JP7508450B2 - Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００及びその使用方法 - Google Patents

Description

ATCC PTA-125182

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１６日に出願の米国仮出願第６２／７４６，１５８号の優先権の利益を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の組み込み
１６，４８３バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）であり、２０１９年９月１２日に作成された「ＭＯＮＳ４５０ＷＯ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表が、電子的提出により本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の組換えＤＮＡ分子に関する。また本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物、植物部分、種子、細胞、及び農産物、ならびにそれらを使用する方法及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出する方法に関する。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物、植物部分、種子、及び細胞は、ジカンバに対する耐性を示す。

Ｂｒａｓｓｉｃａは世界の多くの地域で重要な作物であり、作物生産における雑草防除のための除草剤の使用は確立されたツールである。雑草は、空間、養分、水、及び光をめぐって作物と競合し、収穫物に混入し得、従って、雑草防除は農業に不可欠なものとなっている。導入遺伝子としても公知の異種遺伝子の発現に起因して特定の除草剤に対する耐性の形質を有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａを作製するために、バイオテクノロジーの方法が使用されてきた。トランスジェニック除草剤耐性は、薬害を伴わない作物栽培環境における除草剤の使用を可能にし、これにより、雑草防除を改善し、作物収量を支える。Ｂｒａｓｓｉｃａにおけるグリホセート耐性及びグルホシネート耐性のトランスジェニック形質は、Ｂｒａｓｓｉｃａの商業生産において雑草防除のために広く使用されてきた除草剤耐性形質の例である。除草剤耐性形質は、単独でまたは他の形質と組み合わせて使用され得、除草剤耐性形質の組み合わせは、栽培者の自由度を向上させ、選択肢を拡大し、手ごわい雑草を防除するための複数の除草剤作用様式の使用を可能にする雑草防除選択肢を提供することが望ましい場合がある。形質の組み合わせは、各個別の形質を互いに交配させることによって達成され得る。

トランスジェニック形質は、染色体の固定された位置での固有のＤＮＡ配列である、ゲノムにおける遺伝子導入事象の存在により付与される。事象は、トランスジェニック発現カセットの植物ゲノム内の単一の特定位置への１回限りのランダムな挿入により創出される。各事象は固有であり、各事象においてトランスジェニック植物、植物部分、種子、または細胞における導入遺伝子の発現は、トランスジェニック発現カセットに使用されるエレメント、それらのエレメントの相互作用、遺伝子挿入断片のゲノム位置、及び遺伝子挿入断片の染色体状況などの多数の異なる因子により影響を受け得、従って、導入遺伝子の有効性はそれらにより影響を受け得る。例えば、同様に作製された事象間で導入遺伝子の発現の全体的なレベル、または導入遺伝子の発現の空間的もしくは時間的パターンに幅広い変動が存在する場合があることが観察されている。このために、数百の個々の事象を作製及び試験して、最終的に商業的農業用途に有用な１つの事象を同定する必要がある。商業的作物生産に必要とされる特性を有する事象の創出及び選択は、何年にも及ぶ植物試験、分子的特徴付け、圃場試験、及びデータ解析を必要とする科学的プロセスである。最初に、トランスジェニック発現カセットが、特定の作物での特定の導入遺伝子発現のために設計、試験、及び最適化されなければならない。次いで、数千の固有の事象が作製され、商用利用のための固有のより優れた事象を選択するために、植物の複数世代にかけて種々の圃場条件及び遺伝的背景で解析されなければならない。かかる事象は、所望の導入遺伝子発現及び分子的特徴を有するものとして同定されると、植物育種方法を使用して他のＢｒａｓｓｉｃａ遺伝的背景に形質を遺伝子移入して、天然の形質、高収量の生殖質、耐病性、雑種種子生産のための形質、及び他のトランスジェニック除草剤耐性形質（複数可）などの他の所望の特性と組み合わされた新規な形質を有する多数の異なるＢｒａｓｓｉｃａ品種を作製するために使用され得る。

本発明は、配列番号１０、配列番号９、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２、及び配列番号１からなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、種子、または細胞に由来し、当該事象を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２５１８２として寄託されている。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、細胞、種子、または植物部分に存在し、当該事象を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ ＰＴＡ－１２５１８２として寄託されている。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の診断に役立つアンプリコンである。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料中の配列番号１０に特異的なＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号１０のうちの連続ヌクレオチドを有するＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、ＤＮＡプローブは、配列番号１３を含む。

本発明は、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子を提供し、ここで、当該第１及び第２のＤＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０の断片を含み、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つアンプリコンを生成するための増幅反応においてＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＤＮＡと共に使用される場合に、ＤＮＡプライマーとして機能する。一実施形態では、ＤＮＡプライマーは、配列番号１１及び配列番号１２を含む。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、当該試料をＤＮＡプローブと接触させること、当該試料及び当該ＤＮＡプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置くこと、ならびに当該試料におけるＤＮＡ分子への当該ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出すること、を含み、当該ＤＮＡプローブの当該ＤＮＡ分子への当該ハイブリダイゼーションが、当該ＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、当該方法を提供する。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、当該試料をＤＮＡプライマーとして機能する一対のＤＮＡ分子と接触させること、配列番号１０、配列番号９、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２、及び配列番号１からなる群から選択される配列を含むＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を実行すること、ならびに当該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出すること、を含み、当該ＤＮＡアンプリコンの存在が当該試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、当該方法を提供する。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、当該試料をＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させること、及び当該試料におけるタンパク質への当該抗体の結合を検出すること、を含み、当該抗体のタンパク質への当該結合が当該試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、当該方法を提供する。

本発明は、配列番号１０に特異的なＤＮＡプローブ、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つアンプリコンを生成する一対のＤＮＡプライマー、またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を含む、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するためのキットを提供する。

本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択される配列を含むＤＮＡ分子を含む植物、種子、細胞、植物部分、または商品生産物を提供する。一実施形態では、植物、種子、細胞、または植物部分は、ジカンバに対して耐性を示す。

本発明は、区域の雑草を防除するための方法であって、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａを植えること、及び当該Ｂｒａｓｓｉｃａを害することなく当該区域の当該雑草を防除するために有効量のジカンバを施用すること、を含む当該方法を提供する。一実施形態では、有効量のジカンバは、生育期にわたって約０．１ポンド酸当量／エーカー～約１６ポンド酸当量／エーカーである。一実施形態では、有効量のジカンバは、生育期にわたって約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２ポンド酸当量／エーカーである。

本発明は、区域におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除するための方法であって、ジカンバでない除草上有効量の少なくとも１種の除草剤を施用することを含み、当該除草剤施用がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａの生育を防止する、当該方法を提供する。一実施形態では、除草剤は、２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）、ブロモキシニル（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾニトリル）、及びＭＣＰＡアミン（４－クロロ－２－メチルフェノキシ酢酸）からなる群から選択される。

本発明は、ジカンバに対する耐性を示す植物を生産する方法であって、種子を生産するためにＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物をそれ自体とまたは第２の植物と交配すること、及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定すること、を含む当該方法を提供する。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することは、後代植物を生産するために後代種子を生育させること、当該後代植物を有効量のジカンバで処理すること、及びジカンバに対する耐性を示す後代植物を選択することによるものである。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することは、当該後代種子に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出することによるものである。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することは、当該後代種子に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質の存在を検出することによるものである。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００について植物の接合性を判定する方法であって、当該植物に由来するＤＮＡを含む試料を、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の診断に役立つ第１のアンプリコン及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含まない野生型ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡの診断に役立つ第２のアンプリコンを生成することができるプライマーセットと接触させること、核酸増幅反応を実行すること、当該第１のアンプリコン及び／または当該第２のアンプリコンを検出すること、を含み、両方のアンプリコンの存在が、当該試料がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヘテロ接合性であることを示し、当該第１のアンプリコンのみの存在が、当該試料がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性であることを示す、当該方法を提供する。一実施形態では、プライマーセットは、配列番号１１及び配列番号１２を含む。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物のジカンバに対する耐性を改善する方法であって、作動可能に連結された、（ａ）ピーナッツ白化条斑ウイルス（Ｐｅａｎｕｔ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ）由来のプロモーター、（ｂ）タバコエッチウイルス由来のリーダー、（ｃ）Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のリブロース１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの葉緑体輸送ペプチド、（ｄ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ由来のジカンバモノオキシゲナーゼコード配列、及び（ｅ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ由来の３’ＵＴＲを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物を得ること、ならびに当該ＤＮＡ構築物をＢｒａｓｓｉｃａ細胞のゲノムに挿入すること、当該Ｂｒａｓｓｉｃａ細胞をＢｒａｓｓｉｃａ植物に再生させること、及び当該ＤＮＡ構築物を含むＢｒａｓｓｉｃａ植物を選択すること、を含む、当該方法を提供する。一実施形態では、選択することは、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物を有効量のジカンバで処理することによるものである。本発明は、本方法により入手可能なジカンバに対する耐性を示すＢｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞を提供し、ここで、当該Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞は、ＤＮＡ構築物を含む。別の実施形態では、本方法により作製されるＢｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞は、配列番号１０を含む。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の配列を示す。水平線は、配列番号１０に対する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９の位置に相当し、ＳＱ５１３２１（配列番号１１）及びＳＱ１３８０５（配列番号１２）と表記された水平矢印は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出するために使用され得る一対のプライマーのおおよその位置を示し、ＰＢ４８３２（配列番号１３）と表記された水平線は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出するために使用され得るＤＮＡプローブのおおよその位置を示す。 配列番号９に対する表１に記載のように表記された遺伝的エレメントを有するＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の発現カセットを示す。

配列の簡単な説明
配列番号１は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との５’ジャンクションを示す３０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号１は、配列番号１０のヌクレオチドの９８６位～１０１５位に相当する。

配列番号２は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との３’ジャンクションを示す３０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号２は、配列番号１０のヌクレオチドの３８９９位～３９２８位に相当する。

配列番号３は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との５’ジャンクションを示す６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号３は、配列番号１０のヌクレオチドの９７１位～１０３０位に相当する。

配列番号４は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との３’ジャンクションを示す６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号４は、配列番号１０のヌクレオチドの３８８４位～３９４３位に相当する。

配列番号５は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との５’ジャンクションを示す１００ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号５は、配列番号１０のヌクレオチドの９５１位～１０５０位に相当する。

配列番号６は、ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡと導入遺伝子挿入断片との３’ジャンクションを示す１００ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号６は、配列番号１０のヌクレオチドの３８６４位～３９６３位に相当する。

配列番号７は、５’隣接ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡの１０００ヌクレオチド及び導入遺伝子挿入断片の５’末端の１０４ヌクレオチドを示す１１０４ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。

配列番号８は、導入遺伝子挿入断片の３’末端の２８１ヌクレオチド及び３’隣接ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡの１０００ヌクレオチドを示す１２８１ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。

