ES2743728T3 - Evento transgénico MON 88701 del algodón y procedimientos de uso del mismo - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10, y sus complementos, en la que la molécula de ADN recombinante comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a una planta de algodón.

Description

DESCRIPCIÓN

Evento transgénico MON 88701 del algodón y procedimientos de uso del mismo

Campo de la invención

La invención se refiere al evento transgénico MON 88701de Gossypium hirsutum. El evento muestra tolerancia a los herbicidas dicamba y glufosinato. La invención también se refiere a plantas, partes de plantas, semillas de plantas, células vegetales, productos agrícolas y procedimientos relacionados con el evento MON 88701 y proporciona moléculas de nucleótidos que son únicas para el evento y que se crearon en relación con la inserción de ADN transgénico en el genoma. de la planta de Gossypium hirsutum.

Antecedentes de la invención

El algodón (Gossypium hirsutum) es un cultivo importante en muchas áreas del mundo, y se han aplicado los procedimientos de biotecnología a este cultivo con el fin de producir algodón con características deseables. Una de esas características deseables es la tolerancia a herbicidas. La expresión de un transgén de tolerancia a herbicidas en una planta puede conferir la característica deseable de tolerancia a herbicidas en la planta, pero la expresión del transgén puede ser influenciada por la ubicación cromosómica y el resultado genómico de la inserción del transgén. Por ejemplo, se ha observado en plantas que a menudo existe una variación en el nivel y el patrón de expresión del transgén entre los eventos individuales que difieren en el sitio de inserción cromosómica del transgén, pero son idénticas. También puede haber diferencias fenotípicas o agronómicas indeseables y/o deseables entre los eventos. Debido a esto, a menudo es necesario producir y analizar un gran número de eventos de transformación de plantas individuales para seleccionar un evento que tenga tanto el rasgo deseable como las características fenotípicas y agrícolas óptimas necesarias para que sea adecuado para fines comerciales. Dicha selección a menudo requiere pruebas de invernadero y de campo con muchos eventos durante varios años, en múltiples ubicaciones y bajo una variedad de condiciones para que se pueda recopilar una cantidad significativa de datos agronómicos, fenotípicos y moleculares. Los datos y las observaciones resultantes deben ser analizados por equipos de científicos y agrónomos con el objetivo de seleccionar un evento comercialmente adecuado. Dicho evento, una vez seleccionado, se puede utilizar para introducir el rasgo deseable en otros antecedentes genéticos utilizando procedimientos de fitomejoramiento y, por lo tanto, producir una serie de variedades de cultivo diferentes que contengan el rasgo deseable y se adapten adecuadamente a las condiciones específicas de cultivo locales.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ADN recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 1-8 y 10, y complementos de las mismas, en la que la molécula de ADN recombinante comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a una planta de algodón. La molécula de ADN recombinante puede comprender las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1 y 2 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10.

La presente invención proporciona además una planta, semilla, célula de algodón recombinante o parte de la misma que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-8 o 10, y complementos de las mismas en las que la molécula de ADN recombinante comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a una planta de algodón, semilla, célula o parte de la planta. La planta de algodón recombinante, semilla, célula o parte de la planta puede caracterizarse porque el genoma produce un amplicón que comprende una molécula de ADN seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y sus complementos, cuando se analiza en un procedimiento de amplificación de ADN; o dicha planta, semilla, célula o parte de la misma comprende el evento MON 88701, una muestra representativa de semilla que comprende el evento MON 88701 que se ha depositado bajo el número de acceso PTA-11754 de la ATCC, preferiblemente dicha planta o semilla es un híbrido que tiene al menos un progenitor que comprende un evento MON 88701 de algodón ; o puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende:

cruzar sexualmente una planta de algodón transgénica que comprende el evento MON 88701 que comprende una molécula de nucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y complementos de la misma, con una segunda planta de algodón;

recoger la semilla producida a partir de dicho cruce;

cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie;

tratar dicha pluralidad de plantas de la progenie con dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato; y

seleccionar una planta de progenie que sea tolerante a dicamba y glufosinato; o

(iv) se puede obtener mediante un procedimiento que comprende:

autofecundar una planta de algodón transgénica que comprende el evento MON 88701 que comprende una molécula de nucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y sus complementos;

recoger la semilla producida a partir de dicha autofecundación;

cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie;

tratar dicha pluralidad de plantas de la progenie con dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato; y

seleccionar una planta de la progenie que sea tolerante a dicamba y glufosinato; o

(v) dicha planta, semilla, célula o parte de la planta comprende un casete de expresión transgénico integrado que comprende un gen que codifica la proteína dicamba mono oxigenasa (DMO) y un gen que codifica la proteína fosfinotricina acetil transferasa (PAT).

La presente invención también proporciona un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN derivada de una planta de algodón como se describió anteriormente en una muestra,

comprendiendo dicho procedimiento:

poner en contacto dicha muestra con una sonda de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de suficiente longitud de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10, o un complemento de la misma, para funcionar como una sonda de ADN que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10 y no se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10;

someter dicha muestra y dicha sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y

detectar la hibridación de dicha sonda de ADN con una molécula de ADN en dicha muestra, en la que la hibridación de dicha sonda de ADN con dicha molécula de ADN indica la presencia de una molécula de ADN derivada de plantas de algodón como se describió anteriormente en dicha muestra; o

comprendiendo dicho procedimiento:

poner en contacto dicha muestra con un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, en la que cada una de estas moléculas de ADN comprende una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10 , o un complemento del mismo, para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN derivado de plantas de algodón como se describió anteriormente para producir un diagnóstico de amplicón para ADN de plantas de algodón como se describió anteriormente en una muestra;

realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10, y sus complementos; y

detectar la presencia de dicho amplificador de ADN en dicha reacción, en la que la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción indica la presencia de una molécula de ADN derivada de una planta de algodón de acuerdo con lo descrito anteriormente en dicha muestra.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de determinación de la cigosidad de una planta o algodón de semilla como se describió anteriormente que comprende:

poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores y un conjunto de sondas que

cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación de ácido nucleico con el ADN de una planta como se describió anteriormente, produce un primer amplicón que es diagnóstico para el evento MON 88701; y

cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de algodón diferente al ADN de la planta como se describió anteriormente, produce un segundo amplicón que es diagnóstico para ADN genómico de algodón nativo no derivado de una planta como se describió anteriormente;

realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con dicha muestra, conjunto de cebadores y conjunto de sondas;

detectar en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico una primera señal fluorescente que es diagnóstica para el ADN de una planta como se describió anteriormente y una segunda señal fluorescente diferente de dicha primera señal fluorescente y diagnóstico para el ADN genómico de algodón nativo correspondiente al evento de la planta como se describió anteriormente; y

analizar la presencia o ausencia de dicha primera señal fluorescente y dicha segunda señal fluorescente en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, en la que la presencia de ambas señales fluorescentes indica que dicha muestra es heterocigota para el ADN de una planta como se describió anteriormente y la presencia de solo dicha primera señal fluorescente indica que dicha muestra es homocigota para el ADN de una planta como se describió anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la organización del inserto transgénico en el genoma de una planta de algodón que comprende el evento MON 88701. [A] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 1; [A'] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 3; [A"] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 5; [B] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 2; [B'] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 4; [B"] corresponde a la posición relativa de SEQ ID

^NO: 6^{; [C] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 7; [D] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO:} 8^{; [E] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 9; [F] corresponde a la posición relativa de SEQ ID} NO: 10; SQ21654 y SQ23205 corresponden a la posición relativa de los cebadores utilizados para identificar el evento MON 88701 de algodón .

La Figura 2 muestra dos años de datos de ensayos de campo de rendimiento agronómico reportados como kilogramos de algodón de semilla por hectárea.

La Figura 3 muestra los datos del ensayo de campo de rendimiento del primer año reportados como kilogramos de algodón de semilla por hectárea.

La Figura 4 muestra los datos del ensayo de campo de rendimiento del segundo año reportados como kilogramos de algodón de semilla por hectárea con cantidades crecientes de herbicida dicamba (4.A.) o glufosinato (4.B.). La Figura 5 muestra el porcentaje de manchas necróticas que ocurren con cantidades crecientes de herbicida dicamba (5.A.) o glufosinato (5.B.).

La Figura 6 muestra los datos del ensayo de campo de rendimiento como kilogramos de algodón de semilla por hectárea del régimen de rociado para el evento MON 88701.

La Figura 7 muestra plantas que comprenden el evento MON 88701 frente a plantas Coker 130 no transgénicas rociadas con dicamba y glufosinato en el campo. Las aplicaciones de herbicidas fueron de 0,4536 kg de dicamba (2X) antes de la emergencia; 0,4536 kg de glufosinato (2X) cuando tiene 2 hojas; 0,4536 kg de dicamba cuando ^{tiene 5 hojas; y 0,4536 kg de glufosinato cuando tiene} 8 ^hojas.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO: 1 está posicionada en la SEQ ID NO: 10 en la posición de los nucleótidos 1117-1136.

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO: 2 se posiciona en la SEQ ID NO: 10 en la posición de los nucleótidos 5222-5241.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia 5' que flanquea el ADN insertado de MON 88701 hasta e incluyendo una parte del casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia 3' que flanquea el ADN insertado de MON 88701 hasta e incluyendo una parte del casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia del casete de expresión transgénico integrado.

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos contigua de la secuencia 5' que flanquea el ADN insertado (SEQ ID NO: 7), el casete de expresión transgénico integrado (SEQ ID NO: 9) y la secuencia 3' que flanquea el ADN ^{insertado ( SEQ ID NO:} 8^{). La SEQ ID NO: 10 incluye las SEQ ID NO: 1-9.}

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de un cebador denominado cebador SQ21654 y se usa para identificar el evento MON 88701 de algodón . Es complementaria al casete de expresión insertado en la región cercana al borde de inserción del transgén 3'. Un amplicón de PCR producido a partir de un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que utiliza la combinación de los cebadores SQ21654 y SQ23205 (SEQ ID nO: 12) es un resultado positivo de la presencia del evento MON 88701. Este conjunto de cebadores también se puede usar para identificar un evento MON 88701 en un ensayo de cigosidad.

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de un cebador denominado cebador SQ23205 y se usa para identificar el evento MON 88701 de algodón . Es complementaria a una región 3' que flanquea el casete de expresión insertado y está cerca del borde de inserción del ADN del transgén. Un amplicón de PCR producido a partir de un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que usa la combinación de los cebadores SQ21654 (SEQ ID NO: 11) y SQ23205 es un resultado positivo de la presencia del evento MON 88701. Este también es el cebador utilizado para identificar el evento MON 88701 y de tipo silvestre con un ensayo de cigosidad.

