CN104245940A - 植物中的靶向基因组工程 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于以一种靶向方式经由细菌转化在预定义位点处修饰植物细胞或植物的基因组的改进的方法和手段。

Description

植物中的靶向基因组工程
发明领域
本发明涉及农学领域。更具体地，本发明提供了经由细菌介导的转化(例如农杆菌)在植物细胞或植物的基因组中的精确定位的核苷酸序列处引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或取代。通过使用一种由T-DNA编码的双链DNA断裂诱导酶在识别核苷酸序列处诱导双链断裂而在一个第一步骤中触发这些修饰，该T-DNA已经被引入进植物细胞中，同时随后将包括修复DNA分子的共引入的T-DNA用作修复双链断裂的模板。通过经由一种单一的细菌细胞共引入这两种T-DNA分子增加正确靶向基因组修饰的频率。
背景
农杆菌介导的DNA转移是大多数植物(包括作物)的标准转化方法。农杆菌方法优于其他方法的优点包括转化的高效率，具有确定末端的DNA片段的转移，相对较大的DNA区段的转移，以及不存在对原生质体培养技术的需求(Komari(科玛丽)等人，1996Plant J.(植物杂志)10:165-174)。
当多于一种构建体有待转化时，与使用多于一种农杆菌菌株的同时转化相比，直接DNA递送方法(例如粒子轰击或电穿孔)由于更高的共转化频率可以是更有效的。然而，这些直接递送方法的一个缺点在于它们可以导致更加复杂的转基因整合模式，从而使得单拷贝转化体的鉴定过程漫长且费力。
为了能够在预定的位点处引入一个外源DNA(所谓的基因靶向)，需要具有两种构建体的转化植物细胞或组织，一种包括编码在特定靶标位点处诱导双链DNA断裂(DSB)的酶的基因并且一种包括用于修复该断裂的感兴趣的DNA。当用修复DNA和编码双链DNA断裂诱导(DSBI)酶的DNA同时转化植物细胞时，使用直接DNA递送方法的这一过程比当使用两种农杆菌菌株时也可以是更有效的。
可以通过使用一种单一的农杆菌菌株共递送在同一T-DNA上的修复DNA和DSBI酶编码基因改善经由农杆菌介导的转化的使用感兴趣的DNA的DSB诱导和随后的修复的频率。然而，这可以导致DSBI酶编码基因在双链断裂诱导的位点处的共整合，这是不令人希望的。这一共整合可以通过按以下方式构建T-DNA载体来避免：有待引入进基因组中的DNA的侧翼是与基因组靶标位点具有同源性的区域，从而经由同源重组指导插入，但是由此DSBI基因位于这些同源区之外，但是由于需要在一种构建体中包括另外的元件，所以克隆程序变得更加复杂。
Wright(赖特)等人(2005，plant J(植物杂志)，44:693-705)披露了通过两种分别包含ZNF表达构建体和供体DNA的线性化质粒的同时电穿孔，经由同源重组在烟草原生质体中的工程化靶标基因座处的锌指核酸酶(ZNF)诱导的染色体断裂修复。
Shukla(舒克拉)等人(2009，Nature(自然)459:437-441)、US08/0182332和US 10/0199389描述了经由触须(Whiskers)和粒子轰击通过将设计的ZNF表达构建体与包含同源臂的供体质粒共递送进玉米胚性细胞培养物中而靶向插入玉米中的内源性基因座。
Lloyd(劳埃德)等人(2005，Proc Natl Acad Sci(国家科学院院刊)，102:2232-2237)和Zhang(张)等人(2009，Proc Natl Acad Sci(国家科学院院刊)，107:12028-1203)以及US 10/0071083描述了被稳定转化进植物基因组中用于在靶向诱变中使用的可诱导的DSBI酶编码基因。
Cai(蔡)等人(2009，Plant Mol Biol(植物分子生物学)，69:699-709)和US 2011008833描述了使用农杆菌，经由两种农杆菌菌株的共培养，并且还通过包含Ti质粒的一种单一农杆菌菌株的共培养的向工程化且内源的烟草基因座中的同源性介导的靶向插入，两种农杆菌菌株中的一者具有供体DNA并且另一者具有设计的ZNF表达构建体，该Ti质粒在同一T-DNA内具有ZNF和供体构建体两者。
Komari(科玛丽)等人(1996，Plant J(植物杂志)10:165-174)和US 5,731,179披露了用于生产不含选择标记的转化体的超级二元载体。
因此，考虑到农杆菌系统针对植物转化的优点，对于使用农杆菌共递送修复DNA分子和DSBI酶编码嵌合基因的更有效的方法存在需要。在下文的详细的说明书、实施例和权利要求书中解决了这一问题。
附图说明
图1：(a)使用一种双T-DNA载体向预选的基因组靶标位点中的靶向插入的示意性图示，该载体在一组T-DNA边界之间包括一个具有感兴趣的DNA(编码2mEPSPS和Pf-HPPD的嵌合基因)的修复DNA分子以及在一个第二对T-DNA边界之间包括一种编码识别靶标植物的基因组中的识别位点的核酸内切酶的嵌合基因。基于非同源性的靶向插入的结果是两种可能的事件，取决于插入的感兴趣的DNA的方向(随机的)。指示出用于鉴定这些事件的引物及其扩增产物。剪刀表示大范围核酸酶蛋白，该蛋白在由两个三角形指示的其识别位点处诱导断裂(每个三角形表示二分之一部分的识别位点)。RB和LB分别表示右侧和左侧T-DNA边界。(b)：与a)中类似的情形，但是在此处，修复DNA另外包括侧翼于感兴趣的DNA的DNA区域(同源区1和2：hr1和hr2，由连谱号指示)，这些DNA区域分别与预选位点/识别位点的上游区或下游区具有同源性，也由连谱号指示。在这种情景中，插入的方向不是随机的而是由hr1和hr2与预定义位点的上游或下游区的同源性决定。还取决于同源区的选择，一半部分的识别位点存在或不存在于基因组中。
图2：候选者正确靶向的插入事件的序列比对。(a)右侧插入事件，(b)左侧插入事件。
详细说明
在先前实验中，当使用直接DNA递送方法(例如粒子轰击)时，比当用两种农杆菌菌株的共孵育时，修复DNA和DSBI酶编码DNA的共转化导致的正确靶向插入事件的频率高约十倍。本发明是基于以下发现：当用一种单一的农杆菌菌株转化植物细胞时，经由农杆菌将修复DNA和编码DSBI酶的DNA共递送至这些植物细胞中的靶向插入事件的频率可以被增加至与当使用直接DNA递送方法时的类似的频率，该菌株在单独的T-DNA中包括两种DNA分子，例如在相同T-DNA载体(双T-DNA载体)上。这一经由农杆菌转化共递送DSBI酶编码基因和修复DNA的改善方法因此结合了农杆菌介导的转化的优点与具有与直接递送方法的频率相等的靶向基因组修饰的频率，并且同时允许任何整合的DSBI酶编码基因在下一代中与靶向修饰分离。
因此，在一个第一实施例中，本发明涉及一种用于在预选位点处修饰植物细胞的基因组的方法，该方法包括以下步骤：
a.使一种植物细胞与一种细菌接触，该细菌能够指导来自所述细菌的确定的DNA分子转移进所述植物细胞的基因组中，所述细菌包括：
i.一种第一确定的DNA分子，该分子包括一种编码植物功能性DSBI酶的嵌合基因，所述DSBI酶能够在位于所述预选位点处或其附近的识别位点处识别并诱导双链DNA断裂，所述嵌合基因包括以下可操作连接的元件：
1.一种植物可表达的启动子；
2.一个编码DSBI酶的DNA区域；
3.一个植物功能性3’终止和多聚腺苷酸化区域；以及
ii.一种第二确定的DNA分子，该分子包括一种用作修复所述双链DNA断裂的模板的修复DNA分子；
b.选择一种植物细胞，其中所述修复DNA被用作修复双链DNA断裂的模板，所述双链DNA断裂的所述修复导致在所述预选位点处的所述基因组的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的替代；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i.-iii.的任何组合。
如在此使用，“双链DNA断裂诱导酶”是一种能够在被称作“识别位点”的具体核苷酸序列处诱导双链DNA断裂的酶。稀有切割性核酸内切酶是具有14至40或甚至至70个连续核苷酸的识别位点的DSBI酶，并且因此具有非常低的剪切频率，甚至在较大的植物基因组中。也称为大范围核酸酶的寻靶核酸内切酶构成了此类稀有切割性核酸内切酶家族。它们可以由内含子、独立基因或插入序列编码，并且呈现了将它们和更经典的限制性内切酶(通常来自细菌限制修饰II型系统)区分的显著结构和功能特性。它们的识别位点具有与大多数限制性内切酶识别位点的特征性二重对称形成对比的一般不对称性(general asymmetry)。若干由内含子或内含肽编码的寻靶核酸内切酶已经示出促进它们对应的遗传元件寻靶进入等位基因的无内含子的或无内含肽位点。通过在无内含子或无内含肽等位基因中制造一种位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生了引起重组的末端，这些末端参与基因转换过程，该过程复制了编码序列并且导致了内含子或插入序列在DNA水平的插入。
其他稀有切割性大范围核酸酶以及它们对应的识别位点的列表提供在WO 03/004659的表I中(17页至20页)(通过引用结合在此)。这些包括I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I。
