CN112920971B - 一种氟咯草酮降解菌株及其应用 - Google Patents

一种氟咯草酮降解菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氟咯草酮降解菌株及其应用，涉及农药生物降解技术领域，所述菌株为链霉菌属（Purpureocillium sp.）FL‑G‑2菌株，于2021年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61420。该菌株对氟咯草酮的降解率高，14d的氟咯草酮降解率可达到84.4%，可以广泛应用于氟咯草酮污染土壤以及水体治理，不仅解决了氟咯草酮使用后土壤中残留难于降解的问题，同时，避免了后茬作物蚕豆、蔬菜、油菜等的残留药害影响。

Description

一种氟咯草酮降解菌株及其应用
技术领域
本发明涉及农药生物降解技术领域，具体涉及一种氟咯草酮降解菌株及其应用。
背景技术
氟咯草酮（flurochloridone）是一种旱田芽前选择性除草剂，隶属吡咯烷酮类除草剂，化学名称为3-氯-4-氯甲基-1-(3-三氟甲基苯基)-2-吡咯烷酮，是一种胡萝卜素合成抑制剂，通过阻断杂草类胡萝卜素、叶绿素和脱落酸的合成而达到杂草防除的目的，主要用于冬小麦、棉花、向日葵、胡萝卜田等农作物田间的杂草防除，效果良好，安全性高。根据申请人前期大量工作基础研究表明：（1）氟咯草酮在500g a.i./hm2供试浓度施用于马铃薯田，田间单双子叶杂草防除效果可达到90%以上；（2）氟咯草酮施用后，降解缓慢，在不同区域内的半衰期为7.46-14.23d，有些区域在施用后140d的土壤中仍检测到氟咯草酮（浓度为0.013mg/kg）；（3）后茬作物蔬菜、油菜和藜麦等对氟咯草酮较为敏感，常导致不出苗等残留药害问题发生。另外，氟咯草酮在施用环境条件中的有效利用率仅仅达到20%-30%，其余大部分的氟咯草酮流失于农田土壤、河流、地下水体中造成土壤农残过高，水源水体污染。综上所诉，氟咯草酮作为除草剂对田间多种杂草具有非常好的防除效果，但其在环境中降解缓慢，对后茬作物残留药害影响较大，急需开发一种能快速降解氟咯草酮的技术方法。
自然环境中的微生物降解代谢是消解和修复除草剂残留的高效且理想方式。从上个世纪中叶开始，环境微生物研究人员已经陆续分离出了许多能够降解各类除草剂的微生物菌株。但是目前对吡咯烷酮类除草剂降解菌的研究较少，氟咯草酮降解菌方面的相关报道几乎空白。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种氟咯草酮降解菌剂及其应用。
本发明采用的技术方案为：
一种氟咯草酮降解菌株，所述菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.）FL-G-2菌株，于2021年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61420。
本发明另一个目的是提供一种本发明所述菌株在降解氟咯草酮中的应用。
本发明另一个目的是提供一种本发明所述菌株在制备降解氟咯草酮土壤或水体中农药残留的制剂中的应用。
本发明另一个目的是提供一种氟咯草酮降解菌剂，所述菌剂包含本发明所述菌株或其发酵液。
本发明的有益效果：
本发明的菌株对氟咯草酮14天的降解率可高达84.4%，可以有效降解农田及水体中残留的氟咯草酮，环保、安全、高效，可以广泛应用于氟咯草酮污染土壤以及水体治理，不仅解决了氟咯草酮使用后土壤中残留难于降解的问题，同时，避免了后茬作物蚕豆、蔬菜、油菜等的残留药害影响。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例的分离、训化后的菌株；
图2是本发明实施例的FL-G-2菌株的显微镜图（40倍）；
图3是本发明实施例的氟咯草酮标准曲线；
图4是本发明实施例的FL-G-2菌株对氟咯草酮的降解率曲线；
图5是本发明实施例的FL-G-2菌株的系统发育树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 菌株分离与鉴定
一种氟咯草酮降解菌株，所述菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.）FL-G-2菌株，于2021年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61420。
所述菌株通过以下方式获得：
样品采集：采集青海省农林科学院植物保护研究所试验地长期大量使用氟咯草酮的马铃薯地表层土壤，并于－20℃保存备用。
菌种的分离纯化：
S1：称取10g上述土壤加入含有90mL无菌水的三角瓶中，30℃，180r/min条件下恒温摇晃培养30min制成菌悬液；取1mL上述菌悬液加入含9mL无菌水的试管中进行稀释，然后再取1mL稀释后的菌悬液加入含9mL无菌水的试管中，重复上述步骤至稀释浓度为原来的10-4-10-6。
S2：将稀释好的菌悬液涂布于高氏1号培养基28℃培养4-14d，平板中挑取单菌落重复多次划线分离培养，直至分离出单菌落，将单菌落保存于相应的固体斜面培养基中。
其中，高氏1号培养基包括：氯化钠0.5g、可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸亚铁0.01g和无水硫酸镁0.244g，固体培养基加入 1.5% 的琼脂。
训化：配置500m L无机盐固体培养基，高压灭菌，待温度冷却到40℃左右时吸取10mg/L的氟咯草酮标准母液5mL，制备成氟咯草酮浓度为 0.1mg/L的无机盐培养基，将分离纯化得到的菌株接种在此平板上30℃条件下培养2-3天，同理，将浓度0.1mg/L的氟咯草酮无机盐培养基中生长的菌种转代接种于氟咯草酮浓度为0.2mg/L的无机盐固体培养基中，继续驯化转代培养，并不断加大浓度，当氟咯草酮浓度增大到1mg/L时若还能在平板上生长，即此菌株具有降解氟咯草酮的潜能，保存菌株研究其降解特性。
对训化后存活的菌株分别进行梯度稀释涂布平板，挑取菌落外观特征存在差异的菌株进行纯化，在氟咯草酮无机盐培养基中得到11株菌，供试菌株在28℃、PH7.0的条件下均能够生长且长势良好，如图1所示。
显微镜观察：对驯化得到的具有降解氟咯草酮潜能菌株在显微镜下观察细胞形态，如图2所示。
核苷酸序列测定：重组质粒由生工生物工程（上海）技术服务有限公司提供测序，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，获取序列号后登录NCBI网站，再进入Blast界面选取与已知各菌株的序列最相近的同源序列下载备用。再运MEGA7.0 软件进行系统发育树的构建，如图5所示，根据系统发育树分析结果与菌株形态特征结合，初步判定菌株FL-G-2为Streptomyces sp（链霉菌），将所得菌株于2021年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61420。
实施例2 氟咯草酮降解能力检验
色谱检测条件：
色谱柱，C18柱；柱温，40℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%乙酸 +5mmol/L乙酸铵；流速为0.4mL/min；进样体积，1.0µL。
标准曲线的绘制：
根据氟咯草酮出峰的保留时间定性，峰面积定量。采用外标法制作氟咯草酮进样浓度和峰面积关系的标准曲线，结果见图3。
添加回收率的测定
