TW201739916A - 用於轉殖基因表現之植物啟動子與３’ｕｔｒ - Google Patents

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Abstract

本發明係有關採用玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子以促進核苷酸序列在植物或植物細胞中轉錄之組合物及方法。一些實施例係有關玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子在植物中具有促進以可操作地連接之核苷酸序列轉錄作用的功能。其它實施例係有關玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR在植物中具有促進以可操作地連接之核苷酸序列轉錄作用的功能。

Description

用於轉殖基因表現之植物啟動子與3’UTR 相關申請案之交叉引用
本申請案主張2016年5月2日於美國專利商標局提交之臨時專利申請案第62/330534號之優先權，其整個內容係以引用方式併入本文中。
電子遞交之以引用方式併入的資料
以全文引用方式併入的資料為與本申請案同時提交且如下標識之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表：2016年3月4日所建立之名稱為「78827-US-PSP-20160126-Sequence-Listing-ST25.txt」的一個21.8KB ACII(文字)檔案。
本發明大體上係有關促進核苷酸序列在植物或植物細胞中轉錄之組合物及方法。一些實施例係有關一種新穎玉蜀黍(Zea mays)GRMZM2G047720啟動子與其它的玉蜀黍GRMZM2G047720調控元件，其在植物中具有促進及/或終止一個以可操作方式連接之核苷酸序列之轉錄作用的功能。特定實施例係有關於包含有啟動子(例如，用以將核酸分子導入至細胞中)之方法及包括有啟動子之細胞、細胞培養物、組織、生物體及部分生物體，以及由其產生之產物。其它實施例係有關於包含有3’UTR(例如，用以將核酸分子導入至細胞中)之方法及包括有啟動子之細胞、細胞培養物、組織、生物體及部分生物體，以及由其產生之產物。
許多植物品種能夠經以轉殖基因轉形以導入農藝學上所期望的性 狀或特徵。植物品種係經開發及/或修飾以具有特定所需性狀。一般而言，所期望的性狀包含(例如)改良營養價值品質、增加產率、賦予害蟲或疾病抗性、增加乾旱及壓力耐受性、改良園藝品質(例如，色素形成與生長)(例如色素沉著及生長)、給予除草劑耐受性、使得能夠由植物產生工業上適用之化合物及/或材料、及/或使得能夠產生醫藥品。於一實施例中，所期望的性狀係通過轉殖基因插入其本身或者通過DNA結合蛋白及/或轉錄因子的表現轉而結合特定的DNA序列來提供。
包含多個轉殖基因堆疊在單個基因組基因座之基因轉殖植物品種係經由植物轉形技術而產生。植物轉形技術使得轉殖基因導入至植物細胞中，於植物基因組中含有穩定整合之轉殖基因複本的可育基因轉殖植物回復，隨後經由植物基因組的轉錄及轉譯進行轉殖基因之表現而產生具備有所期望性狀與表現型之基因轉殖植物。然而，期望有機制可用來產生基因轉殖植物品種以高度表現多個性狀堆疊之經改造的轉殖基因。
同樣地，也期望有機制可用來在植物的特定組織或器官內表現轉殖基因。例如，可藉由用病原體抗性基因對植物基因組進行轉形來實現植物對受土壤媒介病原體感染的抗性增加，使得病原體抗性蛋白在植物根內穩固表現。或者，會期望能在特定的生長或發育階段(諸如細胞分裂或伸長)中在植物組織中表現轉殖基因。此外，可能期望在植物的葉及莖組織中表現轉殖基因，以提供針對除草劑之耐受性或針對地上昆蟲及害蟲之抗性。
因此，需要有可在特定植物組織中驅動所期望的轉殖基因表現程度之新基因調控元件。
在本發明之實施例中，本發明係有關一種核酸載體，其包括一個可操作地連接於以下之啟動子：一個多酶切點接頭序列、一個非 GRMZM2G047720基因；或所述多酶切點接頭序列與所述非GRMZM2G047720基因的組合，其中該啟動子包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列。於此實施例態樣中，該啟動子的長度為2,065bp。另外的實施例係包含一個由與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列所組成的啟動子。於其它態樣中，該啟動子係可操作地連接至一選擇標誌物。於額外的態樣中，該啟動子係可操作地連接至一轉殖基因。例示性轉殖基因包含：一選擇標誌物或一賦予殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、氮利用效率、小RNA表現、位點特異性核酸酶、水分利用效率、營養品質或DNA結合蛋白之基因產物。於另外的態樣中，該核酸載體係包括一個與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性之3'非轉譯聚核苷酸序列，其中該3'非轉譯序列係可操作地連接至該多酶切點接頭或該轉殖基因。於其它態樣中，該核酸載體係包括一個5'非轉譯聚核苷酸序列，其中該5'非轉譯序列係可操作地連接至該多酶切點接頭或該轉殖基因。於另外的態樣中，該核酸載體係包括一個內含子序列。本發明之啟動子係進一步在葉子組織中驅動轉殖基因的表現。
於本發明另外的實施例中，本發明係有關一種非玉蜀黍c.v.B73植物，其包括一個與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性且可操作地連接至一轉殖基因之聚核苷酸序列。於此實施例的一態樣中，所述植物係選自由以下組成之群：小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、阿拉伯芥、菸草、向日葵及芥花。於另一態樣中，所述植物為玉米植物。於另外的態樣中，該轉殖基因係插入該植物的基因組內。於其它實施例中，所述與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列係為啟動子。於另一態樣中，所述植物係包括一包括有SEQ ID NO：5之3'非轉譯序列，其中該3'非轉譯序列係可操作地連接至該轉殖基因。於另外的態樣中，該啟動子 係驅動葉子組織的轉殖基因表現。於這些實施例額外的態樣中，該啟動子的長度為2,065bp。
於本發明的其它實施例中，其係提供一種產生基因轉殖植物細胞之方法。該方法包含以下步驟：以一包括有玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之基因表現卡匣轉形植物細胞，所述啟動子係可操作地連接於至少一所關注的聚核苷酸序列；分離所述包括有基因表現卡匣之經轉形植物細胞；以及，產生一包括有該可操作地連接於至少一所關注的聚核苷酸序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因轉殖植物細胞。於此實施例的一態樣中，該植物細胞的轉形係以一植物轉形方法執行。該植物轉形方法係選自下列轉形方法中之任一者：農桿菌介導之轉形方法、基因槍轉形方法、碳化矽轉形方法、原生質體轉形方法及脂質體轉形方法。於另外的態樣中，所關注的聚核苷酸序列係優先表現於地面上的組織中。於額外的態樣中，所關注的聚核苷酸序列係穩定整合至基因轉殖植物細胞的基因組中。於該方法額外的態樣中，其進一步包含以下步驟：使該基因轉殖植物細胞再生成基因轉殖植物，以及獲得該基因轉殖植物，其中該基因轉殖植物係包括所述包括有該可操作地連接於至少一所關注的聚核苷酸序列之如請求項1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因表現卡匣。於該實施例之另一態樣中，該基因轉殖植物細胞係為一種單子葉基因轉殖植物細胞或雙子葉基因轉殖植物細胞。因此，該雙子葉基因轉殖植物細胞係可為阿拉伯芥植物細胞、菸草植物細胞、大豆植物細胞、芥花植物細胞及棉花植物細胞。同樣地，該單子葉基因轉殖植物細胞係可為玉米植物細胞、水稻植物細胞及小麥植物細胞。於其它的態樣中，玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係包括SEQ ID NO：1之聚核苷酸。於一態樣中該等實施例係包含可操作地連接至SEQ ID NO：1的3'端之第一個所關注的核苷酸序列。
本發明係進一步有關一種在植物細胞中表現所關注的聚核苷酸序列之方法，該方法包括將一個可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之所關注的聚核苷酸序列導入植物細胞。於此實施例之一態樣中，所述可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之所關注的聚核苷酸序列係藉由植物轉形方法而導入植物細胞中。於一額外的態樣中，該植物轉形方法係選自農桿菌介導之轉形方法、基因槍轉形方法、碳化矽轉形方法、原生質體轉形方法及脂質體轉形方法。於另外的態樣中，所關注的聚核苷酸序列係組成性地表現在整個植物細胞中。在另一些態樣中，所關注的聚核苷酸序列係穩定整合至植物細胞的基因組中。於一實施例中，該基因轉殖植物細胞係為一種單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞。因此，該雙子葉植物細胞包含阿拉伯芥植物細胞、菸草植物細胞、大豆植物細胞、芥花植物細胞及棉花植物細胞。同樣地，該單子葉植物細胞包含玉米植物細胞、水稻植物細胞及小麥植物細胞。
本發明係進一步有關一種包括有玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之基因轉殖植物細胞。於此實施例的一態樣中，該基因轉殖植物細胞係包括一個基因轉殖事件。於其它態樣中，該基因轉殖事件係包括一個農藝性狀。例示性基因轉殖性狀包含殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮利用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、選擇標誌物性狀、小RNA性狀或其任何組合。於一實施例中，該除草劑耐受性性狀係包括aad-1編碼序列。於其它態樣中，該基因轉殖植物細胞係產生商品化產品。例如，該商品化產品係可為蛋白濃縮物、蛋白分離物、穀物、粗磨粉、麵粉、油或纖維。於另外的態樣中，該基因轉殖殖物細胞係選自由雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞所組成之群。例如，該單子葉植物細胞係可為玉米植物細胞。於其它態樣中，該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係包括一個與SEQ ID NO：1之聚核苷酸具有至少90%序列一致性的聚核苷酸。於另外的態樣中，該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的長度為2,065bp。在另一個態樣中，該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係包括一個與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列。另外的態樣係包含一個可操作地連接至SEQ ID NO：1的3'端之第一個所關注的聚核苷酸序列。於一額外的態樣中，該農藝性狀係優先表現在葉子組織中。
本發明係進一步有關一種經分離的聚核苷酸，其包括一個與SEQ ID NO：1之聚核苷酸具有至少90%序列一致性的核酸序列。於此實施例的一態樣中，該經分離的聚核苷酸係偏好在葉子組織中表現。於其它態樣中，該經分離的聚核苷酸在植物細胞內係具有表現活性。於另外的態樣中，該經分離的聚核苷酸係包括一編碼多肽之開放讀取框架聚核苷酸；以及一終止序列。於一額外的態樣中，SEQ ID NO：1之聚核苷酸的長度為2,065bp。
前述及其他特徵將參照附圖，藉由詳細描述下列數個實施例而變得更清楚。
圖1：此圖為pDAB108739之示意圖，其包含於一驅動cry3Ab1轉殖基因表現的基因表現卡匣中之SEQ ID NO：1的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子以及SEQ ID NO：5的玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR。
I.數個實施例的概述
基因轉殖植物產品的開發正變得愈來愈複雜。現今商業上確實可行的基因轉殖植物係需要將多個轉殖基因堆疊至單個基因座中。用於基礎研究或生物技術應用之植物啟動子一般為單向的，僅用以導入一個已融合在其3’端(下游)的基因。用於基礎研究或生物技術應用的植物3’UTR一般為單向 的，僅用以終止一個已融合在其5’端(上游)的基因的表現。因此，每個轉殖基因通常需要一個啟動子供進行表現之用，以及一個3’UTR供終止表現之用，其中表現一個基因堆疊內的多個轉殖基因係需要有多個啟動子與3’UTR。隨著基因堆疊中之轉殖基因的數目增加，習慣使用相同的啟動子與3’UTR來獲得相似程度的不同轉殖基因表現模式。獲得相似程度的轉殖基因表現是產生單一個多基因性表徵所必需的。遺憾的是，已知道受相同啟動子及3’UTR所驅動的多基因構築體會引起基因沉默，導致本領域中的有效基因轉殖產物較少。重複的啟動子與3’UTR元件可引起基於同源性的基因沉默。另外，轉殖基因內之重複序列可引起基因在基因座內的同源重組，導致聚核苷酸重新排列。轉殖基因的沉默及重新排列將可能對所產生的基因轉殖植物表現轉殖基因的效能有不被期望的影響。再者，歸因於啟動子重複之轉錄因子(TF)結合位點過量係可造成內源性TF耗盡，引起轉錄失活。考慮到需要導入多個基因至植物中以用於代謝工程改造及性狀堆疊，需要多種啟動子與3’UTR來產生可驅動多個基因表現之基因轉殖作物。
在啟動子鑑別中的特別問題在於，需要鑑別與植物中之特定細胞類型、發育階段及/或功能相關之不在其他植物組織中表現的組織特異性啟動子。組織特異性(即組織較佳)或器官特異性啟動子係驅動諸如植物之果仁、根、葉或營養層之某一組織中的基因表現。組織及發育階段特異性啟動子最初係可由觀察基因的表現來鑑別，該等基因係於特定組織中或在植物發育期間之特定時間周期中表現。這些組織特異性啟動子係為基因轉殖植物產業中之某些應用所需的，且由於其可合乎期望地允許異源基因以組織及/或發育階段選擇性方式特異性表現，表明了異源基因有差異地在各種器官、組織及/或時間表現，但不在其他組織表現。例如，可藉由用病原體抗性基因對植物基因組進行轉形來實現植物對受土壤媒介病原體感染的抗性增加，使得病原體 抗性蛋白在植物根內穩固表現。或者，會期望能在特定的生長或發育階段(諸如細胞分裂或伸長)中在植物組織中表現轉殖基因。另一應用為期望使用組織特異性啟動子來限制該等編碼農藝性狀之轉殖基因在特定的組織類型(如發育中的薄壁細胞)中表現。由此，在啟動子鑑別中的特別問題為，如何鑑別啟動子以及如何針對特定的組織表現來將所鑑別的啟動子與細胞之發育特性聯繫起來。
關於啟動子或3’UTR鑑別的另一個問題為，需要選殖所有相關的順式作用與反式活化轉錄控制元件，以便所選殖的DNA片段以想要的特定表現模式來驅動轉錄作用。考慮到這類控制元件係位於轉譯起始或開始位點的遠端，經選擇用來包括啟動子之聚核苷酸的大小對於提供該啟動子聚核苷酸序列之表現程度及表現模式至關重要。考慮到針對3’UTR終止之類似元件係位於轉譯終止或停止位點的遠端，經選擇用來包括3’UTR之聚核苷酸的大小對於提供一個由聚核苷酸序列所編碼之轉殖基因的表現終止係至關重要的。已知啟動子及3’UTR長度包含了功能資訊，且不同的基因已顯示出具有與基因組中其他基因之啟動子更長或更短的啟動子。闡明啟動子之轉錄開始位點及預測啟動子區域中之功能性基因元件係具有挑戰性的。另外增加挑戰性的是，調節基元及順式與反式調控元件的複雜性、多樣性及固有簡併性質(Blanchette,Mathieu,等人，"Genome-wide computational prediction of transcriptional regulatory modules reveals new insights into human gene expression." Genome research 16.5(2006)：656-668)。順式與反式調控元件係位於啟動子的遠端部分，而啟動子調控了基因之空間及時間表現以僅在所需位點及特定時間出現(Porto,Milena Silva,等人，"Plant promoters：an approach of structure and function." Molecular biotechnology 56.1(2014)：38-49)。現有的啟動子分析工具無法可靠地鑑別基因組序列中的這類順式調控元件，因此預測出過多的誤判，因為這些工具一般僅專注在序列內容(Fickett JW, Hatzigeorgiou AG(1997)Eukaryotic promoter recognition.Genome research 7：861-878)。因此，鑑別啟動子調控元件需要獲得一個具有特定大小之適當序列，該序列將以所期望方式引起一個可操作地連接之轉殖基因的驅動表現。再者，鑑別3’UTR調控元件需要獲得一個具有特定大小之適當序列，該序列將以所期望方式引起一個可操作地連接之轉殖基因的終止表現。
本發明提供了經由使用玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子元件及其它玉蜀黍GRMZM2G047720調控元件克服此類問題以在植物中表現轉殖基因之方法及組合物。
II.術語及縮寫
在本申請案通篇係使用了許多的術語。為了對本說明書及申請專利範圍(包含欲給出此類術語之範疇)提供清楚且一致的解釋，提供了以下的定義。
如本文中所用，術語「內含子」係指基因(或所關注的經表現聚核苷酸序列)中所包括之經轉錄但未經轉譯的任何核酸序列。內含子係包含於DNA的表現序列以及由其轉錄之RNA分子中的相應序列之內的非轉譯核酸序列。本文中所述之構築體亦可含有增強轉譯及/或mRNA穩定性之序列，諸如內含子。一個此類內含子之實例為阿拉伯芥之組織蛋白H3變異體之基因II的第一內含子，或任何其他通常已知的內含子序列。內含子係可與啟動子序列組合使用以增強轉譯及/或mRNA穩定性。
如本文中所用，術語「經分離的」意指已從其自然環境移除，或於化合物最初形成時從存在的其他化合物中移除。術語「經分離的」係涵蓋從自然來源分離之材料，以及在藉由於宿主細胞中重組表現來製備之後所回收的材料(例如，核酸及蛋白質)，或化學合成之化合物(諸如核酸分子、蛋白質及肽)。
如本文中所用，術語「經純化的」係有關將分子或化合物分離為一種實質上不含有通常在天然或自然環境中與該分子或化合物相關聯的汙染物之形式，或相對於該化合物最初形成時存在的其它化合物而言在濃度上高度富集之形式，且意指已由於與原始組成中之其他組分分離而在純度上有所增加。術語「經純化的核酸」在本文中係用以描述已與其他生物化合物(包含(但不限於)多肽、脂質及碳水化合物)分離、分開產生、或純化出來，同時影響組分的化學或功能改變(例如，藉由移除蛋白質污染物並使連接核酸與染色體中的其餘DNA化學鍵斷裂，而可將核酸從染色體中純化出來)的核酸序列。
如本文中所用，術語「合成的」係指經由化學合成做為體外方法所構建的聚核苷酸(即DNA或RNA)分子。例如，合成的DNA係可於反應期間在一個EppendorfTM管子內形成，以便由天然DNA或RNA股酶促產生所述合成的DNA。可採用其他實驗室方法來合成聚核苷酸序列。寡核苷酸係可在寡核苷酸合成儀上使用胺基磷酸酯經由固相合成而化學合成。所合成的寡核苷酸可彼此黏接為複合物，藉此產生「合成的」聚核苷酸。用於化學合成聚核苷酸的其他方法為本領域中已知的，可易於實施而使用於本發明之中。
如本文中所用，術語「約」意指言明的值或數值範圍大或小10%，但不意圖將任何值或數值範圍僅僅指定為此較廣的定義。前面有術語「約」的每個值或數值範圍亦意欲涵蓋所陳述絕對值或數值範圍之實施例。
