CN109477079A - 增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本公开主题特征在于一种生产富含EPA的脂质的方法，该方法包括修饰微藻以增加PFA1和/或PFA3的表达，并在允许PFA1和/或PFA3表达的条件下培养该修饰的微藻，其中产生富含EPA的脂质。特征还在于其中过表达PFA1和/或PFA3的重组微藻。本文已经证明此类重组微藻产生极其有利的脂肪酸脂质谱(例如EPA水平增加、EPA:DHA的比例增加，DPA n‑6的水平下降等)。

Description

增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法
相关申请
本申请要求于2016年5月12日提交的美国临时专利申请号62/335,498的申请日的权益，将其公开内容通过引用特此并入本文。
技术领域
本公开文本涉及通过改变编码多不饱和脂肪酸合酶的亚基的基因的表达水平增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸(诸如二十碳五烯酸(EPA))产量的方法。例如，公开了通过增加编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3的表达水平增加EPA产量的方法。本公开文本还涉及经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因(诸如PFA1和/或PFA3)的表达水平的重组微藻。本公开文本还涉及操纵ω-3多不饱和脂肪酸与ω-6多不饱和脂肪酸的比例，诸如操纵微藻中生产的EPA与二十二碳六烯酸(DHA)的比例的方法。
发明背景
破囊壶菌是破囊壶菌目的微生物，包括破囊壶菌属(Thraustochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)的成员，且已被公认为PUFA的重要来源。参见，例如美国专利号5,130,242。已经表明，海洋细菌和破囊壶菌中的聚酮合酶(PKS)样系统能够从乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成多不饱和脂肪酸(PUFA)。这些PKS样系统在本文中也称为PUFA合酶系统。海洋细菌希瓦氏菌属(Shewanella)和海洋弧菌(Vibrio marinus)中的PUFA合酶系统描述于美国专利号6,140,486中。裂殖壶菌属的破囊壶菌中的PUFA合酶系统描述于美国专利号6,566,583中。裂殖壶菌属(ATCC 20888)和破囊壶菌属(ATCC 20892)的破囊壶菌中的PUFA合酶系统也描述于美国专利号7,247,461和7,256,022中。美国专利号7,211,418描述了破囊壶菌属的破囊壶菌中的PUFA合酶系统以及利用该系统生产二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)(EPA)和其他PUFA。美国专利号7,217,856描述了奥氏希瓦氏菌(Shewanella olleyana)和日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)中的PUFA合酶系统。WO 2005/097982描述了菌株SAM2179中的PUFA合酶系统。美国专利号7,208,590和7,368,552描述了来自金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)的PUFA合酶基因和蛋白。
最近来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶系统描述于美国专利号8,940,884中。当表达时，来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶(PFA1、PFA2和PFA3)产生独特的脂肪酸谱，部分特征在于高水平的ω-3脂肪酸。图1中提供了来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶的基因构造(PFA1、PFA2和PFA3)的示意图。图2中提供了几种上述破囊壶菌中的PUFA合酶的结构域构造示意图。
传统上，PKS系统在文献中已被描述为属于三种基本类型之一，通常称为I型(模块化或迭代)、II型和III型。II型系统的特征在于可分离的蛋白，每一种蛋白进行不同的酶促反应。这些酶协作生产最终产物，且该系统的每种单独的酶通常多次参与生产最终产物。这类系统作用方式类似于见于植物和细菌中的II型脂肪酸合酶(FAS)系统。I型迭代PKS系统与II型系统类似，类似之处在于这些酶以迭代方式用于生产最终产物。I型迭代系统与II型系统的不同之处在于，酶活性与可分离的蛋白无关，而是作为较大蛋白的结构域发生。这个系统与见于动物和真菌中的I型FAS系统类似。
与II型系统相反，在生产最终产物时只使用I型模块化PKS系统中的每个酶结构域一次。该结构域见于较大蛋白，且将每个反应的产物传递至PKS蛋白的另一结构域。
最近已发现了III型系统，且属于缩合酶的植物查耳酮合酶家族。III型PKS系统不同于I型和II型PKS系统，且在迭代缩合反应中使用游离CoA底物，通常用于生产杂环最终产物。
在PUFA合成的常规或标准途径中，通过一系列延伸和去饱和反应修饰中等链长饱和脂肪酸(脂肪酸合酶(FAS)系统的产物)。延伸反应的底物是脂肪酰-CoA(待延伸的脂肪酸链)和丙二酰-CoA(每个延伸反应期间添加的两个碳的来源)。延伸酶反应的产物是脂肪酰-CoA，其在直链中具有两个额外的碳。去饱和酶通过提取氧依赖性反应中的两个氢在预先存在的脂肪酸链中产生顺式双键。去饱和酶的底物是酰基-CoA(在一些动物中)或酯化为磷脂(例如磷脂酰胆碱)的甘油主链的脂肪酸。
基于碳链的长度和饱和特征对脂肪酸分类。脂肪酸基于链中存在的碳数量称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间不存在双键时称为饱和脂肪酸，当存在双键时称为不饱和脂肪酸。不饱和长链脂肪酸在只存在一个双键时是单饱和的，且在存在超过一个双键时是多不饱和的。
PUFA基于从脂肪酸的甲基末端开始的第一双键的位置分类：ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是具有22个碳链长和6个双键的ω-3 PUFA，通常命名为“22:6n-3”。其他ω-3 PUFA包括二十碳五烯酸(“EPA”)，命名为“20:5n-3”，和ω-3二十二碳五烯酸(“DPA n-3”)，命名为“22:5n-3”。DHA和EPA被称为“必需”脂肪酸。ω-6 PUFA包括花生四烯酸(“ARA”)，命名为“20:4n-6”，和ω-6二十二碳五烯酸(“DPA n-6”)，命名为“22:5n-6”。
ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于它们存在于细胞膜中，影响细胞生理学，调节生物活性化合物的产生和基因表达，并作为生物合成底物。Roche,H.M.,Proc.Nutr.Soc.58:397-401(1999)。例如，DHA占人类大脑皮层中脂质的大约15％-20％，视网膜中脂质的30％-60％，集中在睾丸和精子中，并且是母乳中的重要组分。Bergé,J.P.,and Barnathan,G.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125(2005)。DHA占脑中ω-3脂肪酸的高达97％，且占视网膜中ω-3脂肪酸的高达93％。此外，DHA对于胎儿和婴儿的发育以及成人认知功能的维持都是必不可少的。同上。因为ω-3脂肪酸不是在人体中从头合成，所以这些脂肪酸必须来源于营养来源。
亚麻籽油和鱼油被认为是ω-3脂肪酸的良好膳食来源。亚麻籽油不含EPA、DHA、DPA或ARA，但含有亚麻酸(C18:3n-3)，这是一种能够使身体制造EPA的结构单元。然而，有证据表明，代谢转化的速度可能是缓慢且可变的，特别是在健康受损的人群中。鱼油的脂肪酸组成的类型和水平差异很大，这取决于具体的物种和它们的饮食。例如，通过水产养殖饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平往往低于野生鱼。此外，鱼油具有含有环境污染物的风险，并且可能与稳定性问题和鱼腥味或味道有关。
已经通过修饰内部产生的脂肪酸努力在油仔作物中生产PUFA。用脂肪酸延长酶和去饱和酶的各种单独基因给这些植物进行遗传修饰已经产生含有PUFA(诸如EPA和DHA)的叶子或种子(Ruiz-Lopez等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.99:143-154(2015)；Qi等人,Nature Biotech.22:739(2004)；PCT公开号WO 04/071467；Abbadi等人,Plant Cell 16:1(2004))；Napier and Sayanova,Proc.Nutrition Society 64:387-393(2005)；Robert等人,Functional Plant Biology 32:473-479(2005)；和美国专利公开号2004/0172682)。
破囊壶菌所产生的油的多不饱和脂肪酸谱通常比相应的鱼或微藻油简单(Lewis,T.E.,Mar.Biotechnol.1:580-587(1999)).已报道，破囊壶菌物种的菌株产生的ω-3脂肪酸达到微生物产生的总脂肪酸的高百分比(参见美国专利号5,130,242；Huang,J.等人,J.Am.Oil.Chem.Soc.78:605-610(2001)；Huang,J.等人,Mar.Biotechnol.5:450-457(2003))。然而，分离的破囊壶菌所产生的PUFA的性质和量不同，使得一些先前所述的菌株可具有非期望的PUFA谱。
因此，持续需要通过重组修饰单细胞生物来产生所需PUFA谱的方法。该技术问题的解决方案由权利要求书中表征的实施方案提供。
发明概述
公开文本提供了一种生产富含ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)(诸如EPA)的脂质的方法，其包括修饰微藻以改变编码多不饱和脂肪酸合酶(PUFA合酶)的基因的表达水平，和在其中产生富含ω-3 PUFA的脂质的条件下培养经修饰的微藻。例如，本发明的方法包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1的表达水平，和/或改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2的表达水平，和/或改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3的表达水平。在一个实施方案中，微藻经修饰以增加PFA1和/或PFA3的表达水平。在一些实施方案中，微藻经修饰以增加PFA1的表达水平。在其他实施方案中，微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。
在一些实施方案中，待修饰的微藻是网粘菌纲。在一些实施方案中，待修饰的微藻是破囊壶菌，优选地是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。在一个优选的实施方案中，待修饰的微藻是裂殖壶菌属。在一个具体的实施方案中，待修饰的微藻是裂殖壶菌属物种ATCC 20888或其衍生物。
在一个实施方案中，微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的多个拷贝。在一个优选的实施方案中，微藻经修饰以包含编码PFA1的基因的多个拷贝。在一个实施方案中，微藻包含编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。在另一个实施方案中，微藻包含编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。在另外的实施方案中，微藻包含编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。
在另一个实施方案中，微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和编码PFA3的基因两者的多个拷贝。
在另一个实施方案中，微藻通过启动子工程化来修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因。例如，本发明的构建体可经修饰以插入和/或替代一个或多个启动子，所述启动子驱动编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的表达，以增加重组微藻中这些基因的表达水平。
在一些实施方案中，编码PFA1、PFA2和/或PFA3的基因衍生自内源产生富EPA脂质的网粘菌纲。在一个实施方案中，编码PFA1、PFA2和/或PFA3的基因衍生自内源产生富EPA脂质的裂殖壶菌属。在一个优选的实施方案中，编码PFA1、PFA2和/或PFA3的基因衍生自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695或者是其功能等效物。将富EPA脂质定义为具有显著水平的EPA的脂质，诸如含有至少5％EPA的脂质。在其他实施方案中，将具有显著水平的EPA的脂质定义为含有至少10％EPA、至少15％EPA、至少20％EPA或更多的脂质。
在一个优选的实施方案中，使待修饰的微藻(即，宿主微藻)的内源性PUFA合酶基因中的一个或多个突变或缺失。在一个更优选的实施方案中，使待修饰的微藻的所有内源性PUFA合酶基因突变或缺失。
令人惊奇的是，已经发现，通过在重组微藻中过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因，EPA产量可相对于宿主微藻的EPA产量增加至少2倍。在一些实施方案中，本发明重组微藻的EPA产量相对于宿主微藻的EPA产量增加至少5倍。在一些实施方案中，本发明重组微藻的EPA产量相对于宿主微藻的EPA产量增加至少10倍。在另一个实施方案中，本发明重组微藻的EPA产量相对于宿主微藻的EPA产量增加至少20倍。
