WO2000008184A1 - Pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, verfahren zur herstellung der pflanzen, ihre verwendung sowie die modifizierte stärke - Google Patents

Pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, verfahren zur herstellung der pflanzen, ihre verwendung sowie die modifizierte stärke Download PDF

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WO2000008184A1
WO2000008184A1 PCT/EP1999/005182 EP9905182W WO0008184A1 WO 2000008184 A1 WO2000008184 A1 WO 2000008184A1 EP 9905182 W EP9905182 W EP 9905182W WO 0008184 A1 WO0008184 A1 WO 0008184A1
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starch
plant
nucleic acid
enzymes
cells
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PCT/EP1999/005182
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Volker Landschütze
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Aventis Cropscience Gmbh
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    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B30/00—Preparation of starch, degraded or non-chemically modified starch, amylose, or amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to recombinant nucleic acid molecules which contain two or more nucleotide sequences which encode enzymes involved in starch metabolism, processes for producing transgenic plant cells and plants which synthesize a starch which has been modified with regard to its phosphate content and its side chain structure. Furthermore, the present invention relates to vectors and host cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention, the plant cells and plants resulting from the processes according to the invention, the starch synthesized by the plant cells and plants according to the invention and processes for producing this starch.
  • polysaccharides are important, renewable raw materials from plants.
  • starch which is one of the most important storage substances in higher plants, plays a central role in the polysaccharides.
  • the potato plays an important role in starch production.
  • the polysaccharide starch is a polymer made up of chemically uniform building blocks, the glucose molecules. However, it is a very complex mixture from different molecular forms that differ in terms of their degree of polymerization and the occurrence of branches of the glucose chains. Starch is therefore not a uniform raw material.
  • amylose starch an essentially unbranched polymer composed of ⁇ -1,4-glycosidically linked glucose molecules, and amylopectin starch, which in turn is a complex mixture of differently branched glucose chains.
  • the branches come about through the occurrence of additional ⁇ -1,6-glycosidic linkages.
  • the synthesized starch consists of approximately 25% amylose starch and approximately 75% amylopectin starch.
  • the molecular structure of the starch which is largely determined by the degree of branching, the amylose / amylopectin ratio, the average length and distribution of the side chains and the presence of phosphate groups, is crucial for important functional properties of the starch or its aqueous solutions .
  • important functional properties are solubility, retrograding behavior, film-forming properties, viscosity, color stability, gelatinization properties, and binding and adhesive properties.
  • the starch grain size can also be important for various applications.
  • the production of starches containing high amylose is of particular interest for certain applications.
  • a modified starch contained in plant cells can advantageously change the behavior of the plant cell under certain conditions.
  • the biochemical pathways that lead to starch building are essentially known.
  • the starch synthesis in plant cells takes place in the plastids.
  • Important enzymes involved in starch synthesis are, for example, branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch-bound Starch synthases, soluble starch synthases, debranching enzymes, disproportionation enzymes, plastid starch phosphorylases and the R1 enzymes (R1 proteins).
  • the object of the present invention is to develop further or alternative genetic engineering approaches for modifying the starch metabolism in starch-forming plants (for example rye, barley, oats, maize, wheat, millet, sago, rice, pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rape, To provide soybean, hemp, flax, sunflower, cow pea, mung bean, bean, banana or arrowroot) or suitable nucleic acid molecules by means of which plant cells can be transformed, so that the synthesis of modified, advantageous starch varieties is made possible.
  • starch-forming plants for example rye, barley, oats, maize, wheat, millet, sago, rice, pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rape,
  • suitable nucleic acid molecules by means of which plant cells can be transformed, so that the synthesis of modified, advantageous starch varieties is made possible.
  • Such changed starch varieties e.g. Modifications related to their degree of branching, the amylose / amylopectin ratio, the phosphate content, the starch grain size and / or the average length and distribution of the side chains (i.e. side chain structure).
  • Another object of the invention is to provide methods which enable the production of transgenic plants which synthesize a modified (modified) starch variety.
  • transgenic plants or plant cells which have been transformed with the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention synthesize a starch which has been changed in its particular physicochemical properties and / or in its side chain structure in the particular manner according to the invention.
  • known starches which are synthesized by transgenic plants do not show the changes according to the invention.
  • the invention therefore relates to a recombinant nucleic acid molecule (nucleotide sequence) comprising a) at least one nucleotide sequence (polynucleotide or nucleic acid molecule) coding for a protein with the function of a soluble starch synthase III or fragments of said nucleotide sequence and b) one or more nucleotide sequences which are suitable for one Encode protein, selected from group A, consisting of proteins with the function of branching enzymes (BE I, Ha and 11b), ADP-glucose pyrophosphorylases, starch-bound starch synthases, soluble starch synthases I, II or others, debranching enzymes, disproportionation enzymes, plastidary Starch phosphorylases, R1 enzymes, amylases and glucosidases or their fragments - preferably soluble starch synth
  • group A consisting of proteins with the function of branching enzymes (BE
  • Nucleotide sequences which are suitable according to the invention and which code for a protein with the function of a soluble starch synthase III are known, for example, from EP-A-0779363.
  • the term “nucleotide sequence coding for a protein with the function of a soluble starch synthase IN” should be understood in particular to mean those sequences whose coding region has a length of 3000-4500 bp, preferably 3200-4250 bp, particularly preferably 3400- 4000 bp and their homology to the entire coding region of a nucleic acid coding for a protein with the function of a starch synthase is at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferably at least 95%.
  • Nucleotide sequences which are suitable according to the invention and which code for a group A protein are, for example, soluble starch synthases (type I, II or other) or starch grain-bound starch synthase isoforms (for example Hergersberg, 1988, dissertation, University of Cologne; Abel, 1995, dissertation FU Berlin ; Abel et al., 1996, Plant Journal 10 (6): 981-991; Visser et al., 1989, Plant Sei. 64: 185-192; van der Leij et al., 1991, Mol. Gen. Genet.
  • soluble starch synthases type I, II or other
  • starch grain-bound starch synthase isoforms for example Hergersberg, 1988, dissertation, University of Cologne; Abel, 1995, dissertation FU Berlin ; Abel et al., 1996, Plant Journal 10 (6): 981-991; Visser et al., 1989, Plant Sei. 64: 185-192; van der Lei
  • Branching enzyme isoforms (branching enzyme I, IIa, Mb), debranching enzyme isoforms (debranching enzymes, isoamylases, pullulanases), • or disproportionation enzyme isoforms described for example in WO 92/14827; WO 95/07335; WO 95/09922; WO 96/19581; WO 97/22703; WO 97/32985; WO 97/42328; Takaha et al., 1993, J. Biol.
  • Botany 41 (Suppl.) 5-7; Lin et al., 1991, Plant Physiol. 95: 1250-1253; Sonnewald et al., 1995, Plant Mol. Biol. 27: 567-576; DDBJ No. D23280; Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 473-477 and for amylases and glucosidases.
  • nucleotide sequences to be used according to the invention are of pro- or eukaryotic origin, preferably of bacterial, fungal or vegetable origin.
  • fragment means parts of the Nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention which are at least 15 bp, preferably at least 150 bp, particularly preferably at least 500 bp long, but generally do not exceed a length of 5000 bp, preferably 2500 bp.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • fragment encompasses biologically active molecules.
  • a “specific hybridization” is particularly preferably carried out under the following • highly stringent conditions:
  • Hybridization buffer 2 x SSC; 10 x Denhardt's solution (Fikoll 400 + PEG + BSA; ratio 1: 1: 1); 0.1% SDS; 5mM EDTA; 50 mM Na 2 HPO 4 ; 250 ⁇ g / ml herring sperm DNA; 50 ⁇ g / ml tRNA; or 0.25 M sodium phosphate buffer pH 7.2; 1mM EDTA; 7% SDS in one
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention.
  • “Fragments” are not only understood to mean parts of the nucleic acid molecules that are long enough to encode a functionally active part of the proteins described.
  • the term “derivative” in the context of the present invention means that the sequences of these molecules differ from the Sequences of the invention or according to the invention distinguish using nucleic acid molecules at one or more positions and have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 60%, preferably over 70% and particularly preferably over 85%, in particular over 90% and very particularly preferably over 95%.
  • the deviations from the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention may have arisen from one or more deletions, substitutions, insertions (addition) or recombinations.
  • nucleic acid molecules which are homologous to the molecules according to the invention or to be used according to the invention and which are derivatives of these molecules are generally variations of these molecules which represent modifications which have the same, an almost identical or similar biological function.
  • These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other plant species, or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis.
  • the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention can be DNA molecules, in particular cDNA or possibly the combination of genomic molecules. Furthermore, the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention can be RNA molecules.
  • the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention or fragments thereof can e.g. B. obtained from natural sources, be produced by recombinant techniques or synthetically.
  • nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention in sense or antisense orientation in plant cells are linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • These include promoters in particular.
  • any promoter active in plant cells can be used for the expression.
  • the promoter can be selected so that the expression takes place constitutively or only in a certain tissue, at a certain time in plant development or at a time determined by external influences, which can be chemically or biologically inducible, for example.
  • the promoter - like the nucleotide sequence - can be homologous or heterologous.
  • Suitable • promoters are, for example, the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus and the ubiquitin promoter from maize for a constitutive expression, the patatin promoter B33 (Rocha-Sosa et al, 1989, EMBO J. 8:. 23-29) for a bulb-specific expression in potatoes or a promoter which ensures expression only in photosynthetically active tissues, for example the ST-LS1 promoter (Stockhaus et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2445-2451) the Ca / b promoter (e.g.
  • a termination sequence terminating the nucleic acid molecule according to the invention can serve for the correct completion of the transcription, as well as the addition of a poly-A tail to the transcript, which is believed to have a function in stabilizing the transcripts.
  • Such elements are described in the literature (cf. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) and are generally interchangeable.
  • the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention can be used for the production of transgenic plant cells and plants which are each increased and / or decreased in the activity of the soluble starch synthase III and at least one further enzyme, the starch metabolism.
  • the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention are introduced into suitable vectors, provided with the necessary regulatory nucleic acid sequences for efficient transcription in plant cells and introduced into plant cells. It consists • a possibility to use the invention or used according to nucleic acid molecules to inhibit the synthesis of endogenous soluble starch synthase III and / or at least one further protein of the group A in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention can be used to express the soluble starch synthase III and / or at least one other protein of group A in cells of transgenic plants and thus lead to an increase in the activity of the respectively expressed enzymes in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention for inhibiting the synthesis of the endogenous soluble starch synthase III and the overexpression of at least one further protein of group A in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention can also be used to express soluble starch synthase III and to inhibit at least one other Group A protein in cells of transgenic plants. The latter two embodiments of the invention thus lead to a simultaneous inhibition and increase in the activities of the respectively inhibited or expressed enzymes in the cells.
  • Another object of the invention is a vector containing a nucleic acid molecule according to the invention.
  • vector encompasses plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which contain the nucleic acid molecules according to the invention and are suitable for transforming cells.
  • Such vectors are preferably suitable for transforming plant cells. They particularly preferably allow the nucleic acid molecules according to the invention, optionally together with flanking regulatory regions, to be integrated into the genome of the plant cell. Examples of this are binary vectors, such as pBinAR or pBinB33, which can be used in the gene transfer mediated by agrobacteria.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which codes for a protein with the function of a soluble starch synthase III or whose fragments are present in the sense or anti-sense direction.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which codes for one or more proteins selected from group A or fragments thereof is present in the sense or antisense direction.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which is for several Proteins selected from group A are encoded or fragments thereof, partly in the sense direction and partly in the anti-sense direction.
  • the vector according to the invention very particularly preferably contains one or more regulatory elements which ensure the transcription and synthesis of an RNA in a pro- or eukaryotic cell.
  • deletions at the 5 'end of the DNA sequence make it possible, for example, to specifically produce enzymes which, by removing the corresponding transit or signal sequences, no longer in their original (homologous) compartment, but in the cytosol, or due to the addition of other signal sequences in one or more other (heterologous) compartments (eg plastid, vacuole, mitochondrium, apoplast) are localized.
  • heterologous compartments eg plastid, vacuole, mitochondrium, apoplast
  • the introduction of point mutations is also conceivable at positions in which a change in the amino acid sequence has an influence, for example on the enzyme activity or the regulation of the enzyme.
  • the DNA sequences according to the invention or to be used according to the invention or fragments of these sequences can be introduced into plasmids which permit mutagenesis or a sequence change by recombination of DNA sequences. With the help of standard molecular biological methods (cf.
  • Base exchanges can be carried out or natural or synthetic sequences can be added.
  • adapters or links can be attached to the parts.
  • Manipulations that provide suitable restriction sites or that remove excess DNA or restriction sites that are no longer required can also be used. Where insertions, deletions or substitutions are possible, w ' fra mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Sequence analysis, restriction analysis and possibly other biochemical-molecular biological methods are generally carried out as the analysis method.
  • Another object of the invention is a transgenic host cell with altered starch metabolism, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, preferably bacterial or plant (monocotyledon or dicotyledonous) cells (for example from E. coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, rye, barley, oats, maize, Wheat, millet, sago, rice, pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rapeseed, soybean, hemp, flax, sunflower, cow pea, mung bean, bean, banana or arrowroot), the one or more nucleic acid molecules according to the invention or one or more according to the invention Contains vectors, or which is derived from such a cell.