出於本發明之目的，「基因」包含編碼基因產物(參見下文)之DNA區域，以及調控基因產物的生成之所有DNA區域，無論這類調節序列是否鄰近編碼序列及/或轉錄序列。因此，基因係包含(但不一定限於)啟動子序列、終止子、轉譯調控序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位 點)、強化子、靜止子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附接位點及基因座控制區。
如本文中所用，術語「天然的或自然的」係界定於自然界中所發現之條件。「天然DNA序列」為自然界中存在之藉由自然手段或傳統育種技術產生而非藉由遺傳工程改造(例如，使用分子生物學/轉形技術)所產生的DNA序列。
如本文中所用，「轉殖基因」的定義為一個編碼基因產物之核酸序列，包含(例如)但不限於mRNA。於一實施例中該轉殖基因係為外源性核酸，其中該轉殖基因序列已藉由遺傳工程改造而導入至通常未發現該轉殖基因之宿主細胞中(或其子代)。於一實例中，轉殖基因係編碼工業上或醫藥學上有用的化合物，或編碼所期望農業性狀之基因(例如，除草劑抗性基因)。於又一實例中，轉殖基因係為反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表現抑制了目標核酸序列的表現。於一實施例中，該轉殖基因係為內源性核酸，其中該內源性核酸之額外基因組複本為所期望的；或為相對於宿主生物體中之目標核酸序列呈反義方向的核酸。
如本文中所用，術語「非GRMZM2G047720轉殖基因」或「非GRMZM2G047720基因」係為與GRMZM2G047720基因編碼序列(SEQ ID NO：4)具有小於80%序列一致性之任何轉殖基因。
如本文所定義之「基因產物」係為藉由該基因所產生之任何產物。例如，該基因產物係可為基因之直接轉錄產物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、干擾RNA、核糖核酸酶、結構性RNA或任何其他類型之RNA)或藉由mRNA轉譯所產生之蛋白質。基因產物亦包含藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化及編輯之方法所修飾的RNA，以及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻醯化及糖基化所修飾的蛋白 質。基因表現係可受外部信號影響，例如細胞、組織或生物體暴露於增加或降低基因表現之試劑。亦可在由DNA到RNA到蛋白質之路徑中的任何位置來調控基因的表現。基因表現的調控係(例如)經由控制對轉錄、轉譯、RNA運輸及加工的作用、諸如mRNA之中間分子的降解、或經由特異性蛋白分子在其已製得之後的活化、失活、隔室化或降解、或藉由其組合而發生。基因表現可藉由本領域中已知的任何方法在RNA層級或蛋白質層級進行量測，所述方法包括(但不限於)北方墨點法、RT-PCR、西方墨點法、或體外、原位或體內蛋白質活性分析。
如本文中所用，術語「基因表現」係有關將核酸轉錄單元(包含(例如)基因組DNA)之編碼資訊轉化成細胞之操作性、非操作性或結構部分的過程，其常包含蛋白質的合成。基因表現可受到外部信號影響；例如，細胞、組織或生物體暴露於增加或降低基因表現之試劑。亦可在由DNA到RNA到蛋白質之路徑中的任何位置來調控基因的表現。基因表現的調控係(例如)經由控制對轉錄、轉譯、RNA運輸及加工的作用、諸如mRNA之中間分子的降解、或經由特異性蛋白分子在其已製得之後的活化、失活、隔室化或降解、或藉由其組合而發生。基因表現可藉由本領域中已知的任何方法在RNA層級或蛋白質層級進行量測，所述方法包括(但不限於)北方墨點法、RT-PCR、西方墨點法、或體外、原位或體內蛋白質活性分析。
如本文中所用，「基於同源性之基因沉默」(HBGS)係為包含轉錄基因沉默及轉錄後基因沉默之通用術語。非連鎖沉默基因座對於目標基因座的沉默作用可以是轉錄抑制(轉錄基因沉默；TGS)或mRNA降解(轉錄後基因沉默；PTGS)的結果，二者分別是由對應於啟動子之雙股RNA(dsRNA)或轉錄序列之雙股RNA的產生所導致的。每個過程涉及不同的細胞組分，這表明dsRNA誘導的TGS及PTGS可能是由古老的共同機制之多樣化而來的。 然而，TGS及PTGS的嚴格比較是難以達成的，因為這一般比較依賴於對不同的沉默基因座的分析。在一些情況下，由於產生了對應於不同目標基因之啟動子及轉錄序列的dsRNA，單個轉殖基因基因座皆可觸發TGS及PTGS。Mourrain等人(2007)Planta 225：365-79。siRNA可能為在同源序列上觸發TGS及PTGS之實際分子：siRNA會在此模型中經由擴展轉殖基因序列之甲基化至內源性啟動子中而以順式及反式觸發同源序列之沉默及甲基化。
如本文中所用，術語「核酸分子」(或「核酸」或「聚核苷酸」)係可指聚合物形式的核苷酸，其可包含RNA、cDNA、基因組DNA及合成形式之有義股及反義股，及以上各物的混合聚合物。核苷酸係可指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸之任一者的修飾形式。如本文中所用，「核酸分子」係與「核酸」及「聚核苷酸」同義。除非另有指明，核酸分子的長度通常為至少10個鹼基。前述術語係可指具有不確定長度的RNA或DNA分子。前述術語係包含單股及雙股形式的DNA。核酸分子可包含自然存在的核苷酸以及藉由天然存在之核苷酸鍵及/或非天然存在之核苷酸鍵連接在一起的經修飾核苷酸中之任一者或兩者。
如熟習該項技術者應易於瞭解，核酸分子可經化學或生物化學修飾，或可含有非天然或衍生化核苷酸鹼基。這類修飾包含(例如)標記、甲基化、用類似物取代一或多個天然存在之核苷酸、核苷酸間修飾(例如，不帶電連接的修飾：例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等；帶電連接的修飾：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；側接部分的修飾：例如肽；嵌入劑修飾：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷基化劑；及經修飾鍵：例如α變旋異構核酸等)。術語「核酸分子」亦包含任何拓撲構形，包含單股、雙股、部分雙螺旋、三螺旋、髮夾形、環形及鎖式構形。
轉錄係以5'至3'的方式沿著DNA股鏈前進。此意味著RNA是藉 由依序添加核糖核苷酸-5'-三磷酸至生長鏈的3'端(同時必須去清除焦磷酸)而製造。在線性或環形核酸分子中，若離散元件(例如特定的核苷酸序列)結合到或將結合到相同核酸上之另一元件的5'方向上，則稱其位於所述另一元件的「上游」或「5'」。同樣地，若離散元件結合到或將結合到相同核酸上之另一元件的3'方向上，則稱其位於所述另一元件的「下游」或「3'」。
如本文中所用，鹼基「位置」係指於一指定核酸內之給定鹼基或核苷酸殘基的位置。所述指定核酸係可藉由與一參考核酸進行比對(參見下文)而加以定義。
雜交係有關於兩個聚核苷酸股經由氫鍵之結合。寡核苷酸及其類似物係藉由互補鹼基之間的氫鍵鍵結雜交，所述氫鍵鍵結包含華森-克里克(Watson-Crick)、胡格斯丁(Hoogsteen)或反向胡格斯丁氫鍵鍵結。一般而言，核酸分子係由含氮鹼基所組成，所述含氮鹼基為嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G))。此等含氮鹼基在嘧啶及嘌呤之間形成氫鍵，且嘧啶與嘌呤之鍵合係稱為「鹼基配對」。更具體而言，A將與T或U氫鍵鍵結，而G將與C氫鍵鍵結。「互補」係指在兩個不同的核酸序列之間或在同一核酸序列之兩個不同區域之間所發生的鹼基配對。
術語「可特異性雜交」及「特異性互補」係指示有足夠程度的互補性，從而在寡核苷酸及DNA或RNA目標之間發生穩定且特異性的結合。寡核苷酸無需與其可特異性雜交之目標序列100%互補。當寡核苷酸與目標DNA或RNA分子的結合會干擾目標DNA或RNA的正常功能時，並且有足夠的互補程度得以在期望有特異性結合的情況下(例如就體內測定或系統而言在生理條件下)避免寡核苷酸與非目標序列發生非特異性結合，則所述寡核苷酸係為可特異性雜交的。這類的結合係稱為特異性雜交。
引起特定嚴格性程度的雜交條件將視所選擇的雜交方法的本質以 及雜交核酸序列之組成與長度而改變。一般而言，雜交溫度及雜交緩衝液之離子強度(尤其是Na+及/或Mg2+濃度)將構成雜交嚴格性，儘管清洗時間也會影響嚴格性。關於獲得特定嚴格程度所需的雜交條件的計算係於Sambrook人(編)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989，第9及11章中有所討論。
如本文中所用，「嚴格條件」係涵蓋只有在雜交分子與DNA目標之間的錯配小於50%的時候才會發生雜交的條件。「嚴格條件」包含了其他特定的嚴格性程度。因此，如本文中所用，「中等嚴格性」條件係為序列錯配超過50%的分子不會雜交的條件；「高嚴格性」條件係為序列錯配超過20%的序列不會雜交的條件；而「極高嚴格性」條件係為錯配超過10%的序列不會雜交的條件。
在特定實施例中，嚴格條件可包含在65℃下雜交，隨後在65℃下以0.1x SSC/0.1% SDS清洗40分鐘。
以下為代表性、非限制性之雜交條件：
極高嚴格性：於5x SSC緩衝液中在65℃下雜交16小時；於2x SSC緩衝液中在室溫下清洗兩次，每次15分鐘；以及於0.5x SSC緩衝液中在65℃下清洗兩次，每次20分鐘。
高嚴格性：於5x-6x SSC緩衝液中在65-70℃下雜交16-20小時；於2x SSC緩衝液中在室溫下清洗兩次，每次5-20分鐘；以及於1x SSC緩衝液中在55-70℃下清洗兩次，每次30分鐘。
中嚴格性：於6x SSC緩衝液中在室溫至55℃下雜交16-20小時；於2x-3x SSC緩衝液中在室溫至55℃下清洗至少兩次，每次20-30分鐘。
於特定實施例中，可特異性雜交之核酸分子係可在極高嚴格性雜 交條件下保持結合。於這些及其他實施例中，可特異性雜交之核酸分子係可在高嚴格性雜交條件下保持結合。於這些及其他實施例中，可特異性雜交之核酸分子係可在中等嚴格性雜交條件下保持結合。
寡核苷酸：寡核苷酸係為短核酸聚合物。寡核苷酸係可藉由較長核酸區段的裂解、或藉由使個別核苷酸前驅物聚合化而形成。自動合成儀允許合成長度達數百個鹼基對的寡核苷酸。因為寡核苷酸可以結合到互補的核苷酸序列，故其可做為檢測DNA或RNA的探針。由DNA組成之寡核苷酸(寡去氧核糖核苷酸)可使用於用來擴增小DNA序列的PCR技術中。在PCR中，寡核苷酸通常稱為「引子」，其允許DNA聚合酶延伸寡核苷酸且複製互補股鏈。
如本文中所用，術語「序列一致性」或「一致性」(如使用在本文中之兩個核酸或多肽序列的上下文之中者)可指當該二個序列在一個指定比較視窗上比對出最大的對應度時，兩個序列中相同的殘基。
如本文中所用，術語「序列一致性百分比」可指藉由在比較視窗上比較兩個最佳比對序列(例如核酸序列及胺基酸序列)所判定的數值，其中為了使兩個序列實現最佳的比對，在比較視窗中的序列部分與該參考序列(其不包括添加或缺失)比較時係可包括添加或缺失(即缺口)。該百分比的計算方式如下：判定兩個序列中出現相同核酸或胺基酸殘基的位置的數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較視窗中的位置總數，並將所得結果乘以100，從而產生所述序列一致性百分比。
用於比對序列進行比較之方法在本領域中是眾所周知的。各種程式及比對演算法係描述於(例如)：Smith及Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson及Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.85：2444；Higgins及Sharp(1988)Gene 73：237-44； Higgins及Sharp(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50。序列比對方法及同源性計算之詳細考量可見於(例如)Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10。
國家生物技術資訊中心(NCBI)鹼基局部比對檢索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))係可從多種來源獲得，包含國家生物技術資訊中心(Bethesda,MD)及網際網路上，供與多種序列分析程式結合使用。關於如何使用此程式判定序列一致性的描述係可在網際網路上BLASTTM的「幫助」部分獲得。對於核酸序列的比較，可使用預設參數執行BLASTTM程式的「Blast 2序列」(Blastn)。當使用這種方法進行評估時，與參考序列的相似性越大的核酸序列將顯示出越高的一致性百分比。
如本文中所用，術語「可操作地連接」係關於當第一核酸序列與第二核酸序列係呈功能關係時，第一核酸序列係與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，當啟動子影響編碼序列之轉錄或表現時，啟動子係與編碼序列可操作地連接。當以重組方式產生時，可操作地連接之核酸序列一般為鄰接的，且在必需接合兩個蛋白編碼區域時，位在同一個讀取框架中。然而，元件無需是鄰接以便可操作地連接。
如本文中所用，術語「啟動子」係指一般位於基因上游(朝向基因之5'區)且為起始及驅動基因轉錄所需之DNA區域。啟動子可使其控制之基因適當活化或抑制。啟動子可含有被轉錄因子識別的特異性序列。這些因子可結合至一個啟動子DNA序列，導致RNA聚合酶(一種從基因的編碼區域合成RNA的酶)的添補。啟動子一般係指位於基因上游之所有基因調控元件，包含上游啟動子、5’ UTR、內含子及前導序列。
如本文中所用，術語「上游啟動子」係指足以引導轉錄開始之鄰接聚核苷酸序列。如本文中所用，上游啟動子涵蓋了轉錄起始位點與數個序列基元，包含TATA盒、起始序列、TFIIB識別元件及其他啟動子基元(Jennifer,E.F.等人，(2002)Genes & Dev.,16：2583-2592)。上游啟動子提供了RNA聚合酶II(其為一種多次級單位酶)與如TFIIA、B、D、E、F及H之基本或通用轉錄因子的作用位點。這些因子組裝成轉錄前起始複合物，其催化了從DNA模板合成RNA。
上游啟動子之活化係藉由調控DNA序列元件之額外序列來進行，各種蛋白質係結合至所述額外序列且隨後與轉錄起始複合體交互作用以活化基因表現。這些基因調控元件序列係與特異性DNA結合因子交互作用。這些序列基元有時可稱為順式元件。組織特異性或發育特異性轉錄因子單獨地或組合結合這類順式元件，使這類順式元件可在轉錄層級判定啟動子的時空表現模式。這些順式元件在對可操作連接之基因的控制類型方面可以有很大不同。一些元件會響應於環境反應(例如溫度、濕度、和受創)而增加可操作連接之基因的轉錄。其他順式元件係可對發育信號(例如發芽、種子成熟及開花)或對空間資訊(例如組織特異性)起反應。參見(例如)Langridge等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-23。這些順式元件與轉錄起始點的距離各不相同，一些順式元件(稱為近端元件)係鄰近一個最小核心啟動子區域，而其他元件可位於啟動子(強化子)上游或下游數千個鹼基位置處。
如本文中所用，術語「5'非轉譯區域」或「5’ UTR」或「5’UTR」定義為前mRNA或成熟mRNA之5'端的非轉譯區段。例如，在成熟mRNA上，5’ UTR通常在其5'端上含有一個7-甲基鳥苷帽，並且涉及許多過程，諸如剪接、聚腺苷酸化、mRNA輸出至細胞質、由轉譯機構鑑別mRNA的5'端，以及保護mRNA免於降解。
如本文中所用，術語「轉錄終止子」定義為前mRNA或成熟mRNA之3'端的轉錄區段。例如，「聚腺苷酸化信號」位點之外較長延伸的DNA係轉錄為前mRNA。此DNA序列通常含有轉錄終止信號以便將前mRNA適當加工為成熟mRNA。
如本文中所用，術語「3'非轉譯區域」或「3’UTR」或「3’ UTR」定義為前mRNA或成熟mRNA之3'端的非轉譯區段。例如，在成熟mRNA上，此區域含有聚(A)尾部且已知在mRNA穩定性、轉譯起始及mRNA輸出中具有許多作用。另外，3’ UTR被認為含有聚腺苷酸化信號及轉錄終止子。
如本文中所用，術語「聚腺苷酸化信號」係指代mRNA轉錄物中存在的核酸序列，當在聚(A)聚合酶存在時，允許轉錄物在例如位於聚(A)信號下游10至30個鹼基處的聚腺苷酸化位點上聚腺苷酸化。許多聚腺苷酸化信號在本領域中是已知的且適用於本發明。例示性序列包含AAUAAA及其變異體，如Loke J.，等人，(2005)Plant Physiology 138(3)；1457-1468中所述。
「DNA結合轉殖基因」係為一個編碼DNA結合蛋白之聚核苷酸編碼序列。DNA結合蛋白隨後能夠結合至另一分子。結合蛋白可結合至(例如)DNA分子(DNA結合蛋白)、RNA分子(RNA結合蛋白)及/或蛋白質分子(蛋白質結合蛋白)。就蛋白質結合蛋白而言，其可結合至其自身(以形成均二聚體、均三聚體等)，且/或其可結合至不同蛋白質之一或多個分子。結合蛋白可具有一種類型以上的結合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結合、RNA結合及蛋白質結合活性。
DNA結合蛋白的實例包含；可「經工程改造」以結合至預定核苷酸序列之大範圍核酸酶、鋅指、CRISPR及TALE結合結構域。通常，經工程改造之DNA結合蛋白(例如鋅指、CRISPR或TALE)係為非自然存在的 蛋白質。用於工程改造的DNA結合蛋白之方法的非限制性實例係經為設計及選擇。所設計的DNA結合蛋白為自然界中不存在的蛋白質，其設計/組成大體上由合理準則產生。設計之合理準則包含應用取代法則及電腦化算法以處理現有ZFP、CRISPR及/或TALE設計及結合資料之資料庫儲存資訊中的資訊。參見(例如)美國專利案第6,140,081、6,453,242及6,534,261號；亦參見WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536及WO 03/016496以及美國專利公開案第20110301073、20110239315及20119145940號。
「鋅指DNA結合蛋白」(或結合結構域)為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之一種蛋白質或一種較大蛋白質內的結構域，其係為該結合結構域內其結構通過鋅離子配位而被穩定化之胺基酸序列區域。術語鋅指DNA結合蛋白常常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結合結構域可「經工程改造」以結合至一預定核苷酸序列。用於工程改造鋅指蛋白之方法的非限制性實例係經設計及選擇。所設計的鋅指蛋白為自然界中不存在的蛋白質，其設計/組成大體上由合理準則產生。設計之合理準則包含應用取代法則及電腦化算法以處理現有ZFP設計及結合資料之資料庫儲存資訊中的資訊。參見(例如)美國專利第6,140,081、6,453,242、6,534,261及6,794,136號；亦參見WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536及WO 03/016496。
