如lacZ启动子的表达控制下表达每种HPPD编码序列，并适当考虑(例如通过使用合成DNA)诸如密码子选择等问题以便获得不同HPPD序列的尽可能相当的表达水平。可以在任选地，补充有酪氨酸的培养基中在不同浓度的选定除草剂上铺板显出(plate out)表达包含备选候选HPPD序列的多核苷酸的此类菌株，并基于抑制褐色、褐黄病色素形成的程度和MIC来评估所表达HPPD酶的固有耐受性的相对水平。在该方法的变型中，所述细胞可以是渗透化的(permeabilized)，或者特别在酵母的情况中，是具有失效泵(disabled pump)的菌株以便使HPPD抑制剂类出入细胞的差别摄取和输出的效应最小化。在一种变型中，在液体培养基中将细菌细胞几乎培养至稳定期，暴露于选定的除草剂达1小时或更少的一段短时间，在类似体积的新鲜培养基中重悬，并监测色素形成速率。在另一种变型中，将候选HPPD表达序列转移至穿梭载体，并且与先前的变型类似的是，各以相当的水平表达，只是在此情况中，在合适的假单胞菌(Pseudomonas)物种诸如能够被转化并在作为唯一碳源的酪氨酸上生长的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达。优选地，通过例如抗生素标志基因的重组插入来敲除宿主假单胞菌系的内源HPPD基因。将各被转化成表达备选抗性HPPD酶的假单胞菌系各自在不同浓度的选定HPPD抑制剂类上培养，并基于在含有作为唯一碳源的酪氨酸的培养基上阻止生长所必需的浓度来评估所表达HPPD序列相对于每种HPPD抑制剂的固有抗性。在最终的选择步骤中，可以将一小列候选多核苷酸转化入植物材料中，将所述材料再生成形态学正常的能育植株，然后对所述植株测量对选定HPPD抑制剂除草剂类的差别耐受性。
植物表达盒
本发明的组合物可以另外含有用于在感兴趣的植物中转化和表达的核酸序列。核酸序列可以存在于DNA构建体或表达盒中。如本文中所使用的，“表达盒”指能够指导特定的核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的核酸分子，包含与感兴趣核苷酸序列(即除草剂抗性或耐受性细胞色素P450多核苷酸，单独地或与一种或多种编码赋予想要的性状的多肽的附加的核酸分子组合地)可操作连接的启动子，所述感兴趣核苷酸序列与终止信号可操作连接。典型地，其还包含用于正确翻译核苷酸序列所要求的序列。编码序列通常编码感兴趣的蛋白质，但是也可能以有义或反义方向编码感兴趣的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含感兴趣核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着其构件的至少一项相对于其其它构件的至少一项是异源的。表达盒还可以是天然存在的但是已经以对于异源表达有用的重组形式获得的表达盒。典型地，然而，表达盒相对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然存在，而且必须已经通过转化事件而被导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。核苷酸序列在表达盒中的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子仅在宿主细胞被暴露于某些特定的外部刺激物时才启动转录。另外，启动子还可以是特定组织或器官或发育阶段特异性的。
本发明涵盖单独地或与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地，用能够表达感兴趣的多核苷酸，即编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的多核苷酸的表达盒转化植物。表达盒会包含沿5’-3’方向转录的转录和翻译起始区(即启动子)和多核苷酸。任选地，表达盒可以包含在植物中有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，表达盒包含选择标志基因以容许选择合适的转化体。本发明的表达构建体还可以包含前导序列和/或容许感兴趣多核苷酸诱导型表达的序列。参见Guo等(2003)Plant J.34：383-92和Chen等(2003)Plant J.36：731-40，其关于容许诱导型表达的序列的例子。
表达构建体的调节序列与感兴趣的多核苷酸可操作连接。“可操作连接的”意指启动子和第二序列之间的功能联锁，其中所述启动子序列启动和介导与所述第二序列对应的DNA序列的转录。一般而言，可操作连接的指被连接的核苷酸序列是邻近的。
能够在感兴趣植物中驱动表达的任何启动子可以在本发明的实践中使用。启动子对于植物宿主而言可以是天然的或类似的或外来的或异源的。术语“异源的”和“外源的”在本文中使用时指核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因，指源自于对于特定宿主细胞而言外来的来源的序列或者，若来自相同来源，则自其初始形式修饰的序列。如此，宿主细胞中的异源基因包括如下基因，其对于特定宿主细胞而言是外源的，但是已经经由例如使用DNA改组来修饰过。所述术语还包括非天然存在的多个拷贝的天然存在的DNA序列。如此，所述术语指如下DNA区段，其对于细胞而言是外来的或外源的，或者对于细胞而言是同源的，但是在宿主细胞核酸内通常找不到该元件的位置中。表达外源DNA区段以产生外源多肽。
“同源”核酸(例如DNA)序列指与将其导入的宿主细胞天然有关的核酸(例如DNA或RNA)序列。
要包括的启动子的选择取决于数种因素，包括但不限于功效、可选择性(selectability)、可诱导性、想要的表达水平、和细胞或组织优先的表达。调节序列的表达对于本领域技术人员是常规的事，其通过适当地选择和相对于该序列定位启动子和其它调控区来实现。用于表达转基因的启动子可以是强的植物启动子、病毒启动子、或嵌合启动子，其由以下元件构成，诸如：来自任何基因的TATA框(或合成的，基于对植物基因TATA框的分析)，其任选地与植物启动子(其指导组织和时间合适的基因表达)的TATA框的5’区融合，任选地，其与1种或多种增强子(诸如35S增强子、FMV增强子、CMP增强子)融合。
例示性的组成型启动子包括例如，WO 99/43838和美国专利号6,072,050中所披露的Rsyn7启动子的核心启动子和其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；及6,177,611。
合适的植物或嵌合启动子对于诸如在某些组织中表达转基因而在其它组织(诸如种子或繁殖组织)中使表达最小化的应用是有用的。在一些实施方案中，任选地，可以将本发明细胞色素P450基因的表达定位于种子或果实组织以便进一步氧化掉达到这些组织的母体除草剂的任何残留。例示性的细胞类型或组织优先的启动子优先在靶组织中驱动表达，但是还可以导致在其它细胞类型或组织中的一些表达。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区域的方法包括例如那些记载于以下参考文献中的：Jordano等，植物细胞，1：855-866(1989)；Bustos等，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green等，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier等，Plant Cell，3，309-316(1991)；及Zhang等，PlantPhysiology 110：1069-1079(1996)。
在本发明的其它实施方案中，诱导型启动子可能是想要的。诱导型启动子应答外部刺激物诸如化学剂或环境刺激物而驱动转录。例如，诱导型启动子可以应答激素诸如赤霉酸或乙烯，或者应答光或干旱而赋予转录。
多种转录终止子可用于在表达盒中使用。这些负责转基因外的转录终止和正确的mRNA多腺苷酸化。终止区及转录起始区可以是天然的，终止区及可操作连接的感兴趣DNA序列可以是天然的，终止区及植物宿主可以是天然的，或者终止区可以衍生自另一种来源(即对于启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主、或其任意组合而言是外来的或异源的)。合适的转录终止子是那些已知在植物中运行的，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。这些可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。另外，可以使用基因的天然转录终止子。
一般而言，表达盒会包含用于选择经转化细胞的选择标志基因。利用选择标志基因来选择经转化的细胞或组织。
已经从转录单元内找到增强基因表达的许多序列，并且这些序列可以与本发明的基因一起使用以提高其在转基因植物中的表达。
已经显示了多种内含子序列增强表达，特别在单子叶植物细胞中。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子在被导入玉米细胞中后显著增强野生型基因在其关联启动子下的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰基转移酶基因的融合构建体中是特别有效的，而且表达增强(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在相同实验系统中，来自玉米Bronze 1基因的内含子在增强系统中具有类似的效果。已经常规地将内含子序列掺入植物转化载体中，通常在非翻译前导内。
还已知自病毒衍生的许多非翻译前导序列增强表达，并且这些在双子叶植物细胞中是特别有效的。具体地，已经显示了来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑点病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus，MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达中是有效的(例如Gallie等Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski等Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其它前导序列包括但不限于：微小核糖核酸病毒(picomavirus)前导，例如，EMCV前导(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导，例如，TEV前导(烟草蚀斑病毒)(Allison等，1986)；MDMV前导(玉米矮花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))；Virology 154：9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导，(Macejak，D.G.和Samow，P.，Nature 353：90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导，(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，Nature 325：622-625(1987)；烟草花叶病毒前导(TMV)，(Gallie，D.R.等，Molecular Biology of RNA，第237页-第256页(1989)；及玉米褪绿斑点病毒前导(MCMV)(Lommel，S.A.等，Virology81：382-385(1991)。还可参见Della-Cioppa等，Plant Physiology 84：965-968(1987)。
植物
如本文中所使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括可以再生植株的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物，植物或植物部分中完整的植物愈伤组织、植物块、和植物细胞，诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核/仁(kernel)、穗、穗轴(cob)、外壳(husk)、柄(stalk)、根、根尖、花药等。
本发明中有用的植物包括在编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的至少一种多核苷酸(单独地或与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地)方面转基因的植物。选定的植物类型取决于多种因素，包括例如所收获植物材料的下游用途、植物物种进行转化的可控制性(amenability)、和要培养、收获、和/或加工植物的条件。本领域技术人员会进一步认可，用于选择在本发明中使用的合适的植物品种的别的因素包括高产率潜力、良好的柄强度、对特定疾病的抗性、干旱耐受性、快速的彻底干燥(dry down)和足以容许以最少的损失贮存和向市场运输的谷粒质量。
依照本发明的植物包括出于产生人或动物为了经口消耗或者在工业、制药、或商业过程中利用而寻找的植物材料的目的而栽培的任何植物。可以将本发明应用于多种植物之任一种，包括但不限于玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、高粱(sorghum)、豆类(beans)，一般而言，油菜/芸苔、苜蓿、亚麻(flax)、向日葵、红花(safflower)、黍(millet)、黑麦(rye)、甘蔗、糖甜菜、可可(cocoa)、茶、芸苔属(Brassica)、棉花、咖啡、甘薯(sweet potato)、亚麻、花生、三叶草(clover)；蔬菜(vegetables)诸如莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、兵豆(lentils)、甘蓝/卷心菜(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、嫩茎花椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprout)、胡椒、和凤梨/菠萝(pineapple)；树果实诸如柑桔(citrus)、苹果、梨、桃、杏、胡桃、鳄梨、香蕉、和椰子；和花诸如兰花(orchid)、麝香石竹(carnation)和玫瑰/蔷薇(rose)。在本发明的实践中有用的其它植物包括多年生牧草(perennial grass)，诸如柳枝稷(switchgrass)、北美草原草(prairie grass)、假高粱属(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)等。认可的是可以使用植物的混合物。
另外，术语“作物”要理解为包括已经由于常规的育种或遗传改造方法而给予对除草剂或除草剂种类(诸如例如ALS抑制剂类，例如氟嘧磺隆(primisulfuron)、氟磺隆(prosulfuron)和三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)，EPSPS(5-烯醇-丙酮酸-莽草酸-3-磷酸-合酶)抑制剂类、GS(谷氨酰胺合成酶)抑制剂类)的耐受性的作物。已经通过遗传改造方法而给予对除草剂或除草剂种类的耐受性的作物的例子包括可以商品名Roundup
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和Liberty
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购得的草甘膦和草铵膦抗性作物品种。依照本发明的方法特别适合于保护如下大豆作物，所述大豆作物也已经给予对草甘膦和/或草铵膦的耐受性，且其中在杂草控制项目中使用HPPD除草剂以及其它此类除草剂(草铵膦和/或草甘膦)以进行杂草控制。
进一步涵盖的是，可以将本发明的构建体导入具有对于特定下游用途合适的或最佳的改良特性的植物品种中。例如，天然存在的遗传变异性导致具有对HPPD抑制剂类或其它除草剂的抗性或耐受性的植物，并且此类植物在本发明的方法中也是有用的。可以通过杂交提供耐受性水平的转基因与展现出对HPPD抑制剂类的耐受性水平增强的大豆栽培种来进一步优化依照本发明的方法，所述对HPPD抑制剂类的耐受性水平增强在小百分比的大豆系中找到。
植物转化
一旦已经将除草剂抗性或耐受性细胞色素P450多核苷酸(单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地)克隆入表达系统中，便将其转化入植物细胞中。可以以许多本领域认可的方式将本发明的受体和靶表达盒导入植物细胞中。术语“导入”在多核苷酸(例如感兴趣的核苷酸构建体)的背景中意图指以如下方式向植物呈递多核苷酸以使得多核苷酸接近(gain access to)植物细胞内部。若要导入超过1种多核苷酸，则可以以单一核苷酸构建体的一部分，或者以分开的核苷酸构建体装配这些多核苷酸，并可以定位于同一或不同转化载体中。因而，可以在单一转化事件中，在分开的转化事件中，或者例如在植物中，作为育种方案的一部分将这些多核苷酸导入感兴趣的宿主细胞中。本发明的方法不依赖于用于将一种或多种多核苷酸导入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸接近至少一个植物细胞的内部。用于将多核苷酸导入植物中的方法是本领域中已知的，包括但不限于瞬时转化方法、合适的转化方法、和病毒介导的方法。
“瞬时转化”在多核苷酸的背景中意图指多核苷酸被导入植物中，但不整合入植物基因组中。
“稳定导入”或“稳定导入的”在被导入植物中的多核苷酸的背景中意指所导入的多核苷酸被稳定整合入植物基因组中，如此所述植物是用所述多核苷酸稳定转化的。
“稳定转化”或“稳定转化的”意指被导入植物中的多核苷酸(例如本文中所描述的核苷酸构建体)整合入植物基因组中，并且能够被其后代，更具体地，被多个连续世代的后代遗传得到。
可用于植物转化的多种转化载体是植物转化领域普通技术人员已知的，并且与本发明有关的基因可以与任何此类载体一起使用。载体的选择会取决于优选的转化技术和用于转化的靶物种。对于某些靶物种，可以优选不同抗生素或除草剂选择标志。在转化中常规使用的选择标志包括nptll基因，其赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing和Vierra Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))；pat和bar基因，其赋予对除草剂草铵膦(也称作膦丝菌素；参见White等，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990)及美国专利号5,561,236和5,276,268)的抗性；hph基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol.Cell Biol.4：2929-2931)；和dhfr基因，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))；EPSPS基因，其赋予对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)基因，其也赋予对草甘膦的抗性(Castle等(2004)Science，304：1151-1154；美国专利申请公开文本号20070004912，20050246798，和20050060767)；及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，其提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。
用于再生植物的方法也是本领域中公知的。例如，已经利用Ti质粒载体来进行外来DNA投递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、微注射、和微粒。另外，可以利用来自土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌来转化植物细胞。下文是用于转化双子叶植物和单子叶植物两者的代表性技术，以及代表性质粒转化技术的描述。
许多载体可用于使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行的转化。这些通常携带至少一种T-DNA边界序列，并包括诸如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))的载体。关于在土壤杆菌转化中有用的载体的构建，参见例如美国专利申请公开文本号2006/0260011，本文中通过提及而将其收入。