  • prokaryotic or eukaryotic cells preferably bacterial or plant (monocotyledon or dicotyledonous) cells (for example from E. coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, rye
  • Yet another object of the invention is a transgenic host cell with an altered starch metabolism, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, preferably bacterial or plant cells (for example from E. coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Rye, Barley, Oats, Corn, Wheat, Millet, Sago, Rice, Pea, Pea, Cassava, Potato, Tomato, Rapeseed, Soybean, Hemp, Flax, Sunflower, Cow Pea, Mung Bean, Bean, Banana or Arrowroot) which contains a) at least one nucleotide sequence coding for a protein with the function of a soluble starch synthase III or its fragments and b) one or more nucleotide sequences which code for a protein selected from group A, or whose fragments or nucleotide sequences hybridizing with these nucleic acid molecules , or which is derived from such a cell.
  • prokaryotic or eukaryotic cells
  • host cells according to the invention can also be produced by successive transformation (for example by so-called “supertransformation"), in which several parts of the nucleotide sequence according to the invention or several vectors containing parts of the nucleotide sequence according to the invention which code for a protein with the function of a soluble starch synthase III or their fragments and also one or more proteins selected from group A consisting of branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch granule-bound starch synthases, soluble starch synthases I, II or others, debranching enzymes, disproportionation enzymes, plastid starch phosphorylases, amylases, R1 - Enzymes, their fragments - preferably soluble starch synthases II, soluble starch synthases I and / or branching enzymes and their fragments - and nucleic acid molecules, which with one of the hybridize said
  • the cell is transformed with a) at least one nucleic acid molecule which encodes a protein with the function of a soluble starch synthase III, its fragment or with a vector containing said nucleic acid molecule, and b) with one or more nucleic acid molecules which encode a protein, which is selected from group A, consisting of branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch-bound starch synthases, soluble starch synthases I, II or others, Branching enzymes, disproportionation enzymes, amylases, glucosidases, plastid starch phosphorylases and R1 enzymes, or their fragments - preferably soluble starch synthases II, soluble starch synthases I and / or branching enzymes and their fragments - and nucleic acid molecules which hybridize with one of said or their nucleotide sequences or their nucleotide sequences one or more vectors containing one or more of said
  • Another object of the invention is a method for producing a transgenic host cell, bacterial cell, plant cell or plant which synthesizes a modified starch, characterized in that a) at least one nucleic acid molecule which encodes a protein with the function of a soluble starch synthase III or its fragments and b) one or more nucleic acid molecules which encode a protein which is selected from group A, consisting of branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch-bound starch synthases, soluble starch synthases I, II or others, debranching enzymes, disproportionation enzymes, amylases, Glucosidases, plastidic starch phosphorylases and R1 enzymes or their fragments - preferably soluble starch synthases II, soluble starch synthases I and / or branching enzymes and their fragments - and nucleic acid molecules which are associated with one of said nucleotide sequences or their fragment
  • a further embodiment of the present invention relates to a method for producing a transgenic host cell, bacterial cell, plant cell or plant which synthesizes a modified starch, characterized in that one or more nucleic acid molecules according to the invention or one or more vectors according to the invention are integrated into the genome of a cell and if necessary, an entire plant is regenerated from the transgenic plant cell.
  • nucleic acid molecules according to the invention it is possible, using genetic engineering methods, to intervene in the starch metabolism of plants and to change it in such a way that a modified starch is synthesized which, for example, in terms of structure, water content, protein content, lipid content, fiber content, Ash / phosphate content, amylose / amylopectin ratio, molecular weight distribution, degree of branching, grain size and shape as well as crystallization or also in their physico-chemical properties such as flow and sorption behavior, gelatinization temperature, viscosity, thickening performance, solubility, paste structure, transparency, heat, shear and Acid stability, tendency to retrogradation, gel formation, freeze / thaw stability, complex formation, iodine binding, film formation, adhesive strength, enzyme stability, digestibility or reactivity is changed compared to starch synthesized in wild-type plants.
  • a modified starch which, for example, in terms of structure, water content, protein content, lipid content, fiber content, Ash
  • the synthesized protein can be located in any compartment of the plant cell.
  • the transit or signal sequence ensuring the localization may have to be deleted (removed) and the remaining coding region may have to be linked to DNA sequences, which ensure localization in the respective compartment.
  • sequences are known (see, for example, Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the production of plant cells with a reduced activity of a protein involved in starch metabolism can be achieved, for example, by the expression of a corresponding antisense-RNA, a sense-RNA to achieve a cosuppression effect, in vivo mutagenesis or the expression of a correspondingly constructed ribozyme that specifically transcripts cleaves which encode one of the proteins involved in starch metabolism using a nucleic acid molecule according to the invention, preferably by expression of an antisense transcript.
  • a DNA molecule can be used which comprises the entire sequence coding for a protein involved in starch metabolism, including any flanking sequences which may be present, and also DNA molecules which only comprise parts of the coding sequence, these parts having a minimum length of 15 bp, preferably of at least 100-500 bp, and in particular of over 500 bp.
  • DNA molecules are used which are shorter than 5000 bp, preferably shorter than 2500 bp.
  • DNA sequences that have a high degree of Have homology to the sequences of the DNA molecules according to the invention, but are not completely identical.
  • the minimum homology should be greater than approximately 65%.
  • sequences with a homology of about 75 to 85% and in particular of about 85 to 95% is preferred.
  • ribozymes to reduce the activity of certain proteins in cells is known to the person skilled in the art and is described, for example, in EP-B1-0 321 201.
  • the expression of ribozymes in plant cells has been described e.g. described in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
  • the reduction of the proteins involved in starch metabolism in the plant cells according to the invention can also be achieved by the so-called "in vivo mutagenesis", in which a hybrid RNA-DNA oligonucleotide ("chimeroplast”) is introduced into cells by transforming cells (Kipp PB et al, Poster session at.
  • in vivo mutagenesis in which a hybrid RNA-DNA oligonucleotide (“chimeroplast”) is introduced into cells by transforming cells (Kipp PB et al, Poster session at.
  • Part of the DNA component of the RNA-DNA oligonucleotide used here is homologous to a nucleic acid sequence of an endogenous protein, but has a mutation in comparison to the nucleic acid sequence of the endogenous protein or contains a heterologous region which is enclosed by the homologous regions.
  • the mutation or heterologous region contained in the DNA component of the RNA-DNA oligonucleotide can be transferred into the genome of a plant cell. This leads to a decrease in the activity of the protein involved in starch metabolism.
  • the enzyme activities involved in starch metabolism in the plant cells can be reduced by a cosuppression effect.
  • This method is described, for example, in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet 248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621).
  • DNA molecules can be used for the transformation, which simultaneously contain several regions coding for the corresponding enzymes in antisense orientation under the control of a suitable promoter.
  • Each sequence can alternatively be under the control of its own promoter, or the sequences can be transcribed as a fusion from a common promoter, so that the synthesis of the proteins in question is inhibited to approximately the same or different extent.
  • the length of the individual coding regions which are used in such a construct what has already been stated above for the production of antisense constructs applies. In principle, there is no upper limit for the number of antisense fragments transcribed from a promoter in such a DNA molecule. However, the resulting transcript should generally not exceed a length of 25 kb, preferably 15 kb.
  • nucleic acid molecules according to the invention With the aid of the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention, it is therefore possible to transform plant cells and to inhibit the synthesis of several enzymes simultaneously.
  • Nucleic acid molecules are introduced into classic mutants that are defective or defective in relation to one or more genes of starch biosynthesis (Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition: 25 -86).
  • defects can relate, for example, to the following proteins: starch-grain-bound (GBSS I) and soluble starch synthases (SS I, II, III and others), branching enzymes (BE I, Ha and IIb), "debranching" enzymes (R-enzymes , Isoamylases, pullulanases), disproportionation enzymes and plastid starch phosphorylases.
  • GBSS I starch-grain-bound
  • SS I, II, III and others branching enzymes
  • BE I, Ha and IIb branching enzymes
  • R-enzymes "debranching" enzymes
  • Isoamylases Isoamylases, pullulanases
  • disproportionation enzymes plastid starch phosphorylases.
  • the present invention relates thus also to transgenic plant cells obtainable by a method according to the invention which are derived with an inventive or have been transformed according to the invention to be used in nucleic acid molecule or vector, as well as transgenic plant cells or plants transformed by such ⁇ cells.
  • the cells according to the invention contain one or more nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention, these preferably being linked to one or more regulatory DNA elements (for example promoter, enhancer, terminator) which ensure transcription in plant cells, in particular with a promoter.
  • regulatory DNA elements for example promoter, enhancer, terminator
  • the cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring plant cells, inter alia, in that they contain a nucleic acid molecule according to the invention which does not naturally occur in these cells or in that such a molecule is integrated at a location in the genome of the cell where it is not otherwise occurs, ie in a different genomic environment.
  • the transgenic plant cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring plant cells in that they contain at least one copy of a nucleic acid molecule according to the invention stably integrated into their genome, optionally in addition to copies of such a molecule or the nucleic acid molecules to be used according to the invention that occur naturally in the cells.
  • the plant cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring cells, in particular in that these additional copy (s) are (are) located at locations in the genome where they do not naturally occur. This can be checked, for example, using a Southern blot analysis.
  • Plant cells according to the invention are preferred in which the enzyme activity of individual enzymes involved in starch metabolism is increased and / or decreased by at least 10%, particularly preferably at least 30% and very particularly preferably by at least 50%.
  • the plant cells according to the invention can preferably be distinguished from naturally occurring plant cells by at least one of the following features: If the nucleic acid molecule introduced is heterologous with respect to the plant cell, the transgenic plant cells have transcripts of the nucleic acid molecules introduced. These can e.g. B. by Northem blot analysis.
  • the plant cells according to the invention contain one or more proteins which are encoded by an introduced nucleic acid molecule according to the invention or to be used according to the invention. This can e.g. B. by immunological methods, in particular by Western blot analysis.
  • the cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring nucleic acid molecules, for example due to the additional expression of nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention.
  • the transgenic plant cells contain, for example, more or fewer transcripts of the nucleic acid molecules according to the invention or to be used according to the invention. This can e.g. B. detected by Northem blot analysis.
  • "More” or “less” means here preferably at least 10% more or less, preferably at least 20% more or less and particularly preferably at least 50% more or less transcripts than corresponding non-transformed cells.
  • the cells preferably also have a corresponding (at least 10%, 20% or 50%) increase or decrease in the content of the protein encoded by the introduced nucleic acid molecules.
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention and processes for producing transgenic plants by regeneration of whole plants from the plant cells according to the invention are likewise the subject of the present invention.
  • the invention furthermore relates to plants which contain the transgenic plant cells according to the invention.
  • the transgenic plants can in principle be plants of any species, i.e. both monocot and dicot plants. They are preferably useful plants and starch-storing plants, such as e.g.
  • Cereals (rye, barley, oats, maize, wheat, millet etc.), sago, rice, peas, marker peas, cassava, potatoes, tomatoes, rapeseed, soybeans, hemp, flax, sunflower, cow peas, mung beans or arrowroot.
  • the invention also relates to propagation material of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, calli, protoplasts, cell cultures etc.
  • the change in the enzymatic activities of the enzymes involved in the starch metabolism results in the synthesis of a starch with a different structure in the plants produced by the process according to the invention.
  • a large number of cloning vectors are available to prepare the introduction of foreign genes into higher plants, which a replication signal for E.coli and contain a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC-Ser ⁇ en, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequences can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells. Transformed E.co// cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed. The plasmid is recovered.
  • Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained (Sambrook et al. Loc.cit.). After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts using polyethylene glycol (PEG), the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and further possibilities (Gene Transfer to Plants. pp. 24-29, eds .: Potrykus, I. and Spangenberg, G., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995).
  • PEG polyethylene glycol
  • DNA When DNA is injected and electroporated into plant cells, there are no special requirements for the plasmids or DNA used. Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. If whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. If whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • additional DNA sequences may be required. Used for example for the transformation of the plant cell If the Ti or Ri plasmid is used, at least the right boundary, but frequently the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as the flank region, must be linked to the genes to be introduced.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the ' r region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria.
  • T-DNA border region They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Serving as host cell should contain a plasmid of Agrobacterium carrying a w 'R region. The v / r region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present. The agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is described in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • From the infected plant material e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension cultivated Plant cells
  • a suitable medium which can contain, for example, antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other possibilities of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (cf. e.g. Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. Rehm, G. Reed, A. Pühler , P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
  • EP 292 435 describes a process by means of which fertile plants can be obtained starting from a slimy, soft (friable) granular corn callus. Shillito et al. (Bio / Technology 7 (1989), 581) have observed in this connection that it is also necessary for the regenerability to fertile plants to start from callus suspension cultures, from which a dividing protoplast culture with the ability to regenerate plants, can be produced. Prioli and Sondahl (Bio / Technology 7 (1989), 589) also describe regeneration and Obtaining fertile maize plants from maize protoplasts.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It usually contains a selection marker that gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin and others. taught.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic characteristics.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds o.a. are harvested to ensure that the appropriate phenotype or other traits have been preserved.
  • the transgenic plant cells and plants according to the invention synthesize a starch whose physicochemical properties have been changed, for example, compared to starch synthesized in wild-type plants.
  • Yet another object of the invention is starch, which can be obtained from a plant cell according to the invention, a plant, its propagation material or by a method according to the invention.
  • Another subject of the invention is a process for the production of starch in a manner known per se, in which host cells, plant cells, plants, plant parts or propagation material according to the invention are processed or integrated into the process.
