TR201802544T4 - Önceden seçilmiş bir bölgede bir bitki genomunu modifiye için yöntemler ve araçlar. - Google Patents

Abstract

Emzim ve embriyojenik kallus içeren bir çift sarmallı DNA kırılma kullanan bir pamuk bitkisinin genomunu hedeflenen bir şekilde modifiye etmek için yöntem ve araçlar sağlanmıştır.

Description

TARIFNAME ÖNCEDEN SEÇILMIS BIR BÖLGEDE BIR BITKI GENOMUNU MODIFIYE içiN YÖNTEMLER VE ARAÇLAR BULUSUN SAHASI Bulus agronomi alani ile ilgilidir. Daha özel olarak, bulus, embriyojenik kallus kullanarak bir pamuk bitkisinin genomundaki kesin olarak lokalize bir nükleotid dizisinde, insersiyon, delesyon veya sübstitüsyon dahil olmak üzere hedeflenen bir modifikasyonun uygulanmasina yönelik yöntemler ve araçlar saglar. ÖNCEKI TEKNIK Yabanci DNA'nin bitkilerde entegrasyon konumu üzerindeki kontrol dahil olmak üzere bitki genomlarinda hedeflenen modifikasyonlarin yapilma ihtiyaci gittikçe önem kazanmistir ve bu ihtiyaci karsilamak için bir takim yöntemler gelistirilmistir (bir inceleme için bakiniz Kumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp155- enzim ekspresyonu vasitasiyla hedeflenen konumda bir çift sarmalli DNA kirilmasinin baslangiç girisine dayanmaktadir. l-Scel gibi ender kesici endonükleazlar vasitasiyla çift sarmalli DNA kirilmalarinin (DSB) indüklenmesi yoluyla hedef lokusun velveya onarim veya donör DNA'nin aktivasyonunun, çesitli büyüklük siralarla homolog rekombinasyon sikligini artirdigi 6, 93-102).

W096/14408, l-Scel enzimini kodlayan izole edilmis bir DNA'yi tarif eder. Bu DNA dizisi, klonlama ve ekspresyon vektörleri, transformasyona ugramis hücre çizgileri ve transgenik hayvanlara eklenebilir. Vektörler, gen haritalama ve genlerin bölgeye yönlendirilmis insersiyonunda yararlidir.

WOOO/46386, bir l-Scel indüklü çift sarmalli kirilma yoluyla bir hücredeki bir geni veya diger kromozomal DNA'yi modifiye etme, onarma, hafifletme ve etkisiz hale getirme yöntemlerini açiklamaktadir. Ayni zamanda, ihtiyaç duyan bir bireyde bir genetik hastaligin tedavisine veya profilaksisine yönelik yöntemler da açiklanmaktadir. Ayrica, kimerik kisitlama endonükleazlari açiklanmaktadir.

WO enzimleri ve gelistirilmis I-Scel kodlayan nükleotid dizilerini kullanan bitkilerde hedeflenen DNA insersiyonunu iyilestirmek için yöntem ve araçlari açiklamaktadir. dizisinin bitki hücrelerindeki ve bitkilerindeki kesin degisim için bir yöntemi tarif eder; burada seçici veya taranabilir belirteç, homolog rekombinasyon safhasinda, gen degistirme olaylarinin geçici seçimi için, bir ayak izi birakmadan ve bir DSBI nadir bölünen endonükleazin mikro gözenek spesifik ekspresyonu ile seçilmis bir DNA'nin çikarilmasi için burada açiklanan yöntemi kullanarak, çikarma adimi sirasinda in vitro kültürden yararlanmadan daha sonra çikarilabilir. etmekte olup, burada seçilen bir DNA fragmaninin çift sarmalli kirilmayi indükleyen nadir bir bölünme endonükleazi tarafindan indüklenen çikarma adimi, bir germ hattina özgü promotörün kontrolü altindadir. Yöntemin diger uygulamalari. onarici DNA'sinin bir ucunda homolog olmayan uç birlesmesine ve diger ucunda homolog varyantlarini, diger bir deyisle homolog rekombinasyon yoluyla ilgili bir DNA dizisi için bir hedef DNA dizisinin ökaryotik hücrelerdeki örnegin, bitki hücreleri kesin degisimini saglayan yöntemleri açiklar; burada kullanilan gen degistirme olaylarinin geçici seçimi için homolog rekombinasyon asamasi sirasinda seçilebilir veya taranabilir belirteç, daha sonra, dogrudan tekrarlarda iki nükleotid dizisi ile bitisik seçilmis bir DNA'nin çikarilmasi için bir yöntem kullanarak bir ayak izi birakmadan çikarilabilir. kromozomal DNA'sindan nükleik asit dizilerini çikarmak için bir yöntemi açiklar. Bulus ayni zamanda söz konusu sistemleri içeren veya söz konusu yöntemle üretilen transgenik organizmalara (tercihen bitkiler) iliskindir. genomundan elimine etmek için yöntemleri açiklamaktadir. Özellikle, bulus, maydanoz ubikitin promotörünü içeren ve bir diziye özgü DNA-endonükleazi kodlayan bir nükleik asit dizisine islevsel olarak bagli bir ekspresyon kasetinin kullanilmasina dayanmaktad ir. monokot bitki hücresinin ve bir monokot bitkisinin genomunun degistirilmesi amaciyla çift sarmal kirilma indükleyici ajan içeren bir monokot bitki veya bitki hücresi genomik dizisini degistirmek için yöntem ve bilesimleri açiklamaktadir. yöntemlerini ve Agrobacterium aracili transformasyonunu tarif etmektedir. destek olarak filtrelerin membranlarini kullanan süspansiyon kültürlü hücrelere veya kalluslara Agrobacterium aracili T-DNA konjügasyonu yoluyla yüksek verimli bitki transformasyonu için yöntemler açiklanmaktadir. maddesinin eksizyonuyla ilgilidir. Doku hazirlama, depolama, transformasyon ve transformasyona ugramis bitkilerin seçimi veya tanimlanmasi için yöntemler, transforme edilebilir meristem dokulari ve bu türlü yöntemlerle üretilen bitkiler ve doku hazirlama uygulamalari açiklanmaktadir.

Bir DSBI enzimi kullanilarak genom mühendisligi yöntemleri, tütün (bakiniz örnegin 2009). Bununla birlikte, bitkilerde, pamuk gibi doku kültürü ve transformasyonunda daha belirgin olan hedeflenen genom modifikasyonu için yöntemlerin gelistirilmesine halen ihtiyaç duyulmaktadir. Bu bulus, bir endonükleazin tek basina veya çift sarmalli DNA kirilma onarimi için bir sablon olarak kullanilacak olan bir onarici DNA'si ile kombinasyon halinde uygulanmasi için pamuk embriyojenik kallus kullanilarak bu türlü yöntemlerin saglanmasi ile teknige katki saglamaktadir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Birinci uygulamada, bulus, önceden belirlenmis bir konumdaki pamuk bitki hücresinin genomunun modifiye edilmesi için bir yöntem sunmaktadir bu yöntem asagidaki adimlari içermektedir a. söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yakininda veya içinde bir tanima dizisini taniyan nadir bölünen bir endonükleaz enziminin söz konusu hücresine eklenmesi yoluyla indüklenen söz konusu çift sarmalli kirilmanin söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yakininda veya içinde bir çift sarmalli DNA kirilmasinin indüklenmesi; b. söz konusu çift sarmalli DNA kirilmasinin onarildigi, söz konusu önceden seçilen bölgede genomda bir modifikasyon ile sonuçlanan bir bitki hücresi seçilmesi, burada söz konusu modifikasyon, i. en az bir nükleotidin degistirilmesi; ii. en az bir nükleotidin delesyonu; iii. en az bir nükleotidin insersiyonu; veya iv. i. - iii'ün herhangi bir kombinasyonudur; karakterize edici özelligi, söz konusu hücrenin kirilgan embriyojenik kallustan olusmasidir, burada söz konusu kirilgan embriyojenik kallus los isik kosullari altinda ve aktif karbon ihtiva eden ortamda muhafaza edilmistir.

Bir uygulamada endonükleaz enzimi, söz konusu endonükleaz enzimini kodlayan bir DNA molekülünün söz konusu hücreye gönderilmesiyle söz konusu hücre içine eklenebilir.

Baska bir uygulamada adim b'den önce. söz konusu yabanci onarici DNA molekülü söz konusu hücre Içine gönderilir, söz konusu yabanci onarici DNA molekülü çift sarmalli DNA kirilmasinin onarimi için bir sablon olarak kullanilir.

Spesifik bir uygulamada embriyojenik kallus, hipokotil eksplantlardan indüklenir.

Embriyojenik kallus, aktif karbon ihtiva eden ortam üzerinde indüklenebilir. Söz konusu endonükleaz enziminin söz konusu eklenmesi öncesinde, sirasinda ve sonrasinda embriyojenik kallus, hormonsuz ortamda inkübe edilebilir. Kallusi söz konusu endonükleaz enziminin söz konusu eklenmesinden önce ve sonra kati ortamda inkübe edilebilir. Ayrica, endonükleaz enziminin söz konusu eklenmesi sirasinda veya sonrasinda, embriyojenik kallus, seçici olmayan bir ortamda 1 ila 4 gün inkübe edilebilir.

Bir uygulamada DNA ve/veya yabanci onarici DNA'yi kodlayan endonükleaz enzimi, parçacik bombardimani ile embriyojenik kallusun hücrelerine gönderilir. Bombardiman, yaklasik 0.5 pmol yabanci onarici DNA ve/veya yaklasik 0.5 pmol endonükleaz kodlayan DNA ile gerçeklestirilebilir. Bombardimandan önce, embriyojenik kallus, yaklasik 2 ila yaklasik 20 saat boyunca 0.2M manitol ve 0.2M sorbitolden olusan bir ortam içerisinde inkübe edilebilir. Ayrica söz konusu endonükleaz enziminin söz konusu eklenmesi sirasinda veya sonrasinda, embriyojenik kallus, 0.2 M manitol içeren seçici olmayan bir ortamda 1 ila 4 gün inkübe edilebilir.