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de una sonda denominada Sonda PB10280 y se usa para identificar el evento MON 88701 de algodón . Es complementaria de una región del casete de expresión insertado y adyacente a la ^{unión 3' del ADN genómico. Esta sonda es un oligonucleótido sintético marcado con} 6^{-FAMMR. La liberación de} una señal fluorescente en una reacción de amplificación usando los cebadores SQ21654 y SQ23205 (SEQ ID NO: ^{11-12) en combinación con la sonda PB10280 marcada con} 6^{-FAMMR es diagnóstica del evento MON 88701 en un} ensayo TAQMAN®. PB 10280 es también la sonda utilizada para identificar un evento MON 88701 en un ensayo de cigosidad.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ23901 y se usa para identificar un alelo de tipo silvestre de algodón en un ensayo de cigosidad de MON 88701.

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de una sonda marcada con VICMR denominada como Sonda PB10631 y utilizada para identificar un alelo de tipo silvestre de algodón en un ensayo de cigosidad MON 88701.

Descripción detallada

Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante.

La invención proporciona un evento de algodón transgénico MON 88701 que exhibe una tolerancia comercialmente aceptable a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato. El evento comprende una inserción única de ADN transgénico en el cromosoma/genoma del germoplasma de algodón. Un "evento" se produce por: (i) transformación de una célula vegetal con un constructo de ácido nucleico que incluye un transgén de interés, (ii) regeneración de una población de plantas resultante de la inserción del transgén en el genoma de la planta y (iii) la selección de una planta particular caracterizada por la inserción del transgén en una ubicación particular en el genoma de la planta.

El término "evento" se refiere a una molécula de ADN que comprende el ADN insertado y el ADN genómico de algodón flanqueante inmediatamente adyacente a cada lado del ADN insertado. Esta molécula de ADN se crea mediante el acto de insertar el ADN transgénico en el genoma de la planta de algodón, es decir, mediante el acto de transformación. Por lo tanto, esta molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es específica del evento y que es única para el genoma de la planta de algodón en la que se insertó el ADN transgénico, ya que esta secuencia de nucleótidos contiene tanto la secuencia de una región particular de ADN genómico de algodón y del inserto de ADN transgénico. La disposición del ADN insertado en el evento MON 88701 de algodón en relación con el ADN del genoma de la planta de algodón circundante es, por lo tanto, específico y único para el evento MON 88701 de algodón . Esta molécula de ADN también es una parte integral del cromosoma de algodón de las plantas que contienen el evento MON 88701 y como tal, es estática en la planta y se puede transmitir a la progenie de la planta.

La presente invención también proporciona el transformante original que incluye el transgén insertado en la ubicación particular en el genoma de la planta y la progenie del transformante que incluye el transgén insertado en la ubicación particular en el genoma de la planta. Dicha progenie puede producirse por un cruzamiento sexual entre el transformante, o su progenie, y otra planta. Dicha otra planta puede ser una planta transgénica que comprende el mismo o diferente transgén y/o una planta no transgénica, tal como una de una variedad diferente. Incluso después de repetidos cruzamientos con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del progenitor transformado están presentes en la progenie del cruzamiento en la misma ubicación genómica.

Como se usa en el presente documento, el término "algodón" significa Gossypium hirsutum e incluye todas las variedades de plantas que pueden criarse con algodón, incluidas las especies de algodón silvestre, así como aquellas plantas que pertenecen a Gossypium que permiten el fitomejoramiento entre especies.

El evento MON 88701 comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a la planta de algodón. "Dicamba" se refiere al ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico. Dicamba es un herbicida de auxina sintético útil para controlar malezas de hoja ancha. Las plantas de algodón se transformaron con un gen (dmo) de Stenotrophomonas maltophilia que codifica dicamba monooxigenasa (DMO). La DMO es una enzima que cataliza la desactivación de dicamba mediante una reacción de O-desmetilación con el compuesto no herbicida ácido 3,5-diclorosalicílico. "Glufosinato" se refiere al ácido 2-amino-4-(hidroximetilfosfinil)butanoico. El glufosinato es un herbicida organofosforado útil para controlar un amplio espectro de malezas anuales y perennes y malezas de hoja ancha. Las plantas de algodón se transformaron con un gen de resistencia a Bialafos (bar) de Streptomyces hygroscopicus que codifica fosfinotricina acetil transferasa (PAT). La PAT es una enzima que cataliza la acetilación y, por lo tanto, la inactivación del glufosinato.

Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una forma de ADN y/o proteína y/o un organismo que normalmente no se encontraría en la naturaleza y, como tal, fue creado por la intervención humana. Dicha intervención humana puede producir una molécula de ADN recombinante y/o una planta recombinante. Como se usa en este documento, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se producirían naturalmente juntas y es el resultado de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que comprende una combinación de al menos dos moléculas ADN heterólogas entre sí, y/o una molécula de a Dn que se sintetiza artificialmente y comprende una secuencia de polinucleótidos que se desvía de la secuencia de polinucleótidos que normalmente existiría en la naturaleza, y/o una molécula de ADN que comprende un transgén incorporado artificialmente en un ADN genómico de una célula huésped y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula huésped. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN descrita en el presente documento que resulta de la inserción del transgén en el ADN genómico del algodón, que en última instancia puede resultar en la expresión de una molécula de ARN y/o proteína recombinante en ese organismo. Como se usa en este documento, una "planta recombinante" es una planta que normalmente no existiría en la naturaleza, es el resultado de la intervención humana y contiene una molécula de ADN transgénica y/o heteróloga incorporada en su genoma. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es claramente diferente de la planta de tipo silvestre relacionada. Un ejemplo de una planta recombinante es una planta de algodón descrita en el presente documento que comprende el evento Mo N 88701.

Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a una molécula de nucleótido incorporada artificialmente en el genoma de una célula huésped. Dicho transgén puede ser heterólogo a la célula huésped. El término "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende tal transgén.

Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a una primera molécula que normalmente no se encuentra en combinación con una segunda molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula puede derivarse de una primera especie e insertarse en el genoma de una segunda especie. Por lo tanto, la molécula sería heteróloga para el huésped e incorporada artificialmente en el genoma de una célula huésped.

Como se usa en el presente documento, el término "quimérica" se refiere a una única molécula de ADN producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, en la que normalmente no se encontraría una primera y una segunda molécula de ADN en esa configuración, es decir, fusionada a la otra. La molécula de ADN quimérica es, por lo tanto, una nueva molécula de ADN que normalmente no se encuentra en la naturaleza.

La invención proporciona moléculas de ADN y sus correspondientes secuencias de nucleótidos. Tal como se usa en el presente documento, el término "ADN", "molécula de ADN", "molécula de nucleótido" se refiere a una molécula de a Dn de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótidos o una molécula de polinucleótido, leída desde el extremo 5' (secuencia arriba) hasta el extremo 3' (secuencia abajo). Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de ADN", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótidos" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en el presente documento es aquella requerida por el Título 37 del Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos § 1.822 y se expone en las tablas de la Norma ST.25 (1998) de la OMPI, Apéndice 2, Tablas 1 y 3. Por convención, las secuencias de nucleótidos de la invención proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8 y 10 y fragmentos de las mismas se describen con referencia a solo una cadena de las dos cadenas de secuencias de nucleótidos complementarias. Por implicación, las secuencias complementarias (es decir, las secuencias de la cadena complementaria), también denominadas en la técnica secuencias complementarias inversas, están dentro del ámbito de la invención y se pretende que estén expresamente dentro del ámbito de la materia reivindicada.

La secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos completa del ADN transgénico insertado y los segmentos sustanciales del ADN del genoma del algodón que flanquean cualquiera de los extremos del ADN transgénico insertado se proporciona en este documento como la SEQ ID NO: 10. Una subsección de esta es el ADN transgénico insertado proporcionado como la SEQ ID NO: 9. La secuencia de nucleótidos del ADN del genoma del algodón físicamente unida por el enlace fosfodiéster y, por lo tanto, flanqueando el extremo 5' del ADN transgénico insertado se presenta como se muestra en la Figura 1 y se proporciona como las SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7. La secuencia de nucleótidos del ADN del genoma del algodón físicamente unida por el enlace fosfodiéster y, por lo tanto, flanqueando el extremo 3' del ADN transgénico insertado se presenta como se muestra en la Figura 1 y se ^{proporciona como las SEQ ID NO: 2, 4,} 6 ^y 8^.

El evento MON 88701 de algodón comprende además dos regiones, una que abarca la ubicación 5' y otra que abarca la ubicación 3' en las que se inserta el ADN transgénico en el ADN genómico, denominado en este documento como la unión 5' y 3', respectivamente . Una "secuencia de unión" o "región de unión" se refiere a la secuencia de ADN y/o la molécula de ADN correspondiente que abarca el ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante adyacente. Las secuencias de unión pueden representarse arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, cada una de las cuales representa 10 nucleótidos del ADN genómico flanqueante adyacente y contiguo a 10 nucleótidos del ADN del inserto. Alternativamente, las secuencias de unión pueden representarse arbitrariamente por las dos secuencias de 60 nucleótidos proporcionadas como las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, cada una de las cuales representa 30 nucleótidos del ADN genómico flanqueante adyacente y contiguo a 30 nucleótidos del ADN del inserto. Alternativamente, las secuencias de unión pueden representarse arbitrariamente por las dos secuencias de 100 ^{nucleótidos proporcionadas como las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:} 6^{, cada una de las cuales representa 50} nucleótidos del ADN genómico flanqueante adyacente y contiguo a 50 nucleótidos del ADN del inserto. Estos nucleótidos están conectados por el enlace fosfodiéster y en el evento MON 88701 de algodón están presentes como parte del genoma. La identificación de una o más de las SEQ ID NO: 1-10 en una muestra derivada de una planta de algodón, semilla o parte de la planta es determinante de que el ADN se obtuvo del evento MON 88701 de algodón y es diagnóstico de la presencia en una muestra de ADN del evento MON 88701 de algodón . La invención proporciona así una molécula de ADN que contiene al menos una de las secuencias de nucleótidos proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8 y 10. Cualquier segmento de ADN derivado del evento de algodón transgénico MON 88701 que sea suficiente para incluir al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8 y 10 está dentro del ámbito de la invención. Además, cualquier polinucleótido que comprenda una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo está dentro del ámbito de la invención. La Figura 1 ilustra la disposición física de las SEQ ID NO: 1-9 relativa a la SEQ ID NO: 10 dispuesta de 5' a 3'.

La invención proporciona moléculas de ADN ejemplares que pueden usarse como cebadores o sondas para diagnosticar la presencia de ADN derivado de una planta de algodón que comprende el evento MON 88701 en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico objetivo y, como tales, son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento MON 88701 de algodón por los procedimientos de la invención descritos en este documento.

