ES2354109T3

ES2354109T3 - Métodos y medios para eliminar una secuencia de adn seleccionada.

Info

Publication number: ES2354109T3
Application number: ES06724035T
Authority: ES
Inventors: Kathleen D'halluin; Rene Ruiter
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2005-04-04
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2011-03-10
Anticipated expiration: 2026-03-31
Also published as: WO2006105946A2; DE602006017527D1; AU2006232828A1; US8148607B2; EP1869186B1; DK1869186T3; CA2603177A1; SI1869186T1; ATE484594T1; AU2006232828B2; CN101155921A; WO2006105946A3; CN102286456B; JP2008534023A; EP1869186A2; CN102286456A; CN101155921B; CA2603177C; US20090089890A1; JP5639336B2

Abstract

Un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una planta por una secuencia de ADN de interés, que comprende las siguientes etapas: a. inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado dicho sitio preseleccionado en dicha secuencia de ADN diana o en la vecindad de dicha secuencia de ADN diana; b. introducir una molécula de ADN de interés en dicha célula vegetal, comprendiendo dicha molécula de ADN i. dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea dicha secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea dicho sitio preseleccionado en el genoma de dicha célula vegetal; ii. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y otra copia de al menos parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa indicada como secuencia de ADN flanqueante parcial; iii. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa; c. seleccionar una población de células vegetales que comprenden dicho marcador seleccionable o identificable; d. seleccionar una célula vegetal en la que dicho marcador seleccionable o identificable se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de dichas regiones de ADN flanqueantes, y regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal; e. cruzar dicha planta regenerada o una planta descendiente de esta última, que comprende dicho gen marcador seleccionable, con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima DSBI, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente: iv. un promotor específico de microspora; v. una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés; vi. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación; f. seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende dicho gen marcador seleccionable o identificable y dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; g. cruzar dicha planta descendiente con otra planta, con lo que dicha planta descendiente se usa como donante de polen; h. seleccionar una población de plantas descendientes (población F2) que comprenden dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y i. seleccionar una planta descendiente en la que dicho gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante recombinación homóloga entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes.

Description

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Campo de la invención

La actual invención se refiere a métodos y medios para el intercambio exacto en células vegetales y en plantas de una secuencia de ADN diana por una secuencia de ADN de interés a través de recombinación homóloga, con lo que el marcador seleccionable o identificable usado durante la fase de recombinación homóloga para la selección temporal de los sucesos de sustitución génica se puede eliminar subsiguientemente sin dejar una huella y sin recurrir al cultivo in vitro durante la etapa de eliminación.

Antecedentes de la técnica

La eliminación de subfragmentos seleccionados de ADN extraño introducido en células vegetales o en plantas, pero que se han convertido subsiguientemente en obsoletos o incluso indeseados, por diversas razones, tras la introducción de los mismos, ha sido el objeto de una intensa investigación. Los ejemplos de tales secuencias son, por ejemplo, genes marcadores seleccionables que fueron necesarios para el aislamiento de plantas transgénicas pero que ya no son necesarios en las plantas maduras. Los métodos para lograr la eliminación eficaz de los mismos se basan mayoritariamente en la recombinación específica del sitio o en la transposición (véase, por ejemplo, Hohn et al., Plant Bio-Technology p 139-143).

Siebert y Puchta (2002) describieron que las secuencias transgénicas flanqueadas por sitios de una enzima de restricción de corte rara se pueden cortar eficazmente del genoma de un eucariota superior mediante recombinación homóloga, así como mediante unión de extremos no homólogos.

El documento WO 03/004659 se refiere a sistemas de recombinación y a un método para eliminar una secuencia de ácido nucleico del ADN cromosómico de organismos eucariotas. El documento también se refiere a organismos transgénicos (preferiblemente plantas), que contienen los sistemas descritos o producidos por los métodos descritos.

Sin embargo, los métodos descritos requieren en su mayoría el uso de un método de cultivo in vitro para identificar o seleccionar aquellas células vegetales en las que ha tenido lugar la eliminación de las secuencias de ADN a eliminar, y para generar una planta a partir de tales células.

La Solicitud de Patente US 2005/0060769 propone un método para preparar una planta o célula vegetal de Zea mays transgénica recombinada a partir de una primera célula vegetal de Zea mays transgénica, en el que el transgén en la planta o célula vegetal recombinante tiene una estructura genética alterada con relación a la estructura genética del transgén en la primera célula vegetal transgénica, debido a la eliminación transgénica mediada por recombinación homóloga.

El documento WO 97/30166 o la patente US 6.407.314 describe fragmentos promotores procedentes de un gen específico de microsporas del tabaco, que se pueden usar para la expresión de genes en microsporas.

El problema que se ha resuelto por la presente invención se refiere al intercambio seleccionado y exacto a través de recombinación homóloga de una secuencia de ADN diana en una célula de una planta por una secuencia de ADN de sustitución sin dejar huellas del procedimiento, y sin tener que recurrir a métodos de cultivo in vitro después de la etapa inicial de recombinación homóloga. Para este fin, se pueden usar convenientemente los métodos para la eliminación eficaz de la subsecuencia seleccionada de una parte de una molécula de ADN previamente insertada en el genoma, preferiblemente el genoma nuclear de células de una planta, a través de recombinación homóloga intracromosómica.

La necesidad de controlar el sitio de integración transgénica en plantas se ha reconocido desde muy temprano, y se han desarrollado varios métodos en un esfuerzo para satisfacer esta necesidad (para un repaso, véase Kumar y Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, p. 155-159). Estos métodos se basan en su mayoría en la integración transgénica basada en recombinación homóloga, una estrategia que se ha aplicado con éxito en procariotas y eucariotas inferiores (véase, por ejemplo, el documento EP 0317509, o la publicación correspondiente de Paszkowski et al., 1988, EMBO J., 7, p. 4021-4026). Sin embargo, para las plantas, el mecanismo predominante para la integración transgénica se basa en una recombinación ilegítima que implica poca homología entre las hebras de ADN que se recombinan. Por lo tanto, un reto importante en esta área es la detección de los sucesos de recombinación homóloga raros, que están enmascarados por la integración mucho más eficaz del ADN extraño introducido vía recombinación ilegítima.

Una manera de resolver este problema es seleccionando frente a los sucesos de integración que se han producido mediante recombinación ilegítima, tal como se ejemplifica en el documento WO 94/17176.

Otra manera de resolver el problema es mediante la activación del locus diana a través de la inducción de rupturas de ADN bicatenarias vía endonucleasas que cortan de forma rara, tales como I-SceI. Se ha demostrado que esta técnica incrementa la frecuencia de recombinación homóloga en al menos dos órdenes de magnitud usando agrobacterias para suministrar el ADN de reparación a las células vegetales (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, p. 5055-5060).

El documento WO 96/14408 describe un AND aislado que codifica la enzima I-SceI. Esta secuencia de ADN se puede incorporar en vectores de clonación y de expresión, estirpes celulares transformadas y en animales transgénicos. Los vectores son útiles en el cartografiado de genes y en la inserción de genes dirigida al sitio.

El documento WO 00/46386 describe métodos para modificar, reparar, atenuar e inactivar un gen u otro AND cromosómico en una célula a través de una ruptura bicatenaria mediante I-SceI. También se describen métodos para tratar o para la profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que lo necesite. Se describen además endonucleasas de restricción quiméricas.

Chilton y Que (2003, Plant Physiol. 133: p. 956-965) y Tzifira et al. (2003, Plant Physiol. 133: p. 1011-1023) informan que el ADN T se integra preferentemente en rupturas de ADN bicatenarias, inducidas artificialmente por las enzimas que escinden de forma rara I-SceI o I-CeuI. Los informes también incluyeron vectores de ADN T donantes que comprendían un sitio de reconocimiento para la enzima respectiva que escinde de forma rara.

