CN103269577A - 经修饰以增加植物转化频率的土壤杆菌属的菌株 - Google Patents

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Abstract

提供了携带转化增强基因和植物转化二元载体的土壤杆菌属菌株及其用途，所述转化增强基因在能够独立于土壤杆菌属染色体复制的质粒(Ti质粒)上。另外，还提供了在导致植物转化二元载体的不稳定性或重排的DNA重组功能中有缺陷，并且携带转化增强基因和植物转化二元载体的土壤杆菌属菌株及其用途，所述转化增强基因在能够独立于土壤杆菌属染色体复制的质粒(Ti质粒)上。进一步包括了携带整合到土壤杆菌属染色体中某基因座处的转化增强基因的土壤杆菌属菌株及其用途，在所述基因座处不干扰或者损害土壤杆菌细胞的正常生长和植物转化能力。还描述了使用这些土壤杆菌属菌株制备的植物。

Description

经修饰以增加植物转化频率的土壤杆菌属的菌株
本申请要求2010年7月29日提交的美国临时申请号61/368,965的权益。在先申请的公开内容被视为本申请公开内容的一部分。
发明背景
植物转化一般涵盖了将植物可表达的外源基因引入植物细胞从而可以获得稳定维持和表达该外源基因的能育的后代植物所需要并加以利用的方法学。已经转化了单子叶植物和双子叶植物类别的众多成员。转基因的农作物以及水果和蔬菜具有商业利益。这类作物包括但不限于：玉米、稻、大豆、芸苔(canola)、向日葵、苜蓿、高粱(sorghum)、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯，等等。尽管已经开发了用于将植物可表达的外源基因引入植物细胞的植物转化系统，但还期望有容许增加转化效率的其它改良，并在用外源基因转化植物时在克服操作性缺陷中提供重要的优点。
已知数项用于将外源遗传物质引入植物细胞，并用于获得稳定维持和表达该引入基因的植物的技术。这类技术包括对包覆于微粒上的遗传物质直接进入细胞的加速(例如美国专利号4,945,050和美国专利号5,141,131)。其它转化技术包括碳化硅(silicon carbide)或WHISKERSTM技术。参见，例如，美国专利号5,302,523和美国专利号5,464,765。电穿孔技术也已用于转化植物。参见，例如，WO87/06614、美国专利号5,472,869、美国专利号5,384,253、WO92/09696、和WO93/21335。另外，可以采用植物原生质体与含有待递送的DNA的脂质体的融合、DNA的直接注射、以及其它可能的方法。
一旦已经将插入的DNA整合到植物基因组中，其在全部后续世代中通常是相对稳定的。转化细胞在植物内以通常方式生长。它们可以形成生殖细胞并将转化的一个或多个性状传递给后代植物。可以以正常的方式种植这类植物，并且可以将其与具有相同的转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得杂交个体具有相应的表型特性，例如，能够控制植物害虫进食的能力。
还可以使用多种备选的技术将DNA插入到宿主植物细胞中。那些技术包括但不限于，使用由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)递送的T-DNA作为转化剂来进行转化。可以使用土壤杆菌技术来转化植物，如记载于例如美国专利号5,177,010、美国专利号5,104,310、欧洲专利申请号0131624B1、欧洲专利申请号120516、欧洲专利申请号159418B1、欧洲专利申请号176112、美国专利号5,149,645、美国专利号5,469,976、美国专利号5,464,763、美国专利号4,940,838、美国专利号4,693,976、欧洲专利申请号116718、欧洲专利申请号290799、欧洲专利申请号320500、欧洲专利申请号604662、欧洲专利申请号627752、欧洲专利申请号0267159、欧洲专利申请号0292435、美国专利号5,231,019、美国专利号5,463,174、美国专利号4,762,785、美国专利号5,004,863、和美国专利号5,159,135中的。已经深入研究了含有T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途，并充分记载于欧洲专利申请120516；An等，(1985,EMBO J.4:277-284)，Fraley等，(1986,Crit.Rev.Plant Sci.4:1-46)，以及Lee和Gelvin(2008,PlantPhysiol.146:325-332)中，并且其在本领域中是良好确立的。
将T-DNA从土壤杆菌属转移到植物细胞的生物学是已知的。参见，例如Gelvin(2003)Microbiol.Molec.Biol.Rev.67:16-37；和Gelvin(2009)PlantPhysiol.150:1665-1676。在最低程度上，至少将T-DNA右边界重复(但经常是Ti或Ri质粒的右边界重复和左边界重复)作为期望插入到植物细胞中的基因的侧翼区连接(join)。T-DNA的左和右边界重复是T-DNA转移所需的至关重要的顺式作用序列。在总的土壤杆菌属基因组中编码了各种反式作用组件。其中主要的是由vir基因编码的蛋白质，该基因通常被发现是Ti或Ri质粒上的一系列操纵子。不同的Ti和Ri质粒在vir基因补足中有些不同，例如，virF并不总是存在。由vir基因编码的蛋白质实施许多不同的功能，包括识别植物细胞/细菌相互作用并进行信号传导、诱导vir基因转录、形成IV型分泌通道、识别T-DNA边界重复、形成T链、将T链转移到植物细胞、将T链输入到植物细胞核中、以及将T链整合到植物核染色体中，仅举几例。参见，例如Tzfira和Citovsky(2006)Curr.Opin.Biotechnol.17:147-154。
如果将土壤杆菌属菌株用于转化，那么可以将待插入植物细胞中的DNA克隆到特定质粒中，例如克隆到中间(穿梭)载体或二元载体中。中间载体不能在土壤杆菌属细胞中独立复制，但可以在一般的大肠杆菌(Escherichia coli)分子克隆菌株中对其进行操作和复制。这类中间载体包含的序列通常被T-DNA右边界和左边界重复区外接(frame)，其可以包括对转化植物细胞的选择有功能的可选择的标志基因、克隆接头、克隆多接头、或其它可以充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点的序列。由此，使用穿梭载体作为克隆载体，可以通过大肠杆菌中的标准方法学容易地实施对期望转移到植物的基因的克隆和操作。随后，可以将最后操作的穿梭载体引入土壤杆菌属植物转化菌株中用于进一步的工作。可以通过辅助质粒(经由细菌缀合)、通过电穿孔、通过化学法介导的直接DNA转化、或通过其它已知的方法学将中间穿梭载体转移到土壤杆菌属中。由于在Ti或Ri质粒或其衍生物和中间质粒之间同源的序列，可以通过同源重组将穿梭质粒整合到Ti或Ri质粒或其衍生物中。此同源重组(即质粒整合)事件由此提供了在土壤杆菌属中稳定维持改变的穿梭载体的手段，所述改变的穿梭载体具有复制起点和由共整合质粒的Ti或Ri质粒部分提供的其它质粒维持功能。Ti或Ri质粒还包含vir区，其包含T-DNA转移所必需的vir基因。携带vir区的质粒通常是突变的Ti或Ri质粒(辅助质粒)，其中T-DNA区(包括右和左T-DNA边界重复)已经缺失。这类具有功能性vir基因且缺少所有或基本上所有T区和有关元件的pTi衍生质粒，在本文中被描述性地称为辅助质粒。
超二元系统是穿梭载体/同源重组系统的一个特殊化例子(综述见Komari等，(2006)于：Methods in Molecular Biology(K.Wang编)No.343:Agrobacterium Protocols(第2版，第1卷)HUMANA PRESS Inc.,Totowa,NJ，第15-41页；和Komori等，(2007)Plant Physiol.145:1155-1160)。对超二元系统采用的根癌土壤杆菌宿主菌株是LBA4404(pSB1)。菌株LBA4404(pSB1)携带两种独立复制的质粒，pAL4404和pSB1。pAL4404是Ti-质粒-衍生的辅助质粒，其含有完整的vir基因集(来自Ti质粒pTiACH5)，但没有T-DNA区(且由此没有T-DNA左和右边界重复序列)。质粒pSB1供应了从pTiBo542衍生的另外的部分vir基因集；此部分的vir基因集包括virB操纵子和virC操纵子，以及基因virG和virD1。在超二元系统中使用的穿梭载体的一个例子是pSB11，其含有充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点的克隆多接头，侧翼为右和左T-DNA边界重复区。穿梭载体pSB11不能在土壤杆菌属中独立复制，但在经由pSB1和pSB11上存在的通用序列之间的同源重组整合到pSB1中时，被稳定维持为共整合质粒。因此，自两种不同的土壤杆菌属Ti质粒来源(pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白，对引入到经修饰的pSB11载体上的LBA4404(pSB1)中的完全修饰的T-DNA区起着有力的作用并将其转移到植物细胞中。已经证明超二元系统在单子叶植物物种的转化中特别有用。参见Hiei等，(1994)Plant J.6:271-282和Ishida等，(1996)Nat.Biotechnol.14:745-750。
除了土壤杆菌属Ti质粒携带的vir基因外，还已知其它染色体携带的毒力控制基因(称为chv基因)控制着土壤杆菌属细胞和植物细胞相互作用的某些方面，并由此影响总体植物转化频率(Pan等，(1995)Molec.Microbiol.17:259-269)。毒力和附接所需要的数种染色体携带基因聚集在跨越29kb的染色体基因座中(Matthysse等，(2000)Biochim.Biophys.Acta1490:208-212)。
不管采用哪种特定的质粒系统，将这样转化的土壤杆菌属细胞用于转化植物细胞。可以将植物外植体(例如，叶片、茎片段、根、还有原生质体或悬浮-培养的细胞)与根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌一起有利地培养以用于将DNA转移到植物细胞中。在放置到合适的生长条件和培养基(可能含有抗生素或除草剂用于选择经转化的植物细胞)中后，可以随后从感染的植物材料再生出全植物。然后可以对这样获得的植物测试插入DNA的存在。
这些用于向植物中引入外源遗传物质的技术可用于将有益性状引入到植物中。例如，每年花费数十亿美元以控制虫害，并且由于它们所造成的损害还另外损失数十亿。合成的有机化学杀虫剂已是用于控制虫害的主要工具，但是生物杀虫剂(诸如源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的杀虫蛋白)在一些区域(area)中起着重要作用。通过引入Bt杀虫蛋白基因来生成昆虫抗性植物的能力已经彻底改革了现代农业，并且提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
已经使用了数种Bt蛋白来创建昆虫抗性的转基因植物，所述转基因植物已经被成功地开发出来，并且在许多情况中已经被注册并商业化了。这些蛋白质包括谷物/玉米(corn)中的Cry1Ab、Cry1Ca、Cry1Fa、和Cry3Bb，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab，和马铃薯中的Cry3A。
除了其中期望的是2种蛋白质的组合杀虫谱的情况(例如组合谷物/玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb来分别提供对鳞翅类害虫和根虫的抗性)，或者其中蛋白质的独立作用使得它们可用作延迟昆虫易感群体中抗性产生的工具的情况(例如组合棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab来提供对烟草蚜虫的抗性管理)之外，表达Bt蛋白的商业化产品都表达单一的蛋白质。
也就是说，使得该技术被快速且广泛采纳的昆虫抗性转基因植物的一些性质还产生了一些忧虑，即害虫群体会对由这些植物生成的杀虫蛋白产生抗性。已经提出了数项策略来保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用，其包括将较高剂量的蛋白质与庇护所(refuge)组合运用，并交替或共同运用不同的毒素(McGaughey等.1998,Nature Biotechnol.16:144-146)。
如果选择Bt蛋白组合使用，那么它们需要独立发挥其杀虫效果，这样对一种蛋白质产生的抗性并不赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。典型地，使用通常对某种杀虫蛋白敏感的害虫物种群体来进行对交叉抗性的有力评估，而该害虫物种是已就对于杀虫蛋白抗性选择的。如果，例如就对于“蛋白A”的抗性选择的害虫群体对“蛋白B”敏感，那么我们会得出结论，即没有交叉抗性且蛋白A和蛋白B的组合在延迟单独的蛋白A抗性中有效。
在没有抗性昆虫群体的情况中，可以基于推测为与作用机制和交叉抗性潜力有关的其它特性来进行评估。已经提出了受体介导的结合在鉴定不太可能显示交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(美国专利号6,855,873)。该办法中的对缺乏交叉抗性的关键预测物为，杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。
在两种Bt Cry毒素竞争相同受体的事件中，如果该昆虫中的该受体突变使得毒素之一不再结合该受体并且由此对该昆虫不再是杀虫性的，那么还可能为以下情况，即该昆虫对第二种毒素(其竞争性结合相同的受体)也是抗性的。然而，如果两种毒素结合两种不同的受体，那么这可能指示该昆虫不会对那两种毒素同时为抗性。
Cry1Fa可用于控制许多鳞翅类害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer)(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))，并且对蔗螟(SCB；Diatraea saccharalis)有活性。
Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的谷物/玉米植物中生成的)负责工业领先的昆虫抗性性状以用于FAW控制。Cry1Fa还在
Figure BDA00002986637600051
、SMARTSTAXTM和WIDESTRIKETM产品中运用。
使用Cry1Fa蛋白进行(竞争性或同源的)受体结合研究的能力是有限的，因为可用于标记蛋白质以在受体结合测定法中进行检测的最常见的技术使得Cry1Fa蛋白的杀虫活性失活。
Cry1Ab和Cry1Fa是目前在转基因谷物/玉米中使用(分开地)的杀虫蛋白，以保护植物免受多种害虫侵害。这些蛋白质提供保护免受侵害的一种关键的谷物/玉米害虫是欧洲玉米螟(ECB)。美国专利申请号2008/0311096部分涉及了使用Cry1Ab以控制Cry1F抗性的ECB群体。
本申请描述了经修饰以提高植物转化频率的根癌土壤杆菌的菌株。这些菌株的使用提供了新的植物转化系统来将植物可表达的外源基因引入植物细胞中。另外，这些菌株提供了容许增加转化效率的另外改良，并且在用外源基因转化植物时在克服操作性缺陷中提供了重要的优点。
发明内容
在本文中描述了携带转化增强基因和植物转化二元载体的土壤杆菌属菌株及其使用方法，所述转化增强基因在能够独立于土壤杆菌属染色体复制的质粒(Ti质粒)上。所述土壤杆菌属菌株在导致植物转化二元载体的不稳定性或重排的DNA重组功能中有缺陷，并且携带转化增强基因和植物转化二元载体，所述转化增强基因在能够独立于土壤杆菌属染色体复制的质粒(Ti质粒)上。还描述了另外的土壤杆菌属菌株及其用途，所述菌株携带整合到土壤杆菌属染色体中某基因座处的转化增强基因，在所述基因座处不干扰或者损害土壤杆菌属细胞的正常生长和植物转化能力。
在本文中所描述的方法的一个实施方案中，通过使植物细胞与土壤杆菌属菌株接触来转化该植物，所述菌株具有至少一个包含pSB1的14.8KpnI片段的pTi辅助质粒，和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，所述T-DNA区包含至少T-DNA右边界和邻近于该边界的外源DNA，其中所述质粒具有相对于彼此的不同的复制起点。
在本文中所描述的方法的又一个实施方案中，通过使植物细胞与土壤杆菌属细菌接触来转化该植物，所述细菌具有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段，且具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，其中所述14.8KpnI VirBCDG片段已整合到该细菌染色体的中性整合位点中。
在本文中所描述的方法的一个另外的实施方案中，土壤杆菌属菌株包括至少一个包含pSB1的14.8KpnI片段的pTi辅助质粒，和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，其中所述质粒具有相对于彼此的不同的复制起点。
在又一个实施方案中，具有转化增强特性的土壤杆菌属菌株包括从pSB1分离的14.8KpnI VirBCDG片段和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒。