配列番号９は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の導入遺伝子挿入断片に相当する２９１３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。

配列番号１０は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に相当する４９１３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、当該配列は、１位～１０００位の５’隣接ゲノムＤＮＡ配列、１００１位～３９１３位のトランスジェニックＤＮＡ挿入断片、及び３９１４位～４９１３位の３’隣接ゲノムＤＮＡ配列を含有する。

配列番号１１は、ＳＱ５１３２１と称されるプライマーに相当し、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のＤＮＡを同定するために使用される２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、これは、配列番号１０の３９５３位～３９３１位に相当する。

配列番号１２は、ＳＱ１３８０５と称されるプライマーに相当し、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のＤＮＡを同定するために使用される２６ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、これは、配列番号１０の３８３９位～３８６４位に相当する。

配列番号１３は、ＰＢ４８３２と称されるプローブに相当し、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のＤＮＡを同定するために使用される１６ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、これは、配列番号１０の３８６９位～３８８１位に相当する。

以下の定義及び方法は、本発明をより十分に定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。別途注記のない限り、用語は、関連する技術分野の当業者による慣例的用法に従って理解されるべきである。

植物形質転換技術は、外来ＤＮＡ（トランスジェニックＤＮＡとしても公知）を細胞のゲノムの染色体にランダムに挿入して、「トランスジェニック」細胞または「組換え」細胞とも称される遺伝子操作された細胞を作製するために使用される。この技術を使用して、多数の個々の細胞が形質転換され、外来ＤＮＡのゲノムへのランダムな挿入により、各々が固有のトランスジェニック事象を生じる。次いで、トランスジェニック植物は、各個別のトランスジェニック細胞から再生される。これは、固有の挿入されたトランスジェニック事象をゲノムの安定した部分として含有するトランスジェニック植物のあらゆる細胞を生じる。次いで、このトランスジェニック植物は、それぞれが固有のトランスジェニック事象を含有する後代植物を生産するために使用され得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、（ｉ）トランスジェニック発現カセット（多数の異なる発現カセットの設計及び試験後に選択されている）を含むＤＮＡ構築物による数千個のＢｒａｓｓｉｃａ細胞の形質転換、（ｉｉ）各々が固有のトランスジェニック事象を含有するトランスジェニック植物集団の再生、ならびに（ｉｉｉ）数千の事象についての数万の植物による種々の遺伝的背景での分子的特徴、除草剤耐性の有効性、及び農業特性の試験及び分析を伴う複数年にわたる厳密な事象の選択、により作製及び選択された。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、このようにして作製され、大規模な商業的農業目的に有用な固有の優れた事象として選択された。

トランスジェニックＤＮＡをＢｒａｓｓｉｃａ植物のゲノムに挿入する行為は、当該技術分野において公知の植物形質転換法により達成され、「トランスジェニック事象」または「事象」として公知の新規なトランスジェニックゲノムＤＮＡ配列を創出する。この事象のＤＮＡ配列は、挿入された外来ＤＮＡ（「トランスジェニック挿入断片」と称される）及び挿入位置の両側にある当該トランスジェニック挿入断片に直接隣接するか、または「隣接する」ゲノムＤＮＡ（「隣接ＤＮＡ」と呼ばれる）からなる。事象のＤＮＡ配列は、当該事象に固有かつ特異的であり、他の事象の配列または非形質転換ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡの配列などの他のＤＮＡ配列と比較される場合に容易に同定され得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、配列番号１０として提供される新規かつ固有のＤＮＡ配列を有し、これは配列番号９として提供されるトランスジェニック挿入断片配列、ならびにそれぞれ配列番号７及び配列番号８に提供される５’及び３’隣接ＤＮＡ配列を含有する。従って、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、当該事象を含むトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ細胞及び植物の染色体の構成要素であるＤＮＡ分子であり、従って、静的であり、後代細胞及び後代植物に伝えられ得る。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む最初の形質転換細胞及び植物の後代も提供する。かかる後代は、細胞組織培養により、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａ植物の自家受粉により、またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａ植物と当該事象を含有するか、または含有しない別の植物との間の有性異系交配により生産され得る。かかる他の植物は、同一のもしくは異なる事象（複数可）を含むトランスジェニック植物、または異なる品種由来のものなどの非トランスジェニック植物であり得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、各世代にわたって元の親から後代に伝えられる。

本明細書で使用する場合、用語「Ｂｒａｓｓｉｃａ」は、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物を意味し、Ｂｒａｓｓｉｃａと交配することができる全ての植物品種を含む。本発明の方法を実施するのに有用なＢｒａｓｓｉｃａとしては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの品種（アブラナと称され得るナタネ及び特定の栽培品種として一般に公知）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ、及びＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、ならびにＢｒａｓｓｉｃａ種間の交配を可能にするＢｒａｓｓｉｃａ属に属する任意の他の植物が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（以前はＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの交配及びそれらの両方のゲノムの保持により生じる異質四倍体であるため、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物は、育種方法によりＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００及び従ってジカンバ耐性形質を、Ｂｒａｓｓｉｃａ属の他のメンバーに導入するために使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「アブラナ」または「アブラナ植物」は、キャノーラ油（すなわち、２％未満のエルカ酸を含有するという特定の品質指定を満たす油）を生成するために使用することができるＢｒａｓｓｉｃａ植物を指す。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を提供し、これは、当該事象を含むＢｒａｓｓｉｃａ細胞、植物、及び種子にジカンバに対する耐性を提供する。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００は、ＤＭＯタンパク質を発現させるための発現カセットを含有する。本明細書で使用する場合、「発現カセット」または「カセット」は、形質転換細胞により発現される別個のエレメントの組み合わせを含む組換えＤＮＡ分子である。表１は、配列番号９に含有され、図２に図示されるエレメントのリストを提供する。

本明細書で使用する場合、用語「組換え」は、通常は自然界に見い出されず、ヒトの介入により作製された非天然のＤＮＡ、タンパク質、または生物を指す。本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」は、天然には一緒に存在しないであろう、かつヒトの介入の結果であるＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子、例えば、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせから構成されるＤＮＡ分子、例えば、導入遺伝子及び当該導入遺伝子に隣接する植物ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の例は、配列番号１～１０から選択される少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、「組換え植物」は、通常自然界には存在せず、ヒトの介入の結果であり、トランスジェニックＤＮＡ分子を含有する植物である。かかるゲノム改変の結果として、組換え植物は新規なものであり、関連する野生型植物とは明確に異なる。組換え植物の例は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａ植物である。

本明細書で使用する場合、用語「導入遺伝子」は、例えば、植物形質転換法によるヒトの介入の結果として、生物のゲノムに人為的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。導入遺伝子は生物にとって異種であり得る。本明細書で使用する場合、用語「トランスジェニック挿入断片」は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を作製するために植物形質転換技術によりＢｒａｓｓｉｃａゲノムに挿入された外来ＤＮＡを指す。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のトランスジェニック挿入断片の配列は、配列番号９として提供される。用語「トランスジェニック」は、導入遺伝子を含むことを指し、例えば「トランスジェニック植物」は導入遺伝子を含む植物を指す。

本明細書で使用する場合、用語「異種」は、第１の分子であって、通常、自然界で第２の分子または生物と関連しない、当該第１の分子を指す。例えば、ＤＮＡ分子は、第１の種に由来し得、第２の種のゲノムに挿入され得る。そうであるとすれば、ＤＮＡ分子はゲノム及び生物にとって異種であろう。

本明細書で使用する場合、用語「キメラ」は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子に融合させることによって作製される単一のＤＮＡ分子を指し、ここで、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、通常、他方に融合されたその構成では見出されない。従って、キメラＤＮＡ分子は、通常、自然界には見出されない新規なＤＮＡ分子である。キメラＤＮＡ分子の例は、配列番号１～１０から選択される少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ分子である。

本明細書で使用する場合、用語「ＤＭＯ」または「ジカンバモノオキシゲナーゼ」は、Ｏ－脱メチル化反応を介した非除草性化合物である３，５－ジクロロサリチル酸へのジカンバの不活性化を触媒するタンパク質を指す。ジカンバモノオキシゲナーゼは、一般に土壌の根圏に見出される微生物であるＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａから最初に単離された。ジカンバモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の例示的な配列、及びこれらの核酸分子によりコードされるタンパク質配列は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第７，８８４，２６２号に記載されている。

本明細書で使用する場合、用語「単離」は、分子を、通常、自然状態または天然状態でそれに関連する他の分子から分離することを指す。従って、用語「単離」は、ＤＮＡ分子であって、自然状態または天然状態でそれに関連する他のＤＮＡ分子（複数可）から分離されている当該ＤＮＡ分子を指し得る。かかるＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子などの組み換えられた状態で存在し得る。従って、天然状態から取り出され、通常、関連しない別のＤＮＡ分子に融合されたＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子であろう。かかる単離ＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡを作製すること、または外来ＤＮＡ分子を細胞、植物、または種子の染色体に組み込むことなどのバイオテクノロジー技術の使用によりもたらされ得る。

本発明は、ＤＮＡ分子及びそれらの対応するＤＮＡ配列を提供する。本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ」及び「ＤＮＡ分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を指す。ＤＮＡ分子は、ゲノム起源または合成起源のものであり得、慣例により、５’（上流）末端から３’（下流）末端までである。本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。使用される名称は、米国連邦規則集のタイトル３７、§１．８２２によって要求され、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）の表、付録２、表１及び３に記載されているものである。慣例により、本発明のＤＮＡ配列及びその断片は、２本の相補的ＤＮＡ配列鎖のうちの一方の鎖のみを参照して開示される。暗示的かつ意図的に、本明細書において提供される配列の相補配列（相補鎖の配列、当該技術分野において逆相補配列とも称される）は、本発明の範囲内であり、請求される主題の範囲内であることが明確に意図される。従って、本明細書で使用する場合、配列番号１～１０及びその断片への言及は、相補鎖及びその断片の配列を含み、それらを指す。

本明細書で使用する場合、用語「断片」は、全体のより小さな部分を指す。例えば、配列番号１０の断片は、配列番号１０の完全配列のうちの少なくとも約１０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１１個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１２個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１３個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１４個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１６個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１７個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１８個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１９個の連続ヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続ヌクレオチド、少なくとも約３０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約３５個の連続ヌクレオチド、少なくとも約４０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約４５個の連続ヌクレオチド、少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約６０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約７０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約８０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約９０個の連続ヌクレオチド、または少なくとも約１００個の連続ヌクレオチドである配列を含むであろう。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のトランスジェニック挿入断片のＤＮＡ配列は、配列番号９として提供される。トランスジェニック挿入断片及びトランスジェニック挿入断片のそれぞれの側に隣接するＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列は、配列番号１０として提供される。隣接するＤＮＡの一部及びトランスジェニック挿入断片の５’末端のＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７として提供される。隣接するＤＮＡの一部及びトランスジェニック挿入断片の３’末端のＤＮＡ配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８として提供される。