於其他實例中，一或多種核酸酶之DNA結合結構域係包括自然存在或經工程改造(非自然存在)之TAL效應物DNA結合結構域。參見(例如)美國專利公開案第20110301073號，其係以全文引用方式併入本文中。已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)之植物病原菌會在重要作物中引起許多疾病。黃單胞菌屬之病原性係視保守性III型分泌(T3S)系統而定，該系統將更多不 同效應蛋白注入植物細胞中。這些注入的蛋白質當中包括轉錄活化因子樣(TALEN)效應物，其模擬植物轉錄活化因子並操控植物轉錄組(參見Kay等人，(2007)Science 318：648-651)。這些蛋白質含有DNA結合結構域及轉錄活化結構域。一種最充分表徵之TAL效應物為來自野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)之AvrBs3(參見Bonas等人，(1989)Mol Gen Genet 218：127-136及WO2010079430)。TAL效應物含有一種由串聯重複序列構成的中心結構域，每個重複序列含有大約34個胺基酸，這些重複序列對於這些蛋白質之DNA結合特異性是關鍵的。另外，其含有一個核定位序列及一個酸性轉錄活化結構域(綜述參見Schornack S,等人，(2006)J Plant Physiol 163(3)：256-272)。另外，在植物病原性細菌青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中已發現到兩個名為brg11與hpx17的基因是與青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)生物變種菌株GMI1000及生物變種4菌株RS1000中之黃單胞菌AvrBs3家族是同源的(參見Heuer等人，(2007)Appl and Enviro Micro 73(13)：4379-4384)。這些基因彼此之間的核苷酸序列有98.9%相同，差異在於hpx17的重複結構域中有1,575bp的缺失。然而，這兩種基因產物與黃單孢菌AvrBs3家族蛋白的序列一致性均小於40%。參見例如美國專利公開案第20110301073號，其以全文引用的方式併入本文中。
此等TAL效應物之特異性係視串聯重複序列中所發現之序列而定。該重複序列係包括大致102bp且其彼此之間通常有91-100%的同源性(Bonas等人，同上)。重複序列的多形現象通常位於位置12及13處，且在位置12及13處之高變雙殘基的身分標識與TAL效應物目標序列中之連續核苷酸的身分標識之間似乎存在一對一的對應性(參見Moscou及Bogdanove,(2009)Science 326：1501及Boch等人，(2009)Science 326：1509-1512)。已用實驗方式測定這些TAL效應物之用於DNA識別之天然編碼，使 得位置12及13處之HD序列結合至胞嘧啶(C)，NG結合至T，NI結合至A、C、G或T，NN結合至A或G，及ING結合至T。這些DNA結合性重複序列已被組配為具有新的重複序列組合與數目的蛋白質，並製造出能夠在植物細胞中與新序列相互作用且活化非內源性報告基因之表現的人工轉錄因子(Boch等人，同上)。經工程改造之TAL蛋白已被連接至FokI裂解半結構域，以產生在酵母報告測定(基於質體之目標)中展現出活性之TAL效應子結構域核酸酶融合物(TALEN)。
CRISPR(成簇的、規律間隔的短回文重複序列)叢集規律間隔短回文重複序列)/CAS(CRISPR相關的)核酸酶系統是近來經工程改造之基於可用于基因組工程改造的細菌系統之核酸酶系統。其係部分地基於許多細菌和古細菌之適應性免疫反應。當病毒或質體侵入細菌時，侵入者的DNA區段係藉由「免疫」反應轉化成CRISPR RNA(crRNA)。此crRNA接著通過部分互補的區域與稱為tracrRNA之另一類型的RNA結合，以引導Cas9核酸酶至與目標DNA中之與crRNA同源之稱為「原型間隔子」的區域。Cas9係於由一個在crRNA轉錄體內含有之20個核苷酸的引導序列所指定的位點處裂解DNA，以在雙股斷裂(DSB)處產生鈍端。Cas9皆需要crRNA及tracrRNA以用於位點特異性DNA識別及裂解。此系統現已經工程改造以使得crRNA及tracrRNA可組合成一個分子(「單引導RNA」)，且所述單引導RNA之crRNA等效部分係可經工程改造以引導Cas9核酸酶引導到任何所期望的序列(參見Jinek等人，(2012)Science 337，第816-821頁；Jinek等人，(2013),eLife 2：e00471及David Segal,(2013)eLife 2：e00563)。因此，CRISPR/Cas系統係可經工程改造以在基因組中之所期待的目標處形成DSB，並通過修復抑制劑的使用而影響DSB的修復，從而增加容易出錯的修復。
於其他實例中，DNA結合轉殖基因係為一個包括經工程改造(非自然存在)之大範圍核酸酶(也稱作歸巢核酸內切酶)之位點特異性核酸酶。諸如I-SceI,I-CeuI,PI-PspI,PI-Sce,I-SceIV,I-CsmI,I-PanI,I-SceII,I-PpoI,I-SceIII,I-CreI,I-TevI,I-TevII及I-TevIII之歸巢核酸內切酶或大範圍核酸酶的識別序列為已知的。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-30 3388；Dujon等人，(1989)Gene 82：115-118；Perler等人，(1994)Nucleic Acids Res.22,11127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人，(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人，(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。另外，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的DNA結合特異性係可經工程改造而結合非自然目標位點。參見(例如)Chevalier等人，(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等人，(2003)Nucleic Acids Res.5 31：2952-2962；Ashworth等人，(2006)Nature 441：656-659；Paques等人，(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美國專利公開案第20070117128號。歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶之DNA結合結構域係可在整個核酸酶主體上改變(即使得核酸酶包含同源裂解結構域)或可與異源裂解結構域融合。
如本文中所用，術語「轉形」係涵蓋可將核酸分子導入至這類的細胞中之所有技術。實例包含(但不限於)：用病毒載體轉染；用質體載體轉形；電穿孔；脂質體轉染；顯微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15：579-85)；農桿菌介導的轉移；直接DNA吸收；WHISKERSTM介導的轉形；以及微彈轟擊。這些技術皆可用於植物細胞之穩定轉形及暫時轉形。「穩定轉形」係指核酸片段導入到宿主生物體的基因組中導致基因上的穩定遺傳。一旦穩定轉形，核酸片段係穩定地整合於宿主生物體及任何子代之基因組中。含有經轉形核酸片段之宿主生物體稱為「轉殖基因」生物體。「暫時轉形」係指核酸片段 引入至宿主生物體之細胞核或含DNA之胞器中，在無基因上穩定遺傳的情況下導致基因表現。
外源性核酸序列。於一實例中，轉殖基因係為基因序列(例如除草劑抗性基因)、編碼工業上或醫藥學上適用之化合物的基因或編碼所需農業性狀之基因。在另一實例中，轉殖基因係為反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表現抑制了目標核酸序列的表現。轉殖基因可含有可操作地連接至轉殖基因之調節序列(例如啟動子)。於一些實施例中，所關注的聚核苷酸序列係為轉殖基因。然而，在其他實施例中，所關注的聚核苷酸序列係為一個內源性核酸序列(其中該內源性核酸序列之額外基因組複本是被期望的)或一個相對於宿主生物體之目標核酸分子的序列呈反義方向的核酸序列。
如本文中所用，術語基因轉殖「事件」藉由以下步驟產生：用異源性DNA(即包含所關注的轉殖基因之核酸構築體)轉形植物細胞，由該轉殖基因插入至植物基因組中所產生的植物群體再生，以及選擇一個藉由插入至特定基因組位置中表徵之特定植物。術語「事件」係指包括異源性DNA之原始轉形體及轉形體的子代。術語「事件」亦指藉由轉形體與包含該基因組/轉殖基因DNA之另一品種之間的有性異型雜交所產生的子代。即使在與輪迴親本重複回交之後，來自經轉形親代之所插入的轉殖基因DNA及側接基因組DNA(基因組/轉殖基因DNA)仍存在於雜交子代之相同染色體位置。術語「事件」亦指來自原始轉形體及其子代，其包括有預期會被轉移到子代之所插入的DNA及緊鄰所插入的DNA之側接基因組序列，且由於一個包含該所插入的DNA之親本品系(例如，原始轉形體及由自交產生之子代)與一個不含有所插入的DNA之親本品系進行有性雜交的結果，所述子代接受了包含有所關注轉殖基因之所插入的DNA。
如本文中所用，術語「聚合酶鏈反應」或「PCR」的定義為一個 微量核酸、RNA及/或DNA係如1987年7月28日公告之美國專利第4,683,195號中所如述進行擴增之程序或技術。一般而言，必須得到來自所關注區域的末端或該末端以外的序列資訊，以便設計寡核苷酸引子；這些引子在序列上將會與待擴增模板上的相對股鏈一致或相似。該二個引子於5'端的核苷酸係可與經擴增的物質之末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列、以及從總細胞RNA、噬菌體或質體序列等所轉錄的cDNA。一般參見Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,51：263(1987)；Erlich編，PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。
如本文中所用，術語「引子」係指當條件適於合成引子延伸產物時，能夠充當沿著互補股合成之起始點的寡核苷酸。合成條件係包含四種不同的去氧核糖核苷酸三磷酸及至少一種聚合誘導劑(諸如反轉錄酶或DNA聚合酶)的存在。其係存在於合適的緩衝液中，該緩衝液可包含輔助因子成分或在各種適合的溫度下會影響諸如pH等條件的成分。引子較佳地為一個單股鏈序列，以使得擴增效率最佳化，但亦可採用雙股鏈序列。
如本文中所用，術語「探針」係指一個與目標序列雜交的寡核苷酸。在TaqMan®或TaqMan®-型式的測定程序中，探針係與目標上的兩個引子黏接位點之間的部分雜交。探針包含約八個核苷酸、約十個核苷酸、約十五個核苷酸、約二十個核苷酸、約三十個核苷酸、約四十個核苷酸或約五十個核苷酸。於一些實施例中，探針係包含約八個核苷酸至約十五個核苷酸。探針可另外包含一個可偵測標記，例如螢光團(Texas-Red®、異硫氰酸螢光素等)。該可偵測標記係可直接共價連接到探針寡核苷酸，例如位於探針的5'端或探針的3'端。包含螢光團的探針亦可另外包含淬滅劑，例如Black Hole QuencherTM、Iowa BlackTM等。
如本文中所用，術語「核酸限制內切酶」及「限制酶」係指細菌酶，其每一者係於一個特定的核苷酸序列處或該處附近切割雙股DNA。第2型(Type-2)限制酶在相同位點處識別及裂解DNA，包含(但不限於)XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI及SmaII。
如本文中所用，術語「載體」係與術語「構築體」、「選殖載體」及「表現載體」可互換使用，且意指可將DNA或RNA序列(例如外來基因)導入到宿主細胞內，從而轉形宿主並促進所導入的序列表現(例如轉錄及轉譯)之載體。「非病毒載體」係意指不包括病毒或反轉錄病毒的任何載體。於一些實施例中，「載體」係為一個包括至少一個DNA複製起點及至少一個選擇標誌物基因之DNA序列。實例包含(但不限於)將外源性DNA攜載到細胞內的質體、黏質體、噬菌體、人造細菌染色體(BAC)。載體亦可包含一或多個基因、反義分子及/或選擇標誌物基因以及本領域中已知的其他遺傳元件。載體係可轉導、轉形或感染細胞，藉此使細胞表現出由該載體所編碼之核酸分子及/或蛋白質。術語「質體」的定義為一種能夠在原核或真核宿主細胞中進行常染色體複製的環股鏈核酸。該術語係包含可為DNA或RNA並且可為單股鏈或雙股鏈的核酸。質體的定義亦可包含對應於細菌複製起點的序列。
如本文中所用，術語「選擇標誌物基因」係定義一個編碼有助於鑑別插入選擇標誌物基因之細胞的蛋白質之基因或其他表現卡匣。例如，「選擇標誌物基因」係涵蓋報告基因以及用於植物轉形以(例如)保護植物細胞免於選擇藥劑或提供對選擇藥劑之抗性/耐受性的基因。於一實施例中，只有那些接受功能性選擇標誌物的細胞或植物能夠在具有選擇藥劑的條件下分裂或生長。選擇藥劑的實例可包含(例如)抗生素，其包含大觀黴素(spectinomycin)、新黴素(neomycin)、卡那黴素(kanamycin)、巴龍黴素(paromomycin)、慶大黴素(gentamicin)及潮黴素(hygromycin)。這些選擇標誌物 包含新黴素磷酸轉移酶(nptII)，其表現出賦予抗生素卡那黴素抗性之酶；以及針對相關抗生素新黴素、巴龍黴素、慶大黴素及G418的基因；或針對表現出賦予潮黴素抗性之酶潮黴素磷酸轉移酶(hpt)的基因。其他選擇標誌物基因可包含編碼除草劑抗性的基因，包含：bar或pat(針對草銨膦(glufosinate ammonium)或草丁膦(phosphinothricin)之抗性)；乙醯乳酸合成酶(ALS，針對抑制劑的抗性，所述抑制劑諸如為磺醯脲(SU)、咪唑啉酮(IMI)、三唑并嘧啶(TP)、嘧啶基氧基苯甲酸酯(POB)及磺醯基胺基羰基三唑啉酮，其防止分支鏈胺基酸合成的第一步)、草甘膦(glyphosate)、2,4-D以及金屬抗性或敏感性。可用作選擇標誌物基因的「報告基因」實例包含目視觀測所表現之報告基因蛋白，諸如編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、鹼性磷酸酶等之蛋白質。短語「標誌物陽性」係指已經轉形而包含選擇標誌物基因的植物。
如本文中所用，術語「可偵測標誌物」係指能夠偵測的標記，諸如(例如)放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶。可偵測標誌物的實例包含(但不限於)以下各物：螢光標記(例如FITC、鹼性蕊香紅、鑭系磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記、生物素基、可被第二個報告物識別的預定多肽表位(例如白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。於一實施例中，可偵測標記係可藉由各種長度的間隔臂附接以降低潛在的空間位阻。
如本文中所用，術語「卡匣」、「表現卡匣」及「基因表現卡匣」係指一個可在特異性限制性位點或通過同源重組而插入至核酸或聚核苷酸中的DNA區段。如本文中所用，該DNA區段包括編碼所關注的多肽之聚核苷 酸，且該卡匣及限制性位點係經設計以確保卡匣插入到適當的閱讀框架中供轉錄及轉譯。於一實施例中，表現卡匣可包含編碼所關注的多肽之聚核苷酸，且具有除了該聚合苷酸外之促進特定宿主細胞轉化之元件。於一實施例中，基因表現卡匣亦可包含可在宿主細胞中增強一個編碼所關注的多肽之聚核苷酸的表現之元件。這些元件可包含(但不限於)：啟動子、最小啟動子、強化子、反應元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列等。
如本文中所用，「連接子」或「間隔子」係為使兩個分離實體彼此結合之鍵結、分子或分子群。連接子及間隔子可向兩個實體提供最佳間距，或可另外供應允許兩個實體彼此分離之不穩定連接。不穩定的連接包含光可裂解基團、酸不穩定部分、鹼不穩定部分及酶可裂解基團。如本文中所用，術語「多酶切點接頭」或「多選殖位點」的定義為在一個核酸序列上之彼此位於10個核苷酸內之成簇的三個或更多個的第2型限制酶位點。包括有多酶切點接頭之構築體係用於核酸序列(諸如基因編碼區)的插入及/或切除。在其他情形中，如本文中所用之術語「多酶切點接頭」係指一段被靶向的核苷酸供使用於經由任何已知的無縫選殖方法(即Gibson Assembly®、NEBuilder HiFiDNA Assembly®、Golden Gate Assembly、BioBrick® Assembly等)來接合兩個序列。包括有多酶切點接頭之構築體係用於核酸序列(諸如基因編碼區)的插入及/或切除。
如本文中所用，術語「對照組」係指一個在用於比較目的之分析程序中所使用的樣本。對照組可以是「陽性」或「陰性」。例如，在分析程序之目的是檢測細胞或組織中差異表現之轉錄體或多肽的情況下，一般最好是包含陽性對照組，諸如來自於一個展現所期望的表現之已知植物樣本；及陰性對照組，諸如缺乏所期望的表現之已知植物樣本。
如本文中所用，術語「植物」係包含整株植物以及植物之任何後 代、細胞、組織或一部分。可用於本發明中之植物類別一般廣泛地包含適合於又便突變誘發之高等及低等植物，包含被子植物(單子葉及雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物及多細胞藻類。因此，「植物」係包含雙子葉植物及單子葉植物。術語「植物部分」係包含植物的任何部分，包含(例如)且不限於：種子(包含成熟種子及未成熟種子)；植物插條；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官(例如花粉、胚芽、花、果實、芽、葉、根、莖及外植體)。植物組織或植物器官可為種子、原生質體、植物癒合組織或組織成結構或功能單元之任何其他植物細胞群。植物細胞或組織培養物可能能夠再生一個具有獲得該細胞或組織之植物的生理及形態特徵的植物，且能夠再生一個具有與該植物實質上相同基因型之植物。相比之下，一些植物細胞不能夠再生來產生植物。植物細胞或組織培養物中之可再生細胞係可為胚芽、原生質體、分生細胞、植物癒合組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、穗絲、花、果仁、穗、穗軸、果殼或梗。
植物部分包括可收穫部分及適用於繁殖子代植物的部分。適用於繁殖的植物部分包含(例如)且不限於：種子；果實；插條；幼苗；塊莖；及根莖。植物之可收穫部分係可為植物之任何可用部分，包含(例如)且不限於：花；花粉；幼苗；塊莖；葉；莖；果實；種子；及根。
植物細胞係為植物之結構及生理單元，包括原生質體及細胞壁。植物細胞係可呈經分離之單細胞或細胞聚集物(例如脆弱的植物癒合組織及經培養細胞)，且可為較高級的組織單元(例如植物組織、植物器官及植物)的一部分。因此，植物細胞係可為原生質體、配子產生細胞或可再生成整株植物之細胞或細胞集合。因此，包括多個植物細胞且能夠再生成整株植物的種子在本文實施例中係視為「植物細胞」。
如本文中所用，術語「小RNA」係指多種類型的非編碼核糖核酸(ncRNA)。術語小RNA係描述在細菌細胞、動物、植物及真菌中所產生的短鏈ncRNA。這些ncRNA短鏈係可在細胞內自然產生，或可藉由導入會表現出短鏈或ncRNA之外源性序列而產生。小RNA序列不直接編碼蛋白質，且在功能方面與其他RNA不同，因為小RNA序列僅轉錄且不轉譯。小RNA序列參與其他細胞功能，包含基因表現及修飾。小RNA分子通常由約20至30個核苷酸所組成。小RNA序列可以從較長的前驅物得到。前驅物係形成在自身互補區域內會彼此回折的結構；其接著藉由動物中之核酸酶Dicer或植物中之核酸酶DCL1加工處理。
許多類型的小RNA係以自然的或人工產生的形式存在，包含微RNA(miRNA)、短干擾RNA(siRNA)、反義RNA、短髮夾RNA(shRNA)及小核仁RNA(snoRNA)。某些類型的小RNA(諸如微RNA及siRNA)在基因沉默及RNA干擾(RNAi)中是重要的。基因沉默是一種基因調控過程，其中通常被表現的基因係被細胞內元件(在此情況下為小RNA)所「關閉」。通常應由此遺傳資訊形成的蛋白質會由於干擾而不形成，且基因中所編碼的資訊被阻斷而不表現。