Un "cebador" es típicamente un polinucleótido aislado altamente purificado que está diseñado para uso en procedimientos específicos de apareamiento o hibridación que involucran la amplificación térmica. Se puede usar un par de cebadores con el ADN plantilla, tal como una muestra de ADN genómico de algodón, en una amplificación térmica, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, en la que el amplicón producido a partir de dicha reacción tendría una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN plantilla ubicada entre los dos sitios en los que los cebadores se hibridan con la plantilla. Como se usa en este documento, un "amplicón" es una pieza o fragmento de ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación. Un amplicón de la invención comprende al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-10. Un cebador está diseñado típicamente para hibridar con una cadena de ADN objetivo complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN objetivo, y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para comenzar la extensión del cebador (es decir, la polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula de nucleótido que se alarga) usando como plantilla la cadena de ADN objetivo. Los pares de cebadores, como se usan en la invención, pretenden referirse al uso de dos cebadores que unen cadenas opuestas de un segmento de nucleótido de doble cadena con el fin de amplificar linealmente el segmento de polinucleótido entre las posiciones seleccionadas para la unión por los miembros individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmica u otros procedimientos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. Las moléculas de ADN ejemplares útiles como cebadores se proporcionan como las SEQ ID NO: 11-12. El par cebador proporcionado como la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 es útil como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN, y ambas tienen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10 para funcionar como cebadores de ADN que, cuando se usan juntos en una reacción de amplificación térmica con ADN plantilla derivado del evento MON 88701 de algodón , produce un diagnóstico de amplicón para el ADN del evento m On 88701 de algodón en una muestra.

Una "sonda" es un ácido nucleico aislado que es complementario a una cadena de un ácido nucleico objetivo. Las sondas de acuerdo con la invención incluyen no solamente ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sondas que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y la detección de dicha unión puede ser útil para diagnosticar, discriminar, determinar o confirmar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo en una muestra particular. Se puede unir una sonda a un marcador o molécula informadora detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima. Se proporciona una molécula de ADN ejemplar útil como sonda tal como la SEQ ID NO: 13.

Las sondas y cebadores de acuerdo con la invención pueden tener una identidad de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque los cebadores y las sondas que difieren de la secuencia objetivo que retienen la capacidad de hibridar preferentemente con secuencias objetivo pueden diseñarse por procedimientos convencionales. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, solo necesita ser lo suficientemente complementaria en su secuencia para poder formar una estructura estable de doble cadena bajo el disolvente particular y las concentraciones de sal empleadas. Se puede usar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de ADN transgénico del evento MON 88701 de algodón en una muestra. Las sondas y los cebadores son generalmente al menos aproximadamente de 11 nucleótidos, al menos aproximadamente 18 nucleótidos, al menos aproximadamente 24 nucleótidos, o al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia de ADN objetivo bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de rigurosidad convencionales están descritas por Sambrook et al., 1989, y por Haymes et al., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Como se usa en el presente documento, dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico antiparalela de cadena doble. Una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan una complementariedad completa. Como se usa en el presente documento, dos moléculas exhiben una "complementariedad completa" si, cuando se alinean, cada nucleótido de la primera molécula es complementario de cada nucleótido de la segunda molécula. Dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en al menos condiciones convencionales de "baja rigurosidad". De manera similar, las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Por lo tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que tales desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena.

Como se usa en el presente documento, el término "aislada" se refiere a separar al menos parcialmente una molécula de otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo o natural. En una realización, el término "aislada" se refiere a una molécula de ADN que está al menos parcialmente separada de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por lo tanto, las moléculas de ADN fusionadas a secuencias reguladoras o codificantes con las que normalmente no están asociadas, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas en el presente documento. Dichas moléculas se consideran aisladas incluso cuando se integran en el cromosoma de una célula huésped o están presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN.

Se puede usar cualquier número de procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, divulgado en la invención. Por ejemplo, la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se puede utilizar para amplificar una molécula particular de ADN de partida y/o para producir variantes de la molécula original. Las moléculas de ADN, o sus fragmentos, también se pueden obtener mediante otras técnicas, tales como sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como se practica comúnmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.

Las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en este documento son, por lo tanto, útiles para, entre otras cosas, identificar el evento MON 88701 de algodón, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento MON 88701 de algodón, detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88701 de algodón transgénico en una muestra, y monitorizar las muestras para detectar la presencia y/o ausencia del evento MON 88701 de algodón o partes de plantas derivadas de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701.

La invención proporciona plantas de algodón, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas (tales como polen, óvulo, vaina, tejido de flores, tejido de la raíz, tejido del tallo y tejido de la hoja).

Estas plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la invención, es decir, tal como un polinucleótido que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8 y 10. Las plantas, progenie, semillas, células de plantas y partes de plantas de la invención también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifique una proteína o molécula de ARN que confiera un rasgo deseable que incluya, entre otros, un aumento de la resistencia a los insectos, un aumento de la eficiencia en el uso del agua, un aumento del rendimiento, una mayor resistencia a la sequía, un aumento de la calidad de las semillas, una mejor calidad nutricional y/o mayor tolerancia a los herbicidas, en la que el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de algodón que carece de dicho transgén adicional.

La invención proporciona plantas de algodón, progenie, semillas, células vegetales y partes de plantas tales como polen, óvulos, vainas, flores, raíces o tejidos del tallo, y hojas derivadas de una planta de algodón transgénico que comprende el evento MON 88701. Una muestra representativa de semillas de algodón que comprende el evento MON 88701 se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC®). El repositorio de la ATCC ha asignado la Designación de Depósito de Patente PTA-11754 a la semilla que comprende el evento MON 88701.

La solicitud divulga un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10 presente en su genoma. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula vegetal transgénica. Los microorganismos, tales como una célula vegetal de la invención, son útiles en muchas aplicaciones industriales, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a: (i) el uso como herramienta de investigación para investigación científica o investigación industrial; (ii) uso en cultivos para producir productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteínas endógenas o recombinantes o moléculas pequeñas que se pueden usar para investigaciones científicas posteriores o como productos industriales; y (iii) uso con técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales que luego se pueden usar para investigación o producción agrícola. La producción y el uso de microorganismos como las células vegetales transgénicas utilizan técnicas microbiológicas modernas y la intervención humana para producir un microorganismo único creado por el hombre. En este procedimiento, el ADN recombinante se inserta en el genoma de una célula vegetal para crear una célula vegetal transgénica que es separada y única de las células vegetales naturales. Esta célula vegetal transgénica se puede cultivar de manera muy similar a las bacterias y las células de levadura utilizando técnicas modernas de microbiología y puede existir en un estado unicelular no diferenciado. La composición genética y el fenotipo de la nueva célula vegetal es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Otro aspecto de la invención es un procedimiento de uso de un microorganismo. Los procedimientos para usar los microorganismos de la invención, tales como las células vegetales transgénicas, incluyen (i) procedimientos de producción de células transgénicas mediante la integración de ADN recombinante en el genoma de la célula y luego usar esta célula para derivar células adicionales que poseen el mismo ADN heterólogo; (ii) procedimientos para cultivar células que contienen ADN recombinante utilizando técnicas modernas de microbiología; (iii) procedimientos de producción y purificación de productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteínas endógenas o recombinantes a partir de células cultivadas; y (iv) procedimientos para utilizar técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales con células vegetales transgénicas para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales transgénicos.

Las plantas de la invención pueden pasar a lo largo del ADN del evento, incluyendo el transgén, hasta la progenie. Tal como se usa en el presente documento, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o parte de la planta regenerable que comprende el ADN del evento derivado de una planta ancestral y/o que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10. Las plantas, la progenie y las semillas pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. La progenie se puede cultivar a partir de semillas producidas por una planta que contiene el evento MON 88701 de algodón y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento MON 88701 de algodón.

Las plantas de la progenie pueden autopolinizarse (también conocidas como "autofecundantes") para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas homocigotas para ambos genes agregados, exógenos.

Alternativamente, las plantas de la progenie se pueden cruzar, por ejemplo, criarse con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. La otra planta no relacionada puede ser transgénica o no transgénica. Una semilla o planta varietal o híbrida de la invención se puede derivar así cruzando un primer progenitor que carece del ADN específico y único del evento MON 88701 de algodón con un segundo progenitor que comprende el evento MON 88701 de algodón, dando como resultado un híbrido que comprende el ADN único y específico del evento MON 88701 de algodón. Cada progenitor puede ser un híbrido o una línea endogámica/varietal, siempre que el cruzamiento o el mejoramiento produzcan una planta o semilla de la invención, es decir, una semilla que tenga al menos un alelo que contenga el ADN del evento MON 88701 de algodón y/o una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10. De este modo, se pueden cruzar dos plantas transgénicas diferentes para producir descendientes híbridos que contienen dos genes exógenos independientemente, segregados, añadidos. Por ejemplo, el algodón tolerante a dicamba y glufosinato que contiene MON 88701 se puede cruzar con otras plantas de algodón transgénico para producir una planta que tenga las características de ambos progenitores transgénicos. Un ejemplo de esto sería un cruce de algodón tolerante a dicamba y glufosinato que contiene MON 88701 con una planta que tiene uno o más rasgos adicionales tales como tolerancia a herbicidas (por ejemplo, evento MON 1445 de algodón o evento MON 88913 de algodón) y/o control de insectos (por ejemplo, evento MON 15985, MON 757 o MON 531 de algodón), lo que resulta en una planta o semilla de la progenie que es tolerante a dicamba y glufosinato y tiene al menos uno o más rasgos adicionales. También se contemplan un retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

La invención proporciona una parte de la planta que se deriva de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701. Como se usa en este documento, una "parte de la planta" se refiere a cualquier parte de una planta que comprende material derivado de una planta de algodón que comprende el evento MON 88701. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, polen, óvulo, vaina, flor, tejido de la raíz o tallo, fibras y hojas. Las partes de la planta pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.

Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de la planta (tales como polen, óvulos, vainas, flores, raíces o tejidos del tallo y hojas) de la invención son, por lo tanto, útiles para, entre otras cosas, cultivar plantas con el fin de producir semillas y/o partes de plantas que comprenden el evento MON 88701 de algodón para fines agrícolas, producir una progenie que comprende el evento MON 88701 de algodón para fines de fitomejoramiento e investigación, uso con técnicas microbiológicas para aplicaciones industriales y de investigación, y venta a consumidores.