另外，已经发现，通过在重组微藻中过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因，EPA:二十二碳六烯酸(DHA)比例可相对于宿主微藻的EPA产量增加至少2倍。在一些实施方案中，在重组微藻中，EPA:二十二碳六烯酸(DHA)比例相对于宿主微藻的EPA产量增加至少10倍。在一些实施方案中，在本发明重组微藻中，EPA:二十二碳六烯酸(DHA)比例相对于宿主微藻的EPA产量增加至少20倍。在另一个实施方案中，在本发明重组微藻中，EPA:二十二碳六烯酸(DHA)比例相对于宿主微藻的EPA产量增加至少50倍。
在一些实施方案中，根据本发明生产的富含EPA的脂质还富含DHA。
本公开文本还提供了一种生产具有降低水平的DPA n-6的脂质的方法，其包括修饰微藻以改变基因PFA1、PFA2和/或PFA3的表达水平和培养经修饰的微藻；其中生产具有降低水平的DPA n-6的脂质。
本申请还涉及重组生物体，其中该重组生物体经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶(PUFA合酶)的基因的表达水平。在一些实施方案中，本发明的生物体可包含天然PUFA合酶基因。含有天然PUFA合酶基因的生物体包括但不限于微藻。例如，本发明的重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1的表达水平，和/或改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2的表达水平，和/或改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3的表达水平。在一个实施方案中，微藻经修饰以增加PFA1和/或PFA3的表达水平。在一些实施方案中，微藻经修饰以增加基因PFA1的表达。在其他实施方案中，微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。在其他实施方案中，本发明的生物体不含PUFA合酶基因，包括但不限于植物。这些生物体必须首先经修饰以表达PUFA合酶系统，以允许生产多不饱和脂肪酸。然后使所得重组生物体(诸如植物)进一步修饰，以改变编码PUFA合酶的基因的表达水平。
本申请还涉及已经历突变过程(诸如选择性压力)的突变微藻，导致编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平改变，其中与野生型未突变微藻相比，该突变微藻产生的EPA的水平增加。
本申请还涉及制造上述重组微藻菌株的方法。本申请还涉及通过上述重组微藻菌株生产的PUFA油。
附图简述
为进一步理解本公开文本的本质、目标和优点，应当参考以下详细描述，结合以下附图阅读，其中相同的参考号表示相同的元件。
图1示出了裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PUFA合酶亚基PFA1、PFA2和PFA3的基因构造。
图2示出了裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695、破囊壶菌属物种ATCC PTA-10212和裂殖壶菌属物种ATCC 20888 PUFA合酶的结构域构造。
图3示出了用来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶亚基基因靶向替代裂殖壶菌属物种N230D中的天然PUFA合酶亚基基因产生的裂殖壶菌属菌株B156的菌株谱系，进一步如实施例1中所述。
图4示出了在25℃(图4A)或30℃(图4B)下培养后，含有内源性PFA1、PFA2和PFA3PUFA合酶亚基基因的天然裂殖壶菌属物种N230D中的脂肪酸甲酯谱(FAME)与其中各个基因座上的内源性PFA1、PFA2和PFA3基因已被来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1、PFA2和PFA3基因替代的重组裂殖壶菌属物种N230D(菌株B156-2)的脂肪酸甲酯谱相比的分析。特别感兴趣的是，C20:5n-3是EPA，C22:5n-6是DPA n-6，且C22:6n-3是DHA。
图5示出了在30℃下培养后，含有内源性PFA1、PFA2和PFA3 PUFA合酶基因的天然裂殖壶菌属物种ATCC 20888中的FAME谱与其中已经移除了内源性PFA1、PFA2和PFA3基因并随机整合了来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1、PFA2和PFA3基因的重组裂殖壶菌属物种ATCC 20888(菌株B149)中的FAME谱的比较。
图6示出了用裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1基因的标记部分探测的裂殖壶菌属菌株B145(B145-16和B145-33)和B149(E9、B149-3和B149-4)的Southern印迹。通过用来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1靶向替代裂殖壶菌属物种ATCC 20888中的天然PFA1 PUFA合酶基因产生裂殖壶菌属菌株B145。因此，重组菌株B145含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1基因的一个拷贝，并用于比较以测定重组菌株B149中PFA1的拷贝数。光密度分析表明，平均参考条带(B145)等于7,165个单位。相比之下，来自菌株B149(“E9”)的条带经计算为42,747个单位(约6个PFA1拷贝)；来自菌株B149-3的条带经计算为37,897个单位(约5-6个PFA1拷贝)；且来自菌株B149-4的条带经计算为33,928个单位(约4-5个PFA1拷贝)。
图7示出了将来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1基因多拷贝插入B149的裂殖壶菌属突变菌株的示意图。
图8示出了过表达来自裂殖壶菌属ATCC PTA-9695的PFA1基因、PFA3基因以及PFA1和PFA3基因二者的重组裂殖壶菌属菌株与裂殖壶菌属物种ATCC 20888的亲本菌株(重组菌株B156-2)和子菌株(裂殖壶菌属物种N230D)相比的EPA和DHA产量。
图9示出了通过定量PCR(qPCR)测量的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695和ATCCPTA-10208中的PFA1、PFA2和PFA3表达。
发明详述
在进一步描述本公开文本之前，应理解，本公开文本并不限于下文所述公开文本的特定实施方案，因为可对特定实施方案进行变动，且仍落入所附权利要求书的范围内。还应当理解，所使用的术语是出于描述特定实施方案的目的，而不意图限制。相反，本公开文本的范围将由所附权利要求书确定。
在本说明书和所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
如本文所用，“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白)已经从生物体的细胞(该组分天然存在于其中)中的其他生物组分(即，其他染色体和外染色体DNA和RNA以及蛋白)基本分离、产生或纯化，同时影响该组分的化学或功能变化(例如，核酸可以通过破坏将该核酸连接至染色体中其余DNA的化学键从该染色体分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。
如本文所用，术语“核酸分子”可以指聚合形式的核苷酸，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA的正义链和反义链以及以上的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式。如本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另外指明，否则核酸分子的长度通常是至少10个碱基。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸。
核酸分子可以化学或生物化学方式修饰，或者可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，这是本领域技术人员容易理解的。此类修饰包括，例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如不带电的连接：例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电的连接：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；侧链部分：例如肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链、三链、发夹、环形和闭锁构象。
如本文所用，当第一核酸序列与第二核酸序列有功能关系时，第一核苷酸序列与第二核酸序列“可操作地连接”。当重组产生时，可操作连接的核酸序列通常是连续的，且在必要时将两个蛋白编码区结合在同一阅读框内(例如，在多顺反子ORF中)。然而，核酸不必连续以可操作地连接。
当提到调节序列和编码序列使用时，术语“可操作地连接”意指调节序列影响所连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录时机和水平/量、RNA处理或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合序列；终止序列；和多腺苷酸化识别序列。特定调节序列可位于可操作地连接的编码序列的上游和/或下游。而且，可操作地连接至编码序列的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
如本文所用，术语“启动子”是指DNA中可在转录起点的上游，且可参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以开始转录的区域。启动子可操作地连接至细胞中的编码序列以进行表达，或启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列(该编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接至细胞中的编码序列)以进行表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。
任何诱导型启动子都可用于本发明的一些实施方案中。参见Ward等人(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。有了诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而增加。示例性诱导型启动子包括但不限于：来自响应于铜的ACEI系统的启动子；来自响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米的In2基因；来自Tn10的Tet阻遏物；和来自甾体激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质甾体激素诱导(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
可用于驱动PFA1、PFA2和PFA3基因表达的启动子的例子已经描述在先前专利中(美国专利号8,945,875和美国专利号8,637,651)。此外，可以利用通过全转录组分析产生的数据选择各种长度的其他启动子。例如，可将钙转运ATP酶(EC 3.6.3.8)基因、NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)基因或乙酰-CoA乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)基因的启动子用于裂殖壶菌属物种N230D菌株的高表达通量发酵。在裂殖壶菌属物种N230D菌株发酵的脂质积累期期间，钠依赖性磷酸转运蛋白基因的启动子可用于诱导高表达。在裂殖壶菌属物种N230D菌株的生长期，组蛋白H2B基因或天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)的启动子可用于促进PFA1和PFA3的高表达。
如本文所用，术语“异源的”意指来源不同。例如，如果用非天然存在的未转化宿主细胞的核酸使宿主细胞转化，那么该核酸对于该宿主细胞来说是异源的(和外源的)。此外，转化核酸的不同元件(例如启动子、增强子、编码序列、终止子等)可以彼此异源和/或与转化宿主异源。如本文所用，术语异源的也可以应用于序列与已经存在于宿主细胞中的核酸相同但是现在与不同的额外序列连接和/或是以不同拷贝数存在等的一种或多种核酸。
如本文所用，术语“天然”是指多核苷酸或基因在生物体中天然位置或在天然生物体的基因组中的形式，具有其自身的调节序列(如果存在的话)。
如本文所用，术语“内源的”是指位于通常天然包含分子的生物体或基因组中的多核苷酸、基因或多肽。
如本文所用，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。转导于细胞中的核酸分子变得通过细胞稳定复制时(通过将该核酸分子掺入细胞基因组或通过游离型复制)，该细胞被该核酸分子“转化”。如本文所用，术语“转化”涵盖核酸分子可借以被引入这样的细胞中的所有技术。例子包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌属介导的转染(Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)；直接DNA摄入；和微粒轰击(Klein等人(1987)Nature 327:70)。