Sin embargo, los métodos en la técnica anterior se basan frecuentemente en la reformación o generación, a través de recombinación homóloga, de un gen marcador seleccionable o identificable intacto.

Por lo tanto, todavía sigue existiendo la necesidad de métodos que permitiesen el intercambio selecto de virtualmente cualquier secuencia de ADN diana mediante un ADN de sustitución. Estos y otros problemas se resuelven como se describe en lo sucesivo en las diferentes realizaciones detalladas de la invención, así como en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

En una realización de la invención, se proporciona un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma, particularmente el genoma nuclear, de una planta por una secuencia de ADN de interés, que comprende las siguientes etapas:

a.: inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado el sitio preseleccionado en la secuencia de ADN diana o en la vecindad de la secuencia de ADN diana;

b.: introducir una molécula de ADN de interés en la célula vegetal, comprendiendo la molécula de ADN

i. la secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia, preferiblemente 100% de homología de secuencia, con una región de ADN que flanquea a la secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea al sitio preseleccionado en el genoma de la célula vegetal;

ii. un gen marcador seleccionable o identificable si

tuado entre las regiones de ADN flanqueantes, estando situado además el gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial, que comprende parte de la una de las regiones de ADN flanqueantes, situada en la repetición directa;

iii. un sitio de reconocimiento para una enzima que escinde de forma rara, inductora de una ruptura de ADN bicatenaria (DSBI), situado entre la una de las regiones de ADN flanqueantes y la región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa;

c.: seleccionar una población de células vegetales que comprenden el marcador seleccionable o identificable;

d.: seleccionar una célula vegetal en la que la secuencia de ADN de interés (y el marcador seleccionable o identificable) se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes, y regenerar una planta a partir de la célula vegetal;

e.: cruzar la planta regenerada o una planta que desciende de esta última, que comprende el gen marcador seleccionable, con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima inductora de la ruptura bicatenaria (“DSBI”) que escinde de forma rara, comprendiendo el gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente:

iv.: un promotor específico de microspora;

v.: una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce el sitio de reconocimiento situado en el ADN de interés;

vi. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

f.: seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende el gen marcador seleccionable o identificable y el gen quimérico que codifica la enzima DSBI;

g.: cruzar la planta descendiente con otra planta, con lo que la planta descendiente se usa como donante de polen;

h.: seleccionar una población de plantas descendientes (población F2) que comprenden el gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y

i.: seleccionar una planta descendiente en la que el gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante recombinación homóloga entre la una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de la una de las regiones de ADN flanqueantes.

En otra realización de la invención, se proporciona un vector de ADN para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una célula vegetal por una secuencia de ADN de interés a través de la inducción de una ruptura bicatenaria en un sitio preseleccionado dentro de la secuencia diana o en su vecindad, comprendiendo el vector de ADN

a.: la secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia, preferiblemente un 100% de homología de secuencia, con una región de ADN que flanquea a la secuencia de ADN diana y que flanquea al sitio preseleccionado;

b.: un gen marcador seleccionable o identificable situa

do entre las regiones de ADN flanqueantes, estando situado además el gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de la una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa; y

c. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre la una de las regiones de ADN flanqueantes y la región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 3 representan diferentes aplicaciones del método para eliminar una subparte seleccionada de un ADN de interés que se introduce o se ha introducido en una célula de una planta. Sólo sirven para ilustración.

La Figura 1 es una representación esquemática comparativa, sólo para referencia, de un método para introducir un ADN de interés que tiene una subparte seleccionada, que comprende un gen marcador seleccionable o identificable, en una célula de una planta, y eliminar subsiguientemente la subparte seleccionada del ADN de interés. Rasgo: representa cualquier secuencia de ADN de interés; DSB: sitio de reconocimiento para una enzima inductora de una ruptura bicatenaria (“DSBIE”); SMG1: gen marcador seleccionable o gen marcador identificable; drs: secuencia de repetición directa; SMG2: gen marcador seleccionable o identificable asociado con el gen quimérico que codifica la DSBIE; MSP: promotor específico de microspora; 3’: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

la Fig. 2 es una representación esquemática de un método que permite la sustitución exacta de una secuencia de ADN diana por una secuencia de ADN de sustitución. DSBI: sitio de reconocimiento para una primera enzima inductora de una ruptura bicatenaria; FS1: secuencia flanqueante 1; FS2: secuencia flanqueante 2; DSB2: sitio de reconocimiento para una segunda enzima inductora de una ruptura bicatenaria; SMG1: gen marcador seleccionable 1 o gen marcador identificable 1; SMG2: gen marcador seleccionable 2 o gen marcador identificable 2; DSBIE: enzima inductora de una ruptura bicatenaria; dr1: secuencia 1 de repetición directa (que es similar

o idéntica a la secuencia 2 de repetición directa que es parte de la secuencia flanqueante 2; también indicada aquí como “región de ADN flanqueante parcial”); MSP: promotor específico de microspora; 3’: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

la Fig. 3 es una representación esquemática de un método que permite la sustitución exacta de una secuencia de ADN diana por una secuencia de ADN de sustitución similar al método ilustrado en la Fig. 2. En este caso, drI es una secuencia de repetición directa que es parte de la secuencia flanqueante 1 y que es similar o idéntica a la secuencia 2 de repetición directa (dr2).

Realizaciones detalladas de la invención

La actual invención se basa en el hallazgo de que secuencias seleccionadas de una molécula de ADN que están flanqueadas por dos repeticiones directas, y que están situadas en la vecindad de un sitio de reconocimiento para una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que escinde de forma rara se pueden eliminar eficazmente cuando la planta que comprende tal ADN se cruza en primer lugar con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima que escinde de forma rara inductora de una ruptura de ADN bicatenaria bajo el control de un promotor específico de microspora, y el polen de la planta resultante se usa para polinizar una planta receptora.

De este modo, la invención se basa en el uso de una planta que comprende un gen quimérico que codifica una endonucleasa que escinde de forma rara, inductora de una ruptura de ADN bicatenaria, bajo el control de un promotor específico de microspora, para eliminar, mediante cruzamiento, un fragmento de ADN situado en la vecindad de un sitio de reconocimiento para la endonucleasa que escinde de forma rara inductora de una ruptura de ADN bicatenaria, y situado además entre dos secuencias situadas en la orientación de la repetición directa (véase la Fig. 1). La expresión de la endonucleasa DSBI que escinde de forma rara en la microspora durante la formación del polen es suficiente para inducir rupturas de ADN bicatenarias, y de ese modo estimula significativamente la recombinación homóloga intracromosómica entre las secuencias repetidas directamente, dando como resultado una eliminación de las secuencias situadas entre estas secuencias repetidas directamente.

Como se usa aquí, una “endonucleasa que escinde de forma rara inductora de una ruptura de ADN bicatenaria” es una enzima capaz de inducir una ruptura de ADN bicatenaria en una secuencia nucleotídica particular, denominada el “sitio de reconocimiento”. Las endonucleasas que escinden de forma rara, también denominadas algunas veces meganucleasas, tienen un sitio de reconocimiento de 14 a 40 nucleótidos consecutivos. Por lo tanto, las endonucleasas que escinden de forma rara tienen una frecuencia de escisión muy baja, incluso en los genomas de plantas superiores. Las endonucleasas codificadas por intrones que actúan sobre el ADN de la propia célula que las sintetiza constituyen una familia de tales endonucleasas que escinden de forma rara. Pueden ser codificadas por intrones, genes independientes o secuencias intervinientes, y presentan propiedades estructurales y funcionales sorprendentes que las distinguen de las enzimas de restricción más clásicas, habitualmente de los sistemas de tipo II de restricción y modificación bacterianos. Sus sitios de reconocimiento tienen una asimetría general que contrasta con la simetría de diada característica de la mayoría de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Se ha demostrado que varias endonucleasas codificadas por intrones o inteínas, que actúan sobre el ADN de la propia célula que las sintetiza, promueven el movimiento de sus elementos genéticos respectivos a sitios alélicos sin intrones o sin inteínas. Realizando una ruptura bicatenaria específica del sitio en los alelos sin intrones o sin inteínas, estas nucleasas crean extremos recombinogénicos, que se ven envueltos en un proceso de conversión génica que duplica la secuencia codificante y conduce a la inserción de un intrón o una secuencia interviniente al nivel del ADN.