La invención proporciona procedimientos de control de las malas hierbas y procedimientos de producción de plantas utilizando herbicidas de dicamba y glufosinato y el evento MON 88701 de algodón. Se proporciona un procedimiento de control de las malas hierbas en un campo y consiste en plantar plantas varietales o híbridas el evento MON 88701 de algodón en un campo y la aplicar d una dosis herbicida eficaz de dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato en el campo con el fin de controlar las malezas en el campo sin dañar las plantas que contienen MON 88701. Dicha aplicación de herbicida de dicamba o glufosinato o de dicamba y glufosinato puede ser previa a la emergencia, es decir, en cualquier momento después de que se haya plantado semillas que contienen MON 88701 y antes de la emergencia de las plantas que contienen MON 88701, o posterior a la emergencia, es decir, en cualquier momento después de la emergencia de las plantas que contienen MON 88701. También se proporciona otro procedimiento de control de las malezas en un campo y consiste en aplicar una dosis efectiva de los herbicidas dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato para controlar las malezas en un campo y luego plantar plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701 en el campo. Dicha aplicación de los herbicidas dicamba o glufosinato o de dicamba y glufosinato se realizaría antes de la siembra, es decir, antes de que se plante la semilla que contiene MON 88701, y se puede hacer en cualquier momento antes de la siembra, incluidos, entre otros, aproximadamente 14 días antes de la siembra, hasta aproximadamente un 1 día antes de la siembra. La invención también proporciona un procedimiento de producción de semillas de algodón o hilas esencialmente libres de semillas de malezas sembrando semillas de plantas de algodón tolerantes a dicamba y glufosinato que comprenden MON 88701 en un campo, aplicando una dosis eficaz posterior a la emergencia de herbicidas de dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato, suficiente para matar la maleza en el campo, y cosechar semillas o hilas del campo. Una dosis herbicida eficaz de dicamba para uso en el campo debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,0056 kilogramos por hectárea hasta aproximadamente 17,94 kilogramos por hectárea de dicamba durante una temporada de crecimiento. En una realización, se aplica un total de aproximadamente 0,56 kilogramos por hectárea hasta aproximadamente 2,24 kilogramos por hectárea de dicamba durante una temporada de crecimiento. Se pueden usar múltiples aplicaciones de dicamba durante una temporada de crecimiento, por ejemplo, dos aplicaciones (como una aplicación previa a la siembra y una aplicación posterior a la emergencia o una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia) o tres aplicaciones (tales como una aplicación previa a la siembra, una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia). Una dosis herbicida eficaz de glufosinato para uso en el campo debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,0056 kilogramos por hectárea hasta aproximadamente 17,94 kilogramos por hectárea de glufosinato durante una temporada de crecimiento. En una realización, se aplica un total de aproximadamente 0,56 kilogramos por hectárea hasta aproximadamente 1,78 kilogramos por hectárea de glufosinato durante una temporada de crecimiento. Se pueden usar múltiples aplicaciones de glufosinato durante una temporada de crecimiento, por ejemplo, dos aplicaciones (como una aplicación previa a la siembra y una aplicación posterior a la emergencia o una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia) o tres aplicaciones (tales como una aplicación previa a la siembra, una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia o tres aplicaciones posteriores a la emergencia).

Se proporcionan procedimientos de producción de una planta de algodón tolerante a herbicidas que comprende las secuencias de ADN específicas y únicas para el evento MON 88701 de la invención. Las plantas transgénicas utilizadas en estos procedimientos pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de la progenie producidas por estos procedimientos pueden ser plantas varietales o híbridas; se pueden cultivar a partir de semillas producidas por una planta que contiene el evento MON 88701 de algodón y/o a partir de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento MON 88701 de algodón; y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de la progenie pueden autopolinizarse posteriormente para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén, o alternativamente pueden cruzarse, por ejemplo, criarse con otra planta no relacionada, para producir un varietal o una semilla o planta híbrida.

Se puede producir una planta de algodón que tolera la aplicación de los herbicidas dicamba y glufosinato al cruzar sexualmente una planta que contiene el evento MON 88701 que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10 con otra planta de algodón y, por lo tanto, producir semilla, que luego se cultivan en plantas de la progenie. Estas plantas de la progenie pueden tratarse luego con herbicidas de dicamba y/o glufosinato para seleccionar las plantas de la progenie que son tolerantes a los herbicidas de dicamba y glufosinato. Alternativamente, estas plantas de la progenie se pueden analizar utilizando procedimientos de diagnóstico para seleccionar las plantas de la progenie que contienen ADN del evento MON 88701. La otra planta utilizada en el cruce puede o no ser tolerante a los herbicidas dicamba y glufosinato y puede ser o no transgénica. La progenie de la planta y/o la semilla producida puede ser semilla varietal o híbrida. Al practicar este procedimiento, la etapa de cruzamiento sexual de una planta con otra planta, es decir, la polinización cruzada, se puede lograr o facilitar mediante la intervención humana, por ejemplo: recolectar a mano el polen de una planta y poner en contacto este polen con el estilo o el estigma de una segunda planta; por manos humanas y/o acciones que eliminan, destruyen o cubren el estambre o las anteras de una planta (por ejemplo, mediante el despendonación o aplicación de un gametocida químico) para prevenir la autopolinización natural y tener que realizar una polinización cruzada para que ocurra la fertilización; mediante la colocación humana de insectos polinizadores en una posición para "polinización dirigida" (por ejemplo, colocando colmenas en huertos o campos o enjaulando plantas con insectos polinizadores); mediante apertura o remoción por acción humana de partes de la flor para permitir la colocación o el contacto de polen foráneo en el estilo o estigma (por ejemplo, en la soja que naturalmente tiene flores que impiden o evitan la polinización cruzada, volviéndolas autopolinizadoras obligadas naturalmente sin intervención humana); mediante la colocación selectiva de plantas (por ejemplo, plantar intencionalmente plantas en la proximidad de la polinización); y/o mediante la aplicación de productos químicos para precipitar la floración o fomentar la receptividad (del estigma por el polen).

Una planta de algodón que tolera la aplicación de los herbicidas dicamba y glufosinato puede producirse mediante autofecundación de una planta que contiene el evento MON 88701 que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10 y, por lo tanto, producir semillas, que luego se cultivan en plantas de la progenie. Estas plantas de la progenie pueden luego tratarse con herbicidas dicamba y glufosinato para seleccionar las plantas de la progenie que son tolerantes a los herbicidas dicamba y glufosinato. Alternativamente, estas plantas de la progenie se pueden analizar utilizando procedimientos de diagnóstico para seleccionar las plantas de la progenie que contienen el ADN del evento MON 88701. Al practicar este procedimiento, la etapa de cruzar sexualmente una planta consigo mismo, es decir, la autopolinización o la autofecundación, puede lograrse o facilitarse mediante la intervención humana, por ejemplo: manos humanas recogen el polen de la planta y ponen en contacto este polen con el estilo o estigma de la misma planta y luego, opcionalmente, evitar la fertilización adicional de la planta; mediante manos humanas y/o acciones que eliminen, destruyan o cubran el estambre o las anteras de otras plantas cercanas (por ejemplo, mediante la despendonación o mediante la aplicación de un gametocida químico) para prevenir la polinización cruzada natural y la autopolinización tendría que producirse para que ocurra la fertilización; mediante la colocación humana de insectos polinizadores en una posición para "polinización dirigida" (por ejemplo, enjaulando una planta sola con insectos polinizadores); por la manipulación humana de la flor o sus partes para permitir la autopolinización; mediante la colocación selectiva de plantas (por ejemplo, plantar intencionalmente plantas más allá de la proximidad de la polinización); y/o mediante la aplicación de productos químicos para precipitar la floración o fomentar la receptividad (del estigma por el polen).

Las plantas y semillas de algodón de progenie abarcadas por estos procedimientos y producidas usando estos procedimientos serán distintas de otras plantas de algodón, por ejemplo porque las plantas y semillas de algodón de la progenie: son recombinantes y como tales se crean por intervención humana; son tolerantes a los herbicidas dicamba y glufosinato; contienen al menos un alelo que consiste en el ADN transgénico de la invención; y/o contienen una cantidad detectable de una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10. Una semilla puede seleccionarse de una planta de la progenie individual, y siempre que la semilla comprenda una molécula de ADN que tenga al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, estará dentro del ámbito de la invención.

En la práctica de la invención, se pueden cruzar dos plantas transgénicas diferentes para producir descendientes híbridos que contienen dos genes heterólogos que se segregan independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas homocigotas para ambos genes. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos que se usan comúnmente para diferentes características y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

Las plantas y semillas utilizadas en los procedimientos divulgaos en el presente documento también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifique una proteína o molécula de ARN que confiera un rasgo deseable que incluya, pero sin limitarse a, un aumento de la resistencia a los insectos, un aumento de la eficiencia en el uso del agua, un aumento del rendimiento, una mayor resistencia a la sequía, un aumento de la calidad de las semillas, una mejor calidad nutricional y/o mayor tolerancia a los herbicidas, en la que el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de algodón que carece de dicho transgén adicional.

Los procedimientos de la invención son, por lo tanto, útiles para, entre otras cosas, controlar malezas en un campo mientras se cultivan plantas con el fin de producir semillas y/o partes de plantas que comprenden el evento ^m Oⁿ 88701 de algodón con fines agrícolas o de investigación, seleccionando la progenie que comprende el evento MON 88701 de algodón con fines de fitomejoramiento o investigación, y la producción de plantas y semillas de la progenie que comprende el evento MON 88701 de algodón.

Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de plantas (tales como polen, óvulos, vainas, flores, raíces o tejidos del tallo y hojas), y productos básicos de la invención pueden evaluarse para determinar la composición del ADN, la expresión génica, y/o expresión de proteínas. Dicha evaluación se puede realizar utilizando cualquier procedimiento estándar, como PCR, transferencia Northern, análisis Southern, transferencia Western, Inmunoprecipitación y ELISA, o utilizando los procedimientos de detección y/o los kits de detección que se proporcionan en este documento.

Se proporcionan procedimientos de detección de la presencia de ADN derivado de una célula de algodón, tejido, semilla o planta que comprende el evento MON 88701 de algodón en una muestra. Un procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula, tejido, semilla o planta de algodón, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con al menos un cebador que sea capaz de producir una secuencia de ADN específica para el ADN de evento MON 88701 en condiciones apropiadas para la secuenciación de ADN, (iii) realizar una reacción de secuenciación de ADN y luego (iv) confirmar que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 88701, tal como una seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-10. Otro procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de algodón, tejido, semilla o planta, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con un par de cebadores que sea capaz de producir un amplicón de ADN del evento MON 88701 bajo condiciones apropiadas para la amplificación de ^a Dⁿ , (iii) realizar una reacción de amplificación de ADN y luego (iv) detectar la molécula de amplicón y/o confirmar que la secuencia de nucleótidos del amplicón comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 88701, tal como una seleccionada del grupo formado por las SEQ ID NO: 1-10. El amplicón debe ser uno que sea específico para el evento MON 88701, tal como un amplicón que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. La detección de una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 88701 en el amplicón es determinativa y/o diagnóstica de la presencia del ADN específico del evento MON 88701 de algodón en la muestra. Un ejemplo de un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón a partir del ADN del evento MON 88701 en condiciones apropiadas para la amplificación de ADN se proporciona como las SEQ ID NO: 11-12. Otros pares de cebadores pueden ser diseñados fácilmente por un experto en la técnica y comprenderían al menos un fragmento de la SEQ ID NO: 10. Otro procedimiento de detección de la presencia de ADN derivado de una célula de algodón, tejido, semilla o planta que comprende el evento MON 88701 de algodón en una muestra consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula, tejido, semilla o planta de algodón, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con una sonda de ADN específica para el ADN del evento MON 88701, (iii) permitir que la sonda y la muestra de ADN se hibriden en condiciones de hibridación rigurosas, y luego (iv) detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN objetivo. Un ejemplo de la secuencia de una sonda de ADN que es específica para el ADN del evento MON 88701 se proporciona como la SEQ ID NO: 13. Otras sondas pueden ser diseñadas fácilmente por un experto en la técnica y comprenderían al menos un fragmento de la SEQ ID NO: 10. La detección de la hibridación de la sonda con la muestra de ADN es diagnóstica de la presencia del ADN específico del evento MON 88701 de algodón en la muestra. La ausencia de hibridación es, alternativamente, un diagnóstico de la ausencia del ADN específico del evento MON 88701 de algodón en la muestra.

