CN104946670A - 一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变引起水稻CYP81A6基因第一个外显子中7个碱基对缺失，将该CYP81A6基因突变体命名为CYP81A6-m1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实CYP81A6-m1对苯达松除草剂高度敏感，可用于制备对苯达松敏感的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。

Description

一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用。

背景技术

水稻是我国的核心粮食作物，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，目前我国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的55％左右。杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。我国杂交水稻制种效率不高，主要表现在劳动强度大，种子产量和质量不稳定等方面。因此实现杂交水稻制种全程机械化是进一步提升我国杂交水稻生产的必由之路。目前，已经尝试了下列方法：1)机械采粉-贮藏-授粉技术。利用机械采集父本花粉，直接或经贮藏然后对母本授粉。2)父本为雌性不育，实现父母本混播混收机械化。3)种子颜色标记法。通过选育使父母本种子颜色不同，混播群体收获后，通过色选机将母本的杂交种与父本的自交种子分离。4)利用除草剂清除混杂种子。这又包括两条途径，一是将抗除草剂基因通过转基因导入母本不育系，使其对除草剂产生抗性。将母本与父本混播以产生杂交种子，授粉后用母本可抗的除草剂进行田间喷施处理，将父本选择性杀死，收获的种子即是杂交后代。这一方法受转基因法规制约，故尚未实现商业化。另一途径是将除草剂敏感突变基因导入父本，使父本水稻对某种除草剂敏感。将母本与父本混播以产生杂交种子，授粉后用父本敏感的除草剂进行田间处理，将父本水稻选择性杀死。这一方法不受转基因法规制约，具有较好的应用前景。

野生型CYP81A6基因(GenBank:DQ 341412.1)全长3914bp，其结构包括1321bp的启动子序列，53bp的5’非翻译区(5’-UTR)，2268bp的编码区以及272bp的3’-UTR。编码区包含两个外显子(长度分别为924bp和618bp)和一个内含子(长度为726bp)，编码513个氨基酸，属于细胞色素P450基因家族。尽管目前发现的数十个细胞色素P450晶体结构显示不同种属间的序列差异较大，但其三维结构高度保守(王斌,李德远(2009)细胞色素P450的结构与催化机理.有机化学29:658-662)。细胞色素P450的主要结构功能域包括：底物结合结构域和亚铁血红素(HEM)结合及催化结构域。其中，由于细胞色素P450是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶，故亚铁血红素结合及催化结构域在行使其活性功能时，HEM的铁离子一侧与绝对保守的半胱氨酸的硫络合，形成硫醇盐离子键，成为铁的一个配体；另一侧可与水中的氧分子络合，形成亚铁P450-二氧复合物(P-Fe(II)-O2)。P-Fe(II)-O2经第二个单电子还原和质子化，形成Fe(III)-氢过氧化复合物(P-Fe(III)-O-OH)，进一步自催化形成高价铁氧中间体(P·Fe(IV)＝O)，该氧铁卟啉阳离子自由基，即能提供单电子，又含正电荷，提供活性氧原子，在水溶液中能够实现转移氧原子，插入到惰性的C-H键中，实现温和条件下烃的羟基化，此为单加氧方式；另外一种方式是高价铁氧中间体P·Fe(IV)＝O直接对底物氧化脱氢，而不是在C-H键上插入氧，该方式为氧化脱氢方式。无论那种方式均依赖亚铁血红素(HEM)结合及催化结构域对底物进行氧化，该结构域核心区域如图4中黑色方框所示(FGMGRRRCPG)(张集文，2010，水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。