Una endonucleasa de traslado de intrones o inteínas bien caracterizada es I-SceI. I-SceI es una endonucleasa específica del sitio, responsable de la movilidad intrónica en mitocondrias en Saccharomyces cerevisiae. La enzima es codificada por el intrón opcional Sc LSU.1 del gen de ARNr 21S, e inicia una ruptura de ADN bicatenaria en el sitio de inserción del intrón, generando un corte escalonado de 4 pb con salientes 3’-OH. El sitio de reconocimiento de la endonucleasa I-SceI se extiende a lo largo de una secuencia no simétrica de 18 pb (Colleaux et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6022-6026). La secuencia de aminoácidos para I-SceI y un equivalente de código universal del gen de I-SceI mitocondrial se ha proporcionado mediante, por ejemplo, el documento WO 96/14408. El documento WO 96/14408 describe además un número de variantes de la proteína I-SceI que todavía son funcionales.

La Solicitud PCT PCT/EP04/013122 proporciona variantes de secuencias nucleotídicas sintéticas de I-SceI que se han optimizado para la expresión en plantas. La secuencia nucleotídica de tales regiones codificantes de I-SceI sintéticas se expone en SEC ID No 1 en el código DE IUPAC. Los símbolos del código de IUPAC tienen su significado habitual, es decir, N = A o C o G o T; R = A o G; Y = C o T; B = C o G o T (no A); V = A o Co G (no T); D = A o G o T (no C); H = A o Co T (no G); K = G o T; M = A o C; S = G o C; W =A o T.

En la Tabla I del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) se proporciona una lista de otras enzimas inductoras de DSB que escinden de forma rara y sus sitios de reconocimiento respectivos. Estos incluyen I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I o PI-Tsp I.

Además, existen métodos para diseñar endonucleasas que escinden de forma rara personalizadas para cada usuario que reconocen básicamente cualquier secuencia nucleotídica diana de elección. De forma breve, las enzimas de restricción quiméricas se pueden preparar usando híbridos entre un dominio de dedos de cinc diseñado para reconocer una secuencia nucleotídica específica y el dominio de escisión de ADN no específico procedente de una enzima de restricción natural, tal como FokI. Tales métodos se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 03/080809, WO 94/1831 o WO 95/09233, y en Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530. En el documento WO 2004/067736 se describe otra manera de producir meganucleasas personalizadas, mediante selección de una librería de variantes.

Como se usa aquí, “flanqueada por dos secuencias dispuestas en la repetición directa” indica que la secuencia a eliminar de la molécula de ADN introducida está precedida y seguida inmediatamente por dos regiones de ADN, una en cada extremo, en la que dichas dos regiones de ADN son esencialmente similares en secuencia nucleotídica. Las secuencias directamente repetidas no necesitan ser idénticas, sino que pueden variar entre alrededor de 75% y alrededor de 100% de identidad de secuencia. Cuanto más corta sea la secuencia repetida, más restrictivo es preferiblemente el requisito de similitud de secuencia. Sin embargo, a fin de restaurar la secuencia de ADN sin dejar una huella, como se describe después aquí, las secuencias de ADN dispuestas en la repetición directa deberían ser preferiblemente idénticas. Para evitar dudas, si las dos regiones de ADN esencialmente similares en la secuencia nucleotídica están contenidas en una molécula de ADN bicatenario, estas secuencias de ADN se han de localizar en la misma hebra de ADN, en la misma dirección 5’3’.

La secuencia de ADN repetida puede tener una longitud de al menos 10, 50 ó 100 nucleótidos, pero por supuesto la secuencia puede ser más larga. Sin embargo, se ha encontrado que las repeticiones mayores que 300 nucleótidos ya no potencian significativamente más la recombinación homóloga intracromosómica dando como resultado la eliminación de la secuencia de ADN situada entre las secuencias de repetición directa.

Para los fines de esta invención, la “identidad de secuencia” de dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen restos idénticos (x 100) dividido entre el número de posiciones comparadas. Un salto, es decir, una posición en un alineamiento en el que un resto está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con restos no idénticos. El alineamiento de las dos secuencias se lleva a cabo mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). El alineamiento de secuencias asistido por ordenador se puede llevar a cabo convenientemente usando un programa de software estándar tal como GAP, que es parte del Wisconsin Package Versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA), usando la matriz de puntuación por defecto con una penalización de creación de salto de 50 y una penalización de extensión de salto de 3.

Aunque el sitio de reconocimiento DSBI está situado preferiblemente entre las secuencias de ADN directamente repetidas, esto no es esencial ni es necesario. De hecho, el sitio de reconocimiento DSBI podría ser también parte de una de las secuencias de ADN repetidas.

Como se usa aquí, “situada en la vecindad” se refiere a que la DSBI está situada a una distancia entre 500 pb, 1 kpb a 10 kpb de las secuencias de ADN directamente repetidas.

Los métodos descritos aquí requieren el uso de un gen quimérico que codifica una enzima inductora de una ruptura bicatenaria que escinde de forma rara, con lo que la región codificante para la endonucleasa está bajo el control de un fragmento de un promotor específico de microspora.

Como se usa aquí, “una región de un promotor específico de microspora” o “un promotor específico de microspora”, o un “fragmento de un promotor específico de microspora”, es una región promotora o un promotor o fragmento promotor que puede promover selectivamente, preferiblemente de forma específica, la transcripción en la microspora unicelular de una planta. En las plantas angiospermas, la reproducción sexual requiere la producción de gametofitos machos y hembras viables. El polen, como gametofito macho, se forma en la antera y se inicia a partir de células esporógenas, que se desarrollan en meiocitos. El meiocito sufre una meiosis para formar una tétrada de microsporas haploides, que son liberadas subsiguientemente en el lóculo de la antera. Tras la expansión y vacuolización, una mitosis asimétrica de la microspora da como resultado polen bicelular, que contiene una célula vegetativa y una célula generativa. En la mayoría de las especies, el polen se desprende en condición bicelular. Una región de un promotor específico de microspora adecuada se describe en el documento WO 97/30166 (véase también SEC ID No 3) como la región promotora procedente del gen NTM19 en el tabaco. Un fragmento funcional del mismo se ha incorporado en el gen quimérico de los Ejemplos SEC ID No 6). Un fragmento de un promotor específico de microspora podría incluir la secuencia nucleotídica de SEC ID No 3 desde la posición 1 hasta la po

5 sición 954, o desde la posición 1 hasta la posición 993, o la secuencia nucleotídica de SEC ID No 6 desde la posición 1941 a 2926.