此外，对设计定制的稀有切割性核酸内切酶(基本上识别任何选择的核苷酸序列)，方法是可用的。简言之，可以使用杂合体制备嵌合限制性内切酶，该杂合体是在设计用于识别特异核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制性内切酶(例如FokI)的非特异性DNA-切割结构域之间的杂合体。此类方法已经描述于例如WO 03/080809、WO 94/18313或WO 95/09233中并且描述在Isalan(艾莎兰)等人，2001，NatureBiotechnology(自然生物技术)19，656-660；Liu(刘)等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)94，5525-5530中。通过从变体文库中进行选择来产生定制大范围核酸酶，描述于WO2004/067736中。具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶也可以通过如描述于WO 2007/047859中的合理设计来获得。定制设计的核酸内切酶的另一个实例包括所谓的TALE核酸酶，该酶基于来自融合至例如FOKI的核酸酶的催化结构域的细菌属黄单胞菌属的转录激活因子样效应物(TALE)。这些TALE的DNA结合特异性由串联排列的34/35-氨基酸重复单元的重复可变双残基(RVD)定义，这样使得一种RVD特异性识别靶标DNA中的一种核苷酸。这些重复单元可以被装配为基本上识别任何靶标序列并且可以被融合至核酸酶的催化结构域以产生序列特异性核酸内切酶(参见例如，Boch(博赫)等人，2009，Science(科学)326:p1509-1512；Moscou(莫斯考)和Bogdanove(保格丹威)，2009，Science(科学)326:p1501；Christian(克里斯蒂安)等人，2010，Genetics(遗传学)186:757-761，WO 10/079430，WO11/072246，WO 2011/154393，WO 11/146121，WO 2012/001527，WO2012/093833，WO 2012/104729，WO 2012/138927，WO 2012/138939)。WO 2012/138927进一步描述了单体型(紧凑型)TALEN和具有不同催化结构域的TALEN及其组合。近来，描述了一种新型的可定制的核酸内切酶系统；所谓的CRISPR/Cas系统，该系统利用一种赋予序列特异性的专用RNA分子(CrRNA)指导相关核酸酶Cas9的切割(Jinek(季聂克)等人，2012，Science(科学)337:p816-821)。此类定制设计的核酸内切酶还被称为非天然发生的核酸内切酶。
位点特异性重组酶是不同于核酸内切酶的酶，但是也可以用于进行本发明的方法。与核酸内切酶形成对比，位点特异性重组酶需要两个识别位点，在其之间发生重组。因此，包括至少一个这样的识别位点的修复DNA可以靶向也包括至少一个这样的位点的基因组座。位点特异性重组酶的实例在本领域是熟知的，并且包括例如来自噬菌体P1的Cre-Lox系统(Austin(奥斯丁)等人，1981，Cell(细胞)，25:729-736)，来自酿酒酵母的Flp-Frt系统(Broach(布罗奇)等人，1982，CelI(《细胞》)，29:227-234)，来自鲁氏接合酵母的R-RS系统(Araki(阿拉基)等人，1985，J.MoL Biol.(分子生物学杂志)，182：191-203)以及来自链霉菌噬菌体PhiC31的整合酶(Thorpe(索普)&Smith(史密斯)，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.，(国家科学院院刊)95：5505-5510；Groth(格罗思)等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.,(国家科学院院刊)97：5995-6000)。
如在此使用，“预选位点”或“预定义位点”指示植物基因组(例如核基因组)中的具体的核苷酸序列，在该位置处希望插入、取代或缺失一个或多个核苷酸。这可以例如是内源基因座或先前引入的外源DNA或转基因中的具体核苷酸序列。
如在此使用，相对于DSBI酶的识别位点的位置，“在预选位点处或附近”是指识别位点与预选位点重叠(在此处)或远离预选位点(在附近)。这可以例如远离预选位点10bp、20bp、30bp、40bp、50bp，但是还可以是100bp、、200bp、300bp、400bp、500bp、1kb、2kb或5kb。本领域的普通技术人员将能够选择一种识别在预选位点处或附近的识别位点的双链DNA断裂诱导(“DSBI”)酶或工程化这样的一种DSBI酶。可替代地，可以使用任何常规转化方法或通过使用在其基因组中具有DSBI酶识别位点的植物株系的常规育种，将DSBI酶识别位点引入进植物基因组中，并且然后可以将任何所希望的DNA引入进那一识别位点中或附近。
也称为直接DNA递送方法的非基于细菌的(non-bacteria-based)基因转移和转化方法描述于例如US 2011008833中，包括但不限于，通过钙-、聚乙二醇(PEG)-或电穿孔介导的裸DNA的摄取的原生质体转染(参见Paszkowski(帕克沃斯基)等人(1984)，EMBO J(欧洲分子生物学学会杂志)3:2717-2722；Potrykus(波特里库斯)等人(1985)，Molec.Gen.Genet.(普通遗传学)199:169-177；From(弗罗姆)等人(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)825824-5828；和Shimamoto(岛本町)(1989)，Nature(自然)338:274-276)以及植物组织的电穿孔(D'Halluin(德阿吕安)等人(1992)，Plant Cell(植物细胞)4:1495-1505)。植物细胞转染的另外的方法包括微注射，碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler(凯普勒)等人(1990)，PlantCellReporter(植物细胞报道)9:415-418)，以及微弹轰击(参见Klein(克莱因)等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)85:4305-4309；和Gordon-Kim(戈登-金)等人(1990)，Plant Cell(植物细胞)2:603-618)。
可以用于进行本发明的细菌可以是任何能够指导被包含在该细菌中的确定的DNA片段稳定地转移进植物细胞的基因组中的细菌，优选是不致病的或消除伤害力的(disarmed)(不包含癌基因)。此类细菌具有一个或多个质粒，例如瘤诱导质粒(Ti质粒)或根诱导质粒(Ri质粒)，这些质粒的所谓的转移DNA(T-DNA)在转化后被转移进植物细胞中并掺入在植物基因组中。根瘤菌目的某些土壤细菌具有这一能力，如根瘤菌科(例如，根瘤菌属、中华根瘤菌属、农杆菌属)；叶杆菌科(例如，中慢生根瘤菌属、叶杆菌属)；布鲁氏菌科(例如，苍白杆菌属)；慢生根瘤菌科(例如，慢生根瘤菌属)，以及黄色杆菌科(例如，氮根瘤菌属)，农杆菌属，根瘤菌属，中华根瘤菌属，中慢生根瘤菌属，叶杆菌属，苍白杆菌属和慢生根瘤菌属，其实例包括苍白杆菌属、根瘤菌属、中慢生型百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、苜蓿中华根瘤菌。根瘤菌的实例包括豌豆根瘤菌三叶草生物变异型(R.leguminosarum bv，trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物变异型(R.leguminosarum bv，phaseoli)以及豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(Rhizobium leguminosarum,bv，viciae)(美国专利7,888,552)。
能够转化植物细胞并诱导外源DNA掺入进植物基因组中的可以用于进行本发明的其他细菌是固氮菌属(好氧)，菱形藻属(严格厌氧)，克雷伯氏菌属(可选择好氧)以及红螺菌属(厌氧，有光合活性)的细菌。还发现Ti质粒的转移为若干根瘤菌科成员赋予瘤诱导能力，这些根瘤菌科成员是例如三叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌和紫金牛叶瘤杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)，而根瘤菌属NGR234、苜蓿中华根瘤菌和中慢生型百脉根根瘤菌的确可以被修饰以介导至多种不同植物的基因转移(Broothaerts(布鲁塞尔特斯)等人，2005，Nature(自然)，433:629-633)。
通过农杆菌等将T-DNA转移至植物细胞的机理已经被很好地记录(参见例如，Tzfira(特兹菲拉)和Citovsky(奇图斯基)(2006)Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术现行观点)17:147-154；Gelvin(格尔林)(2003)Microbiol.Molec.Biol.Rev.(微生物学与分子生物学综述)67:16-37；Gelvin(格尔林)(2009)Plant Physiol.(植物生理学)150:1665-1676)。简言之，T-DNA被两个称作右边界(RB)和左边界(LB)的边界区限定。这些边界被毒性蛋白VirD2断口，从而在其5’末端产生具有40个VirD2的共价附接的单链转移DNA(“T-链”)。该蛋白-DNA复合体(还包括农杆菌VirE2蛋白)通过所谓的4型分泌系统(T4SS，毒性蛋白和ssDNA运载蛋白两者)退出农杆菌细胞，并且被转移进植物细胞中并在农杆菌毒性蛋白和植物因子的帮助下整合进植物基因组中。正常地发现作为Ti或Ri质粒上的一系列操纵子的vir基因。不同的Ti和Ri质粒在vir基因的互补体方面多少有些不同，例如通常不存在virF。使用农杆菌介导的载体将DNA引入进植物细胞中在本领域是熟知的。参见例如，Fraley(弗雷利)等人，(1985；Biotechnology(生物技术)3:629-635)、Rogers(罗杰斯)等人，(1987；Methods Enzymol(酶学方法)153:253-277)以及美国专利号5,563,055。
