CN111684071B - 玉米事件mon87429及其使用方法 - Google Patents

玉米事件mon87429及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了对于玉米事件MON87429独特的重组DNA分子，以及含有玉米事件MON87429的转基因玉米植物、玉米植物部分、玉米种子、玉米细胞和农产品，以及使用和检测玉米事件MON87429的方法。转基因玉米植物含有对以下表现出耐受性的玉米事件MON87429：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5‑烯醇丙酮莽草酸‑3‑磷酸合酶(EPSPS)抑制剂。

Description

玉米事件MON87429及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月2日提交的美国临时申请号62/625,537的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
于2019年1月17日创建的44.2KB(在MS-Windows中进行测量)的名为“MONS430WO-seq.txt”的文件中包含的序列表通过电子提交方式提交，并以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及玉米事件MON87429的重组DNA分子。本发明还涉及含有玉米事件MON87429的转基因玉米植物、部分、种子、细胞和农产品，以及使用含有玉米事件MON87429的转基因玉米植物、部分、种子、细胞和农产品以及检测玉米事件MON87429的方法。含有玉米事件MON87429的转基因玉米植物、部分、种子和细胞对以下表现出耐受性：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如喹禾灵和盖草能；合成生长素，诸如麦草畏和2,4-D；谷氨酰胺合成酶抑制剂，诸如草铵膦；和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂，诸如草甘膦。
背景技术
玉米(Zea mays)是世界许多地区的重要作物，并且在作物生产中使用控制杂草的除草剂是一种行之有效的工具。已使用生物技术方法产生由于异源基因(也称为转基因)的表达而耐受特定除草剂的转基因玉米。除草剂耐受性状可以单独使用，也可以与其他性状(诸如对另一种除草剂的耐受性或对害虫或病原体的抗性)组合使用。除草剂耐受性状的组合对于提供杂草控制选择是理想的，这增加生长物的灵活性并能够使用多种除草剂作用模式来控制具有挑战性的杂草。通过将每个单独的性状一起育种，可以实现性状的组合。将玉米中的各个性状一起育种并在育种过程中保持与多种优良种质的组合是一项耗时且昂贵的过程。通过在基因组的一个位置或基因座处组合多个性状也可以实现性状的组合，从而简化育种过程。实现这一点的一种方法是通过含有多个转基因的单个转基因插入。在玉米的单个基因座处组合多种除草剂耐受性状将提供可用的杂草控制工具，其在使用多种优良种质的育种过程中保持更加简单且成本较低。
转基因在转基因植物、部分、种子或细胞中的表达及其有效性可能受到许多不同因素的影响，诸如转基因表达盒中使用的元件以及那些元件之间的相互作用。这对于含有两个或更多个表达盒的转基因插入而言更加复杂，其中每个表达盒具有赋予单独性状的转基因，也称为多基因转基因事件。商业上可用的多基因转基因事件要求转基因插入中的每个转基因以每种性状必需的方式表达。为此，首先在植物中设计并测试了单个表达盒，并且针对每个性状选择最佳表达盒。接下来，将针对一种性状选择的表达盒与针对另一种性状选择的表达盒组合成一个构建体，并且对所述构建体进行测试以确保所有表达盒都一起良好地发挥作用并且每个转基因都得以正确表达。然后，所选择的表达盒组合被用作单个转基因插入物以产生数百个多基因转基因事件，每个事件都是外来DNA在不同基因组位置中随机插入的结果。
每个转基因事件都是独特的。然后，通过多代植物对独特事件进行分析，以选择用于商业用途的优异事件。事件在转基因植物、部分、种子或细胞中的表现及其有效性可能受到转基因插入的基因组位置的影响。事件可以具有相同的转基因插入，但是在各种种质中或在特定的生长条件下，在组织和发育阶段之间具有不同的转基因表达水平和表现。创建用于商业用途的多基因事件需要严格的分子表征、温室测试以及在多个地点和各种条件下的多年田间试验，因此可以收集大量的农艺、表型和分子数据。然后必须由科学家和农艺师分析所得数据，以选择可用于商业目的的事件。然后，可以使用植物育种方法将商业多基因事件作为具有多种除草剂耐受性状的单个基因座渗入新的种质中。
发明内容
本发明提供了重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，重组DNA分子来源于包含玉米事件MON87429的植物、种子或细胞，包含所述事件的代表性种子样品已作为ATCC登录号PTA-124635保藏。在另一个实施方案中，重组DNA分子在包含玉米事件MON87429的植物、细胞、种子或植物部分中，包含所述事件的代表性种子样品已作为ATCC PTA-124635保藏。在另一个实施方案中，重组DNA分子是诊断玉米事件MON87429的存在的扩增子。
本发明提供了包含四个表达盒的DNA构建体，其中第一表达盒在可操作的连接中包含(I)来自沙蔗茅(Erianthus ravennae)的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)膦丝菌素N-乙酰基转移酶编码序列，以及(III)来自粟(Setaria italica)的果糖-二磷酸醛缩酶3'UTR；第二表达盒在可操作的连接中包含(I)来自薏苡(Coix lacryma-jobi)的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的白化和淡绿色6叶绿体转运肽编码序列，(III)麦草畏单加氧酶编码序列，以及(IV)来自水稻(Oryza sativa)的金属硫蛋白样蛋白3'UTR；第三表达盒在可操作的连接中包含(I)来自芦竹(Arundo donax)的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的苹果酸脱氢酶叶绿体转运肽编码序列，(III)FT_T蛋白编码序列，以及(IV)来自水稻的无顶端分生组织蛋白3'UTR；并且第四表达盒在可操作的连接中包含(I)CaMV35S启动子和前导序列，(II)来自普通小麦(Triticumaestivum)的叶绿素a/b结合蛋白前导序列，(III)来自水稻的肌动蛋白1内含子，(IV)来自拟南芥的ShkG叶绿体转运肽编码序列，(V)来自土壤杆菌属(Agrobacterium sp)菌株CP4的草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码序列，(VI)来自玉米雄性组织特异性siRNA靶标，以及(VII)来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR。
本发明提供了一种具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸的DNA分子，以用作对来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中的SEQ ID NO:10具有特异性的DNA探针。在一个实施方案中，所述DNA探针包含SEQ ID NO:13。
本发明提供了包含第一DNA分子和第二DNA分子的一对DNA分子，其中所述第一DNA分子和所述第二DNA分子各自包含SEQ ID NO:10的片段，并且当与含有玉米事件MON87429的DNA一起用于扩增反应时，其可用作DNA引物以产生诊断样品中的玉米事件MON87429的扩增子。在一个实施方案中，至少一种DNA引物包含选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的序列的片段。在另一个实施方案中，第一DNA分子包含SEQ ID NO:11，并且第二DNA分子包含SEQ ID NO:12。
本发明提供了一种在来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中检测玉米事件MON87429的存在的方法，所述方法包括：使样品与DNA探针接触；以及使样品和DNA探针经受严格的杂交条件；以及检测样品中DNA探针与DNA分子的杂交，其中所述DNA探针与DNA分子的杂交表明DNA样品中玉米事件MON87429的存在。
本发明提供了一种在来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中检测玉米事件MON87429的存在的方法，所述方法包括：使样品与一对用作DNA引物的DNA分子接触；进行足以产生DNA扩增子的扩增反应，所述扩增子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1；以及检测DNA扩增子的存在，其中所述DNA扩增子的存在表明样品中玉米事件MON87429的存在。
本发明提供了一种在来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的样品中检测玉米事件MON87429的存在的方法，所述方法包括：使样品与至少一种对由玉米事件MON87429编码的至少一种或多种蛋白质具有特异性的抗体接触；以及检测样品中抗体与蛋白质的结合，其中所述抗体与蛋白质的结合表明样品中玉米事件MON87429的存在。在另一个实施方案中，所述方法另外包括使样品至少与对由玉米事件MON87429编码的第二蛋白质具有特异性的第二抗体接触。在另一个实施方案中，所述方法另外包括使样品至少与对分别由玉米事件MON87429编码的第二蛋白质和第三蛋白质具有特异性的第二抗体和第三抗体接触。在另一个实施方案中，所述方法另外包括使样品至少与对分别由玉米事件MON87429编码的第二蛋白质、第三蛋白质和第四蛋白质具有特异性的第二抗体、第三抗体和第四抗体接触。
本发明提供了一种用于检测玉米事件MON87429的存在的试剂盒，其包含对SEQ IDNO:10具有特异性的DNA探针、产生诊断玉米事件MON87429的扩增子的一对DNA引物、或至少一种对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性的抗体。
本发明提供了包含DNA分子的植物、种子、细胞、植物部分或商业产品，所述DNA分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，所述植物、种子、细胞或植物部分对选自由以下组成的组的至少一种除草剂具有耐受性：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合。在另一个实施方案中，所述植物、种子、细胞或植物部分对喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D和草铵膦具有耐受性。
本发明提供了一种用于控制作物生长区域中的杂草的方法，所述方法包括在所述作物生长区域中种植包含玉米事件MON87429的玉米，以及向所述作物生长区域或其任何部分施用选自由以下组成的组的至少一种有效量的除草剂：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，以控制所述区域的杂草而不损伤所述玉米。在一个实施方案中，所述方法包括在整个生长季节中施用选自由以下组成的组的至少两种或更多种除草剂：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用选自由以下组成的组的除草剂：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦和草甘膦或其任意组合。在一个实施方案中，在整个生长季节中麦草畏的有效量为约0.1磅酸当量/英亩(lb ae/英亩)至约16lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中麦草畏的有效量为约0.5lb ae/英亩至约2lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中草铵膦的有效量为约0.1lb ae/英亩至约16lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中草铵膦的有效量为约0.4lb ae/英亩至约1.59lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中2,4-D的有效量为约0.1lb ae/英亩至约10lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中2,4-D的有效量为约0.75lb ae/英亩至约1.0lb ae/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中FOP除草剂的有效量为约0.01磅活性成分/英亩(lb ai/英亩)至约1.0lb ai/英亩。在一个实施方案中，在整个生长季节中FOP除草剂的有效量为约0.034lb ai/英亩至约0.083lb ai/英亩喹禾灵。在一个实施方案中，在整个生长季节中FOP除草剂的有效量为约0.018ai/英亩至约0.07lb ai/英亩盖草能。
本发明提供了一种在区域中控制包含玉米事件MON87429的自生玉米的方法，其包括施用除草有效量的至少一种环己二酮(DIM)除草剂，其中所述除草剂施用阻止包含玉米事件MON87429的玉米的生长。在一个实施方案中，所述环己二酮(DIM)除草剂选自由烯草酮、稀禾定和肟草酮组成的组。
