TW201525136A - 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸 - Google Patents

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Cory M Larsen
Scott A Bevan
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Abstract

本揭露內容係有關於重組型宿主生物體，其係經一種多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統及一或多種輔助蛋白進行基因改造，而促成及/或提高宿主生物體中的PUFA生成作用。本揭露內容亦有關於製造與使用該等生物體之方法，以及有關於從該等生物體所得的產物。

Description

利用破囊壺菌PUFA合成酶於油籽作物中生成ω-3長鏈多不飽和脂肪酸 優先權之主張
本申請案主張於2013年11月26日提出申請之美國暫准專利申請案序號第61/909,289號“利用破囊壺菌PUFA合成酶於油籽作物中生成ω-3長鏈多不飽和脂肪酸”的申請日期之利益。
技術領域
本揭露內容整體而言係有關於重組型宿主生物體(如植物)，其係經一種多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統及一或多種輔助蛋白進行基因改造，而促成及/或提高宿主生物體中的PUFA生成作用。本發明亦有關於製造與使用該等生物體之方法(如從而製得PUFA)，以及有關於從該等生物體所得的產物(如油與種子)。
 背景
多不飽和脂肪酸(PUFA)被視為適用於營養、製藥及工業方面的應用以及其他用途。然而，對於許多長期的商業需求而言，目前來自天然來源(如魚油與海藻油)及來 自化學合成作用的PUFA供應並不足夠，或者不具成本效益。
衍生自植物(如油籽作物)的植物油較不昂貴，並且不具有魚油所面臨的污染問題，及被視為永續的。然而，商業研發的植物與植物油中所存在的PUFA通常不包括飽和度更高或更長鏈的PUFA，及典型地僅包括脂肪酸諸如亞麻油酸(18個碳及具有位於δ9與12位置的2個雙鍵-18：2 δ 9,12)及次亞麻油酸(18：3 δ 9,12,15)。
已有人提及藉由對於植物本身所產生的脂肪酸進行改質，而在植物中生成不飽和程度更高或更長鏈的PUFA。例如，曾述及用編碼脂肪酸延長酶及/或去飽和酶的各種個別基因進行植物的基因改造作用，而導致所產生的葉片或種子含有顯著之長鏈與不飽和程度更高的PUFA水平，該等PUFA諸如二十二碳六烯酸(DHA)與二十碳五烯酸(EPA)；但亦含有顯著之混合短鏈與不飽和程度較低的PUFA水平。Qi等人(2004年)於期刊“Nature Biotech.”第22期第739頁乙文；PCT國際專利公開案WO 04/071467；Abbadi等人(2004年)於期刊“Plant Cell”第16期第1頁乙文；Napier與Sayanova(2005年)於期刊“Proc.Nutr.Soc.”第64期第387-93頁乙文；Robert等人(2005年)於期刊“Functional Plant Biol.”第32期第473-79頁乙文；第2004/0172682號美國專利公開案；Petrie等人(2012年)於期刊“PLOS One”第7期第e49165頁乙文；及第61/345,537號美國暫准申請案(於2010年5月17日提出申請)。
 揭露內容
在本申請案中述及可用於在基因轉殖型宿主生物體(如植物細胞、植物部位及植物)中產生LC-PUFA以及非天然的植物脂質之方法與組成物，例如富集該等PUFA中的三醯甘油脂(TAG)與磷脂類(PL)，及使其等的主鏈比先前更長及不飽和程度更高。在本申請案中亦述及用於在一宿主植物中生產PUFA之系統，該系統提供經基因改造而具有功能性PUFA合成酶系統之一宿主生物體。
本申請案的一些實施例係包括一種基因改造植物細胞(如一種油菜、大豆及/或芥菜屬(Arabidopsis )的植物細胞)，其所包含的聚核苷酸係編碼來自一種破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )(其代表性實例為ATCC登錄號PTA-9695所寄存的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種)的多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶(PFA1、PFA2及PFA3)及來自來自藍綠藻中的念珠藻屬(Nostoc )之磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )之至少一種多肽，其等表現作用之產物重新構建一個功能性PUFA合成酶系統。例如，一植物細胞可包含用於編碼裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PFA1、PFA2及PFA3及念珠藻屬(Nostoc )的HetI 之聚核苷酸。在一些實施例中，植物細胞亦包含用於編碼醯基-CoA合成酶同功異構酶第2型(SzACS2)之至少一種聚核苷酸。在特定的實施例中，編碼至少一種偏好DHA型輔助蛋白之聚核苷酸亦在宿主植物細胞中表現，以促進將LC-PUFA納入籽油中(如ACS、 DGAT、LPAT、LPCAT及PDAT)。
本申請案的特定實施例包括一種基因改造植物(如一種蕓薹屬(Brassica )、大豆屬(Glycine )，芥菜屬(Arabidopsis )及油籽作物植物)，及包括該植物細胞以及其子代、種子、組織或部位。在特定的實施例中，基因改造植物細胞係一種油籽作物植物細胞；例如但不限於紅花、向日葵及棕櫚)。表現一種功能性PUFA合成酶系統之一種經基因改造的油籽作物植物細胞，可能產生特徵性的脂肪酸廓型，例如包括其植物油中含有DHA。
一些實施例提供編碼該功能性PUFA合成酶系統的組分(如裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PFA1、PFA2、PFA3及念珠藻屬(Nostoc )的HetI )之聚核苷酸，及選擇性地至少一種輔助蛋白(如SzACS2)。在一些實施例中，該等聚核苷酸係包含在單一的重組型表現載體中。在其他實施例中，該等聚核苷酸係包含在不同的重組型表現載體中。
在特定的實施例中，編碼該功能性PUFA合成酶系統的組分及選擇性地至少一種輔助蛋白之聚核苷酸，係與一種具種子特異性的啟動子操作連鎖。例如，在特定的實施例中，聚核苷酸可與一啟動子操作連鎖，該啟動子係選自由PvDlec2、PvPhas、LfKCS3、FAE1、BoACP、BnaNapinC、SSPRO2745.1及SSPRO2743.1所組成之群組，該等啟動子元件係如本申請案所舉例說明。在一些實施例中，該聚核苷酸係與一種持續性啟動子(如泛素與CsVMV啟動子)或一種具葉片特異性的啟動子操作連鎖。在特定的 實施例中可使用其他的啟動子，以在不同的生長階段驅動及/或在種子發育期間以更高水平驅動功能性PUFA合成酶系統的表現作用，例如藉而增加LC-PUFA之累積。
在其他實施例中，編碼該功能性PUFA合成酶的組分之聚核苷酸係編碼：所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：1之一致性係至少80%之一種多肽；所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：4之一致性係至少80%之一種多肽；及/或所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：7或序列辨識編號：14之一致性係至少80%之一種多肽，其中該聚核苷酸亦包含一種HetI 基因(如編碼一種多肽之一種聚核苷酸，其中該多肽與序列辨識編號：10的編碼產物之一致性係至少80%)。在一些實施例中，該聚核苷酸亦包含一種SzACS2 基因(如編碼一種多肽之一種聚核苷酸，其中該多肽與序列辨識編號：11的編碼產物之一致性係至少80%)。
在特定的實施例中，編碼該功能性PUFA合成酶的組分之聚核苷酸係包含：與序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3之一致性係至少70%之一種聚核苷酸；與序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6之一致性係至少70%之一種聚核苷酸；與序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13之一致性係至少70%之一種聚核苷酸；及/或與序列辨識編號：10之一致性係至少80%之一種聚核苷酸。在特定實例中，該聚核苷酸亦包含編碼一種多肽之一種聚核苷酸，其與序列辨識編號：11的一致性係至少80%。
在特定的實施例中，編碼該功能性PUFA合成酶的組分之聚核苷酸係在嚴格條件(如非常嚴格條件)下與序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3雜合；與序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6雜合；與序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13雜合；與序列辨識編號：10雜合；及/或與序列辨識編號：11雜合。在特定實例中，該聚核苷酸係在嚴格條件下與序列辨識編號：2、序列辨識編號：5、序列辨識編號：8、序列辨識編號：10及序列辨識編號：11中之所有者雜合。
本申請案亦述及用於產生基因轉殖型植物之一種方法，其中該方法包括將編碼該功能性PUFA合成酶的組分之聚核苷酸導入一植物細胞中；及從該植物細胞再生一植株。在一些實施例中，將位於單一載體中的聚核苷酸轉形至一作物植物中。在其他實施例中，該聚核苷酸係經由多個載體轉形至一作物植物中，而產生含有不同品項的組成基因之一植物。在一些實施例中，藉由常規育種的漸滲雜交作用，將核苷酸導入該作物植物中。在特定的實施例中，藉由育種雜交作用而將功能性PUFA合成酶系統重組，以最佳化子代植物的PUFA廓型(如藉由篩選產生DHA(C22：6，n-3)及/或EPA(C20：5，n-3)之植物)。
在一些實施例中，一種基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位，或自基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得之一種非天然的油(如一種原料籽油)，係包含可檢測量的DHA、DPA(n-6)(C22：5，n-6)及/或EPA。 在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，係具有介於0.01重量%與15重量%之間的DHA(如介於0.05重量%與10重量%之間的DHA；或0.05重量%至5重量%之間的DHA)。在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，係具有介於0.01重量%與10重量%之間的EPA(如介於0.05重量%與5重量%之間的EPA；或0.05重量%至1重量%之間的EPA)。在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，係具有介於0.01重量%與10重量%之間的DPA(n-6)(如介於0.01重量%與5重量%之間的DPA(n-6)；或0.01重量%至1重量%之間的DPA(n-6))。在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，就總脂肪酸的重量而言，EPA：DHA的比例係自10：1至1：30(如約2：1至約1：10，約1：1至約1：12，約2：1至約1：11，約1：1.5至約1：5，約6：1至約1：6.5，及約1：1.25)。在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，就總脂肪酸的重量而言，DPA(n-6)：DHA的比例係自1：1至1：10(如自1：2至1：5，約1：3至約1：5，約1：3至約1：6，及約1：5)。在特定的實施例中，該基因改造植物、其子代、細胞、組織、種子或部位或油所包含的脂肪酸廓型，就該油的重量而言，係具有自70%至99%的三酸甘油酯。
在一些實施例中，在從該基因改造植物所得的植 物性商品產物(如油品、特種油品、穀粒及粕)中，亦可發現可檢測量的DHA、DPA(n-6)及/或EPA。從本申請案所述的基因改造植物所得之含有LC-PUFA的植物油，可使用作為食品配料的低成本DHA/EPA來源，而用於增進人類營養。從本申請案所述的基因改造植物所得之油與油籽可使用作為供動物飼料與水產養殖所用之低成本、高品質的ω-3 LC-PUFA來源；或作為交酯化作用的原料，以建造用於製藥與營養製劑用途之富集ω-3 LC-PUFA的結構化脂質。
本申請案亦述及用於生產一油之方法，該油包含至少一種LC-PUFA，其中該方法包括種植本申請案所述之一種基因改造植物(如一種油籽植物)、其子代、細胞、組織或部位，及/或從本申請案所述之一種基因改造植物提取油(如籽油)。
本申請案亦述及用於提供一個體含有至少一種LC-PUFA的一種增補劑或醫療產品之方法，其中該方法包括提供該個體本申請案所述之一種基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位；本申請案所述之一種油；本申請案所述之一種子；本申請案所述之一食品；本申請案所述之一功能性食品；或本申請案所述之一藥品。在一些實施例中，該等實施例所含有的LC-PUFA係DHA、DPA(n-6)及/或EPA。
從下列參照所附圖示之數個實施例的詳細說明中，將更加明瞭前述的特性及其他特性。
序列表
在所附序列表中的核酸序列係使用核苷酸鹼基的標準字母縮寫顯示，該等標準字母縮寫係如37C.F.R.§1.822中所界定。僅顯示各核酸序列的一股，但是凡提及所顯示的股時，應理解係包括互補股。在所附的序列表中：序列辨識編號：1係顯示一種例示性PFA1蛋白的胺基酸序列：
序列辨識編號：2係顯示在本申請案中稱作PFA1 v1 的一種例示性PFA1 基因的核苷酸序列，其係單離自破囊壺菌裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種(以ATCC登錄號PTA-9695為代表)：
序列辨識編號：3係顯示在本申請案中稱作PFA1 v2 之一種例示性植物最佳化PFA1 基因的核苷酸序列：
序列辨識編號：4係顯示一種例示性PFA2蛋白的胺基酸序列：
序列辨識編號：5係顯示在本申請案中稱作PFA2 v1 之一種例示性PFA2 基因的核苷酸序列，其係單離自破囊壺菌裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種(以ATCC登錄號PTA-9695為代表)：
序列辨識編號：6係顯示在本申請案中稱作PFA2 v2 之一種例示性植物最佳化PFA2 基因的核苷酸序列：
序列辨識編號：7係顯示一種例示性PFA3蛋白的胺基酸序列：
序列辨識編號：8係顯示在本申請案中稱作PFA3 v1 之一種例示性PFA3 基因的核苷酸序列，其係單離自破囊壺菌裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種(以ATCC登錄號PTA-9695為代表)：
序列辨識編號：9係顯示在本申請案中稱作PFA3 v2 之一種例示性植物最佳化PFA3 基因的核苷酸序列：
序列辨識編號：10係顯示一種例示性HetI 基因的核苷酸序列：
序列辨識編號：11係顯示一種例示性SzACS2 基因的核苷酸序列，其係單離自裂殖壺菌(Schizochytrium )ATCC登錄號20888：
序列辨識編號：12係顯示用於一些實施例中之一種隨機“間隔區”聚核苷酸的核苷酸序列。
序列辨識編號：13係顯示在本申請案中稱作PFA3 v3 之一種例示性5’截短型PFA3 基因的核苷酸序列：
序列辨識編號：14係顯示一種例示性5’截短型PFA3蛋白(PFA3v3)的胺基酸序列：
序列辨識編號：15至38係顯示用於本申請案的特定實例中之數種質體的核苷酸序列。
圖1包括用於一些實施例中之例示性PUFA合成酶構築質體之概要。轉錄方向係示於各PTU框之上，編碼序列係述於各PTU之上，及顯示所用的啟動子/終止子組合。
圖1a包括依“第一定向”配置之PUFA合成酶構築質體。
圖1b包括依“第二定向”配置之構築質體。
圖1c包括依“第三定向”配置之構築質體。
圖2包括14 碳標記的EPA、DHA及DPA標準品之HPLC輻射軌跡。EPA與DHA的滯留時間分別標示為約5.3分鐘與約6.1分鐘。
圖3包括經PUFA合成酶與HetI 轉殖基因轉形的芥菜屬(Arabidopsis )品項之T2 種子的LC-PUFA含量摘要。各垂直條狀代表來自一種芥菜屬(Arabidopsis )品項的LC-PUFA含量；黑色為DHA，深灰色為EPA，淺灰色為DPA(n-6)。
圖4包括來自所篩選之基因轉殖型芥菜屬(Arabidopsis )之產生DHA的T2 細胞株之T3 種子子代的LC-PUFA含量之圖示。各圓圈代表來自一同型接合T2 植物的T3 種子。灰色條狀代表各T3 種子品系的平均LC-PUFA含量。
圖5包括來自四種同型接合與五種半合子T1 油菜植物之個別T2 種子的LC-PUFA含量之圖示。分析各品系的48顆種子。“PUFA”代表DHA+EPA+DPA(n=6)的總量。縱 軸係對應於以總FAME%顯示之LC-PUFA含量。
 本發明之進行模式 I.概述數個實施例
在真核生物體中，用於合成LC-PUFA的典型途徑係涉及飽和或單不飽和脂肪酸之延伸作用與去飽和作用。經由PUFA合成酶的LC-PUFA合成途徑係與典型途徑大不相同。具體而言，PUFA合成酶使用丙二醯基-CoA作為碳來源，及產生最終的PUFA而未釋出任何顯著量的中間產物。此外，藉著PUFA合成酶，使用不需要氧的一機制而在合成期間添加適當的順式雙鍵。例如，可在合成循環期間，使用NADPH作為還原劑。
本申請案述及植物、植物種子或植物油中之長鏈或不飽和程度更高的PUFA(以及富集該等PUFA的脂質如TAG與PL)之相對便宜的組成物及有效率且有效的生成方法。該等脂肪酸及其等的生成方法係適用於各種情況，包括膳食與工業應用。如本申請案所述之藉由提供經一種PUFA合成酶系統(例如含有從破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )所辨識出的PUFA合成酶組分及來自來自藍綠藻中的念珠藻屬(Nostoc )的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )，例如亦含有一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶同功異構酶第2型)基因改造之重組型宿主生物體，而在宿主生物體(如植物)中提供及增進PUFA生成作用之一系統，係具有優於製得該等脂肪酸的傳統方法之顯著益處。
海洋破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )(以ATCC登錄號PTA-9695為代表)產生具有高ω-3/ω-6比例的油，該油亦可作為用於作物轉形作用的PUFA合成酶 基因之來源。此外，除了DHA之外，裂殖壺菌所產生的油可含有顯著的EPA水平。產生顯著量的EPA之能力係與其他一些破囊壺菌菌株(例如ATCC登錄號20888之裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種)相反。第US2013/0150599A1號美國專利公開案；第WO2013/016546號PCT國際專利公開案。當以異源方式在廣泛種類的作物植物中表現時，裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶系統可產生功用，而製造出商業上顯著的ω-3 LC-PUFA水平(如DHA與EPA)，如在本申請案中藉由油菜、大豆及模式植物芥菜屬(Arabidopsis )之實例所證實。因此，在一些實施例中，相較於植物中的其他PUFA合成酶基因組，該基因組可導致生成顯著較多的DHA與EPA。
本申請案亦述及各種構築質體設計之用途，包括多樣化之具種子特異性的不同啟動子與終止子、使用間隔區元件、改變轉錄定向、基因在T-DNA內的不同相對位置及使用天然與經改質的基因序列。可使用該等構築質體設計，以進一步提高所回收之產生LC-PUFA的品項數目，及ω-3 LC-PUFA表徵在後代中的遺傳率。
在本申請案的實例中，油菜、大豆及芥菜屬(Arabidopsis )植物係用載體進行轉形，該等載體所承載之基因係編碼來自破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )之PUFA合成酶的三種組分多肽(即PFA1、PFA2及PFA3)，連同來自念珠藻屬(Nostoc )的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )。在一些實施例中，單一構築質體中所含 有的所有四種基因皆在一種具種子特異性的啟動子之控制下，及由多種具種子特異性之不同構形的啟動子所驅動。植物轉形實驗所產生之品項係在種子中含有所有四種轉殖基因及表現所有四種多肽。在所得的基因轉殖型品項之種子脂質中產生ω-3長鏈多不飽和脂肪酸DHA與EPA。亦檢測出ω-6長鏈多不飽和脂肪酸DPA。所回收的油菜品項在T1 種子的總體分析中，含有高達2.9%的DHA與1.0%的EPA(3.9%的總ω-3 LC-PUFA)及1.1%的DHA+2.0%的EPA。在T1 油菜種子的單粒種子分析中，檢測出高達4.6%的DHA與3.7%的EPA。在T1 種子的單粒種子分析中，所回收的大豆品項含有高達1.9%的DHA與2.2%的EPA。
II.縮寫
III.詞彙
回交：可使用回交方法將一核酸序列導入植物中。數十年來，已廣泛使用回交技術將新的表徵導入植物中。約翰‧威利父子(John Wiley & Sons)出版有限公司於1988年出版及由Jensen，N.編輯之“植物育種方法(Plant Breeding Methodology)”乙書。在典型的回交程序中，所關注的原始品種(回交親本)係與帶有一種所關注的待轉移基因之第二品種(非回交親本)雜交。該雜交作用所產生的子代然後再度與回交親本雜交，及重複該過程直到獲得一植物為止，其中除了從非回交親本所轉移的基因之外，回交植物中所有所欲的形態與生理特徵亦已在轉化植物中得著恢復。
單離的：一種“單離的”生物組分(諸如一核酸或蛋白)係已實質上與該組分所天然存在之生物體的細胞中之其他生物組分(即其他染色體與染色體外的DNA與RNA及蛋白)分開、經生產或純化而與其等分開，而在該組分中引發化學或功能變化(如一核酸可能藉由斷開連接該核酸 與染色體中的其餘DNA之化學鍵而從一染色體單離出)。已“單離的”核酸分子與蛋白係包括藉由標準純化方法純化而得的核酸分子與蛋白。該詞亦涵蓋在一宿主細胞中藉由重組型表現作用所製備的核酸與蛋白，以及經化學合成的核酸分子、蛋白及肽。
核酸分子：如本申請案所用的“核酸分子”一詞係指核苷酸的一種聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因體DNA的訊息股與反訊息股，及上述的合成形式與混合型聚合物。核苷酸係指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型的改質形式。如本申請案所用之“核酸分子”係與“核酸”及“聚核苷酸”同義。一核酸分子的長度通常至少有10個鹼基，除非另有說明。該詞包括DNA的單股與雙股形式。一核酸分子可包括天然存在的核苷酸與改質型核苷酸中之任一或二者，及藉由天然存在及/或非天然存在的核苷酸連鎖而連結在一起。
如本技術領域的一般技術人員即可理解，核酸分子能以化學方式或生化方式改質，或可含有非天然或衍生的核苷酸鹼基。該改質作用例如包括標記、甲基化作用、以一類似物取代一或多種天然存在的核苷酸、核苷酸間的改質作用(如未荷電連鎖：例如膦酸甲酯類、磷酸三酯類、胺基磷酸酯類、胺甲酸酯類等；荷電連鎖：例如硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類等；側鏈基團：例如肽；嵌合劑：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑；烷化劑；及改質型連鎖：例如α變旋異構核酸等)。“核酸分子”一詞亦包括任一拓撲 構形，包括單股型、雙股型、部份雙股型、三股型、髮夾型、環型及扣鎖型構形。
操作連鎖：當第一種核酸序列與第二種核酸序列具有一功能性關係時，則第一種核酸序列係與第二種核酸序列操作連鎖。當以重組方式產生時，操作連鎖的核酸序列一般是鄰接的；而在需要連接二個蛋白編碼區之情況下，則位於同一個讀框中(如位於一個多順反子ORF中)。然而，核酸並非必需鄰接方能操作連鎖。
當“操作連鎖”一詞用於一調控序列與一編碼序列時，係指該調控序列影響所連鎖的編碼序列之表現作用。“調控序列”或“控制元件”係指影響轉錄作用的時程與水平/量、RNA處理或安定性或相關編碼序列的轉譯作用之核苷酸序列。調控序列可包括啟動子、轉譯引導序列、內含子、增強子、莖環結構、抑制子結合序列、終止序列及多腺苷酸化辨識序列。特定的調控序列可位於其所操作連鎖的一編碼序列之上游及/或下游。此外，與一編碼序列操作連鎖之特定的調控序列可位於一雙股核酸分子所結合的互補股上。
啟動子：如本申請案所用之“啟動子”一詞係指可位於轉錄作用起始點上游之一DNA區域，及可能涉及用以起始轉錄作用之RNA聚合酶與其他蛋白的辨識作用與結合作用。一啟動子可與用於在一細胞中表現的一編碼序列操作連鎖，或者一啟動子可與編碼一訊息序列的核苷酸序列操作連鎖，該訊息序列可與用於在一細胞中表現的一編碼 序列操作連鎖。一“植物啟動子”可為在植物細胞中可起始轉錄作用之啟動子。在發育控制下的啟動子實例包括優先在特定組織諸如葉片、根部、種子、纖維、木質導管、管胞或厚壁組織起始轉錄作用之啟動子。該等啟動子係稱作“組織偏好性”啟動子。僅在特定組織中起始轉錄作用之啟動子係稱作“組織特異性”啟動子。“細胞類型特異性”啟動子主要驅動一或多種器官的特定細胞類型中之表現作用，例如根部或葉片中的維管細胞。“誘導性”啟動子可為一種在環境控制下的一種啟動子。可藉由誘導性啟動子起始轉錄作用之環境條件的實例包括厭氧條件及光照之下。組織特異性、組織偏好性、細胞類型特異性及誘導性啟動子係“非持續性”啟動子之類別。“持續性”啟動子係在大部分的環境條件下，在生物體的大部分細胞中皆具有活性的啟動子。