在不使用根癌土壤杆菌的情况中进行的转化避免要求选定转化载体中的T-DNA序列，随后在诸如上文所描述的含有T-DNA序列的载体等的载体外可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括经由颗粒轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和微注射进行的转化。载体的选择主要取决于对所转化物种进行的优选选择。关于此类载体的构建，参见例如美国申请号20060260011，本文通过提及而将其收入。
对于本发明的核苷酸序列在植物质体中的表达，使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将核苷酸序列插入pPH143中，由此替代(replacement)PROTOX编码序列。然后使用此载体进行质体转化，并对转化体选择壮观霉素抗性。或者，在pPH143中插入核苷酸序列以使得其替代aadH基因。在此情况中，对转化体选择对PROTOX抑制剂的抗性。
用于双子叶植物的转化技术是本领域中公知的，并且包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术牵涉直接由原生质体或细胞摄取外源遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄取、颗粒轰击介导的投递、或微注射来实现。这些技术的例子记载于Paszkowski等，EMBO J.3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，及Klein等，Nature 327：70-73(1987)。在每种情况中，使用本领域已知的标准技术来将所转化的细胞再生成全植物。
土壤杆菌介导的转化是用于转化双子叶植物的优选技术，这是由于其高转化效率和其与许多不同物种的广泛效用。土壤杆菌转化通常牵涉将携带感兴趣的外来DNA的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)转移至合适的土壤杆菌菌株，其可能取决于同时驻留(co-resident)Ti质粒或染色体上的由宿主土壤杆菌菌株所携带的vir基因的互补物(例如用于pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542(Uknes等Plant Cell 5：159-169(1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌，即携带诸如pRK2013的质粒并能够使重组二元载体转移至靶土壤杆菌菌株的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配规程来实现重组二元载体向土壤杆菌的转移。或者，可以通过DNA转化将重组二元载体转移至土壤杆菌(Hofgen和Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。
通过重组土壤杆菌进行的靶植物物种的转化通常牵涉土壤杆菌与来自植物的外植体的共培养，并遵循本领域中公知的方案。在选择培养基上再生经转化的组织，其携带在二元质粒T-DNA边界之间存在的抗生素或除草剂抗性标志物。
用基因转化植物细胞的另一种办法牵涉在植物组织和细胞处推进惰性或生物学活性颗粒。此技术披露于Sanford等的美国专利号4,945,050，5,036,006，和5,100,792。一般而言，此规程牵涉在细胞处在有效渗透细胞外表面，并且能给予在其内部内的掺入的条件下推进惰性或生物学活性颗粒。在利用惰性颗粒时，可以通过用含有想要的基因的载体包被颗粒来将载体导入细胞中。或者，可以以载体围绕靶细胞以使得通过激发(wake)颗粒来将载体携带入细胞中。还可以将生物学活性颗粒(例如干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各含有寻求被导入的DNA)推入植物细胞组织中。
大多数单子叶植物物种的转化现在也已经变为常规的。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术向原生质体中直接进行基因转移，和向愈伤组织中进行的颗粒轰击。转化可以用单一DNA种类或多个DNA种类(即共转化)进行，并且这些技术都适合与本发明一起使用。共转化可以具有以下优点：即避免完全的载体构建和产生在感兴趣基因和选择标志方面具有不连锁的基因座的转基因植物，使得能够在后续世代中除去选择标志，这应当被视为不想要的。然而，使用共转化的缺点在于分开的DNA种类以小于100％的频率整合入基因组中(Schocher等Biotechnology 4：1093-1096(1986))。
专利申请EP 0292435，EP 0392225，和WO 93/07278描绘了用于从玉米良种(elite)近交系制备愈伤组织和原生质体，使用PEG或电穿孔转化原生质体，和自经转化的原生质体再生玉米植株的技术。Gordon-Kamm等(PlantCell 2：603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology 8：833-839(1990))已经发表了用于使用颗粒轰击转化A188衍生的玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11：194-200(1993))描绘了用于通过颗粒轰击转化玉米良种近交系的技术。此技术利用自传粉后14-15天的玉米穗切出的1.5-2.5mm长度的未成熟玉米胚和用于轰击的PDS-1000He生物射弹装置。
稻的转化也可以通过利用原生质体的直接基因转移技术或颗粒轰击来进行。已经在Japonica型和Indica型方面描绘了原生质体介导的转化(Zhang等Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto等Nature 338：274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8：736-740(1990))。两种类型也都能使用颗粒轰击来常规地转化(Christou等Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335描绘了用于经由电穿孔来转化稻的技术。
专利申请EP 0,332,581描绘了用于产生、转化和再生早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的技术。这些技术容许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。此外，小麦转化已经记载于Vasil等(Biotechnology 10：667-674(1992))，其使用向C型可长期再生的愈伤组织的细胞中进行的颗粒轰击来实现，而且还记载于Vasil等(Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))，其使用对未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的颗粒轰击来实现。然而，用于小麦转化的优选技术牵涉通过对未成熟胚的颗粒轰击来转化小麦，并且包括基因投递之前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。轰击前，将任何数目的胚(长0.75-1mm)铺板至具有3％蔗糖(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))和用于诱导体细胞胚的3mg/l 2，4-D的MS培养基上，这容许在黑暗中进行。在选定的轰击日，自诱导培养基取出胚，并放置至渗压剂(即具有以想要的浓度，通常15％添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)上。容许胚进行质壁分离达2-3小时，然后进行轰击。每块靶平板通常有20个胚，虽然这不是至关重要的。使用标准规程将合适的基因携带质粒(诸如pCIB3064或pSOG35)沉淀至微米大小的金颗粒上。用DuPont
Figure GPA00001010481400271
氦装置射击每块胚平板，其使用约1000psi的脉冲压力使用标准80网孔筛来进行。轰击后，将胚回放入黑暗中以恢复达约24小时(仍然在渗透剂上)。24小时后，自渗透剂取出胚，并回放至诱导培养基上，在那里它们停留达约1个月，之后进行再生。约1个月后，将具有发育中的胚发生愈伤组织的胚外植体转移至再生培养基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)，其还含有合适的选择剂(在pCIB3064的情况中是10mg/l Basta而在pSOG35的情况中是2mg/l甲氨蝶呤)。约1个月后，将发育后的苗转移至称为“GA7”的较大无菌容器，其含有半强度MS、2％蔗糖、和相同浓度的选择剂。
使用土壤杆菌进行单子叶植物的转化也已经有描述。参见WO 94/00977和美国专利号5,591,616，本文通过提及而收入这两者。还可参见Negrotto等，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)，本文通过提及而将其收入。
例如，可以使用稻(Oryza sativa)来产生转基因植物。可以使用多种稻栽培种(Hiei等，1994，Plant Journal 6：271-282；Dong等，1996，Molecular Breeding2：267-276；Hiei等，1997，Plant Molecular Biology，35：205-218)。还有，可以在数量方面改变或替代下文所描述的多种培养基组分。启动胚发生应答和/或通过在MS-CIM培养基(MS基础盐类，4.3g/升；B5维生素(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH将pH调节至5.8；植物凝胶，3g/升)上培养来从成熟的胚建立培养物。接种培养应答初始阶段的成熟胚或建立的培养系，并与含有想要的载体构建体的根癌土壤杆菌菌株LBA4404(土壤杆菌)一起培养。将来自甘油贮液的土壤杆菌在固体YPC培养基(100mg/L壮观霉素和任何其它合适的抗生素)上于28℃培养2天。将土壤杆菌在液体MS-CIM培养基中重悬。将土壤杆菌培养物稀释至OD6000.2-0.3，并将乙酰丁香酮添加至终浓度200uM。添加乙酰丁香酮，之后混合该溶液与稻培养物以诱导用于将DNA转移至植物细胞的土壤杆菌。为了接种，将植物培养物浸没于细菌悬浮液中。除去液体细菌悬浮液，并将接种后的培养物放置在共培养培养基上，并于22℃温育2天。然后将培养物转移至具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培养基以抑制土壤杆菌的生长。对于利用PMI选择标志基因的构建体(Reed等，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37：127-132)，7天后将培养物转移至含有作为碳水化合物来源的甘露糖的选择培养基(具有2％甘露糖，300mg/升替卡西林的MS)，并在黑暗中培养3-4周。然后将抗性集落转移至再生诱导培养基(没有2，4-D、具有0.5mg/升IAA、1mg/升玉米素、200mg/升特美汀(timentin)、2％甘露糖和3％山梨糖醇的MS)，并在黑暗中培养14天。然后将增殖中的集落转移至另一轮再生诱导培养基，并移动至光生长室。将再生的苗转移至装有GA7-1培养基(没有激素但具有2％山梨糖醇的MS)的GA7容器达2周，然后移动至温室，此时它们足够大，而且具有足够的根。将植株移植至温室中的土壤，(至世代)栽培至成熟，并收获T1种子。
用本发明中的感兴趣核酸序列进行的转化获得的植物可以是极其多种植物物种之任一种，包括那些单子叶植物和双子叶植物的；然而，本发明方法中所使用的植物优选选自本文中别处所示在农艺学上重要的靶作物的列表。可以经由育种来将本发明的基因表达与对于产量和质量重要的其它特征的组合掺入植物品系中。育种办法和技术是本领域中已知的。参见例如，Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley&Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(编)American Society of AgronomyMadison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，第2版，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breeding for Resistance toDiseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；及Wricke和Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)。
对于质体的转化，在T琼脂培养基上的1”圆形阵列中每块平板发芽7颗烟草(Nicotiana tabacum)栽培种“Xanthienc”的种子，并在播种后12-14天用包被有来自质粒pPH143和pPH145的DNA的1um钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，Calif.)轰击，基本上如所描述的(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)。在T培养基上温育经轰击的幼苗达2天，之后切出叶，并在含有500ug/ml二盐酸壮观霉素(spectinomycin dihydrochloride，Sigma，St.Louis，Mo.)的RMOP培养基(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)平板上在明亮的光线中向上放置背轴侧。将轰击后3至8周出现在褪色的叶下的抗性苗亚克隆至相同选择培养基上，容许形成愈伤组织，分离次生苗(shoot)，并进行亚克隆。通过Southern印迹的标准技术(Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)来评估独立亚克隆中经转化质体基因组拷贝的完全分离(同原生质体性(homoplasmicity))。在1％Tris-硼酸盐(TBE)琼脂糖凝胶上分开经BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol BiolReporter 5，346349)，转移至尼龙膜(Amersham)，并用经32P标记的随机引物(primed)DNA序列探查，所述随机引物DNA序列对应于来自含有rps 7/12质体靶向序列的一部分的pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段。在含有壮观霉素的MS/IBA培养基上以无菌方法使同质(homoplasmic)苗生根(McBride，K.E.等(1994)PNAS 91，7301-7305)，并转移至温室。
通过有性生殖或营养生长传递工程化改造成上文所描述的转基因种子和植株的遗传特性，如此可以在后代植株中维持和繁殖。一般而言，维持和繁殖利用开发用于适合特定目的(诸如耕作、播种或收获)的已知农业方法。
可以在植物育种中进一步得到依照本发明的转基因植物和种子的有利遗传特性的用途。根据想要的特性，采取不同育种措施。相关技术是本领域中公知的，并且包括但不限于杂交、育种、回交育种、多系育种、品种混合、种间杂交、非整倍体技术等。如此，可以使用依照本发明的转基因种子和植物来进行改良植物品系的育种，所述改良的植物品系例如提高常规方法诸如除草剂或杀虫剂处理的效力或者由于它们经修饰的遗传特性而容许省略所述方法。
许多适合于使用合适的选择标志诸如卡那霉素、二元载体(诸如来自土壤杆菌的)进行的转化和植株再生(如例如自烟草叶盘)的方法是本领域中公知的。任选地，同样地用表达对照HPPD的多核苷酸转化一群对照植物。或者，可以使用未转化的双子叶植物诸如拟南芥或烟草作为对照，因为这在任何情况中都表达其自身的内源HPPD。
除草剂抗性
本发明提供了转基因植物、植物细胞、组织、和种子，它们已经单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地用编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化。
在一个实施方案中，本发明的转基因植物展现出对应用以下量的除草剂的抗性或耐受性：每公顷约5至约2,000克(g/ha)，包括例如，约5g/ha、约10g/ha、约15g/ha、约20g/ha、约25g/ha、约30g/ha、约35g/ha、约40g/ha、约45g/ha、约50g/ha、约55g/ha、约60g/ha、约65g/ha、约70g/ha、约75g/ha、约80g/ha、约85g/ha、约90g/ha、约95g/ha、约100g/ha、约110g/ha、约120g/ha、约130g/ha、约140g/ha、约150g/ha、约160g/ha、约170g/ha、约180g/ha、约190g/ha、约200g/ha、约210g/ha、约220g/ha、约230g/ha、约240g/ha、约250g/ha、约260g/ha、约270g/ha、约280g/ha、约290g/ha、约300g/ha、约310g/ha、约320g/ha、约330g/ha、约340g/ha、约350g/ha、约360g/ha、约370g/ha、约380g/ha、约390g/ha、约400g/ha、约410g/ha、约420g/ha、约430g/ha、约440g/ha、约450g/ha、约460g/ha、约470g/ha、约480g/ha、约490g/ha、约500g/ha、约510g/ha、约520g/ha、约530g/ha、约540g/ha、约550g/ha、约560g/ha、约570g/ha、约580g/ha、约590g/ha、约600g/ha、约610g/ha、约620g/ha、约630g/ha、约640g/ha、约650g/ha、约660g/ha、约670g/ha、约680g/ha、约690g/ha、约700g/ha、约710g/ha、约720g/ha、约730g/ha、约740g/ha、约750g/ha、约760g/ha、约770g/ha、约780g/ha、约790g/ha、约800g/ha、约810g/ha、约820g/ha、约830g/ha、约840g/ha、约850g/ha、约860g/ha、约870g/ha、约880g/ha、约890g/ha、约900g/ha、约910g/ha、约920g/ha、约930g/ha、约940g/ha、约950g/ha、约960g/ha、约970g/ha、约980g/ha、约990g/ha、约1,000，g/ha、约1,010g/ha、约1,020g/ha、约1,030g/ha、约1,040g/ha、约1,050g/ha、约1,060g/ha、约1,070g/ha、约1,080g/ha、约1,090g/ha、约1,100g/ha、约1,110g/ha、约1,120g/ha、约1,130g/ha、约1,140g/ha、约1,150g/ha、约1,160g/ha、约1,170g/ha、约1,180g/ha、约1,190g/ha、约1,200g/ha、约1,210g/ha、约1,220g/ha、约1,230g/ha、约1,240g/ha、约1,250g/ha、约1,260g/ha、约1,270g/ha、约1,280g/ha、约1,290g/ha、约1,300g/ha、约1,310g/ha、约1,320g/ha、约1,330g/ha、约1,340g/ha、约1,350g/ha、约1360g/ha、约1,370g/ha、约1,380g/ha、约1,390g/ha、约1,400g/ha、约1,410g/ha、约1,420g/ha、约1,430g/ha、约1,440g/ha、约1,450g/ha、约1,460g/ha、约1,470g/ha、约1,480g/ha、约1,490g/ha、约1,500g/ha、约1,510g/ha、约1,520g/ha、约1,530g/ha、约1,540g/ha、约1,550g/ha、约1,560g/ha、约1,570g/ha、约1,580g/ha、约1,590g/ha、约1,600g/ha、约1,610g/ha、约1,620g/ha、约1,630g/ha、约1,640g/ha、约1,650g/ha、约1,660g/ha、约1,670g/ha、约1,680g/ha、约1,690g/ha、约1,700g/ha、约1,710g/ha、约1,720g/ha、约1,730g/ha、约1,740g/ha、约1,750g/ha、约1,760g/ha、约1,770g/ha、约1,780g/ha、约1,790g/ha、约1,800g/ha、约1,810g/ha、约1,820g/ha、约1,830g/ha、约1,840g/ha、约1,850g/ha、约1,860g/ha、约1,870g/ha、约1,880g/ha、约1,890g/ha、约1,900g/ha、约1,910g/ha、约1,920g/ha、约1,930g/ha、约1,940g/ha、约1,950g/ha、约1,960g/ha、约1,970g/ha、约1,980g/ha、约1,990g/ha、或约2,000。