如本文所用，“转基因”是整合到宿主基因组中的外源核酸序列。在一些例子中，转基因可包含可操作地连接至转基因的编码序列的调节序列(例如启动子)。
如本文所用，“载体”是引入细胞中例如以产生转化细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的例子包括但不限于：将外源DNA带入细胞中的质粒；粘粒；噬菌体；或病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择标记物基因以及本领域中已知的其他遗传元件。载体可转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达核酸分子和/或该载体编码的蛋白。载体任选地包括有助于实现核酸分子进入细胞的材料(例如脂质体和蛋白涂层)。
如本文所用，术语“表达”可以指多核苷酸所编码的mRNA的转录和稳定累积，或将这样的mRNA翻译为多肽。如本文所用，术语“过表达”高于相同或密切相关的基因的内源性表达的表达。如果异源基因的表达高于密切相关的内源性基因(例如同系物)，那么它被过表达。
如本文所用，术语“外源的”是指通常不存在于其特定环境或背景中的一种或多种核酸。例如，如果用非天然存在的未转化宿主细胞的核酸使宿主细胞转化，那么该核酸对于该宿主细胞来说是外源的。如本文所用，术语外源的还指序列与宿主细胞中已经存在的核酸相同，但位置不同于宿主细胞中已经存在的具有相同序列的核酸的细胞或基因组背景的一种或多种核酸。例如，通常将整合到宿主细胞基因组中不同于具有相同序列的核酸的位置的核酸整合到宿主细胞的基因组中。此外，当具有相同序列的核酸通常仅存在于宿主细胞的基因组中时，存在于宿主细胞中的质粒或载体中的核酸(例如，DNA分子)对于该宿主细胞是外源的。
如本文在两个核酸或多肽序列的背景中使用的术语“序列同一性”或“同一性”可指两个序列通过指定比较窗比对最大对应性时相同的残基。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”可以指通过比较窗比较两个最佳比对序列(例如，核酸序列和氨基酸序列)而确定的值，其中该比较窗中的序列部分与参考序列(其不含添加或缺失)比较时可以包含添加或缺失(即，缺口)，以对两个序列进行最佳比对。通过以下方式计算这种百分比：确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
用于比对序列以进行比较的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述在例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acidss Res.16:10881-90；Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考量可见于例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可从多个来源获得以便与若干种序列分析程序结合使用，该来源包括国家生物技术信息中心(Bethesda,Md)以及互联网上。关于如何使用该程序测定序列同一性的描述可在互联网上在BLASTTM的“帮助”部分下获得。为了比较核酸序列，可采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast2序列”功能，其中利用默认参数。当通过该方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出增加的百分比同一性。
如本文所用，术语“基本上相同的”可指同一性超过80％的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以与参考序列是至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；或至少99.5％相同的。
如本文在编码蛋白的核酸的语境中所用，术语“优化的”是指其中异源核苷酸序列已经改变以反映靶宿主生物体的密码子偏好性的核酸。在一些实施方案中，核苷酸序列可以进一步改变以移除可干扰基因表达的遗传元件。
应当理解，由于遗传密码的冗余，可以设计多个DNA序列来编码单个氨基酸序列。因此，可以设计优化的DNA序列，例如，去除多余的限制性位点和不需要的RNA二级结构，同时优化编码区的核苷酸序列，使得密码子组成类似于待表达DNA的宿主的总密码子组成。关于合成DNA序列的设计和生产的指南可以在例如，国际专利申请号WO 2013016546、WO2011146524和WO 1997013402；和美国专利号6,166,302和5,380,831中找到。
如本文所用，术语“保守取代”是指一种氨基酸残基取代相同类别中的另一种氨基酸的取代。非保守氨基酸取代是一种残基不落入相同类别的氨基酸，例如，用碱性氨基酸取代中性或非极性氨基酸。可以为进行保守取代定义的氨基酸类别在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一脂肪族氨基酸取代第二不同脂肪族氨基酸。例如，如果第一氨基酸是Gly；Ala；Pro；Ile；Leu；Val；和Met中的一种；该第一氨基酸可由选自Gly；Ala；Pro；Ile；Leu；Val；和Met的第二不同氨基酸替代。在特定例子中，如果第一氨基酸是Gly；Ala；Pro；Ile；Leu；和Val中的一种，该第一氨基酸可由选自Gly；Ala；Pro；Ile；Leu；和Val的第二不同氨基酸替代。在涉及取代疏水脂肪族氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是Ala；Pro；Ile；Leu；和Val中的一种，该第一氨基酸可由选自Ala；Pro；Ile；Leu；和Val的第二不同氨基酸替代。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一芳族氨基酸取代第二不同芳族氨基酸。例如，如果第一氨基酸是His；Phe；Trp；和Tyr中的一种，该第一氨基酸可由选自His；Phe；Trp；和Tyr的第二不同氨基酸替代。在涉及取代不带电芳族氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是Phe；Trp；和Tyr中的一种，该第一氨基酸可由选自Phe；Trp；和Tyr的第二不同氨基酸替代。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一疏水氨基酸取代第二不同疏水氨基酸。例如，如果第一氨基酸是Ala；Val；Ile；Leu；Met；Phe；Tyr；和Trp中的一种，该第一氨基酸可由选自Ala；Val；Ile；Leu；Met；Phe；Tyr；和Trp的第二不同氨基酸替代。在涉及取代非芳族疏水氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是Ala；Val；Ile；Leu；和Met中的一种，该第一氨基酸可由选自Ala；Val；Ile；Leu；和Met的第二不同氨基酸替代。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一极性氨基酸取代第二不同极性氨基酸。例如，如果第一氨基酸是Ser；Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；Pro；Arg；His；Lys；Asp；和Glu中的一种，该第一氨基酸可由选自Ser；Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；Pro；Arg；His；Lys；Asp；和Glu的第二不同氨基酸替代。在涉及取代不带电极性氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是Ser；Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；和Pro中的一种，该第一氨基酸可由选自Ser；Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；和Pro的第二不同氨基酸替代。在涉及取代带电极性氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是His；Arg；Lys；Asp；和Glu中的一种，该第一氨基酸可由选自His；Arg；Lys；Asp；和Glu的第二不同氨基酸替代。在涉及取代带电极性氨基酸的其他例子中，如果第一氨基酸是Arg；Lys；Asp；和Glu中的一种，该第一氨基酸可由选自Arg；Lys；Asp；和Glu的第二不同氨基酸替代。在涉及取代带正电(碱性)极性氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是His；Arg；和Lys中的一种，该第一氨基酸可由选自His；Arg；和Lys的第二不同氨基酸替代。在涉及取代带正电极性氨基酸的其他例子中，如果第一氨基酸是Arg或Lys，该第一氨基酸可由其他氨基酸Arg和Lys替代。在取代带负电(酸性)极性氨基酸的特定例子中，如果第一氨基酸是Asp或Glu，该第一氨基酸可由其他氨基酸Asp和Glu替代。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一电中性氨基酸取代第二不同电中性氨基酸。例如，如果第一氨基酸是Gly；Ser；Thr；Cys；Asn；Gln；和Tyr中的一种，该第一氨基酸可由选自Gly；Ser；Thr；Cys；Asn；Gln；和Tyr的第二不同氨基酸替代。
在一些实施方案中，保守取代包括用第一非极性氨基酸取代第二不同非极性氨基酸。例如，如果第一氨基酸是Ala；Val；Leu；Ile；Phe；Trp；Pro；和Met中的一种，该第一氨基酸可由选自Ala；Val；Leu；Ile；Phe；Trp；Pro；和Met的第二不同氨基酸替代。
在许多例子中，可以选择欲在保守取代中用于替代第一氨基酸的特定第二氨基酸，以最大化第一和第二氨基酸都属于的前述类别的数量。因此，如果第一氨基酸是Ser(极性、非芳族和电中性氨基酸)，该第二氨基酸可以是另一种极性氨基酸(即，Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；Pro；Arg；His；Lys；Asp；或Glu)；另一种非芳族氨基酸(即，Thr；Asn；Gln；Cys；Gly；Pro；Arg；His；Lys；Asp；Glu；Ala；Ile；Leu；Val；或Met)；或另一种电中性氨基酸(即，Gly；Thr；Cys；Asn；Gln；或Tyr)。然而，在这种情况下，第二氨基酸可能优选为Thr；Asn；Gln；Cys；和Gly中的一种，因为根据极性、非芳香性和电中性，这些氨基酸共享所有类别。可任选地用于选择特定欲在保守取代中使用的特定第二氨基酸的其他标准是本领域中已知的。例如，当Thr；Asn；Gln；Cys；和Gly可用于Ser的保守取代中时，可以不选择Cys，以避免形成非期望的交联和/或二硫键。同样，可以不选择Gly，因为它缺少烷基侧链。在这种情况下，可以选择Thr，例如，以保留侧链羟基基团的官能度。然而，选择欲在保守取代中使用的特定第二氨基酸最终由技术人员判断。
如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸”或“PUFA”是指碳链长度为至少16个碳(例如至少18个碳、至少20个碳和22个碳或更多个碳)以及至少3个或更多个碳碳双键(在下文中，就PUFA而言讨论的“双键”是指碳碳键)(例如4个或更多个双键、5个或更多个双键以及6个或更多个双键)的脂肪酸，其中所有双键都是顺式构型。
如本文所用，术语“长链多不饱和脂肪酸”或“LC-PUFA”是指碳链长度为20或更多个碳的含3个或更多个双键、或22个或更多个碳的含3个或更多个双键(例如4个或更多个双键、5个或更多个双键、和6个或更多个双键)的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括例如且不限于二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(ARA；C20:4n-6)、肾上腺酸(还称为二十二碳四烯酸或DTA；C22:4n-6)和二十二碳五烯酸(DPA n-6；C22:5n-6)。ω-3系列的LC-PUFA包括，例如但不限于二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(EPA；C20:5n-3)、二十二碳五烯酸(DPA n-3；C22:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA；C22:6n-3)。LC-PUFA还包括具有超过22个碳和4或更多个双键的脂肪酸，例如且不限于C28:8(n-3)。
如本文所用的术语“PUFA合酶”是指催化从头合成PUFA(例如LC-PUFA)的酶。大多数破囊壶菌PUFA合酶由三个亚基组成，在此称为PFA1、PFA2和PFA3(或Pfa1、Pfa2和Pfa3)。这些亚基先前已被称为OrfA、OrfB和OrfC(或ORFA、ORFB和ORFC)。来自细菌的PUFA合酶通常由称为PfaA、PfaB、PfaC和PfaD的四个亚基组成。术语PUFA合酶包括例如且不限于用于生产PUFA的PUFA合酶系统或PUFA合酶样系统。一些具体的PUFA合酶在本文中由其他符号表示，例如，来自裂殖壶菌属物种的PUFA合酶，ATCC登录号PTA-9695。术语“PUFA合酶系统”是指一种或多种PUFA合酶以及可影响PUFA合酶功能的任何异源辅助酶(例如4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)或酰基-CoA合成酶(ACS))。