トランスジェニック挿入断片の一端の隣接するＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡへのホスホジエステル結合連結による連結部にまたがる領域のＤＮＡ配列は、本明細書において「接合部」と称される。接合部は、１つの連続した分子としてのトランスジェニック挿入断片及び隣接するＤＮＡの連結点である。一方の接合部はトランスジェニック挿入断片の５’末端に見出され、他方はトランスジェニック挿入断片の３’末端に見出され、本明細書においてそれぞれ５’接合部及び３’接合部と称される。「接合部配列」は、事象の５’または３’接合部にまたがる任意の長さのＤＮＡ配列を指す。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の接合部配列は、配列番号１０を使用すれば当業者に明らかである。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の接合部配列の例は、配列番号１～８として提供される。図１は、５’から３’に配置された配列番号１～１０の物理的配置を示す。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の接合部配列は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物、種子、または細胞のゲノムの一部として存在し得る。植物、植物部分、種子、または細胞に由来する試料における配列番号１～８または１０のうちのいずれか１つ以上の同定は、ＤＮＡがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＢｒａｓｓｉｃａから得られたこと、及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の診断に役立つことを示す。

本発明の植物、種子、細胞、植物部分、及び商品生産物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示すＤＮＡ分子またはタンパク質分子の検出に使用され得る。試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するためのプライマーまたはプローブのいずれかとして使用され得る例示的なＤＮＡ分子が提供される。かかるプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に特異的であり、従って、本明細書に記載される方法によるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の同定に有用である。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の検出は、核酸の熱増幅または核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンブロット及びサザン解析）などの当該技術分野において公知の方法を使用することによって行われ得る。

「プライマー」は、増幅反応を伴うアニーリング法またはハイブリダイゼーション法に使用するために設計されるＤＮＡ分子である。増幅反応は、鋳型ＤＮＡを増幅してアンプリコンを生成するインビトロ反応である。本明細書で使用する場合、「アンプリコン」は、増幅技術を使用して合成されているＤＮＡ分子である。本発明のアンプリコンは、配列番号１～１０のうちの１つ以上またはその断片を含むＤＮＡ配列を有する。一対のプライマーは、アンプリコンを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応においてＢｒａｓｓｉｃａのゲノムＤＮＡの試料などの鋳型ＤＮＡと共に使用され得、ここで、生成される当該アンプリコンは、プライマーが鋳型にハイブリダイズした２つの部位の間に位置する鋳型ＤＮＡの配列に相当するＤＮＡ配列を有する。プライマーは、通常、相補的な標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成するように設計される。プライマーの存在は、標的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用してプライマーの伸長を開始するためにポリメラーゼにより認識される位置である。プライマー対は、それらの間のヌクレオチドセグメントを増幅するための二本鎖ヌクレオチドセグメントの反対側の鎖に結合する２つのプライマーの使用を指す。プライマー配列の例は、配列番号１１（ＳＱ５１３２１）及び配列番号１２（ＳＱ１３８０５）として提供される。配列番号１１及び配列番号１２として提供されるプライマー対は第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子として有用であり、ここで、当該第１のＤＮＡ分子は配列番号１０のトランスジェニック挿入断片ＤＮＡ配列の断片であり、当該第２のＤＮＡ分子は配列番号１０の隣接ＤＮＡ配列の断片であり、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つアンプリコンを生成するためのＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＤＮＡを用いる増幅反応に一緒に使用される場合に、各々がＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さのものである。ある種の実施形態では、本発明のプライマー対は、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含むとして定義されてもよく、ここで、当該第１のＤＮＡ分子は配列番号１０のＢｒａｓｓｉｃａゲノム部分の断片であり、当該第２のＤＮＡ分子は配列番号１０の導入遺伝子部分の断片であり、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つアンプリコンを生成するためのＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＤＮＡを用いる増幅反応に一緒に使用される場合に、各々がＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さのものである。

「プローブ」は、標的核酸の鎖に相補的であり、ハイブリダイゼーション検出法に有用である核酸分子である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミド及び他のプローブ物質も含み、かかる結合の検出は、標的ＤＮＡ配列の存在または非存在の検出に有用であり得る。プローブは、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素などの従来の検出可能な標識またはレポーター分子に付着され得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出するためのプローブとして有用な例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１３（ＰＢ４８３２）として提供される。

プライマー及びプローブを設計及び使用する方法は、当該技術分野において周知である。配列番号１～１０の断片を含むＤＮＡ分子は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出するためのプライマー及びプローブとして有用であり、本明細書において提供される配列を使用して当業者により容易に設計され得る。

本発明によるプローブ及びプライマーは、標的配列と完全な配列同一性を有し得るが、標的配列に優先的にハイブリダイズする能力を保持する、標的配列と異なるプライマー及びプローブが従来の方法により設計され得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、核酸分子の配列が、用いられる特定の溶媒及び塩濃度下で安定した二本鎖構造を形成できるように十分に相補的であることのみを必要とする。試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００由来のトランスジェニックＤＮＡの存在を同定するために、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション法または増幅法が使用され得る。プローブ及びプライマーは、一般に、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約３０ヌクレオチド以上の長さである。かかるプローブ及びプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＭＲ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）に記載されている。本明細書で使用する場合、２つの核酸分子は、当該２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いに特異的にハイブリダイズすることができる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」である。本明細書で使用する場合、アラインメントされた第１の分子の全てのヌクレオチドが第２の分子の全てのヌクレオチドに相補的である場合、２つの分子は「完全な相補性」を示す。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、それらが互いにアニーリングした状態を維持するのを可能にするほど十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」である。同様に、当該分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、それらが互いにアニーリングした状態を維持するのを可能にするほど十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」である。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限り許容される。

ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後の５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６に見出され得る。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシー～５０℃での約０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択され得る。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度及び塩の両方が変更され得るか、または温度もしくは塩濃度のいずれかが一定に保たれ、一方で他の変数が変更される。

試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するための抗体を生成するために使用され得るタンパク質が提供される。かかる抗体は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質のうちの１種以上に特異的である。かかるタンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号１０に提供され、コード配列の開始位置及び停止位置は表１に示される。各タンパク質をコードするＤＮＡ配列及び配列によりコードされるタンパク質は、本明細書に記載される方法によりＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するための抗体を生成するのに有用である。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の検出は、当該技術分野において公知の任意のタンパク質検出技術、例えば、ウェスタンブロット法、免疫沈降、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、検出可能な標識もしくはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素）への抗体の付着、またはレポーター分子に対する酵素作用を使用して行われ得る。１つの方法は、試料をＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるＤＭＯタンパク質に結合する抗体と接触させること、及び次いで抗体結合の存在または非存在を検出することを提供する。かかる抗体の結合は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる１種以上のタンパク質の存在の診断に役立つ。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するためのタンパク質及び核酸検出キットが提供される。かかるキットの変形形態も、本明細書において開示される組成物及び方法、ならびにタンパク質及び核酸検出の技術分野において周知の方法を使用して開発され得る。タンパク質及び核酸検出キットは、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物と交配するための方法に適用され得る。かかるキットは、配列番号１～１０の断片を含むプライマーもしくはプローブ、またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を含有し、１種以上の反応試薬などの他の要素（例えば、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、緩衝液）を含有し得る。キットは、陽性対照、陰性対照、及び使用するためのプロトコールも含み得る。

検出キットの一例は、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在または非存在を検出するのに有用なＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号１０のうちの連続ヌクレオチドの少なくとも１種のＤＮＡ分子を含む。プローブとして使用するのに十分な例示的なＤＮＡ分子は、配列番号１３として提供される配列を含むものである。他のプローブは当業者によって容易に設計され得る。検出キットの別の例は、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在または非存在を検出するのに有用なアンプリコンを生成するのに有用な少なくとも１つのプライマー対を含む。かかる方法は、アンプリコンまたはその断片を配列決定することも含み得る。プライマー対としての使用に十分な例示的なＤＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２として提供される配列を含むものである。他のプライマー対は当業者により容易に設計され得る。本発明のキットは、任意により、本明細書に記載される検出反応または診断反応を実行するための試薬も含み得る。検出キットの別の例は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的な少なくとも１種の抗体を含む。例えば、かかるキットは、ラテラルフローストリップであって、当該ストリップの先端が水溶液と接触すると活性化される試薬を含む当該ラテラルフローストリップを利用し得る。抗体生成に使用するのに十分な例示的なタンパク質は、配列番号１０として提供される配列によりコードされるもの、または任意のその断片である。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＢｒａｓｓｉｃａ植物、後代、種子、細胞、及び植物部分、ならびにこれらを使用して生産される商品生産物を提供する。本発明の植物、後代、種子、細胞、植物部分、及び商品生産物は、配列番号１～８及び配列番号１０として提供される配列のうちの少なくとも１つを有する検出可能量のＤＮＡを含有する。

本発明の植物、後代、種子、細胞、及び植物部分は、１つ以上の追加の所望の形質（複数可）も含有し得る。かかる所望の形質は、トランスジェニック形質、天然形質、またはゲノム編集または他の従来の変異誘発法などの他の方法により作製される形質であり得る。所望の形質は、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＢｒａｓｓｉｃａ植物を追加の形質（複数可）を含有する別のＢｒａｓｓｉｃａ植物と交配することにより、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００と組み合わされ得る。かかる形質としては、虫害抵抗性の向上、脱さやまたは脱粒の改善、油品質の改善、水利用効率の向上、収量性の向上、耐乾燥性の向上、種子品質の向上、栄養品質の改善、雑種種子生産、及び／または除草剤耐性の向上が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、形質はかかるトランスジェニック形質を欠くＢｒａｓｓｉｃａ植物と比較して測定される。

本発明の植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する後代を生産するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「後代」には、配列番号１～８及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む植物によって示される、先祖植物から受け継がれたＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む任意の植物、種子、及び細胞が含まれる。植物、種子、及び細胞は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。後代植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＢｒａｓｓｉｃａ植物により生産された種子から、またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する花粉で受精させたＢｒａｓｓｉｃａ植物により生産された種子から生育され得る。

本明細書で使用する場合、本発明の「植物部分」は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物に由来する任意の部分である。植物部分としては、組織試料、花粉、胚珠、さや、種子、花、根、茎、繊維、及び葉の全体または一部が挙げられるが、これらに限定されない。植物部分は生育可能であっても、生育可能でなくてもよい。