在另一个实施方案中，根癌土壤杆菌的nilA基因组基因座包括整合到nilA基因座中的多核苷酸序列。
在一个另外的实施方案中，土壤杆菌属菌株具有整合到土壤杆菌属染色体上的中性整合位点中的SB1的14.8KpnI VirBCDG片段。
在另一个实施方案中，土壤杆菌属菌株LB4404包括在pTi辅助质粒上的14.8KpnI VirBCDG片段和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，并具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的外源DNA，其中所述质粒具有相对于彼此的不同的复制起点。
在一个进一步的实施方案中，土壤杆菌属菌株LBA4404包括至少一个来自从pSB1分离的14.8KpnI VirBCDG片段的vir基因，该基因被整合到土壤杆菌属染色体上的中性整合位点中。
在另外的实施方案中，提供依照本文中描述的转化方法制备的植物。
在再一个实施方案中，能育的转基因谷物/玉米植物或其后代表达杀虫量的Cry1Ca蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白，和除草剂耐受量的AAD-1蛋白，其中从稳定并入该植物基因组中的重组DNA的单个基因座共同表达所述Cry1Ca、Cry1F、Cry1Ab1、和AAD1蛋白。
附图说明
图1：显示用于构建质粒pDAB9292的克隆方案。
图2：显示质粒pDOW3719的图谱。
图3：显示用于构建质粒pDAB9698的克隆方案。
图4：显示二元载体质粒pDAB101513和pDAB101514的图谱。
图5：显示二元载体质粒pDAB101556的图谱。
发明详述
土壤杆菌属的菌株在其转化植物细胞的能力中彼此不同。野生型致癌土壤杆菌属菌株以其在许多宿主植物特别是双子叶植物物种上诱导冠瘿(肿瘤性生长过度)的能力著称。从正常生长的植物细胞到不受自身调节的肿瘤细胞的这种转化的起因在于特殊化DNA序列(T-DNA)(其编码植物可表达的基因，该基因编码植物激素)从肿瘤诱导(Ti)质粒到植物细胞中的转移，其中它们被稳定整合到植物染色体中。来自菌株Bo542的Ti质粒(即pTiBo542)的著名之处在于，当置于一些土壤杆菌属染色体背景中时，其促进对一些植物上特别大的、旺盛生长的肿瘤的诱导(Hood等，(1986)J.Bacteriol.168:1291-1301)。对此“超毒力”表型负责的基因位于pTiBo542上T-DNA区以外。进一步的工作发现，含有自pTiBo542衍生的“15.8”千碱基对(kbp)KpnI片段并且含有完整的virG、virB和virC操纵子的质粒当与缺乏该质粒的菌株相比时促进了菌株A281的肿瘤形成的增加(Jin等，(1987)J.Bacteriol.169:4417-4425)。pTiBo542的virG基因被认为负责土壤杆菌属菌株A281的超毒力表型。来自pTiBo542的virG相比于来自pTiA6的virG导致virB表达中1.7倍的增加，这是由于两基因之间在启动子区、编码序列、和3’非翻译区中的差异(Chen等，(1991)Molec.Gen.Genet.230:302-309)。因此，可以将来自pTiBo542的virG基因有利地用于促进更高的T-DNA转移效率，以及由此更高的植物转化频率，尤其在其存在于还携带pTiBo542virB和virC操纵子的pTiBo542质粒的大的KpnI片段上时。
pTiBo542的完整的、注释的序列于2005年5月12日被提交到GENBANK，登录号为DQ058764。对KpnI限制片段图谱和基因注释的检查揭示，完整的virB操纵子(其包括基因virB1、virB2、virB3、virB4、virB5、virB6、virB7、virB8、virB9、virB10和virB11)、virG基因、virC操纵子(其包含基因virC1和virC2)和包含基因virD1的virD操纵子的部分是可在包含14,815个碱基对(bp)的KpnI片段上分离的。Jin等，(见上)中所指的KpnI片段“15.8kbp”的大小大概是从该片段的琼脂糖凝胶迁移率估计的，并且所指片段的真实大小实际上为14.8kbp。分子生物学领域中的技术人员会理解经由琼脂糖凝胶电泳迁移率对这类较大的DNA片段的大小估计可能与由DNA序列分析测定的真实片段大小有1kbp或更大的不同。为了易于描述，自pTiBo542衍生的该片段在本文中称为14.8KpnI VirBCDG片段。
本文中所描述的方法的一个实施方案包括在自pSB1分离的14.8KpnIVirBCDG片段上编码的转化增强特性在携带至少一个卸甲pTi辅助质粒的土壤杆菌属菌株中的用途，其中14.8KpnI VirBCDG片段位于具有不属于IncP的不相容组的复制起点的质粒上以转化植物。一个进一步的实施方案包括将如描述的土壤杆菌属菌株用在该方法中。使用该土壤杆菌属菌株要引入植物的T-DNA区可以位于具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒上，该质粒具有IncP不相容组或与14.8KpnI VirBCDG片段的不相容组相容的不相容组的复制起点，所述14.8KpnI VirBCDG片段位于具有不属于IncP的不相容组的复制起点的质粒上。该质粒的T-DNA区可以邻近于土壤杆菌属T-DNA右边界和左边界。
基于质粒中含有的序列，将质粒归属于不相容组(基因型命名：inc；组命名：Inc)。inc决定子通常起作用以避免相同或有关的不相容组的其它质粒共同存在于相同的宿主中，并且帮助维持该质粒在细胞中的特定拷贝数。参见，例如Fernandez-Lopez,等，(2006)FEMS Microbiol.Rev.30:942-66；以及Adamczyk和Jagura-Burdzy(2003)Acta Biochim.Pol.50:425-53。如果两个质粒中的任何一个在存在另一个的情况下比其单独存在时更不稳定，那么这两个质粒是不相容的。当在相同细胞中发现同一不相容组的两个质粒时，可能产生对细胞资源的竞争。哪个质粒能够更快地复制或提供一些其它优势，其就会在不相容系统允许的拷贝中以不成比例的程度呈现出来。令人惊讶地，当质粒都具有将其自身分裂到子细胞中的相同的功能时，它们也可能是不相容的。
质粒通常仅落入许多现有的不相容组之一。有超过30种已知的不相容组。已经彻底研究了属于不相容组IncP的质粒，并且已经构建了大量自该IncP组衍生的质粒(Schmidhauser等，(1988)Biotechnology10:287-332)。含有IncP不相容组的例示性质粒包括：pMP90RK、pRK2013、pRK290、pRK404和pRK415。可以在众多细菌物种包括大肠杆菌和根癌土壤杆菌中维持这些质粒。其它不相容组的例子包括但不限于：IncN、IncW、IncL/M、IncT、IncU、IncW、IncY、IncB/O、IncFII、IncII、IncK、IncCom9、IncFI、IncFII、IncFIII、IncHIl、IncHI2、IncX、IncA/C、IncD、IncFIV、IncFV/FO、IncFVI、IncHl3、IncHII、Inc12、IncI、IncJ、IncV、IncQ，等等，包括其变体，例如显示基本的序列或功能关系的变体。表1列出了数种普遍已知的不相容组并且提供了代表这些不相容组的质粒的例子(该不相容组和质粒的列表仅作为例子提供，并且不意图限制可用于本文中所描述的土壤杆菌属菌株和方法的不相容组和质粒)。
本文中所描述的方法的另一个实施方案包括在自pSB1分离的14.8KpnIVirBCDG片段上编码的转化增强特性在具有RecA功能缺陷并且携带至少一个卸甲pTi辅助质粒的土壤杆菌属菌株中的用途，其中所述14.8KpnIVirBCDG片段位于具有不属于IncP的不相容组的复制起点的质粒上。一个进一步的实施方案包括将如描述的土壤杆菌属菌株用在该方法中。使用该土壤杆菌属菌株待引入植物的T-DNA区可以位于具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒上，该质粒具有IncP不相容组或与14.8KpnIVirBCDG片段的不相容组相容的不相容组的复制起点，所述14.8KpnIVirBCDG片段位于具有不属于IncP的不相容组的复制起点的质粒上。
本文中所描述的方法的再一个实施方案包括在自pSB1分离的14.8KpnIVirBCDG片段上编码，且携带至少一个卸甲pTi辅助质粒的转化增强特性的用途，其中所述14.8KpnI VirBCDG片段被整合到不同于菌株C58的土壤杆菌属菌株的染色体位置上的中性整合位点中。一个进一步的实施方案包括如描述的土壤杆菌属菌株用在该方法中。使用该土壤杆菌属菌株待引入植物的T-DNA区进一步包含具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒。
尽管超二元系统是已知的(例如参见WO94/00977A1、WO95/06722A1和WO95/16031A1，并且进一步由Komari等，(见上)，和Komori等，(见上)描述)，但是这些系统具有许多缺点。超二元系统的操作性缺点(其被本文中描述的土壤杆菌属菌株和方法克服)是，必须通过在pSB1和pSB11(及其衍生物)之间形成共整合质粒来使位于pSB11衍生物上的改变的T-DNA在土壤杆菌属中稳定维持。由于pSB1和pSB11同源区之间的重组，该共整合事件生成一对大的(约2.3kbp)直接重复的序列。如分子生物学领域中的技术人员公知的，这样的大的重复序列是用于分子内重组的优选靶物，特别当所述重复是质粒结构的一部分时，所述分子内重组最终导致DNA缺失和其它重排。在土壤杆菌属超二元系统中，这类重排可导致由pSB11衍生物引入的T-DNA区的部分重排或完全丧失，其最终导致完整的期望外源基因很少或没有转移到宿主植物细胞中。
上文所描述的超二元系统的进一步的缺点(并且其也被本文中所描述的土壤杆菌属菌株和方法克服)是，在pSB1和pSB11衍生物之间的共整合质粒的形成生成了大的质粒(最低限度超过43kbp)，其具有两个独特的ColE1型(不相容组pMB1/ColE1)复制起点(ori)，以及自RK2质粒(不相容组IncP)衍生的第三ori。尽管在正常情况中，ColE1ori在土壤杆菌属中是无功能的，但是已知允许具有ColE1ori的质粒在土壤杆菌属中稳定维持的基因组突变(Ruslyakova等，(1999)Russian J.Genet.35:327-331)。在具有这类突变的细胞中，会预期质粒诸如具有3个功能性复制起点的pSB1::pSB11衍生物共整合体是高度不稳定的。因此，超二元系统具有的缺点被本文中所描述的土壤杆菌属菌株的元件和用于转化植物的方法有利地解决了。
预定通过土壤杆菌介导的转化引入转基因植物细胞并在其中表达的一个或多个外源基因的DNA结构可能对携带那些基因的二元载体质粒或穿梭载体质粒在大肠杆菌和土壤杆菌属的细胞中的稳定性具有深远的影响。当外源基因包含在基因构建体中多次采用的基因组件时，尤其表现不稳定性。例如，可以使用特定的植物可表达的启动子来驱动不同的蛋白质编码区在转基因植物中的表达，这并非不常见的。在单个T-DNA区内可以复制其它基因组件或者其以多个拷贝存在，所述其它基因组件诸如3’非翻译区(3’UTR)(即决定转录终止和多腺苷酸化添加的序列)和甚至高度类似的蛋白质编码区。如上文提述的，这些重复的序列元件(可能以倒置或直接重复的取向存在)是可能导致DNA缺失和其它重排的分子内重组的靶物，特别在所述重复是质粒结构的一部分时。
已经开发了多种大肠杆菌的特殊化菌株充当分子克隆宿主，这帮助克服了这类不稳定性困难(例如由INVITROGEN;Carlsbad,CA提供的STBL2TM、STBL3TM和STBL4TM菌株)。所有这类大肠杆菌克隆菌株的共同特征是在recA基因中存在基因突变。RecA蛋白是一种多功能酶，其在同源重组、DNA修复、和细菌SOS应答的诱导中起作用。在同源重组过程中，该蛋白质发挥着DNA依赖性ATP酶的功能，其促进同源DNA之间的联会(synapsis)、异源双链体的形成和链交换。由此，RecA功能缺陷的细胞更倾向于容许同源DNA序列而没有重排或缺失。
已经开发了土壤杆菌属的RecA缺陷菌株来帮助解决在克隆含有重复序列的大DNA片段时观察到的不稳定性问题(Klapwicj等，(1979)Molec.Gen.Genet.173:171-175;Farrand等，(1989)J.Bacteriol.171:5314-5321;Lazo等，(1991)Bio/Technology9:963-967)。已经证明了这些菌株在一些情况中在帮助稳定高分子量的转化构建体中是有用的(Frary和Hamilton,(2001)TransgenicRes.10:121-132)，但并非在所有情况中都如此(Song等，(2003)Theor.Appl.Genet.107:958-964)。因此，在开发在质粒维持和植物转化能力中高度有效的菌株中可以有利地使用recA缺陷的土壤杆菌属染色体背景。除了使用recA缺陷的土壤杆菌属染色体背景来开发用在本文中所描述的方法中的菌株外，还可以使现存或产生的菌株中的recA功能性失活来使该菌株可用于本文中所描述的方法中。参见，例如Farrand等(见上)。例如，可以开发具有RecA功能性的菌株并进行任何期望的染色体添加(例如添加vir基因)，然后使RecA功能性失活。
可以使用BIBAC载体，其被设计为能够将大的DNA片段有效转化到植物和非植物宿主细胞中。参见，例如美国专利号5,733,744、美国专利号5,977,439和美国专利申请号2002/0123100A1。一种可以和BIBAC载体一起利用的土壤杆菌属菌株是由Farrand等，(见上)开发的RecA缺陷菌株UIA143。对BIBAC系统的改进使用了位于14.8KpnI VirBCDG片段上的基因子集和其它vir基因的组合来增强经工程改造的土壤杆菌属菌株的植物转化能力。具体地，已经在UIA143RecA缺陷菌株中单独地或与来自pTiA6的virE1和virE2基因组合采用了来自14.8KpnI VirBCDG片段的virG基因。参见，例如Hamilton等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:9975-9979;Hamilton,(1997)Gene200:107-116;Frary和Hamilton,(见上)。
另外，使用本文中描述的方法用于转化植物细胞的合适的载体可以含有可选择的标志基因，其编码赋予转化的植物细胞对抗生素或除草剂抗性的蛋白质。因此，分别采用的可选择标志基因可以允许对转化细胞的选择，而不含有插入DNA的细胞的生长可能受到该选择性化合物的抑制。使用的特定的可选择基因(一种或多种)可以依赖于实验设计或偏好，但可以使用以下任一种可选择标志物以及任何未在本文中列出但可以充当可选择标志物的其它基因。可选择标志物的例子包括但不限于，提供对抗生素诸如卡那霉素、G418、潮霉素、博来霉素、和甲氨蝶呤的抗性或耐受的基因，或提供对除草剂诸如膦丝菌素(双丙氨膦(Bialaphos))、草甘膦、咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶(Triazolopyrimidine)、氯磺隆(Chlorosulfuron)、溴草腈(Bromoxynil)、和茅草枯(DALAPON)的抗性或耐受的基因。
除了可选择标志物外，还可以使用报告基因。在一些情况中，可以使用报告基因而没有可选择标志物。报告基因是通常不向受体生物体或组织提供生长优势的基因。报告基因通常编码提供表型变化或酶特性的蛋白质。合适的报告基因包括但不限于，编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤火虫萤光素酶、或荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的那些。
除了众多用于转化植物的技术外，与外源基因接触的组织类型也可以变化。这类组织可以包括但不限于，胚组织、I和II型愈伤(callus)组织、下胚轴(hypocotyl)、和分生组织。使用本领域技术中的合适的技术，几乎可以在脱分化期间转化所有的植物组织。植物转化领域中的技术人员会理解有多种方法学可用于生成转化植物，并且可以对它们进行修改和专门化以容纳各种宿主植物物种之间的生物学差异。
不管采用哪种特定的转化技术，都可以将外源基因并入基因转移载体中，该基因转移载体通过在载体中纳入植物启动子而适于在植物细胞中表达该外源基因。除了植物启动子外，还可以在植物细胞中有效地使用来自各种来源的启动子来表达外源基因。例如，可以使用细菌来源的启动子，诸如章鱼碱(octopine)合酶启动子、胭脂碱(nopaline)合酶启动子、甘露碱(mannopine)合酶启动子；病毒来源的启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子，来自甘蔗杆状病毒的启动子，等等。自植物衍生的启动子包括但不限于，核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)启动子、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆蛋白(phaseolin)启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、以及组织特异性的启动子。启动子还可以含有特定的增强子序列元件，其可以改善转录效率。典型的增强子包括但不限于，醇脱氢酶1(ADH1)内含子1和ADH1内含子6。可以使用组成型启动子。组成型启动子在近乎所有的细胞类型中且在近乎所有的时间都指导连续的基因表达(例如肌动蛋白启动子、泛素启动子、CaMV35S启动子)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型诸如叶或种子中的基因表达。其它可以使用的启动子的例子包括那些在植物发育的某个阶段期间有活性的，以及在特定植物组织和器官中有活性的。这类启动子的例子包括但不限于，根特异性、花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝(corn silk)特异性、棉花纤维特异性、种子胚乳特异性、以及韧皮部特异性的启动子。