基于不同除草剂浓度范围的植株损害、分生组织漂白症状等以正常方式(normal manner)评估一系列主要植物转化事件的除草剂耐受性或抗性水平的平均值和分布。这些数据可以按照例如自剂量/响应曲线衍生的GR50值表达，剂量/响应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“百分比杀死”、“除草效果”、“新出现绿色植物的数目”等，其中GR50值增加对应于所表达IHPPD的固有抑制剂耐受性水平升高(Ki值增加)。
本发明的方法特别可用于保护大豆作物免于选自下组的HPPD化学种类的HPPD抑制剂除草剂的除草损害：式Ia的化合物
Figure GPA00001010481400321
其中R1和R2是氢或者在一起是乙烯桥；
R3是C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-C1-C4烷基或者R3是基团
Figure GPA00001010481400322
R4是C1-C4烷基磺酰基或C1-C4卤烷基；
R5是氢或苯硫基；X是次甲基、氮或C-R6，其中R6是C1-C4卤烷氧基-C1-C4烷基或基团
式Ib的化合物
Figure GPA00001010481400324
其中R7是甲基或氯；
式Ic的化合物
Figure GPA00001010481400325
其中R8是卤素或C1-C4卤烷基；
式Id的化合物
Figure GPA00001010481400331
式Ie的化合物
Figure GPA00001010481400332
式If的化合物
Figure GPA00001010481400333
式Ig的化合物及其游离酸；
式Ih的化合物
Figure GPA00001010481400341
式Ii的化合物
Figure GPA00001010481400342
式Ij的化合物
Figure GPA00001010481400343
和
式Ik的化合物
Figure GPA00001010481400344
出现在取代定义中的烷基基团可以是直链或分支的，并且是例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。一般而言，卤素是氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。与其它意义，诸如卤烷基结合的卤素同样如此。
优选地，卤烷基基团具有1至4个碳原子的链长度。卤烷基是例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、2，2，2-三氟乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、五氟乙基、1，1-二氟-2，2，2-三氯乙基、2，2，3，3-四氟乙基或2，2，2-三氯乙基；优选三氯甲基、二氟氯甲基、二氟甲基、三氟甲基或二氯氟甲基。
优选地，烷氧基烷氧基基团具有1至8个碳原子的链长度。烷氧基烷氧基的例子是：甲氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、甲氧基丙氧基、乙氧基甲氧基、乙氧基乙氧基、丙氧基甲氧基和丁氧基丁氧基。优选地，烷氧基烷基基团具有1至6个碳原子的链长度。烷氧基烷基是例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、正丙氧基甲基、正丙氧基乙基、异丙氧基甲基或异丙氧基乙基。
优选地，烷氧基-烷氧基-烷基基团具有1至8个碳原子的链长度。烷氧基-烷氧基-烷基的例子是：甲氧基甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙氧基甲氧基甲基和甲氧基乙氧基乙基。
式Ia至Ik的化合物是已知的，或者可以依照已知的方法来制备。式Ia的化合物及其制备记载于WO/0015615，WO/0015615，WO 02/085118，WO00/021924，US-A-5,006,158和美国专利号4,780,127。式Ib的化合物记载于WO98/31681，并且那些化合物与除草剂的混合物记载于WO 99/65314。式Ic的化合物记载于US-A-5,656,573。式Id的化合物记载于The Pesticide Manual第12版，在条目号71下，式Ie的化合物在条目号663下而式If的化合物在条目号666下。式Ig的化合物以注册号CAS 192708-91-1记载于Chemical Abstracts。式Ih的化合物记载于EP-A-0352543。式Ii的化合物记载于EP-A-0496631，式Ij的化合物记载于WO 04/021788。式Ik的化合物具有Chemical Abstracts注册号365400-11-9。
一方面，使用依照本发明的方法来保护大豆作物免于选自下组的HPPD化学种类的HPPD抑制剂除草剂的除草损害：式Ia或Ig的化合物。在一个备选的方面，细胞色素P450基因选自编码SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多核苷酸序列。在一个别的实施方案中，HPPD抑制剂除草剂选自磺草酮、硝磺草酮、特灭酮和式1a的化合物，其中X是氮而R4是CF3、CF2H或CFH2和/或其中R1和R2一起形成乙烯桥。在一个别的实施方案中，HPPD抑制剂除草剂选自硝磺草酮、SYN449280、异噁氟草、特灭酮、Topramezone、匹拉沙托(pyrasulfatole)、磺草酮、吡唑特、苄草唑、氯草酮、吡草酮、和苯并双环酮(Benzobicyclon)。
另一方面，转化大豆或其它双子叶作物植物以表达编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的细胞色素P450基因还有自单子叶植物(例如燕麦)衍生的HPPD基因两者，其水平足以提供商业上有用水平的对选自下组的除草剂的抗性：磺草酮、硝磺草酮、特灭酮和式1a的化合物，其中X是氮而R4是CF3、CF2H或CFH2和/或其中R1和R2一起形成乙烯桥。细胞色素P450的表达水平应当足以实质上降低(相对于同样处理的植株，只是其缺乏P450转基因)整个植物组织，特别是在豆中的母体除草剂的残留水平。本领域普通技术人员当然会了解的是，某些P450酶可能赋予对某些亚组的HPPD化学的抗性，并且一种酶不可能提供对所有HPPD的抗性。
在另一个实施方案中，本发明提供了对选自下组的除草剂有抗性或耐受性的转基因植物：苯并噻二嗪酮类(Benzothiadiazinones)、磺酰脲类(Sulfonylureas)、和其它种类的除草剂，包括例如咪唑啉酮类(Imidazolinones)、三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸类(Pyrimidinylthiobenzoates)、三唑啉酮类(Triazolinones)、生长素类(Auxins)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类(Dinitroanalines)、和乙酰胺、以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯和异噁草酮。
例示性的苯并噻二嗪酮类包括苯达松(Bentazon)(CAS注册号25057-89-0；可获自BASF，Research Triangle Park，NC)。
例示性的磺酰脲类包括苄嘧磺隆(Bensulfuron)(CAS注册号99283-01-9)，氯磺隆(Chlorsulfuron)(CAS注册号64902-72-3)、卤嘧磺隆(Halosulfuron)(CAS注册号135397-30-7)、烟嘧磺隆(CAS注册号111991-09-4)、砜嘧磺隆(Rimsulfuron)(CAS注册号122931-48-0)、甲嘧磺隆(Sulfometuron)(CAS注册号74223-56-6)、和氟胺磺隆(Triflusulfuron)(CAS注册号135990-29-3)，以及其盐类和酯类。别的磺酰脲类包括但不限于三氟啶磺隆、氟嘧磺隆、乙基氯嘧磺隆(Chlorimuron-ethyl)、酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、甲基苄嘧磺隆(Bensulfuron-methyl)、环丙嘧磺隆(Cyclosulfamuron)、甲基胺苯磺隆(Ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧磺隆(Ethoxysulfuron)、啶嘧磺隆(Flazasulfuron)、甲基氟啶嘧磺隆(Flupyrsulfuron-methyl)、甲基卤嘧磺隆、唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron)、甲基碘磺隆(Iodosulfuron)、甲基甲磺隆(Metsulfuron-methyl)、甲酰胺磺隆(Foramsulfuron)、环氧嘧磺隆(Oxasulfuron)、氟磺隆、乙基吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron-ethyl)、甲嘧磺隆(Sulfometuron-methyl)、磺酰磺隆(Sulfosulfuron)、三氟甲磺隆(Tritosulfuron)、甲基噻吩磺隆(Thifensulfuron-methyl)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、甲基苯磺隆(Tribenuron-methyl)、和甲基氟胺磺隆。
例示性的咪唑啉酮类包括但不限于甲氧咪草烟、咪唑乙烟酸(Imazethapyr)、甲咪唑烟酸(Imazapic)、甲基咪草酸(Imazamethabenz-methyl)、和灭草喹(Imazaquin)。
例示性的三唑并嘧啶类包括但不限于唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺(Florasulam)、氯酯磺草胺(Chloransulam-methyl)、和磺草唑胺(Metosulam)。
例示性的嘧啶硫代苯甲酸类包括但不限于双草醚(Bispyribac)、嘧硫草醚(Pyrithiobac)、甲基嘧草醚(Pyriminobac-methyl)、环酯草醚(Pyriftalid)、和嘧啶肟草醚(Pyribenzoxim)。
例示性的三唑啉酮类包括但不限于氟酮磺隆(Flucarbazone)、甲基Thiencarbazone、和丙苯磺隆(Propoxycarbazone)。
例示性的生长素类包括但不限于麦草畏(Dicamba)、氨草啶(Aminopyralid)、2，4-D、甲氯丙酸(Mecoprop)、胺环吡克(Aminocyclopyrachlor)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、2，4-滴丙酸(Dichlorprop)、MCPA、MCPB、2，4-DB、二氯吡啶酸(Clopyralid)、和毒莠定(Picloram)。
例示性的ACC酶抑制剂包括但不限于精吡氟禾草灵(Fluazifop-P-butyl)、唑啉草酯(Pinoxaden)、炔草酯(Clodinafop-propargyl)、精噁唑禾草灵(Fenoxaprop-P-ethyl)、三甲苯草酮(tralkoxydim)、甲基禾草灵(Diclofop-methyl)、氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)、氟吡甲禾灵(Haloxyfop-P-methyl)、精喹禾灵(Quizalofop-P-ethyl)、禾草灭(Alloxydim)、丁苯草酮(Butroxydim)、烯草酮(Clethodim)、和噻草酮(Cycloxydim)。
例示性的PSII抑制剂包括但不限于苯达松(Bentazon)、利谷隆(Linuron)、环嗪酮(Hexazinone)、赛克津(Metribuzin)、莠去津(Atrazine)、敌草隆(Diuron)、异丙隆(Isoproturon)、绿谷隆(Monolinuron)、双苯胺灵(Desmedipham)、苯嗪草酮(Metamitron)、敌稗(Propanil)、胺唑草酮(Amicarbzone)、伏草隆(Fluometuron)、甜菜宁(Phenmedipham)、哒草特(Pyridate)、莠灭净(Ametryn)、氰草津(Cynazine)、噁唑隆(Dimefuron)、伏草隆(Fluometuron)、甲基苯噻隆(Methibenzuron)、甲氧隆(Metoxuron)、扑草净(Prometryn)、西玛津(Simazine)、西草净(Simetryn)、特草定(Terbacil)、特丁津(Terbuthylazine)、绿麦隆(Chlorotoluron)、和草达津(Trietazine)。
例示性的PPO抑制剂包括但不限于氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、氟酮唑草(carfentrazone)、嘧啶肟草醚(Saflufenacil)、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、甲磺草胺(Sulfentrazone)、乳氟禾草灵(Lactofen)、噁草酮(Oxadiazon)、三氟羧草醚(Acifluorfen)、氟哒嗪草酯(Flufenpyr-ethyl)、氟烯草酸(Flumiclorac)、和丙炔噁草酮(Oxadiargyl)。
例示性的PDS抑制剂包括但不限于达草灭(Norflurazon)、吡氟草胺(Diflufenican)、氟咯草酮(Flurochloridone)、呋草酮(Flurtamone)、氟吡酰草胺(Picolinafen)、和氟啶草酮(Fluridone)。
例示性的二硝基苯胺类包括但不限于胺硝草(Pendimethalin)、氟乐灵(Trifluralin)、安磺灵(Orazalin)、仲丁灵(Butralin)、敌乐胺(Dinitroamine)、和乙丁烯氟灵(Ethalfluralin)。
例示性的乙酰胺包括但不限于乙草胺(Acetochlor)、精异丙甲草胺(S-metolachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、二甲酚噻草胺(Dimethenamid)、对二甲酚噻草胺(P-dimethenamid)、氟噻草胺(Flufenacet)、甲草胺(Alachlor)、丁草胺(Butachlor)、苯噻草胺(Mefenacet)、丙草胺(Pretilachlor)、毒草胺(Propachlor)、和甲氧噻草胺(Thenylchlor)。
在另一个实施方案中，本发明提供了对选自下组的除草剂有抗性或耐受性的转基因植物：咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶基(硫代)苯甲酸类(pyrimidinyl(thio)benzoates)、苯甲酸、苯氧羧酸类(phenoxycarboxylic acids)、喹啉羧酸类(quinoline carboxylic acids)、芳氧基苯氧基丙酸类(aryloxyphenoxypropionates)、烯己二酮类(cyclohexanediones)、二硝基苯胺类(dinitroanilines)、苯甲酰胺(benzamides)、氨基甲酸酯类(carbamates)、尿素类、酰胺类、三嗪酮类(triazinones)、苯基哒嗪类、苯基氨基甲酸酯类(phenylcarbamates)、三唑啉酮类、嘧啶二酮类(pyrimidindiones)、噁二唑类(oxadiazoles)、N-苯基酞酰亚胺类、氯乙酰胺类、哒嗪酮类(pyridazinones)、和吡啶甲酰胺类(pyridinecarboxamides)。
本发明进一步提供了一种在包含作物植物和杂草的位置选择性控制杂草的方法，其中通过上文所描述的本发明的任何方法来获得所述植物，其中所述方法包括向杂草位置应用控制量的一种或多种除草剂。可以在本发明的这些方法内使用本文中所描述的任何转基因植物。术语“位置”/场所(locus)可以包括土壤、种子、和幼苗，以及建立的植被。可以在出土前或出土后合适地应用除草剂。
术语“杂草控制量”意图包括在功能上能够影响给定的杂草生长或发育的除草剂量。如此，该量可以少到足以仅仅延迟或阻抑给定杂草的生长或发育，或者该量可以多到足以不可逆地破坏给定的杂草。
如此，本发明提供了一种控制位置的杂草的方法，所述方法包括向所述位置应用杂草控制量的一种或多种除草剂，其中所述位置包含已经单独地或者与编码赋予想要的性状的多肽的一种或多种附加的核酸分子组合地用编码赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化。具体地，该位置包含如下转基因植物，其已经用编码赋予对选自下组的除草剂的抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的核酸分子转化：HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、ACC酶抑制剂类、PSII抑制剂类、PPO抑制剂类、PDS抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺类、以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯和异噁草酮。在另一个实施方案中，想要的性状是对除草剂的抗性或耐受性，包括例如，选自下组的除草剂：HPPD抑制剂、草甘膦、和草铵膦。在另一个实施方案中，该位置包含如下转基因植物，其已经用上文所描述的核酸分子的任何组合转化，包括与编码赋予想要的性状的多肽的至少1种、至少2种、至少3种、或至少4种附加的核酸分子组合的编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体的一种或多种核酸分子。
在一个实施方案中，本发明提供了对于控制作物耕地中不想要的植物物种有用的转基因植物和方法，其中通过用表达降解HPPD除草剂的酶的细胞色素P450基因进行的转化来使所述作物植物对HPPD化学产生抗性。以能够杀死或损害不想要的植物物种(大豆作物植物的耕地中的杂草物种或例如遗留(carry-over)或“劣种”或“自生”作物植物)的量过多的应用HPPD除草剂。所述应用可以是在作物植物或者不想要的物种出土前或者出土后，并且可以组合所述作物天然耐受的或它经由表达一种或多种其它转基因而有其抗性的其它除草剂。参见例如美国申请公开文本号2004/0058427；PCT公开文本WO98/20144。
在另一个实施方案中，本发明还涉及一种保护作物植物免于除草损害的方法。在作物植物的栽培(特别是以商业规模)中，正确的轮作对于产量稳定性(在长时期里达到良好质量的高产量)和对于农艺学事务的经济成功是至关重要的。例如，跨越美国主要玉米生长区(“中部玉米带”)的大片区域，在超过75％的情况中以玉米的后续作物栽培大豆。愈来愈多地使用HPPD抑制剂除草剂来实施玉米作物中的选择性杂草控制。虽然除草剂种类对该目的具有卓越的稳定性，但是其可以导致在后续作物中，特别在后续大豆作物中对作物植物造成农艺学不可接受的植物毒性损害，因为某些大豆品种对甚至少量的此类HPPD抑制剂除草剂残留都是敏感的(“残留”损害)。因而，本发明的除草剂抗性或耐受性植物对于在来自先前应用的任何短期除草剂残留的位置中种植也是有用的(例如通过在应用除草剂后一年中种植本发明的转基因植物来降低来自除草剂土壤残留的损害风险)。
经由以下非限制性实施例来使本发明更为清楚。为了例示而非为了限制而提供以下实施例。
实施例
实施例1：适合于将对HPPD除草剂(具体的是，硝磺草酮)的耐受性工程化改造入作物植物中的基因盒。
