BR112020014164A2 - Evento de milho mon87429 e métodos de uso do mesmo - Google Patents

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Michael E. Goley
Jintai Huang
Tracy E. Klingaman
Clayton T. Larue
Youlin Qi
Oscar C. Sparks
Brook Van Scoyoc
Heping Yang
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Abstract

a invenção refere-se a moléculas de dna recombinante únicas para o evento de milho mon87429 e plantas de milho transgênicas, partes de plantas de milho, sementes de milho, células de milho e produtos agrícolas contendo o evento de milho mon87429, bem como métodos de uso e detecção do evento de milho mon87429. plantas de milho transgênicas contendo o evento de milho mon87429 exibem tolerância a inibidores da acetil coa carboxilase (accase) no grupo ariloxifenoxipropionato (fop), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (epsps).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “EVENTO DE MILHO MON87429 E MÉTODOS DE USO DO MESMO”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório Nº 62/625.537 dos Estados Unidos, depositado em 2 de fe- vereiro de 2018, cuja descrição é incorporada neste documento por re- ferência na sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] A listagem de sequência que está contida no arquivo "MONS430WO-seq.txt", que tem 44,2 KB (medido no MS-Windows) e criada em 17 de janeiro de 2019, está depositada em anexo a este do- cumento por envio eletrônico e incorporada neste documento por refe- rência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A invenção refere-se a moléculas de DNA recombinante do evento de milho MON87429. A invenção também se refere a plantas, partes, sementes, células e produtos agrícolas de milho transgênicos que contêm o evento de milho MON87429, bem como métodos de uso de plantas, partes, sementes, células e produtos agrícolas de milho transgênicos que contêm o evento de milho MON87429 e a detecção do evento de milho MON87429. Plantas, partes, sementes e células transgênicas de milho contendo evento de milho MON87429 exibem to- lerância a inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ari- loxifenoxipropionato (FOP), como quizalofop e haloxifop; auxinas sinté- ticas como dicamba e 2,4-D; inibidores de sintetase de glutamina, como glufosinato; e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), como glifosato.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] O milho (Zea mays) é uma cultura importante em muitas áreas do mundo, e o uso de herbicidas para o controle de ervas dani- nhas na produção agrícola é uma ferramenta bem estabelecida. Os mé- todos de biotecnologia têm sido usados para produzir milho transgênico tolerante a um herbicida específico devido à expressão de um gene he- terólogo, também conhecido como transgene. Um traço de tolerância a herbicida pode ser usado sozinho ou combinado com outros traços, como tolerância a outro herbicida ou resistência a pragas ou patógenos. As combinações de traços de tolerância a herbicidas são desejáveis para fornecer opções de controle de ervas daninhas que aumentam a flexibilidade do cultivador e permitem o uso de vários modos de ação de herbicidas para controlar ervas daninhas difíceis. Uma combinação de traços pode ser alcançada através da criação conjunta de cada traço individual. Criar traços individuais no milho e manter essa combinação durante a criação com um conjunto diversificado de germoplasma de elite é um processo demorado e caro. Uma combinação de traços tam- bém pode ser alcançada combinando vários traços em um local ou locus no genoma, simplificando assim o processo de criação. Uma maneira de alcançar isso é através de um único inserto transgênico contendo vários transgenes. A combinação de múltiplos traços de tolerância a her- bicidas em um único locus no milho forneceria uma ferramenta útil no controle de ervas daninhas que é muito mais simples e mais barata de manter durante a criação com um conjunto diversificado de germo- plasma de elite.
[005] A expressão de um transgene em uma planta, parte, se- mente ou célula transgênica e, portanto, sua eficácia, pode ser influen- ciada por muitos fatores diferentes, como os elementos usados no cas- sete de expressão do transgene e a interação desses elementos. Isso é ainda mais complicado para um inserto transgênico contendo dois ou mais cassetes de expressão, com cada cassete de expressão tendo um transgene conferindo um traço separado, também conhecido como evento transgênico multigênico. Um evento transgênico multigênico co- mercialmente útil requer que cada um dos transgenes no inserto trans- gênico se expresse da maneira necessária para cada traço. Para alcan- çar isso, primeiro os cassetes de expressão individuais são concebidos e testados em plantas, e os melhores cassetes de expressão são sele- cionados para cada traço. Em seguida, os cassetes de expressão sele- cionados para um traço são combinados com os cassetes de expressão selecionados para outros traços em um construto, e o construto é tes- tado para garantir que todos os cassetes de expressão funcionem bem juntos e cada transgene seja propriamente expresso. Em seguida, a combinação selecionada de cassetes de expressão é usada como um único inserto transgênico para produzir centenas de eventos transgêni- cos multigênicos, em cada evento, o resultado de uma inserção aleató- ria do DNA estranho ocorre em um local genômico diferente.
[006] Cada evento transgênico é único. Os eventos únicos são en- tão analisados através de várias gerações de plantas para selecionar um evento superior para uso comercial. O desempenho de um evento em uma planta, parte, semente ou célula transgênica e, portanto, sua eficácia, pode ser influenciado pelo local genômico da inserção transgê- nica. Os eventos podem ter a mesma inserção transgênica e, no en- tanto, têm diferentes níveis de expressão transgênica e desempenho nos tecidos e estágios de desenvolvimento, em vários germoplasma, ou sob condições específicas de crescimento. A criação de um evento mul- tigênico para uso comercial requer rigorosa caracterização molecular, testes em estufa e ensaios de campo por vários anos, em vários locais e sob uma variedade de condições para que dados agronômicos, feno- típicos e moleculares extensos possam ser coletados. Os dados resul- tantes devem ser analisados por cientistas e engenheiros agrônomos para selecionar um evento que seja útil para fins comerciais. O evento multigênico comercial pode então ser introgressado como um único lo- cus com vários traços de tolerância a herbicidas no novo germoplasma usando métodos de criação de plantas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A invenção fornece moléculas de DNA recombinante com- preendendo uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a molécula de DNA recombinante é de- rivada de uma planta, semente ou célula compreendendo o evento de milho MON87429, uma amostra representativa de semente compreen- dendo o evento tendo sido depositada como número de acesso ATCC PTA-124635. Em outra modalidade, a molécula de DNA recombinante está em uma planta, célula, semente ou parte da planta compreendendo o evento de milho MON87429, uma amostra representativa de semente compreendendo o evento tendo sido depositado como ATCC PTA-
124635. Em outra modalidade, a molécula de DNA recombinante é um diagnóstico de amplificador para a presença do evento de milho MONB87429.
[008] A invenção fornece um construto de DNA compreendendo quatro cassetes de expressão, em que o primeiro cassete de expressão compreende, em ligação operável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Erianthus ravennae, (Il) uma sequência codificadora de fosfi- notricina N-acetiltransferase e (Ill) uma 3' UTR de frutose-bifosfato aldo- lasea de Setaria italica; o segundo cassete de expressão compreende, em ligação operável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Coix lacryma-jobi, (11) uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplastos albinos e verde-claros 6 de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma sequência codificadora de mono-oxigenase e (IV) uma 3'UTR de prote- ína tipo metalotioneína de Oryza sativa; o terceiro cassete de expressão compreende, em ligação operável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Arundo donax, (Il) uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplastos de malato desidrogenase de Arabidopsis thali- ana, (Ill) uma sequência codificadora de proteína FT T e (IV) uma 3'UTR de proteína de meristema apical de Oryza sativa; e o quarto cas- sete de expressão compreende, em uma ligação operável, (1) um pro- motor de CaMV 358 e líder, (Il) uma proteína líder de ligação à clorofila a/b de Triticum aestivum, (Ill) um íntron de actina 1 de Oryza sativa, (IV) uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplastos ShkG de Arabidopsis thaliana, (V) uma sequência codificadora de a 5- enolpiruvilshiquimate-3-fosfato sintase tolerante a glifosato da cepa CP4 de Agrobacterium sp, (VI) um alvo de siRNA específico de tecido mas- culino a partir de Zea mays e (VII) uma 3'UTR de proteína de ligação ao RNA rica em glicina de Oryza sativa.
[009] A invenção fornece uma molécula de DNA com um compri- mento suficiente de nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 10 para fun- cionar como uma sonda de DNA específica para a SEQ ID NO: 10 em uma amostra de DNA derivada de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho. Em uma modalidade, a sonda de DNA com- preende a SEQ ID NO: 13.
[0010] A invenção fornece um par de moléculas de DNA compreen- dendo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e a segunda moléculas de DNA compreendem um fragmento da SEQ ID NO: 10 e funcionam como iniciadores de DNA quando usados juntos em uma reação de amplificação com DNA con- tendo evento de milho MON87429 para produzir um diagnóstico de am- plificador para o evento de milho MON87429 em uma amostra. Em uma modalidade, pelo menos um iniciador de DNA compreende um frag- mento de uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, a primeira molécula de
DNA compreende a SEQ ID NO: 11 e a segunda molécula de DNA com- preende a SEQ ID NO: 12.
[0011] A invenção fornece um método para detectar a presença do evento de milho MON87429 em uma amostra de DNA derivado de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, compreendendo o método: contato da amostra com uma sonda de DNA; sujeitar a amos- tra e a sonda de DNA a condições rigorosas de hibridização; e detectar a hibridização da sonda de DNA com uma molécula de DNA na amostra, em que a hibridização da sonda de DNA com a molécula de DNA indica a presença do evento de milho MON87429 na amostra de DNA.
[0012] A invenção fornece um método para detectar a presença do evento de milho MON87429 em uma amostra de DNA derivado de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, compreendendo o método: contato da amostra com um par de moléculas de DNA que funcionam como iniciadores de DNA; realizar uma reação de amplifica- ção suficiente para produzir um amplicon de DNA compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1; e detectar a presença do amplicon de DNA, em que a presença do amplicon de DNA indica a presença do evento de milho MON87429 na amostra.
[0013] A invenção fornece um método para detectar a presença do evento de milho MON87429 em uma amostra derivada de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, o método compreen- dendo: colocar a amostra em contato com pelo menos um anticorpo es- pecífico para pelo menos uma ou mais proteínas codificadas pelo evento de milho MON87429; e detectar a ligação do anticorpo à proteína na amostra, em que a ligação do anticorpo à proteína indica a presença de evento de milho MON87429 na amostra. Em outra modalidade, o método compreende o contato adicional da amostra com pelo menos
7ITO um segundo anticorpo específico para uma segunda proteína codificada pelo evento de milho MON87429. Em outra modalidade, o método com- preende o contato adicional da amostra com pelo menos um segundo anticorpo e um terceiro anticorpo específico para uma segunda proteína e uma terceira proteína, respectivamente, codificadas pelo evento de milho MON87429. Em outra modalidade, o método compreende o con- tato adicional da amostra com pelo menos um segundo anticorpo, um terceiro anticorpo e um quarto anticorpo específico para uma segunda proteína, uma terceira proteína e uma quarta proteína, respectivamente, codificados pelo evento de milho MON87429.
[0014] A invenção fornece um kit para detectar a presença do evento de milho MON87429, compreendendo uma sonda de DNA es- pecífica para SEQ ID NO: 10, um par de iniciadores de DNA que produ- zem um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MON87429 ou pelo menos um anticorpo específico para pelo menos um proteína codi- ficada pelo evento de milho MON87429.
[0015] A invenção fornece um produto de planta, semente, célula, parte de planta ou produto primário compreendendo uma molécula de DNA que compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10. Em uma modalidade, a planta, semente, célula ou parte da planta é tolerante a pelo menos um herbicida selecionado den- tre o grupo que consiste em inibidores da acetil CoA carboxilase (AC- Case) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibi- dores da glutamina sintetase e inibidores da 5-enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação destes. Em outra mo- dalidade, a planta, semente, célula ou parte da planta é tolerante a qui- zalofope, haloxifope, dicamba, 2,4-D e glufosinato.
[0016] A invenção fornece um método para controlar ervas dani- nhas em uma área de cultivo compreendendo uma plantação de milho que compreende o evento de milho MON87429 na área de cultivo e aplicar à área de cultivo ou a qualquer parte dela, uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifeno- xipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) ou qualquer combinação destes, controlar as ervas daninhas na área sem ferir o milho.
Em uma modalidade, o método compreende aplicar pelo menos dois ou mais herbicidas selecionados dentre o grupo que con- siste em inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxi- fenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores de glutamina sin- tetase e inibidores de 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) durante uma estação de crescimento.
Em outra modalidade, o método compreende aplicar um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em quizalofope, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosinato e glifosato, ou qualquer combinação destes.
Em uma modalidade, a quan- tidade eficaz de dicamba é de cerca de 0,1 lb ae/acre a cerca de 16 Ib ae/acre durante uma estação de crescimento.
Em uma modalidade, a quantidade eficaz de dicamba é de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo.
Em uma modalidade, a quantidade eficaz de glufosinato é de cerca de 0,1 lb ae/acre a cerca de 16 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo.
Em uma modalidade, a quantidade eficaz de glufosinato é de cerca de 0,4 lb ae/acre a cerca de 1,59 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo.
Em uma modali- dade, a quantidade eficaz de 2,4-D é de cerca de 0,1 lb ae/acre a cerca de 10 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo.
Em uma modali- dade, a quantidade eficaz de 2,4-D é de cerca de 0,75 |b ae/acre a 1,0 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo.
Em uma modalidade, a quantidade eficaz do herbicida FOP é de cerca de 0,01 |b ai/acre a cerca de 1,0 lb ai/acre durante uma temporada de cultivo. Em uma modali- dade, a quantidade eficaz do herbicida FOP é de cerca de 0,034 |b ai/acre a cerca de 0,083 |b ai/acre de quizalofope durante uma tempo- rada de cultivo. Em uma modalidade, a quantidade eficaz do herbicida FOP é de cerca de 0,018 ai/acre a cerca de 0,07 |b ai/acre de haloxifope durante uma temporada de cultivo.
[0017] A invenção fornece um método para controlar milho "volun- tário" compreendendo evento de milho MON87429 em uma área com- preendendo aplicar uma quantidade herbicidamente eficaz de pelo me- nos um herbicida de ciclo-hexanodiona, onde a aplicação do herbicida evita o crescimento do milho compreendendo o evento de milho MONB87429. Em uma modalidade, o herbicida de ciclohexanodiona (DIM) é selecionado dentre o grupo que consiste em cletodim, setoxidim e tralcoxidim.
[0018] A invenção fornece um método para produzir uma planta que é tolerante a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ari- loxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação destes, o método compreendendo: criar uma planta que compreende o evento de milho MON87429 em si mesma, ou uma segunda planta para produzir sementes; e identificar as sementes progênies que compreendem o evento de milho MON87429. Em uma modalidade, identificar sementes progênies que compreendem o evento de milho MON87429 ocorre ao cultivar as sementes progênies para produzir plantas progênies; tratar as plantas progênies com uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em quizalofope, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosi- nato, glifosato, ou qualquer combinação destes; e selecionar uma planta progênie que seja tolerante a pelo menos um herbicida selecionado den- tre o grupo que consiste em inibidores de acetil CoA carboxilase (AC- Case) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibi- dores de glutamina sintetase e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS). Em uma modalidade, identificar sementes pro- gênies que compreende o evento de milho MON87429 ocorre ao detec- tar a presença do evento de milho MON87429 em uma amostra deri- vada a partir das sementes progênies. Em uma modalidade, identificar as sementes progênies que compreendem o evento de milho MONB87429 ocorre ao detectar a presença de pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429 em uma amostra derivada das sementes progênies.
