JP2021508486A - トウモロコシ事象mon87429及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は2018年2月2日出願の米国仮出願第62/625,537号の優先権の利益を主張し、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
44.2KBであり(MS Windowsにおいて測定された)、2019年1月17日に作成されたファイル名「MONS430WO−seq.txt」中に含有されている配列表は、電子申請によって本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、トウモロコシ事象MON87429の組換えDNA分子に関する。本発明はまた、トウモロコシ事象MON87429を含有するトランスジェニックトウモロコシの植物体、一部、種子、細胞、及び農産物、ならびにトウモロコシ事象MON87429を含有するトランスジェニックトウモロコシの植物体、一部、種子、細胞、及び農産物を使用し、トウモロコシ事象MON87429を検出する方法にも関する。トウモロコシ事象MON87429を含有するトランスジェニックトウモロコシの植物体、一部、種子、及び細胞は、例えば、キザロホップやハロキシホップのようなアリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤;ジカンバ及び2,4−Dのような合成オーキシン;グルホシネートのようなグルタミン合成酵素の阻害剤;ならびにグリホサートのような5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤に対する耐性を示す。
配列番号1は、トウモロコシのゲノムDNAと導入遺伝子挿入断片の5’接合部を表す30ヌクレオチドのDNA配列である。配列番号1は、配列番号10のヌクレオチドの1015位〜1044位に対応する。
表1:トウモロコシ事象MON87429の説明
実施例1:発現カセット試験、構築物の設計、及びR0植物の試験
表2:第1のシーズンの野外試験の近交系の有効性
35の構築物のそれぞれについてのR0分析から進められた事象と共に野外試験は長年にわたって実施され、野外試験の第1のシーズンにおける各構築物について植物体ごとに成績をセットとして分析した。したがって、各構築物は多くの独特の事象によって表された。これは、多数の構築物が第1のシーズンの野外試験で調べられるようにした一方で、第1のシーズンの試験を超えて進んだのは一番成績の良い構築物のみだった。(1)グルホシネート+ジカンバ、キザロホップ、及び2,4−D耐性についての近交系の有効性、(2)ラウンドアップ交雑システム(RHS)の有効性、及び(3)除草剤キザロホップ、2,4−D、グルホシネート、及びジカンバのさらに高い施用率に対する耐性に対する除草剤圧力試験についてR2植物(各事象についてホモ接合性)で別個の第1のシーズンの野外試験を行った。
表3:第1のシーズンの野外試験の近交系の有効性
表4:第1のシーズンの野外試験のRHS有効性
表5:第1のシーズンの野外試験の除草剤圧力試験
分子分析は進められた事象で野外試験と同時に行われた。DNAの増幅と配列決定を用いて、挿入配列、挿入コピー数、及び挿入における主鎖の非存在を確認した。各事象についてのトウモロコシゲノムにおける挿入部位をマッピングした。ノーザン解析を行って、pat、dmo、ft_t、cp4−epspsの遺伝子のmRNA転写物を検出し、測定した。トランスジェニック植物から精製したPAT、DMO、FT_T、及びCP4−EPSPSのタンパク質のN末端タンパク質の配列決定を行って、組換えタンパク質配列を確認した。PAT、DMO、FT_T、及びCP4−EPSPSのタンパク質を検出するためのウエスタンブロット解析は、トランスジェニック植物試料で行われた。R1植物由来のゲノムDNAで詳細なサザン解析を実施し、コピー数及び主鎖の非存在を確認した。
構築物HT4−14、HT4−32、及びHT4−34についての第1のシーズンの野外試験から進んだ事象で、進んだ野外試験(第2のシーズンの試験以降)が長年にわたって行われた。各野外試験における各事象について多くの個々の植物の成績をセットとして分析した。したがって、各事象は多くの独特の植物によって表された。これにより、さまざまな場所や区域で、種々の特性について、多数の条件下にて各事象の成績を分析できるようになった。
表6:進んだ野外試験の概要
表7:野外試験の反復
表8:雑種有効性の野外試験に由来する薬害採点のメタ解析
表9:雑種有効性の野外試験に由来する収量のメタ解析
表10:雑種/近交系の圧力試験有効性の野外試験からの収量
表11:雑種の農業的野外試験に由来する収量のメタ解析
表12:グリコサート処理した近交系有効性の野外試験に由来する収量のメタ解析
表13:近交系の農業的野外試験に由来する収量のメタ解析