如本文中所用，術語「小RNA」涵蓋了文獻中描述為「微小RNA」(Storz,(2002)Science 296：1260-3；Illangasekare等人，(1999)RNA 5：1482-1489)；原核「小RNA」(sRNA)(Wassarman等人，(1999)Trends Microbiol.7：37-45)；真核「非編碼RNA(ncRNA)」；「微RNA(miRNA)」；「小非mRNA(snmRNA)」；「功能性RNA(fRNA)」；「轉移RNA(tRNA)」；「催化性RNA」[例如核酶，包含自身醯化核酶(Illangaskare等人，(1999)RNA 5：1482-1489)；「小核仁RNA(snoRNA)」、「tmRNA」(亦稱為「10S RNA」，Muto等人，(1998)Trends Biochem Sci.23：25-29；及Gillet等人，(2001)Mol Microbiol.42：879-885)之RNA分子；RNAi分子，包含(但不限於)「小干擾RNA(siRNA)」、「內切核糖核酸酶製備之siRNA(e-siRNA)」、「短髮夾RNA(shRNA)」及「小時間調節RNA(stRNA)」、「切割的siRNA(d-siRNA)」及適體；包括至少一個尿嘧啶鹼基之寡核苷酸及其他合成核酸。
除非另外特定闡述，否則本文所用之所有技術及科學術語係具有與本領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。分子生物學中之常見術語的定義可見於(例如)：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；及Meyers(編)，Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
如本文中所用，除非上下文另外明確且不含糊地指出，否則冠詞「一/一個」及「該」係包含複數個提及物。
III.玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及包括該啟動子之核酸
本發明所提供的是使用來自玉蜀黍GRMZM2G047720基因之啟動子及其它調控元件在植物中表現非轉殖基因之方法及組合物。於一實施例中，啟動子係可為SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於另一實施例中，3’UTR係可為SEQ ID NO：5之玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR。
於一實施例中，其提供了一種包括有啟動子的聚核苷酸，其中該啟動子係與SEQ ID NO：1至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或100%一致。於一實施例中，啟動子係為玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，其包括一種與SEQ ID NO：1之聚核苷酸至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或100%一致的聚核苷酸。於一實施例中，其提供 了一種經分離的聚核苷酸，所述聚核苷酸係與SEQ ID NO：1之聚核苷酸至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或100%一致。於一實施例中，其提供了一種包括有SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的核酸載體。於一實施例中，其提供了一種包括有一可操作地連接至多酶切點接頭之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的聚核苷酸。於一實施例中，其提供了一種包括有一可操作地連接至非GRMZM2G047720轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因表現卡匣。於一實施例中，其提供了一種包括有一可操作地連接至非GRMZM2G047720轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的核酸載體。於一實施例中，該啟動子係由SEQ ID NO：1所組成。於一說明性實施例中，核酸載體係包括一種可操作地連接至一轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，其中該轉殖基因係可為殺蟲劑抗性轉殖基因、除草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水分利用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、DNA結合轉殖基因、小RNA轉殖基因、選擇標誌物轉殖基因或其組合。
轉殖基因表現亦可藉由位於基因編碼序列下游之3’非轉譯基因區域(即，3’ UTR)來調控。啟動子及3’ UTR均可調控轉殖基因表現。儘管啟動子為驅動轉錄作用所必需的，但3’ UTR基因區域係可終止轉錄並啟動所得mRNA轉錄體之聚腺苷酸化以用於轉譯及蛋白質合成。3’ UTR基因區域幫助了轉殖基因穩定表現。
於一實施例中，其提供了一種包括有如本文所述之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及3’ UTR的核酸載體。於一實施例中，該核酸載體係包括玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。於一實施例中，該玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR為SEQ ID NO：5。
於一實施例中，其提供了一種包括有如本文所述之玉蜀黍 GRMZM2G047720啟動子及3’ UTR的核酸載體，其中該3’ UTR係與SEQ ID NO：5之聚核苷酸至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或100%一致。於一實施例中，其提供了一種包括有如本文所述之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的核酸載體，其中該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及該玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR係均可操作地連接至一個多酶切點接頭的相對末端。於一實施例中，其提供了一種包括有如本文所述之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的基因表現卡匣，其中該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及該玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR係均可操作地連接至一個非GRMZM2G047720轉殖基因的相對末端。於一實施例中該3’ UTR係由SEQ ID NO：5所組成。於一實施例中，其提供了一種包括有如本文所述之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的基因表現卡匣，其中該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係包括SEQ ID NO：1且該玉蜀黍GRMZM2G047720 3' UTR係包括SEQ ID NO：5，其中該啟動子及3’ UTR均可操作地連接至一個非GRMZM2G047720轉殖基因的相對末端。於此實施例之一態樣中，該3’ UTR係由SEQ ID NO：5所組成。於此實施例之另一態樣中，該啟動子係由SEQ ID NO：1所組成。於一說明性實施例中，基因表現卡匣係包括可操作地連接至轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR，其中該轉殖基因係可為殺蟲劑抗性轉殖基因、除草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水分使用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、DNA結合轉殖基因、小RNA轉殖基因、選擇標誌物轉殖基因或其組合。於另一實施例中，該轉殖基因係可操作地連接至來自於相同的GRMZM2G047720樣基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。
轉殖基因表現亦可藉由位於啟動子序列下游之內含子區來調控。啟動子及內含子均可調控轉殖基因表現。儘管啟動子為驅動轉錄所必需的，但內含子之存在可提高表現水準，產生mRNA轉錄物以用於轉譯及蛋白質合成。內含子基因區輔助轉殖基因之穩定表現。於另一實施例中，內含子係可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。
轉殖基因表現亦可藉由位於啟動子序列下游之5’ UTR區域來調控。啟動子及5’ UTR均可調控轉殖基因表現。儘管啟動子為驅動轉錄所必需的，但5' UTR之存在可提高表現水準，產生mRNA轉錄物以用於轉譯及蛋白質合成。5' UTR基因區域係輔助轉殖基因之穩定表現。於另一實施例中，5’ UTR係可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。
玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子亦可包括一或多個額外的序列元件。於一些實施例中，玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子可包括一個外顯子(例如，前導或訊息肽，諸如葉綠體轉運肽或ER滯留訊息)。例如且不限於，玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係可編碼一個併入到玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子中之外顯子而做為另一實施例。
於一實施例中，核酸載體係包括如本文所揭示之基因表現卡匣。於一實施例中，載體係可為適用於直接轉形或基因靶向諸如供體DNA之質體、黏質體、人造細菌染色體(BAC)、噬菌體、病毒或經剪切的聚核苷酸片段。
根據一實施例其提供了一種包括有重組基因表現卡匣之核酸載體，其中該重組基因表現卡匣係包括可操作地連接至多酶切點接頭序列、非GRMZM2G047720轉殖基因或其組合之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，該重組基因卡匣係包括可操作地連接至非-GRMZM2G047720轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，該重組基因卡匣係包括可操作地連接至多酶切點接頭序列之如本文所揭示之玉蜀黍 GRMZM2G047720啟動子。該多酶切點接頭以一定方式可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，使得編碼序列插入該多酶切點接頭的一個限制位點中時會將該編碼序列可操作地連接，從而允許在載體經轉形或轉染至宿主細胞中時表現該編碼序列。
根據一實施例，該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係包括SEQ ID NO：1或是一個與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之序列。根據一實施例，該啟動子序列之總長度不超過1.5、2、2.5、3或4kb。根據一實施例，該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係由SEQ ID NO：1或一個與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之2,065bp序列所組成。
根據一實施例其提供了一種包括有由玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、非GRMZM2G047720轉殖基因及SEQ ID NO：5之玉蜀黍GRMZM2G047720 3' UTR所組成的基因卡匣之核酸載體。於一實施例中，所述SEQ ID NO：5之玉蜀黍GRMZM2G047720 3' UTR係可操作地連接至該非GRMZM2G047720轉殖基因的3'端。於另一實施例中，所述3'非轉譯序列係包括SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少80、85、90、95、99或100%序列一致性的序列。根據一實施例其提供了一種核酸載體，該核酸載體包括有一個由SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之2,065bp序列所組成之基因卡匣、一個非GRMZM2G047720轉殖基因及一個玉蜀黍GRMZM2G047720 3' UTR，其中SEQ ID NO：1係可操作地連接至該非GRMZM2G047720轉殖基因的5'端，且SEQ ID NO：5的3' UTR係可操作地連接至該非GRMZM2G047720轉殖基因的3'端。於另一實施例中，所述3'非轉譯序列係包括SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少80、85、90、95、99或100%序列一致性的序列。於另一實 施例中，所述玉蜀黍GRMZM2G047720 3'非轉譯序列係由SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之1,023bp的序列所組成。
於一實施例中其提供了一種核酸構築體，該核酸構築體包括有啟動子及非GRMZM2G047720轉殖基因且選擇性地包括下列元件中之一或多種：a)一個5'非轉譯區域；b)一個內含子；及c)一個3'非轉譯區域，其中，該啟動子係由SEQ ID NO：1或一個與SEQ ID NO：1具有至少98%序列一致性之序列所組成；且該3'非轉譯區域係由SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性之序列所組成；且進一步地其中該啟動子係可操作地連接至該轉殖基因，且每一個可選擇的元件(當存在時)係亦可操作地連接至該啟動子及該轉殖基因二者。於另一實施例中其提供了一種包括有上文剛剛揭示的核酸構築體之基因轉殖細胞。於一實施例中該基因轉殖細胞為植物細胞，且於另一實施例中其提供了一種植物，其中該植物係包括所述基因轉殖細胞。
於一實施例中其提供了一種核酸構築體，該核酸構築體包括有啟動子及非GRMZM2G047720轉殖基因且選擇性地包括下列元件中之一或多種：a)一個5'非轉譯區域；及b)一個3'非轉譯區域，其中，該啟動子係由SEQ ID NO：1或一個與SEQ ID NO：1具有至少98%序列一致性之序列所組成；且 該3'非轉譯區域係由SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性之序列所組成；且進一步地其中該啟動子係可操作地連接至該轉殖基因，且每一個可選擇的元件(當存在時)係亦可操作地連接至該啟動子及該轉殖基因二者。於另一實施例中其提供了一種包括有上文剛剛揭示的核酸構築體之基因轉殖細胞。於一實施例中該基因轉殖細胞為植物細胞，且於另一實施例中其提供了一種植物，其中該植物係包括所述基因轉殖細胞。
於一實施例中其提供了一種核酸構築體，該核酸構築體包括有啟動子及多酶切點接頭且選擇性地包括下列元件中之一或多種：a)一個5'非轉譯區域；b)一個內含子；及c)一個3'非轉譯區域，其中，該啟動子係由SEQ ID NO：1或一個與SEQ ID NO：1具有至少98%序列一致性之序列所組成；且該3'非轉譯區域係由SEQ ID NO：5或一個與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性之序列所組成；且進一步地其中該啟動子係可操作地連接至該多酶切點接頭，且每一個可選擇的元件(當存在時)係亦可操作地連接至該啟動子及該多酶切點接頭二者。
根據一實施例該核酸構築體係進一步包括編碼選擇標誌物的序列。根據一實施例該重組基因卡匣係可操作地連接至農桿菌T-DNA邊界。根據一實施例該重組基因卡匣係進一步包括第一及第二T-DNA邊界，其中該第一T-DNA邊界係可操作地連接至該基因構築體的一端，而該第二T-DNA邊界係可操作地連接至該基因構築體的另一端。該第一及第二農桿菌T-DNA邊界可獨立地選自來源於選自由以下組成之群的細菌菌株的T-DNA邊界序列：合成胭 脂鹼之農桿菌T-DNA邊界、合成章魚鹼之農桿菌T-DNA邊界、合成甘露鹼之農桿菌T-DNA邊界、合成琥珀鹼之農桿菌T-邊界，或其任何組合。於一實施例中其提供了選自由胭脂鹼合成菌株、甘露鹼合成菌株、琥珀鹼合成菌株或章魚鹼合成菌株組成之群的農桿菌菌株，其中該菌株係包括質體，其中該質體包括一可操作地連接至選自SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之序列的序列之轉殖基因。
適用於本發明所揭示之構築體之所關注轉殖基因包含(但不限於)賦予(1)對害蟲或疾病之抗性；(2)對除草劑之耐受性；(3)增加價值之農藝性狀，諸如產率改良、氮利用效率、水分使用效率及營養品質；(4)蛋白質與DNA以位點特異性方式結合；(5)小RNA的表現；及(6)選擇標誌物之編碼序列。根據一實施例，該轉殖基因係編碼一選擇標誌物或一賦予殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、小RNA表現、氮利用效率、水分使用效率或營養品質之基因產物。
1.昆蟲抗性
各種昆蟲抗性編碼序列係可操作地連接至SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，啟動子係可為SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、包括有SEQ ID NO：1之啟動子、或一與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性的序列。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1及5’UTR之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或包括有一與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性的序列以及5’UTR之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。可操作地連接的序列可接著併入所選載體中以允許鑑別及篩選經轉形植物(「轉形體」)。例示性昆蟲抗性編碼序列在本技術領域中是已知的。以下性狀係供做為可操作地連接至本發明之調控元件的昆蟲抗性編碼序列實施例。提供了例示性的鱗翅目昆蟲抗性之編碼序列係包含：cry1A；cry1A.105；cry1Ab； cry1Ab(截短型)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(以Widestrike®進行銷售)；cry1C；cry1F(以Widestrike®進行銷售)；cry1Fa2；cry2Ab2；cry2Ae；cry9C；mocry1F；pinII(蛋白酶抑制蛋白)；vip3A(a)；及vip3Aa20。提供了例示性的鞘翅目昆蟲抗性之編碼序列係包含：cry34Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry35Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry3A；cry3Bb1；dvsnf7；及mcry3A。提供了例示性的多昆蟲抗性之編碼序列係包含ecry31.Ab。以上昆蟲抗性基因清單不意欲為限制性的。任何昆蟲抗性基因係皆為本發明所涵蓋。