[0019] A invenção fornece um método para produzir sementes hí- bridas compreendendo: cultivar uma planta que compreende SEQ ID NO:10; aplicar uma quantidade eficaz de glifosato antes ou durante o desenvolvimento do tecido reprodutor macho da planta, induzindo assim a esterilidade masculina na planta; fertilizar a planta com pólen a partir de uma segunda planta; e colher as sementes híbridas a partir da planta. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado antes ou durante o desen- volvimento de uma quantidade eficaz de cerca de 0,25 |b ae/acre a cerca de 11,0 lb ae/acre. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado antes ou durante o desenvolvimento de uma quantidade eficaz de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2,5 lb ae/acre totais em uma ou mais apli- cações. Em uma modalidade, a quantidade eficaz de glifosato é apli- cada em um estágio de desenvolvimento selecionado dentre o grupo que consiste no estágio V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, Vide V14 do desenvolvimento da planta de milho. A invenção fornece semen- tes híbridas compreendendo SEQ ID NO:10; e produzidas ao usar o método para produzir sementes híbridas compreendendo: cultivar uma planta compreendendo SEQ ID NO:10; aplicar uma quantidade eficaz de glifosato antes ou durante o desenvolvimento do tecido reprodutor macho da planta, induzindo assim a esterilidade masculina na planta; fertilizar a planta com pólen a partir de uma segunda planta; e colher as sementes híbridas a partir da planta.
[0020] A invenção fornece um método para determinar a zigosidade de uma planta para o evento de milho MON87429, compreendendo: co- locar em contato uma amostra compreendendo DNA derivado a partir da planta com um conjunto de iniciadores capaz de produzir um primeiro diagnóstico de amplicon para a presença do evento de milho MONB87429 e um segundo diagnóstico de amplicon para o DNA genô- mico de milho do tipo selvagem não compreendendo o evento de milho MONB87429; realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico; de- tectar o primeiro amplicon e o segundo amplicon, em que a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica para o evento de milho MON87429 e a presença de apenas o primeiro amplicon indica que a amostra é homozigótica para o evento de milho MON87429. Em uma modalidade, o conjunto de iniciadores compreende SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
[0021] A invenção fornece um método para aprimorar a tolerância a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipro- pionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores de glutamina sintetase e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimate-3-fosfato (EPSPS), ou qualquer combinação destes, em uma planta de milho compreendendo: (a) obter um construto de DNA que compreende quatro cassetes de expressão, em que o primeiro cassete de expressão compreende, em ligação ope- rável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Erianthus ravennae, (Il) uma sequência codificadora de fosfinotricina N-acetiltransferase e (Ill) uma 3' UTR de frutose-bifosfato aldolase de Setaria italica; o se- gundo cassete de expressão compreende, em ligação operável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Coix lacryma-jobi, (Il) uma se- quência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplastos albinos e verde-claros 6 de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma sequência codificadora de dicamba mono-oxigenase e (IV) uma 3'UTR de proteína tipo meta- lotioneína de Oryza sativa; o terceiro cassete de expressão compre- ende, em ligação operável, (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Arundo donax, (Il) uma sequência codificadora de peptídeo de trân- sito de cloroplastos de malato desidrogenase de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma sequência codificadora de proteína FT T e (IV) uma 3'UTR de proteína de meristema apical de Oryza sativa; e o quarto cassete de expressão compreende, em ligação operável, (I) um promotor de CAMV 35S e líder, (Il) uma proteína líder de ligação à clorofila a/b de Triticum aestivum, (Ill) um íntron de actina 1 de Oryza sativa, (IV) uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplastos ShkG de Arabi- dopsis thaliana, (V) uma sequência codificadora de 5-enolpiruvilshiqui- mato-3-fosfato sintase tolerante a glifosato da cepa CP4 de Agrobacte- rium sp, (VI) um alvo de siRNA específico para tecido masculino de Zea mays e (VII) uma 3'UTR de proteína de ligação ao RNA rica em glicina de Oryza sativa; (b) inserir o construto de DNA no genoma de uma cé- lula de milho; (c) regenerar a célula de milho em uma planta de milho; e (d) selecionar uma planta de milho compreendendo o construto de DNA.
Em uma modalidade, selecionar ocorre ao tratar a planta de milho com uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em quizalofope, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufo- sinato ou glifosato.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de milho, semente de milho, ou célula de milho tolerante a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores de glutamina sintetase e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer com- binação destes, e obteníveis pelo método, em que a planta de milho, semente de milho, ou célula de milho compreende o construto de DNA. Em uma modalidade adicional, a planta de milho, a semente de milho ou a célula de milho produzida pelo método compreende a SEQ ID NO:
10.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0022] A Figura 1 representa a sequência do evento de milho MONB87429. As linhas horizontais correspondem às posições de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 relativas à SEQ ID NO:10; as setas horizontais marcadas como SQ51062 (SEQ ID NO:11) e SO51053 (SEQ ID NO:12) representam a posição aproximada de um par de iniciadores que podem ser usados para detectar o evento de milho MON87429; e a linha horizontal marcada como PB50370 (SEQ ID NO:13) representa a posição aproximada de uma sonda de DNA que pode ser usada para detectar o evento de milho MON87429.
[0023] A Figura 2 representa os quatro cassetes de expressão do evento de milho MON87429 relativas à SEQ ID NO: 9 com seus respec- tivos elementos genéticos marcados conforme descrito na Tabela 1.
[0024] A Figura 3 representa a criação, teste, caracterização e se- leção do evento MON87429, conforme descrito neste documento. To- dos os tempos são aproximados.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0025] A SEQ ID NO:1 é uma sequência de DNA de trinta nucleotí- deos que representa a junção 5' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. A SEQ ID NO:1 corresponde às posições de nucleotídeo 1015 a 1044 da SEQ ID NO:10.
[0026] A SEQ ID NO:2 é uma sequência de DNA de trinta nucleotí- deos que representa junção 3' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. A SEQ ID NO:2 corresponde às posições de nucleotídeo 15023 a 15052 da SEQ ID NO:10.
[0027] A SEQ ID NO:3 é uma sequência de DNA de sessenta nu- cleotídeos que representa a junção 5' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. A SEQ ID NO:3 corresponde às posições de nu- cleotídeo 1000 a 1059 da SEQ ID NO:10.
[0028] A SEQ ID NO:4 é uma sequência de DNA de sessenta nu- cleotídeos que representa a junção 3' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. À SEQ ID NO:4 corresponde às posições de nu- cleotídeo 15008 a 15067 da SEQ ID NO:10.
[0029] A SEQ ID NO:5 é uma sequência de DNA de cem nucleotí- deos que representa a junção 5' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. A SEQ ID NO:5 corresponde à posições de nucleotídeo 980 a 1079 da SEQ ID NO:10.
[0030] A SEQ ID NO:6 é uma sequência de DNA de cem nucleotí- deos que representa a junção 3' do DNA genômico de milho e a inserção do transgene. A SEQ ID NO:6 corresponde às posições de nucleotídeo 14988 a 15087 da SEQ ID NO:10.
[0031] A SEQ ID NO:7 é uma sequência de DNA de 1350 nucleotí- deos que representa 1029 nucleotídeos do DNA genômico de milho flan- queador 5' e 321 nucleotídeos da extremidade 5' da inserção do trans- gene.
[0032] A SEQ ID NO: 8 é uma sequência de DNA de 1069 nucleo- tídeos que representa 38 nucleotídeos da extremidade 3' do inserto do transgene e 1031 nucleotídeos do DNA genômico de milho flanqueador
3.
[0033] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de DNA de 14008 nucle- otídeos correspondente ao inserto do transgene do evento de milho MONB87429.
[0034] A SEQ ID NO:10 é uma sequência de DNA de 16068 nucle- otídeos correspondente ao evento de milho MON87429; a sequência contém a sequência de DNA genômico flanqueador 5' a partir das posi- ções 1 a 1029, o inserto de DNA transgênico a partir das posições 1030 a 15037 e a sequência de DNA genômico flanqueador 3' a partir das posições 15038 a 16068.
[0035] A SEQ ID NO:11 é uma sequência de DNA de 29 nucleotí- deos correspondente a um iniciador referido como SQ51062 e usada para identificar o DNA do evento de milho MON87429 em uma amostra; que corresponde às posições 15038 a 15066 da SEQ ID NO:10.
[0036] A SEQ ID NO:12 é uma sequência de DNA de 17 nucleotí- deos correspondente a um iniciador referido como SQ51053 e usada para identificar o DNA do evento de milho MON87429 em uma amostra; que corresponde às posições 14987 a 15003 da SEQ ID NO:10.
[0037] A SEQ ID NO:13 é uma sequência de DNA de 16 nucleotí- deos correspondente a uma sonda referida como PB50370 e usada para identificar o DNA do evento de milho MON87429 em uma amostra; que corresponde às posições 15009 a 15024 da SEQ ID NO:10.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0038] As seguintes definições e métodos são fornecidos para defi- nir melhor a invenção e para guiar os versados na técnica na prática da invenção. A menos que indicado de outra forma, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante.
[0039] As técnicas de transformação de plantas são usadas para inserir DNA estranho (também conhecido como DNA transgênico) alea- toriamente em um cromossomo do genoma de uma célula para produzir uma célula geneticamente modificada, também conhecida como célula "transgênica" ou "recombinante". Ao usar esta técnica, muitas células individuais são transformadas, cada uma resultando em um evento transgênico único devido à inserção aleatória do DNA estranho no ge- noma. Uma planta transgênica é então regenerada a partir de cada cé- lula transgênica individual. Isto resulta em todas as células da planta transgênica contendo o evento transgênico inserido exclusivamente como parte estável de seu genoma. Esta planta transgênica pode então ser usada para produzir plantas progênies, cada uma contendo o evento transgênico único. O evento de milho MON87429 foi produzido por: (i) transformação de milhares de células de milho com um construto de DNA que inclui quatro cassetes de expressão (cada cassete de expres- são foi selecionado após teste individual seguido de teste em combina- ção com os outros três cassetes de expressão), (ii) regeneração de uma população de plantas transgênicas, cada um contendo um evento trans- gênico único; e (iii) seleção rigorosa de eventos plurianuais envolvendo o teste e a análise de características moleculares, eficácia da tolerância a herbicidas e propriedades agronômicas em uma variedade de origens genéticas para milhares de eventos através de dezenas de milhares de plantas. O evento de milho MON87429 foi, portanto, produzido e seleci- onado como um evento excepcionalmente superior, útil para fins comer- ciais agronômicos em larga escala.
[0040] Conforme usado neste documento, um "evento transgênico" ou um "evento" é uma molécula de DNA criada pelo ato de inserir uma molécula de DNA transgênico no DNA genômico de uma célula de planta usando métodos de transformação conhecidos na técnica. Essa inserção cria uma nova sequência de DNA genômico transgênico que consiste no DNA estranho inserido (referido como o "inserto transgê- nico") e o DNA genômico imediatamente adjacente a, ou "flanqueando", o inserto transgênico em ambos os lados do local da inserção (referido como o "DNA flanqueador"). A sequência de DNA de um evento é única e específica para o evento e pode ser facilmente identificada quando comparada a outras sequências de DNA, como a de outros eventos ou
DNA genômico de milho não transformado. O evento de milho MONB87429 tem a nova e única sequência de DNA fornecida como SEQ ID NO:10, que contém a sequência de inserto transgênico fornecida como SEQ ID NO:9 e a sequência de DNA flanqueadora 5' e 3' nas SEQ ID NO:7 e SEQ |D NO:8, respectivamente. O evento de milho MONB87429 é, portanto, uma molécula de DNA que é parte integrante do cromossomo das células e plantas transgênicas de milho compreen- dendo o evento e, desta forma, é estático e pode ser transmitido às cé- lulas e plantas progênies.
[0041] A presente invenção também fornece progênies da célula e planta originais transformadas que compreendem o evento de milho MONB87429. Essa descendência pode ser produzida por cultura de te- cido celular, por autorreprodução de uma planta de milho compreen- dendo o evento de milho MON87429, ou por cruzamento sexual entre uma planta de milho compreendendo o evento de milho MON87429 e outra planta que contém ou não contém o evento. Esta outra planta pode ser de uma planta transgênica compreendendo o mesmo evento ou um evento diferente, ou uma planta transgênica, como uma de uma varie- dade diferente. O evento de milho MON87429 é passado do precursor original, através de cada geração, para o progênie.
[0042] Conforme usado neste documento, o termo "milho" significa Zea mays (também referido como milho verde) e inclui todas as varie- dades de plantas que podem ser criadas com Zea mays.
[0043] A invenção fornece o evento de milho MON87429, que for- nece células, plantas e sementes de milho que compreendem a tolerân- cia a eventos de inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), como quizalofope e haloxifope; auxinas sintéticas como dicamba e 2,4-D; inibidores da glutamina sintetase, como glufosinato; e o glifosato inibidor de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fos-
fato sintase (EPSPS). O evento de milho MON87429 contém quatro cas- setes de expressão. Conforme usado neste documento, um "cassete de expressão" ou "cassete" é uma molécula de DNA recombinante com- preendendo uma combinação de elementos distintos que devem ser ex- pressos por uma célula transformada. A Tabela 1 fornece uma lista dos elementos contidos na SEQ ID NO: 10 e conforme ilustrado na Figura
2. Tabela 1: Descrição do Evento de Milho MON87429 Posição na | Descrição E see DNA flanqueador | 1-1029 Sequência de DNA flanqueadora da extremidade 5' da inser- ug OTÉÕO atenas PASSOS Região da Borda | 1030-1288 Região de DNA a partir de Agrobacterium tumefaciens con- ES o a Sequência de In- | 1289-1359 Sequência usada na clonagem de DNA
FE P-Ea.ubg 1360-3541 Sequências promotora, 5' UTR e de íntron de um gene de SS E aa Sequência de In- | 3542-3546 Sequência usada na clonagem de DNA rr vs CS-Sv.pat 3547-4098 Sequência codificadora para proteína fosfinotricina N-acetil- o Quan eee TS" T-Si.fba 4099-4475 Sequência 3' UTR do gene de frutose-bifosfato aldolase a A o a Sequência de In- | 4476-4537 Sequência usada na clonagem de DNA ai ns ss P-Clj.uba 4538-6463 Sequências promotora, 5' UTR e de íntron de um gene de
MN Sequência de In- | 6464-6473 Sequência usada na clonagem de DNA mr ss TS-At.apg6 6474-6677 Sequência de direcionamento otimizada por códon do gene A a encaman tra miami CS-Sm.dmo 6678-7700 Sequência codificadora para a proteína dicamba mono-oxi-
NM Sequência de In- | 7701-7708 Sequência usada na clonagem de DNA rr sv T-Os.mt 7709-8008 Sequência 3' UTR da proteína tipo metalotioneína de Oryza
A A Sequência de In- | 8009-8016 Sequência usada na clonagem de DNA
E RR
P-Ad.ubg 8017-9973 Sequências promotora, 5' UTR e de íntron de um gene de A A aa Sequência de In- | 9974-9986 Sequência usada na clonagem de DNA sai sus TS-At.mdh 9987-10229 Sequência do peptídeo de trânsito do gene malato desidro- A A O aa Sequência de In- | 11118-11132 Sequência usada na clonagem de DNA ai ps ss T-Os.nam 11133-11649 Sequência 3' UTR da proteína de meristema não apical a FT EmA] Sequência de In- | 11650-11655 Sequência usada na clonagem de DNA ip ss ss ss P-CaMV.35S 11656-11979 Promotor e líder a partir do RNA 358 do vírus do mosaico da
A A Sequência de In- | 11980-12001 Sequência usada na clonagem de DNA sv L-Ta.cab 12002-12062 Sequência líder 5' UTR a partir da proteína de ligação à clo- a mm narram MTP | Sequência de In- | 12063-12078 Sequência usada na clonagem de DNA
CP 1-Os.ract1 12079-12558 A sequência de íntron e UTR da proteína de Actina 1 a partir
MM A Sequência de In- | 12559-12567 Sequência usada na clonagem de DNA ais uu TS-AtLCTP2 12568-12795 Sequência de peptídeo de trânsito do gene ShkG a partir de MA o a CS-cp4epsps 12796-14163 Sequência codificante para a proteína 5-enolpiruvilshiqui- MM a Sequência de In- | 14164-14169 Sequência usada na clonagem de DNA e ss vv Sequência de In- | 14371-14378 Sequência usada na clonagem de DNA me sv sv T-Os.grp3 14379-14989 Sequência 3' UTR do gene da proteína de ligação ao RNA MM a aa Sequência de In- | 14990-15030 Sequência usada na clonagem de DNA su vao Região da Borda | 15031-15037 Região de DNA a partir de Agrobacterium tumefaciens con- ES o a de 3'
[0044] Conforme usado neste documento, o termo "recombinante" refere-se a um DNA não natural, proteína, ou organismo que não seria normalmente encontrado na natureza e foi criado por intervenção hu- mana. Conforme usado neste documento, uma "molécula de DNA re- combinante" é uma molécula de DNA compreendendo uma combinação de moléculas de DNA que não ocorre naturalmente em conjunto e é o resultado de intervenção humana, por exemplo, uma molécula de DNA que é composta por uma combinação de pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas uma à outra, como uma molécula de DNA que com- preende um transgene e o DNA genômico da planta adjacente ao trans- gene. Um exemplo de uma molécula de DNA recombinante é uma mo- lécula de DNA compreendendo pelo menos uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1-10. Conforme usado neste documento, uma "planta recombinante" é uma planta que não normalmente existiria na natureza, é o resultado de intervenção humana e contém uma molécula de DNA transgênico. Como resultado desta alteração genômica, a planta recombinante é algo novo e distintamente diferente da planta do tipo selvagem relacionada. Um exemplo de uma planta recombinante é uma planta de milho contendo o evento de milho MON87429.