本发明提供了一种产生对至少一种除草剂具有耐受性的植物的方法，所述除草剂选自由以下组成的组：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，所述方法包括：使用包含玉米事件MON87429的植物自身或第二植物育种以产生种子；以及鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子。在一个实施方案中，鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子通过以下来完成：使后代种子生长以产生后代植物；用有效量的选自由以下组成的组的至少一种除草剂处理后代植物：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦、草甘膦或其任意组合；以及选择对选自由以下组成的组的至少一种除草剂具有耐受性的后代植物：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂。在一个实施方案中，鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子通过在来源于后代种子的样品中检测玉米事件MON87429的存在来完成。在一个实施方案中，鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子通过在来源于后代种子的样品中检测由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质的存在来完成。
本发明提供了一种产生杂交种子的方法，所述方法包括：使包含SEQ ID NO:10的植物生长；在植物雄性生殖组织发育之前或期间施用有效量的草甘膦，从而在植物中诱导雄性不育；用第二植物的花粉使植物受精；以及从植物收获杂交种子。在一个实施方案中，在发育之前或期间，以约0.25lb ae/英亩至约11.0lb ae/英亩的有效量施用草甘膦。在一个实施方案中，在发育之前或期间，在一种或多种应用中，以约0.5lb ae/英亩至约2.5lbae/英亩的有效量施用草甘膦。在一个实施方案中，在选自由以下组成的组的发育阶段施用有效量的草甘膦：玉米植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13和V14阶段。本发明提供了包含SEQ ID NO:10并通过使用产生杂交种子的方法产生的杂交种子，所述方法包括：使包含SEQ ID NO:10的植物生长；在植物雄性生殖组织发育之前或期间施用有效量的草甘膦，从而在植物中诱导雄性不育；用第二植物的花粉使植物受精；以及从植物收获杂交种子。
本发明提供了一种确定植物对玉米事件MON87429的接合性的方法，所述方法包括：使包含来源于植物的DNA的样品与引物组接触，所述引物组能够产生诊断玉米事件MON87429的存在的第一扩增子和诊断不包含玉米事件MON87429的野生型玉米基因组DNA的第二扩增子；进行核酸扩增反应；检测第一扩增子和第二扩增子，其中两种扩增子的存在表示样品对于玉米事件MON87429是杂合的，并且仅第一扩增子的存在表示样品对于玉米事件MON87429是纯合的。在一个实施方案中，引物组包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
本发明提供了一种在玉米植物中改善对至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂选自由以下组成的组：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，所述方法包括：(a)获得包含四个表达盒的DNA构建体，其中第一表达盒在可操作的连接中包含(I)来自沙蔗茅的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)膦丝菌素N-乙酰基转移酶编码序列，以及(III)来自粟的果糖-二磷酸醛缩酶3'UTR；第二表达盒在可操作的连接中包含(I)来自薏苡的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的白化和淡绿色6叶绿体转运肽编码序列，(III)麦草畏单加氧酶编码序列，以及(IV)来自水稻的金属硫蛋白样蛋白3'UTR；第三表达盒在可操作的连接中包括(I)来自芦竹的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的苹果酸脱氢酶叶绿体转运肽编码序列，(III)FT_T蛋白编码序列，以及(IV)来自水稻的无顶端分生组织蛋白3'UTR；并且第四表达盒在可操作的连接中包含(I)CaMV 35S启动子和前导序列，(II)来自普通小麦的叶绿素a/b结合蛋白前导序列，(III)来自水稻的肌动蛋白1内含子，(IV)来自拟南芥的ShkG叶绿体转运肽编码序列，(V)来自土壤杆菌属菌株CP4的草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的编码序列，(VI)来自玉米雄性组织特异性siRNA靶标，以及(VII)来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR；(b)将DNA构建体插入玉米细胞的基因组中；(c)使玉米细胞再生为玉米植物；以及(d)选择包含DNA构建体的玉米植物。在一个实施方案中，选择通过用有效量的至少一种除草剂处理玉米植物来完成，所述除草剂选自由以下组成的组：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦或草甘膦。在一个实施方案中，本发明提供了对至少一种除草剂具有耐受性并且可通过所述方法获得的玉米植物、玉米种子或玉米细胞，所述除草剂选自由以下组成的组：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，其中所述玉米植物、玉米种子或玉米细胞包含DNA构建体。在另一实施方案中，通过所述方法产生的玉米植物、玉米种子或玉米细胞包含SEQ ID NO:10。
附图说明
图1表示玉米事件MON87429的序列。水平线对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9相对于SEQ ID NO:10的位置；标记为SQ51062(SEQ ID NO:11)和SQ51053(SEQ ID NO:12)的水平箭头表示可用于检测玉米事件MON87429的一对引物的大致位置；并且标记为PB50370(SEQ ID NO:13)的水平线表示可用于检测玉米事件MON87429的DNA探针的大致位置。
图2表示玉米事件MON87429相对于SEQ ID NO:9的四个表达盒，其各自标记的遗传元件如表1所述。
图3表示如本文所述的MON87429事件的创建、测试、表征和选择。所有时间均为近似值。
序列简述
SEQ ID NO:1是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的5'接头的三十个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:1对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1015至1044。
SEQ ID NO:2是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的3'接头的三十个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:2对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置15023至15052。
SEQ ID NO:3是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的5'接头的六十个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:3对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1000至1059。
SEQ ID NO:4是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的3'接头的六十个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:4对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置15008至15067。
SEQ ID NO:5是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的5'接头的一百个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:5对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置980至1079。
SEQ ID NO:6是表示玉米基因组DNA和转基因插入物的3'接头的一百个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:6对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置14988至15087。
SEQ ID NO:7是1350个核苷酸的DNA序列，其表示5'侧翼玉米基因组DNA的1029个核苷酸和转基因插入物的5'端的321个核苷酸。
SEQ ID NO:8是1069个核苷酸的DNA序列，其表示转基因插入物的3'端的38个核苷酸和3'侧翼玉米基因组DNA的1031个核苷酸。
SEQ ID NO:9是对应于玉米MON87429事件的转基因插入物的14008个核苷酸的DNA序列。
SEQ ID NO:10是对应于玉米MON87429事件的16068个核苷酸的DNA序列；所述序列包含5'侧翼基因组DNA序列的位置1至1029、转基因DNA插入物的位置1030至15037和3'侧翼基因组DNA序列的位置15038至16068。
SEQ ID NO:11是对应于称为SQ51062并且用于鉴定样品中的玉米MON87429事件DNA的引物的29个核苷酸的DNA序列；它对应于SEQ ID NO:10的位置15038至15066。
SEQ ID NO:12是对应于称为SQ51053并且用于鉴定样品中的玉米MON87429事件DNA的引物的17个核苷酸的DNA序列；它对应于SEQ ID NO:10的位置14987至15003。
SEQ ID NO:13是对应于称为PB50370并且用于鉴定样品中的玉米MON87429事件DNA的引物的16个核苷酸的DNA序列；它对应于SEQ ID NO:10的位置15009至15024。
具体实施方式
提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导实施本发明的一般技术人员。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。
植物转化技术用于将外来DNA(也称为转基因DNA)随机插入细胞基因组的染色体中以产生遗传工程细胞，也称为“转基因”或“重组”细胞。使用这种技术，许多单个细胞被转化，由于外来DNA随机插入基因组，每个细胞都导致独特的转基因事件。然后从每个单个的转基因细胞再生出转基因植物。这导致转基因植物的每个细胞都含有独特插入的转基因事件作为其基因组的稳定部分。然后可以使用此转基因植物来产生后代植物，每个后代植物都含有独特的转基因事件。玉米事件MON87429是通过以下产生的：(i)用包含四个表达盒的DNA构建体转化成千上万个玉米细胞(每个表达盒均经过单独测试然后与其他三个表达盒组合测试之后选择)，(ii)再生一群各自含有独特转基因事件的转基因植物，以及(iii)严格的多年事件选择，涉及在数以万计的植物中的事件的不同遗传背景下测试和分析分子特性、除草剂耐受性功效和农艺特性。因此，产生玉米事件MON87429并选择其作为可用于大规模农艺商业目的的独特优异事件。
如本文所用，“转基因事件”或“事件”是通过使用本领域已知的植物转化方法将转基因DNA分子插入植物细胞的基因组DNA中的行为而产生的DNA分子。此插入产生一个新的转基因基因组DNA序列，所述序列由插入的外来DNA(称为“转基因插入物”)和在插入位置的任一侧紧邻或“侧接”转基因插入物的基因组DNA(称为“侧翼DNA”)组成。事件的DNA序列对所述事件是唯一的并且是特定的，与其他DNA序列(诸如其他事件或未转化的玉米基因组DNA)相比，可以很容易地进行鉴定。玉米事件MON87429具有提供为SEQ ID NO:10的新的独特DNA序列，其含有提供为SEQ ID NO:9的转基因插入物序列以及分别提供为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的5'和3'侧翼DNA序列。因此玉米事件MON87429是DNA分子，其是包含所述事件的转基因玉米细胞和植物的染色体的组成部分，并且因此是静态的且可以传递给后代细胞和植物。
本发明还提供了包含玉米事件MON87429的原始转化细胞和植物的后代。可以通过细胞组织培养，通过使包含玉米事件MON87429的玉米植物自交，或通过在包含玉米事件MON87429的玉米植物与含有或不含有所述事件的另一个植物之间的有性远交来产生这种后代。此类其他植物可以是包含相同或不同事件的转基因植物或非转基因植物，诸如来自不同品种的一种。玉米事件MON87429从原始亲本传承到每一代后代。
如本文所用，术语“玉米”是指玉米(Zea mays)(也称为玉米(corn))，并且包括可以用玉米育种的所有植物品种。