分别向三种培养基中添加氟咯草酮标准品，使其浓度分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L三个添加水平，五个重复，吸取10m L培养液，置于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈溶液，涡旋振荡3min至充分混匀。加入3gNaCl，涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液1.5mL，加入50mgPSA和100mg无水硫酸镁，涡旋1min，以12000 r/min 离心2 min，取上层清液，经0.22µm膜过滤后，供超高效液相色谱—串联质谱仪测定。
添加回收率计算公式：
添加回收率（%）=加标量/加标试样测定值量×100
结果表明：标准样品在浓度范围内峰面积线性关系良好，氟咯草酮在各培养基中的平均添加回收率范围为82.7%-98.0% ，表明该方法测定培养基中氟咯草酮的含量比较精确，并且操作简便、可靠，符合农药残留分析质量控制的技术要求。
菌株降解能力的测定
将驯化得到的具有降解氟咯草酮潜能的菌株接种于高氏1号液体培养基中，28℃、180r/min条件下培养24h，作为种子液。将种子液以2%的接种量（种子液体积与培养液体积之比）接到浓度为1mg/L的氟咯草酮无机盐液体培养基中，在28℃条件下，以180r/min的速度进行培养，每隔1d、3d、5d、7d、14d取样，以添加相同浓度氟咯草酮不接菌的无机盐培养基为对照，液相色谱－串联质谱法检测分析各菌株对氟咯草酮的降解率。吸取10mL培养液，置于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈溶液。涡旋振荡3min至充分混匀。加入3gNaCl，涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液1.5mL，加入50mgPSA和100mg无水硫酸镁，涡旋1min，以12000 r/min离心2min，取上层清液，经0.22µm膜过滤后，供超高效液相色谱—串联质谱仪测定。
降解率计算公式：
X%=(A1-A2)/A1×100
式中：
X%——氟咯草酮的降解率
A1——对照中农药浓度（mg/L）
A2——处理中农药浓度（mg/L）
结果表明本发明的菌株对氟咯草酮的降解率见图4：菌株G2 1d,3d,5d,7d,14d的降解率分别为12.3%，41.6%，51.2%，68.8%，84.4%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青海省农林科学院
<120> 一种氟咯草酮降解菌株
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 链霉菌属（tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgaagccgcttcgg 60 tggtggatta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttcactctgggac 120 aagccctgga aacggggtct aataccggat aacactctgt cccgcatgggacggggttga 180 aagctccggc ggtgaaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggggtaatggcct 240 accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgggactgagaca 300 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggcgaaagcctga 360 tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctctttcagcagggaa 420 gaagcgaaag tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgccagcagccgcg 480 gtaatacgta gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagctcgtaggcggc 540 ttgtcacgtc ggatgtgaaa gcccggggct taaccccggg tctgcattcgatacgggcta 600 gctagagtgt ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgcgcagatatca 660 ggaggaacac cggtggcgaa ggcggatctc tgggccatta ctgacgctgaggagcgaaag 720 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgttgggaactag 780 gtgttggcga cattccacgt cgtcggtgcc gcagctaacg cattaagttccccgcctggg 840 gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcacaagcagcggag 900 catgtggctt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacatataccggaaa 960 gcatcagaga tggtgccccc cttgtggtcg gtatacaggt ggtgcatggctgtcgtcagc 1020 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgttctgtgttgcc 1080 agcatgccct tcggggtgat ggggactcac aggagactgc cggggtcaactcggaggaag 1140 gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacgtgctacaatg 1200 gccggtacaa tgagctgcga tgccgtgagg cggagcgaat ctcaaaaagccggtctcagt 1260 tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt tgctagtaatcgcagatcag 1320 cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacgtcacgaaagt 1380 cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag ggagctgtcgaaggtgggac 1440 tggcgattgg gacgaagtc 1459)
<400> 1

Claims (4)

1.一种氟咯草酮降解菌株，其特征在于，所述菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.）FL-G-2菌株，于2021年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61420。
2.一种权利要求1所述菌株在降解氟咯草酮中的应用。
3.一种权利要求1所述菌株在制备降解氟咯草酮土壤或水体中农药残留的制剂中的应用。
4.一种氟咯草酮降解菌剂，所述菌剂包含权利要求1所述菌株或其发酵液。
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