[0045] Conforme usado neste documento, o termo "transgene" re- fere-se a uma molécula de DNA incorporada artificialmente no genoma de um organismo como resultado de intervenção humana, como por meio de métodos de transformação de plantas. Um transgene pode ser heterólogo para o organismo. O termo "inserção transgênica", conforme usado neste documento, refere-se ao DNA estranho inserido por técni- cas de transformação de plantas no genoma de milho para produzir o evento de milho MON87429. A sequência para o inserto transgênico do evento de milho MON87429 é fornecida como SEQ ID NO:9. O termo "transgênico" refere-se a compreender um transgene, por exemplo, uma
"planta transgênica" refere-se a uma planta que compreende um trans- gene.
[0046] Conforme usado neste documento, o termo "heterólogo" re- fere-se a uma primeira molécula normalmente não associada com uma segunda molécula ou um organismo na natureza. Por exemplo, uma molécula de DNA pode ser a partir de uma primeira espécie e inserida no genoma de uma segunda espécie. A molécula de DNA, portanto, se- ria heteróloga ao genoma e ao organismo.
[0047] Conforme usado neste documento, o termo "quimérico" re- fere-se a uma única molécula de DNA produzida por fusão de uma pri- meira molécula de DNA com uma segunda molécula de DNA, onde nem a primeira molécula de DNA nem a segunda será normalmente encon- trada naquela configuração fundidda à outra. A molécula de DNA qui- mérico é, portanto, uma nova molécula de DNA que não é normalmente encontrada na natureza. Um exemplo de uma molécula de DNA quimé- rico é uma molécula de DNA compreendendo pelo menos uma sequên- cia selecionada dentre SEQ ID NO:1-10.
[0048] Conforme usado neste documento, o termo "isolado" se re- fere à separação de uma molécula de outras moléculas que são normal- mente associadas a ela em seu estado nativo ou natural. O termo "iso- lado", portanto, pode referir-se a uma molécula de DNA que foi separada de outras moléculas de DNA que estão associadas com ela no seu es- tado nativo ou natural. Esta molécula de DNA pode estar presente em um estado recombinado, como uma molécula de DNA recombinante. Portanto, uma molécula de DNA removida de seu estado natural e fun- dida com outra molécula de DNA à qual não está normalmente associ- ada seria uma molécula de DNA isolada. Esta molécula de DNA isolada pode resultar do uso de técnicas de biotecnologia, como a produção de DNA recombinante ou a integração de uma molécula de DNA estranha no cromossomo de uma célula, planta ou semente.
[0049] A invenção fornece as moléculas de DNA e suas sequências de DNA correspondentes. Conforme usado neste documento, os termos “DNA” e “molécula de DNA" refere-se a uma molécula de ácido desoxir- ribonucleico (DNA). Uma molécula de DNA pode ser de origem genô- mica ou sintética e é, por convenção, a partir da extremidade 5' (a mon- tante) para a extremidade 3' (a jusante). Conforme usado neste docu- mento, o termo "sequência de DNA" refere-se à sequência de nucleotí- deos de uma molécula de DNA. A nomenclatura usada é a exigida pelo Título 37 do Código de Regulações Federais dos Estados Unidos, $
1.822 e estabelecida nas tabelas no Padrão WIPO ST.25 (1998), Apên- dice 2, Tabelas 1 e 3. Por convenção, as sequências de DNA da inven- ção e fragmentos destas são divulgados com referência a apenas uma fita das duas fitas de sequência de DNA complementares. Por implica- ção e intenção, as sequências complementares das sequências forne- cidas neste documento (as sequências da fita complementar), também referido na técnica como as sequências complementares reversas, es- tão dentro do âmbito da invenção e são expressamente destina-se a estar dentro do âmbito da matéria reivindicada. Portanto, conforme usa- das neste documento, as referências a SEQ ID NO:1-10 e fragmentos destas incluem e referem-se à sequência da fita complementar e frag- mentos desta.
[0050] Conforme usado neste documento, o termo "fragmento" re- fere-se a uma parte menor de um todo. Por exemplo, os fragmentos da SEQ ID NO:10 incluiriam as sequências que têm pelo menos cerca de nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 11 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 12 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 13 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 14 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos con- secutivos, pelo menos cerca de 16 nucleotídeos consecutivos, pelo me- nos cerca de 17 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 18 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos con- secutivos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos consecutivos, pelo me- nos cerca de 25 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 30 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 35 nucleotídeos con- secutivos, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos consecutivos, pelo me- nos cerca de 45 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 50 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 60 nucleotídeos con- secutivos, pelo menos cerca de 70 nucleotídeos consecutivos, pelo me- nos cerca de 80 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 90 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos cerca de 100 nucleotídeos consecutivos da sequência completa da SEQ ID NO:10.
[0051] A sequência de DNA para o inserto transgênico do evento de milho MON87429 é fornecida como SEQ ID NO:9. A sequência de DNA do inserto transgênico e o DNA genômico de milho flanqueador de cada lado do inserto transgênico é fornecido como SEQ ID NO:10. As se- quências de DNA de uma porção de DNA flanqueador e a extremidade 5' do inserto transgênico são fornecidas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:7. As sequências de DNA de uma porção de DNA flanqueador e a extremidade 3' do inserto transgênico são fornecidas como SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8.
[0052] A sequência de DNA da região que abrange a conexão pela ligação da ligação de fosfodiéster de uma extremidade do inserto trans- gênico ao DNA genômico de milho flanqueador é referida neste docu- mento como uma "junção". Uma junção é o ponto de conexão do inserto transgênico e do DNA flanqueador como uma molécula contígua. Uma junção é encontrada na extremidade 5' do inserto transgênico e a outra é encontrada na extremidade 3' do inserto transgênico, referida neste documento como junção 5' e 3', respectivamente. Uma "sequência de junção" refere-se a uma sequência de DNA de qualquer comprimento que abrange a junção 5' ou 3' de um evento. As sequências de junção do evento de milho MON87429 são prontamente evidentes para um ver- sado na técnica usando a SEQ ID NO:10. Os exemplos de sequências de junção do evento de milho MON87429 são fornecidos como SEQ ID NO:1-8. A Figura 1 ilustra a disposição física da SEQ ID NO:1-10 dis- posta de 5' a 3'. As sequências de junção do evento de milho MON87429 podem estar presentes como parte do genoma de uma planta, semente ou célula contendo o evento de milho MON87429. A identificação de qualquer uma ou mais das SEQ ID NO:1-8 ou 10 em uma amostra a partir de uma planta, parte de planta, semente ou célula indica que o DNA foi obtido a partir do milho contendo o evento de milho MON87429 e é diagnóstico para a presença do evento de milho MON87429.
[0053] As plantas, sementes, células, partes de plantas e produtos primários da invenção podem ser usados para a detecção de moléculas de DNA ou proteína indicativas da presença do evento de milho MONB87429. São fornecidas moléculas de DNA exemplificativas que po- dem ser usadas como iniciadores ou como sondas para detectar a pre- sença do evento de milho MON87429 em uma amostra. Estes iniciado- res ou sondas são específicos para uma sequência de ácido nucleico alvo e, deste modo, útil para a identificação do evento de milho MONB87429 pelos métodos descritos neste documento. A detecção da presença do evento de milho MON87429 pode ser feita usando métodos conhecidos na técnica, como amplificação térmica de ácido nucleico ou técnicas de hibridização de ácido nucleico (como análise por northen blot e southern).
[0054] Um "iniciador" é uma molécula de DNA que foi concebida para uso em métodos de anelamento ou de hibridização que envolvem uma reação de amplificação. Uma reação de amplificação é uma reação in vitro que amplifica o modelo de DNA para produzir um amplicon. Con- forme usado neste documento, um "amplicon" é uma molécula de DNA que foi sintetizada usando técnicas de amplificação.
Os amplicons da invenção têm uma sequência de DNA compreendendo uma ou mais das SEQ ID NO:1-10, ou fragmentos destas.
Um par de iniciadores pode ser usado com o modelo de DNA, como uma amostra de DNA genômico de milho, em uma reação de amplificação, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), para produzir um amplicon, onde o amplicon produ- zido teria uma sequência de DNA correspondente à sequência de DNA localizada entre os dois sítios onde os iniciadores hibridizaram para o modelo.
Um iniciador é tipicamente concebido para hibridizar com uma fita de DNA alvo complementar, para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo.
A presença de um iniciador é um ponto de reco- nhecimento por uma polimerase para iniciar a extensão do iniciador usando como um modelo a fita de DNA alvo.
Os pares de iniciadores referem-se ao uso de dois iniciadores de ligação de fitas opostas de um segmento de nucleotídeos de fita dupla com a finalidade de amplificar o segmento de nucleotídeos entre eles.
Os exemplos de sequências de iniciador são fornecidos como SEQ ID NO:11 (SQ51062) e SEQ ID NO:12 (SQ51053). O par de iniciadores fornecido como SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 são úteis como uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, onde a primeira molécula de DNA é um fra- gmento da sequência de DNA de inserto transgênico da SEQ ID NO:10 e a segunda molécula de DNA é um fragmento da sequência de DNA flanqueadora da SEQ ID NO:10, e cada uma tem comprimento sufici- ente para funcionar como iniciadores de DNA quando usadas em con- junto com uma reação de amplificação com DNA contendo o evento de milho MON87429 para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MON87429 em uma amostra.
Os pares de iniciadores da presente invenção também podem, em certas modalidades, ser de- finidos como compreendendo uma primeira e uma segunda moléculas de DNA, em que a primeira molécula de DNA é um fragmento da porção genômica de milho da SEQ ID NO:10 e a segunda molécula de DNA é um fragmento da porção de transgene da SEQ ID NO:10 e cada uma delas tem comprimento suficiente para funcionar como iniciadores de DNA quando usadas em conjunto com uma reação de amplificação com DNA contendo o evento de milho MON87429 para produzir um diagnós- tico de amplicon para o evento de milho MON87429 em uma amostra.
[0055] Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico que é com- plementar a uma cadeia de um ácido nucleico alvo e útil em métodos de detecção de hibridização. As sondas de acordo com a invenção incluem não só os ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e a detecção desta ligação pode ser útil na detecção da presença ou ausência da sequência de DNA alvo. Uma sonda pode ser ligada a uma molécula marcadora ou repórter conven- cional detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente de quimioluminescência ou enzima. Uma sequência de DNA exemplifica- tiva útil como uma sonda para detectar o evento de milho MON87429 é fornecida como SEQ ID NO:13 (PB50370).
[0056] Os métodos para conceber e usar iniciadores e sondas são bem conhecidos na técnica. As moléculas de DNA compreendendo o comprimento completo ou fragmentos da SEQ ID NO:1-10 são úteis como iniciadores e sondas para detectar o evento de milho MON87429 e podem prontamente ser concebidos por um versado na técnica usando as sequências fornecidas neste documento.
[0057] As sondas ou iniciadores de acordo com a invenção podem ter identidade de sequência completa com a sequência alvo, embora os iniciadores e sondas diferentes da sequência alvo que mantém a capa- cidade de hibridizar preferencialmente para sequências alvo possam ser concebidos por métodos convencionais. Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda ela precisa apenas ser sufi- cientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de cadeia dupla sob as concentrações de solvente e sal espe- cíficas empregadas.
Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a pre- sença de DNA transgênico a partir do evento de milho MON87429 em uma amostra.
As sondas e iniciadores são geralmente de pelo menos cerca de 11 nucleotídeos, pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 30 nucleotí- deos ou mais de comprimento.
Essas sondas e iniciadores hibridizam especificamente para uma sequência de DNA alvo sob condições de hibridização rigorosas.
As condições rigorosas convencionais são des- critas por MR Green e J Sambrook, Molecular cloning: a laboratory ma- nual, 4º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, N.Y. (2012). Conforme usadas neste documento, duas moléculas de ácido nucleico são capazes de hibridizar especificamente uma à ou- tra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura anti- paralela de fita dupla do ácido nucleico.
Uma molécula de ácido nucleico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se ela exibe complementaridade completa.
Conforme usado neste documento, duas moléculas exibem "complementaridade completa" se, quando alinha- das, todo nucleotídeo da primeira molécula for complementar a todo nu- cleotídeo da segunda molécula.
Duas moléculas são "minimamente complementares" se elas podem hibridizar uma à outra com estabili- dade suficiente para permitir que permaneçam permanecer aneladas uma à outra sob pelo menos condições convencionais de "baixo rigor". De modo semelhante, duas moléculas são "complementares" se elas podem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam aneladas uma à outra sob condições convencionais de "alto rigor". Os desvios da complementaridade completa, portanto,
são admissíveis contanto que esses desvios não excluam completa- mente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de fita du- pla.
[0058] As condições rigorosas adequadas que promovem a hibridi- zação de DNA, por exemplo, 6,0 x citrato de sódio/cloreto de sódio (SSC) a cerca de 45ºC, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50ºC, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encon- tradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada dentre um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50ºC a um alto rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50ºC. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixo rigor à temperatura ambiente, cerca de 22ºC, a condições de alto rigor a cerca de 65ºC. Ambos a temperatura e o sal podem ser va- riados, ou tanto a temperatura quanto a concentração de sal podem ser mantidas constante enquanto a outra variável é alterada.
[0059] São fornecidas proteínas que podem ser usadas para produ- zir anticorpos para detectar a presença do evento de milho MON87429 em uma amostra. Estes anticorpos são específicos para uma ou mais das proteínas que são codificadas pelo evento de milho MON87429. À sequência de DNA que codifica essas proteínas é fornecida na SEQ ID NO:10 e as posições inicial e final da sequência codificadora são indi- cadas na Tabela 1. A sequência de DNA que codifica cada proteína e a proteína codificada pela sequência são úteis para produzir anticorpos para detectar a presença do evento de milho MON87429 pelos métodos descritos neste documento. A detecção da presença do evento de milho MONB87429 pode ser realizada ao usar qualquer técnica de detecção de proteínas conhecida na técnica, como western blotting, imunoprecipita- ção, ensaio imunoabsorvente enzimático (ELISA), ligação de anticorpos a um marcador detectável ou molécula repórter (como um isótopo radi- oativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima) ou ação enzimá- tica em uma molécula repórter. Um método prevê o contato de uma amostra com um anticorpo que se liga à proteína DMO, PAT, FT T ou CP4-EPSPS codificada pelo evento de milho MON87429 e, em seguida, detectar a presença ou ausência de ligação ao anticorpo. A ligação deste anticorpo é diagnóstica quanto à presença de uma ou mais prote- íÍnas codificadas pelo evento de milho MON87429.
[0060] São fornecidos kits de detecção de proteínas e ácidos nu- cleicos para detectar a presença do evento de milho MON87429. As variações nestes kits também podem ser desenvolvidas usando as com- posições e métodos descritos neste documento e os métodos bem co- nhecidos na técnica de detecção de ácido nucleico. Os kits de detecção de proteínas e ácidos nucleicos podem ser aplicados a métodos de cri- ação com plantas contendo o evento de milho MON87429. Estes kits contêm iniciadores ou sondas compreendendo fragmentos da SEQ ID NO: 1-10 ou anticorpos específicos para uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429.