本发明提供了玉米事件MON87429，其为包含所述事件的玉米细胞、植物和种子提供了对以下的耐受性：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如喹禾灵和盖草能；合成生长素，诸如麦草畏和2,4-D；谷氨酰胺合成酶抑制剂，诸如草铵膦；以及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂草甘膦。玉米事件MON87429含有四个表达盒。如本文所用，“表达盒”或“盒”是重组DNA分子，其包含将由转化细胞表达的不同元件的组合。表1列出了SEQ ID NO:10中包含的元件，如图2所示。
表1：玉米事件MON87429的描述
Figure BDA0002612609730000131
Figure BDA0002612609730000141
如本文所用，术语“重组”是指非天然DNA、蛋白质或生物体，其正常在自然界中不存在并且是通过人为干预产生的。如本文所用，“重组DNA分子”是包含自然中不会同时出现并且是人为干预产生的DNA分子的组合的DNA分子，例如，由至少两种相互异种的DNA分子的组合组成的DNA分子，诸如包含转基因和与转基因相邻的植物基因组DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例是包含选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子。如本文所用，“重组植物”是正常不会在自然界中存在的植物，是人为干预的结果，并且含有转基因DNA分子。由于这种基因组改变，重组植物是新事物，并且与相关的野生型植物明显不同。重组植物的实例是含有玉米事件MON87429的玉米植物。
如本文所用，术语“转基因”是指由于人为干预(诸如通过植物转化方法)而人工掺入生物体基因组中的DNA分子。转基因可能与生物体异种。如本文所用，术语“转基因插入物”是指通过植物转化技术插入玉米基因组中以产生玉米事件MON87429的外来DNA。玉米事件MON87429的转基因插入物的序列提供为SEQ ID NO:9。术语“转基因”是指包含转基因，例如“转基因植物”是指包含转基因的植物。
如本文所用，术语“异种的”是指第一分子正常与自然界中的第二分子或生物体不相关联。例如，DNA分子可以来自第一物种，并插入第二物种的基因组中。因此，DNA分子对基因组和生物体都是异种的。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子融合至第二DNA分子而产生的单个DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子都不会在正常所见的构型中彼此融合。因此，嵌合DNA分子是自然界中正常不存在的新的DNA分子。嵌合DNA分子的实例是包含选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子。
如本文所用，术语“分离的”是指将分子与正常以其原始或天然状态与其缔合的其他分子分离。因此，术语“分离的”可以是指已经从其原始或天然状态与其缔合的其他DNA分子分离的DNA分子。这种DNA分子可以重组状态存在，诸如重组DNA分子。因此，从其天然状态中取出并融合至正常不与其缔合的另一个DNA分子上的DNA分子是分离的DNA分子。这种分离的DNA分子可能是使用生物技术的结果，诸如制备重组DNA或将外来DNA分子整合到细胞、植物或种子的染色体中。
本发明提供DNA分子和它们对应的DNA序列。如本文所用，术语“DNA”和“DNA分子”是指脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA分子可以是基因组或合成来源的，并且按照惯例是从5'(上游)端至3'(下游)端。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。所用的术语是《美国联邦法规》第1.822条第37款的要求，并在WIPO标准ST.25(1998)附录2，表1和3中的表中阐述。按照惯例，本发明的DNA序列及其片段仅参考两条互补DNA序列链中的一条链公开。通过暗示和意图，此处提供的序列的互补序列(互补链的序列)，在本领域中也称为反向互补序列，在本发明的范围内，并且明确地意图在所要求保护的主题的范围内。因此，如本文所用，提及SEQ ID NO:1-10及其片段包括并且是指互补链及其片段的序列。
如本文所用，术语“片段”是指整体的较小部分。例如、SEQ ID NO:10的片段将包括SEQ ID NO:10的完整序列的至少约10个连续核苷酸、至少约11个连续核苷酸、至少约12个连续核苷酸、至少约13个连续核苷酸、至少约14个连续核苷酸的序列、至少约15个连续核苷酸、至少约16个连续核苷酸、至少约17个连续核苷酸、至少约18个连续核苷酸、至少约19个连续核苷酸、至少约20个连续核苷酸、至少约25个连续核苷酸、至少约30个连续核苷酸、至少约35个连续核苷酸、至少约40个连续核苷酸、至少约45个连续核苷酸、至少约50个连续核苷酸、至少约60个连续核苷酸、至少约70个连续核苷酸、至少约80个连续核苷酸、至少约90个连续核苷酸或至少约100个连续核苷酸。
玉米事件MON87429的转基因插入物的DNA序列提供为SEQ ID NO:9。转基因插入物和侧接转基因插入物的每一侧的玉米基因组DNA的DNA序列提供为SEQ ID NO:10。侧翼DNA的一部分和转基因插入物的5'端的DNA序列提供为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7。侧翼DNA的一部分和转基因插入物的3'端的DNA序列提供为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。
跨越将转基因插入物的一端连接至侧翼玉米基因组DNA的磷酸二酯键的区域的DNA序列在本文中称为“接头”。接头是转基因插入物和侧翼DNA作为一个连续分子的连接点。在转基因插入物的5'端发现一个接头，并且在转基因插入物的3'端发现另一个接头，本文分别称为5'和3'接头。“接头序列”是指跨越事件的5'或3'接头的任何长度的DNA序列。玉米事件MON87429的接头序列使用SEQ ID NO:10对本领域技术人员是显而易见的。玉米事件MON87429的接头序列的实例提供为SEQ ID NO:1-8。图1示出了从5'至3'排列的SEQ ID NO:1-10的物理排列。玉米事件MON87429的接头序列可以作为含有玉米事件MON87429的植物、种子或细胞的基因组的一部分存在。从植物、植物部分、种子或细胞的样品中鉴定出SEQ IDNO:1-8或10中的任何一个或多个，表明DNA是从含有玉米事件MON87429的玉米中获得的，并且可用于诊断玉米事件MON87429的存在。
本发明的植物、种子、细胞、植物部分和商业产品可用于检测表示玉米事件MON87429的存在的DNA或蛋白质分子。提供了示例性DNA分子，其可以用作用于检测样品中玉米事件MON87429的存在的引物或探针。此类引物或探针对靶核酸序列是特异性的，并且因此可用于通过本文描述的方法鉴定玉米事件MON87429。玉米事件MON87429的存在的检测可以通过使用本领域已知的方法完成，诸如核酸的热扩增或核酸杂交技术(诸如northern印迹和southern分析)。
“引物”是被设计用于参与扩增反应的退火或杂交方法中的DNA分子。扩增反应是体外反应，其扩增模板DNA以产生扩增子。如本文所用，“扩增子”是已经使用扩增技术合成的DNA分子。本发明的扩增子具有包含SEQ ID NO:1-10中的一个或多个或其片段的DNA序列。一对引物可与模板DNA(诸如玉米基因组DNA样品)一起用于扩增反应(诸如聚合酶链反应(PCR))中以产生扩增子，其中产生的扩增子的DNA序列对应于位于引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列。引物通常被设计成与互补的靶DNA链杂交以在引物与靶DNA链之间形成杂合体。引物的存在是聚合酶识别的点，以使用靶DNA链作为模板开始引物的延伸。引物对是指使用结合双链核苷酸区段的相对链的两个引物，用于扩增它们之间的核苷酸区段的目的。引物序列的实例提供为SEQ ID NO:11(SQ51062)和SEQ ID NO:12(SQ51053)。提供为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物对可用作第一DNA分子和第二DNA分子，其中第一DNA分子是SEQ ID NO:10的转基因插入物DNA序列的片段，并且第二DNA分子是SEQ ID NO:10的侧翼DNA序列的片段，并且当与含有玉米事件MON87429的DNA一起用于扩增反应时，每个DNA分子都具有足够的长度以用作DNA引物，以产生诊断样品中的玉米事件MON87429的扩增子。在某些实施方案中，本发明的引物对还可被定义为包含第一和第二DNA分子，其中第一DNA分子是SEQ ID NO:10的玉米基因组部分的片段，并且第二DNA分子是SEQID NO:10的转基因部分的片段，并且当与含有玉米事件MON87429的DNA一起用于扩增反应时，每个DNA分子都具有足够的长度以用作DNA引物，以产生诊断样品中的玉米事件MON87429的扩增子。
“探针”是与靶核酸的链互补并且可用于杂交检测方法的核酸分子。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括与靶DNA序列特异性结合的聚酰胺和其他探针材料，并且这种结合的检测可用于检测靶DNA序列是否存在。探针可以连接到常规的可检测标记或报告分子，诸如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。可用作检测玉米事件MON87429的探针的示例性DNA序列提供为SEQ ID NO:13(PB50370)。
设计和使用引物和探针的方法是本领域众所周知的。包含SEQ ID NO:1-10的全长或片段的DNA分子可用作用于检测玉米事件MON87429的引物和探针，并且可以由本领域技术人员使用本文提供的序列容易地设计。
尽管可以通过常规方法设计保留优先与靶序列杂交的能力的与靶序列不同的引物和探针，但是根据本发明的探针和引物可以与靶序列具有完全的序列同一性。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需核酸分子在序列上充分互补以在所用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构即可。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴定样品中来自玉米事件MON87429的转基因DNA的存在。探针和引物的长度一般为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更长。此类探针和引物在严格的杂交条件下与靶DNA序列特异性杂交。常规的严格性条件由MR Green和J Sambrook在Molecular cloning:a laboratory manual,第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)中进行了描述。如本文所用，如果两个分子能够形成反平行的双链核酸结构，则所述两个分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子表现出完全的互补性，则它是另一个核酸分子的“互补”。如本文所用，如果在比对时第一分子的每个核苷酸与第二分子的每个核苷酸互补，则两个分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则它们是“最小互补”的。类似地，如果分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则它们是“互补的”。因此，允许偏离完全互补，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。
促进DNA杂交的适当严格性条件是本领域技术人员已知的或可以在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到，例如在约45℃下6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50℃下2.0×SSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下约2.0×SSC的低严格性至在50℃下约0.2×SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格性条件增加到约65℃的高严格性条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而其他变量可以改变。
提供了蛋白质，其可用于产生抗体以检测样品中玉米事件MON87429的存在。此类抗体对由玉米事件MON87429编码的蛋白质中的一种或多种具有特异性。编码此类蛋白质的DNA序列在SEQ ID NO:10中提供，并且编码序列的起始位置和终止位置在表1中示出。编码每种蛋白质的DNA序列和由所述序列编码的蛋白质可用于产生抗体以通过本文所述的方法检测玉米事件MON87429的存在。可以使用本领域已知的任何蛋白质检测技术来完成玉米事件MON87429的存在的检测，所述技术诸如蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体与可检测标记或报告分子(诸如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)的连接、或对报告分子的酶促作用。提供了一种方法，其用于使样品与结合由玉米事件MON87429编码的DMO、PAT、FT_T或CP4-EPSPS蛋白的抗体接触，并且然后检测抗体结合是否存在。此类抗体的结合用于诊断由玉米事件MON87429编码的一种或多种蛋白质的存在。