トウモロコシ事象MON87429は商業事象として選択される際、広範な分子特性評価に供された。トウモロコシ事象MON87429のトランスジェニック挿入断片は表1に記載されている要素及び配列を含有する。
試料におけるトウモロコシ事象MON87429の検出は、DNA、RNA、またはタンパク質の検出技法を使用して行うことができる。例示的な検出方法及び材料を以下に提供する。検出は、試料にてトウモロコシ事象MON87429の存在または非存在を判定してもよい。検出は、ゲノムDNAの試料におけるトウモロコシ事象MON87429(すなわち、半接合、ホモ接合、またはヘテロ接合)のゲノムコピーの数を示してもよい。
Claims (41)
- 配列番号10、配列番号9、配列番号8、配列番号7、配列番号6、配列番号5、配列番号4、配列番号3、配列番号2、及び配列番号1から成る群から選択される配列を含む組換えDNA分子。
- 前記組換えDNA分子が、トウモロコシ事象MON87429を含む植物体、種子、または細胞に由来し、前記事象を含む種子の代表的な試料がATCC受託番号PTA−124635として寄託されている、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記組換えDNA分子がトウモロコシ事象MON87429を含む植物体、細胞、種子、または植物体の一部にあり、前記事象を含む種子の代表的な試料がATCC PTA−124635として寄託されている、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記組換えDNA分子が、トウモロコシ事象MON87429の存在についての診断に役立つアンプリコンである、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 4つの発現カセットを含むDNA構築物であって
(a)第1の発現カセットは、操作可能な連結にて(I)Erianthus ravennaeに由来するユビキチンのプロモーター、リーダー、イントロンと、(II)ホスフィノトリシンN―アセチルトランスフェラーゼのコーディング配列と、(III)Setaria italicaに由来するフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼの3’UTRとを含み;
(b)第2の発現カセットは、操作可能な連結にて(I)Coix lacryma−jobi由来のユビキチンのプロモーター、リーダー、及びイントロンと、(II)Arabidopsis thaliana由来のアルビノ及び淡緑色6葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(III)ジカンバモノオキシゲナーゼのコーディング配列と、(IV)Oryza sativa由来のメタロチオネイン様タンパク質の3’UTRとを含み;
(c)第3の発現カセットは、操作可能な連結にて(I)Arundo donax由来のユビキチンのプロモーター、リーダー、及びイントロンと、(II)Arabidopsis thaliana由来のリンゴ酸脱水素酵素葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(III)FT_Tタンパク質のコーディング配列と、(IV)Oryza sativa由来の無頂端分裂組織タンパク質の3’UTRとを含み;
(d)第4の発現カセットは、操作可能な連結にて(I)CaMV 35Sのプロモーターとリーダーと、(II)Triticum aestivum由来のクロロフィルa/b結合タンパクの質のリーダーと、(III)Oryza sativa由来のアクチン1のイントロンと、(IV)Arabidopsis thaliana由来のShkG葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(V)Agrobacterium sp株CP4由来のグリホサート耐性5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼのコーディング配列と、(VI)Zea mays由来の雄性組織特異的siRNAの標的と、(VII)Oryza sativa由来のグリシンリッチRNA結合タンパク質の3’UTRとを含む、
前記DNA構築物。 - トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞に由来するDNAの試料において配列番号10に特異的なDNAプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号10の隣接ヌクレオチドを有するDNA分子。
- 前記DNAプローブが配列番号13を含む、請求項6に記載のDNA分子。
- 第1のDNA分子と第2のDNA分子とを含む一対のDNA分子であって、前記第1及び第2のDNA分子はそれぞれ、配列番号10の断片を含み、トウモロコシ事象MON87429を含有するDNAとの増幅反応において一緒に使用されるとき、DNAプライマーとして機能して、試料にてトウモロコシ事象MON87429を診断するのに役立つアンプリコンを生成する、前記一対のDNA分子。