[0061] Um exemplo de um kit de detecção compreende pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos con- tíguos da SEQ ID NO:10 para funcionar como uma sonda de DNA útil para detectar a presença ou ausência do evento de milho MON87429 em uma amostra. Uma molécula de DNA exemplificativa suficiente para uso como uma sonda é aquela que compreende a sequência fornecida como SEQ ID NO:13. Outras sondas podem ser prontamente concebi- das por um versado na técnica. Outro exemplo de um kit de detecção compreende pelo menos um par de iniciadores útil para produzir um amplicon útil para detectar a presença ou ausência do evento de milho MONB87429 em uma amostra. Este método pode também incluir o se- quenciamento do fragmento amplificado, ou um fragmento deste. As moléculas de DNA exemplificativas suficientes para uso como um par de iniciadores são aquelas que compreendem as sequências fornecidas como SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente. Outros pares de iniciadores podem ser facilmente concebidos por um versado na téc- nica. Os kits da invenção podem opcionalmente também compreender reagentes para realizar as reações de detecção ou diagnóstico descritas neste documento. Outro exemplo de um kit de detecção compreende pelo menos um anticorpo específico para pelo menos uma proteína co- dificada pelo evento de milho MON87429. Por exemplo, esse kit pode utilizar uma faixa de fluxo lateral compreendendo reagentes ativados quando a ponta da faixa entra em contato com uma solução aquosa. As proteínas exemplificativas suficientes para uso na produção de anticor- pos são aquelas codificadas pela sequência fornecida como SEQ ID NO: 10, ou qualquer fragmento desta.
[0062] A invenção fornece plantas de milho, descendência, semen- tes, células e partes de plantas contendo o evento de milho MON87429, e produtos primários produzidos usando estes. As plantas, descendên- cia, sementes, células, partes de plantas e produtos primários contêm uma quantidade detectável de DNA tendo pelo menos uma das sequên- cias fornecidas como SEQ ID NO:1-8 e SEQ ID NO:10.
[0063] As plantas, progênie, sementes, células e partes de plantas da invenção podem também conter um ou mais traços transgênicos adi- cionais, particularmente aqueles introduzidos por cruzamento de uma planta de milho contendo o evento de milho MON87429 com outra planta contendo os traços transgênicos adicionais. Estes traços in- cluem, mas não estão limitadas a um aumento da resistência aos inse- tos, o aumento da eficiência de uso de água, aumento da performance de rendimento, aumento da resistência à seca, o aumento da qualidade da semente, a melhoria da qualidade nutricional, a produção de se- mente híbrida e/ou aumento da tolerância a herbicidas, em que o traço é medido no que diz respeito a uma planta de milho sem esse traço transgênico.
[0064] As plantas da invenção podem ser usadas para produzir pro- gênies que contêm o evento de milho MON87429. Conforme usado neste documento, "progênie" inclui qualquer planta, semente e célula compreendendo o evento de milho MON87429 herdado a partir de uma planta ancestral, indicado pela planta compreendendo uma molécula de DNA tendo pelo menos uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1-8 e SEQ ID NO:10. Plantas, sementes e células podem ser homo- zigóticas ou heterozigóticas para o evento de milho MON87429. As plantas progênie podem ser cultivadas a partir de sementes produzidas por uma planta de milho contendo o evento de milho MON87429 ou a partir de sementes produzidas por uma planta de milho fertilizada com pólen contendo o evento de milho MON87429.
[0065] Conforme usado neste documento, uma "parte de planta" da invenção é qualquer parte de uma planta que contém o evento de milho MONB87429. Partes de plantas incluem, mas não estão limitadas a amostras de tecido, pólen, óvulo, vagem, flor, raízes, caules, fibras e folhas no todo ou em parte. As partes da planta podem ser viáveis ou inviáveis.
[0066] A invenção fornece um produto primário que é produzido a partir de plantas que contêm o evento de milho MON87429. Os produtos primários da invenção contêm uma quantidade detectável de DNA com- preendendo uma sequência de DNA selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1-10. Conforme usado neste documento, um "produto primário" refere-se a qualquer composição ou produto que é composto de material de planta, semente, célula ou parte de planta que compreende o evento de milho MON87429. Os produtos primários in- cluem, entre outros, sementes processadas, grãos, partes de plantas e farinhas. Um produto primário da invenção conterá uma quantidade de- tectável de DNA correspondente ao evento de milho MON87429. A de- tecção de um ou mais deste DNA em uma amostra pode ser usada para determinar o conteúdo ou a fonte do produto primário. Qualquer método convencional de detecção de moléculas de DNA pode ser usado, inclu- indo métodos de detecção divulgados neste documento.
[0067] O evento de milho MON87429 contém quatro cassetes de expressão que, juntos, fornecem tolerância a inibidores de acetil COA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP); auxinas sintéticas; inibidores de glutamina sintetase; e inibidores de 5-enolpiru- vilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS).
[0068] Conforme usado neste documento, os inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP) (re- feridos como "herbicidas FOP") incluem, mas não estão limitados a, clo- dinafope, clodinafope-etil, clodinafope-propargil, cialofope, cialofope- butil, diclofope, diclofope-metil, diclofope-P, diclofope-P-metil, fenoxa- prope, fenoxaprope-P, fenoxaprope-P-etil, fentiaprope, fluazifope, flua- zifope-butil, fluazifope-P, fluazifope-P-butil, fluroxipir, haloxifope, haloxi- fope-totil, haloxifope-metil, haloxifope-P, haloxifope-P-metil, isoxapiri- fope, metamifope, propaquizafope, quizalofope, quizalafope-etil, quiza- lofope-P, quizalafope-P, quizalafope-P, tefuril e trifope.
[0069] Conforme usado neste documento, as auxinas sintéticas in- cluem, mas não estão limitadas a, herbicidas de ácido benzoico, herbi- cidas de ácido fenóxi, herbicidas de arilpicolinato e herbicidas d ácido piridinilóxi. Os exemplos de herbicidas com ácido benzoico incluem, mas não se limitam a, dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico), sais de dicamba, dicamba-butotil, sal de dicamba-diglicolamina, di- camba-dimetilamônio, dicamba-dietanolamônio, dicamba- isopropila- mônio, dicamba-potássio, dicamba-sódio e dicamba-trolamina. Os exemplos de herbicidas de ácido fenóxi são 2,4-D (ácido 2,4-diclorfeno- xiacético), 2,4-D-butotil, 2,4-D-butil, 2,4-D-colina, 2,4-D-dimetilamônio, 2,4-D-diolamina, 2,4-D-etil, 2,4-D-2-etil-hexil, 2,4-D-isobutil, 2,4-D-isoc- til, 2,4-D-isopropil, 2,4-D-isopropilamônio, 2,4-D-potássio, 2,4-D-sódio, 2,4-D-triisopropanolamônio, 2,4-D-trolamina, clomeprope, diclorprope, fenoprope, MCPA, MCPA-butotil, MCPA-dimetilamônio, MCPA-2-etil- hexil. MCPA-isopropilamônio, MCPA-potássio, MCPA-sódio, MCPA-tio- etil, 2,4-DB, MCPB, MCPB-metil, MCPB-etil-sódio e mecoprope. Os exemplos de herbicidas arilpicolinato são halauxifeno, halauxifeno-metil e florpirauxifen-benzil. Os exemplos de herbicidas de ácido piridinilóxi são triclopir, fluroxipir, aminopiralida, clopiralida e picloram.
[0070] Conforme usado neste documento, os inibidores de gluta- mina sintetase incluem, mas não estão limitados a, fosfinotricina, glufo- sinato, sais de glufosinato, glufosinato-amônio, glufosinato-sódio, glufo- sinato-P, L-glufosinato-amônio e L-glufosinato-sódio.
[0071] Conforme usado neste documento, os inibidores de 5-enol- piruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) incluem, mas não estão |i- mitados a, glifosato, sais de glifosato, glifosato-isopropilamônio, glifo- sato-amônio, glifosato-dimetilamônio, glifosato-trimésio (=sulfosato), gli- fosato-amônio, glifosato-potássio e glifosato-sódio.
[0072] Conforme usado neste documento, “tolerante a herbicida”, ou “tolerância a herbicida” ou "tolerância" significa a capacidade de ser total ou parcialmente não afetado pela presença ou a aplicação de um ou mais herbicidas, por exemplo, para resistir aos efeitos tóxicos de um herbicida quando aplicado. Uma célula, semente ou planta é "tolerante a herbicida" ou tem "tolerância aprimorada" se puder manter pelo menos algum crescimento ou fenótipo normal na presença de um ou mais her- bicidas. Um traço é um traço de tolerância a herbicida se a sua presença pode conferir uma maior tolerância a um herbicida em uma célula, planta ou semente em comparação com a célula, planta ou semente do tipo selvagem ou de controle. As colheitas compreendendo um traço de to- lerância a herbicida podem continuar a crescer na presença do herbicida e podem ser minimamente afetadas pela presença do herbicida. Uma proteína confere "tolerância a herbicida" se a expressão da proteína pu- der conferir tolerância aprimorada a um herbicida em uma célula, planta ou semente, em comparação com a célula, planta ou semente do tipo selvagem ou de controle. Os exemplos de proteínas de tolerância a her- bicidas são a sequência codificadora de fosfinotricina N-acetiltransfe- rase, dicamba mono-oxigenase, a proteína FT T e a sequência codifi- cadora de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato tolerante ao glifosato a par- tir da cepa CP4 de Agrobacterium sp . A tolerância a herbicida pode ser uma insensibilidade parcial ou completa a um herbicida específico e pode ser expressa como uma porcentagem (%) de tolerância ou insen- sibilidade a um herbicida específico.
[0073] Conforme usado neste documento, uma “erva daninha” é qualquer planta indesejada. Uma planta pode ser considerada geral- mente indesejável para fins de agricultura ou horticultura (por exemplo, espécies de Amaranthus ) ou pode ser considerada indesejável em uma situação específica (por exemplo, uma planta de colheita de uma espé- cie em um campo de uma espécie diferente, também conhecida como planta voluntária). As ervas daninhas são comumente conhecidas na técnica e variam de acordo com a geografia, estação, ambiente de cul- tivo e tempo. As listas de espécies de ervas daninhas estão disponíveis em sociedades e esforços agrícolas e científicos (como a Sociedade Americana da Ciência das Plantas Daninhas, a Sociedade Canadense da Ciência das Plantas Daninhas, a Sociedade Brasileira da Ciência das Plantas Daninhas, a Sociedade Internacional da Ciência das Plantas Daninhas e a Pesquisa Internacional de Plantas Daninhas Resistentes a Herbicida), agências governamentais (como o Departamento de Agri-
cultura dos Estados Unidos e o Departamento do Meio Ambiente e Ener- gia da Austrália) e associações industriais e de agricultores (como a As- sociação Nacional dos Produtores de Milho).
[0074] A invenção fornece métodos para controlar ervas daninhas em uma área para cultivo de milho ao aplicar pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em (i) inibidores de acetil COA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), como quizalofope e haloxifope; (ii) auxinas sintéticas como dicamba e 2,4-D; (iii) inibidores da glutamina sintetase, como glufosinato; e (iv) o glifosato inibidor de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), onde se- mentes ou plantas compreendendo o evento de milho MON87429 são plantadas na área antes, no momento ou após a aplicação do herbicida e a aplicação de herbicida impede ou inibe o crescimento de plantas daninhas e não prejudica as plantas de milho. A área de crescimento de planta pode ou não compreender ervas daninhas no momento da apli- cação do herbicida. Os herbicidas usados nos métodos da invenção po- dem ser aplicados sozinhos ou em combinação com um ou mais herbi- cidas durante a temporada de cultivo. Os herbicidas usados nos méto- dos da invenção podem ser aplicados em combinação com um ou mais herbicidas temporariamente (por exemplo, como uma mistura de tanque ou em aplicações sequenciais), espacialmente (por exemplo, em tem- pos diferentes da temporada de cultivo incluindo antes e após o plantio de sementes de milho) ou ambos. Por exemplo, é fornecido um método para controlar ervas daninhas que consiste em plantar sementes com- preendendo o evento de milho MON87429 em uma área e aplicar uma quantidade herbicida eficaz durante o período de crescimento de um ou mais de dicamba, glufosinato, glifosato, 2,4-D ou um herbicida FOP, so- zinho ou em combinação com outro herbicida, com o objetivo de contro- lar ervas daninhas na área sem ferir as plantas que contêm o evento de milho MON87429. Esta aplicação de herbicidas pode ser pré-plantio
(qualquer tempo antes de plantar as sementes contendo o evento de milho MON87429, incluindo para fins de queimada, ou seja, aplicação a ervas daninhas emergentes ou existentes antes do plantio das semen- tes), pré-emergência (qualquer tempo após as sementes contendo o evento de milho MON87429 serem plantadas e antes de as plantas con- tendo o evento de milho MON87429 aparecerem) ou pós-emergência (qualquer tempo após as plantas contendo o evento de milho MONB87429 aparecerem). Várias aplicações de um ou mais herbicidas, ou uma combinação de herbicidas juntos ou individualmente, podem ser usadas durante uma temporada de cultivo, por exemplo, duas aplica- ções (como uma aplicação de pré-plantio e uma aplicação de pós-emer- gência ou pré-emergência) ou três ou mais aplicações (como uma apli- cação de pré-plantio e duas aplicações de pós-emergência).
[0075] A aplicação de herbicida na prática dos métodos da invenção pode estar na taxa comercial recomendada ou em qualquer fração ou múltiplo desta, como o dobro da taxa comercial recomendada. As taxas de herbicidas podem ser expressas como equivalente ácido por libra por acre (lb ae/acre) ou ingrediente ativo por libra por acre (lb ai/acre), de- pendendo do herbicida e da formulação. A aplicação de herbicida pode ser a taxa comercial recomendada ou uma fração ou múltiplos desta. O uso de acres nas taxas de aplicação de herbicidas, conforme fornecido neste documento, é meramente instrutivo; as taxas de aplicação de her- bicida nas dosagens equivalentes a qualquer taxa fornecida neste do- cumento podem ser usadas para áreas maiores ou menores que um hectare. A aplicação de herbicida compreende pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em (i) inibidores da acetil COA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), como quizalofope e haloxifope; (ii) auxinas sintéticas como dicamba e 2,4-D; (iii) inibidores da glutamina sintetase, como glufosinato; e (iv) o glifosato inibidor de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). A área de crescimento de planta pode ou não compreender ervas daninhas no mo- mento da aplicação do herbicida.
Uma quantidade herbicidamente efi- caz dos herbicidas FOP para uso na área para controlar ervas daninhas deve consistir em um intervalo de a partir de cerca de 0,01 lb ai/acre a cerca de 1,0 lb ai/acre durante uma temporada de cultivo (por exemplo, quizalofope poderia ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,034 |b ai/acre a cerca de 0,083 |b ai/acre e haloxifope poderia ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,018 ai/acre a cerca de 0,07 lb ai/acre). Uma quantidade herbicidamente eficaz de herbicidas de ácido fenóxi de auxina sintética para uso na área para controlar ervas daninhas deve consistir em um intervalo de a partir de cerca de 0,1 lb ae/acre a cerca de 10 |b ae/acre durante uma temporada de cultivo (por exemplo, 2,4-D poderia ser apli- cado a uma taxa de cerca de 0,75 lb ae/acre a 1,0 lb ae/acre). Uma quantidade herbicidamente eficaz dos herbicidas de ácido piridinilóxi de auxina sintética para uso na área para controlar ervas daninhas deve consistir em um intervalo de a partir de cerca de 0,05 lb ae/acre a cerca de 5,0 lb ae/acre durante uma temporada de cultivo (por exemplo, fluro- xipir poderia ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,14 |b ae/acre a cerca de 0,49 |b ae/acre). Uma quantidade herbicidamente eficaz de um her- bicida de ácido benzoico de auxina sintética para uso na área para con- trolar ervas daninhas deve consistir em um intervalo de a partir de cerca de 0,1 lb ae/ac tanto como a cerca de 16 |b ae/ac durante uma tempo- rada de cultivo (por exemplo, dicamba poderia ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2,0 lb ae/acre). Uma quantidade herbicidamente eficaz de inibidores da glutamina sintetase para uso na área de controle de ervas daninhas deve consistir em um intervalo de cerca de 0,1 lb ae/acre a até 10 |b ae/acre durante uma temporada de cultivo (por exemplo, o glufosinato pode ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,4 lb ai/acre a cerca de 1,59 |b ai/acre). Uma quantidade her- bicidamente eficaz de inibidores de EPSPS para uso na área de controle de ervas daninhas deve consistir em um intervalo de cerca de 0,5 |b ae/ac a cerca de 12 |b ae/ac durante uma temporada de cultivo (por exemplo, o glifosato pode ser aplicado a uma taxa de cerca de 0,75 lb ae/acre a cerca de 2,25 |b ae/acre).