提供了用于检测玉米事件MON87429的存在的蛋白质和核酸检测试剂盒。也可以使用本文公开的组合物和方法以及蛋白质和核酸检测领域中众所周知的方法来开发此类试剂盒的变体。蛋白质和核酸检测试剂盒可用于使用含有玉米事件MON87429的植物育种的方法。此类试剂盒含有包含SEQ ID NO:1-10的片段的引物或探针或者对由玉米事件MON87429编码的蛋白质具有特异性的抗体。
检测试剂盒的一个实例包含至少一个具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸的DNA分子，以用作可用于检测样品中玉米事件MON87429是否存在的DNA探针。足以用作探针的示例性DNA分子是包含提供为SEQ ID NO:13的序列的DNA分子。本领域技术人员可以容易地设计其他探针。检测试剂盒的另一个实例包含至少一个引物对，所述引物对可用于产生可用于检测样品中玉米事件MON87429是否存在的扩增子。这种方法还可以包括对扩增子或其片段进行测序。足以用作引物对的示例性DNA分子是包含分别提供为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列的DNA分子。本领域技术人员可以容易地设计其他引物对。本发明的试剂盒还可任选地包含用于进行本文所述的检测或诊断反应的试剂。检测试剂盒的另一个实例包含对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性的至少一种抗体。例如，这种试剂盒可以利用侧流条，其包含当所述条的尖端与水性溶液接触时被活化的试剂。足以用于抗体产生的示例性蛋白质是由提供为SEQ ID NO:10的序列或其任何片段编码的蛋白质。
本发明提供了含有玉米事件MON87429的玉米植物、后代、种子、细胞和植物部分，以及使用这些产生的商业产品。本发明的植物、后代、种子、细胞、植物部分和商业产品含有可检测量的DNA，其具有提供为SEQ ID NO:1-8和SEQ ID NO:10的序列中的至少一个。
本发明的植物、后代、种子、细胞和植物部分也可以含有一种或多种附加转基因性状，特别是通过使包含玉米事件MON87429的玉米植物与另一种含有所述附加转基因性状的植物杂交而引入的那些。此类性状包括但不限于增加的抗虫性、增加的用水效率、增加的产量表现、增加的抗旱性、增加的种子质量、改善的营养品质、杂交种子产生和/或增加的除草剂耐受性，其中所述性状是相对于缺乏这种转基因性状的玉米植物测量的。
本发明的植物可以用于产生含有玉米事件MON87429的后代。如本文所用，“后代”包括包含从祖先植物继承的玉米事件MON87429的任何植物、种子和细胞，所述祖先植物是指包含具有选自SEQ ID NO:1-8和SE ID NO:10的至少一个序列的DNA分子的植物。对于玉米事件MON87429，植物、种子和细胞可以是纯合的或杂合的。后代植物可以由含有玉米事件MON87429的玉米植物产生的种子或由含有玉米事件MON87429的花粉受精的玉米植物产生的种子生长。
如本文所用，本发明的“植物部分”是来自含有玉米事件MON87429的植物的任何部分。植物部分包括但不限于全部或部分的组织样品、花粉、胚珠、荚果、花、根、茎、纤维和叶子。植物部分可能是有生命的或无生命的。
本发明提供了由含有玉米事件MON87429的植物产生的商业产品。本发明的商业产品含有可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的DNA序列。如本文所用，“商业产品”是指由来自包含玉米事件MON87429的植物、种子、细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商业产品包括但不限于加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。本发明的商业产品将含有可检测量的对应于玉米事件MON87429的DNA。样品中此DNA的一种或多种的检测可用于确定商业产品的含量或来源。可以使用任何标准的DNA分子检测方法，包括本文公开的检测方法。
玉米事件MON87429含有四个表达盒，它们共同提供对以下的耐受性：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂；合成生长素；谷氨酰胺合成酶抑制剂；和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂。
如本文所用，芳氧基苯氧基丙酸酯(FOP)基团中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂(称为“FOP除草剂”)包括但不限炔草酸(clodinafop)、炔草酸-乙酯、炔草酸-炔丙酯、氰氟草酸(cyhalofop)、氰氟草酸-丁酯、禾草灵(diclofop)、禾草灵-甲酯、精禾草灵(diclofop-P)、精禾草灵-甲酯、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精噁唑禾草灵、精噁唑禾草灵-乙酯、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、吡氟禾草灵-丁酯、精吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵-丁酯、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)、盖草能、盖草能乙酯(haloxyfop.etotyl)、盖草能-甲酯、精盖草能、精盖草能-甲酯、异噁草醚(isoxapyrifop)、噁唑酰草胺(metamifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵、喹禾灵-乙酯、精喹禾灵、精喹禾灵-乙酯、精喹禾灵-喹禾糠酯和三氟苯氧丙酸(trifop)。
如本文所用，合成生长素包括但不限于苯甲酸除草剂、苯氧酸除草剂、芳基吡啶甲酸酯除草剂和吡啶氧基酸除草剂。苯甲酸除草剂的实例包括但不限于麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)、麦草畏盐、麦草畏-丁氧基乙酯、麦草畏-二甘醇胺盐、麦草畏-二甲铵、麦草畏-二乙醇铵、麦草畏-异丙铵、麦草畏-钾、麦草畏-钠和麦草畏-三乙醇胺。苯氧酸除草剂的实例是2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、2,4-D-丁氧基乙酯、2,4-D-丁酯、2,4-D-胆碱、2,4-D-二甲铵、2,4-D-二乙醇胺、2,4-D-乙酯、2,4-D-2-乙基己酯、2,4-D-异丁酯、2,4-D-异辛酯、2,4-D-异丙酯、2,4-D-异丙铵、2,4-D-钾、2,4-D-钠、2,4-D-三异丙醇铵、2,4-D-三乙醇胺、氯甲酰草胺、滴丙酸、涕丙酸、MCPA、MCPA-丁氧基乙酯、MCPA-二甲铵、MCPA-2-乙基己酯。MCPA-异丙铵、MCPA-钾、MCPA-钠、MCPA-硫代乙酯、2,4-DB、MCPB、MCPB-甲酯、MCPB-乙基-钠和2-甲-4-氯丙酸(mecoprop)。芳基吡啶甲酸酯除草剂的实例是氟氯吡啶酸(halauxifen)、氟氯吡啶-甲酯和氯氟吡啶-苯甲酯(florpyrauxifen-benzyl)。吡啶氧基酸除草剂的实例是绿草定、氯氟吡氧乙酸、氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸和毒莠定。
如本文所用，谷氨酰胺合成酶抑制剂包括但不限于膦丝菌素、草铵膦、草铵膦盐、草铵膦-铵、草铵膦-钠、精草铵膦、L-草铵膦铵和L-草铵膦钠。
如本文所用，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂包括但不限于草甘膦、草甘膦盐、草甘膦-异丙铵、草甘膦-铵、草甘膦-二甲铵、草甘膦-三甲基锍盐(＝硫酸盐)、草甘膦-二铵、草甘膦-钾和草甘膦-钠。
如本文所用，“除草剂耐受性(herbicide tolerant或herbicide tolerance)”或“耐受性(tolerance)”意指完全或部分不受一种或多种除草剂的存在或施用影响的能力，例如当施用除草剂时抵抗毒性作用的能力。如果细胞、种子或植物在一种或多种除草剂的存在下能够维持至少一定程度的正常生长或表型，则它是“除草剂耐受的”或具有“改善的耐受性”。如果性状的存在可赋予细胞、种子或植物与野生型或对照细胞、种子或植物相比改善的除草剂耐受性，则所述性状为除草剂耐受性状。包含除草剂耐受性状的作物在除草剂存在下可以继续生长，并且受除草剂存在的影响最小。如果蛋白质的表达可赋予细胞、种子或植物与野生型或对照细胞、种子或植物相比改善的除草剂耐受性，则所述蛋白质赋予“除草剂耐受性”。除草剂耐受性蛋白的实例是来自土壤杆菌属菌株CP4的膦丝菌素N-乙酰基转移酶、麦草畏单加氧酶编码序列、FT_T蛋白和草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码序列。除草剂耐受性可以是对特定除草剂的完全或部分不敏感性，并且可以表示为对特定除草剂的耐受性百分比(％)或不敏感性。
如本文所用，“杂草”是任何不期望的植物。一种植物可能总体上出于农业或园艺目的被认为是不期望的(例如，苋属(Amaranthus)物种)，或者在特定情况下被认为是不期望的(例如，在不同物种的田地中的一种物种的作物植物，也称为自生植物)。杂草在本领域中一般是已知的，并且随地理、季节、生长环境和时间而变化。杂草种类的列表可从农业和科学学会(诸如美国杂草科学学会、加拿大杂草科学学会、巴西杂草科学学会、国际杂草科学学会和国际抗除草剂杂草调查)、政府机构(诸如美国农业部和澳大利亚环境与能源部)以及工业和农民协会(诸如国家玉米种植者协会)获得。
本发明提供了通过施用选自由以下组成的组的至少一种除草剂来控制玉米栽培区域中的杂草的方法：(i)芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如如喹禾灵和盖草能；(ii)合成生长素，诸如麦草畏和2,4-D；(iii)谷氨酰胺合成酶抑制剂，诸如草铵膦；以及(iv)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂草甘膦，其中在施用除草剂之前、之时或之后在所述区域种植了包含玉米事件MON87429的种子或植物，并且除草剂施用防止或抑制杂草生长且不伤害玉米植物。在施用除草剂时，植物生长区域可以包含或可以不包含杂草植物。在本发明的方法中使用的除草剂可以在生长季节单独施用或与一种或多种除草剂组合施用。可将本发明的方法中使用的除草剂与一种或多种除草剂在时间上(例如，作为桶混剂或以顺序施用方式)、空间上(例如，在生长季节的不同时间，包括玉米种子种植前后)组合施用，或两者兼有。例如，提供了一种控制杂草的方法，所述方法包括在一个区域种植包含玉米事件MON87429的种子，并在生长季节施用除草有效量的单独或与另一种除草剂组合的麦草畏、草铵膦、草甘膦、2,4-D或FOP除草剂，目的是控制所述区域的杂草而不伤害含有玉米事件MON87429的植物。此类除草剂的施用可以是在种植前(在种植含有玉米事件MON87429的种子之前的任何时间，包括出于燃尽目的，即在种子种植前施用于发芽或存在的杂草)、出苗前(种植含有玉米事件MON87429的种子之后以及含有玉米事件MON87429的植物出苗之前的任何时间)或出苗后(含有玉米事件MON87429的植物出苗后的任何时间)。在整个生长季节中可以多次施用一种或多种除草剂或者一起或单独施用除草剂的组合，例如两次施用(诸如种植前施用和出苗后施用，或出苗前施用和出苗后施用)或三次或更多次施用(诸如种植前施用和两次出苗后施用)。
在实施本发明的方法中除草剂施用可以是推荐的商业量或其任何分数或倍数，诸如推荐的商业量的两倍。除草剂量可以表示为每英亩每磅酸当量(lb ae/英亩)或每英亩每磅有效成分(lb ai/英亩)，取决于除草剂和配方。除草剂施用可以是推荐的商业量或其分数或倍数。如本文所提供的以英亩为单位的除草剂施用量仅是指导性的；与本文提供的任何剂量等效的剂量的除草剂施用量可以用于大于或小于一英亩的区域。除草剂施用包括选自由以下组成的组的至少一种除草剂：(i)芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如如喹禾灵和盖草能；(ii)合成生长素，诸如麦草畏和2,4-D；(iii)谷氨酰胺合成酶抑制剂，诸如草铵膦；以及(iv)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂草甘膦。在除草剂施用时，植物生长区域可以包含或可以不包含杂草植物。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的FOP除草剂的范围应在约0.01lb ai/英亩至约1.0lb ai/英亩(例如，喹禾灵可以约0.034lb ai/英亩至约0.083lb ai/英亩的量施用，并且盖草能可以约0.018ai/英亩至约0.07lb ai/英亩的量施用)。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的合成生长素苯氧酸除草剂的范围应在约0.1lb ae/英亩至约10lb ae/英亩(例如，2,4-D可以约0.75lb ae/英亩至约1.0lb ae/英亩的量施用)。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的合成生长素吡啶氧基酸除草剂的范围应在约0.05lb ae/英亩至约5.0lb ae/英亩(例如，氯氟吡氧乙酸可以约0.14lbae/英亩至约0.49lb ae/英亩的量施用)。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的合成生长素苯甲酸除草剂的范围应在约0.1lb ae/英亩至约16lb ae/英亩(例如，麦草畏可以约0.5lb ae/英亩至约2.0lb ae/英亩的量施用)。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的谷氨酰胺合成酶抑制剂的范围应在约0.1lb ae/英亩至约10lb ae/英亩(例如，草铵膦可以约0.4lb ai/英亩至约1.59lb ai/英亩的量施用)。在整个生长季节中，在控制杂草的区域使用的除草有效量的EPSPS抑制剂的范围应在约0.5lbae/英亩至约12lb ae/英亩(例如，草甘膦可以约0.75lb ae/英亩至约2.25lb ae/英亩的量施用)。