Baska bir uygulamada DNA ve/veya yabanci onarici DNA'yi kodlayan endonükleaz enzim, Agrobacterium aracili transformasyon kullanilarak embriyojenik kallusun hücresine verilir. Agrobacterium aracili DNA transferi, kallusun 100 uM asetosiringon ve/veya 100 mg/l L-sistein içeren bir ortamda yaklasik üç gün süreyle DNA molekül(lerini) içeren Agrobacterium sus(lar) ile birlikte kültürlenmesi ile gerçeklestirilebilir. Transformasyondan sonra, kalluslar 250mg/L veya 125mg/L triasilin içeren bir ortamda inkübe edilebilir. Özel bir uygulamada, yabanci onarici DNA, söz konusu yukari veya asagi yönde DNA bölgesi ile rekombinasyon saglamak için söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari veya asagi yönde DNA bölgesinde yeterli homologluga sahip en az bir bitisik nükleotit dizisi içerir. Yabanci onarici DNA, söz konusu yabanci DNA'nin zit uçlarinda yer alan iki bitisik nükleotit dizisi içerebilir, söz konusu bitisik nükleotid dizisinden biri söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari yönde DNA bölgesinde yeterli homolojiye sahiptir, diger bitisik nükleotid dizisi, söz konusu bitisik nükleotid dizileri ile söz konusu yukari ve asagi yönde DNA bölgeleri arasinda rekombinasyona olanak tanimak üzere söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin asagi yönde dizisi ile yeterli homolojiye sahiptir. Yabanci onarici DNA ayrica seçilebilir bir belirteç geni ve/veya ilgili bitki eksprese edilebilir bir geni içerebilir. Ilgili bitki eksprese edilebilen gen, bir herbisit tolerans geni, bir böcek direnç geni, bir hastalik direnç geni, bir abiyotik stres direnç geni, yag biyosentezinde veya karbonhidrat biyosentezinde rol oynayan bir enzimi kodlayan bir gen, bir gen kodlayan gen lif kuvveti veya lif uzunlugunda yer alan bir enzim, sekonder metabolitlerin biyosentezinde rol oynayan bir enzimi kodlayan bir gen arasindan seçilebilir.

Baska bir uygulamada, yabanci DNA iki bitisik nükleotid dizisinden olusur, söz konusu bitisik nükleotid dizilerinden biri söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari yönde DNA bölgesine yeterli homolojiye sahiptir, diger bitisik nükleotid dizisi, söz konusu bitisik nükleotid dizileri ile söz konusu yukari ve asagi DNA bölgeleri arasinda rekombinasyona olanak tanimak üzere söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin asagi yönde dizisi ile yeterli homolojiye sahiptir.

Yine baska bir uygulamada önceden seçilen bölge, birbirleriyle rekombinasyon için yeterli homolojiye sahip iki bölge ile bitisiktir.

Bulus ayrica, yukarida tarif edildigi gibi embriyojenik kallus kullanilarak bir pamuk bitki hücresinin genomunun önceden tanimlanmis bir bölgede modifiye edilmesi için yöntemler sunmaktadir, burada söz konusu pamuk bitki hücresi bir pamuk bitkisine rejenere edilir. Bu sekilde üretilen pamuk bitkisi baska bir bitki ile ayrica çaprazlanabilir.

Ayrica, yukarida açiklanan yöntemlerden herhangi biriyle elde edilen, genomun önceden tanimlanmis bir bölgesinde bir modifikasyon içeren bir pamuk bitki hücresi ve bunun yani sira, bir genomun önceden tanimlanmis bir bölgesinde bir modifikasyon içeren bir pamuk bitkisi veya bu bitkinin elyafi veya tohum veya üreme maddesi saglanmaktadir.

Bulus, bundan baska, yukarida tarif edildigi gibi bir pamuk bitkisinin yetistirilmesi için bir yöntemle ilgilidir; bu yöntem ayrica, söz konusu bitkiye veya substrata bir kimyasal madde uygulama adimini içermektedir, burada söz konusu bitki yetistirilmektedir, ayrica genomun önceden tanimlanmis bir bölgesinde bir modifikasyon içeren bir bitki üretmek için bir yöntem ile ilgilidir, yukarida tarif edildigi gibi esas olarak bitki hücrelerinden veya yukarida tarif edildigi gibi diger bir bitki ile veya kendisi ile ve istege bagli olarak hasat edilen tohumlar ile bir bitkiyi çaprazlama adimini içeren bir yöntem SEKIL AÇIKLAMALARI Sekil 1: En az bir tarafli homolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen insersiyon/degistirmenin sematik görünümü. Makaslar DSBI enzimleri (l-Scel) için tanima bölgelerini, blok oklar promotörleri, P3 ve P4 oklari primerleri, çapraz ve noktali çapraz hedef yapi pTCV117 ile onarici DNA pTlBS23 arasindaki potansiyel homolog rekombinasyonu temsil etmektedir. Higromisin direnci (hng) ve glifosat duyarliligi (glyphS) için seçim yaptiktan sonra iki olay grubu ortaya çikabilir; (Il) ya (Il) higromisin direnci kazandiran onarici DNA, rastgele bir bölgede genoma entegre edilir ve hedef lokustaki EPSPS geni, 358 promotörün ilk (sol) I-Scel bölgesindeki çift sarmalli DNA kirilma indüksiyonu ile çift yönlü kontrolünden çikarilir, bu durumda P3 x P4 primerleri ile PCR amplifikasyonu bir PCR ürünü ile sonuçlanmaz veya (l) hedef lokustaki EPSPS geni, onarici DNA'nin 3'EPSPS fragmani ile homolog rekombinasyon yoluyla kesilir, burada higromisin direnç geni hedef Iokusunda yer alir ve diger ucunda I-Scel bölgelerinin hangisinin kullanildigina (seritli desenle gösterilir) bagli olarak çesitli senaryolar mümkündür, her durumda bölgeye amplifiye edilecek P3 ve P4 primerleri arasinda bir bölgeye olanak saglanir.

Sekil 2: Homolog olmayan uç birlesmesi yoluyla hedeflenen insersiyon/degistirmenin sematik görünümü. Higromisin direnci için seçim, onarici DNA pTIBZ36'nin genom içine rasgele entegrasyonuna neden olabilir, böylece P3 X P4 ve P1 x P2 primerleri ile PCR amplifikasyonu, bir PCR ürünü ile sonuçlanmaz veya (l-lll) l-Scel bölgelerinin hangisinin kullanildigina bagli olarak onarici DNA`nin DSBI (I ve III) bölgesine insersiyonu veya onarici DNA (II) ile BAR geninin degistirilmesi ile çesitli uzunluklarda P3 X P4 ve P1 x P2 primerlerine sahip PCR ürünleri elde edilir.

BULUSUN FARKLI UYGULAMALARININ DETAYLI AÇIKLAMASI Bulus sahipleri, çift sarmalli DNA kirilma indüksiyonu yoluyla pamukta hedeflenen genom modifikasyonunun, bir çift sarmalli kirilma Indükleyici (DSBI) enzim, örnegin bu türlü bir enzimi kodlayan bir DNA molekülünü ve istege bagli olarak, çift sarmalli DNA kirilmasinin onarimi için bir sablon olarak islev gören bir DNA molekülünün eklenmesi yoluyla, örnegin dogrudan DNA transfer yöntemleri (parçacik bombardimani) veya Agrobacterium aracili DNA iletimi yoluyla kirilabilir embriyogenik kallus kullanarak verimli olarak gerçeklestirebilir. Bu gönderme prosedürlerini kirilabilir embriyojenik kallus halinde kullanarak, hedeflenen insersiyonlar, degistirmeler ve delesyonlar, bir pamuk bitkisinin çekirdek genomunda çift sarmalli kirilma indüksiyonu bölgesi çevresinde yapilabilir.

Burada kullanildigi sekliyle, nadir bölünen bir endonükleaz, "tanima bölgesi" veya indükleyebilen enzimdir, diger bir deyisle bölge spesifik endonükleazlardir. Bunlar dolayi, daha büyük bitki genomlarinda bile çok düsük bölünme frekansina sahiptirler, örnegin, hedef genomda 20x'den az, 10x'den az, 5x'den az veya sadece bir kez kesilirler. Nadir bölünen çift sarmalli DNA kirilma indükleyici (DSBI) enzimler, tanima alanina çift sarmalli bir DNA kirilmasini (DSB) indükleyen nadir bölünen endonükleazlardir. Homing endonükleazlari, bazen meganükleazlar olarak da adlandirilirlar, bu tür nadir bölünen endonükleazlarin bir ailesini olustururlar. Bunlar intronlar, bagimsiz genler veya ara diziler tarafindan kodlanmis olabilir ve daha klasik restriksiyon enzimlerinden, genellikle Tip II bakteriyel restriksiyon modifikasyon sistemlerinden kendilerini ayiran çarpici yapisal ve islevsel özellikler sunar. Bunlarin tanima bölgeleri, çogu restriksiyon enzimi tanima bölgelerinin karakteristik ikili simetrisinin tersine genel bir asimetriye sahiptir. Intronlar veya inteinler tarafindan kodlanan birkaç homing endonükleazi, ilgili genetik unsurlarinin, alelik intronsuz veya inteinsiz bölgelerde homing edilmesini tesvik ettigi gösterilmistir. Intronsuz veya inteinsiz allellerde bu nükleazlar bir bölge spesifik çift sarmalli kirilma yaparak, rekombinanjik uçlar olusturur; bunlar, kodlama dizisini kopyalar ve DNA düzeyinde bir intronun veya ara bir dizinin eklenmesine yol açan bir gen transformasyon islemine Iyi karakterize edilmis bir homing endonükleaz I-Scel'dir. I-Scel, Saccharomyces cerevi'sea'daki mitokondriyumda intronun hareketliliginden sorumlu bölgeye özgü endonükleazdir. Enzim, 218 rRNA geninin istege bagli intron SC LSU.1 tarafindan kodlanir ve 3'OH çikintilari ile 4 bp'lik kademeli bir kesim üreten intron insersiyon bölgesinde çift sarmalli bir DNA kirilmasi baslatir. I-Scel endonükleazin tanima bölgesi, 18 bp'lik bir simetrik olmayan dizinin üzerinde uzanir (Colleaux et al., 1988 Proc. Natl. ayrica halen islevsel olan I-Scel proteininin bir dizi varyanti açiklar.

PCT basvurusu PCT/EP04/013122 (buraya referans olarak dahil edilmistir) bitkilerde ekspresyon için optimize edilmis olan I-Scel sentetik nükleotid dizi varyantlarini temin etmektedir. Bu tür sentetik I-Scel kodlayan bölgelerin nükleotid dizisi, UIPAC kodunda SEQ ID No 1'de verilmektedir. UIPAC kodunun sembolleri normal anlamlarina sahiptir, diger bir deyisle N=A veya C veya G veya T; R=A veya G;Y=C veya T; B: C veya G veya T (A degil); V= A veya C veya G (T degil); D=A veya G veya T (C degil); H=A veya C veya T (G degil); K= G veya T; M: A veya C; 8: G veya C; W=A veya T.

Diger nadir bulunan bölünme DSBI enzimlerinin ve bunlarin ilgili tanima bölgelerinin bir Ceu l, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU l, PI-Dhal, PI-Dra I, PI- Mav I, PI-Mch l, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle l, PI- Mma I, PI-lVIsh I, PI-Msm I, PI-Mth I, Pl-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI- Spb i, PI-Ssp i, PI-Fac i, PI-Mja i, PI-Pho i, PI-Tag i, Pl-Thy i, PI-Tko i veya PI-Tsp i Ayrica, temelde seçilecek herhangi bir hedef nükleotid dizisini taniyan, özel olarak hazirlanmis nadir bölünme endonükleazlari tasarlamak için yöntemler mevcuttur.

