BR9910408B1

BR9910408B1 - mÉtodo para produÇço de uma planta transgÊnica que exibe um teor de amido aumentado, uso de molÉculas de Ácido nucleico que codifica um translocador de atp/adp plastidial, e metodo de produÇço de um amido modificado.

Info

Publication number: BR9910408B1
Application number: BRPI9910408-3A
Authority: BR
Inventors: Ekkehard Neuhaus; Torsten Moehlmann; Karl-Heinz Graeve-Kampfenkel; Joachim Tjaden; Jozef Schell; Norbert Martini
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2012-03-06
Also published as: HUP0200074A3; DE59913709D1; US6891088B1; HUP0200074A2; JP2002514412A; CA2328394C; EP1078088B1; PL197407B1; JP4494634B2; WO1999058654A2; HU228219B1; BR9910408A; AU4261099A; ATE334212T1; CN1309834C; EP1078088A2; PL344751A1; CA2328394A1; CN1306578A; WO1999058654A3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA QUE EXIBE UM TEOR DE AMIDO AUMENTADO, USO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NU- CLÉICO QUE CODIFICA UM TRANSLOCADOR DE ATP/ADP PLASTIDI- AL, E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM AMIDO MODIFICADO".

A presente invenção se refere a células de planta e plantas transgênicas com atividade translocadora de ATP/ADP plastidial. Tais célu- las de planta exibem um rendimento aumentado, de preferência um teor de amido e/ou de óleo aumentado, e sintetizam de preferência um amido com teor de amilose aumentado.

Além disso, a presente invenção refere-se a plantas e células de planta transgênicas com uma atividade translocadora de de ATP/ADP au- mentada. Tais células e plantas sintetizam um amido com teor de amilose diminuído.

No campo de agricultura e silvicultura têm havido tentativas permanentes para prover plantas com um rendimento aumentado, a fim de se assegurar o fornecimento de alimento da população mundial permanen- temente crescente e para garantir o fornecimento de matérias-primas rege- neradoras. Tradicionalmente, foi tentado se obter plantas de alto rendimento por reprodução. Isto, no entanto, é consumidor de tempo e dispendioso. A- lém do mais, programas de reprodução correspondentes têm de ser realiza- dos para cada espécie de planta de interesse.

Progresso foi feito, parcialmente, por manipulação genética de plantas, isto é, por expressão e introdução intencional de moléculas de áci- do nucléico recombinantes em plantas. Abordagens daquela espécie têm a vantagem que elas são, em geral, não-limitadas a uma espécie de planta mas também podem ser transferidas para outra espécie de planta.

Na EP-A 0 511 979, por exemplo, foi descrito que a expressão de uma sintetase de asparagina procariótica em células de planta leva a uma produção de biomassa aumentada, entre outras. A WO 96/21737 des- creve, por exemplo, o aumento no campo de plantas por expressão de fru- tose-1,6-bisfosfatase desregulada ou não-regulada devido ao aumento na taxa de fotossíntese. No entanto, há ainda uma necessidade de métodos geralmente aplicáveis para o aperfeiçoamento do rendimento em plantas interessantes para a agricultura ou silvicultura.

Além do mais, com referência ao fato de que substâncias conti- das em plantas desempenham um papel mais e mais importante como fon- tes renováveis de matéria-prima, um dos problemas em pesquisa biotecno- lógica é o ajuste das ditas matérias-primas vegetais para as necessidades da indústria de processamento. A fim de permitir aplicação de matérias- primas regeneradoras em tanto campos quanto possíveis é além do mais necessária para se conseguir uma ampla faixa de substâncias a fim de au- mentar a eficácia da produção de fontes renováveis de matéria-prima a par- tir de plantas.

Além das gorduras e proteínas, óleos e polissacarídeos são as matérias-primas vegetais regeneradoras essenciais. Um papel central com os polissacarídeos, além da celulose, é desempenhado pelo amido que é uma das substâncias de reserva mais importante em plantas superiores. Entre aquelas, batata e milho, em particular, são plantas interessantes uma vez que elas são plantas cultivadas importantes para a produção de amido.

O amido de polissacarídeo que é uma das substâncias de reser- va mais importante no mundo vegetal é, além do seu uso na indústria ali- mentícia, amplamente usado como matéria-prima de regeneração para a produção de produtos industriais.

A indústria de amido tem um grande interesse em plantas com teor de amido aumentado que, por via de regra, significa um peso seco au- mentado. Um peso seco aumentado aumenta o valor das plantas processa- das na indústria de amido (milho, batata, tapioca, trigo, cevada, arroz etc.) devido ao campo aumentado. Além disso, órgãos ou células de planta con- tendo quantidades mais altas de amido oferecem vantagens para o proces- samento na indústria alimentícia uma vez que eles absorvem menos gordura ou óleo de fritura e, assim, levam a produtos "mais saudáveis" com teor ca- lórico reduzido. A dita propriedade é de grande importância, por exemplo, na produção de pipoca, flocos de milho a partir de milho ou cascas, "crisps" ou batatas fritas a partir de batatas.

Para a indústria que processa amido de batata o peso seco (teor de amido) é um tamanho crucial uma vez que ele determina os custos de processamento. Um peso seco aumentado (teor de amido) significa, que com o mesmo rendimento, o teor de água do tubérculo de batata é reduzido.

O teor de água reduzido leva a custos de transporte reduzidos e a uma re- dução do período de cozimento exato necessário no cozimento.

Portanto, parece desejável prover plantas e células de planta transgênicas que exibem um teor de amido aumentando bem como métodos para a produção de tais plantas e células de planta. Além do mais, parece desejável prover amidos cujo teor de amilose e amilopectina satisfaçam as necessidades da indústria de processamento. Neste contexto, tanto amidos com um teor de amilose aumentado quanto amidos com um teor de amilose reduzido são de interesse uma vez que eles são particularmente adequados para cada um dos usos especiais.

Assim, um problema subjacente da presente invenção é prover plantas e células de planta que, em comparação com plantas de tipo selva- gem e células de planta de tipo selvagem não-modificas, exibam um rendi- mento aumentado de preferência de óleo e/ou amido e/ou sintetizem um amido com um teor de amilose modificado.

Este problema é resolvido pela provisão das modalidades carac- terizadas nas reivindicações.

Assim, a presente invenção se refere a células de planta trans- gênicas que são geneticamente modificadas, em que a modificação genéti- ca é a introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena cuja presen- ça ou expressão leva a um aumento na atividade translocadora de ATP/ADP plastidial nas células trangênicas em comparação com células de planta não modificadas geneticamente correspondentes oriundas de plantas de tipo selvagem.

Neste contexto, a modificação genética pode ser qualquer modi- ficação genética que leva a um aumento na atividade translocadora de ATP/ADP plastidial. Uma possibilidade, por exemplo, é a assim chamada "ativação in situ", em que a modificação genética é uma mudança de regi- ões reguladoras dos ditos genes. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por meio de introdução de um promotor muito forte à frente dos genes cor- respondentes, por exemplo, por meio de recombinação homóloga.

Além disso, há a possibilidade de aplicar o método da assim chamada "etiquetagem de ativação" (activation tagging) (cf., por exemplo, Walden e outros, Plant J. (1991), 281-288; Walden e outros, Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528). O dito método é baseado na ativação de promotores endógenos por meio de elementos aumentadores tal como o aumentador do promotor de RNA 35S do vírus de mosaico de couve-flor ou o aumentador de sintase de octopina.

Em uma modalidade preferida a modificação genética compre- ende, no entanto, a introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial para dentro do genoma da célula de planta.

O termo "transgênico", portanto, significa que a célula de planta da invenção contém pelo menos uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial estavelmente integrado no genoma, de preferência uma molécula de ácido nucléico.

O termo "molécula de ácido nucléico exógena" de preferência significa uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína com a atividade biológica de um translocador de ATP/ADP plastidial e ou não ocor- re naturalmente em células de planta correspondentes ou não ocorre natu- ralmente na ordem especial precisa nas células de planta ou que está Iocali- zada em um lugar no genoma da célula de planta onde não ocorre natural- mente. De preferência, a molécula de ácido nucléico exógena é uma molé- cula recombinante que consiste de vários elementos e cuja combinação ou disposição especial específica não ocorre naturalmente em células de plan- ta. As células de planta transgênicas da invenção contêm pelo menos uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com a ativi- dade biológica de um translocador de ATP/ADP plastidial, em que a dita mo- lécula de ácido nucléico de preferência está ligada com elementos de DNA reguladores que asseguram a transcrição em células de planta, em particu- lar com um promotor.

Em princípio, a molécula de ácido nucléico exógena pode ser qualquer molécula de ácido nucléico que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial que, depois da expressão, está localizado na membrana interna dos plastídios. Neste contexto, um translocador de ATP/ADP plasti- dial é uma proteína que catalisa o transporte de ATP para dentro dos plastí- dios e de ADP para fora dos plastídios. Tais moléculas de ácido nucléico são conhecidas, por exemplo, de Arabidopsis thaliana (Kampfenkel e outros, FEBS Lett. 374 (1995), 351-355; Genebank Acc. N0 X94626, SEQ ID NO: 7 e Acc. N0 Z49227, SEQ ID NO: 5) ou de batata (Genebank Acc. N0 Y10821). Por meio das ditas moléculas de ácido nucléico conhecidas a pessoa versa- da na técnica pode isolar seqüências correspondentes de outros organis- mos, particularmente aqueles vegetais, de acordo com os métodos padrão, por exemplo, por triagem heteróloga. Em particular, moléculas de ácido nu- cléico de não-vegetais podem ser usadas, também, que codificam um trans- locador de ATP/ADP e estão ligadas com uma seqüência alvo que assegura a localização na membrana de plastídio interna. Neste contexto, por exem- plo, um translocador de ATP/ADP é conhecido de Rickettsia prowazekii (Wil- liamson e outros, Gene 80 (1989), 269-278) e de Chlamydia trachomatis.

Em uma modalidade preferida a molécula de ácido nucléico e- xógena codifica uma forma de translocador de ATP/ADP plastidial Arabidop- sis thaliana, em particular a proteína AATP1 (SEQ ID NO: 6) descrita em Kampfenkel e outros (1995, loc. cit).

As células da invenção podem ser distingüidas de células de planta de ocorrência natural entre outras, pelo fato de que elas contêm uma molécula de ácido nucléico exógena que não ocorre naturalmente nas ditas células ou pelo fato de que a dita molécula é integrada em um lugar no ge- noma da célula onde não ocorre naturalmente, isto é, em um outro ambiente genômico. Além disso, as ditas células de planta transgênicas da invenção podem ser diferenciadas de células de planta de ocorrência natural pelo fato de que elas contêm pelo menos uma cópia da molécula de ácido nucléico exógena estavelmente integrada em seu genoma, opcionalmente além das cópias da dita molécula de ocorrência natural nas células. Se a(s) molécu- la(s) de ácido nucléico introduzida(s) para dentro das células é/são uma co- piais) adicional(is) de moléculas de ocorrência natural nas células, as célu- las de planta da invenção podem ser diferenciadas de células de planta de ocorrência natural particularmente pelo fato de que cópia(s) adicional(is) es- tá/estão localizada(s) em lugares no genoma onde ela(elas)/não ocorre(m) naturalmente. Isto pode, por exemplo, ser determinado por meio de uma análise de Southern blot.

As células de planta da invenção podem ulteriormente ser dife- renciadas de células de planta de ocorrência natural de preferência por pelo menos uma das seguintes características: se a molécula de ácido nucléico é heteróloga com relação à célula de planta, as células de planta transgênicas exibem transcritos da molécula de ácido nucléico introduzidos, que podem ser detectados por, por exemplo, análise de Northern blot. De preferência, as células de planta da invenção contêm uma proteína que é codificada por uma molécula de ácido nucléico introduzida. Isto pode ser detectado por, por exemplo, métodos imunológicos, particularmente, por análise de Wes- tern blot.

Se a molécula de ácido nucléico é homóloga em relação à célula de planta, as células da invenção podem ser diferenciadas das células de ocorrência natural, devido à expressão adicional das moléculas de ácido nucléico exógenas introduzidas. De preferência, as células de planta trans- gênicas contêm mais transcritos das moléculas de ácido nucléico exógenas.

Isto pode ser detectado por, por exemplo, análise de Northern blot.

O termo "geneticamente modificado" significa que a célula de planta é modificada em sua informação genética pela introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena e que a presença ou a expressão da molécula de ácido nucléico exógena leva a uma mudança fenotípica. Neste contexto, mudança fenotípica de preferência significa uma mudança mensu- rável de uma ou mais funções das células. Por exemplo, as células de plan- ta geneticamente modificadas da invenção exibem um aumento na atividade de um translocador de ATP/ADP plastidial devido à presença ou na expres- são da molécula de ácido nucléico exógena introduzida.

No contexto da presente invenção o termo "aumento na ativida- de" significa um aumento da expressão de um gene translocador de ATP/ADP plastidial, um aumento em uma quantidade de proteína transloca- dora de ATP/ADP plastidial e/ou um aumento na atividade de um transloca- dor de ATP/ADP plastidial nas células.

O aumento na expressão pode, por exemplo, ser determinado por medição da quantidade de transcritos que codificam translocador de ATP/ADP, por exemplo, por meio de análise de Northern blot. Neste contex- to, um aumento de preferência significa um aumento na quantidade de transcritos em comparação com células não-geneticamente modificadas cor- respondentes por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, particularmente por pelo menos 50% e particularmente preferido por pelo menos 75%. O aumento na quantidade de proteína translocadora de ATP/ADP pode, por exemplo, ser determinado por análise de Western blot. Neste contexto, um aumento de preferência significa um aumento na quan- tidade de proteína translocadora de ATP/ADP plastidial em comparação com células não-geneticamente modificadas correspondentes por pelo me- nos 10%, de preferência por pelo menos 20%, particularmente por pelo me- nos 50% e particularmente preferido por pelo menos 75%.