  • the starch according to the invention is distinguished by the fact that it has one in comparison to a starch which can be obtained from a non-transformed cell or plant (ie the wild type), by at least 30%, preferably at least 50% preferably has at least 70% and very particularly preferably at least 90% reduced phosphate content and their glucan content (see Fraction 3 in Example No. 13) after isoamyiase treatment in the excluded volume of an HPLC column system consisting of 2 TSK-Gel 2000SW- Columns and a TSK-Gel 3000SW column in 10 mM sodium acetate pH 3.0 (at a flow rate of 0.35 ml / min as described in Example No. 13) by at least 50%, preferably at least 150%, particularly preferably at least 300 % and most preferably at least 500% is increased.
  • the starch according to the invention is characterized in that, compared to a starch which can be obtained from a non-transformed cell or plant (ie the wild type), one by at least 10%, preferably at least 30% and particularly preferably has at least 50% increased phosphate content and their glucan content (see Fraction 3 in Example No. 13) after isoamyiase treatment in the exclusion volume of an HPLC column system consisting of 2 TSK-Gel 2000SW columns connected in series and a TSK-Gel 3000SW Column in 10 mM sodium acetate pH 3.0 (at a flow rate of 0.35 ml / min as described in Example No.
  • Another embodiment of the present invention also includes the use of the starch according to the invention in the industrial field, preferably for the production of foods, packaging materials or disposable articles.
  • the starch according to the invention can be chemically and / or physically modified by methods known to those skilled in the art and is suitable in unmodified or modified form for various uses in the food or non-food sector.
  • the possible uses of the starch according to the invention can basically be divided into two large areas.
  • One area includes the hydrolysis products of the Starch, mainly glucose and glucose building blocks obtained by enzymatic or chemical processes. They " serve as a starting material for further chemical modifications and processes, such as fermentation. Of importance here may be the simplicity and cost-effective execution of a hydrolysis process, as is currently carried out essentially enzymatically using amyloglucosidase. Cost savings would be conceivable through a lower use of enzymes
  • a change in the structure of the starch for example an increase in the surface area of the grain, easier digestibility due to a lower degree of branching or a steric structure which limits the accessibility for the enzymes used, could result in this.
  • Starch is a classic additive for many foods, where it essentially takes on the function of binding aqueous additives or increases the viscosity or increases gel formation. Important characteristics are the flow and sorption behavior, the swelling and gelatinization temperature, the viscosity and thickening performance, the solubility of the starch, the transparency and paste structure, the heat, shear and acid stability, the tendency to retrogradation, the ability to form films, the Freeze / thaw stability, digestibility and the ability to form complexes with e.g. inorganic or organic ions.
  • starch is used as an additive for different manufacturing processes or as an additive in technical products.
  • starch is primarily used for retardation (retention of solids), the imaging of filler and fine particles, as a strengthening agent and for drainage.
  • the favorable properties of the starch in terms of rigidity, hardness, sound, grip, gloss, smoothness, splitting resistance and surfaces are exploited.
  • starches A large area of use of starches is in the adhesive industry, where the possible uses are divided into four areas: use as pure starch glue, use with starch glues prepared with special chemicals, use of starch as an additive to synthetic resins and polymer dispersions, and use of starches as an extender for synthetic adhesives.
  • 90% of the starch-based adhesives are used in the fields of corrugated cardboard manufacture, paper sacks, bags and pouches, composite materials for paper and aluminum, cardboard and Remoistening glue used for envelopes, stamps etc.
  • starch as an auxiliary and additive is the area of manufacture of textiles and textile care products.
  • the following four areas of application can be distinguished within the textile industry:
  • starch as a sizing agent, i.e. as an auxiliary for smoothing and strengthening the hook-and-loop behavior to protect against the tensile forces acting during weaving and to increase the abrasion resistance during weaving
  • starch as an agent for textile finishing, especially after quality-reducing pretreatments such as bleaching, dyeing etc.
  • starch as a thickening agent in the manufacture of color pastes to prevent dye diffusion and starch as an additive to chaining agents for sewing threads.
  • the fourth area of application is the use of starches as an additive in building materials.
  • One example is the production of gypsum plasterboard, in which the starch mixed in the gypsum slurry pastes with the water, diffuses to the surface of the gypsum board and binds the cardboard to the board there.
  • Other areas of application are admixing to plaster and mineral fibers.
  • starch products are used to delay setting.
  • starch products lends itself to the manufacture of soil stabilization agents that are used to temporarily protect soil particles from water during artificial earth movements.
  • Combined products made of starch and polymer emulsions are, according to current knowledge, equivalent in their erosion and crust-minimizing effect to the products previously used, but are priced significantly below these.
  • starches are used as binders for tablets or for binder dilution in capsules. Starches also serve as tablet disintegrants since they absorb liquid after swallowing and swell to such an extent after a short time that the active substance is released. Medical lubricant and wound powders are based on starch for qualitative reasons. In the field of cosmetics, starches are used, for example, as carriers for powder additives such as fragrances and salicylic acid. A relatively large area of application for starch is toothpaste.
  • Starch is used as an additive to coal and briquette. Coal can be agglomerated or briquetted with a high-quality addition of starch, which prevents the briquettes from breaking down prematurely.
  • the added starch is between 4 and 6% for barbecued coal and between 0.1 and 0.5% for calorized coal. Furthermore, starches are becoming increasingly important as binders, since their addition to coal and briquette can significantly reduce the emissions of harmful substances.
  • Starch can also be used as a flocculant in ore and coal sludge processing. 2:10. Foundry auxiliary
  • Bentonite which is mixed with modified starches, mostly swelling starches, is predominantly used today as a binder.
  • starch addition is to increase the flowability and improve the binding strength.
  • swelling starches can have other production requirements, such as dispersibility in cold water, rehydration, good miscibility in sand and high water retention capacity.
  • Starch is used in the rubber industry to improve technical and optical quality. The reasons for this are the improvement of the surface gloss, the improvement of the handle and the appearance, for this reason starch is sprinkled on the sticky rubberized surfaces of rubber materials before the cold vulcanization, and the improvement of the printability of the rubber.
  • starch secondary products in the processing process (starch is only a filler, there is no direct link between synthetic polymer and starch) or, alternatively, the integration of starch secondary products in the production of polymers (starch and polymer are one firm bond).
  • starch as a pure filler is not competitive compared to other substances like talc. It is different if the specific starch properties come into play and this significantly changes the property profile of the end products.
  • thermoplastics such as polyethylene.
  • the starch and the synthetic polymer are combined by co-expression in a ratio of 1: 1 to form a 'master batch', from which various products are made using granulated polyethylene using conventional processing techniques.
  • the incorporation of starch in polyethylene foils can result in increased material permeability in the case of hollow bodies, improved water vapor permeability, improved antistatic behavior, improved antiblocking behavior and improved printability with aqueous inks.
  • Current disadvantages include insufficient transparency, reduced tensile strength, and reduced ductility.
  • starch in polyurethane foams.
  • starch derivatives By adapting the starch derivatives and by optimizing the process, it is possible to control the reaction between synthetic polymers and the hydroxyl groups of the starches.
  • the result is polyurethane foils, which get the following property profiles through the use of starch: a reduction in the coefficient of thermal expansion, a reduction in shrinkage behavior, an improvement in pressure / stress behavior, an increase in water vapor permeability without changing the water absorption, a reduction in flammability and tear density, no dripping of flammable parts, Halogen free and reduced aging.
  • Disadvantages that are currently still present are reduced compressive strength and reduced impact resistance.
  • Solid plastic products such as pots, plates and bowls also have a starch content of over 50%. Furthermore, starch / polymer mixtures can be assessed favorably because they have a much higher biodegradability.
  • starch graft polymer seeds Due to their extreme water-binding capacity, starch graft polymer seeds have become extremely important. These are products with a backbone made of starch and a side grid of a synthetic monomer grafted on according to the principle of the radical chain mechanism.
  • the starch graft polymers available today are characterized by better binding and retention properties of up to 1000 g of water per g of starch with high viscosity.
  • the areas of application for these superabsorbents have expanded significantly in recent years and are in the hygiene area with products of diapers and pads as well as in the agricultural sector, e.g. seed pilling.
  • modified starches by means of genetic engineering methods can, on the one hand, change the properties of the starch obtained, for example, from the plant in such a way that further modifications by means of chemical or physical changes no longer appear necessary.
  • starches modified by genetic engineering processes can also be subjected to further chemical modifications, which leads to further improvements in quality for certain of the areas of use described above.
  • This chemical Modifications are generally known. In particular, these are modifications by heat and pressure treatment, treatment with organic or inorganic acids, enzymatic treatment, oxidations and esterifications, which lead, for example, to the formation of phosphate, nitrate, sulfate, xanthate, acetate and citrate starches.
  • monohydric or polyhydric alcohols can be used in the presence of strong acids to produce starch ethers, so that starch alkyl ethers, O-allyl ethers, hydroxylalkyl ethers, O-carboxylmethyl ethers, N-containing starch ethers, P-containing starch ethers, S-containing starch ethers, crosslinked Starches or starch graft polymers result.
  • the starches according to the invention are used in industrial applications, preferably for food or in the production of packaging materials and disposable articles.
  • Buffer B 50mM Tris-HCl pH 7.6 2.5mM DTT 2mM EDTA
  • Buffer C 0.5 M sodium citrate pH 7.6 50 mM Tris-HCl pH 7.6 2.5 mM DTT 2 mM EDTA
  • Dialysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.0 50 mM NaCI 2 mM EDTA 14.7 mM beta-mercaptoethanol 0.5 mM PMSF
  • the vector pBluescript II SK (Stratagene) was used for cloning in E. co / V.
  • the E. co // strain DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) was used for the Bluescript vector p Bluescript II KS (Stratagene) and for the pBinAR Hyg and pBinB33 Hyg constructs.
  • the E. co // strain XL1-Blue was used for the in vivo excision.
  • the plasmid pBinAR is a derivative of the binary vector plasmid pBin19 (Bevan, 1984), which was constructed as follows:
  • a 529 bp fragment comprising nucleotides 6909-7437 of the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus was isolated as an EcoRI / Kpnl fragment from the plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) and between the EcoRI and Kpnl sites of the polylinker of pUC18 ligated and was called plasmid pUC18-35S.
  • a 192 bp fragment was isolated from the plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) with the aid of the restriction endonucleases Hindlll and Pvull, which comprises the DNA of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al, 1984) (nucleotides 11749-11939 ). After adding Sphl linkers to the Pvull site, the fragment was ligated between the SpHI and HindIII sites of pUC18-35S and was designated plasmid pA7.
  • the promoter of the Patatin gene B33 from Solanum tuberosum was inserted as a Dral fragment (nucleotides -1512 - +14) in the vector pUC19 cut with Sst I, the ends of which were obtained with the aid of T4-DNA polymerase had been smoothed, ligated. This resulted in the plasmid pUC19-B33.
  • the B33 promoter was cut out from this plasmid with EcoRI and Smal and ligated into the correspondingly cut vector pBinAR. This gave rise to the plant expression vector pBinB33.
  • the DNA was transferred by direct transformation using the Höfgen & Willmitzer method (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877).
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was isolated by the method of Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) and analyzed by gel electrophoresis after a suitable restriction cleavage. 4 Transformation of potatoes
  • the leaves were used to induce shoots on MS medium with 1.6% glucose, 1.4 mg / l zeatin ribose, 20 mg / l naphthylacetic acid, 20 mg / l gibberellic acid, 250 mg / l claforan , 50 mg / l kanamycin, and 0.80.% Bacto agar.
  • the radiocative labeling of DNA fragments was carried out using a DNA random primer labeling kit from Boehringer Mannheim (Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the starch synthase activity was determined by determining the incorporation of 14 C-glucose from ADP [ 14 C-glucose] into a product insoluble in methanol / KCI as described in Denyer & Smith, 1992, Planta 186: 609-617.
  • tissue samples from potato tubers were disrupted in 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM DTT, 2.5 mM EDTA, 10% glycerol and 0.4 mM PMSF.
  • the electrophoresis was carried out in a MiniProtean II chamber (BioRAD).
  • the monomer concentration of the 1.5 mm thick gels was 7.5% (w / v), 25 mM Tris-Glycine pH 8.4 served as gel and running buffer. Equal amounts of protein extract were applied and separated for 2 h at 10 mA per gel.
  • the activity gels were then incubated in 50 mM Tricine-NaOH pH 8.5, 25 mM potassium acetate, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-glucose, 0.1% (w / v) amylopectin and 0. 5 M sodium citrate. Glucans formed were stained with Lugol's solution. 9. Starch analysis
  • Starch was isolated from potato plants using standard methods and the amylose to amylopectin ratio according to the method described by Hovenkamp-Hermelink et al. described method (Potato Research 31 (1988) 241-246).
  • glucose units may be phosphorylated at the carbon atoms of positions C2, C3 and C6.
  • 100 mg of starch in 1 ml of 0.7 M HCl were hydrolyzed for 4 hours at 95 C (Nielsen et. Al. (1994) Plant Physiol. 105: 111-117). After neutralization with 0.7 M KOH, 50 ml of the hydrolyzate were subjected to an optical-enzymatic test to determine glucose-6-phosphate.
  • the change in the absorption of the test mixture (100 mM imidazole / HCl; 10 mM MgCl 2 ; 0.4 mM NAD; 2 units of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides; 30 C) was followed at 334 nm.
  • the total phosphate was determined as described in Arnes, 1996, Methods in Enzymology VIII, 115-118.
  • the grain size was determined using a "Lumosed" photo sedimentometer from Retsch GmbH, Germany. For this, 0.2 g of starch was suspended in approx. 150 ml of water and measured immediately. The program supplied by the manufacturer calculated the average diameter of the starch granules on the assumption of an average density of the starch of 1.5 g / l.