Kisaca, kimerik restriksiyon enzimleri, belirli bir nükleotid dizisini tanimlamak üzere tasarlanmis bir çinko-parmak bölgesi ile dogal bir restriksiyon enzimi olan Fokl gibi spesifik olmayan DNA bölünme bölgesi arasindaki hibridleri kullanarak hazirlanabilir.

Bu gibi enzimlere genel olarak çinko parmak endonükleazlari (ZFE'ler) olarak kütüphanesinden seçerek özel olarak yapilan nadir bölünme endonükleazlari veya Degistirilmis dizi özelligi ve DNA-baglama afinitesi ile özel olarak yapilan edilebilir. Özel olarak tasarlanan nadir bölünme endonükleazlarin bir baska örnegi, örnegin FOKI katalitik alanina kaynastirilmis Xanthomonas bakteri cinsinden transkripsiyon aktivatör benzeri efektörlere (TALE'Ier) dayanan TALE olarak bilinen nükleazlari kapsar. Bu TALE'Ierin DNA baglanma spesifitesi, spesifik hedef dizilerini tanimak için modifiye edilebilen, tandem-düzenlenmis 34/35-amino asit tekrar birimlerinin tekrar degisken direzidüler (RVD'leri) ile tanimlanir (Christian et al., 2010, olarak tasarlanmis nadir bölünme endonükleazlarina, dogal olarak olusmayan endonükleazlar denir.

Yeniden tasarlanan meganükleazlar dogal olarak olusan endonükleazlardan türetildiginden, mevcut potansiyel tanima bölgeleri tamamen rastgele degil, yeniden tasarlanan meganükleazlarin dayandigi dogal olarak olusan endonükleaz tarafindan orijinal olarak tanimlanan nükleotid dizisine benzerlik göstermektedirler. Gao et al. (2010, The Plant Journal, pp 1-11) tarafindan belirtildigi gibi, l-Crel'in DNA-baglama özelliklerini degistirmek için yapi temelli protein tasarim yöntemi, l-CreI-DNA ortak- kristal yapida, tanima bölgesindeki belirli konumlarda I-Crel baz tercihini degistiren çok sayida amino asit sübstitisyonunun öngörülmesine yol açmaktadir. Bireysel amino asit sübstitisyonlari deneysel olarak degerlendirilmistir ve baz tercihinde istenen degisikligi kazandiranlar, yüksek derecede farkli DNA bölgelerini taniyan I-Crel türevlerini üretmek için "karisik ve eslesen" mutasyonlardan olusan bir veri tabanina eklenmistir. Teorik olarak, mevcut mutasyon veri tabani kullanilarak mevcut olan kombinasyonel çesitlilik, rastgele bir DNA dizisinde yaklasik 1000 bp'lik bir mühendislik endonükleazini hedeflemek için yeterlidir.

Yeniden tasarlanan meganükleazlar, bir yapi iskelesi olarak kullanilmak üzere dogal olarak bulunan meganükleaz l-Crel'e dayanabilir. I-Crel, Chlarnydomonas rheinhardtfnin kloroplastlarinda bulunan bir homing endonükleazdir (Thompson et al. 22 hp DNA bölgesini taniyan ve bir intronun uygulanmasi için kullanilan çift sarmalli bir DNA kirilmasi yaratan bir homodimerdir. l-Crel, tek bir LAGLIDADG motifi tasiyan endonükleazlardan bir grubun üyesidir. LAGLlDADG enzimleri, konsensüs motifinin bir veya iki kopyasini içerir. l-Crel gibi tek motifli enzimler, homodimerler olarak islev görürken, çift motifli enzimler, iki ayri alanina sahip olan monomerlerdir. Buna göre, bir tanimasi için yeniden tasarlarken, her biri 22 bp'lik tanima alaninin bir bölümünü taniyan iki monomerik birim tasarlanir; bunlarin bir çift 22 hp tanima bölgesinde bir çift Birlikte hareket eden eylem, iki monomerik birimi bir tek Zincirli meganükleaz ile olusumunu tesvik ederek elde edilebilir. Bu gibi özel olarak tasarlanmis (yayinlanmamis) tarif edilmistir.

Dolayisiyla, bu türlü dimerik endonükleazlarin birlikte hareket etmesi için, alt birimler, genomda önceden seçilen bölgede çift sarmalli bir kirilma meydana getirebilmek için dimerize edilmelidir. Gelistirilmis birlikte gelistirilmis eylem, iki monomerik birimi bir tek tarif edildigi gibi heterodimerler olusumunu tesvik ederek de basarilabilir.

Hücrelere/dokulara DNA'nin iletilmesi için teknikte çesitli yöntemler bilinmektedir ve burada referans olarak zikredilen U.S. Pat. No. 5,384,253'de gösterildigi gibi gibi Agrobacterium-aracili transformasyon, U.S. Patent No. 5,508,184'te gösterildigi gibi protoplast transformasyon, elektroporasyon, kimyasal yardimli transformasyon, lipozom aracili transformasyon (bakiniz örnegin A. Deshayes et al. (1985) EMBO J. 4: 2731-7), karbon lifi, silikon karbid lif veya alüminyum borat lifi (genel olarak killar olarak viral aracili transformasyon (bakiniz, örnegin, SB Gelvin, (2005) Net Biotechnol, 23: 684-5), parçaciklara yapismis heterolog yabanci DNA ile bitki hücrelerinin bombardimani, balistik parçacik ivmesi, aerosol isin transformasyonu (US Patent transformasyonu, PEG transformasyonu ve çesitli diger parçacikli olmayan dogrudan- aracili DNA aktarma yöntemlerini içerir.

Bulusa göre hedeflenen genom modifikasyonu için pamuk hücrelerinin hedeflenmis genom modifikasyonu, embriyojenik kallus, tercihen kirilabilir kallus üzerinde yapilir. kümelerinin, bitki dokusu kültürünün bir sonucu olarak daginik olmayan bir kütlesine karsilik gelir. Kirilabilir kallus, kirilabilir dokularla sürgünler ve kökler olusturma potansiyeli tasiyan ve sonuç olarak tüm bitkilere rejenere edilen kallus anlamina gelir.

Bu türlü kallus ayrica, papagan-yesili/kremsi renk, sivi ortamda kolaylikla daginik hücre yigmalari ve nodüler bir sekil ile ayirt edilebilir. Dolayisiyla, burada kullanildigi sekliyle kendisi, diger bir deyisle bu hücrenin kallus dokusunun bir parçasi oldugu anlamina Kallus, hipokotil, kotiledon, olgunlasmamis zigot embriyolar, yapraklar, anterler, yapraklar, ovüller, kökler ve meristemler, kök hücreler ve yapraklari gibi çesitli doku eksplantlarindan rejenere edilebilir/indüklenebilir. Bu bulusun bir uygulamasinda eksplant, hipokotil veya kotiledondan alinir. Bir uygulamada embriyojenik kallus indüksiyonu, eksplantlarin yaklasik 2 ila 4 ay, tercihen 4 ay boyunca aktif karbon içeren ortamda inkübe edilmesi veya en azindan los isik kosullarinda embriyojenik kallus olusana kadar gerçeklestirilir.

Bir uygulamada kallus, kallus rejenerasyonu, DNA transferi ve daha sonra seçme ve rejenerasyon prosedürü boyunca hormonsuz ortamda muhafaza edilir. Burada kullanilan sekliyle hormonlar, oksinler, örnegin 2.4-D ve sitokininler (örnegin Kin) gibi bitki hormonlari ile ilgilidir. Bir uygulamada hücreler, tüm prosedür boyunca kati ortamda tutulur.

Baska bir uygulamada, DNA iletildikten sonra kalluslar, seçici olmayan bir ortamda, diger bir deyisle, bir seçim bilesigi içermeyen bir ortamda 1-4 gün boyunca, tercihen 3 gün boyunca muhafaza edilir. Seçici olmayan ortam, M100 alt katmaninin bilesenlerini içerebilir. Seçici olmayan ortamda 1-4 gün sonra, kalluslar, M100 substratinin bilesenleri ve bir seçim bileseni içerebilen bir ortama aktarilabilir. Transformasyondan sonra bir seçim bilesigi kullanmak, seçme bilesigine tolerans veren seçilebilir bir belirteç geni içeren bir onarici DNA'nin birlikte verilmesi durumunda hedeflenen rekombinasyon olaylarinin zenginlestirilmesine olanak tanir. Embriyogenik kallus seçildikten sonra, embriyo indüksiyonu ve embriyo çimlenmesi, M104 substratinin ve aktif karbonun bilesenlerini içerebilen seçici bir ortam üzerinde gerçeklesebilir. Diger embriyo gelisimi, M702 substrat bilesenlerini içerebilen seçici olmayan bir substrat üzerinde gerçeklesebilir ve bitki rejenerasyonu, M700 substrat bilesenleri içeren ortam üzerinde gerçeklesebilir. Çesitli substratlarin bilesenleri asagida tarif edilmektedir.

Burada kullanildigi haliyle, DNA iletimi, bir veya daha fazla DNA molekülünün bir hücre içine dahil edilmesi anlamina gelmektedir. Bu hem istikrarli transfeksiyona, hem de dahil edilen DNA molekülünün konakçi hücrenin genomuna istikrarli bir sekilde entegre edilmesine ve ayni zamanda bu moleküllerin hücrede geçici varligina iliskindir. Bulusun yöntemlerini gerçeklestirmek için hücrelerin, endonükleaz kodlayan DNA ile kararli bir sekilde transformasyona tabi tutulmasi gerekmemekle birlikte, endonükleazin geçici ekspresyonu, DNA çift sarmalli kirilmayi baslatmak için yeterli olabilir.

Hücrelere/dokulara DNA'nin iletilmesi için teknikte çesitli yöntemler bilinmektedir ve burada referans olarak zikredilen U.S. Pat. No. 5,384,253'de gösterildigi gibi gösterildigi gibi Agrobacterium-aracili transformasyon, U.S. Patent No. 5,508,184'te gösterildigi gibi protoplast transformasyon, elektroporasyon, kimyasal yardimli transformasyon, lipozom aracili transformasyon (bakiniz örnegin A. Deshayes et al. (, karbon lifi, silikon karbid lif veya alüminyum borat lifi (genel olarak killar olarak adlandirilir) (bakiniz örnegin J. Brisibe, Exp. Bot 51 (343): Biotechnol, 23: 684-5), parçaciklara yapismis heterolog yabanci DNA ile bitki hücrelerinin bombardimani, balistik parçacik ivmesi, aerosol isin transformasyonu (US transformasyonu, PEG transformasyonu ve çesitli diger parçacikli olmayan dogrudan- aracili DNA aktarma yöntemlerini içerir.

Spesifik bir uygulamada bulusa uygun pamuk hücrelerini içeren kallus içine DNA verilmesi, parçacik bombardimani gibi dogrudan DNA transfer yöntemleriyle gerçeklesti rilir.

Bir uygulamada parçacik bombardimani öncesinde, kalluslar, manitol ve sorbitol içeren ortamda yaklasik 2 ila yaklasik 20 saat, tercihen yaklasik 2 ila 4 saat boyunca önceden plazmolize edilir.