Se proporcionan kits de detección de ADN que son útiles para la identificación del ADN del evento MON 88701 de algodón en una muestra y también se pueden aplicar a procedimientos para el fitomejoramiento de plantas de algodón que contienen el ADN del evento apropiado. Tales kits contienen cebadores de ADN y/o sondas que comprenden fragmentos de las SEQ ID NO: 1-10. Un ejemplo de un kit de este tipo comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10 para funcionar como una sonda de ADN útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN derivado de plantas de algodón transgénicas que comprenden el evento MON 88701 en una muestra. El ADN derivado de plantas de algodón transgénico que comprenden el evento MON 88701 comprendería una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10. Se proporciona una molécula de ADN suficiente para usar como una sonda de ADN que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia y/o ausencia de ADN del evento MON 88701 de algodón en una muestra como la SEQ ID NO: 13. Otras sondas pueden ser fácilmente diseñadas por un experto en la técnica y debe comprender al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10 y ser suficientemente único para el ADN del evento MON 88701 de algodón para identificar el ADN derivado del evento. Otro tipo de kit comprende un par de cebadores útiles para producir un amplicón útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN derivado del evento MON 88701 de algodón transgénico en una muestra. Dicho kit emplearía un procedimiento que comprende poner en contacto una muestra de ADN objetivo con un par cebador como se describe en el presente documento, y luego realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico suficiente para producir un amplicón que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y luego detectar la presencia y/o ausencia del amplicón. Dicho procedimiento también puede incluir la secuenciación del amplicón o un fragmento del mismo, que sería determinante, es decir, de diagnóstico, de la presencia del ADN específico del evento MON 88701 de algodón en la muestra de ADN objetivo. Otros pares de cebadores pueden ser diseñados fácilmente por un experto en la técnica y deben comprender al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10 y ser lo suficientemente únicos para el ADN del evento MON 88701 del algodón para identificar el ADN derivado del evento.

La amplificación de ácidos nucleicos se puede lograr mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluidos los procedimientos de amplificación térmica. Se conocen muchas técnicas en el arte para detectar, cuantificar y/o secuenciar el amplicón producido por estos procedimientos. Una técnica ejemplar útil en la práctica de esta invención es TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Los kits y los procedimientos de detección de la invención son útiles para, entre otras cosas, identificar el evento MON 88701 de algodón, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento MON 88701 de algodón, detectar la presencia de ADN derivado de las plantas de algodón transgénico que comprenden el evento MON 88701 en una muestra, y monitorizar las muestras de la presencia y/o ausencia de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701 o partes de plantas derivadas de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701.

La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o las secuencias flanqueantes del evento MON 88701 de algodón se puede verificar (y corregir si es necesario) amplificando dichas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en este documento seguidas por secuenciación del ADN estándar del amplicón o del ADN clonado.

Como se usa en el presente documento, el término "que comprende" significa "que incluye pero no se limita a". Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas realizaciones de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Transformación de algodón y selección del evento MON 88701

Este ejemplo describe la producción, el análisis y la selección del evento MON 88701. Se resume la producción y el análisis de miles de plantas individuales durante varios años a través de las rigurosas pruebas moleculares, fenotípicas y de campo requeridas para la selección final del evento comercial, el evento MON 88701.

El evento MON 88701 de algodón transgénico tolerante a dicamba y glufosinato se creó a través de la transformación mediada por Agrobacterium del tejido de hipocótilo de algodón utilizando un vector de transformación de plantas que comprende el casete de expresión ilustrado en la Figura 1. Los procedimientos para transformar algodón son conocidos en la técnica. Para producir el evento MON 88701, se utilizó material de algodón Coker 130 (Asgrow, St Louis, MO) para la transformación de plantas. Las células de algodón se transformaron y se regeneraron en plantas de algodón intactas. Las plantas con raíces con características fenotípicas normales se seleccionaron y se transfirieron al suelo para su crecimiento y evaluación adicional.

Las plantas R0 se transfirieron al suelo y se sometieron a una selección de herbicida a tasas de campo 1X o 2X (es decir, 0,56 o 1,121 kg/ha de ingrediente activo) tanto de dicamba como de glufosinato. Posteriormente, se identificaron y seleccionaron plantas R0 que contenían solo un único casete de expresión de T-ADN. El casete de expresión de T-ADN contiene el promotor del virus de la raya clorótica del maní (PC1SV) con una región potenciadora duplicada (P-PC1SV.FLt-enh); enlazado operativamente a un líder de ADN derivado de la transcripción del ARN del virus del grabado del tabaco (L-TEV); enlazado operativamente a una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto del terminal N del péptido de tránsito del cloroplasto de 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfatosintasa (EPSPS) de Arabidopsis thaliana (TS-CTP2); enlazado operativamente a una molécula de ADN que codifica dicamba monooxigenasa (DMO) de Stenotrophomonas maltophilia; enlazado operativamente a una ^{molécula de ADN 3' UTR derivada del gen E}6 ^{de la proteína de fibra del algodón de las islas marinas (T-Gb.E6-3b);} enlazado operativamente al promotor del transcripto de ARN 35S mejorado (con una región potenciadora duplicada) del virus del mosaico de la coliflor (P-CaMV.35S-enh); enlazado operativamente a un líder de ADN derivado de la región no traducida 5' del gen de la proteína 70 (HSP70) de choque térmico de Petunia x hybrida (L-Ph.DnaK); enlazado operativamente al gen de resistencia a Bialaphos (bar) de Streptomyces hygroscopicus que codifica una fosfinotricina acetil transferasa (PAT) (CR-Sh.bar); enlazado operativamente a una región no traducida 3' del gen de la nopalina sintasa (NOS) (que dirige la poliadenilación del ARNm) de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos).

El evento MON 88701 se seleccionó entre aproximadamente 151 eventos transgénicos individuales en función de su combinación superior de características fenotípicas (incluida la tolerancia a nivel comercial tanto a los herbicidas dicamba como glufosinato), las características moleculares (determinadas utilizando un análisis completo del perfil molecular), y asociación de haplotipos. La selección del evento MON 88701 de entre los 151 eventos transgénicos originales fue un procedimiento de varios años que requirió análisis de datos en cada etapa. Se procesaron dos oleadas de eventos de transformación para permitir un mayor número de eventos entre los cuales elegir el evento comercial final. La Tabla 1 proporciona un sumario de cada tipo de análisis con el número de eventos seleccionados y avanzados para cada etapa de la selección del evento. La selección de la eficacia de la prueba de campo de Puerto Rico para la Ola 2 precedió a la primera prueba de campo en los EE. UU.

Tabla 1

Los 151 eventos transgénicos R0 originales se analizaron utilizando una combinación de técnicas analíticas (Análisis de la Calidad de la Transformación incluyendo los análisis TaqMan y/o PCR) y el Análisis de Eficacia del Herbicida R0 (rociado del herbicida). Las plantas seleccionadas que contenían el evento R0 se autofertilizaron para producir la semilla R1, y luego se avanzaron 32 de los eventos para el Análisis de Eficacia del Herbicida R1.

Se completó el análisis molecular detallado de los eventos que pasaron los ensayos de campo agronómicos y de eficacia. Se usaron transferencias Northern para confirmar que los transcritos de ^a Rⁿ mensajero bar y dmo estaban presentes en muestras preparadas a partir de semillas de los eventos probados. Se realizó un análisis de transferencia Western para confirmar que una única banda de proteína DMO y PAT estaba presente en muestras preparadas a partir de tejido de hoja de los eventos probados. La secuenciación del terminal N de la proteína PAT purificada aislada mostró la secuencia de aminoácidos esperada en el terminal N de la proteína PAT. La secuenciación del terminal N de la proteína DMO aislada y purificada mostró 9 aminoácidos de la CTP (TS-CTP2) presentes en el terminal N de la proteína DMO.

La prueba de campo agronómico consistió en sembrar eventos de isolínea positiva e isolínea emparejados (que contienen el casete del transgén y carecen del casete del transgén, respectivamente) lado a lado con dos filas de Coker 130 de tipo silvestre (no transgénico) por parcela. Las parcelas se mantuvieron libres de malezas e insectos mediante programas de control convencionales durante la duración del ensayo. Los datos recopilados incluyeron la fecha de siembra, el número de plantas, la altura de la planta, el número de nodos, las diferencias brutas agronómicas/fenotípicas, las muestras de cápsulas, la fecha de cosecha y el rendimiento. El número de plantas para cada parcela se tomaron 10 días después de la siembra (DAP) y nuevamente a 20 DAP. Los cotiledones que habían limpiado completamente el suelo se consideraron "germinados". Se notaron las diferencias observadas en la densidad de la planta, es decir, saltos, germinación deficiente, pérdida debida a la formación de costras, lavados, etc. Las plantaciones finales tenían 10 plantas por metro en promedio. Las medidas de altura de la planta se tomaron en la primera floración más dos semanas (FF2). Se registraron las medidas promedio de la altura de la planta (cm) de cinco plantas por parcela. En las mismas plantas utilizadas para las mediciones de la altura de las plantas, se contó el número de nodos (el cotiledón es el nodo 0). Se registraron diferencias agronómicas importantes, como la morfología de las hojas, el hábito de ramificación, el color de las hojas, el tiempo de floración, el patrón de fructificación, etc. Las muestras de cápsulas se recolectaron aleatoriamente de 50 cápsulas de primera posición (solo algodón de semilla) de la mitad de las plantas (notas 8-12). Las muestras de cápsulas se utilizaron para calcular la fracción de hilas y la calidad de la fibra. Para las determinaciones de rendimiento, las parcelas se defoliaron y se usó un abridor de cápsulas (con etefón, es decir, PREP) antes de la cosecha. Las parcelas se recolectaron y registraron como kilogramos por parcela de algodón de semilla y se expresaron como kilogramos por hectárea de algodón de semilla. No hubo diferencia significativa en el rendimiento entre los eventos de isolínea positiva, los eventos de isolínea negativa emparejada y el algodón Coker 130 de tipo silvestre durante dos años de ensayos de campo agronómico (Figura 2).