本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物から生産される商品生産物を提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１～１０からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む検出可能量のＤＮＡを含有する。本明細書で使用する場合、「商品生産物」は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、種子、細胞、または植物部分に由来する材料から構成される任意の組成物または生産物を指す。商品生産物としては、加工された種子、穀物、植物部分、ミール、及び油が挙げられるが、これらに限定されない。商品生産物は、生きていない植物物質、すなわち、生きておらず、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、種子、細胞、または植物部分に由来する物質であり得る。本発明の商品生産物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に対応する検出可能量のＤＮＡを含有する。試料におけるこのＤＮＡのうちの１種以上の検出は、商品生産物の内容または供給源を決定するために使用され得る。本明細書において開示される検出方法が含まれる、ＤＮＡ分子の任意の標準的な検出方法が使用され得る。

本明細書で使用する場合、ジカンバは、３，６－ジクロロ－２－メトキシ安息香酸という化学名を有する除草活性成分、ならびにジカンバ－Ｎａ塩、ジカンバブトチル、ジカンバジグリコールアミン塩、ジカンバジメチルアミン塩、ジカンバジメチルアンモニウム塩、ジカンバジエタノールアンモニウム、Ｎ，Ｎ－ビス－（アミノプロピル）メチルアミン塩、ジカンバイソプロピルアンモニウム、ジカンバカリウム、ジカンバナトリウム、及びジカンバトロラミンが含まれるがこれらに限定されないジカンバの任意の塩またはエステルを意味する。ジカンバは、１種以上の追加の除草剤（複数可）を含む製剤で使用され得る。

本明細書で使用する場合、「除草剤に対する耐性を示す」または「除草剤耐性」または「耐性」は、１種以上の除草剤（複数可）の存在または施用による影響を完全にまたは部分的に受けない能力、例えば、施用された場合に除草剤の毒性作用に抵抗する能力を意味する。細胞、種子、または植物は、１種以上の除草剤（複数可）の存在下で少なくともある程度の正常な生育または表現型を維持することができる場合、「除草剤に対する耐性を示す」または「改善された耐性」を有する。形質は、その存在が、野生型または対照の細胞、植物、または種子と比較して、細胞、植物、または種子に除草剤に対する改善された耐性を付与することができる場合、除草剤耐性形質である。除草剤耐性形質を含む作物は、生育し続けることができ、除草剤の存在による最小限の影響を受ける。タンパク質は、当該タンパク質の発現が、野生型または対照の細胞、植物、または種子と比較して、細胞、植物、または種子に除草剤に対する改善された耐性を付与することができる場合、「除草剤耐性」を付与する。除草剤耐性タンパク質の例は、ジカンバモノオキシゲナーゼである。除草剤耐性は、特定の除草剤に対する完全または部分的な非感受性であり得、特定の除草剤に対するパーセント（％）耐性または非感受性として表され得る。

本明細書で使用する場合、「薬傷」または「傷害」は、除草剤の施用に起因する植物への傷害を指す。「傷害率」または「傷害パーセント」は、除草剤により引き起こされる傷害の目視評価を指す。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＢｒａｓｓｉｃａ植物の場合、植物は、ジカンバ施用後に傷害が減少する。ジカンバは、インドール－３－酢酸などの天然オーキシンと同様に植物の生育に影響を及ぼし得るが、植物により代謝調節されない合成オーキシンである。結果として、ジカンバで処理された植物組織は、生育が植物に対する負の効果を有する場合であっても生育し続ける。葉の上偏生長は、それらの成長撹乱の結果としての葉の顕著な下向きの屈曲または湾曲であり、薬傷の目視評価に有用であるジカンバの１つの効果である。

本明細書で使用する場合、「雑草」は、任意の望ましくない植物である。植物は、一般に、農業もしくは園芸目的にとって望ましくないとみなされてもよく（例えば、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ種）、または特定の状況では望ましくないとみなされてもよい（例えば、自生植物としても公知の、異なる種の圃場における１つの種の作物）。雑草は、一般に、当該技術分野において公知であり、地理、シーズン、生育環境、及び時間により異なる。雑草種のリストは、農業組合及び学会（例えば、Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ及びＣａｎａｄｉａｎ Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、政府機関（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、ならびに産業組合及び農民組合（例えば、Ｃａｎｏｌａ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）から入手可能である。

本発明は、ジカンバを施用することによってＢｒａｓｓｉｃａ栽培区域における雑草を防除する方法を提供し、ここで、除草剤を施用する前、施用時、または施用した後にＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子または植物が当該区域に植えられ、除草剤施用が雑草の生育を防止または阻害し、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物を害さない。植物生育区域は、除草剤施用時に雑草の種子または植物を含んでいてもいなくてもよい。本発明の方法において使用されるジカンバは、生育期の間に単独で、または１種以上の除草剤（複数可）と組み合わせて施用され得る。本発明の方法において使用される除草剤（複数可）は、１種以上の除草剤（複数可）と時間的に（例えば、タンク混合物として、または逐次施用で）、空間的に（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子の植え付けの前後を含む生育期の間の異なる時点で）、またはその両方で組み合わせて施用され得る。例えば、雑草を防除する方法であって、区域にＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子を植えること、及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物を害することなく当該区域の雑草を防除する目的で、除草上有効量のジカンバを、単独でまたは別の除草剤と組み合わせて生育期にわたって施用すること、からなる当該方法が提供される。かかる施用は、植え付け前（枯殺目的、すなわち、種子の植え付け前に出現または存在した雑草に対する施用が含まれる、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する種子を植える前の任意の時点）、出芽前（Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する種子が植えられた後、かつＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物が出芽する前の任意の時点）、または出芽後（Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物が出芽した後の任意の時点）であり得る。ジカンバの複数回の施用、またはジカンバ及び１種以上の他の除草剤（複数可）の組み合わせの同時もしくは個別での複数回の施用、例えば、２回の施用（例えば、植え付け前の施用及び出芽後の施用、または出芽前の施用及び出芽後の施用）、または３回以上の施用（例えば、植え付け前の施用及び２回の出芽後の施用）が、生育期にわたって使用され得る。

本発明の方法を実施する際の除草剤施用は、商業的に推奨される量またはその任意の割合もしくは倍数、例えば、商業的に推奨される量の２倍であり得る。除草剤の量は、除草剤及び製剤に応じて、１エーカー当たりの１ポンド当たりの酸当量（ポンド酸当量／エーカー）または１エーカー当たりの１ポンド当たりの活性成分（ポンド活性成分／エーカー）として表され得る。雑草を防除するために区域に使用するジカンバの除草上有効量は、生育期にわたって約０．１ポンド酸当量／エーカー～約１６ポンド酸当量／エーカー程度の範囲からなるべきである（例えば、ジカンバは、約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２．０ポンド酸当量／エーカーの量で施用され得る）。

本発明は、除草上有効量の別の除草剤、例えば、２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）、ブロモキシニル（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾニトリル）、及びＭＣＰＡアミン（４－クロロ－２－メチルフェノキシ酢酸）からなる群から選択される合成オーキシンを施用することによる、作物栽培のために区域におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除する方法を提供し、ここで、当該除草剤の施用は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａの生育を予防する。自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除するために区域に使用する除草上有効量の２，４－Ｄ除草剤は、生育期にわたって約０．１ポンド酸当量／エーカー～約１６ポンド酸当量／エーカー程度の量で施用され得る（例えば、２，４－Ｄは、生育期にわたって約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２．０ポンド酸当量／エーカーの量で施用され得る）。自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除するために区域に使用する除草上有効量のブロモキシニル除草剤は、生育期にわたって約０．１ポンド酸当量／エーカー～約１６ポンド酸当量／エーカー程度の量で施用され得る（例えば、ブロモキシニルは、生育期にわたって約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２．０ポンド酸当量／エーカーの量で施用され得る）。自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除するために区域に使用する除草上有効量のＭＣＰＡアミン除草剤は、生育期にわたって約０．１ポンド酸当量／エーカー～約１６ポンド酸当量／エーカー程度の量で施用され得る（例えば、ＭＣＰＡアミンは、生育期にわたって約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２．０ポンド酸当量／エーカーの量で施用され得る）。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物及び種子を生産する方法が提供される。植物は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、ＷＲ Ｆｅｈｒ，ｉｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ（１９８７）に見出され得る一般的に使用される育種法の記載を使用して交配され得る。植物は自家受粉（「自殖」としても公知）または他家受粉（「交配」としても公知）され得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性である植物の純粋系統を作製するために自家受粉され得る。自殖は「近交系」として公知の後代を生じ、遺伝的に均一である近交系を生産するために使用され得る。あるいは、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物は、変種または雑種の種子を生産するために他花受粉（トランスジェニックまたは非トランスジェニックである別の植物と交配）され得る。本発明の方法により作製される種子及び後代植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００が耐性を付与する１種以上の除草剤の施用は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する後代を選択するために使用され得る。あるいは、後代は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物または種子を選択するための診断方法を使用して解析され得る。後代は、変種または雑種の植物であってもよく、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物により生産された種子から、またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物由来の花粉で受精させた植物により生産された種子から生育されてもよく、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性またはヘテロ接合性であってもよい。

本発明の植物、後代、種子、細胞、及び植物部分は、１つ以上の追加のＢｒａｓｓｉｃａ形質（複数可）またはトランスジェニック事象（複数可）も含有し得る。かかる追加の形質（複数可）またはトランスジェニック事象（複数可）としては、虫害抵抗性の向上、水利用効率の向上、収量性の向上、耐乾燥性の向上、種子品質の向上、栄養品質の改善、雑種種子生産、雄性不稔性、及び除草剤耐性が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、形質はかかるトランスジェニック形質を欠くＢｒａｓｓｉｃａ植物と比較して測定される。Ｂｒａｓｓｉｃａのトランスジェニック事象は当業者に公知であり、例えば、かかる形質のリストは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）のＡｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＰＨＩＳ）により提供される。各々が１種以上のトランスジェニック事象（複数可）を含む２つの親植物を交配し、後代種子を収集し、２種以上のトランスジェニック事象を含有する後代種子または植物を選択することによって、２種以上のトランスジェニック事象が後代種子または植物において組み合わされてもよく、次いで、これらのステップが、後代においてトランスジェニック事象の所望の組み合わせが達成されるまで繰り返されてもよい。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も、栄養繁殖と同様に意図される。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子の代表的試料は、ブダペスト条約に従って、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０（ＵＳＡ）に住所を有するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙに寄託された。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子のＡＴＣＣ特許寄託名称（受託番号）はＰＴＡ－１２５１８２であり、寄託日は２０１８年８月２１日であった。寄託は、３０年間、または最後の請求から５年間、または特許の有効期間のうちのいずれか長い方の期間、寄託機関で維持される。

本明細書で使用する場合、用語「を含む」は、「を含むが、これに限定されない」を意味する。

以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために含まれる。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の創出及び最終的な選択のために必要とされる、６種の異なる発現構築物の構築及び試験、２，７７５の固有の形質転換事象の作製、ならびに厳密な分子的試験、農学的試験、及び圃場試験による５年間にわたる数百万の個々の植物の解析が要約される。