在本發明的一些實施例中，可使用任一種誘導性啟動子。見Ward等人(1993年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第22期第361-366頁乙文。因著誘導性啟動子，轉錄作用回應一誘導劑而增加速率。例示性的誘導性啟動子包括但不限於：來自ACEI系統的啟動子，其係回應銅；來自玉米的In2 基因，其係回應苯磺醯胺除草劑安全劑；來自Tn10的Tet抑制子；及來自一種類固醇荷爾蒙基因的誘導性啟動子，其轉錄活性可藉由一種糖皮質類固醇荷爾蒙誘導(Schena等人(1991年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第88期第0421頁乙文)。
例示性的持續性啟動子包括但不限於：來自植物病毒的啟動子，諸如來自CaMV的35S啟動子；來自稻米肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉米H3組織蛋白啟動子；及ALS啟動子，在西洋油菜(Brassica napus )的ALS3 結構基因5'處之Xba1/NcoI片段(或類似於該Xba1/NcoI片段之一核苷酸序列)(第WO96/30530號國際專利公開案)。
此外，在本發明的一些實施例中，可使用任一種組織特異性或組織偏好性啟動子。當植物藉由一核酸分子轉形，而該核酸分子所包含的一編碼序列係與一組織特異性啟動子操作連鎖時，可在一特定組織中僅僅或優先產生該編碼序列的產物。例示性的組織特異性或組織偏好性啟動子包括但不限於：根部偏好性啟動子，諸如來自菜豆素基因者；一種葉片特異性與光誘導性啟動子，諸如來自碳酸酐酶或核酮糖雙磷酸羧化酶者；一種花藥特異性啟動子，諸如來自LAT52 者；一種花粉特異性啟動子，諸如來自Zm13 者；一種小孢子偏好性啟動子，諸如來自apg 者；及一種種子特異性啟動子(如來自PvDlec2 、LfKCS3 、FAE1 、BoACP 或BnaNapinC 之一啟動子)。
異源性：在本申請案中，用於核酸(如聚核苷酸、DNA、RNA及基因)之“異源性”一詞係指來自不同來源。例如，若一宿主細胞係經一核酸轉形，而該核酸在自然界中未經轉形的宿主細胞中係不存在的，則對該宿主細胞而言，該核酸係異源性(及外源性)。此外，一轉形核酸的不同元件 (如啟動子、增強子、編碼序列、終止子等)可彼此互為異源性，及/或對經轉形的宿主而言為異源性的。本申請案所用之異源性一詞，亦可適用於與一宿主細胞中已存在的一核酸序列一致之一或多種核酸，惟該一或多種核酸係與其他不同序列連接及/或係以不同的套數存在等等。
原生：如本申請案所用之“原生”一詞，係指位於其在生物體中的天然位置或位於自然界所存在之一生物體的基因體中之一聚核苷酸或基因形式，在調控序列存在之情況下，則其具有自身的調控序列。
內源性：如本申請案所用之“內源性”一詞，係指一聚核苷酸、基因或多肽，其係位於在自然界中正常包含該分子之生物體或基因體中。
轉形作用：如本申請案所用之“轉形作用”或“轉導作用”一詞，係指將一或多種核酸分子轉移至一細胞中。當藉著將一核酸分子嵌入細胞基因體中，或藉由游離基因體複製作用，使得核酸分子在一細胞中穩定複製時，該細胞即藉由轉導至細胞中的該核酸分子而“轉形”。如本申請案所用之“轉形作用”一詞，係涵蓋可將一核酸分子導入該一細胞中之所有技術。實例包括但不限於：使用病毒載體的轉染作用；使用質體載體的轉形作用；電穿孔法(Fromm等人(1986年)於期刊“Nature”第319期第791-3頁乙文)；脂質體轉染作用(Felgner等人(1987年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第84期第7413-7頁乙文)；顯微注射(Mueller等人(1978年)於期刊“Cell”第15期第579-85頁乙文)；農桿菌介導 型轉移作用(Fraley等人(1983年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第80期第4803-7頁乙文)；DNA直接攝入作用；及微彈轟擊法(Klein等人(1987年)於期刊“Nature”第327期第70頁乙文)。
轉殖基因：係指嵌入宿主基因體中的一外源性核酸序列。在一些實施例中，一轉殖基因可能含有與該轉殖基因的一編碼序列操作連鎖之調控序列(如一啟動子)。
載體：係指當導入一細胞中時，例如可產生一轉形細胞之一核酸分子。一載體可包括核酸序列，其促成該載體在宿主細胞中複製，諸如一複製起點。載體的實例包括但不限於：一質體；黏接質體；噬菌體；或將外源性DNA帶入一細胞中之病毒。載體亦可包括一或多種基因、反訊息分子及/或篩選標記基因及技藝中所知的其他遺傳元件。一載體可使一細胞轉導、轉形或感染，從而促使該細胞表現該載體所編碼的核酸分子及/或蛋白。載體選擇性地包括有助於核酸分子進入細胞之物質(如脂質體與蛋白塗層)。
表現作用：如本申請案所用之“表現作用”一詞，可指轉錄作用及聚核苷酸所編碼的mRNA之穩定累積作用，或指該mRNA轉譯成多肽之作用。如本申請案所用之“過度表現”一詞，係指表現作用係高於相同基因或一密切相關基因的內源性表現作用。若一異源基因的表現作用高於一密切相關的內源基因(如一同源物)的表現作用，則該異源基因係過度表現。
外源性：在本申請案中用於核酸(如聚核苷酸、 DNA、RNA及基因)之“外源性”一詞，係指在其等的特定環境或情境下，一般不存在的一或多種核酸。例如，若一宿主細胞係經一核酸轉形，而該核酸在自然界中未經轉形的宿主細胞中係不存在的，則對於該宿主細胞而言，該核酸係外源性。如本申請案所用之外源性一詞，亦指其序列係與業已存在於宿主細胞中的一核酸一致之一或多種核酸，但其所處的細胞或基因體情境係不同於業已存在於宿主細胞中之具相同序列的核酸。例如，若一核酸嵌入宿主細胞的基因體之位置，係不同於具相同序列的一核酸一般嵌入該宿主細胞的基因體之位置，則對於該宿主細胞而言，該核酸係外源性。此外，若一核酸(如一DNA分子)係存在於宿主細胞的一質體或載體中，而具相同序列的一核酸一般僅存在於該宿主細胞的基因體，則對於該宿主細胞而言，該核酸係外源性。
序列一致性：如本申請案在二種核酸或多肽序列的上下文中所用的“序列一致性”或“一致性”一詞，可指在一指定的比較窗口進行最大對應的排比時之該二序列中的相同殘基。
如本申請案所用之“序列一致性百分比”一詞，可指藉由在一比較窗口比較二種經最佳排比的序列(如核酸序列與胺基酸序列)所測得之數值，其中相較於供該二序列的最佳排比所用之參考序列(其不包含添加或刪除)，在比較窗口中之該序列部分可包含添加或刪除(亦即間隙)。百分比之計算係藉由測定在該二序列中出現一致性核苷酸或胺基 酸殘基的位置之數目，而得配對位置之數目，將比較窗口中之配對位置的數目除以位置總數，及將該結果乘以100而得序列一致性百分比。
用於序列排比之方法係技藝中眾所周知。各種程式與排比演算法係述於：Smith與Waterman(1981年)於期刊“Adv.Appl.math.”第2期第482頁乙文；Needleman與Wunsch(1970年)於期刊“J.Mol.Biol.”第48期第443頁乙文；Pearson與Lipman(1988年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第85期第2444頁乙文；Higgins與Sharp(1988年)於期刊“Gene”第73期第237-44頁乙文；Higgins與Sharp(1989年)於期刊“CABIOS”第5期第151-3頁乙文；Corpet等人(1988年)於期刊“Nucleic Acids Research”第16期第10881-90頁乙文；Huang等人(1992年)於期刊“Computer Applications in the Biosciences”第8期第155-65頁乙文；Pearson等人(1994年)於期刊“Methods in Molecular Biology”第24期第307-31頁乙文；Tatiana等人(1999年)於期刊“FEMS Microbiol.Lett.”第174期第247-50頁乙文。關於序列排比方法與同源性計算之詳細審議可見Altschul等人(1990年)於期刊“J.Mol.Biol.”第215期第403-10頁乙文。
可從包括國家生物技術資訊中心(美國馬里蘭州貝塞斯達(Bethesda))及網際網路在內的數個來源，取得國家生物技術資訊中心(NCBI)的基本局部排比搜尋工具(BLASTTM ；Altschul等人(1990年)乙文)，以供連同數個序列分析程式使用。可在網際網路上，在BLASTTM 的“協助” 部分，取得如何使用該程式測定序列一致性之說明。就胺基酸序列之比較而言，BLASTTM (Blastn)程式的“Blast 2序列”功能之運用係採用預設參數。當藉由該方法進行評估時，與參考序列的相似程度較高之核酸序列所顯示的一致性百分比將遞增。
本申請案所用之“實質上一致”一詞，可指一致性高過85%之核苷酸序列。例如，一實質上一致的核苷酸序列與參考序列之一致性可為至少85.5%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%。
在一些實施例中，可經由使用一核酸探針，檢測一植物中是否存在一異源性核酸。探針可為一DNA分子或一RNA分子。可藉由技藝中所知之方式，例如使用一DNA分子模板，合成RNA探針。一探針可含有該異源性核酸的所有或一部分的核苷酸序列及來自植物基因體之附加的鄰接核苷酸序列。這在本申請案中稱作“鄰接探針”。如習慣上所理解，依該植物染色體的鄰接核苷酸序列係位於該異源性核酸的5’側或3’側而定，該附加的鄰接核苷酸序列亦稱作該異源性核酸的“上游”或“下游”。如本技術領域的一般技術人員所明瞭，用以納入探針中之附加的鄰接核苷酸序列之製造方法幾乎可以無限地重複(僅受限於染色體的長度)，以使得沿著染色體辨識附加的核酸。在本發明的一些實施例中，可使用上述任一與所有種類的探針。
探針可含有並非與該異源性核酸鄰接的一核苷酸序列；在本申請案中，該探針係稱作“非鄰接探針”。該非鄰接探針的序列之位置係與染色體上之異源性核酸的序列充分接近，使得該非鄰接探針係與該異源性核酸在基因上連接。探針亦可為待檢測的一異源性核酸之完全相同的複製本。探針亦可為包含一核苷酸序列或由其所組成之一核酸分子，而該核苷酸序列係與包含一種待檢測的異源性核酸之染色體DNA的一選殖節段實質上一致。
可藉由合成方式或藉由選殖而製備寡核苷酸探針序列。適宜的選殖載體係本技術領域的嫻熟技術人員眾所周知。寡核苷酸探針可具有標記或不具有標記。有廣泛種類的技術可用於標記核酸分子，例如包括但不限於：藉由缺口轉譯作用之放射性標記作用；隨機導引作用；使用末端去氧轉移酶之尾部嵌入法等；在這種情況下所用的核苷酸係經標記的，例如經放射性32 磷標記。其他可用的標記例如包括但不限於：螢光團、酵素、酵素受質、酵素輔因子、酵素抑制劑等。任擇地，可使用與受體結合之配位體，而取代其本身或連同其他反應劑提供一種可檢測訊號之一標記，其中該等受體係具有標記(例如上述所示的標記)而由其本身或連同其他試劑提供可檢測的訊號。如見Leary等人(1983年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第80期第4045-9頁乙文。
探針亦可為一核酸分子，其係與待檢測的核酸(“DNA標的”)之完全相同的複製本“可特異性雜合”或“特異 性互補”。“可特異性雜合”與“特異性互補”等詞係指具有充分的互補程度，使得在該核酸分子與該DNA標的之間產生安定的特異性結合作用。可特異性雜合的核酸分子並不需要與其標的序列100%互補。在期望特異性結合作用之條件下，例如在嚴格的雜合條件下，當互補程度足以避免該核酸與非標的序列的非特異性結合作用時，該核酸分子即為可特異性雜合的。
導致特定嚴格程度之雜合條件，將依所選擇的雜合方法之性質及雜合的核酸序列之組成與長度而異。一般而言，雜合作用的溫度及雜合緩衝液的離子強度(尤其鈉+ 及/或鎂++ 濃度)將決定雜合作用的嚴格度，雖然清洗次數亦影響嚴格度。本技術領域的一般技術人員知悉關於達到特定嚴格程度所需的雜合條件之計算，及例如論述於美國紐約州冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版公司於1989年出版及由Sambrook等人編輯之“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)”乙書第二版第1-3冊第9與11章；及英國牛津之IRL出版社於1985年出版及由Hames與Higgins編輯之“核酸雜合作用(Nucleic Acid Hybridization)”乙書。關於核酸雜合作用進一步的詳細說明與指導，例如可見於美國紐約的埃爾塞維爾(Elsevier)出版公司於1993年出版之“生物化學與分子生物學之實驗室技術-與核酸探針的雜合作用(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)”乙書第I 部第2章之Tijssen所著“概述雜合作用之原理及核酸探針分析之策略(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)”乙文；及美國紐約的格林(Greene)出版社與威利資訊網路(Wiley-Interscience)公司於1995年出版及由Ausubel等人編輯之“當前的分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)”乙書第2章。
如本申請案所用之“嚴格條件”，係涵蓋唯有當雜合分子與DNA標的之間的誤配少於25%時才會發生雜合作用之條件。“嚴格條件”進一步包括特定的嚴格度水平。因而，本申請案所用之“適度嚴格”條件，係當分子的序列誤配超過25%時則不會發生雜合作用之條件；“中度嚴格”條件係當分子的誤配超過15%時則不會發生雜合作用之條件；及“高度嚴格”條件係當序列的誤配超過10%時則不會發生雜合作用之條件。“非常高度嚴格”條件係當序列的誤配超過6%時則不會發生雜合作用之條件。
在特定的實施例中，嚴格條件係在65℃及6x食鹽水-檸檬酸鈉(SSC)緩衝液、5x丹哈特(Denhardt)溶液、0.5% SDS及100微克的剪碎鮭魚睪丸DNA中進行雜合作用，接著在65℃依序在下列各者中清洗15至30分鐘：2x SSC緩衝液與0.5% SDS，接著1xSSC緩衝液與0.5% SDS，及最後0.2x SSC緩衝液與0.5% SDS。
就上文所論及的所有探針而言，該探針可包含附加的核酸序列，例如啟動子、轉錄訊號及/或載體序列。
最佳化：就編碼一蛋白的一核酸而言，本申請案所用之“最佳化”一詞係指一核酸，其中已改變一異源性核苷酸序列，以反映一標的宿主生物體之密碼子偏移。在一些實施例中，可進一步改變該核苷酸序列，以移除可能干擾基因表現作用的遺傳元件。
應理解由於遺傳密碼的冗餘性，可設計多種DNA序列來編碼單一胺基酸序列。因而，可設計最佳化DNA序列，例如以去除多餘的限制酶位點及非所欲的RNA二級結構，同時將編碼區的核苷酸序列最佳化，以使得密碼子組成係類似於待表現該DNA的宿主之整體密碼子組成。關於合成DNA序列之設計與生成作用之指南，例如可見第WO2013016546號、第WO2011146524號及第WO1997013402號國際專利申請案；及第6,166,302號與第5,380,831號美國專利。
保留性取代作用：如本申請案所用之“保留性取代作用”一詞，係指一胺基酸殘基經另一個同類胺基酸取代之取代作用。非保留性胺基酸取代作用係指該等殘基並非同一類，例如，用一種鹼性胺基酸取代一種中性或非極性胺基酸。針對保留性取代作用之目的所界定之胺基酸類別，係技藝中所知的。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種脂族胺基酸取代不同的第二種脂族胺基酸。例如，若第一種胺基酸係甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選 自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在特定的實施例中，若第一種胺基酸係甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及疏水性脂族胺基酸取代作用的特定實施例中，若第一種胺基酸係丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之不同的第二種胺基酸置換。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種芳族胺基酸取代不同的第二種芳族胺基酸。例如，若第一種胺基酸係組胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自組胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及未荷電的芳族胺基酸取代作用的特定實施例中，若第一種胺基酸係苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸之不同的第二種胺基酸置換。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種疏水性胺基酸取代不同的第二種疏水性胺基酸。例如，若第一種胺基酸係丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、 甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及非芳族的疏水性胺基酸取代作用之特定實施例中，若第一種胺基酸係丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸及甲硫胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸及甲硫胺酸之不同的第二種胺基酸置換。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種極性胺基酸取代不同的第二種極性胺基酸。例如，若第一種胺基酸係絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及未荷電的極性胺基酸取代作用之特定實施例中，若第一種胺基酸係絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸及脯胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸及脯胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及荷電的極性胺基酸取代作用之特定實施例中，若第一種胺基酸係組胺酸、精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自組胺酸、精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及荷電的極性胺基酸取代作用之其他實施例中，若第一種胺基酸係精胺酸、離胺酸、 天門冬胺酸及麩胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及正電荷(鹼性)的極性胺基酸取代作用之特定實施例中，若第一種胺基酸係組胺酸、精胺酸及離胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自組胺酸、精胺酸及離胺酸之不同的第二種胺基酸置換。在涉及正電荷的極性胺基酸取代作用之其他實施例中，若第一種胺基酸係精胺酸或離胺酸，則第一種胺基酸可被精胺酸與離胺酸中的另一胺基酸置換。在涉及負電荷(酸性)的極性胺基酸取代作用之特定實施例中，若第一種胺基酸係天門冬胺酸或麩胺酸，則第一種胺基酸可被天門冬胺酸與麩胺酸中的另一胺基酸置換。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種電中性胺基酸取代不同的第二種電中性胺基酸。例如，若第一種胺基酸係甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺及酪胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺及酪胺酸之不同的第二種胺基酸置換。
在一些實施例中，保留性取代作用係包括用第一種非極性胺基酸取代不同的第二種非極性胺基酸。例如，若第一種胺基酸係丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸及甲硫胺酸中之一者，則第一種胺基酸可被選自丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸及甲硫胺酸之不同的第二種胺 基酸置換。
在許多實例中，在保留性取代作用中用於置換第一種胺基酸之特定的第二種胺基酸之選擇方式，係為了將第一種與第二種胺基酸所同屬的上述類別之數目最大化。因而，若第一種胺基酸為絲胺酸(一種極性、非芳族的電中性胺基酸)，第二種胺基酸可為另一種極性胺基酸(即蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸或麩胺酸)；另一種非芳族胺基酸(即蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、或甲硫胺酸)；或另一種電中性胺基酸(即甘胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺或酪胺酸)。然而，在這種情況下，第二種胺基酸較佳為蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸及甘胺酸中之一者，因為該等胺基酸在根據極性、非芳香性及電中性所分類的類別上相同。選擇性地，用於挑選在保留性取代作用中所用之特定的第二種胺基酸之其他標準，係技藝中所知。例如，當蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸及甘胺酸可供用於絲胺酸的保留性取代作用時，可從選擇過程中淘汰半胱胺酸，以避免形成不良的交聯及/或雙硫鍵。同樣地，可從選擇過程中淘汰甘胺酸，因為其缺乏烷基側鏈。在這種情況下，可選擇蘇胺酸，例如以保有一側鏈羥基的官能度。然而，用於保留性取代作用中之特定的第二種胺基酸之選擇，最終仍由嫻熟的技術人 員酌情決定。
PUFA：如本申請案所用之“多不飽和脂肪酸”或“PUFA”一詞，係指碳鏈長度為至少16個碳(如至少18個碳、至少20個碳及22個碳或更多個碳)及具有至少3個以上的雙鍵(如4個以上的雙鍵、5個以上的雙鍵及6個以上的雙鍵)之一脂肪酸，其中所有雙鍵皆為順式構形。
本申請案所用之“長鏈多不飽和脂肪酸”或“LC-PUFA”一詞，係指碳鏈長度為20個碳以上及含有3個以上的雙鍵或碳鏈長度為22個碳以上及含有3個以上的雙鍵(如4個以上的雙鍵、5個以上的雙鍵及6個以上的雙鍵)之一脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA例如包括但不限於二-同-γ-次亞麻油酸(C20：3 n-6)、花生油酸(C20：4 n-6)、腎上腺酸(亦稱作二十二碳四烯酸或DTA；C22：4 n-6)及二十二碳五烯酸(C22：5 n-6)。ω-3系列的LC-PUFA例如包括但不限於二十碳三烯酸(C20：3 n-3)、二十碳四烯酸(C20：4 n-3)、二十碳五烯酸(C20：5 n-3)、二十二碳五烯酸(C22：5 n-3)及二十二碳六烯酸(C22：6 n-3)。LC-PUFA亦包括具有超過22個碳及4個以上的雙鍵之脂肪酸，例如但不限於C28：8(n-3)。
本申請案所用之“PUFA合成酶”或“PFA”一詞，係指產生PUFA(如LC-PUFA)之一酵素，以及該酵素在一系統或複合體中之一域。PUFA合成酶一詞例如包括但不限於用於PUFA生成作用的PUFA PKS系統或類PKS系統。在本申請案中，藉由附加的表示方式來指定一些特定的PUFA合成酶(“裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶”，PFA1、PFA2 及PFA3；如來自ATCC登錄號為PTA-9695之裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種)。“PUFA合成酶系統”一詞係指一或多種PUFA合成酶及可影響PUFA合成酶功能的任何異源性輔助酵素(如一種PPTase或ACS)。
PPTase：如本申請案所用之“磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶”或“PPTase”一詞，係指藉由將一輔因子(如4-磷酸泛醯巰基乙胺)從輔酶A(CoA)轉移至存在於PUFA合成酶中的一或多個ACP域而活化PUFA合成酶之一酵素。用於本申請案的實施例中之可活化PUFA合成酶的一或多個ACP域之PPTase實例，係來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的HetI 蛋白(如來自PCC 7120的HetI ；苷稱念球藻屬(Anabaena )物種PCC 7120)，在本申請案中稱作“NoHetI ”。
ACS：本申請案所用之“醯基-CoA合成酶”、“ACoAS”或“ACS”一詞，係指催化長鏈多不飽和游離脂肪酸(FFA)轉化為醯基-CoA之一酵素。用於本申請案的特定實施例中之特定的醯基-CoA合成酶，係衍生自ATCC登錄號為20888之裂殖壺菌(Schizochytrium )，及藉由附加的表示方式稱作“SzACS2”。
植物：如本申請案所用之“植物”一詞，係包括其任何子代、細胞、組織、種子、籽油或部位。
表徵或表現型：在本申請案中，“表徵”與“表現型”等詞係以可互換方式使用。就本揭露內容的目的而言，特別關注的表徵係包括例如可在一油籽作物植物中表現之ω-3 LC-PUFA表徵。
功能性食品：如本申請案所用之“功能性食品”一詞，係指外觀與一般膳食所食用的慣用食物相近之一食物，但基於改變該慣用食物之未經改質原料典型所存在的組分比例之改質作用，而具有提高的營養價值及/或特定膳食益處。
除非特別說明或暗示，如本申請案所用之“一(a)”、“一(an)”及“該”係表示“至少一個”。
除非另有具體說明，本申請案中所用的所有技術與科學用語之含義，係與本揭露內容所屬技術領域的普通技術人員通常所理解者相同。分子生物學中的常見用語之定義，例如可見於牛津(Oxford)大學出版社於1994出版及由Lewin B.所著之“基因(Genes)第五冊”乙書(ISBN 0-19-854287-9)；布萊克韋爾科學(Blackwell Science)有限公司於1994出版及由Kendrew等人編輯之“分子生物學百科全書(The Encyclopedia of Molecular Biology)”乙書(ISBN 0-632-02182-9)；及VCH出版有限公司於1995出版及由Meyers R.A.編輯之“分子生物學與生物技術：桌上參考手冊大全(Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference)”乙書(ISBN 1-56081-569-8)。所有百分比係以重量為基礎，而所有溶劑混合物比例係以體積為基礎，除非另有說明。所有溫度皆為攝氏溫度。