例如，制备DNA构建体，其具有1)如下盒，该盒具有如在SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中的燕麦HPPD基因(例如编码SEQ ID NO：10的蛋白质或与SEQ ID NO：10至少85％相似的蛋白质)或经修饰的燕麦HPPD基因(例如编码SEQ ID NO：11、12、或13中所示氨基酸序列)，如上文所描述的，其在上游启动子(诸如烟草、拟南芥或大豆Rubisco启动子区的小亚基，包括5’非翻译前导序列)和与第二个盒邻近的下游胭脂氨酸合酶3’终止子序列的可操作表达控制下；2)具有如下DNA序列，其编码在上游拟南芥或大豆多聚遍在蛋白启动子和5’非翻译前导序列和来自组蛋白基因的下游3’终止子序列可操作控制下的玉米nsf1或稻CYP81A6蛋白序列(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5)(参见图1)。任选地，构建体包括不管哪个启动子上游的转录增强子序列(例如来自MV35S启动子区的)，且任选地，包括翻译起始前的翻译增强子诸如TMVω序列。用于操作DNA以便制备这些构建体的合适序列和方法是本领域中公知的。任选地，部分地或者完全地，以合成方法制备和通过PCR及限制酶和连接反应拼合它们。启动子还可以是嵌合启动子，其中5’上游启动子区与TATA框和增强子融合。经优化的基因的例子是燕麦HPPD基因(SEQ IDNO：14)、“经修饰的燕麦HPPD基因”(SEQ ID NO：15)、nsf1(SEQ ID NO：2)、和玉米CYP72A1(SEQ ID NO：4)。
在该实施例的别的变型(variant)中，从GeneArt以合成方法获得细胞色素P450和/或燕麦基因，为了在大豆中表达而进行密码子优化，并设计成具有用于克隆的5’NdeI和3’BamHI限制性位点(其没有添加额外的氨基酸)。任选地，将Nde1：BamH1产物克隆入载体pMCJA中，其是为了在翻译起始密码子位点包含Nde1而不是Nco1位点才进行修饰的pMJB1(记载于WO98/20144)的衍生物。pMJB1是PUC19衍生的质粒，其含有植物可操作的双倍增强的CAMV35S启动子、TMVω翻译增强子和NOS转录终止子。WO98/20144的图2中描绘了该质粒示意图。切出包含例如双倍增强的35S启动子、TMVω前导、SEQ ID NO：1细胞色素P450编码序列和nos 3’终止子的表达盒，例如酌情使用HindIII/EcoR1部分消化来实现，克隆入经类似消化的pBIN19中，并转化入大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。然后使用自大肠杆菌回收的DNA来转化根癌土壤杆菌LBA4404，并在利福平和卡那霉素上选择经转化的细菌。例如然后使烟草组织经受土壤杆菌介导的转化，其使用本领域中充分描述的教科书标准方法来进行。自卡那霉素抗性愈伤组织再生经转化的苗。使苗在含有卡那霉素的MS琼脂上生根。使存活的生根外植体再次生根以提供约30-50株卡那霉素抗性转化烟草植株。
实施例2：用测试CYP基因进行的烟草转化和除草剂抗性品系的选择
合成候选全长基因，包括有用的限制性位点和起始位点5’的翻译增强子序列。在FMV启动子下游克隆这些基因盒，接着将这些基因盒克隆入含有bar或PPO选择标志基因盒的转化载体中。
或者，通过PCR编辑自玉米或稻cDNA文库获得的候选全长cyp基因以包括例如，5’Nco1和3’Kpn1末端。然后将此产物连接入pMJB1中。pMJB1是pUC19衍生的质粒，其含有植物可操作的双倍增强的CaMV35S启动子；TMVω增强子和NOS转录终止子。WO 98/20144的图2中显示了所得的质粒的图示。使用Hind III/Eco R1(部分Eco R1消化)切出包含双倍增强的35S增强子、TMVω前导、4-HPPD基因和nos终止子的表达盒，并克隆入经类似消化的pBIN 19植物转化载体中，并转化入大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。
或者，将如实施例1中那样设计的双基因构建体合适地设计有限制性末端，类似地克隆入pBIN19植物转化载体中，并转化入大肠杆菌TOP 10细胞中。
使用具有合适的P450基因表达盒的植物转化载体来转化根癌土壤杆菌LBA4404。使用本领域中充分描述的方法来使烟草组织经受土壤杆菌介导的转化。自对选择剂(例如草铵膦、氟丙嘧草酯、卡那霉素)有抗性的愈伤组织再生经转化的苗。使苗在含有选择剂的MS琼脂上生根。
为了确定P450转基因外植体(即叶加上含有辅助芽的短茎区段)的耐受性，将这些放入含有多个浓度的硝磺草酮(0.02至2ppm)的MS琼脂(+3％蔗糖)中。在烟草中，例如，未转化的外植体在0.02ppm被完全漂白。它们在延长暴露于除草剂后没有恢复。在这些具体的实验中，仅从芽发育的苗被漂白，外植组织上的叶保持绿色。
许多经转基因PCR+ve转化的植株在没有漂白指征的情况中耐受对野生型烟草引起症状的水平的硝磺草酮。它们正常生根，而且在表型方面与未转化的植株不能区别。转化体的子集耐受大于0.1ppm的浓度，产生看上去正常并且在存在除草剂的情况中生根良好的植株。最初一些经转化的植株可以在经受所述较高浓度的除草剂时被漂白，但是在延长的暴露后它们逐渐“变绿”并“恢复”。或者，可以以如下水平的硝磺草酮喷射来自表达P450转基因的事件的T1植株，所述水平对非转化植株的新生长引起漂白，但是在表达P450转基因的转基因植株中没有漂白。
或者，可以用含有推定的HPPD除草剂降解P450基因和选择标志基因的表达载体转化HPPD敏感性玉米植株。可以对事件测试对HPPD抑制剂类的耐受性增强。
或者，可以用含有推定的HPPD除草剂降解P450基因和选择标志基因的表达载体转化大豆植株。可以对事件测试对HPPD抑制剂类的耐受性增强。
实施例3：大豆的转化和除草剂抗性植株的选择
通过消化含有想要的基因的载体来生成适合于在基于轰击的植物转化中使用的线性DNA(例如如在实施例1中的)。然后在琼脂糖凝胶上纯化这种想要的片段，并使用Biotrap来分离。
任选地，CYP、HPPD基因或者两者共同可以提供选择和鉴定转基因组织的手段。任选地，用于表达CYP和例如燕麦HPPD的基因可以存在于提供选择/鉴定经转化组织的别的手段的其它序列旁的多核苷酸中，所述其它序列包括例如，提供对卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、氟丙嘧草酯或草甘膦的抗性的已知基因。或者，这些选择标志序列可以存在于分开的多核苷酸上，并且使用例如共转化和共选择的方法。或者，可以使用可评分的标志基因诸如GUS而非选择标志基因来鉴定经转化的组织。可以合适地转化大豆植物材料，并通过技术人员公知的许多方法来再生能育植株。例如，可以如下获得能育的形态学正常的转基因大豆植物，即1)从例如未成熟的子叶、下胚轴或其它合适的组织生成体细胞胚发生组织，2)通过颗粒轰击或用土壤杆菌的感染进行的转化，和3)再生植株。在一个实施例中，如在USP 5024944中所描述的，自大豆的未成熟胚切出子叶组织，优选地，其中除去胚轴，并在含有激素的培养基上培养以便形成体细胞胚发生植物材料。使用例如直接DNA方法、经DNA包被的微粒轰击或用土壤杆菌的感染来转化此材料，在合适的选择培养基上培养，并再生(任选地，也在持续存在选择剂的情况中)成能育的转基因大豆植株。选择剂可以是抗生素诸如卡那霉素、潮霉素或除草剂诸如膦丝菌素(phosphonothricin)或草甘膦，或者，选择可以基于可视化标志基因诸如GUS的表达。或者，用于转化的靶组织包含分生组织的而非体细胞克隆的胚发生组织，或者任选地，是花或形成花的组织。
在一个实施例中，使用生物射弹型办法(例如Santarem ER，Finer，J.J(1999)‘Transformation of soybean(Glycine max(L.)Merrill)using proliferativeembryogenic tissue maintained on a semi-solid medium.In vitro Cellular andDevelopmental Biology-Plant 35，451-455；USP-5,503,998，USP 5830728)或者经由用土壤杆菌的感染(例如USP-5,024,944，USP-5,959,179)来将构建体转化入可再生的胚发生大豆组织中。
可以将增殖性胚发生组织在例如半固体培养基上维持。例如，以如下方式获得此类组织。花形成后2-3周，从例如大豆(Glycine max(L.)Merrill)的豆荚分离长3-4mm的未成熟合子胚。可以通过“逆光”来对豆荚检查正确长度和成熟的胚的存在。然后使豆荚无菌。取出未成熟的胚，并自每个除去轴。然后将未成熟的胚在含有B5维生素、3％蔗糖和40mg/l 2，4-D的‘D40-Lite’半固体(0.2％Gelrite)MS盐培养基(pH 7.0)上铺板达3-4周。为了胚的增殖，然后将该材料转移至含有B5维生素、3％蔗糖，20mg/l 2，4-D和0.2％Gelrite的‘D20’MS盐培养基(pH 5.7)。选择具有亮绿色球形增殖胚的材料，并每2-3周进行传代培养。
对于轰击，选择20-25块/组织平板(轰击前传代培养4-5天)，并在含有D20培养基的皿中心安排。通过在无菌罩下揭盖达15分钟来使组织干燥15分钟。使用许多商品化的枪之任一种，两次将以DNA构建体包被的金颗粒(例如使用上文参考文献中所描述的方法包被的)轰击入D20培养基上的组织中。进一步举例而言，使用PDS1000颗粒枪。可以制备颗粒，并用DNA包被，其方式类似于记载于Klein等1987，Nature，327，70-73的。或者，例如，在HPLC级乙醇中重复清洗微离心管中的60mg金或钨颗粒(约1.0μm)，然后在无菌水中重复清洗。将颗粒在1ml无菌水中重悬，并分配成微离心管中的50μl等分试样。金颗粒于4℃贮存，钨颗粒于-20℃贮存。将3mg DNA添加至每等分试样的(解冻的)颗粒，并全速涡旋振荡该管。在维持接近连续涡旋振荡时，添加50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺。进一步涡旋振荡10分钟后，将样品在Eppendorf离心管中离心5秒，吸去上清液，并在HPLC级乙醇的连续添加中清洗颗粒。将颗粒在60μl乙醇中彻底重悬，然后以10μl等分试样分配至要在PDS1000颗粒枪中使用的每个大载体(macrocarrier)的表面上。PDS1000颗粒枪的构件是通过浸没在70％的乙醇中并风干来灭菌的表面。在距离停止屏(stopping screen)6cm处放置如上文所描述的那样制备的靶平板，其中组织被安排入约2.5cm盘中。然后使用适当选定的破裂盘(rupture disc)进行轰击。
轰击后1周，将所有组织块转移至缓冲至pH5.7的D20培养基上，其含有合适选择浓度的选择剂(例如在使用草甘膦进行选择，和抗性EPSPS或GOX编码基因存在于作为表达燕麦HPPD的基因的同一转化DNA上，或者否则存在于共同轰击的DNA中的情况中，是0.05和10mM之间的草甘膦)。再3-4周后，将所有组织转移至含有合适的渐增浓度的选择剂的新鲜D20培养基。再3-4周后，选择活组织，并在含有选择剂的类似D20培养基中按每3-4周进行传代培养。在存在一些不同于草甘膦的选择标志的情况中，则可以酌情进行选择(例如使用渐增浓度的潮霉素)。或者，使用HPPD抑制剂除草剂进行所有选择。如此维持生长中的部分，并且倘若有足够的组织，可以通过PCR来分析以证实它们是在想要的DNA方面转基因的。
为了使胚发育和成熟，将组织块放置至M6培养基上，所述M6培养基包含pH 5.7的MS盐类，其含有B5维生素、6％麦芽糖和0.2％Gelrite。于23℃将6-9块放置在高型皿(tall dish)中。3-4周后，胚伸长，并可以将它们分开，并转移至在M6培养基上的另一轮温育。4-6周后，胚是乳酪色的，并准备好干燥。将9个此类乳酪色的胚放置在干燥的培养皿中，用石蜡膜密封，并放置至架子上达2-3天。胚应当有些松软，并且不是“脆的-易碎的”(“crispy-crunchy”)。
可以通过放置至OMS(无生长调节剂的MS培养基)上来使干燥的胚发芽。通常在一周内发生的发芽后，将植株转移至较大的盒，并且一旦有足够的根和苗形成，由该处转移至土壤。为了阻止真菌污染，建议用蒸馏水清洗来自根的OMS。可以在高湿度下和初始在24小时照明下保持并培养植株。可以在24小时照明下培养植株直至高约2英尺，然后经由向16小时照明方案的改变来促进开花和形成豆荚。收集种子，并在其上培养后代，进行杂交和回交以将转基因移入想要的植物背景中，其使用植物育种的普通方法来实现。常规地对植株分析转基因的存在和表达，其使用分子生物学的普通方法来实现，包括通过PCR、Southern、Western、ELISA和酶测定法技术进行的分析。
用于大豆转化的基于土壤杆菌的方法如下：
从不同发育阶段的种子豆荚分离种子：在温室中在16小时日光下于24℃栽培大豆(大豆栽培种Jack，Williams 82或S42H1)母株。收集发育阶段R5-R7的豆荚(具有绿色至黄色豆荚颜色)，并通过浸没于70％乙醇中达30秒或于20％Clorox漂白剂中达20分钟来灭菌。用无菌水漂洗经灭菌的豆荚4次。然后用戴有喷射有70％乙醇的手套的手从经灭菌豆荚分离种子。用无菌水漂洗所分离的种子3-5次，或者如下进一步灭菌，即用10％Clorox达10分钟，接着用无菌水漂洗3次。然后直接使用经灭菌的种子来制备用于土壤杆菌介导的转化的外植体。
转化载体和土壤杆菌菌株：使用含有经修饰的HPPD基因、或P450基因的二元载体(具有表达所需要的必要遗传元件)进行转化。使用电穿孔分开将这些载体导入根癌土壤杆菌菌株LB4404或EHA101中。选择含有这些载体之每一种的单细菌菌落以证实完整载体的存在，并用于进一步的实验。将土壤杆菌培养物在含有合适的抗生素的YP固体培养基上培养，并在28℃培养箱培养。接种前一天将土壤杆菌划线至新鲜YP培养基上，并在28℃培养箱中培养。对于植物转化用途，使用一次性塑料接种环从所述平板收集土壤杆菌，并无菌的50ml一次性聚丙烯离心管中的液体感染培养基诸如SoyInf中悬浮。温和摇动该管，直至将土壤杆菌细胞均一地分散在悬浮液中。然后将细菌细胞悬浮液稀释至A6600.5至0.8，并添加乙酰丁香酮至终浓度40-80mg/L(200-400uM)以诱导毒力基因表达。
转化靶物的制备：在不进行进一步发芽或培养的情况中以一项如下方式自直接分离自豆荚的经灭菌大豆种子制备外植体，如实施例1中所描述的：
a)修剪就在子叶节下的下胚轴，并除去种皮。通过用解剖刀的钝端破坏邻近组织来取出一个子叶和两片初生叶。
b)修剪就在子叶节下的下胚轴，并除去种皮。通过用解剖刀的钝端破坏邻近组织来取出一个子叶和两片初生叶，然后用刀片的锋利端使包括顶端分生组织的胚芽受伤。
c)在胚轴中间纵向将种子切成两半。取出两片初生叶，然后进一步用解剖刀的锋利端使外植体的顶端区受伤。所得外植体的两半都包含一个子叶和未成熟胚轴的一部分。
大豆种子外植体的感染和共培养：通过混合外植体与如实施例1.2中所制备的细菌悬浮液来用土壤杆菌感染如上文实施例1.3所制备的外植体。将混合物于室温温育30分钟至4小时。感染后，自土壤杆菌悬浮液取出外植体，并放置在共培养培养基诸如SoyCoC上。温育共培养平板达3-5天。
转基因植株的再生和选择：共培养后，削减外植体的伸长的下胚轴，其就在子叶下。将外植株转移至具有杀死土壤杆菌或抑制土壤杆菌生长的抗生素且具有低的选择剂(诸如SoyR1)或者没有选择剂的恢复培养基上。温育具有外植体的平板，优选于24℃在16小时光亮/8小时黑暗方案且大于80μE/m2/s下达1周。恢复期后，切出伸长的上胚轴或发育中的苗，并连同子叶一起转移至具有较高浓度的选择剂诸如SoyR2的再生培养基达2周。SoyR2培养基含有供选择用的6-8mg/L草铵膦。在再生/选择培养基诸如SoyR2中2周后，切出发育的或发育中的多个苗簇，并转移至伸长培养基诸如SoyE1进行苗伸长。SoyE1含有4-8mg/L草铵膦。每2周实施向新鲜伸长培养基的传代培养。在不进行选择的情况中将伸长的苗(大于2cm)转移至伸长培养基SoyE2达2周。在SoyE2培养基中2周后，将苗转移至生根培养基(例如SoyRoot)。对叶进行取样来进行分析以鉴定含有bar或pat基因的转化体。用水漂洗
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阳性和生根的小植株以洗去琼脂培养基，并移植至土壤，并在温室中培养以得到种子。
下表提供了在本文中所描述的方法内使用的转化培养基配方：
               表2.SoyInf培养基
配方名称       SoyInf
最终pH         5.4
1L的配方       化学品名称                      量          单位
               MS基础盐混合物                  2.15        g
               B5维生素200X                    5           ml
               蔗糖                            20          g
               葡萄糖                          10          g
               MES                             4           g
               玉米素核苷，反式异构体1mg/ml    2           ml
               表3.SoyCCM培养基
配方名称       SoyCCM
最终pH         5.4
1L的配方       化学品名称                      量          单位
               蔗糖                            20          g
               MES                             4           g
               纯化琼脂                        6           g
               Evian水                         990         ml
               乙酰丁香酮40mg/ml               1           ml
               BAP 1mg/ml                      0.5         ml
               表4.SoyCoC培养基
配方名称       SoyCoC
最终pH         5.4
1L的配方       化学品名称                      量          单位
               MS基础盐混合物                  2.15        g
               B5维生素200X                    5           ml
               蔗糖                            20          g
               葡萄糖                          10          g
               MES                             4           g
               玉米素核苷，反式异构体1mg/ml    2           ml
               纯化琼脂                                6         g
               表5.SoyR1培养基
配方名称       SoyR1
最终pH         5.6
1L的配方       化学品名称                              量        单位
               B5基础盐，Gamborg氏                     3.1       g
               B5维生素200X                            5         ml
               MS铁200X                                4         ml
               天冬酰胺                                100       mg