A atividade do translocador de ATP/ADP plastidial pode ser de- terminada, por exemplo, por isolamento dos plastídios do tecido correspon- dente e determinação do Vmax- valores de importação de ATP por meio do método de filtração de óleo de silicone. A purificação de vários tipos de plas- tídios é descrita em, por exemplo, Neuhaus e outros (Biochem. J. 296 (1993), 395-401). O método de filtração de óleo de silicone é descrito, por exemplo, em Quick e outros (Plant Physiol. 109 (1995), 113-121).

Surpreendentemente verificou-se que com plantas contendo as ditas células de planta com atividade aumentada do translocador de ATP/ADP plastidial, o rendimento de biomassa e/ou teor de substâncias é aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem não modificadas correspondentes. Verificou-se, por exemplo, que o teor de óleo e/ou o teor de amido nas plantas de acordo com a invenção é aumentado e/ou que também o teor de amilose destes amido é aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem não modificadas.

Neste contexto, o termo "planta de tipo selvagem" se refere a plantas que servem como material de partida para a produção das plantas descritas, isto é, plantas das quais a informação genética - além da modifi- cação genética introduzida - é idêntica à informação genética de uma planta da invenção.

O termo "rendimento aumentado" significa que a porção de substâncias de conteúdo, de preferência amido ou óleo nas células de plan- ta da invenção é aumentado por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, mais de preferência por pelo menos 30%, e mais de preferên- cia por pelo menos 40% em comparação com células de planta de plantas de tipo selvagem não modificadas.

O termo "teor de amido aumentado" significa que a porção de amido em células de planta de acordo com a invenção é aumentada por pe- lo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, mais de preferência por pelo menos 30% e mais de preferência por pelo menos 40% em compara- ção com células de planta de plantas de tipo selvagem não modificadas.

A determinação da porção de amido é realizada de acordo com os métodos descritos nos exemplos anexos.

O termo "teor de amilose aumentado" significa que o teor de amilose do amido sintetizado nas células de planta da invenção é aumenta- do por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, mais de prefe- rência por pelo menos 30%, e mais de preferência por pelo menos 40% em comparação com células de planta de plantas de tipo selvagem não modifi- cadas.

O teor de amilose é determinado por realização dos métodos descritos nos exemplos anexos.

Como mencionado acima, o translocador de ATP/ADP plastidial é uma proteína de transporte que está localizada na membrana interna dos plastídios (Heldt e outros, FEBS Lett. 5 (1969), 11-14: Pozueta-Romero e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 88 (1991), 5769-5773; Neuhaus, Plant Physiol. 101 (1993) 573-578; Schünemann e outros, Plant Physiol. 103 (1993), 131-137) e que catalisa o transporte de ATP para dentro do plastí- dios e de ADP para fora dos plastídios. Assim, o translocador de ATP/ADP plastidial provê o estroma com ATP citosólico.

Kampfenkel e outros (FEBS Lett. 374 (1995), 351-355) foram os primeiros a isolar um cDNA que codifica um translocador de ATP/ADP (A- ATP1) de Arabidopsis thaliana (Neuhaus e outros, Plant J. 11(1997), 73-82) e que exibem uma grande similaridade (66,2% de similaridade) ao translo- cador de ATP/ADP da bactéria gram-negativa Rickettsia prowazekii. O cDNA de AATP1 (SEQ ID NO: 5) oriundo de A. thaliana codifica uma proteína (SEQ ID NO: 6) fortemente hidrofóbica que consiste de 589 aminoácidos que exibem 12 hélices de transmembrana potenciais (Kampfenkel e outros, FEBS Lett. 374 (1995), 351-355). O dito cDNA poderia ser funcionalmente expresso em levedura de padeiro e E. coli. Depois da extração da proteína e reconstituição em proteolipossomas um aumento na taxa de transporte de ATP poderia ser determinado (Neuhaus e outros, Plant J. 11 (1997), 73-82). Por meio de anticorpos contra um fragmento de peptídeo do AATP1 oriundo de A. thaliana poderia ser demonstrado que o translocador de ATP/ADP AATP1 está localizado na membrana de envelope de cloroplasto interna (Neuhaus e outros, Plant J. 11(1997), 73-82).

A função do translocador de ATP/ADP plastidial para o metabo- lismo de planta não poderia ser definitivamente clarificada até agora. Várias funções foram levadas em consideração, por exemplo, que o fornecimento do estroma com ATP citosólico poderia ter uma influência sobre a importa- ção de proteínas para dentro dos plastídios, sobre a biossíntese de aminoá- cido, sobre o metabolismo de ácido graxo ou sobre o metabolismo de amido (Flügge e Hinz, Eur. J. Biochem. 160 (1986), 563-570; Tetlow e outros, Plan- ta 194 (1994), 454-460; Hill e Smith, Planta 185 (1991), 91-96; Kleippinger- Sparace e outros, Plant Physiol. 98 (1992), 723-727).

O fato de que um aumento na atividade do translocador de ATP/ADP plastidial leva a um aumento no teor de amido nas plantas trans- gênicas correspondentes foi, no entanto, totalmente surpreendente. Igual- mente supreendente foi a constatação que o aumento na atividade do trans- locador de ATP/ADP plastidial tem um efeito sobre a composição molecular do amido produzido. O amido oriundo de tubérculos de plantas de batata de acordo com a invenção, por exemplo, exibe um teor de amilose aumentado em comparação com amidos oriundos de tubérculos de plantas de batata não transformadas.

Até agora, foi admitido que as propriedades moleculares de a- mido são exclusivamente determinadas pela interação de enzimas de sinte- tização de amido, tais como as enzimas de ramificação (E.C. 2.4.1.18), as sintases de amido (E.C. 2.4.1.21) e a pirofosforilase de glicose de ADP (E.C. 2.7.7.27). O fato de que a expressão de uma proteína de transporte plastidi- al tem uma influência sobre a estrutura do amido é, no entanto, totalmente supreendente.

As células de planta da invenção podem ser derivadas de quaisquer espécies de planta, isto é, tanto de plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. De preferência as células de planta são de plantas de colheita de agricultura, isto é, de plantas cultivadas por seres humanos para a finalidade de nutrição ou para as finalidades técnicas, particularmente industriais. Em geral preferidas são células de planta de plantas de sinteti- zação de óleo e/ou de amido ou de armazenagem de óleo e/ou de amido. Assim, a invenção de preferência se refere a células de planta de plantas de armazenagem de amido ou de sintetização de amido tais como cereais (centeio, cevada, aveia, trigo, milho miúdo, sagu etc.), arroz, ervilhas, milho, ervilha medular, aipim, batata, colza, soja, cânhamo, linho, girassol ou vege- tais (tomate, chicória, pepino, salada etc.). Células de planta oriundas de batata, girassol, soja, arroz são preferidas. Particularmente preferidas são células de planta oriundas de milho, trigo, colza e arroz.

Além do mais, o objeto da invenção são plantas transgênicas contendo as células de planta transgênicas descritas acima. As ditas plantas podem ser produzidas, por exemplo, por regeneração de células de planta da invenção. As plantas transgênicas podem, em princípio, ser plantas de quaisquer espécies, isto é, tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotile- dôneas. De preferência, elas são plantas úteis, isto é, plantas cultivadas por seres humanos para a finalidade de nutrição para finalidades técnicas, parti- cularmente industriais. Estas plantas podem ser plantas de sintetização de óleo e/ou de amido ou de armazenagem de óleo e/ou de amido. A invenção de preferência se refere a plantas tais como cereais (centeio, cevada, aveia, trigo, milho miúdo, sagu etc.), arroz, ervilhas, milho, ervilha medular, aipim, batata, colza, soja, cânhamo, linho, girassol ou vegetais (tomate, chicória, pepino, salada etc.). Preferidas são batata, girassol, soja, arroz. Particular- mente preferidas são milho, trigo, colza e arroz.

Como mencionado antes, surpreendentemente verificou-se que em plantas de armazenagem de amido contendo células de planta da inven- ção com atividade aumentada do translocador de ATP/ADP plastidial o teor de amido é aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem e/ou que também o teor de amilose destes amidos é aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem não modificadas correspondentes.

Assim, em uma modalidade preferida a presente invenção tam- bém se refere a plantas de armazenagem de milho que contêm as células de planta da invenção e que exibem um teor de amido aumentado em com- paração com plantas de tipo selvagem não modificadas e/ou um teor de amilose aumentado do dito amido em comparação com plantas de tipo sel- vagem não modificadas correspondentes.

O termo "plantas de armazenagem de amido" compreende to- das as plantas com tecidos de armazenagem de amido tais como milho, tri- go, arroz, batata, centeio, cevada, aveia. Arroz, cevada e batata são preferi- dos. Particularmente preferidos são milho e trigo.

Neste contexto, um aumento no "rendimento" ("rendimento au- mentado"), um aumento no teor de amido ("teor de amido aumentado"), um aumento no teor de amilose ("teor de amilose aumentado") e o termo "planta de tipo selvagem" são usados dentro do significado das definições acima e são usados dentro do mesmo significado para as seguintes modalidades da invenção, também. O termo "rendimento aumentado" de preferência signifi- ca um aumento na produção de substâncias de conteúdo e/ou biomassa, em particular, se ele é medido por meio de peso fresco por planta.

O dito aumento no rendimento de preferência se refere a partes de plantas que podem ser coletadas tais como sementes, frutas, raízes de armazenagem, raízes, flores, botões de flor, brotos, troncos ou madeira.

De acordo com a invenção o aumento no rendimento é pelo menos 3% com relação às substâncias de conteúdo e/ou biomassa em comparação com plantas não transformadas correspondentes do mesmo genótipo, se as ditas plantas são cultivadas sob as mesmas condições, de preferência pelo menos 10%, mais de preferência pelo menos 20% e mais de preferência pelo menos 30% ou ainda 40% em comparação com plantas de tipo selvagem.

As ditas plantas de acordo com a invenção têm, por exemplo, em comparação com outras plantas que sintetizam amido com teor de ami- Iose aumentado tais como o extensor de amilose ("amilose-extender") e os mutantes "dull" oriundos de milho, a vatagem que além de um teor de amilo- se aumentado elas não exibem nenhum teor de amido reduzido mas ainda um teor de amido aumentado.

Além do mais, o objeto da presente invenção são plantas de armazenagem de óleo que contêm as células de planta da invenção e que exibem um teor de óleo aumentado em comparação com células de planta de tipo selvagem não modificadas, de preferência em células de tecido de armazenagem de óleo.

O termo "plantas de armazenagem de óleo" compreende plantas capazes de armazenar óleo tais como colza, canola, soja, girassol, milho, amendoim, trigo, algodão, palmas oleosas, árvores de oliva e abacate. Pre- feridos são milho, trigo e soja. Particularmente preferidos são colza e canola.

O termo "teor de óleo aumentado" significa que o teor de óleo em células de planta da invenção é aumentado por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, mais de preferência por pelo menos 30%, e mais de preferência por pelo menos 40% em comparação com células de planta oriundas de plantas de tipo selvagem não modificadas.

Métodos para a determinação do teor de óleo são conhecidos pela pessoa versada na técnica e são descritos, por exemplo, por Matthaeus e Bruehl, GIT Labor-Fachz. 43 (1999), 151-152, 154-155; Matthaeus, Labor- praxis 22 (1998), 52-55. A determinação do teor de óleo pode também ser realizada por espectroscopia de IR próxima não invasiva que é um método de análise (comumente usado em reprodução) e foi descrito, por exemplo, por Schulz e outros, J. Near Infrared Espectrosc. 6 (1998), A125-A130, Starr e outros, J. Agric. Sei. 104 (1985), 317-323.

Plantas que exibem uma concentração aumentada de óleo são de grande interesse comercial. Plantas de milho, por exemplo, grãos esses que exibem alto nível de amido mas também um teor aumentado do óleo de produto colateral são de grande interesse para a indústria de moagem por via úmida uma vez que o produto colateral é de alto valor. A indústria de ra- ções está também interessada em plantas de alimentação com teor de óleo aumentado uma vez que tais plantas têm um valor nutritivo aumentado. Pa- ra a indústria de processamento de plantas oleosas um aumento do teor de óleo significa um aumento da eficácia do processo de extração de óleo.

A presente invenção ulteriormente se refere a um método para a produção de plantas transgênicas, em comparação com plantas de tipo sel- vagem, exibem um rendimento aumentado, em que

(a) uma célula de planta geneticamente modificada por meio de in- trodução de uma molécula de ácido nucléico exógena e a modi- ficação genética leva a um aumento da atividade de um translo- cador de ATP/ADP plastidial; e

(b) uma planta é regenerada a partir da célula; e opcionalmente

(c) outras plantas são produzidas a partir da planta de acordo com (b).

A presente invenção ulteriormente se refere a um método para a produção de plantas transgênicas que, em comparação com plantas de tipo selvagem, exibem um teor de amido aumentado e/ou cujo amido exibe um teor de amilose aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem correspondentes, em que

(b) uma planta é regenerada a partir da célula; e opcionalmente

(c) outras plantas são produzidas a partir da planta de acordo com (b).

Além do mais, o objeto da presente invenção é um método para a produção de plantas geneticamente que, em comparação com plantas de tipo selvagem, exibem um teor de óleo aumentado, em que

(b) uma planta é regenerada a partir da célula; e opcionalmente

(c) outras plantas são produzidas a partir da planta de acordo com (b).

Para a modificação introduzida na célula de planta de acordo com a etapa (a) aplica-se o mesmo que foi discutida acima com relação às células de planta e plantas da invenção.

A regeneração de plantas de acordo com a etapa (b) pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

A geração de outras plantas de acordo com a etapa (c) dos mé- todos da invenção pode ser conseguida, por exemplo, por propagação vege- tativa (por exemplo, via mudas, tubérculos ou via cultura de calo e regenera- ção de plantas inteiras) ou por reprodução sexual. De preferência, reprodu- ção sexual ocorre em um modo controlado, isto é, plantas selecionadas com propriedades específicas são cruzadas umas com outras e são propagadas.

A presente invenção também se refere às plantas obteníveis pelo método da invenção.