  • the gelatinization or viscosity properties of the starch were recorded with a Viscograph E from Brabender OHG, Germany, or with a Rapid Visco Analyzer, Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia.
  • a suspension of 20 g starch in 450 ml water was subjected to the following heating program: heating from 50 C to 96 C at 3 / min., Keeping constant for 30 minutes, cooling to 30 C at 3 / min. and keep it constant for another 30 minutes.
  • the temperature profile provided characteristic gelatinization properties.
  • RVA Rapid Visco Analyzer
  • a suspension of 2 g starch in 25 ml water was subjected to the following heating program: suspend for 60 s at 50 C, heat from 50 C to 95 C at 12 / min., 2.5 minutes keep constant, cool to 50 C at 12 C / min. and keep it constant for another 2 minutes.
  • the RVA temperature profile provided the viscometric parameters of the starches examined for the maximum (max) and final viscosity (fin), the gelatinization temperature (T), the minimum viscosity (min) that occurs after the maximum viscosity and the difference between the minimum and final viscosity (setback, set) (see Table 1 and Fig. 1) .
  • the residue was weighed after centrifugation (10 min at 10000 x g) of the starch swollen at 70 ° C. after the soluble portion had been separated off.
  • the water absorption capacity of the starch was based on the weight of the starch corrected for the soluble mass.
  • a 2384 bp EcoRI fragment containing a cDNA coding for SS I from potato (Abel 1995, loc.cit.) was smoothed and introduced in the vector pBinAR precut with Smal in a "sense" orientation with respect to the 35S promoter.
  • a 4212 bp Asp718 / Xbal fragment containing a cDNA coding for the SS III from potato was in "antisense" orientation with respect to the 35S promoter between the Asp718 and the Xbal interface of the vector pBinAR-Hyg introduced.
  • a 1650 bp HindIII fragment which contains a partial cDNA coding for the BE enzyme from potato was smoothed and introduced in "antisense" orientation with respect to the B33 promoter into the vector pBinB33 precut with Smal.
  • the plasmid obtained was cut open with BamHI.
  • a 1362 bp BamHI fragment containing a partial cDNA coding for the SS HI enzyme from potato was also inserted into the cleavage, also in an “antisense” orientation with respect to the B33 Promotors introduced.
  • a 2384 bp EcoRI fragment containing a cDNA coding for SS I from potato (Abel, 1995, loc.cit.) was smoothed and cloned into the Smal site of the pBinB33 vector in an "antisense" orientation with respect to the B33 promoter .
  • On 1362 bp BamHI fragment containing a partial cDNA coding for the SS in from potato (Abel et al., 1996, loc.cit.) was also inserted into the BamHI site of the resulting vector in an “antisense” orientation with respect to the B33 Promotors introduced.
  • Example 10 B Preparation of the plasmid pB33 ⁇ R1 -Hyg
  • a 1.9 kB fragment of R1 from S. tuberosum (WO 97/11188) was obtained from the vector pBluescript by digestion with Asp718. The fragment was cloned into the Asp718 site behind the B33 promoter in the antisense orientation of the vector pB33-Binar-Hyg. This vector contains hygromycin resistance.
  • Example 11 Introduction of the plasmids into the genome of potato cells
  • the plasmids listed in Examples 1 to 10 were transferred individually and / or successively into agrobacteria, with the aid of which the transformation of potato cells was carried out as described above. Whole plants were then regenerated from the transformed plant cells.
  • Transgenic plant cells of the genotype asSSI-asSSII-asSSIII were generated by transformation with the plasmid p35S ⁇ SSI-Hyg described in Example No. 1 and subsequent retransformation with the plasmid described in Example No. 8 p35S ⁇ SSII- ⁇ SSIII-Kan.
  • Transgenic plant cells of the genotype asSSII-asSSI-asSSIII were generated by transformation with the plasmid p35S ⁇ SSII-Hyg described in Example No. 10 and subsequent retransformation with the plasmid pB33 ⁇ SSI ⁇ SSIII-Kan described in Example No. 9.
  • the transgenic potato plants synthesized modified starch varieties.
  • the starch formed from the transgenic plants produced according to Example 11 differs, for example, from starch synthesized in wild type plants (potato) in its phosphate or amylose content and in the viscosities and gelatinization properties determined by means of RVA.
  • the results of the physico-chemical characterization of the modified starches are shown in Table 1.
  • the enzyme activities of the suppressed soluble starch synthases were reduced by up to 85% compared to the non-transformed control plants.
  • SSI starch synthase isoform I
  • SSII starch synthase isoform II
  • SSIII starch synthase isoform III
  • BE branching enzyme
  • as anti-sense
  • oe overexpressed (sense)
  • cos cosuppressed (sense)
  • the separation of the glucan chains was carried out after separation of the amylose by means of thymol precipitation (Tomlinson et al. Loc. Cit.) By a high-performance anion exchange chromatography system with an amperometric detector (HPEAC-PAD, Dionex).
  • HPEAC-PAD amperometric detector
  • the samples (10 mg / ml amylopectin) were dissolved in 40% DMSO and 1/10 volume part of 100 mM sodium acetate pH 3.5 and 0.4 U isoamylase (Megazyme) were added. After incubation, 10 ⁇ l of the sample were applied to the column system and according to the information by Tomlinson et al. (loc. cit.) eluted.
  • the results of the HPEAC-PAD analysis on the length and distribution of the side chains of starch samples Nos. 1, 7, 8, 13 and 14 are shown in FIG. 2.
  • the glucans were detected using a refractive index detector (Gynkotek), the chain lengths of the eluted linear glucans were determined both by mass spectrometry and by iodometry (Hizukuri (1986) loc.cit.).
  • Fraction 1 represents the proportion of the A and B1 chains (according to Hizukuri (1986) loc.cit.)
  • Fraction 2 represents the proportion of the B2, B3 and B4 chains (according to Hizukuri (1986) loc.cit.)
  • Fraction 3 gives the proportion of high molecular weight glucan molecules eluting in the exclusion volume.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die zwei oder mehr Nukleotidsequenzen enthalten, die am Stärkemetabolismus beteiligte Enzyme kodieren, Verfahren zur Herstelllung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine Stärke synthetisieren, die bezüglich ihres Phosphatgehalts und ihrer Seitenkettenstruktur verändert ist. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren zur Herstellung dieser Stärke.

Description

Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die zwei oder mehr Nukleotidsequenzen enthalten, die am Stärkemetabolismus beteiligte Enzyme kodieren, Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine Stärke synthetisieren, die bezüglich ihres Phosphatgehalts und ihrer Seitenkettenstruktur verändert ist. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren zur Herstellung dieser Stärke.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen Inhaltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen beigemessen wird, ist die biotechnologische Forschung um eine Anpassung pflanzlicher Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie bemüht. Um die Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es insofern erforderlich, eine große Stoffvielfalt zur Verfügung zu stellen.
Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide wichtige, nachwachsende Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellulose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren Pflanzen ist. Neben Mais, Reis und Weizen spielt die Kartoffel insbesondere bei der Stärkeproduktion eine wichtige Rolle.
Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die Amylose- Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1 ,4-glykosidisch verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α-1 ,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z.B. Mais oder Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 25% aus Amylosestärke und zu ca. 75% aus Amylopektin-Stärke.
Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, die durchschnittliche Länge und Verteilung der Seitenketten sowie das Vorhandensein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktioneile Eigenschaften der Stärke bzw. ihrer wäßrigen Lösungen. Als wichtige funktionelle Eigenschaften sind hierbei beispielsweise zu nennen, die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigenschaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die Verkleisterungseigenschaften sowie Binde- und Klebeeigenschaften. Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein. Für bestimmte Anwendungen ist auch die Erzeugung von hochamylosehaltigen Stärken von besonderem Interesse. Ferner kann eine in Pflanzenzellen enthaltene modifizierte Stärke das Verhalten der Pflanzenzelle unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft verändern. Denkbar ist beispielsweise eine Verringerung des Stärkeabbaus während der Lagerung von Stärke-enthaltenden Organen, wie z.B. Samen oder Knollen, vor deren weiterer Verarbeitung, z.B. zur Extraktion der Stärke. Ferner ist es von Interesse, modifizierte Stärken herzustellen, die dazu führen, daß Pflanzenzellen oder pflanzliche Organe, die diese Stärke enthalten, besser zur Weiterverarbeitung geeignet sind, beispielsweise bei der Herstellung von Lebensmitteln wie "Popcorn" oder "Cornflakes" aus Mais oder von Pommes frites, Chips oder Kartoffel pul ver aus Kartoffeln. Von besonderem Interesse ist hierbei die Verbesserung der Stärken in der Hinsicht, daß sie ein reduziertes "cold sweetening" aufweisen, d.h. eine verringerte Freisetzung von reduzierenden Zuckern (insbesondere Glucose) bei einer längeren Lagerung bei niedrigen Temperaturen. Gerade Kartoffeln werden häufig bei Temperaturen von 4 bis 8°C gelagert, um den Stärkeabbau während der Lagerung. zu minimieren. Die hierbei freigesetzten reduzierenden Zucker, insbesondere Glucose, führen beispielsweise bei der Herstellung von Pommes frites oder Chips zu unerwünschten Bräunungsreaktionen (sogennannte Maillard-Reaktionen).
Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an bestimmte industrielle Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der Regel zeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Möglichkeiten zu finden, Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die in ihren Eigenschaften bereits den spezifischen Anforderungen der verarbeitenden Industrie entsprechen und somit ökonomische und ökologische Vorteile in sich vereinen.
Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflanzen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese - modifikation und -abbau (Stärkemetabolismus) beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entsprechenden, für diese Enzyme kodierenden DNA-Sequenzen.
Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke führen, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Piastiden statt. In photosynthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.
Wichtige an der Stärkesynthese beteiligte Enzyme sind z.B. die Verzweigungsenzyme (branching enzyme), ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundene Stärkesynthasen, lösliche Stärkesynthasen, Entzweigungsenzyme (debranching enzyme), Disproportionierungsenzyme, plastidäre Stärkephosphorylasen und die R1- Enzyme (R1 -Proteine).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere bzw. alternative gentechnische Ansätze zur Modifizierung des Stärkemetabolismus in stärkebildenden Pflanzen (z.B. Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot) bzw. geeignete Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, mittels derer Pflanzenzellen transformiert werden können, so daß die Synthese von veränderten, vorteilhaften Stärkevarietäten ermöglicht wird.
Solche veränderten Stärkevarietäten weisen z.B. Modifikationen in bezug auf ihren Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, den Phosphatgehalt, die Stärkekorngröße und/oder die durchschnittliche Länge und Verteilung der Seitenketten (d.h. Seitenkettenstruktur) auf.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Herstellung transgener Pflanzen ermöglichen, die eine veränderte (modifizierte) Stärkevarietät synthetisieren.
Überraschenderweise synthetisieren transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die mit den erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremolekülen transformiert wurden, eine Stärke, die in der besonderen, erfindungsgemäßen Weise in ihren physikochemischen Eigenschaften und/oder in ihrer Seitenkettenstruktur verändert ist. Hingegen zeigen bekannte Stärken, die von transgenen Pflanzen synthetisiert werden, nicht die erfindungsgemäßen Veränderungen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst. Gegenstand der Erfindung ist daher ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül (Nukleotidsequenz), enthaltend a) mindestens eine Nukleotidsequenz (Polynukleotid bzw. Nukleinsäuremolekül) codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Fragmente besagter Nucleotidsequenz und b) ein oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen (BE I, Ha and 11b), ADP-Glukose- Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II oder andere, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1- Enzymen, Amylasen und Glukosidasen oder deren Fragmenten - vorzugsweise löslichen Stärkesynthasen II, löslichen Stärkesynthasen I und/oder Verzweigungsenzymen sowie •deren Fragmenten - und Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Fragmenten hybridisieren, vorzugsweise ein Desoxyribonukleinsäure- oder Ribonukleinsäure-Molekül, besonders bevorzugt ein cDNA-Molekül. Besonders bevorzugt ist ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Fragmenten spezifisch hybridisiert.
Erfindungsgemäß geeignete Nukleotidsequenzen codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III sind z.B. aus der EP-A-0779363 bekannt. Unter dem Begriff "Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase IN" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere solche Sequenzen zu verstehen, deren kodierender Bereich eine Länge von 3000-4500 bp, vorzugsweise 3200-4250 bp, besonders bevorzugt 3400-4000 bp aufweist und deren Homologie zu dem gesamten kodierenden Bereich einer Nukleinsäure kodierend für ein Protein mit der Funktion einer Stärkesynthase mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 95% beträgt. Erfindungsgemäß geeignete Nukleotidsequenzen, die für ein Protein der Gruppe A kodieren, sind beispielsweise lösliche Stärkesynthasen (Typ I, II oder andere) oder Stärkekorn-gebundene Stärkesynthase-Isoformen (z.B. Hergersberg, 1988, Dissertation, Universität Köln; Abel, 1995, Dissertation FU Berlin; Abel et al., 1996, Plant Journal 10(6):981-991 ; Visser et al., 1989, Plant Sei. 64:185-192; van der Leij et al., 1991 , Mol. Gen. Genet. 228:240-248; EP-A-0779363; WO 92/11376; WO 96/15248, worin SSSB eine lösliche Stärkesynthase I und GBSSII eine lösliche Stärkesynthase II bedeutet; WO 97/26362; WO 97/44472; WO 97/45545; Delrue et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 3612-3620; Baba et al., 1993, Plant Physiol. 103:565-573; Dry et al., 1992, The Plant Journal 2,2: 193-202 oder auch in den EMBL Datenbank Einträgen X74160; X58453; X88789); Verzweigungsenzym-Isoformen (branching enzyme I, lla, Mb), Entzweigungsenzym-Isoformen (debranching Enzyme, Isoamylasen, Pullulanasen) •oder Disproportionierungsenzym-Isoformen beispielsweise beschrieben in WO 92/14827; WO 95/07335; WO 95/09922; WO 96/19581 ; WO 97/22703; WO 97/32985; WO 97/42328; Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396 oder auch in dem EMBL Datenbank Eintrag X83969 und solche für ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, plastidäre Stärkephosphorylase-Isoformen und R1 - Enzyme (R1 -Proteine) beispielsweise beschrieben in EP-A-0368506; EP-A-0455316; WO 94/28146; DE 19653176.4; WO 97/11188; Brisson et al., 1989, The Plant Cell 1 :559-566; Buchner et al., 1996, Planta 199:64-73; Camirand et al., 1989, Plant Physiol. 89(4 Suppl.) 61; Bhatt & Knowler, J. Exp. Botany 41 (Suppl.) 5-7; Lin et al., 1991 , Plant Physiol. 95:1250-1253; Sonnewald et al.,1995, Plant Mol. Biol. 27:567-576; DDBJ Nr. D23280; Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16:473-477 sowie für Amylasen und Glukosidasen.