Baska bir spesifik uygulamada, DNA'nin bulusa göre pamuk hücrelerine iletilmesi Agrobacterium aracili transformasyon ile gerçeklestirilir. Bir uygulamada embriyojenik kalluslar, pamuk hücrelerine dahil edilecek DNA ihtiva eden bir Agrobacterium susuyla temas ettirilir ve bundan sonra kalluslar yaklasik 3 gün boyunca karanlikta asetosiringon ve L-sistein içeren ortamda Agrobacterium susuyla birlikte kültive edilir.

Bir baska uygulamada, birlikte-kültive edildikten sonra, transformasyona ugramis embriyojenik kallus, ayrica triasilin içeren bir seçim ortami üzerinde (diger bir deyisle, bir veya daha çok seçme bilesigi ihtiva eden) seçilmektedir.

DNA ve yabanci onarici DNA'yi kodlayan endonükleazin ayni veya farkli iletim yöntemleri kullanilarak sirayla (veya ters sirayla) hücreye veya dokuya (örnegin, kallus) birlikte iletilebilecegi veya bunlarin eszamanli olarak birlikte iletilebilecegi anlasilacaktir, örnegin yabanci onarici DNA ve DNA kodlayan endonükleaz ayni karisim içerisinde veya hatta ayni molekül içinde bulunur.

NLS'si gibi bir nükleer Iokalizasyon sinyalini (NLS) (Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627- 1632 (1992) ve buradaki referanslari) Içerebilir ancak bu gerekli degildir. Nükleer ucunda elverisli bir sekilde bulunur. Nükleer lokalizasyon sinyali, çift sarmalli kirilma indükleyici enzimin bir veya daha fazla amino asidinin yerini alabilir. Önceden seçilmis bir bölgede bir çift sarmalli kirilmanin indüksiyonu birkaç potansiyel uygulamaya izin verir. Herhangi bir yabanci onarici DNA'sinin verilmemesi dahil edilmemesi durumunda, endonükleaz tanima bölgesi yakinindaki DNA bölgesi, bir veya daha çok sayida nükleotide delesyon, degistirme veya insersiyon ile degistirilebilir. Bu yolla, önceden seçilen bölgede daha küçük veya daha büyük delesyon veya insersiyonlarin olusturulmasi, örnegin, önceden seçilen bölge/tanima bölgesinin tanimlama bölgesinin yukari ve asagi yönünde yer alan genomik DNA bölgeleri, yukari ve asagi yöndeki DNA bölgesi arasindaki rekombinasyona olanak saglamak için birbirlerine yeterli homolojiye sahiplerse, aradaki DNA bölgesi, diger bir deyisle iki homolog yukari ve asagi yöndeki DNA arasindaki DNA bölgesi bölge silinmis olabilir (devre tamamlanmistir). Bu, örnegin belirteç genler gibi önceden dahil edilen dizileri, örnegin; WO 06/105946'da anlatilan yöntemdeki gibi ortadan kaldirmak için kullanilir. Çift sarmalli DNA kirilma indüksiyonuna, sablon olarak kullanilan yabanci bir onarici DNA molekülünün girisi eslik ederse, çift sarmalli kirilma onarimi temel olarak üç sekilde olusabilmektedir. Onarici DNA, DSB bölgesindeki genomik DNA'ya her iki uçta homolog olmayan uç birlestirme yoluyla entegre edilebilir veya onarici DNA`da önceden seçilen bölgenin yukari ve/veya asagi bölgelerinde homoloji içeren bir veya iki bitisik bölge varsa, onarici DNA'nin entegrasyonu da (kismen) homolog rekombinasyon yoluyla gerçeklesebilir. Bu sekilde, önceden seçilen bölgedeki çift sarmalli kirilma, söz konusu DNA bölgesi için ilgili bir DNA bölgesinin yakininda örnegin WO 06/105946, degistirmesini kolaylastiracaktir. Önceden seçilen bölgede homolog rekombinasyon ile yabanci bir DNA insert etmek için yabanci DNA, önceden seçilen bölgenin yukari yönünde veya asagi yönünde DNA bölgesinin nükleotid dizisine benzer bir nükleotid dizisine sahip en az bir bitisik DNA bölgesini içerebilir. Yabanci DNA ayrica, molekülün karsit uçlarinda yer alan ve söz konusu bitisik bölgeler ve söz konusu yukari yön ve asagi yön bölgesi arasinda rekombinasyon saglamak Için önceden seçilen bölgenin yukari ve asagi yönünde DNA bölgesinin nükleotid dizisi için yeterli homologluga sahip olan iki bitisik DNA bölgesinden olusabilir.

Burada kullanildigi sekliyle "önceden seçilmis bir bölge" veya "önceden tanimlanmis belirli bir nükleotid dizisini belirtir; bu konumda, yabanci DNA'nin insersiyonu veya hedef DNA dizisinin degistirilmesi arzu edilir. Teknikte uzman bir kisi, seçilen hedef nükleotid dizisini taniyan veya bu türlü bir DSBI endonükleazini üreten bir çift sarmalli DNA kirilma indükleyioi ("DSBI") enzim seçebilir. Alternatif olarak, bir DSBI endonükleaz tanima bölgesi, herhangi bir geleneksel transformasyon yöntemi kullanilarak veya genomunda bir DSBI endonükleaz tanima bölgesine sahip olan bir bitki hatti kullanilarak geleneksel yetistirme yöntemiyle bitki genomuna insert edilebilir ve daha sonra, aizu edilen herhangi bir yabanci DNA, önceden dahil edilen seçilmis hedef bölgeye dahil edilebilir.

Burada kullanildigi sekliyle "yakininda yer alan", önceden tanimlanmis bölgeden, diger bir deyisle modifiye edilecek olan genomik DNA içindeki bölgeden (hedef bölge) 500 bp, 1 kbp, 2 kbp, 3 kbp, 4 kbp, 5 kbp ila 10kbp bir uzaklikta konumlanan çift sarmalli DNA kirilma indüksiyonu bölgesi, diger bir deyisle endonükleaz tanima bölgesini ifade Burada kullanildigi sekliyle, "bitisik bir DNA bölgesi", hedef DNA dizisinin veya önceden seçilen bölgenin sirasiyla yukari ve/veya asagi yöndeki DNA bölgeleri ile homolojiye sahip bir nükleotid dizisi olan bir DNA'dir. Bu, amaçlanan modifikasyonun hassasiyetinin daha iyi kontrol edilmesini saglar. Gerçekten de homolog rekombinasyon ile entegrasyon, yabanci DNA fragmaninin nükleotid seviyesine kadar bitki nükleer genomuna tam olarak katilmasini saglayacaktir.

Rekombinasyon için yeterli homologluga sahip olmak için, onarici DNA'nin bitisik DNA bölgelerinin uzunlugu degisiklik gösterebilir, ve en az yaklasik 10 nükleotid uzunlugunda olmalidir. Bununla birlikte, bitisik bölge, pratik olarak mümkün oldugunca r uzun olabilir (örnegin tam bakteri yapay kromozomlarinda (BAC'ler) oldugu gibi bp olacaktir. Ilgili yabanci DNA'ya bitisik bölgelerin, önceden seçilen bölge ile bitisik DNA bölgeleri ile özdes olmasi gerekmez ve önceden seçilen bölgeye bitisik DNA bölgeleri ile yaklasik %80 ila yaklasik %100 dizi özdesligi, tercihen yaklasik %95 ila yaklasik %100 dizi özdesligi içerebilir. Bitisik bölge uzadikça, homologluk gerekliligi o kadar azdir. Ayrica dizi kimliginin DSB'nin yakininda pratik olarak mümkün oldugunca yüksek olmasi tercih edilir. Ayrica, hedef DNA dizisinin bitisik DNA dizilerinin DNA dizisi degistirilmeden degistirilmesini saglamak için, bitisik DNA dizileri tercihen önceden seçilen bölgeyi veya degistirilmesi planlanan hedef DNA'ya bitisik yukari ve asagi yöndeki DNA bölgeleri ile özdes olmalidir. Araya giren DNA dizilerini ortadan kaldirmak için yukari yönde ve asagi yöndeki bölge arasindaki homolojiyi birbirine baglayan rekombinasyon için ayni kriterler geçerlidir.

Ayrica, ilgi konusu yabanci DNA'ya bitisik bölgeler önceden seçilen bölgenin hemen yaninda bulunan bölgelerde homoloji gerektirmemekle birlikte, önceden seçilen bölgeden uzaktaki genomun bir DNA bölgesinde homoloji olusturabilir. Genomik DNA ile onarici DNA arasindaki homolog rekombinasyon, daha sonra, önceden seçilmis insersiyon bölgesi ile homolojinin DNA bölgesi arasindaki hedef DNA'nin ortadan kaldirilmasina neden olacaktir. Baska bir deyisle, homoloji bölgeleri arasinda bulunan hedef DNA, bitisik bölgeler arasindaki yabanci DNA'nin yerini alacaktir. Onarici DNA yalnizca iki bitisik diziden olustugunda, diger bir deyisle herhangi bir araya giren dizi içermezse, bu yaklasim, iki homoloji bölgesi arasinda yer alan genomik bölgeyi spesifik olarak silmek için kullanilabilir.

Yabanci onarim DNA'sinda homoloji bölgelerinin bulundugu durumda, bulusa ait yöntemlerin uygulanmasi için ayni zamanda bölgeye özgü rekombinazlarin kullanilabilecegi açiktir. Bölgeye özgü rekombinazlar ayni DNA molekülünde bulunabilen, ancak rekombinasyon meydana gelen iki farkli DNA molekülü üzerinde bulunan iki tanima bölgesi gerektirir. Dolayisiyla, en az bir adet bu türlü tanima bölgesi içeren bir onarici DNA, ayni zamanda en az bir adet bu türlü bir bölgeyi içeren bir genomik Iokusa hedeflenebilir. Bölgeye özgü rekombinazlara örnekler teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin P1 bakteriyofajindan Cre-Lox sistemi (Austin et al., 1981, Cell, 5995-6000). gibi insersiyon sonra ortadan kaldirilabilen veya kaldirilamayan seçilebilir veya taranabilir bir belirteç de içerebilir.

Burada kullanildigi sekliyle seçilebilir veya taranabilir belirteçler” teknikte bilinen bir anlam tasirlar ve bunlarla sinirli olmamakla birlikte bitki eksprese edilebilir fosfinotrisin asetiltransferaz, neomisin fosfotransferaz, glifosat oksidaz, glifosat toleransli EPSP enzimi, nitrilaz geni, mutant asetolaktat sintazi veya asetohidroksiasit sintaz geni, B- glukoronidaz (GUS), R-Iokus genleri, yesil floresan protein ve benzerlerini içerir.