- 少なくとも1つのDNAプライマーが配列番号7及び配列番号8から成る群から選択される配列の断片を含む、請求項8に記載の一対のDNA分子。
- 前記第1のDNA分子が配列番号11を含み、前記第2のDNA分子が配列番号12を含む、請求項8に記載の一対のDNA分子。
- トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞に由来するDNAの試料にてトウモロコシ事象MON87429の存在を検出する方法であって、前記方法が、
(a)試料を請求項6に記載のDNAプローブと接触させることと;
(b)前記試料及び前記DNAプローブをストリンジェントなハイブリッド形成条件に供することと;
(c)前記試料における前記DNA分子との前記DNAプローブのハイブリッド形成を検出することとを含み、
その際、前記DNAプローブの前記DNA分子との前記ハイブリッド形成がDNAの前記試料におけるトウモロコシ事象MON87429の存在を示す、前記方法。 - トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞に由来するDNAの試料にてトウモロコシ事象MON87429の存在を検出する方法であって、前記方法が、
(a)前記試料を請求項8に記載の一対のDNA分子と接触させることと;
(b)配列番号10、配列番号9、配列番号8、配列番号7、配列番号6、配列番号5、配列番号4、配列番号3、配列番号2、及び配列番号1から成る群から選択される配列を含むDNAアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を実施することと;
(c)前記DNAアンプリコンの存在を検出することと、を含み、
その際、前記DNAアンプリコンの存在が試料におけるトウモロコシ事象MON87429の存在を示す、前記方法。 - トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞に由来する試料にてトウモロコシ事象MON87429の存在を検出する方法であって、前記方法が、
(a)トウモロコシ事象MON87429によってコードされる少なくとも1つのタンパク質に特異的な少なくとも1つの抗体に前記試料を接触させることと;
(b)前記試料における前記タンパク質への前記抗体の結合を検出することと、を含み、
その際、前記抗体の前記タンパク質への結合が試料におけるトウモロコシ事象MON87429の存在を示す、前記方法。 - トウモロコシ事象MON87429によってコードされる第2のタンパク質に特異的な少なくとも第2の抗体をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- トウモロコシ事象MON87429の存在を検出するためのキットであって、配列番号10に特異的なDNAプローブ、トウモロコシ事象MON87429の診断に役立つアンプリコンを生成する一対のDNAプライマー、またはトウモロコシ事象MON87429によってコードされる少なくとも1つのタンパク質に特異的な少なくとも1つの抗体を含む、前記キット。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10から成る群から選択される配列を含むDNA分子を含む植物体、種子、細胞、植物体の一部、または商品生産物。
- 前記植物体、種子、細胞、または植物体の一部が、アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤に対する耐性を含む、請求項16に記載の植物体、種子、細胞、または植物体の一部。
- 前記植物体、種子、細胞、または植物体の一部がキザロホップ、ハロキシホップ、ジカンバ、2,4−D、グルホシネート及びグリホサートに対して耐性がある、請求項17に記載の植物体、種子、細胞、または植物体の一部。
- 作物栽培区域の雑草を防除する方法であって、
(a)前記作物栽培区域にてトウモロコシ事象MON87429を含むトウモロコシを植えることと;
(b)アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤の有効量を前記作物栽培区域またはその一部に施用して、トウモロコシに薬害を与えることなく雑草を防除することと、を含む、前記方法。 - 前記有効量の少なくとも1つの除草剤を施用することが、アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤から成る群から選択される少なくとも2以上の除草剤を生育期全体にわたって施用することを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記有効量の少なくとも1つの除草剤を施用することが、キザロホップ、ハロキシホップ、ジカンバ、2,4−D、グルホシネート及びグリホサート、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される除草剤を施用することを含む、請求項19に記載の方法。
- ジカンバの前記有効量が、生育期全体にわたる約0.5ポンド酸当量/エーカーから約2ポンド酸当量/エーカーまでのジカンバである、請求項21に記載の方法。
- グルホシネートの前記有効量が生育期全体にわたる約0.4ポンド活性成分/エーカーから約1.59ポンド活性成分/エーカーまでである、請求項21に記載の方法。
- 2,4−Dの前記有効量が生育期全体にわたる約0.75ポンド酸当量/エーカーから1.0ポンド酸当量/エーカーまでである、請求項21に記載の方法。
- ギザロホップの前記有効量が生育期全体にわたる約0.034ポンド活性成分/エーカーから約0.083ポンド活性成分/エーカーまでである、請求項21に記載の方法。
- ハロキシホップの前記有効量が生育期全体にわたる約0.018ポンド活性成分/エーカーから約0.07ポンド活性成分/エーカーまでである、請求項21に記載の方法。
- 区画にてトウモロコシ事象MON87429を含む自生トウモロコシを防除する方法であって、除草剤として有効な量の少なくとも1つのシクロヘキサンジオン(DIM)除草剤を施用することを含み、その際、前記除草剤の施用はトウモロコシ事象MON87429を含むトウモロコシの生育を阻止する、前記方法。
- 前記除草剤として有効な量の少なくとも1つのシクロヘキサンジオン(DIM)除草剤を施用することが、クレトジム、セトキシジム及びトラルコキシジムから成る群から選択されるシクロヘキサンジオン(DIM)除草剤を施用することを含む、請求項27に記載の方法。
- アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤に対する耐性を含む植物を生産する方法であって、
(a)トウモロコシ事象MON87429を含む植物をそれ自体とまたは第2の植物と交配して種子を生産することと;
(b)トウモロコシ事象MON87429を含む子孫種子を同定することと、を含む、前記方法。 - トウモロコシ事象MON87429を含む子孫種子を同定することが、
(a)前記子孫種子を生育させて子孫植物を生産することと;
(b)キザロホップ、ハロキシホップ、ジカンバ、2,4−D、グルホシネート及びグリホサート、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤の有効量で前記子孫植物を処理することと;
(c)アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤に対して耐性がある子孫植物を選択することと、を含む、請求項29に記載の方法。 - トウモロコシ事象MON87429を含む子孫種子を同定することが、前記子孫種子に由来する試料にてトウモロコシ事象MON87429の存在を検出することを含む、請求項29に記載の方法。
- トウモロコシ事象MON87429を含む子孫種子を同定することが、前記子孫種子に由来する試料にてトウモロコシ事象MON87429によってコードされる少なくとも1つのタンパク質の存在を検出することを含む、請求項29に記載の方法。
- 雑種種子を生産する方法であって、
(a)配列番号10を含む植物を生育させることと;
(b)前記植物の雄性生殖組織が発達するのに先立って、またはその最中に有効量のグリホサートを施用し、それによって前記植物にて雄性不稔を誘導することと;
(c)前記植物を第2の植物由来の花粉と受粉させることと;
(d)前記植物から雑種種子を収穫することと、を含む、前記方法。 - 前記有効量のグリホサートを施用することが、前記発達に先立ってまたはその最中に約0.5ポンド酸当量/エーカーから約2.5ポンド酸当量/エーカーまでの有効量でグリホサートを施用することを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記有効量のグリホサートを施用することが、トウモロコシ植物発達のV4期、V5期、V6期、V7期、V8期、V9期、V10期、V11期、V12期、V13期及びV14期から成る群から選択される発達期でグリホサートを施用することを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記雑種種子が配列番号10を含む、請求項33に記載の方法によって生産される雑種種子。
- トウモロコシ事象MON87429について植物の接合性を判定する方法であって、
(a)トウモロコシ事象MON87429の存在の診断に役立つ第1のアンプリコンとトウモロコシ事象MON87429を含まない野生型トウモロコシのゲノムDNAの診断に役立つ第2のアンプリコンとを作り出すことができるプライマーのセットに前記植物由来のDNAを含む試料を接触させることと;
(b)核酸の増幅反応を実施することと;
(c)第1のアンプリコン及び第2のアンプリコンを検出することと、を含み、その際、双方のアンプリコンの存在は前記試料がトウモロコシ事象MON87429についてヘテロ接合性であることを示し、第1のアンプリコンのみの存在は前記試料がトウモロコシ事象MON87429についてホモ接合性であることを示す、前記方法。 - 前記プライマーのセットが配列番号11及び配列番号12を含む、請求項37に記載の方法。
- アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤に対して耐性を含むトウモロコシ植物にて耐性を改善する方法であって、
(a)4つの発現カセットを含むDNA構築物を得ること、その際、
(i)第1の発現カセットは操作可能な連結にて、(I)Erianthus ravennae由来のユビキチンのプロモーター、リーダー、及びイントロンと、(II)ホスフィノトリシンN−アセチルトランスフェラーゼのコーディング配列と、(III)Setaria italica由来のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼの3’URLとを含み;
(ii)第2の発現カセットは操作可能な連結にて、(I)Coix lacryma−jobi由来のユビキチンのプロモーター、リーダー、及びイントロンと、(II)Arabidopsis thaliana由来のアルビノ及び淡緑6葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(III)ジカンバモノオキシゲナーゼのコーディング配列と、(IV)Oryza sativa由来のメタロチオネイン様タンパク質の3’UTRとを含み;
(iii)第3の発現カセットは操作可能な連結にて、(I)Arundo donax由来のユビキチンのプロモーター、リーダー、及びイントロンと、(II)Arabidopsis thaliana由来のリンゴ酸脱水素酵素葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(III)FT_Tタンパク質のコーディング配列と、(IV)Oryza sativa由来の無頂端分裂組織タンパク質の3’UTRとを含み;
(iv)第4の発現カセットは操作可能な連結にて、(I)CaMV 35Sのプロモーター及びリーダーと、(II)Triticum aestivum由来のクロロフィルa/b結合タンパク質のリーダーと、(III)Oryza sativa由来のアクチン1のイントロンと、(IV)Arabidopsis thaliana由来のShkG葉緑体輸送ペプチドのコーディング配列と、(V)Agrobacterium spのCP4株由来のグリホサート耐性の5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼのコーディング配列と、(VI)Zea mays由来の雄性組織特異的なsiRNA標的と、(VII)Oryza sativa由来のグリシンリッチRNA結合タンパク質の3’UTRとを含むことと;
(b)トウモロコシ細胞のゲノムに前記DNA構築物を挿入することと;
(c)トウモロコシ細胞をトウモロコシ植物にて再生させることと;
(d)前記DNA構築物を含むトウモロコシ植物を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記選択することが、キザロホップ、ハロキシホップ、ジカンバ、2,4−D、グルホシネート及びグリホサートから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤の有効量でトウモロコシ植物を処理することを含む、請求項39に記載の方法。
- トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞であって、アリールオキシフェノキシプロピオン酸(FOP)群のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)の阻害剤、合成オーキシン、グルタミン合成酵素の阻害剤、及び5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の阻害剤、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの除草剤に対する耐性を含み、請求項39に記載の方法によって入手可能であり、その際、前記トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞は前記DNA構築物を含む、前記トウモロコシ植物体、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ細胞。
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