Die erfindungsgemäß geeignet einzusetzenden Nukleotidsequenzen sind pro- oder eukaryontischen Ursprungs, vorzugsweise bakteriellen, pilzlichen oder pflanzlichen Ursprungs.
Der Begriff "Fragment " bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung Teile der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle, die mindestens 15 bp, vorzugsweise mindestens 150 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp lang sind, jedoch im allgemeinen eine Länge von 5000 bp, vorzugsweise 2500 bp nicht überschreiten.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Insbesondere umfaßt der Begriff „Fragment" biologisch aktive Moleküle.
Besonders bevorzugt erfolgt eine "spezifische Hybridisierung", unter den folgenden • hoch-stringenten Bedingungen:
Hybridisierungspuffer: 2 x SSC; 10 x Denhardt-Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1 :1 :1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 μg/ml Heringssperma-DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS bei einer
Hybridisierungstemperatur: T = 55 bis 68° C,
Waschpuffer: 0,2 x SSC; 0, 1 % SDS und
Waschtemperatur: T = 40 bis 68° C.
Die mit den erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle. Unter „Fragmenten" werden dabei nicht nur Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um einen funktionell aktiven Teil der beschriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 60 %, vorzugsweise über 70 % und besonders bevorzugt über 85 %, insbesondere über 90 % und ganz besonders bevorzugt über 95 %. Die Abweichungen zu den erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremolekülen können dabei durch eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Insertionen (Addition) oder Rekombinationen entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktioneile und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäuremolekülen oder den durch sie kodierten Proteinen, besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe, eine nahezu identische oder ähnliche biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Pflanzenspezies, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
Bei den erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremolekülen kann es sich um DNA-Moleküle handeln, insbesondere um cDNA- oder gegebenenfalls die Kombination von genomischen Molekülen. Ferner können die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sein. Die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon können z. B. aus natürlichen Quellen gewonnen sein, durch rekombinante Techniken oder synthetisch hergestellt sein.
Zur Expression der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt, der z.B. chemisch oder biologisch induzierbar sein kann. In Bezug auf die transformierte Pflanze kann der Promotor - wie auch die Nukleotidsequenz - homolog oder heterolog sein. Geeignete • Promotoren sind z.B. der 35S RNA Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatin-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8:23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS1 -Promotor (Stockhaus et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2445-2451) der Ca/b-Promotor (z.B. US 5656496, US 5639952, Bansal et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 89, 3654-3658) und der Rubisco SSU-Promotor (s. beispielsweise US 5034322, US 4962028) oder für eine endosperm-spezifische Expression der Glutelin- Promotor (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14, (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4, (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383, (1996), 213-218), der Shrunken-1 Promotor (Werr et al., EMBO J. 4, (1985), 1373-1380), der HMG-Promotor aus Weizen, der USP- Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais (Pedersen et al., Cell 29, (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81 -93).
Eine das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül abschließende Terminationssequenz kann der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines Poly- Ä-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8:23-29) und sind in der Regel beliebig austauschbar.
Die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle können für die Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen verwendet werden, die in der Aktivität der löslichen Stärkesynthase III sowie mindestens eines weiteren Enzyms, des Stärkemetabolismus jeweils erhöht und/oder erniedrigt sind. Hierfür werden die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in geeignete Vektoren eingebracht, mit den notwendigen regulatorischen Nukleinsäure-Sequenzen für eine effiziente Transkription in pflanzlichen Zellen versehen und in pflanzliche Zellen eingeführt. Es besteht zum • einen die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle zur Inhibierung der Synthese der endogenen löslichen Stärkesynthase III und/oder mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden. Dies kann mit Hilfe von antisense-Konstrukten, in vivo Mutagenese, eines auftretenden Cosuppressionseffektes oder mit Hilfe von in entsprechender Weise konstruierten Ribozymen erreicht werden. Andererseits können die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle zur Expression der löslichen Stärkesynthase III und/oder mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in Zellen transgener Pflanzen verwendet werden und so zu einer Steigerung der Aktivität der jeweils exprimierten Enzyme in den Zellen führen.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle zur Inhibierung der Synthese der endogenen löslichen Stärkesynthase III und der Überexpression mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden. Schließlich können die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle auch zur Expression der löslichen Stärkesynthase III und der Inhibierung mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in Zellen transgener Pflanzen verwendet werden. Die beiden letztgenannten Ausführungsformen der Erfindung führen so zu einer gleichzeitigen Hemmung und Steigerung der Aktivitäten der jeweils inhibierten bzw. exprimierten Enzyme in den Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül.
Der Begriff "Vektor" umfaßt Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und zur Transformation von Zellen geeignet sind. Vorzugsweise sind derartige Vektoren zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet. Besonders bevorzugt erlauben sie die Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, gegebenenfalls zusammen mit flankierenden regulatorischen Regionen, in das Genom der Pflanzenzelle. Beispiele hierfür sind binäre Vektoren, wie pBinAR oder pBinB33, die bei dem Agrobakterien-vermittelten Gentransfer eingesetzt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III codiert oder deren Fragmente in sense- oder anti-sense- Richtung vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A kodiert oder Fragmenten davon, in sense- oder anti- sense-Richtung vorliegt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A kodiert oder Fragmenten davon, teilweise in sehse-Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
Der erfindungsgemäße Vektor enthält ganz besonders bevorzugt eine oder mehrere regulatorische Elemente, die die Transkription und Synthese einer RNA in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
Darüberhinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden DNA- Sequenzen einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit gegebenfalls veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung • von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der kodierenden DNA-Sequenzen erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5'-Ende der DNA-Sequenz ist es beispielsweise möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Transit- oder Signal-Sequenzen nicht mehr in ihrem ursprünglichen (homologen) Kompartiment, sondern im Cytosol, oder aufgrund der Addition von andereren Signalsequenzen in einem oder mehreren anderen (heterologen) Kompartimenten (z.B. Plastid, Vakuole, Mitochondrium, Apoplast) lokalisiert sind.
Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten K - oder kcat-Wert besitzen oder die nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen, z.B. über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden DNA-Sequenzen oder Fragmente dieser Sequenzen in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von molekularbiologischen Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, loc.cit.) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Teile untereinander können an die Teile Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überfüssige DNA oder nicht mehr benötigte Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in w'fra-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet • werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und ggf. weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine transgene Wirtszelle mit verändertem Stärkemetabolismus, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche (monokotyle oder dikotyle) Zellen (z.B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot), die ein oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere erfindungsgemäße Vektoren enthält, oder die von einer solchen Zelle abstammt.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine transgene Wirtszelle mit verändertem Stärkemetabolismus, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche Zellen (z.B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot), die a) mindestens eine Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder deren Fragmente und b) ein oder mehrere Nukleotidsequenzen enthält, die für ein Protein ausgewählt aus der Gruppe A kodieren, oder deren Fragmenten oder mit diesen Nukleinsäuremolekülen hybridisierende Nukleotidsequenzen, oder die von einer solchen Zelle abstammt.
Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle lassen sich erfindungsgemäße Wirtszellen auch durch sukzessive Transformation herstellen (z.B. durch sogenannte "Supertransformation"), indem mehrere Teile der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder mehrere Vektoren enthaltend Teile der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, die für ein Protein codieren mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder deren Fragmente sowie außerdem einem oder mehreren Proteinen ausgewählt aus der Gruppe A bestehend aus Verzweigungsenzymen, ADP- Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II oder andere, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, Amylasen, Glukosidasen, R1- Enzymen, deren Fragmenten - vorzugsweise löslichen Stärkesynthasen II, löslichen Stärkesynthasen I und/oder Verzweigungsenzymen sowie deren Fragmenten - und Nukleinsäuremolekülen, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Fragmenten hybridisieren, in mehreren Transformationsschritten der Zellen eingesetzt werden. Hierbei wird die Zelle mit a) mindestens einem Nukleinsäuremolekül transformiert, das ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärke Synthase III codiert, deren Fragment oder mit einem Vektor enthaltend ein besagtes Nukleinsäuremolekül, und b) mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das aus der Gruppe A ausgewählt ist, bestehend aus Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn- gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II oder andere, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, Amylasen, Glukosidasen, plastidären Stärkephosphorylasen und R1- Enzymen, oder deren Fragmenten - vorzugsweise löslichen Stärkesynthasen II, löslichen Stärkesynthasen I und/oder Verzweigungsenzymen sowie deren Fragmenten - und Nukleinsäuremolekülen, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Fragmenten hybridisieren, oder einem oder mehreren Vektoren enthaltend ein oder mehrere der besagten Nukleinsäuremoleküle in beliebiger Reihenfolge zeitgleich oder aufeinanderfolgend transformiert.
Noch ein Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Wirtszelle, bakteriellen Zelle, Pflanzenzelle oder Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß a) mindestens ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärke Synthase III codiert oder deren Fragmente und b) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das aus der Gruppe A ausgewählt ist, bestehend aus Verzweigungsenzymen, ADP- Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II oder andere, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, Amylasen, Glukosidasen, plastidären Stärkephosphorylasen und R1- Enzymen oder deren Fragmenten - vorzugsweise löslichen Stärkesynthasen II, löslichen Stärkesynthasen I und/oder Verzweigungsenzymen sowie deren Fragmenten - und Nukleinsäuremolekülen, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Fragmenten hybridisieren in das Genom einer Zelle integriert werden und gegebenenfalls aus der transgenen Pflanzenzelle eine ganze Pflanze regeneriert wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Wirtszelle, bakteriellen Zelle, Pflanzenzelle oder Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder ein oder mehrere erfindungsgemäße Vektoren in das Genom einer Zelle integriert werden und gegebenenfalls aus der transgenen Pflanzenzelle eine ganze Pflanze regeneriert wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer modifizierten Stärke kommt, die beispielsweise in bezug auf Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation oder auch in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit oder Reaktivität im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist.
Durch eine Erhöhung der Aktivität von am Stärkemetabolismus beteiligten Proteinen, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nukleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unterschiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivität besitzen, besteht ferner die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Durch die Steigerung der Aktivität einer oder mehrerer am Stärkemetabolismus beteiligten Proteinen in bestimmten Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter Pflanzen wie z.B. in der Knolle bei der Kartoffel oder in dem Endosperm von Mais oder Weizen kann es zu einer besonders ausgeprägten Ertragssteigerung kommen. Die wirtschaftliche Bedeutung und die Vorteile dieser Möglichkeiten des Eingriffs in den Stärkemetabolismus sind enorm.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment (Cytosol, Vakuole, Apoplast, Piastiden, Mitochondrien) zu erreichen, muß die die Lokalisation gewährleistende Transit- oder Signalsequenz ggf. deletiert (entfernt) werden und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219- 3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991 ), 95-106). Die Lokalisation in bestimmten Pflanzenteilen oder Geweben kann z.B. durch spezifische Promotoren gewährleistet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität eines am • Stärkemetabolismus beteiligten Proteins kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressionseffektes, in vivo Mutagenese oder die Expression eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der am Stärkemetabolismus beteiligten Proteine codieren, unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise durch Expression eines antisense-Transkripts.
Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das die gesamte für ein am Stärkemetabolismus beteiligtes Protein codierende Sequenz einschließlich eventuell vorhandener flankierender Sequenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile eine Mindestlänge von 15 bp, vorzugsweise von mindestens 100-500 bp, und insbesondere von über 500 bp aufweisen. In der Regel werden DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise kürzer als 2500 bp sind.
Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65 % sein. Die Verwendung von Sequenzen mit einer Homologie von etwa 75 bis 85 % und insbesondere von etwa 85 bis 95 % ist zu bevorzugen.
Die Expression von Ribozymen zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Proteinen in Zellen ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise beschrieben in EP-B1-0 321 201. Die Expression von Ribozymen in pflanzlichen Zellen wurde z.B. beschrieben in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
Ferner kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Proteine in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen auch durch die sogenannte "in vivo-Mutagenese" erreicht werden, bei der durch Transformation von Zellen ein hybrides RNA-DNA- Oligonucleotid ("Chimeroplast") in Zellen eingeführt wird (Kipp P.B. et al., Poster Session beim "5th International Congress of Plant Molecular Biology, 21-27, September 1997, Singapore; R.A. Dixon und C.J. Arntzen, Meeting report zu "Metabolie Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-447; internationale Patentanmeldung WO 95/15972; Kren et al., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273 (1996), 1386- 1389).