               MES 100mg/ml                            10        ml
               玉米素核苷，反式异构体1mg/ml            2         ml
               蔗糖                                    30        g
               纯化琼脂                                7         g
               谷氨酰胺50mg/ml                         2         ml
               替卡西林：克拉维酸钾(clavulanate)15∶1
               100mg/ml                                3         ml
               表6.SoyR2培养基
配方名称       SoyR2
最终pH         5.6
1L的配方       化学品名称                              量        单位
               B5基础盐，Gamborg氏                     3.1       g
               B5维生素200X                            5         ml
               MS铁200X                                4         ml
               天冬酰胺                                100       mg
               MES 100mg/ml                            10        ml
               BAP 1mg/ml                              1         ml
               蔗糖                                    30        g
               纯化琼脂                                7         g
               谷氨酰胺50mg/ml                         2         ml
               草铵膦
               替卡西林：克拉维酸钾15∶1100mg/ml       3         ml
               表7.SoyE1培养基
配方名称       SoyE1
最终pH         5.6
1L的配方       化学品名称                              量        单位
               MS基础盐混合物                          4.3       g
               B5维生素200X                            5         ml
               MS铁200X                                3         ml
               蔗糖                                    30        g
               MES                                     590       mg
               纯化琼脂                                7         g
               替卡西林：克拉维酸钾15∶1100mg/ml       3         ml
               头孢噻肟250mg/ml                        0.4       ml
               草铵膦                                            mg
               IAA 1mg/ml                              0.1       ml
               GA3 5mg/ml                              0.1       ml
               谷氨酰胺50mg/ml                         2         ml
               天冬酰胺25mg/ml                         2         ml
               玉米素核苷，反式异构体1mg/ml            1         ml
               表8.SoyE2培养基
配方名称       SoyE2
最终pH         5.4
1L的配方       化学品名称                              量        单位
               MS基础盐混合物                          4.3       g
               B5维生素200X                            5         ml
               MS铁200X                                3         ml
               蔗糖                                    30        g
               MES                                     590       mg
               Gelrite                                 3         g
               替卡西林：克拉维酸钾15∶1100mg/ml       3         ml
               头孢噻肟250mg/ml                        0.4       ml
               草铵膦mg
               谷氨酰胺50mg/ml                         2         ml
               天冬酰胺25mg/ml                         2         ml
               表9.SoyRoot培养基
配方名称       SoyRoot-H
最终pH         5.4
1L的配方       化学品名称            量          单位
               MS基础盐混合物        2.2         g
               B5维生素200X          5           ml
               MS铁200X              3           ml
               蔗糖                  20          g
               MES                   590         mg
               Gelrite               3           g
               谷氨酰胺50mg/ml       2           ml
               天冬酰胺25mg/ml       2           ml
               IBA1mg/ml             0.6         ml
实施例4：大豆转化载体的构建
构建供双子叶植物(大豆)转化用的二元载体(17107)，其具有驱动玉米CYP72A1细胞色素P450基因的拟南芥UBQ3启动子，接着有NOS终止子(图3)。基于玉米基因编码区的预测氨基酸序列来在大豆表达方面对基因进行密码子优化。SEQ ID NO：3中提供了由CYP72A1基因编码的蛋白质的氨基酸序列，而SEQ ID NO：4中提供了在此二元转化载体中经优化的CYP72A1基因的核苷酸序列。转化载体还含有两个PAT基因盒(一个具有35S启动子，而一个具有CMP启动子，并且两个PAT基因后面均有nos终止子)以在转化过程中进行基于草铵膦的选择。
构建类似的二元载体(17108)，其具有替代CYP72A1基因的玉米细胞色素P450基因‘nsf’(图4)。基于玉米基因编码区的预测氨基酸序列(SEQ IDNO：1)在大豆表达方面对在此载体中的nsf基因进行密码子优化(SEQ IDNO：2)。
实施例5：大豆转化
产生经转化的大豆植株，其具有实施例4中所描述的CYP载体之每一种。使用实施例3中所描述的土壤杆菌方法来创建这些事件(还可参见美国专利申请流水号11/716,975)。
实施例6：T0植株建立和选择
从组织培养采集T0植株至温室，在那里将它们移植入2”正方形罐中以5-10g/gal Redi-
Figure GPA00001010481400501
混合物与1％颗粒状
Figure GPA00001010481400502
(Olympic HorticulturalProducts，Co.，Mainland，PA)混合的饱和土壤(Redi-Plug and SeedlingMix，Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)中。用湿度穹顶(humidity dome)覆盖植株，并放置在Conviron室(Pembina，ND)中，其具有如下环境条件：白天24℃；晚上18℃；23小时光周期；80％相对湿度。
在土壤中建立植株并出现新生长(约1-2周)后，对植株取样，并对其测试想要的转基因的存在，其通过使用针对P450(CYP72A1)或启动子(prCMP和prUBq3)的探针进行的
Figure GPA00001010481400511
分析来进行。将所有阳性植株和数个阴性植株移植入装有
Figure GPA00001010481400512
380土壤(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)的4”正方形罐中。以推荐的比率将Sierra 17-6-12缓效肥料掺入土壤中。阴性植株充当喷射实验的对照。然后将植株重新定位至标准温室中以进行驯化(约1周)。环境条件是：白天27℃；晚上21℃；12小时光周期(用环境光)；环境湿度。驯化(约1周)后，植株准备好用想要的除草剂进行喷射。
实施例7：植株处理和评估
用硝磺草酮喷射来自实施例6的植株以确定它们是否耐受此除草剂。在水和X-77表面活性剂(0.25％v/v终浓度)中混合
Figure GPA00001010481400513
(活性成分硝磺草酮，Syngenta Crop Protection，Inc.，Greensboro，NC)。将植株放置在DeVries喷雾室(DeVries Manufacturing，Hollandale，Minn.)中，并将喷嘴与植株顶部的距离调节至约12英寸。建立系统以使喷杆以2mph移动，并且每英亩投递25加仑液体。校准喷射速率以在植株顶部上方喷射52.5g/ha硝磺草酮。以此方式喷射阴性T0转化体(即通过
Figure GPA00001010481400514
在转基因存在方面是阴性的)、具有载体17107的T0转化体、和具有载体17108的一个转化体(事件17108-A)。喷射后，在与上文实施例3中所描述的相同条件下将植株放置在温室中，并频繁地对其评估症状。喷射到的所有植株都在应用除草剂时暴露的小部分叶上形成坏死症状。在所有植株上自植株出现的新生长被完全漂白。然而，所有植株上的叶随时间而变绿。新生长发育为部分漂白的、或褪绿的，并且最初漂白的叶也变绿。喷射后1周时，清楚的是，事件17108-A的叶比具有载体17107的事件上的叶更快地转变绿色。喷射后22天时，对植株评估最初漂白的叶上的症状。仅在就在喷射过程中暴露的叶上面的叶(即具有坏死斑点的叶)上，和在一些事件中，在侧枝中的叶上看到可见的缺绿病(chlorosis)。部分缺绿病作为亮绿色斑点是明显的，并且常常作为叶上的亮绿色(几乎黄色的)边缘。在下文表10中显示了此数据。
表10.硝磺草酮处理后对植物的评估
事件编号     基因型，如由具有大于等于具有小于50％缺
Figure GPA00001010481400521
所测50％缺绿病的叶绿病的叶的数
             定的           的数目             目
6D032-A#4    阴性           1                  1
6D032-A#14   阴性           2                  0
17107-A      17107阳性      2                  0
17107-B      17107阳性      2                  2
17107-C      17107阳性      1                  1
17107-D      17107阳性      3                  2
17107-E      17107阳性      2                  1
17107-F      17107阳性      1                  2
17107-G      17107阳性      1                  2
17107-H      17107阳性      2                  4
17107-I      17107阳性      1                  1
17108-A      17108阳性      0                  0
如上文所显示的，仅含有nsfP450基因的事件17108-A能够从硝磺草酮损伤完全恢复。
实施例8：对来自17108事件的T1种子分析HPPD除草剂耐受性
容许含有nsf转基因(载体17108)的T0转化体产生T1种子，并收获种子。种植此种子，并分析后代以鉴定自种系转化植株衍生的种子批(seedlot)。分析转基因后代植株(T1或随后世代)以证实硝磺草酮耐受性。自后代种子栽培的植株在用其它HPPD除草剂(包括但不限于特灭酮、异噁氟草、Topramezone、匹拉沙托、磺草酮、吡唑特、苄草唑、氯草酮、吡草酮、和苯并双环酮)喷射时也展示出耐受性。用这些除草剂以40-80g/ha的速率，或比这高的速率喷射植株，如实施例7中所描述的。对植株评估漂白，和缺绿病，如实施例7中所描述的。
实施例9：P450表达植株降解其它除草剂的能力
许多植株具有经由基于P450的降解机制来降解除草剂的能力，并且一般而言，假设这种降解部分或主要负责这些植株的除草剂耐受性。一个例子是玉米CYP72A1酶降解除草剂苯达松、绿麦隆、和氯磺隆的能力。另外，这些植株还能够降解杀昆虫剂马拉硫磷(malathion)(参见例如美国专利号6,380,465)。同样地，已经显示了nsf酶赋予对一系列除草剂的耐受性，包括HPPD除草剂、某些磺酰脲类、某些PPO除草剂、和其它种类的除草剂(参见例如美国专利申请号2007/0214515A1)。另一个例子是稻CYP81A6酶，其能够降解苯达松和某些磺酰脲除草剂(Pan等(2007)Plant Molecular Biology，61：933-943)。因此，在植物中以合适水平表达本文中所描述的P450时，它们可以提供对多种除草剂的耐受性，包括苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺，以及具有未知作用方式的除草剂诸如野燕枯和异噁草酮。
在苯并噻二嗪酮除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于苯达松。
在磺酰脲除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于烟嘧磺隆、三氟啶磺隆和砜嘧磺隆，而且还可以降解氟嘧磺隆、乙基氯嘧磺隆、酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、甲基苄嘧磺隆、氯磺隆、环丙嘧磺隆、甲基胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、甲基氟啶嘧磺隆、甲基卤嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲基碘磺隆、甲基甲磺隆、甲酰胺磺隆、氧嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、甲基甲嘧磺隆、磺酰磺隆、三氟甲磺隆、甲基噻吩磺隆、醚苯磺隆、甲基苯磺隆、和甲基氟胺磺隆。
在咪唑啉酮除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于甲氧咪草烟、咪唑乙烟酸、甲咪唑烟酸、甲基咪草酸、和灭草喹。
在三唑并嘧啶类除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、氯酯磺草胺、和磺草唑胺。
在嘧啶硫代苯甲酸类除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于双草醚、嘧硫草醚、甲基嘧草醚、环酯草醚、和嘧啶肟草醚。
在三唑啉酮类除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于氟酮磺隆、甲基Thiencarbazone、和丙苯磺隆。
在生长素除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于麦草畏、氨草啶、2，4-D、甲氯丙酸、胺环吡克、二氯喹啉酸、2，4-滴丙酸、MCPA、MCPB、2，4-DB、二氯吡啶酸、和毒莠定。
在ACC酶抑制剂除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于精吡氟禾草灵、唑啉草酯、炔草酯、精噁唑禾草灵、三甲苯草酮、甲基禾草灵、氰氟草酯、氟吡甲禾灵、精喹禾灵、禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、和噻草酮。
在PSII抑制剂除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于苯达松、利谷隆、环嗪酮、赛克津、莠去津、敌草隆、异丙隆、绿谷隆、双苯胺灵、苯嗪草酮、敌稗、胺唑草酮、伏草隆、甜菜宁、哒草特、莠灭净、氰草津、噁唑隆、伏草隆、甲基苯噻隆、甲氧隆、扑草净、西玛津、西草净、特草定、特丁津、绿麦隆、和草达津。
在PPO抑制剂除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于氟丙嘧草酯、氟磺胺草醚、氟酮唑草(carfentrazone)、嘧啶肟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、甲磺草胺、乳氟禾草灵、噁草酮、三氟羧草醚、氟哒嗪草酯、氟烯草酸、和丙炔噁草酮。
在PDS抑制剂除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于达草灭、吡氟草胺、氟咯草酮、呋草酮、氟吡酰草胺、和氟啶草酮。
在二硝基苯胺类除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于胺硝草、氟乐灵、安磺灵、仲丁灵、敌乐胺、和乙丁烯氟灵。
在乙酰胺类除草剂种类中，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于乙草胺、精异丙甲草胺、异丙甲草胺、二甲酚噻草胺、对二甲酚噻草胺、氟噻草胺、甲草胺、丁草胺、苯噻草胺、丙草胺、毒草胺、和甲氧噻草胺。
另外，P450酶可以降解如下除草剂，包括但不限于野燕枯和异噁草酮，即具有未知作用方式的除草剂。
本文通过提及而收录所有出版物和专利申请，其程度就像明确且单独指明通过提及而收录每篇单独的出版物、专利或专利申请一样。
序列表
<110>先正达参股股份有限公司(Syngenta Participations AG)
     Hawkes，Timothy R
     Vernooij，Bernardus T M
 