Seçilebilir belirteçler, fosfinotrisin, neomisin, glifosat, higromisin, ALS inhibe edici herbisitleri (örnegin sülfonil üre ve benzerleri) gibi seçme bilesiklerine tolerans veya direnç saglayabilirler veya arzu edilen modifikasyonun gerçeklestigi hücreleri seçmek veya zenginlestirmek için, örnegin görsel (GUS boyama, flüoresan) yollar saglayabilir.

Seçilebilir veya taranabilir belirtecin ve yabanci DNA molekülünün geri kalaninin, bitisik DNA bölgeleri boyunca homolog rekombinasyon ile dahil edildigi bitki hücresinin veya bitkinin seçilmesi, örnegin transformasyon DNA'sinda bulunan ancak bitisik DNA bölgeleri disinda bulunan dizilerin yoklugunda tarama ile elde edilebilir. Gerçekten de, bitisik DNA bölgelerinin disindaki transformasyon DNA'sindan dizilerin varligi, transforme edilmis bitki hücrelerinin olusmasinin rastgele DNA insersiyonu olduguna isaret eder. Bu amaçla, bitisik DNA bölgelerinin disinda bulunan seçilebilir veya taranabilir belirteçler dahil edilebilir; bu, daha sonra, transformasyon DNA'sinin disinda yer alan ve bitisik DNA bölgeleri boyunca homolog rekombinasyon ile ortaya çikabilecek transformasyon DNA'sinin disinda yer alan seçilebilir veya taranabilir belirteçleri bulunmayan bitki hücrelerini tanimlamak için kullanilabilir. Alternatif olarak, transformasyon DNA molekülü, bu tür genlerin yokluguna yönelik seçime izin veren (negatif seçilebilir belirteç` genler) bitisik DNA bölgelerinin disinda seçilebilir belirteçler içerebilir.

Bulusa göre yöntemlerin, belirli bir nükleotid dizisi imzasina, örnegin sonraki tanimlama için, bir nükleotid dizisine sahip DNA içeren bir herhangi bir ilgili DNA'nin insersiyonuna olanak sagladigi açikça görülecektir. Ilgili DNA, bir herbisit toleransi geni, bir böcek direnç geni, bir hastalik direnci geni, bir abiyotik stres direnç geni, bir bitki direnci geni, yag biyosentezinde veya karbonhidrat biyosentezinde rol oynayan bir enzimi kodlayan bir gen, lif kuvveti veya lif uzunlugunda yer alan bir enzimi kodlayan bir gen, sekonder metabolitlerin biyosentezi ile ilgili bir enzimi kodlayan bir gen dahil ancak bunlarla sinirli olmayacak sekilde bir veya daha fazla bitki ekprese edebilir gen(ler) olabilir.

Herbisit tolerans genleri, enzim 5-enolpiruvilsikimat-S-fosfat sentezini (EPSPS) kodlayan bir geni içerir. Bu türlü EPSPS genlerine örnek olarak, Salmonella typhimurium bakterisinin AroA geni (mutant CT7) (Comai et al., 1983, Science 221, veya bir Eleusine EPSPS (WO 01166704) bulunmaktadir. Ayni zamanda örnegin EP mutasyona ugramis EPSPS de olabilir. Glifosat toleransli bitkiler, U.S. Patent No. kodlayan bir genin eksprese edilmesi yoluyla da elde edilebilir. Glifosat toleransli tarif edildigi gibi bir glifosat asetil transferaz enzimini kodlayan bir genin eksprese edilmesi yoluyla da elde edilebilir. Glifosat toleransli bitkiler, örnegin WO 01/024615 veya WO 03/013226'da tarif edildigi gibi, yukarida bahsedilen genlerin dogal olarak olusan mutasyonlarini içeren bitkiler seçilerek elde edilebilir. Glifosat toleransina sahip EPSPS genleri, örnegin U.S. Patent Basvuru No Dekarboksilaz genleri gibi glifosat tolerans saglayan diger genler, örnegin U.S. patent açiklanmaktadir.

Diger herbisit tolerans genleri, herbisidi detoksifiye eden bir enzim veya inhibisyona dirençli bir mutant glutamin sentaz enzimini kodlayabilir, örnegin 11/760,602 sayili U.S.

Patent Basvurusunda açiklanmaktadir. Bu türlü etkili detoksifiye edici bir enzim, bir fosfinotrisin asetiltransferaz (Streptomyoes türünden çubuk veya pat proteini) kodlayan bir enzimdir. Fosfinotrisin asetiltransferazlar örnegin U.S. Patent No. 5,561,236; 7,112,665'de açiklanmaktadir.

Herbisit tolerans genleri ayrica, hidroksifenilpiruvatoksijenaz enzimini (HPPD) inhibe eden herbisitlere de tolerans gösterebilir. Hidroksifenilpiüretik oksijenazlar, para- hidroksifenilpiruvatin (HPP) homojenlestirmeye dönüstürüldügü reaksiyonu katalize eden enzimlerdir. HPPD-inhibitörlerine toleransli bitkiler, dogal olarak olusan bir dirençli mutasyona ugramis veya kimerik HPPD enzimini kodlayan bir gen ile transforme edilebilir. HPPD-inhibitörlerine karsi tolerans, natif HPPD enziminin HPPD-inhibitörü tarafindan engellenmesine ragmen homogentisat olusumunu saglayan bazi enzimleri sifreleyen genlerle bitkiler dönüstürerek de elde edilebilir. Bu tür bitkiler ve genler WO bir genin yani sira, prehonat deshidrojenaz (PDH) aktivitesine sahip bir enzimi kodlayan bir gen ile transforme ederek de iyilestirilebilir. Ayrica, bitkiler, HPPD CYP450 enzimleri gibi HPPD inhibitörlerini metabolize edebilen veya indirgeyebilen bir enzimi kodlayan bir geni genomlarina ekleyerek daha toleransli hale getirebilirler.

Yine herbisit tolerans genleri, örnegin Tranel ve Wright (2002, Weed Science 50: 700- ,013,659'de açiklandigi gibi varyant ALS enzimlerini (ayrica asetohidroksiasit sintazi, AHAS olarak da bilinir), kodlamaktadir. Sülfonilüreye toleransli bitkiler ve imidazolinona uluslararasi yayin WO 96/33270'de açiklanmaktadir. Diger imidazolinon tolerans Böcek dirençli gen, asagidakileri kodlayan bir kodlama dizisi içerebilir: 1) Bacillus thuringiensis'den bir insektisidal kristal proteini veya Crickmore et al. (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813) tarafindan listelenen ve Crickmore et al. (2005) tarafindan Bacillus thuringiensis toksin isimlendirme, çevrimiçi: http://www.Iifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)'de güncellenen insektisidal kristal proteinleri gibi insektisidal bir bölüm, veya böcek öldürücü bölümler, örnegin Cry protein siniflari Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1 F, Cry2Ab, Cry3Aa veya Cry3Bb veya bunlarin insektisidal bölümleri (örnegin, EP 1999141 ve WO tarafindan kodlanan proteinler; veya 2) Bacillus thuringiensis'ten bir kristal protein veya Bacillus thuringiensis`den bir ikinci kristal proteinin varliginda insektisidal olan bir bölümü, örnegin Cry34 ve Cry35 kristal proteinlerinden olusan ikili toksin gibi bir bölüm (Moellenbeck et al. 2001 Nat. 1774) veya Cry1A veya Cry1 F proteinlerinden ve Cry2Aa veya Cry2Ab veya Cry2Ae proteinlerinden olusan ikili toksin (US Patent Basvurusu No. 12/214,022 ve EP 08010791 .5); veya 3) Bacillus thuringiensis'ten farkli insektisidal kristal proteinleri, örnegin bir protein hibriti, örnegin yukaridaki 1)'in proteinlerinin bir hibridini veya yukaridaki 2) proteinlerinin bir hibridini içeren bir hibrid insektisidal protein, örnegin, misir olayi MON tarafindan üretilen Cry1A.105 proteini veya 4) bir hedef böcek türüne karsi daha yüksek bir insektisidal aktivite elde etmek ve/veya etkilenen hedef böcek araligini genisletmek için, ve/veya klonlama veya transformasyon sirasinda kodlayan DNA'ya dahil edilen degisikliklerden dolayi, örnegin olayinda Cry3A proteini, bazi, özellikle de 1 ila 10, amino asidi, bir baska amino asit ile degistiren yukaridaki 1) ila 3)'ün herhangi birindeki bir protein; veya ) Bacillus thuringiensis veya Bacillus cereus'tan bir insektisidal salgilanan protein veya httpzl/www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html'de listelenen örnegin vejetatif insektisidal (VlP) proteinler gibi bir insektisidal bölümü, örnegin, VlP3Aa protein sinifindan proteinler; veya 6) Bacillus thuringiensis veya B. cereus'tan ikinci bir salgilanmis proteinin, örnegin VIP1A ve VIP2A proteinlerinden (WO 94/21795) olusan ikili toksin varliginda insektisidal olan Bacillus thuringiensis veya Bacillus cereus'tan salgilanan bir protein; 7) yukarida 1) 'deki proteinlerin bir hibridi veya 2)' deki proteinlerin bir hibridi gibi Bacillus thuringiensis veya Bacillus cereus'tan farkli salgilanan proteinlerin bölümlerini içeren bir hibrid insektisidal protein; veya 8) bir hedef böcek türüne karsi daha yüksek bir insektisidal aktivite elde etmek ve/veya etkilenen hedef böcek araligini genisletmek için, ve/veya klonlama veya transformasyon sirasinda kodlayan (halen insektisidal bir proteini kodlarken) DNA'ya dahil edilen degisikliklerden dolayi, örnegin pamuk olayi COT102'deki VIP3Aa proteini gibi, bazi, özellikle de 1 ila 10, amino asidi, bir baska amino asit ile degistiren yukaridaki 5) ila 7)'nin herhangi birindeki bir protein; veya 9) Bacillus thuringiensis'den veya Bacillus cereus'dan salgilanan, VIP3 ve Cry1A veya Cry1F'den olusan ikili toksin gibi Bacillus thuringiensis'ten bir kristal proteinin varliginda VIP3 proteini ve Cry2Aa veya Cry2Ab veya Cry2Ae proteinlerinden (US Patent ) bir hedef böcek türüne karsi daha yüksek bir insektisidal aktivite elde etmek ve/veya etkilenen hedef böcek araligini genisletmek için ve/veya klonlama veya transformasyon sirasinda kodlayan (halen insektisidal bir proteini kodlarken) DNA'ya dahil edilen degisikliklerden dolayi, bazi, özellikle 1 ila 10 amino asitlerin bir baska amino asit ile degistirildigi yukaridaki 9)un bir proteini.

Burada kullanilan sekliyle "böcek dirençli bir gen" ayrica, bir bitki böcek zararlisi tarafindan yutulmasi üzerine, bu böcek zararlilarinin büyümesini inhibe eden, örnegin dizi ihtiva eden transgenler içerir.