如本文所用的术语“功能等效物”包括催化生产PUFA的任何PUFA合酶或编码催化生产PUFA的任何PUFA合酶的任何基因和/或核苷酸序列。PFA1的功能等效物包括具有与PFA1相同或相似的酶活性的任何多肽(或编码多肽的任何基因和/或核苷酸序列)。相似地，PFA2的功能等效物包括具有与PFA2相同或相似酶活性的任何多肽(或编码多肽的任何基因和/或核苷酸序列)，且PFA3的功能等效物包括具有与PFA3相同或相似酶活性的任何多肽(或编码多肽的任何基因和/或核苷酸序列)。在一些实施方案中，PUFA合酶亚基的功能等效物包括存在PUFA合酶亚基内的一个或多个结构域。例如，PFA1的功能等效物可包括KS结构域、MAT结构域、ACP结构域、两个或更多个ACP结构域的组合(诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个ACP结构域，包括串联结构域)、KR结构域、DH结构域、及其组合。PFA2的功能等效物可包括KS结构域、CLF结构域、AT结构域、ER结构域、及其组合。PFA3的功能等效物可以包括DH结构域、ER结构域、及其组合。在其他实施方案中，功能等效物包括但不限于在参考氨基酸序列(即，SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6)内添加或取代氨基酸残基，但这导致沉默改变，因此产生功能相当的基因产物。例如，可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守氨基酸取代。
在一个方面，本公开主题特征在于一种生产富含EPA的脂质的方法，该方法包括修饰微藻以增加编码PFA1的PFA1、和/或编码PFA3的PFA3的表达水平，并且培养该修饰的微藻，其中产生富含EPA的脂质。特征还在于其中过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的重组微藻。本文已经证明此类重组微藻产生极其有利的脂肪酸脂质谱(例如EPA水平增加、EPA:DHA的比例增加，DPA n-6的水平下降等)。下面还详细描述本发明的某些非限制性实施方案。
海洋破囊壶菌裂殖壶菌属藻类(由ATCC登录号PTA-9695表示)产生具有高ω-3/ω-6比例的油，它还可以用作作物转化的PUFA合酶基因的来源。参见PCT国际专利申请号WO2015/081270。另外，这个裂殖壶菌属可产生含除DHA以外显著水平的EPA的油。产生大量EPA的能力与一些其他破囊壶菌属菌株相反(例如，裂殖壶菌属物种ATCC登录号20888)。参见美国专利公开号US 2013/0150599A1；PCT国际专利申请号WO 2013/016546。在一些实施方案中，在微藻中重组表达衍生自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695、或其功能等效物的一个或多个PUFA合酶亚基。在一个优选的实施方案中，编码来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的一个或多个PUFA合酶亚基的基因在微藻中重组地过表达。特别地，编码来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的过表达的一个或多个PUFA合酶亚基的基因选自编码PFA1的基因和编码PFA3的基因，优选地编码PFA1的基因和任选地编码PFA3的基因。
利用重组宿主细胞生产脂质的方法
本发明涉及一种生产至少一种PUFA的方法，其包括在有效产生PUFA的条件下在宿主细胞中表达PUFA合酶系统，其中该PUFA合酶系统包含本文所述的分离核酸分子和重组核酸分子以及其组合中的任一者，其中产生至少一种PUFA。在一些实施方案中，该至少一种PUFA包括EPA、DHA、或其组合。在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞、分离的动物细胞或微生物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是破囊壶菌。
本发明涉及一种生产富含EPA、DHA或其组合的脂质的方法，其包括在有效产生脂质的条件下在宿主细胞中表达至少一种PUFA合酶基因，其中该宿主细胞中该至少一种PUFA合酶基因包含本文所述分离的核酸分子和重组核酸分子以及其组合中的任一者，其中产生富含EPA、DHA或其组合的脂质。
本发明还涉及一种从宿主细胞分离脂质的方法，其包括在有效产生脂质的条件下在该宿主细胞中表达至少一种PUFA合酶基因，并且从该宿主细胞分离脂质，其中该宿主细胞中的该PUFA合酶系统包含本文所述的分离的核酸分子和重组核酸分子以及其组合中的任一者。
在一些实施方案中，从宿主细胞分离一种或多种含PUFA的脂质级分。在一些实施方案中，从宿主细胞分离的一种或多种级分包括总脂肪酸级分、甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、二酰基甘油级分、磷脂级分、或其组合。在一些实施方案中，从宿主细胞分离PUFA，其中这些PUFA富含ω-3脂肪酸或ω-6脂肪酸或其组合，这基于引入宿主细胞的PUFA合酶系统的组成。在一些实施方案中，PUFA富含DHA、EPA或其组合，这基于引入宿主细胞的PUFA合酶系统的组成。在一些实施方案中，PUFA富含DHA、EPA、或其组合。在一些实施方案中，从宿主细胞分离的PUFA的PUFA谱包括高浓度的EPA和较低浓度的DHA、ARA、DPA n-6或其组合。在一些实施方案中，从宿主细胞分离的PUFA的PUFA谱包括高浓度的DHA和EPA和较低浓度的ARA、DPA n-6或其组合。在一些实施方案中，从宿主细胞分离的PUFA的PUFA谱包括高浓度的EPA和较低浓度的DHA、ARA、DPA n-6或其组合。
本发明涉及一种在具有PUFA合酶活性的生物体中替代失活或缺失的PUFA合酶活性，引入新的PUFA合酶活性，或增强现有的PUFA合酶活性的方法，其包括在有效表达的条件下在生物体中表达本文所述的分离的核酸分子和重组核酸分子、以及其组合中的任一者。在一些实施方案中，该核酸分子包含编码PUFA合酶亚基(PFA1、PFA2或PFA3)中一者或多者的本文所述的一种或多种多核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，核酸分子包含编码PFA1和/或PFA3的本文所述的一种或多种多核苷酸序列。在一些实施方案中，通过引入本发明的一种或多种核酸分子改变生物体的PUFA谱。
在一些实施方案中，如本文所述的重组宿主细胞中编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的表达水平增加或增强。在一个优选的实施方案中，重组宿主细胞是微藻，诸如破囊壶菌。如下文实施例中进一步详细讨论的，在产生高水平脂质的裂殖壶菌属物种中过表达来自产生富EPA脂质的裂殖壶菌属的编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因产生比存在于野生型裂殖壶菌属中更有利的PUFA谱。
在一些实施方案中，被改变的PUFA谱包括ω-3脂肪酸增加和ω-6脂肪酸减少。在一些实施方案中，DHA的量增加，而EPA、ARA、DPA n-6或其组合中的任一者的量维持或减少。在一些实施方案中，EPA和DHA的量增加，而ARA、DPA n-6或其组合的量维持或减少。在一些实施方案中，EPA的量增加，而DHA、ARA、DPA n-6或其组合中的任一者的量维持或减少。在一些实施方案中，核酸分子包含来自PFA1编码序列的多核苷酸序列或者其中的一个或多个结构域的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码PFA1的多核苷酸序列或者其中的一个或多个结构域，且生物体中ω-3脂肪酸的量增加，而ω-6脂肪酸的量减少。在一些实施方案中，核酸分子包含来自PFA3编码序列的多核苷酸序列或者其中的一个或多个结构域。在一些实施方案中，核酸分子包含编码PFA3的多核苷酸序列或者其中的一个或多个结构域，且生物体中ω-3脂肪酸的量增加，而ω-6脂肪酸的量减少。
本发明涉及增加具有PUFA合酶活性的生物体中的EPA、DHA、或其组合的产量的方法，其包括在有效生产EPA、DHA、或其组合的条件下在生物体中表达本文所述的分离的核酸分子和重组核酸分子以及其组合中的任一者，其中该PUFA合酶活性替代失活或缺失的活性、引入新的活性、或增强生物体中现有的活性，且其中生物体中DHA、EPA或其组合的产量增加。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及增加具有PUFA合酶活性的生物体中EPA、DHA、或其中的组合的产量的方法，其包括引入和/或增加生物体中编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的表达水平。在一些实施方案中，通过将多个拷贝的编码PFA1的核苷酸序列和/或编码PFA3的核苷酸序列引入生物体中增加生物体中编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的表达水平。将多个拷贝的编码PFA1的核苷酸序列和任选地编码PFA3的核苷酸序列引入生物体可以是靶向的或随机的。在另一个实施方案中，通过使编码PFA1的核苷酸序列和/或编码PFA3的核苷酸序列与强启动子(诸如延长因子-1(EF-1)启动子)偶联增加生物体中编码PFA1的核苷酸序列和/或编码PFA3的核苷酸序列的表达水平。
PUFA合酶
本文的实施方案包括经基因修饰以表达PUFA合酶的宿主生物体(例如微藻)。在一些实施方案中，生物体已经基因修饰以表达异源PUFA合酶系统，例如，包含PUFA合酶和至少一个它的辅助蛋白的功能性异源蛋白系统。本文的基因修饰还可用于一些实施方案中以提高内源性表达PUFA合酶的宿主生物体中的PUFA产量。
PUFA合酶系统可包含几种多功能蛋白(且可包含单功能蛋白)，其可一起作用以进行脂肪酸链迭代处理以及非迭代处理，包括在选定的周期中顺反异构和烯酰基还原反应。这些蛋白质在本文中称为核心PUFA合酶系统或核心PUFA合酶。关于这些蛋白中所含结构域和基序的一般信息和细节可见于例如：美国专利号6,140,486和6,566,583；美国专利公开号2002/0194641、2004/0235127和2005/0100995；国际专利申请号WO 2006/135866；和Metz等人(2001)Science 293:290-3。功能性PUFA合酶结构域可作为单个蛋白(例如，结构域和蛋白是同义词)或单个蛋白中的两个或更多个结构域中的一个找到。
具有PUFA合酶活性的酶、其亚基和/或结构域(以及编码它们的多核苷酸和基因)的许多例子在本领域中是已知的，且可组合在包含本文公开的异源PUFA合酶的基因修饰的宿主中。此类PUFA合酶(或其亚基或结构域)包括细菌和非细菌PUFA合酶。非细菌PUFA合酶可以是真核PUFA合酶。某些细菌PUFA合酶描述在例如美国专利公开号2008/0050505中。
在一些实施方案中，异源PUFA合酶包括选自下组的生物活性结构域，该组由以下各项组成：至少一种烯酰基-ACP还原酶(ER)结构域(且在一些实施方案中，两个ER结构域)；多个酰基载体蛋白(ACP)结构域(例如，至少一个至四个或至少五个ACP结构域，且在一些实施方案中上至六个、七个、八个、九个、十个或超过十个ACP结构域)；至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；至少一个酰基转移酶(AT)结构域(除下文所列丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶结构域以外)；至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域；至少两个FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)结构域；至少一个链长因子(CLF)结构域；至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；和不在DH的FabA样DH家族中的至少一个DH结构域。在特定的实施方案中，异源PUFA合酶还包含含有脱水酶保守活性位点基序且通过与Pfam蛋白家族数据库相比鉴定为DH结构域的至少一个区域(Finn等人,Nucleic Acids Res.Database Issue 44:D279-D285(2016))。
在一些实施方案中，异源PUFA合酶包含来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的亚基PFA1(SEQ ID NO:2)、PFA2(SEQ ID NO:4)和PFA3(SEQ ID NO:6)或其功能等效物。参见美国专利号8,940,884。其他破囊壶菌中的PUFA合酶也已经分别命名为ORF 1、ORF 2和ORF 3，或分别命名为OrfA、OrfB和OrfC。参见，例如，美国专利号7,247,461和7,256,022中的裂殖壶菌属物种(ATCC-20888)和破囊壶菌属物种(ATCC-20892)，参考orfA、orfB和orfC基因以及相应的OrfA、OrfB和OrfC蛋白；以及美国专利号7,368,552中的金黄色破囊壶菌(ATCC-34304)，参考ORF A、ORF B和ORF C基因和蛋白。还可参见，WO/2005/097982中的菌株SAM2179，参考ORF 1、ORF 2和ORF 3基因以及蛋白。
例如，根据本文实施方案的异源PUFA合酶系统可包括例如且不限于包含与SEQ IDNO:2；SEQ ID NO:4；和/或SEQ ID NO:6具有至少80％(例如至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；和至少99％)同一性的氨基酸序列的至少一种蛋白。在特定例子中，异源PUFA合酶系统包括含SEQ ID NO:2；SEQID NO:4；和/或SEQ ID NO:6的至少一种蛋白。在特定例子中，异源PUFA合酶系统包括具有选自下组的氨基酸序列的至少一种蛋白，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；和/或SEQ ID NO:6。