多数の改変が開示されている特定の例においてなされ得、それでも同様の結果が得られることが当業者によって理解されよう。化学的関連性及び生理学的関連性の両方を示す特定の薬剤が、同一または同様の結果を達成する限り、本明細書に記載される薬剤の代わりに使用され得る。当業者にとって明らかなかかる代用及び改変は、全て本発明の範囲内であるとみなされる。

実施例１：発現構築物の設計、事象の作製、ならびにＲ０及びＲ１植物の試験
この実施例は、ジカンバ耐性のための６種の異なる発現構築物の設計、これらの構築物を含有する植物ベクターを使用した数千の固有のＢｒａｓｓｉｃａ事象の作製、ならびに２世代（Ｒ０及びＲ１）にわたる得られたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物の試験及び解析を記載する。

６種の発現構築物を設計し、植物形質転換ベクターにクローニングした。各々が作動可能に連結された発現エレメント及びＤＭＯ導入遺伝子の固有の組み合わせを有し、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物において３種の異なるプロモーター、３種の異なるＣＴＰ、及び２種の異なるＤＭＯバリアントを試験することを可能にする４種の単一の発現カセット構築物（ＤＴ－１、ＤＴ－２、ＤＴ－３、及びＤＴ－４）を設計した。各々が作動可能に連結された発現エレメント及びＤＭＯ導入遺伝子の固有の組み合わせを有し、同一のＣＰ４－ＥＰＳＰＳ発現カセットと組み合わされた２種の異なるプロモーター、２種の異なるＣＴＰ、及び２種の異なるＤＭＯバリアント導入遺伝子を試験することを可能にする２種の二重発現カセット構築物（ＤＴ－５及びＤＴ－６）を設計した。構築物を表２に示す。次いで、６種の発現構築物を植物形質転換ベクターにクローニングした。

６種の植物形質転換ベクターを、当該技術分野において公知の方法を使用した稔性回復系統であるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ品種６５０３７（カナダ植物育成者権出願第０６－５５１７号）のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより媒介される形質転換に使用して、２，７７５の固有の形質転換事象を作製した。各形質転換事象は、導入遺伝子挿入断片のＢｒａｓｓｉｃａゲノムへの固有の位置でのランダムな挿入により作製された。次いで、Ｒ０植物をトランスジェニック細胞から再生させ、正常な表現型の特徴を有する発根した植物を生育及び更なる評価のために土壌に移した。

２，７７５本のＲ０植物を、インタクトな単一コピーのトランスジェニック挿入断片を有し、ベクター骨格配列が存在しないことについて解析した。この最初の分子的解析により、２０１の固有の事象が、先に進めるための最も高品質な事象として同定された。

ＤＴ－１、ＤＴ－２、及びＤＴ－３構築物を代表する植物を選択し、温室でのＲ０形質有効性（ジカンバ耐性）試験に使用した。ジカンバを、１．０ポンド酸当量／エーカーのＣｌａｒｉｔｙ（登録商標）除草剤（２倍量）または２．０ポンド酸当量／エーカーのＣｌａｒｉｔｙ除草剤（４倍量）のいずれかの散布量でＶ３生育段階に施用した。ジカンバにより誘発された植物の傷害を、植物の上偏成長（葉の屈曲またはねん曲）、生育減退、白化、及び壊死の評価に基づいて目視で評価した。２０％を超える傷害を示した植物は廃棄した。ＤＴ－１及びＤＴ－３構築物では、Ｒ０植物は、温室での２倍量の散布に対して耐性（２０％未満の傷害）を示したが、ＤＴ－２構築物では、全てのＲ０植物が、２倍量に対して２０％超のジカンバ傷害を示した。このデータの解析から、ＤＴ－２構築物を使用して作製されたどの事象も先に進めないことを決定した。

６種の形質転換ベクターを使用して作製された最初の２，７７５の固有の形質転換事象の分子的解析データ及びＲ０でのジカンバ耐性試験を組み合わせて、２０６の固有の事象を先に進めるために選択した。選択された事象のＲ０植物を、Ｒ１試験のためのホモ接合性種子を生産するために自家受粉させた。

ジカンバ耐性の温室試験を、１６９の固有の事象のＲ１植物を用いて実施した。ジカンバを、１１２０ｇ酸当量／ヘクタールのＣｌａｒｉｔｙ除草剤（２倍量）の散布量でＶ３生育段階で施用した。二重カセット事象（ＤＴ－５またはＤＴ－６を使用して作製されたもの）については、ジカンバを、グリホセートのタンク混合物として３６００ｇ酸当量／ヘクタールのＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）の散布量（２倍量）で施用した。ジカンバにより誘発された植物傷害を上記のように評価した。ジカンバによる症候の軽さに基づいて先に進める植物の優先順位をつけた。

Ｒ１植物は、ＤＴ－１構築物で７．４８％、ＤＴ－３構築物で７２．６６％、ＤＴ－５構築物で２０．７％、及びＤＴ－６構築物で３３．４％の平均傷害率を示した。しかしながら、２０％未満の傷害を有する個々の事象を、当該傷害が上偏成長でない限り先に進めた。これにより、ＤＴ－４構築物からの１つの事象に加えて、ＤＴ－１構築物から９つの事象、ＤＴ－５構築物から１７の事象、及びＤＴ－６構築物から９つの事象が選択された。

最初の分子的解析（コピー数、インタクトな挿入断片、及びベクター骨格の欠如について）ならびに温室でのＲ０及びＲ１の除草剤耐性評価のデータの解析に基づいて、３６の固有の事象をＦ１圃場試験に進めるために選択した。これに関するデータを表３に要約する。選択された事象のＲ１植物を従来の植物と他花受粉させ、種子を生産した。

実施例２：第１シーズンの圃場試験
この実施例は、Ｒ１解析から先に進んだ３６の固有の事象の各々を含有する植物の第１シーズン圃場試験を記載する。各固有の事象について、第１シーズン圃場試験で数千本の植物を、８～１３の異なる場所で２年にわたって形質有効性（ジカンバ耐性）、農業性能、及び収量について圃場試験した。これらのデータを解析して、全ての植物及び全ての場所にわたって圃場条件における各事象の性能を比較した。次いで、第１シーズン圃場試験のデータを使用して、第２シーズン圃場試験に進めるための優れた事象を選択した。

Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ１またはＲ２植物で他花受粉させ、雑種Ｆ１種子（事象についてヘミ接合）を生産することによって、圃場試験のための雑種Ｆ１植物を生産した。第１シーズン圃場試験が実施された２年間の各年で、異なるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ１植物で他花受粉させて、Ｆ１雑種種子を生産した。また対照として使用するために、この雌親系統を、Ｒ１系統と同じ遺伝的背景の非トランスジェニック植物で他花受粉させた。この戦略により、種々の雌親系統での事象の試験及び比較のための適切な対照の使用を確実にした。

第１シーズン試験において、３６の固有の事象が、最初の２，７７５の事象から圃場試験に選択された。これらの３６の事象は、４種の異なる発現構築物による最も良好な事象を示した：構築物ＤＴ－１について９つの事象、構築物ＤＴ－４について１つの事象、構築物ＤＴ－５について１７の事象、及び構築物ＤＴ－６について９つの事象。第１シーズン試験は、２年にわたって実施されたが、各事象についての第１シーズン農業性能圃場試験は、第１シーズン形質有効性圃場試験と同時に（同一シーズンの間に）行われた。全ての圃場試験で無作為完備型ブロック計画を使用し、北米の８～１３の異なる場所で実施した。

第１シーズン形質有効性試験では、Ｆ１雑種植物をジカンバに対する耐性について評価した。全ての事象について以下の２種のジカンバ施用を試験した。処理１（ＴＲＴ１）は、２．４ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のＢＡＮＶＥＬ（登録商標）ＩＩによる出芽前処理及び１．２ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のＢＡＮＶＥＬ（登録商標）ＩＩによる３葉生育段階（Ｖ３）での出芽後処理を含んだ。処理２（ＴＲＴ２）は、２．４ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のＢＡＮＶＥＬ（登録商標）ＩＩによる出芽前処理、１．２ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のＢＡＮＶＥＬ（登録商標）ＩＩによるＶ３での出芽後処理、及び１．２ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のＢＡＮＶＥＬ（登録商標）ＩＩによる初花段階での出芽後処理を含んだ。各施用（それぞれ、Ｖ３または初花）の７日後に、除草剤により誘発された植物傷害百分率を、植物上偏成長（葉の屈曲またはねん曲）、生育減退、白化、及び壊死の判定に基づいて目視で評価した。農業的評価を圃場試験シーズンにわたって収集した。シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として収量を決定した。

第１シーズン圃場試験の形質有効性データを集計した。各固有の事象について、第１シーズン形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたる集計データのメタ解析を、雑種傷害評価の比較のために実施した。表４は、２種のジカンバ処理計画についての全ての場所にわたる各事象の平均傷害評価を提供する（ＮＡは処理についてのデータが利用不可であることを示す）。各シーズンにわたる形質有効性圃場試験のメタ解析は、概して全ての事象の植物が、ジカンバによる軽い傷害を有したが、ＤＴ－１及びＤＴ－４構築物の事象が、より低い傷害評価を有し、成績が非常に良好であったことを示した。

第１シーズン形質有効性圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第１シーズン形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたって集計した収量データのメタ解析を、比較のために実施した。表５は、２種のジカンバ処理計画についての全ての場所にわたる各事象のポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として平均収量を提供する（ＮＡは処理についてのデータが利用不可であることを示す）。各シーズンにわたる形質有効性圃場試験の収量のメタ解析は、概して全ての事象の植物が、散布していない対照植物と同等の収量を有したことを示した。ＤＴ－６構築物による事象を含む植物の集計されたデータのメタ解析は、ＤＴ－５構築物による事象を含む植物より顕著に低い平均収量を有した。

第１シーズン農業性能試験において、Ｆ１雑種植物を、農業性能及び収量について評価した。試験区は、完全除草を維持し、試験除草剤（ジカンバまたはジカンバ及びグリホセート）を生育期の間に施用しなかった。以下の農業的評価を、全ての事象について収集した：早期強勢、出芽均一性、初花の日付、開花の終わりの日付、草高、成熟日付、実際の収穫粒重、パーセント穀粒水分、収穫日付、ならびに適用可能な場合、自立性（Ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）、脱さや、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属菌の発生、ならびに疾病及び害虫圧力。農業的評価を圃場試験シーズンにわたって収集した。シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として農業収量を決定した。

第１シーズン農業性能圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第１シーズン農業圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたる集計データのメタ解析を、比較のために実施した。表６は、各事象についての全ての場所にわたるポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）としての平均収量を提供する。各シーズンにわたる農業圃場試験の収量のメタ解析は、顕著に低い収量を有したＤＴ－４構築物による事象６８４０３ならびにＤＴ－５構築物による事象４３１６６及び４３２３７を除いて、概して全ての事象の植物が、散布していない対照植物と同等の収量を有したことを示した。ＤＴ－１構築物による４つの事象は、ＤＴ－１構築物による他の５つの事象より顕著に低い農業収量を有した。