Abiyotik stres tolerans genleri asagidakileri içerir: edildigi gibi bitki hücrelerinde veya bitkilerde poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) geninin ekspresyonunu ve/veya aktivitesini azaltabilen bir transgen. kodlayan genlerinin ekspresyonunu ve/veya aktivitesini azaltabilen bir transgen. nikotinik asit mononükleotit adenil transferaz, nikotinamid adenin dinükleotid sentetaz veya nikotin amid fosforobosiltransferaz gibi nikotinamid adenin dinükleotit kurtarma sentez yolaginin bitki fonksiyonel bir enzimini kodlayan birtransgen. özellikle de inulin ve Ievan tipi üretiminde yer alan enzimler, WO 95/31553'te enzimleri içerir.

Teknikte uzman bir kisi, nükleer genoma ilaveten bulusun yöntemlerinin örnegin; kloroplast genomu veya mitokondri genomunu modifiye etmek için uygulanabilecegini bilir, burada önceden tanimlanmis alanda DSB indüksiyonu yer alir ve ayrica endonükleaz enzimine dogru hedef sinyali vererek arttirilabilir.

Ayrica pamuk bitki hücreleri ve bulusun yöntemlerine göre üretilen bitkiler de açiklanmaktadir. Bu türlü bitkiler, bir hedef diziye insert edilen veya hedef dizi yerine bir heterolog veya yabanci DNA dizisi içerebilir veya bir delesyon içerebilir ve yalnizca belirli modifikasyonun mevcudiyetiyle öncül bitkilerden farkli olacaktir.

Açiklandigi üzere bulusa ait bitki hücreleri, diger bir deyisle T-DNA kombinasyonunu içeren bir bitki hücresi ve burada açiklanan yöntemlere göre üretilen bitki hücreleri, amaçlanan genomik modifikasyonu içeren, yayilmayan hücreler olabilir.

Burada tarif edilen yöntemlerle elde edilen pamuk bitkileri, hedeflenen modifikasyonu içeren döl bitkiler elde etmek için diger bitkilerle geleneksel üreme teknikleri ile ayrica çaprazlanabilir.

Burada açiklanan pamuk bitkiler ve tohumlarina, asagidaki listeden seçilen bir kimyasal bilesik seklinde bir kimyasal bilesik ile daha da muamele edilebilir: - Herbisitler: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oksifluorfen, Prometrin, Trifluralin, Karfentrazon, Kletodim, FIuazifop-butil, Glifosat, Norflurazon, Pendimetalin, Piritiyobak- sodyum, Trifloksisülfüron, Tepraloksidim, Glüfosinat, Flumioksazin, Tidiazuron ° Insektisitler: Asefat, Aldikarb, Klorpirifos, Sipermetrin, Deltametrin, Abamektin, Asetamiprid, Emamektin Benzoat, Imidakloprid, Indoksakarb, Lambda-Sihalotrin, Spinosad, Tiyodikarb, Gama-Sihalotrin, Spiromesifen, Piridil, Flikonamid Flubendiamit, Triflümüron, Rinaksipir, Beta-Siflutrin, Spirotetramat, Klotianidin, Tiyametoksam, Tiyakloprit, Dinetofuran, Flubendiamid, Siazipir, Spinosad, Spinotoram, gamma Avermektin, Flonikamid, Piridil, Spiromesifen, Sulfoksaflor . Fungisitler: Azoksistrobin, Biksafen, Boskalid, Karbendazim, Klorotalonil, Bakir, Siprokonazol, Difenokonazol, Dimoksistrobin, Epoksikonazol, Fenamidon, Fluazinam, Fluopiram, Fluoksastrobin, Fluksapiroksad, Iprodion, Izopirazam, Izotianil, Mankozeb, Maneb, Metominostrobin, Penti0pirad, Pikoksistrobin, Propineb, Protiyokonazol, Piraklostrobin, Kintozen, Tebukonazol, Tetrakonazol, Tiyofanat-metil, Trifloksistrobin.

Burada kullanildigi sekliyle pamuk, mevcut herhangi bir pamuk çesidine deginmektedir. Örnegin, pamuk bitki hücresi, pamuk yetistirilmesi için yararli çesitli türden olabilir. En çok kullanilan pamuk çesitleri arasinda Gossypium barbadense, G. hii'sutum, G. arboreum ve G. herbaceum'dur. Diger çesitler arasinda G. africanum ve G. raimondii Burada açiklanan pamuk bitkilerinin örnekleri, Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ- Acala G0356, Acala GCS10, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala olmayan i'toplayici" Siokra, "siyirici" çesidi, F02017, Coker 315, STONEVILLE C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED CB. CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA 86 ORO BLANCO PIMA, FIBERMAX FM5013, FIBERMAX FM5017 veya FlBERMAX FM5024 ve bunlarin türemis genotipleri olan bitkilerdir.

Bunlar, yukarida açiklanan yöntemlerin uygulanmasi için uygundur.

Burada kullanildigi sekliyle "ihtiva eden", söz konusu özelliklerin, tam sayilarin, basamaklar veya bilesenlerin varliginin belirtilmesi olarak yorumlanacak ancak bir veya daha fazla özellik, tamsayi, basamak veya bilesenin veya bunlarin gruplarinin varligini veya eklenmesini engellemeyecektir. Bu nedenle, örnegin bir nükleotid veya amino asit dizisini içeren bir nükleik asit veya protein, aslinda belirtilenlerden daha fazla nükleotit veya amino asit içerebilir, diger bir deyisle daha büyük bir nükleik asit veya protein içinde yer alabilir. islevsel veya yapisal olarak tanimlanan bir DNA bölgesinden olusan kimerik bir gen ek DNA bölgeleri vb. ihtiva edebilir. bitki parçalari gibi kendi kendine elde veya çaprazlama yoluyla elde edilen tohum gibi, parentlerin belirgin özelliklerini koruyan bitkilerden olusan bir dölü de kapsar.

Burada kullanildigi sekliyle, "bitki parçasi", meyveler, tohumlar, embriyolar, lifler, meristematik bölgeler, kallus dokusu, yapraklar, kökler, sürgünler, çiçekler, gametofitler, sporfitler, polen ve mikrospor dahil olmak ancak bunlarla sinirli olmayan herhangi bir bitki organi veya bitki dokusunu içerir.

Burada kullanildigi sekliyle "protein" veya "polipeptit" terimleri, 30'dan fazla amino asitten olusan bir molekül grubunu tarif eder, buna karsin "peptit" terimi 30'a kadar amino asitten olusan molekülleri tanimlar. Proteinler ve peptitler ayrica dimerler, trimerler ve daha yüksek oligomerler, diger bir deyisle birden fazla (poli)peptit molekülünden meydana gelebilir. Bu tür dimerler, trimerler vb. olusturan protein veya peptit molekülleri özdes veya özdes olmayan olabilir. Dolayisiyla, karsilik gelen daha yüksek sira yapilari, homo- veya heterodimerler, homo- veya heterotrimerler vb. olarak adlandirilir. "Protein" ve "peptit" terimleri ayrica glikosilasyon, asetilasyon, fosforilasyon ve benzerleri ile modifikasyonun gerçeklestirildigi dogal modifiye proteinleri veya peptitleri ifade eder. Bu modifikasyonlar teknikte iyi bilinmektedir.

Bu bulusun amaci dogrultusunda, iki ilgili nükleotid veya amino asit dizisinin bir yüzde olarak ifade edilen i'dizi özdesligi", karsilastirilan konumlarin sayisi ile bölünen ayni kalintilara (X100) sahip iki optimal olarak hizalanmis dizi içindeki konum sayisini ifade etmektedir. Bir aralik, diger bir deyisle bir kalintinin bir dizide mevcut oldugu ancak digerinde bulunmayan bir hizadaki bir konum, özdes olmayan kalintilara sahip bir konum olarak kabul edilir. Iki dizinin hizalanmasi Needleman ve Wunsch algoritmasi ile gerçeklestirilmistir (Needleman and Wunsch 1970). Yukaridaki bilgisayar destekli dizi hizalama, uygun bir sekilde, Wisoonsin Paketi Sürüm 10.1'in (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, ABD) bir parçasi olan GAP gibi standart yazilim programini kullanarak varsayilan bir bosluk yaratma penaltisi 50 ve bosluk uzatma penaltisi 3'e sahip bir puanlama matrisini kullanarak geleneksel olarak gerçeklesti rilebilir. boyut olarak) bulunan dizi listesinde SEQ lD No: 1 ila SEQ ID No: 4 olmak üzere 4 dizi bulunur; burada elektronik gönderme yoluyla ve buraya referans olarak dahil edilmistir.

Asagidaki sinirlayici olmayan Örnekler, bir DSBI enzimi ve hem Agrobacterium aracili ayni zamanda embriyojenik kallustaki dogrudan iletim yöntemleri kullanilarak bir pamuk bitki hücresinin genomunun modifiye edilmesi için yöntemleri tarif etmektedir. Örneklerde aksi belirtilmedigi sürece, bütün rekombinant DNA teknikleri, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ve Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA'da açiklandigi gibi standart protokollere göre gerçeklestirilir. Bitki moleküler çalismasi için standart materyaller ve yöntemler, Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, birlikte BIOS Scientific Publications Ltd (UK) ve Blackwell Scientific Publications, UK tarafindan yayinlanmistir.