一些实施方案包括异源PUFA合酶系统，其包括SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；和/或SEQ ID NO:6的至少一种功能等效物以及至少一种辅助酶。例如，该系统可包括SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；和/或SEQ ID NO:6的变体、部分、片段或衍生物，其中这种系统具有PUFA合酶活性。例如，可以在文献中和本领域中可获得的生物信息数据库中鉴定其他PUFA合酶或其亚基或单个结构域的多肽序列(以及编码它们的基因或多核苷酸)。可以例如用已知PUFA合酶基因或多肽序列，通过BLAST搜索可公开获得的数据库鉴定此类序列。在这种方法中，同一性可基于ClustalW比对方法，其中利用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数以及Gonnet 250系列蛋白权重矩阵。
另外，本文公开的PUFA合酶基因或多肽序列可用于鉴定自然中的其他PUFA合酶同源物。例如，本文公开的每种PUFA合酶核酸可用于分离编码同源蛋白的基因。本领域中熟知利用序列依赖性方案分离同源基因。序列依赖性方案的例子包括例如且不限于：核酸杂交的方法；DNA和RNA扩增的方法，如通过核酸扩增技术(例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和链替代扩增(SDA))的各种用途例示；和文库构建和互补筛选的方法。
在一些实施方案中，异源PUFA合酶包含裂殖壶菌属PUFA合酶结构域(例如ER结构域、ACP结构域、KS结构域、AT结构域、KR结构域、FabA样DH结构域、CLF结构域、MAT结构域、和非FabA样DH结构域)，其中该结构域与来自不同PUFA合酶的一种或多种结构域组合形成具有PUFA合酶活性的完整PUFA合酶。
在一些实施方案中，包含异源PUFA合酶的基因修饰的生物可进一步用另一种PUFA合酶的至少一个结构域或其生物活性片段修饰。在特定的实施方案中，PUFA合酶的任一结构域可由其天然结构修饰而来，以修饰或增强PUFA合酶系统中结构域的功能(例如，修饰通过该系统产生的PUFA类型或其比率，参见美国专利号8,003,772。
核酸分子
如本文所用，“多核苷酸”可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如见于肽核酸(PNA)中)。多核苷酸可含有全长cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻译的5’和3’序列、编码序列以及核酸序列的片段、表位、结构域和变体。多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA以及单链和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子组成，该DNA和RNA可以是单链或双链(或更通常是双链)或者单链和双链区域的混合物。此外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域组成。多核苷酸可以包含核糖核酸(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核酸(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。多核苷酸还可以出于稳定性或其他原因包含一个或多个修饰的碱基或者修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。术语核酸分子仅指分子的一级和二级结构，且不将其限制为任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其见于线性或环状DNA分子(例如限制性片段)、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，本文可以根据仅沿着DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列的常规习惯描述序列。
术语“分离的”核酸分子是指已经从天然环境移出的核酸分子、DNA或RNA。分离的核酸分子的其他例子包括含维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸的核酸分子。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的核酸分子还包括此类合成产生的分子。此外，核酸分子或多核苷酸可包括调节元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
“基因”是指编码多肽的核苷酸的组件(assembly)，且包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还是指表达具体蛋白的核酸片段，包括单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)，以及编码序列之前(5’非编码序列)以及之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指见于自然界的具有其自身调节序列的基因。
在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含与裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695 PFA1(SEQ ID NO:1)、裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695PFA2(SEQ ID NO:3)、裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3(SEQ ID NO:5)、及其组合的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列，其中这些多核苷酸编码包含与通过PUFA合酶合成PUFA相关的一种或多种活性的多肽。
PUFA合酶结构域可通过其与具有完善生化活性的酶或结构域的序列和结构同源性鉴定。保守活性位点基序的存在可以提供结构域可具有酶活性的额外证据。参见，例如美国专利号8.940,884，通过引用将其全文并入本文。PUFA合酶结构域的例子包括：PFA1中的β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域、丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)结构域、酰基载体蛋白(ACP)结构域、酮还原酶(KR)结构域和β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)结构域；PFA2中的KS结构域、链长因子(CLF)结构域、酰基转移酶(AT)结构域和烯酰基-ACP还原酶(ER)结构域；以及PFA3中的DH结构域和ER结构域。
先前已显示，具有β-酮脂酰-ACP合酶(KS)生物活性(功能)的多肽或多肽的结构域能够进行脂肪酸延长反应周期的初始步骤。术语“β-酮脂酰-ACP合酶”可与术语“3-酮脂酰-ACP合酶”、“β-酮脂酰-ACP合酶”和“酮脂酰ACP合酶”互换使用。在其他系统中，已经显示，通过硫酯键将用于延伸的酰基基团连接至半胱氨酸残基的KS活性位点连接，且酰基-KS与丙二酰基-ACP缩合形成-酮脂酰-ACP、CO2和未结合的(“游离”)KS。在此类系统中，已经显示，KS的底物特异性大于反应循环的其他多肽。多肽(或多肽的结构域)可以通过与已知KS序列的同源性容易地鉴定为属于KS家族。
先前已显示，具有丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性的多肽或多肽的结构域能够将丙二酰基部分从丙二酰-CoA转移到ACP。术语“丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶”可与“丙二酰酰基转移酶”互换使用。除活性位点基序(GxSxG)以外，已显示，MAT具有延长的基序(关键位置的R和Q氨基酸)。多肽(或多肽的结构域)可通过其与已知MAT序列的同源性和其延长的基序结构容易地鉴定为属于MAT家族。
先前已显示，具有酰基载体蛋白(ACP)活性的多肽或多肽的结构域能够充当通过硫酯连接至共价结合的辅因子使脂肪酰链生长的载体。ACP通常长约80至约100个氨基酸，且已显示，可通过将CoA的磷酸泛酰巯基乙胺基部分转移至ACP的高度保守的丝氨酸残基从失活的apo形式转化为功能性holo形式。还显示，酰基基团通过硫酯连接附接至ACP的磷酸泛酰巯基乙胺基部分的游离末端。活性位点基序(LGIDS*)的变型的存在也被认为是ACP的标志。活性位点丝氨酸(S*)的功能已经在细菌PUFA合酶中得到证实(Jiang等人,J.Am.Chem.Soc.130:6336-7(2008))。多肽(或多肽的结构域)可以通过用放射性泛酰巯基乙胺标记和通过与已知ACP的序列同源性容易地鉴定为属于ACP家族。
先前已经示出，具有脱水酶或水酶(DH)活性的多肽或多肽的结构域能够催化脱水反应。先前已经证实，PUFA合酶系统的至少两个结构域示出与一些细菌的II型FAS系统相关的FabA DH/异构酶同源(而非与其他PKS系统的DH结构域同源)。参见，例如美国专利号7.217.856，通过引用将其全文并入本文。FabA样酶具有β-羟基酰基-ACP脱水酶生物活性，起初在碳链中产生反式双键。除DH活性以外，FabA样酶还具有顺反异构酶活性(Heath等人,J.Biol.Chem.271:27795(1996))。术语“FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶”可与术语“FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶”、“β-羟基酰基-ACP脱水酶”和“脱水酶”互换使用。基于所证实的FabA样DH/异构酶蛋白的活性，与那些蛋白具有同源性的PUFA合酶系统的结构域可能与在PUFA合酶产物中产生顺式双键有关。多肽或结构域还可具有非FabA样DH活性或非FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)活性。更具体地，先前已经在PUFA合酶DH结构域中鉴定长度约13个氨基酸的保守活性位点基序：LxxHxxxGxxxxP(基序中的L位置也可以是I)。参见，例如美国专利号7,217,856和Donadio S,Katz L.,Gene 111(1):51-60(1992)，其各自的全部内容通过引用并入本文。这个保守基序见于所有已知PUFA合酶序列的类似区域，且可能与非FabA样脱水反应相关。另外，保守基序见于通过与Pfam蛋白家族数据库比较鉴定为DH结构域的区域中(Finn等人,Nucleic Acids Res.Database Issue 44:D279-D285(2016))。
先前已示出，具有β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性的多肽或多肽的结构域能够催化ACP的3-酮脂酰形式的吡啶-核苷酸依赖性还原。术语“β-酮脂酰-ACP还原酶”可与术语“酮还原酶”、“3-酮脂酰-ACP还原酶”和“酮脂酰ACP还原酶”互换使用。已经在其他系统中确定，KR功能涉及从头合成脂肪酸生物合成延长周期中的第一还原步骤。多肽(或多肽的结构域)可以通过与已知PUFA合酶KR的序列同源性容易地鉴定为属于KR家族。
先前已将具有链长因子(CLF)特征的多肽或多肽的结构域定义为具有以下活性或特征中的一者或多者：(1)它已经涉及到测定延长周期的数量以及因此还有II型PUFA合酶系统中最终产物的链长，(2)它与KS具有同源性，但缺少KS活性位点半胱氨酸，和(3)它可与KS异源二聚化。具有CLF的序列特征的结构域见于所有当前鉴定的PUFA合酶系统，且在每种情况下发现为多结构域蛋白的一部分。
先前已将具有酰基转移酶(AT)活性的多肽或多肽的结构域定义为具有以下活性或特征中的一者或多者：(1)它可将脂肪酰基从ACP结构域转移到水(即，硫酯酶)，释放脂肪酰基作为游离脂肪酸，(2)它可将脂肪酰基转移至受体，诸如CoA，(3)它可在各种ACP结构域之间转移酰基基团，或(4)它可将脂肪酰基转移至亲脂性受体分子(例如，转移至溶血磷脂酸(lysophosphadic acid))。多肽(或多肽的结构域)可通过测定与已知AT的序列同源性容易地鉴定为属于AT家族。