Como se usa aquí, “región codificante de una endonucleasa inductora de una ruptura bicatenaria que escinde de 10 forma rara”, o “región codificante de una enzima inductora de una ruptura bicatenaria que escinde de forma rara”, es una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que se caracteriza como una enzima DSBI que escinde de forma rara, tal como las endonucleasas codificadas por intrones o 15 inteínas que actúan sobre el ADN de la propia célula que las sintetiza, o las endonucleasas quiméricas descritas en cualquier otra parte en esta solicitud. La región codificante puede comprender así cualquier secuencia nucleotídica que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos de

20 las endonucleasas codificadas por intrones o inteínas que actúan sobre el ADN de la propia célula que las sintetiza enumeradas en la siguiente tabla, que se pueden encontrar en las bases de datos públicas con los número de acceso mencionados:

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Enzima DSBI: Número de acceso

I-AniI: P03880

I-CvuI: P56347

I-CreI: P05725

I-ChuI: 032001

I-OpaI - I-CpaIII –: Q39562/ Q8WKZ5/ Q8WKZ6/

I-CpaIV – I-CpaV: Q8WKZ8

I-CpaII: Q39559

I-CeuI: P32761

I-DmoI: P21505

I-SceI: P03882

I-SceII: P03878

I-SceIII: Q9ZZX3

PI-SceI: P17255

I-NanI: 025535

I-NitI: Q25567

I-NjaI: 025568

I-PpoI: 094702

PI-PfuI: 073954

PI-PkoI: P77933

PI-PkoII: P77933

PI-PspI: 051334

PI-Tfu: P74918

PI-TfuII: P74918

PI-ThyI: 09HH05

PI-ThyII: 09HH05

PI-TliI: P30317

PI-TliII: P30317

I-TevI: P13299

I-TevH: P07072

I-TevIII: Q38419

Estará claro que, para la expresión de las endonucleasas bajo el control de un fragmento de un promotor específico de microspora, la región codificante se debería de adaptar de forma que se use el lenguaje de codones universal para codificar los polipéptidos mencionados anteriormente. La región codificante se puede optimizar además para la expresión en plantas, y la región codificante sintética tiene una secuencia nucleotídica que se ha diseñado para satisfacer los siguientes criterios:

a) la secuencia nucleotídica codifica una endonucleasa inductora de una ruptura bicatenaria que escinde de forma rara funcional, b) la secuencia nucleotídica tiene un contenido de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%, c) la secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA; d) la secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en ATTTA, AAGGT, GCAAT y ATTGC; e) la secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia seleccionada del grupo que consiste en ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG; f) la secuencia nucleotídica no comprende ningún tramo de GC que consiste en 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C; g) la secuencia nucleotídica no comprende ningún tramo de GC que consiste en 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T; y h) la secuencia nucleotídica no comprende codones que codifican Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala que comprende dupletes TA o CG en las posiciones 2 y 3 (es decir, la secuencia nucleotídica no comprende los codones

TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG).

La enzima inductora de una ruptura bicatenaria puede comprender, pero no necesita comprender, una señal de localización nuclear (NLS) [Raikhel, Plant Physiol. 100: 16271632 (1992) y referencias allí], tales como la NLS del antígeno T grande de SV40 [Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)]. La señal de localización nuclear puede estar situada en cualquier parte en la proteína, pero está situada convenientemente en el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede sustituir a uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de la ruptura bicatenaria.

También estará claro que los términos usados para describir el método, tales como “introducción de un fragmento de ADN” así como “regeneración de una planta a partir de la célula”, no implica que tal fragmento de ADN necesita necesariamente ser introducido mediante técnicas de transformación. De hecho, estará claro inmediatamente para la persona experta en la técnica que la molécula de ADN de interés también se puede introducir mediante técnicas de reproducción o de cruzamiento de una planta a la otra.

Sin embargo, estará claro que la molécula de ADN de interés se puede introducir en las células vegetales mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, pero también mediante métodos de transferencia directa de ADN. La molécula de ADN transformante se puede transferir a las células vegetales usando cualquier método convencional, incluyendo, pero sin limitarse a, un método de transferencia directa de ADN. Como se usa aquí, “transferencia directa de ADN” es cualquier método de introducción de ADN en células vegetales que no implique el uso de Agrobacterium spp. natural y que sea capaz de introducir ADN en células vegetales. Esto incluye métodos bien conocidos en la técnica, tales como la introducción de ADN mediante electroporación en protoplastos, la introducción de ADN mediante electroporación en células vegetales intactas o tejidos o células vegetales parcialmente degradados, la introducción de ADN a través de la acción de agentes tales como PEG y similares en protoplastos, el uso de triquitas de silicio, y el bombardeo con microproyectiles revestidos de ADN.

El ADN se puede integrar mediante métodos de recombinación homóloga o de unión de extremos no homólogos que implican una inducción de una ruptura bicatenaria en un sitio preseleccionado, como se describe por ejemplo en el documento PCT/EP04/013122.

En una realización de la invención, el método de eliminación se usa en combinación con la inserción, supresión

o sustitución de ADN mediante recombinación homóloga seleccionada, y en el que la inserción seleccionada de ADN se logra usando un marcador seleccionable o identificable, seguido de la verificación en la población de células vegetales o plantas que comprenden el marcador seleccionable o identificable de aquellas células vegetales o plantas en las que la inserción seleccionada de ADN se produjo mediante recombinación homóloga. Cuando se escogen apropiadamente las secuencias de flanqueo y las repeticiones directas, este método da como resultado la sustitución exacta del ADN diana por el ADN de interés, sin ningún resto (“huella”) de la molécula de ADN de interés usado para lograr la sustitución. El método de eliminación no necesita además ningún cultivo in vitro adicional, evitando de ese modo que se generen variaciones somaclonales. En las figuras 2 y 3 se

puede encontrar un esquema del método.

De forma interesante, se ha observado que, usando los métodos como se describe en el documento PCT/EP04/013122 para una inserción seleccionada de ADN extraño de interés mediante recombinación homóloga, esos sucesos de transformación en los que el ADN extraño se inserta de hecho mediante recombinación homóloga representan una proporción relativamente elevada (del orden de 1 a 5%) de la población total de sucesos en los que el ADN se incorpora en el cromosoma vegetal por cualquier medio. En consecuencia, no es necesario basarse en la generación o recreación mediante la recombinación homóloga de una secuencia de ADN que da como resultado un fenotipo reconocible (tal como la creación de un gen marcador seleccionable intacto después de la recombinación homóloga) para identificar aquellos sucesos mediante los cuales el ADN se inserta mediante recombinación homóloga. Más bien, se puede incluir un marcador seleccionable o identificable en la región de ADN entre las secuencias de ADN flanqueantes, seguido del análisis de un número relativamente pequeño de células vegetales o plantas transformadas, para la identificación de aquellos sucesos de transformación en los que la inserción seleccionada de ADN se produjo mediante recombinación homóloga.

De este modo, en esta realización de la invención, se proporciona un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en células de una planta por una secuencia de ADN de interés (o un ADN extraño), que comprende las siguientes etapas:

inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de la célula, estando situado el sitio preseleccionado en la secuencia de ADN diana o en la vecindad de dicha secuencia de ADN diana; introducir una molécula de ADN de interés (de ADN extraño) en la célula vegetal, con lo que la molécula de ADN comprende los siguientes fragmentos de ADN operablemente enlazados:

i. una molécula de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tienen al menos 80% de homología de secuencia, preferiblemente 100% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea a la secuencia de ADN diana y que flanquea al sitio preseleccionado en el genoma de la célula vegetal;

ii. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre las regiones de ADN flanqueantes, con lo que el gen marcador seleccionable o identificable está situado además entre una de las regiones de ADN flanqueantes y otra copia de al menos parte de la mencionada una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa (también indicada como secuencia de ADN flanqueante parcial);

iii. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre la una de las regiones de ADN flanqueantes y la región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa;

seleccionar una población de células vegetales que comprende el marcador seleccionable o identificable; seleccionar una célula vegetal en la que se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes el marcador seleccionable o identificable, y regenerar una planta a partir de la célula vegetal; cruzar la planta regenerada o una planta derivada de la misma que comprende el gen marcador seleccionable con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima DSBI, comprendiendo el gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente:

■: un promotor específico de microspora;

■: una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce el sitio de reconocimiento situado en el ADN de interés;

■: una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

- seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende el gen marcador seleccionable o identificable y el gen quimérico que codifica la enzima DSBI;

- cruzar la planta descendiente con otra planta, con lo que la planta descendiente se usa como donante de polen;

-: seleccionar una población de plantas descendientes (población F2) que comprende el gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y

-: seleccionar una planta descendiente dentro de dicha población F2 en la que el gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante re-combinación homóloga entre la una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de la una de las regiones de ADN flanqueantes.