LB并不为T-DNA转移所严格需要，因为包含缺少LB但含有RB的T-DNA的癌基因是高毒性的，而包含LB但不包含RB的这样的T-DNA是完全无毒性的(Jen(珍)等人，1986，J Bacteriol(细菌学杂志)166:491-499)。因此，如在此使用，T-DNA是指一种可以被细菌转移进植物细胞中的DNA分子，该分子除包括用于修复DNA断裂的DNA(修复DNA)之外，还包括至少一种T-DNA边界，优选至少右侧T-DNA边界。然而，为了阻止所不希望的载体元件的掺入，左边界和右边界两者都应该被包括，即侧翼于感兴趣的DNA，因为这些边界定义了T-DNA分子的末端。
已经描述到，左边界比右边界更易于“通读(read through)”(参考(ref))。因此，为了减少一个载体中的两个DNA被加工为一个单一T-DNA分子的可能性，这两个T-DNA被如此定向，以使得在这两个T-DNA在该载体上彼此最靠近的点处，不存在两个面对面的左边界(头对头；RB-LB；LB-RB)。因此，在一个实施例中，在该载体上的这两个T-DNA的方向是这样的，以使得在这两个T-DNA在该载体上彼此最靠近的点处，存在两个面对面的右边界(这些T-DNA处于尾对尾的方向：LB-RB；RB-LB)。在一个更优选的实施例中，在该载体上的这两个T-DNA的方向是处于同一方向的，这样使得一个T-DNA的左边界对着另一个T-DNA的右边界，即这两个T-DNA处于头对尾方向(LB-LB；RB-LB)。
可以用于本发明的属于农杆菌属的细菌的实例包括但不限于，根癌农杆菌、发根农杆菌、放射形土壤杆菌、悬钩子农杆菌(Agrobacteriumrubi)、葡萄农杆菌(Agrobacterium vitis)。使用的农杆菌物种可以是一种野生型(例如，有毒性的)或消除伤害力的菌株。适合的农杆菌菌株包括野生型菌株(例如，如根癌农杆菌)或其中的一个或多个基因被突变以增加转化率的菌株，例如，如由于突变的或嵌合的virA或virG基因的存在，其中的vir基因表达和/或其诱导被改变的农杆菌菌株(例如Chen(陈)和Winans(怀南斯)，1991，J.Bacteriol.(细菌学杂志)173:1139-1144；和Scheeren-Groot(舍人-格鲁特)等人，1994，J.Bacteriol.(细菌学杂志)176:6418-6246)，包括一个额外的virG基因拷贝的农杆菌菌株，如衍生自pTiBo542的超级virG基因，优选地连接至一个多拷贝质粒，如例如在美国专利号6,483,013中所描述。其他适合的菌株包括但不限于：根癌农杆菌GV3101(pMP90))(Konc(柯妮科)和Schell(谢尔)，1986，Mol Gen Genet.(分子与普通遗传学)204:383-396)，LBA4404(Hoekema(胡艾克玛)等人，Nature(自然)303:179-180(1983))；EHA101(Hood(霍德)等人，J.Bac.(细菌学杂志)168:1291-1301(1986))；EHA105(Hood(霍德)等人，Trans Res.(转基因研究)2:208-218(1993))；AGL1(Lazo(拉索)等人，Bio Technology(生物技术)2:963-967(1991))。
用于农杆菌介导的植物转化，可以将有待插入进植物中的DNA克隆进特定质粒中，例如克隆进中间(穿梭)载体中或克隆进二元载体中。中间载体不能在农杆菌细胞中独立复制，但是可以在常见大肠杆菌分子克隆菌株中进行操纵和复制。此类中间载体包括常见地由右和左T-DNA边界重复区加框的序列，这些序列可以包括一种用于选择转化的植物细胞的选择性标记基因、一种克隆接头、一种克隆多接头、或可以作为注定用于植物细胞转化的基因的引入位点的其他序列。因此，希望有待转移进植物中的基因的克隆和操纵可以通过标准方法容易地在大肠杆菌中进行，使用穿梭载体作为克隆载体。随后地，可以将最终操纵地穿梭载体引入进农杆菌植物转化菌株中，用于进一步工作。中间穿梭载体可以借助辅助质粒(经由细菌接合)、通过电穿孔、通过化学介导的直接DNA转化、或通过其他已知的方法转移进农杆菌中。由于在Ti或Ri质粒或其衍生物与中间质粒之间同源的序列，可以通过同源重组将穿梭载体整合进Ti或Ri质粒或其衍生物中。这一同源重组(即质粒整合)事件从而提供了一种在农杆菌中稳定维持改变的穿梭载体的手段，由共整合的质粒的Ti或Ri质粒部分来提供复制起点以及其他质粒维持功能。Ti或Ri质粒还包括含有T-DNA的转移所必需的vir基因的vir区。携带vir区的质粒常见地是一种突变的Ti或Ri质粒(辅助质粒)，T-DNA区域(包括右和左T-DNA边界重复)已经被从其中缺失。在此将此类具有功能性vir基因并且缺少全部或基本上全部T-区以及相关元件的pTi-衍生的质粒描述性地称为辅助质粒。
还可以使用所谓的超级二元系统制备用于植物转化的T-DNA载体。这是穿梭载体/同源重组系统的一种特化实例(由Komari(科玛丽)等人，(2006)综述于：Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)(K.Wang(王)，编)第343期：Agrobacterium Protocols(农杆菌方案)(第2版，第1卷)HUMANA PRESS Inc.(HUMANA出版公司)，Totowa(特图瓦市)，新泽西州，第15-41页；以及Komori(科玛丽)等人，(2007)Plant Physiol.(植物生理学)145:1155-1160中)。与超级二元系统一起使用的根癌农杆菌宿主菌株是LBA4404(pSBl)。菌株LBA4404(pSBl)具有两个独立复制的质粒pAL4404和pSBl。pAL4404是一种Ti质粒衍生的辅助质粒，该辅助质粒包含一整组的vir基因(来自Ti质粒pTiACH5)，但是不具有T-DNA区域(并且因此不具有T-DNA左和右边界重复序列)。质粒pSBl提供了另外部分组的衍生自pTiBo542的vir基因；这一另外的vir基因组包括virB操纵子和virC操纵子以及基因virG和virDl。用于超级二元系统中的穿梭载体的一个实例是pSBl l，它包含作为注定用于植物细胞转化的基因的引入位点的克隆多接头，侧翼是右和左T-DNA边界重复区。穿梭载体pSBl 1不能在农杆菌中独立复制，但是当借助存在于pSBl和pSBl l上的共有序列之间的同源重组整合进pSBl中时，稳定地维持为共整合质粒。因此，被引入进修饰的pSBll载体上的LBA4404(pSBl)中的完全修饰的T-DNA区域通过衍生自两种不同的农杆菌Ti质粒源(pTiACH5和pTiBo542)的Vir蛋白有成效地作用于并且转移进植物细胞中。已经证明超级二元系统在单子叶植物物种的转化中是特别有用的。参见，Hiei(江井)等人，(1994)Plant J.(植物杂志)(6:271-282)和Ishida(石田)等人，(1996)Nat.Biotechnol.(自然生物技术)14:745-750。
将清楚的是，还可以通过如在下文描述的常规的克隆技术而非经由上述二元同源重组系统制备本发明的双T-DNA载体。
使用农杆菌或任何其他细菌转化植物细胞可以经由原生质体共培养、外植体接种、花序转染(floral dipping)以及真空渗入而发生。此类技术描述于例如美国专利号5,177,010、美国专利号5,104,310、欧洲专利申请号0131624B1、欧洲专利申请号120516、欧洲专利申请号159418B1、欧洲专利申请号176112、美国专利号5,149,645、美国专利号5,469,976、美国专利号5,464,763、美国专利号4,940,838、美国专利号4,693,976、欧洲专利申请号116718、欧洲专利申请号290799、欧洲专利申请号320500、欧洲专利申请号604662、欧洲专利申请号627752、欧洲专利申请号0267159、欧洲专利申请号0292435、美国专利号5,231,019、美国专利号5,463,174、美国专利号4,762,785、美国专利号5,004,863、以及美国专利号5,159,135中。使用包含T-DNA的载体用于转化植物细胞已经被集中研究并充分描述于欧洲专利申请120516；An(安)等人，(1985，EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志)4:277-284)，Fraley(弗雷利)等人，(1986，Crit.Rev.Plant Sci.(植物科学评论性综述)4:1-46)，以及Lee(李)和Gelvin(格尔林)(2008，Plant Physiol.(植物生理学)146:325-332)中。
根据本发明，可以被转化的不同组织外植体包括来自下胚轴、子叶、不成熟的合子胚，叶、花药、花瓣、胚珠、根、以及分生组织、干细胞和叶柄的外植体。根据本发明，愈伤组织也可以被转化。如在此使用，术语“愈伤组织”是指作为植物组织培养的结果产生的胚性细胞和细胞群的无组织团块。脆弱愈伤组织是指具有脆弱质地的愈伤组织，它具有形成芽和根并最终再生成完整植物的潜力。致密愈伤组织也可以具有形成芽和根的潜力。愈伤组织可以再生/诱导自如上提及的不同组织外植体。
在一个实施例中，其基因组被根据本发明进行修饰的植物细胞经由(脆弱)胚性愈伤组织细胞的转化进行转化，即该细胞是一种(脆弱)胚性愈伤组织细胞(被包含在(脆弱)胚性愈伤组织内)，如下所述。
在另一个实施例中，其基因组被根据本发明进行修饰的植物细胞经由下胚轴转化进行转化，即该植物细胞是一种下胚轴细胞(被包含在下胚轴内)。认为下胚轴转化导致更纯粹的修饰事件(较低百分比的嵌合事件)。
在预选位点处诱导双链断裂的能力打开了若干潜在的应用，即一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失。假如存在于修复DNA分子中的感兴趣的DNA有待插入进预选位点中，这可以通过同源重组或通过非同源末端连接的过程而发生。还可以使用双链断裂来在预选位点处诱导小缺失或插入的形成，从而潜在地钝化包括该预选位点的核苷酸序列的基因或调控元件。在预选位点处或附近的双链断裂也将促进使用修复DNA将双链断裂诱导位点附近的DNA区域取代为感兴趣的DNA，例如如描述于WO 06/105946、WO 08/037436或WO 08/148559中。