[0076] A invenção fornece métodos para controlar milho "voluntário" compreendendo evento de milho MON87429 em uma área para cultivo de colheita ao aplicar uma quantidade herbicidamente eficaz de pelo menos um herbicida de ciclo-hexanodiona (DIM), como cletodim, seto- xidim e tralcoxidim, onde a aplicação do herbicida evita o crescimento do milho compreendendo o evento de milho MON87429. Uma quanti- dade herbicidamente eficaz de um herbicida de DIM para uso na área de controle de milho voluntário pode ser aplicada a uma taxa de cerca de 0,03 lb ai/acre a cerca de 2,75 lb ai/acre durante uma temporada de cultivo (por exemplo, cletodim poderia ser aplicado a partir de cerca de 0,0625 lb ai/acre a cerca de 0,125 |b ai/acre e o setetoxidim pode ser aplicado de cerca de 0,188 lb ai/acre a 0,281 sobre lb ai/acre).
[0077] São fornecidos métodos para produzir plantas e sementes contendo o evento de milho MON87429. As plantas podem ser criadas usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, descrições de métodos de criação que são comumente usadas podem ser encon- tradas em WR Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wil- cox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). As plan- tas podem ser autopolinizadas (também conhecido como "autofecunda- ção") ou de polinização cruzada (também conhecido como "cruza- mento"). As plantas contendo o evento de milho MON87429 podem ser autopolinizadas para gerar uma verdadeira linhagem de plantas que são homozigóticas para o evento de milho MON87429. Autopolinização re- sulta em progênie conhecida como "pura" e pode ser usada para produ- zir linhagens puras que são geneticamente uniformes. Alternativamente,
as plantas que contêm o evento de milho MON87429 podem ser polini- zadas de modo cruzado (criadas com outra planta que é transgênica ou não transgênica) para produzir uma semente varietal ou híbrida. As plantas de semente e progênie feitas pelos métodos da invenção con- têm o evento de milho MON87429. A aplicação de um ou mais herbici- das para os quais o evento de milho MON87429 confere tolerância pode ser usada para selecionar a progênie que contém o evento de milho MONB87429. Alternativamente, a progênie pode ser analisada usando métodos de diagnóstico para selecionar plantas ou sementes que con- têm o evento de milho MON87429. A progênie pode ser de plantas va- rietais ou híbridas; pode ser cultivada a partir de sementes produzidas por uma planta que contém o evento de milho MON87429 ou de semen- tes produzidas por uma planta fertilizada com pólen de uma planta que contém o evento de milho MON87429; e pode ser homozigoto ou hete- rozigoto para o evento de milho MON87429.
[0078] São fornecidos métodos para produzir sementes híbridas usando o evento de milho MON87429. As plantas compreendendo o evento de milho MON87429 têm expressão da proteína CP4-EPSPS to- lerante ao glifosato em todos os tecidos, exceto nos tecidos reproduto- res masculinos. Isso resulta em tolerância ao glifosato nos tecidos re- produtivos feminino e vegetativo e sensibilidade ao glifosato nos tecidos reprodutivos masculinos. Essa sensibilidade ao glifosato pode ser usada para induzir a esterilidade masculina através da aplicação ade- quada do glifosato. O glifosato é um herbicida sistêmico que é translo- cado da fonte para afundar os tecidos nas plantas. Devido à taxa de metabolismo do glifosato no milho, a aplicação em plantas que compre- endem o evento de milho MON87429 antes do desenvolvimento do te- cido reprodutivo masculino pode impedir o desenvolvimento de pólen, a liberação de pólen ou a extrusão de anteras. Esta esterilidade masculina induzida por glifosato pode ser usada para aumentar a eficácia da pro- dução de sementes híbridas, por exemplo, eliminando ou reduzindo a necessidade de emascular fisicamente a planta de milho usada como fêmea em uma determinada cruzamento durante a produção de semen- tes híbridas.
[0079] A invenção fornece um método de produção de sementes híbridas que compreende (a) cultivar uma planta compreendendo o evento de milho MON87429, (b) aplicar uma quantidade eficaz de glifo- sato à planta para induzir a esterilidade masculina, em que a aplicação do herbicida é anterior ou durante o desenvolvimento do tecido repro- dutor masculino da planta induzindo assim a esterilidade masculina na planta; (c) fertilizar a planta com pólen de uma segunda planta; e (d) colher sementes híbridas da planta. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado anterior ou durante o desenvolvimento de uma quantidade efi- caz de cerca de 0,25 lb ae/acre a cerca de 11,0 lb ae/acre totais em uma ou mais aplicações. Em outra modalidade, a etapa de fertilização pode ser realizada permitindo a fertilização passiva (por exemplo, através da polinização pelo vento), por outros meios, como a polinização mecânica ou manual, ou por uma combinação desses. A aplicação de herbicida pode ser aplicada em uma ou mais aplicações anterior ou durante o de- senvolvimento do tecido reprodutivo masculino, como em um estágio selecionado do grupo que consiste em V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10O, V11, V12, V13 e V14 do desenvolvimento das plantas de milho e pode impedir pelo menos o desenvolvimento de pólen, a liberação de pólen ou a extrusão de anteras. A esterilidade masculina pode ser parcial ou completa. Em uma modalidade, a quantidade eficaz de glifosato seria de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2,5 lb ae/acre total (em uma apli- cação ou dividida em duas ou mais aplicações) aplicada no estágio V4 ao V8 ou até 100 unidades de graus de crescimento (GDU) antes da floração.
[0080] As plantas, prole, sementes, células e partes de plantas da invenção podem também conter uma ou mais características de milho ou eventos transgênicas adicionais, particularmente aquelas introduzi- das por cruzamento de uma planta de milho contendo o evento de milho MONB87429 com outra planta contendo as características transgênicas adicionais. Tais características transgênicas de milho incluem, mas não estão limitadas a um aumento da resistência aos insetos, o aumento da eficiência de utilização de água, aumento da performance de rendi- mento, aumento da resistência à seca, o aumento da qualidade da se- mente, a melhoria da qualidade nutricional, a produção de semente hí- brida e tolerância a herbicidas, em que a característica é medida em relação a uma planta de milho com falta de tal trato genético. Os eventos transgênicos de milho são conhecidos por um versado na técnica; por exemplo, uma lista desses traços é fornecida pelo Serviço de Inspeção de Sanidade Animal e Vegetal (APHIS), Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e pode ser encontrada em seu website em www .aphis.usda.gov. Assim, dois ou mais eventos transgênicos podem ser combinados em uma semente descendente ou planta descendente cruzando duas plantas progenitoras, cada uma compreendendo um ou mais evento(s) transgênico(s), coletando sementes descendentes e se- lecionando sementes ou plantas descendentes que contenham os dois ou mais eventos transgênicos; essas etapas podem ser repetidas até que a combinação desejada de eventos transgênicos em uma progênie seja alcançada. O retrocruzamento em uma planta progenitora e a fe- cundação cruzada com uma planta não transgênica são contempladas também, posto que é propagação vegetativa.
[0081] Um depósito de uma amostra representativa de semente compreendendo o evento de milho MON 87429 foi feito de acordo com o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection
((ATCCO)) que tem um endereço em 10801 University Boulevard, Ma- nassas, Virginia EUA, CEP 20110. A Designação de Depósito de Pa- tente ATCC (número de acesso) para sementes compreendendo o evento de milho MON87429 é PTA-124635 e a data do depósito foi 12 de janeiro de 2018. O depósito será mantido no depositário por um pe- ríodo de 30 anos, ou 5 anos após a último requisição, ou para a vida efetiva da patente, consoante o que for maior.
[0082] Conforme usado neste documento, o termo “compreen- dendo” significa “incluindo mas não limitado a”.
EXEMPLOS
[0083] Os exemplos seguintes são incluídos para descrever mais completamente a invenção. Resumem-se a construção e o teste de trinta e cinco construtos de expressão, a produção de mais de quinze mil eventos únicos e a análise de centenas de milhares de plantas indi- viduais ao longo de sete anos através dos rigorosos testes moleculares, agronômicos e de campo necessários para a criação e seleção final do evento de milho MON87429.
[0084] Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que muitas modificações podem ser feitas nos exemplos específicos que se encontram descritos e ainda obter um resultado semelhante. Certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento alcançando re- sultados iguais ou semelhantes. Todas as substituições e modificações semelhantes aparentes àqueles versados na técnica são consideradas como estando dentro do escopo da invenção. Exemplo 1: Teste de cassete de expressão, projeto de construto e teste de planta RO
[0085] Este exemplo descreve o projeto e o teste em plantas de mi- lho de 35 construtos diferentes. Cada construto continha quatro casse- tes de expressão, cada cassete de expressão usado para expressar um transgene diferente. Este teste foi realizado para selecionar o melhor construto para uso na expressão de todos os quatro transgenes no mi- lho. Cada construto tinha uma configuração única, variando pela orien- tação do cassete de expressão e pelos elementos de expressão.
[0086] Vários cassetes de expressão individual com diferentes combinações de elementos de expressão e transgenes foram projeta- das, clonadas em vetores de transformação de plantas e testadas quanto à eficácia do traço em plantas de milho para criar um pool das melhores cassetes de expressão individual. Usando esse agrupamento de cassetes de expressão individual, 35 construtos diferentes foram pro- jetadas para que cada um contivesse quatro cassetes de expressão (cada cassete de expressão com o transgene para PAT, DMO, CP4- EPSPS ou FT) e pudesse ser usado para testar a combinação de quatro vias dos diferentes cassetes de expressão. As combinações de casse- tes de expressão variaram por elementos de expressão, sequência de codificação de proteínas e orientação. Isto resultou no teste de duas cassetes de expressão PAT, 6 cassetes de expressão DMO, 5 cassetes de expressão FT, 18 cassetes de expressão CP4-EPSPS.
[0087] Os 35 construtos de cassete de quatro expressões foram clo- nados em vetores de transformação de plantas e esses vetores foram usados para transformação mediada por Agrobacteriumde embriões imaturos de milho LH244 usando métodos conhecidos na técnica para produzir 15.326 eventos de transformação únicos, cada um feito por in- serção aleatória do inserto de transgene no genoma do milho. As plan- tas RO foram então regeneradas a partir das células transgênicas, e as plantas enraizadas com características fenotípicas normais foram trans- feridas para o solo para crescimento e avaliação adicional.
[0088] As 15.326 plantas RO foram analisadas para ter uma única cópia do inserto transgênico e ausência da sequência da estrutura prin-
cipal do vetor. As plantas com uma única cópia do inserto foram avan- çadas para testes de eficácia de tolerância a herbicidas. As plantas RO de cópia única foram avaliadas na estufa quanto à tolerância ao quiza- lofop (0,16 lb ai/ac do herbicida Assure 1I&) seguido de uma mistura de glufosinato (0,98 lb ae/ac do herbicida Ignite& 280), dicamba (2,0 Ib ae/ac do herbicida Clarity&) ou 2,4-D (2,0 lb ae/ac 2,4-D do herbicida Amine 48) (ou uma combinação de qualquer um destes) pulverizados no estágio de crescimento V1/V2. Plantas que apresentaram deforma- ção > 30% foram descartadas.
[0089] Dos 15.326 eventos de transformação únicos iniciais produ- zidos usando os 35 vetores de transformação, 1.945 eventos únicos fo- ram selecionados após a análise do número de cópias e dados de pul- verização de herbicida. Os dados são fornecidos na Tabela 2. As plan- tas RO para os eventos selecionados foram autopolinizadas para produ- zir sementes R1 ou cruzadas para produzir sementes F1 que foram avançadas para testes de campo da primeira temporada. Tabela 2: Eficácia pura na primeira estação de teste de campo [FT
FR res e [FR E [o ro o o Exemplo 2: Experimentos de campo da primeira temporada
[0090] Os ensaios de campo foram conduzidos ao longo de muitos anos com eventos avançados da análise RO para cada um dos 35 cons- trutos, e o desempenho de cada planta para cada construto em sua pri- meira temporada de ensaios de campo foi analisado como um conjunto. Cada construto foi assim representado por muitos eventos únicos. Isso permitiu que um número maior de construtos fosse testado nos ensaios de campo da primeira temporada, enquanto apenas avançava-se além do teste da primeira temporada, os construtos de melhor desempenho. Testes de campo separados da primeira temporada foram conduzidos com plantas R2 (homozigotos para cada evento) para (1) eficácia pura a glufosinato + dicamba, quizalofop e tolerância ao 2,4-D, (2) eficácia do Sistema de Hibridação Roundup (RHS) e (3) teste de pressão de herbi- cida para tolerância a taxas de aplicação mais altas dos herbicidas qui- zalofop, 2,4-D, glufosinato e dicamba.
[0091] Foi realizado um rastreio de eficácia puro das plantas para avaliar a tolerância a herbicidas para glufosinato + dicamba, quizalofop e 2,4-D. Os tratamentos com herbicida consistiram em: uma aplicação de mistura em tanque de glufosinato a 0,8 lb ai/acre mais dicamba a 2,0 lb ae/acre; quizalofop a 0,16 1b ai/acre; ou 2,4-D a 2,0 lb ai/acre. Os lotes foram visualmente classificadas quanto à deformação nas colheitas 10- 14 dias após o tratamento com herbicida em uma escala de O a 100, sendo "0" sem lesão e "100" como destruição completa da colheita. Al- tura da planta (PHT), altura da espiga (EHT), dias a 50% de seda (S50D), dias a 50% de pólen (P5OD), peso da casca (SHW), peso do teste (TWT), umidade (MST) e rendimento de grãos (YLD) também fo- ram coletados. Todos os dados foram submetidos à análise de variância e separação das médias a p <0,05. As médias gerais de várias plantas contendo o mesmo evento foram usadas e a eficácia pura foi resumida a glufosinato + dicamba, quizalofop e 2,4-D como excelente (4), bom (3), regular (2) ou ruim (1). ou não aplicável (NA). Os dados são forne- cidos na Tabela 3. Tabela 3: Eficácia de Endogâmicas em Ensaio da Primeira Tempo- rada Glufosinato/Dicamba Quizalofope o E
E RR RC E RNA RR A RNA RC E RAR A RA RC A RA RC E RA RC E ERRA RC E ERRA RC A FLIE AAA LIRE EA RM LI RAR AAA LEE LL RA AAA LI A AAA LI EE AA RM RM LI RA AAA RE A A
[0092] Um rastreio de eficácia de RHS das plantas foi realizado para identificar diferenças na tolerância ao glifosato e na esterilidade do pen- dão induzida por glifosato do material puro. Um único tratamento com herbicida foi utilizado para a triagem e consistiu em glifosato a 1,5 lb ae/acre aplicado a V2 seguido de 0,75 lb ae/acre a aproximadamente V8 (875 graus-dia de crescimento) seguido por aproximadamente V10 (1025 graus-dia de crescimento). Os lotes foram visualmente classifica- das quanto à % de deformação das colheitas (CIPV2, CIPV8, CIPV1I0 e
CIPVT) 10-14 dias após a aplicação do herbicida em uma escala de 0 a 100, mais uma classificação final de deformação no VT (após emergên- cia de pendão). Os lotes também foram classificadas visualmente por % de emergência de seda [(SES9A (S90) e SES9C (S90 mais 4 dias) SESS9E (S90 mais 8 dias)] e % extrusão de anteras [(AES9A (S90), AESS9C (S90 mais 4 dias), e AESS9E (S90 mais 8 dias)] em uma escala semelhante de O a 100, sendo "0" nenhuma emergência de seda ou extrusão de antera e "100" sendo uma emergência de seda ou extrusão de antera completa. Outros parâmetros agronômicos foram coletados, como no rastreio de eficácia pura. As médias gerais de várias plantas contendo o mesmo evento foram usadas, e a tolerância ao glifosato, a esterilidade do pendão e o rendimento foram cada um resumidos em excelente (4), bom (3), regular (2) ou ruim (1) ou não aplicável (NA) Os dados são fornecidos na Tabela 4.