De este modo, como se usa aquí, “un sitio preseleccionado” indica una secuencia nucleotídica particular en el genoma nuclear de la planta, situada en o próxima a la secuencia de ADN diana en cuya localización se desea insertar el ADN extraño o intercambiar la secuencia de ADN diana. Una persona experta en la técnica sería capaz de elegir una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria (“DSBI”) que reconoce la secuencia nucleotídica diana seleccionada,

o manipular mediante ingeniería tal endonucleasa DSBI. Como alternativa, se puede introducir en el genoma vegetal un sitio de reconocimiento de endonucleasa DSBI usando cualquier método de transformación convencional o mediante reproducción convencional usando una línea vegetal que tiene en su genoma un sitio de reconocimiento de endonucleasa DSBI, y después se puede introducir cualquier ADN extraño deseado en el sitio diana preseleccionado previamente introducido.

Las rupturas de ADN bicatenarias en la molécula de ADN transformante se pueden inducir convenientemente mediante interrupción transitoria de un gen quimérico expresable en la planta que comprende una región promotora expresable en la planta operablemente enlazada a una región de ADN que codifica una enzima inductora de la ruptura bicatenaria. La región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura bicatenaria puede ser una región de ADN sintética, tal como, pero sin limitarse a, una región de ADN sintética mediante la cual los codones se eligen según el esquema de diseño como se describe en cualquier otra parte en esta solicitud para regiones codificantes de I-SceI. La propia endonucleasa, como proteína, también se podría introducir en las células vegetales, por ejemplo mediante electroporación. Sin embargo, la endonucleasa también se puede proporcionar de una manera transitoria introduciendo, en el genoma de una célula vegetal o planta, un gen quimérico que comprende la región codificante de la endonucleasa operablemente enlazada a un promotor inducible expresable en la planta, y proporcionando el compuesto inducible apropiado durante un tiempo limitado antes, durante

o inmediatamente después de la introducción de la molécula de ADN transformante. La endonucleasa también se podría proporcionar como un precursor de ARN que codifica la endonucleasa.

La enzima inductora de una ruptura bicatenaria puede comprender, pero no necesita comprender, una señal de localización nuclear (NLS) [Raikhel, Plant Physiol. 100: 16271632 (1992) y referencias allí], tal como la NLS del antígeno T grande de SV40 [Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)]. La señal de localización nuclear puede estar situada en cualquier parte en la proteína, pero está situada convenientemente en el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede sustituir a uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de una ruptura bicatenaria.

Como se usa aquí, la “secuencia de ADN diana” es la secuencia de ADN situada en el genoma de la célula vegetal que se modifica mediante adición, supresión o sustitución.

Como se usa aquí, “regiones de ADN flanqueantes” son secuencias de ADN que tienen homología con las regiones de ADN respectivamente en dirección 5’ o en dirección 3’ de la secuencia de ADN diana. Esto permite controlar mejor la inserción del ADN extraño o de la molécula de ADN de interés. De hecho, la integración mediante recombinación homóloga permitirá la unión precisa del fragmento de ADN extraño al genoma nuclear de la planta hasta el nivel nucleotídico.

Las regiones de ADN flanqueantes pueden variar en longitud, y deberían tener al menos alrededor de 10 nucleótidos de longitud. Sin embargo, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (por ejemplo, hasta alrededor de 100-150 kb, tal como cromosomas artificiales bacterianos completos (BAC)). Preferiblemente, la región flanqueante tendrá alrededor de 50 pb a alrededor de 2000 pb. Además, las regiones que flanquean a la molécula extraña de interés no necesitan ser idénticas a las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado, y pueden tener entre alrededor de 80% y alrededor de 100% de identidad de secuencia, preferiblemente alrededor de 95% a alrededor de 100% de identidad de secuencia con las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado. Cuanto mayor es la región flanqueante, menos restrictivo es el requisito de la homología. Adicionalmente, se prefiere que la identidad de secuencia sea tan alta como sea prácticamente posible en la vecindad de la localización de la inserción exacta del ADN extraño. Además, para lograr el intercambio de la secuencia de ADN diana sin cambiar la secuencia de ADN de las secuencias de ADN adyacentes, las secuencias de ADN flanqueantes deberían ser preferiblemente idénticas a las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado.

Además, las regiones que flanquean al ADN extraño de interés no necesitan tener homología con las regiones inmediatamente que flanquean al sitio preseleccionado, sino que pueden tener homología con una región de ADN del genoma nuclear más remota que ese sitio preseleccionado. La inserción del ADN extraño dará entonces como resultado una eliminación del ADN diana entre el sitio de inserción preseleccionado y la región de ADN de homología. En otras palabras, el ADN diana situado entre las regiones de homología se sustituirá por el ADN extraño de interés.

Preferiblemente, el sitio preseleccionado y la secuencia de reconocimiento mencionada además son reconocidos por diferentes endonucleasas inductoras de una ruptura bicatenaria que escinden de forma rara.

La “región de ADN flanqueante parcial” mencionada indica que la región de ADN comprende al menos una porción de la región de ADN flanqueante adyacente a la región de ADN a eliminar y que habitualmente comprenderá el marcador seleccionable o identificable. Está claro que la secuencia de ADN flanqueante parcial también puede tener una longitud igual a la secuencia de ADN flanqueante, o incluso comprender una secuencia de ADN flanqueante más larga.

“Marcadores seleccionables o identificables”, como se usa aquí, tienen su significado habitual en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, fosfinotricin acetiltransferasa expresable en plantas, neomicina fosfotransferasa, glifosato oxidasa, enzima EPSP tolerante a glifosatos, gen de nitrilasa, gen de acetolactato sintasa o acetohidroxiá

cido sintasa mutante, -glucuronidasa (GUS), genes del locus R, la proteína fluorescente verde, y similares.

La selección de la célula vegetal o planta en la que el marcador seleccionable o identificable y el resto de la molécula de ADN extraño se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes se puede lograr, por ejemplo, identificando en busca de ausencia de secuencias presentes en el ADN transformante pero situadas fuera de las regiones de ADN flanqueantes. De hecho, la presencia de secuencias del ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueantes indicaría que las células vegetales transformadas se originan mediante inserción aleatoria del ADN. Para este fin, se pueden incluir marcadores seleccionables o identificables en la molécula de ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueantes, que entonces se pueden usar para identificar aquellas células vegetales que no tienen los marcadores seleccionables o identificables situados fuera del ADN transformante y que pueden haber surgido mediante recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes. Como alternativa, la molécula de ADN transformante puede contener marcadores seleccionables fuera de las regiones de ADN flanqueantes que permiten la selección en busca de la ausencia de tales genes (genes marcadores seleccionables negativos).

Se apreciará que los medios y métodos de la invención se pueden usar en cualquier planta capaz de reproducirse a través de polen, incluyendo plantas de maíz, tabaco, plantas de cereales que incluyen plantas de trigo, avena, cebada, centeno, arroz, césped, sorgo, mijo o caña de azúcar. Los métodos de la invención también se pueden aplicar a cualquier planta (angiospermas o gimnospermas), incluyendo, pero sin limitarse a, algodón, colza con bajo contenido en ácido erúcico, colza, haba de soja, vegetales, patatas, Lemna spp., Nicotiana spp., Arabidopsis, alfalfa, cebada, haba, maíz, algodón, lino, guisante, colza, arroz, centeno, alazor, sorgo, haba de soja, girasol, tabaco, trigo, espárrago, remolacha, brócoli, repollo, zanahoria, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga, cebolla, colza, pimiento, patata, calabaza, rábano, espinaca, calabaza, tomate, calabacín, almendra, manzana, albaricoque, plátano, zarzamora, arándano, cacao, cereza, coco, arándano, dátil, uva, pomelo, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, fruta de la pasión, melocotón, cacahuete, pera, piña, pistacho, ciruela, frambuesa, fresa, clementina, nuez y sandía.