先前已示出，烯酰基-ACP还原酶(ER)生物活性的多肽或多肽的结构域能够还原脂肪酰-ACP中反式双键(通过DH活性引入)，导致相关的碳饱和。先前已示出，PUFA合酶系统中的ER结构域与ER酶家族具有同源性(Heath等人,Nature 406:145-146(2000)，通过引用以其全部内容并入本文)，且已示出，ER同源物充当体外烯酰基-ACP还原酶(Bumpus等人J.Am.Chem.Soc.,130:11614-11616(2008)，通过引用以其全部内容并入本文)。术语“烯酰基-ACP还原酶”可与“烯酰基-还原酶”、“烯酰基-ACP-还原酶”和“烯酰基-酰基-ACP还原酶”互换使用。多肽(或多肽的结构域)可通过测定与已知ER的序列同源性容易地鉴定为属于ER家族。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与PFA1(SEQ ID NO:1)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与PFA1(SEQ ID NO:1)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列，该结构域诸如KS结构域(SEQ ID NO:7)、MAT结构域(SEQ ID NO:9)、ACP结构域(诸如SEQ ID NO:13、15、17、19、21或23中任一者)，两个或更多个ACP结构域的组合，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个ACP结构域，包括串联结构域(SEQ ID NO:11及其部分)、KR结构域(SEQ ID NO:25)、DH结构域(SEQ IDNO:27)、及其组合。在一些实施方案中，核酸分子包含PFA1(SEQ ID NO:1)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个多核苷酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与PFA2(SEQ ID NO:3)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与PFA2(SEQ ID NO:3)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列，该结构域诸如KS结构域(SEQ ID NO:29)、CLF结构域(SEQ ID NO:31)、AT结构域(SEQ ID NO:33)、ER结构域(SEQ ID NO:35)、及其组合。在一些实施方案中，核酸分子包含PFA2(SEQ ID NO:3)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个多核苷酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与PFA3(SEQ ID NO:5)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与PFA3(SEQ ID NO:5)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列，该结构域诸如DH结构域(诸如SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:39)、ER结构域(SEQ ID NO:41)、及其组合。在一些实施方案中，核酸分子包含PFA3(SEQID NO:5)内编码一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个多核苷酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多核苷酸序列编码包含选自下组的PUFA合酶活性的多肽，该组由以下各项组成：KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、及其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:3至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多核苷酸序列编码包含选自下组的PUFA合酶活性的多肽，该组由以下各项组成：KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、及其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:5至少80％相同的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多核苷酸序列编码包含选自下组的PUFA合酶活性的多肽，该组由以下各项组成：DH活性、ER活性、及其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码根据SEQ ID NO:2的PFA1的功能等效物的多核苷酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码根据SEQ ID NO:4的PFA2的功能等效物的多核苷酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码根据SEQ ID NO:6的PFA3的功能等效物的多核苷酸序列的核酸分子。
本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的分离的核酸分子，其中该多肽包含与PFA1(SEQ ID NO:2)、PFA2(SEQ ID NO:4)或PFA3(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，其中该多核苷酸编码包含一种或多种PUFA合酶活性的多肽。
本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与本发明PUFA合酶的一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与PFA1(SEQ ID NO:2)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽包含与PFA1(SEQ ID NO:2)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该结构域诸如KS结构域(SEQ ID NO:8)、MAT结构域(SEQ ID NO:10)、ACP结构域(诸如SEQ ID NO:14、16、18、20、22或24中任一者)，两个或更多个ACP结构域的组合，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个ACP结构域，包括串联结构域(SEQ ID NO:12及其部分)、KR结构域(SEQ IDNO:26)、DH结构域(SEQ ID NO:28)、及其组合。在一些实施方案中，多肽包含PFA1(SEQ IDNO:2)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个氨基酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与PFA2(SEQ ID NO:4)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与PFA2(SEQ ID NO:4)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该结构域诸如KS结构域(SEQ ID NO:30)、CLF结构域(SEQ ID NO:32)、AT结构域(SEQ ID NO:34)、ER结构域(SEQ IDNO:36)、及其组合。在一些实施方案中，多肽包含PFA2(SEQ ID NO:4)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个氨基酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与PFA3(SEQ ID NO:6)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与PFA3(SEQ ID NO:6)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该结构域诸如DH结构域(诸如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40)、ER结构域(SEQ ID NO:42)、及其组合。在一些实施方案中，多肽包含PFA3(SEQ ID NO:6)内包含一个或多个PUFA合酶结构域的一个或多个氨基酸序列，包括任何单个结构域的一个或多个拷贝与任何其他单个结构域的一个或多个拷贝的组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列，且其中该多肽包含选自下组的PUFA合酶活性，该组由以下各项组成：KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、及其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，且其中该多肽包含选自下组的PUFA合酶活性，该组由以下各项组成：KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、及其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中该多肽包含与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列，且其中该多肽包含选自下组的PUFA合酶活性，该组由以下各项组成：DH活性、ER活性、及其组合。
在一些实施方案中，核酸分子包含与本文报告的多核苷酸序列至少约80％、85％或90％相同的或与本文报告的多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。如本领域内已知的，术语“百分比同一性”是两个或更多个氨基酸序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列测定。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或多核苷酸序列(根据具体情况)之间的序列关联度，这是由此类序列串之间的匹配性决定。
所谓与本发明的参考多核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的多核苷酸序列的核酸分子，意指核酸分子的多核苷酸序列与参考序列相同，除了多核苷酸序列可以包括至多五个核苷酸差异/参考多核苷酸序列的每100个核苷酸。换句话说，为获得具有与参考多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列的核酸分子，参考序列中至多5％的核苷酸可以缺失或被另一核苷酸取代，或者可以将数量为参考序列中总核苷酸的至多5％的核苷酸插入参考序列。
实际上，任何特定多核苷酸序列或氨基酸序列是否与本发明的多核苷酸序列或氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以常规地利用已知电脑程序测定。可利用序列比对和计算同一性得分确定用于测定查询序列(本发明的序列)与主题序列之间的最佳总体匹配的方法。利用计算机程序AlignX进行比对，该计算机程序AlignX是来自Invitrogen(www.invitrogen.com)的Vector NTI套件10.0包的组件。利用ClustalW比对(Thompson,J.D.等人Nucl.Acids Res.22:4673-4680(1994))进行比对，用于氨基酸和多核苷酸序列比对两种。将默认评分矩阵Blosum62mt2和swgapdnamt分别用于氨基酸和多核苷酸序列比对。对于氨基酸序列，默认空位开放罚分是10，且空位延伸罚分是0.1。对于多核苷酸序列。默认空位开放罚分是15，且空位延伸罚分是6.66。
本发明涉及包含编码包含选自下组的PUFA合酶活性的多肽的多核苷酸序列的分离的核酸分子，该组由以下各项组成：KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、CLF活性、AT活性、ER活性、DH活性、及其组合，其中多核苷酸在严格条件下与上述任何多核苷酸序列的互补序列杂交。
当单链形式的核酸分子可在适合的温度和溶液离子强度条件下退火至另一核酸分子上时，核酸分子可与该另一核酸分子(诸如cDNA、基因组DNA或RNA)杂交。杂交和洗涤条件是众所周知的且得到例证。参见，例如，Sambrook J.和Russell D.2001.Molecularcloning:Alaboratory manual,第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中等相似的片段，如来自远缘生物的同源序列；以及高度相似的片段，如复制来自近源生物的功能酶的基因。杂交后洗涤决定严格条件。一组条件使用一系列洗涤，开始是6X SSC、0.5％SDS，在室温下持续15min，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复，持续30min，再然后用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复两次，持续30min。对于更严格条件，在较高温度下进行洗涤，其中，洗涤与以上那些相同，除了在0.2X SSC、0.5％SDS中最后两次30min洗涤的温度增加至60℃。另一组高严格条件使用最后两次在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。另一组高严格条件通过在0.1X SSC、0.1％SDS、65℃下杂交，并先后用2X SSC、0.1％SDS以及0.1X SSC、0.1％SDS洗涤限定。
本发明涉及包含与上述任何多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列的分离的核酸分子。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的多核苷酸序列的核酸分子通常可以包括启动子和/或与一个或多个编码区可操作结合的其他转录或翻译控制元件。可操作结合是当基因产物(例如多肽)的编码区与一个或多个调节序列以将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制之下的方式结合的时候。如果诱导启动子功能导致编码期望基因产物的mRNA转录，且两个DNA片段之间的连接性质不干扰调节序列表达以指导表达基因产物的能力或干扰转录DNA模板的能力，那么这两个DNA片段(诸如多肽编码区和与之结合的启动子)是“可操作地结合”。因此，如果启动子能够影响多核苷酸序列转录，启动子区域将与编码多肽的多核苷酸序列可操作地结合。启动子可以是只指导DNA在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。通常，编码区位于启动的3’方向。启动子可以整体衍生自天然基因，或由衍生自见于自然界的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同环境或生理条件而表达。导致基因在大多数细胞中在大部分时候表达的启动子称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，尚未完全界定调节序列的确切边界，所以不同长度的DNA片段可具有相同启动子活性。启动子的3’末端通常被转录起始位点结合，并向上游(5’方向)延伸，以包括启动高于背景的可检测水平的转录所必要最少量的碱基或元件。在启动子内将发现转录起始位点(例如通过用核酸酶S1标示(mapping)方便地界定)以及与结合RNA聚合酶相关的蛋白结合结构域(共有序列)。