En el año 1, se realizaron pruebas de eficacia con ocho eventos en comparación con Coker 130 de tipo silvestre, no transgénico. Para esta prueba, se rociaron parcelas apareadas con dicamba (Clarity®, BASF, Research Triangle Park, NC) y glufosinato. (Ignite®, Bayer CropScience, Research Triangle Park, NC) o se dejaron sin rociar. Las parcelas se mantuvieron libres de malezas e insectos utilizando programas de control convencionales durante la duración del ensayo. Todos los tratamientos con herbicidas se representan como kilogramos de ingrediente activo por hectárea (kg/ha). Para las parcelas que se rociaron, se realizaron las siguientes aplicaciones: dicamba se aplicó ^{previo a la emergencia a razón de} 1,121 ^{kg/ha seguido de glufosinato aplicado} 1,22 ^{kg/ha en la etapa de} 2 ^nodos, seguido de dicamba aplicado a razón de 1,121 kg/ha en la etapa de 5 nodos, seguido de glufosinato aplicado, a ^{razón de} 1,22 ^{kg/ha en la etapa de} 8 ^{nodos, seguido de dicamba aplicado a razón de} 1,121 ^{kg/ha en la etapa de} 12 nodos. Ni el dicamba ni el glufosinato se aplicaron con tensioactivos, aditivos, fertilizantes u otros adyuvantes. Los índices de lesiones se tomaron en las siguientes etapas, que fueron inmediatamente antes de la siguiente aplicación ^{de herbicida asignada: en la etapa de algodón de} 2 ^{nodos, el índice de actividad se tomó por el porcentaje de} epinastia (daño por dicamba) y el porcentaje de lesión total, con enfoque en la epinastia; en la etapa de 5 nodos, el índice de actividad se tomó por el porcentaje de epinastia, el porcentaje quemado o de necrosis (lesión por ^{glufosinato) y el porcentaje de lesión total, con enfoque en necrosis; en la etapa de} 8 ^{nodos, el índice de actividad se} realizó por el porcentaje de epinastia, el porcentaje quemado o de necrosis y el porcentaje de lesión total, con ^{enfoque en epinastia; en la etapa de} 12 ^{nodos, el índice de actividad se realizó por el porcentaje de epinastia, el} porcentaje quemado o de necrosis y el porcentaje de lesión total, con enfoque en necrosis; en la etapa de floración media, el índice de actividad se tomó por el porcentaje de epinastia, el porcentaje quemado o de necrosis y el porcentaje de lesión total, con enfoque en epinastia; y para la etapa de floración tardía, el índice de actividad se tomó por porcentaje de epinastia, el porcentaje quemado o de necrosis y el porcentaje de lesión total. Se recopilaron datos agronómicos adicionales en estos ensayos de campo de eficacia, que incluyen: fecha de siembra, el número de plantas (tomado a 7 y 14 DAP), diferencias brutas agronómicas/fenotípicas, fecha de cosecha y rendimiento. Los ^{índices de lesiones utilizaron escalas porcentuales estándar de la ciencia de malezas, donde} 0^{% es igual a ninguna} lesión en el cultivo y 100% es igual a la muerte completa del cultivo. Los índices elaborados para la lesión por dicamba se conocen como epinastia y aparecen como torsión, malformación del crecimiento. Los índices elaborados para lesión por glufosinato se conocen como quemaduras o necrosis y aparecen como clorosis y/o necrosis. Para las determinaciones de rendimiento, las parcelas se defoliaron y se usó un abridor de cápsulas (con etefón, es decir, PREP) antes de la cosecha. Las parcelas se recolectaron y el rendimiento se registró como kg/parcela de algodón de semilla y se expresó como kg/ha de algodón de semilla. Se observaron diferencias agronómicas/fenotípicas en el perfil de fructificación como normal o inusual. No hubo diferencia significativa en el rendimiento del algodón de semilla entre los eventos emparejados rociados y no rociados en comparación con Coker 130 de tipo silvestre no rociado (Figura 3). El Coker 130 de tipo silvestre no sobrevivió al régimen de rociado (Figura 7).

En el año 2, se realizaron pruebas de eficacia con doce eventos en comparación con Coker 130 de tipo silvestre, no transgénico. Para esta prueba, las parcelas emparejadas se rociaron o no se rociaron. Las parcelas se mantuvieron libres de malezas e insectos utilizando programas de control convencionales durante la duración del ensayo. Para las parcelas que se rociaron, se realizaron las siguientes aplicaciones de tratamiento (1) 0,56 kg/ha de dicamba aplicado PRE, POST temprano, POST medio y POST tardío; (2) 1.121 kg/ha de dicamba aplicado PRE, POST temprano, POST medio y POST tardío; (3) 2,24 kg/ha de dicamba aplicada PRE, POST temprano, POST medio y P^o S^t tardío; (4) glufosinato de 0,56 kg/ha aplicado POST temprano, P^o ST medio y POST tardío: (5) 1,121 kg/ha de ^{glufosinato aplicado POST temprano, POsT medio y POST tardío:} 6^{) 2,24 kg/ha aplicado POST temprano, POST} medio y POST tardío; y 7) Control (sin rociar). La preemergencia (PRE) se define como inmediatamente después de la siembra del algodón (dentro de las 24 horas); POST temprano como algodón de 2 nodos; POST medio como ^{algodón de} 8 ^{nodos; y POST tardío como algodón de 14 nodos. Para estos ensayos de eficacia de campo, hubo tres} parcelas compuestas completamente de algodón de tipo silvestre (Coker 130). En cada medida de tiempo posterior a la emergencia (temprana, media, tardía), se roció la mitad de una parcela con la tasa IX (0,56 kg/ha) de dicamba y la mitad de la misma parcela se roció con la tasa IX (0,56 kg/ha) de glufosinato. Cada una de las tres parcelas recibió rociado de dicamba y glufosinato en una de las aplicaciones de rociado en cada medida de tiempo posterior a la emergencia (temprana, media, tardía).

El protocolo de rociado consistió en los herbicidas aplicados a razón de 93,54 litros por hectárea de volumen de agua usando la siguiente configuración del rociador (que está dentro de los estándares utilizados para la mayoría de las investigaciones científicas sobre malezas). Se utilizaron puntas de rociado XR TeeJet® de intervalo extendido plano con un ángulo de rociado de 80 grados (TeeJet Technologies, Wheaton, IL). Había 2 boquillas por fila (boquillas espaciadas en filas de 38,1 cm por 76,2 cm, filas de 48,26 cm por 96,52 cm y filas de 50,8 cm por 101,6 cm). El tamaño de la boquilla depende de la velocidad del rociador y del espaciado de la boquilla; sin embargo, el tamaño de la boquilla se seleccionó para dar como resultado una presión de rociado de 172,3 kPa a 241,3 kPa. La altura de la pluma se ajustó para permitir un solapamiento de rociado del 50% (que se produce aproximadamente a 76,2 cm por encima de la parte superior del cultivo).

En cada tiempo de calificación, se registraron las siguientes observaciones: 1) porcentaje de necrosis o quemaduras en las hojas más afectadas; 2) porcentaje de necrosis o quemaduras en una planta entera; 3) epinastia; y 4) cualquier otra lesión relevante que se haya observado. Las calificaciones se tomaron cuatro días después de cada aplicación e inmediatamente antes de las aplicaciones posteriores. El cronograma de calificación y el objetivo fueron los siguientes: 1) 4-7 días después de la emergencia y nuevamente inmediatamente antes del rociado de 2 nodos para verificar los efectos previos a la emergencia del rociado con dicamba; 2) 4 días después del rociado de 2 nodos ^{y nuevamente inmediatamente antes del rociado de} 8 ^{nodos para determinar la calificación del rociador de} 2 ^{nodos; 3); 4 días después del rociado de} 8 ^{nodos y otra vez inmediatamente antes del rociado de 14 nodos para determinar la calificación del rociador de} 8 ^{nodos 4); 4 días después del rociado de 14 nodos y nuevamente 10 días después del} rociado de 14 nodos para determinar la calificación del rociado de 14 nodos; y 5) en el recorte para determinar la calificación de temporada tardía del efecto neto de todos los rociados. Las calificaciones de lesiones utilizaron ^{escalas porcentuales estándar de la ciencia de malezas, donde} 0^{% es igual a ninguna lesión en el cultivo y} 100^{% es} igual a la muerte completa del cultivo. Las calificaciones hechas para las lesiones por dicamba se conocen como epinastia y aparecen como torsión, malformación del crecimiento. Las calificaciones hechas para la lesión por glufosinato se conocen como quemaduras o necrosis y aparecen como clorosis y/o necrosis. Para las determinaciones de rendimiento, las parcelas se defoliaron y se usó un abridor de cápsulas (con etefón, es decir, PREP) antes de la cosecha. Las parcelas se cosecharon y registraron como kg/parcela de algodón de semilla y se expresaron como kg/ha de algodón de semilla. Las plantas Coker 130 de tipo silvestre no sobrevivieron a la aplicación de herbicida y, por lo tanto, no se registraron rendimientos en las parcelas de Coker 130. Como se observa en la Figura 4.A, el rendimiento fue casi equivalente para las plantas que comprenden el evento MON 88701 con tasas de aplicación crecientes del herbicida dicamba. Como se observa en la Figura 4.B, el rendimiento fue casi equivalente para las plantas que comprenden el evento MON 88701 con tasas de aplicación crecientes del herbicida glufosinato. Para las clasificaciones de lesiones, la Figura 5.A muestra un mayor porcentaje de lesiones en plantas que comprenden el evento MON 88701 con el aumento de las tasas de aplicación de dicamba. La Figura 5.B muestra un mayor porcentaje de lesiones en plantas que comprenden el evento MON 88701 con tasas de aplicación crecientes de glufosinato.

En el año 3, se realizaron pruebas de campo de eficacia del evento MON 88701 para estudiar la velocidad y el momento de la aplicación de dicamba y/o glufosinato. Las parcelas se mantuvieron libres de malezas e insectos utilizando programas de control convencionales durante la duración del ensayo. El tratamiento y el tiempo de aplicación se detallan en la Tabla 2. Ni el herbicida dicamba ni el glufosinato se aplicaron con tensioactivos, aditivos fertilizantes u otros adyuvantes. El protocolo del rociador fue como se describe para las pruebas de campo de eficacia del año 2. La calificación del soporte, la calificación visual de la lesión (porcentaje de epinastia, porcentaje de necrosis), la altura de la planta y el número de nodos, muestreo de 50 cápsulas y determinaciones de rendimiento fueron las descritas anteriormente para las pruebas de campo de eficacia y agronómicas.

Tabla 2

continuación

Hubo un ligero arrastre en el rendimiento cuando el herbicida dicamba y el glufosinato se mezclaron en el tanque y ^{se aplicaron cuatro veces durante la estación a razón de 1,121 kg g/ha cada uno (Figura} 6^{). Para todos los demás} regímenes de tratamiento, no hubo pérdida de rendimiento para las plantas que comprenden el evento MON 88701 ^{cuando se rociaron con dicamba, glufosinato o dicamba y glufosinato (Figura} 6^).