IV.異源性PUFA合成酶系統 裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶
本申請案的實施例係包括經基因改造而表現一 種PUFA合成酶之宿主生物體(如植物)。在一些實施例中，一生物體係經基因改造而表現一種異源性PUFA合成酶系統，例如包含一種PUFA合成酶及其至少一種輔助蛋白之功能性異源蛋白系統。本申請案的基因改造作用亦可用於一些實施例中，以在可內源表現PUFA合成酶之一宿主生物體中，增進PUFA生成作用。
PUFA合成酶系統可包含數種多功能蛋白(及可包括單一功能蛋白)，其等可一起作用而進行脂肪酸鏈的疊代處理以及非疊代處理，包括在所選擇的循環中之順式-反式異構化作用及烯醯基還原反應。在本申請案中，該等蛋白係稱作核心PUFA合成酶酵素系統或核心PUFA合成酶。關於該等蛋白內所含有的域及基序之一般資訊及詳細資料，例如可見於：第6,140,486號與第6,566,583號美國專利；第2002/0194641號、第2004/0235127號及第2005/0100995號美國專利公開案；第WO 2006/135866號國際專利公開案；及Metz等人(2001年)於期刊“Science”第293期第290-3頁乙文。所發現的功能性PUFA合成酶域可為單一蛋白(如該域與蛋白係同義詞)，或為單一蛋白中的二或多個域之一。
技藝中已知具有PUFA合成酶活性的多肽(及編碼該等多肽的聚核苷酸及基因)之眾多實例，及可組合於本申請案所揭露之包含一種異源性PUFA合成酶的一種經基因改造的宿主中。該等PUFA合成酶蛋白(或域)同時包括細菌性與非細菌性PUFA合成酶。非細菌性PUFA合成酶可為一種真核PFA。特定的細菌性PUFA合成酶例如述於第 2008/0050505號美國專利公開案。本發明所產生之基因改造植物可納入非細菌性PUFA合成酶功能域與細菌性PUFA合成酶功能域，以及來自其他PKS系統(如第I型疊代或模組、第II型及第III型)及/或FAS系統之PUFA合成酶功能域或蛋白。
在一些實施例中，一異源性PUFA合成酶係包含生物活性域，該等生物活性域係選自由下列所組成之群組中之三種、四種或更多種蛋白所典型含有的：至少一個烯醯基-ACP還原酶(ER)域；多重醯基載體蛋白(ACP)域(如至少自1至4個，或至少5個ACP域，及在一些實施例中高達6個、7個、8個、9個、10個或10個以上的ACP域)；至少2個β-酮醯基-ACP合成酶(KS)域；至少一個醯基轉移酶(AT)域；至少一個β-酮醯基-ACP還原酶(KR)域；至少2個FabA類β-羥基醯基-ACP脫水酶(DH)域；至少一個鏈長因子(CLF)域；及至少一個丙二醯基-CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)域。在特定的實施例中，異源性PUFA合成酶亦包含至少一區，其中含有一種脫水酶保留型活性位基序。
在一些實施例中，異源性PUFA合成酶系統係包含來自破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )的一種PUFA合成酶(如PFA1、PFA2及PFA3)。例如，如本申請案的實施例之一種異源性PUFA合成酶系統例如可包括但不限於至少一種蛋白，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14之一致性係至少80%(如至少81%、至 少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%；及至少99%)。在特定的實施例中，一異源性PUFA合成酶系統係包括至少一種蛋白，其包含序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14。在特定的實施例中，一異源性PUFA合成酶系統係包括至少一種蛋白，其具有選自由序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及序列辨識編號：14所組成之群組之一胺基酸序列。
一些實施例係包括一異源性PUFA合成酶系統，其包含序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14之至少一種功能等效物。例如，該系統可包含序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14之一變異體、部分、片段或衍生物，其中該多肽具有PUFA合成酶活性。例如，可在文獻中及在本技術領域可取得的生物信息資料庫中，找出其他PUFA合成酶多肽(及其編碼基因)之序列。例如，可用已知的PUFA合成酶基因或多肽序列，經由BLAST搜尋公開可用的資料庫而找出該等序列。在該種方法中，一致性係以ClustalW排比方法為基礎，使用間隙罰分為10及間隙長度罰分為0.1之預設參數及貢內特(Gonnet)250系列的蛋白權重矩陣。
此外，可使用本申請案所揭露的PUFA合成酶基 因或多肽序列，來辨識自然界中的其他PUFA合成酶同源物。例如，可使用本申請案所揭露之PUFA合成酶核酸的各片段，來單離編碼同源蛋白之基因。使用序列依賴性程序之同源基因單離作用，係技藝中眾所周知。序列依賴性程序之實例例如包括但不限於：核酸雜合方法；DNA與RNA擴增方法，如核酸擴增技術之各項應用所例示(如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)及股置換擴增作用(SDA))；及藉由互補作用建庫與篩選之方法。
在一些實施例中，一異源性PUFA合成酶係包含一種裂殖壺菌的PUFA合成酶域(如ER域、ACP域、KS域、AT域、KR域、DH域、CLF域、MAT域及脫水酶保留型活性位基序)，其中該域係與來自一種不同的PUFA合成酶之一或多個域組合，而形成具有PUFA合成酶活性之完整的PUFA合成酶。
在一些實施例中，包含一異源性PUFA合成酶之一種經基因改造的生物體，可進一步用另一種PUFA合成酶的至少一種域或其生物活性片段進行改質。在特定的實施例中，可針對PUFA合成酶之任一域的天然結構進行改質，以改變或增進該PUFA合成酶系統中之該域的功能(如改變該系統所產生之PUFA的種類或比例)。
磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶
磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)係涉及脂肪酸合成作用、聚酮合成作用及非核糖體肽合成作用之一酵素家族。尤其，需要藉由將來自輔酶A的一種輔因子(4- 磷酸泛醯巰基乙胺)附著至醯基載體蛋白(ACP)，而活化PUFA合成酶酵素中所存在的ACP域。該輔因子的附著作用係藉由PPTase進行。若宿主生物體的內源性PPTase無法活化PUFA合成酶的ACP域，則需要提供可進行該項功能之PPTase。
已證實念珠藻屬(Nostoc )物種的HetI 蛋白係可辨識ACP域作為受質之一個PPTase實例。HetI 係存在於念珠藻的一基因簇中，已知該基因簇係負責該生物體中之特定脂肪酸的合成作用。Black與Wolk於期刊“J.Bacteriol”第176期第2282-92頁(1994年)乙文；Campbell等人(1997年)於期刊“Arch.Microbiol.”第167期第251-8頁乙文。HetI 很有可能活化存在於該簇的一蛋白HglE之ACP域。
在實施例中，PUFA合成酶系統係包括至少一種PPTase或4'-磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶域作為PUFA合成酶的一輔助域或蛋白。技藝中已知具有PPTase活性的多肽之眾多實例，若其等可活化所用之特定PUFA合成酶的ACP域，則可用於本申請案之一種經基因改造的生物體中。可納入該異源性PUFA合成酶系統之多肽實例，例如包括但不限於至少一種蛋白，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：10(NoHetI 蛋白)所編碼的多肽之一致性係至少80%(如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%；及至少99%)。在特定的實施例 中，一異源性PUFA合成酶系統係包括序列辨識編號：10所編碼的多肽。
在一些實施例中包括一異源性PUFA合成酶系統，其包含序列辨識編號：10所編碼的多肽之一種功能等效物。例如，該系統可包含序列辨識編號：10所編碼的多肽之一變異體、部分、片段或衍生物，其中該多肽具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性。例如，可在文獻中及在本技術領域可取得的生物信息資料庫中，找出其他PPTase(及其編碼基因)之序列。例如，可用已知的PPTase基因或多肽序列，經由BLAST搜尋公開可用的資料庫而找出該等序列。在該種方法中，一致性係以ClustalW排比方法為基礎，使用間隙罰分為10及間隙長度罰分為0.1之預設參數及貢內特(Gonnet)250系列的蛋白權重矩陣。可使用本申請案所揭露的PPTase序列，來辨識自然界中的其他PPTase同源物。例如，本申請案之PPTase核酸(如序列辨識編號：10)可用於單離編碼同源蛋白之基因。
根據上文所述，在一些實施例中，一種經基因改造的生物體(如一植物)及/或其子代、細胞、組織或部位係包含一異源性PUFA合成酶(如來自破囊壺菌屬的藻類裂殖壺菌(Schizochytrium algae )的一種PUFA合成酶)及一種異源性PPTase(如一種NoHetI PPTase)。
醯基-CoA合成酶
醯基-CoA合成酶(ACS或任擇地ACoAS)蛋白係催化將長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉化為醯基-CoA之轉化 作用。技藝已知具有ACoAS活性的多肽之眾多實例，及可用於本申請案的實施例中。例如，ATCC登錄號為20888之裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種具有一或多種ACoAS及其等可將其PUFA合成酶的游離脂肪酸產物轉化成為醯基-CoA，包括序列辨識編號：11所編碼的多肽(SzACS2蛋白)。
在一些實施例中，一異源性PUFA合成酶系統例如包括但不限於至少一種蛋白，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：11所編碼的多肽之一致性係至少80%(如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%；及至少99%)。在特定的實施例中，一異源性PUFA合成酶系統係包括序列辨識編號：11所編碼的多肽。
一些實施例係包括一異源性PUFA合成酶系統，其包含序列辨識編號：11所編碼的多肽之一種功能等效物。例如，該系統可包含序列辨識編號：11所編碼的多肽之一變異體、部分、片段或衍生物，其中該多肽具有醯基-CoA合成酶活性。例如，可在文獻中及在本技術領域可取得的生物信息資料庫中，找出其他ACoAS(及其編碼基因)之序列。例如，可用已知的ACoAS基因或多肽序列，經由BLAST搜尋公開可用的資料庫而找出該等序列。在該種方法中，一致性係以ClustalW排比方法為基礎，使用間隙罰分為10 及間隙長度罰分為0.1之預設參數及貢內特(Gonnet)250系列的蛋白權重矩陣。可使用本申請案所揭露的ACoAS序列，來辨識自然界中的其他ACoAS同源物。例如，可使用本申請案中的ACoAS核酸(如序列辨識編號：11)，來單離編碼同源蛋白之基因。
根據上文所述，在一些實施例中，一種經基因改造的生物體(如一植物)及/或其子代、細胞、組織或部位係包含一異源性PUFA合成酶(如來自破囊壺菌中的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種之一種PUFA合成酶)；一種異源性PPTase(如一種NoHetI PPTase)；及一種異源性ACoAS(如來自ATCC登錄號為20888的一種裂殖壺菌之ACoAS)。
功能等效物包括但不限於胺基酸參考序列(即序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7、序列辨識編號：10所編碼的多肽、序列辨識編號：11所編碼的多肽或序列辨識編號：14)內的胺基酸殘基之添加作用或取代作用，但其導致沉默型改變，以使得產生一個功能上等效的基因產物。例如，可基於所涉及的殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或雙性性質方面的相似性，而進行保留性胺基酸取代作用。
可在PUFA合成酶、PPTase及/或ACoAS進行定點突變作用(使用本技術領域的嫻熟技術人員眾所周知的隨機誘變技術)，及可分析所產生的突變型酵素，以確認預期活性。例如，序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7、序列辨識編號：10所編碼的多肽、序列辨識 編號：11所編碼的多肽或序列辨識編號：14可與同源物及其他相關蛋白進行比對，及顯示出其中一致的胺基酸殘基與保留型殘基。可設計在可變位置的保留型變更作用，以產生保有功能的一種多肽；如PUFA合成酶活性、磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶活性及醯基-CoA合成酶活性。
本申請案的實施例例如藉由提供包含一或多種聚核苷酸之一基因轉殖型生物體(如一植物)，及該一或多種聚核苷酸係編碼一異源性PUFA合成酶系統的至少一種組分，而引發一異源性PUFA合成酶系統之表現作用。
在一些實施例中，編碼一異源性PUFA合成酶系統的至少一種組分之一種異源性聚核苷酸，係包含至少一種聚核苷酸，其編碼來自破囊壺菌中的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種之一種PUFA合成酶。例如，在本申請案的實施例中之一種異源性聚核苷酸例如可編碼至少一種蛋白但不限於此，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14之一致性係至少80%(如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及100%)。
在一些實施例中，編碼來自破囊壺菌中的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種之一種PUFA合成酶之一種聚核苷酸，係包含一核苷酸序列，其與序列辨識編號：2、序列 辨識編號：3、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13之一致性係至少70%(如至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及100%)。
在特定的實施例中，編碼來自破囊壺菌中的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種之一種PUFA合成酶之異源性聚核苷酸，係在嚴格條件(如非常嚴格條件)下與序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3、序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13雜合。
在一些實施例中，編碼一異源性PUFA合成酶系統的至少一種組分之一種異源性聚核苷酸，係包含一種聚核苷酸，其編碼來自藍綠藻中的念珠藻屬(Nostoc )之一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )。例如，在本申請案的實施例中之一種異源性聚核苷酸例如可編碼至少一種蛋白但不限於此，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：10所編碼的多肽(即NoHetI )之一致性係至少80%(如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少99%及100%)。
在一些實施例中，編碼來自藍綠藻中的念珠藻屬(Nostoc )之一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )之一種聚核苷酸，係包含一核苷酸序列，其與序列辨識編號：10之一致性係至少70%(如至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及100%)。
在特定的實施例中，編碼一種念珠藻屬(Nostoc )的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(NoHetI )之聚核苷酸，係在嚴格條件(如非常嚴格條件)下與序列辨識編號：10雜合。
在一些實施例中，編碼一異源性PUFA合成酶系統的至少一種組分之一種異源性聚核苷酸，係包含一種聚核苷酸，其編碼來自裂殖壺菌的一種ACoAS。例如，在本申請案的實施例中之一種異源性聚核苷酸例如可編碼至少一種蛋白但不限於此，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：11所編碼的多肽(即SzACS2)之一致性係至少80%(如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及100%)。
在一些實施例中，編碼來自裂殖壺菌屬 (Schizochytrium )(如ATCC登錄號20888)的一種異源性ACoAS之一種聚核苷酸，係包含一核苷酸序列，其與序列辨識編號：11之一致性係至少70%(如至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%及100%)。
在特定的實施例中，編碼該異源性ACoAS之聚核苷酸係在嚴格條件(如非常嚴格條件)下與序列辨識編號：11雜合。
在實施例中，編碼一異源性PUFA合成酶的至少一種組分之一或多種聚核苷酸，可包括編碼來自破囊壺菌中的裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種之一種PUFA合成酶之至少一種聚核苷酸，可具有或不具有編碼來自藍綠藻中的念珠藻屬(Nostoc )之一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(HetI )之一種聚核苷酸及/或編碼來自裂殖壺菌的一種ACoAS之一種異源性聚核苷酸。在一些實施例中，編碼前述組分之該至少一種聚核苷酸係存在於單一核酸分子中。在一些實施例中，該至少一種聚核苷酸係存在於多種核酸分子中。
一些實施例包括載體(如質體)，其中包含編碼一異源性PUFA合成酶的至少一種組分之一或多種聚核苷酸。 在實例中，該等載體包括與該等聚核苷酸操作連鎖的調控序列，從而在標的宿主生物體中引發該等聚核苷酸的表現作用。該等載體的特定實例包括重組型表現載體，諸如pDAB101429(序列辨識編號：15)、pDAB101454(序列辨識編號：16)、pDAB101496(序列辨識編號：17)、pDAB109525(序列辨識編號：18)、pDAB109584(序列辨識編號：19)、pDAB109588(序列辨識編號：20)、pDAB112210(序列辨識編號：21)、pDAB112206(序列辨識編號：22)、pDAB107962(序列辨識編號：23)、pDAB109591(序列辨識編號：24)、pDAB109592(序列辨識編號：25)、pDAB107960(序列辨識編號：26)、pDAB110132(序列辨識編號：27)、pDAB107961(序列辨識編號：28)、pDAB110151(序列辨識編號：29)、pDAB112285(序列辨識編號：30)、pDAB117501(序列辨識編號：31)、pDAB117502(序列辨識編號：32)、pDAB112200(序列辨識編號：33)、pDAB112201(序列辨識編號：34)、pDAB112203(序列辨識編號：35)、pDAB112205(序列辨識編號：36)、pDAB112208(序列辨識編號：37)及pDAB112209(序列辨識編號：38)。
可在特定實施例中使用重組型DNA技藝中的已知技術，以增進對於異源性聚核苷酸表現作用之控制，例如但不限於：藉由操控在宿主細胞內之該等聚核苷酸的套數；藉由操控該等聚核苷酸的轉錄效率；藉由操控所得的轉錄本之轉譯效率；及藉由操控轉譯後改質作用的效率。藉由進一步的實例，可藉由遺傳工程設計啟動子序列，以 提高其在宿主內的表現水平而高於參考啟動子。因而，適用於控制核酸分子的表現作用之技術例如包括但不限於：將核酸分子嵌入一或多種宿主細胞的染色體中；在質體中添加載體穩定性序列；取代或修飾轉錄控制訊息(如啟動子、操縱子及增強子)；取代或修飾轉譯控制訊息(如核糖體結合位與夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列)；將核酸分子改質以對應宿主細胞所用的密碼子；及刪除使轉錄本不穩定之序列。
V.製造經基因改造的生物體之方法
為顯著提高一或多種所欲的多不飽和脂肪酸之產率，可將一宿主生物體(如一植物)基因改造，而在該生物體中導入一異源性PUFA合成酶系統。在一些實施例中採用該方法，以產生包含異源性PUFA合成酶系統之一種基因改造植物。一些實例亦包括增進或提高該基因改造作用的有效性之方法，例如，增進或提高PUFA合成酶系統之終產物的生成作用及/或累積作用；如LC-PUFA，諸如DHA與EPA。本申請案的特定實施例引發一或多種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶及如上述的PPTase之表現作用，而增加一種異源性宿主中之PUFA生成作用及/或累積作用。特定實施例亦導致一種ACS在宿主中表現。
在一種經基因改造的生物體例如包括但不限於一植物中用於基因表現作用之方法，係技藝中所知。在一些實施例中，編碼待表現之一種PUFA合成酶系統的一組分之異源性聚核苷酸的編碼區，係針對標的宿主細胞進行密 碼子最佳化。在重組型宿主細胞例如包括但不限於植物細胞中之基因表現作用，可能需要與所關注的一編碼區操作連鎖之一啟動子，及/或一種轉錄終止子。在一些實施例中，編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一種異源性聚核苷酸係與一種具種子特異性的啟動子(如PvDlec2、LfKCS3、FAE1、BoACP及BnaNapinC)操作連鎖。在一些實施例中，編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之異源性聚核苷酸係與一種具葉片特異性的啟動子(如泛素與CsVMV)操作連鎖。可用於特定實施例中之其他非限制性的啟動子實例，係包括醯基載體蛋白啟動子(第WO 1992/18634號國際專利公開案)與四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素啟動子(及截短形式)。如見Slightom等人(1983年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.”第80期第1897-1901頁乙文；Sengupta-Gopalan等人(1985年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.”第82期第3320-4頁乙文；van der Geest等人(1997年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第33期第553-7頁乙文；及Bustos等人(1991年)於期刊“EMBO J.”第10期第1469-79頁乙文。
一些實施例係包括一種重組型載體(如一種質體)，其中包含編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一或多種異源性聚核苷酸。重組型載體係一種經工程設計(如以人工方式產生)的核酸分子，其係作為操控所選擇的一核酸序列及/或用於將該核酸序列導入一宿主細胞之工具。因此，該重組型載體係適用於選殖、定序及/或在其他情況下操控其中的一聚核苷酸，諸如藉由表現及/或將該聚核苷酸傳送 至一宿主細胞中而形成一重組型細胞。一載體可含有在天然情況下並非與待選殖或待傳送的聚核苷酸相鄰之核苷酸序列。一載體亦可含有調控型核酸序列(如啟動子、非轉譯區)，其在天然情況下係與該聚核苷酸相鄰，或者有益於該聚核苷酸的表現作用之。所嵌入的聚核苷酸可在染色體啟動子之控制下，在原生啟動子或質體啟動子之控制下，或在數種啟動子的組合之控制下。一載體可為RNA型或DNA型，及可為原核生物型或真核生物型。一載體可保持為一種染色體外的元件(如一種質體)，或可嵌入一重組型生物體(如一種微生物與植物細胞)的一染色體中。整個載體可留置在宿主細胞內的位置；或在特定條件下，可將無關的DNA(如不必要的質體序列)刪除，留下編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一或多種異源性聚核苷酸。可將單套或多套的異源性聚核苷酸嵌入該宿主基因體中。本發明的一重組型載體可含有至少一種篩選標記。
在一些實施例中，包含編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一或多種異源性聚核苷酸之重組型載體，係一種表現載體，例如一植物型表現載體。在該等實施例中，可將編碼所待生產的產物之至少一種聚核苷酸(如一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶、NoHetI 及SzACS2)插入該重組型載體中，其方式係使得聚核苷酸與載體中的調控序列操作連鎖，而使得該核酸序列可以在該重組型宿主細胞轉錄與轉譯。技藝中已知適用於將多種宿主生物體與細胞轉形之載體。一載體通常含有一篩選標記， 及含有促成在所欲宿主中自律性複製或嵌入染色體之序列。