Tabela 4: Eficácia do RHS de temporada no primeiro ensaio de campo Construto Tolerância ao | Esterilidade do | Rendimento o ge mat CE a | az | He a Dr | xo RR o
Rm oa a RE a ro
FR OI E DOR eo oa [a E Es poa Dz oo E a a
FR OI DOR
[0093] Um teste de pressão de herbicida foi conduzido para avaliar a tolerância da colheita no nível de construto a taxas de aplicação mais altas dos herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato e dicamba da se- guinte forma. Os tratamentos do Quizalofop consistiram em: 1) quiza- lofop a 0,32 |b ai/acre (4X) mais um surfactante não iônico (NIS) a 0,25% vv aplicado ao VE-V2 seguido por V4 seguido por V8; 2) quizalofop a 0,64 |b ai/acre (8X) mais 0,25% v/v NIS aplicado ao VE-V2 seguido por
V4 seguido por V8; ou 3) quizalofop a 1,28 lb ai/acre (16X) mais NIS a 0,25% v/v aplicado ao VE-V2 seguido por V4 seguido por V8. Os trata- mentos 2,4-D consistiram em 1) amina 2,4-D a 2 |b ai/acre mais surfac- tante não iônico (NIS) a 0,25% v/v aplicado ao VE-V2 seguido por V4 seguido por V8; 2) 2,4-D amina a 4 lb ai/acre mais a 0,25% v/v NIS aplicado ao VE-V2 seguido por V4 seguido por V8; 3) 2,4-D amina a 8 lb ai/acre mais a NIS 0,25% v/v aplicado ao VE-V2 seguido por V4 se- guido por V8; ou 4) 2,4-D amina a 16 lb ai/acre mais NIS a 0,25% v/v aplicado ao VE-V2 seguido por V4 seguido por V8. Os tratamentos com glufosinato consistiram em: 1) glufosinato 1,0 lb ai/acre aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8; 2) galufosinato de 2,0 lb ai/acre aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8; 3) glufosinato 4,0 lb ai/acre apli- cado a V2 seguido por V4 seguido por V8; ou 4) glufosinato de 8,0 lb ai/acre aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8. Os tratamentos com dicamba consistiram em: 1) dicamba a 2,0 lb aplicado em V2 se- guido por V4 seguido por V8; 2) dicamba a 4,0 lb aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8; ou 3) dicamba a 8,0 lb aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8. 4) dicamba a 16 |b aplicado a V2 seguido por V4 seguido por V8. Os lotes foram classificadas visualmente quanto à de- formação das colheitas e os parâmetros agronômicos foram coletados, como no rastreio de eficácia pura. Foram utilizadas médias gerais de várias plantas contendo o mesmo evento e a eficácia da tolerância a herbicidas foi resumida para cada um dos quatro herbicidas como exce- lente (4), bom (3), regular (2) ou ruim (1) ou não aplicável (NA) Os dados são fornecidos na Tabela 5.
Tabela 5: Teste de pressão de herbicida do ensaio de campo da primeira temporada [ Etta T Bifesinas T Dita Tamar 145 Ce Da Da TA
HT4-27 NA NA NA NA mms pa pa a ms a a a o o ar a QI
[0094] Os dados do desempenho do composto de plantas R2 pro- duzidas com cada um dos 35 construtos foram compilados e analisados para (1) o teste de eficácia puro para glufosinato + dicamba, quizalofop e tolerância ao 2,4-D, (2) o teste de eficácia RHS para tolerância ao glifosato, esterilidade do pendão e rendimento, e (3) teste de pressão do herbicida para tolerância a taxas de aplicação mais altas dos herbi- cidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato e dicamba. Usando esses dados, três construtos (HT4-14, HT4-32 e HT4-34) foram selecionadas para o avanço dos 35 construtos testados. Os eventos para essas três cons- trutos foram avançados para testes de campo da segunda temporada. Exemplo 3: Análise Molecular
[0095] A análise molecular foi conduzida concomitantemente aos ensaios de campo em eventos avançados. A amplificação e sequencia- mento de DNA foram usados para confirmar a sequência do inserto, nú- mero de cópias do inserto e ausência da estrutura principal na inserto. O sítio de inserto no genoma do milho para cada evento foi mapeado. À análise Northern foi feita para detectar e medir os transcritos de MRNA dos genes pat, dmo, ft t, e cp4-epsps g O sequenciamento proteico N- terminal das proteínas PAT, DMO, FT T e CP4-EPSPS purificadas a partir de plantas transgênicas foi feito para confirmar a sequência pro- teica recombinante. A análise de Western blot para detectar as proteí- nas PAT, DMO, FT T e CP4-EPSPS foi feita com amostras de plantas transgênicas. Análise de Southern em profundidade genômica de DNA foi realizada em plantas R1 para confirmar o número de cópia e a au- sência de estrutura principal. Exemplo 4: Testes de campo avançados
[0096] Ensaios de campo avançados (testes da segunda temporada e além) foram conduzidos ao longo de muitos anos com eventos avan- çados desde os ensaios de campo da primeira temporada para os cons- trutos HT4-14, HT4-32 e HT4-34. O desempenho de muitas plantas in- dividuais para cada evento em cada ensaio de campo foi analisado como um conjunto. Cada evento foi assim representado por muitas plan- tas únicas. Isso permitiu que o desempenho de cada evento fosse ana- lisado sob várias condições, em diferentes locais e geografias, e para uma variedade de propriedades.
[0097] Ensaios de campo foram conduzidos com plantas endogâ- micas (homozigotos para o evento) e plantas híbridas (hemizigotos para o evento) para avaliar (1) eficácia do traço das taxas comerciais de glu- fosinato, dicamba, quizalofop e tolerância ao 2,4-D, (2) desempenho agronômico, (3) eficácia e glifosato do Sistema de Hibridação Roundup (RHS) e (4) teste de pressão de herbicida para tolerância a taxas de aplicação mais altas de herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato e di- camba.
[0098] Nos ensaios 1 da Temporada de campo, 30 eventos foram testados para os eventos do construto HT4-32 e 21 eventos foram tes- tados para o construto HT4-34. Usando os dados compostos desses ensaios, os eventos foram selecionados para avançar. Nos 2 ensaios da Temporada de Campo, 15 eventos foram testados para o construto HT4-14, 38 eventos para o construto HT4-32 e 38 eventos para o cons- truto HT4-34 (esse número incluiu alguns eventos não testados na Tem- porada 1 de Campo devido a devido à falta de sementes durante essa temporada). Os eventos para o construto HT4-14 foram caracterizados por análise molecular conforme descrito no Exemplo 3 e esses dados também foram utilizados para selecionar eventos. Os dados do com- posto desses ensaios e a caracterização molecular profunda de eventos para o construto HT4-14 foram usados para selecionar 3 eventos para o avanço ao construto HT4-14. Os dados compostos desses ensaios foram usados para selecionar 24 eventos para avanço ao construto HT4-32 e decidir não avançar nenhum evento para o construto HT4-34. Nos 3 experimentos da Temporada de Campo, foram testados os 3 eventos para o construto HT4-14 e 24 eventos para o construto HT4-34. Os dados compostos desses ensaios foram usados para selecionar 2 eventos para avançar no construto do HT4-14 e decidir não avançar ne- nhum evento para o HT4-32. Os 4 ensaios da Temporada de Campo foram usados para comparar os dois eventos finais em um grande nú- mero de locais, sob uma variedade de condições, e em germoplasma híbrido e puro, a fim de produzir os dados necessários para selecionar o evento superior. A Tabela 6 fornece o número de eventos únicos tes- tados para cada construto nos ensaios de campo realizados durante cada temporada.
Tabela 6: Resumo dos ensaios de campo avançados A rea | rasa | WTOsA emosiasám — a a [Temporada a desamor o o [steam gg
[0099] Os ensaios de campo de desempenho agronômico foram executados durante a mesma temporada que os ensaios de campo de eficácia de traço. Todos os ensaios de campo utilizaram um design em bloco randomizado e foram realizados em vários locais. Os ensaios de campo foram realizados em locais na América do Norte e América do Sul. Tanto para os ensaios de eficácia quanto para os ensaios de campo agronômico, a pontuação agronômica foi coletada durante toda a tem- porada de ensaio de campo, e foi determinada no final do rendimento da temporada (rendimento de eficácia ou rendimento agronômico). Os ensaios de eficácia foram conduzidos para avaliar a deformação das colheitas 10 a 14 dias após a aplicação do herbicida. A avaliação de dano na colheita alvo foi uma pontuação inferior a 10% para o avanço de um evento. Para ensaios de campo agronômico, os lotes foram man- tidos livres de ervas daninhas e nenhum dos herbicidas de teste foi apli- cado durante a estação de crescimento. Os ensaios de campo agronô- mico híbrido incluíram controles de um híbrido comparável (controle hí- brido) produzido usando as mesmas linhas de milho parentais usadas para fazer o híbrido transgênico cruzar, mas não contendo um evento transgênico. Controles puros foram de pureza comparável a linhagens puras transgênicas.
[00100] —Paracomparar os dados dos ensaios de campo, a meta-aná- lise foi realizada usando o agregado de todas as plantas nos dados de ensaio de campo de várias temporada e locais múltiplos. Como exem- plo, a Tabela 7 ilustra, ao longo de várias temporadas, o número de repetições (reps) para as quais uma observação foi repetida para dois eventos HT4-14 selecionados e o número total de plantas individuais testadas em cada ensaio para cada evento. Tabela 7: Replicações de ensaio de campo Temporada 1 de campo Temporada 2 do Campo
[00101] A meta-análise dos múltiplos ensaios de eficácia híbrida foi concluída para comparação das classificações de deformações híbri- das. Como exemplo, a Tabela 8 fornece a classificação de deformação ao longo de várias temporadas para dois eventos HT4-14 selecionados pontuados em V8 (onde a análise V8 abrange a deformação cumulativa das aplicações de herbicida V2, V4, V6 e V8) com uma diferença esta- tística menos significativa em nível de confiança de 95% (LSD em p <0,05). As plantas que contêm o evento de milho MON87429 e as plan- tas que contêm o Evento 2 tiveram um bom desempenho nesses en- saios. Tabela 8: Meta-análise de classificação de deformação causada por ensaios de campo eficácia de híbrido
[00102] A meta-análise dos múltiplos ensaios de eficácia híbrida foi concluída para comparação do rendimento em alqueires / acre (Bu / ac). Como exemplo, a Tabela 9 fornece híbridos de rendimento ao longo de várias temporadas para dois eventos HT4-14 selecionados com uma di- ferença estatística menos significativa no nível de confiança de 95% (LSD a p <0,05). As plantas que contêm o evento de milho MON87429 e as plantas que contêm o Evento 2 tiveram um bom desempenho nes- ses ensaios. Tabela 9: Meta-análise de rendimento a partir de ensaios de campo eficácia de híbrida. | Terpasss see campo | voraz | as | at
[00103] Ensaios de campo para teste de pressão com herbicida apli- cado a taxas de aplicação mais altas que o uso comercial foram condu- zidos com plantas híbridas e puras contendo um único evento transgê- nico. Os herbicidas glufosinato (na faixa de 1,6 a 6,4 lb ai/acre), dicamba (na faixa de 2,0 a 16 |b ai/acre), quizalofop (na faixa de 0,32 a 1,28 lb ai/acre), 2,4 -D (na faixa de 2,0 a 8,0 lb ai/acre) e glifosato (a 3,0 lb ae/acre) foram aplicados em ensaios de campo para testes de pressão da eficácia dos traços de tolerância a herbicidas. No final da temporada, foi determinado os ensaios de campo de teste de pressão híbridos foram colhidos e foi determinado o rendimento (Bu/ac). Como exemplo, a Ta- bela 10 fornece dados de rendimento a partir de híbridos e puros em ensaios diferentes para dois eventos HT4-14 selecionados com uma di- ferença estatística menos significativa no nível de confiança de 95% (LSD em p <0,05). As plantas que contêm o evento de milho MON87429 e as plantas que contêm o Evento 2 tiveram um bom desempenho em ensaios de rendimento híbrido e puro para todos os tratamentos com herbicida. Os resultados sugeriram que testes de campo adicionais po- deriam identificar uma vantagem de rendimento puro para o evento de milho MON87429 sobre o Evento 2.
Tabela 10: Rendimento de ensaios de campo de eficácia de testes de pressão híibrida/pura [pesa | Fes evento T Rendimento (Bula0) | 1SD1PS009 |
[00104] Ensaios de campo agronômicos híbridos foram realizados,
medidas agronômicas foram coletadas ao longo da temporada e o ren- dimento agronômico foi determinado no final da temporada. Foi utilizado meta-análise através de ensaios de campo agronômico de várias tem- poradas e locais múltiplos para comparar o rendimento de controle de híbrido e dos híbridos. Como exemplo, a Tabela 11 fornece dados de rendimento (Bu/ac) para dois eventos HT4-14 selecionados com uma diferença estatística menos significativa no nível de confiança de 95% (LSD a p <0,05). As plantas que contêm o evento de milho MON87429 e as plantas que contêm o Evento 2 tiveram um bom desempenho nes- ses ensaios, e nenhuma diferença estatística no rendimento híbrido foi encontrada para as plantas que continham um desses eventos quando comparadas às plantas de controle.
Tabela 11: Meta-análise de rendimento dos ensaios de campo agronômicos híbridos es ee Revimento (Bo) | LsP(PS0?S | | — Temporada Tdecampo — | Controle -menum UR | Fersonáa Tás | moveis a a | — Temporada Tde campo | EVENTOS aa
[00105] Ensaios de campo de eficácia puro foram conduzidos para tolerância ao glifosato e ao Sistema de Hibridação Roundup (RHS) e o rendimento foi determinado no final da temporada. O glifosato foi apli- cado a uma taxa de 1,5 lb ae/acre para controle de plantas daninhas, seguido de duas aplicações de esterilidade de glifosato a 0,75 |b ae/acre a aproximadamente V8, seguidas por 0,75 |b ae/acre a aproximada- mente V10. Foi utilizado meta-análise ao longo dos ensaios de campo de eficácia pura de várias temporadas e locais múltiplos para comparar o rendimento das plantas. Como exemplo, a Tabela 12 fornece dados de rendimento (Bu/ac) para dois eventos HT4-14 selecionados com uma diferença estatística menos significativa no nível de confiança de 95% (LSD a p <0,05). Os ensaios de Temporada 2 de campo e de Tempo- rada 3 de Campo mostraram uma diminuição estatisticamente significa- tiva no rendimento em plantas que contêm o Evento 2 quando compa- radas às plantas que contêm o Evento MON87429. Esses dados indica- ram o desempenho superior em ensaios de rendimento de eficácia pura de plantas contendo o evento de milho MON87429,.