在某些情况下，可能期望使用可诱导的启动子。可诱导的启动子负责应答特定信号的基因表达，所述特定信号诸如物理刺激(例如热休克基因启动子)；光(例如核酮糖二磷酸1,5羧化酶启动子)；激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢物；和应激/胁迫(stress)(例如干旱)。还可以使用其它在植物中发挥功能的合意的转录和翻译元件，诸如例如5’非翻译前导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸化添加信号序列。可以使用本领域已知的任何合适的植物特异性的基因转移载体。
含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物盛行于遍及北美洲的谷物/玉米和棉花植物中，并且这些性状的使用正在全球扩张。多个种子公司已经开发出商业化的转基因作物，其组合了IR和除草剂耐受(HT)性状。这些包括由Bt(苏云金芽孢杆菌)杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状诸如对以下物质的耐受：乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、磺酰苯胺(Sulfonanilide)，等等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂诸如双丙氨膦、草铵膦(Glufosinate)，等等。4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂诸如甲基磺草酮(Mesotrione)、异噁唑草酮(Isoxaflutole)，等等；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EnolPyruvylShikimate-3-Phosphate Synthase)(EPSPS)抑制剂诸如草甘膦等等，以及乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂诸如氟吡氯禾灵(Haloxyfop)、喹禾灵(Quizalofop)、氯甲草(Diclofop)，等等。其它例子是已知的，其中转基因提供的蛋白质提供了植物对化学类除草剂的耐受性，所述化学类除草剂诸如苯氧酸除草剂和吡啶基氧乙酸盐(pyridyloxyacetate)生长素除草剂(参见WO2007/053482A2)、或苯氧酸除草剂和芳基氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxypropionate)除草剂(参见WO2005107437A2、A3)。经由IR性状控制多种害虫问题的能力是有价值的商业化产品概念，而且如果在同一植物中组合昆虫控制性状和杂草控制性状，那么该产品概念的方便性也得到增强。进一步地，可以经由由Bt杀虫蛋白赋予的IR性状与一个或多个另外的HT性状(诸如那些上文所提及的)、加上一个或多个额外的输入性状(例如由Bt衍生的或其它杀虫蛋白赋予的其它昆虫抗性、由机制诸如RNAi等等赋予的昆虫抗性、疾病抗性、应激耐受、改善的氮利用，等等)、或输出性状(例如高油含量、健康的油组成、营养改善，等等)的单一植物组合来获得改善的价值。这类组合可以经由常规育种(例如育种堆)来获得，或作为牵涉同时引入多种基因(例如分子堆)的新的转化事件共同获得。有益之处包括管理虫害的能力以及作物植物中改善的杂草控制，其为生产者和/或消费者提供了次级益处。因此，可以使用本文中描述的土壤杆菌属菌株和方法来提供具有性状组合的转化植物，所述性状组合包含改善的作物质量的完整农业包，该农业包具有灵活并经济地控制任意数目的农业问题的能力。
已经对各种pTi质粒的virG基因进行了研究以理解其增强植物转化频率的能力。Liu等，(1992,Plant Molec.Biol.20:1071-1087)发现来自多种来源(即来自不同的pTi质粒，但包括pTiBo542)的virG基因的额外拷贝增强了一些植物的瞬时转化，并且效应的幅度依赖于辅助pTi质粒(与特定virG基因配对)的同一性。VirG基因(假定来自pTiA6)的一种突变体(称为virGN54D(该突变用Asp取代氨基酸Asn54))在土壤杆菌属中组成型表达(野生型virG基因的诱导需要酸性pH、高单糖浓度、和酚诱导物诸如乙酰丁香酮的存在)。参见Pazour等，(1992)J.Bacteriol.174:4169-4174。pTiA6的VirGN54D在增强玉米转化中是有效的，而亲本野生型virG的多拷贝是无效的。参见Hansen等，(1994)J.Bacteriol.174:4169-4174。已经描述了“三元”(即三质粒)系统，其中来自pTi15955的组成型突变virGN54D基因的拷贝共存于根癌土壤杆菌菌株LBA4404中pBBR1衍生的质粒上，所述菌株含有卸甲pTi辅助质粒pAL4404和携带用于植物转化的基因的二元载体。参见van der Fits等，(2000)PlantMolec.Biol.43:495-502。发现组成型表达的virGN54D基因急剧增加了数种植物物种的瞬时和稳定转化效率。不能将含有pBRR1复制控制区的质粒归类为属于任何已知的不相容组，并因此可以和宽广范围的其它质粒共存在于单个宿主中。此外，已经测试了vir基因的各种组合影响烟草、棉花和稻中植物转化效率的能力，具体地：自pTiA6衍生的突变virGN54D基因、来自pTiBo542的virG基因、来自pTiA6的VirE1/E2基因、以及后两个基因集的组合。参见Park等，(2000)Theor.Appl.Genet.101:1015-1020。对一些植物物种和vir基因的额外拷贝观察到了转化效率中的增加。
欧洲专利申请号2042602A1和美国专利申请号2010/0132068A1描述了粘粒二元载体和“加强”质粒在存在于携带pTi辅助质粒的土壤杆菌属细胞中时，构成了三元质粒系统的另外的例子。如本文中披露的加强质粒具有IncW不相容组的复制起点，且包含具有virGN54D基因的质粒pVGW，和作为pVGW的衍生物的质粒pVGW2，其具有促进克隆和选择的修饰。
通常通过两种基因方法来确定由土壤杆菌属中的染色体基因编码的功能。第一种(或在前的)基因方法，必需获得要研究的基因的分子克隆，随后将所克隆的基因放置在遗传环境中，其中可以评估“功能获得”表型。第二种(或“逆基因方法”)需要通过在染色体中基因中或其周围序列的插入或缺失来破坏基因的结构，随后通过基因功能的损失来确定哪些蛋白质或表型已经被除去。这是构建前文所描述的菌株C58的RecA缺陷突变体所使用的方法。参见Farrand等，见上。那些基因操作土壤杆菌属细胞领域中的技术人员会理解，已经描述了各种载体和众多方法来使这类基因破坏实验可行。在用于鉴定不牵涉突变菌株的活力、生长、和植物转化能力的基因时，该方法已被证明是特别有用的。土壤杆菌属菌株C58中的一种这类基因座是pgl/picA基因座。参见，Lee等，(2001)Plant Microbe Interact.14:577-579；和Lee(2006)于：Methods in Molecular Biology(K.Wang编)No.343:AgrobacteriumProtocols(第2版，第1卷)HUMANA PRESS Inc.,Totowa,NJ.第55-66页。已经发现，其中virD2基因已经通过同源重组整合到该染色体基因座中的细胞所具有的植物转化表型与携带位于复制质粒上的virD2基因的根癌土壤杆菌菌株产生的相同。参见Lee等，见上。此外，可以将整合到C58的pgl/picA基因座的T-DNA区功能性递送到植物细胞(Oltmanns等2010.Plant Physiol.152:1158-1166)。因此，在菌株C58中，pgl/picA基因座可以充当用于将基因引入C58染色体的“中性整合位点”。如本文中使用的，“中性整合位点”指天然存在于土壤杆菌属细胞的染色体上的基因或染色体基因座，其正常功能不是细胞生长或细胞实施植物转化所需的所有功能的能力所需要的。当被通常不存在于该基因中的DNA序列的整合破坏时，携带破坏的中性整合位点基因的细胞可以多产地实施植物转化。举例而言，Hoekema等(1984,EMBO J.3:2485-2490)证明了经由Tn3转座整合到C58染色体中未表征的基因座中的功能性T区被多产地转移到植物细胞中。
可以有利地使用本文中论述的土壤杆菌属菌株来向植物中引入一种或多种基因，例如向植物提供单个或多个杀虫或除草特性。例如，可以使用土壤杆菌属菌株来向植物中引入1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种基因。使用本文中所描述的土壤杆菌属菌株，在转化植物细胞时将含有可选择基因序列的多核苷酸插入到植物细胞中的单个位置中。就用于插入基因的T-DNA区的大小而言，该T-DNA区可以等于或大于15,000个核苷酸碱基对、大于或等于20,000个核苷酸碱基对、等于或大于25,000个核苷酸碱基对、等于或大于26,000个核苷酸碱基对、等于或大于27,000个核苷酸碱基对、等于或大于28,000个核苷酸碱基对、等于或大于29,000个核苷酸碱基对、等于或大于30,000个核苷酸碱基对。当使用本文中所描述的土壤杆菌属菌株时，可选择的基因序列可以具有等于或大于60%、等于或大于65%、等于或大于67%、等于或大于69.5%、等于或大于70%、等于或大于75%、或等于或大于80%的序列同源性，并保留它们的可转录序列的身份。可以引入的基因的类型可以编码杀虫蛋白、除草蛋白、或杀虫蛋白和除草蛋白的混合物。可以引入的基因的特定例子包括编码以下蛋白的基因：Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白和AAD1除草蛋白，其可以以各种组合或作为包括所有四种蛋白的集合引入。可以使用这些土壤杆菌属菌株来转化单子叶植物和双子叶植物物种。
还在本文中披露的是可以向其中整合多核苷酸序列的根癌土壤杆菌的nilA基因组基因座。这类整合的多核苷酸序列可以包括任何vir基因或vir操纵子或其它有用的基因。实施例17-20显示了对根癌土壤杆菌的nilA基因组基因座的鉴定、表征和使用，以及具有位于染色体上的多个vir基因的根癌土壤杆菌菌株的生成。使用本文中所描述的鉴定和表征的技术，可以鉴定其它土壤杆菌属菌株中的nilA基因组基因座或享有85-100%核苷酸序列同一性的任何基因座，并且可以以类似于本文中所描述的方式将任何这类鉴定的nilA基因座用于整合vir或其它合适的基因，其可以例如提高植物转化的效率。还可以将本文中所描述的用于鉴定和表征这类基因组基因座的技术用于鉴定土壤杆菌属染色体上的其它中性整合位点，在这些位点上可以整合含有vir或其它基因的多核苷酸序列从而使得该土壤杆菌属菌株仍然能够转化植物。一些可以用作中性整合位点的染色体位点是已知的，例如RecA缺陷菌株中的RecA位点、根癌土壤杆菌菌株C58中的pgl/picA基因座。然而，需要鉴定除C58外的其它根癌土壤杆菌菌株中的新的中性位点，因为在一些其它菌株例如菌株LBA4404中未检测到pgl/picA基因座(Oltmanns等，见上)。可用作中性整合位点的其它染色体位点记载于美国专利号6,323,396。由此，还披露了具有整合到土壤杆菌属染色体上的中性整合位点的vir基因的土壤杆菌属菌株。这类土壤杆菌属菌株可使用nilA基因组基因座或其它中性整合位点来整合vir基因。
可以以此种方式向染色体加入各种类型的有用基因，其使得T-辅助质粒的使用变得不必要。例如，可以使用来自不同菌株的另外的vir基因和有用的vir基因的多个拷贝。
还在本文中披露的是一种土壤杆菌属菌株，其在辅助质粒上含有vir基因，该辅助质粒具有除IncP以外的不相容组的复制起点，该菌株含有具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒，该质粒具有IncP不相容组的复制起点。
进一步披露了使用本文中描述的土壤杆菌属菌株由本文中描述的方法制备的植物。这类植物稳定地整合任何使用本文中描述的方法引入的T-DNA区。此外，这类植物表达任何由那些T-DNA区赋予的基因，并且展示任何由那些T-DNA区赋予的遗传性状。另外，使用本文中描述的土壤杆菌属菌株由本文中描述的方法制备的植物的任何后代稳定地生成由亲本中发现的那些T-DNA区赋予的任何基因且显示任何由亲本中发现的那些T-DNA区赋予的遗传性状。
在一个特定的实施方案中，描述了稳定表达Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白和AAD1除草蛋白的植物。例如，该植物可为玉米。
尽管在本文中描述了特定的土壤杆菌属菌株的例子，但可以将所论述的功能性用相同的标准移至其它土壤杆菌属菌株，例如其它RecA缺陷的或可以变成RecA缺陷的菌株。可以和本文中描述的菌株和方法一起使用的其它菌株的例子包括但不限于，根癌土壤杆菌菌株C58、根癌土壤杆菌菌株Chry5、发根土壤杆菌菌株、根癌土壤杆菌菌株EHA101、根癌土壤杆菌菌株EHA105、根癌土壤杆菌菌株MOG101、以及根癌土壤杆菌菌株T37。
本文中所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过提述以其整体并入，其程度为它们与本说明书的明确教导并非是不一致的。
以下是实施例，其例示了利用土壤杆菌属菌株并实践本文中描述的方法的规程。这些实施例不应被理解为限制性的。除非另外注明的，所有的百分比都按重量计，且所有的溶剂混合物比例都按体积计。所有的温度都以摄氏度。
除非另外指出或暗示的，如本文中使用的术语“一个/一种/该”都表明“至少一个”。
实施例
实施例1：质粒pUCD2的缺失变体的构建
Close等，(1984,Plasmid12:111-118)描述了质粒pUCD2的构建，并且完整的13,239bp DNA序列在本文中首次披露为SEQ ID NO:1。pUCD2具有四个赋予对抗生素的细菌抗性的基因：具体地，对壮观霉素、卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的抗性(图1)。在本实施例和本公开的其它实施例中描述的此和其他步骤中都采用了标准的分子生物学方法，如教导于例如Sambrook等，(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，COLD SPRING HARBORLABORATORY PRESS,Plainview,N.Y.)和Ausubel等，(1995,Current Protocolsin Molecular Biology,(GREENE PUBLISHING AND WILEY-INTERSCIENCE,New York)及其更新内容中的。通过用限制酶Sac I和Sac II切割pUCD2DNA并连接到通常双链的寡核苷酸片段来完成对pUCD2的首次修饰，所述寡核苷酸片段具有适当的突出的“粘性末端”，其与Sac I或Sac II生成的突出相容。此双链寡核苷酸(图1)是通过将两条互补的寡核苷酸序列(披露为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)退火创建的。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的寡核苷酸序列被设计为在与经Sac I和Sac II切割的pUCD2DNA连接时，重建功能性的卡那霉素抗性基因。该操作创建了质粒pDAB9290(图1)，其与pUCD2的不同在于，壮观霉素抗性的编码区的缺失、Kpn I限制酶识别位点从卡那霉素抗性的编码区内的消除、和卡那霉素抗性编码区下游的新的Kpn I位点的创建。
进一步操作质粒pDAB9290的DNA以使编码四环素抗性和氨苄青霉素抗性的基因无效，其通过首先用限制酶Pst I和Sal I切割，用QUICKBLUNTINGTM试剂盒(NEW ENGLAND BIOLABS;Ipswich,MA)处理这些酶留下的突出末端以创建平端，并且自身连接以使由此生成的片段成环。所得质粒(pDAB9291)仅保留了卡那霉素细菌抗生素抗性基因，并且在卡那霉素抗性基因下游具有单独的Kpn I切割位点。PDAB9291的序列被公开为SEQ IDNO:4。质粒pDAB9291具有两个复制起点，一个(colE1不相容组)自质粒pBR322衍生，第二个自质粒pSa(不相容组W)衍生。因此，质粒pDAB9291能够在大肠杆菌和土壤杆菌属中维持中等拷贝数。
实施例2：将14.8Kpn I virBCDG片段克隆到pDAB9291中
从质粒pSB1分离14.8kbp Kpn I片段，其含有来自“超毒力”的pTiBo542的virG、virB和virC操纵子和virD1(图1)(Komari等，见上；和Komori等，见上)，并将其克隆到pDAB9291的唯一的Kpn I位点中。获得了各含有插入片段的两种可能取向之一的质粒，并称之为pDAB9292和pDAB9293。选择一种质粒pDAB9292(图1)用于后续工作。PDAB9292的序列被披露为SEQ ID NO:5。