Ein Teil der DNA-Komponente des hierbei verwendeten RNA-DNA-Oligonucleotids ist homolog zu einer Nucleinsäuresequenz eines endogenen Proteins, weist jedoch im Vergleich zur Nucleinsäuresequenz des endogenen Proteins eine Mutation auf oder enthält eine heterologe Region, die von den homologen Regionen umschlossen ist.
Durch Basenpaarung der homologen Regionen des RNA-DNA-Oligonucleotids und des endogenen Nucleinsäuremoleküls, gefolgt von homologer Rekombination kann die in der DNA-Komponente des RNA-DNA-Oligonucleotids enthaltene Mutation oder heterologen Region in das Genom einer Pflanzenzelle übertragen werden. Dies führt zu einer Verringerung der Aktivität des am Stärkemetabolismus beteiligten Proteins.
Alternativ kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Enzymaktivitäten in den Pflanzenzellen durch einen Cosuppressionseffekt erfolgen. Dieses Verfahren ist beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311- 317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621 ).
Zur Inhibierung der Synthese mehrerer an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme in den transformierten Pflanzen können DNA-Moleküle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Enzyme codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden, so daß die Synthese der betreffenden Proteine in etwa gleichem oder unterschiedlichem Ausmaß inhibiert wird. Für die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben bereits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es im Prinzip nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 25 kb, vorzugsweise von 15 kb nicht überschreiten.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle ist es daher möglich, Pflanzenzellen zu transformieren und die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in klassische Mutanten eingebracht werden, die in bezug auf ein oder mehrere Gene der Stärkebiosynthese defizient oder defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86). Diese Defekte können sich z.B. auf folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I) und lösliche Stärkesynthasen (SS I, II, III und andere), Verzweigungsenzyme (BE I, Ha und llb), "Debranching' -Enzyme (R-Enzyme, Isoamylasen, Pullulanasen), Disproportionierungsenzyme und plastidäre Stärkephosphorylasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, die mit einem erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen oder Pflanzen, die von derartig transformierten ■ Zellen abstammen. Die erfindungsgemäßen Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäuremoleküle, wobei diese vorzugsweise mit einem oder mehreren regulatorischen DNA-Elementen (z.B. Promoter, Enhancer, Terminator) verknüpft sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die erfindungsgemäßen Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem dadurch unterscheiden, daß sie ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es sonst nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen transgenen Pfianzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls stabil integriert in ihr Genom enthalten, gegebenenfalls zusätzlich zu natürlicherweise in den Zellen vorkommenden Kopien eines solchen Moleküls bzw. der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle. Handelt es sich bei dem (den) in die Zellen eingeführten Nukleinesäuremolekül(en) um zusätzliche Kopien zu bereits natürlicherweise in den Zellen vorkommenden Molekülen, so lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden insbesondere dadurch unterscheiden, daß diese zusätzliche(n) Kopie(n) an Orten im Genom lokalisiert ist (sind) an denen sie natürlicherweise nicht vorkommt (vorkommen). Dies läßt sich beispielsweise mit Hilfe einer Southern Blot-Analyse nachprüfen.
Bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, in denen die Enzymaktivität einzelner, am Stärkemetabolismus beteiligter Enzyme zu mindestens 10%, besonders bevorzugt zu mindestens 30% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 50% jeweils erhöht und/oder erniedrigt ist.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen vorzugsweise durch mindestens eines der folgenden Merkmale unterscheiden: Ist das eingeführte Nukleinsäuremolekül heterolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, so weisen die transgenen Pflanzenzellen Transkripte der eingeführten Nukleinsäuremoleküle auf. Diese lassen sich z. B. durch Northem-Blot- Analyse nachweisen. Beispielsweise enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen ein oder mehrere Proteine, die durch ein eingeführtes erfindungsgemäßes bzw. erfindungsgemäß zu verwendendes Nukleinsäuremolekül codiert werden. Dies kann z. B. durch immunologische Methoden, insbesondere durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden.
Ist das eingeführte erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäuremolekül homolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, können die erfindungsgemäßen Zellen von natürlicherweise auftretenden beispielsweise aufgrund der zusätzlichen Expression erfindungsgemäßer bzw. erfindungsgemäß zu verwendender Nukleinsäuremoleküle unterschieden werden. Die transgenen Pflanzenzellen enthalten z.B. mehr oder weniger Transkripte der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle. Dies kann z. B. durch Northem-Blot-Analyse nachgewiesen werden. "Mehr" bzw. "weniger"bedeutet dabei vorzugweise mindestens 10% mehr bzw. weniger, bevorzugt mindestens 20% mehr bzw. weniger und besonders bevorzugt mindestens 50% mehr bzw. weniger Transkripte als entsprechende nicht-transformierte Zellen. Vorzugsweise weisen die Zellen ferner eine entsprechende (mindestens 10%, 20% bzw. 50%ige) Steigerung bzw. Verminderung des Gehalts an den durch die eingeführten Nukleinsäuremolekülen kodierten Protein auf.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen durch Regeneration von ganzen Pflanzen aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Spezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen und stärkespeichernde Pflanzen, wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse etc.) , Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne oder Arrowroot.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, Kalli, Protoplasten, Zellkulturen etc..
Durch die Veränderung der enzymatischen Aktivitäten der in den Stärkemetabolismus involvierten Enzyme kommt es zur Synthese einer in ihrer Struktur veränderten Stärke in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serϊen, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschten Sequenzen können an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli- Zellen verwendet. Transformierte E.co//-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt (Sambrook et al. loc.cit.). Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, mittels Polyethylenglykol (PEG), die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten (Gene Transfer to Plants. S. 24-29, eds.: Potrykus, I. and Spangenberg, G., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995).
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide bzw. DNA gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist jedoch die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige 'r-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid, das eine w'r-Region trägt, enthalten. Die v/r-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches z.B. Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistsischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H . Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Speziell die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581 ) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kallus- Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschreiben ebenfalls die Regeneration und die Gewinnung fertiler Mais-Pflanzen aus Mais-Protoplasten.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin u.a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Merkmale.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen o.a. geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Merkmale erhalten geblieben sind.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist auch die Stärke, die aus einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, Pflanze, deren Vermehrungsmaterial oder nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Ebenfalls ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung von Stärke in an sich bekannter Weise, worin erfindungsgemäße Wirtszellen, Pflanzenzellen, Pflanzen, Pflanzenteile oder Vermehrungsmaterial verarbeitet bzw. in das Verfahren integriert werden.
Die erfϊndungsgemäße Stärke zeichnet sich in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch aus, daß sie einen im Vergleich zu einer Stärke, die aus einer nicht- transformierten Zelle oder Pflanze (d.h. dem Wildtyp) erhältlich ist, einen um mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 70% und ganz besonders bevorzugt mindestens 90% verminderten Phosphatgehalt aufweist und deren Glukan-Anteil (vgl. Fraktion 3 in Bsp. Nr. 13) nach Isoamyiase- Behandlung im Ausschlußvolumen eines HPLC-Säulensystems bestehend aus 2 nacheinandergeschalteten TSK-Gel 2000SW-Säulen und einer TSK-Gel 3000SW-Säule in 10 mM Natriumacetat pH 3,0 (bei einer Flußrate von 0,35 ml/min wie in Beispiel Nr. 13 ausgeführt) um mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 150%, besonders bevorzugt mindestens 300% und ganz besonders bevorzugt mindestens 500% erhöht ist.
In einer weiteren Ausführungsform zeichnet sich die erfindungsgemäße Stärke dadurch aus, daß sie einen im Vergleich zu einer Stärke, die aus einer nicht-transformierten Zelle oder Pflanze (d.h. dem Wildtyp) erhältlich ist, einen um mindestens 10% , vorzugsweise mindestens 30% und besonders bevorzugt mindestens 50% erhöhten Phosphatgehalt aufweist und deren Glukan-Anteil (vgl. Fraktion 3 in Bsp. Nr. 13) nach Isoamyiase-Behandlung im Ausschlußvolumen eines HPLC-Säulensystems bestehend aus 2 nacheinandergeschalteten TSK-Gel 2000SW-Säulen und einer TSK-Gel 3000SW-Säule in 10 mM Natriumacetat pH 3,0 (bei einer Flußrate von 0,35 ml/min wie in Beispiel Nr. 13 ausgeführt) um mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 150%, besonders bevorzugt mindestens 300% und ganz besonders bevorzugt mindestens 500% erhöht ist. Verfahren zur Extraktion der Stärke aus Pflanzen oder aus stärkespeichernden Teilen von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Verfahren zur Extraktion von Stärke aus Maissamen sind z. B. in Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996) 54-57) beschrieben. Die Extraktion von Maisstärke im industriellen Maßstab wird in der Regel durch das sogenannte "wet milling" erreicht. Weiterhin sind Verfahren zur Extraktion der Stärke aus verschiedenen stärkespeichernden Pflanzen beschrieben, z. B. in "Starch: Chemistry and Technology (Hrsg.: Whistler, BeMiller und Paschall (1994), 2. Ausgabe, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; siehe z. B. Kapitel XII, Seite 412-468: Mais und Sorghum-Stärken: Herstellung; von Watson; Kapitel XIII, Seite 469- 479: Tapioca-, Arrowroot- und Sagostärken: Herstellung; von Corbishley und Miller; Kapitel XIV, Seite 479-490: Kartoffelstärke: Herstellung und Verwendungen; von Mitch; Kapitel XV, Seite 491 bis 506: Weizenstärke: Herstellung, Modifizierung und Verwendungen; von Knight und Oson; und Kapitel XVI, Seite 507 bis 528: Reisstärke: Herstellung und Verwendungen; von Rohmer und Klem). Vorrichtungen, die für gewöhnlich bei Verfahren zur Extraktion von Stärke von Pflanzenmaterial verwendet werden, sind Separatoren, Dekanter, Hydrocyclone, Sprühtrockner und Wirbelschichttrockner.
Zu einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zählt auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Stärke im industriellen Bereich, vorzugswiese zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Verpackungsmaterialien oder Einwegartikeln.
Die erfindungsgemäßen Stärke kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren chemisch und/oder physikalisch modifiziert werden und eignet sich in unmodifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht- Nahrungsmittelbereich.
Die Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Stärke lassen sich grundsätzlich in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glukose und Glukosebausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie" dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Von Bedeutung kann hier die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens sein, wie es gegenwärtig im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglukosidase verläuft. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z.B. Oberflächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies bewirken.
Der andere Bereich, in dem die erfindungsgemäße Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet werden kann, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
1. Nahrungsmittelindustrie
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nahrungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorganischen oder organischen Ionen.
2. Nicht-Nahrungmittelindustrie
In diesem großen Bereich wird Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zusatzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung von Stärke als Hilfsstoff ist hier insbesondere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbihdung von Füllstoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
2.1. Papier- und Pappeindustrie
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier Anwendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden. Auf die Oberflächenstärke entfällt mit 80 % des Verbrauchs die mit Abstand größte Stärkemenge, 8 % werden als Strichstärke, 7 % als Massestärke und 5 % als Sprühstärke eingesetzt. Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierviies von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
2.2. Klebstoffindustrie
Ein großer Einsatzbereich von Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90 % der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
2.3. Textil- und Textilpflegemittelindustrie
Ein großes Einsatzfeld für Stärken als Hilfsmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d.h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
2.4. Baustoffindustrie
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung von Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.
2.5. Bodenstabilisation
Ein mengenmäßig begrenzter Markt für Stärkeprodukte bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombinationsprodukte aus Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und verkrustungsmindemden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.
2.6. Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So werden Stärken zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung eingesetzt.
2.7. Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie werden Stärken als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt. Weiterhin dienen Stärken als Tablettensprengmittel, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für Stärke liegt bei Zahnpasta.
2.8. Stärkezusatz zu Kohle und Brikett
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6 %, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5 %. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.
2.9. Erz- und Kohleschlammaufbereitung
Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammaufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden. 2:10. Gießereihilfsstoff
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten
Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.
Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfähigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produktionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
2.11. Einsatz in der Kautschukindustrie
In der Kautschukindustrie wird Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen Qualität eingesetzt. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Aussehens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.
2.12. Herstellung von Lederersatzstoffen
Eine weitere Absatzmöglichkeit von modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
2.13. Stärke in synthetischen Polymeren
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein). Die Verwendung von Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Bespiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem 'master batch' kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden. Gegenwärtige Nachteile betreffen die ungenügende Transparenz, die verringerte Zugfestigkeit sowie eine verringerte Dehnbarkeit.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung von Stärke in Polyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungsoffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50 % herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropf polymeri säte gewonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz von neuen, gentechnisch veränderten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Verfahren kann zum einen die Eigenschaften der z.B. aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahingehend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Veränderungen nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können jedoch auch durch gentechnische Verfahren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch Hitze- und Druckbehandlung, Behandlung mit organischen oder anorganischen Säuren, enzymatische Behandlung, Oxidationen und Veresterungen, welche z.B. zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Desweiteren können ein- oder mehrwertige Alkohole in Gegenwart starker Säuren zur Erzeugung von Stärkeethem eingesetzt werden, so daß Stärke- Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether, vernetzte Stärken oder Stärke- Pfropf-Polymerisate resultieren.
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Stärken liegt in der industriellen Anwendung, vorzugsweise für Lebensmittel oder der Herstellung von Verpackungsmaterialien und Einwegartikeln.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustrierung der Erfindung und stellen in keiner Weise eine Einschränkung dar.