（１）商業的量のジカンバに対する耐性の形質有効性、及び（２）農業性能を評価する雑種植物の圃場試験から集めたデータを、構築物ＤＴ－１、ＤＴ－４、ＤＴ－５、及びＤＴ－６の試験された３６の事象について解析した。各事象についてのこの解析を、実施例３に記載される綿密な分子的特徴付けの結果と組み合わせて、第２シーズン圃場試験に進める事象を選択した。

実施例３：分子的特徴付け
この実施例は、圃場試験と同時に行われた選択された事象の詳細な分子的特徴付けを記載する。各事象の分子的特徴付けは、事象が先に進めるために選択されるべきかどうかを決定するために使用した。

事象のＤＮＡ及びＲＮＡ解析を、当該技術分野において公知の種々の技術を使用して実施した。サザンブロット解析をゲノムＤＮＡに対して実行して、トランスジェニック植物が、ベクター骨格を全く含有せずに単一コピーの導入遺伝子挿入断片全体を含有することを確認した。ＤＮＡ増幅及び配列決定を使用して、各事象についてトランスジェニック挿入断片の挿入配列の構成及び配列が変化していないことを確認した。トランスジェニック挿入断片の各末端（５’及び３’末端）に隣接するＤＮＡを配列決定し、それぞれの接合部を決定した。ノーザン解析を行って、各事象のトランスジェニック植物におけるｄｍｏ遺伝子及びｃｐ４遺伝子（適用可能な場合）のｍＲＮＡ転写物を検出及び測定した。

各事象を含む植物のタンパク質解析を、当該技術分野において公知の技術を使用して実施した。各事象を含有するトランスジェニック植物から精製されたＤＭＯタンパク質のＮ末端タンパク質配列決定を行って、組換えタンパク質配列を確認した。ウェスタンブロット解析を、各事象を含有する植物からのタンパク質抽出物に対して実施して、ＤＭＯタンパク質が生成されていたことを確認した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＤＭＯタンパク質について植物の葉、種子、根、及び花粉におけるタンパク質レベルを決定した。

ゲノムにおける各事象の挿入部位を解析した。隣接配列を事象の染色体上の位置のバイオインフォマティクス解析に使用し、各事象の挿入部位を一般公開されているＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓゲノム（Ｂｏｕｌｏｓ Ｃｈａｌｈｏｕｂ，ｅｔ ａｌ．“Ｅａｒｌｙ ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔ－Ｎｅｏｌｉｔｈｉｃ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｏｉｌｓｅｅｄ ｇｅｎｏｍｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ３４５ Ｉｓｓｕｅ ６１９９（２２ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４））にマッピングした。ゲノムにおける野生型アリルにわたるＤＮＡ増幅を、各事象の隣接領域に特異的なプライマーを使用して実施した。野生型の挿入部位配列を使用して、事象について固有の導入遺伝子組み込み部位をＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの参照ゲノムにマッピングした。

各事象についての綿密な分子的特徴付けの解析を、各事象についての第１シーズン圃場試験の形質有効性及び農業性能データと組み合わせた。この組み合わせた情報を使用して、第１のシーズン圃場試験で試験された３６から１３の固有の事象を、先に進めるために選択した。解析後、構築物ＤＴ－６の９つの事象のいずれも先に進めるために選択されず、ＤＴ－５の１７の事象のうちの１０が先に進まず、構築物ＤＴ－１の５つの事象、構築物ＤＴ－４の１つの事象、及び構築物ＤＴ－５の７つの事象を含む１３の固有の事象が先に進めるために選択された。

実施例４：第２シーズン圃場試験
この実施例は、第１シーズン圃場試験から進んだ１３の固有の事象の各々を含有する植物の第２シーズン圃場試験を記載する。各固有の事象について、第２シーズン圃場試験で数千本の植物を、複数の場所で２年にわたって形質有効性（ジカンバ及びグリホセート耐性）、農業性能、及び収量について圃場試験した。これらのデータを解析して、全ての植物及び全ての場所にわたって圃場条件における各事象の性能を比較した。次いで、第２シーズン圃場試験のデータを使用して、第３シーズン圃場試験に進めるための優れた事象を選択した。

Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ２植物で他花受粉させ、雑種Ｆ１種子（事象についてヘミ接合）を生産することによって、第２シーズン圃場試験のための雑種Ｆ１植物を生産した。市販のグリホセート耐性事象（ＲＲとして示す）を含有する雌親系統を、ＤＴ－１及びＤＴ－４構築物を含むＲ２植物と交配させるために使用し、これにより、ジカンバ及びグリホセートの両方に対する耐性を示すＦ１植物を生産した。第２シーズン圃場試験が実施された２年間の各年で、１～３の異なるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ２植物で他花受粉させて、Ｆ１雑種種子を生産した。また対照として使用するために、この雌親系統を、Ｒ２系統と同じ遺伝的背景の非トランスジェニック植物で他花受粉させた。この戦略により、種々の雌親系統での事象の試験及び比較のための適切な対照の使用を確実にした。

第２シーズン試験では、試験に選択された１３の固有の事象は、構築物ＤＴ－１の５つの事象、構築物ＤＴ－４の１つの事象、及び構築物ＤＴ－５の７つの事象であった。第２シーズン試験は、２年にわたって実施されたが、各事象について第２シーズン農業性能圃場試験は、第２シーズン形質有効性圃場試験と同時に（同一シーズンの間に）行われた。全ての圃場試験で無作為完備型ブロック計画を使用し、北米の４～９の異なる場所で実施した。

第２シーズン形質有効性試験において、Ｆ１雑種植物を、ジカンバ及びグリホセートに対する耐性について評価した。植物を、Ｖ３段階での１．２ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のジカンバ（ＢＡＮＶＥＬ ＩＩ）及び１．８ｋｇ酸当量／ヘクタールのグリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ）、続いて、初花段階での１．２ｋｇ酸当量／ヘクタール（商業的量の２倍）のジカンバ（ＢＡＮＶＥＬ ＩＩ）及び１．８ｋｇ酸当量／ヘクタールのグリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ）による出芽後施用（タンク混合物として）で処理した。各施用（それぞれ、Ｖ３または初花）の７日後に、除草剤により誘発された植物傷害百分率を、植物上偏成長（葉の屈曲またはねん曲）、生育減退、白化、及び壊死の判定に基づいて目視で評価した。農業的評価を圃場試験シーズンにわたって収集した。シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として収量を決定した。

第２シーズン圃場試験の形質有効性データを集計した。各固有の事象について、形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたる集計データのメタ解析を、雑種傷害評価の比較のために実施した。表７は、処理計画についての全ての場所にわたる各事象の平均傷害評価を提供する。各シーズンにわたる形質有効性圃場試験のメタ解析は、概してＤＴ－１及びＤＴ－４構築物による植物が、より低い薬傷評価を有し、成績が非常に良好であったことを示した。

第２シーズン形質有効性圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第２シーズン形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたって集計した収量データのメタ解析を、比較のために実施した。表８は、全ての場所にわたる各事象についての処理計画で散布した植物及び散布していない植物（対照）のポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）としての平均収量を提供する。各シーズンにわたる形質有効性圃場試験の収量のメタ解析は、概してＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物が、ジカンバ及びグリホセートを散布された場合に他の１２の事象の植物と比較して最も高い収量を有したことを示した。

第２シーズン農業性能試験において、Ｆ１雑種植物を、実施例２に記載したように農業性能及び収量について評価した。シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として農業収量を決定した。第２シーズン農業性能圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第２シーズン農業圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたって集計した収量データのメタ解析を、比較のために実施した。表９は、各事象についての全ての場所にわたるポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）としての平均収量を提供する。各シーズンにわたる農業圃場試験の収量のメタ解析は、ＤＴ－５構築物の事象４０８１９の収量が顕著に低かったことを除いて、概して全ての事象の植物が対照植物と同等の収量を有したことを示した。

分子的解析ならびに（１）商業的量のジカンバ及びグリホセートに対する耐性の形質有効性、及び（２）農業性能を評価する雑種植物での圃場試験から集めたデータを、構築物ＤＴ－１、ＤＴ－４、及びＤＴ－５の試験された１３の事象について解析した。各事象についての第２シーズン圃場試験の形質有効性、農業性能、及び収量データの解析を、実施例３に記載される綿密な分子的特徴付けの結果と組み合わせて、第３シーズン圃場試験で試験する４つの固有の事象を選択した。４つの固有の事象は、構築物ＤＴ－１の２つの事象及び構築物ＤＴ－５の２つの事象であった。

実施例５：第３シーズン圃場試験
この実施例は、第２シーズン圃場試験から進んだ４つの固有の事象の各々を含有する植物の第３シーズン圃場試験を記載する。各固有の事象について、第３シーズン圃場試験で数千本の植物を、複数の場所で２年にわたって形質有効性（ジカンバ耐性）、農業性能、及び収量について圃場試験した。これらのデータを解析して、全ての植物及び全ての場所にわたって圃場条件における各事象の性能を比較した。次いで、第３シーズン圃場試験のデータを使用して、商業化のための優れた事象を選択した。

Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ２またはＲ３植物で他花受粉させ、雑種Ｆ１種子（事象についてヘミ接合）を生産することによって、第３シーズン圃場試験のための雑種Ｆ１植物を生産した。第３シーズン圃場試験が実施された２年間の各年で、２～３つの異なるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ雌親系統を選択された事象のＲ１植物で他花受粉させて、Ｆ１雑種種子を生産した。また対照として使用するために、この雌親系統を、Ｒ２またはＲ３系統と同じ遺伝的背景の非トランスジェニック植物で他花受粉させた。この戦略により、種々の雌親系統での事象の試験及び比較のための適切な対照の使用を確実にした。

第３シーズン試験は、２年にわたって実施されたが、各事象について第３シーズン農業性能圃場試験は、第３シーズン形質有効性圃場試験と同時に（同一シーズンの間に）行われた。全ての圃場試験で無作為完備型ブロック計画を使用し、北米の５～１０の異なる場所で実施した。

第３シーズン形質有効性試験において、Ｆ１雑種植物を、ＸｔｅｎｄｉＭａｘ（登録商標）除草剤を使用して、実施例２に記載するようにジカンバに対する耐性について評価し、シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として収量を決定した。第３シーズン圃場試験の形質有効性データを集計した。各固有の事象について、形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたる集計データのメタ解析を、雑種傷害評価の比較のために実施した。表１０は、処理計画についての全ての場所にわたる各事象の平均傷害評価を提供する。各シーズンにわたる形質有効性圃場試験のメタ解析は、概してＤＴ－１構築物による植物が、より低い薬傷評価を有し、成績が非常に良好であったことを示した。