Las plantas obtenidas mediante los métodos descritos aquí se pueden cruzar además mediante técnicas de reproducción tradicionales con otras plantas para obtener plantas descendientes que comprenden los sucesos de inserción de ADN seleccionados obtenidos según la presente invención.

Los siguientes Ejemplos no limitantes describen la eliminación de un subfragmento seleccionado a partir de una molécula de ADN introducida usando una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria, tal como I-SceI, expresada bajo el control de un gen quimérico que codifica un promotor específico de microspora.

En los Ejemplos, excepto que se establezca de otro modo, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según protocolos estándar como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, juntamente publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications, UK. Otras referencias para técnicas de biología molecular estándar incluyen Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (UK). Los materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania.

A lo largo de la descripción y de los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEC ID No 1: secuencia nucleotídica de la región codificante de I-SceI sintética (código IUPAC).

SEC ID No 2: secuencia nucleotídica de la región codificante de I-SceI sintética.

SEC ID No 3: secuencia nucleotídica de gen NTM19 selectivo de microspora que incluye la región promotora.

SEC ID No 4: secuencia nucleotídica del ADN T de pTCV63

SEC ID No 5: secuencia nucleotídica del ADN T de pTCV64

SEC ID No 6: secuencia nucleotídica del ADN T de pTCV72

EJEMPLOS

Eliminación de un gen marcador seleccionable mediante re-combinación homóloga intracromosómica (IHR) (sólo como referencia)

Se ha desarrollado un ensayo de recombinación para detectar la eliminación de un fragmento de ADN seleccionado basándose en la restauración de un gen de fusión egfp-bar tras la eliminación de un gen marcador seleccionable (hyg) (2000 pb) mediante recombinación homóloga intracromosómica (IHR) entre secuencias directamente repetidas (parte de las secuencias de egfp; alrededor de 300 pb o alrededor de 600 pb). Una de las secuencias repetidas está flanqueada por un sitio de reconocimiento de I-SceI (y el dedo de cinc Zif268), dando la posibilidad de crear una DSB entre las repeticiones. A fin de permitir la IHR durante la transición de una generación a la otra, la endonucleasa I-SceI se colocó bajo el control de un promotor específico de microspora (pNTM19).

Usando técnicas de ADN recombinante estándar, se construyeron las siguientes moléculas de ADN para uso en los siguientes experimentos:

1. pTCV63: con secuencias de repetición directa cortas (300 pb) que contienen los siguientes constructos de ADN enlazados operablemente:

- p35S3: un fragmento promotor de CaMV35S

- egf (corta): una primera parte de la secuencia codificante de eGFP que comprende un solapamiento de 300 pb con la secuencia de GFP nombrada subsiguientemente

-: un sitio de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI

-: un sitio de reconocimiento para la proteína de unión a ADN que contiene el dedo de Zn Zif268

- pCsVMV: un fragmento promotor del virus del mosaico de la avena del casabe

- hyg: una región codificante para resistencia a higromicina

- 3’35S: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 3’

- gfp (corta): la parte de 3’ de la secuencia codificante de eGFP, que comprende una repetición directa de secuencias de 300 pb de la porción de egf previa de este plásmido, y en la que la región codificante está enlazada traduccionalmente a una región que codifica un gen bar

- 3’nos: una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 3’ procedente del gen nopalina sintasa.

Este plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens, y la cepa resultante (A4330) se usó para generar plantas de tabaco transgénicas (G7NT001).

2. pTCV64: con secuencias de repetición directa largas ( 600 pb) que contienen los siguientes constructos de ADN enlazados operablemente:

- p35S3: un promotor de CaMV35S

- egf (larga): una primera parte de la secuencia codificante de eGFP que comprende un solapamiento de 600 pb con la secuencia de GFP nombrada subsiguientemente

-: un sitio de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI

- pCsVMV: un fragmento promotor del virus del mosaico de la avena del casabe

- hyg: una región codificante para resistencia a

higromicina

- gfp (larga): la parte de 3’ de la secuencia codificante de egfp, que comprende una repetición directa de secuencias de 600 pb del constructo de egf previo, y en la que la región codificante está enlazada traduccionalmente a una región que codifica un gen bar

Este plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens, y la cepa resultante (A4364) se usó para generar plantas de tabaco transgénicas (G7NT004).

3. pTCV72:

- pnos: un promotor de nopalina sintasa

- neo: región codificante de neomicina fosfotransferasa II

- 3’ocs: una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 3’ procedente del gen de octopina sintasa;

- pNTM19: un fragmento de promotor específico de microspora

- I-SceI: región codificante para la endonucleasa I-SceI

- 3’nos: una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 3’ procedente del transcrito de CaMV 35S.

Este plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens, y la cepa resultante (A4331) se usó para generar plantas de tabaco transgénicas (G7NT005).

A partir de tres líneas de tabaco transformadas de una sola copia independientes de cada G7NT001 y G7NT004, se han realizado cruzamientos con dos líneas transformadas de una sola copia independientes que comprenden el gen quimérico que codifica I-SceI bajo el control de un promotor específico de microspora (G7NT005) usando G7NT005 como la planta macho, con lo que las líneas descendientes se indican según lo siguiente:

G7NT001-0001 x G7NT005-0001 > 04TDNT000001 G7NT001-0002 x G7NT005-0001 > 04TDNT000002 G7NT001-0003 x G7NT005-0001 > 04TDNT000003 G7NT001-0001 x G7NT005-0002 > 04TDNT000004 G7NT001-0002 x G7NT005-0002 > 04TDNT000005 G7NT001-0003 x G7NT005-0002 > 04TDNT000006 G7NT004-0001 x G7NT005-0001 > 04TDNT000007 G7NT004-0002 x G7NT405-0001 > (sin descendencia) G7NT004-0003 x G7NT005-0001 > 04TDNT000012 G7NT004-0001 x G7NT005-0002 > 04TDNT000008 G7NT004-0002 x G7NT005-0002 > 04TDNT000010 G7NT004-0003 x G7NT005-0002 > 04TDNT000011

A partir de cada cruzamiento, se han sembrado 200 semillas en Km (200 mg/l), 200 semillas en Hyg (50 mg/l) y 200 semillas en Km (200 mg/l) + Hyg (50 mg/l), para comprobar la transmisión normal de transgenes. Hubo una transmisión bastante normal de los diferentes transgenes para la mayoría de los cruzamientos (obsérvese que, para algunos cruzamientos, se encontraron problemas de contaminación y problemas de calidad de las semillas (véase la siguiente tabla)):

Número de plantones resistentes al agente selectivo respec5 tivo

Línea: nº de plantones/50 semillas nº de plantones de KmR/200 semillas nº de plantones de HygR/200 semillas nº de plantones de KmR + HygR/200 semillas

G7NT001-0001x G7NT005-0001: 32 47/150 55 28/150

G7NT001-0001x G7NT005-0002: 32 29 51 15

G7NT001-0002x G7NT005-0001: 32 89 64 59

G7NT001-0002x G7NT005-0002: 46 69 94 42

G7NT001-0003x G7NT005-0001: 47 92 93 53

G7NT001-0003x G7NT005-0002: 48 88 85 47

G7NT004-0001x G7NT005-0001: 49 92 65/150 44

G7NT004-0002x G7NT005-0001: 47 73/150 89 34/150

G7NT004-0002x G7NT005-0002: 49 58/150 98 60

G7NT004-0003x G7NT005-0001: 39 63 69 50

G7NT004-0003x G7NT005-0002: 45 60 91 22

A partir de estos 12 cruzamientos, se transfirieron unas pocas plantas descendientes de KmR + HygR al invernadero para ser usadas como polinizadoras de plantas SR1 WT.