<120>赋予除草剂抗性的细胞色素P450基因
 
<130>71594WOPCT
 
<160>15
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>521
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
 
<400>1
Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys
            20                  25                  30
Ala Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu
    50                  55                  60
Ala Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly
65                  70                  75                  80
Thr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys
                85                  90                  95
Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser
            100                 105                 110
Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr
        115                 120                 125
Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu
    130                 135                 140
Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val
145                 150                 155                 160
Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly
                165                 170                 175
Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu
            180                 185                 190
Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu
        195                 200                 205
Ala Asp Ala Asp Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln
    210                 215                 220
Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp
225                 230                 235                 240
Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys
                245                 250                 255
Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile
            260                 265                 270
Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys
        275                 280                 285
Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val
    290                 295                 300
Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala
305                 310                 315                 320
Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu
                325                 330                 335
Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala
            340                 345                 350
Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu
        355                 360                 365
Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala
    370                 375                 380
Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly
385                 390                 395                 400
Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Val His Ala
                405                 410                 415
Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro
            420                 425                 430
Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu
    450                 455                 460
Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp
465                 470                 475                 480
Asp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu
                485                 490                 495
Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr
            500                 505                 510
Ala Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu
        515                 520
 
<210>2
<211>1560
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>化学合成的
 
<400>2
atggacaagg cttacattgc tgctttgtct gctgctgctc ttttccttct tcactacctc     60
ttgggaagaa gagctggcgg agagggaaag gctaaggcta agggttctag aagaaggctt    120
ccaccatctc cacctgctat tccattcctt ggacaccttc accttgttaa ggctccattc    180
cacggtgctc ttgctagact tgctgctaga catggaccag tgttctctat gaggcttgga    240
actagaaggg ctgtggtggt ttcttctcca gattgcgcta gagagtgctt cactgagcac    300
gatgtgaact tcgctaacag gccacttttc ccatctatga ggctcgcttc attcgatggt    360
gctatgcttt ctgtgtcctc ctatggacca tattggagga accttagaag agttgctgct    420
gttcagcttc tttctgctca tagagtggga tgtatggctc cagctattga ggctcaagtt    480
agggctatgg tgagaagaat ggatagagct gctgctgctg gcggaggtgg agttgctaga    540
gttcagctca agagaaggct tttcgagctt tccctttccg ttctcatgga aaccattgct    600
cacactaaga cttctagggc tgaggctgat gctgattctg atatgtctac cgaggctcat    660
gagttcaagc agatcgtgga tgagcttgtg ccttacattg gaactgctaa cagatgggat    720
taccttccag tgctcagatg gttcgatgtt ttcggagtga ggaacaagat tctcgatgct    780
gtgggaagaa gggatgcttt cctcggaagg cttattgatg gcgagagaag aagattggac    840
gctggcgatg agtctgagtc caagtccatg attgctgtgc ttctcaccct tcaaaagtct    900
gagccagagg tttacaccga taccgtgatt accgctctta accttttcgg agctggaact    960
gagactactt ctactactac cgagtgggct atgtctcttc ttctcaacca cagagaggct   1020
cttaagaagg ctcaggctga gattgatgct gctgttggaa cctctaggct tgttaccgct   1080
gatgatgttc cacaccttac ctaccttcag tgcattgtgg atgagaccct tagacttcat   1140
ccagctgctc cacttttgct tccacatgag tctgctgctg attgcactgt tggaggatac   1200
gatgttccaa ggggcactat gcttttggtt aacgtgcatg ctgttcacag agatccagct   1260
gtttgggaag atccagacag attcgttcca gagagattcg aaggcgcagg tggaaaagct   1320
gagggaaggc ttcttatgcc attcggaatg ggtagaagaa agtgcccagg tgaaactctt   1380
gctcttagga ctgtgggact tgttcttgct actctcctcc aatgcttcga ttgggatact   1440
gttgatggtg ctcaggttga catgaaggct tcaggtggac ttactatgcc aagggctgtt   1500
ccacttgagg ctatgtgcag accaagaact gctatgaggg gagtgcttaa gaggctttga   1560
<210>3
<211>527
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
 
<400>3
 
Met Ala Thr Cys Asp Leu Leu Met Leu Arg Glu Ala Ser Pro Trp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Val Ala Ser Val Ser Leu Leu Trp Leu Val Ala Trp
            20                  25                  30
Thr Leu Glu Trp Ala Trp Trp Thr Pro Trp Arg Leu Asp Arg Ala Leu
        35                  40                  45
Arg Ala Gln Gly Leu Asn Gly Thr Arg Tyr Arg Leu Phe Thr Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Arg Glu Thr Ala Arg Val Asn Arg Glu Ala Arg Lys Lys Pro Leu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Gly Cys His Asp Ile Thr Pro Arg Val Gln Pro Met His His
                85                  90                  95
Ser Thr Ile Lys Glu Tyr Gly Lys Leu Ser Phe Thr Trp Phe Gly Pro
            100                 105                 110
Thr Pro Arg Val Met Ile Pro Asp Pro Glu Leu Val Lys Glu Val Leu
        115                 120                 125
Ser Asn Lys Phe Gly His Phe Gly Lys Pro Arg Ser Ser Arg Ile Gly
    130                 135                 140
Arg Leu Leu Ala Asn Gly Leu Val Asn His Asp Gly Glu Lys Trp Ala
145                 150                 155                 160
Lys His Arg Arg Ile Leu Asn Pro Ala Phe His His Glu Lys Ile Lys
                165                 170                 175
Gly Met Met Pro Val Phe Ser Thr Cys Cys Ile Glu Met Ile Thr Arg
            180                 185                 190
Trp Asp Asn Ser Met Ser Ser Glu Gly Ser Ser Glu Ile Asp Val Trp
        195                 200                 205
Pro Glu Phe Gln Asn Leu Thr Gly Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe
    210                 215                 220
Gly Ser Asn Tyr Gln Glu Gly Arg Arg Ile Phe Glu Leu Gln Gly Glu
225                 230                 235                 240
Leu Ala Glu Arg Leu Ile Gln Ser Val Gln Thr Ile Phe Ile Pro Gly
                245                 250                 255
Tyr Trp Phe Leu Pro Thr Lys Asn Asn Arg Arg Met Arg Ala Ile Asp
            260                 265                 270
Val Glu Ile Arg Lys Ile Leu Arg Glu Ile Ile Gly Lys Arg Glu Lys
        275                 280                 285
Asp Thr Lys Asn Arg Glu Thr Asn Lys Asp Asp Leu Leu Gly Leu Leu
    290                 295                 300
Leu Glu Ser Asn Thr Arg Gln Ser Asn Gly Asn Ala Ser Leu Gly Leu
305                 310                 315                 320
Thr Thr Glu Asp Val Ile Glu Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Phe Ala Gly
                325                 330                 335
Met Glu Thr Thr Ser Val Leu Leu Thr Trp Thr Leu Ile Val Leu Ser
            340                 345                 350
Met His Pro Glu Trp Gln Glu Arg Ala Arg Glu Glu Val Leu Ser His
        355                 360                 365
Phe Gly Arg Thr Thr Pro Asp Tyr Asp Ser Leu Ser Arg Leu Lys Thr
    370                 375                 380
Val Thr Met Ile Leu His Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Thr
385                 390                 395                 400
Phe Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Lys Glu Met Glu Leu Gly Gly Ile Lys
                405                 410                 415
Tyr Pro Ala Gly Val Glu Leu Leu Leu Pro Val Ile Phe Ile His His
            420                 425                 430
Asp Pro Asp Ile Trp Gly Lys Asp Ala Ser Glu Phe Asn Pro Glu Arg
        435                 440                 445
Phe Ala Asn Gly Ile Ser Ser Ala Thr Arg His Gln Ala Ala Phe Phe
    450                 455                 460
Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Ser Phe Ala Leu
465                 470                 475                 480
Leu Glu Ala Lys Met Thr Leu Cys Thr Ile Leu Gln Arg Phe Ser Phe
                485                 490                 495
Glu Leu Ser Pro Ser Tyr Thr His Ala Pro Tyr Thr Val Ile Thr Leu
            500                 505                 510
His Pro Gln His Gly Ala Gln Ile Arg Leu Lys Lys Leu Ser Pro
        515                 520                 525
 
<210>4
<211>1584
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的
 
<400>4
 
atggctacct gcgatcttct tatgcttaga gaggcttctc cttgggctct tgctggtgct     60
gttgcttctg tgtctcttct ttggcttgtt gcttggactc ttgaatgggc ttggtggact    120
ccttggagac ttgatagggc tcttagggct caaggactta acggaaccag gtacaggctt    180
ttcactggtg atcttagaga gaccgctagg gttaacagag aggctaggaa gaagccactt    240
ccacttggat gccacgatat tactccaagg gttcagccaa tgcaccactc taccatcaaa    300
gagtacggca agttgtcttt cacttggttt ggaccaactc caagggtgat gattccagat    360
ccagagcttg tgaaagaggt gctctccaac aagttcggac atttcggaaa gccaaggtcc    420
tctaggattg gaaggcttct tgctaacgga cttgtgaacc atgatggcga gaagtgggct    480
aaacacagaa ggattctcaa cccagctttc caccacgaga agatcaaggg aatgatgcca    540
gttttctcca cttgctgcat cgagatgatc accagatggg ataactctat gtcctctgag    600
ggatcttctg agattgatgt gtggccagag ttccaaaacc ttaccggcga tgtgatttct    660
agaaccgctt tcggttccaa ctatcaagag ggcagaagga ttttcgagct tcaaggtgaa    720
cttgctgaga ggcttattca gtccgttcag accattttca tcccaggata ctggttcctt    780
cctaccaaga acaacagaag gatgagggct attgatgtgg agatcaggaa gatcctcaga    840
gagattatcg gcaagagaga gaaggatacc aagaacagag agaccaacaa ggacgatctt    900
cttggacttc ttctcgagtc taacaccagg caatctaacg gaaacgcttc tcttggactt    960
actaccgagg atgtgatcga ggaatgcaag ctcttctact tcgctggaat ggaaaccact   1020
tctgtgcttt tgacctggac ccttattgtg ctttctatgc acccagagtg gcaagaaaga   1080
gctagggaag aggttttgtc tcatttcgga aggactaccc cagattacga ttctctttcc   1140
aggcttaaga ccgtgaccat gattcttcat gaggtgctca gactttatcc acctgctacc   1200
ttccttacta gaaggaccta caaagagatg gaactcggag gtattaagta cccagctggc   1260
gttgaacttc ttctcccagt gatcttcatt caccacgatc cagatatttg gggaaaggac   1320
gcttctgagt tcaacccaga gagattcgct aacggaattt cttctgctac taggcatcag   1380
gctgctttct tcccatttgg aggtggacca aggatctgca ttggacagtc tttcgctctt   1440
ctcgaggcta agatgacctt gtgcaccatt cttcagaggt tcagcttcga gctttctcca   1500
tcttacaccc atgctccata caccgttatt acccttcatc cacagcatgg tgctcagatt   1560
aggcttaaga agctctcccc ttga                                          1584
 
<210>5
<211>1584
<212>PRT
<213>稻(Oryza sativa)
 
<400>5
 
Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Ala Thr Cys
1               5                   10                  15
Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ala
            20                  25                  30
Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr
        35                  40                  45
Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly
    50                  55                  60
Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr
65                  70                  75                  80
Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Thr Gly Gly
                85                  90                  95
Ala Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Gly
        115                 120                 125
Ala Cys Thr Thr Gly Ala Thr Ala Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr
    130                 135                 140
Ala Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly
                165                 170                 175
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr
            180                 185                 190
Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala
        195                 200                 205
Gly Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys
    210                 215                 220
Thr Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr
225                 230                 235                 240
Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys Ala Cys Gly
                245                 250                 255
Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Thr
            260                 265                 270
Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys
        275                 280                 285
Thr Cys Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr
    290                 295                 300
Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr
305                 310                 315                 320
Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala
                325                 330                 335
Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala
            340                 345                 350
Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr
        355                 360                 365
Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Cys
    370                 375                 380
Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys
385                 390                 395                 400
Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly
                405                 410                 415
Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala
            420                 425                 430
Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly
        435                 440                 445
Gly Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala
    450                 455                 460
Thr Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Thr
465                 470                 475                 480
Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys
                485                 490                 495
Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys Ala
            500                 505                 510
Cys Cys Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly
        515                 520                 525
Gly Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr
    530                 535                 540
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr
545                 550                 555                 560
Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala
                565                 570                 575
Thr Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Thr
            580                 585                 590
Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys
        595                 600                 605
Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Gly Gly
    610                 615                 620
Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys
625                 630                 635                 640
Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Gly Thr Gly Ala Thr
                645                 650                 655
Thr Thr Cys Thr Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys
            660                 665                 670
Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly
        675                 680                 685
Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr
    690                 695                 700
Cys Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala
705                 710                 715                 720
Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Ala
                725                 730                 735
Thr Thr Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys
            740                 745                 750
Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala
        755                 760                 765
Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Ala
    770                 775                 780
Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly
785                 790                 795                 800
Gly Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Thr
                805                 810                 815
Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala
            820                 825                 830
Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr
        835                 840                 845
Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly
    850                 855                 860
Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly
865                 870                 875                 880
Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala
                885                 890                 895
Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr
            900                 905                 910
Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala
        915                 920                 925
Gly Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala
    930                 935                 940
Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr
945                 950                 955                 960
Ala Cys Thr Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Ala
                965                 970                 975
Thr Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr
            980                 985                 990
Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr  Thr Cys Gly Cys Thr  Gly Gly Ala
        995                 1000                 1005
Ala Thr  Gly Gly Ala Ala Ala  Cys Cys Ala Cys Thr  Thr Cys Thr
    1010                 1015                 1020
Gly Thr  Gly Cys Thr Thr Thr  Thr Gly Ala Cys Cys  Thr Gly Gly
    1025                 1030                 1035
Ala Cys  Cys Cys Thr Thr Ala  Thr Thr Gly Thr Gly  Cys Thr Thr
    1040                 1045                 1050
Thr Cys  Thr Ala Thr Gly Cys  Ala Cys Cys Cys Ala  Gly Ala Gly
    1055                 1060                 1065
Thr Gly  Gly Cys Ala Ala Gly  Ala Ala Ala Gly Ala  Gly Cys Thr
    1070                 1075                 1080
Ala Gly  Gly Gly Ala Ala Gly  Ala Gly Gly Thr Thr  Thr Thr Gly
    1085                 1090                 1095
Thr Cys  Thr Cys Ala Thr Thr  Thr Cys Gly Gly Ala  Ala Gly Gly
    1100                 1105                 1110
Ala Cys  Thr Ala Cys Cys Cys  Cys Ala Gly Ala Thr  Thr Ala Cys
    1115                 1120                 1125
Gly Ala  Thr Thr Cys Thr Cys  Thr Thr Thr Cys Cys  Ala Gly Gly
    1130                 1135                 1140
Cys Thr  Thr Ala Ala Gly Ala  Cys Cys Gly Thr Gly  Ala Cys Cys
    1145                 1150                 1155
Ala Thr  Gly Ala Thr Thr Cys  Thr Thr Cys Ala Thr  Gly Ala Gly
    1160                 1165                 1170
Gly Thr  Gly Cys Thr Cys Ala  Gly Ala Cys Thr Thr  Thr Ala Thr
    1175                 1180                 1185
Cys Cys  Ala Cys Cys Thr Gly  Cys Thr Ala Cys Cys  Thr Thr Cys
    1190                 1195                 1200
Cys Thr  Thr Ala Cys Thr Ala  Gly Ala Ala Gly Gly  Ala Cys Cys
    1205                 1210                 1215
Thr Ala  Cys Ala Ala Ala Gly  Ala Gly Ala Thr Gly  Gly Ala Ala
    1220                 1225                 1230
Cys Thr  Cys Gly Gly Ala Gly  Gly Thr Ala Thr Thr  Ala Ala Gly
    1235                 1240                 1245
Thr Ala  Cys Cys Cys Ala Gly  Cys Thr Gly Gly Cys  Gly Thr Thr
    1250                 1255                 1260
Gly Ala  Ala Cys Thr Thr Cys  Thr Thr Cys Thr Cys  Cys Cys Ala
    1265                 1270                 1275
Gly Thr  Gly Ala Thr Cys Thr  Thr Cys Ala Thr Thr  Cys Ala Cys
    1280                 1285                 1290
Cys Ala  Cys Gly Ala Thr Cys  Cys Ala Gly Ala Thr  Ala Thr Thr
    1295                 1300                 1305
Thr Gly  Gly Gly Gly Ala Ala  Ala Gly Gly Ala Cys  Gly Cys Thr
    1310                 1315                 1320
Thr Cys  Thr Gly Ala Gly Thr  Thr Cys Ala Ala Cys  Cys Cys Ala
    1325                 1330                 1335
Gly Ala  Gly Ala Gly Ala Thr  Thr Cys Gly Cys Thr  Ala Ala Cys
    1340                 1345                 1350
Gly Gly  Ala Ala Thr Thr Thr  Cys Thr Thr Cys Thr  Gly Cys Thr
    1355                 1360                 1365
Ala Cys  Thr Ala Gly Gly Cys  Ala Thr Cys Ala Gly  Gly Cys Thr
    1370                 1375                 1380
Gly Cys  Thr Thr Thr Cys Thr  Thr Cys Cys Cys Ala  Thr Thr Thr
    1385                 1390                 1395
Gly Gly  Ala Gly Gly Thr Gly  Gly Ala Cys Cys Ala  Ala Gly Gly
    1400                 1405                 1410
Ala Thr  Cys Thr Gly Cys Ala  Thr Thr Gly Gly Ala  Cys Ala Gly
    1415                 1420                 1425
Thr Cys  Thr Thr Thr Cys Gly  Cys Thr Cys Thr Thr  Cys Thr Cys
    1430                 1435                 1440
Gly Ala  Gly Gly Cys Thr Ala  Ala Gly Ala Thr Gly  Ala Cys Cys
    1445                 1450                 1455
Thr Thr  Gly Thr Gly Cys Ala  Cys Cys Ala Thr Thr  Cys Thr Thr
    1460                 1465                 1470
Cys Ala  Gly Ala Gly Gly Thr  Thr Cys Ala Gly Cys  Thr Thr Cys
    1475                 1480                 1485
Gly Ala  Gly Cys Thr Thr Thr  Cys Thr Cys Cys Ala  Thr Cys Thr
    1490                 1495                 1500
Thr Ala  Cys Ala Cys Cys Cys  Ala Thr Gly Cys Thr  Cys Cys Ala
    1505                 1510                 1515
Thr Ala  Cys Ala Cys Cys Gly  Thr Thr Ala Thr Thr  Ala Cys Cys
    1520                 1525                 1530
Cys Thr  Thr Cys Ala Thr Cys  Cys Ala Cys Ala Gly  Cys Ala Thr
    1535                 1540                 1545
Gly Gly  Thr Gly Cys Thr Cys  Ala Gly Ala Thr Thr  Ala Gly Gly
    1550                 1555                 1560
Cys Thr  Thr Ala Ala Gly Ala  Ala Gly Cys Thr Cys  Thr Cys Cys
    1565                 1570                 1575
Cys Cys  Thr Thr Gly Ala
    1580
 