A presente invenção também se refere a material de propaga- ção de plantas de acordo com a invenção bem como plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos da invenção que contém células ge- neticamente modificadas da invenção. Neste contexto, o termo material de propagação compreende aqueles componentes da planta que são adequa- dos para a geração de descendentes por meio de um modo vegetativo ou sexual. Adequada para a propagação vegetativa são, por exemplo, mudas, culturas de calo, rizomas ou tubérculos. Outro material de propagação com- preende, por exemplo, fruta, sementes, mudas, protoplastos, culturas de célula etc. De preferência, o material de propagação são os tubérculos, par- ticularmente preferidas as sementes.

A presente invenção ulteriormente se refere ao uso de molécu- las de ácido nucléico que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial para a produção de plantas transgênicas com um rendimento aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem.

A presente invenção ulteriormente se refere ao uso de molécu- las de ácido nucléico que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial para a produção de plantas que, em comparação com plantas de tipo selva- gem, têm um teor de amido aumentado no tecido de armazenagem de ami- do e/ou de sintetização de amido, ou para a produção de plantas que sinte- tizam um amido que, em comparação com amido oriundo de plantas de sel- vagem, exibe um teor de amilose aumentado. As moléculas de ácido nucléi- co mencionadas com relação às células da invenção são de preferência u- sadas.

A presente invenção ulteriormente se refere ao uso de molécu- las de ácido nucléico que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial para a produção de plantas transgênicas que, em comparação com plantas de tipo selvagem, têm um teor de óleo aumentado.

A presente invenção se refere ulteriormente a células de planta transgênicas que são geneticamente modificadas, em que a modificação genética leva à diminuição da atividade de um translocador de ATP/ADP plastidial presente endogenamente na célula de planta, em comparação com células de planta não-geneticamente modificadas de plantas de tipo selvagem correspondentes.

O termo "transgênico", como usado aqui, significa que as células de planta da invenção divergem em sua informação genética das células de planta não modificadas correspondentes devido a uma modificação genéti- ca, particularmente a introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena.

Neste contexto, o termo "geneticamente modificado" significa que a célula de planta é modificada em sua informação genética devido à introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena e que a presença ou a expressão da molécula de ácido nucléico exógena leva a uma mudança fenotípica. Mudança fenotípica de preferência significa uma mudança men- surável de uma ou mais funções da célula. Por exemplo, células de planta geneticamente modificadas da invenção exibem uma diminuição da ativida- de de um translocador de ATP/ADP plastidial.

A produção das ditas células de planta da invenção com uma atividade diminuída de um translocador de ATP/ADP pode ser conseguida por vários métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica, por exem- plo, por métodos que levam a uma inibição da expressão de genes endóge- nos que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial. Tais métodos incluem, por exemplo, a expressão de um RNA sem sentido corresponden- te, a expressão de um RNA sentido para se conseguir o efeito de co- supressão, a expressão de uma ribozima correspondentemente construída que especificamente cliva transcritos que codifica um translocador de ATP/ADP ou a "mutagênese in vivo" assim chamada.

Para a redução da atividade de um translocador de ATP/ADP nas células da invenção de preferência um RNA sem sentido é expresso.

Para a expressão ou uma molécula de DNA pode ser usada compreendendo a seqüência inteira que codifica um translocador de ATP/ADP incluindo seqüências de flanqueamento que estão possivelmente presentes ou moléculas de DNA compreendendo apenas partes da seqüên- cia de codificação, em que estas partes têm de ser longas o suficiente para levar a um efeito sem sentido nas células. Em geral, seqüências podem ser usadas até um comprimento mímino de 15 pb, de preferência um compri- mento de 100-500 pares de base, para uma inibição sem sentido eficiente, particularmente, seqüências com um comprimento de mais do que 500 pb. Moléculas de DNA mais curtas do que 500 pb são comumente usadas, de preferência seqüências mais curtas do que 2500 pb.

É também possível usar seqüências de DNA que têm um alto grau de homologia às seqüências que ocorrem endogenamente na célula de planta e que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial. A homologia mínima deve ser mais alta do que cerca de 65%. O uso de seqüências com homologias entre 95 e 100% deve ser preferido.

Alternativamente, a redução da atividade translocadora de ATP/ADP nas células de planta da invenção pode também ser realizada por meio de um efeito de co-supressão. O método é conhecido pela pessoa ver- sada na técnica e é descrito, por exemplo, em Jorgensen (Trends Biotech- nol. 8 (1990), 340-344), Niebel e outros (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell e outros (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui e Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vauche- ret e outros (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne e outros (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) e outras fontes.

A expressão de ribozimas para a redução da atividade de prote- ínas específicas em células é também conhecida pela pessoa versada na técnica e é descrita, por exemplo, na EP-B1 0 321 201. A expressão de ri- bozimas em células de planta foi descrita, por exemplo, em Feyter e outros (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).

Além do mais, a redução da atividade translocadora de ATP/ADP nas células de planta da invenção pode também ser conseguida por meio do "mutagênese in vivo" assim chamada, em que um oligonucleo- tídeo de RNA-DNA híbrido ("quimeroplasto") é introduzido para dentro de células por meio de transformação de células (Kipp, P.B. e outros, Pôster Session no "5o International Congress of Plant Molecular Biology, em 21-27 de setembro de 1997, Singapura; R.A. Dixon e C. J. Arntzen, Meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Cop- per Mountain, CO1 USA TIBTECH 15 (1997), 441-447; pedido de patente internacional WO 95/15972; Kren e outros, Hepatology 25 (1997), 1462- 1468; Cole-Strauss e outros, Science 273 (1996), 1386-1389).

Uma parte do componente de DNA do RNA-DNA- oligonucleotí- deo é homóloga a uma seqüência de ácidos nucléicos de um translocador de ATP/ADP endógeno mas, em comparação com a seqüência de ácidos nucléicos do translocador de ATP/ADP endógeno, exibe uma mutação ou contém uma região heteróloga que é encerrada pelas regiões homólogas.

Por meio de emparelhamento de base das regiões homólogas do RNA-DNA-oligonucleotídeo e a molécula de ácido nucléico endógena seguida por recombinação homóloga, a região heteróloga ou mutação conti- da no componente de DNA do RNA-DNA-oligonucleotídeo pode ser transfe- rido para dentro do genoma de uma célula de planta. Isto leva a uma dimi- nuição da atividade do translocador de ATP/ADP plastidial.

Assim, o objeto da presente invenção particularmente são célu- las de planta transgênicas,

(a) contendo uma molécula de DNA que pode levar à síntese de um RNA sem sentido que causa uma diminuição da expressão dos genes endógenos que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial; e/ou

(b) contendo uma molécula de DNA que pode levar à síntese de um RNA de co-supressão que causa uma diminuição da expressão dos genes endógenos que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial; e/ou

(c) contendo uma molécula de DNA que pode levar à síntese de uma ribozima que pode especificamente clivar transcritos de ge- nes endógenos que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial; e/ou

(d) que, devido a uma mutagênese in vivo, exibe uma mutação ou uma inserção de uma seqüência de DNA heteróloga em pelo menos um gene endógeno que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial, em que a mutação ou inserção causa uma diminuição da expressão do gene ou a síntese de uma molécula transportadora inativa.

O termo "diminuição da atividade" na presente invenção significa uma diminuição da expressão dos genes endógenos que codificam um translocador de ATP/ADP, uma redução da quantidade de proteína translo- cadora de ATP/ADP nas células e/ou uma diminuição da atividade biológica da proteína translocadora de ATP/ADP nas células.

A diminuição da expressão pode ser determinada, por exemplo, por medição da quantidade de transcritos que codifica o translocador de ATP/ADP, por exemplo, por análise de Northern blot. Uma diminuição de preferência significa uma diminuição da quantidade de transcritos em com- paração com células geneticamente não modificadas por pelo menos 30%, de preferência por pelo menos 50%, mais de preferência por pelo menos 70%, particularmente preferida por pelo menos 85% e mais de preferência por pelo menos 95%.

A diminuição da quantidade de proteína translocadora de ATP/ADP pode ser determinada, por exemplo, por meio de análise de Wes- tern blot. A diminuição de preferência significa uma diminuição da quantida- de de proteína translocadora de ATP/ADP em comparação com células ge- neticamente modificadas correspondentes por pelo menos 30%, de prefe- rência por pelo menos 50%, mais de preferência por pelo menos 70%, parti- cularmente preferida por pelo menos 85% e mais de preferência por pelo menos 95%.

Surpreendentemente, verificou-se que o teor de amido de célu- las de planta que têm uma expressão diminuída e assim uma atividade di- minuída do translocador de ATP/ADP plastidial, em comparação com as cé- lulas de planta não modificadas correspondentes oriundas de plantas de tipo selvagem, é reduzido e que também o teor de amilose destes amidos, em comparação com células de planta não modificadas correspondentes oriun- das de plantas de tipo selvagem, é reduzido. O fato de que os amidos das plantas da invenção têm uma estrutura modificada é particularmente surpre- endentemente uma vez que foi admitido até agora que as propriedades mo- leculares de amidos são exclusivamente determinadas pela interação de enzimas de sintetização de amido tais como as enzimas de ramificação (E.C. 2.4.1.18) e a sintase de amido (E.C. 2.4.1.21). É totalmente supreen- dentemente que a expressão de uma proteína de transporte plastidial influ- encia a estrutura de amido.

O termo "teor de amido diminuído" na presente invenção signifi- ca que o teor de amido em células de planta da invenção é reduzido por pe- lo menos 15%, de preferência por pelo menos 30%, mais de preferência por pelo menos 40% e mais de preferência por pelo menos 50% em compara- ção com células de planta de plantas de tipo selvagem não modificadas. O teor de amido é determinado de acordo com os métodos descritos nos e- xemplos.

O termo "teor de amilase diminuído" na presente invenção signi- fica que o teor de amilase em células de planta da invenção, em compara- ção com células de planta de plantas de tipo selvagem não-modificadas, é reduzido por pelo menos 10%, preferivelmente por pelo menos 20%, mais preferivelmente por pelo menos 30% e mais preferivelmente por 40%.

O teor de amilase é determinado de acordo com os métodos descritos nos exemplos.

O termo "planta de tipo selvagem" tem o significado definido a- cima.

As células de planta da invenção podem derivar de quaisquer espécies de planta, isto é tanto de plantas monocotiledôneas quanto dicoti- ledôneas. De preferência estas são células de planta oriundas de plantas de colheita de agricultura, isto é, oriundas de plantas cultivadas por seres hu- manos para a finalidade de nutrição ou para finalidades técnicas, particular- mente industrial. De preferência, assim, a invenção se refere a células de planta oriundas de plantas de armazenagem de amido ou sintetização de amido tais como cereais (centeio, cevada, aveia, trigo, milho miúdo, sagu etc.), arroz, ervilha, milho, ervilha medular, aipim, batata, tomate, colza, soja, cânhamo, linho, girassol, feijão-fradinho e araruta. Particularmente preferi- dos são células de planta oriundas de batata.

Além do mais, o objeto da invenção são plantas transgênicas contendo as células de planta transgênicas descritas acima. As ditas plantas podem ser produzidas por regeneração das células de planta da invenção. Plantas transgênicas podem, em princípio, ser plantas de quaisquer espé- cies de planta, isto é, tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. De preferência, elas são células de planta oriundas de planta de colheita de agricultura, isto é, oriundas de plantas cultivadas por seres humanos para a finalidade de nutrição e para finalidades técnicas, particularmente industri- ais. De preferência estas são plantas de armazenagem de amido ou de sin- tetização de amido tais como cereais (centeio, cevada, trigo, milho miúdo, sagu etc.), arroz, ervilha, milho, ervilha medular aipim, batata, tomate, colza, soja, cânhamo, linha, girassol, feijão-fradinho e araruta. Particularmente pre- ferida é batata.

As ditas plantas da invenção sintetizam um amido que, em com- paração com amido oriundo de plantas de tipo selvagem correspondentes, exibe um teor de amilose reduzido. Os termos "redução do teor de amilose" e "plantas de tipo selvagem" são definicos como descrito acima.

Além do mais, a presente invenção também se refere a um mé- todo para a produção de plantas transgênicas cujo amido, em comparação com amido oriundo de plantas de tipo selvagem correspondentes, exibe um teor de amilose reduzido em que

(a) uma célula de planta geneticamente modificada por meio de in- trodução de uma molécula de ácido nucléico exógena e a modi- ficação genética leva a uma diminuição da atividade de um translocador de ATP/ADP plastidial presente endogenamente em células de planta; e

(b) uma planta é regenerada a partir da célula produzida de acordo com a etapa (a); e opcionalmente

(c) outras plantas são produzidas a partir da planta produzida de acordo com a etapa (b). Para a modificação introduzida para dentro da célula de planta de acordo com a etapa (a) a mesma que se aplica foi revelada anteriormen- te com relação às plantas e células de planta da invenção.

A regeneração de plantas de acordo com a etapa (c) pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

A produção de outras plantas de acordo com a etapa (c) do mé- todo da invenção pode, por exemplo, ser conseguida por propagação vege- tativa (por exemplo, via mudas, tubérculos ou via cultura de calo e regenera- ção de plantas inteiras) ou por propagação sexual. De preferência, propaga- ção sexual ocorre de um modo controlado, isto é, plantas selecionadas com propriedades específicas são cruzadas umas com outras e são propagadas.

Em uma modalidade preferida a método da invenção é usado para a produção de plantas de batata transgênicas.

A presente invenção também se refere a plantas obteníveis pelo método da invenção.

A presente invenção também ao material de propagação de plantas de acordo com a invenção bem como das plantas transgênicas pro- duzidas de acordo com os métodos da invenção que contém células geneti- camente modificadas da invenção. Neste contexto, o termo material de pro- pagação compreende aqueles componentes da planta que são adequados para geração de descendentes por meio de um modo vegetativo ou sexual. Adequado para a propagação são, por exemplo, mudas, culturas de calos, rizomas ou tubérculos. Outro material de propagação compreende, por e- xemplo, sementes de fruta, mudas, protoplastos, culturas de célula, etc. De preferência, material de propagação são as sementes, particularmente os tubérculos.