本发明提供了通过施用除草有效量的至少一种环己二酮(DIM)除草剂(诸如烯草酮、稀禾定和肟草酮)在作物栽培区域中控制包含玉米事件MON87429的自生玉米的方法，其中所述除草剂施用防止包含玉米事件MON87429的玉米的生长。在整个生长季节中，在控制自生玉米的区域使用的除草有效量的DIM除草剂可以以约0.03lb ai/英亩至约2.75lb ai/英亩的量施用(例如，烯草酮可以约0.0625lb ai/英亩至约0.125lb ai/英亩的量施用，并且稀禾定可以约0.188lb ai/英亩至约0.281lb ai/英亩的量施用)。
提供了产生含有玉米事件MON87429的植物和种子的方法。植物可以使用本领域已知的任何方法来育种，例如，通常使用的育种方法的描述可见于例如WR Fehr,BreedingMethods for Cultivar Development,Wilcox J.编著,American Society of Agronomy,Madison WI(1987)中。植物可以是自花授粉(也称为“自交”)或异花授粉(也称为“杂交”)。可以将含有玉米事件MON87429的植物自花授粉以产生对于玉米事件MON87429纯合的植物的真实育种品系。自交产生称为“近交”的后代，并且可用于产生遗传上均一的近交品系。或者，可以使含有玉米事件MON87429的植物异花授粉(用转基因或非转基因的另一种植物育种)以产生变种或杂交种子。通过本发明的方法制备的种子和后代植物含有玉米事件MON87429。玉米事件MON87429赋予对其的耐受性的一种或多种除草剂的施用可用于选择含有玉米事件MON87429的后代。或者，可以使用诊断方法分析后代，以选择含有玉米事件MON87429的植物或种子。后代可以是变种或杂交植物；可以由含有玉米事件MON87429的植物产生的种子或由含有玉米事件MON87429的植物的花粉受精的植物产生的种子生长；并且对于玉米事件MON87429可以是纯合的或杂合的。
提供了使用玉米事件MON87429产生杂交种子的方法。包含玉米事件MON87429的植物在除雄性生殖组织以外的所有组织中均具有草甘膦耐受蛋白CP4-EPSPS的表达。这导致营养组织和雌性生殖组织中的草甘膦耐受性以及雄性生殖组织中的草甘膦敏感性。这种草甘膦敏感性可通过适当施用草甘膦来诱导雄性不育。草甘膦是一种系统性除草剂，其可从源头转移到植物的下沉组织中。由于草甘膦在玉米中的代谢速率，在雄性生殖组织发育之前将其应用于包含玉米事件MON87429的植物可能会阻止花粉发育、花粉脱落或花药挤出。这种草甘膦诱导的雄性不育可用于增加杂交种子产生的效率，例如，通过消除或减少在杂交种子产生过程中在给定杂交中物理去势用作雌性玉米植物的需求。
本发明提供了一种产生杂交种子的方法，所述方法包括：(a)使包含玉米事件MON87429的植物生长，(b)向植物施用有效量的草甘膦以诱导雄性不育，其中在植物的雄性生殖组织发育之前或期间施用除草剂，从而在植物中诱导雄性不育；(c)用第二植物的花粉使植物受精；以及(d)从植物收获杂交种子。在一个实施方案中，在发育之前或期间，以一次或多次施用以总计约0.25lb ae/英亩至约11.0lb ae/英亩的有效量施用草甘膦。在另一个实施方案中，受精步骤可以通过允许被动受精(例如通过风授粉)、通过其他方式(诸如机械或手工授粉)或通过这些的组合来完成。除草剂施用可以在雄性生殖组织发育之前或期间(诸如选自由以下组成的组的阶段：玉米植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13和V14)以一次或多次施用来施用，并可能至少阻止花粉发育、花粉脱落或花药挤出。雄性不育可能是部分或完全的。在一个实施方案中，在V4至V8阶段施用的草甘膦的有效量将为总计约0.5lb ae/英亩至约2.5lb ae/英亩(在一次施用中或分成两次或更多次施用)或在开花前高达100生长度单位(GDU)。
本发明的植物、后代、种子、细胞和植物部分也可以含有一种或多种附加玉米性状或转基因事件，特别是通过使含有玉米事件MON87429的玉米植物与另一种含有所述附加性状或转基因事件的植物杂交而引入的那些。此类性状或转基因事件包括但不限于增加的抗虫性、增加的用水效率、增加的产量表现、增加的抗旱性、增加的种子质量、改善的营养品质、杂交种子产生和除草剂耐受性，其中所述性状是相对于缺乏这种转基因性状的玉米植物测量的。玉米转基因事件是本领域技术人员已知的；例如，美国农业部(USDA)动植物健康检查服务(APHIS)提供了此类性状的列表，并且可以在其网站www.aphis.usda.gov上找到。因此，可以通过使各自包含一个或多个转基因事件的两个亲本植物杂交，收集后代种子并选择含有两个或更多个转基因事件的后代种子或植物来在后代种子或植物中组合两个或更多个转基因事件；然后可以重复这些步骤，直到在后代中获得所需的转基因事件的组合。如同营养繁殖，还涵盖与亲本植物的回交以及与非转基因植物的远交。
根据与美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0002612609730000281
(地址为10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia USA，邮政编码20110)的布达佩斯条约，已保存了包含玉米事件MON87429的代表性种子样品。包含玉米事件MON87429的种子的ATCC专利保藏名称(登录号)为PTA-124635，并且保藏日期为2018年1月12日。保藏物将在保藏处保存30年，或在最后一次请求后保存5年，或在专利的有效期内，以较长者为准。
如本文所用，术语“包括”表示“包括但不限于”。
实施例
包括以下实施例以更全面地描述本发明。通过创建和最终选择玉米事件MON87429所需的严格的分子、农艺和田间测试，总结了三十五种表达构建体的构建和测试、超过一万五千个独特事件的产生以及七年来对数十万个个体植物的分析。
本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施例中进行许多修改，并且仍然获得相似的结果。某些化学和生理学上都相关的试剂可以替代本文中描述的试剂而获得相同或类似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类替代和修改被认为处在本发明的范围内。
实施例1：表达盒测试、构建体设计和R0植物测试
此实施例描述了35种不同构建体在玉米植物中的设计和测试。每种构建体含有四个表达盒，每个表达盒用于表达不同的转基因。进行此测试以选择用于在玉米中表达所有四个转基因的最佳构建体。每种构建体具有独特的构型，随表达盒的方向和表达元件的变化而变化。
设计具有不同表达元件组合和转基因的各种个体表达盒，将其克隆到植物转化载体中，并测试玉米植物中的性状功效，以创建最佳个体表达盒的库。使用此个体表达盒的库，设计了35种不同的构建体，使得每个构建体都含有四个表达盒(每个表达盒均具有PAT、DMO、CP4-EPSPS或FT的转基因)，并可用于测试不同表达盒的四向组合。表达盒组合随表达元件、蛋白质编码序列和方向的变化而变化。这导致测试了两个PAT表达盒、6个DMO表达盒、5个FT表达盒、18个CP4-EPSPS表达盒。
将35个四表达盒构建体克隆到植物转化载体中，并使用本领域已知的方法将这些载体用于LH244玉米未成熟胚的土壤杆菌介导的转化，以产生15,326个独特的转化事件，每个事件都是通过将转基因随机插入到玉米基因组中完成。然后由转基因细胞中再生出R0植物，并且将具有正常表型特征的生根植物转移到土壤中进行生长和进一步评估。
分析了15,326个R0植物具有转基因插入物的单拷贝以及载体骨架序列的缺失。将具有插入物的单拷贝的植物进行除草剂耐受性功效测试。在温室中评估单拷贝R0植物对喹禾灵(0.16lb ai/英亩的
Figure BDA0002612609730000306
除草剂)的耐受性，然后是对在V1/V2生长阶段喷洒的草铵膦(0.98lb ae/英亩的
Figure BDA0002612609730000307
280除草剂)、麦草畏(2.0lb ae/英亩的
Figure BDA0002612609730000309
除草剂)或2,4-D(2.0lb ae/英亩的2,4-D胺
Figure BDA0002612609730000308
除草剂)(或这些的任意组合)的桶混剂的耐受性。表现出>30％损伤的植物被丢弃。
在使用35个转化载体产生的最初的15,326个独特转化事件中，在分析拷贝数和除草剂喷洒数据后，选择了1,945个独特事件。数据提供在表2中。所选事件的R0植物被自花授粉以产生R1种子或杂交以产生F1种子，其被推进至第一季田间试验。
表2：第一季田间试验近交功效
Figure BDA0002612609730000301
Figure BDA0002612609730000311
实施例2：第一季田间试验
使用35种构建体中的每一种进行R0分析后推进的事件进行了多年的田间试验，并然后将每个植物在其第一季田间试验中的表现作为一组进行了分析。因此，每种构建体都由许多独特的事件代表。这使得可以在第一季田间试验中测试大量构建体，而仅将表现最好的构建体推进出第一季试验。针对(1)草铵膦+麦草畏、喹禾灵和2,4-D耐受性的近交功效，(2)综述杂交系统(RHS)功效，以及(3)对更高施用量的除草剂喹禾灵、2,4-D、草铵膦和麦草畏的耐受性的除草剂压力测试，用R2植物(对每个事件都是纯合的)进行了单独的第一季田间试验。
进行了植物的近交功效筛选，以评估对草铵膦+麦草畏、喹禾灵和2,4-D的除草剂耐受性。除草剂处理由以下组成：0.8lb ai/英亩的草铵膦加上2.0lb ae/英亩的麦草畏的桶混剂施用；0.16lb ai/英亩的喹禾灵；或2.0lb ai/英亩的2,4-D。在除草剂处理后的10-14天，以0-100的范围对地块的作物进行视觉评定，“0”为没有作物损伤，“100”为完全作物损坏。也收集了株高(PHT)、穗高(EHT)、到50％出须的天数(S50D)、到50％花粉的天数(P50D)、壳重(SHW)、测试重量(TWT)、水分(MST)和谷物产量(YLD)。所有数据均经过方差分析，并且均值分离为p<0.05。使用了含有相同事件的多个植物的总体平均值，并将对草铵膦+麦草畏、喹禾灵和2,4-D的近交功效总结为优异(4)、良好(3)、一般(2)或差(1)或不适用(NA)。数据提供于表3中。
表3：第一季田间试验近交功效
Figure BDA0002612609730000321
Figure BDA0002612609730000331
进行了植物的RHS功效筛选，以鉴定草甘膦耐受性和草甘膦诱导的近交材料雄穗不育性的差异。单一除草剂处理用于筛选，并且由以下组成：草甘膦以1.5lb ae/英亩施用至V2，然后以0.75lb ae/英亩施用至约V8(875个生长度天数)，然后是约V10(1025生长度天数)。在除草剂施用后10-14天，以0到100的范围视觉评定了地块的作物损伤％(CIPV2、CIPV8、CIPV10和CIPVT)，加上VT(雄穗出现后)的最终损伤等级。还以0到100的相似范围视觉评定了地块的出须％[(SES9A(S90)和SES9C(S90+4天)、SES9E(S90+8天)]和花药挤出％[(AES9A(S90)、AES9C(S90+4天)和AES9E(S90+8天)]，其中“0”为没有出须或花药挤出，并且“100”为完全出须或花药挤出。如在近交功效筛选中一样，收集了其他农艺参数。使用了含有相同事件的多个植物的总体平均值，并将草甘膦耐受性、雄穗不育性和产量各自总结为优异(4)、良好(3)、一般(2)或差(1)或不适用(NA)。数据提供于表4中。
表4：第一季田间试验RHS功效
Figure BDA0002612609730000332
Figure BDA0002612609730000341