2.除草劑耐受性
各種除草劑耐受性編碼序列係可操作地連接至包括有SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性的序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，啟動子係可為SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、包括有SEQ ID NO：1之啟動子、或一個與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性的序列。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1及5’ UTR之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或一個與可操作地連接至5’UTR序列之SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性的序列。可操作地連接的序列可接著併入所選載體中以允許鑑別及篩選經轉形植物(「轉形體」)。例示性除草劑耐受性編碼序列係為本領域中已知的。以下性狀係供做為可操作地連接至本發明之調控元件的除草劑耐受性編碼序列實施例。草甘膦除草劑含有藉由抑制EPSPS酶(5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶)之作用模式。此酶係涉及植物生長及發育必需的芳族胺基酸的生物合成。可用於抑制此酶之各種酶機制係為本領域中已知的。編碼這類酶之基因係可操作地連接至本發明之基因調控元件。於一實施例中，選擇標誌物基因包含(但不限於)編碼包含以下草甘膦抗性基因之基因：突變型EPSPS基因，諸如2mEPSPS基因、 cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；及草甘膦降解基因，諸如草甘膦乙醯轉移酶基因(gat)及草甘膦氧化酶基因(gox)。這些性狀目前係以Gly-TolTM、Optimum®、GAT®、Agrisure® GT及Roundup Ready®進行銷售。草銨膦及/或畢拉草(bialaphos)化合物之抗性基因包含dsm-2、bar及pat基因。bar及pat性狀目前係以LibertyLink®進行銷售。包含在內的還有提供對2,4-D之抗性的耐受性基因，諸如aad-1基因(應注意aad-1基因對於芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑係具有進一步的活性)及aad-12基因(應注意aad-12基因對於吡啶氧基乙酸酯合成植物生長素係具有進一步的活性)。這類性狀係以Enlist®作物保護技術進行銷售。ALS抑制劑(磺醯脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基硫代苯甲酸酯及磺醯基胺基-羰基-三唑啉酮)之抗性基因係為本領域中已知的。這些抗性基因最常由ALS編碼基因序列之點突變引起。其他ALS抑制劑抗性基因包含hra基因、csr1-2基因、Sr-HrA基因及surB基因。一些性狀係以商標Clearfield®進行銷售。抑制HPPD之除草劑包含吡唑啉酮，諸如苄草唑(pyrazoxyfen)、吡草酮(benzofenap)及苯吡唑草酮(topramezone)；三酮，諸如甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、環磺酮(tembotrione)、苯并雙環酮(benzobicyclon)；及二酮腈，諸如異噁唑草酮(isoxatlutole)。這些例示性HPPD除草劑係可被已知的性狀所忍受。HPPD抑制劑之實例包含hppdPF_W336基因(關於對異噁唑草酮之抗性)及avhppd-03基因(關於對甲基磺草酮之抗性)。苯腈除草劑耐受性狀之實例包含bxn基因，其已顯示出賦予對除草劑/抗生素溴苯腈(bromoxynil)之抗性。汰克草(dicamba)之抗性基因包含如國際PCT公開案第WO 2008/105890號中所揭示之汰克草單氧化酶基因(dmo)。PPO或PROTOX抑制劑類型的除草劑(例如，三氟羧草醚(acifluorfen)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟丙草酯(flupropazil)、環戊噁草酮(pentoxazone)、唑草酮(carfentrazone)、異丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚(pyraflufen)、苯草醚 (aclonifen)、草芬定(azafenidin)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac)、必芬諾(bifenox)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、乳氟禾草靈(lactofen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)及甲磺草胺(sulfentrazone))之抗性基因係為本領域中已知的。賦予對PPO之抗性的例示性基因包含野生型阿拉伯芥PPO酶之過度表現(Lermontova I與Grimm B,(2000)Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen.Plant Physiol 122：75-83.)、枯草桿菌PPO基因(B.subtilis)PPO基因(Li,X.and Nicholl D.2005.Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops.Pest Manag.Sci.61：277-285 and Choi KW,HanO,Lee HJ,Yun YC,Moon YH,Kim MK,Kuk YI,Han SU and Guh JO,(1998)Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide,oxyfluorfen,via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants.Biosci Biotechnol Biochem 62：558-560.)。吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮之抗性基因包含ACC酶抑制劑編碼基因(例如，Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸之抗性的例示性基因包含精吡氟氯禾靈(haloxyfop)、禾草靈(diclofop)、精噁唑禾草靈酸(fenoxyprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)及喹禾靈(quizalofop)。最後，可抑制光合作用之除草劑(包含三嗪或苯甲腈)係藉由psbA基因(對三嗪之耐受性)、1s+基因(對三嗪之耐受性)及腈水解酶基因(對苯甲腈之耐受性)而提供耐受性。上列除草劑耐受性基因清單並不意欲為限制性的。任何除草劑耐受性基因係皆為本發明所涵蓋。
3.農藝性狀
各種農藝性狀編碼序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，啟動子係可為該包括有SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的 玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1及5’ UTR之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或一可操作地連接至5’ UTR序列之與SEQ ID NO：1具有至少80、85、90、95或99%序列一致性之序列。所述可操作地連接之序列可接著併入所選載體中以允許鑑別及篩選經轉形的植物(「轉形體」)。例示性農藝性狀編碼序列係為本領域中已知的。以下性狀係供做為可操作地連接於本發明之調控元件的農藝性狀編碼序列的實施例。如由pg基因提供之延遲果實軟化係抑制了造成細胞壁中果膠分子斷裂之聚半乳糖醛酸酶的生成，且因此造成果實延遲軟化。再者，acc基因之延遲果實熟化/老化係用於抑制天然acc合成酶基因的正常表現，從而導致乙烯減少生成及果實熟化延遲。然而，accd基因使果實熟化激素乙烯之前驅物代謝，從而導致果實熟化延遲。或者，sam-k基因藉由減少生成乙烯之反應物S-腺苷甲硫胺酸(SAM)而造成熟化延遲。如由cspB基因提供之乾旱壓力耐受性表現型係藉由保留RNA穩定性及轉譯而在水壓力條件下維持正常的細胞功能。另一實例包含催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼產生的EcBetA基因。此外，RmBetA基因係催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼的產生。藉由與一或多種內源性轉錄因子相互作用以調控植物之日/夜生理過程的蛋白質之bbx32基因的表現來提供光合作用及產率的提高。可藉由編碼熱穩定α-澱粉酶之amy797E基因的表現來增加乙醇的生成，該酶係藉由增加降解澱粉時所用之澱粉酶的熱穩定性而提高生物乙醇的生成。最後，可藉由編碼二氫吡啶二羧酸酯合成酶之cordapA基因的表現來產生經修飾之胺基酸組合物，而該酶增加了胺基酸離胺酸的生成。上列農藝性狀編碼序列清單並不意欲為限制性的。任何農藝性狀編碼序列係皆為本發明所涵蓋。
4.DNA結合蛋白
各種DNA結合蛋白編碼序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，啟動子係可為該SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、包括有SEQ ID NO：1之啟動子、或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1以及5’ UTR序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或包括有一可操作地連接至5’ UTR序列之與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。可操作地連接之序列係可接著併入所選載體中以允許鑑別及篩選經轉形的植物(「轉形體」)。例示性DNA結合蛋白編碼序列係為本領域中已知的。做為可操作地連接於本發明之調控元件之DNA結合蛋白編碼序列的實施例，可包含以下類型的DNA結合蛋白：鋅指、Talens、CRISPRS及大範圍核酸酶。上列DNA結合蛋白編碼序列清單並不意欲為限制性的。任何DNA結合蛋白編碼序列係皆為本發明所涵蓋。
5.小RNA
各種小RNA係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720)啟動子。於一實施例中，啟動子係可為該SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、包括有SEQ ID NO：1之啟動子、或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1以及5’ UTR序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或包括有一可操作地連接至5’ UTR序列之與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。可操作地連接之序列係可接著併入所選載體中以 允許鑑別及篩選經轉形的植物(「轉形體」)。例示性小RNA性狀係為本領域中已知的。以下性狀係供做為可操作地連接至本發明之調控元件的小RNA編碼序列的實施例。例如，延遲果實熟化/老化之抗efe小RNA係經由編碼乙烯形成酶之ACO基因的沉默來抑制乙烯生成而延遲熟化。改變木質素生成之ccomt小RNA係藉由抑制內源性S-腺苷-L-甲硫胺酸：反式咖啡醯基CoA 3-O-甲基轉移酶(CCOMT基因)而減少愈創木基(G)木質素之含量。再者，野生種馬鈴薯(Solanum verrucosum)中之黑斑傷痕耐受性可藉由Ppo5小RNA觸發Ppo5轉錄體降解以阻斷黑斑傷痕出現而減少。包含在內的還有與含有西方玉米根蟲Snf7基因之240bp片段的dsRNA一起抑制西方玉米根蟲之dvsnf7小RNA。改質澱粉/碳水化合物係可由諸如pPhL小RNA(降解PhL轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)及pR1小RNA(降解R1轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)之小RNA而產生。此外，由觸發Asn1降解以削弱天冬醯胺形成及減少聚丙烯醯胺之asn1小RNA產生諸如丙烯醯胺減少之益處。最後，pgas ppo抑制小RNA之非褐變表現型抑制PPO，從而產生具有非褐變表現型的蘋果。上列小RNA清單並不意欲為限制性的。任何小RNA編碼序列係皆為本發明所涵蓋。
6.選擇標誌物
各種選擇標誌物(也被稱為報告基因)係可操作地連接至該包括有包含SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，啟動子係可為SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、包括有SEQ ID NO：1之啟動子、或一個與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性的序列。於一些實施例中，所述序列係可操作地連接至該包括有SEQ ID NO：1以及5’ UTR序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子，或包括有一可操作地連接 至5’UTR序列之與SEQ ID NO：1具有80、85、90、95或99%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。可操作地連接之序列係可接著併入所選載體中以允許鑑別及篩選經轉形的植物(「轉形體」)。有許多方法可供用於確認選擇標誌物在經轉形植物中的表現，包含(例如)DNA定序及PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方墨點法、RNA墨點法、用於偵測由載體表現之蛋白質的免疫方法。但是，報告基因通常係經由目視觀察在表現時會產生有色產物之蛋白質來進行觀察。例示性報告基因在本領域中是已知的，其係編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP、Phi-YFP)、紅色螢光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶及其類似物(參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其內容係以全文引用的方式併入本文中)。
選擇標誌物基因係利用來篩選經轉形的細胞或組織。選擇標誌物基因包含編碼抗生素抗性之基因，諸如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)、大觀黴素/鏈黴素抗性(AAD)及潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HGR)之基因以及賦予對除草化合物之抗性的基因。除草劑抗性基因一般係編碼對除草劑不敏感的經修飾目標蛋白或在除草劑可起作用之前使其在植物中降解或脫毒之酶。例如，已經藉由使用編碼突變型目標酶5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)之基因而獲得對於草甘膦的抗性。EPSPS之基因及突變體為眾所周知的吾人所熟知，並進一步描述於下文中。已經藉由使用編碼PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12(其每一者係為使其各自的除草劑脫毒之蛋白質的實例)之細菌基因而獲得對於草銨膦、溴苯腈及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)之抗性。
於一實施例中，除草劑可抑制生長點或分生組織，包含咪唑啉酮或磺醯脲，且這些除草劑之乙醯羥基酸合成酶(AHAS)及乙醯乳酸合成酶(ALS)的抗性/耐受性基因是眾所周知的。草甘膦抗性基因分別包含突變的5-烯醇丙 酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)及dgt-28基因(經由導入重組核酸及/或天然EPSPs基因之各種形式的體內突變誘發)、aroA基因及草甘膦乙醯基轉移酶(GAT)基因。其他膦醯基化合物之抗性基因包含來自於鏈黴菌屬(包含吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)及綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridichromogenes))之bar及pat基因，及吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸(包含精吡氟氯禾靈、禾草靈、精噁唑禾草靈酸、吡氟禾草靈、喹禾靈)之抗性的例示性基因包含乙醯輔酶A羧化酶(ACC酶)之基因；Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3。於一實施例中，除草劑可抑制光合作用，包含三嗪(psbA及1s+基因)或苯甲腈(腈水解酶基因)。再者，這類選擇標誌物可包含陽性選擇標誌物(諸如磷酸甘露糖異構酶(PMI))。
於一實施例中，選擇標誌物基因包含(但不限於)編碼以下之基因：2,4-D；新黴素磷酸轉移酶II；氰胺水合酶；天冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶；色胺酸脫羧酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶及脫敏的天冬胺酸激酶；bar基因；色胺酸脫羧酶；新黴素磷酸轉移酶(NEO)；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)；二氫葉酸還原酶(DHFR)；草丁膦乙醯轉移酶；2,2-二氯丙酸去鹵酶；乙醯羥基酸合成酶；5-烯醇丙酮醯莽草酸-磷酸合成酶(aroA)；鹵芳基腈水解酶；乙醯輔酶A羧化酶；二氫葉酸合成酶(sul I)；及32kD的光反應系統II多肽(psbA)。實施例還包含了編碼對以下各物之抗性的選擇標誌物基因：氯黴素；甲胺喋呤；潮黴素；大觀黴素；溴苯腈；草甘膦；及草丁膦。上列選擇標誌物基因清單並不意欲為限制性的。任何的報告基因或選擇標誌物基因係皆為本發明所涵蓋。
於一些實施例中所述編碼序列係經合成以便在植物中有最佳的表現。例如，於一實施例中，基因之編碼序列係已藉由密碼子最佳化而經修飾， 以增強在植物中的表現。殺蟲劑抗性轉殖基因、除草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水分使用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、DNA結合轉殖基因或選擇標誌物轉殖基因係可經最佳化以在特定植物品種中表現，或替代性地可經修飾以便在雙子葉或單子葉植物中有最佳的表現。植物偏好的密碼子係可從所關注的特定植物品種中有最大表現量的蛋白質中所出現頻率最高的密碼子來判定。於一實施例中，編碼序列、基因或轉殖基因係經設計在植物中以更高的程度來表現，從而產生更高的轉形效率。對於植物基因最佳化的方法是眾所周知的。關於合成DNA序列之最佳化及生成的指導係可見於(例如)專利案WO2013016546、WO2011146524、WO1997013402、美國專利第6166302號及美國專利第5380831號，其係以引用方式併入本文中。