10 A partir de estos 12 cruzamientos, se han usado cada vez -36 tres plantas de KmR + HygR como polinizadoras de plantas SR1 WT según el siguiente esquema:

imagen1

5

A partir de cada descendencia de estos cruzamientos (véanse las siguientes tablas), se han sembrado 50 semillas en un sustrato no selectivo para determinar la frecuencia 10 de la germinación, 50 semillas en canamicina para determinar la tasa de transmisión del gen NTM19-I-SceI, y alrede

dor de 4000 semillas en PPT para determinar la frecuencia de IHR durante la transición de una generación a la otra. El número de plantones de PPTR que también son KmR determina si hay o no un efecto de inducción de DSB por la endonu

5 cleasa NTM19-I-SceI sobre la frecuencia de IHR durante la transición de una generación a la otra. Los resultados del análisis de la descendencia de 22 descendientes se resumen en las tablas A, B y C. Hay un efecto muy fuerte de NTM19-I-SceI sobre la

10 frecuencia de IHR durante la transición de una generación a la otra puesto que todos los plantones de PPTR son también KmR.

Se ha de señalar que una gran parte de los plantones de PPTR y GFPF no se desarrollaron posteriormente en plan15 tas y murieron debido al efecto tóxico de GFP.

Tabla A:

Cruzamiento: Frecuencia de germinación (n° de plantones/50 semillas) N° de plantones de KmR /50 semillas Plantones de PPTR y GFPF /n° de semillas N° de plantones de KmR/n° de plantones de PPTR y GFPF identificados para KmR

SR1x04TDNT000001-001 repetición corta: 43 24 77/4348 (1,77%) 5/5

SR1x04TDNT000001-002 repetición corta: 49 20 79/4835 (1,63%) 23/23

SR1x04TDNT000001-003 repetición corta: 47 22 98/4827 (2,03%) 27/27

SR1x04TDNT000002-001 repetición corta: 47 23 33/4762 (0,69%) 4/4

SR1x04TDNT000004-001 repetición corta: 49 30 123/4798 (2,6%) 36/36

SR1x04TDNT000004-002: 48 23 100/4745 32/32

-38

repetición corta: (2,1%)

SR1x04TDNT000004-003 repetición corta: 48 15 118/4665 (2,5%) 6/6

SR1 x04TDNT000005-001 repetición corta: 49 25 94/4665 (2,01%) 16/16

SR1x04TDNT000005-002 repetición corta: 48 20 47/4690 (1%) 7/7

SR1x04TDNT000005-003 repetición corta: 48 22 120/4658 (2,6%) 16/18 (¿2 S ó R?)

SR1x04TDNT000006-001 repetición corta: 47 28 136/4665 (2,9%) 24/24

SR1x04TDNT000006-003 repetición corta: 49 20 77/4650 (1,66%) 12/12

Tabla B:

Cruzamiento: Frecuencia de germinación (n° de plantones/50 semillas)* N° de plantones de KmR/50 semillas Plantones de HygR/50 semillas N° de plantones de KmR+HygR/100 semillas N° de plantones de PPTR y GFPF/n° de semillas ** N° de plantones de KmR /n° de plantones de PPTR y GFPF identificados para KmR

SR1x04TDNT000003001 repetición corta: 23 14 12 13 44/4973 (0,89%)** 33/33

SR1x04TDNT000003003 repetición corta: 20 16 11 16 46/4857 (0,95%)** 46/46

SR1x04TDNT000007001 repetición larga: 19 7 7 7 16/4915 (0,33%)** 16/16

SR1x04TDNT000008001 repetición larga: 28 17 12 12 33/4890 (0,7%)** 33/33

SR1x04TDNT000008003 repetición larga: 20 7 8 8 33/4840 (0,69%)** 33/33

SR1x04TDNT000012003 repetición larga: 16 10 9 9 14/4312 (0,32%)** 14/14

* Las descendencias mencionadas en esta tabla se sembraron en el mismo momento. Debido a una esterilización demasiado drástica con lejía, hubo una germinación mala e irregular

-39

(para la mayoría de las líneas <50%). ** Esto significa que el N° de plantones de PPTR y GFPF /N° de semillas es una subestimación con al menos un factor de 2 ya que la frecuencia de germinación es para la mayoría de las líneas menor que 50%

Tabla C:

SR1x04TDNT000002002 repetición corta: 50 20 26 9 7/1330 (0,5%) NT*

SR1x04TDNT000002003 repetición corta: 50 30 18 25 9/1355 (0,66%) NT*

SR1x04TDNT000003002 repetición corta: 50 20 21 25 24/1389 (1,7%) NT*

SR1x04TDNT000007003 repetición larga: 50 25 25 17 3/1346 (0,2%) NT*

*NT: no ensayado todavía

Además, todos los plantones de PPTR y GFPF son de hecho sensibles a higromicina, demostrando que el gen hyg se ha eliminado de hecho mediante recombinación intracromosómica en el locus de IHR.

Cruzamiento: N° de plantones de HygR/N° de plantones de PPTR y GFPF identificados para HygR

SR1x04TDNTT000012-003: 0/11

SR1x04TDNT000008-001: 0/12

SR1x04TDNT000008-003: 0/11

SR1x04TDNT000001-002: 0/8

SR1x04TDNT000005-003: 0/7

SR1x04TDNT000006-003: 0/7

Para el análisis de segregación de 18 poblaciones descendientes, se puede concluir que hay un efecto muy fuerte de NTM19-I-SceI sobre la frecuencia de IHR durante

5 la transición de una generación a la otra puesto que todos los plantones de PPTR son también KmR. La descendencia de un cruzamiento entre SR1 (hembra) y 04TDNT00000X-00Y se segregará normalmente en:

10 25% con sólo endonucleasa NTM19-ISceI 25% con sólo el constructo de IHR 25% tanto con endonucleasa NTM19-I-SceI + constructo de IHR 25% sin endonucleasa NTM19-I-SceI ni constructo de IHR

15 El hecho de que todos los plantones de PPTR sean también KmR muestra que todos los recombinantes de IHR se producen sólo en la fracción que contiene tanto la endonucleasa I-SceI bajo el control de un promotor específico de mi

20 crospora NTM19 así como también el constructo de IHR. Los resultados muestran que, en el mejor de los casos, hasta 11% de las microsporas que contienen tanto la endonucleasa NTM19-ISceI como el constructo de IHR han sufrido una re-combinación homóloga intracromosómica, dando como resultado

25 la restauración de un gen de fusión egfp-bar defectuoso (SR1x04TDNT000006-001). Puesto que no se obtuvieron recombinantes de IHR que dan como resultado un gen egfp-bar funcional en la fracción que contiene sólo el constructo de IHR, se puede concluir que no se produce la IHR espontánea (en ausencia de inducción de DSB seleccionada en las microsporas), o, si se produce la IHR espontánea, no da como resultado la restauración de un gen de fusión egfp-bar defectuoso. Por el contrario, la IHR inducida por DSB en las microsporas permite una recombinación homóloga intracromosómica más precisa, dando como resultado la restauración de un gen de fusión egfp-bar defectuoso.