第３シーズン形質有効性圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第３シーズン形質有効性圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたって集計した収量データのメタ解析を、比較のために実施した。表１１は、２種のジカンバ処理計画についての全ての場所にわたる各事象のポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として平均収量を提供する（ＮＡは処理についてのデータが利用不可であることを示す）。形質有効性圃場試験の収量のメタ解析は、概して全ての事象の植物が、散布していない対照植物と同等の収量を有したことを示した。

第３シーズン農業性能試験において、Ｆ１雑種植物を、実施例２に記載したように農業性能及び収量について評価し、シーズンの終わりにポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）として農業収量を決定した。第３シーズン農業性能圃場試験の収量データを集計した。各固有の事象について、第３シーズン農業圃場試験の全ての場所及び全ての個々の植物にわたって集計した収量データのメタ解析を、比較のために実施した。表１２は、各事象についての全ての場所にわたるポンド／エーカー（ｌｂ／ａｃ）としての平均収量を提供する。農業圃場試験の収量のメタ解析は、概して全ての事象の植物が、散布していない対照植物と同等の収量を有し、統計学的に有意な差がなかったことを示した。

分子的解析及び第３シーズン圃場試験から集めたデータを、４つの事象について解析した。各事象についての第３シーズン圃場試験の形質有効性、農業性能、及び収量データの解析を、実施例３に記載される綿密な分子的特徴付けの結果と組み合わせて、事象を評価した。加えて、別の除草剤耐性形質に分子的に連結されていないジカンバ耐性形質が好ましいことが考慮された。単一のジカンバ耐性発現カセットの構成は、自生防除、雑草防除、農業経営、及び輪作における農業従事者の自由度の向上及び選択肢の拡大を可能にする。ＤＴ－１構築物を代表する２つの事象を、３シーズンの圃場試験からの複合データのメタ解析に進めた。

実施例６：圃場試験複合データのメタ解析
この実施例は、最終的な２つの事象についての全ての圃場試験データのメタ解析を記載する。これは、長い年数、多数の場所、及び数十万本の植物にわたる圃場条件下での雑種植物の形質性能及び収量影響のより大規模な比較を可能にした。

構築物ＤＴ－１による２つの選択された事象について、形質有効性のメタ解析を、全ての場所にわたる第１及び第３シーズンのデータを集計することによって実施した。これは、雑種傷害評価のより大規模な比較を可能にした。表１３は、各処理についての各事象の平均傷害評価を提供する。形質有効性圃場試験のメタ解析は、ＤＴ－１構築物での両方の事象が、両方の処理で非常に低い薬傷評価を有したことを示した。

構築物ＤＴ－１による２つの選択された事象について、形質有効性圃場試験の全ての収量データのメタ解析を、全ての場所にわたる第１及び第３シーズンのデータを集計することによって実施した。表１４は、各処理についての各事象のエーカー当たりのポンド（ｌｂ／ａｃ）としての平均収量変化を提供する（同一の事象を含有する散布した植物と散布していない植物との間のポンド／エーカーでの収量差として計算した）。形質有効性圃場試験の収量のメタ解析は、事象ＭＯＮ９４１００が非常に良好な成績を示し、両方の処理において事象１７００６０より高い平均収量をもたらしたことを示した。このデータは、優良な商業用事象を選択するのに重要であり、圃場条件におけるジカンバ施用下でのＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する植物の顕著な性能を実証した。

構築物ＤＴ－１による２つの選択された事象及び対照植物についての農業圃場試験の全ての収量データのメタ解析を、全ての場所にわたる３シーズン全てのデータを集計することによって実施した。これは、ジカンバを施用しない場合の収量データのより大規模な比較を可能にした。表１５は、各処理について、各事象のポンド／エーカーでの平均収量を提供する。農業圃場試験の収量データのメタ解析は、散布しない条件においてＭＯＮ９４１００及び１７００６０が対照植物と同等の収量を提供し、対照植物と比較した場合に、これらの事象のいずれかを含有する植物の収量と統計的に有意差がないことを示した。

累積データの解析は、事象１７００６０と比較したＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の除草剤施用条件下でのジカンバ耐性及び作物収量における優位性を実証し、この事象を商業目的に有用な優れた事象として選択した。

実施例７：Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の検出
この実施例は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の検出を記載する。試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の検出は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質検出技術を使用して行うことができる。例示的な検出法及び材料を以下に提供する。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のＤＮＡ配列情報を、配列番号１～１０として本明細書において提供する。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のトランスジェニック挿入断片は、表１に記載されるエレメントを含有する。

検出は、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在または非存在を判定するために使用され得、ゲノムＤＮＡの試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のゲノムコピー数（すなわち、ヘミ接合性、ホモ接合性、またはヘテロ接合性）を示し得る。事象特異的なＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）エンドポイント熱増幅法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を同定するために開発した。エンドポイントアッセイに使用されるＤＮＡプライマー及びプローブは、プライマーＳＱ５１３２１（配列番号１１）、ＳＱ１３８０５（配列番号１２）、及び６－ＦＡＭ（商標）標識プローブＰＢ４８３２（配列番号１３）である。６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）は、ＤＮＡプローブに付着されるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の蛍光色素製品である。ＴＡＱＭＡＮ ＭＧＢ（商標）プローブでは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が、フルオロフォアとクエンチャーとの間のプローブを５’末端から切断する。標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズした場合、クエンチャー及びフルオロフォアが蛍光シグナルが生成されるほど十分に分離され、これにより、蛍光が放出される。これらの反応方法及びＰＢ４８３２と共に使用される場合、ＳＱ５１３２１及びＳＱ１３８０５は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つＤＮＡアンプリコンを生成する。この解析の対照には、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有する陽性対照、非トランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ由来の陰性対照、及び鋳型ＤＮＡを含有しない陰性対照が含まれるべきである。更に、ＰＣＲ反応の対照には、好ましくは、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムにおける単一コピー遺伝子に特異的な内部対照プライマー及び内部対照プローブが含まれるべきである。これらのアッセイは、最高速度で実行されるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に使用するために最適化されるが、他の機器が使用されてもよい。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を検出するためのＴＡＱＭＡＮ法と共に使用するのに有用な条件の例は、以下の通りである。ステップ１：５μｌの最終体積に調整される１８メガオームの水。ステップ２：１×最終濃度となる２．２８μｌの２× Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｄＮＴＰ、酵素、緩衝液）。ステップ３：０．９μＭの最終濃度となる０．０５μｌの事象プライマー１（ＳＱ５１３２１）及び事象プライマー２（ＳＱ１３８０５）（１８メガオームの水に各プライマーについて１００ｕＭの濃度まで再懸濁）。ステップ４：０．２μＭの最終濃度となる０．０１μｌの６－ＦＡＭ ＭＧＢ事象プローブＰＢ４８３２（１８メガオームの水に１００μＭの濃度まで再懸濁）。ステップ５：０．９μＭの最終濃度となる０．０５μｌの内部対照プライマー１及び内部対照プライマー２の混合物（１８メガオームの水に各プライマーについて１００μＭの濃度まで再懸濁）。ステップ６：０．２μＭの最終濃度となる０．０１μｌの内部対照ＶＩＣ（商標）プローブ（１８メガオームの水に１００μＭの濃度まで再懸濁）。ステップ７：以下のうちの各１つを有する各試料の２．５μｌの抽出ＤＮＡ（鋳型）：（ａ）解析される葉試料、（ｂ）陰性対照（非トランスジェニックＤＮＡ）、（ｃ）陰性水対照（鋳型なし）、及び（ｄ）Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００のＤＮＡを含有する陽性対照Ｂｒａｓｓｉｃａ。ステップ８：サーモサイクラーの条件は以下の通りである：９５℃で２０秒間を１サイクル、９５℃で３秒間、次いで、６０℃で２０秒間を４０サイクル、及び１０℃の最終サイクル。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物が事象または野生型アリルについてヘテロ接合性であるかホモ接合性であるかを判定するために、接合性アッセイが開発される。本明細書において提供される配列情報を使用して増幅反応アッセイが設計され得る。例えば、かかるＰＣＲアッセイには、少なくとも３つのプライマー：プライマー１、プライマー２、及びプライマー３の設計が含まれ、ここで、プライマー１はＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の３’隣接ＤＮＡのＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡに特異的であり、プライマー２はＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００トランスジェニック挿入断片に特異的であり、プライマー３は野生型アリルに特異的である。増幅反応においてプライマー対として使用される場合、プライマー１はプライマー２と共に、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に特異的なＰＣＲアンプリコンを生成するであろう。増幅反応においてプライマー対として使用される場合、プライマー１はプライマー３と共に、野生型アリルに特異的なＰＣＲアンプリコンを生成するであろう。ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡで実行されるＰＣＲ反応では、プライマー１＋プライマー２により生成された各ＰＣＲアンプリコン及びプライマー１＋プライマー３により生成された各ＰＣＲアンプリコンは、アンプリコンの配列及びサイズが異なるであろう。３つのプライマーがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性の植物から抽出されたＤＮＡでのＰＣＲ反応に含まれる場合、プライマー１＋プライマー２でのアンプリコン（Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００挿入断片に特異的）のみが生成されるであろう。３つのプライマーがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヘテロ接合性の植物から抽出されたＤＮＡでのＰＣＲ反応に含まれる場合、プライマー１＋プライマー２でのアンプリコン（Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００挿入断片に特異的）及びプライマー１＋プライマー３でのアンプリコン（野生型アリルに特異的またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００挿入断片がないことに特異的）の両方が生成されるであろう。３つのプライマーがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヌルである（すなわち野生型である）植物から抽出されたＤＮＡでのＰＣＲ反応において混合される場合、プライマー１＋プライマー３でのアンプリコン（野生型アリルに特異的）のみが生成されるであろう。ＰＣＲ反応を使用して生成されるアンプリコンは、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して同定または区別され得る。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の別の接合性アッセイは、ＴＡＱＭＡＮ熱増幅反応である。この種のアッセイでは、上記のようなプライマーに加えて、アッセイには２つの蛍光標識プローブが含まれる。プローブ１はＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に特異的であり、プローブ２はＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００（野生型）についてヌルである（野生型）Ｂｒａｓｓｉｃａ植物に特異的であり、ここで、２つのプローブは異なる蛍光標識、例えば、６－ＦＡＭ標識またはＶＩＣ（商標）標識を含有する。ＴＡＱＭＡＮ反応において使用される場合、プライマー１＋プライマー２＋プローブ１はＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に特異的な第１の蛍光シグナルを生成し、プライマー１＋プライマー３＋プローブ２は野生型Ｂｒａｓｓｉｃａに特異的な第２の蛍光シグナルを生成するであろう。３つのプライマー及び２つのプローブがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性の植物から抽出されたＤＮＡを用いるＴＡＱＭＡＮ反応に含まれる場合、第１の蛍光シグナル（プライマー１＋プライマー２＋プローブ１に特異的）のみが生成されるであろう。３つのプライマーがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヘテロ接合性の植物から抽出されたＤＮＡを用いるＴＡＱＭＡＮ反応に含まれる場合、第１の蛍光シグナル（プライマー１＋プライマー２＋プローブ１に特異的）及び第２の蛍光シグナル（プライマー１＋プライマー３＋プローブ２に特異的）の両方が生成されるであろう。３つのプライマーがＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヌルである（野生型）植物から抽出されたＤＮＡを用いるＴＡＱＭＡＮ反応において一緒に混合される場合、第２の蛍光シグナル（プライマー１＋プライマー３＋プローブ２に特異的）のみが生成されるであろう。