苯达松为苯并噻二唑类除草剂，可杀死多数阔类叶杂草和莎草科杂草，而对包括水稻在内的禾本科和豆科植物十分安全。其作用机理是抑制植物光合作用的希尔反应。其选择性是因为不同种类植物分解苯达松的能力存在差异。正常水稻品种可将苯达松快速代谢为羟基化的无毒产物。经辐射诱变，在水稻品种农林8号(N8)和W6154S上获得了两个苯达松敏感的突变体，农林8号m(N8m)和8077S。农林8号m的致死浓度为5mg/L，8077S的致死浓度为313mg/L，前者比后者敏感60倍，而正常水稻品种用2500mg/L苯达松处理未表现明显伤害。遗传研究表明农林8号m突变位点和8077S突变位点为等位基因，其敏感致死表型由同一个bsl基因控制。野生型的bsl是一个P450基因(CYP81A6)，其编码区长度为2268bp，含有两个外显子和一个内含子，编码一个由513个氨基酸组成的酶。其在农林8号m中，在翻译起始密码ATG后第507位点，缺失了一个C，这一突变发生在第一外显子上，导致其编码的蛋白大部分氨基酸缺失，因而完全丧失生化功能。在8077S中，突变发生在翻译起始密码ATG后第2058位点，缺失了一个G，这一突变发生在第二个外显子靠近3’端。导致其编码的酶蛋白缺失了49个氨基酸，并使其第441～450位的关键结构域突变，故使其基本丧失了生化功能(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。但上述两个突变体都只有1bp的缺失，不能用实验室常用的琼脂糖电泳检测，难以用于分子标记辅助育种，需特殊的检测单碱基突变的技术方法。另外，两个突变体中，籼稻来源的8077S对苯达松敏感性不高。因此，在水稻杂交制种实际应用中，需要新的对苯达松高度敏感的，易于进行分子检测和开展分子标记辅助育种的籼稻突变体。

发明内容

本发明目的是提供对苯达松高度敏感的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用。

本发明首先对籼稻品种93-11种子(M0代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M1代植株；M1代植株自交产生种子(为M2代)，种植M2代植株，对M2代植株进行苯达松处理，筛选敏感植株；然后对敏感植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得对苯达松高度敏感纯合单株，并用于杂交育种和生物技术研究。

本发明提供的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1，其为水稻CYP81A6基因第一个外显子586位处中缺失7个碱基，所述缺失的7个碱基为AGGCGAC。

进一步地，水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了含有本发明所述水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的表达载体。

本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在制备转基因植物中的应用。

本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在制备对苯达松敏感的转基因植物中的应用。

优选地，所述转基因植物为转基因水稻。

本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在农作物改良育种、制种中的应用。

优选地，所述的农作物为水稻、玉米、小麦、棉花。

本发明提供了克隆水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的方法，以水稻基因组DNA为模板，分别以下述4对引物对进行PCR，将4个扩增产物依次拼接得到水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1，所述4对引物对的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.2-3和SEQ ID NO.4-5和SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9。

用SEQ ID NO.2-3所示的引物对能够扩增出1314bp的水稻CYP81A6基因扩增片段，用SEQ ID NO.4-5所示的引物能够扩增出1216bp(野生型水稻CYP81A6基因)或1209bp(CYP81A6-m1)的扩增片段，用SEQ ID NO.6-7所示的引物能够扩增出1377bp的水稻CYP81A6基因扩增片段，用SEQ ID NO.8-9所示的引物能够扩增出796bp的水稻CYP81A6基因扩增片段。

本发明还提供了检测水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的分子标记，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.10-11或SEQ ID NO.12-13或

SEQ ID NO.14-15或SEQ ID NO.16-17或

SEQ ID NO.18-19或SEQ ID NO.20-21或

SEQ ID NO.22-23。

本发明提供了上述分子标记在检测CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1中的应用。

本发明提供了上述分子标记在制备对苯达松敏感的转基因植物中的应用。

本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。

一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的分子标记的方法，通过下述之一的引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.10-11或SEQ ID NO.12-13或

SEQ ID NO.14-15或SEQ ID NO.16-17或

SEQ ID NO.18-19或SEQ ID NO.20-21或

SEQ ID NO.22-23；

当用SEQ ID NO.10-11所示的引物能够扩增出179bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.12-13所示的引物能够扩增出123bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.14-15所示的引物能够扩增出107bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.16-17所示的引物能够扩增出108bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.18-19所示的引物能够扩增出90bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.20-21所示的引物能够扩增出186bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.22-23所示的引物能够扩增出178bp的扩增片段，则标志着该待检植物存在水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1。

本发明的优点在于：(1)该突变体CYP81A6-m1来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利。(2)辐射诱变发生在一个细胞色素P450基因(CYP81A6)的第一个外显子中，使其完全丧失功能，发现对苯达松除草剂高度敏感。(3)因辐射诱变造成与野生型相比有7bp缺失，采用实验室常用的琼脂糖电泳就能开展分子检测，即能够实现鉴别，不需要特别的检测技术和方法。(4)本发明的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在水稻种质资源改良中筛选效果明显，经济价值巨大。

附图说明

图1为3622株系疑似突变体，A图为M2田间再生水稻喷施3g/L苯达松4天后发现疑似突变体；白色箭头标示枯黄位点；B图为3622-M3苗期喷施1g/L苯达松再次筛选、确定突变体，白色箭头指示野生型；黑色箭头指示突变体。