如下进行除草剂压力测试以评估构建体水平作物对更高施用量的除草剂喹禾灵、2,4-D、草铵膦和麦草畏的耐受性。喹禾灵处理由以下组成：1)将0.32lb ai/英亩(4X)的喹禾灵加上0.25体积％非离子表面活性剂(NIS)施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8；2)将0.64lb ai/英亩(8X)的喹禾灵加上0.25体积％NIS施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8；或3)将1.28lb ai/英亩(16X)的喹禾灵加上0.25体积％NIS施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8。2,4-D处理由以下组成：1)将2lb ai/英亩的2,4-D胺加上0.25体积％非离子表面活性剂(NIS)施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8；2)将4lb ai/英亩的2,4-D胺加上0.25体积％NIS施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8；3)将8lb ai/英亩的2,4-D胺加上0.25体积％NIS施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8；或4)将16lb ai/英亩的2,4-D胺加上0.25体积％NIS施用于VE-V2，然后是V4，然后是V8。草铵膦处理由以下组成：1)将1.0lb ai/英亩的草铵膦施用于V2，然后是V4，然后是V8；2)将2.0lb ai/英亩的草铵膦施用于V2，然后是V4，然后是V8；3)将4.0lb ai/英亩的草铵膦施用于V2，然后是V4，然后是V8；或4)将8.0lb ai/英亩的草铵膦施用于V2，然后是V4，然后是V8。麦草畏处理由以下组成：1)将2.0lb的麦草畏施用于V2，然后是V4，然后是V8；2)将4.0lb的麦草畏施用于V2，然后是V4，然后是V8；3)将8.0lb的麦草畏施用于V2，然后是V4，然后是V8；或4)将16lb的麦草畏施用于V2，然后是V4，然后是V8。如在近交功效筛选中一样，视觉评定了地块的作物损伤，并且收集了农艺参数。使用了含有相同事件的多个植物的总体平均值，并将对四种除草剂中的每一种的除草剂耐受性功效总结为优异(4)、良好(3)、一般(2)或差(1)或不适用(NA)。数据提供于表5中。
表5：第一季田间试验除草剂压力测试
Figure BDA0002612609730000351
Figure BDA0002612609730000361
汇编了用35种构建体中的每一种产生的R2植物的综合性能数据，并针对以下进行分析：(1)草铵膦+麦草畏、喹禾灵和2,4-D耐受性的近交功效测试，(2)草甘膦耐受性、雄穗不育性和产量的RHS功效测试，以及(3)对更高施用量的除草剂喹禾灵、2,4-D、草铵膦和麦草畏的耐受性的除草剂压力测试。利用此数据，从35种测试的构建体中选择了3种构建体(HT4-14、HT4-32和HT4-34)进行推进。然后将这3种构建体的事件推进到第二季田间试验。
实施例3：分子分析
分子分析与推进的事件的田间试验同时进行。DNA扩增和测序用于确认插入物序列、插入物拷贝数和插入物中骨架的缺失。绘制了每个事件在玉米基因组中的插入位点。进行了Northern分析以检测和测量pat、dmo、ft_t和cp4-epsps基因的mRNA转录物。对从转基因植物中纯化的PAT、DMO、FT_T和CP4-EPSPS蛋白进行了N末端蛋白测序，以确认重组蛋白序列。用转基因植物样品进行蛋白质印迹分析以检测PAT、DMO、FT_T和CP4-EPSPS蛋白。对来自R1植物的基因组DNA进行了深入的Southern分析，以确认拷贝数和骨架的缺失。
实施例4：推进的田间试验
多年来用针对构建体HT4-14、HT4-32和HT4-34从第一季田间试验推进的事件进行了推进的田间试验(第二季及以后的测试)。将每个田间试验中针对每个事件的多个个体植物的表现作为一组进行分析。因此，每个事件都由许多独特的植物代表。这允许在许多条件下、在不同地点和地理位置针对各种属性分析每个事件的表现。
用近交植物(对于事件是纯合的)和杂交植物(对于事件是半合的)进行田间试验，以评估(1)商业量的草铵膦、麦草畏、喹禾灵和2,4-D耐受性的性状功效，(2)农艺表现；(3)综述杂交系统(RHS)功效和草甘膦，以及(4)对更高施用量的除草剂喹禾灵、2,4-D、草铵膦和麦草畏除草剂的耐受性的除草剂压力测试。
在田间第1季试验中，针对构建体HT4-14测试了30个事件，针对构建体HT4-32测试了41个事件，并且针对构建体HT4-34测试了21个事件。使用来自这些试验的综合数据，选择事件用于推进。在田间第2季试验中，针对构建体HT4-14测试了15个事件，针对构建体HT4-32测试了38个事件，并且针对构建体HT4-34测试了38个事件(此数目包括在田间第1季中未测试的一些事件，原因是第1季的种子短缺)。如实施例3中所述，通过分子分析表征针对构建体HT4-14的事件，并且此数据也用于选择事件。来自这些试验的综合数据以及针对HT4-14构建体的事件的深入分子表征用于选择3个事件用于HT4-14构建体的推进。来自这些试验的综合数据用于选择24个事件用于HT4-32构建体的推进，并决定不进一步推进HT4-34构建体的任何事件。在田间第3季试验中，测试了针对构建体HT4-14的3个事件和针对HT4-34构建体的24个事件。来自这些试验的综合数据用于选择2个事件用于HT4-14构建体的推进，并决定不进一步推进HT4-32构建体的任何事件。田间第4季试验用于比较各种条件下在大量地点中以及杂种和近交种质中的最后两个事件，以便产生选择优良事件所需的数据。表6提供了在每一季期间进行的田间试验中针对每种构建体测试的独特事件的数量。
表6：推进田间试验总结
里程 HT4-14 HT4-32 HT4-34
田间第1季 30 41 21
田间第2季 15 38 38
田间第3季 3 24 0
田间第4季 2 0 0
最终事件选择 1 0 0
农艺表现田间试验与性状功效田间试验在同一季期间进行。所有田间试验均采用随机完整区组设计，并在多个地点进行。田间试验在北美和南美的地点进行。对于功效和农艺田间试验，在整个田间试验季节收集农艺评分，并在季节结束时确定产量(功效产量或农艺产量)。进行了田间功效试验，以评估除草剂施用后10到14天的作物损伤。目标作物损伤等级是指事件推进低于10％的分数。对于农艺田间试验，地块保持无杂草，并且在生长季节期间均未施用任何测试除草剂。杂交农艺田间试验包括使用与用于进行转基因杂交的亲本玉米相同但不包含转基因事件的亲本玉米品系产生的可比较杂交的对照(杂交对照)。近交对照是与转基因近交品系可比较的近交。
为了比较田间试验数据，使用多季节、多地点田间试验数据中所有植物的汇总进行荟萃分析。作为实例，表7示出了在多个季节中针对两个所选择的HT4-14事件重复观察的重复次数(reps)以及在每个试验中针对每个事件测试的个体植物的总数。
表7：田间试验重复
Figure BDA0002612609730000381
Figure BDA0002612609730000391
为了比较杂交损伤等级，完成了多重杂交功效田间试验的荟萃分析。作为实例，表8提供了在V8评分的两个所选择的HT4-14事件在多个季节中的损伤等级(其中V8分析涵盖了V2、V4、V6和V8除草剂施用造成的累积损伤)，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。在这些试验中，含有玉米事件MON87429的植物和含有事件2的植物均表现良好。
表8：杂交功效田间试验的损伤等级的荟萃分析
里程 事件 V8损伤 LSD(P<0.05)
田间第1季 MON87429 1.3 2.1
田间第1季 事件2 1.1 2.1
田间第2季 MON87429 1.7 3.1
田间第2季 事件2 2.6 3.1
田间第3季 MON87429 0.08 3.4
田间第3季 事件2 0.13 3.4
为了比较以蒲式耳/英亩(Bu/ac)为单位的产量，完成了多重杂交功效田间试验的荟萃分析。作为实例，表9提供了两个所选择的HT4-14事件在多个季节中杂交的产量，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。在这些试验中，含有玉米事件MON87429的植物和含有事件2的植物均表现良好。
表9：杂交功效田间试验的产量的荟萃分析
Figure BDA0002612609730000392
Figure BDA0002612609730000401
对含有单个转基因事件的杂交和近交植物进行了压力测试田间试验，其中以高于商业用量的施用量施用除草剂。将除草剂草铵膦(在1.6至6.4lb ai/英亩范围内)、麦草畏(在2.0至16lb ai/英亩范围内)、喹禾灵(在0.32至1.28lb ai/英亩范围内)、2,4-D(在2.0到8.0lb ai/英亩范围内)和草甘膦(3.0lb ae/英亩)施用于田间试验，用于对除草剂耐受性状的功效的压力测试。在季节结束时，收获了杂交压力测试田间试验并确定了产量(Bu/ac)。作为实例，表10提供了两个所选择的HT4-14事件杂交和近交的产量数据，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。在所有除草剂处理的杂交和近交产量试验中，含有玉米事件MON87429的植物和含有事件2的植物均表现良好。结果表明，进一步的田间测试可以确定玉米MON87429与事件2相比的近交产量优势。
表10：杂交/近交压力测试功效田间试验的产量
Figure BDA0002612609730000402
进行了杂交农艺田间试验，在整个季节中收集了农艺量度，并且在季节结束时确定了农艺产量。使用跨多个季节、多个地点的杂交农艺田间试验的荟萃分析来比较杂交对照和杂交的产量。作为实例，表11提供了两个所选择的HT4-14事件的产量数据(Bu/ac)，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。在这些试验中，含有玉米事件MON87429的植物和含有事件2的植物均表现良好，并且与对照植物相比，发现含有这些事件之一的植物的杂交产量均无统计学差异。
表11：杂交农艺田间试验的荟萃分析
Figure BDA0002612609730000411
对草甘膦耐受性进行了近交功效田间试验，并在季节结束时确定了综述杂交系统(RHS)和产量。草甘膦以1.5lb ae/ac/英亩的量施用以控制杂草，然后在大约V8以0.75lbae/英亩以及然后在大约V10以0.75lb ae/英亩的草甘膦的两次不育施用。使用跨多个季节、多个地点的近交功效田间试验的荟萃分析来比较植物的产量。作为实例，表12提供了两个所选择的HT4-14事件的产量数据(Bu/ac)，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。当与含有事件MON87429的植物相比时，田间第2季和田间第3季试验均示出含有事件2的植物的产量在统计学上显著降低。这些数据表明含有玉米事件MON87429的植物在近交功效产量试验中的优异表现。
表12：草甘膦处理的近交田间试验的产量的荟萃分析
Figure BDA0002612609730000412
Figure BDA0002612609730000421
进行近交农艺田间试验，并在季节结束时确定未处理的植物的产量。试验包括与转基因近交品系可比较的近交品系的对照。进行跨多个季节、多个地点的近交农艺田间试验的荟萃分析，比较配对的对照和转基因近交的产量。作为实例，表13提供了两个所选择的HT4-14事件的产量数据(Bu/ac)，在95％的置信水平上具有统计学上的最小显著差异(LSD为p<0.05)。在对照植物和含有玉米事件MON87429的植物之间，未发现在近交农艺产量方面的统计学差异。相反，对于田间第3季试验，当与对照植物和含有事件MON87429的植物相比时，含有事件2的植物的产量在统计学上显著降低。这些数据表明含有玉米事件MON87429的植物在近交农艺产量试验中的优异表现。
表13：近交农艺田间试验的荟萃分析
Figure BDA0002612609730000422
在阿根廷的四个地点进行了杂交功效试验，以评估植物对草铵膦、麦草畏、喹禾灵、盖草能、2,4-D和草甘膦的耐受性。将含有MON87429的植物与同时含有玉米事件MON88017和玉米事件MON89034的植物杂交，以产生包含所有三个事件的后代(MON87429xMON88017 x MON89034)。除草剂处理包括1)未处理的对照；2)在V2阶段施用0.448kg ai/公顷的草铵膦，然后是在V6阶段同样施用；3)在V2阶段施用0.896kg ai/公顷的草铵膦，然后是在V6阶段同样施用；4)在V2阶段施用0.56lb ae/英亩的麦草畏，然后是在V6阶段同样施用；5)在V2阶段施用1.12lb ae/英亩的麦草畏，然后是在V6阶段同样施用；6)在V2阶段施用0.09kg ae/公顷的喹禾灵，然后是在V6阶段同样施用；7)在V2阶段施用0.18kg ae/公顷的喹禾灵，然后是在V6阶段同样施用；8)在V2阶段施用0.1kg ae/公顷的盖草能，然后是在V6阶段同样施用；9)在V2阶段施用0.2kg ae/公顷的盖草能，然后是在V6阶段同样施用；10)在V2阶段施用1.12lb ai/英亩的2,4-D，然后是在V6阶段同样施用；11)在V2阶段施用2.24lbae/英亩的2,4-D，然后是在V6阶段同样施用；或12)在V2阶段施用2.24lb ae/英亩的草甘膦，然后是在V6阶段同样施用。数据收集由以下组成：在V2和V6除草剂施用后10到14天的作物损伤以及在VT的最终等级、到50％花粉的天数、到50％出须的天数、株高、穗高、壳重、测试重量、水分和谷物产量。所有数据均经过方差分析，且均值分离为p<0.05。
在所有测试的草甘膦、草铵膦、麦草畏、喹禾灵、盖草能和2,4-D的量下，含有MON87429 x MON88017 x MON89034的植物的除草剂耐受性极好(作物损伤<10％)。除草剂处理量在视觉作物损伤方面没有差异。与标准除草剂处理12(2.24lb ae/英亩的草甘膦)相比，任何处理的穗高均无显著差异。与未处理植物相比，在任何处理中，含有MON87429 xMON88017 x MON89034的植物的株高或测试重量没有显著降低、谷物水分没有显著增加、成熟期没有显著延迟(以增加的到50％花粉或出须的天数来衡量)、谷物产量没有显著降低。通过将含有MON87429的植物与含有在雄性组织中提供草甘膦耐受性的事件(诸如可商购获得的玉米事件MON88017或NK603)的植物杂交产生的杂交植物，提供了对以商业标签量施用的草甘膦、草铵膦、麦草畏、喹禾灵、盖草能和2,4-D的极好的营养耐受性。