用於將宿主細胞轉形之適宜方法，係包括可藉而將DNA導入一細胞中之任何方法，諸如藉由原生質體的轉形作用(如見第5,508,184號美國專利)；藉由乾化作用/抑制作用媒介型DNA攝入作用(如見Potrykus等人(1985年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第199期第183-8頁乙文)；藉由電穿孔法(如見第5,384,253號美國專利)；藉由與碳化矽纖維的攪拌作用(如見第5,302,523號與第5,464,765號美國專利)；藉由農桿菌介導型轉形作用(如見第5,563,055號、第5,591,616號、第5,693,512號、第5,824,877號、第5,981,840號及第6,384,301號美國專利)；及藉由塗覆有DNA的顆粒之加速作用(如見第5,015,580號、第5,550,318號、第5,538,880號、第6,160,208號、第6,399,861號及第6,403,865號美國專利)。經由應用該等技術，可將包括單子葉與雙子葉植物在內之實質上任何物種的細胞穩定轉形。在一些實施例中，係將轉形DNA嵌入宿主細胞的基因體中。在多細胞物種的情況下，可將基因轉殖型細胞再生成為一種基因轉殖型生物體。可使用該等技術中之任一者來產生一種基因轉殖型單子葉或雙子葉植物，例如，在該基因轉殖型植物的基因體中包含編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一或多種異源性聚核苷酸。
用於將一表現載體導入植物中之最廣泛使用的方法，係以農桿菌屬(Agrobacterium )的天然轉形系統為基 礎。根癌農桿菌(A.tumefaciens )與發根農桿菌(A.rhizogenes )係植物致病性土壤細菌，其可在基因上將植物細胞轉形。分屬根癌農桿菌(A.tumefaciens )與發根農桿菌(A.rhizogenes )的Ti與Ri質體，係攜帶有負責植物基因轉形作用之基因。Ti(腫瘤誘發型)質體含有稱作T-DNA的一個大型節段，其係轉移至經轉形的植物中。Ti質體的另一節段，即vir區，係負責T-DNA的轉移作用。T-DNA區係以末端重複序列為邊界。在經改質的二元載體中，已刪除該腫瘤誘發型基因，及運用vir區的功能來轉移以T-DNA邊界序列為界的外來DNA。T區亦可含有一種篩選標記，以供有效率地回收基因轉殖型植物與細胞，及供用於轉移諸如一種dsRNA編碼核酸的插入序列所用之一種多選殖位點。
因而，在一些實施例中，植物轉形載體係衍生自根癌農桿菌(A.tumefaciens )的Ti質體(如見第4,536,475號、第4,693,977號、第4,886,937號及第5,501,967號美國專利；及歐洲專利EP 0 122 791)或發根農桿菌(A.rhizogenes )的Ri質體。其他的植物轉形載體例如包括但不限於Herrera-Estrella等人(1983年)於期刊“Nature”第303期第209-13頁乙文、Bevan等人(1983年)於期刊“Nature”第304期第184-7頁乙文、Klee等人(1985年)於期刊“Bio/Technol.”第3期第637-42頁乙文及於歐洲專利EP 0 120 516中所述者，及自前述任一者所衍生者。可將在自然界中可與植物交互作用之諸如中華根瘤菌屬(Sinorhizobium )、根瘤菌屬(Rhizobium )及中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium )的其他細菌 改質，而介導基因轉移至多種不同的植物中。可藉由同時獲得去毒型Ti質體與一種適宜的二元載體，使得該等植物相關性共生細菌勝任基因轉移作用。
將外源性DNA提供予受體細胞之後，一般將經轉形的細胞辨識出來，以供進一步培養及再生成為植株。為提高辨識經轉形的細胞之能力，尚可使用如先前所闡述之一種可挑選或可篩選的標記基因，與用於產生轉形體的轉形載體併用。在使用一種可選擇標記之情況下，藉由使細胞暴露於一或多種選擇劑，而在可能的經轉形細胞族群當中辨識出經轉形的細胞。在使用一種可篩選標記之情況下，可就所欲的標記基因表徵，進行細胞之篩選。
可在支持植株再生作用的培養基中，培養在暴露於選擇劑之後仍存活的細胞，或培養在篩選中被評定為陽性的細胞。在一些實施例中，可藉由納入其他物質，諸如生長調節劑，而將任何適宜的植物組織培養基(如MS與N6培養基)改質。可將組織持續置於具有生長調節劑的基礎培養基中，直到有充分的組織可供進行植株再生作用為止；或進行反複多輪的人工篩選，直到該組織的形態適合再生作用為止(例如至少2個星期)，然後移植至有利於芽形成的培養基中。將培養物定期移植，直到有充分的芽形成為止。一旦形成芽，將其等移植至有利於生根的培養基中。待根部充分形成，可將植物移植至土壤中，讓其進一步生長與成熟。
可進行多種分析法，以確認在再生植株中存有所 關注的核酸分子(例如編碼一種PUFA合成酶系統的一組分之一種異源性聚核苷酸)。該等分析法例如包括：分子生物學分析法，諸如南方與北方印漬術、PCR及核酸定序；生物化學分析法，諸如藉由免疫學方式(ELISA及/或西方印漬術)或藉由酵素功能檢測一蛋白產物之存在與否；植物部位分析法，諸如葉片或根部分析；及分析整株再生植株的表現型。
例如可藉由PCR擴增作用分析嵌入品項，該PCR擴增作用係使用例如對於所關注的一核酸分子具有特異性之寡核苷酸引子。應理解PCR基因型分析包括但不限於自單離的宿主植物癒合組織所衍生之基因體DNA的聚合酶鏈反應(PCR)擴增作用，所預期的該癒合組織含有嵌入基因體中之所關注的一核酸分子，接著進行PCR擴增產物的標準選殖作用與序列分析。PCR基因型分析之方法已有充分論述(例如Rios，G.等人(2002年)於期刊“Plant J.”第32期第243-53頁乙文)，及可應用於自任一植物物種(如玉米(Z.mays )或大豆(G.max ))或組織類型及包括細胞培養在內所衍生之基因體DNA。
使用農桿菌依賴型轉形方法所形成的基因轉殖型植物，通常含有插入一染色體中之單一重組型DNA序列。該單一重組型DNA序列係稱作一種“基因轉殖型品項”或“嵌入品項”。對於所插入的外源性序列而言，該等基因轉殖型植物係異型接合。在一些實施例中，可獲得對於一轉殖基因而言為同型接合之一種基因轉殖型植物，其係藉由 與本身含有單一外源性基因序列之一種獨立的單離體基因轉殖型植物例如一種T0 植物進行性配種(自花授粉)，以產生T1 種子。對於該轉殖基因而言，所產生的T1 種子中之四分之一為同型接合。讓T1 種子萌芽成為植物，該植物可供進行異型接合性測試，通常使用得以區別異型合子與同型合子(即一種合子型式分析)之SNP分析或熱擴增分析進行測試。
除了用一種重組型核酸分子進行一植物的直接轉形作用之外，可藉由將具有至少一種基因轉殖型品項的第一種植物與缺乏該一品項的第二種植物雜交，而製備基因轉殖型植物。例如，可將包含一或多種異源性聚核苷酸的一種重組型核酸分子導入適合轉形之第一種植物系中，而產生一種基因轉殖型植物，其中該一或多種異源性聚核苷酸係編碼PUFA合成酶系統的一組分；該基因轉殖型植物可與第二種植物系雜交，而將聚核苷酸漸滲雜合至第二種植物系中。
一些實施例係包括將異源性PUFA合成酶系統多肽的表現作用靶向宿主的一或多種胞器。例如，在一些實施例中，該異源性PUFA合成酶系統的表現作用係靶向一植物的色素體。在該異源性宿主係一植物或植物細胞及其中需要朝向色素體的靶向作用之實施例中，可使用技藝中已知的多種色素體靶向序列。在一些實施例中，該異源性PUFA合成酶系統的表現作用係靶向細胞質液。在一些實施例中，醯基-CoA合成酶(ACoAS)係在細胞質液中表現，而 將LC-PUFA游離脂肪酸轉化為醯基-CoA，醯基-CoA進而可被醯基轉移酶使用。在一些實施例中，該異源性PUFA合成酶系統的表現作用係同時靶向一植物的色素體與細胞質液。
特定實施例包括使用至少一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶與一種NoHetI PPTase之胞器靶向作用(如靶向植物中的色素體或葉綠體)。基因產物靶向色素體或葉綠體之靶向作用係由存在於各種蛋白的胺基末端之一種訊息序列所控制，該訊息序列係在導入產生成熟蛋白期間被剪切。如見Comai等人(1988年)於期刊“J.Biol.Chem.”第263期第15104-9頁乙文。該等訊息序列可與異源性基因產物融合，以達成將異源性產物導入葉綠體中之作用。van den Broeck等人(1985年)於期刊“Nature”第313期第358-63頁乙文。可將編碼適當訊息序列之DNA單離出來，例如從編碼核酮糖雙磷酸羧化酶蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶酵素、GS2蛋白及已知位於葉綠體的其他眾多蛋白之cDNA中單離出來。
在特定實施例中所用之將基因定位於葉綠體或色素體之任擇方式，係包括葉綠體或色素體轉形作用。可產生重組型植物，其中僅改變葉綠體DNA，使其納入異源性PUFA合成酶系統多肽。技藝中已知該等在葉綠體中運作之啟動子。Hanley-Bowden等人(1987年)於期刊“Trends in Biochem.Sci.”第12期第67-70頁乙文。用於獲得含有葉綠體及在葉綠體中插入具有異源性DNA的細胞之方法與組成物， 係述於例如第5,693,507號與第5,451,513號美國專利中。
可使用標準基因技術與篩選作用，進行前述對於一重組型宿主之基因操作，及可在適合基因操作的任一宿主細胞上進行。在一些實施例中，該重組型宿主係包括雙子葉植物與單子葉植物在內之高等植物，及為實用性植物，包括作物植物與使用其油料之植物。因而，如下文進一步所述，可選擇任一植物物種或植物細胞。
VI.基因轉殖型植物
表現一異源性PUFA合成酶系統之任一植物或植物細胞，例如表現包含一種PUFA合成酶與其至少一種輔助蛋白之一種功能性異源蛋白系統者，係涵蓋於本申請案的特定實施例中。特定實施例係包括含有編碼一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶之一種異源性聚核苷酸及編碼NoHetI PPTase之一種聚核苷酸之一植物細胞，該植物細胞亦可包含編碼一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的ACoAS之一種聚核苷酸。在一些實施例中，該基因轉殖型植物業已進一步經基因改造來表現另一種多肽(如ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGAT及乙醯基CoA羧化酶(ACCase))，以增進宿主之PUFA或PUFA合成酶的其他生物活性產物之生成作用及/或累積作用。
在一些實施例中，一基因改造植物(及/或其植物細胞)係例如下列各者，但不限於選自由下列所組成之群組：高等植物；雙子葉植物；單子葉植物；實用性植物(如作物植物與使用其油料之植物))；大豆；油菜籽；亞麻仁；玉米； 紅花；向日葵；菸草；一種豆科(Fabaceae )植物(豆科(Leguminosae)、莢果科、豆(pea)科、豆(bean)科或豆(pulse)科)；一種大豆屬(Glycine )植物(如G.albicans 、G.aphyonota 、G.arenari 、G.argyrea 、野生大豆(G.canescens )、G.clandestine 、G.curvata 、野生大豆(G.cyrtoloba )、鐮形大豆(G.falcate )、G.gracei 、G.hirticaulis 、G.hirticaulis 亞種leptosa、乳綠大豆(G.lactovirens )、闊葉大豆(G.latifolia )、G.latrobeana 、小葉大豆(G.microphylla )、蒙提-道格拉斯氏大豆(G.montis-douglas )、G.peratosa 、澎湖大豆(G.pescadrensis )、G.pindanica 、G.pullenii 、G.rubiginosa 、G.stenophita 、G.syndetika 、煙豆(G.tabacina )、闊葉大豆(G.tomentella )、野生大豆(G.soja )及大豆(G.max )(黃豆))；花生；四季豆(Phaseolus vulgaris )、蠶豆(Vicia fabas )；及豌豆(Pisum sativum )。
在一些實施例中，一基因改造植物係已知產生作為藥劑、調味劑、營養製劑、功能性食品配料或美容活性劑的化合物之一植物，或為藉由遺傳工程設計而產生該等化合物/劑之一植物。
在一些實施例中，該基因改造植物係一種油籽植物，其中該油籽及/或自其所出的油，含有藉由異源性PUFA合成酶系統所產生的LC-PUFA。在特定的實施例中，該等油含有PUFA合成酶的產物(如DHA與EPA)中之可檢測量的至少一種標的或主要的LC-PUFA。在一些實施例中，該等油可實質上不含並非標的或主要PUFA產物及並非野生型 植物中的內源性FAS系統天然所產生之中間產物或副產物(如野生型植物經由FAS系統產生一些較短鏈或中等鏈長的PUFA，諸如18個碳的PUFA，但是由於經異源性PUFA合成酶進行基因改造作用之故，會在植物中產生新的或附加的脂肪酸)。
在一些實施例中，本申請案所述之表現一異源性PUFA合成酶系統之一種基因轉殖型植物或種子，在其基因體中亦可包含至少一種其他基因轉殖型品項，包括但不限於：編碼一殺蟲性蛋白之一基因(如一種蘇力菌(Bacillus thuringiensis )殺蟲性蛋白)；一種除草劑耐受性基因(如提供對於嘉磷塞(glyphosate)的耐受性之一基因)；及有助於該基因轉殖型植物中之所期望的表現型之一基因，諸如增加產率、改變脂肪酸代謝作用或修復細胞質雄性不孕。在特定的實施例中，藉由重組型DNA技術或藉由與已包含附加轉殖基因的一植物之常規育種技術，使得編碼至少一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶之聚核苷酸與該等附加的轉殖基因組合。
在一些實施例中，亦包括表現如本申請案所述之一異源性PUFA合成酶系統之一植物的部位。該等植物部位係包括一植物的任何部位，例如包括但不限於種子(包括成熟種子與未成熟種子)、組織、花粉、胚、花、果、枝、葉、根、莖及外植體。特定實施例係包括表現如本申請案所述之一異源性PUFA合成酶系統之一植物的子代。
VII.商品產物
本申請案的實施例係包括由本申請案所述之植物、子代、植物部位或細胞所產生之產物，或來自該等植物、子代、植物部位或細胞之產物，例如包括但不限於自其所產出的油。因而，一些實施例係包括商品產物，其含有本申請案所述之異源性PUFA合成酶系統的一或多種多肽及/或聚核苷酸，該等商品產物係由表現異源性PUFA合成酶系統之一重組型植物或種子所產生。含有本申請案所述之異源性PUFA合成酶系統的一或多種多肽及/或聚核苷酸之一種商品產物，係例如包括但不限於：含有一或多種多肽及/或聚核苷酸之一重組型植物或種子之粕；油；壓碎或全粒的穀物或種子；及包含粕、油或壓碎或全粒的穀粒之任何食品。在本申請案所涵蓋的一或多種植物商品或植物商品產物中檢測出如本申請案所述之異源性PUFA合成酶系統的多肽及/或聚核苷酸，這是表明該商品或商品產物係由表現該異源性PUFA合成酶系統之一基因轉殖型植物所組成之事實證據。例如，在一油中檢測出沾染有本申請案所述之異源性PUFA合成酶系統的多肽及/或聚核苷酸，這是表明該油係由表現該異源性PUFA合成酶系統之一基因轉殖型植物所產生之事實證據。
本申請案的實施例藉由使用一異源性PUFA合成酶系統而建立基因改造植物，其中該異源性PUFA合成酶系統所產生的PUFA係該植物物種在其他情況下不產生的，以使得生成富含一或多種所欲(標的或主要)的PUFA之具商業價值的脂質。在一些實施例中，本發明之一種經基因改造 的生物體產生一或多種多不飽和脂肪酸，其包括但不限於EPA(C20：5，n-3)、DHA(C22：6，n-3)、DPA(C22：5，n-6或n-3)及其任何組合。本申請案中的一些實施例特別包括從本申請案所述之包含該等PUFA的基因改造植物所得之油籽與油。
尚未得知植物具有內生性PUFA合酶，因此，本申請案的實施例提供一個機會，來產生具有獨特的脂肪酸生成能力之植物。一些實施例提供創造多種“特製油”中的任一者之能力，該特製油包含來自植物之不同比例與形式之脂肪酸的新穎組合。在一些實施例中，使用本申請案所述之一異源性PUFA合成酶系統可擴大PUFA生成作用之範圍，及在大部分作物植物所生長的溫度範圍內，成功地產生該等PUFA。
在一些實施例中，一植物商品產物係“實質上不含”該PUFA合成系統的中間產物或副產物。當用於本申請案的上下文時，“實質上不含”一詞係指因導入異源性PUFA系統或存在異源性PUFA系統之故(如並非藉由野生型植物或作為所示基因改造作用的受體之親代植物所產生者)，在基因改造植物(及/或植物部位及/或籽油部分)中所產生的任何中間產物或副產物脂肪酸(非標的PUFA)之存在量係例如但不限於：低於總脂肪酸重量的10%；低於總脂肪酸重量的9%；低於總脂肪酸重量的8%；低於總脂肪酸重量的7%；低於總脂肪酸重量的6%；低於總脂肪酸重量的5%；低於總脂肪酸重量的4%；低於總脂肪酸重量的3%；低於總脂肪酸 重量的2%；低於總脂肪酸重量的1%；及低於總脂肪酸重量的0.5%。
在一些實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，係包含可檢測量的DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，n-3))、DPA(n-6)(二十二碳五烯酸(C22：5，n-6))及/或EPA(二十碳五烯酸(C20：5，n-3))。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，係例如包含但不限於：佔總脂肪酸重量的至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%、至少10%、至少10.5%、至少11%、至少11.5%、至少12%、至少12.5%、至少13%、至少13.5%、至少14%、至少14.5%或至少15%之DHA。可在該等數值之間選擇適用的範圍，例如佔總脂肪酸重量的0.01%至15%、0.05%至10%及1%至5%之DHA。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶 系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，係例如包含但不限於：佔總脂肪酸重量的至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%，及/或至少10%之EPA。可在該等數值之間選擇適用的範圍，例如佔總脂肪酸重量的0.01%至10%、0.05%至5%及0.1%至5%之EPA。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，係例如包含但不限於：佔總脂肪酸重量的至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%，及/或至 少10%之DPA(n-6)。可在該等數值之間選擇適用的範圍，例如佔總脂肪酸重量的0.01%至10%、0.01%至5%、0.01%至1%、0.01%至0.05%、0.05%至5%及0.1%至5%之DPA(n-6)。
PUFA的百分比量係所萃取出的總脂肪酸重量的百分比，除非另有說明。在一些實施例中，藉由氣相層析(GC)分析一種脂肪酸甲基酯(FAME)製備物，而測定總脂肪酸；然而，總脂肪酸的測定方法並不限定於該方法。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，其所包含之EPA：DHA的比例係例如但不限於：至少10：1、至少9.5：1、至少9：1、至少8.5：1、至少8：1、至少7.5：1、至少7：1、至少6.5：1、至少6：1、至少5.5：1、至少5：1、至少4.5：1、至少4：1、至少3.5：1、至少3：1、至少2.5：1、至少2：1、至少1.5：1、至少1：1、至少1：1.5、至少1：2、至少1：2.5、至少1：3、至少1：3.5、至少1：4、至少1：4.5、至少1：5、至少1：5.5、至少1：6、至少1：6.5、至少1：7、至少1：7.5、至少1：8、至少1：8.5、至少1：9、至少1：10、至少1：11、至少1：12、至少1：13、至少1：14、至少1：15、至少1：16、至少1：17、至少1：18、至少1：19、至少1：20、至少1：21、至少1：22、至少1：23、至少1：24、至少1：25、至少1：26、至少1：27、至少1：28、至少1：29或至少1：30，就總脂肪酸的重量而言。可在該等數值之間選擇適用的範圍，例如EPA：DHA的比例為10：1、5：1至1：1、2：1至1：1、1至1：30、1：1至1：25、1：1至1：20、1：1至1：15、 1：1至1：10、1：1至1：5、1：1至1：3及1：1至1：2，就總脂肪酸的重量而言。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，其所包含之DPA(n-6)：DHA的比例係例如但不限於：至少1：1、至少1：1.5、至少1：2、至少1：2.5、至少1：3、至少1：3.5、至少1：4、至少1：4.5、至少1：5、至少1：5.5、至少1：6、至少1：6.5、至少1：7、至少1：7.5、至少1：8、至少1：8.5、至少1：9或至少1：10，就總脂肪酸的重量而言。可在該等數值之間選擇適用的範圍，例如DPA(n-6)：DHA的比例1：1至1：10、1：1至1：5、1：1至1：3及1：1至1：2，就總脂肪酸的重量而言。
在特定的實施例中，表現一異源性PUFA合成酶系統之一基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位，或自該基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位所得的一油或種子，其所包含的三酸甘油酯係佔該油重量例如但不限於至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些實施例中，自本發明的一種基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位或種子所得的一油，其所包含的三酸甘油酯係佔該油重量的70%至99%；其所包含的三酸甘油酯係佔該油重量的75%至99%；其所包含的三酸甘油酯係佔該油重量的80%至99%；其所包含的三酸甘油酯係佔該油重量的85%至99%；或者其所包含的三酸甘 油酯係佔該油重量的90%至99%。該等三酸甘油酯可納入該異源性PUFA合成酶系統所產生的LC-PUFA。
在特定的實施例中，當一異源性PUFA合成酶系統之標的產物係一種LC-PUFA時，諸如DHA、DPA(n-6或n-3)或EPA，在表現該系統之基因改造植物的總脂質中所存在的中間產物與副產物之量並不顯著，該等中間產物與副產物例如包括但不限於：γ-次亞麻油酸(GLA；18：3，n-6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4，n-3)；二同-γ-次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3，n-6)、花生油酸(ARA，C20：4，n-6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3，n-9)，及其他各種中間產物或副產物，諸如20：0、20：1(Δ5)、20：1(Δ11)、20：2(Δ8,11)、20：2(Δ11,14)、20：3(Δ5,11,14)、20：3(Δ11,14,17)、二十碳三烯酸(20：3；Δ5,8,11)或20：4(Δ5,1,14,17)。
在一些實施例中，經由自該植物、其子代、細胞、組織或部位萃取化合物之純化方法，而自表現一異源性PUFA合成酶系統的一種基因改造植物提取藉由該系統所產生的PUFA。在一些實施例中，藉由採收該植物、其子代、細胞、組織或部位而提取PUFA。在一些實施例中，藉由自該植物、其子代、細胞、組織或部位(如自油籽)採收該油，而提取PUFA。在一些實施例中，該植物、其子代、細胞、組織或部位係按其天然狀態使用，或經進一步加工成為可供使用的產物。
在本申請案中的一些實施例中，來自表現一異源性PUFA合成酶系統的一種基因改造植物之油可用於非烹 調或非膳食的製程與組成物中。其中一些用途為工業、美容或醫療用途(例如可在用於防止感染並提高所移植的移植物存活率之保護性屏障中使用該油(第6,210,700號美國專利))。來自表現一異源性PUFA合成酶系統的一種基因改造植物之油，亦可應用於本發明的油所適用之任何用途中。一般而言，可使用該油來替代諸如潤滑劑、潤滑添加劑、金屬加工液、液壓液及防火性液壓液的多種應用中之例如礦物油、酯類、脂肪酸或動物脂肪。該油亦可作為生產改質油之製程的材料。油品改質技術之實例包括分餾、氫化、改變該油之油酸或次亞麻油酸的含量，及本技術領域的嫻熟技術人員所知的其他改質技術。
來自表現一異源性PUFA合成酶系統的一種基因改造植物之油的美容用途之實例，係包括作為美容組成物中的潤滑劑；作為石油膠的替代品；作為肥皂的組成部分、作為肥皂生產製程的材料；作為口服治療液的組成部分；作為抗老化組成物的組成部分；及作為皮膚用或頭髮用氣溶膠泡沫製劑的組成部分之用途。
提供下列實例以說明一些具體特性及/或實施例。不應將該等實例解釋為本揭露內容係侷限於所例示的具體特性或實施例。
實例 例1：材料與方法
後續實例中所述的分子生物學與生物化學操作係藉由下列文獻所揭露的標準方法進行，除非另有說明， 例如約翰威利父子(John Wiley & Sons)出版公司於1995年出版及由Ausubel等人所著之“當前之分子生物學操作程序(Current Protocols in Molecular Biology)”乙書；冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版公司於1989年出版及由Sambrook等人所著之“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)”乙書等。
植物最佳化聚核苷酸
設計及合成具有油菜密碼子偏移之多種DNA序列，以在基因轉殖型植物中產生PUFA合成酶之酵素。自寄存在基因資料庫(GenBank)之序列(可在網際網路上取得及網址為ncbi.nlm.nih.gov)所得的蛋白編碼序列，計算油菜(Brassica napus L.)的密碼子使用表。將其使用係佔該胺基酸的總密碼子使用之約10%以下的任何同義密碼子略去之後，計算一重新調整的油菜密碼子組。使用下列公式，計算各密碼子之重新調整的呈現方式：C1的重新調整%=1/(%C1+%C2+%C3...)x %C1 x 100，其中C1係所探討的密碼子，及%C1、%C2及%C3...代表剩餘的同義密碼子之使用數值的原始%。
為衍生用於編碼序列辨識編號：1的胺基酸PFA1蛋白、序列辨識編號：4的PFA2蛋白及序列辨識編號：7的PFA3蛋白之一種油菜密碼子最佳化DNA序列，對於依實驗方式決定之(原生)PFA1 DNA序列(序列辨識編號：2)、PFA2 DNA序列(序列辨識編號：5)及PFA3 DNA序列(序列辨識編 號：8)進行密碼子取代作用，使得所產生的DNA序列具有油菜最佳化密碼子偏移表之整體密碼子組成。