合适的调节区域包括位于编码区上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)，且影响相关编码区的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核酸区域。调节区域可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。除启动子外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号与多核苷酸可操作地连接，以指导细胞特异性转录。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码区可包括但不限于原核区、mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成DNA分子或RNA分子。如果编码区预期在真核细胞中表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码区的3’方向。
在本发明的某些方面，至少20个碱基、至少30个碱基或至少50个碱基且与本发明的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列可用作PCR引物。通常，在PCR型扩增技术中，引物有不同序列，且彼此不互补。根据期望的测试条件，应设计提供靶核酸的有效和忠实复制的引物序列。PCR引物设计方法在本领域内是常见且熟知的。通常，本发明序列的两个短片段可用于聚合酶链反应(PCR)方案中，以扩增来自DNA或RNA的编码同源基因的较长核酸片段。还可以在克隆的核酸片段文库上进行聚合酶链反应，其中引物序列衍生自本发明核酸片段，且其他引物的序列利用了编码微生物基因的mRNA前体的3’端存在多腺苷酸片。可替代地，第二引物序列可以基于衍生自克隆载体的序列。
此外，可以设计特异性引物，并用于扩增本发明序列的部分或全长。所得扩增产物可以在扩增反应期间直接标记或在扩增反应之后标记，并用作在适当严格条件下分离全长DNA片段的探针。
因此，本发明的核酸分子可用于分离来自相同或其他物种或细菌物种的编码同源蛋白的基因。本领域中熟知利用序列依赖性方案分离同源基因。序列依赖性方案的例子包括但不限于核酸杂交的方法以及DNA和RNA扩增的方法，如通过核酸扩增技术(例如聚合酶链反应,Mullis等人,美国专利号4,683,202；连接酶链反应(LCR)(Tabor,S.等人,Proc.Acad.Sci.USA 82:1074(1985))或链替代扩增(SDA；Walker等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:392(1992))的各种用途例证。
在一些实施方案中，将本发明的分离的核酸分子用于从其他生物体分离同源核酸分子，以鉴定产生类似或改进的PUFA谱的PUFA合酶。在一些实施方案中，将本发明的分离的核酸分子用于从涉及产生大量DHA和/或EPA的其他生物体分离同源核酸分子。
本发明的核酸分子还包含编码框内融合至标记物序列的PUFA合酶、PUFA合酶的结构域或PUFA合酶片段的多核苷酸序列，该标记物序列允许检测本发明的多肽。标记物序列包括本领域的普通技术人员已知的营养缺陷型或显性标记物，诸如ZEO(博莱霉素(zeocin))、NEO(G418)、潮霉素(hygromycin)、亚砷酸盐、HPH、NAT等。
本发明还包括PUFA合酶基因的变体。变体可含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。例子是含有产生沉默取代、添加、或缺失但不改变编码的多肽的特性或活性的改变的多核苷酸序列变体。在某些实施方案中，多核苷酸序列变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。在进一步的实施方案中，可出于各种原因产生多核苷酸序列变体，例如，以优化特定宿主的密码子表达(例如，将破囊壶菌mRNA中的密码子变成其他生物体(诸如大肠杆菌(E.Coli)或酿酒酵母(cerevisiae Saccharomyces)优选的那些)。
本发明中还提供了等位基因变体、直系同源物和/或物种同源物。利用来自本文公开的序列的信息，可使用本领域内已知的程序获得本文所述基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物和/或物种同源物。例如，可以通过从本文提供的序列制造合适的探针或引物，并筛选等位基因变体和/或期望同源物的合适核酸来源分离和鉴定等位基因变体和/或物种同源物。
载体
本发明涉及包含上文所述任何核酸分子或其组合以及转录控制序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，重组核酸分子是重组载体。
本发明涉及制造重组载体的方法，其包括将如本文所述的一个或多个分离的核酸分子插入载体中。
本发明的载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒噬菌体等形式。
本发明的多核苷酸序列可以包括在表达多肽的各种表达载体中的任一种中。此类载体包括染色体、非染色体和合成DNA或RNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；和酵母质粒。然而，可使用本领域普通技术人员已知的任何其他合适的载体。
可以通过各种程序将合适的DNA序列插入载体中。例如，通过传统克隆方法(限制酶克隆)或更现代的分子工程技术(诸如PCR克隆、无缝克隆等)插入DNA序列。此类程序和其他程序都被认为是在本领域技术人员的范围内。
本发明还包括包含上文所述一种或多种多核苷酸序列的重组构建体。构建体包含载体(诸如质粒或病毒载体)，其中已经插入本发明的一种或多种序列，正向或反向。在该实施方案的一个方面，构建体还包含调节序列，包括例如，可操作地结合至该序列的启动子。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。
一些实施方案包括重组载体(例如质粒)，其包含编码PUFA合酶系统的组分的一个或多个异源多核苷酸。重组载体是工程化的(例如人工产生)用作操纵所选择的核酸序列和/或将此类核酸序列引入宿主细胞的工具核酸分子。因此，重组载体可适用于克隆、测序和/或以其他方式操纵其中的多核苷酸，如通过将多核苷酸表达和/或递送到宿主细胞中以形成重组细胞。载体可包含在待克隆或递送的多核苷酸附近天然未发现的核苷酸序列。载体还可包含天然存在于多核苷酸附近或可用于表达多核苷酸的调节核酸序列(例如启动子、非翻译区)。整合的多核苷酸可在染色体启动子控制下，在天然或质粒启动子控制下，或在几个启动子组合控制下。载体可以是RNA或DNA，且可以是原核或真核的。载体可以仍为染色体外元件(例如质粒)或其可整合到重组生物体(例如微生物和植物细胞)的染色体中。整个载体可留在宿主细胞内，或在某些条件下，可以缺失外源DNA(例如非必要质粒序列)，留下编码PUFA合酶系统的组分的一个或多个异源多核苷酸。可将异源多核苷酸的单个或多个拷贝整合到宿主基因组中。本发明的重组载体可包含至少一个选择标记物。
在一个实施方案中，用于本发明的重组载体是表达载体。如本文所用，短语“表达载体”用于指适合生产编码产物(例如感兴趣的蛋白)载体。在该实施方案中，将编码待产生产物(例如，一种或多种PUFA合酶)的核酸序列插入重组载体中以产生重组核酸分子。将编码待产生的蛋白的核酸序列以将核酸序列与载体中的调节序列可操作地连接的方式插入载体中，这些调节序列能够在重组宿主细胞内转录和翻译该核酸序列。
在另一个实施方案中，用于本发明的重组核酸分子的重组载体是靶载体。如本文所用，短语“靶载体”用于指用于将特定核酸分子递送至重组宿主细胞中的载体，其中使用该核酸分子缺失、灭活或替代内源基因或宿主细胞或微生物内基因的一部分(即，用于靶向基因破坏或敲除技术)。这样的载体在本领域中还可称为“敲除”载体。在该实施方案的一个方面，载体的一部分，但更通常的是插入载体的核酸分子(即，插入物)具有与宿主细胞中靶基因(即，靶向缺失或失活的基因)的核酸序列同源的核酸序列。将载体插入物的核酸序列设计为与靶基因相关联，使得靶基因和插入物可经历同源重组，借此缺失、灭活、减弱(即，通过使内源靶基因的至少一部分突变或缺失)或替代内源靶基因。使用此类重组载体，例如以重组基因替代内源裂殖壶菌属基因描述在实施例部分，且破囊壶菌的遗传转化的一般技术详细描述在2003年9月4号公开的美国专利申请公开号20030166207中。用于微藻的遗传转化技术在本领域中是众所周知的。本发明的一个实施方案是本文所述的PUFA合酶基因可用于转化植物或微生物如破囊壶菌，以改善和/或改变(修饰、改变)这些植物或微生物的PUFA合酶生产能力。
宿主细胞
本发明涉及表达上述核酸分子和重组核酸分子中任一者以及其组合的宿主细胞。
如本文所用的术语“表达”是指基因产生生化物质(例如RNA或多肽)的过程。该过程包括细胞内基因功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物以及将此类mRNA翻译为多肽。如果最终期望产物是生物化学物质，则表达包括产生该生物化学物质和任何前体。
为产生一种或多种期望的多不饱和脂肪酸，宿主细胞可以经基因修饰以将如本文公开的一种或多种PUFA合酶或其亚基引入宿主细胞。
当经基因修饰生物体以表达根据本发明的PUFA合酶系统，一些宿主生物体可内源表达要求与PUFA合酶系统结合以产生PUFA的辅助蛋白。然而，可能有必要用编码一种或多种辅助蛋白的核酸分子使一些生物体转化，以便能够或增强该生物体产生PUFA，即使该生物体内源产生同源辅助蛋白。一些异源辅助蛋白与转化的PUFA合酶蛋白操作的效率高于宿主细胞内源辅助蛋白。
辅助蛋白在本文中定义为不视为核心PUFA合酶系统的一部分(即，不是PUFA合酶复合物本身的一部分)，但可能是利用本发明的核心PUFA合酶复合物进行PUFA生产或有效PUFA生产所必须的蛋白。例如，为了产生PUFA，PUFA合酶系统必须与将4’-磷酸泛酰巯基乙胺基部分从辅酶A转移至酰基载体蛋白(ACP)结构域的辅助蛋白一起工作。因此，PUFA合酶系统可视为包括至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)结构域，或者这样的结构域可视为是PUFA合酶系统的辅助结构域或蛋白。PPTase的结构和功能特征已经详细描述在例如美国申请公开号2002/0194641；2004/0235127；和2005/0100995中。
具有4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)生物活性(功能)的结构域或蛋白被描述为将4’-磷酸泛酰巯基乙胺基部分从辅酶A转移至酰基载体蛋白(ACP)的酶。这种转移至ACP的不变丝氨酸驻留将失活apo形式激活成holo形式。在聚酮化合物和脂肪酸合成中，磷酸泛酰巯基乙胺基团与生长的酰基链形成硫酯。PPTase是在脂肪酸合成、聚酮化合物合成和非核糖体肽合成中充分表征的酶家族。已知许多PPTase序列，已经确定晶体结构(例如，Reuter K.,等人,EMBO J.18(23):6823-31(1999))，且突变分析已经鉴定对活性重要的氨基酸残基(Mofid M.R.,等人,Biochemistry 43(14):4128-36(2004))。
先前已经证明识别裂殖壶菌属PUFA合酶ACP结构域为底物的一种异源PPTase是念珠藻属物种(Nostoc sp.)PCC 7120(先前称为鱼腥藻属物种(Anabaena sp.)PCC 7120)的Het I蛋白。Het I存在于念珠藻属基因簇中，已知与长链羟基脂肪酸合成有关，长链羟基脂肪酸是存在于该生物体的异形细胞中的糖脂层的组分(Black and Wolk,J.Bacteriol.176:2282-2292(1994)；Campbell等人,Arch.Microbiol.167:251-258(1997))。Het I有可能激活存在于该簇中的蛋白(Hgl E)的ACP结构域。含Het I的序列和构建体已经描述在例如美国申请公开号2007/0244192中，通过引用以其全部内容并入本文。
先前已经证明识别裂殖壶菌属PUFA合酶ACP结构域的另一异源PPTase是Sfp，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。Sfp已经被很好地表征并且由于其识别多种底物的能力而被广泛使用。基于公布的序列信息(Nakana,等人,Molecular and General Genetics232:313-321(1992))，先前已通过将编码区连同确定的上游和下游侧翼DNA序列克隆到pACYC-184克隆载体中产生Sfp的表达载体。该构建体编码功能性PPTase，如通过其与裂殖壶菌属PUFA合酶在大肠杆菌中共表达的能力证明，在合适条件下，导致DHA在那些细胞中累积(参见美国专利公开号2004/0235127，通过引用以其全部内容并入本文)。
宿主细胞可包括微生物细胞；动物细胞；植物细胞；和昆虫细胞。合适的宿主的代表性例子包括细菌细胞；嗜热或嗜常温细菌；海洋细菌；破囊壶菌；真菌细胞，如酵母；植物细胞；昆虫细胞；和分离的动物细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或已经转染至少一种其他重组核酸分子的细胞。宿主细胞还可以包括已经工程化以表达PUFA合酶的转基因细胞。根据本文的教导内容，选择合适的宿主被认为是在本领域内技术人员的范围内。