轉形
適用於轉形植物的方法包含任何可將DNA導入到細胞內的方法，例如(但不限於)：電穿孔(參見，(例如)美國專利第5,384,253號)；微彈轟擊(參見，(例如)美國專利第5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861及6,403,865號)；農桿菌介導的轉形(參見，(例如)美國專利第5,635,055、5,824,877、5,591,616；5,981,840及6,384,301號)；及原生質體轉形(參見，(例如)美國專利第5,508,184號)。
DNA構築體可使用諸如與碳化矽纖維一起攪拌之技術而直接導入到植物細胞之基因組DNA中(參見，(例如)美國專利第5,302,523及5,464,765號)，或者DNA構築體可使用諸如DNA粒子轟擊之基因槍方法而直接導入到植物組織(參見，(例如)Klein等人(1987)Nature 327：70-73)。或者，DNA構築體可經由奈米粒子轉形而導入至植物細胞中(參見，(例如)美國專利公開案第20090104700號，其係以全文引用方式併入本文中)。
另外，基因轉移可使用非農桿菌細菌或病毒來達成，諸如根瘤菌 (Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、馬鈴薯病毒X、花椰菜嵌紋病毒及木薯脈花葉病毒及/或菸草嵌紋病毒，參見(例如)Chung等人(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。
通過轉形技術的應用，幾乎任何植物品種的細胞都可被穩定地轉形，且這些細胞可藉由熟知的技術發育成基因轉殖植物。例如，特別有用於棉花轉形的情形之技術係描述於美國專利第5,846,797、5,159,135、5,004,863及6,624,344中；特別用於轉形芸苔屬植物之技術係描述於(例如)美國專利第5,750,871號中；用於轉形大豆之技術係描述於(例如)美國專利第6,384,301號中；而用於轉形玉米之技術係描述於(例如)美國專利第7,060,876及5,591,616號以及國際PCT公開案第WO 95/06722號中。
在將外源性核酸遞送到受體細胞之後，通常要鑑定出經轉形的細胞以用於進一步的培養與植物再生。為了提高鑑別轉形體之能力，可能期望採用一個選擇標誌物基因與用於產生該轉形體之轉形載體。於一說明性實施例中，經轉形的細胞群體可藉由使細胞暴露於一或多種選擇藥劑而進行測定，或可針對所期望標誌物基因性狀篩選出細胞。
對於在暴露於選擇藥劑時存活的細胞，或者在篩選測定被評定為陽性的細胞，係可在能支持植物再生的培養基中進行培養。於一實施例中，可藉由包含諸如生長調控節劑之其他物質來改良任何適合的植物組織培養基。可將組織維持在具有生長調節劑的基礎培養基上，直到可獲得足夠的組織用於開始植物再生的工作，或者經過重複多輪的人工選擇，直到組織的形態適合於再生為止(例如，至少2週)，接著轉移到有助於芽形成的培養基中。定期地轉移培養物，直到已出現足夠的芽形成為止。一旦形成芽，將其轉移至有利於根形成的培養基。一旦足夠根形成，便將植物轉移到土壤以便進一步生長及成熟。
分子確認
經轉形的植物細胞、癒合組織、組織或植物係可藉由針對所述經工程改造之植物材料進行選擇或篩選由轉形DNA上存在的標誌物基因所編碼之性狀來鑑別及分離。例如，可藉由在含有抑制量之抗生素或除草劑(該轉形基因構築體賦予了對該抗生素或除草劑之抗性)的培養基上培植所述經工程改造之植物材料來進行選擇。另外，亦可藉由篩選所述重組核酸構築體上可能存在之任何可見的標誌物基因(例如，β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或gfp基因)之活性來鑑別經轉形的植物及植物細胞。這類選擇及篩選方法為本領域中熟習該項技術者所熟知的。可用以鑑別基因轉殖植物之分子確認方法為熟習該項技術者已知的。下文進一步描述數個例示性方法。
已發現到供使用於序列偵測之分子信標。簡言之，設計一個FRET寡核苷酸探針以與側接基因組及插入DNA接合點重疊。FRET探針之獨特結構使其含有保持螢光部分及淬滅部分緊密接近之二級結構。FRET探針及PCR引子(該插入DNA序列中的一個引子以及該側接基因組序列中的一個引子)係於熱穩定聚合酶及dNTP的存在下進行循環。在成功PCR擴增cycled之後，FRET探針與目標序列之雜交係導致探針二級結構被移除以及該螢光部分與淬滅部分之空間分離。螢光信號指示出因成功擴增與雜交而存在的側接基因組/轉殖基因插入序列。這類用於以擴增反應形式偵測之分子信標測定係為本發明之一實施例。
水解探針測定(或稱為TAQMAN®(Life Technologies,Foster City,Calif.))為一種偵測及定量DNA序列之存在的方法。簡言之，FRET寡核苷酸探針係設計為具有該轉殖基因內的一個寡核苷酸以及用於事件特異性偵測之側接基因組序列中的一個寡核苷酸。該FRET探針及PCR引子(該插入DNA序列中的一個引子及該側接基因組序列中的一個引子)係於熱穩定聚合 酶及dNTP的存在下進行循環。FRET探針的雜交導致了FRET探針上之螢光部分裂解及釋放而離開淬滅部分。螢光信號指示出因成功擴增及雜交而存在的側接/轉殖基因插入序列。這類用於以擴增反應形式偵測之水解探針測定係為本發明之一實施例。
KASPar®測定係為一種偵測及定量DNA序列之存在的方法。簡言之，包括有經整合之基因表現卡匣聚核苷酸的基因組DNA樣本係使用稱為KASPar®測定系統之基於聚合酶鏈鎖反應(PCR)的測定法來進行篩選。使用於實施本發明之KASPar®測定係可利用一個含有多個引子之KASPar® PCR測定混合物。使用於該PCR測定混合物中的引子可包括至少一正向引子及至少一反向引子。該正向引子係含有對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域之序列，而該反向引子係含有對應於該基因組序列的一個特定區域之序列。另外，使用於PCR測定混合物之引子係可包括至少一正向引子及至少一反向引子。例如，該KASPar® PCR測定混合物係可使用兩個對應於兩個不同對偶基因之正向引子以及一個反向引子。該等正向引子中之一者係含有一個對應於該內源性基因組序列之特定區域的序列。第二個正向引子係含有一個對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域的序列。該反向引子係含有對應於該基因組序列的一個特定區域的序列。這類用於以擴增反應形式偵測之KASPar®測定係為本發明之一實施例。
於一些實施例中，螢光訊號或螢光染料係選自由以下組成之群：HEX螢光染料、FAM螢光染料、JOE螢光染料、TET螢光染料、Cy 3螢光染料、Cy 3.5螢光染料、Cy 5螢光染料、Cy 5.5螢光染料、Cy 7螢光染料及ROX螢光染料。
於其它實施例中，擴增反應係使用適合的第二螢光DNA染料進行，所述染料係能夠以可被流式細胞儀偵測之濃度範圍對細胞的DNA染色， 且具有可被即時熱循環儀偵測之螢光發射光譜。本領域中具有通常知識者應瞭解到其他核酸染料是已知的且不斷被鑑別出來。可採用具有適當激發及發射光譜之任何適宜核酸染料，諸如YO-PRO-1®,SYTOX Green®,SYBR Green I®,SYTO11®,SYTO12®,SYTO13®,BOBO®,YOYO®及TOTO®。於一實施例中，第二螢光DNA染料係為以小於10μM、小於4μM或小於2.7μM來使用的SYTO13®。
於另外的實施例中，可使用次世代測序(NGS)技術進行偵測。如由Brautigma等人於2010年所描述，DNA序列分析係可用以測定經分離及擴增的片段之核苷酸序列。經擴增的片段係可經分離及再選殖到載體中，並使用鏈終止物方法(亦稱為桑格定序(Sanger sequencing))或染料終止物定序來定序。另外，擴增物係可用次世代測序技術來定序。NGS技術不需要再選殖步驟，且可在單一反應中完成多個測序讀序。有三個NGS平台在市場上可以購得，即來自454 Life Sciences/Roche之Genome Sequencer FLXTM、來自Solexa之Illumina Genome AnalyserTM及Applied Biosystems的SOLiDTM(「Sequencing by Oligo Ligation and Detection(以寡核苷酸連接與偵測方式測序)」的縮寫)。另外，有兩種目前正在開發的單分子測序方法。這些方法包含來自Helicos BioscienceTM的true Single Molecule Sequencing(tSMS，真正單一分子測序)及來自Pacific Biosciences的Single Molecule Real TimeTM sequencing(SMRT，單一分子即時DNA測序)。
由454 Life Sciences/Roche進行銷售的Genome Sequencher FLXTM係為一種長讀序NGS，其使用乳化PCR及焦磷酸定序以產生測序讀序片段。可使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kb片段的基因庫。對於250至400百萬鹼基之總產量而言，該等反應每次運行可產生超過一百萬個約250至400個鹼基的讀序片段。此技術產生最長的讀序片段，但每次運行的總序 列輸出與其他NGS技術相比是較低的。
由SolexaTM進行銷售的Illumina Genome AnalyserTM係為一種短讀序NGS，其測序係基於固相橋式PCR，藉由使用以螢光染料標記之可逆性終止核苷酸的合成方法來進行。可使用含有長達10kb之DNA片段的雙端測序基因庫構建體。該等反應產生超過一億個長度為35-76個鹼基之短讀序片段。此數據每次運行可產生3-6千億鹼基。
由Applied BiosystemsTM進行銷售的Sequencing dy Oligo Ligation and Detection(SOLiD)系統係為一種短讀序技術。此NGS技術使用了長度達10kb之片斷化雙股DNA。該系統係藉由接合經染料標記之寡核苷酸引子以及乳化PCR產生十億個短讀序片段來進行測序，每次運行產生多達300億鹼基之總序列輸出。
Helicos BioscienceTM的tSMS及Pacific BiosciencesTM之SMRT係應用不同的方式，使用單個DNA分子進行序列反應。tSMS HelicosTM系統每次運行產生多達8億個短讀序片段而得到210億鹼基。這些反應係使用經螢光染料標記的虛擬終止核苷酸來完成，其被稱為「以合成方式測序」之方法。
由Pacific BiosciencesTM進行銷售的SMRT次世代測序系統係以合成方式進行即時測序。此技術由於不受可逆式終止物的限制，而可產生多達1,000bp長之讀序片段。使用此技術每天可產生相當於二倍體人類基因組之一倍覆蓋度的原始讀取通量。
於另一實施例中，可使用墨點測定法分析完成偵測，包含西方墨點法、北方墨點法及南方墨點法。這類墨點測定法為生物學研究中用於生物樣本之鑑別及定量的常用技術。這些測定包含首先藉由電泳在凝膠中分離樣本組分，接著將來自凝膠之電泳分離組分轉移到由諸如硝化纖維素、聚偏二氟乙烯或耐綸之材料所製成的轉移膜上。分析物亦可直接點樣在這些負載物 上或者以施加真空、毛細作用或壓力引導至負載物上的特定區域，而無需事先分離。接著通常將轉移膜進行轉移後處理，以增強分析物在視覺上或藉由自動化讀取器與彼此區分及偵測之能力。
於另一實施例中，可使用ELISA測定法完成偵測，ELISA測定法係使用固相酵素免疫分析來偵測液體樣本或濕潤樣本中之物質(通常為抗原)的存在。來自於樣本的抗原係附著至一平盤表面。接著，將另一特異性抗體施用在該表面上以使其可與抗原結合。此抗體係與一種酵素連接，並且在最終步驟中，添加一種含有該酵素的受質之物質。後續反應產生出可偵測的信號，最常為該受質中的顏色變化。
基因轉殖植物
於一實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括所述具有一選自SEQ ID NO：1之序列或與一選自SEQ ID NO：1的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於另一實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括所述包括有一選自SEQ ID NO：5的序列或與一選自SEQ ID NO：5的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列的玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。於另一實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括可操作地連接至5’ UTR之選自SEQ ID NO：1的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括一包括有選自SEQ ID NO：1的序列，或可操作地連接至非GRMZM2G047720轉殖基因之與選自SEQ ID NO：1的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列的基因表現卡匣。於一說明性實施例中，植物、植物組織或植物細胞係包括一包括有可操作地連接至轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動 子的基因表現卡匣，其中該轉殖基因可為殺蟲劑抗性轉殖基因、除草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水分使用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、DNA結合轉殖基因、選擇標誌物轉殖基因或其組合。
根據一實施例其提供了植物、植物組織或植物細胞，其中該植物、植物組織或植物細胞係包括一可操作地連接至轉殖基因之源於非內源性GRMZM2G047720基因之啟動子序列，其中該源於玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之啟動子序列係包括SEQ ID NO：1序列或與SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列。於一實施例中其提供了植物、植物組織或植物細胞，其中該植物、植物組織或植物細胞係包括可操作地連接至非GRMZM2G047720轉殖基因之SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列。於一實施例中該植物、植物組織或植物細胞係為雙子葉或單子葉植物，或為源自雙子葉或單子葉植物之細胞或組織。於一實施例中該植物係選自由以下組成之群：玉米、小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵及芥花。於一實施例中所述植物為大豆。根據一實施例該植物、植物組織或植物細胞係包括可操作地連接至非GRMZM2G047720轉殖基因之SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列。於一實施例中該植物、植物組織或植物細胞係包括一可操作地連接至轉殖基因之啟動子，其中該啟動子係由SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列所組成。根據一實施例該包括有可操作地連接至轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子序列的基因構築體係併入該植物、植物組織或植物細胞的基因組中。
於一實施例中其提供了可操作地連接至轉殖基因之包括有SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1具有80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的 序列之非玉蜀黍c.v.B73植物、植物組織或植物細胞。根據一實施例該非玉蜀黍c.v.B73植物、植物組織或植物細胞係為雙子葉或單子葉植物，或源自雙子葉或單子葉植物之植物細胞或組織。於一實施例中該植物係選自由以下組成之群：玉米、小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵及芥花。於一實施例中所述植物為大豆。根據一實施例該可操作地連接至轉殖基因之啟動子序列係併入該植物、植物組織或植物細胞之基因組中。
於一實施例中其提供了一種非玉蜀黍c.v.B73植物、植物組織或植物細胞，其包括SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列，所述序列係可操作地連接至一轉殖基因的5'端及一個3'非轉譯序列，所述3'非轉譯序列係包括SEQ ID NO：5或一與SEQ ID NO：5具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列，其中該3'非轉譯序列係可操作地連接至該轉殖基因。於另一實施例中其提供了一種非玉蜀黍c.v.B73植物、植物組織或植物細胞，其包括SEQ ID NO：1或一與SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性之序列，所述序列係可操作地連接至一個5'非轉譯序列的3'端，其中該5'非轉譯序列係可操作地連接至該轉殖基因。根據一實施例該非玉蜀黍c.v.B73植物、植物組織或植物細胞為雙子葉或單子葉植物，或為源自雙子葉或單子葉植物之植物組織或細胞。於一實施例中該植物係選自由以下組成之群：玉米、小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵及芥花。於一實施例中該植物為大豆。根據一實施例該可操作地連接至轉殖基因之啟動子序列係併入該植物、植物組織或植物細胞之基因組中。
於一實施例中，根據本文所揭示之方法的植物、植物組織或植物細胞係可為單子葉植物。該單子葉植物、植物組織或植物細胞係可為(但不限於)玉米、水稻、小麥、甘蔗、大麥、黑麥、高粱、蘭花、竹子、香蕉、 香蒲、百合、燕麥、洋蔥、粟、柳枝稷、草皮草及黑小麥。
於一實施例中，根據本文所揭示之方法的植物、植物組織或植物細胞係可為雙子葉植物。該雙子葉植物、植物組織或植物細胞可為(但不限於)苜蓿、菜籽、芥花、印度芥菜、埃塞俄比亞芥菜、大豆、向日葵、棉花、菜豆、椰菜、甘藍菜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣；甜瓜、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜、蘿蔔、菠菜、甜菜、向日葵、菸草、番茄及西瓜。
熟習該項技術者應認識到，在外源性序列穩定併入於基因轉殖植物中且確認可運作之後，其可藉由有性雜交而導入至其他植物中。可使用多種標準育種技術中之任一者，視待雜交之品種而定。
本發明亦涵蓋了上述之基因轉殖植物的種子，其中該種子係具有轉殖基因或含有本發明之基因調控元件的基因構築體。本發明進一步涵蓋了上述之基因轉殖植物的子代、純系、細胞株或細胞，其中該子代、純系、細胞株或細胞係具有所述轉殖基因或含有本發明之基因調控元件的基因構築體。
本發明亦涵蓋了上述之基因轉殖植物的栽培物，其中該基因轉殖植物係具有所述轉殖基因或含有本發明之基因調控元件的基因構築體。因此，這類基因轉殖植物可藉由用根據本發明之核酸分子轉形進行工程改造為尤其具有一或多種所期望性狀或含有本發明之基因調控元件的基因轉殖事件，且可藉由熟習該項技術者已知的任何方法種植或栽培。
表現轉殖基因之方法