Standart moleküler biyoloji teknikleri için diger referanslar arasinda, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes l and Il of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK). Standard materials and methods for polymerase chain reactions can be found in Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ve McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany bulunmaktadir. ÖRNEKLER Örnek 1: vektör yapimi Standart rekombinant DNA teknikleri kullanilarak asagidaki islevsel olarak bagli elemanlari içeren DNA vektörleri hazirlandi (sematik olarak sekil 1 ve 2'de gösterildi): Hedef DNA vektörü pTCV: - I-Scel bölgesi (nt 31-14) nopalin sintaz geninin 3' Çevrilmemis bölgesini içeren dizi, - Bar: Streptomyces hygroscopicus'un BAR geninin kodlama bölgesi (nt 240-791, ters tamamlayici) - 5'cab22L: Petunia hybrida'nin klorofil a/b baglayici protein geninin (Harpster et al., tamamlayici) gen 7 3' uç terminasyon ve poliadenilasyon bölgesi, o I-Scel tanima bölgesi (nt 1643 - 1617) (misir) ve Helianthus annuus'un (ayçiçegi) RuBisCO küçük altbirim genlerinin dizisini içeren, optimize edilmis transit peptiti kodlayan dizi. geninin 3' çevrilmemis bölgesini içeren dizi, - RB: sag T-DNA siniri (nt 4594-4618) Onarici DNA vektörü pTIB: ters tamamlayici) klorofil a/b baglayici protein geninin lider dizisini içeren dizi, terminasyon ve poliadenilasyon bölgesi, - Pcsvmv XYZ: CsVMV promotör fragmani (1285-1724) - 5'csvmv: CsVMV promotörünün lideri (nt 1725-1797) - hyg-1 Pa: E.coli'nin higromisin direnç geni (nt 1804-2829) - RB: Sag T-DNA siniri (nt 4267-4243) Onarici DNA ve endonükleaz ekspresyon vektörü pTlB: - LB: Sol T-DNA siniri (nt 1-25) tamamlayici) . hyg-1 Pa: E. coli'den higromisine dirençli gen (nt 340-1365, ters tamamlayici) - 5'csvmv: CsVMV'nin lideri (nt 1372-1444, ters tamamlayici) o Pcsvmv XYZ: CsVMV promotör fragmani (1445-1884, ters tamamlayici) - I-SceI: universal kod I-Scel kodlama bölgesi (nt 2185-2919, ters tamamlayici) lider dizi - RB: Sag T-DNA siniri (nt 4592-5655) ekspresyon vektörü ptrr26 (SEQ ID No: 4): - RB: Sag T-DNA siniri - 5'ats1b: Arabidops/s tha/iana rbcS ATS1A geninden lider dizi - NLSsv40: SV40 nükleer Iokalizasyon sinyali - I-Scel: universal kod l-Scel kodlama bölgesi - 3'358 ° LB: Sol T-DNA siniri Örnek 2: Ortam ve tamponlar Asagida örnekler 3, 4 ve 5'de tarif edildigi gibi embriyonik kallus üretimi ve transformasyonu sirasinda kullanilan ortam ve tamponlar: AS + 100 mg/L L-sistein (L-sistein her zaman yeni hazirlanmali ve otoklavlamadan sonra eklenmelidir) g/L, glukoz 30 g/L, pH 5.8 agar 2.25 g/L, sukroz 20 g/L, pH 6.8 agar 5 g/L, sukroz 5 g/L, pH 6.8 AC: aktif karbon 2 g/L AS: DMSO içinde 100 uM asetosiringon Örnek 3: Kirilgan embriyojenik kallus jenerasyonu Coker 312'den elde edilen pamuk tohumu, kati çimlenme ortami M100 üzerinde, hormonlar olmadan, 7-10 gün karanlikta 28°C'de çimlendi. Daha sonra embriyojenik kallus indüksiyonu, fidelerdeki hipokotil eksplantlarin kati M100 ortami üzerinde (hormonsuz) inkübe edilmesiyle gerçeklestirildi. Hipokotillerin kesik yüzeyindeki yarali kallus hizli proliferasyon göstermeye basladigindan itibaren yaklasik 2 ay sonra, embriyojenik kallusun zenginlestirilmesi ve korunmasi için alt-kültür, aktif karbonlu kati M100 ortami üzerinde yapilir (29/L). Embriyojenik kallus indüksiyonu ve bakimi 28°C'de los isik kosullarinda (yogunluk: 1 ila 7 umol m'2 saniye'1; fotoperiyod: 16 saat isik/8 saat karanlik) gerçeklesir. Örnek 4: Parçacik bombardimani ile pamuk embriyogenik kallus transformasyonu Parçacik bombardimani kullanilarak pamuk embriyojenik kallusun transformasyonu için asagidaki prosedür takip edildi: - Bir DSB'nin neden oldugu hedeflenen modifikasyonu sunacak bir hedef hattin örnek 3'ün kirilgan pamuk embriyojenik kallusu (EC), alt kültürden 2 ila 3 hafta sonra toplanir ve bir filtre kagidinin üstünde bir Büchnerfilter vasitasiyla bombardimandan ~2 ila ~20 saat önce 0.2 M manitol ve 0.2M sorbitol ile M100 substrati üzerinde ince bir tabaka halinde kaplanir preplazmikozasyondan sonra, EC istege bagli olarak bir onarici DNA (~ 0.5 pmol) varliginda endonükleaz DNA (~ 0.5 pmol) ile bombardiman edilir, - Bombardiman kosullari: 0 altin parçaciklarinin çapi: 0.3-3um o yirtilma diski: 1100-1350 psi o hedef dokuya olan uzaklik: 9 cm 0 hazne vakumu ~27 (Hg cinsinden) o BioRAD PPS_1000/He Biyolistik Parçacik iletim sistemi - Bombardimandan sonra, filtreler, seçici madde içermeyen 0.2 M manitol veya M100 substrat ile M100 alt tabakasina aktarilir. sonra filtreler ya 50 mg/L higromisin veya 1 mM glifosat veya 5 mg/L PPT ile seçici M100 substratina aktarilir - Yaklasik 2 ila 3 hafta sonra prolifere edici kalluslar filtreler arasindan seçilir ve ayrica 50 mg/L higromisin veya 1 mM glifosat veya 5 mg/L PPT ile seçici M100 substrat üzerine küçük yiginlar halinde alt kültürlenir. 28°C'de dimmer kosullarinda seçici M100 substrati üzerinde ~3 haftalik alt kültür araliklariyla ~6 hafta alt kültür döneminden sonra, transformasyona ugramis EC/somatik embriyolar seçilebilir. transformasyona ugramis EC/somatik embriyolarin seviyesinde gerçeklestirilir.

- Bitki rejenerasyonu, EC/somatik embriyolarin aktif karbon (AC) ve buna tekabül eden seçici ajanin M104 üzerine kaplanmasiyla isik kosullarinda (yogunluk: 40 ila 70 umol m'zsaniye'1; fotoperiyod: 16 saat isik/8 saat karanlik) 28°C'de baslatilir.

- Yaklasik bir ay sonra yaklasik 0.5-1 cm'lik bireysel embriyo, AC ve ilgili seçici madde ile M104 üzerinde bir filtre kagidinin üzerine aktarilir.

- Daha iyi çim veren embriyolar, 28°C'de isik kosullarinda (yogunluk: 40 ila 70 umol m-2 speC'i; fotoperiyod: 16 saat isik/8 saat karanlik) seçici olmayan çimlenme substratina M702 aktarilir.

- Bir ila iki ay sonra, daha fazla gelismekte olan embriyolar, küçük bitkiler halinde gelismek üzere 28°C'de isik kosullarinda (yogunluk: 40 ila 70 umol m'2 saniye'l; fotoperiyod: 16 saat isik/8 saat karanlik) M700 substratina aktarilir. Örnek 5: Agrobacterium aracili DNA iletimi ile pamuk embriyogenik kallusun transformasyonu Agrobacterium kullanilarak pamuk embriyogenik kallusun transformasyonu için asagidaki prosedür takip edildi: - Bir hedef hattin 3. örneginde, substrat 100 üzerinde alt kültürden 2 ila 3 hafta sonra DSB ile indüklenen hedeflenmis bir modifikasyonun baslatilmasi için kirilgan pamuk embriyojenik kallus (EC) ve 5x10B hücre/ml'lik bir Agrobacterium süspansiyonuna 20' için ile M100 substrat pH 5.2'de daldirma uygulanmistir.

Agrobacterium susu, onarici DNA ve endonükleaz kodlayan geni içeren bir vektörü 100 mg/L L-sistein ile birlikte kültive edildikten 3 gün sonra EC, ya bir filtre kagidinin üzerine, bir Büchner filtresi veya M100 substrat pH5.8, 250mg/L triasilin ve selektif bir madde (higromisin 50mg/L veya PPT 5mg/L veya glifosat 1 ila üzerinde küçük kümeler halinde aktarilir ve 28°C'de los isikta (yogunluk: 1 ila 7 umol rn'2 saniye'1; 16 saat isik/8 saat karanlik) inkübe edilir. ile seçici M100 alt tabakasi üzerine küçük yiginlar halinde alt kültürlenir. 28°C'de dimmer kosullarinda seçici M100 substrati üzerinde ~ 3 haftalik alt kültür araliklarinda ~ 6 hafta boyunca bir alt kültür döneminden sonra, transformasyona ugramis EC/somatik embriyolar seçilebilir.

° Hedeflenen modifikasyon olaylarinin tanimlanmasi için, transformasyona ugramis EC/somatik embriyolarin seviyesinde bir moleküler tarama gerçeklestirilir. tekabül eden seçici ajanin isik kosullari altinda kaplanmasiyla (yogunluk: 40 ila 70 umol m'2 saniye'1; fotoperiyod 16 saat isik/8 saat karanlik) 28°C'de baslatilir. Bu adimdan itibaren, substratlar artik antibiyotik içermez.

- Yaklasik bir ay sonra, yaklasik 0.5-1 cm'lik bireysel embriyo, aktif karbon (AC) ve buna tekabül eden seçici substratli M104 üzerindeki bir filtre kagidinin üzerine aktarilir.

- Diger çimlenen embriyolar, isik kosullarinda (yogunluk: 40 ila 70 umol m'2 saniye'l; fotoperiyod 16 saat isik/8 saat karanlik) seçime bagli olmayan çimlenme 28°C'de substrati M702 üzerine aktarilir.

- Bir ila iki ay sonra, daha da gelismekte olan embriyolar hafif fenometreler (yogunluk: 40 ila 70 umol nT2 saniye'1; fotoperiyod (16 saat isik/8 saat karanlik» altinda küçük bitkiler halinde gelismek üzere 28°C'de M7OO substratina aktarilir. Örnek 6: Hedeflenen genom mühendisliginin degerlendirilmesi için hedef bitkiler üretilmesi PTCV117 hedef DNA vektörünü içeren transjenik pamuk bitkileri, örnek 5'de tarif edildigi gibi Agrobacterium tarafindan üretildi. pTCV117 vektörü, iki l-Scel tanima bölgesi ile bir promotörsüz EPSPS geni arasinda bulunan fonksiyonel bir 35S-tahrikli bar geni içeriyordu (bakiniz Sekil 1). Hedeflenen rekombinasyonu degerlendirmek için baslangiçta bir 35S-I-Scel ekspresyon kaseti ve hedeflenen DNA'ya homoloji bölgelerine sahip bir onarici DNA'siyIa, bir histon promotörünün eklenmesiyle promotörsüz epsps geninin restorasyonu için bu bitkilerin transformasyonu amaçlanmistir, bu da glifosat toleransinin kazanilmasina neden olmustur. Bununla birlikte, bu pTCV117 bitkileri, muhtemelen 358 promotörünün iki yönlü transkripsiyonel aktivitesinden ötürü glifosat için yüksek düzeyde toleransa sahipmis gibi görünür ve böylece deneyi kullanilamaz hale getirir. Örnek 7: Hedeflenen insersiyon veya homolog rekombinasyon yoluyla degistirme Böylece, sekil 1'de sematik olarak gösterildigi gibi, bir ucunda bir 3' epsps gen fragmani bitisik (hedef Iokusunda EPSPS geni ile homolog rekombinasyona olanak saglar, EPSPS geninin 5' bölümünü higromisin geni ile degistirir), diger ucunda 5' bar gen fragmanina) bagli bir 358 yükseltici ile bitisik islevsel bir CSVMV ile tahrik edilen higromisin direnç genini içeren, hedef DNA'ya homoloji bölgelerine sahip yeni bir transforme edildi ve ptrr26 vektörü, örnek 4'te tarif edildigi gibi parçacik bombardimani kullanilarak bir 358 promotöre islevsel olarak bagli bir universal kod I-Scel kodlama bölgesi içeriyordu.