Além do mais, a presente invenção se refere ao uso de molécu- las de ácido nucléico que codificam um translocador de ATP/ADP plastidial, de seus componentes ou de partes das ditas moléculas para a produção de plantas que sintetizam um amido, em comparação com o amido oriundo de plantas de tipo selvagem, com teor de amilose reduzido. De preferência, as moléculas de ácido nucléico mencionadas acima em conexão com as célu- las de planta da invenção que exibem uma atividade translocadora de ATP/ADP devem ser usadas.

Uma variedade de técnicas estão à disposição para a introdução de DNA em uma célula de hospedeiro de planta. Estas técnicas compreen- dem a transformação de células de planta com T-DNA usando-se rizogenes de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium como agente de transfor- mação, a fusão de protoplastos, a injeção, a eletroporação de DNA, a intro- dução do DNA via a abordagem biolística e outras possibilidades.

O uso de transformação mediada por Agrobactéria de células de planta foi analisada em detalhes foi descrita suficientemente na EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley e outros, Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46 and An e outros, EMBO J. 4 (1985), 277-287. Para a transformação de bata- ta, ver, por exemplo, Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8 (1989), 29-33.

A transformação de plantas monocotiledôneas por meio de veto- res à base de Agrobacterium foi também descrita (Chan e outros, Plant Mol. Biol 22 (1993). 491-506; Hiei e outros, Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng e outros, Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink e outros, Plant Cell Re- ports 11 (1992), 76-80; May e outros, Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Connor and Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). Um sistema alternativo para a trans- formação de plantas monocotiledôneas é a transformação via a abordagem biolística (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil e outros, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala e outros, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer e outros, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), a transformação de protoplasto, a eletroporação de células parcialmente permeabilizadas, a introdução de DNA por meio de fibras de vidro. A trans- formação de milho, em particular, é descrita na literatura várias vezes (ver, por exemplo, a WO 95/06128, EP 0513849, EO 0465875, EP 292435@ Fromm e outros, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel e outros, Biotechnology 11 (1993), 194- 200; Moroc e outros, Theor, Appl. Genet. 80 (1990), 721-726).

A transformação bem sucedida de outros cereais foi também descrita, por exemplo, para cevada (Wan and Lemaux1 loc. cit., Ritala e ou- tros, loc. cit., Krens e outros, Nature 296 (1982), 72-74) e para trigo (Nehra e outros, Plant J. 5(1994), 285-297).

Para a expressão das moléculas de ácido nucléico que codifi- cam um translocador de ATP/ADP em orientação sentido ou sem-sentido em células de planta as ditas moléculas de ácido nucléico estão de prefe- rência ligadas com elementos de DNA reguladores que asseguram a trans- crição em células de planta. Os ditos elementos incluem, em particular, promotores. Em geral, qualquer promotor ativo em células de planta é ade- quado.

O promotor pode ser escolhido de um tal modo que a expressão ocorre constitutivamente ou apenas em um tecido específico, em um ponto específico de tempo do desenvolvimento da planta ou em um ponto de tem- po por fatores externos. Tanto com referência à planta quanto com referên- cia à molécula de ácido nucléico, o promotor pode ser homólogo ou heteró- logo.

Promotores adequados são, por exemplo, o promotor do 35S RNA do vírus de mosaico de couve-flor e o promotor de ubiquitina oriundo de milho para um expressão constitutiva, o promotor de gene de patatina (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8(1989), 23-29) para uma expressão espe- cífica de tubérculo em batata e um promotor que assegura uma expressão apenas em tecido fotossinteticamente ativo, por exemplo, o promotor ST- LS1 (Stockaus e outros de dietila, Proc. Natl. Acad. USA 84(1987), 7943- 7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8(1989), 2445-2451) ou para uma ex- pressão específica de endoesperma, o promotor HMB oriundo de trigo, o promotor USP, o promotor de faseolina, promotores a partir de genes zeína oriundos de milho (Pedersen e outros, Cell 29(1982), 1015-1026; Quatroccio e outros, Plant Mol. Biol. 15(1990), 81-93), promotor de glutelina (Leisy e outros, Plant. Mol. Biol. 14(1990), 41-50; Zheng e outros, Plant J. 4(1993), 357-366; Yoshikara e outros, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) ou promotor shrunken-1 (Werr e outros, EMBO J. 4(1985), 1373-1380). Promotores que são ativados apenas em um ponto de tempo determinado por fatores exter- nos podem, no entanto, também ser usados (ver, por exemplo, a WO 9307279). Neste contexto, promotores de proteína de choque térmico, per- mitindo uma indução simples, pode ser particularmente do interesse. Além disso, promotores específicos de semente podem ser usados como o pro- motor USP da Vicia faba que assegura uma expressão específica de se- mente em Vicia fabe e outras plantas (Fiedler e outros, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bãumlein e outros, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

As modalidades acima mencionadas com os promotores especí- ficos de endoesperma são adequados, em particular, para o aumento do teor de amido no endoesperma. Em contraste com isso, o uso de promoto- res específicos de embrião é de interesse, em particular, o aumento do teor de óleo uma vez que, por via de regra, óleo é o principalmente armazenado no embrião.

Assim, de preferência um promotor é usado de acordo com a presente invenção que assegura a expressão no embrião ou na semente. Em uma modalidade preferida da invenção o promotor é o promotor de glo- bulina-1 (gibi) oriundo de milho (Styer e Cantliffe, Plant Physiol. 76 (1984), 196-200). Uma outra modalidade da invenção o promotor específico de em- brião é oriundo de plantas, de preferência de Cuphea lancelata, Brassica rapa ou Brassica napus. Particularmente preferido são os promotores pCI- FatB3 e CIFatB4. Esses são promotores dos genes CIFatB3 e CIFatB4 res- pectivamente, que já foi usado com sucesso em um colza transgênica para a biossíntese de ácidos graxos de cadeia média e, assim, têm uma janela de expressão adequada para a solução da presente invenção.

Em uma outra modalidade o promotor pCIGPDH (WO 95/06733), a napina (descrita, por exemplo, por Kridl, Seed Sei. Res 1(1991), 209-219; Ellerstrom e outros, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1019-1027; Stalberg e outros, Planta 199 (1996), 515-519) ou o promotor de oleosina (descrito, por exemplo, por Keddie, Plant Mol. Biol. 24(1994), 327-340; Plant e outros, Plant Mol. Biol. 25 (1994), 193-205) é usado Além do mais, uma seqüência de terminação pode estar presen- te que serve a terminação correta da transcrição e a adição de poly-A-tail ao transcrito considerado como tendo uma função em estabilização dos trans- critos. Os ditos elementos são descritos na literatura (ver, por exemplo, Gie- len e outros, EMBO J. 8(1989), 23-29) e são intercambeáveis quando desejados.

As células de planta e plantas transgências da invenção sinteti- zam, de preferência devido ao aumento ou à diminuição da atividade de um translocador de ATP/ADP plastidial, um amido que, em comparação com o amido sintetizado em plantas de tipo selvagem, é modificado em suas pro- priedades fisico-químicas, em particular a razão de amilose/amilopectina.

Em particular, o dito amido pode, em comparação com o amido de tipo sel- vagem, ser modificado com referência à viscosidade e/ou as propriedades de formação de gel de colas do dito amido.

Assim, a presente invenção refere-se a métodos para a produ- ção de um amido modificado compreendendo a etapa de extração do amido oriundo de uma das plantas descritas acima e/ou oriunda de partes de ar- mazenagem de amido da dita planta. De preferência, o dito método compre- ende também a etapa de colheita das plantas cultivadas e/ou partes de ar- mazenagem de amido das ditas plantas antes da extração do amido e ulte- riormente, particularmente preferida, a etapa de cultivo das plantas da in- venção antes da colheita. Métodos para a extração do amido oriundo de plantas ou as partes de armazenagem de amido de plantas são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Além do mais, métodos para a extração do amido oriundo de várias outras plantas de armazenagem de amido são des- critos, por exemplo, "Starch": Chemistry and Technology (eds: Whistler, Be- Miller and Paschall (1994), 2a ed., Academic Press Inc. Londres Ltd; ISBN Ο- 12-746270-8; ver, por exemplo, o capítulo XII, págs. 412-468: milho e amido de sorgo: produção; por Watson, capítulo XIII, pág. 469-479: amidos oridun- dos de tapioca, aipim e sogu: produção; por Corbishley e Miller; capítulo XIV, pág. 491-506: amido oriundo de trigo; produção, modificação e usos: por Knight e Oson; e capítulo XVI, pág. 507 até 528; amido oriundo de arroz; produção e usos; por Rohmer e Klem; amido oriundo de milho: Eckhoff e outros, Cereal Chem. 73 (1996) 54-57, a extração de amido oriundo de mi- lho para padrão industrial é usualmente conseguido por "moagem por via úmida" assim chamada. Aplicações usualmente usadas para os métodos para a extração de amido oriundo de material de planta são separadores, decantadores, hidrociclones, secadores de spray e secadores de leito fluidizado.

Além do mais, o objeto da presente invenção é amido obtenível a partir de material de propagação e plantas e células de planta trangênicas da invenção e amido obtenível pelo menos da invenção descrito acima.

Os amidos da invenção podem ser modificados de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica e são adequados para vários usados nos gêneros alimentícios ou indústria de gêneros alimen- tícios em forma não-modificada ou modificada.

Em princípio, possibilidades de uso podem ser divididas em du- as grandes áreas. Uma área compreende, produtos de hidrólise do amido, principalmente blocos de construção de glicose e de glucano obtidos via mé- todos enzimáticos ou químicos. Eles servem como material de partida para outras modificações químicas e processos tal como fermentação. Para uma redução de custos a simplicidade e realização barata de um método de hi- drólise pode ser de importância. No momento, o método é essencialmente enzimático com o uso de amiloglicosidase. Seria possível proteger custos por redução de uso de enzimas. Isto poderia ser conseguido por mudança da estrutura do amido, por exemplo, alargamento do grão, digeribilidade mais fácil devido a baixo grau de ramificação de enzimas, ou uma estrutura entérica que limita a acessabilidade para as enzimas usadas.

A outra área onde amido é usado como amido nativo assim chamado devido a sua estrutura polimérica pode ser subdividida em dois outros campos de aplicação.

1. Uso em Gêneros Alimentícios

Amido é um aditivo clássico para vários genêros alimentícios, em que ele essencialmente serve a finalidade de ligação de aditivos aquo- sos e/ou causa uma viscosidade aumentada ou uma formação de gel au- mentada. Propriedades características importantes são o comportamento de sorção e escomento, intumescimento e temperatura de pastificação, de- sempenho de espessamento e viscosidade, solubilidade do amido, transpa- rência e estrutura de pasta, resistência a ácido, cisalhamento, calor, tendên- cia a retrogradação, capacidade de formação de película, resistência a con- gelamento/descongelamento, digeribilidade bem como a capacidade de formação de complexo com, por exemplo, íons orgânicos ou inorgânicos.

2. Uso em Gêneros não-Alimentícios

O outro principal campo de aplicação no uso de amido como um auxiliar em vários processos de produção ou com um aditivo em produtos técnicos. Os principais campos de aplicação para o uso de amido como um auxiliar são, antes de tudo, a indústria de papel e de papelão. Neste campo, o amido é principalmente usado para a retenção (reter sólidos), para o di- mensionamento de partículas finas e material de enchimento, como subs- tância de solidificação e para desidratação. Além disso, as propriedades vantajosas do amido com referência a rigidez, dureza, som, retenção, brilho, maciez, resistência a rasgamento bem como as superfícies são utilizadas.

2.1 Indústria de Papel e de Papelão

Dentro do processo de produção de papel, uma diferenciação pode ser feita entre quatro campos de aplicação, a saber superfície, reves- timento, massa e borrifamento. As exigências sobre amido com referência ao tratamento de superfície são essencialmente um alto grau de brilho, vis- cosidade correspondente, alta estabilidade de viscosidade, boa formação de película bem como baixa formação de poeira. Quando usado em revesti- mento o teor de sólido, uma viscosidade correspondente, uma alta capaci- dade de se ligar bem como uma alta afinidade de pigmento desempenham um papel importante. Como um aditivo para a massa dispersão rápida, uni- forme, livre de perda, alta estabilidade mecânica e retenção completa na polpa de papel são de importância. Quando do uso do amido em borrifa- mento, teor correspondente de sólidos, alta viscosidade bem como alta ca- pacidade de se ligar são também significativos. 2.2 Indústria de Adesivo

Um principal campo de aplicações é, por exemplo, na indústria de adesivo, onde os campos de aplicação são subdivididos em quatro á- reas: o uso como cola de amido pura, o uso em colas de amido preparadas com produtos químicos especiais, o uso de amido como um aditivo para re- sinas sintéticas e dispersões de polímero bem como o uso de amidos como diluentes para adesivos sintéticos. 90% de todos os adesivos à base de a- mido são usados na produção de papelão corrugados, sacos de papel e bolsas, materiais de compósito para papel e alumínio, caixas e cola de u- medecimento para envelopes, selos, etc.

2.3 Têxteis e Produtos para Cuidado de Têxtil

Um outro uso possível como auxiliar e aditivo é na produção têx- teis e produtos para cuidado de têxtil. Dentro da indústria têxtil, uma diferen- ciação pode ser feita entre os seguintes quatro campos de aplicação: o uso de amido como um agente de engomamento, isto é, como um auxiliar para alisamento e reforçamento do comportamento de "burring" para a proteção contra forças de tração ativas em tecelagem bem como para o aumento de resistência ao uso durante a tecelagem, como um agente para aperfeiçoa- mento têxtil principalmente depois do pré-tratamentos de que deteriora qua- lidade, tais como alvejamento, tingimento, etc., como espessante na produ- ção de pastas de corante para a prevenção de difusão de corante como um aditivo para agentes de urdidura para costurar fios.

2.4 Indústria de Construção

Além do mais, amido pode ser usado como um aditivo em mate- riais de construção. Um exemplo é a produção de placa de gesso, em que o amido misturado no gesso fino plastifica-se com a água, difunde na superfí- cie da placa de gesso e assim liga papelão à placa. Outros campos de apli- cação, são a misturação dele a gesso e a fibras minerais. Em concreto mis- turado para o uso, amido pode ser usado para a desaceleração do processo de colagem.