進一步改善該等序列，以除去不良的限制酶辨識位置、潛在的植物內含子剪接位置、長串的A/T或C/G殘基及可能干擾植物細胞中的編碼區之mRNA安定性、轉錄作用或轉譯作用之其他基序。所進行的其他改變係導入所欲的限制酶辨識位置及除去長的內部開放讀框(+1以外的框)。該等改變皆在保有油菜偏移的重新調整型密碼子組成的限制之內進行。合成含有所產生的核苷酸油菜密碼子最佳化DNA序列之聚核苷酸。表1。
脂質萃取作用與分析
經由一種FAME分析方法分析所單離的種子，以找出包含LC-PUFA之基因轉殖型植物品項(自大豆、油菜及芥菜屬(Arabidopsis )獲得)，其係相較於在相同條件生長的對照組植物而言。量化LC-PUFA含量(FAME重量%)，及與一負對照組植物比較。FAME分析係在單粒種子上完成，或在來自各個別基因轉殖型品項的成批種子上進行，及使用如下文所述的操作程序進行分析。
芥菜屬(Arabidopsis )與油菜種子分析。使用鋼球磨機，在含有十七碳酸甘油三酯(美國明尼蘇達州伊利森(Elysian)之Nu-ChekTM Prep公司)的庚烷中，將基因轉殖型種子試樣(單粒油菜種子試樣或成批的芥菜屬(Arabidopsis )種子試樣)均質化，作為三醯甘油脂的內標準。在均質化之前，添加剛配製之甲氧化鈉(美國密蘇里州聖路易市的西克瑪-艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)於甲醇中的0.25M溶液。萃取作用與衍生作用係在40℃及持續振盪下進行。重複進行FAME萃取作用三次，及在分析之前將庚烷層匯集。成批的芥菜屬(Arabidopsis )與油菜種子分析，係分別由芥菜屬(Arabidopsis )的10毫克等分試樣或8至12顆的油菜種子所組成。為了驅使該衍生化反應完成，來自成批油菜種子與大豆單粒種子的油係首先用庚烷萃取三次。然後，合併的油萃取物之一等分試樣係在FAME中進行衍生化。藉由在第四次萃取作用/衍生化作用中檢查是否存在內源性FAME，而驗證該反應之完成。藉由使用安捷倫(Agilent)6890型氣相層析儀(美國加州聖克拉拉(Santa Clara)的安捷倫科技(Agilent Technologies)公司)與來自SGE公司(美國德州奧斯汀(Austin))的毛細管柱BPX 70TM (15公尺x0.25毫米x0.25微米)之GC-FID，分析所產生的FAME萃取物。藉由滯留時間確認各FAME，及藉由注射來自麥崔亞(Matreya)有限責任公司(美國賓州愉悅隘口(Pleasant Gap))的菜籽油參考混合物作為一校正標準及添加適當的長鏈脂肪酸(美國明尼蘇達州伊利森(Elysian)之Nu-Chek Prep公司)而進行定量。在芥 菜屬(Arabidopsis )、大豆及油菜中之DHA與其他LC-PUFA生成作用的結果，係如下文所述。
例2：PUFA合成酶基因在植物中的表現作用
構築含有植物轉錄單元(PTU)之二元載體，該植物轉錄單元係包含與一啟動子及3’-UTR操作連鎖之原生及密碼子最佳化的PUFA合成酶系統轉殖基因(PFA1 、PFA2 及PFA3 )。所產生的二元載體亦含有一PTU，其包含與一啟動子及3’ UTR操作連鎖之轉殖基因。僅有一種二元載體包括與一啟動子及3’ UTR操作連鎖之SzACS2轉殖基因(pDAB101429)。在二元載體中納入不同的啟動子與3’-UTR序列之組合，以驅動PUFA合成酶系統與HetI 轉殖基因的表現作用。在PTU的設計中採納使用該等不同的調控基因元件，以改變及變換轉殖基因的表現水平。同樣地，PTU係以不同的定向位於二元載體中，以試驗PTU的定向是否改變或變換轉殖基因的表現水平。
試驗PTU的三種不同定向。包含按第一定向配置的PTU之二元載體係位於一種頭對尾的構形。
使用3’ UTR的雙向性，構築包含按第二定向配置的PTU之二元載體。PFA1 與HetI PTU共享一個單一3’ UTR，及其等的定向係按下列構形：啟動子：：所關注的基因：：3’ UTR：：所關注的基因：：啟動子。同樣地，PFA3 與PFA2 PTU共享一個單一3’ UTR，及其等的定向係按下列構形；啟動子：：所關注的基因：：3’ UTR：：所關注的基因：：啟動子。
最後，第三定向係納入一種隨機DNA間隔區序列 (序列辨識編號：12)。該隨機DNA間隔區係置於定向位於該隨機DNA間隔區上游的二個PTU及定向位於該隨機DNA間隔區下游的二個PTU之間。該二組PTU係按一種頭對頭定向構築。因此，該定向如下：←PFA1 PTU：：HetI PTU→：：隨機DNA間隔區：：←PFA3 PTU：：PFA 2 PTU→。
第一定向
pDAB101429 。pDAB101429質體(序列辨識編號：15)含有三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有一種截短型四季豆(Phaseolus vulgaris )植物血球凝集素-L基因啟動子(PvDlec2啟動子v2；基因資料庫(GenBank)登錄序號X06336)；阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana )AT2S3基因5’非轉譯區(2S5’ UTR；基因資料庫(GenBank)登錄序號NM_118850)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的多不飽和脂肪酸合成酶PFA1 v2；及阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana )2S白蛋白基因3’非轉譯區終止子v1(At2S SSP終止子v1；基因資料庫(GenBank)登錄序號M22035)。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的多不飽和脂肪酸合成酶PFA2 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的多不飽和脂肪酸合成酶PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。醯基-CoA合成酶PTU係含有 PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種醯基-CoA合成酶(SzACS-2 v3)及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、念珠藻屬(Nostoc )物種的4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI (NoHetI v3)及At2S SSP終止子v1。該五種PTU係按一種頭對尾的定向置於一植物轉形二元載體(pDAB7333)的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v2、SzACS-2 v3、NoHetI v3。該植物轉形二元載體亦含有草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU：樹薯葉脈嵌紋病毒啟動子(CsVMV啟動子v2；Verdaguer等人於1996年期刊“Plant Molecular Biolog”第31期第1129-1139頁乙文)；草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶(PAT v5；Wohlleben等人於1988年期刊“Gene”第70期第25-37頁乙文)；及根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )ORF1 3’非轉譯區(AtuORF1 3’ UTR v4；Huang等人於1990年期刊“J.Bacteriol.”第172期第1814-1822頁乙文)，除了諸如Overdrive(Toro等人於1988年期刊“PNAS”第85(22)期第8558-8562頁乙文)的其他調控元件及T-股邊界序列(T-DNA邊界A與T-DNA邊界B；Gardner等人於1986年期刊“Science”第231期第725-727頁乙文及第WO 2001/025459 A1號國際專利公開案)之外。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB101454 。pDAB101454質體(序列辨識編號：16)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉 移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。上述四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v2、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB101496 。pDAB101496質體(序列辨識編號：17)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v4、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens )Ti質體pTi15955開放讀框23/24 3’非轉譯區(基因資料庫(GenBank)登錄序號AF242881.1之AtuORF23 3’ UTR v1)。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3(序列辨識編號：13，其編碼序列辨識編號：14的多肽)及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v5、PvPhas5’ UTR、NoHetI v3及AtuORF23 3’ UTR v1。該四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB109525 。pDAB109525質體(序列辨識編號：18)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1及At2S SSP終止子v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvDlec2啟 動子v2、2S5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。該四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v1、PFA2 v1、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。然後將含有該四種PTU之重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測該四種PTU的納入作用。
pDAB109584 。pDAB109584質體(序列辨識編號：19)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有一種西洋油菜(Brassica napus napin )基因啟動子(BnaNapinC啟動子v1；基因資料庫(GenBank)登錄序號M64633.1)；西洋油菜(Brassica napus napin )基因5’非轉譯區(BnaNapinC5’ UTR v1；基因資料庫(GenBank)登錄序號M64633.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2；及西洋油菜(Brassica napus napin )基因5’非轉譯區(BnaNapinC 3’ UTR v1；基因資料庫(GenBank)登錄序號M64633.1)。第二種PUFA合成酶PTU係含有一種截短型四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素啟動子(PvPhas啟動子v4；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素5’非轉譯區(PvPhas5’ UTR；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2；四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素3’非轉譯區(PvPhas 3’ UTR v1； 基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；及四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素3’MAR(PvPhas 3’MARv2；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有一種甘藍(Brassica oleracea )醯基載體蛋白基因啟動子(BoACP啟動子v1；第WO 1992/18634號國際公開案)；甘藍(Brassica oleracea )醯基載體蛋白基因5’非轉譯區(BoACP5’ UTR v2；第WO 1992/18634號國際公開案)；NoHetI v3；及西洋油菜(Brassicanapus )醯基載體蛋白基因3’非轉譯區(BnACP05 3’ UTR v1；基因資料庫(GenBank)登錄序號X64114.1)。該四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB109588 。pDAB109588質體(序列辨識編號：20)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有一種四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素啟動子(PvPhas啟動子v3；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)、PvPhas5’ UTR、裂 殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。第二種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及BnaNapinC 3’ UTR v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1；甘藍(Brassica oleracea )醯基載體蛋白基因5’非轉譯區(BoACP5’ UTR v1；第WO 1992/18634號國際公開案)；NoHetI v3；及AtuORF23 3’ UTR v1。該四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v2、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112210 。pDAB112210質體(序列辨識編號：21)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1及At2S SSP終止子v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、 裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v1及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。該四種PTU係按一種頭對尾的定向置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v1、PFA2 v1、PFA3 v1、NoHetI v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測該四種PTU的納入作用。
pDAB112206 。pDAB112206質體(序列辨識編號：22)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v4、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有一種截短型四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素啟動子(PvPhas啟動子v6；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)、PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。上述四種PTU係按一種頭對尾的定向 置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測該四種PTU的納入作用。
第二定向
pDAB107962 。pDAB107962質體(序列辨識編號：23)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v2與PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個 PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB109591 。pDAB109591質體(序列辨識編號：24)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v3係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v3與PFA2 v2係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如 先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB109592 。pDAB109592質體(序列辨識編號：25)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及BnaNapinC 3’ UTR v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1；甘藍(Brassica oleracea )醯基載體蛋白基因5’非轉譯區(BoACP5’ UTR v2；第WO 1992/18634號國際公開案)；NoHetI v3；BnACP05 3’ UTR v1；及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v6；四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素5’非轉譯區(PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2；PvPhas 3’ UTR v1；PvPhas 3’MARv2；及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v3係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v3與PFA2 v2係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉 形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。然後將含有該四種PTU之重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測該四種PTU的納入作用。
pDAB107960 。pDAB107960質體(序列辨識編號：26)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2、AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v1與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將一個AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v3係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v3與PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將一個AtuORF23 3’ UTR置於植物轉形二元載體pDAB7333 的T-股DNA邊界區內的二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB110132 。pDAB110132質體(序列辨識編號：27)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有一種四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素啟動子(PvPhas啟動子v3；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；四季豆(Phaseolus vulgaris )β-菜豆素5’非轉譯區(PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR；基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2；PvPhas 3’ UTR v1；及PvPhas 3’MARv2。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、NoHetI v3、BnACP05 3’ UTR v1及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、BnaNapinC 3’ UTR v1及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v2 係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v2與PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB107961 。pDAB107961質體(序列辨識編號：28)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v3、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、NoHetI v3、BnACP05 3’ UTR v1及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v3及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、BnaNapinC 3’ UTR v1及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v1與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v3係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v3與PFA2 v1係按一種 尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB110151 。pDAB110151質體(序列辨識編號：29)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及BnaNapinC 3’ UTR v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有the BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1及At2S SSP終止子v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v2與PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界 區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112285 。pDAB112285質體(序列辨識編號：30)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF25/26 3’ UTR v3。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將一個AtuORF25/26 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v2與PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為： PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。然後將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB117501 。pDAB117501質體(序列辨識編號：31)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v6、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2、基因資料庫(GenBank)登錄序號J01263.1及AtuORF25/26 3’ UTRv3。第二種PUFA合成酶PTU係含有一種大豆(Glycine max )的β-伴大豆球蛋α原初次單元基因啟動子與5’非轉譯區(SSPRO2745.1；基因資料庫(GenBank)登錄序號GU723691.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v1；PvPhas 3’ UTR v1；及PvPhas 3’MARv2。第三種PUFA合成酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、BnaNapinC 3’ UTR v1。PFA1 v1與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將一個AtuORF25/26 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v1係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v1 and PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v1、NoHetI v3，PFA3 v1、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB117502 。pDAB117502質體(序列辨識編號：32)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v3、PvPhas啟動子PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v1、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC5’ UTR v1、NoHetI v3、BnaNapinC 3’ UTR v1及AtuORF25/26 3’ UTR v1。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v1及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有一種SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v1、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。PFA1 v1與NoHetI v3係按一種尾對尾的定向配置，及將一個AtuORF25/26 3’ UTR置於二個PTU之間；NoHetI v3與PFA3 v1係按一種頭對頭的定向配置；PFA3 v1 and PFA2 v1係按一種尾對尾的定向配置，及將AtuORF23 3’ UTR置於在植物轉形二元載體pDAB7333的T- 股DNA邊界區內之二個PTU之間。該等基因的順序為：PFA1 v1、NoHetI v3，PFA3 v1、PFA2 v1。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
第三定向
pDAB112200 。pDAB112200質體(序列辨識編號：33)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有PvPhas啟動子v4、PvPhas5’ UTR、NoHetI v3、AtuORF23 3’ UTR v1及一個隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及At2S SSP終止子v1。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvPhas啟動子v5、PvPhas5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及AtuORF23 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含 有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112201 。pDAB112201質體(序列辨識編號：34)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有一種沙漠芥菜(Lesquerella fendleri )的3-酮醯基-CoA合成酶基因啟動子與5’非轉譯區(LfKCS3啟動子v2；基因資料庫(GenBank)登錄序號AF367052.1)；裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2；及3-酮醯基-CoA合成酶基因3’非轉譯區(SSTER2742.1；基因資料庫(GenBank)登錄序號AF367052.1)。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、NoHetI v3、BnACP05 3’ UTR v1及一個隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有LfKCS3啟動子v2、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及SSTER2742.1。第三種PUFA合成酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及BnACP05 3’ UTR v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、 PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112203 。pDAB112203質體(序列辨識編號：35)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有一種大豆(Glycine max )庫尼茨(Kunitz)胰蛋白酶抑制劑第3型基因啟動子與5’非轉譯區(SSPRO2743.1；基因資料庫(GenBank)登錄序號AF233296.1)；NoHetI v3；大豆(Glycine max )庫尼茨(Kunitz)胰蛋白酶抑制劑第3型基因3’非轉譯區(SSTER2744.1；基因資料庫(GenBank)登錄序號AF233296.1)；及一個隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。第三種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2743.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)物種的PFA2 v2及SSTER2744.1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112205 。pDAB112205質體(序列辨識編號：36)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及At2S SSP終止子v1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、NoHetI v3、BnACP05 3’ UTR v1及一個隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2743.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及SSTER2744.1。第三種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。然後將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA 定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112208 。pDAB112208質體(序列辨識編號：37)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2743.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及SSTER2744.1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有SSPRO2745.1、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1、PvPhas 3’MARv2及一個隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2743.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2及SSTER2744.1。第三種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)物種的PFA2 v2及PvPhas 3’MARv2。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
pDAB112209 。pDAB112209質體(序列辨識編號：38)含有三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶 PTU。具體而言，第一種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2743.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA1 v2及SSTER2744.1。磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU係含有BoACP啟動子v1、BoACP5’ UTR v2、NoHetI v3、BnACP05 3’ UTR v1及隨機DNA間隔區。第二種PUFA合成酶PTU係含有SSPRO2745.1、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA3 v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’MARv2。第三種PUFA合成酶PTU係含有PvDlec2啟動子v2、2S5’ UTR、裂殖壺菌屬(Schizochytrium )物種的PFA2 v2及At2S SSP終止子v1。PFA1 v2與NoHetI v3係按一種頭對頭的定向配置；NoHetI v3與PFA3 v2係按一種尾對尾的定向配置，及有一個隨機DNA間隔區置於二個PTU之間；PFA3 v2與PFA2 v2係按一種頭對頭的定向配置於植物轉形二元載體pDAB7333的T-股DNA邊界區內。該等基因的順序為：PFA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333亦含有如先前所述的草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。將重組型質體單離，及用限制酶酶切作用與DNA定序來檢測PTU的納入作用。
根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )轉形作用
將所選擇的二元構築質體轉形至農桿菌屬(Agrobacterium )菌株中，以供進行植物轉形作用。所挑選用於轉形作用之菌株係衍生自根癌農桿菌(A.tumefaciens )菌株EHA 105。用二元構築質體進行下列二種根癌農桿菌(A.tumefaciens )菌株AGL1與DA2552(見第WO2012016222號國 際專利公開案)之轉形作用，及經由限制酶酶切作用與定序作用確認。
使用基本上如Clough與Bent(1998年)於期刊“Plant J.”第16(6)期第735-43頁乙文所述之花序浸染方法，在如上述的植物表現元件之控制下，產生經根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )轉形之芥菜屬(Arabidopsis )T0 品項，該根癌農桿菌承載編碼PUFA合成酶基因與HetI (及在一些情況下為SzACS2 )的二元質體。獲得及篩選出芥菜屬(Arabidopsis )T0 品項，使其等生長至成熟及自花授粉。採收所產生的T1 種子及進行播種。經轉形的T1 植物之篩選，係藉由噴灑草胺膦(phosphinothricin)而篩選含有篩選標記即一種功能性pat 基因之該等植物。取樣來自存活的T1 植物之葉片組織，及藉由對於pat 基因具有特異性之定量PCR反應進行分析，以辨識出含有單套的篩選標記(與相關轉殖基因)之該等植物。讓該等植物生長至成熟，及採收T2 種子及分析LC-PUFA含量(示為可萃取的總FAME%)。
油菜轉形作用。
種子發芽。將野生型油菜種子(品種DH12075；ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1456120/)置於10%高樂氏(Clorox)漂白水10分鐘而進行表面殺菌，及用無菌的蒸餾水清洗三次(在整個過程中，將種子置於鋼製過濾器中)。將種子種植在含有½ MS油菜培養基(1/2X MS、2%的蔗糖、0.8%的瓊脂)的植物培養皿中，讓其發芽；在每個植物培養皿中置入25顆種子，及放入生長狀態設定於25℃及光照16 小時與黑暗週期8小時之珀西瓦爾(Percival)生長箱TM 中，讓種子發芽5天。
預處理。在第5天，以無菌方式切下長度約3毫米的下胚軸節段，將根與芽部分棄置(在切除過程中，藉由將下胚軸節段放置在10毫升的無菌MILLIQ®水中，而避免下胚軸乾燥)。在生長狀態設定於22至23℃及光照16小時與黑暗週期8小時之珀西瓦爾(Percival)生長箱TM 中，將下胚軸節段水平置於癒合組織誘導培養基MSK1D1(1X MS、1毫克/公升細胞裂殖素、1毫克/公升的2,4-D、3%的蔗糖、0.7%的植物瓊脂(PHYTAGAR)®)上的無菌濾紙上，進行3天的預處理。
與農桿菌共同培養。在進行農桿菌處理的前一天，在含有適當抗生素的YEP培養基之燒瓶中進行接種。將下胚軸節段從濾紙轉移至含有10毫升液態M培養基之空白的100x25毫米培養皿，而避免下胚軸節段乾燥。這時使用一刮勺來挖取及運送該節段。用吸量管移除該液態M培養基，及在培養皿(40毫升農桿菌溶液中有500個節段)中添加40毫升的農桿菌懸浮液。處理該等節段30分鐘，及週期性地渦漩該培養皿，使得下胚軸可持續浸沒於農桿菌溶液中。
在處理期間結束時，用吸量管將農桿菌溶液吸取置入廢棄物燒杯中，進行高壓蒸氣滅菌及予以棄置(將農桿菌溶液完全移除，以避免農桿菌過度生長)。用鑷子將經處理的下胚軸移回至含有MSK1D1與濾紙的原平皿(需留意確保該等節段並未乾燥)。將下胚軸節段連同控制節段置回光 強度降低(藉由用鋁箔覆蓋平皿)的珀西瓦爾(Percival)生長箱TM 中，及將經處理的下胚軸與農桿菌共同培養3天。
在篩選培養基上誘導癒合組織。共同培養3天之後，用鑷子將下胚軸節段個別地轉移至癒合組織誘導培養基MSK1D1H1(1X MS、1毫克/公升的細胞裂殖素、1毫克/公升的2,4-D、0.5克/公升的MES、5毫克/公升的硝酸銀、300毫克/公升的TIMENTIN®、200毫克/公升的卡本西林(Carbenicillin)TM 、1毫克/公升的HerbiaceTM 、3%的蔗糖、0.7%的植物瓊脂(PHYTAGAR)®)上。下胚軸節段已固定在培養基上，但並未埋入培養基中。
篩選作用與芽再生作用。在癒合組織誘導培養基上7天之後，將癒合中的下胚軸節段轉移至含有篩選MSB3Z1H1之第1型芽再生培養基(1X MS、3毫克/公升的BAP、1毫克/公升的玉米素、0.5克/公升的MES、5毫克/公升的硝酸銀、300毫克/公升的TIMENTIN®、200毫克/公升的卡本西林(Carbenicillin)TM 、1毫克/公升的HerbiaceTM 、3%的蔗糖、0.7%的植物瓊脂(PHYTAGAR)®)中。14天之後，將具有芽的下胚軸轉移至含有更多的篩選MSB3Z1H3之第2型再生培養基(1X MS、3毫克/公升的BAP、1毫克/公升的玉米素、0.5克/公升的MES、5毫克/公升的硝酸銀、300毫克/公升的TIMENTIN®、200毫克/公升的卡本西林(Carbenicillin)TM 、3毫克/公升的HerbiaceTM 、3%的蔗糖、0.7%的植物瓊脂(PHYTAGAR)®)中。
芽伸長作用。14天之後，將具有芽的節段轉移至 芽伸長培養基MSMESH5(1X MS、300毫克/公升的TIMENTIN®、5毫克/公升的HerbiaceTM 、2%的蔗糖、0.7%的TC AgarTM )。將已經伸長的芽單離出來及轉移至MSMESH5。14天之後，將在第一輪中確實伸長的剩餘芽置於MSMESH5上，及轉移至具有相同組成之新的篩選培養基中。在這階段，將所有剩餘的下胚軸節段棄置。將在MSB3Z1H3培養基上2個星期後伸長的芽單離出來，及轉移至MSMESH5培養基。將在第一輪中在MSMESH5上確實伸長的剩餘芽單離出來，及轉移至具有相同組成之新的篩選培養基中。在這階段，將所有剩餘的下胚軸節段棄置。
誘導生根。14天之後，將芽轉移至MSMEST培養基(1X MS、0.5克/公升的MES、300毫克/公升的TIMENTIN®、2%的蔗糖、0.7%的TC AgarTM )上，以誘導生根。第一次轉移至MSMEST培養基時並未生根的芽，繼續按第二次或第三次循環而轉移至MSMEST培養基，直到獲得生根的植物為止。
PCR分析。當芽在MSMESH5培養基培養至少14天後，將進行PCR之試樣單離出來。藉由PCR測試來自綠色芽的葉片組織是否有pat 篩選標記基因存在。將所有黃化的芽棄置，而不進行PCR分析。保留PCR反應為陽性的試樣，及讓該等芽留置在MSMEST培養基上，以讓根部伸長與發育。將PCR反應為陰性的芽棄置。將在MSMESH5或MSMEST上生根及為PCR陽性之植物移植至土壤中。在強化之後，進一步分析T0 油菜植物是否具有包含所有轉殖基 因PTU匣的品項，將該等植物轉移至溫室中生長至成熟，及採收T1 種子進行脂肪酸組成分析。
大豆轉形作用
子葉節大豆。經由Zeng等人(2004年)於期刊“Plant Cell Rep.”第22(7)期第478-82頁乙文之修改過的程序，使用承載一種二元載體的一種農桿菌屬(Agrobacterium )菌株，進行大豆(大豆品種馬弗里克號(Glycine max c.v.，Maverick))之農桿菌介導型轉形作用。修改該操作程序，在其中納入除草劑固殺草(glufosinate)作為篩選劑。此外，另一項修改係包括讓經殺菌處理的大豆種子在用3克/公升的植物凝膠(PhytagelTM )(美國密蘇里州聖路易市的西克瑪-艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)凝固之B5基礎培養基上萌芽(Gamborg等人(1968年)於期刊“Exp Cell Res.”第50(1)期第151-8頁乙文)。對於該操作程序的最後一項修改係使用子葉節外植體，該子葉節外植體係自生長5-6天的幼苗製備，及如Zeng等人(1999年)於期刊“Plant Cell Tiss.Org.”第56期第37-46頁乙文所述，用農桿菌進行感染。如Zeng等人(2004年)乙文所述，在供共同培養用的培養基上進行共同培養5天。在供芽誘導、芽伸長及生根用的培養基中增補50毫克/公升的CefotaximeTM 、50毫克/公升的TIMENTIN®與50毫克/公升的VancomycinTM ，及用3克/公升的植物凝膠(PhytagelTM )使之凝固。
對半剖開種子式大豆轉形法。經由Paz等人(2005年)於期刊“Plant Cell Rep.”第25期第206-13頁乙文之修改 過的程序，使用承載一種二元載體的一種農桿菌屬(Agrobacterium )菌株，進行大豆(大豆品種馬弗里克號(Glycine max c.v.，Maverick))的農桿菌介導型轉形作用。簡而言之，藉由將大豆種子沿著種臍縱向切成兩半，而將種子分開，及除去種皮。摘除胚軸，及移除子葉節的軸向枝芽/芽。所得的半種子外植體係用農桿菌進行感染。在供芽誘導、芽伸長及生根用的培養基中增補50毫克/公升的CefotaximeTM ，50毫克/公升的TIMENTIN®與50毫克/公升的VancomycinTM ，及用3克/公升的植物凝膠(PhytagelTM )使之凝固。使用固殺草(glufosinate)篩選作用，以抑制非轉形芽的生長作用。
具有部分胚軸的對半剖開種子式大豆轉形法。經由第61/739,349號美國暫准申請案所述之具有部分胚軸的對半剖開種子外植體之大豆轉形操作程序，使用承載一種二元載體的一種農桿菌屬(Agrobacterium )菌株，進行大豆(大豆品種馬弗里克號(Glycine max c.v.，Maverick))的農桿菌介導型轉形作用。在轉形作用之後，使用第61/739,349號美國暫准申請案所述之組織培養方法，培養大豆組織。使用固殺草(glufosinate)篩選作用，以抑制非轉形芽的生長作用。將所篩選的芽轉移至生根培養基，讓根部發育；然後轉移至土壤混合物中，讓小植株適應。
用固殺草(glufosinate)局部處理(葉片塗覆技術)所挑選之小植株的頂生小葉，以篩選推定性轉形體。將所篩選的小植株轉移至溫室，讓其適應，然後用固殺草 (glufosinate)塗覆葉片，以再次確認耐受性。進行該等推定性轉形的T0 植物之採樣，及使用分子分析來確認PTU內是否存在轉殖基因。讓所確定的T0 植物在溫室中自花授粉，以產生T1 種子供進行脂肪酸組成物分析。
來自基因轉殖型大豆品項的成熟T1 種子之脂質分析。
來自3種構築質體pDAB101454、pDAB101496及pDAB107960之T0 植物係在溫室中生長至成熟。篩選含有數套PAT v5及所伴隨之用於DHA生成作用的四種基因之植物。讓該等植物自花授粉，及在成熟時採收所產生的T1 種子。經由FAME GC-FID分析單粒種子，以測定T1 大豆種子中的LC-PUFA與DHA含量。藉由使用一壓機壓碎種子及使用一鋼球與球磨機(史派克斯試樣製備(Spex SamplePrep)有限責任公司)進行均質化作用，而個別分析各植株之12顆完整的成熟種子。用己烷將組織脫脂三次，將所匯集的己烷分液蒸發至乾，將殘餘物稱重，及在庚烷中復原以供進行FAME分析。在擬似標準品十七碳酸甘油三酯(美國明尼蘇達州伊利森(Elysian)之Nu-Chek Prep公司)之存在下，用新製備之位於甲醇中的0.25M甲氧化鈉(美國密蘇里州聖路易市的西克瑪-艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)，進行一已知量的油殘餘物之甲基轉移作用。該反應係在溫和加熱(40℃)及持續振盪之下進行，及用庚烷萃取所產生的FAME。藉由十七碳酸化甲基酯擬似標準品之回收，而證實該反應之完成。藉由使用安捷倫(Agilent)6890型氣相層析儀(加州聖克拉拉 (Santa Clara)的安捷倫科技(Agilent Technologies)公司)與來自SGE公司(美國德州奧斯汀(Austin))之一個15公尺x0.25毫米x0.25微米的BPX 70毛細管柱之GC-FID，分析FAME萃取物。藉由滯留時間辨識各FAME峰，及藉由注射來自麥崔亞(Matreya)有限責任公司(美國賓州愉悅隘口(Pleasant Gap))的菜籽油參考混合物而定量。校正標準係含有所個別添加之來自Nu-Chek公司的DHA(C22：6)、EPA(C20：5)、DPA(n-6)(C22：5)、γ-次亞麻油酸酯(linolenoate)(C18：3)及花生四烯酸甲基酯標準。使用ChemStation4軟體(安捷倫(Agilent)公司)，進行數據分析。
在該等含有LC-PUFA的T2 種子中，DHA佔LC-PUFA總含量之60%。在T2 大豆種子中，僅檢測出二種新穎的LC-PUFA，即DHA與DPA(n-6)。預期存在於大豆種子中之脂肪酸係按正常水平檢測出，除了總C18脂肪酸係因存在LC-PUFA之故而按比例降低之外。在該等基因轉殖型大豆種子中，還檢測出低水平(合併起來係低於1%)之另外二種脂肪酸(γ-次亞麻油酸與花生油酸)。
植物轉形體之分子確認作用。
編碼區之套數分析與檢測作用。從上述的轉形作用辨識與篩選T0 植物。進一步分析該等轉形體，以辨識出含有各轉殖基因PTU表現匣之植物。進行類似於TAQMAN®之水解探針分析，以初步篩選與確認PFA1 、PFA2、PFA3 、HetI 、SzACS2 及pat 轉殖基因之存在，及確認不存在VirD2 農桿菌屬(Agrobacterium )基因。採用先前述於 第WO2013016546號與第WO2011146524號國際專利公開案中之分析。使用該等定量PCR研究所得的數據，以測定是否存在轉殖基因及其套數。篩選含有所有PTU之品項，以晉升成為T1 植物。
檢測油菜與芥菜屬(Arabidopsis )種子中的PUFA合成酶蛋白。研發出定量式西方印漬法，以用於檢測油菜與芥菜屬(Arabidopsis )種子試樣中的PUFA合成酶多肽。用於全長式PFA1與PFA3之抗原係以重組方式表現及具有N端組胺酸標簽，並且經由鈷親和性層析法進行部分純化。用於全長式PFA2之抗原並不含有一種組胺酸標簽，及係自包涵體單離出來。一種N端PFA2片段及與一預測的ER域重疊之一種PFA3片段亦以重組方式表現作為抗原。所有該等片段皆以凝膠片形式提交，以供在兔子體內生成多株抗體。用於全長式HetI 之抗原係以重組方式在BL21(DE3)大腸桿菌(Escherichia coli )細胞(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)中表現及具有一個N端6X組胺酸標簽，並且經由鈷親和性層析法高度純化。抗原係以濃度約2毫克/毫升之經TBS緩衝的可溶性蛋白形式提交，以供在兔子體內生成多株抗體。所有抗血清皆藉由蛋白G抗體親和性層析法純化。
用於PFA1、PFA2、PFA3及HetI 之重組型參考標準係在Arctic Express(DE3)RIL中異源表現及產生(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)，及經由組胺酸-ComAC純化作用進行純化。藉由密度測定法，使用具 有變性SDS-PAGE與考馬斯(Coomassie)藍染色作用之凝膠內定量的BSA標準曲線，測定蛋白濃度。
藉由用Kleco Bead BeaterTM (美國加州維塞利亞(Visalia)的加西亞機械(Garcia Machine)公司)中的二個不銹鋼珠，使得乾燥的芥菜屬(Arabidopsis)種子裂開，或者藉由處理自上述的一種批式油菜種子FAME分析所產生之脫脂餅，而製備供分析用的種子試樣。在種子試樣中添加萃取緩衝液(50mM Tris、10mM EDTA、2%的SDS)，及將裝有試樣與萃取緩衝液之試管輕輕搖晃15至30分鐘。試樣於3,000 x g離心30分鐘。收集上清液及用於分析中。
使用皮爾斯(Pierce)660奈米蛋白分析TM (美國伊利諾州洛克福德(Rockford)的賽默科技(Thermo Scientific)公司)，測定種子萃取物中之總可溶性蛋白的量。將試樣標準化為1.55毫克/毫升的總可溶性蛋白，及在LDS試樣緩衝液(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)中用40mM DTT製備，以製成每道20微克的總可溶性蛋白之標準加載量。試樣係在3-8%的Tris乙酸鹽凝膠(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)中進行電泳，及轉移至硝化纖維素膜。在阻斷緩衝液中阻斷印漬，及用對抗不同的PUFA合成酶多肽(PFA1、PFA2及PFA3)之抗體進行探測。使用一種經螢光標記的抗兔二級抗體即山羊抗兔AF 633TM (美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)進行檢測。在Typhoon Trio Plus Fluorescent ImagerTM (美國紐澤西州新伯朗士威克(New Brunswick)的GE醫療保健(GE Healthcare)公司)上目視印漬。當用PFA1、PFA2、PFA3及HetI 特異性抗血清進行探測時，所得之來自芥菜屬(Arabidopsis )T2 種子、大豆T1 種子及油菜T1 種子的成熟種子萃取物之SDS-PAGE西方印漬，係在適當尺寸產生帶狀。
針對品項101454[267]-26702.001之T1 大豆種子萃取物中的PUFA合成酶多肽PFA1、PFA2、PFA3及HetI 的SDS-PAGE西方印漬檢測作用，係產生具預期分子量之帶狀。
此外，針對下列品項之T1 油菜種子萃取物中的PUFA合成酶多肽PFA1、PFA2、PFA3及HetI 的SDS-PAGE西方印漬檢測作用：6580[2]-016.Sx001、6580[2]-017.Sx001、6580[2]-017.Sx002、6580[2]-018.Sx001、6580[2]-019.Sx001、6580[2]-020.Sx001、6580[2]-021.Sx001、6580[2]-021.Sx002、6580[2]-024.Sx001、6580[2]-039.Sx001及6580[2]-039.Sx002，係產生具預期分子量之帶狀。
接著，用針對各多肽之5個點的標準曲線(100奈克、50奈克、25奈克、12.5奈克及6.25奈克)，經由SDS-PAGE西方印漬術，量化PUFA合成酶特異性蛋白。表2與表3分別摘要說明芥菜屬(Arabidopsis )與油菜的結果。
例3：經PUFA合成酶轉形的芥菜屬(Arabidopsis )種子中之LC-PUFA生成作用
用編碼PUFA合成酶基因的構築質體產生基因轉殖型芥菜屬(Arabidopsis )T1 品項，從其種子所得之DHA與其他LC-PUFA油含量摘要係示於表4中。使用實作14 碳標記的標準，確定DHA與EPA的HPLC滯留時間。圖2。使用1-14 碳標記的DHA標準曲線，進行PUFA之定量。所分析之各品項的LC-PUFA含量係示於圖3中。該等數據顯示構築質體PTU構形之類型及用於表現PUFA合成酶與HetI 基因的調控元件之特定組合，其等可用以改變在T2 芥菜屬(Arabidopsis )種子中所得之產生LC-PUFA的基因轉殖型品項的數目。
例如，pDAB101454的所有單套品項中僅有22%產生DHA，而65%的pDAB101496品項及79%的pDAB112206品項產生DHA。相較於pDAB101454，pDAB101496二元載體含有多樣化的調控元件。同樣地，相較於pDAB101454，pDAB112206構築質體同時含有多樣化的調控元件及改變的PTU構形。另一種構築質體pDAB109584含有附加的調控元件多樣性，同時含有PFA3 基因的原生編碼序列版本，而 非“植物最佳化”版本。在這種情況下，所有單套品項中有82%產生LC-PUFA。
調控元件、構築質體構形的進一步改質作用及使用第二定向PTU構形的原生基因序列所建構之構築質體，其所產生的基因轉殖型芥菜屬(Arabidopsis )植物之單套品項中的61至80%產生LC-PUFA。具第二定向PTU構形的構築質體亦產生基因轉殖型植物，其T2 芥菜屬(Arabidopsis )種子中的LC-PUFA含量高於1%之品項比例(41至62%)係較高。當存在原生(相對於植物最佳化)的PUFA合成酶基因序列時，亦提高其LC-PUFA高於1%之品項比例。例如，含有原生基因序列之pDAB109525與pDAB112210，其單套品項的LC-PUFA高於1%之比例分別為60%與54%。相反地，皆包含植物最佳化基因(構形相同並使用相同的調控元件)之pDAB101454之LC-PUFA高於1%的品項比例僅有5%。
使用不同構築質體之品項的T2 種子之最高LC-PUFA含量係自0.71%至2.14%。最高DHA含量係自0.39%至1.59%。第二定向PTU構形之構築質體例如pDAB109591、pDAB107962及pDAB107960所得的DHA水平最高。該等構築質體含有二種不同的啟動子/終止子組合，以用於驅動四種轉殖基因及一種或三種原生的PUFA合成酶基因。
所有構築質體及所產生品項之最高的EPA含量係自0至1.17%。相較於其他構築質體，構築質體pDAB112203(第三定向PTU構形)、pDAB112200(第三定向 PTU構形)、pDAB112201(第三定向PTU構形)及pDAB101496(第一定向PTU構形)可有效達成相對高水平的EPA。相較於DHA(佔LC-PUFA的37至45%)而言，來自該等構築質體之產生LC-PUFA的品項係含有相對高比例的EPA(佔LC-PUFA的39至56%)；而其他構築質體通常含有較低比例的EPA(佔LC-PUFA的9至27%)，及較高比例的DHA(佔LC-PUFA的60至76%)。
該等數據顯示構築質體構形及基因調控元件之選擇，導致芥菜屬(Arabidopsis )種子中產生二種ω-3 LC-PUFA即DHA與EPA之效率提高；及顯示構築質體構形及基因調控元件之選擇，可用於提高作物植物生產二種ω-3 LC-PUFA即DHA與EPA之效率。
芥菜屬(Arabiaopsis )T3 種子
種植來自高LC-PUFA產量的芥菜屬(Arabidopsis )品項之T2 種子，採樣來自T2 植物的葉片組織及經由定量PCR反應檢測pat 基因與其他轉殖基因。辨識出含有二套轉殖基因(即同型合子)之植物，及讓其等生長至成熟。採收所產生的T3 種子，及分析LC-PUFA含量。含有重複的啟動子/終止子表現元件及皆使用“植物最佳化”PUFA合成酶基因序列之構築質體pDAB101454與pDAB101429，其等在後續T3 種子世代所展現的LC-PUFA表徵之安定性極其不良，及在T3 種子子代檢測出極少的LC-PUFA或全無LC-PUFA。使用具有不同的PTU構形及/或多樣化表現元件之構築質體(pDAB109588、pDAB101496)轉形之其他品項，產生基因 轉殖型芥菜屬(Arabidopsis )品系，其等的T3 種子世代具有從可檢測至水平不一的LC-PUFA(表5、圖4)。來自具有完全多樣化啟動子/終止子組合(pDAB109584)或具有完全原生的PUFA合成酶基因序列(pDAB109525)的一種第一定向PTU構形構築質體之品系，其T3 種子世代顯示非常良好的安定性。合併使用多樣化啟動子/終止子組合及/或使用第二定向或第三定向PTU構形之一或三種原生的PUFA合成酶序列，亦導致T3 種子世代具有一致的安定性(例如就構築質體pDAB107960與pDAB107961而言)。這導致個別的T3 同型接合種子品系含有高達1.77%的DHA，高達1.1%的EPA，及高達2.57%的總LC-PUFA。
總LC-PUFA、DHA與EPA含量係總FAME%。 1.分析來自個別同型接合植物之5至20顆成批T3 種子
與產生DHA的轉殖基因同型接合之例示性個別芥菜屬(Arabidopsis )T3 品系，其完整的種子脂肪酸廓型係示於表6，並與T3 無效姊妹植株的平均脂質廓型相比較。由PUFA合成酶所驅動的LC-PUFA生成作用係與原生的加長脂肪酸及尤其二十烯酸(22：1)的含量之降低相關聯，及略微增加油酸(18：1)與亞麻油酸(18：2)的含量。棕櫚酸酸(16：0)與硬脂酸(18：0)等飽和脂肪酸之含量並無顯著變化。
種植所篩選之高DHA產量的同型接合T3 品系，及分析來自該等植物的T4 種子。分析來自pDAB109591、pDAB109584、pDAB109525、pDAB109592、pDAB107960及pDAB107961轉形作用之十個品系。該等品系在T4 種子世代中持續產生DHA(高達1.85%)與EPA(高達1.00%)，顯示經由三個自花授粉種子世代之ω-3 LC-PUFA表徵遺傳作用仍然安定。
例4：用裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的PUFA合成酶轉形之油菜種子中的LC-PUFA生成作用
用二元構築質體pDAB101496、pDAB109584、pDAB109592、pDAB107960、pDAB107961、pDAB107962及pDAB117501(皆含有PUFA合成酶基因PFA1 、PFA2 、PFA3 及念珠藻屬(Nostoc )的PPTaseNoHetI )產生基因轉殖型油菜，及經由分子確認作用確認含有單套的T-股轉殖基因。
從個別的T0 基因轉殖型油菜植物採收T1 種子，及 如先前所述，分析來自各T1 種子試樣之約10顆種子的成批種子試樣之LC-PUFA含量。
在針對各構築質體所分析之T1 試樣當中，有高比例(81至93%)含有LC-PUFA。表7。在油菜T1 種子試樣中所觀察到的最高DHA含量，係pDAB107960的3.04%。所觀察到的最高EPA含量係pDAB101496的1.97%。最高的ω-3 LC-PUFA合併含量(DHA+EPA)係pDAB107960的4.20%。
為獲得基因轉殖型表徵分離的早期跡象，對於來自所篩選的T1 種子試樣之48顆種子進行LC-PUFA含量分析。根據孟德爾分離定律，在單一基因座具有T-DNA插入之品項，預期將產生約25%的無效種子。就所分析之來自pDAB101496品項的42顆T1 種子試樣而言，其中24顆所具有的無LC-PUFA種子係介於12至35%之間(所有24個試樣之無效種子的平均比例為24%)。表8。檢測出單粒油菜T1 種子的DHA係高達5.41%，EPA高達3.72%，及合併的ω-3 LC-PUFA(DHA+EPA)高達7.33%。
將所篩選的T1 油菜種子試樣種植於溫室中，以產生約60至75棵的T1 植物。從4至5片葉片階段的幼苗取得供DNA分析用之葉片試樣，以測定各T1 分離體植物的轉殖基因套數。使用上述操作程序，藉由轉殖基因的水解探針分析進行套數分析。自該等分析，辨識出對於轉殖基因而言 為同型接合、異型接合及無效之植物。在來自9種品系之同型接合植物的葉片試樣萃取而得的基因體DNA上，進行南方(Southern)分析，探測是否存在PFA1 轉殖基因、pat 轉殖基因(在T-DNA的各端)及來自質體主鏈的SpecR 基因。來自6580[1]-035.Sx001與6580[1]-035.Sx002的T1 植物之南方(Southern)帶狀模式相近，顯示該等品項可能來自株系來源，如同6580[1]-052.Sx001與6580[1]-057.Sx001。南方分析之結果係示於表9。
讓pDAB101496轉殖基因之同型接合型油菜植物(及包括一些異型接合與無效植物)生長至成熟，採收T2 種子，及分析成批種子試樣的LC-PUFA含量。表10。所篩選的所有10種pDAB101496油菜品系皆在T2 種子中產生DHA與EPA。最高的LC-PUFA含量係3.26%的DHA(品系6580[1]-035.Sx002)及1.42%的EPA(品系6580[1]-035.Sx001)。該等品系中的ω-3 LC-PUFA(DHA與EPA)的量係佔總LC-PUFA的80至88%(平均85%)，剩餘的12至20%為ω-6 DPA。半合子T1 植物產生較少的LC-PUFA，這歸因於PUFA合成酶表徵在T2 種子中之預期的分離作用。圖5。來自油菜品系6580[1]-035.Sx002之同型接合與無效種子的完整FAME廓型，係示於表10。該品系產生3.3%的DHA與1.3% EPA。α-次亞麻油酸(C18：3)與亞麻油酸(C18：2)略有增加，而油酸(C18：1)含量則減少。除了所預期的LC-PUFA即DHA、EPA及DPA之外，亦檢測出低水平的新ω-6脂肪酸，諸如γ-次亞麻油酸與花生油酸(分別為0.4%與0.7%)。
油菜品系6580[1]-035.Sx002在成批種子分析中展現較高的DHA與EPA生成水平，在來自該品系的姊妹植株同型接合與半合子植物之成批T2 種子上，進行單粒種子LC-PUFA分析。圖5。來自同型接合植物之種子的DHA含量係相當均一，其變異係數(CV)低於14%。在所分析之來自轉殖基因的同型接合型植物之48顆個別種子中之4個試樣，其等的平均DHA含量為3.70%(SD=0.44，CV=14%)；3.67%(SD=0.31，CV=8%)；3.11%(SD=0.36，CV=12%)；及3.11%(SD=0.35，CV=11%)。就來自半合子植物的種子而言，在每48顆種子試樣中，平均有15顆無效種子，這數值與單一基因座的孟德爾分離定律所預期的12顆種子相近。來自該等半合子植物的個別種子之DHA含量的最大差異可高達5.81%。圖5。
將經pDAB101496轉形的四種油菜品項所衍生之同型接合品系的T2 種子種植於溫室中，及讓其生長以產生 T3 種子。所有品系均在所採收的T3 種子中持續產生DHA與EPA。就LC-PUFA生成作用而言，自[6]-274.Sx001與6580[1]-035.Sx002品項所衍生之品系特別安定，在來自個別植物的T3 成批種子中分別產生平均3.16%的DHA(來自三種T2 品系的13棵植株所產生的DHA範圍係自2.73%至3.61%)；0.78%的EPA(範圍係自0.48%至1.13%)；3.34%的DHA(來自八種T2 品系的53棵植株所產生的DHA範圍係自2.85%至3.89%)；及1.12%的EPA(範圍係自0.75%至1.71%)。
例5：在經PUFA合成酶轉形的大豆種子中之LC-PUFA生成作用
經由使用二元構築質體pDAB101454(101454[16]-341.001與101454[267]26702.001)、pDAB101496(101454[330]33007.001、101454[333]33308.001及101454[334]33402.001)及pDAB10796(107960[12]-626.001、107960[12]-641.001、107960[12]-644.001、107960[26]-655.001及107960[26]-733.001)之植物轉形作用所產生的基因轉殖型T0 大豆品項，係在溫室中生長至成熟。篩選含有數套pat 轉殖基因及所伴隨的PUFA合成酶與HetI 轉殖基因之大豆品項。所篩選的基因轉殖型植物係自花授粉，而所產生的T1 種子係在成熟時採收。獲得單粒種子及經由FAME GC-FID分析，以測定LC-PUFA與DHA含量。藉由使用一壓機壓碎種子及使用一鋼球與球磨機進行均質化作用，而個別分析各植株之12顆完整的成熟種子。用己烷將組織脫脂三次，將所匯集的己烷分液蒸發至乾，將殘餘物稱重，及在庚烷復原中， 而如先前實例中所述進行FAME分析。相較於在相同時間及相同條件下在溫室生長的非基因轉殖型馬弗里克(Maverick)對照栽培品種，基因轉殖型種子的油含量(個別FAME的質量總和除以種子質量)及基因轉殖型T1 品系所產生的種子數目並無顯著不同。所篩選品項之單粒T1 種子之LC-PUFA含量的平均水平與最高水平(%)係歸納總結於表11。DHA含量係高達2.0%，而總PUFA係高達5.1%。此外，在T1 大豆種子中檢測出3種新穎的非內源性LC-PUFA，即DHA、EPA及DPA(n-6)。表11。
DHA與EPA構成該等含有LC-PUFA的T1 種子中之LC-PUFA總含量的90%至99%。其中以品項107960[12]-626.001中的構築質體107960所達到的LCPUFA含量(5.1%)最高。
來自大豆品項101454[16]-341.Sx001、pDAB101496{330}33007.001、107960[12]-626.001及107960[12]-641.001之個別T1種子的完整脂質廓型係示於表12。附上來自馬弗里克(Maverick)對照組的二顆個別種子以供比較。列出所有檢測出的FAME。
表12.來自3種構築質體及對照組野生型馬弗里克(Maverick)的個別種子T1 之脂肪酸甲基酯分析。所有組成係以所檢測出的脂肪酸重量%示之。並非所有脂肪酸皆在進行分析時予以定量(NA)。數值0係對應於低於定量極限之一水平。
例6：來自基因轉殖型大豆品項的成熟T2 種子之脂質分析
為評估LC-PUFA表徵的遺傳性及其跨世代的安定性，測試來自三種構築質體的數種代表品項，基於其等的LCPUFA含量而挑選101454[16]-341.Sx001、107960[12]-641.001、107960[12]-644.001及pDAB101496{334}33402.001，及讓其等在溫室中生長。T1 種子係在溫室中發芽，及分析PAT 、PFA1 及NoHetI 轉殖基因是否存在於T1 小植株。讓具有轉殖基因的T1 植物生長至成熟，及採收由自花授粉所產生的T2 種子，以供進一步分析油。藉由例1中所述的方法，個別分析來自各T2 植物之5至11顆T2 種子的FAME。T1 種子的結果係以粗體形式納入表13中作為參考。品項107960[12]-644.001與pDAB101496{334}33402.001的T1 品系並非同型接合，因此，一些T2 分離型種子並不含有LC-PUFA(最低的LC-PUFA為0)。相較於T1 (3%)，來自品項101454[16]-341.Sx001的T2 種子顯示穩定的LC-PUFA含量(2.2%至5.6%)。所觀察到之平均PUFA的略微增加，係歸因於針對轉殖基因基因座篩選同型接合植物，從而排除T2 子代中之姊妹植株無效種子。大部分的LC-PUFA係n3(比例為0.9)，及由EPA(0.6至2.4%)與DHA(1.3至2.7%)所組成。相較於親本種子，來自品項107960[12]-641.001之T2 種子展現類似的趨勢。LC-PUFA含量(1.5至2.1%)可與T1 種子(3.2%)相比。選自品項pDAB101496{334}33402.001之所有品系的T2 種子並不具有LC-PUFA，這表明T1 植物的轉殖基因基因座並未固定下來。 T2 種子的平均LC-PUFA含量(0.1至1.1%)可與T1 (0.6%)相比。就所有該等構築質體而言，LC-PUFA表徵係遺傳至下一世代，而所累積的LC-PUFA量並無顯著差異。
例7：在田間生長之來自pDAB101496的油菜種子之LC-PUFA生成作用
從產生中等至高水平的DHA(如上述)之六種pDAB101496(序列辨識編號：17)油菜品項衍生數棵同型接合T1植株，從該等植株獨立地匯集成批的T2 油菜種子。該種子於2013年種植於美國明尼蘇達州與北達科他州的田間。使用來自未轉形植物的油菜種子項目作為對照組，及使用市售的油菜品系作為核對。將各種子種植在四重複的小區(1.2x6公尺)，自各區採收所產生的成熟種子(在基因轉殖型試樣的情況為T3 種子)及分析LC-PUFA含量。自四重複的田間各區採收成批籽粒，自其中採樣各具10顆種子的三個等分試樣，進行FAME萃取作用，而測定自各實驗區所採收之油菜籽粒的LC-PUFA含量。表14。
就品項6580[1]-035.Sx002而言，各項目跨四個田間之最高的DHA與EPA含量係分別為4.27%與0.65%。來自個別小區的最高DHA含量係4.54%。就種植於田間之各品項而言，其成批的相同T2 種子品系亦在溫室中生長，以比較所產生的T3 種子之LC-PUFA含量。生長在田間之四個最高的pDAB101496品系的DHA含量，係比生長在溫室中的等效品系平均高22%。表14。
相對於非基因轉殖型DH12075植物而言，產生DHA的基因轉殖型油菜品系之籽粒產率並無顯著差異。表15。生長於田間的所有品系所產生的種子之平均油含量係高於40%(油克數/種子克數)。就種子的葉綠素含量而言，或就油萃取作用後之每克粕中的種子蛋白%而言，在基因轉殖型與非基因轉殖型對照組之間並無顯著差異。基因轉殖型品系與對照組植物在開花時間與成熟所需時間方面並無差異。
將來自田間試驗的各批籽粒匯集，及壓碎以萃取含有LC-PUFA的油，並使用標準方法，經由精煉、漂白及除臭作用加工處理該油。處理二批的種子而產生含有3.02%的DHA與1.0%的EPA之1.2公斤的RBD油，及含有4.1%的DHA與0.7%的EPA之1.0公斤的RBD油。這證明可將表現PUFA合成酶與HetI的 基因轉殖型油菜植物之籽粒加工處理，而產生高度富集DHA與EPA的油菜油。
例8：pDAB107960油菜品項之跨數個種子世代的LC-PUFA表徵安定性
就質體pDAB107960而言，當在芥菜屬(Arabidopsis )中試驗時，聯合使用多樣化啟動子/終止子組合及使用第二定向PTU構形的三種原生PUFA合成酶序列，導致T3 種子世代具有持續的LC-PUFA表徵安定性。表5。經pDAB107960產生的油菜品項之跨三個自花授粉的作物種子世代之LC-PUFA表徵安定性，係以類似方式進行試驗。
藉由先前所述的T1 種子之單粒種子分析，篩選9種pDAB107960油菜品項，及將其T1 種子種植在溫室中。讓對於pDAB107960轉殖基因而言係同型接合及分離成單一孟德爾式基因座之植物生長至成熟，從植物採收T2 種子，及分析種子試樣的LC-PUFA含量。來自所篩選的pDAB107960油菜品項的所有植物皆在T2 種子中產生DHA與EPA。表16。將來自7種品項(113顆植株)的T2 種子種植在溫室中，讓其等生長至成熟，及從該等植株採收T3 種子。再次分析來自各子代植物的種子試樣之LC-PUFA含量。來 自所篩選的7種pDAB107960品項之所有113棵T2 油菜植株，皆在T3 種子中產生DHA與EPA。表16。將衍生自6種品項(137棵植株)的T3 種子種植在溫室中，讓其等生長至成熟，及從該等植株採收T4 種子。來自所篩選的6種pDAB107960品項之所有137棵T3 植株，皆在T4 種子中產生DHA與EPA。表16。所測試之6種品項中的5種在各種子世代皆維持相近之高水平的DHA，這證實跨多品項之DHA表徵安定性。
在6種單一基因座pDAB107960油菜品項中傳遞至T4 種子世代之轉殖基因套數係如前述測定。品項107960[6]-106、107960[6]-107、107960[7]-111及107960[6]-353含有二套的所有轉殖基因，而品項107960[7]-085與107960[6]-352含有一套的所有轉殖基因(PFA1 、PFA2 、PFA3 、NoHetI )。因而，LC-PUFA表徵係以一套或二套的轉殖基因組傳遞，及跨三個種子世代仍維持安定。
自二種不同品項(107960[7]-085與107960[6]-353)所衍生的二棵T3 植株之成批T4 種子試樣的完整FAME廓型，係示於表17。該等種子分別含有4.4%與4.6%的DHA，及0.6%與0.7%的EPA。相伴發生油酸(C18：1)含量之減少(-8%)，及亞麻油酸(18：2)含量之略微增加(+2%)，除此之外，該廓型並未因存在新的LC-PUFA而有顯著變化。除了所預期的LC-PUFA即DHA、EPA及DPA(n-6)之外，亦可檢測出低水平(總量約1%)的新ω-6脂肪酸，即γ-次亞麻油酸(GLA，18：3)與花生油酸(ARA，20：4)。
例9：在田間生長之來自pDAB107960的T4 油菜種子之LC-PUFA生成作用
從產生約3%的DHA(如上述)之6種不同的pDAB107960油菜品項所衍生之同型接合T2 植物，獨立地將成批T3 油菜種子匯集。該種子於2014年種植於美國北達科他州二處地點的田間。使用來自未轉形的DH12075植物之油菜種子項目作為對照組，及使用市售的油菜品系作為核對。將各種子項目種植在四重複的小區(1.2x6公尺)，自各區採收所產生的種子(在基因轉殖型試樣的情況為T4 種子)，如前述藉由FAME分析而分析LC-PUFA含量。在來自四重複田間的各區之成批籽粒中，採樣各具10顆種子的三個技術重複試樣，及進行FAME萃取作用。表18。
就地點1的品項107960[6]-353與107960[6]-106而言，最高的DHA與EPA含量(各項目的四個小區之平均)係分別為3.98%與0.88%。就地點1的品項107960[6]-353而言，來自個別小區的最高DHA含量係4.69%。就種植於田間之各品項而言，其成批的相同T3 種子品系亦在溫室中生長，以比較所產生的T4 種子之LC-PUFA含量。表16。生長於二個地點之所有六個小區的pDAB107960品項之平均DHA含量為3.24%，而生長於溫室的等效品項之平均DHA含量為3.06%。因而，生長在田間的油菜之DHA含量，係比生長於溫室中的等效品系平均高6%。
<110> 陶氏農業科學公司及DSM智慧財產有限公司
<120> 利用破囊壺菌PUFA合成酶於油籽作物中生成ω -3長鏈多不飽和脂肪酸
<130> 2971-p11958US(72907)
<160> 38
<170> 專利申請軟體3.5版
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Claims (71)

  1. 一種基因改造植物，其包含編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶的至少一種多肽之一種聚核苷酸，該多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶係來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌(Schizochytrium )，及包含編碼來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的至少一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)之一種聚核苷酸。
  2. 如請求項1之基因改造植物之一細胞、組織或部位。
  3. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物係選自由高等植物、雙子葉植物、單子葉植物、芥菜屬(Arabidopsis )、實用性(consumable)植物、油籽植物、大豆、油菜籽、油菜、亞麻仁、玉米、紅花、向日葵、菸草、豆科(Fabaceae)之一植物、大豆屬(Glycine )之一植物、花生、四季豆(Phaseolus vulgaris )、蠶豆(Vicia fabas )及豌豆(Pisum sativum )所組成之群組。
  4. 如請求項1之基因改造植物，其中該聚核苷酸係與一啟動子、具種子特異性的一啟動子、具葉片特異性的一啟動子、一種5’UTR、一種3’UTR及一終止序列中之至少一者操作連鎖。
  5. 如請求項1之基因改造植物，其中該聚核苷酸係與一種具種子特異性的啟動子及一種終止序列操作連鎖。
  6. 如請求項1之基因改造植物，其中該聚核苷酸係與一啟 動子操作連鎖，該啟動子係選自由PvDlec2、LfKCS3、FAE1、BoACP、BnaNapinC、泛素、CsVMV、SSPRO2745.1及SSPRO2743.1啟動子所組成之群組。
  7. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其一細胞、組織、種子或部位係包含可檢測量的DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，n-3))及/或EPA(二十碳五烯酸(C20：5，n-3))。
  8. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的DHA量係佔總脂肪酸重量的0.01%至15%之間。
  9. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的DHA量係佔總脂肪酸重量的0.05%至10%之間。
  10. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的DHA量係佔總脂肪酸重量的0.05%至5%之間。
  11. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的EPA量係佔總脂肪酸重量的0.01%至10%之間。
  12. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的EPA量係佔總脂肪酸重量的0.05%至5%之間。
  13. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的EPA量係佔總脂肪酸重量的 0.05%至1%之間。
  14. 如請求項1至13項中任一項之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的EPA：DHA比例係介於1：1至1：30之間，就總脂肪酸的重量而言。
  15. 如請求項14之基因改造植物，其中該植物或其細胞、組織、種子或部位所包含的EPA：DHA比例係介於1：1至1：3之間，就總脂肪酸的重量而言。
  16. 一種種子，其係從如請求項1至15項中任一項之基因改造植物獲得。
  17. 一種商品產物，其係從如請求項1至16項中任一項之基因改造植物獲得。
  18. 如請求項17之商品產物，其中該產物係包含可檢測量之編碼一種多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶多肽的一種聚核苷酸，該多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶多肽係來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌，或包含可檢測量的一種PUFA合成酶多肽，該PUFA合成酶多肽係來自產生具有顯著水平的EPA的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )；及包含可檢測量之一種聚核苷酸，該聚核苷酸係編碼來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)，或包含可檢測量之來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種PPTase。
  19. 如請求項18之商品產物，其中該產物進一步包含可檢測量之一種聚核苷酸，該聚核苷酸係編碼一種異源性裂殖 壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶(ACS)；或包含可檢測量的一種異源性裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的ACS。
  20. 如請求項17之商品產物，其中該產物係一種精製油、一種未精製油、一種粗製油、一種飼料或粕(meal)組成物或一種功能性食品產物。
  21. 如請求項17之商品產物，其中該產物係一種油。
  22. 一種調和油，其包含如請求項21之油與另一種油。
  23. 一種用於獲得包含至少一種PUFA的一油之方法，該方法包括從如請求項1至15項中任一項之基因改造植物或其一細胞、組織、種子或部位回收一油。
  24. 一種用於產生包含至少一種PUFA的一油之方法，該方法包括：讓如請求項1至15項中任一項之基因改造植物生長；及自該基因改造植物或自其一細胞、組織、種子或部位回收一油。
  25. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物係包含下列之至少一者：與序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3的一致性係至少70%之一種聚核苷酸；與序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6的一致性係至少70%之一種聚核苷酸；及與序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13的一致性係至少70%之一種聚核苷酸。
  26. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物係包含序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及序列辨識編號：13中之至少一者。
  27. 如請求項1之基因改造植物，其中該PUFA合成酶的多肽係選自由PFA1、PFA2及PFA3所組成之群組。
  28. 如請求項27之基因改造植物，其中該多肽係包含與序列辨識編號：1的一致性係至少80%之一胺基酸序列；與序列辨識編號：4的一致性係至少80%之一胺基酸序列；及/或與序列辨識編號：7或序列辨識編號：14的一致性係至少80%之一胺基酸序列。
  29. 如請求項27之基因改造植物，其中該多肽係包含序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14。
  30. 如請求項1之基因改造植物，其中編碼念珠藻屬(Nostoc )的PPTase之該聚核苷酸與序列辨識編號：10的一致性係至少80%。
  31. 如請求項30之基因改造植物，其中編碼念珠藻屬(Nostoc )的PPTase之該聚核苷酸係序列辨識編號：10。
  32. 如請求項1之基因改造植物，其中該植物係包含PFA1、PFA2、PFA3及NoHetI 。
  33. 如請求項32之基因改造植物，其中用於PFA1、PFA2、PFA3及NoHetI 之編碼區係以一種頭對尾之構形配置。
  34. 如請求項32之基因改造植物，其中用於PFA1與NoHetI 之編碼區係以一種尾對尾之構形配置，及其中用於PFA3與PFA2之編碼區係以一種尾對尾之構形配置。
  35. 如請求項32之基因改造植物，其中用於PFA1與NoHetI之編碼區係以一種頭對頭之構形配置，及其中用於PFA3與PFA2之編碼區係以一種頭對頭之構形配置。
  36. 如請求項1之基因改造植物，其中該等聚核苷酸中之至少一者係在嚴格條件下與下列各者的補體雜合：序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3；序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6；序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13；及/或序列辨識編號：10。
  37. 一種基因改造植物，其包含編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶的至少一種多肽之一種聚核苷酸，該多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶係來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )；包含編碼來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的至少一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)之一種聚核苷酸；及包含編碼至少一種異源性裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶(ACS)之一種聚核苷酸。
  38. 如請求項37之基因改造植物，其中該裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的ACS與序列辨識編號：11的一致性係至少80%。
  39. 如請求項38之基因改造植物，其中該裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的ACS係序列辨識編號：11。
  40. 如請求項37之基因改造植物，其中該生物體係包含PFA1、PFA2、PFA3、NoHetI 及SzACS2。
  41. 如請求項37之基因改造植物，其中該等聚核苷酸中之至少一者係在嚴格條件下與下列各者的補體雜合：序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3；序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6；序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13序列辨識編號：10；及/或序列辨識編號：11。
  42. 一種包含一植物特異性啟動子之單離核酸，其中該啟動子係與編碼下列至少一種多肽之一種聚核苷酸操作連鎖：來自產生具有顯著的二十碳五烯酸(C20：5,n-3)(EPA)水平的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶；來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)。
  43. 如請求項42之單離核酸，其中該聚核苷酸係包含下列之至少一者：與序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3的一致性係至少70%之一種聚核苷酸；與序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6的一致性係至少70%之一種聚核苷酸；及與序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13的一致性係至少70%之一種聚核苷 酸。
  44. 如請求項42之單離核酸，其中該聚核苷酸係包含序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及序列辨識編號：13中之至少一者。
  45. 如請求項42之單離核酸，其中該PUFA合成酶的多肽係選自由PFA1、PFA2及PFA3所組成之群組。
  46. 如請求項45之單離核酸，其中該多肽係包含與序列辨識編號：1的一致性係至少80%之一胺基酸序列；與序列辨識編號：4的一致性係至少80%之一胺基酸序列；及/或與序列辨識編號：7或序列辨識編號：14的一致性係至少80%之一胺基酸序列。
  47. 如請求項45之單離核酸，其中該多肽係包含序列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：7及/或序列辨識編號：14。
  48. 如請求項42之單離核酸，其中編碼念珠藻屬(Nostoc )的PPTase之該聚核苷酸與序列辨識編號：10的一致性係至少80%。
  49. 如請求項48之單離核酸，其中編碼念珠藻屬(Nostoc )的PPTase之該聚核苷酸係序列辨識編號：10。
  50. 如請求項42之單離核酸，其中該聚核苷酸係編碼PFA1、PFA2、PFA3及NoHetI 。
  51. 如請求項50之單離核酸，其中用於PFA1、PFA2、PFA3及NoHetI 之編碼區係以一種頭對尾之構形配置。
  52. 如請求項50之單離核酸，其中用於PFA1與NoHetI之編碼區係以一種尾對尾之構形配置，及其中用於PFA3與PFA2之編碼區係以一種尾對尾之構形配置。
  53. 如請求項50之單離核酸，其中用於PFA1與NoHetI之編碼區係以一種頭對頭之構形配置，及其中用於PFA3與PFA2之編碼區係以一種頭對頭之構形配置。
  54. 一種用於產生一基因改造植物之系統，該系統係包含單離核酸，其中來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5,n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的多不飽和脂肪酸合成酶(PFA)多肽、PFA1、PFA2及PFA3；及來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)即NoHetI 中之各者係由一或多種單離核酸中之一種聚核苷酸所編碼。
  55. 一種用於產生一基因改造植物之系統，該系統係包含單離核酸，其中該等單離核酸中的至少一者係在嚴格條件下與下列各者之補體中的各者雜合：來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5,n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的多不飽和脂肪酸合成酶(PFA)多肽、PFA1、PFA2及PFA3；及來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)即NoHetI 。
  56. 如請求項55之系統，其中該等單離核酸中的至少一者係在嚴格條件下與下列各者之補體中的各者雜合： 序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3；序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6；序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13；及序列辨識編號：10。
  57. 一種包含一植物特異性啟動子之單離核酸，其中該啟動子係與編碼下列至少一種多肽之一種聚核苷酸操作連鎖：來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶；來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)；及一種異源性裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶(ACS)。
  58. 如請求項57之單離核酸，其中該裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的ACS與序列辨識編號：11的一致性係至少80%。
  59. 如請求項58之單離核酸，其中該裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的ACS係序列辨識編號：11。
  60. 如請求項57之單離核酸，其中該聚核苷酸係編碼PFA1、PFA2、PFA3、NoHetI及SzACS2。
  61. 一種用於產生一基因改造植物之系統，該系統係包含單離核酸，其中來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的多不飽和脂肪酸合成酶(PFA)多肽、 PFA1、PFA2及PFA3；來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)即NoHetI；及一種異源性裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶(ACS)即SzACS2中之各者，係由一或多種單離核酸中之一種聚核苷酸所編碼。
  62. 一種用於產生一基因改造植物之系統，該系統係包含單離核酸，其中該等單離核酸中的至少一者係在嚴格條件下與下各者之補體中的各者雜合：來自產生具有顯著水平的二十碳五烯酸(C20：5，n-3)(EPA)的油之一種裂殖壺菌(Schizochytrium )屬的多不飽和脂肪酸合成酶(PFA)多肽、PFA1、PFA2及PFA3；來自一種念珠藻屬(Nostoc )物種的一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)，即NoHetI；及一種異源性裂殖壺菌屬(Schizochytrium )的醯基-CoA合成酶(ACS)，即SzACS2。
  63. 如請求項62之系統，其中該等單離核酸中的至少一者係在嚴格條件下與下列各者之補體中的各者雜合：序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：3；序列辨識編號：5及/或序列辨識編號：6；序列辨識編號：8、序列辨識編號：9及/或序列辨識編號：13；序列辨識編號：10；及序列辨識編號：11。
  64. 如請求項41至53項及57至60項中任一項之核酸，其中該核酸係一種重組型表現載體。
  65. 如請求項64之核酸，其中該核酸係選自由序列辨識編號：14至37所組成之群組。
  66. 如請求項54至56項及61至63項中任一項之系統，其中該核酸分子係一或多種重組型表現載體。
  67. 如請求項66之系統，其中該等核酸中之各者係選自由序列辨識編號：14至37所組成之群組。
  68. 一種用於產生一種基因改造植物之方法，該方法包括：將如請求項42至53項及57至60項之任一核酸或將來自如請求項54至56項及61至63項之任一系統的核酸導入一植物中，以使得產生該基因改造植物。
  69. 如請求項68之方法，其中該核酸係藉由轉形作用導入該植物中。
  70. 如請求項68之方法，其中藉由來自已包含該核酸的一種不同植物之漸滲雜交作用，而將該核酸導入該植物中。
  71. 一種用於產生包含至少一種PUFA的一油之方法，該方法包括：將如請求項42至53項及57至60項之任一核酸或將來自如請求項54至56項及61至63項之任一系統的核酸導入一植物中，以產生一種基因改造植物；讓該基因改造植物生長；及自該基因改造植物或自其一細胞、組織、種子或部位回收一油。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2623610T3 (es) * 2009-03-19 2017-07-11 Dsm Ip Assets B.V. Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos
TW201525136A (zh) * 2013-11-26 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸
CN107257630A (zh) 2014-11-14 2017-10-17 巴斯夫植物科学有限公司 包含pufa的植物脂质的修饰
CN109477079A (zh) * 2016-05-12 2019-03-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法
WO2017223055A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College A green alga bicarbonate transporter and uses thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693977A (en) 1982-08-23 1987-09-15 Queen's University At Kingston Enzyme immobilization for producing cephalosporin antibiotics
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NZ207765A (en) 1983-04-15 1987-03-06 Lubrizol Genetics Inc Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4886937A (en) 1985-05-20 1989-12-12 North Carolina State University Method for transforming pine
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
DE3784860D1 (de) 1986-12-05 1993-04-22 Ciba Geigy Ag Verbessertes verfahren zur transformation von pflanzlichen protoplasten.
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU669478B2 (en) 1991-04-09 1996-06-13 Unilever Plc Plant promoter involved in controlling lipid biosynthesis in seeds
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
IL124020A (en) 1995-10-13 2003-05-29 Dow Agrosciences Llc Plant optimized nucleotide sequence that encodes an insecticidal crystal protein
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US6210700B1 (en) 1997-01-14 2001-04-03 Novartis Nutrition Ag Enhancement of transplant graft survival through nutritional immunomodulation with omega-9 fatty acid dietary supplement therapy
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
JP2002510205A (ja) 1997-06-04 2002-04-02 カルジーン エルエルシー ポリケチド様合成遺伝子を植物内で発現させることによる多不飽和脂肪酸の製造
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
EP1141346A2 (en) 1999-01-14 2001-10-10 Monsanto Co. Soybean transformation method
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
KR100785946B1 (ko) 1999-09-30 2007-12-14 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 식물 형질전환 벡터
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
ATE459247T1 (de) * 2003-11-14 2010-03-15 Consejo Superior Investigacion Sonnenblumenöl, sonnenblumensamen und pflanzen mit modifizierter fettsäureverteilung im triacylglycerolmolekül
ES2375363T3 (es) * 2004-02-27 2012-02-29 Basf Plant Science Gmbh Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos.
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
US7868228B2 (en) 2006-01-31 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Phosphopantetheinyl transferases from bacteria
JP2009529891A (ja) * 2006-03-15 2009-08-27 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 多価不飽和脂肪酸を含む植物種子油
ES2623610T3 (es) * 2009-03-19 2017-07-11 Dsm Ip Assets B.V. Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos
CN201389213Y (zh) * 2009-04-03 2010-01-27 陈春芬 一种新型吸痰器
TW201144442A (en) * 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
WO2012016222A2 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Dow Agrosciences Llc Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency
TW201307553A (zh) * 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
TW201525136A (zh) * 2013-11-26 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸

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