实施例3：构建携带辅助质粒pTiEHA105的RecA缺陷的土壤杆菌属菌株
土壤杆菌属菌株UIA143是具有C58遗传背景的RecA缺陷菌株，并且其由Farrand等，(见上)构建和描述。使染色体的recA基因缺失并用赋予对150μg/mL红霉素的抗性的基因盒取代。UIA143菌株不含有Ti质粒或Ti质粒衍生物。
由Hood等，(1993,Transgenic Research2:208-221)构建和描述的土壤杆菌属菌株EHA105具有自“超毒力”pTiBo542质粒衍生的辅助质粒(本文中称为pTiEHA105)。从菌株EHA105制备质粒pTiEHA105DNA，并通过电穿孔将其引入到经由标准方法(Weigel和Glazebrook,(2002)Arabidopsis:A LaboratoryManual.COLD SPRING HARBOR PRESS,Cold Spring Harbor,NY,354页；Mersereau等，(1990)Gene90:149-151;Mattanovich等，(1989)Nucl.Acids Res.17:6747))制成电感受态的菌株UIA143的细胞中。对于用pTiEHA105转化的菌株UIA143细胞，就其在AB基本培养基(Watson,等，(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上生长的能力进行选择，所述培养基使用纯化的琼脂和甘露碱(2mg/mL)作为用于生长的碳和氮的唯一来源(Guyon等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:2693-2697;Dessaux等，(1987)Molec.Gen.Genet.208:301-308)。
通过使用经设计以扩增pTiBo542virD2和virG基因片段的引物的聚合酶链式反应(PCR)来验证pTiEHA105的存在，并通过对从候选菌落制备的总DNA的Southern印迹分析进行进一步表征，其使用通过氯化铯梯度离心纯化的pTiEHA101的经32P标记的DNA作为探针。该土壤杆菌属菌株(即含有pTiEHA105的UIA143)被称为DA2552。
实施例4：构建携带辅助质粒pTiC58Δ的RecA缺陷的土壤杆菌属菌株
通过将根癌土壤杆菌菌株C58的pTiC58质粒的完整T-DNA区用Tn903的npt I基因(赋予卡那霉素抗性)替换得到菌株Z707。所得质粒(本文中称为pTiC58Δ)的全部vir区保留完整(Hepburn等，(1985)J.Gen.Microbiol.131:2961-2969)。通过氯化铯梯度离心纯化来自菌株Z707的辅助质粒pTiC58Δ，并且将其电穿孔到电感受态的UIA143细胞中。在pTiC58Δ质粒携带的卡那霉素抗性基因和染色体携带的红霉素抗性基因的基础上选择转化体，并将该菌株称为DA2569。通过使用检测所选择的vir基因区的引物的PCR扩增，并且通过对从DA2569候选菌落制备的总DNA的Southern印迹分析，验证了DA2569中pTiC58Δ的存在，所述Southern印迹分析使用pTiC58Δ的经32P标记的DNA作为探针，而pTiC58Δ是从菌株Z707的细胞通过氯化铯梯度离心纯化的。
实施例5：构建携带辅助质粒pMP90的RecA缺陷的土壤杆菌属菌株
根癌土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)携带称为pMP90的缺失型pTiC58，所述pMP90缺失全部T-DNA区并被赋予庆大霉素抗性的基因替换(Koncz和Schell,(1986)Mol.Gen.Genet.204:383-396)。通过诸如氯化铯梯度离心或MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI试剂盒“低拷贝”(MACHEREY-NAGEL Inc.;Bethelem,PA)的方法来制备质粒pMP90的DNA，并且将其电穿孔到UIA143细胞中。基于pMP90质粒携带的庆大霉素抗性基因(100μg/mL)选择转化体，并将该菌株称为DAt20538。通过使用检测所选择的vir基因区的引物的PCR扩增，并且通过对从DAt20538制备的总DNA的Southern印迹分析，验证了DAt20538中pMP90的存在。
实施例6：构建携带辅助质粒pMP90RK的RecA缺陷的土壤杆菌属菌株
通过引入(经由双交换同源重组)自质粒pRK2013衍生的42kbp EcoR I片段对实施例5中描述的辅助质粒pMP90进一步修饰(Figurski和Helinski,(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1648-1652)。所述42kbp片段含有用于质粒复制和活动化的质粒RK2衍生基因(例如trfA、tra1、tra2、tra3和oriT)，和赋予卡那霉素抗性的基因。此操作替换了质粒pMP90的庆大霉素抗性基因，并且所得质粒被称为pMP90RK(Koncz和Schell,见上)。通过诸如氯化铯梯度离心或MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI试剂盒“低拷贝”(MACHEREY-NAGEL Inc.;Bethelem,PA)的方法来制备质粒pMP90RK的DNA，并且将其电穿孔到电感受态的UIA143细胞中。基于pMP90RK质粒携带的卡那霉素抗性基因选择转化体，并将该菌株称为DAt20539。通过使用检测所选择的vir基因区的引物的PCR扩增，并且通过对从DAt20539制备的总DNA的Southern印迹分析，验证了DAt20539中pMP90RK的存在。
实施例7：将pDAB9292DNA电穿孔到土壤杆菌属菌株DA2552中
使用标准方案制备电感受态的DA2552细胞(参见实施例3)。将50μL感受态DA2552细胞在冰上冻融并使用300至400ng质粒pDAB9292DNA进行转化。以下列条件使用预冷的电穿孔小杯(0.2cm)和BIO-RAD GENE PULSER电穿孔器(BIO-RAD Inc.;Hercules,CA.)对DNA和细胞混合物进行电穿孔：电压：2.5kV，脉冲长度：5毫秒，输出电容：25微法拉，电阻：200欧姆。在电穿孔后，向小杯中加入1mL YEP(gm/L：酵母提取物10，蛋白胨10，NaCl5)培养液，并将细胞-YEP悬浮液转移到15mL培养管中。将细胞在28℃温育4小时，伴随着轻微搅动，随后将培养物铺到含有50μg/mL卡那霉素和150μg/mL红霉素的YEP+琼脂上。将平板在28℃温育2-4天，选择菌落并划线接种到新鲜的YEP+琼脂(具有如上文的抗生素)平板上，并在28℃温育1-3天。使用酮乳糖(ketolactose)测试，这些菌落都被验证为土壤杆菌(Bouzar等，(1995)于：Methods in Molecular Biology(K.Gartland和M.Davey编)AgrobacteriumProtocols.(第44卷)HUMANA PRESS,Totowa,NJ.第9-13页)。选择数个酮乳糖阳性菌落开始3mL YEP(有抗生素)种菌培养，其在28℃伴随摇动过夜生长。使用每个种菌培养物300μL来接种在28℃伴随200rpm的摇动生长的200mL YEP(有抗生素)过夜培养物。使用MACHEREY-NAGELXTRA MAXI质粒DNA纯化试剂盒从每个200mL过夜培养物的165mL制备质粒DNA。除了使用各30mL的缓冲液RES、LYS和NEU外，都遵循制造商的方案。将洗脱的DNA储存于4℃。
使用BamH I对质粒DNA的限制酶消化来验证这些分离物中pDAB9292的存在，随后使用两次单菌落分离传代对具有正确模式的菌落进一步纯化。从如上文描述的过夜培养物制备质粒DNA，并且使用限制消化分析来验证完整的pDAB9292的存在。将最初在DA2552转化中使用的pDAB9292载体的质粒DNA作为消化标准纳入。使用750ng至1μg DNA进行4种分别的消化反应(Pst I、BamH I、Mfe I和Hind III)。允许反应进行1-2小时，并通过琼脂糖凝胶电泳(0.8%w/v)进行分析，并且通过溴化乙锭染色使DNA片段可见。该土壤杆菌属菌株(即携带pDAB9292的DA2552)被称为DAt13192。该菌株为重组缺陷的“三元”植物转化系统提供了基础。
实施例8：将pDAB9292DNA电穿孔到土壤杆菌属菌株GV3101(pMP90)中
通过标准方案(参见实施例3)使根癌土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell,见上)的细胞制成电感受态的。将50μL感受态GV3101(pMP90)细胞在冰上冻融，并使用300-400ng质粒pDAB9292DNA转化。以下列条件使用预冷的电穿孔小杯(0.2cm)和BIO-RAD GENE PULSER电穿孔器(BIO-RAD Inc.;Hercules,CA.)对DNA和细胞混合物进行电穿孔：电压：2.5kV，脉冲长度：5毫秒，输出电容：25微法拉，电阻：200欧姆。在电穿孔后，向小杯中加入1mL YEP培养液，并将细胞-YEP悬浮液转移到15mL培养管中。将细胞在28℃温育4小时，伴随着轻微搅动，随后将培养物铺到含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的YEP+琼脂上。将平板在28℃温育2-4天，选择菌落并划线接种到新鲜的YEP+琼脂(具有如上文的抗生素)平板上，并在28℃温育1-3天。使用酮乳糖测试，这些菌落都被验证为土壤杆菌。选择数个酮乳糖阳性菌落开始3mL YEP(有抗生素)种菌培养，其在28℃伴随摇动过夜生长。使用每个种菌培养物300μL来接种在28℃伴随200rpm的摇动生长的200mL YEP(有抗生素)过夜培养物。使用MACHEREY-NAGEL
Figure BDA00002986637600222
XTRA MAXI质粒DNA纯化试剂盒从每个200mL过夜培养物的165mL制备质粒DNA。除了使用各30mL的缓冲液RES、LYS和NEU外，都遵循制造商的方案。将洗脱的DNA储存于4℃。
利用BamH I对质粒DNA的限制酶消化来验证这些分离物中pDAB9292的存在，随后使用两次单菌落分离传代对具有正确模式的菌落进一步纯化。从如上文描述的过夜培养物制备质粒DNA，并且使用限制消化分析来验证完整的pDAB9292的存在。将最初在GV3101(pMP90)转化中使用的pDAB9292载体的质粒DNA作为消化标准纳入。使用750ng至1μg DNA进行4种分别的消化反应(Pst I、BamH I、Mfe I和Hind III)。允许反应进行1-2小时，并通过琼脂糖凝胶电泳(0.8%w/v)进行分析，并且通过溴化乙锭染色使DNA片段可见。携带pMP90Ti辅助质粒和pDAB9292的根癌土壤杆菌GV3101分离物被称为DAt20712。
实施例9：将pDAB9292DNA电穿孔到土壤杆菌属菌株LBA4404中
通过标准方案(参见实施例3)使根癌土壤杆菌菌株LBA4404(Ooms等，(1982)Plasmid7:15-29)的细胞制成电感受态的。将50μL感受态LBA4404细胞在冰上冻融，并使用300-400ng质粒pDAB9292DNA转化。以下列条件使用预冷的电穿孔小杯(0.2cm)和BIO-RAD GENE PULSER电穿孔器(BIO-RADInc.;Hercules,CA.)对DNA和细胞混合物进行电穿孔：电压：2.5kV，脉冲长度：5毫秒，输出电容：25微法拉，电阻：200欧姆。在电穿孔后，向小杯中加入1mL YEP培养液，并将细胞-YEP悬浮液转移到15mL培养管中。将细胞在28℃温育4小时，伴随着轻微搅动，随后将培养物铺到含有50μg/mL卡那霉素和250μg/mL链霉素的YEP+琼脂上。将平板在28℃温育2-4天，选择菌落并划线接种于新鲜的YEP+琼脂(具有如上文的抗生素)平板上，并在28℃温育1-3天。使用酮乳糖测试，这些菌落都被验证为土壤杆菌，并使用两次单菌落分离传代进一步纯化。
选择数个酮乳糖阳性菌落开始3mL YEP(有抗生素)种菌培养，其在28℃伴随摇动过夜生长。使用每个种菌培养物300μL来接种在28℃伴随200rpm的摇动生长的200mL YEP(有抗生素)过夜培养为。使用MACHEREY-NAGELXTRA MAXI质粒DNA纯化试剂盒从每个200mL过夜培养物的165mL制备质粒DNA。除了使用各30mL的缓冲液RES、LYS和NEU外，都遵循制造商的方案。将洗脱的DNA储存于4℃。
通过限制消化分析来验证完整的pDAB9292质粒的存在。将最初在LBA4404转化中使用的pDAB9292载体的质粒DNA作为消化标准纳入。使用750ng-1μg DNA进行3种分别的消化反应(Pst I、BamH I和Hind III)。允许反应进行1-2小时，并通过琼脂糖凝胶电泳(0.8%w/v)进行分析，并且通过溴化乙锭染色使DNA片段可见。携带pDAB9292的根癌土壤杆菌LBA4404分离物被称为DAt20711。该菌株为熟练重组的“三元”系统提供了基础。
实施例10：将pDAB9292DNA电穿孔到土壤杆菌属菌株DAt20538中
使用标准方案(参见实施例3)制备电感受态的DAt20538细胞。将50μL感受态DAt20538细胞在冰上冻融，并使用300-400ng质粒pDAB9292DNA转化。以下列条件使用预冷的电穿孔小杯(0.2cm)和BIO-RAD GENE PULSER电穿孔器(BIO-RAD Inc.;Hercules,CA.)对DNA和细胞混合物进行电穿孔：电压：2.5kV，脉冲长度：5毫秒，输出电容：25微法拉，电阻：200欧姆。在电穿孔后，向小杯中加入1mL YEP培养液，并将细胞-YEP悬浮液转移到15mL培养管中。将细胞在28℃温育4小时，伴随着轻微搅动，随后将培养物铺到含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的YEP+琼脂上。将平板在28℃温育2-4天，选择菌落并划线接种于新鲜的YEP+琼脂(具有如上文的抗生素)平板上，并在28℃温育1-3天。使用酮乳糖测试，这些菌落都被验证为土壤杆菌，并使用两次单菌落分离传代进一步纯化。
选择数个酮乳糖阳性菌落开始3mL YEP(有抗生素)种菌培养，其在28℃伴随摇动过夜生长。使用每个种菌培养物300μL来接种在28℃伴随200rpm的摇动生长的200mL YEP(有抗生素)过夜培养为。使用MACHEREY-NAGEL
Figure BDA00002986637600241
XTRA MAXI质粒DNA纯化试剂盒从每个200mL过夜培养物的165mL制备质粒DNA。除了使用各30mL的缓冲液RES、LYS和NEU外，都遵循制造商的方案。将洗脱的DNA储存于4℃。
使用限制消化分析来验证完整的pDAB9292质粒的存在。将最初在DAt20538转化中使用的pDAB9292载体的质粒DNA作为消化标准纳入。使用750ng-1μg DNA进行4种分别的消化反应(Pst I、BamH I、Mfe I和Hind III)。允许反应进行1-2小时，并通过琼脂糖凝胶电泳(0.8%w/v)进行分析，并且通过溴化乙锭染色使DNA片段可见。具有pDAB9292的根癌土壤杆菌DAt20538分离物被称为DAt20538(pDAB9292)。
实施例11：构建具有多个重复序列元件的植物转化载体并引入土壤杆菌属菌株中
在本文中例示了工程改造的根癌土壤杆菌菌株和辅助vir基因组合的效用，所述根癌土壤杆菌菌株在RecA功能中有缺陷，所述辅助vir基因由14.8KpnI VirBCDG片段提供。通过标准的克隆方法(如例如记载于Sambrook等，(1989，见上)和Ausubel等，(1995，见上))和GATEWAYTM技术(INVITROGEN)的组合，在大肠杆菌克隆菌株STBL2TM中构建二元植物转化载体pDAB101513(图4A)。二元载体pDAB101513基于质粒RK2的IncP型复制起点，并且载体骨架携带赋予对100μg/mL壮观霉素(图4中的SpcR)的抗性的细菌基因。T-DNA边界重复自pTi15955的TL区衍生。4个植物可表达的、经植物密码子优化的蛋白质编码序列(CDS)位于质粒pDAB101513的T-DNA区的右边界(图4中的T-DNA边界B)和三个左边界(图4中的T-DNA边界A)中，其每一个的转录由1,991bp玉米泛素1启动子连同有关的内含子1驱动(美国专利号5,510,474)。其中三个编码区编码分别的Bt Cry1蛋白(Cry1Ca，SEQ ID NO:7；Cry1Fa，SEQ ID NO:9；和Cry1Ab，SEQ ID NO:11)，每个包含约3,500bp。这些编码区是经过密码子优化的以在玉米植物中表达，其使用玉米(玉蜀黍属(zea mays))密码子偏好表，该表从对706个玉米蛋白编码区(自GENBANK保存项获得)的分析计算而来。关于合成基因的设计和产生的其它指引可以在例如WO97/13402A1、美国专利号6,166,302和美国专利号5,380,831中发现。3个B.t蛋白编码区以下列方式彼此相关：cry1Ca的编码区(SEQ ID NO:6)和cry1Fa的编码区(SEQ ID NO:8)享有67%的序列同源性；cry1Ca的编码区(SEQ ID NO:6)和cry1Ab的(SEQ ID NO:10)享有69.5%的序列同源性，且cry1Fa的编码区(SEQ ID NO:8)和cry1Ab的(SEQ ID NO:10)享有67%的序列同源性。此外，cry1Ca、cry1Fa和cry1Ab的CDS C末端的1,600bp具有73%的序列同源性。这三个编码区的每一个都由365bp玉米Per53’非翻译区(3’UTR)终止(美国专利号6,384,207)。第4个基因包含经植物密码子优化的aad1编码区(SEQ ID NO:12)，其编码AAD1可选择的标志蛋白(SEQ ID NO:13)(美国专利号7,838,733)。Aad1编码区和cry1Ca、cry1Fa或cry1Ab的CDS不相关。使用植物密码子偏好表设计aad1的编码区。玉米密码子偏好表是从706个玉米蛋白编码序列(自保存于GENBANK中的序列获得)计算而来的。从位于网站http://www.kazusa.or.jp/codon/处的数据下载烟草(Nicotiana tabacum，1268CDS)、油菜(Brassica napus，530CDS)、棉花(Gossypium hirsutum，197CDS)、和大豆(Glycine max；约1000CDS)的密码子使用表。在略去了任何其使用小于任一植物类型中该氨基酸的总密码子使用的约10%的冗余密码子后，计算偏好密码子集，其包含经常使用的常见于玉米和双子叶植物数据集的密码子，以适当调整的平均相对量存在。aad1基因由玉米脂肪酶3’UTR终止(美国专利号7,179,902)。因此，在pDAB101513的22,729bp T-DNA区中，玉米ubi1启动子的4个拷贝包含排列为各约2kbp(千碱基对)的4个直接重复的总共7,964个碱基，每个重复彼此100%相关。Per53’UTR的3个拷贝包含排列为3个直接重复单元的总共1,095个碱基，每个彼此100%相关，并且3个编码区cry1Ca、cry1Fa和cry1Ab被排列为彼此具有67%-73%之间的同源性的直接重复。总之，pDAB101513的T区包含约86%的高度重复的序列，并且可以在下面方便地例示为：