<210>6
<211>1670
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>化学合成的
 
<400>6
 
ggatcctata aataggaagt tcatttcatt tggagaggaa acctcgagta tttttacaac     60
aattaccaac aacaacaaac aacaaacaac attacaatta ctatttacaa ttacagatct    120
ccatggataa cgcttatatt attgctattc tttctgttgc tattcttttc cttcttcatt    180
attatcttct tggaagagga aacggaggag ctgctagact tccaccagga ccaccagctg    240
ttccaattct tggacatctt catcttgtta agaagccaat gcatgctact atgtctagac    300
ttgctgagag atatggacca gttttctctc ttagacttgg atctagaaga gctgttgttg    360
tttcttctcc aggatgcgct agagagtgct tcactgagca tgatgttact ttcgctaaca    420
gaccaagatt cgagtctcaa cttcttgttt ctttcaacgg agctgctctt gctactgctt    480
cttatggtgc tcattggaga aaccttagaa gaattgttgc tgttcaactt ctttctgctc    540
atagagttgg acttatgtct ggacttattg ctggagaggt tagagctatg gttagaagaa    600
tgtatagagc tgctgctgct tctccagctg gagctgctag aattcaactt aagagaagac     660
ttttcgaggt ttctctttct gttcttatgg agactattgc tcatactaag gctactagac     720
cagagactga tccagatact gatatgtctg ttgaggctca agagttcaag caagttgttg     780
atgagattat tccacatatt ggagctgcta acctttggga ttatcttcca gctcttagat     840
ggttcgatgt tttcggagtt agaagaaaga ttcttgctgc tgtttctaga agagatgctt     900
tccttagaag acttattgat gctgagagaa gaagacttga tgatggagat gagggagaga     960
agaagtctat gattgctgtt cttcttactc ttcaaaagac tgagccagag gtttatactg    1020
ataacatgat tactgctctt actgctaacc ttttcggagc tggaactgag actacttcta    1080
ctacttctga gtgggctatg tctcttcttc ttaaccatcc agatactctt aagaaggctc    1140
aagctgagat tgatgcttct gttggaaact ctagacttat tactgctgat gatgttacta    1200
gacttggata tcttcaatgc attgttagag agactcttag actttatcca gctgctccaa    1260
tgcttcttcc acatgagtct tctgctgatt gcaaggttgg aggatataac attccaagag    1320
gatctatgct tcttattaac gcttatgcta ttcatagaga tccagctgtt tgggaggagc    1380
cagagaagtt catgccagag agattcgagg atggaggatg cgatggaaac cttcttatgc    1440
cattcggaat gggaagaaga agatgcccag gagagactct tgctcttaga actgttggac    1500
ttgttcttgg aactcttatt caatgcttcg attgggagag agttgatgga gttgaggttg    1560
atatgactga gggaggagga cttactattc caaaggttgt tccacttgag gctatgtgca    1620
gaccaagaga tgctatggga ggagttctta gagagcttgt ttaagagctc               1670
 
<210>7
<211>513
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
 
<400>7
 
Met Asp Lys Ala Tyr Val Ala Ala Leu Ser Val Ala Phe Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Val His Tyr Leu Val Gly Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Lys Gly Arg
            20                  25                  30
Lys Arg Leu Pro Pro Ser Pro Leu Ala Ile Pro Phe Leu Gly His Leu
        35                  40                  45
His Leu Val Lys Thr Pro Phe His Ser Ala Leu Gly Arg Leu Ala Glu
    50                  55                  60
Arg His Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Met Gly Cys Arg Arg Ala Val
65                  70                  75                  80
Val Val Ser Ser Pro Glu Cys Ala Arg Ala Cys Phe Thr Glu His Asp
                85                  90                  95
Met Ser Phe Ala Asn Arg Pro Arg Phe Glu Ser Met Arg Leu Val Ser
            100                 105                 110
Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg
        115                 120                 125
Thr Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala His Arg Val
    130                 135                 140
Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Cys Ala Glu Val Arg Ala Met Val Arg
145                 150                 155                 160
Arg Met Ala Arg Leu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Arg Val Gln Leu Arg
                165                 170                 175
Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Gly Val Leu Met Glu Thr Ile Ala
            180                 185                 190
Arg Thr Lys Thr Ser Arg Ser Glu Ala Cys Ala Ala Asp Thr Asp Val
        195                 200                 205
Ser Pro Glu Ala Ser Glu Leu Thr Arg Ile Ser Glu Glu Ile Met Pro
    210                 215                 220
Tyr Leu Gly Thr Ala Asn Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Phe Leu Arg Trp
225                 230                 235                 240
Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Leu Met Ala Ala Val Arg Trp
                245                 250                 255
Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Arg Arg Met
            260                 265                 270
Asp Gly Asp Gly Asp Gly Glu Lys Lys Ser Met Ile Ala Val Leu Leu
        275                 280                 285
Ser Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Met Ile Met
    290                 295                 300
Ala Leu Cys Gly Asp Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Val
305                 310                 315                 320
Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Ser His Pro Glu Ala Leu
                325                 330                 335
Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Val Val Gly Asn Ser Arg Arg
            340                 345                 350
Leu Ile Thr Ala Asp Asp Val Pro Arg Leu Gly Tyr Leu His Cys Val
        355                 360                 365
Ile Asn Glu Thr Leu Arg Met Tyr Pro Ala Ala Pro Leu Leu Leu Pro
    370                 375                 380
His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr Asp Val Pro Arg
385                 390                 395                 400
Gly Thr Leu Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His Arg Asp Pro Ala
                405                 410                 415
Val Trp Glu Asp Pro Gly Ser Phe Leu Pro Glu Arg Phe Glu Asp Gly
            420                 425                 430
Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys
        435                 440                 445
Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala
    450                 455                 460
Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp Asp Thr Val Asp Gly Ala Glu Val
465                 470                 475                 480
Asp Met Thr Glu Ser Gly Gly Leu Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu
                485                 490                 495
Glu Ala Met Cys Lys Pro Arg Ala Ala Met Cys Asp Val Leu Arg Glu
            500                 505                 510
Leu
 
<210>8
<211>542
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
 
<400>8
 
Met Ala His Asp Ala Arg Cys Cys Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Ser Met Met Asp Leu Ala Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Val Phe Leu Phe Leu Leu Arg Arg Val His Gly Leu Ala Arg Arg Asp
        35                  40                  45
Gly Lys Ser Arg Ser Met Arg Arg Pro Pro Pro Ser Pro Pro Gly Ala
    50                  55                  60
Val Pro Phe Leu Gly His Leu His Leu Ile Lys Lys Pro Phe His Ala
65                  70                  75                  80
Thr Leu Ser Gly Leu Ala Gln Arg His Gly Pro Val Phe Thr Leu Arg
                85                  90                  95
Leu Gly Ser Arg Asp Ala Ala Val Val Thr Ser Pro Ala Cys Ala Arg
            100                 105                 110
Glu Cys Phe Thr Glu His Asp Val Thr Phe Ala Asn Arg Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Pro Ser Gln Arg Leu Val Thr Phe Asp Gly Ala Ala Leu Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ser Tyr Gly Pro Arg Trp Arg Asp Leu Arg Arg Val Ala Val Val Gln
145                 150                 155                 160
Leu Leu Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ser Gly Val Ile Cys Gly
                165                 170                 175
Glu Val Arg Ala Met Val Arg Arg Leu His Arg Ala Ala Ala Ala Ser
            180                 185                 190
Ala Ala Ala Gly Ala Arg Ile Glu Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu
        195                 200                 205
Ser Leu Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Ala Glu Thr Lys Ala Lys Arg
    210                 215                 220
Arg Asp Pro Asp Pro Glu Pro Asp Ala Asp Gly Thr Thr Asp Met Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Ala Gln Glu Phe Lys Arg Val Ile Asp Glu Val Phe Pro Tyr
                245                 250                 255
Val Ser Ser Val Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp
            260                 265                 270
Val Ala Gly Val Arg Ser Arg Ile Leu Ala Ala Val Ser Arg Arg Asp
        275                 280                 285
Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Arg Arg Met Ala Asp
    290                 295                 300
Gly Val Cys Gly Glu Lys Lys Ser Leu Ile Ala Val Leu Leu Ala Leu
305                 310                 315                 320
Gln Lys Leu Glu Pro Glu Val Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Phe
                325                 330                 335
Cys Ser Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Val
            340                 345                 350
Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn Asn Pro Gly Thr Leu Glu Lys
        355                 360                 365
Ala Arg Ala Glu Ile Asp Ala Ala Val Gly His Ser Arg Leu Leu Asn
    370                 375                 380
Ala Gly Asp Leu Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Arg Cys Ile Ile Ala Glu
385                 390                 395                 400
Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser
                405                 410                 415
Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Ala
            420                 425                 430
Leu Leu Val Asn Val Tyr Ala Ile His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu
        435                 440                 445
Glu Pro Gly Arg Phe Val Pro Glu Arg Phe Glu Gly Gly Lys Ala Glu
    450                 455                 460
Gly Leu Phe Val Ala Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Leu Ala Leu Gln Thr Val Gly Val Ala Leu Gly Ser Leu Ile
                485                 490                 495
Gln Cys Phe His Trp Asn Arg Val Asp Gly Val Glu Val Asp Met Ser
            500                 505                 510
Glu Gly Ser Gly Leu Thr Met Pro Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Leu
        515                 520                 525
Cys Thr Thr Arg Glu Ala Met Tyr Asp Val Leu Gln Lys Ile
    530                 535                 540
 
<210>9
<211>524
<212>PRT
<213>长春花(Catharanthus roseus)
 
<400>9
 
Met Glu Met Asp Met Asp Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Ala Thr Ile
1               5                   10                  15
Phe Ala Leu Val Met Ala Trp Ala Trp Arg Val Leu Asp Trp Ala Trp
            20                  25                  30
Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Lys Arg Leu Arg Gln Gln Gly Phe Arg
        35                  40                  45
Gly Asn Pro Tyr Arg Phe Leu Val Gly Asp Val Lys Glu Ser Gly Lys
    50                  55                  60
Met His Gln Glu Ala Leu Ser Lys Pro Met Glu Phe Asn Asn Asp Ile
65                  70                  75                  80
Val Pro Arg Leu Met Pro His Ile Asn His Thr Ile Asn Thr Tyr Gly
                85                  90                  95
Arg Asn Ser Phe Thr Trp Met Gly Arg Ile Pro Arg Ile His Val Met
            100                 105                 110
Glu Pro Glu Leu Ile Lys Glu Val Leu Thr His Ser Ser Lys Tyr Gln
        115                 120                 125
Lys Asn Phe Asp Val His Asn Pro Leu Val Lys Phe Leu Leu Thr Gly
    130                 135                 140
Val Gly Ser Phe Glu Gly Ala Lys Trp Ser Lys Hi s Arg Arg Ile Ile
145                 150                 155                 160
Ser Pro Ala Phe Thr Leu Glu Ly s Leu Lys Ser Met Leu Pro Ala Phe
                165                 170                 175
Ala Ile Cys Tyr His Asp Met Leu Thr Lys Trp Glu Lys Ile Ala Glu
            180                 185                 190
Lys Gln Gly Ser His Glu Val Asp Ile Phe Pro Thr Phe Asp Val Leu
        195                 200                 205
Thr Ser Asp Val Ile Ser Lys Val Ala Phe Gly Ser Thr Tyr Glu Glu
    210                 215                 220
Gly Gly Lys Ile Phe Arg Leu Leu Lys Glu Leu Met Asp Leu Thr Ile
225                 230                 235                 240
Asp Cys Met Arg Asp Val Tyr Ile Pro Gly Trp Ser Tyr Leu Pro Thr
                245                 250                 255
Lys Arg Asn Lys Arg Met Lys Glu Ile Asn Lys Glu Ile Thr Asp Met
            260                 265                 270
Leu Arg Phe Ile Ile Asn Lys Arg Met Lys Ala Leu Lys Ala Gly Glu
        275                 280                 285
Pro Gly Glu Asp Asp Leu Leu Gly Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Gln
    290                 295                 300
Glu Ile Gln Lys Gln Gly Asn Lys Lys Asp Gly Gly Met Ser Ile Asn
305                 310                 315                 320
Asp Val Ile Glu Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Phe Ala Gly Gln Glu Thr
                325                 330                 335
Thr Gly Val Leu Leu Thr Trp Thr Thr Ile Leu Leu Ser Lys His Pro
            340                 345                 350
Glu Trp Gln Glu Arg Ala Arg Glu Glu Val Leu Gln Ala Phe Gly Lys
        355                 360                 365
Asn Lys Pro Glu Phe Glu Arg Leu Asn His Leu Lys Tyr Val Ser Met
    370                 375                 380
Ile Leu Tyr Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Val Ile Asp Leu Thr
385                 390                 395                 400
Lys Ile Val His Lys Asp Thr Lys Leu Gly Ser Tyr Thr Ile Pro Ala
                405                 410                 415
Gly Thr Gln Val Met Leu Pro Thr Val Met Leu His Arg Glu Lys Ser
            420                 425                 430
Ile Trp Gly Glu Asp Ala Met Glu Phe Asn Pro Met Arg Phe Val Asp
        435                 440                 445
Gly Val Ala Asn Ala Thr Lys Asn Asn Val Thr Tyr Leu Pro Phe Ser
    450                 455                 460
Trp Gly Pro Arg Val Cys Leu Gly Gln Asn Phe Ala Leu Leu Gln Ala
465                 470                 475                 480
Lys Leu Gly Leu Ala Met Ile Leu Gln Arg Phe Lys Phe Asp Val Ala
                485                 490                 495
Pro Ser Tyr Val His Ala Pro Phe Thr Ile Leu Thr Val Gln Pro Gln
            500                 505                 510
Phe Gly Ser His Val Ile Tyr Lys Lys Leu Glu Ser
        515                 520
 