如果双链DNA断裂诱导伴随着用作模板的修复DNA分子的引入，那么双链断裂修复基本上可以按三种方式发生。修复DNA可以在DSB位点处通过在两端的非同源末端连接整合进基因组DNA中，或者如果在修复DNA中存在一个或两个与预选位点的上游和/或下游区域具有同源性的侧翼区域(同源区)，那么修复DNA的整合也可以(部分地)通过同源重组发生。照此，在预选位点附近的双链断裂也将促进将该断裂附近的DNA区域取代为感兴趣的DNA区域，例如如描述于WO06/105946、WO 08/037436或WO 08/148559中。
为了通过同源重组在预选位点处插入一个感兴趣的DNA，该修复DNA可以包括至少一个侧翼DNA区域，该侧翼DNA区域具有与预选位点上游或下游的DNA区域的核苷酸序列相似的核苷酸序列。外源DNA也可以包括位于该分子相反端的两个侧翼DNA区域，并且这些区域分别与预选位点上游和下游的DNA区域的核苷酸序列具有充分同源性，以允许所述侧翼区域与所述上游和下游区域之间的重组。修复T-DNA中的同源区可以进一步阻止DSBI T-DNA的偶然性共整合。
如在此使用，“侧翼DNA区域”是具有以下核苷酸序列的修复DNA中的DNA区域，该核苷酸序列分别与靶标DNA序列或预选位点的上游和/或下游的DNA区域具有同源性(即高序列一致性)(同源区)。这允许更好地控制感兴趣的DNA的插入。的确，通过同源重组的整合将允许上升至核苷酸水平的感兴趣的DNA精确连接至植物核基因组。优选地，DSBI酶的识别位点然后被定位在两个同源区之间。为了促进取代/缺失，也可以存在多于一个DSBI酶识别位点。
为了具有充分同源性用于重组，修复DNA的侧翼DNA区域可以在长度方面变化并且应至少约10个核苷酸长。然而，侧翼区域在实际中可以尽可能长(例如高达约100-150kb)，例如完全细菌人工染色体(BAC)。优选地，该侧翼区域将是约25bp至约2000bp，例如约50bp、100bp、200bp、500bp、1000或1500bp。此外，侧翼于感兴趣的DNA的区域不需要和同源区(侧翼于预选位点的DNA区域)相同，并且可以与侧翼于预选位点的DNA区域具有约80％至约100％之间的序列一致性，优选约95％至约100％的序列一致性。侧翼区域越长，对于同源性的要求越不严格。此外，优选的是在实际中在DSB附近序列一致性尽量高。此外，为了达到在预选位点处交换靶标DNA序列而不改变毗邻DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应优选与侧翼于预选位点的上游或下游DNA区域或与有待交换的靶标DNA序列相同。
此外，修复DNA的一个或多个侧翼区域不需要与紧侧翼于DSBI酶的识别位点的区域具有同源性，但是可以与距离那一位点更远的核基因组的DNA区域具有同源性。感兴趣的DNA的插入将然后导致预选插入位点与DNA同源区域之间的靶标DNA的移除。换言之，位于这些同源区(即与修复DNA的侧翼区域具有同源性的基因组区域)之间的靶标DNA将被取代为位于修复DNA的两个侧翼区域之间的感兴趣的DNA。当修复DNA仅由两个侧翼区域组成时，即缺少任何插入序列(感兴趣的DNA)，可以使用这种方法特异地缺失位于这两个同源区域之间的基因组区域。
有待插入的感兴趣的DNA还可以包括一种在插入后可以被或可以不被移除的可选择的或可筛选的标记，例如如描述于WO 06/105946、WO 08/037436或WO 08/148559中，用于促进潜在正确靶向事件的鉴定。同样地，编码DSBI酶的T-DNA也可以包括一种可选择的或可筛选的标记基因，该基因优选地不同于感兴趣的DNA中的标记基因，以允许在分离后进行(负或逆)选择。
如在此使用，“可选择的或可筛选的标记”具有其本领域通常的含义并且包括但不限于，植物可表达的草丁膦乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受EPSP酶、腈水解酶基因、突变型乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶基因、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、R-基因座基因、绿色荧光蛋白等。
将清楚的是，根据本发明的这些方法允许任何感兴趣的DNA的插入，这些感兴趣的DNA包括：包括具有具体核苷酸序列签名的核苷酸序列的DNA，例如用于随后的鉴定，或包括(可诱导的)增强子或沉默子的DNA，例如用于调节已存在的精英(elite)事件的表达。感兴趣的DNA还可以包括一种或多种植物可表达的感兴趣的基因，这些基因包括但不限于除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、非生物胁迫抗性基因、涉及油类生物合成或碳水化合物生物合成的酶、涉及纤维强度和/或纤维长度的酶、涉及次级代谢产物的生物合成的酶。
除草剂耐受性基因包括编码酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因。此类EPSPS基因的实例是鼠伤寒沙门杆菌的AroA基因(突变体CT7)(Comai(措美)等人，1983，Science(科学)221，370-371)，农杆菌属的CP4基因(Barry(巴里)等人，1992，Curr.TopicsPlant Physiol.(当代热带植物生理学)7，139-145，编码矮牵牛花EPSPS的基因(Shah(沙阿)等人，1986，Science(科学)233，478-481)，编码番茄EPSPS的基因(Gasser(加塞)等人，1988，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)263，4280-4289)，或编码蟋蟀草属EPSPS的基因(WO01/66704)。它还可以是如描述于例如EP 0837944、WO 00/66746、WO00/66747或WO 02/26995中的突变的EPSPS。草甘膦耐受性植物还可以通过表达一种基因获得，该基因编码如描述于美国专利号5,776,760和5,463,175中的草甘膦氧化还原酶。草甘膦耐受性植物还可以通过表达一种基因获得，该基因编码如描述于例如WO 02/36782、WO 03/092360、WO 05/012515和WO 07/024782中的草甘膦乙酰基转移酶。草甘膦耐受性植物还可以通过选择包含以上提到基因的天然发生突变的植物来获得，如描述于例如WO 01/024615或WO 03/013226中。赋予草甘膦耐受性的EPSPS基因描述于例如美国专利申请号11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774中。赋予草甘膦耐受性的其他基因，例如脱羧酶基因描述于例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中。
其他除草剂耐受性基因可以编码一种使除草剂脱毒的酶或者对抑制有抗性的突变型谷氨酰胺合酶，例如描述于美国专利申请号11/760,602中。一种此类有效脱毒酶是编码草丁膦乙酰转移酶(例如来自链霉菌属物种的bar或pat蛋白)的酶。草丁膦乙酰转移酶是例如描述于美国专利号5,561,236、5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810和7,112,665中。
除草剂耐受性基因还可以赋予对抑制酶羟基苯丙酮酸双氧化酶(HPPD)的除草剂的耐受性。羟基苯丙酮酸双氧化酶是催化其中对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐的反应的多种酶。可以用编码天然发生的抗HPPD酶的一种基因或编码突变的或嵌合的HPPD酶的一种基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物，如描述于WO 96/38567、WO99/24585以及WO 99/24586、WO 2009/144079、WO 2002/046387、或US 6,768,044中。还可以通过用编码某些使得能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管被HPPD抑制剂抑制了天然的HPPD酶。这样的植物和基因描述于WO 99/34008和WO02/36787中。还可以通过用除了一种编码HPPD耐受酶的基因之外的一种编码具有酶预苯酸脱氢酶(PDH)活性的基因转化植物来改进对HPPD抑制剂的耐受性，如描述于WO 2004/024928中。另外，可以通过向它们的基因组中添加编码够使HPPD抑制剂代谢或降解的酶(例如WO2007/103567和WO 2008/150473中示出的CYP450酶)的基因来使植物对HPPD抑制剂除草剂更具耐受性。
仍另外的除草剂耐受性基因编码变体ALS酶(也称为乙酰羟酸合成酶，AHAS)，如例如描述于Tranel(特瑞纳)和Wright(赖特)(2002，Weed Science(《杂草科学》)50:700-712)中，而且在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。硫酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生产描述于美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937、以及5,378,824、以及国际公开WO 96/33270中。其他的咪唑啉酮耐受性基因还描述于例如WO 2004/040012、WO 2004/106529、WO 2005/020673、WO 2005/093093、WO 2006/007373、WO 2006/015376、WO 2006/024351、以及WO 2006/060634中。另外的磺酰脲以及咪唑啉酮耐受性基因描述于例如WO 07/024782和美国专利申请号61/288958中。