RB>Ubi1启动子:cry1Ca CDS:Per53’UTR>Ubi1启动子:cry1Fa CDS:Per53’UTR>Ubi1启动子:cry1Ab CDS:Per53’UTR>Ubi1启动子:aad1CDS:Lip3’UTR>LB
该构建体的高度重复的性质需要在大肠杆菌克隆菌株STBL2TM中完成克隆步骤，该菌株被特定地工程化改造为维持含有这类高度重复的DNA序列的克隆的完整性。
通过电穿孔将质粒pDAB101513引入根癌土壤杆菌菌株EHA105的电感受态细胞(经由自发的染色体突变成为链霉素抗性的)中，并且在制备冷冻的甘油保存物和-80℃储存前，通过限制消化分析验证壮观霉素/链霉素抗性分离物含有完整的质粒pDAB101513。该菌株被称为EHA105(pDAB101513)。发现从获自EHA105(pDAB101513)冷冻的甘油保存物的细胞建立的众多单独的培养物含有pDAB101513质粒的重排或缺失型。对于玉米转化，从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株EHA105(pDAB101513)的大量细胞，并如实施例13中描述的直接使用。
通过电穿孔成功地将质粒pDAB101513引入根癌土壤杆菌菌株DA2552(基本为菌株EHA105的RecA缺陷型)的电感受态细胞中以生成菌株DA2552(pDAB101513)。在制备冷冻的甘油保存物并存储于-80°前，通过对质粒DNA的限制酶消化对经由红霉素和壮观霉素抗性选择的转化体进行验证。发现从获自冷冻的甘油保存物的细胞建立的众多单独的培养物含有完整的pDAB101513质粒。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DA2552(pDAB101513)的大量细胞，并用于玉米转化(实施例13)。
通过电穿孔成功地将质粒pDAB101513引入根癌土壤杆菌菌株DAt13192(携带质粒pDAB9292的菌株DA2552)的电感受态细胞中以生成菌株DAt13192(pDAB101513)。在制备冷冻的甘油保存物并存储于-80℃前，通过对质粒DNA的限制酶消化对经由红霉素、卡那霉素、和壮观霉素抗性选择的转化体进行验证。发现从获自冷冻的甘油保存物的细胞建立的众多单独的培养物含有完整的pDAB101513质粒。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DAt13192(pDAB101513)的大量细胞，并用于玉米转化(实施例13)。
以类似的方式，构建pSB11(超二元系统的穿梭载体)的衍生物，其具有的T-DNA区类似于pDAB101513的。许多试图通过标准方法在LBA4404(pSB1)中构建超二元载体的尝试没有成功。所有的尝试都产生了高度重排和缺失的基于pSB1的共整合质粒的分离。
实施例12：构建具有多个重复序列元件的植物转化载体pDAB101514并引入土壤杆菌属菌株中
在本文中例示了工程改造的根癌土壤杆菌菌株和辅助vir基因组合的效用，所述根癌土壤杆菌菌株在RecA功能中有缺陷，所述辅助vir基因由14.8KpnI VirBCDG片段提供。通过标准的克隆方法(如例如记载于Sambrook等，(1989，见上)和Ausubel等，(1995，见上))和GATEWAYTM技术(INVITROGEN)的组合，在大肠杆菌克隆菌株STBL2TM中构建二元植物转化载体pDAB101514(图4B)。除了用于驱动cry1Ca基因表达的表达元件外，二元载体pDAB101514的结构几乎与pDAB101513(前面的实施例)的相同。pDAB101514中cry1Ca CDS的转录由1429bp甘蔗杆状病毒启动子驱动(SCBV;Tzafrir等，(1998)Plant Molec.Biol.38:347-356)。5’UTR基本由玉米醇脱氢酶基因(GENBANK登录X04049)的内含子6组成，其侧翼为外显子6的20个碱基和外显子7的11个碱基。该基因的转录由马铃薯pinII3’UTR(An等，(1989)Plant Cell.1:115-122)终止。用于控制cry1Fa、cry1Ab和aad1基因表达的表达元件与pDAB101513中采用的相同。因此，在pDAB101514的22,586bpT-DNA区中，玉米ubi1启动子的3个拷贝包含排列为各约2kbp的3个直接重复的总共5,973个碱基，每个重复彼此100%相关。Per53’UTR的2个拷贝包含排列为2个直接重复单元的总共730个碱基，每个彼此100%相关，并且3个编码区cry1Ca、cry1Fa和cry1Ab被排列为彼此具有67%-73%DNA序列同源性的直接重复。总之，pDAB101514的T区包含约76%的高度重复的DNA序列，并且物质排列可以在下面方便地例示为：
RB>SCBV启动子:cry1Ca CDS:pinII3’UTR>Ubi1启动子:cry1FaCDS:Per53’UTR>Ubi1启动子:cry1Ab CDS:Per53’UTR>Ubi1启动子:aad1CDS:Lip3’UTR>LB
该构建体的高度重复的性质需要在大肠杆菌克隆菌株STBL2TM中完成克隆步骤，该菌株被特定地工程化改造为维持含有这类高度重复的DNA序列的克隆的完整性。
通过电穿孔将质粒pDAB101514引入根癌土壤杆菌菌株EHA105(经由自发染色体突变成为链霉素抗性的)的电感受态细胞中，并在制备冷冻的甘油保存物并存储于-80℃前，通过限制消化分析来验证壮观霉素/链霉素抗性的分离物含有完整的质粒pDAB101514。该菌株被命名为EHA105(pDAB101514)。发现从获自冷冻的甘油保存物的EHA105(pDAB101514)细胞建立的众多单独的培养物含有重排或缺失型的pDAB101514质粒。对于玉米转化，从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株EHA105(pDAB101514)的大量细胞，并按实施例13中披露的方法使用。
通过电穿孔将质粒pDAB101514成功地引入根癌土壤杆菌菌株DA2552(基本为菌株EHA105的RecA缺陷型)的电感受态细胞中以生成菌株DA2552(pDAB101514)。在制备冷冻的甘油保存物并存储于-80℃前，通过对质粒DNA的限制酶消化对经由红霉素和壮观霉素抗性选择的转化体进行验证。发现从获自冷冻的甘油保存物的细胞建立的众多单独的培养物含有完整的pDAB101514质粒。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DA2552(pDAB101514)的大量细胞，并按实施例13中披露的方法用于玉米转化。
通过电穿孔将质粒pDAB101514成功地引入根癌土壤杆菌菌株DAt13192(携带质粒pDAB9292的菌株DA2552)的细胞中以生成菌株DAt13192(pDAB101514)。在制备冷冻的甘油保存物并存储于-80℃前，通过对质粒DNA的限制酶消化对经由红霉素、卡那霉素和壮观霉素抗性选择的转化体进行验证。发现从获自冷冻的甘油保存物的DAt13192(pDAB101514)细胞建立的众多单独的培养物含有完整的pDAB101514质粒。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DAt13192(pDAB101514)的大量细胞，并按实施例13中披露的方法用于玉米转化。
以类似的方式，构建pSB11(超二元系统的穿梭载体)的衍生物，其具有的T-DNA区类似于pDAB101514的。许多试图通过标准方法在LBA4404(pSB1)中构建超二元载体的尝试没有成功。所有的尝试都产生了高度重排和缺失的基于pSB1的共整合质粒的分离。
实施例13：通过携带二元载体pDAB101513和pDAB101514的土壤杆菌属菌株来转化玉米
土壤杆菌介导的玉米转化将Hi-II F1杂交的种子(Armstrong等，(1991)Maize Genet.Coop.Newslett.65:92-93)种植到5加仑的罐中，其含有95%METRO-MIX360无土生长培养基(SUN GRO HORTICULTURE;Bellevue,WA)和5%粘土/壤土的混合物。在温室中生长该植物，其使用高压钠和金属卤化物灯，光周期为16小时光照：8小时黑暗。实施受控的近缘授粉以获得用于转化的未成熟的F2胚。在授粉后约8-10天，当未成熟的胚大小在1.0mm和2.0mm之间时，收获玉米穗。
侵染和共培养。将玉米穗去皮并通过用肥皂水擦洗、浸没于20%的商用漂白剂(含有5%次氯酸钠)中约20分钟进行表面消毒，然后用无菌水漂洗3次。通过将1或2环细菌(在含有合适抗生素的YEP琼脂培养基上于28℃生长2-3天)转移到含有200μM乙酰丁香酮的5mL液体侵染培养基(LS基础培养基(Linsmaier和Skoog,(1965)Physiologia Plantarum18:100-127)、N6维生素(Chu等，(1975)Scientia Sinica18:659-668)、1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、68.5gm/L蔗糖、36.0gm/L葡萄糖、6mM L-脯氨酸，pH5.2)中，制备携带pDAB101513或pDAB101514(具有编码Bt Cry1Ca、Cry1Fa和Cry1Ab蛋白的三个基因，且含有aad-1植物可选择标志基因的二元载体)的根癌土壤杆菌细胞的悬浮液。涡旋该溶液直至得到均一的悬浮液，并将浓度调节为最终光密度在550nm处为约0.4。
将未成熟的胚直接分离到含有2mL侵染培养基的微离心管中。除去培养基并用1mL土壤杆菌溶液取代，并将土壤杆菌/胚溶液在室温温育5-10分钟。然后将胚转移到含有200μM乙酰丁香酮的共培养培养基(LS基础培养基、N6维生素、1.5mg/L2,4-D、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯氨酸、0.85mg/L AgNO3、2.8gm/L GELLAN GUMTM(PHYTOTECHNOLOGY LABORATORIES;Lenexa,KS)，pH5.8)中，并于20℃在黑暗中共培养3-4天。
在共培养后，将胚转移到静息培养基中，其含有MS盐和维生素(Frame等，2011,Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.于：Plant Embryo Culture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe和E.C.Yeung,(编),SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA,LLC.第327页-第341页)、6mM L-脯氨酸、100mg/L肌醇、500mg/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.)、30gm/L蔗糖、1.5mg/L2,4-D、0.85AgNO3、250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)、2.8gm/LGELLAN GUMTM，pH5.8。约7天后，将胚转移到用100nM氟吡氯禾灵补充的相同的培养基中。约8周后鉴定转化的分离物，并以2周为时间间隔通过转移到新鲜的选择培养基增殖(bulk up)以进行再生和分析。
再生和种子产生对于再生，将培养物转移到用100nM氟吡氯禾灵补充的“28”诱导培养基(MS盐和维生素、30gm/L蔗糖、5mg/L苄基氨基嘌呤、0.25mg/L2,4-D、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/L GELLAN GUMTM，pH5.7)中。在低光条件(14μEm-2s-1)下温育1周，随后在高光条件(约89μEm-2s-1)下1周。随后将组织转移到“36”再生培养基(与诱导培养基相同，只是缺少植物生长调节剂)。当植株长度为3cm-5cm时，将其转移到含有SHGA培养基[(Schenk和Hildebrandt盐和维生素，PHYTOTECHNOLOGIES LABR.)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖和2.0gm/L GELLAN GUMTM，pH5.8]的玻璃培养管以容许芽和根的进一步生长以及发育。如前面描述的将植物移植到相同的土壤混合物中并在温室中生长至开花。收获植物组织的样品，并按实施例14中披露的方法用在昆虫生物测定法中并用于分子和生化分析。进行受控的授粉以用于种子生成。
那些玉米转化领域的技术人员会理解当使用其它的植物可表达的可选择的标志基因(例如除草剂耐受基因)时，可使用其它方法来转化玉米或选择转化的植物。
实施例14：叶样品抗玉米虫害的体外生物测定法
测定的鳞翅类物种为谷棉铃虫(corn earworm)(CEW;Helicoverpa zea(Boddie))、欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nubilalis(Hübner))、和秋粘虫(FAW;Spodoptera frugiperda(J.E.Smith))。从BENZON RESEARCH(Carlisle,PA)获得这些昆虫的卵。
一线生物测定法：高通量96孔生物测定法将高通量96孔盘(TPP-US;St.Louis,MO)用2%琼脂溶液(SIGMA-ALDRICH)部分填充，并允许琼脂凝固。使用标准的手持纸打孔机，对在此形式中测试的两种昆虫物种(CEW和FAW)的每一种取3份1/8英寸直径的叶盘作为样品。将一个叶盘置于96孔板的单个孔中；对每种测试的昆虫有3个板(对一次重复/叶盘有一个板)。使用接种卵的装置将昆虫卵施用到96孔板的每个孔中。然后用穿孔的粘性盖将板密封，并还用和板一起的塑料盖封好。将板保持在30℃、40%相对湿度(RH)、16小时光照：8小时黑暗3天。使用0-1-2等级进行评级，其中在每个孔中0指示<25%的叶盘损失，1指示25-50%的叶盘损失，且2指示>50%的叶盘损失。将每个测试的损失得分平均，并使用伴随的蛋白表达分析进行相关性分析。平均昆虫损失得分为0.67或更小的植物被视为针对测试害虫有活性的。
二级生物测定法：32孔生物测定法将32孔盘(C-D INTERNATIONAL;Pitman,NJ)用2%琼脂溶液部分填充，并允许琼脂凝固。从每种植物各取约1平方英寸的叶切片并单独地置于32孔盘的孔中。在每个孔中放置一个叶片，并对每种植物和每种昆虫测试两个叶片。使用画笔大量滋生昆虫(ECB和FAW)，其将10-20个新生幼虫置入每个孔中。用穿孔的粘性盖密封盘，其允许测试期间的通风。将盘在28℃、40%RH、16小时光照：8小时黑暗放置3天。在测试持续期后，对每个叶片进行简单的百分比损失打分。将每个测试的损失得分平均，并使用伴随的蛋白表达分析进行相关性分析。平均昆虫损失评分为25%或更小的植物被视为针对测试害虫有活性的。
统计学分析在JMP8.0.2(SAS INSTITUTE Inc.,Cary,North Carolina)中进行所有分析。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)来测定处理物和阴性对照植物之间昆虫损失数据的显著差异。还使用Tukey-Kramer HSD均值比较来进一步评估处理物之中的显著差异。另外，使用线性回归(最小二乘方拟合)分析来关联定量蛋白表达和昆虫活性测量。
生物测定法的结果总结于表2中。
实施例15：对用pDAB101513转化的玉米组织的生化和分子表征
用工程改造的根癌土壤杆菌菌株EHA105(pDAB101513)、DA2552(pDAB101513)和DAt13192(pDAB101513)实施多个转化实验。使用基因特异性的寡核苷酸通过水解探针测定法(Bubner和Baldwin,(2004)Plant Cell Rep.23:263-271)估算转基因T0植物中4种转基因的拷贝数。进一步检查具有1-3个基因拷贝(“低拷贝”)的植物的蛋白提取物中Bt Cry1Ca、Cry1Fa和Cry1Ab蛋白以及AAD1蛋白的生成，其通过使用商业化生产的抗体试剂盒(ENVIROLOGIXTM,Portland,MA)的ELISA方法。发现一些植物生成所有4种蛋白质(表3)。另外，在喂养测定法中对植物的叶片针对以下三种玉米虫害的活性进行生物测定：谷棉铃虫(CEW,Helicoverpa zea)、秋粘虫(FAW,Spodoptera frugiperda)和欧洲玉米螟(ECB,Ostrinia nubilalis)(实施例14)。发现一些植物具有低拷贝数的所有4种转基因，生成所有4种蛋白质，且具有针对所有三种害虫的昆虫活性(表4)。没有从使用EHA105(pDAB101513)或DA2552(pDAB101513)菌株的实验获得达到这些标准的转化植物(表4)。因此，菌株DAt13192的特征在于其能够有效生成具有由高度重复的序列元件组成的大T-DNA区的经转化玉米植物，所述菌株DAt13192包含染色体recA基因的缺失，进一步包含pTiEHA105上携带的完整的pTiBo542衍生的vir基因集合，并且甚至进一步包含pDAB9292的14.8KpnIVirBCDG片段上携带的部分pTiBo542衍生的vir基因集合。
实施例16：对用pDAB101514转化的玉米组织的生化和分子表征
用工程改造的根癌土壤杆菌菌株EHA105(pDAB101514)、DA2552(pDAB101514)和DAt13192(pDAB101514)实施多个转化实验。使用基因特异性的寡核苷酸通过水解探针测定法(Bubner和Baldwin，见上)估算转基因T0植物中4种转基因的拷贝数。进一步检查具有1-3个基因拷贝(“低拷贝”)的植物的蛋白提取物中Bt Cry1Ca、Cry1Fa和Cry1Ab蛋白以及AAD1蛋白的生成，其通过使用商业化生产的抗体试剂盒(ENVIROLOGIXTM,Portland,MA)的ELISA方法。另外，在喂养测定法中对植物的叶片针对三种玉米虫害的活性进行生物测定(实施例14)。发现一些植物具有低拷贝数的所有4种转基因，生成所有4种蛋白质，且具有针对所有三种害虫的昆虫活性(表5)。没有从使用EHA105(pDAB101514)或DA2552(pDAB101514)菌株的实验获得达到这些标准的转化植物。因此，菌株DAt13192的特征在于其能够有效生成具有由高度重复的序列元件组成的大T-DNA区的经转化玉米植物，所述菌株DAt13192包含染色体recA基因的缺失，进一步包含pTiEHA105上携带的完整的pTiBo542衍生的vir基因集合，并且甚至进一步包含pDAB9292的14.8KpnIVirBCDG片段上携带的部分pTiBo542衍生的vir基因集合。
实施例17：对根癌土壤杆菌LBA4404染色体中中性整合位点的鉴定和表征
根癌土壤杆菌菌株C58染色体的植物可诱导的picA/pgl基因座(GENBANK登录AE0009243)被鉴定为非必需基因，其中可以整合DNA片段(Rong等，(1990)J.Bacteriol.172:5828-5836;Rong等，(1991)J.Bacteriol.173:5110-5120)。根癌土壤杆菌菌株LBA4404基因组中的类似的中性整合位点还未有报道。我们在此描述了对包括与C58picA/pgl基因座部分同源的序列的LBA4404基因组区域的鉴定和测序。在YM培养基(gm/L：酵母提取物，0.4；甘露醇，10；NaCl，0.1；MgSO47H2O，0.2；K2HPO43H2O，0.5)中于30℃过夜生长LBA4404(INVITROGEN)的细胞。使用EASY DNA试剂盒(INVITROGEN)依照制造商方案从1mL培养物制备基因组DNA。基于C58PicA蛋白序列和从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、Caldicellulosiruptorsaccharolyticus、Alkaliphilus metalliredigenes和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)鉴定的同源物之间的两个同源性区来设计简并引物。使用LBA4404基因组DNA作为聚合酶链式反应(PCR)的模板，该反应使用HERCULASETMMASTER MIX(STRATAGENE;San Diego,CA)和简并引物AtnilA1Fa(5’-GACAGTCCNAATACSGAYGG-3';SEQ ID NO:14；对应于C58PicA蛋白的氨基酸273-279)和AtnilA3R(5'-GTYTTSAGNCGSAGSCCSCGRTCSGT-3';SEQ ID NO:15，对应于编码C58PicA蛋白的氨基酸364-369的互补链)。使用的热循环条件是：94℃2分钟，1个循环；[94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，60秒]，25个循环；72℃7分钟，1个循环。引物序列中简并核苷酸的命名对应于如下的DNA核苷酸：N=A、C、G或T；Y=T或C；R=A或G；和S=C或G。分离285个碱基对(bp)的产物，克隆到大肠杆菌TOP10细胞(INVITROGEN)中的载体pCR2.1-TOPO(INVITROGEN)中，并测定DNA序列。发现该序列与C58picA基因的区域是同源(85%的序列同一性)但并非相同的，且其代表的LBA4404基因区在本文中被称为nilA片段。
与285bp LBA4404nilA片段互补的另外的引物被设计为用作基因组片段PCR扩增的锚定物，该片段侧接285bp序列的两端。在PCR反应中，它们与从C58picA基因侧接区的序列设计的引物配对。确定扩增片段的序列，其起始于285bp序列中并延伸到两个nilA片段侧接区，将该序列用于设计其它引物以用于后续PCR反应。使用LBA4404基因组DNA模板和引物nilA2F(5'-CCATCCTCATAACACCAGCT-3';SEQ ID NO:16)和nilA2R(5'-GCAGATCATCGATACGACCA-3';SEQ ID NO:17)，生成约2千碱基(kbp)的PCR片段，并使用TOPO TA克隆试剂盒(INVITROGEN)克隆到
Figure BDA00002986637600342
中以生成质粒pDOW3719(图2)。对pDOW3719插入片段的序列分析得到了1,796bp序列(SEQ ID NO:18)，其包含编码531个氨基酸的推定蛋白质的最长开读框(ORF)。在同一读框中的较短的ORF编码523个氨基酸的推定蛋白质。LBA4404523个氨基酸的推定蛋白质和C58PicA蛋白显示88%的相似性、85%的同一性。LBA4404523个氨基酸的推定蛋白质和C58PicA蛋白的编码序列具有81%的同一性。因此，LBA4404nilA片段代表了一个基因组区段，其包括实质性趋异于C58picA基因的推定基因。在本公开中，由SEQID NO:18代表的1.8kbp基因组序列被称为nilA基因座。
预期具有colE1复制起点的质粒pDOW3719不会在根癌土壤杆菌细胞中自主复制。使用质粒pDOW3719的DNA通过电穿孔来转化根癌土壤杆菌菌株LBA4404的细胞。对卡那霉素抗性(位于pDOW3719上)的选择鉴定了转化体，其已经由重组将pDOW3719整合到LBA4404的染色体中，所述重组由存在于LBA4404染色体中和pDOW3719上的1.8kbp同源性区介导。这类整合事件导致pDOW3719载体质粒序列的线性拷贝的创建，其在每一侧都由现在复制的1.8kbp同源性区侧接。分离卡那霉素抗性的LBA4404转化体，并通过PCR分析筛选pDOW3719的插入。在PCR反应中使用转化体的基因组DNA制备物作为模板和5组引物：i)M13F引物与M13R引物配对，其侧接pDOW3719中的插入，ii)M13F引物与引物AS4R(包含与SEQ ID NO:18的残基1041-1060互补的碱基)配对，iii)M13F引物与引物AS10R(包含与SEQ ID NO:18的残基1,320-1,337互补的碱基)配对，iv)M13F引物与引物AS11R(包含与SEQ ID NO:18的残基1,391-1,406互补的碱基)配对，和v)M13R引物与AS9F(包含SEQ IDNO:18的碱基634-649)配对。在对照反应中，当使用pDOW3719质粒DNA作为模板时，所有这些引物组都扩增出具有期望长度的片段。然而，当使用来自卡那霉素抗性的LBA4404转化体的基因组DNA作为模板时，使用M13F和M13R引物对的PCR未得到扩增产物，指示了没有完整的(非整合的)pDOW3719质粒DNA与基因组DNA共纯化。用其它4对引物对基因组DNA样品的PCR分析显示生成了具有期望长度的DNA片段。这些结果指示，整合到基因组中的pDOW3719DNA赋予了LBA4404转化体的卡那霉素抗性。
使用这类转化体中的一种[LBA4404nilA-int1]来测试将基因组插入于nilA基因座中对于菌株转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)的能力的影响。将二元载体pDAB3779(其含有植物可表达的基因，该基因编码PAT蛋白(赋予对除草剂BASTATM的抗性))转化到菌株LBA4404nilA-int1和LBA4404的细胞中，针对壮观霉素抗性进行选择。然后使用这些菌株来进行拟南芥转化实验，其使用Weigel和Glazebrook(见上)的方法。在用两种菌株获得的转化频率中未见到差异。因此，本文中所描述的实施方案和方法的特征在于，在根癌土壤杆菌菌株LBA4404(包含SEQ ID NO:18)的染色体nilA基因座中插入外源DNA片段对于这类工程改造的菌株的生长或植物转化能力没有影响。
实施例18：构建pDOW3719的自杀衍生物以整合到LBA4404nilA基因座中
通过剪接重叠延伸(splice overlap extension)(SOE)PCR(Horton等，(1990)BioTechniques8:528-535)完成在克隆于pDOW3719中的nilA基因座中的多克隆位点的插入。使用HERCULASETMmaster mix依照制造商的方案实施SOEPCR反应。扩增nilA基因座的一部分以生成约800bp片段，其使用pDOW3719DNA作为模板及引物nilA5’(5’-CCGGCTCTTCCAGCTCCTCATGCACGAACAACGAGAAACGAGC-3’;SEQ ID NO:19)与引物nilA_MCS_SOER(5’-GAATGGTGAAACCTCTAGATTAATTAAGGATCCCCGGGTACCGAAAAGCCCGACATTGC-3’;SEQ ID NO:20)配对。扩增nilA基因座的第二部分以生成约900bp片段，其使用pDOW3719DNA作为模板及引物nilA_MCS_SOEF(5’-GCAATGTCGGGCTTTTCGGTACCCGGGGATCCTTAATTAATCTAGAGGTTTCACCATTC-3’;SEQ ID NO:21)与引物nilA3’(5’-GGAATTCTCAGTGGCTTTCATGGGTTTTCTCG-3’;SEQ ID NO:22)配对。随后凝胶纯化所得片段(NUCLEOSPINTM,CLONTECH;Mountain View,CA)，并用作引物nilA5’和nilA3’的扩增模板以得到1.6kbp片段，其序列被披露为SEQ IDNO:23(nilA MCS)。用Pvu I和Sap I(NEB)消化所得片段，并使用T4DNA连接酶(NEB)连接至用相同限制酶消化的pBCSK+sacBI DNA(INVITROGEN)。用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞，并在用30μg/mL氯霉素补充的LB大豆琼脂(TEKNOVA;Hollister,CA)上选择转化体。通过用Pvu I和Kpn I(NEB)限制消化对克隆进行筛选。验证了阳性克隆的nilA基因座区的序列，并将所得质粒命名为pDOW3721。pDOW3721的特征是含有限制酶Sph I、Kpn I、SmaI、BamH I、Pac I、Ase I和Xba I识别序列的多克隆位点(MCS)在一侧被852bpLBA4404衍生的碱基侧接，且在另一侧被745bp LBA4404衍生的碱基侧接。
因此，可以将外源DNA片段克隆到pDOW3721的MCS中，并随后经由同源重组整合到LBA4404染色体nilA基因座中，所述同源重组由LBA4404衍生的侧接序列介导。通过在含有蔗糖的培养基上的反选择，可以将单一交叉事件(完整的pDOW3721质粒序列由此整合到LBA4404染色体中)转变为双交叉事件。在这类培养基上，当由sacB基因编码的SacB蛋白进行酶解时，蔗糖被转化为有毒产物(Reid和Collmer,(1987)Gene57:239-246;Quandt等，(1993)Gene127:15-21)。因此，能够存活于含有蔗糖的生长培养基上的转化体将已经经历第二次交叉事件，其从染色体中除去pDOW3721质粒载体骨架，留下含有整合的外源DNA片段的被破坏的nilA基因座。许多报告已经显示，在过去的10年中，载体骨架序列的转移是相当普遍的。转化体中获得主链序列的植物的比率范围通常为20%-50%，并有有时会高达75%以上。
作为pDOW3721效用的一个例示，从质粒pSB1制备14.8KpnI VirBCDG片段并使用T4DNA连接酶连接至经Kpn I消化的pDOW3721DNA。用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞，并在用30μg/mL氯霉素补充的LB大豆琼脂上选择转化体。通过用EcoR I和Hind III限制消化筛选克隆。所得质粒被命名为pDOW3722。
实施例19：对nilA上游和下游核苷酸序列的鉴定
使用根癌土壤杆菌的LBA4404nilA-int1菌株(含有质粒pDOW3719的基因组整合物)(图2和实施例18)来鉴定位于nilA基因组区上游和下游的其它序列。pDOW3719含有根癌土壤杆菌菌株LBA4404nilA基因座的1,796bp PCR扩增子，其被克隆到PCR-BLUNT
Figure BDA00002986637600361
(INVITROGEN)中。将该质粒经由同源重组整合到根癌土壤杆菌菌株LBA4404的基因组中。通过对卡那霉素的抗性来鉴定含有整合质粒的菌落(实施例17)。整合的质粒和其中含有的元件可以用作工具以通过“质粒拯救”技术分离和表征其它核苷酸序列。
按照用于细菌基因组DNA分离的方案(Sambrook等，见上)，从LBA4404nilA-int1菌株的细胞制备基因组DNA(gDNA)。用下列酶(都自NEB获得)单独地消化1微克gDNA：Hind III、BamH I、Pst I、Asc I和Sac II。这些酶是特别选择用来生成匹配nilA基因座上下游的gDNA片段的。选择了HindIII、BamH I和Pst I限制酶，因为它们的识别位点在pDOW3719序列中是唯一的。而且，这些酶识别位点位于nilA基因座扩增子片段与PCR-BLUNT
Figure BDA00002986637600371
载体之间的连接处(图2)。由此，用这些酶切割gDNA并将所得片段自身连接产生了质粒拯救片段，其含有连接的邻近于pDOW3917质粒的M13正向通用引物或M13反向通用引物结合位点的未表征的基因组序列。通过将连接混合物转化到大肠杆菌细胞中，并选择由pDOW3917携带的卡那霉素抗性基因来分离这类克隆。
此外，pDOW3719质粒不含有Asc I和Sac II限制酶的识别位点。因此，由这些限制酶生成的gDNA片段会生成嵌合DNA片段，其跨越整合的pDOW3719质粒序列的全长并包括侧接于整合的pDOW3719质粒两侧的gDNA区。
使用T4连接酶(ROCHE APPLIED SCIENCES;Indianapolis,IN)将从如上文描述的限制酶消化得到的gDNA片段自身连接。将连接产物转化到大肠杆菌
Figure BDA00002986637600372
TOP10细胞(INVITROGEN)中，并铺到含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上。选择单菌落并分离质粒DNA，并经由质粒限制酶消化模式对其进行表征。将含有显示一致的(consistent)限制酶消化条带模式(如相较于彼此)的质粒的克隆优先用于测序反应。
使用“基因组步移(genome walking)”技术确定nilA基因座上下游的gDNA的核苷酸序列。设计对应于已知gDNA序列(如存在于pDOW3719中的)的测序引物，并与CEQTMDYE TERMINAT或CYCLE SEQUENCING试剂盒一起依照制造商推荐(BECKMAN COULTER;Fullerton,CA)使用。从确定的序列，设计位于之前未知的基因组序列中的第二组引物并用于生成另外的测序数据。重复该过程直到确定所有可得到的gDNA核苷酸序列。该技术生成了nilA基因座上游的2,936bp序列，和nilA基因座下游的4,361bp序列。与之前鉴定的nilA基因座的1,796bp组合，新鉴定的上下游侧接序列区连成了包含nilA基因组区(SEQ ID NO:24)的9,093bp序列，其从最初鉴定的nilA基因座向两个方向延伸。
实施例20：构建载体以整合到LBA4404 nilA基因组区中
设计并构建整合载体用于外源DNA序列到根癌土壤杆菌LBA4404 nilA基因组区中的同源介导的整合。使用FAILSAFETMPCR试剂盒(
Figure BDA00002986637600387
,Madison,WI)对跨越nilA基因座的nilA基因组区6.3kbp片段进行PCR扩增。将扩增片段连接至
Figure BDA00002986637600381
载体(INVITROGEN)，并经由限制酶消化和DNA序列验证确认阳性克隆。通过加入含有多个唯一的限制酶识别位点的寡核苷酸片段对所得载体pDAB9615进行进一步修饰。这些限制位点(被nilA基因组区的3,244bp和3,128bp区侧接)充当克隆位点以引入外源核苷酸序列。所得载体被命名为pDAB9618(图3)。
通过用Kpn I加Bst1107I消化pDAB9292DNA来制备含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和细菌卡那霉素抗性基因的15,549bp片段。然后将该片段连接至已经用Kpn I加Swa I消化的pDAB9618的DNA以生成载体pDAB9621(图3)。接着使用
Figure BDA00002986637600382
反应将含有14.8KpnI VirBCDG片段和细菌卡那霉素抗性基因的pDAB9621的部分(在每侧被3kbp LBA4404nilA基因组区序列侧接)经由AN L-R
Figure BDA00002986637600383
反应(INVITROGEN)移动到
Figure BDA00002986637600384
PDESTTM14载体中。经由限制酶消化和DNA测序反应确认所得质粒pDAB9698(图3，SEQ ID NO:25)。pDAB9698充当整合载体，其用于将来自pSB1的pTiBo542衍生的vir基因(位于14.8KpnI VirBCDG片段上)整合到根癌土壤杆菌菌株LBA4404的nilA染色体区中。
实施例21：14.8KpnI VirBCDG片段经由同源重组的染色体整合
使用
Figure BDA00002986637600385
AX阴离子交换层析质粒DNA分离试剂盒(MACHEREY-NAGEL)生成质粒pDAB9698的DNA。将纯化的质粒DNA电穿孔到根癌土壤杆菌LBA4404细胞(INVITROGEN)中。简言之，将500ng质粒DNA与细胞在4℃温育10分钟。将该混合物移取到冰预冷的0.2cm GENE
Figure BDA00002986637600386
小杯(BIO-RAD)中，并以下列设置使用BIO-RAD GENE PULSER进行电穿孔：电容输出25微法拉、电容扩充960微法拉、电阻200欧姆、和电压2.5千伏特。紧接电穿孔后，加入950μL SOC培养基(INVITROGEN)，并将混合物转移到Falcon2059管(BECTON DICKINSON AND CO.;FranklinLakes,NJ)中。然后将转化细胞在28℃温育5-6小时。在温育后，将细胞铺到分别的含有卡那霉素(50μg/mL)的YEP培养基平板上。将平板在28℃倒置生长36-48小时。挑出单个菌落并在5mL含有卡那霉素(50μg/mL)的液体YEP中于28℃增殖约36小时。将这些培养物用于制备甘油储存培养物，其通过和相等体积的100%无菌甘油剧烈混合，随后冷冻并存储于-80℃。
实施例22：14.8KpnI VirBCDG片段染色体整合的表型和分子确认
预期具有colE1复制起点的pDAB9698不会在根癌土壤杆菌细胞中自主复制。因此，在将pDAB9698DNA转化到LBA4404细胞中时，稳定的卡那霉素抗性来自pDAB9698DNA到自主复制的土壤杆菌属遗传元件的整合。这些质粒整合体会落入四类，其可以依照如本文中描述的土壤杆菌属菌株的各种实施方案和其使用方法来使用。第一类包含的细胞中pDAB9698DNA已经经由非同源重组整合到远离nilA基因组区的位点。这些细胞通过邻近于14.8KpnI VirBCDG片段的卡那霉素抗性基因应当是卡那霉素抗性的，并且另外经由位于pDAB9698主链载体(pDESTTM14)上的氨苄青霉素抗性基因应当是氨苄青霉素抗性的。第二类包含的细胞中pDAB9698DNA已经经由同源重组整合到自主复制的pAL4404Ti辅助质粒(天然存在于LBA4404)中，所述重组由存在于pDAB9698上的pTiBo542衍生的VirBCDG基因和存在于pAL4404上的pTiACH5衍生的VirBCDG基因介导。这些细胞还应当是卡那霉素且氨苄青霉素抗性的。第三类包含的细胞中pDAB9698DNA已经经由单一同源重组(交叉)事件整合到LBA4404 nilA基因组区中，所述重组事件由位于pDAB9698的约3kbp nilA基因组区序列或侧接15,549bp片段(含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和卡那霉素抗性基因)的序列介导。这些细胞也应当是卡那霉素且氨苄青霉素抗性的。第四类包含的细胞中，上文第三类细胞的单一交叉事件经历第二交叉事件，其由现在复制的3kbp nilA基因组区序列介导，该序列作为单一交叉事件的结果生成。根据哪个侧接3kbp nilA基因组区序列生成单一交叉事件，并且其中哪个侧接序列生成第二交叉事件，所得细胞应当或者是卡那霉素敏感且氨苄青霉素抗性的，或者是卡那霉素抗性且氨苄青霉素敏感的。如本文中描述的优选的细胞包含后一类，即卡那霉素抗性且氨苄青霉素敏感的细胞。期望这些不含有pDESTTM14质粒主链的双交叉事件，因为它们不含有过剩的遗传元件诸如colE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
就期望的双同源重组介导的整合事件筛选实施例21中分离的推定转化体。经由对氨苄青霉素的敏感性，鉴定了卡那霉素抗性的分离物，其具有含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和卡那霉素抗性基因的15,549bp片段(且缺少pDESTTM14载体骨架)。将推定的转化体在3mL含有卡那霉素(50μg/mL)的YEP中于28℃生长约36小时。然后将这些培养物划线接种到固体YEP培养基上，其含有各种如下的单一的抗生素(浓度表示为μg/mL)：利福霉素，100；卡那霉素，50；链霉素，125；氯霉素，50；红霉素，200；四环素，12.5；和氨苄青霉素，100。将平板在28℃温育48小时，并且对菌落生长打分。鉴定了对卡那霉素、利福霉素(染色体标志物)和链霉素(pAL4404标志物；Ooms等，见上)抗性的菌株。此外，该菌株对氯霉素、红霉素和四环素是敏感的。最重要地，该菌株对氨苄青霉素是敏感的。此药物筛选表型指示了期望的双交叉同源重组事件，其中将含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和卡那霉素抗性基因的15,549bp片段整合到根癌土壤杆菌LBA4404染色体中。该菌株被称为DAt16174。
通过分子表征进一步确认了菌株DAt16174中pTiBo542衍生的VirBCDG基因的存在。使用细菌基因组DNA分离方案(Sambrook等，见上和其更新内容)分离菌株DAt16174的基因组DNA。设计PCR引物以扩增染色体整合的VirBCDG基因的重叠片段。按照制造商指引使用FAILSAFETMPCR试剂盒
Figure BDA00002986637600401
来完成使用表6中描述的引物的PCR反应。由于所整合的VirBCDG基因的大的总分子大小，进行扩增以生成5个重叠片段。依照制造商的方案使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN;Valencia,CA)从琼脂糖凝胶纯化具有预期大小的扩增子。使用
Figure BDA00002986637600402
试剂盒(INVITROGEN)将这些片段克隆到
Figure BDA00002986637600403
载体中。经由限制酶消化确认怀疑含有PCR扩增子克隆的细菌菌落。依照制造商说明书使用CEQTMDYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING试剂盒来测定扩增子片段的DNA序列，并使用SEQUENCHERTM版本4.1.4软件(GENE CODES CORP.;Ann Arbor,MI)来分析测序数据。所得序列产生了22kbp的连续序列，其跨越含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和卡那霉素抗性基因的完整的15,549bp片段，以及两个约3kbp的侧接nilA基因组区，并进一步延伸到nilA基因组区上下游(由此包括最初并不包含在pDAB9698中的LBA4404染色体序列)。
经由酮乳糖测试验证菌株DAt16174的根癌土壤杆菌身份。在乳糖琼脂上将推定转化的菌落划线接种，并在28℃温育48小时。然后用Benedict’s溶液充满平板，并在室温监测。由此，将Benedict’s溶液和下面的琼脂从蓝色变为黄色的分离物确认为土壤杆菌。
根癌土壤杆菌菌株DAt16174的一个特征在于，其可以被有利地用作植物转化剂来将T-DNA基因从二元载体转移，所述二元载体具有例如IncP、IncW或VS1类的复制起点。从广义上讲，引入的二元载体可以具有能够在土壤杆菌属中复制且和位于DAt16174中的pAL4404质粒的pTi复制起点(和有关功能)相容的任何类的复制起点。因此，属于菌株DAt16174的可能用途范围的是，如果质粒具有相容的复制起点(即属于不同的不相容组)，那么多于一种二元载体质粒可以共存于菌株DAt16174中。对这类引入的二元载体的选择不应该依赖于赋予卡那霉素、利福霉素或链霉素抗性的细菌可选择标志基因，因为DAt16174菌株对这三种抗生素是抗性的。
二元载体可以在大肠杆菌和土壤杆菌属细胞中都自主复制。它们包含被T-DNA右边界和左边界重复区外接的序列，该序列可以包括对经转化的植物细胞的选择起作用的可选择标志基因、克隆接头、克隆多接头、或其它可以充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点的序列。可以将它们通过电穿孔、通过化学法介导的直接DNA转化、通过细菌缀合引入或其它方法学直接转化到土壤杆菌属细胞中。用作宿主细胞的土壤杆菌属携带至少一个携带vir区的质粒。该vir区是提供Vir蛋白以实施所有牵涉T-DNA到植物细胞中的转移的必需功能所必要的。携带vir区的质粒通常是突变的Ti或Ri质粒(辅助质粒)，其中包括T-DNA右边界和左边界重复在内的T-DNA区已经缺失。含有辅助质粒且可用于植物转化的土壤杆菌属菌株的例子包括，例如，LBA4404、GV3101(pMP90)、GV3101(pMP90RK)、GV2260、GV3850、EHA101、EHA105和AGL1。Hellens等，(2000,Trends Plant Sci.5:446-451)综述了二元载体系统的众多例子。
另外，在菌株DAt16174中保留了赋予菌株LBA4404(pSB1)[在超二元系统中使用]的植物转化优点，所述优点由pTiBo542衍生的virB操纵子(其包括基因virB1、virB2、virB3、virB4、virB5、virB6、virB7、virB8、virB9、virB10和virB11)、virG基因、virC操纵子(其包含基因virC1和virC2)和包含基因virD1的virD操纵子的部分赋予，如位于pSB1质粒上的。由于上文所列的超二元vir基因被整合到LBA4404染色体中，菌株DAt16174被称为SUPERCHROME菌株。相对于超二元系统，菌株DAt16174的使用不需要经由pSB1和穿梭载体诸如pSB11之间的同源重组形成不稳定的超二元质粒。SUPERCHROME菌株的另一个益处在于可以将标准的二元载体引入到菌株中用于植物转化。
实施例23：对用携带pDAB101556的各种土壤杆菌属菌株转化的玉米组织的生化和分子表征
通过标准克隆方法和GATEWAYTM技术的组合构建二元植物转化pDAB101556(图5)。二元载体pDAB101556基于质粒RK2的IncP型复制起点，且载体骨架携带赋予对100μg/mL壮观霉素抗性的细菌基因。T-DNA边界重复自pTi15955的TL区衍生。2条植物可表达的蛋白编码序列(CDS)位于质粒pDAB101556的T-DNA区的右边界(RB)和多个左边界(LB)中。第一基因(可选择的标志物)包含AAD1可选择标志蛋白的编码区(SEQ ID NO:13)(美国专利号7,838,733)，其在1,991bp玉米泛素1启动子及相关的内含子1的转录控制下(美国专利号5,510,474)。该基因由玉米脂肪酶3’UTR终止(美国专利号7,179,902)。第二基因(可筛选的标志物)包含黄色荧光蛋白的CDS(YFP，基本如美国专利号7,951,923中披露的)，其转录受到玉米泛素1启动子及相关的内含子1的调控。该基因由玉米Per53’UTR终止(美国专利号6,384,207)。
通过电穿孔将质粒pDAB101556成功地引入根癌土壤杆菌菌株LBA4404的细胞中以生成菌株LBA4404(pDAB101556)。该菌株/质粒组合由此包含标准的二元植物转化系统。在制备冷冻的甘油保存物和-80℃储存前，通过对质粒DNA的限制酶消化来验证经由对链霉素和壮观霉素的抗性选出的转化体。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株LBA4404(pDAB101556)的大量细胞，并按实施例24中披露的方法用于玉米转化。
通过电穿孔将质粒pDAB101556成功地引入根癌土壤杆菌菌株DAt13192(参见实施例7)的细胞中以生成菌株DAt13192(pDAB101556)。该菌株/质粒组合由此包含重组缺陷的三元植物转化系统。在制备冷冻的甘油保存物和-80℃储存前，通过对质粒DNA的限制酶消化来验证经由对红霉素、卡那霉素和壮观霉素的抗性选择的转化体。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DAt13192(pDAB101556)的大量细胞，并按实施例24中披露的方法用于玉米转化。
已经进行了数种尝试以将质粒pDAB101556的DNA引入到菌株DAt20711(参见实施例9)中，其为一种适合用于重组的三元系统。在所有的情况中，发现质粒pDAB101556在该菌株中是不稳定的，并且没有构建Dat20711(pDAB101556)菌株。
通过电穿孔将质粒pDAB101556成功地引入根癌土壤杆菌菌株DAt16174(实施例22)的细胞中以生成菌株DAt16174(pDAB101556)。该菌株/质粒组合由此包含SUPERCHROME/二元植物转化系统。在制备冷冻的甘油保存物和-80℃储存前，通过对质粒DNA的限制酶消化来验证经由对链霉素、卡那霉素和壮观霉素的抗性选择的转化体。从接种了冷冻的甘油保存物的琼脂平板收获菌株DAt16174(pDAB101556)的大量细胞，并按实施例24中披露的方法用于玉米转化。
实施例24：通过携带二元载体pDAB101556的土壤杆菌属菌株对玉米进行转化
未成熟胚的生成将B104近交的种子种植到具有METRO MIX360(SUNGRO HORTICULTURE Inc.;Bellevue,WA)的3.5英寸的SVD罐中。当植物达到V4-V5生长阶段时，将它们移植到4加仑罐中，其含有1:1混合的METRO-MIX360和PROFILE GREENS GRADE煅烧粘土(PROFILEPRODUCTS LLC;Buffalo Grove,IL)，和20克OSMOCOTE19-6-12，以及20克IRONITETM作为添加物。在温室中生长植物，其使用设置为16：8光照/黑暗的光周期的1000W HPS(高压钠)和1000W MH(金属卤化物)灯的组合(如果外界光照不超过450W/m2的话)。为了获得用于转化的未成熟胚，实施受控的近缘或自体授粉。
在授粉后10-13天，当胚大小为约1.6-2.0mm时，分离未成熟的胚。
侵染和共培养通过浸没于具有LIQUINOXTM洗涤剂(每500mL1或2滴)的20%的商用漂白剂中20分钟将玉米穗表面消毒，并用无菌水漂洗3次。从在AB固体培养基上于20℃生长2-3天，随后在YEP固体培养基于28℃生长1-2天的细菌制备含有二元载体pDAB101556的土壤杆菌属细胞的悬浮液。AB和YEP培养基都含有合适的抗生素补充物，如实施例23中对于用二元载体pDAB101556测试的每种土壤杆菌属菌株所述的。将从YEP平板刮取的菌环量细胞转移到10-15mL液体侵染培养基，其包含：MS盐(Frame等，见上)，经ISU修饰的MS维生素(Frame等，见上)、3.3mg/L麦草畏(Dicamba)-乙醇、68.4gm/L蔗糖、36gm/L葡萄糖、700mg/L L-脯氨酸，pH5.2，且含有100-200μM乙酰丁香酮。使用无菌5mL移液管或涡旋混合器温和地吹吸溶液直到达到均一的悬浮液，并使用Hewlett-Packard P8452a分光光度计将浓度调节为光密度在600nm处(OD600)为约1.0。
共培养将未成熟的胚直接分离到含有2mL侵染培养基的微离心管中。除去培养基并用1-2mL新鲜的侵染培养基替换，然后用1.5mL土壤杆菌属溶液替换。将土壤杆菌属和胚溶液在室温温育5分钟，然后转移到共培养培养基，其含有MS盐、经ISU修饰的MS维生素、3.3mg/L麦草畏-乙醇、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶水解物、15mg/LAgNO3、100-200μM乙酰丁香酮和2.3gm/L GELRITETM(SIGMA-ALDRICH;St.Louis,MO)，于pH5.8。共培养温育在黑暗中于20℃进行3天。
静息和选择在共培养后，将胚转移到无选择的基于MS的静息培养基中，其含有MS盐、经ISU修饰的MS维生素、3.3mg/L麦草畏-乙醇、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶水解物、15mg/LAgNO3、0.5gm/L MES、250mg/L头孢噻肟和2.3gm/L GELRITETM，于pH5.8。在黑暗中于28℃持续温育7天。在7天静息期后，将胚转移到选择培养基中。对于用超二元或二元质粒(含有植物可表达的aad-1可选择的标志基因)转化的玉米组织的选择，使用用氟吡氯禾灵补充的基于MS的静息培养基(上文)。首先将胚转移到含有100nM氟吡氯禾灵的选择培养基I并温育2周，然后转移到有500nM氟吡氯禾灵的选择培养基II并再温育2周。在黑暗中于28℃约5周的时长获得转化的分离物。如必要的，在转移到再生培养基前，将回收的分离物通过转移到新鲜的选择培养基II再进行2周以进行增殖。
玉米转化领域中的技术人员会理解的是，当使用其它植物可表达的可选择的标志基因(例如除草剂耐受基因)时，可用其它方法对转化的植物进行选择。
再生1在选择过程后，将培养物转移到基于MS的再生培养基I，其含有MS盐、经ISU修饰的MS维生素、60gm/L蔗糖、350mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、50mg/L酪蛋白酶水解物、1mg/L AgNO3、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/LGELRITETM和500nM氟吡氯禾灵，于pH5.8。在黑暗中于28℃持续温育2周。
再生II将培养物转移到基于MS的再生培养基II，其含有MS盐、经ISU修饰的MS维生素、30gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/LGELRITETM和500nM氟吡氯禾灵，于pH5.8。在16/8小时光周期下于28℃3周后，采用白色荧光光照条件(约80μEm-2s-1)，将植株切下并转移到基于MS或(基于1/2MS)的芽/根延伸培养基，其由MS盐(或1/2MS盐)、经ISU修饰的MS维生素、0.5gm/L MES、30gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、2.5gm/L GELRITETM，于pH5.8组成。当植株长度达到4-6cm时，将其转移到生长室并最终转移到温室中。
种子生成将再生的植物移植到具有METRO MIX360的3.5英寸的SVD罐中，并放置在生长室中以使其变得耐寒(harden off)。当植物达到V3生长阶段时，将它们移植到温室中，并且在V4/V5生长阶段，将其移植到5加仑罐中，其含有1:1混合的METRO-MIX360和PROFILE GREENS GRADE煅烧粘土(PROFILEPRODUCTS LLC;Buffalo Grove,IL)，和20克OSMOCOTE19-6-12，以及20克IRONITETM作为添加物。在温室中在16：8光照/黑暗的光周期下生长该植物。通过实施受控的授粉(回交B104)生成T1种子。在授粉后6周收获种子。
用工程改造的根癌土壤杆菌菌株LBA4404(pDAB101556)、DAt13192(pDAB101556)和DAt16174(pDAB101556)实施多个玉米转化实验，且将在抑制性浓度的氟吡氯禾灵上选择的转基因愈伤组织继续用于植株再生和进一步的研究。总计在LBA4404(pDAB101556)转化中保留了16个事件，在DAt13192(pDAB101556)转化中保留了49个事件，且在DAt16174(pDAB101556)转化中保留了60个事件(表7)。
使用基因特异性的寡核苷酸通过水解探针测定法(Bubner和Baldwin，见上)估算转基因T0植物中aad-1转基因的拷贝数。对经NcoI切割的DNA实施Southern印迹分析，其使用aad-1基因的PCR扩增片段作为经32P标记的探针，所述切割的DNA是通过十六烷基三甲基溴化铵提取方法从选择的事件中制备的。此外，通过水解探针分析检测起源于pDAB101556的整合的主链载体序列的存在。
因此，菌株DAt16174能够有效生成转化的玉米植物，该菌株是一种SUPERCHROME菌株，其包含位于pAL4404上的完整的pTiACH5衍生的vir基因集合，且进一步包含整合到LBA4404染色体nilA基因座处的部分pTiBo542衍生的vir基因集合。此外，尽管具有的总转化效率比用三元菌株获得的小一些，但SUPERCHROME产生的事件的质量是优异的，90%的产生事件具有单拷贝插入而没有可检测到的主链污染。
尽管已经在特定实施例实施方案(意图例示本发明的一些方面)中描述了本发明，但可以在本公开的精神和范围内对本发明进行进一步修改。因此本公开意图涵盖使用本发明的一般原理对其进行的任何变化、使用或改变。此外，本申请意图涵盖这类从本公开的偏离，如在本发明所属领域中已知的或常规实践中的且落入所附权利要求的限制内的。
本文中引用的所有参考文件，包括出版物、专利和专利申请都通过提述引入本文，其程度如同每一参考文件都被单独地或特定地指示为通过提述并入且以其整体列在本文中。本文中所讨论的参考文件仅以其在本申请的申请日前的公开内容提供。不应将本文中的任何内容理解为承认发明人未被授权以通过在先发明使本公开内容提前公开。
表1.代表性的不相容组和归为属于这些不相容组的一些质粒例子。
不相容组 质粒
FI F、R386
FII R1
FIII Col B-K99、Col B-K166
FIV R124
I R62、R64、R483(至少5个亚组)
J R391
N R46
O R724
P RP4、RK2
Q RSF1010
T R401
W R388、S-a
表2.体外生物测定法结果的总结。
表3.在用二元载体pDAB101513转化的玉米植物中AAD1、Cry1Ca、Cry1Fa和Cry1Ab蛋白的生成(以ppm；百万分之…表示)。
事件名 AAD1 Cry1Ca Cry1Fa Cry1Ab
101513[37]-008.002 830 370 160 84
101513[37]-020.001 550 410 210 100
101513[39]-011.002 380 270 150 27
101513[44]-031.003 740 300 100 40
101513[45]-022.002 380 270 86 32
101513[45]-023.001 300 340 160 31
101513[49]-040.002 220 270 170 21
101513[49]-040.003 210 410 220 26
101513[49]-041.001 340 270 200 21
表4.用携带质粒pDAB101513的根癌土壤杆菌菌株进行的玉米转化实验的结果
Figure BDA00002986637600471
表5.用携带质粒pDAB101514的根癌土壤杆菌菌株进行的玉米转化实验的结果
Figure BDA00002986637600472
表6：用于分子确认15,549bp片段整合到根癌土壤杆菌菌株DAt16174染色体的nilA基因组区中的PCR引物，该片段含有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和卡那霉素抗性基因。
Figure BDA00002986637600473
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表7.对由携带质粒pDAB101556的三种土壤杆菌属菌株生成的转基因事件的分析。
Figure BDA00002986637600482
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Claims (48)

1.一种用于转化植物的方法，其包括使所述植物的细胞与具有至少一个pTi辅助质粒和pTi质粒的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株接触，所述pTi辅助质粒包含pSB1的14.8KpnI片段，所述pTi质粒具有至少一个卸甲T-DNA区，所述T-DNA区包含至少一个右T-DNA边界和邻近于所述边界的外源DNA，其中所述质粒具有相对于彼此的不同复制起点。
2.权利要求1的方法，其中土壤杆菌属菌株中从pSB分离的14.8KpnIVirBCDG片段在RecA功能中具有缺陷。
3.一种用于转化植物的方法，其包括使所述植物的细胞与土壤杆菌属的细菌接触，所述细菌具有pSB1的14.8KpnI VirBCDG片段和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，其中已经将所述14.8KpnI VirBCDG片段整合到所述细菌的染色体的中性整合位点中。
4.依照权利要求1-2中任一项的用于转化植物的方法，其中所述细菌进一步包含具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒，所述质粒具有IncP不相容组的复制起点。
5.依照权利要求3的用于转化植物的方法，其中所述细菌进一步包含具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒。
6.依照权利要求3的用于转化植物的方法，其中所述土壤杆菌属菌株在RecA功能性中有缺陷。
7.依照权利要求4-6中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区含有3种或更多种基因序列。
8.依照权利要求4-7中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区含有等于或大于25,000个核苷酸碱基对。
9.依照权利要求4-8中任一项的用于转化植物的方法，其中在转化所述植物时所述T-DNA区被插入到所述植物细胞中的单个位置中。
10.依照权利要求4-9中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区包含多于一种基因序列，并且所述基因序列具有等于或大于60%的序列同源性。
11.依照权利要求4-10中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区编码一种或多种杀虫蛋白、除草蛋白、或杀虫蛋白和除草剂耐受蛋白的混合物。
12.依照权利要求4-11中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区编码Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、和Cry1Ab1杀虫蛋白。
13.依照权利要求4-12中任一项的用于转化植物的方法，其中所述T-DNA区编码Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白、和AAD-1除草剂耐受蛋白。
14.依照权利要求1-13中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
15.依照权利要求1-14中任一项的方法，其中将14.8KpnI VirBCDG片段克隆到pDAB9291质粒的Kpn I位点中。
16.依照权利要求1-15中任一项的方法，其中所述pTi辅助质粒是质粒pMP90。
17.依照权利要求1-16中任一项的方法，其中所述pTi辅助质粒是质粒pTiC58Δ。
18.依照权利要求15的方法，其进一步包括使用质粒pDAB9292DNA来转化所述土壤杆菌属菌株。
19.依照权利要求1-18中任一项的方法，其进一步包括在使培养的组织经过转化后选择转化的细胞或转化的组织的步骤。
20.一种土壤杆菌属菌株，其具有至少一个pTi辅助质粒和pTi质粒，所述pTi辅助质粒包含pSB1的14.8KpnI片段，所述pTi质粒具有至少一个卸甲T-DNA区，其中所述质粒具有相对于彼此的不同的复制起点。
21.权利要求20的土壤杆菌属菌株，其中所述土壤杆菌属菌株在RecA功能中有缺陷。
22.具有转化增强特性的土壤杆菌属菌株，其包含从pSB1分离的14.8KpnI VirBCDG片段和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒。
23.依照权利要求20-21中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述细菌进一步包含具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒。
24.依照权利要求22的土壤杆菌属菌株，其中所述细菌进一步包含具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的T-DNA区的质粒。
25.依照权利要求24的土壤杆菌属菌株，其中所述土壤杆菌属菌株在RecA功能性中有缺陷。
26.依照权利要求23-25中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区含有三种或更多种基因序列。
27.依照权利要求23-26中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区含有等于或大于25,000个核苷酸。
28.依照权利要求23-27中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区包含多于一种基因序列，且所述基因序列具有大于60%的序列同源性。
29.依照权利要求23-28中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区编码一种或多种杀虫蛋白、除草蛋白、或杀虫蛋白和除草剂耐受蛋白的混合物。
30.依照权利要求23-29中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区编码Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、和Cry1Ab1杀虫蛋白。
31.依照权利要求23-30中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述T-DNA区编码Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白、和AAD-1除草剂耐受蛋白。
32.根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nilA基因组基因座，其中多核苷酸序列被整合到nilA基因组基因座中。
33.权利要求32的nilA基因组基因座，其中所述多核苷酸序列包含vir基因。
34.一种土壤杆菌属菌株，其具有整合到土壤杆菌属染色体上的中性整合位点中的SB1的14.8KpnI VirBCDG片段。
35.依照权利要求34的土壤杆菌属菌株，其中所述中性整合位点是nilA基因组基因座。
36.依照权利要求34-35中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述土壤杆菌属菌株在RecA功能性中有缺陷。
37.依照权利要求34-36中任一项的土壤杆菌属菌株，其中所述土壤杆菌属菌株是根癌土壤杆菌。
38.土壤杆菌属菌株LB4404，其包含pTi辅助质粒上的pSB1的14.8KpnIVirBCDG片段和具有至少一个卸甲T-DNA区的pTi质粒，并且具有邻近于至少一个土壤杆菌属T-DNA边界的外源DNA，其中所述质粒具有相对于彼此的不同的复制起点。
39.依照权利要求1-19中任一项的植物。
40.依照权利要求39的植物，其中在所述植物的后代中稳定产生通过转化引入所述植物的任何遗传性状。
41.依照权利要求4-13中任一项的植物，其中所述T-DNA区被稳定并入到所述植物DNA中。
42.依照权利要求41的植物，其中由所述T-DNA区编码的任何基因都在所述植物中表达。
43.依照权利要求41-42中任一项的植物，其中在所述植物的后代中稳定产生由所述T-DNA区编码的任何基因。
44.依照权利要求41的植物，其中所述植物稳定表达Cry1Ca杀虫蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白、和AAD1除草蛋白。
45.依照权利要求44的植物，其中所述植物是玉米。
46.土壤杆菌属菌株LBA4404，其包含至少一个来自从pSB1分离的14.8KpnI VirBCDG片段的vir基因，所述vir基因被整合到土壤杆菌属染色体上的中性整合位点中。
47.一种能育的转基因谷物/玉米植物或其后代，其表达杀虫量的Cry1Ca蛋白、Cry1F杀虫蛋白、Cry1Ab1杀虫蛋白、和除草剂耐受量的AAD-1蛋白，其中从稳定并入所述植物基因组中的重组DNA的单个基因座共同表达所述Cry1Ca、Cry1F、Cry1Ab1、和AAD1蛋白。
48.权利要求47的能育的转基因谷物/玉米植物，其中所述重组DNA的单个基因座基本上没有来自pTiDNA质粒的载体骨架序列。
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