2.5 Estabilização de Solo

Além do mais, o amido é vantajoso para a produção de meios para a estabilização de solo usado para a proteção temporária de partículas de solo contra água em deslocamento de terra artificial. De acordo com os produtos de combinação de conhecidos do estado da técnica que consistem de amido e emulsões de polímero podem ser considerados ter o mesmo efeito de redução de encrustação e de erosão que os produtos usados até agora; no entanto, eles são consideravelmente menos caros.

2.6 Uso em Fertilizantes e Protetores de Planta

Um outro campo de aplicação é o uso de amido em protetores de planta para a modificação das propriedades específicas destas prepara- ções. Por exemplo, amido é usado para aperfeiçoar a umectação de fertili- zantes e protetores de planta, para a liberação administrada em doses dos ingredientes ativos, para a conversão de ingredientes ativos líquidos, volá- teis e/ou odorantes em substâncias microcristalinas, estáveis, deformáveis, por misturação de composições incompatíveis e para o prolongamento da duração do efeito devido a uma desintegração reduzida.

2.7 Drogas, Medicina e Indústria de Cosméticos

Amido pode também ser usado nos campos de drogas, medici- na e na indústria de cosméticos. Na indústria farmacêutica, amido pode ser usado como um aglutinante para comprimidos ou para a diluição do agluti- nante em cápsulas. Além do mais, amido é adequado como desintegrante para comprimidos uma vez que, após o engolimento, ele absorve fluido e depois de um curto tempo ele incha tanto que o ingrediente ativo é liberado. Por razões de qualidade, pós de polvilhamento vulnerários e lubrificantes médicos são outros campos de aplicação. No campo de cosméticos, o ami- do pode, por exemplo, ser usado como um veículo de aditivos de pó, tais como aromas e ácido salicílico. Um campo relativamente extensivo de apli- cação para o amido é a pasta de dente.

2.8 Amido como um Aditivo em Carvão e Briquetes

Amido pode também ser usado como um aditivo em carvão e briquetes. Por adição de amido, carvão pode ser quantitativamente aglome- rado e/ou briquetado em alta qualidade, assim prevenindo desintegração prematura dos briquetes. Carvão de churrasco contém entre 4 e 6% de ami- do adicionado, carvão aquecido (calorated) entre 0,1 e 0,5%. Além do mais, amido é adequado como um agente de ligação uma vez que a adição dele a carvão e briquete pode consideravelmente reduzir a emissão de substâncias tóxicas.

2.9 Processamento de Pasta de Carvão e Minério

Além do mais, amido pode ser usado como um floculante no processamento de pasta de carvão e minério.

2.10 Aditivos para Materiais de Fundição

Um outro campo de aplicação é o uso como um aditivo para processar materiais em fundição. Para vários processos de fundição núcleos produzidos a partir de areias misturadas com agente de ligação são neces- sários. Hoje em dia, o agente de ligação mais comumente usado é bentonita misturada com amidos modificados, na maioria das vezes amidos de intu- mescimento. A finalidade de adição de amido é resistência de escoamento aumentado bem como resistência de ligação aperfeiçoada. Além do mais, amidos de intumescimento pode satisfazer pré-requesitos para o processo de produção, tais como dispersabilidade em água fria, reidratabilidade, boa misturabilidade em área e alta capacidade de ligar água.

2.11 Indústria de Borracha

Na indústria de borracha, amido pode ser usado para o aperfei- çoamento da qualidade técnica e ótica. Razões para isto são brilho de su- perfície aperfeiçoado, "grip" e aparência. Para esta finalidade, amido é dis- perso sobre as superfícies emborrachadas adesivas de substâncias de bor- racha antes da vulcanização a frio. Pode também ser usado para o aperfei- çoamento da estampabilidade de borracha.

2.12 Produção de Substitutos de Couro

Um outro campo de aplicação para amido modificado é a produ- ção de substitutos de couro.

2.13 Amido em Polímeros Sintéticos

No mercado de plásticos os seguintes campos de aplicação es- tão emergindo: a integração de produtos derivados de amido no processo de processamento (amido é apenas uma carga, não há ligação direta entre o polímero sintético e o amido) ou, alternativamente, a integração de produ- tos derivados de amido na produção de polímeros (amido e polímero for- mam uma ligação estável) ou, alternativamente, a integração de produtos derivados de amido na produção de polímeros (amido e polímero formam uma ligação estável).

O uso do amido como um material de enchimento puro não po- de competir com outras substâncias tal como talco. Esta situação é diferente quando as propriedades de amido específicos se tornam eficazes e o perfil de propriedade dos produtos finais é assim claramente mudado. Um exem- plo é o uso de produtos de amido no processamento de materiais termoplás- ticos, tal como polietileno. Desse modo, amido e o polímero sintético são combinados em uma razão de 1:1 por meio de co-expressão para formar uma "master batch", a partir do qual vários produtos são produzidos por meio de técnicas comuns usando-se polietileno granulados. A integração de amido em películas de polietileno pode causar uma permeabilidade de subs- tância aumentada em corpos ocos, permeabilidade de vapor de água aper- feiçoada, comportamento anti-estático aperfeiçoado, comportamento anti- bloqueamento aperfeiçoado bem como estampabilidade aumentada com corantes aquosos.

Uma outra possibilidade é o uso do amido em espumas de poliu- retano. Devido à adaptação de derivados de amido bem como devido à oti- mização de técnicas de processamento, é possível especificamente contro- lar a reação entre polímeros sintéticos e os grupo hidróxi do amido. Os re- sultados são películas de poliuretano tendo os seguintes perfis de proprie- dade devido ao uso de amido: um coeficiente reduzido de expansão térmica, comportamento de encolhimento diminuído, comportamento de tensão/pres- são aperfeiçoado, permeabilidade de vapor de água aumentado sem uma mudança na aceitação de água, inflamabilidade e densidade de craque- amento reduzida, nenhum vazamento de partes de combustíveis, nenhum haletos e envelhecimento reduzido. Desvantagens que presentemente ainda existem são pressão reduzida e resistência ao impacto.

Desenvolvimento de produto de película não é a única opção. Também produtos de plásticos sólidos, tais como potes e tigelas podem ser produzidos por meio de um teor de amido de mais do que 50%. Além do mais, as misturas de amido/polímero oferecem a vantagem que eles são muito mais facilmente degradáveis.

Além do mais, devido a sua capacidade extrema de ligar água, polímeros de enxerto de amido têm ganho maior importância. Estes são produtos tendo uma cadeia principal de amido e uma rede lateral de um monômero sintético enxertado de acordo com o princípio de mecanismo de cadeia de radical. Os polímeros de enxerto de amido disponíveis hoje em dia são caracterizados por uma ligação aperfeiçoada e capacidade de re- tenção de até 1000 g de água por g de amido em uma alta viscosidade. Es- tes super absorvedores são usados principalmente no campo da higiene, por exemplo, em produtos tais como guardanapos e lençóis, bem como se- tor de agricultura, por exemplo, em péletes de semente.

O que é decisivo para o uso do novo amido modificado por téc- nicas de DNA recombinantes, por um lado, estrutura, teor de água, teor de proteína, teor de lipídio, teor de fibra, teor de cinzas/fosfato, razão de amilo- se/amilopectina, distribuição da massa molar relativa, grau de ramificação, forma e tamanho de grânulo bem como cristalização, por outro lado, as pro- priedades que resultam nas seguintes características: comportamento de escoamento e sorção, temperatura de pastificação, viscosidade, desempe- nho de espessamento, solubilidade, estrutura em pasta, transparência, ca- lor, cisalhamento e resistência ácida, tendência a retrogradação, capacidade de formação de gel, resistência a congelamento/descongelamento, capaci- dade de formação de complexo, ligação de iodo, formação de película, re- sistência a adesivo, estabilidade de enzima, digeribilidade e reatividade.

A produção de amido modificado por operação genética com uma planta transgênica pode modificar as propriedades do amido obtidas a partir da planta de um tal modo que para desenvolver outras modificações por meio de métodos químicos ou físicos supérfulos. Por outro lado, os ami- dos modificados por meio de técnicas de DNA recombinantes pode ser submetidas a outras modificações químicas, que resultarão em outros aper- feiçoamentos da qualidade para dos certos campos acima mencionados de aplicação. Estas modificações químicas são principalmente conhecidas. Es- tas são particularmente modificações por meio de tratamento térmico

- tratamento de ácido

- oxidação e

- esterificação

levando à formação de amidos de fosfato, de nitrato, de sulfato, de xantato, de acetato e de citrato. Outros ácidos orgânicos podem também ser usados para a esterificação:

- formação de éteres de amido éter de alquila de amido, éter de O-alila, éter de hidroalquila, éter de O-carboxilmetila, éteres de amido contendo N, éteres de amido contendo P e éteres de a- mido contendo S.

- formação de amidos ramificados

- formação de polímeros de enxerto de amido

Figura 1 esquematicamente ilustra o plasmídio pJT31 (sentido AATP1 (.Arabidopsis thaliana)

Figura 2 esquematicamente ilustra o plasmídio pJT32 (sem sentido A- ATP1 (Solanum tuberosum);

Figura 3 mostra a comparação da seqüência de aminoácidos do AATP2 oriunda de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 8) com a AATP1 (A. thaliana, SEQ ID NO: 6) e uma proteína homóloga oriunda de Rickettsia prowazekii (Williamson e outros, Gene 80 (1989), 269-278);

Figura 4 análise de hidropatia de AATP2 (A. thaliana, SEQ ID NO: 8), AATP1 (A. thaliana, SEQ ID NO: 6) e o translocador de ATP/ADP Rickettsia realizada de acordo com o método de von Heijne e outros (Eur. J. Biochem. 189 (1989), 535-545)

Figura 5 mostra uma análise de Northern blot da expressão da AATP1 (Solanum tuberosum) em folha e em tubérculo de plantas sem sentido de translocador de ATP/ADP. Figura 6 mostra uma análise de Northern blot da expressão da AATP1 (Arabidopsis thaliana) em folha e em tubérculo de plantas de ul- tra-expressão de translocador de ATP/ADP.

Figura 7 mapa esquemático do pacote pTE200 para a expressão de gene específico de embrião. Sítios de reconhecimento de marcas E- coRI, Smal, BamHI, Xhol, Notl, Xbal, Saci, Kpnl, Apal, Sall, e Sfil para endonucleases de restrição. Por razões práticas, Sfil (A) e Sfil (B) diferem na seqüência de nucleotídeos variável dentro da seqüência de reconhecimento. As abreviações codificam como se segue: promotor de PCIFatB4 = CIFatB4, terminador de tCI- FatB4 = CIFatB4. amp = resistência bacteriana contra ampicili- na, CoIEI ori = "origem de replicação" oriunda do plasmídio Co- IE1, f1(-) ori = "origem de replicação" oriunda do fago f1.

Figura 8 mapa esquemático do pacote de expressão de translocador de ATP/ADP pTE208: este derivado do vetor pTE200 (figura 7) por- ta um cDNA que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial oriundo de Solanum tuberosum em orientação sentido.

Figura 9 mapa esquemático do vetor binário pMH000-0. Sítios de reco- nhecimento de marca Sfil1 Sall1 Ciai, Hindlll, EcoRI1 Nsil, Smal, BamHi, Spel, Notl, Kpnl, Bglll, Apal, Xhol1 Xbal e BstEII para en- donucleases de restrição. Sfil (A) e Sfil (B) diferem na seqüência de nucleotídeos variável de sua seqüência de reconhecimento como afirmado. Isto é a razão porque a recircularização do plasmídio de partida é evitado depois da clivagem de Sfil e uma inserção direcionada da pacote de expressão do derivado pTE200 é possível. As abreviações codificam como se segue: RB1 LB = região de limite à direita e à esquerda, t35S - sinal de terminação do gene 35S RNA oriundo de CaMV, pat = gene de transferase de acetila de fofinotricina, p35S = promotor do gene 35S RNA oriundo de CaMV1 p35S(min) = promotor mínimo do gene 35S RNA oriundo CaMV1 tp-sul = gene de resistência de sulfonamida com peptídeo de trânsito, tnos = sinal de termina- ção do gene de sintase de nopalina, Sm/Sp = resistência bacte- riana contra estreptomicina e espectinomicina, parA, parB e parR = funções de multiplicação de plasmídio oriundo do plas- mídio pVS1 com área de hospedeiro grande i.a. para Agrobacte- rium tumefaciens e Escherichia coli.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1

Construção do vetor de expressão bacteriano pJT118 e trans- formação de E. coli

A proteína AATP2 (biblioteca de gene X94626, SEQ ID NO: 8) oriunda de Arabidopsis thaliana foi fundida terminalmente em N com uma "etiqueta de histidina" compreendendo 10 aminoácidos.

Para isto, o cDNA que codifica a proteína AATP2 (SEQ ID NO: 7) inteira oriunda de Arabidopsis thaliana foi isolado por meio de uma abor- dagem de PCR. Os seguintes oligonucleotídeos serviram como iniciador sentido que, além disso, tinham um sítio de restrição de Xhol: cgtgagagatagagagctcgagggtctgattcaaacc (SEQ ID NO: 1); com- preendendo os pares de base 66-102).

Um oligonucleotídeo que porta um sítio de restrição BamHI adi- cional serviu como iniciador sem sentido: gatacaacaggaatcctggatgaagc (SEQ ID NO: 2); compreendendo os pares de base 1863-1835). O produto de PCR obtido foi purificado por meio de um gel de agarose, cortar com as enzimas de restrição Xhol/BamHI e introduzidas "em quadro" no plasmídio pET16b (Novagene, Heidelberg, Alemanha). Isto leva à exibição de uma etiqueta de histidina de 10 aminoácidos no N-terminal do cDNA que codifica a proteína AATP2 inteira oriunda de Arabidopsis thaliana (His-AATP2). O dito vetor foi chamado pJT118. A seqüência do produto de PCR foi determi- nada por sequênciação de ambos os fios de nucleotídeos (Eurogentec). A transformação de E. coli C43 (Miroux e Walker, J. Mol. Biol. 260 (1996), 289-298) foi realizada de acordo com os métodos padrão. A cepa de E. coli C43 permite a expressão hteróloga de animal (Miroux e Walker, loc. cit.) e proteínas de membrana de planta (Tjaden e outros, J. Biol. Chem. (1998) (em pressão)).