三年的田间试验用于使用烯草酮测试对包含玉米事件MON87429的植物的控制。这些试验评估了DIM除草剂在含有玉米事件MON87429的植物中的自生控制方法的使用。用商业标记量的烯草酮处理植物，并观察包含玉米事件MON87429的植物的完全控制。
从分子分析以及近交和杂交植物的田间试验累积评估以下的数据(1)商业量的草铵膦、麦草畏、喹禾灵和2,4-D耐受性的性状功效，(2)农艺表现；(3)综述杂交系统(RHS)功效和草甘膦耐受性，以及(4)对更高施用量的除草剂喹禾灵、2,4-D、草铵膦和麦草畏除草剂的耐受性的除草剂压力测试，对于针对构建体HT4-14、HT4-32和HT4-34测试的所有事件分析所述数据。对累积数据的分析表明，与其他事件相比，玉米事件MON87429的总体表现优异，并因此出于商业目的选择了此事件。
实施例5：玉米事件MON87429的分子表征
玉米事件MON87429在被选作商业事件后进行了广泛的分子表征。玉米事件MON87429的转基因插入物含有表1中所述的元件和序列。
进行了玉米事件MON87429的DNA序列分析。进行Southern印迹分析以确认含有玉米事件MON87429的植物含有完整的转基因插入物的单个完整拷贝，而不含任何转化载体骨架。在插入物的5'和3'端对侧翼DNA进行测序，并使用序列捕获、富集、测序、反向PCR和基因组步移技术确定各自的接头。玉米事件MON87429的侧翼DNA序列被映射到已知的玉米基因组物理组装。插入位点序列信息用于事件的染色体位置的生物信息学分析。通过使用对玉米事件MON87429的侧翼区域具有特异性的引物，通过跨野生型等位基因的PCR来确定插入位点的完整性。使用野生型插入位点将玉米事件MON87429的转基因整合的独特位点映射到玉米参考基因组。为了确保在转化过程中没有将改变或突变引入转基因的任何区域，从植物中分离出玉米事件MON87429的整个转基因插入物并测序。5'接头、3'接头和转基因插入物的序列信息在本文中提供为SEQ ID NO:1-10。
进行了包含玉米事件MON87429的构建体的植物的RNA分析。对从含有玉米事件MON87429的植物的谷物中分离的总RNA进行Northern分析。这证实了pat、dmo、ft_t和cp4-epsps mRNA产物的转录物大小和数量。还使用来自含有玉米事件MON87429的植物组织的样品通过实时PCR测量了CP4-EPSPS的RNA表达水平。cDNA端的快速扩增(RACE)用于鉴定CP4-EPSPS裂解产物，以确认CP4-EPSPS转录物的裂解仅在包含玉米事件MON87429的植物的穗中发生，并且这是由玉米内源性雄性特异性小干扰RNA(siRNA)以序列特异性方式触发的。进行低分子量Northern分析，以证明没有CP4-EPSPS siRNA会损害非穗组织中的草甘膦耐受性。
进行包含玉米事件MON87429的构建体的植物的蛋白质分析。使用来自谷物的免疫纯化的蛋白提取物对表达的PAT、DMO、FT_T和CP4-EPSPS蛋白进行N末端蛋白测序，以确认真实的N末端氨基酸序列。对来自含有玉米事件MON87429的谷物的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析，以确认分别产生了PAT、DMO、FT_T和CP4-EPSPS的单个预期大小的蛋白质。使用ELISA以确定PAT、DMO、FT_T和CP4-EPSPS蛋白在植物的叶子、种子、根和花粉中的蛋白质水平。
实施例6：玉米事件MON87429的检测
可以使用DNA、RNA或蛋白质检测技术来检测样品中的玉米事件MON87429。示例性检测方法和材料在下文提供。检测可以确定样品中是否存在玉米事件MON87429。检测可表示基因组DNA样品中玉米事件MON87429的基因组拷贝数(即半合、纯合或杂合)。
开发了事件特异性终端Applied BiosystemsTM
Figure BDA0002612609730000451
热扩增方法(ThermoFisher Scientific)以鉴定样品中的玉米事件MON87429。终端测定中使用的DNA引物和探针是引物SQ51062(SEQ ID NO:11)、SQ51053(SEQ ID NO:12)和6-FAMTM标记的探针PB50370(SEQ ID NO:13)。6-FAM是连接到DNA探针的Applied Biosystems(Foster City,CA)的荧光染料产品。对于TAQMAN MGBTM探针，TaqDNA聚合酶的5'核酸外切酶活性从荧光团和猝灭剂之间的5'端裂解探针。当与靶DNA链杂交时，猝灭剂和荧光团被充分分离以产生荧光信号，从而释放荧光。当SQ51062和SQ51053与这些反应方法和PB50370一起使用时会产生诊断玉米事件MON87429的DNA扩增子。此分析的对照应包括含有玉米事件MON87429的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照以及不含模板DNA的阴性对照。此外，PCR反应的对照应最佳地包括对玉米基因组中单拷贝基因具有特异性的内部对照引物和内部对照探针。这些测定经过优化，可与以最高速度运行的Applied Biosystems
Figure BDA0002612609730000461
PCR System 9700(ThermoFisher Scientific)一起使用，但也可以使用其他设备。
可使用TAQMAN方法检测玉米事件MON87429的条件的实例如下。步骤1：将18兆欧的水调整为最终体积为5μl。步骤2：使2.28μl的2X Universal Master Mix(dNTP、酶、缓冲液)达到1X的最终浓度。步骤3：0.05μl的事件引物1(SQ51062)和事件引物2(SQ51053)(重悬于18兆欧水中至每种引物的浓度为100uM)至最终浓度为0.9μM。步骤4：0.01μl的事件6-FAMMGB探针PB50370(重悬于18兆欧的水中至浓度为100μM)至最终浓度为0.2μM。步骤5：0.05μl的内部对照引物1和内部对照引物2混合物(重悬于18兆欧的水中至每种引物的浓度为100μM)至最终浓度为0.9μM。步骤6：0.01μl的内部对照VICTM探针(重悬浮于18兆欧的水中至浓度为100μM)至最终浓度为0.2μM。步骤7：每个样品2.5μl的提取DNA(模板)，其中以下每个样品都包含提取DNA：(a)待分析的叶子样品；(b)阴性对照(非转基因DNA)；(c)阴性水对照(无模板)；(d)含有玉米事件MON87429的DNA的阳性对照玉米。步骤8：热循环仪条件如下：在95℃下20秒，进行一次循环；在95℃下3秒，然后在60℃下20秒，进行四十次循环；以及10℃的最终循环。
开发了接合性测定以确定包含玉米事件MON87429的植物对于所述事件或野生型等位基因是杂合的还是纯合的。可以使用本文提供的序列信息设计扩增反应测定。例如，这种PCR测定将包括至少三个引物的设计：引物1、引物2和引物3，其中引物1对玉米事件MON87429的3'侧翼上的玉米基因组DNA具有特异性；引物2对玉米事件MON87429转基因插入物具有特异性；并且引物3对野生型等位基因具有特异性。当在扩增反应中用作引物对时，引物1和引物2将产生对玉米事件MON87429具有特异性的PCR扩增子。当在扩增反应中用作引物对时，引物1和引物3将产生对野生型等位基因具有特异性的PCR扩增子。在玉米基因组DNA上进行的PCR反应中，分别由引物1+引物2产生的PCR扩增子和由引物1+引物3产生的PCR扩增子在扩增子的序列和大小方面会有所不同。当将三个引物包含在使用从对于玉米事件MON87429纯合的植物中提取的DNA的PCR反应中时，将仅生成引物1+引物2扩增子(对玉米MON87429插入具有特异性)。当将三个引物包含在使用从对于玉米事件MON87429杂合的植物中提取的DNA的PCR反应中时，将同时生成引物1+引物2扩增子(对野生型等位基因具有特异性)和引物1+引物3扩增子(对玉米MON87429插入具有特异性)。当将三个引物包含在使用从对于玉米事件MON87429为空(野生型)的植物中提取的DNA的PCR反应中时，将仅生成引物1+引物3扩增子(对野生型等位基因具有特异性)。可以使用本领域已知的任何方法来鉴定或区分使用PCR反应产生的扩增子。
玉米事件MON87429的另一种接合性测定是TAQMAN热扩增反应。对于这种类型的测定，除了如上所述的引物之外，测定还将包括两个荧光标记的探针。探针1将对玉米事件MON87429具有特异性，而探针2将对于玉米事件MON87429为空(野生型)的玉米植物具有特异性，并且其中两个探针含有不同的荧光标记，例如6-FAM标记或VICTM标记。当用于TAQMAN反应时，引物1+引物2+探针1将产生对玉米事件MON87429具有特异性的第一荧光信号，并且引物1+引物3+探针2将产生对野生型玉米具有特异性的第二荧光信号。当将三个引物和两个探针包含在使用从对于玉米事件MON87429纯合的植物中提取的DNA的TAQMAN反应中时，将仅生成第一荧光信号(对引物1+引物2+探针1具有特异性)。当将三个引物和两个探针包含在使用从对于玉米事件MON87429杂合的植物中提取的DNA的TAQMAN反应中时，将同时生成第一荧光信号(对引物1+引物2+探针1具有特异性)和第二荧光信号(对引物1+引物3+探针2具有特异性)。当将三个引物混合在使用从对于玉米事件MON87429为空(野生型)的植物中提取的DNA的TAQMAN反应中时，将仅生成第二荧光信号(对引物1+引物3+探针2具有特异性)。
检测植物样品中玉米事件MON87429的存在的另一种方法是Southern分析。本领域技术人员将理解如何设计对玉米事件MON87429具有特异性的Southern杂交探针和对于玉米事件MON87429为空(野生型)的玉米植物具有特异性的第二Southern杂交探针。通过Southern分析，仅从第一Southern杂交探针检测到的信号将指示对于玉米事件MON87429纯合的植物；从第一Southern杂交探针和第二Southern杂交探针两者检测到的信号将指示对于玉米事件MON87429杂合的植物；并且仅从第二Southern杂交探针检测到的信号将指示所述DNA是从对于玉米事件MON87429为空(野生型)的植物中提取的。
检测试剂盒的另一个实例包括对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性的至少一种抗体。例如，这种试剂盒可以利用侧流条，其包含当所述条的尖端与水性溶液接触时被活化的试剂。足以用于抗体产生的示例性蛋白质是由提供为SEQ ID NO:10的序列或其任何片段编码的蛋白质。
开发了一种蛋白质检测方法来确定样品是否来自包含玉米事件MON87429的植物、种子、细胞或植物部分。对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性的至少一种抗体用于检测样品中由玉米事件MON87429编码的蛋白质。包含对由玉米事件MON87429编码的一种或多种蛋白质具有特异性的一种或多种抗体的检测试剂盒，可以利用侧流条，其含有当所述条的尖端与水性溶液接触时被活化的试剂。可以研磨玉米组织的样品，并使用水或水性缓冲剂(例如，含有去污剂和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水)分析提取的蛋白质。离心后，在含有吸收垫的侧流条上使用ELISA方法以夹心形式分析水性上清液。通过将所述条的尖端浸入含有待测样品的水性溶液中来活化检测。水性溶液通过毛细管作用被带到条上，并使条上的金标记抗体溶解。金标记的抗体对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性，并将与样品中蛋白质的表位结合形成抗体-抗原复合物。然后，将金标记的抗体-抗原复合物沿条带至硝酸纤维素膜上。所述膜包含固定的抗体的测试线，所述测试线与由玉米事件MON87429编码的蛋白质上的第二独立表位结合，如果样品中存在由玉米事件MON87429编码的蛋白质，则会在测试条上出现可见线。
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Claims (36)

1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2和SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子来源于包含玉米事件MON87429的植物、种子或细胞，包含所述事件的种子的代表性样品已作为ATCC登录号PTA-124635保藏。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子在包含玉米事件MON87429的植物、细胞、种子或植物部分中，包含所述事件的种子的代表性样品已作为ATCC登录号PTA-124635保藏。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子是诊断玉米事件MON87429的存在的扩增子。
5.一种包含四个表达盒的DNA构建体，其中
a)第一表达盒在可操作的连接中包含(I)来自沙蔗茅的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)膦丝菌素N-乙酰基转移酶编码序列，和(III)来自粟的果糖-二磷酸醛缩酶3'UTR；
b)第二表达盒在可操作的连接中包含(I)来自薏苡的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的白化和淡绿色6叶绿体转运肽编码序列，(III)麦草畏单加氧酶编码序列，和(IV)来自水稻的金属硫蛋白样蛋白3'UTR；
c)第三表达盒在可操作的连接中包含(I)来自芦竹的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的苹果酸脱氢酶叶绿体转运肽编码序列，(III)FT-T蛋白编码序列，和(IV)来自水稻的无顶端分生组织蛋白3’UTR，其中所述FT-T蛋白编码序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸10230-11117；并且