昆虫抗性基因可以包括一种编码序列，该序列编码：
1)一种来自苏云金杆菌的杀昆虫晶体蛋白或其杀昆虫部分，例如由Crickmore(克里克莫尔)等人列举的杀昆虫晶体蛋白(1998，Microbiologyand Molecular Biology Reviews(微生物学和分子生物学综述)，62:807-813)，由(克里克莫尔)等人(2005)在苏云金杆菌毒素命名法中更新，联机在：
http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)，或其杀昆虫部分，例如Cry蛋白类Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白或其杀昆虫部分(例如EP1999141和WO 2007/107302)，或由如例如描述于美国专利申请号12/249,016中的合成基因编码的此类蛋白；或
2)一种来自苏云金杆菌的晶体蛋白或其部分，该部分在一个第二其他的来自苏云金杆菌的晶体蛋白或其部分的存在下是杀昆虫的，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白组成的二元毒素(Moellenbeck(默勒本克)等人，2001，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)19:668-72；Schnepf(史涅夫)等人2006，Applied Environm.Microbiol.(应用与环境微生物学)71,1765-1774)或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和EP 08010791.5)；或
3)一种包括来自苏云金杆菌的不同的杀昆虫晶体蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)的蛋白的杂交体或以上2)的蛋白的杂交体，例如由玉米事件MON89034(WO 2007/027777)生产的Cry1A.105蛋白；或
4)以上1)至3)中任一的蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化，例如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或
5)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的杀昆虫分泌蛋白或其杀昆虫部分，例如列举在：
http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html的营养期杀昆虫蛋白(VIP)，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白；或
6)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的一个第二分泌蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素(WO 94/21795)；或
7)一种包括来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)中的蛋白的一种杂交体或以上2)中的蛋白的一种杂交体；或
8)以上5)至7)中任一的蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化(尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白)，例如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或
9)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌的一种晶体蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F构成的二元毒素(美国专利申请号61/126083和61/195019)，或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白构成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和EP 08010791.5)；
10)以上9)的一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化(尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白)。
如在此使用，“昆虫抗性基因”，进一步包括转基因，这些转基因包含一个在表达时生产双链RNA的序列，该双链RNA被植物昆虫有害生物摄取时抑制这种昆虫有害生物的生长，如例如描述于WO2007/080126、WO 2006/129204、WO 2007/074405、WO 2007/080127和WO 2007/035650中。
非生物胁迫耐受性基因包括
1)在植物细胞或植物中能够减少聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的一种转基因，如描述于WO 00/04173、WO/2006/045633、EP 04077984.5或EP 06009836.5中。
2)能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或活性的一种转基因，如例如描述于WO 2004/090140中。
3)编码一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成通路的植物功能性酶的一种转基因，这些酶包括烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如例如描述于EP 04077624.7、WO 2006/133827、PCT/EP07/002433、EP 1999263或WO 2007/107326中。
涉及碳水化合物生物合成的酶包括描述于以下的那些，例如：EP0571427、WO 95/04826、EP 0719338、WO 96/15248、WO 96/19581、WO 96/27674、WO 97/11188、WO 97/26362、WO 97/32985、WO 97/42328、WO 97/44472、WO 97/45545、WO 98/27212、WO 98/40503、WO 99/58688、WO 99/58690、WO 99/58654、WO 00/08184、WO 00/08185、WO 00/08175、WO 00/28052、WO 00/77229、WO 01/12782、WO 01/12826、WO02/101059、WO 03/071860、WO 2004/056999、WO 2005/030942、WO2005/030941、WO 2005/095632、WO 2005/095617、WO 2005/095619、WO 2005/095618、WO 2005/123927、WO 2006/018319、WO 2006/103107、WO 2006/108702、WO 2007/009823、WO 00/22140、WO 2006/063862、WO 2006/072603、WO 02/034923、EP 06090134.5、EP 06090228.5、EP06090227.7、EP 07090007.1、EP 07090009.7、WO 01/14569、WO 02/79410、WO 03/33540、WO 2004/078983、WO 01/19975、WO 95/26407、WO96/34968、WO 98/20145、WO 99/12950、WO 99/66050、WO 99/53072、US 6,734,341、WO 00/11192、WO 98/22604、WO 98/32326、WO 01/98509、WO 01/98509、WO 2005/002359、US 5,824,790、US 6,013,861、WO94/04693、WO 94/09144、WO 94/11520、WO 95/35026或WO 97/20936，或涉及多聚果糖，尤其是菊粉和果聚糖型的生产的酶，如披露于EP0663956、WO 96/01904、WO 96/21023、WO 98/39460、和WO 99/24593中，如披露于WO 95/31553、US 2002031826、US 6,284,479、US 5,712,107、WO 97/47806、WO 97/47807、WO 97/47808和WO 00/14249中的α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于WO 00/73422中的α-1,6分支α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于例如WO 00/47727、WO 00/73422、EP 06077301.7、US5,908,975和EP 0728213的alternan的生产，如例如披露于WO2006/032538、WO 2007/039314、WO 2007/039315、WO 2007/039316、JP 2006304779、和WO 2005/012529中的透明质酸的生产。