Depois da transformação da dita cepa com os estudos de cap- tação de vetor pJT118 com ATP e ADP radioativamente marcados foram realizados. Poderia ser demonstrado por estes estudos que His-AATP2 po- dem ser funcionalmente expressos em E. coli C43 na membrana citoplas- mática de E. coli. Isto demonstrou que AATP2 de fato codifica um transloca- dor de ATP/ADP. A presença de etiqueta de histidina N-terminal leva a um aumento (2x-3x) da atividade de transporte de AATP2 oriundo de A. thaliana em E co//em comparação com AATP2 sem etiqueta his N-terminal.

Exemplo 2

Construção do plasmídio pJT31 e introdução do plasmídio para dentro do genoma de plantas de batata

Para a construção de vetor de transformação de planta um fragmento de EcoRV/BamHI do AATP1-cDNA oriundo de A. Thaliana (Kampfenkel e outros, FEBS Letters 374 (1995), 351-355) com um compri- mento de 2230 pb estava ligado no corte de vetor pBinAR com Smal/EcoRV e BamHI (Hófgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230). Por inserção do fragmento de cDNA um pacote de expressão é formado (pJT31) que é construído dos fragmentos A, B e C como se segue (ver a figura 1):

O fragmento A (540 pb) contém o promotor 35S oriundo do vírus de mosaico de couve-flor.

O fragmento B1 além das regiões de flanqueamento, a região de codificação de proteína de um translocador de ATP/ADP oriundo de A. thali- ana (AATP1). A dita região foi isolada como descrito acima e foi fundida em orientação sentido ao promotor 35S em pBinAR.

O fragmento C (215 pb) contém um sinal de poliadenilação do gene de sintase de octopina oriundo de Agrobacterium tumefaciens.

O tamanho do plasmídio pJT31 é cerca de 14,2 kb.

O plasmídio foi transferido para dentro de plantas de batata por meio de Agrobactéria como por Rocha-Sosa e outros (EMBO J. 8 (1989), 23-29). Como um resultado da transformação de plantas de batata transgê- nicas exibiu um aumento do mRNA de um translocador de ATP/ADP plasti- dial. Isto foi detectado por análise de Northern blot (ver a fig. 6). RNA foi iso- lado de acordo com os protocolos padrão oriundos de folha e tecido de tu- bérculo oriundo de plantas de batata. 50 μ9 de RNA foram separados sobre um gel de agarose (agarose a 1,5%, 1x tampão de MEN1 formaldeídeo a 16,6%). Depois da eletroforese o RNA foi transferido com 20 χ SSC sobre uma membrana de náilon Hybond N (Amersham, UK) por meio de blot capi- lar. O RNA foi fixo sobre a membrana por meio de irradiação de UV. A membrana foi pré-hibridizada por 2 horas em tampão de hibridização de fos- fato (Sambrook e outros, loc. cit.) e subseqüentemente foi hibridizada por 10 horas por meio de adição da sonda radioativamente marcada.

Exemplo 3

Construção do plasmídio pJT32 e introdução do plasmídio para dentro do genoma de plantas de batata

Para a construção de um vetor de transformação de planta um fragmento de BamHI/Ndel da região de codificação do AATP1-cDNA oriundo de S. tuberosum (Genbank Y10821) com um comprimento de 1265 pb esta- va ligado no corte de vetor pBinAR (Hõfgen e Wilmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230) com Smal/Ndel e BamHI.

Por inserção do fragmento de cDNA um pacote de expressão é formado que é construído dos fragmentos A, B e C como se segue (ver a fig. 2):

O fragmento B, contém uma região de um translocador de ATP/ADP oriundo de S. tuberosum (AATP1 S.t) com um comprimento de 1265 pb. Esta região foi fundida em orientação sem sentido ao promotor 35S em pBinAR.

O tamanho do plasmídio pJT31 é cerca de 13,3 kb.

O plasmídio foi transferido para dentro de plantas de batata por meio de Agrobactéria como por Rocha-Sosa e outros (EMBO J. 8 (1989), 23-29). Como um resultado da transformação de plantas de batata transgê- nicas exibiu uma diminuição do mRNA de um translocador de ATP/ADP plastidial. Isto foi detectado por análise de Northern blot (ver a fig. 5). RNA foi isolado de acordo com os protocolos padrão oriundos de folha e tecido de tubérculo oriundo de plantas de batata. 50 μ9 de RNA foram separados sobre um gel de agarose (agarose a 1,5%, 1x tampão de ΜΕΝ, formaldeí- deo a 16,6%). Depois da eletroforese o RNA foi transferido com 20 χ SSC sobre uma membrana de náilon Hybond N (Amersham, UK) por meio de blot capilar. O RNA foi fixo sobre a membrana por meio de irradiação de UV. A membrana foi pré-hibridizada por 2 horas em tampão de hibridização de fos- fato (Sambrook e outros, loc. cit.) e subseqüentemente foi hibridizada por 10 horas por meio de adição da sonda radioativamente marcada.

Exemplo 4

Análise do teor de amido, de amilose e de açúcar de plantas de batata transgênicas

A determinação do teor de açúcares solúveis foi realizada como descrito por Lowry e Passoneau em "A Flexible System of Enzymatic Analy- sis", Academic Press, New York, USA (1972). A determinação do teor de amido foi realizada como descrito por Batz e outros (Plant Physiol. 100 (1992), 184-190).

Tabela 1:

<table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table>

A determinação do teor de amilose foi realizada como descrito por Hovenkamp-Hermelink e outros (Potato Res. 31 (1988), 241-246):

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Exemplo 5

Produção de um pacote de expressão e transformação de plan- tas de colza

O pacote de expressão pTE200 em um derivado de pBluescript (Short e outros, Nucl. Acid Res. 16, (1988), 7583-7600) porta as seqüências de terminador e promotor do gene tioesterase CIFatB4 (GenBak acesso: AJ131741) oriunda de Cuphea Lanceolata e seqüências de poliligadores adequadas para a inserção de vários genes úteis. Sítios de reconhecimento de Sfil periféricos com nucleotídeos não-compatíveis em regiões de reco- nhecimento variáveis permitem uma transferência direcionada do pacote de expressão total incluindo o gene útil nos sítios de restrição correspondentes do vetor de plasmídio binário pMHOOO-O, um desenvolvimento ulterior de pLH9000 (Hausmann e Tõpfer, (1999): capítulo 9: "Entwicklung von Plas- mid-Vektoren" em Bioengineering für Rapssorten nach Map, D. Brauer, G. Rõbbelen e R. Tõpfer (eds.) Vortrãge für Planzenzüchtung, volume 45, 155- 172), e previnem recircularização do DNA no vetor receptor. Para a produção do pacote de expressão pTE200, em primeiro lugar, um fragmento de Sall-Bbvl que porta um promotor com um compri- mento aproximado de 3,3 kb foi isolado do clone genômico CITEg16 (WO 95/07357) que porta o gene CIFatB4 completo oriundo de C. Ianceolata. A fim de se conseguir isso, o sítio de restrição Bbvl na extremidade 3' do pro- motor foi aberto foi modificado de tal modo que o fragmento poderia então ser absorvido pelo corte de pBluescript (stratagene) com Sall e Smal. Um sítio de restrição de EcoR interno do fragmento localizado a 1211 nucleotí- deos 5' foi deletado por estar aberto, modificado por meio de T4 polimerase e subseqüentemente fechado novamente.

A seqüência de terminador foi ampliada por meio da reação de cadeia de polimerase e iniciadores de oligonucleotídeo específicos na matriz de CITEg 16 (WO 95/07357) e foi provida com vários sítios de restrição de poliligador (MCS) via os iniciadores. As seqüências dos iniciadores são:

5'GAATTCCTGCAGCCCGGGGATCCACTAGTCTCGAGAAGT

GGCTGGGGGCCTTTCC3' (SEQ ID NO: 3) = iniciador 5': (MCS: EcorRI1 Pstl, Smal, BamHI, Spel, Xhol; terminador CIFatB4: de pós. 35-36) e

5TCTAGAGGCCAAGGCGGCCGCTTCAACGGACTGCAGTGC 3' (SEQ ID NO: 4) = iniciador 3': terminador CIFatB4: de pós. 22-39, MCS: Notl, Styl, Sfil, Xbal. O amplificado foi cortado com EcoRI e Notl e foi inserido para dentro dos sítios de restrição correspondentes do pBlueSfi BA (Haus- mann e Tõper, ver acima). O fragmento que porta o promotor foi aberto com BamHI, foi modificado e subseqüentemente foi cortado com Sall para colo- cá-lo no vetor pBlueSfi via sítio de restrição de Hindlll modificado e Sall em frente do terminador. O resultado é o pacote de expressão pTE200 (ver a figura 7). Para a construção de um vetor de transformação de planta um fragmento EcoRI do cDNA de AATP1 oriundo de Solanum tuberosum (pTM1, Tjaden e outros, The Plant Journal 16 (1998) 531-540) com um comprimento de 2270 pb estava ligado no vetor pTE200 aberto com EcoRI.

A orientação foi controlada por meio de digesto de restrição. O resultado era o plasmídio pTE208 (figura 8). Na etapa seguinte, o fragmento Sfil oriundo de pTE208 foi inserido para dentro dos sítios de restrição de poliligador do vetor binário pMHOOO-O (figura 9) em um modo direcionado. O resultado era o vetor pMH 0208.

O vetor de plasmídio binário pMHOOO-O foi desenvolvido ulteri- ormente de pLH9000 (Hausmann e Tõper, ver acima) com marcadores de seleção alternativos para a transformação de planta. O gene de sulfonamida (sul) foi isolado juntamente com a seqüência de peptídeos de sinal (tp) para importação plastidial da sub-unidade pequena da carboxilase de ribuossebi- fosfato oriunda do plasmídio percursor de pS001 (Reiss e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, (1996), 3094-3098) depois da modificação do sítio de restrição de Asp718 no sítio de restrição Xhol. O fragmento Xhol-Sall foi in- serido para dentro dos sítios de restrição Xhol e BamHI de um derivado de p-Bluescript em frente do terminador do gene de sintase de nopalina (pA- nos) depois da modificação de Sall e BamHI. Em uma ligação de três frag- mentos o fragmento tpsul-pAnos resultante (XhoI-XbaI) e o fragmento Xhol- Hindlll oriundo de pRT103pat (Tõper e outros, Methods in Enzymol. 217, (1993), 66-78) estavam ligados com o plasmídio pK18 (Pridmore, Gene 56, (1987), 309-312) aberto por meio de Hindlll e Xbal. Como um resultado o gene para a acetiltransferase de fosfinotricina com o terminado do gene RNA de CaMV35S oriundo de pRT103pat foi colocado na orientação oposta à unidade de tpsul-pAnos. Um promotor duplo do gene de RNA de CaMV35S como fragmento de Xhol oriundo de um descendente de pROA93 (Ott e outros, Mol. Gen. Genet. 221, (1990), 121-124) foi inserido para den- tro do sítio de restrição Xhol entre as seqüências de genes de mediação de resistência para completar a dita unidade de seleção dupla (para resistência contra o herbicida Basta e a sulfadiazina de sulfonamida). Depois das modi- ficações correspondentes no poliligador adjacente do pacote de seleção du- pla resultante foi trocado por meio de Xbal e Hindlll contra o pacote de ca- namicina no plasmídio percursor pLH9000 (Hausmann e Tõper, ver acima). O resultado foi o vetor de plasmídio binário pMHOOO-O.

A transformação de explantes de hipocotila de colza da varieda- de Drakkar foi realizada de acordo com o protocolo de De Block (Plant Phy- siol. 91 (1989), 694-701) por meio de Agrobactéria (cepa GV 3101 C58C1 Rifr) que porta o vetor binário pMH0208 (sentido de transportador de ATP/ADP). Brotos foram regeneradas sobre meio de nutriente seletivo (sul- fonamida) e foram cultivadas na estufa até a maturação da semente. Por meio de PCR e teste de folha (tolerância contra glufosinatamônio (Basta®)) foi testado plantas essas que continham o transgene. Maturação de embri- ões em vários estágio de desenvolvimento foram coletados a partir das ditas plantas e foram armazenados em nitrogênio líquido.