d)第四表达盒在可操作的连接中包含(I)CaMV 35S启动子和前导序列，(II)来自普通小麦的叶绿素a/b结合蛋白前导序列，(III)来自水稻的肌动蛋白1内含子，(IV)来自拟南芥的ShkG叶绿体转运肽编码序列，(V)来自土壤杆菌属菌株CP4的草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码序列，(VI)来自玉米的雄性组织特异性siRNA靶标，和(VII)来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR，其中来自玉米的雄性组织特异性siRNA靶标包含SEQID NO:10的核苷酸14170-14370，和来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR包含SEQID NO:10的核苷酸14379-14989。
6.一种DNA分子，其具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸以用作对来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中的SEQ ID NO:10具有特异性的DNA探针，其中所述DNA探针包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
7.如权利要求6所述的DNA分子，其中所述DNA探针包含SEQ ID NO:13。
8.一对DNA分子，其包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和所述第二DNA分子各自包含SEQ ID NO:10的片段，并且当与含有玉米事件MON87429的DNA一起用于扩增反应时，其可用作DNA引物以产生诊断样品中玉米事件MON87429的扩增子，其中所述扩增子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1。
9.如权利要求8所述的DNA分子对，其中至少一个DNA引物包含选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的序列的片段。
10.如权利要求8所述的DNA分子对，其中所述第一DNA分子包含SEQ ID NO:11并且所述第二DNA分子包含SEQ ID NO:12。
11.一种检测来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中玉米事件MON87429的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与权利要求6所述的DNA探针接触；
b)使所述样品和所述DNA探针经受严格杂交条件；以及
c)检测所述DNA探针与所述样品中DNA分子的杂交，
其中所述DNA探针与所述DNA分子的杂交表明所述DNA样品中玉米事件MON87429的存在。
12.一种检测来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中玉米事件MON87429的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与权利要求8所述的DNA分子对接触；
b)进行足以产生DNA扩增子的扩增反应，所述DNA扩增子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1；以及
c)检测所述DNA扩增子的存在，
其中所述DNA扩增子的存在表明所述样品中玉米事件MON87429的存在。
13.一种检测来源于玉米植物、玉米种子或玉米细胞的样品中玉米事件MON87429的存在的方法，其中所述玉米植物、玉米种子或玉米细胞源自包含玉米事件MON87429的植物或其后代植物，所述方法包括：
a)使所述样品与至少一种对由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质具有特异性的抗体接触；以及
b)检测所述抗体与所述样品中的所述蛋白质的结合，
其中所述抗体与所述蛋白质的结合表明所述样品中玉米事件MON87429的存在。
14.如权利要求13所述的方法，其还包含至少对由玉米事件MON87429编码的第二蛋白质具有特异性的第二抗体。
15.一种用于检测玉米事件MON87429的存在的试剂盒，其包含：
a)具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸的DNA探针，以用作对源自玉米植物、玉米种子或玉米细胞的DNA样品中的SEQ ID NO:10具有特异性的DNA探针，其中所述DNA探针包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；或
b)一对DNA引物，包含第一引物分子和第二引物分子，其中所述第一和第二引物分子各自包含SEQ ID NO:10的片段，并且当与含有玉米事件MON87429的DNA一起用于扩增反应时，其功能是产生诊断玉米事件MON87429的扩增子，其中所述扩增子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1。
16.一种用于控制作物生长区域中的杂草的方法，其包括：
a)在所述作物生长区域中种植包含玉米事件MON87429的玉米；以及
b)向所述作物生长区域或其任何部分施用有效量的选自由以下组成的组的至少一种除草剂：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，以控制所述区域的杂草而不损伤所述玉米。
17.如权利要求16所述的方法，其中施用所述有效量的至少一种除草剂包括在整个生长季节中施用至少两种或更多种选自由以下组成的组的除草剂：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中施用所述有效量的至少一种除草剂包括施用选自由以下组成的组的除草剂：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦和草甘膦或其任意组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中在整个生长季节中所述麦草畏的有效量为0.5lbae/英亩至2lb ae/英亩。
20.如权利要求18所述的方法，其中在整个生长季节中所述草铵膦的有效量为0.4lbai/英亩至1.59lb ai/英亩。
21.如权利要求18所述的方法，其中在整个生长季节中所述2,4-D的有效量为0.75lbae/英亩至1.0lb ae/英亩。
22.如权利要求18所述的方法，其中在整个生长季节中所述喹禾灵的有效量为0.034lbai/英亩至0.083lb ai/英亩。
23.如权利要求18所述的方法，其中在整个生长季节中所述盖草能的有效量为0.018ai/英亩至0.07lb ai/英亩。
24.一种在区域中控制包含玉米事件MON87429的自生玉米的方法，其包括施用除草有效量的至少一种环己二酮(DIM)除草剂，其中所述除草剂施用阻止包含玉米事件MON87429的玉米的生长。
25.如权利要求24所述的方法，其中施用所述除草有效量的至少一种环己二酮(DIM)除草剂包括施用选自由以下组成的组的环己二酮(DIM)除草剂：烯草酮、稀禾定和肟草酮。
26.一种产生包含对至少一种除草剂的耐受性的植物的方法，所述除草剂选自由以下组成的组：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，所述方法包括：
a)用自身或第二植物对包含玉米事件MON87429的植物育种以产生种子；以及
b)鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子。
27.如权利要求26所述的方法，其中鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子包括：
a)种植所述后代种子以产生后代植物；
b)用有效量的选自由以下组成的组的至少一种除草剂处理所述后代植物：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦和草甘膦或其任意组合；以及
c)选择对选自由以下组成的组的至少一种除草剂具有耐受性的后代植物：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合。
28.如权利要求26所述的方法，其中鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子包括在来源于所述后代种子的样品中检测玉米事件MON87429的存在。
29.如权利要求26所述的方法，其中鉴定包含玉米事件MON87429的后代种子包括在来源于所述后代种子的样品中检测由玉米事件MON87429编码的至少一种蛋白质的存在。
30.一种产生杂交种子的方法，其包括：
a)使包含SEQ ID NO:10的植物生长；
b)在所述植物的雄性生殖组织发育之前或期间施用有效量的草甘膦，从而在所述植物中诱导雄性不育；
c)用第二植物的花粉使所述植物受精；以及
d)从所述植物收获杂交种子。
31.如权利要求30所述的方法，其中施用所述有效量的草甘膦包括在所述发育之前或期间以0.5lb ae/英亩至2.5lb ae/英亩的有效量施用草甘膦。
32.如权利要求30所述的方法，其中施用所述有效量的草甘膦包括在选自由以下组成的组的发育阶段施用草甘膦：玉米植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13和V14阶段。
33.一种确定植物对玉米事件MON87429的接合性的方法，其包括：
a)使包含来源于所述植物的DNA的样品与引物组接触，所述引物组能够产生诊断玉米事件MON87429的存在的第一扩增子和诊断不包含玉米事件MON87429的野生型玉米基因组DNA的第二扩增子，其中所述第一扩增子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1；
b)进行核酸扩增反应；以及
c)检测所述第一扩增子和所述第二扩增子，其中所述两种扩增子的存在表示所述样品对于玉米事件MON87429是杂合的，并且仅所述第一扩增子的存在表示所述样品对于玉米事件MON87429是纯合的。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述引物组包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
35.一种改善玉米植物的耐受性的方法，所述玉米植物的耐受性包含对选自由以下组成的组至少一种除草剂的耐受性：芳氧基苯氧丙酸酯(FOP)组中的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂、合成生长素、谷氨酰胺合成酶抑制剂和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂或其任意组合，所述方法包括：
a)获得一种包含四个表达盒的DNA构建体，其中
i)第一表达盒在可操作的连接中包含(I)来自沙蔗茅的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)膦丝菌素N-乙酰基转移酶编码序列，和(III)来自粟的果糖-二磷酸醛缩酶3'UTR；
ii)第二表达盒在可操作的连接中包含(I)来自薏苡的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的白化和淡绿色6叶绿体转运肽编码序列，(III)麦草畏单加氧酶编码序列，和(IV)来自水稻的金属硫蛋白样蛋白3'UTR；
iii)第三表达盒在可操作的连接中包含(I)来自芦竹的泛素启动子、前导序列和内含子，(II)来自拟南芥的苹果酸脱氢酶叶绿体转运肽编码序列，(III)FT-T蛋白编码序列，和(IV)来自水稻的无顶端分生组织蛋白3’UTR，其中所述FT-T蛋白编码序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸10230-11117；并且
iv)第四表达盒在可操作的连接中包含(I)CaMV 35S启动子和前导序列，(II)来自普通小麦的叶绿素a/b结合蛋白前导序列，(III)来自水稻的肌动蛋白1内含子，(IV)来自拟南芥的ShkG叶绿体转运肽编码序列，(V)来自土壤杆菌属菌株CP4的草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码序列，(VI)来自玉米的雄性组织特异性siRNA靶标，和(VII)来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR，其中来自玉米的雄性组织特异性siRNA靶标包含SEQID NO:10的核苷酸14170-14370，和来自水稻的富含甘氨酸的RNA结合蛋白3’UTR包含SEQID NO:10的核苷酸14379-14989；
b)将所述DNA构建体插入玉米细胞的基因组中；
c)使所述玉米细胞再生为玉米植物；以及
d)选择包含所述DNA构建体的玉米植物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述选择包括使用有效量的选自由以下组成的组的至少一种除草剂处理所述玉米植物：喹禾灵、盖草能、麦草畏、2,4-D、草铵膦和草甘膦。
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