<210>10
<211>440
<212>PRT
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>10
 
Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
            20                  25                  30
Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
        35                  40                  45
Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr
                85                  90                  95
Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr
            100                 105                 110
Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala
        115                 120                 125
Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Ala Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe
145                 150                 155                 160
Ala Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu
                165                 170                 175
Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp
            180                 185                 190
Leu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val
        195                 200                 205
Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu
    210                 215                 220
Met Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu
                245                 250                 255
Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu
            260                 265                 270
Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr
        275                 280                 285
Leu Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser
    290                 295                 300
Asn Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met
305                 310                 315                 320
Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly
                325                 330                 335
Val Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu
            340                 345                 350
Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu
        355                 360                 365
Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu
    370                 375                 380
Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln
385                 390                 395                 400
Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser
                405                 410                 415
Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys
            420                 425                 430
Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
        435                 440
<210>11
<211>439
<212>PRT
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>11
 
Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
            20                  25                  30
Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
        35                  40                  45
Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr
                85                  90                  95
Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala
            100                 105                 110
Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala
        115                 120                 125
His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala
    130                 135                 140
Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala
145                 150                 155                 160
Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr
                165                 170                 175
Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu
            180                 185                 190
Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp
        195                 200                 205
Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met
    210                 215                 220
Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe
225                 230                 235                 240
Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn
                245                 250                 255
Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn
            260                 265                 270
Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu
        275                 280                 285
Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn
    290                 295                 300
Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly
305                 310                 315                 320
Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val
                325                 330                 335
Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys
            340                 345                 350
Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu
        355                 360                 365
Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu
    370                 375                 380
Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu
385                 390                 395                 400
Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu
                405                 410                 415
Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln
            420                 425                 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
        435
 
<210>12
<211>440
<212>PRT
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>12
 
Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
            20                  25                  30
Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
        35                  40                  45
Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr
                85                  90                  95
Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr
            100                 105                 110
Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala
        115                 120                 125
Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Ala Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe
145                 150                 155                 160
Ala Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu
                165                 170                 175
Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp
            180                 185                 190
Leu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val
        195                 200                 205
Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu
    210                 215                 220
Met Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu
                245                 250                 255
Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu
            260                 265                 270
Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr
        275                 280                 285
Leu Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser
    290                 295                 300
Asn Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met
305                 310                 315                 320
Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly
                325                 330                 335
Val Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu
            340                 345                 350
Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu
        355                 360                 365
Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu
    370                 375                 380
Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln
385                 390                 395                 400
Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser
                405                 410                 415
Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys
            420                 425                 430
Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
        435                 440
 
<210>13
<211>440
<212>PRT
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>13
Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
            20                  25                  30
Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
        35                  40                  45
Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu
    50                  55                  60
Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr
                85                  90                  95
Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr
            100                 105                 110
Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala
         115                 120                 125
Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Ala Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe
145                 150                 155                 160
Ala Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu
                165                 170                 175
Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp
            180                 185                 190
Leu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val
        195                 200                 205
Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu
    210                 215                 220
Met Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu
                245                 250                 255
Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu
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        275                 280                 285
Leu Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser
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Asn Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met
305                 310                 315                 320
Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly
                325                 330                 335
Val Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu
            340                 345                 350
Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu
        355                 360                 365
Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu
    370                 375                 380
Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln
385                 390                 395                 400
Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser
                405                 410                 415
Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys
            420                 425                 430
Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
        435                 440
 
<210>14
<211>1323
<212>DNA
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>14
atgcctccaa caccagctac tgctactgga gctgctgctg ctgccgttac accagaacat     60
gctgcaaggt cattccctag agttgttcgc gttaacccta ggtctgacag attccctgtt    120
ctgtccttcc atcatgtgga gctttggtgt gctgatgcag ctagtgctgc tggtcgtttc    180
agctttgcac ttggagcacc acttgctgca agatctgatc tgtctacagg gaactcagca    240
catgcttctc tcctacttcg atctggagca ttagccttcc tttttaccgc tccttatgct    300
ccacctccac aagaagctgc aactgctgct gcaactgctt ccattccctc cttttcagca    360
gatgctgcaa gaacctttgc tgctgcacat ggacttgctg tcagatctgt tggagttagg    420
gttgctgatg cagctgaagc atttcgcgtt agtgttgctg gaggagcaag acctgctttt    480
gctccagcag atcttggtca cggatttgga cttgctgaag tggagctgta tggagatgtg    540
gttctgagat tcgtgagcta tcctgacgaa actgacctac catttctccc aggattcgag    600
agggtttcaa gtccaggtgc agttgactac ggtttgactc gctttgacca cgttgttgga    660
aacgttccag aaatggctcc tgtcatcgac tacatgaagg gattccttgg tttccacgag    720
ttcgctgaat tcacagcaga ggatgttgga accacagaat ctggactgaa cagtgtggtt    780
ctagccaaca acagtgaagc tgttcttctg ccattgaacg agcctgttca tggaaccaag    840
agacgatctc agatccaaac ctacctcgaa taccatggtg gaccaggagt tcaacacatc    900
gcattggctt ctaacgatgt gcttcgaact ctcagggaaa tgagagccag aactccaatg    960
ggagggttcg aatttatggc tcctccacaa gccaagtact atgaaggagt ccgtagaatc   1020
gctggagatg tcttgtcaga ggaacagatc aaggagtgtc aagaactggg tgttctcgtt   1080
gatcgagacg atcaaggtgt gctactccag atcttcacca aaccagttgg tgatcgtccc   1140
acttttttcc tcgaaatgat tcagcgaata ggatgcatgg agaaggatga agttgggcaa   1200
gagtaccaga aaggtggatg tggtgggttt ggaaagggga acttttccga gttgttcaag   1260
tccatagagg actacgagaa gtcactggaa gtcaagcagt ctgtcgttgc tcagaagagc   1320
taa                                                                 1323
 
<210>15
<211>1320
<212>DNA
<213>燕麦(Avena sativa)
 
<400>15
atgcctccaa caccagctac tgctactgga gctgctgctg ctgccgttac accagaacat     60
gctgcaaggt cattccctag agttgttcgc gttaacccta ggtctgacag attccctgtt    120
ctgtccttcc atcatgtgga gctttggtgt gctgatgcag ctagtgctgc tggtcgtttc    180
agctttgcac ttggagcacc acttgctgca agatctgatc tgtctacagg gaactcagca    240
catgcttctc tcctacttcg atctggagca ttagccttcc tttttaccgc tccttatgct    300
ccacctccac aagaagctgc aactgctgca actgcttcca ttccctcctt ttcagcagat    360
gctgcaagaa cctttgctgc tgcacatgga cttgctgtca gatctgttgg agttagggtt    420
gctgatgcag ctgaagcatt tcgcgttagt gttgctggag gagcaagacc tgcttttgct    480
ccagcagatc ttggtcacgg atttggactt gctgaagtgg agctgtatgg agatgtggtt    540
ctgagattcg tgagctatcc tgacgaaact gacctaccat ttctcccagg attcgagagg    600
gtttcaagtc caggtgcagt tgactacggt ttgactcgct ttgaccacgt tgttggaaac    660
gttccagaaa tggctcctgt catcgactac atgaagggat tccttggttt ccacgagttc    720
gctgaattca cagcagagga tgttggaacc acagaatctg gactgaacag tgtggttcta    780
gccaacaaca gtgaagctgt tcttctgcca ttgaacgagc ctgttcatgg aaccaagaga    840
cgatctcaga tccaaaccta cctcgaatac catggtggac caggagttca acacatcgca    900
ttggcttcta acgatgtgct tcgaactctc agggaaatga gagccagaac tccaatggga    960
gggttcgaat ttatggctcc tccacaagcc aagtactatg aaggagtccg tagaatcgct   1020
ggagatgtct tgtcagagga acagatcaag gagtgtcaag aactgggtgt tctcgttgat   1080
cgagacgatc aaggtgtgct actccagatc ttcaccaaac cagttggtga tcgtcccact   1140
tttttcctcg aaatgattca gcgaatagga tgcatggaga aggatgaagt tgggcaagag   1200
taccagaaag gtggatgtgg tgggtttgga aaggggaact tttccgagtt gttcaagtcc   1260
atagaggact acgagaagtc actggaagtc aagcagtctg tcgttgctca gaagagctaa   1320

Claims (41)

1.一种植物细胞，其含有包含与启动子可操作连接的编码细胞色素P450或其变体的多核苷酸序列的核酸构建体，所述启动子能够驱动所述多核苷酸序列的表达，其中所述核酸构建体在所述植物细胞中的表达导致与野生型植物细胞相比对除草剂的抗性或耐受性改善，其中所述细胞色素P450或其变体选自下组：
a)SEQ ID NO：2、4、或6中所示核苷酸序列；
b)编码包含SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：2、4、或6的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列；和
d)编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
2.权利要求1的植物细胞，其中所述除草剂是HPPD抑制剂。
3.权利要求2的植物细胞，其中所述HPPD抑制剂选自下组：
a)式Ia的化合物
其中R1和R2是氢或者在一起是乙烯桥；
R3是C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-C1-C4烷基或者R3是基团
Figure FPA00001010481300012
R4是C1-C4烷基磺酰基或C1-C4卤烷基；
R5是氢或苯硫基；X是次甲基、氮或C-R6，其中R6是C1-C4卤烷氧基-C1-C4烷基或基团
式Ib的化合物
Figure FPA00001010481300022
其中R7是甲基或氯；
c)式Ic的化合物
Figure FPA00001010481300023
其中R8是卤素或C1-C4卤烷基；
d)式Id的化合物
Figure FPA00001010481300024
e)式Ie的化合物
Figure FPA00001010481300031
f)式If的化合物
Figure FPA00001010481300032
g)式Ig的化合物
Figure FPA00001010481300033
及其游离酸；
h)式Ih的化合物
Figure FPA00001010481300034
i)式Ii的化合物
j)式Ij的化合物
k)式Ik的化合物
Figure FPA00001010481300043
4.权利要求1的植物细胞，其中所述除草剂是选自下组的除草剂类型的成员：苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺类。
5.权利要求4的植物细胞，其中所述苯并噻二嗪酮是苯达松。
6.权利要求4的植物细胞，其中所述磺酰脲选自下组：烟嘧磺隆、三氟啶磺隆、砜嘧磺隆、乙基氯嘧磺隆、甲酰胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、和甲基苯磺隆。
7.权利要求4的植物细胞，其中所述咪唑啉酮是甲氧咪草烟。
8.权利要求4的植物细胞，其中所述三唑并嘧啶选自下组：唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、和氯酯磺草胺。
9.权利要求4的植物细胞，其中所述生长素选自下组：麦草畏、氨草啶、2，4-D、和胺环吡克。
10.权利要求4的植物细胞，其中所述ACC酶抑制剂选自下组：精吡氟禾草灵、唑啉草酯、炔草酯、和精噁唑禾草灵。
11.权利要求4的植物细胞，其中所述PSII抑制剂选自下组：苯达松、利谷隆、环嗪酮、赛克津、氨唑草酮、和哒草特。
12.权利要求4的植物细胞，其中所述PDS抑制剂是达草灭。
13.权利要求4的植物细胞，其中所述二硝基苯胺是胺硝草。
14.权利要求4的植物细胞，其中所述乙酰胺选自下组：乙草胺和精异丙甲草胺。
15.权利要求4的植物细胞，其中所述PPO抑制剂选自下组：氟丙嘧草酯、氟磺胺草醚、氟酮唑草、嘧啶肟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、和甲磺草胺。
16.权利要求1的植物细胞，其中所述除草剂是异噁草酮。
17.权利要求1的植物细胞，其中所述核酸构建体进一步包含编码赋予想要的性状的多肽的多核苷酸序列。
18.权利要求17的植物细胞，其中所述想要的性状是对除草剂的抗性或耐受性。
19.权利要求18的植物细胞，其中所述想要的性状是对HPPD抑制剂的抗性或耐受性。
20.权利要求19的植物细胞，其中赋予想要的性状的所述多肽是经修饰的HPPD。
21.权利要求18的植物细胞，其中所述想要的性状是对草甘膦的抗性或耐受性。
22.权利要求21的植物细胞，其中赋予想要的性状的所述多肽是赋予对草甘膦的抗性的EPSPS(5-烯醇-丙酮酸-莽草酸-3-磷酸-合酶)。
23.权利要求18的植物细胞，其中所述想要的性状是对草铵膦的抗性或耐受性。
24.权利要求23的植物细胞，其中赋予想要的性状的所述多肽是膦丝菌素乙酰基转移酶。
25.权利要求1的植物细胞，其中所述植物细胞是稻、大麦、马铃薯、甘薯、芸苔、向日葵、黑麦、燕麦、小麦、玉米、大豆、糖甜菜、烟草、芒属草(Miscanthus grass)、柳枝稷、红花、树、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、糖甜菜、和甘蔗植物细胞。
26.权利要求1的植物细胞，其中所述植物细胞是大豆植物细胞。
27.一种植物、植物部分、或种子，其包含权利要求1的植物细胞。
28.一种用于在植物中赋予对除草剂的抗性的方法，所述方法包括用核酸构建体转化所述植物，所述构建体包含与编码细胞色素P450或其变体的多核苷酸序列可操作连接的能够驱动植物细胞中的表达的启动子，其中所述核酸构建体在所述植物细胞中的表达导致与野生型植物细胞相比对除草剂的抗性或耐受性改善，并使经转化的植物再生，其中所述细胞色素P450或其变体选自下组：
a)SEQ ID NO：2、4、或6中所示核苷酸序列；
b)编码包含SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：2、4、或6的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列；和
d)编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
29.权利要求28的方法，其中所述除草剂是HPPD抑制剂。
30.权利要求28的方法，其中所述除草剂是选自下组的除草剂类型的成员：苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺类。
31.权利要求28的方法，其中所述核酸构建体进一步包含编码赋予想要的性状的多肽的多核苷酸序列。
32.权利要求31的方法，其中所述想要的性状是对除草剂的抗性或耐受性。
33.权利要求32的方法，其中所述想要的性状是对HPPD抑制剂的抗性或耐受性。
34.权利要求32的方法，其中所述想要的性状是对草甘膦的抗性或耐受性。
35.权利要求32的方法，其中所述想要的性状是对草铵膦的抗性或耐受性。
36.权利要求28的方法，其中所述植物是稻、大麦、马铃薯、甘薯、芸苔、向日葵、黑麦、燕麦、小麦、玉米、大豆、糖甜菜、烟草、芒属草、柳枝稷、红花、树、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、糖甜菜、或甘蔗植物。
37.权利要求36的方法，其中所述植物是大豆植物。
38.一种控制所处位置的杂草的方法，所述方法包括向所述位置应用杂草控制量的一种或多种除草剂，其中所述位置包含已经用如下核酸构建体转化的植物，所述构建体包含与编码细胞色素P450或其变体的多核苷酸序列可操作连接的能够驱动植物细胞中的表达的启动子，其中所述细胞色素P450或其变体选自下组：
a)SEQ ID NO：2、4、或6中所示核苷酸序列；
b)编码包含SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：2、4、或6的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列；和
d)编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：1、3、或5中所示氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
39.权利要求38的方法，其中所述一种或多种除草剂是选自下组：HPPD抑制剂类、苯并噻二嗪酮类、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫代苯甲酸类、三唑啉酮类、生长素类、乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂类、光系统II(PSII)抑制剂类、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂类、八氢番茄红素不饱和酶(PDS)抑制剂类、二硝基苯胺类、和乙酰胺类。
40.权利要求38的方法，其中所述核酸构建体进一步包含编码赋予想要的性状的多肽的多核苷酸序列。
41.权利要求40的方法，其中所想要的性状是对选自下组的除草剂的抗性或耐受性：HPPD抑制剂、草甘磷、和草铵膦。
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