Para a determinação do teor de óleo de sementes maduras de linhas de colza transgênicas e de linhas de controle foram analisadas por meio da espectroscopia de infra-vermelho quase não invasiva (descrito, por exemplo, por Schulz e outros, J. Near Infrared Spectrosc. 6, (1998), A125- A130; Starr e outros, J. Agric. Sei. 104(2), (1985), 317-323). Listagem de Seqüências

<110> Bayer Bioscience GmbH

<120> MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA

QUE EXIBE UM TEOR DE AMIDO AUMENTADO, USO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICA UM TRANSLOCADOR DE ATP/ADP PLASTIDIAL, E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM AMIDO MODIFICADO

<130> AN-BR

<140> PI9910408-3

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<170> PatentIn versão 3.5

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cgtgagagat agagagctcg agggtctgat tcaaacc

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotideo sintético

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gatacaacag gaatcctgga tgaagc

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> oligonucleotideo sintético

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gaattcctgc agcccggggg atccactagt ctcgagaagt ggctgggggc ctttcc

26

56

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<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

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<223> oligonucleotideo sintético

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tctagaggcc aaggcggccg cttcaacgga ctgcagtgc 39

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tctcccattt tttcttctgt gtatcagcgg gagagagtga aatagagag atg gaa gct 118

Met Glu Ala 1

gtg att caa acc aga ggg ctt ctc tct tta ccc acc aaa ccc ate gga 166

vai Ile Gln Thr Arg Gly Leu Leu Ser Leu Pro Thr Lys Pro lie Gly 5 10 15

gtg aga age caa ctt cag cct tcc cat ggc tta aag cag aga ctt ttc 214

vai Arg ser Gln Leu Gln Pro ser His Gly Leu Lys Gln Arg Leu Phe 20 25 30 35

gcc gcg aag cca aga aat cta cat ggg tgt ctc tat cct tta acg ggc 262

Ala Ala Lys Pro Arg Asn Leu His Gly Cys Leu Tyr Pro Leu Thr Gly 40 45 50

aca aga aat ttc aaa cct ttg age caa ccc tgc atg gga ttt cga ttt 310

Thr Arg Asn Phe Lys Pro Leu Ser Gln Pro Cys Met Gly Phe Arg Phe 55 60 65

ccc aca aag aga gaa gea ccg agt tca tat gea agg cgg agg cgc ggc 358

Pro Thr Lys Arg Glu Ala Pro Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Gly 70 75 80

tgc tgg cga cgg age tgt ctt cgg cga age gat tcc gea gct gtt gta 406

Cys Trp Arg Arg Ser Cys Leu Arg Arg Ser Asp Ser Ala Ala Val Val 85 90 95

gcc tcg cgg aag att ttc ggt gtg gag gtt gea acc ttg aaa aag att 454

Ala ser Arg Lys lie Phe Gly vai Glu vai Ala Thr Leu Lys Lys lie 100 105 110 115

ate cct tta gga ttg atg ttc ttt tgt att ctt ttc aat tac aca att 502

Ile Pro Leu Gly Leu Met Phe Phe Cys Ile Leu Phe Asn Tyr Thr Ile 120 125 130

ctg agg gat aca aag gat gtc ttg gtg gtg acg gcg aaa gga agt tct 550

Leu Arg Asp Thr Lys Asp Val Leu Val Val Thr Ala Lys Gly Ser Ser 135 140 145

gct gag att ata cct ttc ttg aag act tgg gtg aat ctt cct atg gcc 598

Ala Glu lie Ile Pro Phe Leu Lys Thr Trp Val Asn Leu Pro Met Ala 150 155 160

att ggg ttt atg ctc ctc tac act aaa ctc tcc aat gtt ctc tcc aag 646

Ile Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Val Leu Ser Lys 165 170 175

aag gct ctg ttt tac act gtt att gtc cct ttc ate ate tac ttt ggg 694

Lys Ala Leu Phe Tyr Thr Val Ile vai Pro Phe Ile Ile Tyr Phe Gly 180 185 190 195

ggc ttt ggt ttc gtc atg tac cct ctc age aac tat att cac ccg gaa 742

Gly Phe Gly Phe Val Met Tyr Pro Leu Ser Asn Tyr Ile His Pro Glu 200 205 210

gct ctc gea gat aag ctc ctt aca acc ctc ggc cca aga ttc atg ggt 790

Ala Leu Ala Asp Lys Leu Leu Thr Thr Leu Gly Pro Arg Phe Met Gly 215 220 225 cct att gca ata ttg cgg att tgg agt ttc tgt ttg ttt tat gtt atg 838

Pro lie Ala lie Leu Arg lie Trp Ser Phe Cys Leu Phe Tyr vai Met 230 235 240

gct gag ctt tgg ggt agt gtg gtg gtc tca gtt ctc ttc tgg ggc ttt 886

Ala Glu Leu Trp Gly Ser vai vai vai Ser vai Leu Phe Trp Gly Phe 245 250 255

gct aat cag ate aca act gtq gat gaa gcc aag aaa ttc tat cct ttg 934

Ala Asn Gln Ile Thr Thr vai Asp Glu Ala Lys Lys Phe Tyr Pro Leu 260 265 270 275

ttc ggc att gga gcc aat gtt gca ctg att ttc tca gga aga acc gtq 982

Phe Gly lie Gly Ala Asn vai Ala Leu lie Phe Ser Gly Arg Thr vai 280 285 290

aaa tac ttc tet aac ttg aga aag aat ctt ggt cct gga gtt gac ggc 1030

Lys Tyr Phe Ser Asn Leu Arg Lys Asn Leu Gly Pro Gly vai Asp Gly 295 300 305

agt ttc gtt gaa age cat gat gag cat tgt ggt ggg aat ggg act cgc 1078

Ser Phe Val Glu Ser His Asp Glu His Cys Gly Gly Asn Gly Thr Arg 310 315 320

att tgt ctc tet att ggt ggg tcg aat aga tat gtt cct ctt cca acc 1126

lie Cys Leu Ser lie Gly Gly Ser Asn Arg Tyr vai Pro Leu Pro Thr

325 330 335

cgt age aag aac aag aag gag aaa ccg aag atg gga acg atg gaa age 1174

Arg ser Lys Asn Lys Lys Glu Lys Pro Lys Met Gly Thr Met Glu ser

340 345 350 355

ttg aag ttc ttg gta tca tca cca tac att aga gat ctt gct act tta 1222

Leu Lys Phe Leu Val ser Ser Pro Tyr Ile Arg Asp Leu Ala Thr Leu

360 365 370

gtg gtg gca tac ggt att agt ate aat ctt gtg gaa gtc aca tgg aaa Val Val Ala Tyr Gly Ile Ser Ile Asn Leu Val Glu Val Thr Trp Lys 375 380 385

atg aca ccg cta ctt gca gct gtg tat gtc ggt gcc ctt cag aat ate Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala vai Tyr vai Gly Ala Leu Gln Asn Ile 470 475 480

1270

tca aag ctt aaa gct cag ttc cct age ccg aat gag tac tca gca ttt 1318

Ser Lys Leu Lys Ala Gln Phe Pro Ser Pro Asn Glu Tyr Ser Ala Phe 390 395 400

atg gga gca ttc tca acc tgc acg ggt gtt gca aca ttc aca atg atg 1366

Met Gly Ala Phe ser Thr Cys Thr Gly vai Ala Thr Phe Thr Met Met

405 410 415

ctt ctc age caa tac gta ttc aat aag tat ggt tgg gga gta gct gca 1414

Leu Leu Ser Gln Tyr Val Phe Asn Lys Tyr Gly Trp Gly Val Ala Ala

420 425 430 435

aag ate acc cca act gtt ctg cta ttg act ggt gtt gcg ttc ttc tet 1462

Lys lie Thr Pro Thr Val Leu Leu Leu Thr Gly Val Ala Phe Phe Ser

440 445 450

cta ata ttg ttt ggc ggc cca ttc gca cca ctt gtt gcc aag ctt ggt 1510

Leu lie Leu Phe Gly Gly Pro Phe Ala Pro Leu vai Ala Lys Leu Gly 455 460 465

1558

ttc age aag agt gcc aag tac age ttg ttc gac cct tgc aaa gaa atg 1606

Phe Ser Lys Ser Ala Lys Tyr Ser Leu Phe Asp Pro Cys Lys Glu Met 485 490 495

gcc tat ate cca ttg gat gag gac acc aag gtt aaa ggc aaa gct gcg 1654

Ala Tyr Ile Pro Leu Asp Glu Asp Thr Lys Val Lys Gly Lys Ala Ala 500 505 510 515

att gac gtg gtc tgc aac cca tta gga aaa tca ggg gga gct tta ata 1702

lie Asp vai Val Cys Asn Pro Leu Gly Lys Ser Gly Gly Ala Leu Ile

520 525 530 cag cag ttc atg ate tta tcc ttt gqa tca cta gcg aat tca acg ccg 1750

Gln Gln Phe Met lie Leu Ser Phe Gly Ser Leu Ala Asn ser Thr Pro 535 540 545

tat cta gqa atg ate ttg ttg gtt att gtc act gcg tgg tta gct gea 1798

Tyr Leu Gly Met lie Leu Leu vai lie vai Thr Ala Trp Leu Ala Ala 550 555 560

gct aag tcg ctg gag gqa cag ttc aac age ttg cgt ctg aag aag age 1846

Ala Lys Ser Leu Glu Gly Gln Phe Asn Ser Leu Arg Leu Lys Lys Ser 565 570 575

ttg aga agg aaa tgg aga gag ctt cat cgg tga Leu Arg Arg Lys Trp Arg Glu Leu His Arg 580 585 agatccctgt cgtgtctcag 1899 gacgaaagcg gaaacggttc ccttggagaa tctcctagca gttcaccgga gaaatctgct 1959 cccaccaact tataaaaagt ttttttttga tatttggttt tgttgggggg gaaagaaaga 2019 aggatgatga atcaaaaata agattttgag agcagtctct caaacaatcg cccttttgca 2079 ccactcactc tttatagtct gtagcttttt ttccttacat tcttttcagt tcaatgtggt 2139 ttcacgttct aagtttcttc ctaaaaaaaa aaaaa 2174

<210> 6 <211> 589 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 6

Met Glu Ala Val Ile Gln Thr Arg Gly Leu Leu Ser Leu Pro Thr Lys 1 5 10 15

Pro lie Gly vai Arg ser Gln Leu Gln Pro ser His Gly Leu Lys Gln 20 25 30

Arg Leu Phe Ala Ala Lys Pro Arg Asn Leu His Gly Cys Leu Tyr Pro 35 40 45

Leu Thr Gly Thr Arg Asn Phe Lys Pro Leu Ser Gln Pro Cys Met Gly 50 55 60

Phe Arg Phe Pro Thr Lys Arg Glu Ala Pro Ser Ser Tyr Ala Arg Arg 65 70 75 80

Arg Arg Gly Cys Trp Arg Arg Ser Cys Leu Arg Arg ser Asp Ser Ala 85 90 95

Ala Val vai Ala Ser Arg Lys Ile Phe Gly Val Glu Val Ala Thr Leu 100 105 110

Lys Lys Ile Ile Pro Leu Gly Leu Met Phe Phe Cys lie Leu Phe Asn 115 120 125

Tyr Thr Ile Leu Arg Asp Thr Lys Asp Val Leu Val Val Thr Ala Lys 130 135 140

Gly Ser Ser Ala Glu Ile Ile Pro Phe Leu Lys Thr Trp Val Asn Leu 145 150 155 160

Pro Met Ala Ile Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Val 165 170 175 Leu Ser Lys Lys Ala Leu Phe Tyr Thr vai lie Val Pro Phe lie lie 180 185 190

Tyr Phe Gly Gly Phe Gly Phe Val Met Tyr Pro Leu Ser Asn Tyr Ile

195 200 205

His Pro Glu Ala Leu Ala Asp Lys Leu Leu Thr Thr Leu Gly Pro Arg

210 215 220

Phe Met Gly Pro lie Ala lie Leu Arg Ile Trp Ser Phe Cys Leu Phe

225 230 235 240

Tyr vai Met Ala Glu Leu Trp Gly Ser Val vai vai ser vai Leu Phe

245 250 255

Trp Gly Phe Ala Asn Gln lie Thr Thr vai Asp Glu Ala Lys Lys Phe

260 265 270

Tyr Pro Leu Phe Gly Ile Gly Ala Asn vai Ala Leu lie Phe Ser Gly

275 280 285

Arg Thr Val Lys Tyr Phe Ser Asn Leu Arg Lys Asn Leu Gly Pro Gly 290 295 300

val Asp Gly Ser Phe vai Glu ser His Asp Glu His Cys Gly Gly Asn

305 310 315 320

Gly Thr Arg Ile Cys Leu Ser Ile Gly Gly Ser Asn Arg Tyr Val Pro

325 330 335

Leu Pro Thr Arg Ser Lys Asn Lys Lys Glu Lys Pro Lys Met Gly Thr 340 345 350

Met Glu Ser Leu Lys Phe Leu Val Ser Ser Pro Tyr Ile Arg Asp Leu

355 360 365

Ala Thr Leu Val Val Ala Tyr Gly Ile ser lie Asn Leu Val Glu vai 370 375 380

Thr Trp Lys ser Lys Leu Lys Ala Gln Phe Pro Ser Pro Asn Glu Tyr

385 390 395 400

Ser Ala Phe Met Gly Ala Phe Ser Thr Cys Thr Gly Val Ala Thr Phe

405 410 415

Thr Met Met Leu Leu Ser Gln Tyr Val Phe Asn Lys Tyr Gly Trp Gly 420 425 430

Val Ala Ala Lys Ile Thr Pro Thr Val Leu Leu Leu Thr Gly Val Ala 435 440 445

Phe Phe Ser Leu Ile Leu Phe Gly Gly Pro Phe Ala Pro Leu Val Ala 450 455 460

Lys Leu Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala vai Tyr vai Gly Ala Leu 465 470 475 480 Gln Asn Ile Phe ser Lys Ser Ala Lys Tyr Ser Leu Phe Asp Pro Cys 485 490 495

Lys Glu Met Ala Tyr Ile Pro Leu Asp Glu Asp Thr Lys vai Lys Gly 500 505 510

Lys Ala Ala Ile Asp vai vai Cys Asn Pro Leu Gly Lys Ser Gly Gly 515 520 525

Ala Leu lie Gln Gln Phe Met Ile Leu Ser Phe Gly Ser Leu Ala Asn

530 535 540

Ser Thr Pro Tyr Leu Gly Met lie Leu Leu vai Ile vai Thr Ala Trp

545 550 555 560

Leu Ala Ala Ala Lys Ser Leu Glu Gly Gln Phe Asn Ser Leu Arg Leu 565 570 575

Lys Lys Ser Leu Arg Arg Lys Trp Arg Glu Leu His Arg 580 585

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tgctacgtga gagatagaga g atg gaa gqt ctg att caa acc aga gqa att 111