图2的A图为CYP81A6基因组分区段PCR扩增结果图，-：阴性对照；1-3：3种水稻品种即93-11，ZH11，3622m；图中F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4分别代表引物SEQ ID NO.2-3、SEQ ID NO.4-5、SEQ IDNO.6-7及SEQ ID NO.8-9；B图为突变体3622m与野生型(93-11)序列比对结果。

图3为3622m水稻基因结构及农林8m(n8m)和8077S突变位点示意图，Exon：外显子；Intron：内含子；UTR：非翻译区；△：缺失。

图4为野生型及各突变体细胞色素P450编码的氨基酸序列比对图。

图5的A图为2％琼脂糖电泳筛选适用于分子标记辅助选择育种的引物结果图；图5的B图为6％聚丙烯酰胺电泳(PAGE)筛选适用于分子标记辅助选择育种的引物结果图。BM1-7为设计不同分子标记的名称，分别对应SEQ ID NO.10-11、SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ IDNO.22-23；1-3：分别为H₂O，WT(野生型)，本发明突变得到的3622m水稻。

图6为分子标记BM3在3622株系M2代验证及M3代突变体筛选(聚丙烯酰胺电泳)图，其中A：3622m突变体的BM3分子标记在3622株系M2代验证；B：M3代突变体筛选；C：分子标记筛选获得突变体经苯达松喷施验证；其中W，WT：野生型；M：突变体；H：杂合株；1-10：野生型纯合单株；0d：1g/L苯达松溶液喷施当天；7d：1g/L苯达松溶液喷施后7天。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

表1本发明实施例采用的引物序列

实施例1 对苯达松敏感的水稻突变体的筛选

1、钴⁶⁰辐射诱变突变体库及M1、M2代种植与性状观察

2013年夏于长沙经钴⁶⁰辐射10公斤93-11种子，夏季种植于海南临高田间，此为M1代，分单株收获M1代种子，共收获约4557份种子。选取M1代种子3617个株系，每个株系种植50棵单株，2014年春季种植于海南临高田间，此为M2代。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体；每个株系收6个单株，作为突变体库资源保存。分株系每个单株收取1个穗子用于苯达松敏感突变体筛选。

2、苯达松敏感突变体筛选

收获M2种子后，将整体水稻突变体库割稻兜，留30-40cm稻桩，使其再生。再生约2-3周后，绝大多数抽出10-20cm新叶，按每亩66.7L喷施3g/L的苯达松溶液至再生叶片表面，喷施2天后开始观察，寻找叶片萎黄的单株。其中在株系3622中发现一株疑似苯达松敏感突变体，叶片萎黄，如图1的A图所示。将此单株枯黄叶片去除，清水洗净，分成5株移栽至盆中，未能存活。取株系3622的M2混收种子，分批播种，生长2-3周后，单株叶片局部喷施1g/L的苯达松溶液(常州精度生物科技有限公司)，2天后开始观察，寻找叶片喷施部位萎黄的单株，如图1的B图所示，叶片萎黄程度随时间延长而逐渐加重。筛选共获得7株由叶尖开始枯黄的敏感单株，如图1的B图黑色箭头所示。将疑似单株剪去喷施过苯达松的叶片，使其继续生长，存活5株，命名为3622m。

实施例2 水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的确定

确认苯达松敏感突变体后，取3622m叶片，提取DNA，设计覆盖基因全长的引物(SEQ ID NO.2-3、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7及SEQ ID NO.8-9)，进行PCR扩增并将产物测序。DNA提取按如下步骤进行：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的氯仿/异戊醇(24︰1)，上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心，10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95％乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心，15min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH₂O溶解DNA，电泳检测DNA质量。

获得DNA后，设计引物进行PCR反应，引物为(SEQ ID NO.2-3、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7及SEQ ID NO.8-9)。PCR反应程序和体系如下：

程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，进行42个循环，再延伸72℃延伸10min，16℃结束。

其中P1/P2代表引物对，即(SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.4-5或SEQ ID NO.6-7或SEQ ID NO.8-9)。

PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2的A图所示，选取PCR扩增条带清晰，符合大小预期的结果送样测序。测序结果显示3622m与野生型(93-11)相比，在586位(ATG为起始1)缺失了7bp的碱基，如图2的B图所示。表明3622m在此位置发生了基因突变，将水稻CYP81A6基因的该突变体命名为CYP81A6-m1。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长3907bp，启动子5’-UTR及3’-UTR与野生型相同，但其编码区全长2261bp，与野生型相比，CYP81A6-m1在第一个外显子586位处有一段7bp(AGGCGAC)的缺失，如图2的B图及图3所示，造成其后的编码框移码突变，仅编码251个氨基酸，其中仅有195个氨基酸与野生型形同，如图4所示。该突变造成其编码的细胞色素P450蛋白C端的核心结构域——血红素结合及催化结构域缺失，如图4中黑色方框所示，进而造成该蛋白丧失功能。本发明所获得的突变型CYP81A6基因CYP81A6-m1与现有报道的CYP81A6突变体均不相同，是一个新的等位基因突变位点，如图3和4所示。

实施例3 检测CYP81A6-m1分子标记的筛选

经过测序明确3622m的DNA突变位点后，围绕该位点设计共显性引物标记，用于分子标记辅助选择育种。PCR扩增条件同实施例2，扩增产物分别用琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺(PAGE)电泳检测。结果如图5和图6所示。2％琼脂糖电泳结果显示(图5的A)，引物对BM3、BM5、BM6扩增目的片段单一、条带清晰，可作为分子标记用于后续分子标记辅助选择育种区分野生型CYP81A6及突变型CYP81A6-m1；6％PAGE电泳结果显示(图5的B)，引物对BM1-BM7均可作为分子标记用于后续辅助选择育种区分野生型CYP81A6及突变型CYP81A6-m1。

同时标记BM3在PAGE电泳中结果显示，使用该标记可以明显区分野生型和突变体，如图6的A所示，该引物在野生型中扩增出114bp特征带，在突变体中扩增出107bp特征带。在此基础上，利用BM3标记进一步筛选3622m M3代混合株系184株，筛选到4株纯合突变体(107bp单条带，如图6的B图中方框M)及2株杂合突变体(114bp及107bp双条带，如图6的B图中方框H)，这种共显性的分子标记对于选育隐形核基因更为有效，可以防止在选育的早期漏选。进一步用1g/L苯达松溶液叶片部分喷施筛选获得的4株纯合突变体进行验证，4株纯合突变体均出现叶片枯黄现象，如图6的C图所示，表明该标记BM3可用于检测CYP81A6-m1基因，进而用于以3622m突变体为基础选育的苯达松敏感水稻材料的分子辅助选择育种。

实施例4 杂交转育：利用分子标记将突变体CYP81A6-m1转育到三系恢复系中

以实施例1获得的苯达松敏感突变体3622m(含CYP81A6-m1基因)与苯达松不敏感的优良籼稻恢复系R808进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记如BM3对所得后代进行辅助选择，最终获得带型与3622m带型一致的单株用于生产和育种实践。其具体实施步骤如下：

1、以R808为母本与3622m杂交获得F1。

2、以F1为母本与R808回交获得BC1F1。

3、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态(即具有114bp及107bp双条带)的BC1F1。具体操作如下：

(1)种植BC1F1，按实施例2所述方法提取苗期叶片基因组DNA。

(2)以实施例3中所述分子标记如BM3对本实施例步骤3(1)中获得的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增条件同实施例2。选择在CYP81A6位点为杂合状态的个体，即选择PCR产物同时显示114bp和107bp片段的个体。

4、以CYP81A6位点为杂合状态的BC1F1为母本与R808回交获得BC2F1。

5、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态的BC2F1。具体操作同本实施例步骤3。

6、以CYP81A6位点为杂合状态的BC2F1为母本与R808回交获得BC3F1。

7、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态的BC3F1。具体操作同本实施例步骤3。

8、将CYP81A6位点为杂合状态的BC3F1自交获得BC3F2。

9、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点与3622m带型一致的BC3F2。具体操作如下：

(1)种植BC3F2，提取苗期叶片基因组DNA。

(2)利用分子标记BM3对本实施例步骤9(1)中获得的基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件同实施例2。选择在CYP81A6位点与3622m带型一致的个体，即选择PCR产物只显示107bp片段的个体，也就是带有突变型CYP81A6的R808恢复系，即为苯达松敏感型恢复系。