Ejemplo 2: Caracterización de secuencias de ADN de MON 88701

Este ejemplo describe la caracterización molecular del evento MON 88701. El ADN insertado en el genoma de las plantas de algodón que comprende MON 88701 y la secuencia genómica que flanquea esta inserción se caracterizaron mediante análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: la secuencia de inserción, el número de inserción (número de sitios de integración dentro del genoma del algodón), el número de copia (número de copias de ADN transgénico dentro de un locus), la integridad del casete del gen insertado, las secuencias flanqueantes y la asociación de la inserción con las regiones haplotípicas del genoma del algodón.

Se usaron sondas moleculares de ADN que incluían la región de codificación intacta y sus respectivos elementos reguladores, los promotores, los intrones y las secuencias de poliadenilación de los casetes de expresión de la planta. El análisis mostró que MON 88701 contiene una sola inserción de ADN transgénico con una copia del casete de expresión. La PCR inversa y los análisis de secuencia de ADN se realizaron para determinar las uniones del genoma de inserción en la planta en 5' y 3', confirman la organización de los elementos dentro de la inserción (Figura 1) y determinan la secuencia de ADN completa de la inserción en plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701 (proporcionado en este documento como la SEQ ID NO: 9). Una planta de algodón que comprende en su genoma los elementos genéticos transgénicos enlazados que se muestran en la Figura 1 y es resistente a los herbicidas dicamba y glufosinato es un aspecto de la invención.

Las secuencias que flanquean la inserción del ADN transgénico en MON 88701 se determinaron usando PCR inversa como se describe en Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.) y/o técnicas de navegación genómica. El ADN genómico de la planta se aisló tanto de la línea de algodón Coker 130 como de las líneas de algodón transgénico del tejido cultivado en condiciones estándar de invernadero. Aproximadamente 0,2 gramos de tejido de hoja joven se liofilizaron y se pulverizaron mediante la adición de varias perlas de acero pequeñas seguido de una vigorosa agitación. El tejido se lavó dos veces con 5 ml de metanol al 100% seguido de un lavado con 5 ml de metanol al 50% para eliminar los compuestos fenólicos interferentes. El ADN se extrajo mediante la adición de 7 ml de tampón de extracción CTAB (Tris 100 mM, pH 8,0, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 2% p/v, polivinilpirrolidona 1% p/v, poli(vinilpolipirrolidona) al 1% p/v, beta-mercaptoetanol al 0,07%, DTT 1 mM). Las muestras se incubaron a 65 °C durante 45 minutos para lisar completamente las células y, a continuación, se centrifugaron durante 5 minutos a 3.000 g para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante se extrajo con 7 ml de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1, se centrifugó a 3.000 g durante 5 minutos para separar las fases y se extrajo el ADN de la fase acuosa en un ^{tubo nuevo mediante la adición de} 6 ^{ml de isopropanol. Los sedimentos de ADN se lavaron con} 6 ^{ml de etanol al} 70% para eliminar las sales, y los sedimentos se dejaron secar al aire. Los sedimentos de ADN se resuspendieron en Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía 0,5 ug/ml de RNasa libre de DNasa y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después del tratamiento, el ADN se cuantificó utilizando Quant-iTMR PicoGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Un experto en la técnica puede modificar este procedimiento para extraer ADN de cualquier tejido de algodón. Se digirió una parte alícuota de ADN con endonucleasas de restricción seleccionadas en base al análisis de restricción del ADN transgénico. Después de la autoligación de los fragmentos de restricción, la PCR se realizó utilizando cebadores diseñados a partir de la secuencia de ADN transgénica que amplificaría las secuencias que se alejan de los extremos 5' y 3' del ADN transgénico. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron utilizando un kit de purificación de gel QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Los siguientes productos de ADN se secuenciaron directamente utilizando protocolos estándar de secuenciación de ADN. La secuencia flanqueante 5' que se extiende hacia la secuencia del borde derecho del ADN transgénico del casete de expresión se presenta como la SEQ ID NO: 7 ([C], véase la Figura 1). La secuencia flanqueante 3' que se extiende hacia la secuencia del borde izquierdo del ADN transgénico del casete de expresión se presenta como la ^{SEQ ID NO:} 8 ^{([D], véase la Figura 1). La porción del ADN del casete de expresión que se integró completamente en} el ADN genómico de Coker se presenta como la SEQ ID NO: 9 ([E], véase la Figura 1).

Las secuencias de moléculas de ADN aisladas se compararon con la secuencia de ADN transgénica para identificar la secuencia flanqueante y el fragmento de ADN transgénico aislado conjuntamente. La confirmación de la presencia del casete de expresión se logró mediante PCR con cebadores diseñados en base a los datos de secuencia de flanqueo deducidos y la secuencia de ADN transgénica conocida. La secuencia de tipo silvestre correspondiente a la misma región en la que se integró el ADN transgénico en la línea transformada se aisló utilizando cebadores diseñados a partir de las secuencias flanqueantes en MON 88701. Las reacciones PCR se realizaron utilizando la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion® con tampón HF (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las secuencias de ADN flanqueantes en MON 88701 y la secuencia de tipo silvestre de Coker se analizaron frente a múltiples bases de datos de nucleótidos y proteínas. Esta información se utilizó para examinar la relación del transgén con el genoma de la planta y para buscar la integridad del sitio de inserción. La secuencia de flanqueo y las secuencias de tipo silvestre se utilizaron para diseñar cebadores para los ensayos de punto final tAq m An® utilizados para identificar los eventos. Los ensayos de cigosidad se desarrollaron utilizando esta información.

El casete del transgén de tolerancia a dicamba y glufosinato se mapeó en plantas de algodón que comprenden el evento MON 88701 en el cromosoma A08 en la posición del mapa de 19,3 cM y se limitó con NG0207927 en la posición del mapa de 18,6 cM a la izquierda y con NG0207529 en la posición del mapa de 20,0 cM a la derecha.

Ejemplo 3: Ensayos TAQMAN® de punto final específicos del evento

Este ejemplo describe un procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final específico del evento desarrollado para identificar el evento MON 88701 en una muestra. Los ejemplos de condiciones útiles con el procedimiento TAQMAN® de punto final específico del evento MON 88701 son los siguientes: Etapa 1: agua de 18 megaohmios ajustada para un volumen final de 10 pl. Etapa 2: 5,0 pl de mezcla maestra universal 2X (dNTP, enzima, tampón) a una concentración final IX. Etapa 3: 0,5 pl de Cebador del Evento 1 (SQ21654) y cebador del evento 2 (SQ23205). Mezcla (resuspendida en agua de 18 megaohmios a una concentración de 20 uM para cada cebador) a una concentración final de 1,0 pM (por ejemplo, en un tubo de microcentrífuga, se debe agregar lo siguiente para lograr 500 pl a una concentración final de 20 uM: 100 pl de cebador SQ21654 a una concentración de 100 ^pM; 100 ^{pl de cebador SQ23205 a una concentración de} 100 ^{pM; 300 pl de agua de 18 megaohmios). Etapa 4: 0,2 pl de sonda MGB PB10280}6^{-FAMMR del evento (resuspendido en agua de 18 megaohmios a una concentración} de 10 pM hasta una concentración final de 0,2 pM. Etapa 5: 0,5 pl de mezcla de cebador de control interno 1 y cebador de control interno 2 (resuspendida en agua de 18 megaohmios a una concentración de 20 pM para cada ^{cebador) hasta una concentración final de 1,0 pM. Etapa} 6^{: 0,2 pl de sonda VICMR de control interno hasta 0,2 pM de} concentración final (resuspendida en agua de 18 megaohmios a una concentración de 10 pM) Etapa 7: 3,0 pl de ADN extraído (plantilla) para cada muestra y cada uno de los siguientes contiene 1. Muestras de hojas que se analizarán; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Control de agua negativo (sin plantilla); 4. ADN de MON ^{88701 de control positivo. Etapa} 8^{: Las condiciones del termociclador son las siguientes: Un ciclo a 50 °C durante 2} minutos; un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de 95 °C durante 15 segundos, luego a 64 °C durante 1 minuto con -1 °C/ciclo; treinta ciclos de 95 °C durante 15 segundos y luego 54 °C 1 minuto, opcional 10 a 20 ciclos adicionales (95 °C durante 15 segundos, luego 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo) puede proporcionar una separación más clara de la población durante el análisis TaqMan® de punto final; ciclo final de 10 °C.

Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo de punto final son los cebadores SQ21654 (SEQ ID NO: 11), ^{SQ23205 (SEQ ID NO: 12) y la sonda PB10280 marcada con} 6^{-FAMMR (SEQ ID NO: 13).} 6^{-FAMMR es un producto} de colorante fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) unido a la sonda de ADN. Para las sondas TAQMAN® MGBMR, la actividad de exonucleasa 5' de la ADN polimerasa Taq escinde la sonda del extremo 5', entre el fluoróforo y el inhibidor. Cuando se hibrida con la cadena de ADN objetivo, el inhibidor y el fluoróforo se separan lo suficiente como para producir una señal fluorescente, liberando así la fluorescencia. SQ21654 (SEQ ID NO: 11) y SQ23205 (SEQ ID nO: 12) cuando se usan con estos procedimientos de reacción con PB10280 (SEQ ID NO: 13) produce un amplicón de ADN que es diagnóstico del ^a Dⁿ del evento MON 88701. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo del algodón que contiene ADN del evento MON 88701, un control negativo del algodón no transgénico y un control negativo que no contiene ADN plantilla. Además, un control para la reacción PCR incluye cebadores de control interno y una sonda de control interno, específica para un gen de copia única en el genoma de Gossypium. Un experto en la técnica sabrá cómo diseñar cebadores específicos para un gen de copia única en el genoma de Gossypium. Estos ensayos están optimizados para su uso con el sistema de PCR GeneAmp® 9700 de Applied Biosystems (que se ejecuta a máxima velocidad) o con el termociclador MJ Research DNA Engine PTC-225. Otros procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican el ADN del evento MON 88701 están dentro de la experiencia de la técnica.

Se dejó que las plantas R0 que demostraban la presencia del casete de expresión se desarrollaran en plantas completamente maduras y se cosecharon semillas de estas. Se utilizaron sondas basadas en la secuencia del casete de expresión para determinar el número de copias del casete de expresión transgénico en las plantas R1 utilizando una combinación de análisis Southern y TAQMAN® de punto final.