Met Glu Gly Leu Ile Gln Thr Arg Gly Ile

1 5 10

ctc tct tta ccc gcg age cat cgg agt gag aag gtt ctc caa ccc tca 159

Leu Ser Leu Pro Ala Ser His Arg ser Glu Lys Val Leu Gln Pro Ser 15 20 25

cat gqc tta aag caa aga ctt ttc acc aca aac tta cct gcc ttg tcc 207

His Gly Leu Lys Gln Arg Leu Phe Thr Thr Asn Leu Pro Ala Leu Ser 30 35 40

tta tct cta atg gtc aca aga aat ttc aag cct ttc age aaa tcc cac 255

Leu Ser Leu Met Val Thr Arg Asn Phe Lys Pro Phe Ser Lys Ser His 45 50 55

ttg gqa ttt cgg ttt ccc aca agg aga gaa gea gag gat tca ctt gea 303

Leu Gly Phe Arg Phe Pro Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Ser Leu Ala 60 65 70

agg cgg aag ctg cgg cgg ccg agg cgg aaa tgt gtc gac gaa gqa gac 351

Arg Arg Lys Leu Arg Arg Pro Arg Arg Lys Cys vai Asp Glu Glv

Arg Arg Lys Leu Arg Arg Pro Arg Arg Lys Cys vai Asp Glu Gly Asp

75 80 85 90

aca gcg gcg atg gcg gtq tcg cct aag att ttc gqt gtq gag gtt acg

Thr Ala Ala Met Ala Val Ser Pro Lys Ile Phe Gly Val Glu Val Thr

95 100 105

399 act ctg aag aag att gtc cct tta gqg cta atg ttc ttt tgc ate ctt 447

Thr Leu Lys Lys Ile Val Pro Leu Gly Leu Met Phe Phe Cys Ile Leu 110 115 120

ttc aat tac aca ate ctt agg gac acg aag gat gtt ttg gtq gtg acg Phe Asn Tyr Thr lie Leu Arg Asp Thr Lys Asp vai Leu vai VaT Thr 125 130 135

cag atg gqa aca atg gag age ttg aag ttc ttg gtq tca tca cca tac Gln Met Gly Thr Met Glu Ser Leu Lys Phe Leu Val Ser ser Pro Tyr 350 355 360

495

gct aaa gqa agt tet gct gag att ata ccc ttt ttg aag aca tgg gtq 543

Ala Lys Gly Ser Ser Ala Glu Ile lie Pro Phe Leu Lys Thr Trp vai 140 145 150

aat gtt ccg atg gct att gqg ttt atg ttg cta tac acc aaa ctt tcc 591

Asn vai Pro Met Ala lie Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ser 155 160 165 170

aat gtt ctc tcc aaa aag gct ctc ttt tac act gtt att gtc cct ttc 639

Asn vai Leu Ser Lys Lys Ala Leu Phe Tyr Thr vai lie vai Pro Phe 175 180 185

att gtc tac ttt gqa gcc ttt gqt ttc gtq atg tac cct cgc age aat 687

lie vai Tyr Phe Gly Ala Phe Gly Phe vai Met Tyr Pro Arg Ser Asn 190 195 200

ttg att cag cct gaa gct ctt gct gat aag ctt ctt gea aca ctc gqc 735

Leu Ile Gln Pro Glu Ala Leu Ala Asp Lys Leu Leu Ala Thr Leu Gly 205 210 215

ccc aga ttc atg gqt cct ctc gea ate atg agg att tgg agt ttc tgt 783

Pro Arg Phe Met Gly Pro Leu Ala Ile Met Arg lie Trp Ser Phe Cys 220 225 230

ttg ttc tat gtc atg gct gag ctt tgg gqt agt gtt gtc gtt tca gtt 831

Leu Phe Tyr vai Met Ala Glu Leu Trp Gly Ser vai vai vai ser vai

235 240 245 250

ctc ttc tgg gqa ttt gcc aac cag att aca act gtt gac gaa gcc aaa 879

Leu Phe Trp Gly Phe Ala Asn Gln Ile Thr Thr Val Asp Glu Ala Lys 255 260 265

aag ttc tat cct ctg ttt gqa ctt gqg gcc aat gtt gea ctt ate ttc 927

Lys Phe Tyr Pro Leu Phe Gly Leu Gly Ala Asn Val Ala Leu Ile Phe

270 275 280

tca gqa aga act gtq aaa tat ttc tet aat atg aga aag aat ctt gqt 975

Ser Gly Arg Thr Val Lys Tyr Phe Ser Asn Met Arg Lys Asn Leu GTy 285 290 295

cct gqa gtt gat gqc tgg gct gtt tca tta aaa gct atg atg agt att 1023

Pro GTy vai Asp GTy Trp Ala vai Ser Leu Lys Ala Met Met Ser lie 300 305 310

gtc gtq gqg atg gqt ctc gcc ate tgt ttc ctc tac tgg tgg gtq aat 1071

vai VaT GTy Met GTy Leu Ala Ile Cys Phe Leu Tyr Trp Trp VaT Asn 315 320 325 330

aga tat gtq ccc ctt cca acc cgt age aag aag aag aag gtq aaa cca 1119

Arg Tyr VaT Pro Leu Pro Thr Arg Ser Lys Lys Lys Lys VaT Lys Pro 335 340 345

1167

att agg gat ctt gct act ttg gtg gtt gea tat gqa att agt ate aac 1215

lie Arg Asp Leu Ala Thr Leu VaT Val Ala Tyr GTy Ile Ser Ile Asn 365 370 375

ctt gtt gaa gtc aca tgg aaa tca aag ctt aaa agt cag ttc cct age 1263

Leu Val Glu Val Thr Trp Lys Ser Lys Leu Lys Ser Gln Phe Pro Ser 380 385 390

ccg aac gaa tat tca gea ttt atg gac gac ttc tca acc tgc aca gqt 1311

Pro Asn Glu Tyr Ser Ala Phe Met GTy Asp Phe Ser Thr Cys Thr GTy

395 400 405 410 att gca aca ttc aca atg atg ctt cta age caa tac gtg ttt aag aag 1359

Ile Ala Thr Phe Thr Met Met Leu Leu Ser Gln Tyr Val Phe Lys Lys 415 420 425

tat ggt tgg gga gta gct gca aag ate aca cca acc gtt ctg cta ttg 1407

Tyr Gly Trp Gly vai Ala Ala Lys lie Thr Pro Thr Val Leu Leu Leu 430 435 440

acc gqt gtc gcc ttc ttc tet ctg ata ctg ttt ggc ggc cca ttc gca Thr Gly Val Ala Phe Phe Ser Leu Ile Leu Phe Gly Gly Pro Phe Ala 445 450 455

1455

cca ttg gtt gcc aag ctt gqt atg aca ccg cta ctc gca gca gtg tac 1503

Pro Leu vai Ala Lys Leu Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala vai Tyr 460 465 470

gtt gtc cct cca gaa gta tet tca gca aga gtc caa gta cag cat tet 1551

vai vai Pro Pro Glu vai Ser Ser Ala Arg vai Gln vai Gln His ser 475 480 485 490

tcg act ccc tet gca atg caa gaa tgc tta tat cca ttg gat gag gtc 1599

Ser Thr Pro Ser Ala Met Gln Glu Cys Leu Tyr Pro Leu Asp Glu vai 495 500 505

tcc aag gta aag gca aag ctg caa ttg atg tgg tet gca acc att gqg 1647

Ser Lys Val Lys Ala Lys Leu Gln Leu Met Trp Ser Ala Thr Ile Gly 510 515 520

aaa tca ggc ggt gct cta ate cag cag ttc atg ate ctt aca ttc ggc 1695

Lys Ser Gly Gly Ala Leu lie Gln Gln Phe Met lie Leu Thr Phe Gly 525 530 535

tca ctc gcc aat tcc aca cct tac ctt gga gtc ate ctg ctc ggt ata 1743

Ser Leu Ala Asn Ser Thr Pro Tyr Leu Gly vai Ile Leu Leu Gly lie 540 545 550

gtc act gca tgg tta gca gca gct aaa tcg ctg gag gga cca gtt taa 1791 Val Thr Ala Trp Leu Ala Ala Ala Lys Ser Leu Glu Gly Pro Val 555 560 565

cactctcatg tctgaggaag agcttgagag ggaaatggag agagcttcat cagtcaagat 1851

tcctgttgta tctcaggagg atgcgccatc aggagaaact acgagccaac tatcggagaa 1911

atctactcct actggcattt agacgatgat gaataaaagg gttttgggat ttggttacct 1971

gttggtttta atgttttggt caggagtaat attttgatag tgagaagaca aaattaatca 2031

tttagttata tgtttttttg gttgttattg ttctcttgat gataccaata caaaactagt 2091

aataaaattt ccttgttcag taaaaaaaaa ccctgacgta gctcgagg 2139

<210> 8 <211> 569 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 8

Met Glu Gly Leu lie Gln Thr Arg Gly lie Leu ser Leu Pro Ala Ser 15 10 15

His Arg Ser Glu Lys Val Leu Gln Pro Ser His Gly Leu Lys Gln Arg 20 25 30

Leu Phe Thr Thr Asn Leu Pro Ala Leu Ser Leu Ser Leu Met Val Thr 35 40 45

Arg Asn Phe Lys Pro Phe Ser Lys Ser His Leu Gly Phe Arg Phe Pro 50 55 60 Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Ser Leu Ala Arg Arg Lys Leu Arg Arg 65 70 75 80

Pro Arg Arg Lys Cys vai Asp Glu Gly Asp Thr Ala Ala Met Ala vai

85 90 95

ser Pro Lys Ile Phe Gly vai Glu vai Thr Thr Leu Lys Lys Ile vai 100 105 110

Pro Leu Gly Leu Met Phe Phe Cys Ile Leu Phe Asn Tyr Thr lie Leu

115

120

125

Arg Asp Thr Lys Asp vai Leu vai vai Thr Ala Lys Gly Ser Ser Ala

130

135

140

Glu Ile Ile Pro Phe Leu Lys Thr Trp vai Asn vai Pro Met Ala Ile

145

150

155

160

Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Val Leu Ser Lys Lys

165 170 175

Ala Leu Phe Tyr Thr vai lie vai Pro Phe Ile vai Tyr Phe Gly Ala 180 185 190

Phe Gly Phe vai Met Tyr Pro Arg ser Asn Leu lie Gln Pro Glu Ala

195

205

Leu Ala Asp Lys Leu Leu Ala Thr Leu Gly Pro Arg Phe Met Gly Pro

210

215

220

Leu Ala lie Met Arg lie Trp ser Phe Cys Leu Phe Tyr vai Met Ala

225

230

235

240

Glu Leu Trp Gly Ser vai vai vai Ser Val Leu Phe Trp Gly Phe Ala

245 250 255

Asn Gln lie Thr Thr vai Asp Glu Ala Lys Lys Phe Tyr Pro Leu Phe

260 265 270

Gly Leu Gly Ala Asn vai Ala Leu Ile Phe Ser Gly Arg Thr Val Lys

275

280

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Tyr Phe Ser Asn Met Arg Lys Asn Leu Gly Pro Gly Val Asp Gly Trp

290

295

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310

315

320

Ala lie Cys Phe Leu Tyr Trp Trp Val Asn Arg Tyr vai Pro Leu Pro

325 330 335

Thr Arg ser Lys Lys Lys Lys Val Lys Pro Gln Met Gly Thr Met Glu 340 345 350

Ser Leu Lys Phe Leu Val Ser ser Pro Tyr Ile Arg Asp Leu Ala Thr 355 360 365 Leu vai vai Ala Tyr Gly lie ser Ile Asri Leu vai Glu Val Thr Trp 370 375 380

Lys Ser Lys Leu Lys Ser Gln Phe Pro ser Pro Asn Glu Tyr Ser Ala 385 390 395 400

Phe Met Gly Asp Phe Ser Thr Cys Thr Gly lie Ala Thr Phe Thr Met 405 410 415

Met Leu Leu ser Gln Tyr Val Phe Lys Lys Tyr Gly Trp Gly vai Ala 420 425 430

Ala Lys lie Thr Pro Thr vai Leu Leu Leu Thr Gly Val Ala Phe Phe 435 440 445

Ser Leu lie Leu Phe Gly Gly Pro Phe Ala Pro Leu Val Ala Lys Leu 450 455 460

Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala Val Tyr Val Val Pro Pro Glu Val 465 470 475 480

Ser Ser Ala Arg Val Gln Val Gln His Ser Ser Thr Pro Ser Ala Met 485 490 495

Gln Glu Cys Leu Tyr Pro Leu Asp Glu vai Ser Lys vai Lys Ala Lys 500 505 510

Leu Gln Leu Met Trp Ser Ala Thr Ile Gly Lys Ser Gly Gly Ala Leu 515 520 525

Ile Gln Gln Phe Met Ile Leu Thr Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Thr 530 535 540

Pro Tyr Leu Gly vai lie Leu Leu Gly Ile Val Thr Ala Trp Leu Ala 545 550 555 560

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Claims

1. Método para a produção de uma planta transgênica que exibe um teor de amido aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem e/ou cujo amido exibe um teor de amilose aumentado em comparação com amido oriundo de plantas de tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que em: (a) uma célula de planta é geneticamente modificada por meio de introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena que co- difica um translocador de ATP/ADP plastidial, cuja expressão le- va a um aumento na atividade translocadora de ATP/ADP plas- tidial na célula; (b) uma planta é regenerada a partir da célula produzida de acordo com a etapa (a); e (c) opcionalmente outras plantas são produzidas a partir da planta produzida de acordo com a etapa (b).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico codifica um translocador de ATP/ADP plastidial oriundo de Arabidopsis thaliana.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de armazenagem de amido.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta de plan- ta de milho, de trigo ou de batata.

5. Uso de moléculas de ácido nucléico que codificam um trans- locador de ATP/ADP plastidial, caracterizado pelo fato de ser para a produ- ção de plantas transgênicas que exibem um teor de amido aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem e/ou sintetizam um amido que exibe um teor de amilose aumentado em comparação com amido oriundo de plantas de tipo selvagem.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o translocador de ATP/ADP plastidial é AATP1 apresentando a se- qüência SEQ ID NO: 5.

7. Método de produção de um amido modificado, caracterizado pelo fato de que compreende a extração do amido de uma planta produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou a partir de material de propagação de planta que contém células de planta geneticamente modificadas, em que a modificação consiste na introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um translocador de ATP/ADP plastidial, cuja expressão leva a um aumento na atividade translocadora de ATP/ADP plastidial na célula.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o translocador de ATP/ADP plastidial é AATP1 apresentando a SEQ ID NO: 6.