实施例5 杂交转育：利用分子标记将突变体CYP81A6-m1转育到三系不育系中

利用分子标记辅助选择首先将实施例1中所述苯达松敏感突变体3622m中的突变体CYP81A6-m1基因转育到保持系永6B中，然后通过永6B将突变型CYP81A6-m1转育到三系不育系永6A中，从而最终获得在CYP81A6位点带型与3622m带型一致的永6A和永6B用于生产和育种实践。其具体实施步骤如下：

1、以永6B为母本与3622m杂交获得F1。

2、以F1为母本与永6B回交获得BC1F1。

3、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态的BC1F1。具体操作如下：

(1)种植BC1F1，提取苗期叶片基因组DNA。

(2)以实施例3中所述分子标记BM3对本实施例步骤3(1)中获得的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增条件如实施例2。选择在CYP81A6位点为杂合状态的个体，即选择PCR产物同时显示114bp和107bp片段的个体。

4、在抽穗期从CYP81A6位点为杂合状态的BC1F1中选择表型与永6B相似的单株为母本与永6B回交获得BC2F1。

5、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态的BC2F1。具体操作同本实施例步骤3。

6、在抽穗期从CYP81A6位点为杂合状态的BC2F1中选择表型与永6B相似的单株为母本与永6B回交获得BC3F1。

7、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点为杂合状态的BC3F1。具体操作同本实施例步骤3。

8、在抽穗期从CYP81A6位点为杂合状态的BC3F1中选择表型与永6B相似度高的单株，自交结实成熟后，分单株收获BC3F2。

9、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点与3622m带型一致的BC3F2。具体操作如下：

(1)种植BC3F2，提取苗期叶片基因组DNA。

(2)利用分子标记如BM3对本实施例步骤9(1)中获得的基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件同实施例2。选择在CYP81A6位点与3622m带型一致的个体，即选择PCR产物只显示107bp片段的个体。

10、在抽穗期对从步骤9中获得的BC3F2进行目测表型筛选，选择与永6B表型相似的单株分别与永6A成对杂交收获F1，并分别收BC3F3。

11、播种步骤10获得的F1和BC3F3，选择花粉100％败育的F1单株为母本与相应父本来源的BC3F3回交，获得以相应父本为轮回亲本的BC1F1。

12、此后父本连续自交至BC3F6，并在每代与相应母本成对回交至BC3F1。

13、利用分子标记如BM3选择CYP81A6位点与3622m带型一致的父本BC3F6和母本BC3F1。具体操作如下：

(1)种植父本BC3F6和母本BC3F1，提取苗期叶片基因组DNA。

(2)利用分子标记如BM3对本实施例步骤13(1)中获得的基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件同实施例2。选择在CYP81A6位点与3622m带型一致的个体，即选择PCR产物只显示107bp片段的个体。

14、在抽穗期和成熟期对步骤13获得的具有突变型CYP81A6的父本BC3F6和母本BC3F1进行表型观察，分别选择具有优良农艺性状的单株收种。

15、将步骤14所获得的单株种子种成株系，其中编号为“永父18”和“永母18”的不育系和保持系整齐度高，异交习性好，繁种产量高，被命名为“新永6B”和“新永6A”。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1，其为水稻CYP81A6基因第一个外显子586位处中缺失7个碱基，所述缺失的7个碱基为AGGCGAC。

2.如权利要求1所述水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.含有权利要求1或2所述水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1或2所述的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1或2所述的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1在农作物改良育种、制种中的应用。

7.检测权利要求1或2所述的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.10-11或SEQ ID NO.12-13或

SEQ ID NO.14-15或SEQ ID NO.16-17或

SEQ ID NO.18-19或SEQ ID NO.20-21或

SEQ ID NO.22-23。

8.权利要求7所述的分子标记在检测CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1中的应用。

9.权利要求7所述的分子标记在制备对苯达松敏感的转基因植物中的应用。

10.权利要求1或2所述的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1的分子标记的方法，其特征在于，通过下述之一的引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.10-11或SEQ ID NO.12-13或SEQ ID NO.14-15或SEQID NO.16-17或SEQ ID NO.18-19或SEQ ID NO.20-21或SEQ IDNO.22-23；

当用SEQ ID NO.10-11所示的引物对能够扩增出179bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.12-13所示的引物对能够扩增出123bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.14-15所示的引物对能够扩增出107bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.16-17所示的引物对能够扩增出108bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.18-19所示的引物对能够扩增出90bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.20-21所示的引物对能够扩增出186bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO.22-23所示的引物对能够扩增出178bp的扩增片段，则标志着该待检植物存在水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1。