Tabela 12: Meta-análise do rendimento de ensaios de campo de efi- cácia pura tratados com glifosato E ee TT Renimeni (Eae T TsofaaS | | erresssa em | evo ao se
[00106] Ensaios de campo agronômicos puros foram realizados e o rendimento foi determinado no final da temporada para plantas não tra- tadas. Os ensaios incluíram controles linhagens puros comparáveis às linhagens puras transgênicas. Meta-análise ao longo dos ensaios de campo agronômicos puros multi-temporada e multi-localização foi con- duzida comparando o rendimento com ao controle pareado e as linha- gens transgênicas puras. Como exemplo, a Tabela 13 fornece dados de rendimento (Bu/ac) para dois eventos HT4-14 selecionados com uma diferença estatística menos significativa no nível de confiança de 95% (LSD a p <0,05). Não foi encontrada diferença estatística no rendimento agronômico puro entre as plantas de controle e as plantas que contêm o evento de milho MON87429. Por outro lado, para os experimentos da Estação 3 de Campo, houve uma diminuição estatisticamente significa- tiva no rendimento em plantas contendo o Evento 2 quando comparadas às plantas de controle e plantas que continham o evento de milho
MONB87429. Esses dados indicaram o desempenho superior em en- saios de rendimento de eficácia pura de plantas contendo o evento de milho MON87429. Tabela 13: Meta-análise de rendimento a partir de ensaios de campo agronômicos puros Foo EE | Fa 7 srs | [| Temporada Tdscampo | Contole-mentum [rosa es [Temporada Tdscampo EVENTO res as Temporada 2 do Campo
[00107] Ensaios de eficácia híbrida foram realizados em quatro locais na Argentina para avaliar a tolerância das plantas ao glufosinato, di- camba, quizalofop, haloxifope, 24-D e glifosato. Plantas contendo MONB87429 foram cruzadas com plantas contendo o evento de milho MONB88017 e o evento de milho MON89034 para produzir progênie con- tendo todos os três eventos (MON87429 x MON88017 x MON89034). Os tratamentos com herbicida consistiram em 1) um controle não tra- tado; 2) glufosinato a 0,448 kg ia/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 3) glufosinato a 0,896 kg ia/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 4) dicamba a 0,56 |b ae/acre aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 5) dicamba a 1,12 lb ae/acre aplicado no estágio V2 se- guido pela mesma aplicação no estágio V6; 6) quizalofop a 0,09 kg ae/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 7) quizalofop a 0,18 kg ae/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 8) haloxifope a 0,1 kg ae/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 9) haloxifope a 0,2 kg ae/ha aplicado no estágio V2 seguido da mesma aplicação no estágio V6; 10) 2,4-D a 1,12 |b ai/acre aplicado no estágio V2 seguido pela mesma aplicação no estágio V6; 11) 2,4-D a 2,24 lb ae/acre apli- cado no estágio V2 seguido pela mesma aplicação no estágio V6; ou 12) glifosato a 2,24 lb ae/acre aplicado no estágio V2 seguido pela mesma aplicação no estágio V6. A coleta de dados consistiu em defor- mação na colheita 10 a 14 dias após as aplicações de herbicidas V2 e V6 e uma classificação final no VT, dias a 50% de pólen, dias a 50% de seda, altura de planta, altura da espiga, peso da casca, peso do teste, umidade e rendimento de grãos. Todos os dados foram submetidos à análise de variância e separação das médias a p <0,05.
[00108] A tolerância ao herbicida de plantas contendo MON87429 x MON88017 x MON89034 foi excelente (<10% de deformação na co- lheita) em todas as taxas de glifosato, glufosinato, dicamba, quizalofop, haloxifope e 2,4-D testados. As taxas de tratamento com herbicidas não produziram diferenças em relação à deformação visual na colheita. À altura da espiga não foi significativamente diferente para nenhum dos tratamentos em comparação com o tratamento padrão com herbicida 12 (glifosato a 2,24 lb ae/acre). Não houve redução significativa na altura da planta ou no peso do teste, aumento da umidade dos grãos, retardo na maturidade (medida como dias de aumento para 50% de pólen ou seda), diminuição no rendimento de grãos das plantas que contêm MONB87429 x MON88017 x MON89034 em qualquer tratamento das plantas não tratadas. Plantas híbridas produzidas através do cruza- mento de uma planta contendo MON87429 com uma planta contendo um evento que fornece tolerância ao glifosato em tecidos masculinos (como eventos de milho disponíveis no mercado MON88017 ou NK603) fornecem excelente tolerância vegetativa ao glifosato, glufosinato, di- camba, quizalofop, haloxifope e 2,4-D quando aplicado em taxas de marcação comercial.
[00109] Três anos de ensaios de campo foram utilizados para testar o controle de plantas compreendendo o evento de milho MON87429 usando clethodim. Estes ensaios avaliaram o uso em métodos de con- trole voluntário de um herbicida DIM com plantas contendo o evento de milho MON87429. As plantas foram tratadas com clethodim a taxas de marcação comercial e foi observado controle completo das plantas com- preendendo o evento de milho MON87429.
[00110] Os dados acumulados a partir da análise molecular e dos ensaios de campo com plantas híbridas e puras avaliando (1) a eficácia das características das taxas comerciais de tolerância ao glufosinato, dicamba, quizalofop e 2,4-D, (2) desempenho agronômico, (3) A eficácia do Sistema de Hibridização Roundup (RHS) e a tolerância ao glifosato e (4) teste de pressão de herbicida à tolerância de taxas de aplicação mais altas dos herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato e dicamba foram analisados para todos os eventos testados pelos construtos HT4-14 , HT4-32 e HT4-34. A análise dos dados acumulados demonstrou o de- sempenho superior geral do evento de milho MON87429 em compara- ção com os outros eventos e resultou na seleção desse evento para fins comerciais. Exemplo 5: Caracterização Molecular do Evento de Milho MON87429
[00111] O evento de milho MON87429 foi sujeito a extensa caracte- rização molecular após seleção como um evento comercial. A inserção transgênica do evento de milho MON87429 contém os elementos e se- quências descritos na Tabela 1.
[00112] A análise da sequência de DNA do evento de milho MONB87429 foi realizada. A análise de Southern blot foi conduzida para confirmar que as plantas contendo o evento de milho MON87429 conti- nham uma única cópia intacta de todo o inserto do transgene inteiro, sem qualquer estrutura do vetor de transformação. O DNA flanqueador foi sequenciado nas extremidades 5' e 3' do inserto e as respectivas junções foram determinadas usando técnicas de captura, enriqueci- mento, sequenciamento, PCR inverso e caminhada do genoma da se- quência. As sequências do DNA flanqueador para o evento de milho MONB87429 foram mapeadas para o conjunto físico do genoma do milho conhecido. A informação sobre a sequência do sítio de inserção também foi usada para a análise da bioinformática da localização cromossômica do evento. Integridade do sítio de inserção foi determinada por PCR através do alelo de tipo selvagem, utilizando iniciadores específicos para as regiões flanqueadoras do evento de milho MON 87429. O sítio de inserção do tipo selvagem foi usado para mapear o sítio exclusivo de integração do transgene para o evento de milho MON87429 para o ge- noma de referência do milho. Para assegurar que alterações ou muta- ções não foram introduzidas a qualquer região do transgene durante a transformação, todo o inserto transgênico do evento de milho MONB87429 foi isolado a partir da planta e sequenciada. As informações de sequência para a junção 5', junção 3' e inserto transgênico são for- necidas neste documento como SEQ ID NOs: 1-10.
[00113] Foirealizada análise de RNA de plantas compreendendo o construto do evento de milho MON87429. A análise Northern foi reali- zada no RNA total isolado do grão de plantas contendo o evento de milho MON87429. Isso confirmou o tamanho e o número do transcrito para os produtos de mRNA pat, dmo, ft t, e cp4-epsps. Os níveis de expressão de RNA para CP4-EPSPS também foram medidos por PCR em tempo real usando amostras de tecidos de plantas contendo o evento de milho MON87429. A rápida amplificação das extremidades do cDNA (RACE) foi usada para identificar produtos de clivagem CP4- EPSPS para confirmar que a clivagem do transcrito CP4-EPSPS ocorre apenas em pendões de plantas compreendendo o evento de milho MONB87429 e que isso é desencadeado por RNAs de interferência pe- quenos (siRNAs) específicos do macho endógenos do milho de uma maneira específica de sequência. A análise Northern de baixo peso mo- lecular foi realizada para demonstrar que não existem siRNAs de CP4- EPSPS que poderiam comprometer a tolerância ao glifosato em tecidos que não são pendões.
[00114] Foirealizada análise proteica de plantas compreendendo o construto do evento de milho MON87429. O sequenciamento proteico N-terminal das proteínas PAT, DMO, FT T e CP4-EPSPS expressas foi realizada usando extratos proteicos imunopurificados do grão para con- firmar a autêntica sequência de aminoácidos N-terminais. A análise Western blot foi realizada em extratos de proteínas do grão contendo o evento de milho MON87429 para confirmar que uma única proteína de tamanho esperado estava sendo produzida para PAT, DMO, FT Te CP4-EPSPS, respectivamente. Os ELISAs foram utilizados para deter- minar os níveis de proteínas nas folhas, sementes, raízes e pólen das plantas para as proteínas PAT, DMO, FT T e CP4-EPSPS. Exemplo 6: Detecção do evento de milho MON87429
[00115] A detecção do evento de milho MON87429 em uma amostra pode ser feita usando técnicas de detecção de DNA, RNA ou proteínas. Métodos e materiais de detecção exemplares são fornecidos abaixo. À detecção pode determinar a presença ou ausência do evento de milho MONB87429 em uma amostra. A detecção pode indicar o número de có- pias genômicas do evento de milho MON87429 (isto é, hemizigótico, homozigoto ou heterozigoto) em uma amostra de DNA genômico.
[00116] Um método de amplificação térmica Applied Biosystems Tm TAQMANPO (Thermo Fisher Scientific) de terminal específico para um evento foi desenvolvido para identificar o evento de milho MON87429 em uma amostra. Os iniciadores e sonda de DNA utilizados no ensaio de terminal são os iniciadores SQ51062 (SEQ ID NO: 11), SQ51053 (SEQ ID NO: 12) e a sonda PB50370 marcada com 6-FAM'TY (SEQ ID
NO: 13). 6-FAM é um produto corante fluorescente da Applied Biosys- tems (Foster City, CA) anexado à sonda de DNA. Para as sondas TAQMAN MGBY, a atividade da 5' exonuclease da Tag DNA polime- rase cliva a sonda a partir da extremidade 5', entre o fluoróforo e supres- sor. Quando hibridizados à fita de DNA alvo, o supressor e fluoróforo são separados o suficiente para produzir um sinal fluorescente, assim liberando fluorescência. SQ51062 e SQ51053 quando usado com esses métodos de reação e PB50370 produzem um amplicon de DNA que é diagnóstico do evento de milho MON87429. Os controles para esta aná- lise devem incluir um controlo positive contendo o evento de milho MONB87429, um controle negativo de milho não-transgênico, e um con- trole negativo que não contém DNA modelo. Além disso, um controlo para a reação de PCR deverá incluir, idealmente, Iniciadores de Con- trole Interno e uma Sonda de Controle Interno, específicos para um gene de cópia única no genoma do milho. Esses ensaios são otimizados para uso com o sistema GeneAmp& PCR Applied Biosystems 9700 (Thermo Fisher Scientific), executado na velocidade máxima, mas ou- tros equipamentos podem ser usados.
[00117] Um exemplo de condições úteis com os métodos TAQMAN para a detecção do evento de milho MON87429 é apresentado a seguir. Passo 1: 18 megaohm de água ajustada para um volume final de 5 ul. Passo 2: 2,28 ul de 2X Universal Master Mix (dNTP, enzima, tampão) para uma concentração final de 1X. Etapa 3: 0,05 ul de Iniciador de Evento-1 (SQ51062) e Iniciador de Evento-2 (SQ51053) (ressuspenso em 18 megohm de água até uma concentração de 100 uM para cada iniciador) até a concentração final de 0,9 uM. Passo 4: 0,01 ul de Sonda de Evento 6-FAM'T“ MGB PB50370 (ressuspensa em 18 megaohm de água até uma concentração de 100 uM) até a concentração final de 0,2 UM. Etapa 5: 0,05 ul de Iniciador de Controle Interno-1 e Iniciador de
Controle Interno-2 (ressuspenso em 18 megaohm de água a uma con- centração de 100,M para cada iniciador) até a concentração final de 0,9 UM. Etapa 6: 0,01 ul de Sonda VICTY de Controle Interno (ressuspensa em 18 megohm de água até uma concentração de 100 .M) até a con- centração final de 0,2 uM. Etapa 7: 2,5 ul de DNA extraído (modelo) para cada amostra, com cada uma dentre o seguinte: (a) Amostras de folhas a serem analisadas; (b) controle negativo (DNA não transgênico); (c) controle negativo da água (sem modelo); e (d) milho de controle po- sitivo contendo DNA do evento de milho MON87429. Etapa 8: Condi- ções do Termociclador a seguir: um ciclo a 95ºC por 20 segundos; qua- renta ciclos a 95ºC por 3 segundos e depois a 60ºC por 20 segundos; e ciclo final a 10ºC.
[00118] Um ensaio de zigosidade é desenvolvido para determinar se uma planta compreendendo o evento de milho MON87429 é heterozi- gótica ou homozigótica para o evento ou o alelo do tipo selvagem. Um ensaio de reação de amplificação pode ser concebido utilizando a infor- mação da sequência fornecida neste documento. Por exemplo, tal en- saio de PCR tal que inclui o desenho de pelo menos três iniciadores: iniciador-1, iniciador-2, e o iniciador-3, em que o iniciador-1 é específico para o DNA genômico de milho no flanco 3' do evento de milho MONB87429; iniciador-2 é específico para o inserto do transgene do evento de milho MON87429; e o iniciador-3 é específico para o alelo de tipo selvagem. Quando usados como um par de iniciador em uma rea- ção de amplificação, iniciador-1 com o iniciador-2 irão produzir um am- plicon de PCR específico para o evento de milho MON87429. Quando usados como um par de iniciadores em uma reação de amplificação, iniciador-1 com o iniciador-3 irão produzir um amplicon de PCR especí- fico para o alelo de tipo selvagem. Em uma reação de PCR efetuada em DNA genômico de milho, os respectivos amplicons de PCR gerados a partir de iniciador-1+iniciador-2 e gerados a partir de iniciador-1+inicia- dor-3 vão diferir na sequência e tamanho do amplicon. Quando os três iniciadores são incluídos em uma reação de PCR com DNA extraído de uma planta homozigótica para o evento de milho MON87429, apenas o amplicon do iniciador-1+iniciador-2 (específico para a inserto de milho MONB87429) será gerado. Quando os três iniciadores são incluídos em uma reação de PCR com DNA extraído de uma planta heterozigótica para o evento de milho MON87429, tanto o amplicon do iniciador-1+ini- ciador-2 (específico para o inserto do milho MON87429) quanto o am- plicon do iniciador-1+iniciador-3 (específico para alelo do tipo selvagem ou ausência do inserto de milho MON87429) será gerado. Quando os três iniciadores são misturados em uma reação de PCR com DNA ex- traído a partir de uma planta que é nula para o evento de milho MONB87429 (que é do tipo selvagem), apenas o amplicon do iniciador- 1+iniciador-3 (específico para alelo do tipo selvagem) vai ser gerado. Os amplicons produzidos usando a reação de PCR podem ser identificados ou distinguidos usando qualquer método conhecido na técnica.
[00119] Outro ensaio de zigosidade para o evento de milho MONB87429 é uma reação de amplificação térmica TAQMAN. Para este tipo de ensaio, além dos iniciadores conforme descritos acima, o ensaio deve incluir duas sondas marcadas com fluorescência. Sonda-1 seria específica para o evento de milho MON87429, e sonda-2 seria especí- fica para uma planta de milho que é nula para o evento de milho MONB87429 (tipo selvagem), e em que as duas sondas contêm diferen- tes marcadores fluorescentes, por o exemplo marcador 6-FAM ou mar- cador VIC'Y, Quando usado em uma reação TAQMAN, o iniciador- 1+tiniciador-2+sonda-1 produzirá um primeiro sinal fluorescente especí- fico para o evento de milho MON87429 e o iniciador-1+iniciador- 3+sonda-2 produzirá um segundo sinal fluorescente específico para o milho do tipo selvagem. Quando os três iniciadores e as duas sondas estão incluídos em uma reação TAQMAN com DNA extraído a partir de uma planta homozigótica para o evento de milho MON 87429, apenas o primeiro sinal fluorescente (específico para iniciador-1+iniciador- 2+sonda-1) será gerado. Quando os três iniciadores estão incluídos em uma reação TAQMAN com DNA extraído a partir de uma planta hetero- zigótica para o evento de milho MON87429, tanto o primeiro sinal fluo- rescente (específico para iniciador-1+iniciador-2+sonda-1) e o segundo sinal fluorescente (específico para iniciador-1+iniciador-3+sonda-2) se- rão gerados. Quando os três iniciadores são misturados em uma reação TAQMAN com o DNA extraído a partir de uma planta que é nula para o evento de milho MON87429 (tipo selvagem), apenas o segundo sinal fluorescente (específico para iniciador-1+iniciador-3+sonda-2) será ge- rado.