Ilk olarak transformantlar, higromisin toleransi açisindan tarandi, çünkü bu, onarici DNA pTl8232'sinin insersiyonunu belirtmektedir. Daha sonra Hng olaylari, hedef degerlendirildi. Bu sekilde elde edilen 36 hng ve GIyS rekombinantlari ayrica, EPSPS geninin yukari yönündeki genomik bölgeyi ve higromisin genini taniyan primer çifti P3 xP4 kullanilarak PCR analizi ile karakterize edildi (Sekil 1). Bu, 8 potansiyel dogru gen hedefleme olayinin tanimlanmasina neden olmustur (epsps geninin 5' bölümünün higromisin geni tarafindan en az bir tarafli homolog rekombinasyonla degistirilmesi: sekil 1'de yapilandirma I) ve bu durum daha sonra P3, P4 primer seti ile elde edilen PCR ürününün dizi analiziyle dogru gen hedefleme olaylarini gerçekten de dogrulanmistir. Örnek 8: Homolog olmayan uç birlesme yoluyla hedeflenen insersiyon veya degistirme pTCV117 bitkileri, örnek 5'de tarif edildigi gibi Agrobacteruim-aracili DNA transferi kullanilarak hedef bölgeye homoloji tasimayan fonksiyonel bir hng geni ve fonksiyonel bir evrensel kod l-Scel kodlama geni içeren onarici DNA ve endonükleaz ekspresyon vektörü pTIBZ36 ile transforme edildi (bakiniz sekil 2).

Bu sekilde elde edilen 200 hng olayi, P1xP2 ve P3XP4 2 primer çifti kullanilarak PCR ile analiz edildi; hng genini ve bar geninin asagi yönündeki genomik bölgeyi taniyan P1xP2 primer çifti ve EPSPS geninin yukari yönündeki genomik bölgeyi ve higromisin genini taniyan diger çift analiz edildi (Sekil 2). Bu, 17 potansiyel hedeflenen insersiyon/degistirme olayinin tanimlanmasina neden oldu. Bu olaylarin 4'ünde yapilan dizi analizi, aslinda hedeflenen insersiyon/degistirme olaylari olduklarini gösterdi (Sekil 2'de yapilandirma l, ll). Örnek 9: Agrobacterium aracili transformasyon kullanilarak homolog olmayan uç birlestirme yoluyla hedeflenen insersiyon veya degistirme ekspresyon vektörü pTI susuyla transforme edildi.

Higromisine dirençli (Hng) olaylar seçildi, bunlarin 200'ü P1xP2 ve P3xP4 primer çiftleri kullanilarak hyg geninin hedef l-Scel bölgesine(lerine) insersiyonu için PCR ile analiz edildi. Bu 200 olaydan yaklasik %10'unun hedeflenen olaylar oldugu tespit edildi.

Bu hedeflenen olaylarin bazilarinin dizi analizi, ya bar geninin hyg geni ile degistirildigini veya hyg geninin bar geninin yaninda (yigilmis olay) insert edildigini ortaya koymustur. Örnek 10: Özel olarak tasarlanmis bir meganükleaz kullanarak hedeflenen çift sarmalli kirilma indüksiyonu CSVMV promotörünün kontrolü altindaki bar genini ihtiva eden bir kimerik geni içeren PPT'ye dirençli pamuk bitkilerinden gelen embriyojenik kalluslar, parçacik bombardimani yoluyla, tek bir zincir olan (pCV veya bir heterodimer (pCV olarak bar geninde bir hedef diziyi taniyan özel olarak tasarlanmis bir meganükleazi kodlayan bir kimerik gen içeren bir vektör ile transforme edildi. Meganükleaz vektörüne, seçilebilir bir belirteç gen olarak glifosata tolerans kazandiran bitki tarafindan eksprese edilebilen bir promotörün kontrolü altinda 2mEPSPS genini ihtiva eden bir vektörle birlikte iletildi. Yaklasik 3000 glifozata dirençli kalluslar elde edildi, bunlardan 85 olay PPT'ye duyarli görünüyordu, bu da bar geninin bozulmasina isaret ediyordu. Bunlardan 79 olay, PCR ile, hedef bölgeye bitisik primerler kullanilarak PCR ürünü ile karakterize edildi (tablo 1). elde edilebilir PCR ürünü # olaylar hedef bölgede degisiklik # olaylar hayir 11 genis delesyon 11 evet 8 mutasyon yok 6 degistirme / insersiyon 1 delesyon 1 elde edilebilir PCR ürünü # olaylar hedef bölgede degisiklik # olaylar hayir 33 genis delesyon 33 evet 27 mutasyon yok 19 elde edilebilir PCR ürünü # olaylar hedef bölgede degisiklik # olaylar degistirme / insersiyon 4 delesyon 4 Tablo 1: PPT'ye duyarli glifosata dirençli transformasyon olaylarinin karakterizasyonu.

Bir PCR ürününün bulunmamasi, hedef bölge etrafinda büyük bir delesyona isaret Dolayisiyla, bu sonuçlar, hem tek Zincirli hem de heterodimerik sekilde özel olarak tasarlanmis bir meganükleaz ile arzu edilen konumda hedeflenen bir çift sarmalli DNA kirilmasinin indüklenmesinin mümkün oldugunu ve hedeflenen delesyon, degistirme ve insersiyon olaylarinin bu meganükleazlari pamukta kullanarak elde edilebildigini göstermektedir.

DIZI LISTESI <110> Bayer CropScienCe N.V.

D'Halluin, Katelijn <120> ÖNCEDEN SEÇILMIS BIR BÖLGEDE BIR BITKI GENOMUNU MODIFIYE IÇIN YÖNTEMLER VE ARAÇLAR <130> BCS11-2008 <160> 4 <170> Patentln versiyon 3.3 <210> 1 <211> 12641 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> vektör <400>1

Claims (1)

1. ISTEMLER . Önceden belirlenmis bir konumdaki pamuk bitki hücresinin genomunun modifiye edilmesi için bir yöntem olup; asagidaki adimlari içermektedir: a. söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yakininda veya söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin içinde bir tanima dizisini taniyan nadir bölünen bir endonükleaz enziminin söz konusu hücresine eklenmesi yoluyla çift sarmalli DNA kirilmasinin indüklenmesi; b. söz konusu çift sarmalli DNA kirilmasinin onarildigi, söz konusu önceden seçilen bölgede genomda bir modifikasyon ile sonuçlanan bir bitki hücresi seçilmesi, burada söz konusu modifikasyon, i. en az bir nükleotidin degistirilmesi; ii. ii. en az bir nükleotidin delesyonu; iii. en az bir nükleotidin insersiyonu; veya iv. i. - iii.'nün herhangi bir kombinasyonudur; özelligi, söz konusu hücrenin kirilgan embriyojenik kallustan olusmasidir, burada söz konusu kirilgan embriyojenik kallus los isik kosullari altinda ve aktif karbon ihtiva eden ortamda muhafaza edilmistir, burada söz konusu los isik kosullari yaklasik 16 saat isik/8 saat karanlik bir fotoperiyoduyla yaklasik 1 ila 7 umol m'2 saniye'1 yogunlugunu içerir. . Istem 1'e göre yöntemi olup, burada söz konusu kirilgan embriyojenik kallus los isik kosullari altinda ve yaklasik 2 ila 4 ay boyunca aktif karbon ihtiva eden ortamda muhafaza edilmistir. . Istem 1 veya 2'ye göre yöntem olup, burada söz konusu endonükleaz enzimi, söz konusu endonükleaz enzimini kodlayan bir DNA molekülünün söz konusu hücre içine iletilmesi ile söz konusu hücre Içine dahil edilmektedir. . Istemler 1 - Siten herhangi birine göre bir yöntem olup, burada adim b'den önce, söz konusu yabanci onarici DNA molekülü söz konusu hücre içine iletilir, söz konusu yabanci onarici DNA molekülü, çift sarmalli DNA kirilmasinin onarimi için, bir sablon olarak kullanilmaktadir. Istemler 1- 4'ten herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu embriyojenik kallus hormon içermeyen bir ortamda inkübe edilir. Istemler 1 - 5'ten herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu embriyojenik kallus söz konusu endonükleaz enziminin söz konusu dahil edilmesi sirasinda veya sonrasinda seçici olmayan bir ortamda 1 ila 4 gün inkübe edilir. Istemler 3 - 6'dan herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu DNA iletimi parçacik bombardimani veya Agrobacterium kullanilarak gerçeklestirilir. Istemler 3 - 7'den herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu yabanci onarici DNA, söz konusu yukari veya asagi yönde DNA bölgesi ile rekombinasyon saglamak için söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari veya asagi yönde DNA bölgesinde yeterli homologluga sahip en az bir bitisik nükleotit dizisi içerir veya burada söz konusu yabanci onarici DNA, söz konusu yabanci DNA'nin zit uçlarinda yer alan iki bitisik nükleotit dizisi içerir, söz konusu bitisik nükleotid dizisinden biri, söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari yönde DNA bölgesinde yeterli homolojiye sahiptir, diger bitisik nükleotid dizisi, söz konusu bitisik nükleotid dizileri ile söz konusu yukari ve asagi DNA bölgeleri arasinda rekombinasyona olanak tanimak üzere söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin asagi yönde dizisi ile yeterli homolojiye sahiptir. Istemler 4 - 8lden herhangi birine göre bir yöntem olup, burada yabanci onarici DNA seçilebilir bir belirteç genine sahiptir. Istemler 4 - 9'dan herhangi birine göre bir yöntem olup, burada yabanci DNA ilgili bitki eksprese edilebilen gen içerir. .Istem 10'a göre yöntemi olup, burada bitki eksprese edebilir ilgili gen bir herbisit tolerans geni, bir böcek direnç geni, bir hastalik direnç geni, bir abiyotik stres direnç geni, yag biyosentezinde veya karbonhidrat biyosentezinde rol oynayan bir enzimi kodlayan bir gen, bir gen kodlayan gen lif kuvveti veya lif uzunlugunda yer alan bir enzim, sekonder metabolitlerin biyosentezinde rol oynayan bir enzimi kodlayan bir genden olusan bir grup arasindan seçilebilir. Istemler 4 - 7'den herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu yabanci DNA iki bitisik nükleotid dizisinden olusur, söz konusu bitisik nükleotid dizilerinden biri söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin yukari yönde DNA bölgesine yeterli homolojiye sahiptir, diger bitisik nükleotid dizisi, söz konusu bitisik nükleotid dizileri ile söz konusu yukari ve asagi DNA bölgeleri arasinda rek0mbinasyona olanak tanimak üzere söz konusu önceden tanimlanmis bölgenin asagi yönde dizisi ile yeterli homolojiye sahiptir. Istemler 1 - 3 veya 5 - 7'den herhangi birine göre bir yöntem olup, burada önceden seçilen bölge, birbirleriyle rekombinasyon için yeterli homolojiye sahip iki bölge ile bitisiktir. Istemler 1 ila 13'ten herhangi birine göre bir yöntem olup, burada söz konusu pamuk bitki hücresi ayrica bir pamuk bitkisine rejenere edilir.