提供包括修复DNA的T-DNA和包括DSBI酶编码基因的T-DNA的组合以及包括这两种DNA的双T-DNA载体(Ti或Ri质粒)以及提供包括T-DNA的组合或包括如在以上方法中所述的双T-DNA载体的农杆菌细胞和菌株也是本发明的一个实施例。包括以上T-DNA组合的植物或植物细胞也被涵盖在本发明内。
将领会的是，可以将本发明的方法应用于任何植物(被子植物纲或裸子植物纲)，包括但不限于，棉花、卡诺拉(canola)、油菜(oilseedrape)、大豆、蔬菜、马铃薯、浮萍属、烟草属、拟南芥、紫花苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、粟、豌豆、油菜(rape)、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、草坪草、小麦、芦笋、甜菜和糖甜菜、西兰花、卷心菜、胡萝卜、菜花、芹菜、黄瓜、茄子、生菜、洋葱、油菜、辣椒、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、南瓜、甘蔗、番茄、西葫芦、扁桃、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、蔓越橘、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙、番木瓜、西番莲果、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、橘子、核桃以及西瓜。
提供根据本发明的方法产生的植物细胞、植物部分以及植物也是本发明的一个目的，例如果实、种子、胚、生殖组织、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、花、纤维、维管组织、配子体、孢子体、花粉以及小孢子，其特征在于它们在基因组中包括一种具体修饰(插入、取代和/或缺失)。通过传统育种方法产生的包括DNA修饰事件的植物的配子、种子、胚(合子亦或体细胞的)、后代或杂合体也包括在本发明的范围内。此类植物可以包含插入在靶标序列处或替代靶标序列的感兴趣的DNA或可以缺失一种具体的DNA序列(甚至单个核苷酸)，并且与其祖先植物的区别将仅在于交换后这一异源DNA或DNA序列的存在或被具体缺失的序列(即预期的修饰)的不存在。
在一些实施例中，本发明的植物细胞，即包括T-DNA组合的植物细胞以及根据本发明的方法产生的包括预期的基因组修饰的植物细胞，可以是非繁殖细胞，或不能再生成植物的植物细胞，或不能经由光合作用通过从无机物(例如水、二氧化碳以及无机盐)合成碳水化合物和蛋白质来维持其生活的植物细胞。
通过在此描述的方法获得的植物可以进一步通过传统育种技术与其他植物杂交，以获得包括根据本发明获得的靶向DNA插入事件的后代植物。以此方式，还可以分离出编码DSBI酶的T-DNA。
本发明进一步提供了一种用于产生以下植物的方法，该植物在基因组的预定义位点处包括一种修饰，该方法包括使根据以上方法产生的植物与另一种植物或自身杂交并且任选地收获种子的步骤。
本发明进一步提供了一种用于生产饲料、食物或纤维的方法，该方法包括提供根据以上方法产生的植物群体并收获种子的步骤。
本发明进一步提供了一种用于生产棉籽或棉纤维的方法，该方法包括根据以上方法种植棉花植物并将所述种子或所述纤维与所述植物分离的步骤。
根据本发明的植物和种子可以进一步用化学化合物处理，例如如果对这样的一种化学品具有耐受性。
因此，本发明还提供了一种种植根据以上方法产生的植物的方法，该方法包括向所述植物或所述植物在其中生长的基质施用一种化学品的步骤。
进一步提供了一种在大田中种植植物的方法，该方法包括向根据以上方法产生的植物施用一种化学化合物的步骤。
还提供了一种生产处理的种子的方法，该方法包括向根据上述方法产生的植物的种子施用一种化学化合物(例如上述化学品)的步骤。
如在此使用，“包括”将被解释为指定如提及的陈述的特征、整体、步骤或组分的存在，但是并不预先排除一个或多个特征、整体、步骤或组分、或它们的组的存在或添加。因此，例如一种包括一个核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白可以包括比实际引用的一个序列更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在一个更大的核酸或蛋白中。一种包括功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包括另外的DNA区域等。
如在此使用，“植物部分”包括任何植物器官或植物组织，包括但不限于，果实、种子、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、花、配子体、孢子体、花粉以及小孢子。
出于本发明的目的，两个相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”(表示为一个百分数)是指在这两个最佳比对序列中的具有相同残基的位置的数目(×100)除以所比较的位置的数目。一个缺口(即一个比对中的一个位置，其中一个残基在一个序列中存在但是在另一个序列中不存在)被视为具有不相同残基的一个位置。通过Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)算法来实施这两个序列比对(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)1970)。可以使用标准软件程序(例如是部分的威斯康星软件包版本10.1(遗传学计算机组，麦迪逊(Madison)、威斯康星州(Wisconsin)，美国)的缺口(GAP)，使用具有空位创建罚分50和空位延伸罚分3的默认评分矩阵)方便地实施以上的计算机辅助序列比对。
如在此使用，核酸或核苷酸是指DNA和RNA两者。DNA还包括cDNA和基因组DNA。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以用化学方法合成或通过体外或甚至体内生物表达而产生。
将清楚的是，每当通过提及相应DNA分子的核苷酸序列来定义RNA分子的核苷酸序列时，该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应当由尿嘧啶(U)替换。是否指称DNA分子或RNA分子将从本申请的上下文显而易见。
以下非限制性实例描述了一种双T-DNA载体的构建，该载体包括编码DSBI酶的T-DNA和包含修复DNA的T-DNA，以及它们用于有效产生具有靶向基因组修饰的植物的用途。
除非在实例中另行说明，否则所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook(萨姆布鲁克)等人(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，纽约和在Ausubel(奥苏贝尔)等人，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行方案)，Current Protocols(现行方案)，美国中卷1和卷2的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy(克罗伊)撰写的Plant Molecular Biology Labfax(植物分子生物学实验)(1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)(BIOS科学出版有限公司(英国))和Blackwell Scientific Publications,UK(布莱克威尔科学出版物，英国)联合出版。其他用于标准分子生物技术的参考文献包括Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)(2001)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约，Brown(布朗)(1998)，Molecular Biology LabFax(分子生物学实验)，第二版，Academic Press(学术出版社)(英国)的卷I和II。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach(迪芬巴赫)和Dveksler(德福柯思乐)(1995)，PCR Primer：A LaboratoryManual(PCR引物：实验室手册)，冷泉港实验室出版社中，以及在McPherson(麦克弗森)等人(2000)，PCR-Basics:From Background至Bench(PCR基础：从背景到平台)，第一版，Springer Verlag(施普林格)，德国中找到。
在此提到的所有专利、专利申请和出版物，都出于所有目的通过引用以其全文结合在此。
包含在命名为“BCS12-2004-WO1_ST25”的文件中，为54千字节(大小如在微软视窗操作系统(Microsoft)中所测量)，包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11的11个序列的序列表通过电子提交特此归档并且通过引用结合在此。
将参照在此描述的这些实例进一步描述本发明；然而，应明白的是，本发明并不局限于这些实例。
序列表
贯穿本说明书和实例，对以下序列进行了引用：
SEQ ID NO.1：双T-DNA载体pCTV231的核苷酸序列
SEQ ID NO.2：双T-DNA载体pTCV237的核苷酸序列
SEQ ID NO.3：COT5/6识别序列
SEQ ID NO.4：包括COT5/6识别位点的棉花基因组序列
SEQ ID NO.5：PCR引物IB527
SEQ ID NO.6：PCR引物IB616
SEQ ID NO.7：PCR引物IB589
SEQ ID NO.8：PCR引物VDS382
SEQ ID NO.9：PCR引物IB588