於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因或多酶切點接頭序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的植物。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因或多酶切點接頭序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與5’ UTR的植物。於一實施例 中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因或多酶切點接頭序列之玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的植物。於一實施例中該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係由一選自SEQ ID NO：1的序列或一與選自SEQ ID NO：1之序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列所組成。於另一實施例中該玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR係由一選自SEQ ID NO：5的序列或一與選自SEQ ID NO：5之序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列所組成。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的植物。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與5’ UTR的植物。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的植物組織或植物細胞。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的植物組織或植物細胞。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與5’ UTR的植物組織或植物細胞。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR的植物組織或植物細胞。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有可操作 地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與5’ UTR的植物組織或植物細胞。
於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植一包括有基因表現卡匣的植物，該基因表現卡匣包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中該玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係由一選自SEQ ID NO：1的序列或一與選自SEQ ID NO：1之序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列所組成。於另一實施例中該玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR係由一選自SEQ ID NO：5的序列或一與選自SEQ ID NO：5之序列具有至少80%、85%、90%、95%或99.5%序列一致性的序列所組成。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植一包括有基因表現卡匣的植物，該基因表現卡匣包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植一包括有基因表現卡匣的植物，該基因表現卡匣包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與5’ UTR。於一實施例中，在植物中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培植一包括有基因表現卡匣的植物，該基因表現卡匣包括有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有基因表現卡匣的植物組織或植物細胞，該基因表現卡匣含有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有基因表現卡匣的植物組織或植物細胞，該基因表現卡匣含有可操作地連接於至少一個轉殖基因之玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR。於一實施例中，在植物組織或 植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有基因表現卡匣的植物組織或植物細胞，該基因表現卡匣含有可操作地連接於至少一個轉殖基因的5’ UTR。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有基因表現卡匣、玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR之植物組織或植物細胞。於一實施例中，在植物組織或植物細胞中表現至少一個轉殖基因之方法係包括培養一包括有基因表現卡匣、玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子、及5’ UTR之植物組織或植物細胞。
以下實例係供以說明某些特定特徵及/或實施例。該等實例不應被解釋為用來將本發明限制於所例示的具體特徵或實施例。
實例 實例1：新穎啟動子與其它調控元件的分離
新穎玉蜀黍GRMZM2G047720基因調控元件係經由分析公開發表的玉米種子的基因轉錄體而鑑別。這些調控元件係經過鑑別、分離及選殖而表徵該等調控元件的表現概貌，以在基因轉殖植物中使用。穩定地以分離自蘇雲金芽孢桿菌之cry3Ab1基因以及源自鞘脂菌屬herbicidovorans種(Sphingobium herbicidovorans)之aad-1選擇標誌物所轉形之基因轉殖玉米植株係經產生，並評定其轉殖基因表現程度與組織特異性。由此可鑑別出玉蜀黍GRMZM2G047720基因調控元件並表徵其特性。本發明公開了供使用於基因表現構築體之啟動子與3’ UTR調控元件。
三種來源的數據來源被考慮用來優先處理在玉米幼苗的芽與根中有高表現量的玉米基因：1)截至2010年此研究進行時於公開的玉米資料庫中之35,000個玉米基因序列及其注釋；2)V4芽與根之全玉米基因轉錄體的基因表現資料(Wang等人，[2009],The Plant Cell；21：1053-1069)；及3)9,000 個基因的全長cDNA序列(Alexandrov,N.等人，[2009]Plant Molecular Biology；69：179-194)。在此研究中，基因表現資料係皆與9,000個基因的全長cDNA序列以及35,000個玉米基因進行比對。基於每百萬個定位片段中定位到外顯子之每一千個鹼基中的片段數(FPKM)數值(此為基因表現的一種定量量度)，對每個玉米芽與根組織中表現量最高的500個基因進行鑑別。
由於轉殖基因的表現需要在玉米植物的整個生命周期中表現轉殖基因，總mRNA係從三個不同的葉子階段(V4、V12及R3)、兩個不同的根部發育階段(V4及V12)及一個花粉階段(R1)中分離出，以供轉殖基因的表現分析。玉蜀黍c.v.B73玉米基因型係使用於全部的分析之中。於500個優先處理的基因中，約150個表現量最高的基因係進行定量PCR供確認基因的表現。該等結果鑑別出一結果子集，做為葉子及根部偏好表現之表現量最高的基因。
來自玉蜀黍GRMZM2G047720基因調控元件(SEQ ID NO：1)之啟動子係為一個從玉蜀黍基因組DNA(gDNA)序列鑑別出之2,065bp的聚核苷酸序列。根據橫跨數百萬個鹼基對之鄰接染色體序列的評定，一個2,065bp的聚核苷酸序列係經鑑別及分離出，以用於異源編碼序列之表現。此新穎聚核苷酸序列係經分析其做為驅動基因表現之調控序列的用途。如以下序列(SEQ ID NO：2)中所示，SEQ ID NO：1之2,065bp玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係供作為鹼基對1-2,065。天然的基因編碼序列SEQ ID NO：4係供作為SEQ ID NO：2之鹼基對2,066-3,027(ATG起始密碼子及TAA終止密碼子係以大寫字母顯示)。SEQ ID NO：5之1,023bp玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR係供作為SEQ ID NO：2之鹼基對3,028-4,050。
(SEQ ID NO：2)
實例2：載體構築體
以下載體係經構建以併入轉殖基因上游的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子。載體構築體pDAB108739含有一個基因表現卡匣，其中該cry34ab1轉殖基因(來自蘇雲金芽孢桿菌的報告基因)係受SEQ ID NO：1之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子驅動，且側接SEQ ID NO：5之玉蜀黍GRMZM2G047720之3’ UTR。此基因表現卡匣的圖式係顯示於圖1中並供作為SEQ ID NO：3。該載體亦含有一個選擇標誌物基因表現卡匣，該表現卡匣含有受玉蜀黍泛素1啟動子驅動(Christensen等人，(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)並被玉蜀黍脂肪酶3’-UTR終止(美國專利第7,179,902號)之aad-1轉殖基因(美國專利第7,838,733號)。此基因表現卡匣的圖式係顯示於圖1中並供作為SEQ ID NO：15。
此構築體係憑藉合成由外部提供商(Geneart via Life Technologies,Carlsbad,CA)新設計的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子及玉蜀黍GRMZM2G047720 3’ UTR，並使用GeneArt®無縫選殖與組裝試劑組(Life technologies)及限制酶將該啟動子選殖至GatewayTM(Life Technologies)供體載體中來構建。所得供體載體係使用GatewayTM選殖系統(Life Technologies)併 入最終的二元目標載體中。其獲得到pDAB108739殖株並經由限制酶分解及定序來確認。所得構築體含有可穩固地驅動一個可操作地連接至啟動子的3'端之轉殖基因表現的啟動子。
對照組構築體pDAB101556係經組配為含有Phi-yfp報告轉殖基因(Shagin等人，2004,Mol Biol Evol 21；841-50)，代替該cry34Ab1基因。cry34Ab1轉殖基因係受玉蜀黍泛素-1啟動子(Christensen等人，(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)及玉蜀黍過氧化酶5 3’UTR調控元件的驅動。此對照組構築體含有如在pDAB108739中存在的aad-1表現卡匣。此對照組構築體係使用與用於pDAB108739之相同試劑與實驗方案而轉形到植物中。
實例3：玉米轉形 根癌農桿菌的轉形：
將二元表現載體轉形至根癌農桿菌菌株DAi13192(RecA缺陷型三元菌株)(國際專利公開案第WO2012016222號)中。選擇細菌菌落，且二元質體DNA係經分離並經由限制酶分解來確認。
農桿菌培養的開始：
將農桿菌培養物自甘油儲液劃線接種到AB基本培養基(Gelvin,S.,2006,Agrobacterium Virulence Gene Induction,in Wang,K.編，Agrobacterium Protocols第二版第1卷，Humana Press,第79頁；在不含蔗糖下以5g/L的葡萄糖及15g/L的BactoTM瓊脂製造)上並在20℃下於暗處培養3天。接著將農桿菌屬培養物劃線接種於YEP培養基平盤(Gelvin,S.,2006,Agrobacterium Virulence Gene Induction,in Wang,K.編，Agrobacterium Protocols第二版第1卷，Humana Press,第79頁)上並在20℃下於暗處培養1天。
在實驗當天，製備體積適於實驗規模之接種培養基(2.2g/L MS鹽、68.4g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、115mg/L L-脯胺酸、2mg/L甘胺酸、100mg/L肌醇、0.05mg/L菸鹼酸、0.5mg/L吡哆醇HCl、0.5mg/L硫胺HCl)與乙醯丁香酮的混合物。添加乙醯丁香酮於100%二甲亞碸中之1M儲備溶液至接種培養基中，以得到200μM的最終乙醯丁香酮濃度。
對於各構築體，將來自YEP平盤之1-2個接種環的農桿菌懸浮於無菌拋棄式50ml離心管內之15ml接種培養基/乙醯丁香酮混合物中，且在分光光度計中測量該溶液於600nm之光密度(O.D.600)。接著以額外的接種培養基/乙醯丁香酮混合物將懸浮液稀釋至0.25-0.35 O.D.600。接著將該管農桿菌懸浮液水平地放置於設定在約75rpm的平台搖動器上，在室溫下歷時1至4小時後使用。
玉米轉形：
經由農桿菌介導的未成熟胚芽轉形而將實驗構築體轉形至玉米中，該未成熟胚芽係分離自近親品系玉蜀黍c.v.B104。所用方法係與Ishida等人，(1996)Nature Biotechnol 14：745-750及Frame等人，(2006)Plant Cell Rep 25：1024-1034中公開的方法相似，但有一些修改及改良以使得該方法能適用於高通量轉形。用以在玉米中產生大量基因轉殖事件的方法實例係於美國專利申請公開案第US 2013/0157369 A1號中給出，其以胚芽感染及共培養步驟開始。
推定的T0轉殖基因小植株係自PhytatraysTM(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)移植到填充有生長培養基(Premix BX；Premier Tech Horticulture)之3.5”小塑膠盆(T.O.Plastics；Clearwater,MN)中，並以保濕頂(Arco Plastics Ltd.)覆蓋，接著在生長室(28℃日/24℃夜、16小時光照期、50-70% RH、200μEm-2 sec-1光強度)中進行健化。當植物達到V3-V4發育階段(可見到3-4個葉枕)時，將其移植到Sunshine Custom Blend 160TM土壤混合物中並在溫室(光暴露型：光合或同化；強光限制：1200 PAR；16小時晝長；27℃日/24℃夜)中生長至開花。藉由qPCR分析，使用設計用來偵測轉殖基因相對複本數之引子來分析植物之轉殖基因複本數，且選來推進下一步之推定單一複本事件被移植到5加侖的盆子內。
實例4：基因複本數與蛋白質表現之分子確認 轉殖基因的存在與複本數的評估：
玉米植物係於V2-3葉子階段進行採樣，並使用cry34Ab1與aad-1之定量PCR測定法來篩選轉殖基因的存在以及其複本數。總DNA係使用來自QiagenTM之MagAttract DNA extraction kitTM(萃取試劑組)並按照製造商的使用說明來進行萃取。
接著以TaqMan®引子/探針組來擴增DNA片段，該引子/探針組含有針對cry34Ab1基因的FAM-標記螢光探針以及針對內源性轉化酶參考基因的HEX-標記螢光探針。下列引子係使用於cry34Ab1及轉化酶基因的擴增。
Cry34Ab1引子/探針：
SEQ ID NO：6(TQ.8v6.1.F)：GCCATACCCTCCAGTTG
SEQ ID NO：7(TQ.8v6.1.R)：GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG
探針：SEQ ID NO：8(TQ.8v6.1.MGB.P)：5’-/FAM/CCGAATCCAACGGCTTCA/MGB/-3’
轉化酶引子：
SEQ ID NO：9(轉化酶F)：TGGCGGACGACGACTTGT
SEQ ID NO：10(轉化酶R)：AAAGTTTGGAGGCTGCCGT
SEQ ID NO：11(轉化酶探針)：5’-/HEX/CGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT/3BHQ_1/-3’
PCR反應係於最終體積為10μl的反應液中進行，該反應液含有：5μl的Roche LightCycler 480 Probes Master MixTM(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN；Catalog 04887301001)；TQ.8v6.1.F、TQ.8v6.1.R、InvertaseF與InvertaseR引子各0.4μl，其係取自10μM儲液而達到400nM的最終濃度；探針TQ.8v6.1.MGB.P與InvertaseProbe各0.4μl，其係取自5μM儲液而達到200nM的最終濃度；0.1μl的10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)而達0.1%的最終濃度；2μl之10ng/μl基因組DNA；以及0.5μl的水。DNA係在Roche LightCycler 480 SystemTM中以下列條件下進行擴增：1個循環的95℃ 10分鐘；下列3個步驟運行40個循環：95℃ 10秒鐘、58℃ 35秒鐘及72℃ 1秒鐘；以及4℃ 10秒鐘的最終循環。藉由將未知樣本之目標/參考值(由LightCycler 480輸出)與cry34Ab1複本數對照組之目標/參考值進行比較，來判定出cry34Ab1的複本數。
Aad-1基因的偵測係如上述針對cry34Ab1基因的方式，使用轉化 酶內源性參考基因來進行。Aad-1引子序列如下；PCR循環數維持相同：
SEQ ID NO：12(AAD1正向引子)：TGTTCGGTTCCCTCTACCAA
SEQ ID NO：13(AAD1反向引子)：CAACATCCATCACCTTGACTGA
SEQ ID NO：14(AAD1探針)：
5’FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB/BHQ3’
針對轉殖基因的表現之T0植物篩選
含有cry34Ab1與aad-1轉殖基因並生長在溫室內的T0植物係於V4-5發育階段進行採樣，以用於葉子的ELISA測定。採樣4個沖孔塊。用於ELISA測定的蛋白質萃取物係藉由將一個1/8”不銹鋼鋼珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA,USA)加入到每個含有葉子沖孔塊與300μl的萃取緩衝液(補充有0.05% Tween 20與0.5% BSA之1X PBST[Fischer Scientific,St.Louis,MO])之1.2ml的管子中來進行製備。該等樣本係於GenogrinderTM(SPEX SamplePrep,Metuchen,NJ)中以1,500rpm離心處理4分鐘。該等樣本並於Sorvall Legend XFRTM離心機中以4,000rpm離心2分鐘。於此步驟後，將額外的300μl萃取緩衝液添加到該等樣本中，並再次將其置於GenogrinderTM離心機中以1,500rpm處理2分鐘。該等樣本並以4,000rpm離心7分鐘。採集上清液，並以不同稀釋度與Cry34Ab1及AAD-1蛋白質標準試劑一起完成ELISA。按照製造商的使用說明來進行Cry34Ab1(Agdia,Inc.；Cat No 04500/4800)與AAD-1(Acadia BioScience,LLC；Cat No ABS-041)的ELISA測定，ELISA的結果係以ng/cm2葉表面區域來表示，或以百萬分之一 (或者以每mg的總植物蛋白中的目標蛋白質ng數)來表示。