植物試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する別の方法はサザン解析である。当業者は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００に特異的なサザンハイブリダイゼーションプローブ（複数可）及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヌルである（野生型）Ｂｒａｓｓｉｃａ植物に特異的な第２のサザンハイブリダイゼーションプローブを設計する方法を理解するであろう。サザン解析では、第１のサザンハイブリダイゼーションプローブからのみ検出されるシグナルはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性の植物を示し、第１のサザンハイブリダイゼーションプローブ及び第２のサザンハイブリダイゼーションプローブの両方から検出されるシグナルはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヘテロ接合性の植物を示し、第２のサザンハイブリダイゼーションプローブからのみ検出されるシグナルはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヌルである（野生型）植物からＤＮＡが抽出されたことを示すであろう。

検出キットの別の例は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的な少なくとも１種の抗体を含む。例えば、かかるキットは、ラテラルフローストリップであって、当該ストリップの先端が水溶液と接触すると活性化される試薬を含む当該ラテラルフローストリップを利用し得る。抗体生成に使用するのに十分な例示的なタンパク質は、配列番号１０として提供される配列によりコードされるもの、または任意のその断片である。

試料がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、種子、細胞、または植物部分に由来するかどうかを決定するために、タンパク質検出法が開発される。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的な少なくとも１種の抗体が、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質を検出するために使用される。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる１種以上のタンパク質に特異的な１種以上の抗体を含む検出キットは、ラテラルフローストリップであって、当該ストリップの先端が水溶液と接触すると活性化される試薬を含有する当該ラテラルフローストリップを利用し得る。Ｂｒａｓｓｉｃａ組織の試料が粉砕され、水または水性緩衝液（例えば、界面活性剤及びウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水）を使用して解析のためにタンパク質が抽出され得る。遠心分離後に、吸収パッドを有するラテラルフローストリップ上でサンドイッチフォーマットのＥＬＩＳＡ法を使用して水性上澄みが解析される。試験される試料を含有する水溶液にストリップの先端を浸すことによって検出が開始される。水溶液は毛管作用によりストリップの上方に運ばれ、ストリップ上の金標識抗体を可溶化する。金標識抗体は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的であり、試料中の当該タンパク質のエピトープに結合して、抗体抗原複合体を形成する。次いで、金標識抗体抗原複合体は、ニトロセルロース膜までストリップの上方に運ばれる。膜は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質上の第２の別個のエピトープに結合する固定化抗体の試験ラインを含み、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされるタンパク質が試料中に存在する場合、試験ストリップを横切る可視のラインを出現させる。

実施例８：自生防除
この実施例は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物を防除するための方法を記載する。自生防除の目的のために、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物が高い感受性を示す任意の除草剤が有用である。

自生防除の目的のための例示的な除草剤としては、ジカンバ以外の合成オーキシン除草剤が挙げられるであろう。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物のジカンバ以外の合成オーキシン除草剤に対する感受性は、農業従事者に望ましくないジカンバ耐性Ｂｒａｓｓｉｃａ（これはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むものである）を環境から除去する能力を提供する。かかる環境は、他の所望の作物またはＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有しないＢｒａｓｓｉｃａを含んでいてもいなくてもよい。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物及び対照として同一の生殖質の非トランスジェニック植物を、無作為完備型ブロック計画を使用して温室で生育させた。Ｖ３段階の植物に、４種の合成オーキシン除草剤：ジカンバ（ＸｔｅｎｄｉＭａｘ（登録商標））、２，４－Ｄアミン４（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸のジメチルアミン塩）、ブロモキシニル（Ｂｕｃｔｒｉｌ（登録商標）である３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾニトリル）、及びＭＣＰＡアミン（４－クロロ－２－メチルフェノキシ酢酸）のうちの１種を無作為化パターンで散布した。植物傷害率を処理の９日後に測った。

商業的量（１倍）のジカンバを散布した後、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物は傷害を有さず、対照植物は２１．３％の傷害を有した。しかしながら、他の３種の合成オーキシン除草剤（２，４－Ｄアミン、ブロモキシニル、及びＭＣＰＡ）を１倍または２倍量で散布した場合、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物及び対照植物の両方が７０％～９０％の傷害率を示した。これにより、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物及び対照植物が３種のオーキシン除草剤に同様に反応することが確認された。データを表１６に示す。

Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子の代表的試料は、ブダペスト条約に従って、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０（ＵＳＡ）に住所を有するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙに寄託された。Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む種子のＡＴＣＣ特許寄託名称（受託番号）は受託番号ＰＴＡ－１２５１８２であり、寄託日は２０１８年８月２１日であった。寄託は、３０年間、または最後の請求から５年間、または特許の有効期間のうちのいずれか長い方の期間、寄託機関で維持される。

Claims (22)

1. 配列番号１０、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２、及び配列番号１からなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子。
2. 前記組換えＤＮＡ分子が、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、種子、または細胞に由来し、前記事象を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２５１８２として寄託されている、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
3. 前記組換えＤＮＡ分子が、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物、細胞、種子、または植物部分に存在し、前記事象を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２５１８２として寄託されている、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. 前記組換えＤＮＡ分子が、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の診断に役立つアンプリコンである、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料中の配列番号１０に特異的なＤＮＡプローブであって、配列番号１または配列番号２を含む前記ＤＮＡプローブ。
6. Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料中の配列番号１０に特異的なＤＮＡプローブであって、配列番号１３を含む前記ＤＮＡプローブ。
7. Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、
   ａ）前記試料を請求項５に記載のＤＮＡプローブと接触させることと、
   ｂ）前記試料及び前記ＤＮＡプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置くことと、
   ｃ）前記試料におけるＤＮＡ分子への前記ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出することと、を含み、
   前記ＤＮＡプローブの前記ＤＮＡ分子への前記ハイブリダイゼーションが、前記ＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、前記方法。
8. Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来するＤＮＡ試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、
   ａ）前記試料を第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子と接触させることと、但し、前記第１及び第２のＤＮＡ分子が、それぞれ配列番号１０の断片を含み、ＤＮＡプライマーとして機能し、増幅反応においてＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含有するＤＮＡと共に使用される場合に、第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子が、試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の診断に役立つアンプリコンを生成し、該アンプリコンが配列番号１０、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２および配列番号１から成る群から選択される配列を含む、
   ｂ）配列番号１０、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２、及び配列番号１からなる群から選択される配列を含むＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を実行することと、
   ｃ）前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出することと、を含み、
   前記ＤＮＡアンプリコンの存在が前記試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、前記方法。
9. Ｂｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出する方法であって、これらＢｒａｓｓｉｃａ植物、Ｂｒａｓｓｉｃａ種子、またはＢｒａｓｓｉｃａ細胞は、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物またはその後代植物由来であり、該方法が
   ａ）前記試料をＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させることと、
   ｂ）前記試料における前記タンパク質への前記抗体の結合を検出することと、を含み、
   前記抗体の前記タンパク質への前記結合が前記試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を示す、前記方法。
10. 請求項５に記載のＤＮＡプローブを含む、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出するためのキット。
11. 配列番号１０の配列を含むＤＮＡ分子を含むＢｒａｓｓｉｃａ植物、種子、細胞、植物部分、または商品生産物。
12. 前記植物、種子、細胞、または植物部分がジカンバに対する耐性を示す、請求項１１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ植物、種子、細胞、または植物部分。
13. 区域の雑草を防除するための方法であって、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａを植えること、及び前記Ｂｒａｓｓｉｃａを害することなく前記区域の前記雑草を防除するために有効量のジカンバを施用すること、を含む前記方法。
14. 前記有効量のジカンバが、生育期にわたって約０．５ポンド酸当量／エーカー～約２ポンド酸当量／エーカーである、請求項１３に記載の方法。
15. 区域におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む自生Ｂｒａｓｓｉｃａを防除するための方法であって、ジカンバ以外の除草上有効量の少なくとも１種の除草剤を施用することを含み、前記除草剤施用がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含むＢｒａｓｓｉｃａの生育を防止する、前記方法。
16. ジカンバ以外の前記除草剤が、２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）、ブロモキシニル（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシベンゾニトリル）、及びＭＣＰＡアミン（４－クロロ－２－メチルフェノキシ酢酸）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. ジカンバに対する耐性を示すＢｒａｓｓｉｃａ植物を生産する方法であって、
    ａ）種子を生産するためにＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む植物をそれ自体とまたは第２の植物と交配することと、
    ｂ）Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することと、を含む前記方法。
18. Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することが、
    ｉ．後代植物を生産するために前記後代種子を生育させることと、
    ｉｉ．前記後代植物を有効量のジカンバで処理することと、
    ｉｉｉ．ジカンバに対する耐性を示す後代植物を選択することと、によるものである、請求項１７に記載の方法。
19. Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することが、前記後代種子に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在を検出することによるものである、請求項１７に記載の方法。
20. Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含む後代種子を同定することが、前記後代種子に由来する試料におけるＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００によりコードされる少なくとも１種のタンパク質の存在を検出することによるものである、請求項１７に記載の方法。
21. Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００について植物の接合性を判定する方法であって、
    ａ）前記植物に由来するＤＮＡを含む試料を、Ｂｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００の存在の診断に役立つ第１のアンプリコン及びＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００を含まない野生型ＢｒａｓｓｉｃａゲノムＤＮＡの診断に役立つ第２のアンプリコンを生成することができるプライマーセットと接触させることと、
    ｂ）核酸増幅反応を実行することと、
    ｃ）前記第１のアンプリコン及び前記第２のアンプリコンを検出することと、を含み、両方のアンプリコンの存在が、前記試料がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてヘテロ接合性であることを示し、前記第１のアンプリコンのみの存在が、前記試料がＢｒａｓｓｉｃａ事象ＭＯＮ９４１００についてホモ接合性であることを示し、前記第１のアンプリコンが、配列番号１０、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２および配列番号１から成る群より選択される配列を含む、前記方法。
22. 前記プライマーセットが配列番号１１及び配列番号１２を含む、請求項２１に記載の方法。

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