Verwendete Abkürzungen:
BE branching enzyme (Verzweigungsenzym) bp Basenpaar
GBSS granule bound starch synthase (Stärkekorn-gebundene
Stärkesynthase) IPTG Isopropyl ß-D-Thiogalacto-Pyranosid
SS soluble starch synthase (lösliche Stärkesynthase)
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen:
20 x SSC 175,3 g NaCI
88,2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH2O, pH 7,0 mit 10 N NaOH Puffer A 50 mM Tris-HCI pH 8,0
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,4 mM PMSF
10% Glycerin
0,1 % Natriumdithionit
Puffer B 50 mM Tris-HCI pH 7,6 2,5 mM DTT 2 mM EDTA
Puffer C 0,5 M Natriumeitrat pH 7,6 50 mM Tris-HCI pH 7,6 2,5 mM DTT 2 mM EDTA
10 x TBS 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 5,0 M NaCI
10 x TBST 10 x TBS
0,1 % (v/v) Tween 20
Elutionspuffer 25 mM Tris pH 8,3 250 mM Glycin
Dialysepuffer 50 mM Tris-HCI pH 7,0 50 mM NaCI 2 mM EDTA 14,7 mM beta-Mercaptoethanol 0,5 mM PMSF
Proteinpuffer 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2
10 mM EDTA 0,5 mM PMSF 14,7 mM beta-Mercaptoethanol
Beschreibung der Abbildungen:
Fig. 1 stellt ein schematisehes RVA-Temperaturprofil (Viskosität und Temperatur vs. Zeit [min]) dar mit den viskosimetrischen Parametern T=Verkleisterungstemperatur, Temperatur zum Zeitpunkt des Verkleisterungsbeginns; Max bezeichnet die maximale Viskosität; Min bezeichnet die minimale Viskosität; Fin bezeichnet die Viskosität am Ende der Messung; Set ist die Differenz (D) aus Min und Fin (Setback).
Fig. 2 zeigt rechts die mittels HPAEC-PAC (Spannung [mV] vs. Zeit [min]) und links die mittels Gelpermeationschromatographie (Ladung [nC] vs. Zeit [min]) ermittelte Seitenkettenverteilung der Amylopektin-Proben. A = Kontrolle (wildtyp, Nr.1); B = (asSSII, Nr. 7); C = (asSSIII, Nr. 8); D = (asSSII asSSIII, Nr. 13); E = (asSSII asSSIII, Nr. 14)
Die in der Figurenbeschreibung in Klammern genannten Nummern beziehen sich auf die Numerierung der in Tabelle 1 und 2 beschriebenen Stärkeproben.
In den Beispielen wurden die folgenden Methoden verwendet: 1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E. co/V wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR Hyg (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant Sei. 66:221-230) und pBinB33-Hyg kloniert.
2. Bakterienstämme und Plasmide
Für den Bluescript-Vektor p Bluescript II KS (Stratagene) und für die pBinAR Hyg- und pBinB33 Hyg-Konstrukte wurde der E. co//-Stamm DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E. co//-Stamm XL1-Blue verwendet.
pBinAR
Das Plasmid pBinAR ist ein Derivat des binären Vektorplasmids pBin19 (Bevan, 1984), das folgendermaßen konstruiert wurde:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfaßt, wurde als EcoRI/Kpnl-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) isoliert und zwischen die EcoRI- und Kpnl-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 ligiert und wurde Plasmid pUC18-35S bezeichnet. Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen Hindlll und Pvull ein 192 bp langes Fragment isoliert, das die DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, 1984) umfaßt (Nukleotide 11749- 11939). Nach Addition von Sphl-Linkern an die Pvull-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die SpHI- und Hindlll-Schnittstellen von pUC18-35S ligiert und wurde Plasmid pA7 bezeichnet. Desweiteren wurde der gesamte Polylinker enthaltend den 35S- Promotor und ocs-Terminator mit EcoRI und Hindlll herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen pBin19 ligiert. Dabei entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990).
pBinB33
Der Promotor des Patatin Gens B33 aus Solanum tuberosum (Roeha-Sosa et al., 1989) wurde als Dral-Fragment (Nukleotide -1512 - +14) in den mit Sst I geschnittenen Vektor pUC19, dessen Enden mit Hilfe der T4-DNA Polymerase geglättet worden waren, ligiert. Daraus entstand das Plasmid pUC19-B33. Aus diesem Plasmid wurde der B33- Promotor mit EcoRI und Smal herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBinAR ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33.
pBinAR-Hyg
Ausgehend vom Plasmid pA7 (vgl. Beschreibung des Vektors pBinAR) wurde das EcoRI-Hindlll Fragment umfassend den 35S-Promotor, den oes-Terminator sowie den zwischen 35S-Promotor und oes-Terminator gelegenen Teil des Polylinker in das entsprechend geschnittene pBin-Hyg Plasmid gesetzt.
pBinB33-Hyg
Ausgehend vom Plasmid pBinB33 wurde das EcoRI-Hindlll Fragment umfassend den B33-Promotor, einen Teil des Polylinkers sowie den oes-Terminator herausgeschnittenen und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBin-Hyg ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33-Hyg.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen&Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16:9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim&Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7:1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert. 4 Transformation von Kartoffeln
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L.cv. Desiree, Vereinigte Saatzuchten eG, Ebstorf) wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Slammes C58C1 durchgeführt (Dietze et al. (1995) in Gene Transfer to Plants. S. 24-29, eds.: Potrykus, I. and Spangenberg, G., Springer Verlag, Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13:4777^788).
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige&Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens- Übemachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1 ,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80.% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25 C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1 ,6% Glukose, 1 ,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Gibberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80.% Bacto Agar gelegt.
5. Pflanzenhaltung
Kartoffelpfianzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten: Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C Dunkelperiode 8 h bei 15°C Luftfeuchte 60 % ό". Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
7. Bestimmung der Stärkesynthase-Aktivität
Die Bestimmung der Stärkesynthaseaktivität erfolgte durch Bestimmung des Einbaus von 14 C-Glukose aus ADP[14 C-Glukose] in ein in Methanol/KCI unlösliches Produkt wie beschrieben in Denyer & Smith, 1992, Planta 186:609-617.
8. Nachweis von löslichen Stärkesynthasen im nativen Gel
Zum Nachweis der Aktivität löslicher Stärkesynthasen durch nicht-denaturierende Gelelektrophorese wurden Gewebeproben von Kartoffelknollen in 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 2 mM DTT, 2,5 mM EDTA, 10 % Glycerin und 0,4 mM PMSF aufgeschlossen. Die Elektrophorese wurde in einer MiniProtean II Kammer (BioRAD) durchgeführt. Die Monomerkonzentration der 1 ,5 mm dicken Gele war 7,5 % (w/v), als Gel- und Laufpuffer diente 25 mM Tris-Glycin pH 8,4. Gleiche Mengen an Proteinextrakt wurden aufgetragen und für 2 h bei 10 mA je Gel aufgetrennt.
Anschließend erfolgte die Inkubation der Aktivitäts-Gele in 50 mM Tricine-NaOH pH 8,5, 25 mM Kaliumacetat, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-Glukose, 0,1 % (w/v) Amylopektin und 0,5 M Natriumcitrat. Gebildete Glukane wurden mit Lugolscher Lösung angefärbt. 9. Stärkeanalytik
Die von den transgenen Kartoffel pflanzen gebildete Stärke wurde durch folgende Methoden charakterisiert:
a) Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses in Stärke aus Kartoffelpflanzen
Stärke wurde nach Standardmethoden aus Kartoffelpflanzen isoliert und das Verhältnis Amylose zu Amylopektin nach der von Hovenkamp-Hermelink et al. beschriebenen Methode (Potato Research 31 (1988) 241-246) bestimmt.
b) Bestimmung des Phosphatgehaltes
In der Kartoffelstärke können einige Glucoseeinheiten an den Kohlenstoffatomen der Position C2, C3 und C6 phosphoryliert sein. Zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades an der C6-Position der Glucose wurden 100 mg Stärke in 1 ml 0,7 M HCI für 4 Stunden bei 95 C hydrolysiert (Nielsen et. al. (1994) Plant Physiol. 105: 111-117). Nach Neutralisation mit 0,7 M KOH wurden zur Glucose-6-phosphat- Bestimmung 50 ml des Hydrolysats einem optisch-enzymatischen Test unterzogen. Die Änderung der Absorption des Testansatzes (100 mM Imidazol/HCI; 10 mM MgCI2; 0.4 mM NAD; 2 units Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides; 30 C) wurde bei 334 nm verfolgt.
Die Bestimmung des Gesamtphosphats erfolgte wie in Arnes, 1996, Methods in Enzymology VIII, 115-118 beschrieben.
c) Analyse der Seitenketten des Amylopektins
Zur Analyse der Verteilung und Länge der Seitenketten in den Stärkeproben wurde 1 ml einer 0,1 %igen Stärkelösung mit 0,4 U Isoamylase (Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Ireland) über Nacht bei 37 C in 100 mM Na-citrat-Puffer, pH 3,5 verdaut.
Die weitere Analyse erfolgte, sofern nicht anders erwähnt, entsprechend den Angaben von Tomlinson et al., (1997), Plant J. 11 :31-47.
d) Korngrößenbestimmung
Die Korngrößenbestimmung wurde mit einem Fotosedimentometer des Typs "Lumosed" der Firma Retsch GmbH, Deutschland, durchgeführt. Hierfür wurden 0.2 g Stärke in ca. 150 ml Wasser suspendiert und sofort vermessen. Das vom Hersteller mitgelieferte Programm berechnete den mittleren Durchmesser der Stärkekörner auf der Annahme einer durchschnittlichen Dichte der Stärke von 1 ,5 g/l.
e) Verkleisterungseigenschaften
Die Verkleisterungs- bzw. Viskositätseigenschaften der Stärke wurden mit einem Viskograph E der Firma Brabender OHG, Deutschland, oder mit einem Rapid Visco Analyser, Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australien, aufgezeichnet. Bei Verwendung des Viskographen E wurde eine Suspension von 20 g Stärke in 450 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen: aufheizen von 50 C auf 96 C mit 3 /min., 30 Minuten konstant halten, abkühlen auf 30 C mit 3 /min. und abermals 30 Minuten konstant halten . Das Temperaturprofil lieferte charakteristische Verkleisterungseigenschaften.
Bei der Messung mittels des Rapid Visco Analysers (RVA) wurde eine Suspension von 2 g Stärke in 25 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen: 60 s bei 50 C suspendieren, aufheizen von 50 C auf 95 C mit 12 /min., 2,5 Minuten konstant halten, abkühlen auf 50 C mit 12 C/min. und abermals 2 Minuten konstant halten. Das RVA- Temperaturprofil lieferte die viskosimetrischen Parameter der untersuchten Stärken für die maximale (Max) und Endviskosität (Fin), die Verkleisterungstemperatur (T), die nach der maximalen Viskosität auftretende minimale Viskosität (Min) sowie die Differenz aus minimaler und Endviskosität (Setback, Set) (vgl. Tabelle 1 und Fig. 1 ).
f) Bestimmung der Gelfestigkeit
Zur Bestimmung der Gelfestigkeit mittels eines Texture Analyser wurden 2 g Stärke in 25 ml Wasser verkleistert (vgl. Messung mittels RVA) und anschließend 24 h lang bei 25°C luftdicht verschlossen gelagert. Die Proben wurden unter der Sonde (runder Stempel) eines Texture Analysers TA-XT2 (Stable Micro Systems) fixiert und die Gelfestigkeit mit folgenden Parameter-Einstellungen bestimmt:
Test-Geschwindigkeit 0,5 mm
Eindringtiefe 7 mm
Kontaktfläche (des Stempels) 113 mm2
Druck/Kontaktfläche 2 g
10. Bestimmung von Glucose, Fructose und Saccharose
Zur Bestimmung des Glucose-, Fructose- bzw. Saccharosegehalts wurden kleine Knollenstücke (Durchmesser ca. 10 mm) von Kartoffelknollen in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für 30 min bei 80°C in 0,5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5; 80 % (Vol. /Vol.) Ethanol extrahiert. Der Überstand, der die löslichen Bestandteile enthält, wurde abgenommen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde zur Bestimmung der Menge an löslichen Zuckern verwendet. Die quantitative Bestimmung von löslicher Glucose, Fructose und Saccharose wurde in einem Ansatz mit folgender Zusammensetzung durchgeführt.
100,0 mM Imidazol/HCI, pH 6,9
1 ,5 mM MgCI2
0,5 mM NADP+ 1 ,3 mM ATP
10-50 μl Probe
1 ,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe
Der Ansatz wurde 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmung der
Zucker erfolgt anschließend photometrisch durch Messung der Absorption bei 340 nm nach aufeinanderfolgender Zugabe von
1 ,0 Einheiten Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose),
1 ,0 Einheiten Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1 ,0 Einheiten Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).
11. Bestimmung der Wasseraufnahmekapazität (WAK)
Zur Bestimmung der Wasseraufnahmekapazität wurde der Rückstand nach Abtrennung des löslichen Anteils durch Zentrifugation (10 min bei 10000 x g) der bei 70°C gequollenen Stärke gewogen. Die Wasseraufnahmekapazität der Stärke wurde auf die um die lösliche Masse korrigierte Stärkeeinwaage bezogen.