Un ensayo de cigosidad es útil para determinar si una planta que comprende un evento es homocigota para el ADN del evento; es decir, que comprende el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par cromosómico; o heterocigoto para un evento de ADN, que comprende el ADN exógeno en un solo cromosoma de un par cromosómico; o es nulo para el ADN del evento, que es de tipo silvestre. El procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final también se usó para desarrollar ensayos de cigosidad para el evento MON 88701. Este ejemplo describe un procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final específico del evento desarrollado para determinar la cigosidad del evento MON 88701 en una muestra. Para este ensayo, se empleó un ensayo de tres cebadores en el que el cebador SQ21654 se hibrida y se extiende específicamente desde la unión 3' del ADN exógeno insertado y el ADN genómico, el cebador SQ23205 se hibrida y se extiende específicamente desde el ADN que flanquea el lado 3' del ADN exógeno insertado, y el cebador SQ23901 hibrida y se extiende específicamente del ADN genómico en el que se integró el ADN exógeno insertado. Los tres cebadores son diagnósticos para el evento. En este ejemplo, el cebador SQ21654 y el cebador SQ23205 y la sonda de ^{oligonucleótido PB10280 marcada con} 6^{-FAm mr son diagnósticos cuando hay una copia del ADN exógeno} insertado. En este ejemplo, SQ23205 y el cebador SQ23901 y la sonda de oligonucleótidos PB10631 marcada con VICMR son diagnósticos cuando no hay una copia del ADN exógeno insertado presente en el ADN genómico, es decir, de tipo silvestre. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con el ADN extraído de una planta homocigota para el evento MON 88701, solo hay una señal fluorescente de la sonda de ^{oligonucleótidos Pb 10280 marcada con} 6^{-FAMMR, que es indicativa y diagnóstica de una planta homocigota para el} evento MON 88701. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con el ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON 88701, existe una señal fluorescente tanto de la sonda de ^{oligonucleótidos PB10280 marcada con} 6^{-FAMMR como de la sonda de oligonucleótidos PB10631 marcada con} VICMR, que es indicativa y diagnóstica de una planta heterocigota para el evento MON 88701. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta que es nulo para el evento MON 88701 (es decir, de tipo silvestre), hay una señal fluorescente solo de la sonda de oligonucleótido PB10631 marcada con VICMR que es indicativa y diagnóstica para una planta nula para el evento MON 88701, es decir, de tipo silvestre. Ejemplos de condiciones útiles con este procedimiento son los siguientes. Etapa 1: agua de 18 megaohmios ajustada para un volumen final de 10 pl. Etapa 2: 5,0 pl de mezcla master universal 2X (Applied Biosystems cat # 4304437; dNTP, enzima, tampón) a una concentración final IX. Etapa 3: 0,5 pl de cebadores de cigosidad SQ21654; SQ23205 y SQ23901 (resuspendidos en agua de 18 megaohmios a una concentración de 20 ^{pM para cada cebador) a una concentración final de 1,0 pM. Etapa 4: 0,2 pl de la sonda PB10280} 6^-FAMMR (resuspendida en agua de 18 megaohmios a una concentración de 10 pM) a una concentración final de 0,2 pM. Etapa 5: 0,2 pl de sonda PB10631 VICMR (resuspendida en agua de 18 megaohmios a una concentración de 10 pM) ^{a una concentración final de 0,2 pM. Etapa} 6^{: 3,0 pl de ADN extraído (plantilla) para cada muestra, y cada uno de los} siguientes contiene 1. Muestras de hojas que se analizarán (4-5 ng/pl de ADN genómico diluido en agua); 2. Control negativo (ADN de algodón no transgénico; 5 ng/pl diluido en agua); 3. Control de agua negativo (sin plantilla; solución en la que se resuspendió el ADN); 4. ADN genómico de MON 88701 como control positivo de una muestra heterocigota conocida (5 ng/pl diluida en agua); 5. 4. ADN genómico de MON 88701 como control positivo de una ^{muestra homocigota conocida (5 ng/pl diluida en agua). Etapa 7: Mezclar suavemente. Etapa} 8^{: Condiciones del} termociclador al usar el sistema de PCR GeneAmp® 9700 de Applied Biosystems (a velocidad máxima) o el termociclador MJ Research ADN Engine PTC-225 son las siguientes: Un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de (95 °C durante 15 segundos y luego a 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo); treinta ciclos de (95 °C durante 15 segundos y luego a 54 °C durante 1 minuto); 10 a 20 ciclos adicionales opcionales (95 °C durante 15 segundos y luego a 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo) pueden proporcionar una separación más clara de la población durante el análisis TaqMan® de punto final; un ciclo a 10 °C de mantenimiento.

Ejemplo 4: Identificación del evento MON 88701 en cualquier actividad de reproducción de algodón

Este ejemplo describe cómo se puede identificar el evento MON 88701 dentro de la progenie de cualquier actividad de reproducción de algodón. Los pares de cebadores de eventos de ADN se utilizan para producir un diagnóstico de amplicón para el evento MON 88701 de algodón. Un diagnóstico de amplicón para MON 88701 comprende al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-10. Los pares de cebadores de eventos que producirán un amplicón de diagnóstico para MON 88701 incluyen pares de cebadores basados en las secuencias flanqueantes y el casete de expresión insertado. Por ejemplo, para producir un amplicón de diagnóstico en el que se encuentra la SEQ ID NO: 1, se diseñaría un cebador directo basado en la parte de la secuencia flanqueante genómica de la SEQ ID NO: 7 y un cebador inverso basado en la secuencia de ADN insertada en el casete de expresión con los cebadores de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridar específicamente con el a Dn del evento. Para producir un amplicón de diagnóstico en el que se encuentra la SEQ ID NO: 2, se diseñaría un cebador directo basado en la secuencia de ADN del casete de expresión insertado y un cebador inverso basado en ^{la parte de la secuencia flanqueante genómica de la SEQ ID NO:} 8 ^{con los cebadores de longitud suficiente de} nucleótidos contiguos para hibridar específicamente con el ADN del evento. Para propósitos prácticos, se deben ^{diseñar cebadores que produzcan amplicones de un intervalo de tamaño limitado, por ejemplo, entre} 100 ^y 1.000 bases. Los amplicones de tamaño más pequeño (longitud de polinucleótido más corto) en general se producen de manera más confiable en las reacciones PCR, permiten tiempos de ciclo más cortos, y pueden separarse y visualizarse fácilmente en geles de agarosa o adaptarse para su uso en ensayos tipo TAQMAN® de punto final. Se pueden producir y detectar amplicones más pequeños mediante procedimientos conocidos en la técnica de detección de amplicones de ADN. Además, los amplicones producidos utilizando los pares de cebadores pueden clonarse en vectores, propagarse, aislarse y secuenciarse o pueden secuenciarse directamente con procedimientos bien establecidos en la técnica. Un par de cebadores que sea útil en un procedimiento de amplificación de ADN para

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10, y sus complementos, en la que la molécula de ADN recombinante comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a una planta de algodón.

2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, que comprende las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1 y 2.

3. Una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10.

4. Una planta, semilla, célula de algodón recombinante o parte de la planta que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-8 o 10, y sus complementos, en la que la molécula de ADN recombinante comprende un casete de expresión transgénico integrado que confiere tolerancia a las aplicaciones de los herbicidas dicamba y glufosinato a una planta, semilla, célula de algodón o parte de la planta.

5. La planta, semilla, célula de algodón recombinante o parte de la planta de la reivindicación 4, en la que

(i) el genoma del cual produce un amplicón que comprende una molécula de ADN seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y sus complementos, cuando se prueba en un procedimiento de amplificación de ADN; o

(ii) dicha planta, semilla, célula o parte de las mismas comprende el evento MON 88701, una muestra representativa de semilla que comprende el evento MON 88701 que se ha depositado bajo el número de acceso pTA-11754 de la ATCC, preferiblemente dicha planta o semilla es un híbrido que tiene al menos un progenitor que comprende el evento MON 88701 de algodón; o

(iii) se puede obtener mediante un procedimiento que comprende:

(a) cruzar sexualmente una planta de algodón transgénico que comprende el evento MON 88701 que comprende una molécula de nucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y sus complementos, con una segunda planta de algodón;

(b) recoger la semilla producida a partir de dicho cruce;

(c) cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie;

(d) tratar dicha pluralidad de plantas de la progenie con dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato; y (e) seleccionar una planta de la progenie que sea tolerante a dicamba y glufosinato; o

(iv) se puede obtener mediante un procedimiento que comprende:

(a) autofecundar una planta de algodón transgénico que comprende el evento MON 88701 que comprende una molécula de nucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-10, y sus complementos;

(b) recoger la semilla producida a partir de dicha autofecundación;

(c) cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de plantas de la progenie;

(d) tratar dicha pluralidad de plantas de la progenie con dicamba o glufosinato o dicamba y glufosinato; y (e) seleccionar una planta de la progenie que sea tolerante a dicamba y glufosinato; o

(v) dicha planta, semilla, célula o parte de la planta comprende un casete de expresión transgénico integrado que comprende un gen que codifica la proteína dicamba mono oxigenasa (DMO) y un gen que codifica la proteína fosfinotricina acetil transferasa (PAT).

6^{. Un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN derivada de una planta de algodón de} acuerdo con la reivindicación 4 en una muestra,

(I) comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto dicha muestra con una sonda de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10, o un complemento de la misma, para funcionar como una sonda de ADN que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10 y no se hibrida en las condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 10;

(b) someter dicha muestra y dicha sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y

(c) detectar la hibridación de dicha sonda de ADN con una molécula de ADN en dicha muestra, en la que la hibridación de dicha sonda de ADN con dicha molécula de ADN indica la presencia de una molécula de ADN derivada de plantas de algodón de la reivindicación 4 en dicha muestra; o

(II) comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto dicha muestra con un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, en la que dichas primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una, una secuencia de nucleótidos de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 10, o un complemento de la mismo, para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN derivado de plantas de algodón de acuerdo con la reivindicación 3 para producir un diagnóstico de amplicón para ADN de plantas de algodón de acuerdo con la reivindicación 3 en una muestra;

(b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada de las s Eq ID NO: 1-8 y 10, y sus complementos; y

(c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, en la que la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción indica la presencia de una molécula de ADN derivada de una planta de algodón de acuerdo con la reivindicación 4 en dicha muestra.

7. Un procedimiento de determinación de la cigosidad de una planta o semilla de algodón de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores y un conjunto de sondas que

(i) cuando se usan juntos en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN de una planta de acuerdo con la reivindicación 4, produce un primer amplicón que es diagnóstico para el evento MON 88701; y

(ii) cuando se usan juntos en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de algodón distinto del ADN de la planta de acuerdo con la reivindicación 4, produce un segundo amplicón que es diagnóstico para ADN genómico de algodón nativo no derivado de una planta de acuerdo con la reivindicación 4; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con dicha muestra, conjunto de cebadores y conjunto de sondas;

(c) detectar en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico una primera señal fluorescente que es diagnóstica para el ADN de una planta de acuerdo con la reivindicación 4 y una segunda señal fluorescente diferente de dicha primera señal fluorescente y diagnóstica para ADN genómico del algodón nativo correspondiente al evento de la planta de la reivindicación 4; y

(d) analizar la presencia o ausencia de dicha primera señal fluorescente y dicha segunda señal fluorescente en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, en la que la presencia de ambas señales fluorescentes indica que dicha muestra es heterocigota para el ADN de una planta de la reivindicación 4 y la presencia de solo dicha primera señal fluorescente indica que dicha muestra es homocigota para el ADN de una planta de la reivindicación 4.

8^{. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que}

(i) el conjunto de cebadores comprende la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 14; o

(ii) el conjunto de sondas comprende la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 15.