SEQ ID NO.10：PCR引物IB303
SEQ ID NO.11：PCR引物IB624
实施例
实施例1：载体构建
使用标准分子生物学技术，产生双T-DNA载体pCV231(SEQ ID NO.1)，该载体在T-DNA边界之间包括含有2mEPSPS和Pf-HPPD-W336的修复DNA，并且在另一对T-DNA边界之间包括大范围核酸酶COT-5/6基因(图1a)：
·修复T-DNA：
o RB(nt 189至222)：来自根癌农杆菌的T-DNA的右边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
o 3’histonAt(nt 928至262)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o hppdPfW336-1Pa(nt 2021至945)：通过用色氨酸替代氨基酸甘氨酸336而修饰的荧光假单胞菌菌株A32的4-羟苯基丙酮酸双氧化酶基因的编码序列(Boudec(布达科)等人，1999)，适于棉花密码子使用。
o TPotpY-1Pa(nt 2393至2024)：最佳化转运肽衍生物的编码序列(位置55变为Tyr)，包含玉米(Zea mays，corn)和向日葵(Helianthus annuus，sunflower)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun(莱布伦)等人，1996)，适于棉花密码子使用。
o PCsVMV XYZ(2914至2402)：包括木薯脉花叶病毒的启动区的序列(Verdaguer(维达格尔)等人，1996)。
o Ph4a748(nt 3013-3929)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的启动区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o内含子1h3At(nt 3969至4434)：拟南芥的组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子(Chaubet(考贝特)等人，1992)。
o TPotpC(nt 4448至4819)：最佳化转运肽的编码序列，包含玉米(Zea mays，corn)和向日葵(Helianthus annuus，sunflower)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun(莱布伦)等人，1996)。
o 2mepsps(nt 4820至6157)：玉米(Zea mays，corn)的双突变型5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因的编码序列(Lebrun(莱布伦)等人，1997)。
o 3’histonAt(nt 6178至6844)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o LB(nt 6929至6952)：来自根癌农杆菌的T-DNA的左边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
·COT5/6大范围核酸酶T-DNA：
o LB(nt 9211-9188)：来自根癌农杆菌的T-DNA的左边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
o P35S2c(片段)(9236至9594)：P35S2c(片段)比P35S2c短123bp。
o P35S2c(nt 9236-10078)：包括来自花椰菜花叶病毒35S转录物的启动区的序列。
o COT-5/6-SC(nt 10085至11167)：来自Precision BioScience(精密生物科学)的识别COT-5/6识别位点5’TAAAATTATTTACAAGTGTTTA的单链的定制的大范围核酸酶。
o 3’nos(nt 11168至11427)：sequence including the 3’untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA ofpTiT37(Depicker et al.,1982)包括来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’非翻译区的序列(Depicker(戴皮克尔)等人，1982)。
o RB(nt 11517-11493)：来自根癌农杆菌的T-DNA的右边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
使用这一pTCV231载体转化农杆菌菌株A5891(＝C58C1Rif(pTiEHA101))。
实施例2：使用农杆菌转化棉花
将在其核基因组中包含COT5/6靶标序列5’TAAAATTATTTACAAGTGTTTA(SEQ ID NO.3)的靶标株系的脆弱棉花胚性愈伤组织(EC)收集在100基质上并且在具有100μM乙酰丁香酮(AS)的M100基质(pH 5.2)中的5×108细胞/ml的农杆菌悬液液中浸没20’。
在黑暗中、在24℃下、在具有1/2浓度的MS盐(pH 5.2)的M100上与100μM AS和100mg/L L-半胱氨酸共培养3天后，将EC作为小堆转移在M100基质(pH 5.8)上，250mg/L羧噻吩青霉素(triacillin)和1mM草甘膦作为选择剂并且在弱光下、在28℃下进行孵育。
实施例3：靶向插入事件的鉴定
在这一基质(具有125或250mg/L羧噻吩青霉素和1mM草甘膦的M100(pH 5.8))上的若干继代培养后，选择草甘膦抗性愈伤组织。在以此方式获得的575个草甘膦抗性愈伤组织上，使用Expand High FidelityPCR System(罗氏(Roche))进行高通量PCR筛选，以鉴定候选堆叠(stacked)事件(参见图1)，从而鉴定了8个假定的靶向插入事件(～1.4％)，即修复DNA已经被整合进靶标COT5/6识别位点的事件(表1)。
表1：对具有假定的靶向插入事件的愈伤组织的PCR分析的概述指示了获得的扩增子长度(bp)/引物对(括号之间指示理论长度，nd＝未确定，-＝未获得产物，*＝弱产物)。对于引物的位置和理论扩增子长度的示意性图示，参见图1a。
接下来，在候选靶向插入事件上进行序列分析，以证实它们的确是堆叠事件(参见图2)。归因于修复T-DNA缺少可以指导通过同源重组的精确整合的同源区的事实，尽管在靶标植物基因组与插入片段之间的转换中存在一些变化，但是由序列数据清楚的是，在分析的每个事件中，修复DNA的确已经被插入进COT5/6识别位点中。这主要在没有COT5/6T-DNA的共整合的情况下发生，因为获得的PCR产物的长度在很大程度上对应于基于T-DNA精确整合进COT5/6识别位点中所理论预期的长度(大得多的片段可以指示COT5/6T-DNA的偶然性共整合)。
具有靶向插入事件的愈伤组织生长为植物并且将进一步杂交，以评估COT5/6基因的分离。
当使用粒子轰击进行类似实验，用于共递送如上所述的修复DNA和大范围核酸酶编码基因时(但是其中修复DNA另外包含用于经由同源重组而插入的同源区)，获得了2065个草甘膦抗性事件，发现其中的31是正确靶向插入事件(～1.5％)。因此，使用双T-DNA载体，靶向插入的频率可以被改善至与使用直接DNA转移方法可以获得的类似的效率。
实施例4：在序列同源性存在下的双链DNA断裂修复
构建与以上类似的载体(pTCV237，由SEQ ID NO 2表示)，但是其中修复T-DNA在有待插入的DNA区域的一侧或两侧另外包括侧翼区域(即侧翼于HPPD和2mEPSPS基因簇但是在T-DNA边界内)，这些侧翼区域分别与预选位点的上游和/或下游区域具有同源性，该载体包括以下可操作连接的片段：
·修复T-DNA：
o RB(nt 189至222)：来自根癌农杆菌的T-DNA的右边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
o FGD COT5/6ds(nt 1804至254)：对应于COT5/6识别位点的基因组DNA下游的3’侧翼区域。
o 3’histonAt(nt 2547至1887)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o 2mepsps(nt 3908至2571)：玉米(Zea mays，corn)的双突变型5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因的编码序列(Lebrun(莱布伦)等人，1997)。
o TPotpC(nt 4280至3909)：最佳化转运肽的编码序列，包含玉米(Zea mays，corn)和向日葵(Helianthus annuus，sunflower)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun(莱布伦)等人，1996)。
o内含子1h3At(nt 4749至4287)：拟南芥的组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子(Chaubet(考贝特)等人，1992)。
o Ph4a748(nt 5715至4799)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的启动区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o 3’histonAt(nt 6459至5799)：包括拟南芥的组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté(查布特)等人，1987)。