El análisis de secuencias mostró que no se dejan huellas tras la eliminación del marcador seleccionable mediada por IHR inducida por DSB en las microsporas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer BioScience N.V. D’Halluin, Kathleen Ruiter, Rene

<120> Métodos y medios para eliminar una secuencia de ADN seleccionada

<130> BCS 05-2007

<150> EP05075781.4

<151> 04/04/2005

<150> US60/669.243

<151> 04/07/2005

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 732

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> región codificante de I-SceI sintética (UIPAC)

<220>

<221> variación

<222> (25)..(27)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (73)..(75)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (97)..(99)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (169)..(171)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (172)..(174)

<223> AGC <220>

<221> variación

<222> (175)..(177)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (268)..(270)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (289)..(291)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (436)..(438)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (490)..(492)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (502)..(504)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (523)..(525)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (565)..(567)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (631)..(633)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (637)..(639)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (712)..(714)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (715)..(717)

<223> AGC

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 732 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> región codificante de I-SceI sintética 10

<400> 2 <210> 3

imagen1

<211> 1618 5 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> señal TATA 10 <222> (919)..(922)

<220>

<221> ARNm

<222> (954)..(1573) 15

<220>

<221> gen

<222> (993)..(1271)

<223> NTM19

<220>

<221> misc_feature

<222> (993)..(1271)

<223> región codificante

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 4683

5: <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN T de pTCV63

10

<220>

<221> misc_feature

<222> (191)..(222)

<223> frontera derecha de ADN T

15

<220>

<221> misc_feature

<222> (270)..(818)

<223> región promotora de CaMV35S

20

<220>

<221> misc_feature

<222> (819)..(875)

<223> secuencia líder de Cab22

<220>

<221> misc_feature

<222> (885)..(1391)

<223> parte 5’ de la región codificante de eGFP

<220>

<221> misc_feature

<222> (1392)..(1409)

<223> sitio de reconocimiento de I-SceI

<220>

<221> misc_feature

<222> (1411)..(1419)

<223> sitio de reconocimiento de Zif268

<220>

<221> misc_feature

<222> (1433)..(1671)

<223> región de poliadenilación de 35S de 3’ (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1683)..(2708)

<223> región codificante de resistencia a higromicina (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (2715)..(2787)

<223> región líder de CsVMV (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (2788)..(3227)

<223> fragmento promotor de CsVMV (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3269)..(3787)

<223> parte de 3’ de eGFP

<220>

<221> misc_feature

<222> (3788)..(4339)

<223> región codificante de fosfinotricina acetiltransferasa

<220>

<221> misc_feature

<222> (4341)..(4549)

<223> 3’ nos: región de terminación de la transcripción y de poliadenilación

<220>

<221> misc_feature

<222> (4659)..(4683)

<223> frontera derecha de ADN T

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 4992

5: <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN T de pTCV64

10

<220>

<221> misc_feature

<222> (191)..(222)

<223> frontera derecha de ADN T

15

<220>

<221> misc_feature

<222> (270)..(818)

<223> fragmento promoter de CaMV35S

20

<220>

<221> misc_feature

<222> (819)..(875)

<223> fragmento líder de cab22

<220>

<221> misc_feature

<222> (885)..(1553)

<223> parte de 5’ de región codificante de eGFP

<220>

<221> misc_feature

<222> (1554)..(1571)

<223> sitio de reconocimiento de I-SceI

<220>

<221> misc_feature

<222> (1573)..(1581)

<223> sitio de reconocimiento de Zif268

<220>

<221> misc_feature

<222> (1595)..(1833)

<223> región de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 35S de 3’ (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1845)..(2870)

<223> región codificante de higromicina fosfotransferasa

<220> <221> misc_feature

<222> (2877)..(2949)

<223> líder de CsVMV (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (2950)..(3389)

<223> fragmento promotor de CsVMV (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3431)..(4096)

<223> parte de 3’ de región codificante de eGFP

<220>

<221> misc_feature

<222> (4097)..(4648)

<223> región codificante de fosfinotricina acetiltransferasa

<220>

<221> misc_feature

<222> (4650)..(4858)

<223> 3’nos: región de terminación de la transcripción y de poliadenilación del gen de nopalina sintasa

<220>

<221> misc_feature

<222> (4968)..(4992)

<223> secuencia de frontera izquierda de ADN T

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 3987 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN T de pTCV72 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (191)..(222)

<223> frontera derecha de ADN T <220>

<221> misc_feature

<222> (251)..(539)

<223> 3’ocs: región de terminación de la transcripción y de poliadenilación procedente de un gen de octopina sintasa (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (713)..(1510)

<223> región codificante de neomicina fosfotransferansa (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1511)..(1529)

<223> secuencia enlazadora

<220>

<221> misc_feature

<222> (1530)..(1816)

<223> fragmento promoter de nopalina sintasa (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1817)..(1929)

<223> secuencia enlazadora

<220>

<221> misc_feature

<222> (1941)..(2926)

<223> fragmento promotor procedente de gen NTM19 del tabaco

<220>

<221> misc_feature

<222> (2928)..(2961)

<223> señal de localización nuclear

<220>

<221> misc_feature

<222> (2962)..(3661)

<223> región codificante de I-SceI

<220>

<221> misc_feature

<222> (3665)..(3913)

<223> fragmento de terminación de la transcripción y de poliadenilación de 3’ de 35S

<220>

<221> misc_feature

<222> (3963)..(3987)

<223> región de frontera izquierda de ADN T

<400> 6

imagen1

Claims

1.-Un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una planta por una secuencia de ADN de interés, que comprende las siguientes etapas:

a.: inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado dicho sitio preseleccionado en dicha secuencia de ADN diana o en la vecindad de dicha secuencia de ADN diana;

b.: introducir una molécula de ADN de interés en dicha célula vegetal, comprendiendo dicha molécula de ADN

i. dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea dicha secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea dicho sitio preseleccionado en el genoma de dicha célula vegetal;

ii. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable

o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y otra copia de al menos parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa indicada como secuencia de ADN flanqueante parcial;

iii. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa;

c.: seleccionar una población de células vegetales que comprenden dicho marcador seleccionable o identificable;

d.: seleccionar una célula vegetal en la que dicho marcador seleccionable o identificable se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de dichas regiones de ADN flanqueantes, y regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal;

e.: cruzar dicha planta regenerada o una planta descendiente de esta última, que comprende dicho gen marcador seleccionable, con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima DSBI, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente:

iv.: un promotor específico de microspora;

v.: una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés;

vi. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

f.: seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende dicho gen marcador seleccionable o identificable y dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI;

g.: cruzar dicha planta descendiente con otra planta, con lo que dicha planta descendiente se usa como donante de polen;

h.: seleccionar una población de plantas descendientes

(población F2) que comprenden dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y

i. seleccionar una planta descendiente en la que dicho gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante recombinación homóloga entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes.

2.-El método de la reivindicación 1, en el que dicha primera ruptura bicatenaria en dicho sitio preseleccionado es inducida por introducción de una primera enzima inductora de DSBI, no reconociendo dicha primera enzima inductora de DSBI dicho sitio de reconocimiento para una enzima inductora de DSBI situada en dicho ADN de interés.

3.-El método de la reivindicación 2, en el que dicha primera enzima DSBI y dicha enzima DSBI que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés son dos enzimas DSBI diferentes seleccionadas del grupo de I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I o PI-Tsp I, o una endonucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN de dedo de Zn y un dominio de escisión de ADN.

4.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enzima inductora de DSB que reconoce dicho sitio de reconocimiento para una enzima inductora de DSBI situado en dicho ADN de interés es I-SceI.

5.-El método de la reivindicación 4, en el que dicha región de ADN que codifica dicha enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID No 1 o SEC ID No 2.

6.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho promotor específico de microspora comprende un promotor seleccionado de la secuencia nucleotídica de SEC ID No 3 o un fragmento funcional de la misma.

7.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho gen quimérico que codifica DSBI comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID No 6 del nucleótido 1941 a 3913.

8.- Un vector de ADN para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una célula vegetal por una secuencia de ADN de interés a través de la inducción de una ruptura bicatenaria en un sitio preseleccionado dentro de dicha secuencia diana o en su vecindad, comprendiendo dicho vector de ADN

a.: dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea a dicha secuencia de ADN diana y que flanquea a dicho sitio preseleccionado;

b.: un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes

situada en la repetición directa; y

c. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa.