ES2933673T3

ES2933673T3 - Variantes de HPPD y métodos de uso

Info

Publication number: ES2933673T3
Application number: ES16763769T
Authority: ES
Inventors: Marc Linka; Fabien Poree; Bernd Laber; Gudrun Lange; Jan Tebbe; Wayne Coco; Michael Strerath; Ernst Weber; Nikolaus Pawlowski; Sandra Geske; Heike Balven-Ross; Nina Wobst; Christina Thies; Manuel Dubald
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2023-02-13
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: BR112018004779A2; EA201890696A1; ZA201802329B; WO2017042259A1; AU2016319093A1; UA126550C2; EP3347475A1; HK1258349A1; EP3347475B1; KR20180043838A; US20180208937A1; UY36898A; CA2998036A1; CN108884470A; AU2016319093B2; AR105984A1; US10597674B2; JP2018534911A; CN108884470B; BR112018004779A8

Abstract

En la presente invención, se describen los polipéptidos de HPPD y las plantas que los contienen que muestran una tolerancia total frente a uno o más herbicidas inhibidores de HPPD pertenecientes a varias clases químicas. Se ha diseñado un conjunto de polipéptidos de HPPD mutantes que no tienen afinidad o solo la tienen significativamente reducida por los herbicidas inhibidores de HPPD y, al mismo tiempo, la tasa de disociación de los inhibidores de HPPD del polipéptido de HPPD mutante aumenta hasta tal punto que los inhibidores de HPPD ya no actúan como inhibidores de unión lenta o de unión estrecha y lenta, sino que, en lugar de esto, se han convertido en inhibidores completamente reversibles. En particular, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de HPPD mutantes que confieren tolerancia a los herbicidas inhibidores de HPPD que pertenecen a varias clases químicas. Además, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de HPPD y métodos de uso

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la biología molecular de las plantas, particularmente a los nuevos polipéptidos de HPPD que confieren mejor tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD.

Antecedentes de la invención

Las 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasas (HPPD) son enzimas que catalizan la reacción en la que el parahidroxifenilpiruvato (abreviado en la presente descripción como HPP), un producto de la degradación de la tirosina, se transforma en homogentisato (abreviado en la presente descripción como HGA), el precursor en plantas del tocoferol y la plastoquinona (Crouch NP y otros (1997), Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze y otros (2004), Plant Physiology 134:1388-1400). El tocoferol actúa como un antioxidante asociado a la membrana. La plastoquinona, en primer lugar, actúa como transportador de electrones entre el PSII y el complejo citocromo b6/f y, en segundo lugar, es un cofactor redox para la fitoeno desaturasa, implicada en la biosíntesis de carotenoides.

Hasta ahora, se han anotado más de 1000 secuencias de ácido nucleico de diversos organismos presentes en la base de datos del NCBI, como codificantes de una supuesta proteína que tiene un dominio HPPD. Pero para la mayoría de ellas, no se ha probado que la proteína tenga una actividad enzimática HPPD, ni en un ensayo in vitro, ni en un enfoque en plantas, ni que tal proteína HPPD pueda conferir tolerancia herbicida a los herbicidas inhibidores de la HPPD cuando se expresa en una planta. Dentro de las técnicas modernas se han descrito varias proteínas HPPD y sus secuencias primarias, en particular las proteínas HPPD de bacterias tales como Pseudomonas (Rüetschi y otros, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, documento WO96/38567), Kordia (documento WO2011/076889) Synechococcus (documento WO2011/076877), Acidobacterium y Mucilaginibacter (documento WO2015/022634), Rhodococcus (documento WO2011/076892), de protistas tales como Blepharisma (documento WO2011/076882), de euriarqueotas tales como Picrophilus (documento WO2011/076885), de algas tales como Chlamydomonas reinhardtii (documento ES2275365; WO2011145015), Scenedesmus (documento WO2015/022634), de plantas tales como Arabidopsis (documento WO96/38567, G^eNBANK® AF047834), zanahoria (documento WO 96/38567, GENBANK® 87257), Avena sativa (documento WO2002/046387, WO2011/068567), trigo (documento WO2002/046387), Brachiaria platyphylla (documento WO2002/046387), Cenchrus echinatus (documento WO2002/046387), Lolium rigidum (documento WO2002/046387), Festuca arundinacea (documento WO2002/046387), Setaria faberi (documento WO 2002/046387), Eleusine indica (documento WO2002/046387), Sorgo (documento WO2002046387, WO2012021785), maíz (documento WO2012/021785), Coptis japonica (documento WO2006/132270), Lemna (documento WO2015/022634), o de mamíferos tales como el ratón o el cerdo, o de hongos tales como los Coccidioides (GENBANK® COITRP).

La inhibición de la HPPD conduce al desacoplamiento de la fotosíntesis, la deficiencia de pigmentos captadores de luz accesorios y, lo que es más importante, la destrucción de la clorofila por la radiación ^uV y las especies reactivas del oxígeno (blanqueamiento) debido a la falta de protección frente a luz que normalmente proporcionan los carotenoides (Norris y otros (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). El blanqueamiento de los tejidos fotosintéticamente activos conduce a la inhibición del crecimiento y la muerte de la planta.

Algunas moléculas que inhiben la HPPD (en lo sucesivo denominadas herbicidas inhibidores de la HPPD), y que inhiben la transformación del HPP en HGA mientras se unen específicamente a la enzima, han probado ser herbicidas muy efectivos.

En la actualidad, la mayoría de los herbicidas inhibidores de la HPPD disponibles comercialmente pertenecen a una de estas familias químicas, que se enumeran a continuación:

1) las tricetonas, por ejemplo, benzobiciclon [es decir, 3-[2-cloro-4-(metilsulfonil)benzoil]-4-(fenilsulfanil)biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; sulcotriona [es decir, 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], mesotriona [es decir, 2-[4-(metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclohexanodiona] (abreviado en la presente descripción como MST); tembotriona [es decir, 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)-3-[(2,2,2,-trifluoroetoxi)metil]benzoil]-1,3-ciclohexanodiona]; tefuriltriona [es decir, 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)-3-[[(tetrahidro-2-furanil)metoxi]metil]benzoil]-1,3-ciclohexanodiona]]; biciclopirona [es decir, 4-hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; fenquinotriona [es decir, 2-[[8-cloro-3,4-dihidro-4-(4-metoxifenil)-3-oxo-2-quinoxalinil]carbonil]-1,3-ciclohexanodiona], y como se describe en los documentos WO2007088876, WO2009016841, WO2010089993, WO2010116122, WO2012002096, WO201131658,

WO2012136703, JP2013040141, WO2013080484, WO2014014904, WO2014031971, US20140106968;

2) los dicetonitrilos, por ejemplo, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona y 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]- 3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-diona;

3) los isoxazoles, por ejemplo, isoxaflutol [es decir, (5-ciclopropil-4-isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]metanona]. En las plantas, el isoxaflutol (abreviado en la presente descripción como IFT) se metaboliza rápidamente a ^dKⁿ, un compuesto de dicetonitrilo que exhibe la propiedad inhibidora de la HPPD; 4) los hidroxipirazoles, por ejemplo, pirazoxifeno [es decir, 2-[[4-(2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il]oxi]-1-feniletanona]; benzofenap [es decir, 2-[[4-(2,4-dicloro-3-metilbenzoil)-1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il]oxi]-1-(4-metilfenil)etanona]; pirazolinato [es decir, (2,4-diclorofenil)[1,3-dimetil-5-[[(4-metilfenil)sulfonil]oxi]-1H-pirazol-4il]metanona]; pirasulfotol [es decir, (5-hidroxi-1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)[2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]metanona]; topramezona [es decir [3-(4,5-dihidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5-hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)metanona]; tolpiralato [es decir, 1-[[1-etil-4-[3-(2-metoxietoxi)-2-metil-4-(metilsulfonil)benzoil]-1H-pirazol-5-il]oxi]etilmetilcarbonato];

5) N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas como se describe en los documentos WO2011035874, y WO2012123416, WO2012123409, EP2562174, WO2013064459, WO2013087577, WO2013124238, WO2013124228, WO2013164333, WO2013037342, WO2014053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633 y como se describe en WO2013072300, WO2013072402, WO2013072450, WO2014184014, WO2014184019, WO2014184058, WO2014192936, WO2015052152, WO2015052178 y las N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas como se describe en los documentos WO2012126932, y EP2562174, WO2013064459, WO2013087577, WO2013124238,WO2013124228, WO2013124245, WO2013164333, WO2013037342, WO20141053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633; por ejemplo, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"); 2-cloro-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida; 2-cloro-3-(etilsulfonil)-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-4-(trifluorometil)benzamida;

6) N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas como se describe en los documentos WO2012028579 y WO2012123409, WO2013017559, EP2562174, WO2013064459, WO2013064457, WO2013087577, WO2013104705, WO2013124238, WO2013124228, WO2013124245, WO2013164331, WO2013164333, WO2013174843, WO2013037342, WO2014053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633; por ejemplo, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida; 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida; 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, y como se describe en los documentos WO2013072528, WO2013076315, WO2013076316, WO2013083859, WO2013092834, WO2013139760, WO2013144231, WO2014126070, WO2014135654, WO2014184015, WO2014184016, WO2014184017,

WO2014184073, WO2014184074, WO2014192936, WO2015022284, WO2015052153, WO2015052173;

7) derivados de piridazinona como se describe en los documentos WO2013050421 y WO2013083774, WO2014154828, WO2014154882;

8) derivados de la oxoprazina como se describe en el documento WO2013054495;

9) N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas como se describe en los documentos WO2013144234, WO2015007564;

10) triazinonas como se describe en el documento WO2014154829; y

11) pirazolonas como se describe en los documentos EP2881387 y EP2881388.

Estos herbicidas inhibidores de la HPPD pueden usarse contra malas hierbas gramíneas y/o de hoja ancha en el campo de plantas de cultivo que muestren tolerancia metabólica, tales como el maíz (Zea mays), el arroz (Oryza sativa) y el trigo (Triticum aestivum) en los que se degradan rápidamente. (Schulz y otros (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell y otros (2001), Pest Management Science, volumen 57, 120-128; Garcia y otros (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett y otros (2001), Pest Management Science, volumen 57, 133-142). Para extender el alcance del uso de estos herbicidas inhibidores de la HPPD, se han desarrollado varios esfuerzos para conferir a las plantas, particularmente plantas sin, o con una tolerancia metabólica de bajo rendimiento, un nivel de tolerancia aceptable en condiciones agronómicas de campo.

Además del intento de eludir la producción de homogentisato mediada por HPPD (documento US 6,812,010), se ha realizado la sobreexpresión de la enzima sensible para producir cantidades de la enzima diana en la planta que son suficientes en relación con el herbicida (documento WO96/38567). La sobreexpresión de polipéptidos de HPPD resultó en una mejor tolerancia preemergente al derivado de dicetonitrilo (abreviado en la presente descripción como DKN) de IFT, pero el nivel de tolerancia no fue suficiente para la tolerancia al tratamiento postemergente (Matringe y otros (2005), Pest Management Science 61: 269-276).

Una tercera estrategia fue mutar el polipéptido de HPPD para obtener una enzima diana que, mientras conserva sus propiedades de catalizar la transformación de HPP en HGA, es menos sensible a los inhibidores de HPPD que el polipéptido de HPPD nativa, antes de la mutación.

Esta estrategia se ha aplicado con éxito para la producción de plantas tolerantes a 2-ciano-3-ciclopropil1-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona y a 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-diona (documento EP496630), dos herbicidas inhibidores de la HPPD pertenecientes a la familia de los dicetonitrilos (documento WO99/24585). La Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile, y más particularmente Gly336Trp (las posiciones del aminoácido mutado se indican con referencia al polipéptido de HPPD de Pseudomonas fluorescens de tipo salvaje que corresponde a la SEQ ID NO: 1 de la presente invención) se identificaron como mutaciones que son responsables de un aumento de la tolerancia al tratamiento con estos herbicidas de dicetonitrilo.

Muy recientemente, la introducción de un gen HPPD de Pseudomonas fluorescens en el genoma del plasto del tabaco y la soja ha demostrado ser más efectivo que la transformación nuclear, lo que confiere tolerancia a la aplicación postemergente de IFT. Dufourmantel y otros (2007), Plant Biotechnol J.5(1): 118-33).

En el documento WO2004/024928, los inventores buscaron aumentar la biosíntesis de prenilquinona (por ejemplo, síntesis de plastoquinonas, tocoferoles) en las células de las plantas mediante un aumento del flujo del precursor HPP en las células de estas plantas. Esto se ha hecho al conectar la síntesis de dicho precursor a la ruta del “shikimato” mediante la sobreexpresión de una enzima prefenato deshidrogenasa (PDH). También han señalado que la transformación de plantas con un gen que codifica una enzima PDH y un gen que codifica una enzima HPPD posibilita aumentar la tolerancia de dichas plantas a herbicidas inhibidores de la HPPD.

En el documento WO2009/144079, se describieron secuencias de ácido nucleico que codifican una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) con mutaciones específicas en la posición 336 de la proteína HPPD de Pseudomonas fluorescens y su uso para obtener plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD.

En el documento WO2002/046387, se han identificado varios dominios de polipéptidos de HPPD que se originan en plantas, que pueden ser relevantes para conferir tolerancia a diversos herbicidas inhibidores de la HPPD, pero los datos bioquímicos o en plantas no han confirmado el impacto de las funciones de dominio descritas.

En el documento WO2008/150473, se ejemplificó la combinación de dos mecanismos de tolerancia distintos, un gen de Avena sativa modificado que codifica una enzima HPPD mutante y una monooxigenasa de maíz CYP450 (gen nsf1), para obtener una mejor tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD, pero no se han descrito los datos que demuestran los efectos sinérgicos basados en la combinación de ambas proteínas.

Además, un método para generar plantas tolerantes a los herbicidas inhibidores de la HPPD mediante la sobreexpresión no solo de un gen que codifica una HPPD de tolerancia, como por ejemplo de Avena sativa (documento US2011/0173718) o Arabidopsis (documentos WO2013/064964, WO2014/177999), sino también en combinación con varios genes de plantas que codifican una proteína HST (homogentisato solanesiltransferasa). Sin embargo, el nivel de tolerancia a algunos herbicidas inhibidores de la HPPD seleccionados fue bastante limitado.

En los documentos WO2011/094199 y US2011/0185444, se evaluó la tolerancia de varios cientos de líneas de soja de tipo salvaje al inhibidor de la HPPD IFT. Muy pocas líneas mostraron un nivel razonable de tolerancia a los herbicidas. Se identificó el supuesto QTL (loci de rasgos cuantitativos) responsable de la tolerancia. En esta región del genoma, se identificó un gen que codifica para un transportador ABC como el principal rasgo responsable de la mejor tolerancia al herbicida inhibidor de la HPPD que se observó. Sin embargo, las plantas transgénicas que expresan los genes identificados no mostraron ninguna mejora en la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD probados.

En los documentos WO2010/085705y US2014/0053295, se describieron varios mutantes del polipéptido de HPPD de Avena sativa. En el documento WO2010/085705 se demostró que algunas de las variantes mostraban una mejor tolerancia in vitro a la tricetona "mesotriona" (abreviada en la presente descripción como MST), sin embargo, solo se expresaron muy pocos mutantes en las plantas de tabaco. Adicionalmente, ninguna de las plantas de tabaco que expresan estos mutantes mostró una mejor tolerancia a la MST o el IFT en comparación con las plantas de tabaco que expresan el gen de la HPPD de Avena sativa de tipo salvaje. En el documento US2014/0053295, unos pocos mutantes de la HPPD de Avena sativa se expresaron en plantas de soja y tenían un buen nivel de tolerancia a la MST como se conoce de las plantas que expresan el gen de la HPPD de Avena sativa de tipo salvaje. Sin embargo, otros herbicidas tales como la tembotriona o el IFT indujeron un daño foliar mucho mayor en estas plantas de soja.

El documento US 2012/0042413 describe polipéptidos de HPPD de maíz mutantes que tienen actividad HPPD pero que también muestran una determinada insensibilidad a al menos un herbicida inhibidor de la HPPD y sugiere además un determinado conjunto de mutaciones en diferentes posiciones de los polipéptidos de HPPD y, finalmente, describe los datos bioquímicos así como también los niveles de tolerancia de plantas que contienen algunos de tales polipéptidos de HPPD mutados. En el documento EP 2453012, se han descrito varios mutantes de polipéptidos de HPPD; sin embargo, no se demostró en plantas una mejor tolerancia de los mutantes descritos frente a varios herbicidas inhibidores de la HPPD.

En el documento WO2014/043435, se describieron moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican polipéptidos de HPPD de Pseudomonas spp. que consisten en una secuencia de aminoácidos que comprende una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1; o una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1 y un triptófano en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1; o una serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, una serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, una treonina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 339 de la SEQ ID NO: 1, y una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1; o un triptófano en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 188 de la SEQ ID NO:1 y un triptófano en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO:1; o una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, una serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1; o una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, un triptófano en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, una alanina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 339 de la SEQ ID NO: 1 y una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1.

Los herbicidas inhibidores de la HPPD descritos actualmente y comercializados parcialmente actúan como inhibidores de unión lenta o de unión fuerte y lenta (véase [Morrison (1982) Trends Biochem. Sci. 7, 102-105). Estos inhibidores se unen lentamente (es decir, tienen tasas de asociación lentas, kon), pero no de forma covalente, al polipéptido de HPPD (es decir, producen una inhibición dependiente del tiempo) y se liberan muy lentamente (es decir, tienen tasas de disociación excepcionalmente lentas, koff) debido a su interacción extremadamente fuerte con la enzima.

Estos inhibidores se unen con tanta fuerza que son posibles valoraciones estequiométricas con la enzima.

Cada vez se reconoce más que los inhibidores de unión lenta o de unión fuerte y lenta no solo son inhibidores de la HPPD extraordinariamente potentes, sino que, además, tienen características que los convierten en agroquímicos atractivos para el control de malas hierbas. La lenta tasa de disociación mejora la efectividad del inhibidor hasta tal punto que, idealmente, solo una molécula inhibidora por sitio activo del polipéptido de HPPD es suficiente para inhibir completamente la actividad y mantener este nivel de inhibición durante un período de tiempo prolongado, incluso en ausencia de moléculas inhibidoras libres en la célula vegetal. Esto se traduce en bajas tasas de aplicación de estos inhibidores para controlar las malas hierbas no deseadas en las áreas de crecimiento de cultivos.

Las propiedades de los inhibidores de unión lenta o de unión fuerte y lenta son ventajosas cuando el objetivo es lograr la inhibición de la HPPD y la actividad herbicida. Sin embargo, estas propiedades son una desventaja importante cuando se van a inventar polipéptidos de HPPD tolerantes a estos inhibidores. Las mutaciones en el polipéptido de HPPD que solo reducen la afinidad del inhibidor por la enzima (ki) no superan por completo la inhibición de la HPPD ya que la unión del inhibidor y la inhibición del polipéptido de HPPD aún pueden tener lugar y, por lo tanto, el nivel de inhibición logrado se mantendrá durante un largo período de tiempo incluso en ausencia de inhibidor libre en la célula vegetal. Además, los herbicidas inhibidores de la HPPD disponibles comercialmente en parte, pertenecen a clases químicas estructuralmente diversas, como las tricetonas, los dicetonitrilos, los isoxazoles, los hidroxipirazoles, las N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, las N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas, N-(tetrazol-5-il)-o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N -(triazol-2-il), las triazinonas y las pirazolonas. Los polipéptidos de HPPD de las técnicas modernas actualmente descritos demuestran un intervalo de tolerancia bastante estrecho a los herbicidas inhibidores de la HPPD estructuralmente diversos.

Debido a las propiedades cinéticas descritas anteriormente de todos los herbicidas inhibidores de la HPPD actualmente descritos y comercializados parcialmente, hasta ahora, no se han publicado plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD con una tolerancia completa a los herbicidas inhibidores de la HPPD, a pesar de que se han hecho muchos esfuerzos para generarlas.

Resumen de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. En la presente invención, se describen polipéptidos de HPPD y las plantas que los contienen, que muestran una tolerancia completa frente a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD pertenecientes a diversas clases químicas. Resultó que para generar tales polipéptidos de HPPD con una tolerancia amplia y máxima frente a varias clases de herbicidas inhibidores de la HPPD, es importante reducir la afinidad por el polipéptido de HPPD (ki) en relación con los respectivos herbicidas inhibidores de la HPPD y, simultáneamente, garantizar una mejor tasa de disociación (koff) de un inhibidor de unión lenta o de unión fuerte y lenta, como se conoce de los polipéptidos de HPPD del tipo salvaje y de varios mutantes, para lograr un alto nivel de tolerancia al inhibidor.

En la presente invención, este objetivo se logró mediante el desarrollo de un conjunto de polipéptidos de HPPD, que tienen una afinidad significativamente reducida o nula por los herbicidas inhibidores de la HPPD y, al mismo tiempo, la tasa de disociación de los herbicidas inhibidores de la HPPD y la enzima aumenta hasta tal punto que los herbicidas inhibidores de la HPPD ya no actúan como inhibidores de unión lenta o de unión fuerte y lenta, sino que, en lugar de esto, se han convertido en inhibidores completamente reversibles.

En la presente invención, se proporcionan las composiciones y los métodos para obtener un nuevo conjunto de polipéptidos de HPPD que tienen las características mencionadas anteriormente (es decir, solo una afinidad significativamente reducida o nula por los herbicidas inhibidores de la HPPD, tasa de disociación aumentada de los herbicidas inhibidores de la HPPD y la enzima; los herbicidas inhibidores de la HPPD ya no actúan como inhibidores de unión lenta o de unión fuerte y lenta, sino que se han convertido en inhibidores completamente reversibles). Las composiciones incluyen polipéptidos de HPPD y moléculas de ácido nucleico quiméricas, recombinantes o aisladas que codifican tales polipéptidos de HPPD, vectores y células huésped que comprenden esas moléculas de ácido nucleico. Se describen anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, que incluyen microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo que incluyen, pero no se limitan a, un microorganismo o una planta.

Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de HPPD tolerante a herbicidas, que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de HPPD que tiene (a) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, (b) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y (c) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, uno o más sustituciones de aminoácidos adicionales en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 de la SEQ ID NO: 1, que incluyen los polipéptidos de HPPD establecidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-108 así como también fragmentos de los mismos.

Las composiciones también comprenden plantas transformadas, células vegetales, tejidos y semillas que son tolerantes a los herbicidas inhibidores de la HPPD mediante la introducción de la secuencia de ácido nucleico recombinante de la invención en el genoma de las plantas, células vegetales, tejidos y semillas. La introducción de la secuencia permite que los herbicidas inhibidores de la HPPD se apliquen a las plantas para matar selectivamente las malas hierbas u otras plantas no transformadas sensibles al inhibidor de la HPPD, pero no el organismo transformado. Las secuencias pueden usarse adicionalmente como marcador para la selección de células vegetales que crecen en presencia de uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.

Adicionalmente, se proporcionan métodos para identificar polipéptidos de HPPD con actividad de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con mayor tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD. Estos organismos y las composiciones que comprenden los organismos son convenientes para fines agrícolas. Las plantas o semillas que comprenden la secuencia de ácido nucleico recombinante de la invención que codifica un polipéptido de HPPD pueden cultivarse en un campo y cosecharse para obtener un producto vegetal. Las composiciones de la invención también son útiles para detectar la presencia de polipéptidos o ácidos nucleicos tolerantes a los herbicidas inhibidores de la HPPD en productos u organismos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un esquema simplista del ensayo acoplado a la actividad HPPD usado en esta invención para determinar la actividad enzimática de los polipéptidos de HPPD ilustrativos.

La Figura 2 muestra los cambios cinéticos ilustrativos en la absorbancia a 320 nm (Abs320) en muestras de extractos sin procesar de polipéptidos de HPPD de tipo salvaje e inactivados, observados con HPP 200 pM y 0, 4 o 13 pM de Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida), de acuerdo con el Ejemplo 3 en el ensayo acoplado a la actividad HPPD. El polipéptido de HPPD inactivado se obtuvo mediante el intercambio de una histidina por una alanina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 162 de la SEQ ID NO: 1. Esta posición se conoce bien por su importancia debido a su implicación en la unión coordinada del átomo de hierro en el sitio activo del polipéptido de HPPD (Serre y otros (1999), Structure, 7, 977-988).

La Figura 3 muestra los cambios cinéticos ilustrativos en la absorbancia a 320 nm (Abs320) de un polipéptido de HPPD mutante purificado correspondiente a la SEQ ID NO: 17 de acuerdo con el Ejemplo 3, observados a una concentración de sustrato alta y con 0, 48, 240 o 1200 pM de Cmpt. 2 (2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida) en el ensayo acoplado a la actividad HPPD. La constante cinética aparente (kapp) se determinó como el cambio de la señal en el tiempo (delta_Abs320/min) en el período de tiempo encuadrado.

La Figura 4 representa los datos de una determinación de ki ilustrativa con un polipéptido de HPPD mutante purificado correspondiente a la SEQ ID NO: 17 con diferentes concentraciones de inhibidor y sustrato (HPP), mediante el ajuste de acuerdo con el modelo de inhibición competitiva:

a) . Cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en el tiempo (delta _Abs320/min) en presencia de 0 - 0,0012 M de Cmpt. 2 a la concentración de sustrato dada, de acuerdo con el ejemplo 3;

b) . Cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en el tiempo (delta _Abs320/min) en presencia de 0 - 0,0012 M de Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) a la concentración de sustrato dada, de acuerdo con el Ejemplo 3;

c) . Cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en el tiempo (delta _Abs320/min) en presencia de 0 - 0,0012 M de MST a la concentración de sustrato dada, de acuerdo con el Ejemplo 3;

d) . Cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en el tiempo (delta _Abs320/min) en presencia de 0 - 0,0012 M de DKN a la concentración de sustrato dada, de acuerdo con el Ejemplo 3.

Todos los polipéptidos de HPPD ilustrativos, que se resumen en las Tablas 2, 3, 4 y 5, se midieron y analizaron como se muestra, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 17 en las Figuras 3 y 4.

Descripción detallada de la invención

Las presentes invenciones se describirán ahora con más detalle en lo sucesivo con referencia a las figuras acompañantes, en los que se muestran algunas, pero no todas, las modalidades de las invenciones.

Información general

Se han desarrollado varios esfuerzos para conferir a las plantas un nivel agronómicamente aceptable de tolerancia a una amplia gama de herbicidas inhibidores de la HPPD, que incluyen eludir la producción de homogentisato mediada por HPPD (documento US 6,812,010), sobreexpresar la enzima sensible para producir cantidades de la enzima diana en la planta, que sean suficientes en relación con el herbicida (documento WO96/38567), y mutar la HPPD para obtener una enzima diana que, mientras conserva sus propiedades de catalizar la transformación del HPP en homogentisato, es menos sensible a los inhibidores de la HPPd que la HPPD nativa antes de la mutación. A pesar de estos éxitos obtenidos para el desarrollo de plantas que muestran tolerancia a varios herbicidas inhibidores de la HPPD descritos anteriormente, todavía es necesario desarrollar y/o mejorar la tolerancia de las plantas a herbicidas inhibidores de la HPPD más nuevos o a varios herbicidas inhibidores de la HPPD diferentes pertenecientes a diversas clases químicas, particularmente los herbicidas inhibidores de la HPPD pertenecientes a las clases de tricetonas (por ejemplo, benzobiciclon, sulcotriona mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (por ejemplo, isoxaflutol), hidroxipirazoles (por ejemplo, pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (por ejemplo, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4- oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (por ejemplo, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida), 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida); 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, tricetonas, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas.

Por tanto, la presente invención proporciona mejores composiciones y métodos para regular la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD. Los herbicidas inhibidores de la HPPD como los de la clase de las tricetonas (por ejemplo, benzobiciclon, sulcotriona mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (por ejemplo, isoxaflutol), hidroxipirazoles (por ejemplo, pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (por ejemplo, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(tiifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (por ejemplo, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil) -N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1 "); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas tienen una excelente actividad herbicida frente a un amplio espectro de malezas anuales monocotiledóneas y dicotiledóneas económicamente importantes. Las sustancias activas también actúan eficientemente sobre malezas perennes, que producen brotes a partir de rizomas, troncos de madera u otros órganos perennes y que son difíciles de controlar. En el sentido de la presente invención, se entiende por "herbicida" una sustancia con actividad herbicida por sí sola o combinada con un aditivo que altera su eficacia, tal como, por ejemplo, un agente que aumenta su actividad (un agente sinérgico) o que limita su actividad (un compuesto protector). El herbicida puede comprender además adyuvantes o portadores sólidos o líquidos que se emplean normalmente en la tecnología de formulación (por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, emulsionantes, agentes promotores del crecimiento y similares), así como también uno o más herbicidas adicionales y/o uno o más pesticidas (por ejemplo, insecticidas, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas y similares).

Los métodos implican la transformación de organismos con secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención o, de cualquier otra manera, la introducción de tales genes de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD en organismos que no los contienen (por ejemplo, mediante apareamiento, fusión celular, o mediante el cruzamiento de organismos que contienen un gen de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD de la invención introducido, con organismos que no lo contienen y la obtención de la descendencia que contiene tal gen). Las secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención son útiles para preparar plantas que muestran una tolerancia aumentada a los herbicidas inhibidores de la HPPD, particularmente una tolerancia aumentada a los herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona o fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona o tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt.

2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metiMH-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas.

La expresión del gen de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD de la invención también puede resultar en tolerancia hacia los "herbicidas derivados de cumarona" (descritos en los documentos WO2009/090401, WO2009/090402, WO2008/071918, WO2008/009908). A este respecto, cualquiera de los genes de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD de la invención también puede expresarse en una planta que también exprese un gen quimérico de la homogentisato solanesiltransferasa (HST) o un gen de la HST mutado como se describe en los documentos WO2011/145015, WO2013/064987, WO2013/064964 o WO2010/029311, para obtener plantas tolerantes a los herbicidas inhibidores de la HST. Como se usa en la presente descripción, un "herbicida derivado de cumarona" o "herbicida inhibidor de la HST" abarca compuestos que se incluyen dentro de la nomenclatura IUPAC del 5H-tiopirano[4,3-b]piridin-8-ol, 5H-tiopirano[3,4-b]pirazin-8-ol, oxatiíno[5,6-b]piridin-4-ol y oxatiíno[5,6-b]pirazin-4-ol.

Por tanto, por gen de "tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD" de la invención se entiende un gen que codifica un polipéptido que confiere a una célula u organismo la capacidad de tolerar una concentración más alta de un herbicida inhibidor de la HPPD que tal célula u organismo que no expresa la proteína, o para tolerar una determinada concentración de un herbicida inhibidor de la HPPD durante más tiempo que tal célula u organismo que no expresa la proteína, o que confiere a una célula u organismo la capacidad de realizar la fotosíntesis, crecer y/o reproducirse con menos daño o inhibición del crecimiento observado que tal célula u organismo que no expresa tal proteína.

Un "polipéptido de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD" comprende un polipéptido que confiere a una célula u organismo la capacidad de tolerar una concentración más alta de herbicidas inhibidores de la HPPD que tal célula u organismo que no expresa la proteína, o de tolerar una determinada concentración de herbicidas inhibidores de la HPPD por un período de tiempo más largo que tal célula u organismo que no expresa el polipéptido, o que confiere a una célula u organismo la capacidad de realizar la fotosíntesis, crecer y/o reproducirse con menos daño o inhibición del crecimiento observado que tal célula u organismo que no expresa tal polipéptido.

El término "polipéptido" comprende proteínas tales como enzimas, anticuerpos y polipéptidos de longitud media y péptidos cortos hasta una longitud de secuencia de aminoácidos por debajo de diez.

El término "enzima" significa en la presente invención cualquier polipéptido que catalice la reacción en la que el parahidroxifenilpiruvato se transforma en homogentisato. Incluye enzimas naturales, así como también variantes de enzimas y derivados de las mismas. También comprende cualquier fragmento de tal enzima y variantes modificadas genéticamente mediante inserción, deleción, recombinación y/o cualquier otro método, que conduzca a enzimas que difieren en su secuencia de aminoácidos de la enzima natural o de las variantes de la enzima. También comprende moléculas proteicas con modificaciones postraduccionales y/o químicas, por ejemplo, glucosilación, gamma carboxilación y acetilación, cualquier complejo molecular o proteína de fusión que comprende una de las proteínas antes mencionadas.

Los términos "variante polipeptídica" o "polipéptido mutante" significan cualquier molécula polipeptídica obtenida mediante mutagénesis, preferentemente mediante mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio con una secuencia de aminoácidos alterada en comparación con la secuencia de tipo salvaje respectiva. Por "tolerar", "tolerancia" o "resistente" se entiende sobrevivir a una aplicación particular de herbicidas inhibidores de la HPPD o la capacidad de llevar a cabo funciones celulares esenciales tales como la fotosíntesis, la síntesis de proteínas o la respiración y la reproducción de una manera que no es fácilmente discernible de células u organismos no tratados, o la capacidad de no tener una diferencia significativa en el rendimiento o incluso un mejor rendimiento para plantas tratadas con el herbicida inhibidor de la HPPD en comparación con tales plantas no tratadas con tal herbicida (pero donde las malas hierbas se han eliminado o prevenido mediante un mecanismo diferente a la aplicación del herbicida inhibidor de la HPPD, como los métodos descritos en el documento WO2011/100302).

Además de conferir a una célula tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD, las secuencias de ácido nucleico de HPPD recombinante de la invención codifican polipéptidos que tienen actividad HPPD, es decir, catalizan la reacción en la que el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. La actividad catalítica de un polipéptido de HPPD puede definirse mediante diversos métodos bien conocidos en la técnica. Los documentos WO2009/144079 y WO2014/043435 describen diversos métodos de cribado adecuados.

La actividad enzimática de los polipéptidos de HPPD puede medirse mediante cualquier método que posibilite medir la disminución de la cantidad de los sustratos HPP u O2, o medir la acumulación de cualquiera de los productos derivados de la reacción enzimática, es decir, el homogentisato o CO2. En particular, la actividad HPPd puede medirse por medio del método descrito en el documento WO2009/144079; García y otros (1997), Biochem. J. 325, 761-769; García y otros (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516; o en el documento WO2012/021785.

Para los fines de la presente invención, un polipéptido de HPPD de "referencia" (o gen de la HPPD que codifica tal polipéptido) es cualquier polipéptido o ácido nucleico de HPPD con el que se compara el polipéptido de HPPD o el ácido nucleico de HPPD recombinante de la invención. Para los fines de describir los polipéptidos de HPPD de la presente invención, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente. Este polipéptido de HPPD de referencia puede ser una HPPD vegetal, bacteriana o animal nativa, o puede ser un polipéptido de HPPD mutado que se conozca en la técnica, tales como los mutantes PfP215L y PfG336F descritos en la publicación de patente internacional WO2009/144079, o puede ser cualquiera de las proteínas PfHPPDevo33, PfHPPDevo36, PfHPPDevo37, PfHPPDevo40 o PfHPPDevo41 del documento WO2014/043435; PfHPPDevo41 se establece en la presente solicitud como SEQ ID NO:2. Tal polipéptido de HPPD de referencia puede usarse para determinar si el polipéptido de HPPD o el ácido nucleico recombinante de la invención tiene una propiedad particular de interés (por ejemplo, tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD o actividad enzimática del polipéptido de HPPD mejor, comparable o disminuida; expresión mejor, comparable o disminuida en una célula huésped; estabilidad proteica mejor, comparable o disminuida, y similares).

En diversas modalidades de la presente descripción, el polipéptido tolerante a herbicidas inhibidores de la HPPD codificado por un ácido nucleico (que incluye genes aislados, recombinantes y quiméricos del mismo, vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden el ácido nucleico, polipéptidos de HPPD y composiciones de los mismos codificados por el ácido nucleico, así como también métodos de uso del polipéptido codificado por el ácido nuclei

En una modalidad, el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD (que incluye la secuencia de nucleótidos que lo codifica y los genes quiméricos y recombinantes de los mismos, vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de HPPD de la invención) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene

(a) al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1,

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1,

(c) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1 y en donde tal polipéptido HPPD es tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.

En otra modalidad, el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD (que incluye la secuencia de nucleótidos que lo codifica y los genes quiméricos y recombinantes de los mismos, vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de HPPD de la invención) que es tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene (a) al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1,

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1, y comprende además

i. una metionina, treonina, serina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 204 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una lisina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iii. una arginina, lisina, glutamina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iv. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina, leucina, ácido glutámico, prolina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una serina, histidina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 310 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una arginina, metionina o histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una histidina, alanina, fenilalanina, valina o glicina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO:1; y/o

ix. una prolina, histidina, serina, isoleucina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 331 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

xi. un ácido glutámico, arginina, alanina o treonina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 339 de la SEQ ID NO: 1; y/o

xii. una arginina, glutamina, metionina, ácido glutámico, glicina, leucina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

xiii. una glutamina, prolina, o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO: 1; y/o

xiv. una lisina, arginina, metionina, alanina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

i. una leucina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una arginina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iii. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO:1; y/o

iv. un ácido glutámico o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ix. una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una lisina, valina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1 y comprende además

i. una lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID, NO: 1; y/o

iii. una glicina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iv. un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO: 1; y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

(i) una glicina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1,

(iii) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y

(iv) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO: 1,

(i) una lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) una glicina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1,

(iii) un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1,

(iv) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y

(v) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

(ii) una leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO: 1,

(iii) una glicina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1,

(iv) un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1,

(v) una valina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1;

(vi) una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO: 1, y

(vii) una metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO: 1.

(i) una leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1,

(iv) una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO: 1,

(v) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1;

(vii) una metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, y

(c) una histidina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, o

(d) un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y (e) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO:1.

En otra modalidad, el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD (que incluye la secuencia de nucleótidos que lo codifica y los genes quiméricos y recombinantes de los mismos, vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de HPPD de la invención) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene (a) al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1,

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO:1;

(c) una histidina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1 o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1;

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1; y

(e) una histidina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO:1.

(c) una histidina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1;

(d) serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1; y

(e) una valina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1.

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1

(e) una valina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

La Tabla 1 resume las posiciones de aminoácidos respectivas en comparación con el polipéptido de HPPD de Pseudomonas fluorescens de tipo salvaje de referencia (SEQ ID NO: 1) donde las variantes del polipéptido de HPPD de acuerdo con la invención comprenden tres o más sustituciones de aminoácidos. Si no se indica explícitamente de cualquier otra manera, los intercambios en las posiciones de aminoácidos relevantes siempre se refieren al polipéptido de HPPD de Pseudomonas fluorescens de tipo salvaje de referencia correspondiente a la SEQ ID NO:1.

Tabla 1: Información general de intercambios de aminoácidos ilustrativos con respecto al polipéptido de HPPD correspondiente a la SEQ ID NO: 1

En la presente descripción se hace referencia a los aminoácidos mediante el uso del nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una única letra. La tabla que aparece más abajo proporciona una lista de los aminoácidos estándar junto con sus abreviaturas.

Alanina A Ala

Cisteína C Cys

Ácido aspártico D Asp

Ácido glutámico E Glu

Fenilalanina F Phe

Glicina G Gly

Histidina H His

Isoleucina I Ile

Lisina K Lys

Leucina L Leu

Metionina M Met

Asparagina N Asn

Prolina P Pro

Glutamina Q Gln

Arginina R Arg

Serina S Ser

Treonina T Thr

Valina V Val

Triptófano W Trp

Tirosina Y Tyr

Cisteína C Cys

Los expertos en la técnica conocen bien que el código genético es redundante, o sea, más de un triplete de codones puede codificar el mismo aminoácido. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente descripción pueden generarse mediante secuencias alternativas que usan diferentes codones para codificar la misma secuencia de aminoácidos.

En otra modalidad, los polipéptidos de HPPD tienen al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la presente descripción como SEQ ID NO: 1.

Las secuencias de HPPD ilustrativas que pueden modificarse de acuerdo con la presente invención incluyen las de bacterias, particularmente del tipo Pseudomonas spp., más particularmente de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas testosteroni (Comamonas testosteroni).

Para los fines de la presente invención, el polipéptido recombinante que comprende un polipéptido de HPPD de la invención también puede comprender modificaciones adicionales, por ejemplo, en donde algunos aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 17 aminoácidos) se han reemplazado, añadido o eliminado para los fines de la clonación, para hacer una fusión con un péptido de tránsito, y similares, que conservan la actividad de HPPD, es decir, la propiedad de catalizar la conversión de para-hidroxifenilpiruvato en homogentisato, o puede ser cualquier polipéptido de HPPD que pueda mejorarse adicionalmente. Por ejemplo, el polipéptido de HPPD que puede mejorarse adicionalmente mediante las modificaciones descritas en la presente descripción puede ser la variante de HPPD derivada de Pseudomonas fluorescens establecida en la presente descripción como cualquiera de las SEQ ID NO: 3-108.

En una modalidad preferida, los polipéptidos de HPPD de acuerdo con la presente invención y que son tolerantes a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD son equivalentes a la SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) además de los aminoácidos que se reemplazan de acuerdo con la presente invención, es decir.

el polipéptido de HPPD respectivo es idéntico a la SEQ ID NO: 1 pero tiene

(a) una prolina en la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1,

(b) una histidina o un ácido aspártico en la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y

(c) una serina en la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO:1.

En una modalidad preferida adicional, los polipéptidos de HPPD, de acuerdo con la presente invención, que son tolerantes a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD son equivalentes a la SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) además de los aminoácidos que se reemplazan de acuerdo con la presente invención, es decir, el polipéptido de HPPD respectivo es idéntico a la SEQ ID NO: 1 pero tiene uno o más intercambios de aminoácidos en la posición de aminoácido respectiva de acuerdo con la Tabla 1, anterior, con la condición de que existe una prolina en la posición 335 de la SEQ ID NO: 1, existe una histidina o un ácido aspártico en la posición 336 de la SEQ I^dNO: 1 y existe una serina en la posición 337 de la SEQ ID NO: 1.

En una modalidad preferida adicional, los polipéptidos de HPPD, de acuerdo con la presente invención, que son tolerantes a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD son equivalentes a la SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) además de los aminoácidos que se reemplazan de acuerdo con la presente invención, es decir, el polipéptido de HPPD respectivo es idéntico a la SEQ ID NO: 1 pero tiene intercambios de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos respectivas como se define en la Tabla 2 (más abajo) en las líneas de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 19 y de la SEQ ID NO: 21 a la SEQ ID NO: 108.

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos de la invención (que incluye los genes aislados, recombinantes y quiméricos de la misma, vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden la secuencia de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos y composiciones de las mismas codificadas por la secuencia de ácido nucleico, así como también los métodos de uso de la secuencia de ácido nucleico para aumentar la tolerancia de una planta a los herbicidas inhibidores de la HPPD, particularmente una tolerancia aumentada a los herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol) hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2)-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt.

2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas, codifica la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:3-108 y fragmentos y variantes de las mismas que codifican un polipéptido de tolerancia al herbicida inhibidor de la HPPD.

A. Métodos para medir la tolerancia al inhibidor de la HPPD

Cualquier método adecuado para medir la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD puede usarse para evaluar los polipéptidos de HPPD de la invención. La tolerancia puede medirse mediante el monitoreo de la capacidad de una célula u organismo para sobrevivir a una aplicación particular de un herbicida inhibidor de la HPPD, o la capacidad de llevar a cabo funciones celulares esenciales tales como la fotosíntesis, la síntesis de proteínas o la respiración y la reproducción de una manera que no es fácilmente discernible de células u organismos no tratados, o la capacidad de no tener una diferencia significativa en el rendimiento o incluso un mejor rendimiento de las plantas tratadas con un herbicida inhibidor de la HPPD en comparación con tales plantas no tratadas con tal herbicida (pero donde las malas hierbas se han eliminado o prevenido mediante un mecanismo diferente a la aplicación del herbicida inhibidor de la HPPD). En algunas modalidades, la tolerancia puede medirse de acuerdo con un fenotipo indicador visible de la célula u organismo transformado con un ácido nucleico que comprende el gen que codifica el polipéptido de HPPD respectivo, o en un ensayo in vitro del polipéptido de HPPD, en presencia de diferentes concentraciones de los diversos herbicidas inhibidores de la HPPD. Las respuestas a la dosis y los cambios relativos en las respuestas a la dosis asociados con estos fenotipos indicadores (formación de color marrón, inhibición del crecimiento, blanqueamiento, efecto herbicida, etc.) se expresan convenientemente en términos, por ejemplo, de GR50 (concentración para una reducción del crecimiento del 50 %) o valores de MIC (concentración inhibidora mínima) donde los aumentos en los valores que corresponden a aumentos en la tolerancia inherente del polipéptido de HPPD expresado, de la manera normal en base al daño a la planta, síntomas de blanqueamiento meristemático, etc. en un intervalo de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos pueden expresarse en términos de, por ejemplo, valores de GR50 derivados de curvas de dosis/respuesta que tienen la "dosis" representada en el eje x y el "porcentaje de muerte", "efecto herbicida", "número de plantas verdes emergentes", etc. representado en el eje y, donde los valores de GR50 aumentados corresponden a niveles aumentados de tolerancia inherente del polipéptido HPPD expresado. La aplicación adecuada de herbicidas puede ser preemergente y postemergente.

En diversas modalidades, el nivel de tolerancia del ácido nucleico recombinante o el gen de la invención que codifica un polipéptido de HPPD, o el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD, puede cribarse mediante pruebas de transgenia, regeneración, mejoramiento y aspersión de una planta de prueba tal como el tabaco o una planta de cultivo tal como la soja, el maíz o el algodón. De acuerdo con los resultados obtenidos mediante tal cribado, tales plantas son más tolerantes, convenientemente tolerantes a al menos 2 veces la dosis normal recomendada para aplicaciones de campo, incluso más preferentemente, tolerantes a hasta 4 veces la dosis normal recomendada para aplicaciones de campo, a los herbicidas inhibidores de la HPPD (por ejemplo, herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt.

2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas, que tales plantas que no contienen ningún gen exógeno que codifique un polipéptido de HPPD, o que las plantas que contienen un gen que comprende ADN que codifica un polipéptido de HPPD de referencia, por ejemplo, un ADN que codifica la HPPD de Pseudomonas fluorescens, bajo el control del mismo promotor que el ácido nucleico recombinante de la invención que codifica el polipéptido de HPPD. En consecuencia, el término "capaz de aumentar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD" indica una tolerancia de la planta que expresa el polipéptido recombinante de la invención que comprende una HPPD a al menos 1x, 2x, o 3x, o 4x, o mayor, la dosis de campo normal del herbicida inhibidor de la HPPD en comparación con una planta que sólo expresa su HPPD endógena o una planta que expresa un polipéptido de HPPD de referencia. A este respecto, el término "herbicida que actúa sobre la HPPD" no se limita a las sustancias que se conocen y/o usan como herbicidas, sino a cualquier sustancia que inhiba la actividad catalítica de los polipéptidos de HPPD.

El término "tolerancia a herbicidas", "tolerancia a inhibidores" o "insensibilidad a inhibidores" significa también la capacidad de una enzima para realizar su respectiva reacción catalítica en presencia de un inhibidor/herbicida o después de una exposición a un inhibidor/herbicida. La tolerancia a los herbicidas de las enzimas, es decir, su capacidad para resistir el efecto inhibidor del herbicida puede expresarse cualitativa y cuantitativamente. Cualitativamente, las enzimas que toleran diferentes entidades o incluso diferentes clases de inhibidores tienen una alta tolerancia y viceversa. En términos cuantitativos, la tolerancia de una enzima en comparación con un herbicida puede expresarse como la "actividad residual" respectiva o "recambio residual" observada en una muestra de esta enzima calculada como relación de actividades (k^ap, medida cinética) o recambio total de sustrato (cambio en la señal, medición de la variable de valoración) en ausencia y presencia de un inhibidor (Bergmeyer, HU.: "Methods of enzymatic analysis", 1974). En diversas modalidades, para la determinación de la actividad residual, la constante cinética aparente (k^ap) de la conversión de sustrato determinada puede medirse como cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en un ensayo acoplado, en el que el homogentisato (HGA) formado por la HPPD a partir del HPP se convierte directamente en la molécula absorbente maleilacetoacetato (MAA) mediante una segunda enzima homogentisato dioxigenasa (HGD), aplicada en exceso de manera uniforme en todos los ensayos. La relación k^cat/k^Mde una actividad enzimática es proporcional a la constante cinética aparente k^appy es proporcional a k^cat/k^M*[E] ([E] = concentración de enzima). Un inhibidor competitivo exhibe un aumento aparente en la k^My, de esta manera, una disminución recíproca en la k^apen concentraciones de sustrato no saturantes. Dado que las mediciones de la k^apen presencia y ausencia de inhibidor se realizan mediante el uso de la misma muestra de enzima, sin procesar o purificada, y de esta manera a la misma concentración de enzima, la concentración de enzima se elimina del cálculo de la actividad residual y la relación de ambas k^apindica directamente el cambio de la k^Mdebido a la inhibición. Cabe destacar que este concepto se aplica a pares de enzima/inhibidor que interactúan en una manera de "inhibición competitiva", probablemente correcta para casi todas las variantes de polipéptidos e inhibidores descritos. La constante de inhibición ki para una enzima y el inhibidor respectivo describe la fuerza de unión del inhibidor a esta enzima. Una tolerancia aumentada se da para las relaciones de 1,5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o más altas y se compara con una secuencia de HPPD de referencia en presencia o ausencia de cualquier herbicida inhibidor de la HPPD respectivo.

Un tipo de ensayo específico, aunque no limitante, que puede usarse para evaluar las secuencias polipeptídicas de HPPD de la invención es un ensayo colorimétrico (como se describe, por ejemplo, véase el documento US 6,768,044). En este ensayo, por ejemplo, las células de E. coli que contienen el vector pSE420-HPPDx (HPPDx significa cualquier gen que codifica un supuesto polipéptido de HPPD; el vector básico "pSE420" se obtuvo de Invitrogen Karlsruhe, Alemania) o una versión modificada de pSE420 (pSE420 (RI)NX)-HPPDx, producen pigmentos similares a la melanina solubles a partir del catabolismo de la tirosina cuando el polipéptido de HPPD sobreexpresado está activo. Estos pigmentos similares a la melanina se analizan en un cultivo líquido o mediante la aplicación de un cultivo de E. coli en agar sólido tipo caldo LB. Después de 16 horas a 8 días a 20-30 °C, en los pocillos de medio de cultivo o agar que se han inoculado con un cultivo de E. coli que contiene el vector vacío pSE420 no se altera el color del medio, o en aquellos que se han sembrado con un cultivo de E. coli que contiene un vector pSE420-HPPDx que contiene un gen que codifica una HPPD inactiva tampoco se altera el color del medio, mientras que los pocillos inoculados con un cultivo de E. coli que contiene el vector pSE420-HPPDx que codifica una HPPD activa son marrones. En presencia de un herbicida inhibidor de la HPPD, esta producción de pigmento puede inhibirse y en el cultivo no se alterará el color del medio, a menos que se exprese y esté activo un polipéptido de HPPD tolerante al herbicida inhibidor de la HPPD. Se ha demostrado previamente que esta prueba refleja la actividad de la HPPD y la tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD, cualquiera que sea el origen de esta actividad, y permite la identificación de las actividades de la HPPD (documento US 6,768,044), es decir, a nivel cualitativo.

B. Métodos de introducción de mutaciones en secuencias de la HPPD

En los polipéptidos de HPPD mutados codificados por el ácido nucleico recombinante de la invención, al menos tres aminoácidos se han reemplazado como se definió anteriormente.

La sustitución puede efectuarse en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de HPPD de referencia como se definió anteriormente por cualquier medio apropiado para el reemplazo, en dicha secuencia, el codón que codifica el aminoácido a ser reemplazado con el codón que corresponde al aminoácido que va a reemplazarlo y dichos codones se describen ampliamente en la literatura y el experto en la técnica los conoce bien.

Pueden usarse varios métodos de biología molecular para lograr este reemplazo. Un método útil para preparar una secuencia de ácido nucleico mutado de acuerdo con la invención, y la proteína correspondiente, comprende llevar a cabo una mutagénesis dirigida al sitio en codones que codifican uno o más aminoácidos que se seleccionan de antemano. El experto en la técnica conoce bien los métodos para obtener estas mutaciones, que se describen ampliamente en la literatura (en particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, editado por MJ McPHERSON, IRL PRESS), o son métodos para los cuales es posible emplear kits comerciales (por ejemplo, el kit de mutagénesis Lightning de QUIKCHANGE™ de Qiagen o Stratagene). Después de la mutagénesis dirigida al sitio, es útil seleccionar las células que contienen una HPPD mutada que es menos sensible a un inhibidor de la HPPD mediante el uso de un soporte de cribado apropiado. Los métodos de cribado apropiados para lograr esto se han descrito anteriormente.

Alternativamente, una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de HPPD de referencia puede modificarse in silico para codificar un polipéptido de HPP^dque tenga una o más de las sustituciones citadas en la presente descripción, y luego sintetizarse de novo. Este método también se conoce bien en la técnica, descrito en la literatura. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de HPPD mutado puede introducirse en una célula huésped como se describe en otra parte de la presente descripción.

C. Polinucleótidos aislados y variantes y fragmentos de los mismos.

En algunas modalidades, la presente invención comprende polinucleótidos aislados o recombinantes. El término "polinucleótido" corresponde a cualquier material genético de cualquier longitud y cualquier secuencia, que comprende moléculas de ADN y ARN de simple y doble hebra, que incluye elementos reguladores, genes estructurales, grupos de genes, plásmidos, genomas completos y fragmentos de los mismos. Un polinucleótido o polipéptido/proteína "recombinante", o una porción biológicamente activa del mismo, como se define en la presente descripción, ya no está presente en su organismo nativo original, como cuando la contiene una célula huésped heteróloga o una célula vegetal, semilla o planta transgénica. En una modalidad, un polinucleótido recombinante no tiene secuencias (por ejemplo, secuencias reguladoras o que codifican proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el polinucleótido. El término "recombinante" abarca polinucleótidos o polipéptidos que se han manipulado genéticamente con respecto al polinucleótido o polipéptido nativo, de tal manera que el polinucleótido o polipéptido difiere (por ejemplo, en cuanto a la composición química o estructura) del que existe en la naturaleza. En otra modalidad, un polinucleótido "recombinante" no tiene secuencias internas (es decir, intrones) que existen de manera natural en el ADN genómico del organismo del que se deriva el polinucleótido. Un ejemplo típico de tal polinucleótido es el llamado ADN complementario (ADNc). Por ejemplo, en diversas modalidades, el polinucleótido que codifica la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el polinucleótido. Las moléculas de ácido nucleico recombinante de la invención incluyen aquellas que codifican la HPPd . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped vegetal o una célula huésped bacteriana).

La presente invención contempla además variantes ilustrativas y fragmentos de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique las secuencias de aminoácidos establecidas en cualquiera de las SEQ ID NO:3-108. Un “fragmento” de un polinucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido, o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridación o cebador de PCR mediante el uso de los métodos descritos en otra parte de la presente descripción. Los polinucleótidos que son fragmentos de un polinucleótido comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa descrito en la presente descripción, en dependencia del uso que se pretenda darle (por ejemplo, un ácido nucleico de HPPD descrito en la presente descripción). Por nucleótidos "contiguos" se entiende los residuos de nucleótidos que están inmediatamente adyacentes entre sí.

Los fragmentos de los polinucleótidos recombinantes de la presente invención generalmente codificarán fragmentos de polipéptidos que conservan la actividad biológica de la proteína de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD de longitud completa; es decir, la actividad de tolerancia a herbicidas. Por "conserva la actividad de tolerancia a herbicidas" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 250 %, al menos aproximadamente 300 % o mayor, de la actividad de tolerancia a herbicidas de la proteína de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD, de longitud completa, descrita en la presente descripción como SEQ ID NO:3-108. Los métodos para medir la actividad de tolerancia a herbicidas se conocen bien en la técnica y en la presente descripción se describen los métodos ilustrativos. En un ejemplo no limitante, un fragmento será tolerante a la misma dosis de un herbicida inhibidor de la HPPD, o tolerante a dosis 1x, 2x, 3x, 4x o más altas de un herbicida inhibidor de la HPPD, o los fragmentos serán de igual o mayor tolerancia en base a la ki entre el fragmento y las SEQ ID NO:3-108.

Un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de un polinucleótido recombinante de la invención codificará al menos aproximadamente 150, 175, 200, 250, 300, 350 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa de la invención. En un ejemplo no limitante, un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD que tiene (a) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1 y (b) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO:1 y (c) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO:1 y, opcionalmente, uno o más sustituciones de aminoácidos adicionales en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 de la SEQ ID NO: 1, que incluye la proteína HPPD establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-108.

La invención también abarca variantes de polinucleótidos como se describe supra. Las "variantes" del polinucleótido también incluyen aquellas secuencias que codifican el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD pero que difieren conservadoramente debido a la redundancia del código genético, así como también aquellas que son suficientemente idénticas. Las variantes de la presente invención conservarán la actividad del polipéptido de HPPD y la tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD. Por el término "suficientemente idéntico" se entiende una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que tiene al menos aproximadamente 53 %, al menos aproximadamente 60 % o 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente 70 % o 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente 80 % u 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia mediante el uso de uno de los programas de alineamiento que usan parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de los polipéptidos codificados por dos polinucleótidos, al tener en cuenta la redundancia de codones, similitud de aminoácidos, posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Los genes bacterianos poseen, muy a menudo, múltiples codones de iniciación de metionina en la proximidad del inicio del marco abierto de lectura. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, las bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se usan de manera natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos puede conducir a la generación de variantes que confieran tolerancia a herbicidas. En la presente invención se abarcan estas proteínas de tolerancia a herbicidas y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Las variantes alélicas naturales pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación, como se destaca más abajo. Las variantes de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos derivados sintéticamente que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de estrategias de mutagénesis dirigida al sitio u otras, pero que todavía codifican el polipéptido que tiene la actividad biológica deseada.

El experto en la técnica apreciará además que pueden introducirse cambios mediante la mutación adicional de los polinucleótidos recombinantes de la invención, de esta manera se conduce a cambios adicionales en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados, sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos. Por tanto, pueden crearse variantes de polinucleótidos aisladas mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de nucleótidos adicionales en el polinucleótido correspondiente que codifica el polipéptido recombinante de la invención que comprende un polipéptido de HPPD, de tal manera que 3-5, 1-7, 1-9, 1-11, 1-13, 1-15, o 1-17 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, se introducen en el polipéptido codificado. Las mutaciones adicionales pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediante PCR, o técnicas de recombinación aleatoria de genes. La presente invención también abarca tales variantes de polinucleótidos.

Las variantes de polinucleótidos pueden hacerse mediante la introducción aleatoria de mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis por saturación o mutagénesis por permutaciones, y los mutantes resultantes pueden cribarse para determinar la capacidad de conferir actividad de tolerancia a herbicidas, para identificar los mutantes que conservan la actividad.

Los métodos adicionales para generar variantes incluyen someter una célula que expresa una proteína descrita en la presente descripción (o una biblioteca de la misma) a una condición específica que crea estrés en la actividad de la proteína. Las condiciones específicas pueden incluir (pero no se limitan a) cambios de temperatura, cambios de pH, cambios en las concentraciones de sustratos o inhibidores y cambios en la composición del tampón o sus concentraciones. La biblioteca de proteínas puede someterse a estas condiciones durante el tiempo de expresión de la proteína (por ejemplo, en E. coli u otro huésped) o después de la creación de un extracto de proteína, o después de la purificación de la proteína.

La actividad funcional o enzimática de la biblioteca de proteínas que se ha sometido a una condición de estrés puede compararse con la proteína de referencia para identificar las proteínas con mejores propiedades. Esta comparación de actividad puede llevarse a cabo como parte de un cribado del crecimiento o, alternativamente, como parte de un ensayo enzimático que cuantifica la actividad de la proteína. Las propiedades que pueden identificarse como mejores pueden incluir la tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD, cambios en las constantes cinéticas (que incluyen KM, Ki, k^cat), estabilidad de la proteína, termoestabilidad de la proteína o temperatura óptima de la proteína y pH óptimo.

D. Proteínas y variantes aisladas y fragmentos de las mismas

Los polipéptidos recombinantes que comprenden polipéptidos de tolerancia a herbicidas también se abarcan dentro de la presente invención. Un polipéptido de tolerancia a herbicidas incluye preparaciones de polipéptidos que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de polipéptido no tolerante a herbicidas (también denominado en la presente descripción como "proteína contaminante"). En la presente invención, por "proteína de tolerancia a herbicidas" se entiende un polipéptido de HPPD descrito en la presente descripción. También se proporcionan fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de los mismos, y pueden usarse para poner en práctica los métodos de la presente invención.

"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos polipeptídicos que comprenden una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína de tolerancia a herbicidas y que conserva la actividad de tolerancia a herbicidas. Una porción biológicamente activa de una proteína de tolerancia a herbicidas puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar su actividad de tolerancia a herbicidas.

Por "variantes" se entiende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 53 %, 60 %, 65 %, aproximadamente 70 %, 75 %, aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3-108 ilustrativas, en donde dicha variante tiene actividad de polipéptido de HPPD y de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de los polipéptidos codificados por dos polinucleótidos, al tener en cuenta la redundancia de codones, similitud de aminoácidos, posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de referencia de un polipéptido sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se definen familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en el carbono beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que conserven la función. En general, tales sustituciones no se harían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad del polipéptido. Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

También se describen anticuerpos contra la HPPD, o contra variantes o fragmentos de la misma. Los métodos para producir anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente de Estados Unidos núm.

4,196,265).

Por tanto, un aspecto de la descripción se refiere a anticuerpos, moléculas de unión a antígeno monocatenarias u otras proteínas que se unen específicamente a una o más de las moléculas de proteína o péptido y sus homólogos, fusiones o fragmentos. En una modalidad particularmente preferida de la descripción, el anticuerpo se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en las SEQ ID NO: 1-108 o un fragmento de la misma.

Los anticuerpos de la descripción pueden usarse para detectar cuantitativa o cualitativamente las moléculas de proteína o péptido de la invención, o para detectar modificaciones postraduccionales de las proteínas. Como se usa en la presente descripción, se dice que un anticuerpo o péptido se "une específicamente" a una molécula de proteína o péptido de la invención si tal unión no se inhibe competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas.

E. Apilamiento de genes

En la producción comercial de cultivos, es conveniente eliminar, bajo un control plaguicida fiable, plantas no deseadas (es decir, malas hierbas) de un campo de plantas de cultivo. Un tratamiento ideal sería uno que pudiera aplicarse a un campo completo pero que eliminara solo las plantas no deseadas sin afectar las plantas de cultivo. Uno de tales sistemas de tratamiento implicaría el uso de plantas de cultivo que son tolerantes a un herbicida de modo que cuando el herbicida se rocía en un campo de plantas de cultivo tolerantes a herbicidas, las plantas de cultivo continuarían su desarrollo mientras que las malas hierbas no tolerantes a herbicidas mueren o se dañan severamente. Idealmente, tales sistemas de tratamiento aprovecharían las diferentes propiedades de los herbicidas, de modo que el control de las malas hierbas pudiera proporcionar la mejor combinación posible de flexibilidad y economía. Por ejemplo, los herbicidas individuales tienen diferentes longevidades en el campo, y algunos herbicidas persisten y son efectivos durante un tiempo relativamente largo después de que se aplican a un campo, mientras que otros herbicidas se descomponen rápidamente en otros compuestos no activos. Un sistema de tratamiento ideal permitiría el uso de diferentes herbicidas para que los productores pudieran adaptar la elección de herbicidas para una situación particular.

Mientras que, en la actualidad, un número de plantas de cultivo tolerantes a herbicidas están disponibles comercialmente, un problema que ha surgido para muchos herbicidas comerciales y combinaciones de herbicidas/cultivos es que los herbicidas individuales típicamente tienen un espectro de actividad incompleto frente a las especies de malas hierbas comunes. Para la mayoría de los herbicidas individuales que se han usado durante algún tiempo, las poblaciones de especies y biotipos de malas hierbas resistentes a los herbicidas se han vuelto más prevalentes (véase, por ejemplo, Tranel y Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen y Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311). Se han descrito plantas transgénicas que son tolerantes a más de un herbicida (véase, por ejemplo, el documento WO2005/012515). Sin embargo, las mejoras en cada aspecto de la producción de cultivos, las opciones de control de malas hierbas, la extensión del control de malas hierbas residuales y la mejora en el rendimiento de los cultivos tienen una demanda continua.

El polipéptido recombinante de la invención que comprende una proteína HPPD o la secuencia de nucleótidos recombinante de la invención se combina ventajosamente en plantas con otros genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles a tales plantas. Entre los genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles a las plantas transformadas, pueden mencionarse las secuencias de a Dn que codifican proteínas que confieren tolerancia a uno o más herbicidas que, de acuerdo con su estructura química, difieren de los herbicidas inhibidores de la HPPD, y otros que confieren tolerancia a determinados insectos, aquellos que confieren tolerancia a determinadas enfermedades, los ADN que codifican ARN que proporcionan un control de nematodos o insectos, y similares.

Tales genes se describen en particular en las publicaciones de solicitudes de patente del PCT WO91/02071 y WO95/06128 y en las patentes de Estados Unidos 7,923,602 y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20100166723.

Entre las secuencias de ADN que codifican proteínas que confieren tolerancia a determinados herbicidas en las plantas y células vegetales transformadas, puede mencionarse un gen bar o PAT o el gen de Streptomyces coelicolor descrito en el documento WO2009/152359 que confiere tolerancia a los herbicidas de glufosinato, un gen que codifica una EPSPS adecuada que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen como diana la EPSPS, tales como el glifosato y sus sales (documentos (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435), un gen que codifica la glifosato-N-acetiltransferasa (por ejemplo, los documentos US 8,222,489, US 8,088,972, U^s8,044,261, US 8,021,857, US 8,008,547, US 7,999,152, US 7,998,703, US 7,863,503, US 7,714,188, US 7,709,702, US 7,666,644, US 7,666,643, US 7,531,339, US 7,527,955, y US 7,405,074), o un gen que codifica la glifosato oxidorreductasa (por ejemplo el documento, US 5,463,175).

Entre las secuencias de ADN que codifican una EPSPS adecuada que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen como diana la EPSPS, se mencionará más particularmente el gen que codifica una EPSPS de plantas, en particular la EPSPS del maíz, particularmente una EPSPS del maíz que comprende dos mutaciones, particularmente una mutación en la posición de aminoácido 102 y una mutación en la posición de aminoácido 106 (documento WO2004/074443), y que se describe en la solicitud de patente US 6566587, en lo sucesivo denominada EPSPS de maíz doble mutante o 2mEPSPS, o el gen que codifica una EPSPS aislada de Agrobacterium y que se describe mediante la secuencia con número de identificación 2 y la secuencia con número de identificación 3 de la patente de Estados Unidos 5,633,435, también denominada CP4.

Entre las secuencias de ADN que codifican una EPSPS adecuada que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen como diana la EPSPS, se mencionará más particularmente el gen que codifica una EPSPS GRG23 de Arthrobacter globiformis, pero también los mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2, o GRG23 ACE3, particularmente los mutantes o variantes de GRG23 como se describe en los documentos WO2008/100353, tales como GRG23(ace3)R173K de SEQ ID NO. 29 en el documento WO2008/100353.

En el caso de las secuencias de ADN que codifican la EPSPS, y más particularmente que codifican los genes anteriores, a la secuencia que codifica estas enzimas la precede, ventajosamente, una secuencia que codifica un péptido de tránsito, en particular el "péptido de tránsito optimizado" descrito en la patente de Estados Unidos 5,510,471 o 5,633,448.

Los rasgos ilustrativos de tolerancia a herbicidas que pueden combinarse con la secuencia de ácido nucleico recombinante de la invención incluyen además al menos un inhibidor de la ALS (acetolactato sintasa) (documento WO2007/024782); un gen ALS/AHAS de Arabidopsis mutado (patente de Estados Unidos 6,855,533); genes que codifican las 2,4-D-monooxigenasas que confieren tolerancia a 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) por metabolización (patente de Estados Unidos 6,153,401); y, genes que codifican las dicamba monooxigenasas que confieren tolerancia a dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) por metabolización (documentos US 2008/0119361 y US 2008/0120739).

En diversas modalidades, la HPPD se apila con uno o más genes tolerantes a herbicidas, que incluyen uno o más genes tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD adicionales, y/o uno o más genes tolerantes al glifosato y/o el glufosinato. En una modalidad, la HPPD se combina con la 2mEPSPS y bar.

Entre las secuencias de ADN que codifican proteínas relacionadas con propiedades de tolerancia a insectos, se mencionarán más particularmente las proteínas de Bt, ampliamente descritas en la literatura y bien conocidas por el experto en la técnica. También se mencionarán las proteínas extraídas de bacterias tales como Photorhabdus (documentos WO97/17432 y WO98/08932).

Entre tales secuencias de ADN que codifican proteínas de interés que confieren nuevas propiedades de tolerancia a insectos, se mencionarán más particularmente las proteínas Cry o VIP de Bt, ampliamente descritas en la literatura y bien conocidas por el experto en la técnica. Estas incluyen la proteína Cry1F o híbridos derivados de una proteína Cry1F (por ejemplo, las proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas en los documentos US 6,326,169; US 6,281,016; US 6,218,188, o fragmentos tóxicos de las mismas), las proteínas de tipo Cry1A o fragmentos tóxicos de las mismas, preferentemente la proteína Cry1Ac o híbridos derivados de la proteína Cry1Ac (por ejemplo, la proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita en el documento US 5,880,275) o las proteínas Cry1Ab o Bt2 o fragmentos insecticidas de las mismas como se describe en el documento EP451878, las proteínas Cry2Ae, Cry2Af o Cry2Ag como se describe en el documento WO2002/057664 o fragmentos tóxicos de las mismas, la proteína Cry1A.105 descrita en el documento WO 2007/140256 (SEQ ID NO. 7) o un fragmento tóxico de la misma, la proteína VIP3Aa19 de núm. de acceso NCBI ABG20428, la proteína VIP3Aa20 de núm. de acceso NCBI ABG20429 (SEQ ID NO. 2 en el documento WO 2007/142840), las proteínas VIP3A producidas en los eventos de algodón COT202 o COT203 (documentos WO2005/054479 y WO2005/054480, respectivamente), las proteínas Cry como se describe en el documento WO2001/47952, la proteína VIP3Aa o un fragmento tóxico de la misma como se describe en Estruch y otros (1996), Proc Natl Acad Sci US A. 28;93(11):5389-94 y el documento US 6,291,156, las proteínas insecticidas de Xenorhabdus (como se describe en el documento WO98/50427), Serratia (particularmente de S. entomophila) o cepas de especies de Photorhabdus, como las proteínas Tc de Photorhabdus como se describe en el documento WO98/08932 (por ejemplo, Waterfield y otros, 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant y Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33). También se incluyen en la presente descripción cualquiera de las variantes o mutantes de cualquiera de estas proteínas que difieran en algunos (1-10, preferentemente 1-5) aminoácidos de cualquiera de las secuencias anteriores, particularmente la secuencia de su fragmento tóxico, o que está fusionada a un péptido de tránsito, tal como un péptido de tránsito de plastos, u otra proteína o péptido.

En diversas modalidades, la secuencia de HPPD puede combinarse en plantas con uno o más genes que confieren un rasgo conveniente, tal como tolerancia a herbicidas, tolerancia a insectos, tolerancia a la sequía, control de nematodos, eficiencia en el uso del agua, eficiencia en el uso del nitrógeno, mejor valor nutricional, resistencia a enfermedades, mejor fotosíntesis, mejor calidad de fibra, tolerancia al estrés, mejor reproducción y similares.

Los eventos transgénicos particularmente útiles que pueden combinarse con los genes de la presente invención en plantas de la misma especie (por ejemplo, mediante el cruzamiento o al volver a transformar una planta que contiene otro evento transgénico con un gen quimérico de la invención), incluyen el Evento 531/PV-GHBK04 (algodón, control de insectos, descrito en el documento WO2002/040677), Evento 1143-14A (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2006/128569); Evento 1143-51B (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2006/128570); Evento 1445 (algodón, tolerancia a herbicidas, no depositado, descrito en los documentos US-A 2002-120964 o WO2002/034946; Evento 17053 (arroz, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-9843, descrito en el documento WO2010/117737); Evento 17314 (arroz, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-9844, descrito en el documento WO2010/117735); Evento 281-24-236 (algodón, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-6233, descrito en los documentos WO2005/103266 o US-A 2005-216969); Evento 3006-210-23 (algodón, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-6233, descrito en los documentos US-A 2007-143876 o WO2005/103266); Evento 3272 (maíz, rasgo de calidad, depositado como PTA-9972, descrito en los documentos WO2006/098952 o US-A 2006 230473); Evento 33391 (trigo, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-2347, descrito en el documento WO2002/027004), Evento 40416 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11508, descrito en el documento WO 11/075593); Evento 43A47 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11509, descrito en el documento WO2011/075595); Evento 5307 (maíz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito en el documento WO2010/077816); Evento ASR-368 (hierba doblada, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4816, descrito en los documentos US-A 2006-162007 o WO2004/053062); Evento B16 (maíz, tolerancia a herbicidas, no depositado, descrito en el documento US-A 2003 126634); Evento BPS-CV127-9 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como NCIMB núm. 41603, descrito en el documento WO2010/080829); Evento BLR1 (colza, restauración de la esterilidad masculina, depositado como NCIMB 41193, descrito en el documento WO2005/074671); Evento CE43-67B (algodón, control de insectos, depositado como DSM ACC2724, descrito en los documentos US-A 2009-217423 o WO2006/128573); Evento CE44-69D (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento US-A 2010-0024077); Evento CE44-69D (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2006/128571); Evento CE46-02A (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2006/128572); Evento COT102 (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2006-130175 o WO2004/039986); Evento COT202 (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2007-067868 o WO2005/054479); Evento COT203 (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2005/054480); Evento DAS21606-3/1606 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11028, descrito en el documento WO2012/033794), Evento ^dA^s40278 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-10244, descrito en el documento WO2011/022469); Evento DAS-44406-6 / pDAB8264.44.06.1 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11336, descrito en el documento WO2012/075426), Evento DAS-14536-7 /pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11335, descrito en el documento WO2012/075429), Evento DAS-59122-7 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA 11384, descrito en el documento US-A 2006-070139); Evento DAS-59132 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en el documento WO2009/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-10442, descrito en los documentos WO2011/066384 o WO2011/066360); Evento DP-098140-6 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8296, descrito en el documento US-A 2009-137395 o WO 08/112019); Evento DP-305423-1 (soja, rasgo de calidad, no depositado, descrito en los documentos US-A 2008-312082 o WO2008/054747); Evento DP-32138-1 (maíz, sistema de hibridación, depositado como ATCC PTA-9158, descrito en los documentos US-A 2009-0210970 o WO2009/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8287, descrito en los documentos US-A 2010-0184079 o WO2008/002872); Evento EE-1 (berenjena, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 07/091277); Evento FI117 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 209031, descrito en los documentos uS-A 2006-059581 o WO 98/044140); Evento FG72 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11041, descrito en el documento WO2011/063413), Evento GA21 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 209033, descrito en el documento US-A 2005-086719 o WO 98/044140); Evento GG25 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 209032, descrito en los documentos US-A 2005-188434 o WO 98/044140); Evento GHB119 (algodón, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8398, descrito en el documento WO2008/151780); Evento GHB614 (algodón, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-6878, descrito en los documentos US-A 2010 050282 o WO2007/017186); Evento GJ11 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 209030, descrito en los documentos US-A 2005-188434 o WO98/044140); Evento GM RZ13 (remolacha azucarera, resistencia a virus, depositado como NCIMB-41601, descrito en el documento WO2010/076212); Evento H7-1 (remolacha azucarera, tolerancia a herbicidas, depositado como NCIMB 41158 o NCIMB 41159, descrito en los documentos US A 2004-172669 o WO 2004/074492); Evento JOPLIN1 (trigo, tolerancia a enfermedades, no depositado, descrito en el documento US-A 2008-064032); Evento LL27 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como NCIMB41658, descrito en los documentos WO2006/108674 o uS-A 2008-320616); Evento LL55 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como NCIMB 41660, descrito en los documentos WO 2006/108675 o US-A 2008-196127); Evento LLcotton25 (algodón, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3343, descrito en los documentos WO2003/013224 o US-A 2003-097687); Evento ^lL^rICE06 (arroz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 203353, descrito en los documentos US 6,468,747 o WO2000/026345); Evento LLRice62 (arroz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC 203352, descrito en el documento WO2000/026345), Evento LLRICE601 (arroz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-2600, descrito en los documentos US-A 2008-2289060 o WO2000/026356); Evento LY038 (maíz, rasgo de calidad, depositado como ATCC PTA-5623, descrito en los documentos US-A 2007-028322 o WO2005/061720); Evento MIR162 (maíz, control de insectos, depositado como PTA-8166, descrito en los documentos US-A 2009-300784 o WO2007/142840); Evento MIR604 (maíz, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2008-167456 o WO2005/103301); Evento MON15985 (algodón, control de insectos, depositado como ATCC PTA-2516, descrito en los documentos US-A 2004-250317 o WO2002/100163); Evento MON810 (maíz, control de insectos, no depositado, descrito en el documento US-A 2002 102582); Evento MON863 (maíz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-2605, descrito en los documentos WO2004/011601 o US-A 2006-095986); Evento MON87427 (maíz, control de polinización, depositado como ATCC PTA-7899, descrito en el documento WO2011/062904); Evento MON87460 (maíz, tolerancia al estrés, depositado como ATCC PTA-8910, descrito en los documentos WO2009/111263 o US-A 2011-0138504); Evento MON87701 (soja, control de insectos, depositado como ATCC PTA-8194, descrito en los documentos US-A 2009-130071 o WO2009/064652); Evento MON87705 (soja, rasgo de calidad y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-9241, descrito en los documentos US-A 2010-0080887 o WO2010/037016); Evento MON87708 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-9670, descrito en el documento WO2011/034704); Evento MON87712 (soja, rendimiento, depositado como PTA-10296, descrito en el documento WO2012/051199), Evento MON87754 (soja, rasgo de calidad, depositado como ATCC PTA-9385, descrito en el documento WO2010/024976); Evento MON87769 (soja, rasgo de calidad, depositado como ATCC PTA-8911, descrito en los documentos US-A 2011-0067141 o WO2009/102873); Evento MON88017 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-5582, descrito en los documentos US-A 2008-028482 o WO2005/059103); Evento MON88913 (algodón, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4854, descrito en los documentos WO2004/072235 o US-A 2006-059590); Evento MON88302 (colza, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-10955, descrito en el documento WO2011/153186), Evento MON88701 (algodón, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11754, descrito en el documento WO2012/134808), Evento MON89034 (maíz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-7455, descrito en los documentos WO 07/140256 o US-A 2008-260932); Evento MON89788 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-6708, descrito en los documentos US-A 2006-282915 o WO2006/130436); Evento MS11 (colza, control de polinización y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-850 o PTA-2485, descrito en el documento WO2001/031042); Evento MS8 (colza, control de polinización y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito en los documentos WO2001/041558 o US-A 2003-188347); Evento NK603 (maíz, tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-2478, descrito en el documento US-A 2007-292854); Evento PE-7 (arroz, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2008/114282); Evento RF3 (colza, control de polinización y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito en los documentos WO2001/041558 o US-A 2003-188347); Evento RT73 (colza, tolerancia a herbicidas, no depositado, descrito en los documentos WO2002/036831 o US-A 2008-070260); Evento SYHT0H2 / SYN-000H2-5 (soja, tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11226, descrito en el documento WO2012/082548), Evento T227-1 (remolacha azucarera, tolerancia a herbicidas, no depositado, descrita en los documentos WO2002/44407 o US-A 2009-265817); Evento T25 (maíz, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos US-A 2001-029014 o WO2001/051654); Evento T304-40 (algodón, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8171, descrito en los documentos US-A 2010-077501 o WO2008/122406); Evento T342-142 (algodón, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO2006/128568); Evento TC1507 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, no depositado, descrito en los documentos US-A 2005-039226 o WO2004/099447); Evento VIP1034 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3925., descrito en el documento WO2003/052073), Evento 32316 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11507, descrito en el documento WO2011/084632), Evento 4114 (maíz, control de insectos y tolerancia a herbicidas, depositado como PTA-11506, descrito en el documento WO2011/084621), evento EE-GM3 / FG72 (soja, tolerancia a herbicidas, número de acceso ATCC PTA-11041) opcionalmente apilado con el evento EE-GM1/^lL27 o evento EE-GM2/LL55 (documento WO2011/063413A2), evento DAS-68416-4 (soja, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-10442, WO2011/066360A1), evento DAS-68416-4 (soja, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-10442, documento WO2011/066384A1), evento DP-040416-8 (maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA11508, documento WO2011/075593A1), evento DP-043A47-3 (maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA-11509, documento WO2011/075595A1), evento DP-004114-3 (maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA-11506, documento WO2011/084621A1), evento DP-032316-8 (maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA-11507, documento WO2011/084632A1), evento MON-88302-9 (colza, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-10955, documento WO2011/153186A1), evento DAS-21606-3 (soja, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-11028, documento WO2012/033794A2), evento MON-87712-4 (soja, rasgo de calidad, núm. de acceso ATCC PTA-10296, documento WO2012/051199A2), evento DAS-44406-6 (soja, apilamiento de tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-11336, documento WO2012/075426A1), evento DAS-14536-7 (soja, apilamiento de tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-11335, documento WO2012/075429A1), evento SYN-000H2-5 (soja, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-11226, documento WO2012/082548A2), evento DP-061061-7 (colza, tolerancia a herbicidas, sin número de depósito disponible, documento WO2012071039A1), evento DP-073496-4 (colza, tolerancia a herbicidas, sin número de depósito disponible, documento US2012131692), evento 8264.44.06.1 (soja, apilamiento de tolerancia a herbicidas, núm. de acceso PTA-11336, documento WO2012075426A2), evento 8291.45.36.2 (soja, apilamiento de tolerancia a herbicidas, núm. de acceso. PTA-11335, documento WO2012075429A2), evento Sy Ht 0H2 (soja, núm. de acceso ATCC PTA-11226, documento WO2012/082548A2), evento MON88701 (algodón, núm. de acceso ATCC PTA-11754, documento WO2012/134808A1), evento KK179-2 (alfalfa, núm. de acceso ATCC PTA-11833, documento WO2013/003558A1), evento pDAB8264.42.32.1 (soja, apilamiento de tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-11993, documento WO2013/010094A1), evento MZDT09Y (maíz, núm. de acceso ATCC PTA-13025, documento WO2013/012775A1), evento 4114 (Maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA-11506) documento WO201314901, evento MON87411 (Maíz, núm. de acceso ATCC PTA-12669) documento WO2013169923, evento A26-5 (Algodón, control de insectos) documento WO2013170398, evento A2-6 (Algodón, control de insectos) documento WO2013170399, evento 9582.816.15.1 (soja, control de insectos, tolerancia a herbicidas), núm. de acceso ATCC PTA-12588) documento WO2014004458, evento 33121 (Maíz, control de insectos, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-13392) documento WO2014116854, evento 32218 (control de insectos en maíz, tolerancia a herbicidas, núm. de acceso ATCC PTA-13391) documento WO2014116989, evento "SPT-7R-949D SPT-7R-1425D" (Esterilidad masculina del arroz) documento WO2014154115, evento MON87751 (Soja, núm. de acceso ATCC PYA-120166) documento WO2014201235, evento "Pp009-401 Pp009-415 Pp009-469" (césped, núm. de acceso ATCC PTA-120354, PTA-120353, PTA-120355) documento WO2015006774, evento Bs2-X5 (Tomate, ATCC) documento WO2015017637, evento MON87403 (maíz, rendimiento del grano, núm. de acceso ATCC PTA-13584 documento WO2015053998, evento 32218 (Maíz, control de insectos, núm. de acceso ATCC PTA-13391) documento WO2015112182.

F. Construcciones de polinucleótidos

Los polinucleótidos recombinantes de la invención que codifican los polipéptidos de HPPD pueden modificarse para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos identificados en la presente descripción pueden proporcionarse en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. Un "casete de expresión de plantas" incluye una construcción de ADN, que incluye una construcción de ADN recombinante, que es capaz de resultar en la expresión de un polinucleótido en una célula vegetal. El casete puede incluir en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación de la transcripción (es decir, un promotor, particularmente un promotor heterólogo) unida operativamente a uno o más polinucleótidos de interés, y/o una región de traducción y terminación de la transcripción (es decir, región de terminación) funcional en las plantas. El casete puede contener adicionalmente al menos un polinucleótido adicional para ser introducido en el organismo, tal como un gen de un marcador de selección. Alternativamente, el(los) polinucleótido(s) adicional(es) puede(n) proporcionarse en múltiples casetes de expresión. Tal casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción del(de los) polinucleótido(s) esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un gen quimérico que comprende una secuencia codificante que comprende el ácido nucleico recombinante heterólogo de la invención unido operativamente a un promotor de expresión en plantas y, opcionalmente, una región de poliadenilación y terminación de la transcripción. "Heterólogo" generalmente se refiere al polinucleótido o polipéptido que no es endógeno a la célula o no es endógeno a la ubicación en el genoma nativo en el que está presente, y se añade a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, biobalística, o similares. Por "unido operativamente" se entiende un enlace funcional entre dos polinucleótidos. Por ejemplo, cuando un promotor se une operativamente a una secuencia de ADN, la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN. Se reconoce que los polinucleótidos unidos operativamente pueden ser contiguos o no y, cuando se usan para hacer referencia a la unión de dos regiones codificantes de polipéptidos, los polipéptidos se expresan en el mismo marco de lectura.

El promotor puede ser cualquier secuencia de polinucleótido que muestre actividad transcripcional en las células vegetales, partes de plantas o plantas elegidas. El promotor puede ser nativo o análogo, o exógeno o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN recombinante de la invención. Cuando el promotor es "nativo" o "análogo" a la planta huésped, se entiende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "exógeno" o "heterólogo" a la secuencia de ADN recombinante de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o natural de la secuencia de ADN recombinante unida operativamente de la invención. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser natural, puede estar compuesto por porciones de diversos promotores naturales o puede ser parcial o totalmente sintético. La orientación para el diseño de promotores se proporciona en los estudios de la estructura del promotor, tales como los de Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Además, puede optimizarse la ubicación del promotor con respecto inicio de la transcripción. Véase, por ejemplo, Roberts y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764. Muchos promotores adecuados para su uso en plantas se conocen bien en la técnica.

Por ejemplo, los promotores constitutivos adecuados para su uso en plantas incluyen: los promotores de virus de plantas, tal como el promotor del caulimovirus de la estría clorótica del maní (PC1SV) (patente de Estados Unidos núm. 5,850,019); el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell y otros (1985) Nature 313: 810 812); el promotor 35S descrito en Kay y otros (1987) Science 236: 1299-1302; promotores de los genes de la metiltransferasa del virus Chlorella (patente de Estados Unidos núm. 5,563,328) y el promotor del transcrito de longitud completa del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) (patente de Estados Unidos núm. 5,378,619); los promotores de genes tales como la actina del arroz (McElroy y otros (1990) Plant Cell 2: 163-171 y la patente de Estados Unidos 5,641,876); ubiquitina (Christensen y otros (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) y Grefen y otros (2010) Plant J, 64: 355-365; pEMU (Last y otros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten y otros (1984) EMBO J. 3:2723-2730 y patente de Estados Unidos 5,510,474); histona H3 del maíz (Lepetit y otros (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 y Atanasova y otros (1992) Plant J. 2(3):291-300); ALS3 de Brassica napus (solicitud del PCT WO97/41228); un gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa de plantas (RuBisCO); el circovirus (documento AU 689 311) o el virus del mosaico de las venas de la yuca (CsVMV, documento US 7,053,205); y promotores de diversos genes de Agrobacterium (véanse las patentes de Estados Unidos núm. 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; y 5,428,147).

Los promotores inducibles adecuados para su uso en plantas incluyen: el promotor del sistema ACE1 que responde al cobre (Met y otros (1993) PNAS 90:4567-4571); el promotor del gen In2 del maíz que responde a los compuestos protectores de herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey y otros (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 y Gatz y otros (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); y el promotor del represor Tet del Tn10 (Gatz y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Otro promotor inducible para su uso en plantas es uno que responde a un agente inductor al que las plantas normalmente no responden. Un promotor inducible ilustrativo de este tipo es el promotor inducible de un gen de hormona esteroide, cuya actividad transcripcional se induce por una hormona glucocorticoide Schena y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421) o la reciente aplicación de un activador de la transcripción quimérico, XVE, para su uso en un sistema de expresión de plantas inducible basado en receptores de estrógenos, activado por estradiol (Zuo y otros (2000) Plant J., 24:265-273). Otros promotores inducibles para su uso en plantas se describen en los documentos E^p332104, PCT WO 93/21334 y P^cT WO 97/06269. También pueden usarse promotores compuestos por porciones de otros promotores y promotores parcial o totalmente sintéticos. Véase, por ejemplo, Ni y otros (1995) Plant J. 7:661-676 y el documento PCT WO 95/14098 que describen tales promotores para su uso en plantas.

En una modalidad de esta invención, puede usarse una secuencia promotora específica para regiones particulares o tejidos de plantas, para expresar las proteínas HPPD, tal como promotores específicos para semillas (Datla, R. y otros, 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), especialmente el promotor de napina (documento EP 255 378 A1), el promotor de la faseolina, el promotor de la glutenina, el promotor de la heliantinina (documento WO92/17580), el promotor de la albúmina (documento WO98/45460), el promotor de la oleosina (documento WO98/45461), el promotor SAT1 o el promotor SAT3 (documento PCT/US98/06978).

También puede usarse un promotor inducible elegido ventajosamente entre los promotores de la fenilalanina amoniaco liasa (PAL), HMG-CoA reductasa (HMG), quitinasa, glucanasa, inhibidor de proteinasa (PI), gen de la familia PR1, nopalina sintasa (nos) y vspB (documento US 5670349, Tabla 3), el promotor HMG2 (documento US 5 670 349), el promotor de la beta galactosidasa de manzana (ABG1) y el promotor de la aminociclopropano carboxilato sintasa de manzana (ACC sintasa) (documento WO98/45445). Pueden usarse múltiples promotores en las construcciones de la invención, incluso en sucesión.

El promotor puede incluir, o modificarse para incluir, uno o más elementos potenciadores. En algunas modalidades, el promotor puede incluir una pluralidad de elementos potenciadores. Los promotores que contienen elementos potenciadores proporcionan niveles de transcripción más altos en comparación con los promotores que no los incluyen. Los elementos potenciadores adecuados para su uso en plantas incluyen el elemento potenciador del PC1SV (patente de Estados Unidos núm. 5,850,019), el elemento potenciador 35S del CaMV (patente de Estados Unidos núm. 5,106,739 y 5,164,316) y el elemento potenciador de FMV (Maiti y otros (1997) Transgenic Res. 6:143-156); el activador de la traducción del virus del mosaico del tabaco (TMV) descrito en la solicitud WO87/07644, o del virus del grabado del tabaco (TEV) descrito por Carrington y Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por ejemplo, o intrones tales como el intrón adh1 del maíz o el intrón 1 de la actina del arroz. Véanse también los documentos PCT WO96/23898, WO2012/021794, WO2012/021797, WO2011/084370, y WO2011/028914.

A menudo, tales construcciones pueden contener regiones 5' y 3' no traducidas. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a determinadas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plasto), retículo endoplásmico, o aparato de Golgi, o para la secreción. Por ejemplo, la construcción puede modificarse genéticamente para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se conoce o se sospecha que resulte en un transporte de péptidos cotraduccional o postraduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto típicamente implica la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glucosilación resultante. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, resulta en una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen al transporte y/o la glucosilación mediante el paso al retículo endoplásmico, el paso a las vacuolas, los plastos que incluyen cloroplastos, mitocondrias, y similares. También puede preferirse modificar genéticamente el casete de expresión de plantas para que contenga un intrón, de tal manera que se requiere el procesamiento del ARNm del intrón para la expresión.

Por "región 3' no traducida" se entiende un polinucleótido ubicado aguas abajo de una secuencia codificante. Las secuencias señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm son regiones 3' no traducidas. Por "región 5' no traducida" se entiende un polinucleótido ubicado aguas arriba de una secuencia codificante.

Otros elementos no traducidos aguas arriba o aguas abajo incluyen potenciadores. Los potenciadores son polinucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. Los potenciadores se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de la presente invención o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y otros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y otros (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y otros (1990) Gene 91:151-158; Ballas y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi y otros (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639; y la solicitud de patente europea EP 0633317 A1.

En un aspecto de la invención, se diseñan secuencias de ADN sintético para un polipéptido dado, tal como los polipéptidos recombinantes de la invención. La expresión del marco de lectura abierto de la secuencia de ADN sintético en una célula resulta en la producción del polipéptido recombinante de la invención. Las secuencias sintéticas de ADN pueden ser útiles para eliminar simplemente sitios de endonucleasas de restricción no deseados, para facilitar las estrategias de clonación de ADN, para alterar o eliminar cualquier sesgo de codón potencial, para alterar o mejorar el contenido de GC, para eliminar o alterar marcos de lectura alternativos y/o para alterar o eliminar sitios de reconocimiento de corte y empalme de intrones/exones, sitios de poliadenilación, secuencias Shine-Dalgarno, elementos promotores no deseados y similares, que pueden estar presentes en una secuencia de ADN nativa. También es posible que las secuencias de ADN sintéticas puedan utilizarse para introducir otras mejoras en una secuencia de ADN, tal como la introducción de una secuencia de intrones, la creación de una secuencia de ADN que se exprese como una fusión de proteínas con secuencias dirigidas a orgánulos, tales como los péptidos de tránsito de cloroplastos, péptidos dirigidos a apoplasto/vacuolas, o secuencias peptídicas que resultan en la retención del péptido resultante en el retículo endoplásmico. Los genes sintéticos pueden sintetizarse también mediante el uso de codones preferentes de la célula huésped para mejorar la expresión, o pueden sintetizarse mediante el uso de codones en una frecuencia de uso de codones preferente del huésped. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11; patentes de Estados Unidos núm. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; y 5,436,391, solicitudes publicadas de Estados Unidos 20040005600 y 20010003849, y Murray y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una modalidad, los polinucleótidos de interés se dirigen al cloroplasto para su expresión. De esta manera, donde el polinucleótido de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un polinucleótido que codifica un péptido de tránsito para dirigir el nucleótido de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne y otros (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark y otros (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa y otros (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer y otros (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah y otros (1986) Science 233:478-481.

Los polinucleótidos de interés que se dirigirán al cloroplasto pueden optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los polinucleótidos de interés pueden sintetizarse mediante el uso de codones preferentes del cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,380,831.

Este casete de expresión en plantas puede insertarse en un vector de transformación de plantas. Por "vector de transformación" se entiende una molécula de ADN que permite la transformación de una célula. Tal molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión de plantas y puede organizarse en más de una molécula de ADN vector. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones que actúan en cis y en trans requeridas para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de polinucleótido diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña.

El vector de transformación de plantas comprende uno o más vectores de ADN para lograr la transformación de plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan en la técnica vectores binarios. Los vectores binarios, así como también los vectores con plásmidos auxiliares, se usan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen típicamente un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia del T-DNA (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador de selección que se modifica genéticamente para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "polinucleótido de interés" (un polinucleótido diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias que se requieren para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de manera que permitan una transferencia eficiente a las células vegetales y la expresión en estas. Por ejemplo, la secuencia del marcador de selección y la secuencia de interés se ubican entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmídico contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia del T-DNA desde Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias bordes y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para la introducción de polinucleótidos en las plantas por otros métodos tales como biobalística, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

G. Transformación de plantas

Los métodos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de manera tal que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, solo que la construcción de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Se conocen en la técnica métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas que incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. Véanse, por ejemplo, los métodos para transformar células vegetales y regenerar plantas descritos en los documentos: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159 A1, EP 604 662 A1, EP 672 752 A1, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174 A1, EP 486 233 A1, EP 486 234 A1, EP 539 563 A1, EP 674 725 A1, WO91/02071, WO95/06128, WO2011/095460, WO2012006439A2, WO2012006443A2, WO2012015039A1, WO2012019660A1, WO2012021494A1, WO2012064827A1, WO2012075562A1, WO2012077664A1, WO2012083137A1, WO2012084962A1, WO2012092577A1, WO2012109947A1, WO2012129443A2, WO2012138629A2, WO2012139416A1, WO2012149011A1, WO2013014585A1, WO2013025670A1, WO2013033308A2, WO2013066007A1, WO2013077420A1, WO2013090734A1, WO2013149726A1, WO2013180311A1, WO2014029044A1, WO2014029045A1, WO2014062036A1, WO2014065857A1, WO2014100234A1, WO2014100406A1, WO2014123208A1, WO2014143304A1, WO2014144513A2, WO2014157541A1, WO2014200842A2, WO2015051083A1, WO2015077620A1, WO2015085990A1, WO2015099674A1, WO2015118640A1, WO2015119166A1.

En general, los métodos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a las células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (en dependencia del gen marcador de selección) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Subsecuentemente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Luego los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar los brotes o plántulas enraizados. La plántula transgénica luego se cultiva para convertirse en plantas maduras y producir semillas fértiles (por ejemplo Hiei y otros (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y otros (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo o tejido o grupo de células diana en cuestión. La capacidad de matar las células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen resulta en cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. Pueden usarse métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo de interés integrado en el genoma de la planta transgénica.

La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), el bombardeo de células vegetales con ADN exógeno heterólogo adherido a partículas, y otros métodos diversos de mediación directa sin partículas (por ejemplo, Hiei y otros (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y otros (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir el Ad N.

Los métodos para la transformación de cloroplastos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en suministrar, con una pistola de partículas, el ADN que contiene un marcador de selección, y dirigir el ADN al genoma del plasto a través de la recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plastos puede alcanzarse mediante la transactivación de un transgén de plastos silente mediante la expresión preferente en el tejido de una ARN polimerasa dirigida a plastos y codificada en el núcleo. Este sistema se informó en McBride y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91:7301-7305.

Las células vegetales que se han transformado pueden cultivarse para convertirse en plantas, en concordancia con formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick y otros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Luego estas plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y puede identificarse el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y luego se cosechan las semillas para asegurar que se logró la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos recombinante de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma. En diversas modalidades, las semillas pueden recubrirse con al menos un fungicida y/o al menos un insecticida, al menos un herbicida y/o al menos un compuesto protector, o cualquier combinación de los mismos.

H. Evaluación de la transformación de plantas

Tras la introducción de ADN exógeno heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un método rápido para cribar las células, tejidos o brotes transformados para detectar la presencia del gen incorporado en la etapa anterior antes de trasplantarlos al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). La PCR se lleva a cabo mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen de interés o del vector de Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se hidroliza enzimáticamente con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Luego la membrana o "transferencia" puede hibridarse con sondas de, por ejemplo, un fragmento de ADN diana radiomarcado con P32 para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído, y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con los procedimientos estándar que se usan rutinariamente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por las secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención se prueba luego mediante la hibridación del filtro con una sonda radiactiva obtenida mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell (2001) supra). El ARN también puede detectarse y/o cuantificarse mediante el uso de PCR con transcripción inversa como se conoce en la técnica (por ejemplo, Green y Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY).

La transferencia Western, el ELISA, pruebas de flujo lateral, y ensayos bioquímicos y similares pueden llevarse a cabo en las plantas transgénicas para determinar la presencia de la proteína codificada por el gen de tolerancia a herbicidas mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell (2001) supra) mediante el uso de anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína de tolerancia a herbicidas.

En un aspecto de la invención, los genes HPPD descritos en la presente descripción son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales.

I. Uso como un marcador para la transformación

La invención también se refiere al uso, en un método de transformación de plantas, de un ácido nucleico que codifica una HPPD como gen marcador o como una secuencia codificante que posibilita conferir a la planta tolerancia a herbicidas que son inhibidores de la HPPD, y el uso de uno o más inhibidores de la HPPD en plantas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6,791,014.

En esta modalidad, puede introducirse un inhibidor de la HPPD en el medio de cultivo de las células vegetales competentes para blanquear dichas células antes de la etapa de transformación. Luego, las células competentes blanqueadas se transforman con el gen de tolerancia a los inhibidores de la HPPD, como un marcador de selección, y las células transformadas que han integrado dicho marcador de selección en su genoma se vuelven verdes, lo que permite su selección. Tal proceso posibilita disminuir el tiempo requerido para seleccionar las células transformadas. Por tanto, una modalidad de la presente invención consiste en un método para transformar células vegetales mediante la introducción de un gen heterólogo en dichas células vegetales con un gen de tolerancia a inhibidores de la HPPD como marcadores de selección, en donde el método comprende preparar y cultivar células vegetales competentes capaces de recibir el gen heterólogo en un medio adecuado e introducir una cantidad adecuada del inhibidor de la HPPD en el medio de cultivo adecuado de las células vegetales competentes. Luego, las células competentes se transforman con el gen heterólogo y el marcador de selección, y las células transformadas que comprenden el gen heterólogo se cultivan en un medio adecuado y los transformantes se seleccionan a partir del mismo. Luego, las células transformadas pueden regenerarse en una planta transformada fértil.

J. Plantas y Partes de Plantas

Por "planta" se entiende plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y la descendencia de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen). La presente invención puede usarse para la introducción de polinucleótidos en cualquier especie de planta, que incluye, pero no se limita a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, boniato, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, marañón, macadamia, almendras, avena, verduras y hortalizas, ornamentales, y coníferas.

Las verduras y hortalizas incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes, y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo, y melón almizclero. Las ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettia, y crisantemo. También son de interés las plantas de cultivo, que incluyen, por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimiento, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc. Esta invención es adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas, que incluyen, entre otros, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, ñame, cebolla, plátano, coco y dátiles. K. Métodos para aumentar el rendimiento de las plantas

Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden proporcionar una planta que comprende, o introducir en una planta o célula vegetal, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HPPD, cultivar la planta o una semilla de la misma en un campo y producir una cosecha a partir de dichas plantas o semillas. Como se define en la presente descripción, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de las plantas tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de las plantas puede aumentar el rendimiento de las verduras para el consumo humano o animal. Adicionalmente, el aumento de la biomasa de las hojas puede usarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluye, pero no se limita a, al menos 1 % de aumento, al menos 3 % de aumento, al menos 5 % de aumento, al menos 10 % de aumento, al menos 20 % de aumento, al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 % o un aumento mayor.

En métodos específicos, la planta que comprende una secuencia de HPPD se trata con una concentración efectiva de un herbicida inhibidor de la HPPD, tal como uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD seleccionados del grupo que consiste en los herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3)-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metiMH-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metiMH-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas, donde la aplicación del herbicida resulta un rendimiento potenciado de la planta.

También se proporcionan métodos para conferir tolerancia a herbicidas en una planta o parte de una planta. En tales métodos, se introduce en la planta una secuencia de nucleótidos recombinante de la invención que codifica una HPPD, en donde la expresión del polinucleótido resulta en la tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD. Las plantas producidas a través de este método pueden tratarse con una concentración efectiva de un herbicida (tal como uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD seleccionados del grupo que consiste en los herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2 -il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas y muestran una tolerancia aumentada al herbicida. Una "concentración efectiva" de un herbicida, en esta solicitud de patente, es una cantidad suficiente para ralentizar o detener el crecimiento de plantas o partes de plantas que no son naturalmente tolerantes o que no se han vuelto tolerantes al herbicida.

L. Métodos de control de malas hierbas en un campo.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para controlar plantas no deseadas o para regular el crecimiento de plantas en cultivos de plantas que comprenden una secuencia de nucleótidos recombinante de la invención que codifica un polipéptido de HPPD, donde uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD, por ejemplo, uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD seleccionados de la clase de tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas, se aplican a las plantas (por ejemplo, malezas tales como las malas hierbas monocotiledóneas o dicotiledóneas o cultivos de plantas no deseados), a las semillas (por ejemplo, granos, semillas o propágulos vegetativos tales como tubérculos o partes de brotes con yemas) o al área en la que crecen las plantas (por ejemplo, el área de cultivo). En este contexto, una concentración efectiva de uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD, por ejemplo, uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD seleccionados del grupo que consiste en herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de las tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt.

2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas pueden aplicarse, por ejemplo, previo a la plantación (si procede también mediante la incorporación al suelo), preemergente y postemergente, y pueden combinarse con la aplicación de otros herbicidas a los que el cultivo es naturalmente tolerante, o al que es resistente a través de la expresión de uno o más transgenes de resistencia a herbicidas. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2004/0058427 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. WO98/20144. Por "concentración efectiva" se entiende la concentración que controla el crecimiento o la propagación de malas hierbas u otras plantas no transformadas sin afectar significativamente a la planta o semilla de planta tolerante al inhibidor de la HPPD. Los expertos en la técnica entienden que la aplicación de herbicidas puede tomar muchas formas diferentes y puede tener lugar en muchos momentos diferentes antes y/o durante el proceso de plantación de semillas y crecimiento. La aplicación "preemergente" se refiere a un herbicida que se aplica a un área de interés (por ejemplo, un campo o área de cultivo) antes de que una planta emerja visiblemente del suelo. La aplicación "postemergente" se refiere a un herbicida que se aplica a un área después de que una planta emerja visiblemente del suelo. En algunos casos, los términos "preemergente y "postemergente" se usan con referencia a una mala hierba en un área de interés y, en algunos casos, estos términos se usan con referencia a una planta de cultivo en un área de interés. Cuando se usan con referencia a una mala hierba, estos términos pueden aplicarse a un tipo particular de mala hierba o especie de mala hierba que está presente o se cree que está presente en el área de interés. La "incorporación previa a la plantación" de un herbicida implica la incorporación de compuestos en el suelo antes de la plantación.

Por tanto, la presente invención comprende un método para controlar las malas hierbas en un campo, que comprende plantar en un campo una planta o una semilla de la misma que comprende un polipéptido de HPPD y aplicar a dicha planta, o área que rodea dicha planta, una concentración efectiva de uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.

En una modalidad de esta invención, un campo que se plantará con plantas (tales como, por ejemplo, plantas de soja, algodón, maíz o trigo, por ejemplo) que contienen una secuencia de nucleótidos de la HPPD de la invención, puede tratarse con un herbicida inhibidor de la HPPD, tal como el isoxaflutol (IFT), antes de plantar las plantas o sembrar las semillas, lo que limpia el campo de las malas hierbas que mueren por el herbicida inhibidor de la HPPD, lo que permite prácticas de labranza cero, seguidas de la plantación o siembra de las plantas en ese mismo campo previamente tratado posteriormente (aplicación de desecación mediante el uso de un herbicida inhibidor de la HPPD). La actividad residual del IFT también protegerá a las plantas emergentes y en crecimiento de la competencia de las malas hierbas en las primeras etapas de crecimiento. Una vez que las plantas tienen determinado tamaño y las malas hierbas tienden a reaparecer, puede aplicarse glufosinato o glifosato, o un herbicida inhibidor de la HPPD o una mezcla de un herbicida inhibidor de la HPPD con otro herbicida tal como el glifosato, como herbicida postemergente, sobre la parte superior de las plantas, cuando tales plantas son tolerantes a dichos herbicidas.

En otra modalidad de esta invención, un campo en el que se sembraron semillas que contenían una secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención, puede tratarse con un herbicida inhibidor de la HPPD, tal como el IFT, antes de que emerjan las plantas pero después de sembrar las semillas (pueden eliminarse las malas hierbas del campo antes de sembrar mediante el uso de otros medios, típicamente prácticas de labranza convencionales como arado, arado con cincel o preparación del semillero), donde la actividad residual mantendrá el campo libre de malas hierbas eliminadas por el herbicida para que las plantas emergentes y en crecimiento no compitan con las malas hierbas (aplicación preemergente de un herbicida inhibidor de la HPPD). Una vez que las plantas tienen determinado tamaño y las malas hierbas tienden a reaparecer, puede aplicarse glufosinato o glifosato, o un herbicida inhibidor de la HPPD o una mezcla de un herbicida inhibidor de la HPP^dcon otro herbicida tal como el glifosato, como herbicida postemergente, sobre la parte superior de las plantas, cuando tales plantas son tolerantes a dichos herbicidas.

En otra modalidad de esta invención, las plantas que contienen una secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención, pueden tratarse con un herbicida inhibidor de la HPPD, sobre la parte superior de las plantas que han emergido de las semillas que se sembraron, lo que limpia el campo de malas hierbas muertas por el herbicida inhibidor de la HPPD, cuya aplicación puede ser junto con (por ejemplo, en una mezcla en un tanque de aspersión), seguida o precedida por un tratamiento con glifosato o glufosinato, como herbicida postemergente, sobre la parte superior de las plantas (aplicación postemergente de un herbicida inhibidor de la HPPD (con o sin glifosato)), cuando tales plantas son tolerantes a dichos herbicidas.

Los ejemplos de representantes individuales de las malas hierbas monocotiledóneas y dicotiledóneas que pueden controlarse con un herbicida inhibidor de la HPPD incluyen:

Malezas monocotiledóneas de los géneros: Aegilops, Agropyron, Agrostis, Alopecurus, Apera, Avena, Brachiaria, Bromus, Cenchrus, Commelina, Cynodon, Cyperus, Dactyloctenium, Digitaria, Echinochloa, Eleocharis, Eleusine, Eragrostis, Eriochloa, Festuca, Fimbristylis, Heteranthera, Imperata, Ischaemum, Leptochloa, Lolium, Monochoria, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sorghum. Malas hierbas dicotiledóneas de los géneros: Abutilon, Amaranthus, Ambrosia, Anoda, Anthemis, Aphanes, Artemisia, Atriplex, Bellis, Bidens, Capsella, Carduus, Cassia, Centaurea, Chenopodium, Cirsium, Convolvulus, Datura, Desmodium, Emex, Erysimum, Euphorbia, Galeopsis, Galinsoga, Galium, Hibiscus, Ipomoea, Kochia, Lamium, Lepidium, Lindernia, Matricaria, Mentha, Mercurialis, Mullugo, Myosotis, Papaver, Pharbitis, Plantago, Polygonum, Portulaca, Ranunculus, Raphanus, Rorippa, Rotala, Rumex, Salsola, Senecio, Sesbania, Sida, Sinapis, Solanum, Sonchus, Sphenoclea, Stellaria, Taraxacum, Thlaspi, Trifolium, Urtica, Veronica, Viola, Xanthium.

Los herbicidas inhibidores de la HPPD útiles en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, herbicidas inhibidores de la HPPD de la clase de tricetonas (preferentemente benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilos, isoxazoles (preferentemente isoxaflutol), hidroxipirazoles (preferentemente pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato), N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas (preferentemente 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (en los sucesivo también denominada "Cmpt. 2"), N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas (preferentemente 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metiMH-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (en lo sucesivo también denominada "Cmpt. 1"); 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, las triazinonas y las pirazolonas pueden formularse de diversas formas, en dependencia de los parámetros biológicos y/o fisicoquímicos predominantes. Ejemplos de posibles formulaciones son: polvos humectables (WP), polvos solubles en agua (SP), concentrados solubles en agua, concentrados emulsionables (EC), emulsiones (EW), tales como emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite, soluciones para aspersión, suspensiones concentradas (SC), dispersiones a base de aceite o agua, soluciones miscibles en aceite, suspensiones en cápsulas (CS), polvos (DP), productos para el recubrimiento de semillas, gránulos para aplicación al voleo y en el suelo, gránulos (GR) en forma de microgránulos, gránulos para aspersión, gránulos recubiertos y gránulos de adsorción, gránulos dispersables en agua (WG), gránulos solubles en agua (SG), formulaciones ULV, microcápsulas y ceras.

Estos tipos individuales de formulación se conocen en principio y se describen, por ejemplo, en: Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], volumen 7, C. Hanser Verlag Munich, 4.a ed. 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, NY, 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3.a ed. 1979, G. Goodwin Ltd. Londres.

Los auxiliares de la formulación requeridos, tales como materiales inertes, tensioactivos, disolventes y aditivos adicionales, también se conocen y se describen, por ejemplo, en: Watkins, “Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2.a ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2.a ed., J. Wiley & Sons, NY.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2.a edición, Interscience, NY 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley y Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., NY 1964; Schonfeldt, "Grenzflachenaktive Áthylenoxidaddukte" [Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volumen 7, C. Hanser Verlag Munich, 4.a ed. 1986.

Sobre la base de estas formulaciones, también es posible preparar combinaciones con otras sustancias pesticidas activas tales como, por ejemplo, insecticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas, y con compuestos protectores, fertilizantes y/o reguladores del crecimiento, por ejemplo, en forma de una mezcla preparada o una mezcla en tanque.

M. Métodos de introducción del gen de la invención en otra planta

También se proporcionan en este documento métodos para introducir la secuencia de nucleótidos de HPPD recombinante de la invención en otra planta. La secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención, o un fragmento de la misma, puede introducirse en una segunda planta mediante selección recurrente, retrocruzamiento, mejoramiento genealógico, selección de línea, selección por masa, mejoramiento por mutación y/o selección asistida por marcadores genéticos.

Por tanto, en una modalidad, los métodos de la invención comprenden cruzar una primera planta que comprende una secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención con una segunda planta para producir la descendencia de plantas F1 y seleccionar la descendencia de plantas F1 que sean tolerantes a un herbicida inhibidor de la HPPD o que comprendan la secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención. Los métodos pueden comprender además cruzar las plantas de la descendencia seleccionadas con la primera planta que comprende la secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención, para producir plantas descendientes del retrocruzamiento y seleccionar las plantas descendientes del retrocruzamiento que sean tolerantes a un herbicida inhibidor de la HPPD o que comprendan la secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención. Los métodos para evaluar la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD se proporcionan en otra parte de la presente descripción. Los métodos pueden comprender además repetir estas etapas una o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas descendientes de un segundo retrocruzamiento, o superior, que sean tolerantes a un herbicida inhibidor de la HPPD o que comprendan la secuencia de nucleótidos de la HPPD recombinante de la invención.

En el método de la presente invención puede usarse cualquier método de mejoramiento que implique la selección de plantas para el fenotipo deseado. En algunas modalidades, las plantas F1 pueden autopolinizarse para producir una generación F2 segregante. Luego, pueden seleccionarse plantas individuales que representen el fenotipo deseado (por ejemplo, tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD) en cada generación (F3, F4, F5, etc.) hasta que los rasgos sean homocigóticos o se fijen dentro de una población mejorada.

La segunda planta puede ser una planta que tenga un rasgo deseado, tal como tolerancia a herbicidas, tolerancia a insectos, tolerancia a la sequía, control de nematodos, eficiencia en el uso del agua, eficiencia en el uso del nitrógeno, mejor valor nutricional, resistencia a enfermedades, mejor fotosíntesis, mejor calidad de fibra, tolerancia al estrés, mejor reproducción, y similares. La segunda planta puede ser un evento de élite como se describe en otra parte de la presente descripción.

En diversas modalidades, las partes de la planta (plantas completas, órganos de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y similares) pueden cosecharse del cruce resultante y propagarse o recolectarse para su uso posterior (tal como alimentos, piensos, biocombustibles, aceite, harina, sémola, etc.).

N. Métodos de obtención de un producto vegetal.

La presente descripción también se refiere a un proceso para obtener un producto básico, que comprende cosechar y/o moler los granos de un cultivo que comprende una secuencia de la HPPD recombinante de la invención para obtener el producto básico. Productos y/o composiciones de interés importantes desde el punto de vista agronómico y comercial, incluyen, pero no se limitan a, piensos, productos básicos y productos y subproductos vegetales destinados al uso como alimento para el consumo humano o para uso en composiciones y productos básicos destinados al consumo humano, particularmente productos de granos/semillas desvitalizados, que incluyen productos semiprocesados producidos a partir de tales granos/semillas, en donde dicho producto es o comprende semillas o granos completos o procesados, piensos, sémola de maíz o soja, harina de maíz o soja, maíz, almidón de maíz, sémola de soja, harina de soja, copos, concentrado de proteína de soja, aislado de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, cosméticos, productos para el cuidado del cabello, mantequilla de nuez de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolizada, cobertura batida, manteca vegetal, lecitina, soja integral comestible (sin procesar, tostada o como edamame), yogur de soja, queso de soja, tofu, yuba, así como también granos cocidos, pulidos, cocidos al vapor, horneados o sancochados, y similares, están destinados a estar dentro del alcance de la presente descripción si estos productos y composiciones de interés contienen cantidades detectables de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos establecidas en la presente descripción como diagnóstico para cualquier planta que contenga tales secuencias de nucleótidos.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración.

Experimentos

Información general

Ejemplo 1: Creación de polipéptidos de HPPD mutados mediante mutagénesis dirigida al sitio

Ejemplo 2: Clonación, expresión y purificación de polipéptidos de HPPD mutantes y de tipo salvaje recombinantes

Ejemplo 3: Ensayo de enzima HPPD para analizar polipéptidos de HPPD mutantes con mejor tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD

Ejemplo 4: Mejor tolerancia a herbicidas mediada por intercambios de residuos en los polipéptidos de HPPD Ejemplo 5: Ensayo de color marrón para probar polipéptidos de HPPD mutantes, tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD

Ejemplo 6: Transformación de la soja y tolerancia de las plantas de soja T0

Ejemplo 7: Establecimiento y selección de las plantas de algodón T0

Ejemplo 8: Transformación de células vegetales de maíz mediante transformación mediada por Agrobacterium Ejemplo 9: Tolerancia de las plantas de soja T1 a herbicidas inhibidores de la HPPD / Pruebas de campo Ejemplo 1. Creación de polipéptidos de HPPD mutados mediante mutagénesis dirigida al sitio

La secuencia de nucleótidos de la HPPD de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO: 109), como se describe en el documento WO2009/144079, que codifica el polipéptido de HPPD correspondiente a la s Eq ID NO: 1, se clonó de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica y como se describe en el documento WO2014/043435. La mutagénesis por saturación de sitio, la mutagénesis dirigida al sitio y las variantes combinatorias subsecuentes con una o más mutaciones de la secuencia de ácido nucleico codificante del polipéptido de PfHPPD de tipo salvaje que codifica el polipéptido de HPPD recombinante correspondiente a la SEQ ID NO: 1, se llevaron a cabo mediante el uso de tecnologías de PCR estándar bien conocidas en la técnica (y como se describe igualmente en el documento WO2014/043435). Todos los clones mutantes diseñados y sintetizados se confirmaron mediante secuenciación de ADN mediante el uso de oligonucleótidos específicos de plásmidos. La Tabla 2, más abajo, resume los polipéptidos de HPPD mutantes ilustrativos (SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 108).

Tabla 2: Información general de intercambios de aminoácidos ilustrativos correspondientes a la

aminoácido en la SEQ ID NO:1.

Para mayor claridad, las celdas vacías en la posición de aminoácido respectiva en la SEQ ID NO: 2 a la NO: 108 se definen como idénticas a los aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 1, y se resaltan solo los intercambios en los polipéptidos de HPPD mutantes. Los polipéptidos de HPPD mutantes representados aquí son ejemplos a modo de ilustración, no a modo de limitación.

Ejemplo 2: Clonación, expresión y purificación de polipéptidos de HPPD mutantes y de tipo salvaje recombinantes Todas las secuencias de ácido nucleico codificantes de la HPPD de tipo salvaje y mutante resultantes que codifican el polipéptido de HPPD recombinante se clonaron, produjeron y purificaron mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica (Sambrook y otros , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY). Todas las secuencias de ácidos nucleicos codificantes resultantes se clonaron en el pSE420(RI)NX fusionadas con una etiqueta de His N-terminal (que codifica la secuencia de aminoácidos M1-A2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-), como se describe en el documento WO2014/043435, y se expresaron en Escherichia coli cepa BL21 (DE3) (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania). Para mayor claridad, todas las posiciones enumeradas con los intercambios de aminoácidos respectivos de los polipéptidos de HPPD mutantes en las Tablas 1 a 5 y la Tabla 7, correspondientes a la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 108 en esta invención, se refieren a la secuencia de aminoácidos de la HPPD nativa de tipo salvaje sin la etiqueta His N-terminal correspondiente a la SEQ ID NO: 1. Para la generación de muestras de polipéptido de HPPD purificado, las células se cultivaron durante 3 horas a 37 °C en 5 ml de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina en un matraz de agitación de 50 ml, a 140 rpm. Se usó un ml de este cultivo inicial como inóculo para el cultivo de expresión. Las células se cultivaron durante aproximadamente 3 horas a 37 °C en 100 ml de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina y Hepes 150 mM (Merck, Darmstadt, Alemania) en un matraz de agitación de 500 ml, a 120 rpm. A una DO600 de aproximadamente 0,6, se añadió IPTG (Roth, Karlsruhe, Alemania) a una concentración de 0,4 mM. Después de un cultivo adicional durante 60 min a 37 °C, la temperatura se redujo a 28 °C y el cultivo continuó durante otras 18 h a 140 rpm. Las células se cosecharon mediante centrifugación a 4 °C, 3200 g durante 30 min en tubos Falcon de 50 ml y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C. Las células se lisaron y la proteína etiquetada con His se purificó de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit Ni-NTA Fast Start usado (Qiagen, Hilden, Alemania), con las siguientes adaptaciones para aumentar el rendimiento: las células de 50 ml de cultivo se lisaron en 4 ml y el sobrenadante del lisado se generó mediante centrifugación durante 15 min a 18000 g. La cantidad de matriz en las columnas se aumentó mediante la adición de 1 ml de NiNTA Superflow (Qiagen, Hilden, Alemania) a cada una y se volvió a tamponar ampliamente en Tris 20 mM (pH 7,6) (Merck, Darmstadt, Alemania). Se aplicó el sobrenadante del lisado y la proteína etiquetada con His se unió a la matriz de Ni-NTA mediante incubación durante 1 hora a 4 °C.

Las muestras de proteína resultantes se volvieron a tamponar en Tris 20 mM, glicerol al 20 % (pH 7,8) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos) con el uso de las columnas de centrifugación desalinizadoras Zeba™, 7K MWCO, 10 ml (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos) y se analizaron para determinar la concentración y la pureza de las proteínas a la Abs280 (NANODROP 8000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos) y SDS-PAGE. Las concentraciones de las proteínas purificadas estaban generalmente en el intervalo de 0,6 -4,6 mg/ml con una pureza estimada de aproximadamente el 90 %.

Para la generación del extracto del polipéptido de HPPD crudo en placas de microtitulación (MTP) para la determinación de la actividad residual en ensayos de inhibición, las células se cultivaron en 40 o 150 pl de medio LB que contenía glucosa al 1 % (Merck, Darmstadt, Alemania) y 100 pg/ml de ampicilina en una placa estándar de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos) incubada durante aproximadamente 18 h en una incubadora con humedad a 37 °C. Se añadieron 30 pl de este cultivo inicial a 600 pl de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina y Hepes 150 mM (Merck, Darmstadt, Alemania) como inóculo para el cultivo de expresión en placas de 96 pocillos (pocillos profundos de 2 ml; HJ Bioanalytik, Erkelenz, Alemania). Las placas se sellaron con papel de aluminio y las células se incubaron durante 5 horas a 37 °C en un agitador de placas a 750 rpm. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG en una concentración final de 1 mM seguido de una incubación sellada adicional durante aproximadamente 18 horas a 30 °C en un agitador de placas a 750 rpm.

Las células se cosecharon mediante centrifugación a 4 °C, 2500 g durante 15 min, y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C y se lisaron en 250 pl de BugBuster® 1X (Merck, Darmstadt, Alemania) en Tris 140 mM (pH 7,8), con BNase® diluido 1:25000 (Qiagen, Hilden, Alemania) mediante incubación de las células resuspendidas durante 30 min a 4 °C y 1000 rpm. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación durante 15 min a 4 °C, 2500 g, y se transfirieron 150 pl de sobrenadante a una placa estándar de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos) para su análisis cuádruple subsecuente.

Ejemplo 3: Ensayo de enzima HPPD para analizar los polipéptidos de HPPD mutantes con mejor tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD

La actividad de los polipéptidos de HPPD se determinó en ausencia o presencia de inhibidores de la HPPD mediante el ensayo acoplado a la actividad HPPD (Figura 1).

Para la determinación de la actividad residual, se midió la constante cinética aparente (kap) de la conversión del sustrato determinada como cambios cinéticos en la absorbancia a 320 nm en un ensayo acoplado, en el que el homogentisato (HGA) formado por la HPPD a partir del HPP se convierte directamente en la molécula absorbente maleilacetoacetato (MAA) mediante una segunda enzima homogentisato dioxigenasa (HGD), aplicada en exceso de manera uniforme en todos los ensayos (véase la Figura 1). Las mediciones se realizaron en 384 placas de microtitulación (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) mediante lectores de placas (Tecan infinite M1000 o M1000PRO, Tecan, Mannedorf, Suiza). La relación kcat/kM de una actividad enzimática es proporcional a la constante cinética aparente kap y es proporcional a kcat/kM *[E] ([E] = concentración de enzima). Un inhibidor competitivo exhibe un aumento aparente en la kM y, de esta manera, una disminución recíproca en la kap en concentraciones de sustrato no saturantes. Como las mediciones de kap en presencia y ausencia del inhibidor se realizaron mediante el uso de la misma muestra de enzima, cruda o purificada, y de esta manera, a la misma concentración de enzima, la concentración de enzima se elimina del cálculo de la actividad residual y la relación de ambos kap indica directamente el cambio de la kM debido a la inhibición. Cabe destacar que este concepto se aplica a los pares de enzima/inhibidor que interactúan a manera de "inhibición competitiva", probablemente correcta para casi todas las variantes de polipéptidos e inhibidores descritos en la presente descripción, pero seguro que no con respecto al polipéptido de tipo salvaje, que se inhibe de forma irreversible (para una comparación véase WO2014/043435, Figuras 2 y 3;). Por consiguiente, las actividades residuales del polipéptido de HPPD de tipo salvaje que se refieren a la "inhibición competitiva" y los valores de ki no pueden calcularse correctamente, sin embargo, para los fines de ilustración, se dan valores infundados en la Tabla 3 para el polipéptido de HPPD de tipo salvaje, que se calculan por los cambios iniciales en la señal antes de que tenga lugar la inhibición irreversible.

La solución del ensayo usada para la determinación de las actividades residuales en muestras de polipéptido de HPPD sin procesar estaba compuesta por fosfato de sodio 200 mM (Merck, Darmstadt, Alemania, pH 7,0), MgCh 5 mM (Merck, Darmstadt, Alemania), ascorbato 20 mM (Sigma- Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), DTT 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), Pluronic F-68 al 0,1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), FeSO4 40 |jM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), aproximadamente 8 mg/ml de HGD purificada y concentraciones bajas o altas de sustrato HPP (100 o 400 ^jM) de una solución madre 1 M en DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos) y equilibrada durante 20 minutos en hielo. Para cada muestra de polipéptido de HPPD, se realizaron dos ensayos en cuádruple, en los que 5 j l de la muestra del polipéptido de HPPD se mezclaron primero con 5 j l de tampón (BugBuster® 1X; (Merck, Darmstadt, Alemania); en Tris 140 mM, pH 7,8, con BNase® diluido 1: 25000; Qiagen, Hilden, Alemania)) o 5 j l de inhibidor diluido en el mismo tampón de una solución madre 0,1 M en DMSO (30, 100 o 120 ^jM que resulta en 15, 50 y 60 ^jM en la muestra de polipéptido/inhibidor de la HPPD) en el ensayo de referencia y de inhibición, respectivamente, y subsecuentemente con 10 j l de solución de ensayo. Se siguió el cambio de absorbancia a 320 nm en intervalos de 1 min durante 30 min. Los valores de kap se calcularon como la pendiente de la señal en el tiempo en la fase temprana de la reacción cinética, por lo general durante los primeros 5 a 10 minutos de las mediciones (compárese con la Figura 3). Adicionalmente y de acuerdo con la actividad residual calculada, la conversión total, es decir, el cambio absoluto en la señal, en el período de tiempo de 30 min se monitoreó como medida del recambio, y se calculó un recambio residual al dividir el cambio en la señal en presencia del inhibidor por el cambio en la señal en la muestra de referencia sin inhibidor.

Las soluciones de ensayo utilizadas para la determinación de los valores de ki se componían de la misma manera y contenían seis concentraciones diferentes de sustrato HPP (0 - 1350 j M) para cada una de las cuatro concentraciones de inhibidor probadas. Los inhibidores se diluyeron en Tris 140 mM, Pluronic F-68 al 0,05 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos) y se aplicaron en concentraciones adoptadas para los respectivos pares de polipéptido/inhibidor de la HPPD, para generar datos dinámicos (Figura 4 a-d); generalmente, sus concentraciones en la muestra de polipéptido/inhibidor de la HPPD estaban en el intervalo de 0 a 0,0012 M.

Ejemplo 4: Mejor tolerancia a herbicidas, mediada por intercambios de residuos en los polipéptidos de HPPD

Cuando se determinó la tolerancia de los polipéptidos de HPPD mutantes frente a diferentes clases químicas disponibles de herbicidas inhibidores de la HPPD (tricetonas, isoxazoles, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas o N-(tetrazol-5-il)-arilcarboxamidas), se hizo evidente que algunas de las nuevas modalidades en esta invención no solo son significativamente mejores en comparación con la HPPD de tipo salvaje de referencia (SEQ ID NO: 1), sino también, inesperadamente, mejores que los polipéptidos de HPPD mutantes de la técnica anterior (como, por ejemplo, los que se describen en el documento WO2014/043435) con la SEQ ID NO:2 en esta invención como ejemplo.

Como se destaca en la Tabla 3, los polipéptidos de HPPD mutantes de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO:2 en esta invención contienen intercambios de residuos en las posiciones 335, 336, 339 y 340. En base al polipéptido de HPPD mutante que comprende los intercambios de residuos 335 (E=>P), 336 (G=>D/H), 337 (N=>S), la introducción de intercambios de residuos adicionales en la posición 264, 268, 270, 330, 340 y /o 345 generó polipéptidos de HPPD mutantes que muestran una tolerancia mucho mejor (Tabla 3), con respecto a múltiples inhibidores de la HPPD aplicados que pertenecen a diversas clases químicas.

En consecuencia, nosotros generamos y evaluamos nuevos polipéptidos de HPPD mutantes mediante intercambios de residuos combinatorios en la posición 335 (ácido glutámico => prolina), 336 (glicina => ácido aspártico/histidina), 337 (asparagina => serina) y, opcionalmente, que comprenden intercambios adicionales en la posición 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344 y/o 345 (Tabla 3, 4 y 5), que exhiben mejores actividades residuales, recambio residual más alto, valores de ki más altos y, de esta manera, una tolerancia a los herbicidas significativamente más alta. En dependencia del herbicida inhibidor de la HPPD probado, el nivel de mejora podría diferir con respecto a los polipéptidos de HPPD empleados en tal ensayo, con un nivel desde 1,5 hasta 110 veces, en comparación con la SEQ ID NO: 2 (Tabla 4).

El análisis de la evolución temporal de la inhibición frente a las diferentes clases químicas de herbicidas inhibidores de la HPPD reveló, que los herbicidas inhibidores de la HPPD parecen ser inhibidores reversibles frente a los nuevos polipéptidos de HPPD mutantes, en contraste con el inhibidor de unión lenta y fuerte característico del polipéptido de HPPD de tipo salvaje correspondiente a la SEQ ID NO: 1 (véanse las Figuras 2 y 3). Estos comportamientos proporcionan un potencial mejor y más versátil para las tolerancias en las plantas de cultivo a diversos herbicidas inhibidores de la HPPD.

Para una actividad residual alta en presencia de herbicidas inhibidores de la HPPD, en esta invención se muestra que son importantes las posiciones descritas y los cambios de residuos que se resaltan en la Tabla 1 con respecto a la posición de aminoácido en el polipéptido de HPPD correspondiente a la SEQ ID NO: 1.

Tabla 3: Tolerancia de polipéptidos de HPPD mutantes frente a diferentes herbicidas inhibidores de la HPPD pertenecientes a diversas clases químicas.

Tabla 3a) Actividad residual y recambio en presencia de Cmpt. 1 de acuerdo con el Ejemplo 3 a una concentración de sustrato alta y 15 pM de inhibidor.

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ

Tabla 3b) Actividad residual y recambio en presencia de Cmpt. 2 de acuerdo con el Ejemplo 3 a una concentración de sustrato alta y 15 pM de inhibidor.

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ

ID NO: 1 del polipéptido de HPPD

Tabla 3c) Actividad residual y recambio en presencia de mesotriona (MST) de acuerdo con el Ejemplo 3 a una concentración de sustrato alta y 60 pM de inhibidor.

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ

ID NO: 1 del oli é tido de HPPD

Tabla 3d) Actividad residual y recambio en presencia de dicetonitrilo (DKN) de acuerdo con el Ejemplo 3 a una concentración de sustrato alta y 60 pM de inhibidor.

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ

ID N : 1 l li i HPPD

Las actividades residuales y el recambio residual se determinaron de acuerdo con el Ejemplo 3 mediante la medición de la kap y el cambio total en la señal, respectivamente, en presencia y ausencia de (a) Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida), (b) Cmpt. 2 (2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida), (c) mesotriona (MST), y (d) dicetonitrilo (DKN). Para cada polipéptido de HPPD mutante, la kap y el cambio total en la señal sin herbicidas inhibidores de la HPPD sirvieron para la normalización de la kap y el cambio total en la señal en presencia del herbicida. Los "valores porcentuales" resultantes, resumidos en las respectivas Tablas 3a), 3b), 3c) y 3d), son las medias de dos experimentos independientes con una desviación estándar promedio del 5 %. La reacción se realizó a concentraciones de sustrato altas con Cmpt. 1 y el Cmpt. 2 a una concentración de 15 pM y los otros dos herbicidas (DKN, MST) a una concentración de 60 pM. Para mayor claridad, las celdas vacías en la posición de aminoácido respectiva en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 108 se definen como idénticas a los aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 1, y se resaltan solo los intercambios en la variante del polipéptido de HPPD. La abreviatura "ni" significa que no se observó inhibición en las condiciones dadas, es decir, la kap o el cambio total en la señal en presencia del inhibidor no disminuye en comparación con el valor correspondiente en ausencia de inhibidores.

Los polipéptidos de HPPD mutantes correspondientes a la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 24 con intercambios de aminoácidos en las posiciones 335, 336, 337, 340 y 345 con respecto al polipéptido de HPPD de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, exhiben, en presencia de diversos inhibidores de la HPPD probados, una mejora significativa con respecto a las actividades residuales y los recambios residuales (Tabla 3a-d). La tolerancia a herbicidas representada de la SEQ ID NO: 10 muestra no solo la mejora frente al polipéptido de HPPD de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1), sino también frente al polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO: 2 en esta invención, en las cuatro clases representadas de herbicidas diferentes. Las mejoras adicionales en la tolerancia al inhibidor de la HPPD son evidentes en variantes con intercambios de residuos en las posiciones de aminoácidos 268 y 270 descritas.

A partir de la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 31 difiere solo en las posiciones indicadas 268 y 270. Estos cambios aumentan significativamente el recambio residual en presencia del inhibidor de la HPPD Cmpt. 1 y MST (Tabla 3a y 3c), y mantiene el alto recambio residual ya logrado en presencia del Cmpt. 2 (Tabla 3b) y DKN (Tabla 3d). Estos resultados también se observan mediante valores de ki significativamente mejores de la SEQ ID NO: 31 (Tabla 4) en comparación con el polipéptido de HPPD (SEQ ID NO: 1) y el polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ iD NO:2 en esta invención.

A partir del polipéptido de HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 8, el cambio adicional del aminoácido 330 (ver SEQ iD NO: 12) muestra una mejor tolerancia adicional al inhibidor de HPPD (ver Tabla 3)

A partir del polipéptido de HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 12, el cambio adicional de la posición de aminoácido 264 (véase la SEQ ID NO: 18) muestra una mejor tolerancia adicional significativa al inhibidor de la HPPD hacia el Cmpt. 1 y el Cmpt. 2 (ver Tablas 3a, 3b).

Al introducir todos los intercambios mencionados anteriormente en las cuatro posiciones 264, 268, 270, 330 en la parte superior del polipéptido HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 10 que conduce a la SEQ ID NO: 19, se detectó la tolerancia más fuerte de todos los polipéptidos representados en la Tabla 3a con actividad residual y recambio del 68 % y 79 % hacia el Cmpt. 1, lo que demuestra la importancia de los intercambios de residuos combinatorios en las posiciones de aminoácidos descritas. También el polipéptido de HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 19 que tiene mejores valores de ki para el Cmpt. 1 y el Cmpt. 2 (Tabla 4) en comparación con la SEQ ID NO:2.

Tabla 4: Evaluación de la tolerancia de los polipéptidos de HPPD mutados frente a diferentes herbicidas inhibidores de la HPPD pertenecientes a diversas clases químicas mediante la determinación de los valores de ki

Para mayor claridad, las celdas vacías en la posición de aminoácido respectiva en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 108 se definen como idénticas a los aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 1, y se resaltan solo los intercambios en los polipéptidos de HPPD mutantes. Los polipéptidos de HPPD mutantes representados aquí son ejemplos a modo de ilustración, no a modo de limitación. Los datos se obtuvieron mediante la medición de las velocidades de reacción iniciales con concentraciones crecientes de Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida), Cmpt. 2 (2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida), y mesotriona (MST) de acuerdo con el Ejemplo 3. Generalmente, se aplicaron seis concentraciones diferentes de sustrato HPP (0 - 1350 j M) y cuatro concentraciones diferentes del inhibidor respectivo (ver Figura 4). Las concentraciones de inhibidor se adoptaron para los pares de polipéptido/inhibidor de la HPPD respectivos, para generar datos dinámicos, es decir, las variantes con menor tolerancia se analizaron en un intervalo de concentraciones de inhibidor más bajas, y se usaron concentraciones de hasta 1200 pM para variantes con una tolerancia máxima. El software GraphPad Prism (versión 6.00 para Windows, Software GraphPad, La Jolla, California, Estados Unidos) se usó para el análisis de datos y el ajuste de las constantes cinéticas mediante la aplicación de restricciones de acuerdo con un modo de inhibición competitivo. Cuando aparecieron valores atípicos obvios, o las actividades obtenidas en concentraciones de sustrato muy altas no obedecían las matemáticas que subyacen al modo de inhibición competitiva, los valores respectivos se excluyeron del ajuste.

Algunos resultados de variantes sistemáticas generadas sobre la base de los dos polipéptidos de HPPD mutados ya, significativamente mejores, de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19, se destacan en la Tabla 5.

La SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 19 difieren en dos posiciones de aminoácidos, y la SEQ ID NO: 17 muestra una ki aumentada ~ 20 veces, la SEQ ID NO: 19 muestra una ki aumentada ~ 30 veces hacia el Cmpt. 1 en comparación con el polipéptido de HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 2 (véase la Tabla 4).

El polipéptido de HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 17 tiene intercambios de residuos en las posiciones 268, 270, 335, 336, 337, 340 y 345 y exhibe una actividad residual del 29 % y el recambio de sustrato se reduce solo un 46 % en presencia de 50 pM de Cmpt. 1. Una reversión de los residuos en la posición 268, 270, 340, 345 al residuo de tipo salvaje respectivo (de acuerdo con la SEQ ID NO: 1) se acompaña de una caída en la tolerancia a un 19 %, 24 %, 17 % y 20 % de actividad residual, respectivamente (Tabla 5; SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 88, respectivamente), lo que enfatiza las propiedades ventajosas de estas posiciones y mutaciones. En consecuencia, una reversión del residuo Valina en la posición 345 en la SEQ ID: 19 al residuo de tipo salvaje respectivo Isoleucina, se acompaña de una caída en la actividad residual del 67 % al 57 % (Tabla 5; SEQ ID NO: 93).

Por otro lado, la introducción de intercambios de residuos individuales adicionales en la SEQ ID: 17 en la posición 204, 213, 264, 310, 315, 330, 331, 338, 339 o 344 resultó para cada posición en al menos una variante con un aumento adicional significativo de la actividad residual superior al 38 %, por ejemplo, A204M (SEQ ID NO:40), R213L (SEQ ID NO:44), M264K (SEQ ID NO:67), Q310K (SEQ ID NO:65), T315R (SEQ ID NO:45), D330V (SEQ ID NO:38), D331I (SEQ ID NO:49), F338V (SEQ ID NO:53), K339E (SEQ ID NO:55) y S344P (SEQ ID NO:58).

En resumen, los intercambios de residuos adicionales específicos más allá de las mutaciones 335 (ácido glutámico (E) => prolina (P)), 336 (glicina (G) => ácido aspártico (D) / histidina (H)) y 337 (asparagina (N)) => serina (S)) en los polipéptidos de HPPD, proporcionan mejoras en la tolerancia a los herbicidas y demuestra la importancia adicional de las posiciones descritas 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 que confieren mejoras en la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD (Tabla 5). Finalmente, la combinación de estas posiciones descritas conduce a mejoras de la ki en las diferentes clases de inhibidores de la HPPD, como se demuestra en la Tabla 4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 99, 100, 105 y 107), con mejoras frente al Cmpt. 1 de más de 100 veces, frente al Cmpt. 2 de hasta 90 veces, y al mismo tiempo de hasta ~ 7 veces frente a la mesotriona (MST) en comparación con el polipéptido de HPPD de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) y el polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO:2 en esta invención.

Tabla 5: Efecto de los intercambios de residuos individuales en la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 19 analizados de acuerdo con el Ejemplo 3 a una concentración de sustrato baja y 50 pM de inhibidor Cmpt.1

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 1 del polipéptido de

HPPD

Para mayor claridad, las celdas vacías en la posición de aminoácido respectiva en la SEQ ID NO: 2 a la NO: 108 se definen como idénticas a los aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 1, y se resaltan solo los intercambios en el polipéptido HPPD mutado. Las actividades residuales y el recambio residual se determinaron de acuerdo con el Ejemplo 3 mediante la medición de la kap y el cambio total en la señal, respectivamente, en presencia y ausencia del Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metiMH-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) (50 j M) a una concentración de sustrato baja. Para cada polipéptido de HPPD mutante, la kap y el cambio total en la señal sin herbicidas inhibidores de la HPPD sirvieron para la normalización de la kap y el cambio total en la señal en presencia del herbicida, y se resumen los valores porcentuales resultantes.

Ejemplo 5: Ensayo de color marrón para probar los polipéptidos de HPPD mutantes, tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD

Los polipéptidos de HPPD mutantes se analizaron mediante el uso de un ensayo de color marrón (documento WO2014/043435). Las células bacterianas que expresan el polipéptido de HPP^dmutante de acuerdo con la invención se analizaron en un formato de 96 pocilios para determinar la tolerancia al inhibidor de la HPPD mediante su depósito en medios sólidos que contenían LB-agar, del agente de selección para el vector de expresión pSE420(RI)NX (documento WO2014/043435), tirosina 5 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), succinato 42 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos) y seis concentraciones diferentes del herbicida inhibidor de la HPPD Cmpt. 1 (0 - 500 |^j M). En el ensayo de color marrón, se diluyó un cultivo crecido durante toda la noche de células de E. coli que expresaban uno de los polipéptidos de HPPD mutantes respectivos a una DO600 de 1 y se depositaron 10 j l de extracto por triplicado en placas que contenían 0, 25, 50, 100, 250, o 500 ^jM de Cmpt. 1. Las placas se cubrieron con cinta AirPore y se incubaron a 30 grados C. Después de 24 horas, las células se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente y después de 7 días se registró visualmente la formación de un pigmento marrón. En presencia de un herbicida inhibidor de la HPPD, esta formación de pigmento se inhibe y el color de la placa de agar no se alterará, a menos que se exprese y esté activo un polipéptido de HPPD tolerante al herbicida inhibidor de la HPPD. La calificación "+++" significa una coloración marrón oscura como se observa en las células de E. coli que expresan uno de los polipéptidos de HPPD mutantes respectivos sin inhibidor en la placa de agar LB. El "++" y el "+" marcan una pigmentación de color marrón medio y claro, respectivamente, y el "0" significa que no se detectó el desarrollo de pigmentación marrón en las placas de agar LB.

Tabla 6: Evaluación de la tolerancia de los polipéptidos de HPPD mutantes hacia el Cmpt. 1 (0-500 pM) mediante el ensayo de color marrón.

Los polipéptidos de HPPD mutantes ilustrativos, resumidos en la Tabla 6, mostraron una mejor tolerancia hacia el Cmpt. 1(2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) en comparación con el polipéptido de HPPD correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en esta invención. Ya a una concentración de 25 jM de Cmpt. 1, las células de E. coli que expresan el polipéptido de HPPD (correspondiente a la SEQ ID NO: 1) no producen ninguna pigmentación marrón y varios polipéptidos de HPPD mutantes muestran una pigmentación marrón de oscura a media.

Un polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO: 2 en esta invención desarrolló solo una leve pigmentación marrón a 250 jM de Cmpt. 1. y perdieron su pigmentación marrón a 500 jM de Cmpt.1, lo que ilustra una inhibición completa de los polipéptidos de HPPD expresados en la célula. En comparación, varios polipéptidos de HPPD mutantes representados en la Tabla 6 con SEQ ID NO: 31, 32, 96 y especialmente con ^sE^qID NO: 104 muestran una coloración marrón más fuerte en presencia de 25, 50, 100, 250 e incluso 500 jM de Cmpt. 1.

En un experimento adicional, los polipéptidos de HPPD mutantes se analizaron mediante el uso del principio de un ensayo colorimétrico de color marrón (como, por ejemplo, el que se describe en el documento US 6,768,044). Las células bacterianas que expresan los polipéptidos de HPPD de acuerdo con esta invención se analizaron en un formato de placa de 96 pocillos (placa Nunc® 96 DeepWell™, Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos) para determinar los polipéptidos de HPPD con mejor tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD.

Las células de E. coli se cultivaron en medio líquido LB (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Alemania) que contenía el agente de selección para el vector de expresión pSE420(RI)NX (documento WO2014/043435) y parahidroxifenilpiruvato 5 mM (HPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos), en presencia o ausencia del herbicida inhibidor de la HPPD, por ejemplo, la Cmpt. 1 (1000 j M). Un cultivo crecido durante toda la noche de E. coli, que expresa uno de los polipéptidos de HPPD respectivos de acuerdo con esta invención, se ajustó a una DO600 de 0,3 - 0,5 en un volumen final de 500 j l y se incubó a 30 grados Celsius. La formación de color marrón residual se determinó mediante la medición de la formación de color marrón (BCF) en presencia y ausencia de Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida). Por lo tanto, después de 96 horas, se centrifugó el cultivo y se usó el sobrenadante del cultivo para medir la densidad óptica de la formación del pigmento marrón soluble a 440 nm (DO440 nm).

Tabla 7: Evaluación de la tolerancia de polipéptidos de HPPD mutantes ilustrativos hacia el Cmpt. 1 (1000 ^jM) mediante el uso del bioensayo de color marrón y la detección de la formación de color marrón (BCF) residual después de 96 horas.

Posición de aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 1 del polipéptido de

HPPD ID N :1

Los polipéptidos de HPPD mutantes ilustrativos, resumidos en la Tabla 7, mostraron una mejor tolerancia hacia el Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) en comparación con el polipéptido de HPPD correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO: 2 en esta invención. Ambos polipéptidos de HPPD correspondientes a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 no produjeron una pigmentación marrón sustancial en presencia del inhibidor de la HPPD. Varios polipéptidos de HPPD mutantes mostraron una pigmentación de color marrón de media a oscura. Los "valores porcentuales" resultantes resumidos en la Tabla 7 respectiva son medias de al menos dos experimentos independientes con una desviación estándar promedio del 5 %.

Ejemplo 6: Transformación de la soja y tolerancia de las plantas de soja T0

La transformación de la soja se logró mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito mediante el uso de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de explantes de la mitad de la semilla de soja, mediante el uso, esencialmente, del método descrito por Paz y otros (2006), Plant cell Rep.

25:206. Los transformantes se identificaron mediante el uso del herbicida inhibidor de la HPPD, "tembotriona", como marcador de selección. Se observó la aparición de brotes verdes, y se documentó como indicador de tolerancia al herbicida tembotriona, inhibidor de la HPPD. Los brotes transgénicos tolerantes mostraron un verdor normal comparable al de los brotes de soja de tipo salvaje no tratados con el herbicida tembotriona, inhibidor de la HPPD, mientras que los brotes de soja de tipo salvaje tratados con la misma cantidad del herbicida tembotriona, inhibidor de la HPPD, se blanquearon por completo. Esto indicó que la presencia del polipéptido de HPPD respectivo permitía la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD, como la tembotriona.

Los brotes verdes tolerantes se transfirieron a medios de enraizamiento o se injertaron. Las plántulas enraizadas se transfirieron al invernadero después de un período de aclimatación. A continuación, las plantas que contenían el transgén se rociaron con herbicidas inhibidores de la HPPD, como por ejemplo con mesotriona en una relación de 300 - 600 g AI/ha, o con Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) en una relación de 150g - 300g AI/ha complementado con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. De cinco a diez días después de la aplicación, se evaluaron los síntomas debidos a la aplicación del herbicida y se compararon con los síntomas observados en plantas de tipo salvaje en las mismas condiciones.

Por ejemplo, las plantas de soja T0 que tienen un "casete de expresión de plantas", que incluye un polipéptido de HPPD tolerante al inhibidor de la HPPD de la presente invención, se probaron con respecto a la tolerancia al Cmpt.

1.

Antes de los ensayos de invernadero con las plantas transgénicas, los transformantes de soja se analizaron rutinariamente para determinar la expresión y presencia de los transgenes mediante el uso del método de detección de proteínas ELISA (véase la descripción detallada en los puntos D y H). Para el análisis de tolerancia a herbicidas sólo se usaron plantas que se recuperaron en los medios de selección y que tenían una expresión de proteína del transgén de HPPD detectable. Se calibró un aspersor DeVries Tracker antes de cada aspersión. La formulación química usada para el Cmpt. 1 se complementó con sulfato de amonio y aceite de semilla de colza metilado. Las pruebas de aspersión se realizaron con una concentración que equivale a 300 gramos AI por hectárea (300 g AI/ha). La tolerancia se evaluó 5 días después de la aspersión. Las plantas de soja de tipo salvaje rociadas con la misma formulación de herbicida se blanquearon totalmente y exhibieron más del 95 % de daño foliar en las dos hojas trifoliadas superiores. Se asignó una calificación de "1" a las plantas que tenían una tolerancia leve, es decir, las dos hojas trifoliadas superiores muestran un blanqueamiento significativo y pocas señales de recuperación con un daño foliar del 50-95 %. Se asignó una calificación de "2" a las plantas que mostraban una tolerancia moderada, es decir, entre el 10 y el 49 % del área foliar de las tres hojas trifoliadas superiores mostraban cantidades significativas de resistencia al tratamiento con el herbicida. Se asignó una calificación de "3" a las plantas que mostraban una buena tolerancia, es decir, menos del 10 % del área foliar de las tres hojas trifoliadas superiores mostraban clorosis o sólo un blanqueamiento muy leve. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: Evaluación del daño en el área foliar de los eventos de soja transgénica T0 cinco días después de la aplicación del Cmpt. 1 en una relación de 300 g AI/ha.

Los resultados de la Tabla 8 muestran que una porción significativa de los eventos de soja T0 independientes son tolerantes al herbicida inhibidor de la HPPD, Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida), en una relación de 300 g AI/ha, en comparación con las plantas de control de soja de tipo salvaje también tratadas con el herbicida inhibidor de la HPPD, Cmpt. 1.

Más del 90 % de los eventos de soja T0 con los polipéptidos de HPPD mutantes correspondientes a las SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 31 tienen menos del 50 % de daño foliar y, por lo tanto, también mejor que la población T0 del polipéptido de HPPD de la técnica anterior (documento WO2014/043435) con una proporción del 83 % correspondiente a la SEQ ID NO:2 en esta invención. Además, ~72 % de los eventos de soja T0 con el polipéptido HPPD mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 32 muestran menos del 10 % de daño foliar, lo que nuevamente muestra una mejora en comparación con la población de eventos de soja T0 (54 %) que sobreexpresa el polipéptido de HPPD de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO:2 en esta invención.

En ensayos de invernadero adicionales, se rociaron de 21 a 94 eventos de soja T0 independientes, por construcción que contenía un polipéptido de HPPD mutante ilustrativo, con el herbicida inhibidor de la HPPD, Cmpt.1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida), en una relación de 300 gramos AI/ha, complementado con sulfato de amonio y éster metílico de aceite colza. Cinco días después de la aplicación, el área de la hoja dañada por el herbicida inhibidor de la HPPD se puntúa en una escala de 0 (sin daño) a 100 (blanqueamiento completo). Bajo esas condiciones, las plantas de tipo salvaje se blanquearon por completo y sus puntajes de daño estaban en el intervalo de 95-100.

La Tabla 9 presenta la distribución de los datos de los puntajes de daños para los herbicidas inhibidores de la HPPD, como percentil para polipéptidos tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD mutantes ilustrativos (SEQ ID NO). Los percentiles normalizan los rangos de los puntajes de daño de una planta individual en una población. El valor del percentil 25 es el puntaje de daño donde el 25 % de los eventos de soja en la población dada tuvieron un puntaje de daño más bajo y un 75 % más alto. La mediana es el percentil 50. La mitad de los valores tenían puntajes de daño más altos; la mitad tenía puntajes de daño más bajos. El valor del percentil 75 y 90 es el puntaje de daño donde el 75 % y el 90 % de los eventos de soja tuvieron puntajes de daño más bajos, respectivamente. La diferencia entre los percentiles 75 y 25 se denomina intervalo intercuartílico y es un marcador para cuantificar la dispersión en la población. Todas las construcciones tenían solo una única inserción del casete en el genoma de la soja.

En la Tabla 9, las construcciones se distribuyen en base a los puntajes por lesión de acuerdo con el percentil 75, desde el puntaje más pequeño hasta el más alto. Todas las variantes de polipéptido de HPPD ilustrativas son mejores en todos los análisis de percentiles que el polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ ID NO:2 en esta invención. Los puntajes del polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435), correspondiente a la SEQ ID NO: 2 en esta invención, se enumeran en la última fila de la Tabla 9.

Tabla 9: Evaluación del daño en el área foliar de los eventos de soja transgénica T0 cinco días después de la aplicación del Cmpt. 1 en una relación de 300 g AI/ha por distribución percentil.

Ejemplo 7: Establecimiento y selección de plantas de algodón T0

La transformación del algodón se logró mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, especialmente, el método preferido descrito en la publicación de patente del PCT WO 00/71733. Las plantas regeneradas se transfieren al invernadero. Después de un período de aclimatación, las plantas que han crecido lo suficiente se rocían con herbicidas inhibidores de la HPPD como, por ejemplo, la tembotriona equivalente a 100 o 200 gAI/ha complementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. Siete días después de la aplicación por aspersión, se evalúan los síntomas debidos al tratamiento con el herbicida inhibidor de la HPPD y se comparan con los síntomas observados en plantas de algodón de tipo salvaje sometidas al mismo tratamiento en las mismas condiciones.

Ejemplo 8: Transformación de células vegetales de maíz mediante transformación mediada por Agrobacterium La construcción del casete de expresión de plantas para la expresión estable en la planta de maíz y la transformación del maíz se conocen bien en la técnica y en este ejemplo particular los métodos se describieron y usaron a partir de los documentos W02014/043435 y WO2008/100353. Las secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes, en esta solicitud, se apila con una secuencia de polinucleótidos que codifica una variante de la proteína EPSPS para conferir tolerancia a los herbicidas, que se dirigen a la EPSPS. El gen EPSPS se aisló y mutó a partir de Arthrobacter globiformis (documento WO2008/100353) y se unió al marco de una secuencia de un péptido de tránsito para guiar la translocación de la proteína traducida al cloroplasto. La expresión estable se logra con un promotor ubicuo (promotor de ubiquitina 4 de caña de azúcar, US 6,638,766), y una secuencia terminadora 35S del virus del mosaico de la coliflor, que se clonan aguas arriba y aguas abajo del gen EPSPS, respectivamente.

El polipéptido de HPPD mutante correspondiente se clonará con el mismo promotor, péptido de tránsito del cloroplasto y secuencia terminadora que se describe para el casete de expresión del gen EPSPS. Las secuencias codificantes de ambos genes se optimizaron por codones para la expresión en maíz. Para la transformación del maíz, es mejor recolectar las mazorcas de 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas y se prefieren los embriones de 0,8 a 1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se siembran con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado y se incuban durante toda la noche a 25 °C en la oscuridad.

Sin embargo, esto no es necesario per se para incubar los embriones durante toda la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados que tienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención para la transferencia mediada por el plásmido Ti durante aproximadamente 5-10 min, y luego se siembran en medio de cocultivo durante aproximadamente 3 días (25 °C en la oscuridad). Después del cocultivo, los explantes se transfieren a un medio de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25 °C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección con glifosato por hasta ocho semanas, en dependencia de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a un medio de maduración embrionaria, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan luego bajo poca luz y se inicia el proceso de regeneración como se conoce en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en un medio de enraizamiento y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas. Las plantas se analizan rutinariamente para determinar la expresión y presencia de los transgenes mediante el uso del método de detección de proteínas ELISA. Solo las plantas que se recuperan en los medios de selección y que tienen una expresión de proteína del transgén de HPPD detectable se usan para el análisis de tolerancia a herbicidas.

Ejemplo 9. Tolerancia de plantas de soja T1 a herbicidas inhibidores de la HPPD/Pruebas de campo

Las plantas de soja que expresan un polipéptido tolerante a inhibidores de la HPPD de la presente invención solo, o junto con un gen que confiere tolerancia al glifosato y/o un gen que confiere tolerancia al glufosinato o que tiene un "casete de expresión de plantas", que incluye solo un polipéptido tolerante al inhibidor de la HPPD de la presente invención, se probaron para determinar la tolerancia a diferentes clases químicas de herbicidas inhibidores de la HPPD. Las plantas transgénicas se analizaron rutinariamente para determinar la expresión y presencia de los transgenes mediante el uso del método de detección de proteínas ELISA (véase la descripción detallada en el punto D y H). Solo las plantas que se recuperan en los medios de selección y que tenían una expresión de proteína del transgén de HPPD detectable se regeneraron, se transfirieron al invernadero y se usaron en la etapa de crecimiento V2-V4 para el análisis de tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD de los eventos de soja T0 en el invernadero (Ejemplo 6). La formulación química con herbicidas inhibidores de la HPPD se complementó con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. La evaluación de la tolerancia a los herbicidas se realizó de 5 a 21 días después de la aspersión. Los eventos independientes de soja T0 con mejor rendimiento se autofecundaron para producir semillas de soja T1. En los ensayos de campo, las semillas de soja T1 avanzadas se plantaron y trataron con 210g/ha de isoxaflutol o 150 g/ha de Cmpt. 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida) en la etapa de crecimiento V2-V4 (Tabla 10) y se puntuó el daño foliar ocho días después de la aplicación del herbicida inhibidor de la HPPD. Todas las plantas de soja de tipo salvaje o las plantas de soja T1 segregadas sin el polipéptido tolerante al inhibidor de la HPPD se rociaron con la misma formulación de herbicida y se blanquearon totalmente y exhibieron un 100 % de daño foliar ocho días después de la aplicación.

En la Tabla 10, se resume la frecuencia de los eventos de soja que muestran una buena tolerancia, es decir, igual o menor al 15 % de daño del área foliar total.

Todas las variantes ilustrativas de polipéptidos tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD enumeradas aquí tenían una frecuencia más alta en la población con una buena tolerancia, con un daño foliar igual o menor al 15 % y, por lo tanto, eran mejores que el polipéptido de HPPD mutante de la técnica anterior (documento WO2014/043435) correspondiente a la SEQ iD NO:2 en esta invención.

Tabla 10. Evaluación en la prueba de campo del daño en el área foliar de eventos ilustrativos de soja transgénica T1 en la etapa de crecimiento V2-V4 que expresan diferentes variantes del polipéptido de HPPD tratadas con 210 g/ha de isoxaflutol (Tabla 10a) o 150 g/ha de Cmpt. 1 (Tabla 10b).

Tabla 10.a) Pruebas de campo de eventos ilustrativos de soja transgénica T1 rociados con 210 g/ha de isoxaflutol y puntuados ocho días después de la aplicación:

Tabla 10.b) Pruebas de campo de eventos ilustrativos de soja transgénica T1 rociados con 150 g/ha de Cmpt. 1 y puntuados ocho días después de la aplicación:

Claims

REIVINDICACIONES

Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), en donde dicho polipéptido de HPPD codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene:

(a) al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, y

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, y

(c) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición del aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1, y en donde dicho polipéptido de HPPD es tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.

La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de HPPD codificado comprende, además:

i. una metionina, treonina, serina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 204 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una lisina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iii. una arginina, lisina, glutamina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iv. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina, leucina, ácido glutámico, prolina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una serina, histidina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 310 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una arginina, metionina o histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una histidina, alanina, fenilalanina, valina o glicina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO:1; y/o

ix. una prolina, histidina, serina, isoleucina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 331 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

xi. un ácido glutámico, arginina, alanina o treonina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 339 de la SEQ ID NO: 1; y/o

xii. una arginina, glutamina, metionina, ácido glutámico, glicina, leucina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

xiii. una glutamina, prolina, o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO: 1; y/o

xiv. una lisina, arginina, metionina, alanina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína HPPD codificada comprende, además:

i. una leucina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una arginina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iii. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO:1; y/o

iv. un ácido glutámico o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ix. una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una lisina, valina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

4. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína HPPD codificada comprende, además:

i. una lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una arginina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iii. una glicina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iv. un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID O:1; y/o

v. una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vi. una histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO: 1: y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

ix. una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una lisina, valina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

5. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1-4, en donde dicha proteína HPPD codificada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1.

6. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 5, en donde dicha proteína HPPD codificada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1.

7. La molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde su secuencia de nucleótidos se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.

8. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8 que es una célula huésped bacteriana.

10. La célula huésped de la reivindicación 8 que es una célula vegetal.

11. Una planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. La planta de la reivindicación 11, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

13. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. Un polipéptido recombinante que comprende un polipéptido de HPPD, en donde dicho polipéptido de HPPD es tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD y en donde dicho polipéptido de HPPD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene:

(a) al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, y

(b) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, y

(c) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y

(d) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO:1.

15. El polipéptido recombinante de la reivindicación 14, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína HPPD comprende, además:

i. una metionina, treonina, serina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 204 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una lisina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iii. una arginina, lisina, glutamina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iv. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina, leucina, ácido glutámico, prolina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una serina, histidina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 310 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una arginina, metionina o histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una histidina, alanina, fenilalanina, valina o glicina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO:1; y/o

ix. una prolina, histidina, serina, isoleucina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 331 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO: 1: y/o

xi. un ácido glutámico, arginina, alanina o treonina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 339 de la SEQ ID NO:1; y/o

xii. una arginina, glutamina, metionina, ácido glutámico, glicina, leucina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

xiii. una glutamina, prolina, o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO: 1; y/o

xiv. una lisina, arginina, metionina, alanina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

16. El polipéptido recombinante de la reivindicación 15, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína HPPD comprende, además:

i. una leucina o lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ii. una arginina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO: 1: y/o

iii. una arginina, glicina o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO:1; y/o

iv. un ácido glutámico o serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO:1; y/o

vi. una histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vii. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 1; y/o

ix. una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO: 1: y/o

x. una lisina, valina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

17. El polipéptido recombinante de la reivindicación 15, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína HPPD comprende, además:

i. una lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 213 de la SEQ ID NO: 1: y/o

ii. una arginina o leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 264 de la SEQ ID NO:1; y/o

iii. una glicina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1; y/o

iv. un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1; y/o

v. una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 315 de la SEQ ID NO: 1; y/o

vi. una histidina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 1 y/o

vii. una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 338 de la SEQ ID NO:1; y/o

viii. una arginina o valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y/o

ix. una glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 344 de la SEQ ID NO:1; y/o

x. una lisina, valina o metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

18. Un polipéptido recombinante que comprende una proteína HPPD, en donde dicha proteína HPPD es tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD y en donde dicha proteína HPPD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene:

(a) al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, y

(b) una glicina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 268 de la SEQ ID NO: 1, y

(c) un ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 270 de la SEQ ID NO: 1, y

(d) una prolina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 335 de la SEQ ID NO: 1, y

(e) una histidina o un ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición del aminoácido 336 de la SEQ ID NO: 1, y

(f) una serina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 337 de la SEQ ID NO: 1, y (g) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 340 de la SEQ ID NO:1; y

(h) una valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 345 de la SEQ ID NO:1.

19. Un método para producir un polipéptido con actividad de tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones en las que se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

20. Una planta que tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN, dicha construcción comprende un promotor unido operativamente con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

21. La planta de la reivindicación 20, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en una célula vegetal, un tejido vegetal y una semilla vegetal.

22. La planta de la reivindicación 20, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

23. La semilla transgénica de la planta de la reivindicación 20, dicha semilla tiene la construcción de ADN incorporada de manera estable en su genoma, dicha construcción de ADN comprende un promotor unido operativamente con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

24. Un método para regular el crecimiento de plantas en cultivos de plantas de la reivindicación 20, el método comprende plantar la planta de la reivindicación 20 o una semilla de la misma en un campo y aplicar a dicha planta o semilla, o al área que rodea dicha planta o semilla una concentración efectiva de uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.

25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho(s) herbicida(s) inhibidor(es) de la HPPD se selecciona(n) del grupo que consiste en tricetonas, dicetonitrilos, isoxazoles, hidroxipirazoles, N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas, N-(tetrazol-5-il)- o N-(triazol-5-il)-arilcarboxamidas, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas y pirazolonas.

26. El método de la reivindicación 25, en donde dicho(s) herbicida(s) inhibidor(es) de la HPPD se seleccionan del grupo de los herbicidas benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona, isoxaflutol, dicetonitrilo, pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirasulfotol, topramezona, tolpiralato, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1-metil 1H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-doro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida y 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida.

27. Uso de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para hacer que una planta sea tolerante a uno o más herbicidas inhibidores de la HPPD.