[00120] Outro método para detectar a presença do evento de milho MONB87429 em uma amostra de planta seria a análise por Southern. Aquele versado na técnica iria entender como conceber a(s) sonda(s) de hibridação Southern específica para o evento de milho MON87429 e uma segunda sonda de hibridação Southern específica para uma planta de milho que é nula para o evento de milho MON87429 evento (tipo selvagem). Com a análise por Southern um sinal detectado apenas a partir da primeira sonda de hibridação Southern vai ser um indicativo de uma planta homozigótica para o evento de milho MON87429; um sinal detectado a partir da primeira sonda de hibridação Southern e da se- gunda sonda de hibridação Southern será indicativo de uma planta he- terozigótica para o evento de milho MON87429; e um sinal detectado somente a partir da segunda sonda de hibridação Southern vai ser indi- cativo de que o DNA foi extraído de uma planta que é nula para o evento de milho MON87429 evento (tipo selvagem).
[00121] Outro exemplo de um kit de detecção compreende pelo me- nos um anticorpo específico para pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429. Por exemplo, esse kit pode utilizar uma faixa de fluxo lateral compreendendo reagentes ativados quando a ponta da faixa entra em contato com uma solução aquosa. As proteínas exemplificativas suficientes para uso na produção de anticorpos são aquelas codificadas pela sequência fornecida como SEQ ID NO: 10, ou qualquer fragmento desta.
[00122] Um método de detecção de proteínas é desenvolvido para determinar se uma amostra é de uma planta, semente, célula ou parte da planta que compreende o evento de milho MON87429. Pelo menos um anticorpo específico para pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429 é usado para detectar uma proteína codifi- cada pelo evento de milho MON87429 em uma amostra. Um kit de de- tecção compreendendo um ou mais anticorpos específicos para uma ou mais proteínas codificadas pelo evento de milho MON87429 pode utili- zar uma faixa de fluxo lateral contendo reagentes ativados quando a ponta da tira entra em contato com uma solução aquosa. Amostras de tecido de milho podem ser moídas e a proteína extraída para análise usando água ou um tampão aquoso (por exemplo, solução salina tam- ponada com fosfato contendo detergente e albumina sérica bovina). Após a centrifugação, o sobrenadante aquoso é analisado usando o mé- todo ELISA em um formato sanduíche em uma faixa de fluxo lateral con- tendo um filtro absorvente. A detecção é ativada mergulhando a ponta da tira na solução aquosa que contém a amostra a ser testada. A solu- ção aquosa é transportada para a faixa por ação capilar e solubiliza an- ticorpos marcados com ouro na faixa. Os anticorpos marcados com ouro são específicos para pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429 e se ligam a um epítopo da proteína na amostra para formar um complexo anticorpo-antígeno. O complexo anticorpo- antígeno marcado com ouro é então transportado pela faixa para uma membrana de nitrocelulose. A membrana compreende uma linha de teste de anticorpos imobilizados que se ligam a um segundo epítopo separado na proteína codificada pelo evento de milho MON87429, fa- zendo com que uma linha visível apareça através da faixa de teste se a proteína codificada pelo evento de milho MON87429 estiver presente na amostra.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de DNA recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO: 1.
2. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombi- nante é derivada de uma planta, semente ou célula que compreende o evento de milho MON87429, uma amostra representativa de semente que compreende o evento que foi depositado como Nº de Acesso ATCC PTA-124635.
3. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombi- nante está em uma planta, célula, semente ou parte da planta compre- endendo o evento de milho MON87429, uma amostra representativa de semente compreendendo o evento tendo sido depositado como ATCC PTA-124635.
4, Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA é um diagnóstico de amplicon para a presença do evento de milho MONB87429.
5. Construto de DNA caracterizado pelo fato de compre- ende quatro cassetes de expressão, em que a) o primeiro cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Erianthus raven- nae, (Il) uma sequência de codificação de fosfinotricina N-acetiltransfe- rase e (Ill) uma 3'UTR de frutose-bisfosfato aldolase Setaria italica; b) o segundo cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Coix lacryma-
Jobi, (Il) uma sequência de codificação de peptídeos de trânsito de clo- roplastos albinos e verde claro 6 de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma se- quência de codificação de dicamba mono-oxigenase e (IV) uma proteína 3' UTR semelhante à metalotioneína de Oryza sativa; c) o terceiro cassete de expressão compreende na ligação operável (|) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Arundo donax, (11) uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto de malato desidrogenase de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma sequência de codificação de proteína FT T e (IV) uma 3'UTR de proteína do me- ristema apical de Oryza sativa; e d)o quarto cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor e líder de CAaMV 358, (II) um líder de proteína de ligação a clorofila a/b de Triticum aestivum, (Il) um íntron de actina 1 de Oryza sativa, (IV) uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplastos ShkG de Arabidopsis thaliana, (V) uma sequên- cia de codificação de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase tolerante ao glifosato da cepa CP4 de Agrobacterium sp, (VI) um alvo de siRNA específico para tecido masculino de Zea mays, e (VII) uma 3'UTR de proteína de ligação a RNA rica em glicina de Oryza sativa.
6. Molécula de DNA caracterizada pelo fato de que possui um comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: para funcionar como uma sonda de DNA específica para a SEQ ID NO: 10 em uma amostra de DNA derivada de uma planta de milho, se- mente de milho ou célula de milho.
7. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a sonda de DNA compreende a SEQ ID NO: 13.
8. Par de moléculas de DNA caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e a segunda moléculas de DNA compreen- dem cada uma um fragmento da SEQ ID NO: 10 e funcionam como iniciadores de DNA quando usados juntos em uma reação de amplifica- ção com DNA contendo evento de milho MON87429 para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MON87429 em uma amostra.
9. Par de moléculas de DNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um iniciador de DNA com- preende um fragmento de uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.
10. Par de moléculas de DNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a primeira molécula de DNA compre- ende a SEQ ID NO: 11 e a segunda molécula de DNA compreende a SEQ ID NO: 12.
11. Método para detectar a presença do evento de milho MONB87429 em uma amostra de DNA derivada de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar a amostra em contato com a sonda de DNA, de acordo com a reivindicação 6; b) submeter a amostra e a sonda de DNA a condições de hibridização rigorosas; e c) detectar hibridação da sonda de DNA a uma molécula de DNA na amostra, em que a hibridação da sonda de DNA à molécula de DNA indica a presença do evento de milho MON87429 na amostra de DNA.
12. Método para detectar a presença do evento de milho MONB87429 em uma amostra de DNA derivada de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:
a) colocar a amostra em contato com o par de moléculas de DNA, de acordo com a reivindicação 8; b) realizar uma reação de amplificação suficiente para pro- duzir um amplicon de DNA compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 e SEQID NO: 1; e c) detectar a presença do amplicon de DNA, em que a presença do amplicon de DNA indica a presença do evento de milho MON87429 na amostra.
13. Método para detectar a presença do evento de milho MONB87429 em uma amostra derivada de uma planta de milho, semente de milho ou célula de milho, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) colocar a amostra em contato com pelo menos um anti- corpo específico para pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MON87429; e b) detectar a ligação do anticorpo à proteína na amostra, em que a ligação do anticorpo à proteína indica a presença do evento de milho MON87429 na amostra.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um segundo anti- corpo específico para uma segunda proteína codificada pelo evento de milho MON87429.
15. Kit para detectar a presença do evento de milho MONB87429, caracterizado pelo fato de que compreende uma sonda de DNA específica para SEQ ID NO: 10, um par de iniciadores de DNA que produzem um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MONB87429 ou pelo menos um anticorpo específico para pelo menos um proteína codificada pelo evento de milho MON87429,.
16. Planta, semente, célula, parte da planta ou produto pri- mário caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de DNA compreendendo uma sequência selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
17. Planta, semente, célula ou parte da planta, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta, se- mente, célula ou parte da planta é tolerante a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores da acetil COA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores da 5-enolpiru- vilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação des- tes.
18. Planta, semente, célula ou parte da planta, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta, se- mente, célula ou parte da planta é tolerante ao quizalofop, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosinato e glifosato.
19. Método para controlar ervas daninhas em uma área de cultivo caracterizado pelo fato de que compreende: a) plantio de milho compreendendo o evento de milho MONB87429 na área de cultivo; e b) aplicar à área de cultivo, ou a qualquer parte desta, uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado do grupo que consiste em inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores de gluta- mina sintetase e inibidores da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação destes, para controlar as ervas da- ninhas na área sem prejudicar o milho.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteri- zado pelo fato de que a aplicação da quantidade eficaz de pelo menos um herbicida compreende a aplicação de pelo menos dois ou mais her- bicidas selecionados do grupo que consiste em inibidores da acetil COA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores da 5-enolpiru- vilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) durante uma temporada de crescimento.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteri- zado pelo fato de que a aplicação da quantidade eficaz de pelo menos um herbicida compreende a aplicação de um herbicida selecionado do grupo que consiste em quizalofop, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosi- nato e glifosato, ou qualquer combinação destes.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a quantidade eficaz de dicamba é de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2 |b ae/acre de dicamba durante uma temporada de crescimento.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a quantidade eficaz de glufosinato é de cerca de 0,4 lb ai/acre a cerca de 1,59 |b ai/acre durante uma temporada de cres- cimento.
24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a quantidade eficaz de 2,4-D é de cerca de 0,75 lb ae/acre a 1,0 lb ae/acre durante uma temporada de crescimento.
25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a quantidade eficaz de quizalofop é de cerca de 0,034 |b ai/acre a cerca de 0,083 |b ai/acre durante uma temporada de crescimento.
26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a quantidade eficaz de haloxifope é de cerca de
71H 0,018 lb ai/acre a cerca de 0,07 |b ai/acre durante uma temporada de crescimento.
27. Método para controlar milho "voluntário" caracterizado pelo fato de que compreende o evento de milho MON87429 em uma área compreendendo aplicar uma quantidade herbicidamente eficaz de pelo menos um herbicida de ciclo-hexanodiona (DIM), onde a aplicação do herbicida evita o crescimento do milho compreendendo o evento de milho MON87429.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que a aplicação da quantidade herbicidamente eficaz de pelo menos um herbicida ciclo-hexanodiona (DIM) compreende a aplicação de um herbicida ciclo-hexanodiona (DIM) selecionado a partir do grupo que consiste em cletodim, setoxidim e tralcoxidim.
29. Método para produzir uma planta tolerante a pelo menos um herbicida selecionado do grupo que consiste em inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), au- xinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibidores da 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combina- ção destes, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) cruzar uma planta compreendendo o evento de milho MONB87429 consigo mesma ou uma segunda planta para produzir se- mentes; e b) identificar sementes de progênie que compreendem o evento de milho MON87429.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que a identificação de sementes de progênie que com- preendem o evento de milho MON87429 compreende: a) fazer crescer a semente de progênie para produzir plantas de progênie; b) tratar as plantas de progênie com uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado do grupo que consiste em qui- zalofop, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosinato e glifosato, ou qualquer combinação destes; e c) selecionar uma planta de progênie que é tolerante a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibi- dores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropio- nato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sintetase e inibi- dores da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qual- quer combinação destes.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que a identificação da semente de progênie que com- preende o evento de milho MON87429 compreende a detecção da pre- sença do evento de milho MON87429 em uma amostra derivada da se- mente de progênie.
32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que a identificação da semente de progênie que com- preende o evento de milho MON87429 compreende a detecção da pre- sença de pelo menos uma proteína codificada pelo evento de milho MONB87429 em uma amostra derivada da semente de progênie.
33. Método de produção de sementes híbridas, caracteri- zado pelo fato de que compreende: a) cultivar uma planta compreendendo SEQ ID NO: 10; b) aplicar uma quantidade eficaz de glifosato antes ou du- rante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta, in- duzindo assim a esterilidade masculina na planta; c) fertilizar a planta com pólen de uma segunda planta; e d) colher sementes híbridas da planta.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zado pelo fato de que a aplicação da quantidade eficaz de glifosato compreende a aplicação de glifosato antes ou durante o desenvolvi- mento a uma quantidade eficaz de cerca de 0,5 lb ae/acre a cerca de 2,5 lb ae/acre.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zado pelo fato de que a aplicação da quantidade eficaz de glifosato compreende a aplicação do glifosato em um estágio de desenvolvi- mento selecionado do grupo que consiste nos estágios V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 e V14 de desenvolvimento das plantas de milho.
36. Semente híbrida produzida pelo método da reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a semente híbrida compreende SEQ ID NO: 10.
37. Método para determinar a zigosidade de uma planta para o evento de milho MON87429, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) colocar em contato uma amostra compreendendo DNA derivado da planta com um conjunto de iniciadores capaz de produzir um primeiro diagnóstico de amplicon para a presença do evento de mi- lho MON87429 e um segundo diagnóstico de amplicon para o DNA ge- nômico de milho do tipo selvagem que não compreende o evento de milho MON87429; b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico; e c) detectar o primeiro amplicon e o segundo amplicon, em que a presença de ambos os amplicons indica que a amostra é hetero- zigótica para o evento de milho MON87429 e a presença de apenas o primeiro amplicon indica que a amostra é homozigótica para o evento de milho MON87429.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado pelo fato de que o conjunto de iniciadores compreende SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
39. Método para melhorar a tolerância em uma planta de mi- lho tolerante a pelo menos um herbicida selecionado do grupo que con- siste em inibidores da acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxi- fenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores da glutamina sin- tetase e inibidores da 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação destes, caracterizado pelo fato de que compreende:
a) obter um construto de DNA compreendendo quatro casse- tes de expressão, em que i) o primeiro cassete de expressão compreende na ligação operável (|) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Erianthus raven- nae, (Il) uma sequência de codificação de fosfinotricina N-acetiltransfe- rase e (Ill) uma 3'UTR de frutose-bisfosfato aldolase Setaria italica;
ii) o segundo cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Coix lacryma- Jobi, (Il) uma sequência de codificação de peptídeos de trânsito de clo- roplastos albinos e verde claro 6 de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma se- quência de codificação de dicamba mono-oxigenase e (IV) uma 3UTR de proteína semelhante à metalotioneína de Oryza sativa;
iii) o terceiro cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor de ubiquitina, líder e íntron de Arundo donax, (11) uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto de malato desidrogenase de Arabidopsis thaliana, (Ill) uma sequência de codificação de proteína FT T e (IV) uma 3'UTR de proteína do me- ristema apical de Oryza sativa; e iv) o quarto cassete de expressão compreende na ligação operável (1) um promotor e líder de CAMV 358, (II) um líder de proteína de ligação a clorofila a/b de Triticum aestivum, (Ill) um íntron de actina 1 de Oryza sativa, (IV) uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplastos ShkG de Arabidopsis thaliana, (V) uma sequên- cia de codificação de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase tolerante ao glifosato da cepa CP4 de Agrobacterium sp, (VI) um alvo de siRNA específico para tecido masculino de Zea mays, e (VII) uma 3'UTR de proteína de ligação a RNA rica em glicina de Oryza sativa; b) inserir a construção de DNA no genoma de uma célula de milho; c) regenerar a célula de milho em uma planta de milho; e d) selecionar uma planta de milho compreendendo o cons- truto de DNA.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteri- zado pelo fato de que a seleção compreende tratar a planta de milho com uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida selecionado do grupo que consiste em quizalofop, haloxifope, dicamba, 2,4-D, glufosi- nato e glifosato.
41. Planta de milho, semente de milho, ou célula de milho que é tolerante a pelo menos um herbicida selecionado dentre o grupo que consiste em inibidores de acetil CoA carboxilase (ACCase) no grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inibidores de gluta- mina sintetase e inibidores de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou qualquer combinação destes, e obteníveis pelo método como definido em reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a planta de milho, semente de milho, ou célula de milho compreende o construto de DNA.
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