另一組植物係於V4-5階段對其整個根部進行採樣。該等樣本係立即冷凍乾燥一個星期，並接著進行研磨。ELISA係以上述針對葉子樣本的方式進行。總根部蛋白的評估係以Bradford檢測方法按照製造商的使用說明來進行。根部ELISA結果係以百萬分之一(或者以每mg的總植物蛋白中的目標蛋白質ng數)來表示。
針對轉殖基因的偵測與基因表現之T1植物篩選：
T0植物係與玉蜀黍c.v.B104相互雜交而得到T1種子。每個調控元件構築體之3至5個T1植株(或事件)係推進到蛋白表現的研究。播種了每一個事件之約40個T1種子，在發育的V2-3階段對幼苗噴灑Assure® II以殺死無效的植物。對所有存活的植物進行採樣以用於如上文所實施的轉殖基因複本數測定。
在轉殖基因的基因表現分析方面，於多個下列生長與發育階段對植物進行採樣：葉(V4、V12及R3)；根(V4)；莖、花粉、穗絲(皆在R1)、以及果仁與穗軸(皆在R3)。全部的組織係於插入到乾冰中的試管中進行採樣；其於完成採樣之後係立即接著被轉移到-80℃。在萃取用於ELISA的蛋白質之前對冷凍組織進行冷凍乾燥。
用於葉子ELISA之蛋白質萃取係以如前段所述之針對T0樣本之所述方式進行。例如，用於各種組織類型ELISA的蛋白質萃取係憑藉在顏料搖動器中於存有8個0.25”陶瓷珠(MP Biomedicals,USA)之情況下在50ml試管中將冷凍乾燥組織研磨30秒來進行。對於某些需要進一步研磨的組織，再 重複該步驟30秒。接著在2ml的聚丙烯試管中萃取蛋白質，所述試管含有足夠的石榴石粉覆蓋試管的底部彎曲部分。將粗磨組織轉移到2ml的試管，並填充到0.3ml標記處。接著對每個試管加入一個0.25”陶瓷球及0.6ml的萃取緩衝液(200μl的蛋白酶抑制劑混合物[Research Products International Corp.,Solon,OH,USA]、200μl的500mM EDTA、15.5mg DTT粉末與PBST加至20ml)。將全部的管子保持在冰上10分鐘，接著在離心機中處理45秒。接著，向試管添加40μl的10% Tween-20與另外的300μl的萃取緩衝液，再研磨樣本45秒。以13,000rpm將試管離心7-14分鐘。將上清液小心轉移到新的試管中。根據需要而將萃取物稀釋在緩衝液之中，以用於ELISA測定。ELISA的結果係以ng/cm2葉表面區域來表示，或以百萬分之一(或者以每mg的總植物蛋白中的目標蛋白質ng數)來表示。
實例5：可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與3’UTR調控元件之基因的表現
將玉米植物以一含有如上述之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR的基因表現構築體進行轉形。ELISA分析確認了該新穎啟動子係驅動該轉殖基因顯著表現，且該新穎3’UTR係有效地終止該轉殖基因的表現。由包括有新穎啟動子構築體之基因轉殖植物所獲得的Cry34Ab1蛋白質的定量量測值係顯示於表1中。資料顯示出含有新穎玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR(即pDAB108739)之植物中的Cry34Ab1蛋白係於在大多數植物組織中表現，諸如葉、莖、穗軸、果仁與穗絲組織。再者，資料顯示出含有新穎玉蜀黍 GRMZM2G047720啟動子與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR(即pDAB108739)之植物中的Cry34Ab1蛋白並未在跟組織中表現。
Cry34Ab1 ELISA的結果表明了存在於構築體pDAB108739之中的玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子調控元件(SEQ ID NO：1)與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR(SEQ ID NO：5)係驅動於所有已測試之組織類型之T1事件中的Cry34Ab1表現，除了根以外。例如，於以構築體pDAB108739轉形之T1事件之中，在葉、莖、穗軸、果仁、穗絲較佳表現的Cry34Ab1中之Cry34Ab1蛋白係受到玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子調控元件(SEQ ID NO：1)與玉蜀黍GRMZM2G047720 3’UTR(SEQ ID NO：5)而表現。由轉形所產生的事件在葉及根組織中亦皆穩固地表現AAD-1蛋白。總而言之，玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子係經研發以在全部的地面上組織中顯示出顯著的轉殖基因表現。
實例6：可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之基因的作物轉形
大豆係使用先前描述於專利申請案第WO 2007/053482號的實例#11或實例#13中之相同技術，以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形。
棉花係使用先前描述於美國專利第7,838,733號的實例#14或專利申請案第WO 2007/053482號(Wright等人)的實例#12中之相同技術，以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形。
芥花係使用先前描述於美國專利第7,838,733號的實例#26或專利申請案第WO 2007/053482號(Wright等人)的實例#22中之相同技術，以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形。
小麥係使用先前描述於專利申請案第WO 2013/116700A1號(Lira 等人)的實例#23中之相同技術，以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形。
水稻係使用先前描述於專利申請案第WO 2013/116700A1號(Lira等人)的實例#19中之相同技術，以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形。
實例7：可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因之農桿菌介導的轉形
有鑒於本發明，可根據本發明之實施例使用本領域中已知的技術來對額外的作物進行轉形。關於農桿菌介導的黑麥轉形，參見(例如)Popelka JC,Xu J,Altpeter F.,“Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of(Secale cereale L.)plants instantly marker-free transgenic rye,”Transgenic Res.2003 Oct；12(5)：587-96.)。關於農桿菌介導的高梁轉形，參見(例如)Zhao等人，“Agrobacterium-mediated sorghum transformation,”Plant Mol Biol.2000 Dec；44(6)：789-98。關於農桿菌介導的大麥轉形，參見(例如)Tingay等人，“Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation,”The Plant Joumal,(1997)11：1369-1376。關於農桿菌介導的小麥轉形，參見(例如)Cheng等人，“Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens,”Plant Physiol.1997 Nov；115(3)：971-980。關於農桿菌介導的水稻轉形，參見(例如)Hiei等人，“Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens,”Plant Mol.Biol.1997 Sep；35(1-2)：205-18。
這些及其他植物之拉丁名係於下文給出。應明白到可使用其他的(非農桿菌)轉形技術來對可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因進行轉形，例如轉形至這些及其他植物中。實例包含(但不限於)：玉米(玉蜀黍(Zea mays))、小麥(小麥屬(Triticum種))、水稻(稻屬(Oryza種)及菰屬(Zizania種))、大麥(大麥屬(Hordeum種))、棉花(水麻(Abroma augusta種)及棉屬(Gossypium種))、大豆(大豆(Glycine max))、糖及食用甜菜(甜菜屬(Beta種))、甘蔗(秀貴甘蔗(Saccharum officinarum)及其他種)、羽葉棕櫚(桄榔(Arenga pinnata))、番茄(番茄(Lycopersicon esculentum)及其他種、黏果酸漿(Physalis ixocarpa)、黃水茄(Solanum incanum)及其他種，及樹番茄(Cyphomandra betacea))、馬鈴薯(馬鈴薯(Solanum tuberosum))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatas))、黑麥(黑麥屬(Secale種))、胡椒(甜椒(Capsicum annuum)、花椒(chinense)及小米椒(frutescens))、萵苣(萵苣(Lactuca sativa)、山萵菊(perennis)及藍萵苣(pulchella))、甘藍菜(Brassica種)、芹菜(芹菜(Apium graveolens))、茄子(茄子(Solanum melongena))、花生(落花生(Arachis hypogea))、高粱(高粱屬(Sorghum種))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、胡蘿蔔(野胡蘿蔔(Daucus carota))、菜豆(菜豆屬(Phaseolus種)及其他屬)、燕麥(燕麥(Avena sativa)及毛燕麥(strigosa))、豌豆(豌豆屬(Pisum)、豇豆屬(Vigna)及翅莢豌豆屬(Tetragonolobus種))、向日葵(向日葵(Helianthus annuus))、南瓜(南瓜屬(Cucurbita種))、黃瓜(黃瓜(Cucumis sativa))、菸草(菸草屬(Nicotiana種))、阿拉伯芥(擬南芥(Arabidopsis thaliana))、草皮草(黑麥草屬(Lolium)、剪股穎屬(Agrostis)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)及其他屬)、三葉草(車軸草屬(Trifolium))、野豌豆(野豌豆屬(Vicia))。這類(例如)以可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之基因轉形的植物係涵蓋在本發明之實施例中。
使用玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子來驅動可操作地連接之基因係可用於許多落葉樹及常青樹種類。這類應用亦在本發明實施例之範疇內。這些種類包含(但不限於)：榿木(赤楊(Alnus種))、白蠟木(白蠟樹(Fraxinus種))、山楊及白楊品種(白楊(Populus種))、山毛櫸(山毛櫸(Fagus種))、樺樹(樺木(Betula種))、櫻桃木(李屬(Prunus))、桉樹(尤加利樹(Eucalyptus種))、山核 桃木(山核桃屬(Carya))、楓樹(槭屬(Acer))、橡樹(櫟屬(Quercus))及松樹(松屬(Pinus))。
使用玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子來驅動可操作地連接之基因係可用於許多觀賞植物及掛果種類。這類應用亦在本發明實施例之範疇內。實例包含(但不限於)：玫瑰(薔薇屬(Rosa種))、紫衛矛(衛矛屬(Euonymus種))、矮牽牛(矮牽牛屬(Petunia種))、秋海棠(秋海棠(Begonia種))、杜鵑花(杜鵑(Rhododendron種))、海棠果或蘋果(蘋果屬(Malus))、梨(青梨(Pyrus))、桃(李屬(Prunus))及金盞花(萬壽菊屬(Tagetes))。
儘管上文已經討論了許多例示性態樣及實施例，但熟習該項技術者應會認識到其某些修改、置換、添加及子組合。因此，預期以下隨附的申請專利範圍及下文引入之申請專利範圍係解釋為包含於其真正精神及範疇內的所有這類修改、置換、添加及子組合。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 用於轉殖基因表現之植物啟動子與3’UTR
<130> 78827-US-PSP-20160126-Sequence-Listing
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2065
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 1
<210> 2
<211> 4050
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 2
<210> 3
<211> 3498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有玉蜀黍GRMZM2G047720之基因表現卡匣 啟動子：：cry1Ab轉殖基因：：玉蜀黍GRMZM2G047720 3' UTR
<400> 3
<210> 4
<211> 962
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 4
<210> 5
<211> 1023
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子TQ.8v6.1.F
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子TQ.8v6.1.R
<400> 7
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針TQ.8v6.1.MGB.P
<400> 8
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子轉化酶F
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子轉化酶R
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉化酶探針
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAD1正向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAD1反向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAD1探針
<400> 14
<210> 15
<211> 3307
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表現AAD-1之基因表現卡匣
<400> 15

Claims (20)

  1. 一種核酸載體，其包括一可操作地連接於以下之啟動子：a)多酶切點接頭序列；b)非GRMZM2G047720基因；或c)a)與b)之組合，其中該啟動子係包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列。
  2. 如請求項1之核酸載體，其中該啟動子的長度為2,065bp。
  3. 如請求項1之核酸載體，其中該啟動子係由與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列所組成。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸載體，其更包括編碼一選擇標誌物之序列。
  5. 如請求項1之核酸載體，其中該啟動子係可操作地連接至一轉殖基因。
  6. 如請求項5之核酸載體，其中該轉殖基因係編碼一選擇標誌物或一賦予殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、氮利用效率、小RNA表現、位點特異性核酸酶、水分利用效率、營養品質或DNA結合蛋白之基因產物。
  7. 如請求項1至3或5中任一項之核酸載體，其更包括與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性之3'非轉譯聚核苷酸序列，其中該3'非轉譯序列係可操作地連接至該多酶切點接頭或該轉殖基因。
  8. 如請求項1至3或5中任一項之核酸載體，其更包括5'非轉譯聚核苷酸序列，其中該5'非轉譯序列係可操作地連接至該多酶切點接頭或該轉殖基因。
  9. 如請求項1至3或5中任一項之核酸載體，其更包括內含子序列。
  10. 如請求項1之核酸載體，其中該啟動子係驅動葉、莖、穗軸、果仁、花粉與穗絲組織中的轉殖基因表現。
  11. 一種非玉蜀黍c.v.B73植物，其包括與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性並且可操作地連接至一轉殖基因之聚核苷酸序列。
  12. 如請求項11之植物，其中所述非玉蜀黍c.v.B73植物係選自由以下組成之群：小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、阿拉伯芥、菸草、向日葵及芥花。
  13. 如請求項11之植物，其中所述非玉蜀黍c.v.B73植物為玉米。
  14. 如請求項11至13中任一項之植物，其中該轉殖基因係插入所述非玉蜀黍c.v.B73植物之基因組中。
  15. 如請求項11之植物，其中一啟動子係包括具有與SEQ ID NO：1具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列的啟動子，且該啟動子係可操作地連接至一轉殖基因。
  16. 如請求項15之植物，其更包括一包括有SEQ ID NO：5之3'非轉譯序列，其中該3'非轉譯序列係可操作地連接至該轉殖基因。
  17. 如請求項15之植物，其中該啟動子係驅動葉、莖、穗軸、果仁、花粉與穗絲組織中的轉殖基因表現。
  18. 如請求項15之植物，其中該啟動子的長度為2,065bp。
  19. 一種產生基因轉殖植物細胞之方法，該方法包括以下步驟：a)以一包括有玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之基因表現卡匣轉形植物細胞，所述啟動子係可操作地連接於至少一所關注的聚核苷酸序列； b)分離所述包括有基因表現卡匣之經轉形植物細胞；以及c)產生一包括有該可操作地連接於至少一所關注的聚核苷酸序列之玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子的基因轉殖植物細胞。
  20. 一種在植物細胞中表現所關注的聚核苷酸序列之方法，該方法包括將一可操作地連接至玉蜀黍GRMZM2G047720啟動子之所關注的聚核苷酸序列導入植物細胞。
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