o hppdPfW336-1Pa(nt 7561至6485)：通过用色氨酸替代氨基酸甘氨酸336而修饰的荧光假单胞菌菌株A32的4-羟苯基丙酮酸双氧化酶基因的编码序列(Boudec(布达科)等人，1999)，适于棉花密码子使用。
o TPotpY-1Pa(nt 7933至7562)：最佳化转运肽衍生物的编码序列(位置55变为Tyr)，包含玉米(Zea mays，corn)和向日葵(Helianthus annuus，sunflower)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun(莱布伦)等人，1996)，适于棉花密码子使用。
o 5’cab22L(nt 8003至7935)：包括矮牵牛的叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的序列(Harpster(哈皮斯特尔)等人，1988)。
o P35S2(nt 8421至8004)：P35S2启动子序列。
o FGD上游COT5/6us(nt 10523至8465)：对应于COT5/6识别位点的基因组DNA下游的5’侧翼区域。
o LB(nt 10550至10573)：来自根癌农杆菌的T-DNA的左边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
·COT5/6大范围核酸酶T-DNA：
o LB(nt 12832至12809)：来自根癌农杆菌的T-DNA的左边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
o P35S2c(片段)(12857至13215)：P35S2c(片段)比P35S2c短123bp。
o P35S2c(nt 13218至13699)：包括来自花椰菜花叶病毒35S转录物的启动区的序列。
o COT-5/6-SC(nt 13706至14788)：来自Precision BioScience(精密生物科学)的识别COT-5/6识别位点5’-TAAAATTATTTACAAGTGTTTA-3’(SEQ ID NO.3)的单链的定制的大范围核酸酶。
o 3’nos(nt 14789至15048)：sequence including the 3’untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA ofpTiT37(Depicker et al.,1982)包括来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’非翻译区的序列(Depicker(戴皮克尔)等人，1982)。
o RB(nt 15138至15114)：来自根癌农杆菌的T-DNA的右边界重复序列(Zambryski(赛姆布拉斯)，1988)。
将这一载体转化进农杆菌中并且随后将所得农杆菌菌株用于转化来自靶标株系的棉花细胞，将其进一步如上所述培养并选择。从草甘膦抗性愈伤组织当中，如上所述通过PCR和序列分析鉴定堆叠事件(也参见图1b)。
在以此方式获得的1167个草甘膦抗性愈伤组织上，使用Expand HighFidelity PCR System(扩展型高保真PCR系统)(罗氏)进行高通量PCR筛选，以鉴定候选堆叠(stacked)事件(参见图1b)，从而鉴定了总计70个假定的靶向插入事件(～6.0％)，即修复DNA已经被整合进靶标COT5/6识别位点的事件(表1)，如通过PCR用引物对IB527x IB624所确定(形成2679bp的产物)。用引物对IB527x IB616的另外的2992bp的PCR产物指示还存在非修饰靶标(即嵌合事件)，而其不存在指示纯粹的堆叠事件(参见表2)。
表2：对每引物对获得的假定的靶向插入事件的愈伤组织的PCR分析的概述(括号之间指示理论长度)。对于引物的位置和理论扩增子长度的示意性图示，参见图1b。

Claims (23)

1.一种用于在一个预选位点处修饰植物细胞的基因组的方法，该方法包括以下步骤：
a.使一种植物细胞与一种细菌接触，该细菌能够指导来自所述细菌的确定的DNA分子转移进所述植物细胞的基因组中，所述细菌包括
i.一种第一确定的DNA分子，该分子包括一种编码植物功能性DSBI酶的嵌合基因，所述DSBI酶能够在位于所述预选位点处或其附近的识别位点处识别并诱导双链DNA断裂，所述嵌合基因包括以下可操作连接的元件：
1.一种植物可表达的启动子；
2.一个编码DSBI酶的DNA区域；
3.一个植物功能性3’终止和多聚腺苷酸化区域；以及
ii.一种第二确定的DNA分子，该分子包括一种用作修复所述双链DNA断裂的模板的修复DNA分子；
b.选择一种植物细胞，其中所述修复DNA已经被用作修复该双链DNA断裂的模板，所述双链DNA断裂的所述修复导致在所述预选位点处的所述基因组的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的替代；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i.-iii.的任何组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述两种确定的DNA分子被包括在同一载体中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述确定的DNA分子是一种T-DNA分子。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细菌选自下组，该组由以下各项组成：农杆菌属，根瘤菌属，中华根瘤菌属，中慢生根瘤菌属，叶杆菌属，苍白杆菌属，慢生根瘤菌属，固氮菌属，菱形藻属，克雷伯氏菌属以及红螺菌属。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌是根癌农杆菌。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述植物细胞被包括在一种来自植物种子、幼苗、下胚轴、子叶、不成熟的合子胚、叶、花药、花瓣、胚珠、根、分生组织、干细胞、叶柄、愈伤组织或细胞悬浮液的外植体中，优选来自下胚轴或胚性愈伤组织的外植体中，并且该外植体与所述细菌接触。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述DSBI酶是非天然发生的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述修复DNA分子包括一种感兴趣的DNA分子。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的DNA分子包括一个或多个感兴趣的植物可表达的基因。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的植物可表达的基因选自下组：除草剂耐受性基因，昆虫抗性基因，疾病抗性基因，非生物胁迫抗性基因，涉及油类生物合成、碳水化合物生物合成的酶，涉及纤维强度或纤维长度的酶，涉及次级代谢产物的生物合成的酶。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述修复DNA分子包括一个或两个侧翼于感兴趣的DNA分子的侧翼核苷酸序列，所述一个或两个侧翼核苷酸序列与所述预选位点的上游和/或下游基因组DNA具有足够同源性以允许与所述上游和/或下游DNA区域重组。
12.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述修复DNA分子由两个侧翼核苷酸序列组成，所述侧翼核苷酸序列之一与所述预定义位点的上游DNA区域具有足够同源性，另一侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游DNA区域具有足够同源性，以允许在所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二确定的DNA分子进一步包括一种可选择的或可筛选的标记基因。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，包括另外的使所述选择的植物细胞生长为植物的步骤。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述DSBI酶编码基因和所述修饰遗传地在再生自所述选择的植物细胞的植物的后代中分离。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述植物细胞或植物是一种棉花植物细胞或棉花植物。
17.一种DNA载体，包括如在权利要求1至13任一项中所描述的一种第一和一种第二确定的DNA分子。
18.如权利要求17所述的DNA载体，其中所述确定的DNA分子能够被一种细菌转移进植物细胞的基因组中。
19.一种细菌，能够指导来自所述细菌的确定的DNA分子转移进植物细胞的基因组中，所述细菌包括如在权利要求1至13任一项中所描述的第一和第二确定的DNA分子。
20.如权利要求19所述的细菌，该细菌选自下组，该组由以下各项组成：农杆菌属，根瘤菌属，中华根瘤菌属，中慢生根瘤菌属，叶杆菌属，苍白杆菌属，慢生根瘤菌属，固氮菌属，菱形藻属，克雷伯氏菌属以及红螺菌属。
21.如权利要求19或20所述的细菌，该细菌是根癌农杆菌。
22.一种根据权利要求1至16中任一项所述的方法产生的在基因组的预定义位点处包括一种修饰的植物细胞或植物，或其植物部分、纤维、种子或繁殖材料。
23.如权利要求18或19所述的DNA载体或如权利要求19至22中任一项所述的细菌用于在预选位点处修饰植物细胞的基因组的用途。
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