WAK (g/g) = (Rückstand - (Einwaage-löslicher Anteil)) / (Einwaage-löslicher Anteil)
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1 : Herstellung des Plasmids p35SαSSI-Hyg
Ein 1831 bp langes Asp718/Xbal-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS I aus Kartoffel (Abel, G., (1995) Dissertation, Freie Universität Berlin), wurde in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und Xbal-Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt. Beispiel 2: Herstellung des Plasmids p35S-SSI-Kan
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus Kartoffel, (Abel 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in dem mit Smal vorgeschnittenen Vektor pBinAR in "sense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors eingeführt.
Beispiel 3: Herstellung des Plasmids p35SαSSII-Kan
Ein 1959 bp langes Smal/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, dort als GBSS II bezeichnet), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal-Schnittstelle des Vektors pBinAR eingeführt.
Beispiel 4: Herstellung des Plasmids pB33-SSII-Hyg
Ein 2619 bp langes Smal/Sall Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den mit Smal und Sall vorgeschnittenen Vektor pBinB33-Hyg in "sense"-Orientierung bezüglich des B33-Promotors eingeführt.
Beispiel 5: Herstellung des Plasmids p35SαSSIH-Hyg
Ein 4212 bp langes Asp718/Xbal-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die SS III aus Kartofffel (Abel et al., 1996, Plant J. 10(6):981-991 ), wurde in "antisense"- Orientierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und die Xbal- Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt.
Beispiel 6: Herstellung des Plasmids p35S-SSIII-Kan
Ein 4191 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit), wurde geglättet und in "sense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal-Schnittstelle des Vektors pBinAR eingeführt.
Beispiel 7: Herstellung des Plasmids pB33αBEαSSIII-Kan
Ein 1650 bp langes Hindll-Fragment, welches eine partielle cDNA kodierend für das BE-Enzym aus Kartoffel enthält (Kossmann et al., 1991 , Mol. & Gen. Genetics 230(1- 2):39-44), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33 Promotors in den mit Smal vorgeschnittenen Vektor pBinB33 eingeführt. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI aufgeschnitten. In die Schnittstelle wurde ein 1362 Bp langes BamHI- Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für das SS HI-Enzym aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33- Promotors eingeführt.
Beispiel 8: Herstellung des Plasmids p35SαSSII-αSSIII-Kan
Ein 1546 bp langes EcoRV/Hincll-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den EcoRV/Hincll- geschnittenen Vektor pBluescript II KS kloniert und anschließend über einen Asp718/BamHI-Verdau wieder herausgeschnitten und in den ebenso verdauten Vektor pBinAR in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors eingefügt. Danach wurde ein 1356 Bp langes BamHI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in "antisense" - Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die BamHI-Schnittstelle des Vektors pBinAR- SSII eingeführt.
Beispiel 9: Herstellung des Plasmids pB33αSSIαSSIII-Kan
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in die Smal-Schnittstelle des pBinB33-Vektors in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33-Promotors kloniert. Ein 1362 Bp langes BamHI-Fragment enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS in aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.) wurde in die BamHI-Schnittstelle des resultierenden Vektors ebenfalls in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33- Promotors eingeführt.
Beispiel 10: Herstellung des Plasmids p35SαSSII-Hyg
Ein 1959 bp langes Smal/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II (Abel, 1995, loc.cit.), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal-Schnittstelle des pBinAR-Hyg-Vektors eingeführt.
Beispiel 10 B: Herstellung des Plasmids pB33αR1 -Hyg
Ein 1 ,9 kB-Fragment von R1 aus S. tuberosum (WO 97/11188) erhielt man durch Verdau mit Asp718 aus dem Vektor pBlueskript. Das Fragment wurde in die Asp718 Schnittstelle hinter den B33-Promotor in antisense-Orientierung des Vektors pB33- Binar-Hyg kloniert. Dieser Vektor enthält eine Hygromycin-Resistenz.
Beispiel 11 : Einführung der Plasmide in das Genom von Kartoffelzellen
Die in Beispiel 1 bis 10 aufgeführten Plasmide wurden einzeln und/oder aufeinanderfolgend in Agrobakterien transferiert, mit deren Hilfe die Transformation von Kartoffelzellen wie oben beschrieben vorgenommen wurde. Aus den transformierten Pflanzenzellen wurden anschließend ganze Pflanzen regeneriert.
Transgene Pflanzenzellen des Genotyps asSSI-asSSII-asSSIII wurden erzeugt durch Transformation mit dem in Bsp. Nr. 1 beschriebenen Plasmid p35SαSSI-Hyg und anschließende Retransformation mit dem in Bsp. Nr. 8 beschriebenen Plasmid p35SαSSII-αSSIII-Kan.
Transgene Pflanzenzellen des Genotyps asSSII-asSSI-asSSIII wurden erzeugt durch Transformation mit dem in Bsp Nr. 10 beschriebenen Plasmid p35SαSSII-Hyg und anschließende Retransformation mit dem in Bsp Nr. 9 beschriebenen Plasmid pB33αSSIαSSIII-Kan.
Als Ergebnis der Transformation synthetisierten die transgenen Kartoffelpflanzen veränderte Stärkevarietäten.
Beispiel 12: Physiko-chemische Charakterisierung der modifizierten Stärken
Die von den gemäß Beispiel 11 hergestellten transgenen Pflanzen gebildete Stärke unterscheidet sich z.B. von in Wildtyppflanzen (Kartoffel) synthetisierter Stärke in ihrem Phosphat- oder Amylosegehalt und in den mittels RVA bestimmten Viskositäten und Verkleisterungseigenschaften. Die Ergebnisse der physiko-chemischen Charakterisierung der modifizierten Stärken sind in Tabelle 1 dargestellt. In den antisense Konstrukten waren die Enzymaktivitäten der supprimierten löslichen Stärkesynthasen um bis zu 85% gegenüber den nicht transformierten Kontrollpflanzen vermindert .
Tabelle 1 : Eigenschaften der modifizierten Stärken
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Legende: SSI = Stärkesynthase Isoform I; SSII = Stärkesynthase Isoform II; SSIII = Stärkesynthase Isoform III; BE = branching enzyme; as = anti-sense; oe = überexprimiert (sense); cos = cosupprimiert (sense); Rapid Visco Analyzer- (RVA)-Daten: Max bezeichnet die maximale Viskosität; Min die minimale Viskosität; Fin die Viskosität am Ende der Messung; Set ist die Differenz (D) aus Min und Fin (Setback) und T die Verkleisterungstemperatur. Die %-Werte sind auf den Wildtyp (= 100%) bezogen.
Beispiel 13: Charakterisierung der Seitenketten der modifizierten Stärken
Die Auftrennung der Glucanketten erfolgte nach Abtrennung der Amylose mittels der Thymol-Fällung (Tomlinson et al. loc. cit.) durch ein High-Performance- Anionenaustauscher-Chromatographie-System mit einem amperometrischen Detektor (HPEAC-PAD, Dionex). Die Proben (10 mg/ml Amylopektin) wurden in 40 % DMSO gelöst und 1/10 Volumenteil 100 mM Natriumacetat pH 3,5 sowie 0,4 U Isoamylase (Megazyme) hinzugefügt. Nach Inkubation wurden 10 μl der Probe auf das Säulensystem aufgetragen und entsprechend den Angaben von Tomlinson et al. (loc. cit.) eluiert. Die Ergebnisse der HPEAC-PAD-Analyse zur Länge und Verteilung der Seitenketten von Stärkeproben Nr. 1 , 7, 8, 13 und 14 (vgl. Tabelle 1 und 2) sind in Fig. 2 dargestellt.
Ein weiteres HPLC-System zum Nachweis der Seitenkettenverteilung bestand aus 3 nacheinander geschalteten Säulen (2 TSK-Gel 2000SW und einer TSK-Gel 3000SW, Fa. TosoHaas, Stuttgart, BRD) wie von Hizukuri ((1986) Carbohydr. Res. 147:342-347) beschrieben. 100 μl der vorbereiteten Probe wurde auf das Säulensystem aufgetragen. Als Elutionsmittel wurde 10 mM Natriumacetat pH 3,0 bei einer Flußrate von 0,35 ml/min verwendet. Die Glukane wurden mittels eines Refraktionsindexdetektors (Gynkotek) nachgewiesen, die Bestimmung der Kettenlängen der eluierten linearen Glucane erfolgte sowohl massenspektrometrisch als auch iodometrisch (Hizukuri (1986) loc.cit.).
Die Ergebnisse der gelchromatographischen HPLC-Analyse zu der Länge und Verteilung der Seitenketten der Stärkeproben Nr. 1 , 7, 8, 13 und 14 (vgl. Tabelle 1 und 2) sind in Fig. 2 dargestellt.
Tabelle 2 gibt eine Übersicht zu den Anteilen verschiedener Seitenketten-Fraktionen der analysierten Stärken wider. Fraktion 1 repräsentiert den Anteil der A- und B1 -Ketten (nach Hizukuri (1986) loc.cit.), Fraktion 2 repräsentiert den Anteil der B2-, B3 und B4- Ketten (nach Hizukuri (1986) loc.cit.) und Fraktion 3 gibt den Anteil der im Ausschlußvolumen eluierenden hochmolekularen Glukan-Moleküle an.
Tabelle 2: Verteilung der Seitenketten des Amylopektins der modifizierten Stärke
Figure imgf000056_0001

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Wirtszelle, worin a) mindestens eine Nudeotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Fragmente besagter Nudeotidsequenz und b) eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn- gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1- Enzymen, Amylasen und Glukosidasen oder deren Fragmente gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in das Genom einer Zelle integriert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , worin die Zelle eine bakterielle oder pflanzliche Zelle ist.
3. Transgene Wirtszelle, enthaltend a) mindestens eine Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Fragmente besagter Nudeotidsequenz und b) eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn- gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1- Enzymen, Amylasen und Glukosidasen oder deren Fragmente.
4. Wirtszelle nach Anspruch 3, die eine bakterielle oder pflanzliche Zelle ist.
5. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend a mindestens eine Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Fragmente besagter Nudeotidsequenz und b) ein oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn- gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1- Enzymen, Amylasen und Glukosidasen oder deren Fragmenten.
6. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das ein Desoxyribonukleinsäure- Molekül ist.
7. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, das ein cDNA-Molekül ist.
8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das ein Ribonukleinsäure-Molekül ist.
9. Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 8 hybridisiert, vorzugsweise spezifisch hybridisiert.
10. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9.
11. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase oder Fragmente davon in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
12. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Fragmente davon in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
13. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder deren Fragmente teilweise in sense-Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
14. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer RNA in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, worin ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9, oder ein oder mehrere Vektoren nach einem oder mehreren der Anspruch 10- 14 in das Genom einer Zelle integriert werden.
16. Wirtszelle nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9 oder einen oder mehrere Vektoren nach einem oder mehreren der Ansprüche 10-14 enthält.
17. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, worin aus mindestens einer Pflanzenzelle nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4 und 16 eine vollständige Pflanze regeneriert wird.
18. Pflanze, enthaltend eine oder mehrere Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4 und 16.
19. Pflanze nach Anspruch 18, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.
20. Pflanze nach Anspruch 19, die eine Nutzpflanze ist.
21. Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 18-20, die eine Weizen-, Mais-, Kartoffel- oder Reispflanze ist.
22. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 18-21.
23. Verfahren zur Herstellung von Stärke nach einem an sich bekannten Verfahren, worin Zellen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, und 16, Pflanzen nach einem oder mehreren der Ansprüche 18-21 oder Vermehrungsmaterial nach Anspruch 22 in das Verfahren integriert werden.
24. Stärke, erhältlich aus einer Zelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, und 16, einer Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 18-21 oder aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 22.
25. Stärke nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen im Vergleich zu einer Stärke, die aus einer nicht-transformierten Zelle oder Pflanze erhältlich ist, einen um mindestens 30% verminderten Phosphatgehalt aufweist und daß ihr Glukan-Anteil nach Isoamyiase-Behandlung im Auschlußvolumen eines HPLC-Säulensystems bestehend aus 2 nacheinandergeschalteten TSK-Gel 2000SW-Säulen und einer TSK-Gel 3000SW-Säule in 10 mM Natriumacetat pH 3,0 um mindestens 50 % erhöht ist.
26. Stärke nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen im Vergleich zu einer Stärke, die aus einer nicht-transformierten Zelle oder Pflanze erhältlich ist, einen um mindestens 10% erhöhten Phosphatgehalt aufweist und daß ihr Glukan-Anteil nach Isoamyiase-Behandlung im Auschlußvolumen eines HPLC- Säulensystems bestehend aus 2 nacheinandergeschalteten TSK-Gel 2000SW- Säulen und einer TSK-Gel 3000SW-Säule in 10 mM Natriumacetat pH 3,0 um mindestens 50 % erhöht ist.
27. Verwendung der Stärke nach einem oder mehreren der Ansprüche 24-26 im industriellen Bereich, vorzugsweise zur Herstellung von Lebensmitteln, Verpackungsmaterialien oder Einwegartikeln.
28. Verwendung von a) mindestens einer Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Fragmente besagter Nudeotidsequenz und b) einer oder mehreren Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn- gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II oder andere, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1- Enzymen, Amylasen und Glukosidasen oder deren Fragmente zur Herstellung von transgenen Zellen, vorzugsweise bakteriellen oder pflanzlichen Zellen.
29. Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-9 oder eines oder mehrerer Vektoren nach einem oder mehreren der Ansprüche 10-14 zur Herstellung von transgenen Zellen, vorzugsweise bakteriellen oder pflanzlichen Zellen.
30. Verwendung von Zellen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 3,4 und 16, Pflanzen nach einem oder mehreren der Ansprüche 18-21 oder Vermehrungsmaterial nach Anspruch 22 zur Herstellung von Stärke.
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