宿主细胞包括网粘菌纲的微生物，诸如来自破囊壶菌目的微生物。在本申请中，术语“破囊壶菌目”和“破囊壶菌”可互换使用。在一些实施方案中，宿主细胞是来自破囊壶菌科的任何微生物。本发明的宿主细胞可以是来自包括但不限于以下属的任何微生物：裂殖壶菌属、网粘菌属(Labyrinthuloides)、日本壶菌属(Japonochytrium)和裂殖壶菌属。这些属中的物种包括但不限于：任何裂殖壶菌属物种，包括聚合裂殖壶菌(Schizochytriumaggregatum)、Schizochytrium limacinum、小裂殖壶菌(Schizochytrium minutum)；任何裂殖壶菌属物种(包括先前的吾肯氏壶菌属(Ulkenia)物种，诸如威瑟氏吾肯氏壶菌(U.Visurgensis)、变形吾肯氏壶菌(U.amoeboida)、U.sarkariana、U.profunda、放射吾肯氏壶菌(U.radiata)、U.minuta和吾肯氏壶菌属物种BP-5601)，且包括纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)、金黄色破囊壶菌、粉红破囊壶菌(Thraustochytriumroseum)；和任何日本壶菌属物种。破囊壶菌目菌株包括但不限于：裂殖壶菌属物种(S31)(ATCC 20888)；裂殖壶菌属物种(S8)(ATCC 20889)；裂殖壶菌属物种(LC-RM)(ATCC18915)；裂殖壶菌属物种(SR21)；聚合裂殖壶菌(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209)；Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO 32693)；破囊壶菌属物种(23B)(ATCC20891)；纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)(Schneider)(ATCC24473)；金黄色破囊壶菌(Goldstein)(ATCC 34304)；粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)(Goldstein)(ATCC 28210)；日本壶菌属物种(L1)(ATCC 28207)。基因修饰的合适宿主微生物的其他例子包括但不限于酵母(包括酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis))或其他酵母(诸如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces))或其他真菌(例如丝状真菌，诸如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)等)。细菌细胞还可用作宿主。这包括大肠杆菌(Escherichia coli)，可用于发酵过程。可替代地，可使用诸如乳杆菌属(Lactobacillus)物种或芽孢杆菌属(Bacillus)物种的宿主用作宿主。
植物宿主细胞包括但不限于任何高等植物(包括双子叶植物和单子叶植物)，以及可消耗植物(包括作物植物和用于其油的植物)。此类植物可包括例如：卡诺拉、油籽、大豆、油菜籽、亚麻籽、玉米、红花、向日葵、花生和烟草。其他植物包括已知产生用作药剂、调味剂、营养剂、功能性食品成分、美容活性剂的化合物的那些植物，或经遗传工程改造以生产这些化合物/药剂的植物。因此，可以选择任何植物物种或植物细胞。植物和植物细胞以及由此生长或衍生而来的植物的例子包括但不限于可从卡诺拉获得的植物和植物细胞(芸苔(Brassica rapa L.))；卡诺拉品种NQC02CNX12(ATCC PTA-6011)、NQC02CNX21(ATCC PTA-6644)和NQC02CNX25(ATCC PTA-6012)以及源自卡诺拉品种NQC02CNX12、NQC02CNX21和NQC02CNX25的品种、育种品种和植物部分(分别参见美国专利号7,355,100、7,456,340和7,348,473)；豆科(Fabaceae)植物；大豆属(Glycine)植物；菜豆(Phaseolus vulgaris)；蚕豆(Vicia faba)；豌豆(Pisum sativum)；大豆(Glycine max)；油菜籽(芸苔属物种)；亚麻籽/亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(corn)(Zea mays)；红花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)、巴西胡桃(Betholettia excelsa)；蓖麻子(Riccinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；芫荽(Coriandrum sativum)；棉花(棉属(Gossypium)物种)；落花生(Arachis hypogaea)；荷荷芭(Simmondsia chinensis)；芥菜(芸苔属物种和白芥子(Sinapis alba))；油棕(Elaeis guineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；稻(Oryza sativa)；南瓜(Cucurbita maxima)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(Traeticum aestivum)；和浮萍(浮萍科(Lemnaceae)物种)。来自这些和其他植物的植物系可以产生、选择或优化期望的性状，诸如或与之相关但不限于：种子产量、抗倒伏性、出苗、抗病性或耐性、成熟度、晚季植物完整性、植物高度、抗破碎性、植物易转化性、油含量或油谱。可通过植物育种(诸如系谱育种、轮回选择育种、杂交和回交育种以及诸如标记物辅助育种和耕种的方法)选择植物系。参见，例如，美国专利号7,348,473。
动物细胞包括任何分离的动物细胞。
本发明涉及表达本发明的一种或多种核酸分子或重组核酸分子(包括载体)的宿主细胞。
本发明涉及一种制造重组宿主细胞的方法，其包括将重组载体引入宿主细胞。
宿主细胞可以用本发明的载体进行遗传工程改造(转导或转化或转染)，该载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可使用含有如本文所述多核苷酸序列以及合适启动子或控制序列的载体使合适的宿主转化，以允许表达该多核苷酸序列编码的多肽。宿主细胞的基因修饰还可包括优化基因以获得优选的或优化的宿主密码子使用。
可以在改良为适合激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因的常规营养培养基中培养工程化的宿主细胞。培养条件(诸如温度、pH等)是先前选择进行表达的宿主细胞所使用的那些条件，且对于普通技术人员是清楚的。
在一些实施方案中，宿主细胞是其中天然PUFA合酶系统缺失的破囊壶菌。本发明人已经在裂殖壶菌属中敲除PFA1、PFA2和PFA3(参见美国专利号7,217,856；文中称为OrfA、OrfB和OrfC)。敲除策略依赖已经证实在裂殖壶菌属中发生同源重组(参见美国专利号7,001,772)。可以在敲除构建体的设计中采用几种策略。用于使这三个基因失活的具体策略利用将偶联至微管蛋白启动子(源自pMON50000，参见美国专利号7,001,772)的ZeocinTM抗性基因插入Orf的克隆部分。然后通过粒子轰击，使用含有间断编码区的新构建体使野生型裂殖壶菌属细胞转化(参见美国专利号7,001,772)。将受轰击的细胞分散到含有ZeocinTM和PUFA供应源的板上。然后将在这些板上生长的菌落划线到未补充PUFA的ZeocinTM板上。需要补充PUFA进行生长的那些菌落是通过同源重组使PUFA合酶Orf失活的候选者。在所有三种情况下，通过用代表性裂殖壶菌属PFA合酶基因的全长基因组DNA克隆使细胞转化而挽救敲除证实了这个假设。此外，在某些情况下，已发现，在被拯救的转化体中，ZeocinTM抗性基因已被移除(参见美国专利号7,217,856)，表明引入的功能基因已通过双重同源重组整合到原始位点(即，缺失抗性标记物)。该策略成功的一个关键是给生长培养基补充PUFA。已发现，有效地补充方式是在添加至生长培养基之前通过与部分甲基化的β-环糊精混合隔离PUFA(参见美国专利号7,217,856)。这些实验一起证实了这样的原则，给定本文提供的指南，本领域的技术人员可以使含PUFA合酶的微生物(如裂殖壶菌属)中PUFA合酶基因中的一者或多者失活，并产生PUFA营养缺陷型，然后可用于根据本发明进一步基因修饰(例如，通过引入其他PUFA合酶基因)(例如，以改变重组生物体的脂肪酸谱)。
本发明生物体的基因修饰的一个要素是能够使破囊壶菌基因组直接转化。在上述美国专利号7,001,772中，证实了通过单交叉同源重组使裂殖壶菌属转化和通过双交叉同源重组进行靶向基因置换。如上所述，本发明人已使用这种同源重组技术使裂殖壶菌属中的PUFA合酶系统的PFA1、PFA2和PFA3失活(参见美国专利号7,217,856)。所得突变体取决于给培养基补充PUFA。已经开发且可获得几种转化标记物、高水平表达引入的基因的启动子元件以及递送外源遗传物质的方法。因此，工具在适当位置敲除破囊壶菌和具有类似PUFA合酶系统的其他真核生物中的内源性PUFA合酶基因，并用来自其他生物体的基因替代，诸如来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的基因，如本文所示。
制造重组宿主细胞的方法
本发明涉及一种制造重组宿主细胞的方法，其包括将重组载体引入宿主细胞。
宿主细胞可以用本发明的载体进行遗传工程改造(转导或转化或转染)，该载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可使用含有如本文所述多核苷酸序列以及合适启动子或控制序列的载体使合适的宿主转化，以允许表达该多核苷酸序列编码的多肽。宿主细胞的基因修饰还可包括优化基因以获得优选的或优化的宿主密码子使用。
根据本发明，术语“转染”用于指可将外源核酸分子(即，重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当术语“转化”用于指将核酸分子引入微生物细胞(诸如藻类、细菌和酵母)和植物细胞中时，此术语可与术语“转染”互换使用。在微生物和植物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物获得外源核酸而导致的遗传变化，并且基本上与术语“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化已经获得第二个含义，其可以指例如在它们癌变后培养物中细胞的生长特性的变化。因此，为了避免混淆，术语“转染”优选用于将外源核酸引入动物细胞中，且术语“转染”在本文中将用于通常包括转染动物细胞和转化微生物细胞或植物细胞，其程度使这些术语涉及将外源核酸引入细胞。因此，转染技术包括但不限于转化、粒子轰击、扩散、主动转运、超声波浴、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
本领域的技术人员应当理解，使用重组DNA技术可以通过操纵例如以下项来改善对转染的核酸分子表达的控制：宿主细胞内核酸分子的拷贝数、转录那些核酸分子的效率、翻译所得转录物的效率、以及翻译后修饰的效率。另外，与天然启动子相比，启动子序列可以进行基因工程改造以提高表达水平。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括但不限于将核酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体中、向质粒添加载体稳定序列、取代或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)、取代或修饰翻译控制信号(例如核糖体结合位点、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列)、修饰核酸分子以对应宿主细胞的密码子使用、和缺失使转录物不稳定的序列。
可以在改良为适合激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因的常规营养培养基中培养工程化的宿主细胞。培养条件(诸如温度、pH等)是先前选择进行表达的宿主细胞所使用的那些条件，且对于普通技术人员是清楚的。
根据本发明，基因修饰的微生物或植物包括已经利用重组技术或经典诱变和筛选技术修饰的微生物或植物。如本文所用，导致基因表达减少、基因功能下降或基因产物(即，由基因编码的蛋白)功能下降的基因修饰可称为失活(完全或部分)、缺失、中断、阻断或下调基因。例如，基因中导致由此基因编码的蛋白的功能下降的基因修饰可以是完全缺失该基因(即，该基因不存在，且因此不存在该蛋白)、导致该蛋白不完全翻译或不翻译的基因突变(例如，不表达该蛋白)或降低或废除该蛋白的天然功能的基因突变(例如，表达没有或有下降的酶活性或作用的蛋白)的结果。导致基因表达或功能增加的基因修饰可称为基因的扩增、生产过量、过表达、激活、增强、添加或上调。
根据本发明的微生物或植物的基因修饰优选地影响由该微生物或植物表达的PUFA合酶系统的活性，无论该PUFA合酶系统是内源的和基因修饰的、与引入生物体的重组核酸分子呈内源性(选择修饰或不修饰内源系统)，还是完全由重组技术提供。改变PUFA合酶系统或表达该系统的生物体的PUFA产量谱包括与不存在基因修饰相比(即，与未经修饰的野生型微生物或植物或者至少相对于PUFA合成未经修饰的植物或微生物，即，生物体可具有与PUFA合成无关的其他修饰)，引起宿主微生物或植物的任一种或多种PUFA(或由PUFA合酶系统产生的其他生物活性分子)的产量发生任何可检测或可测量的变化。影响PUFA合酶系统的活性包括与不存在基因修饰相比，引起生物体所表达的PUFA合酶系统的任何可检测或可测量变化或修饰的任何基因修饰。PUFA合酶系统的可检测变化或修饰可包括但不限于：与不存在基因修饰的内源性PUFA合酶系统相比，修饰的PUFA合酶系统中任何一个或多个结构域的表达和/或生物活性的改变或修饰(引入、增加或减少)；将PUFA合酶系统活性(即，生物体在基因修饰之前不含PUFA合酶系统)引入生物体，使得该生物体现在具有可测量/可检测PUFA合酶系统活性，诸如生产PUFA合酶系统的产物；将来自不同于该生物体内源表达的PUFA合酶系统的PUFA合酶系统的功能结构域引入该生物体，使得PUFA合酶系统活性被修饰(例如，将PUFA合酶结构域或蛋白引入内源表达PUFA合酶系统的生物体，诸如破囊壶菌)；PUFA合酶系统所产生的生物活性分子(例如PUFA)的量发生变化(例如，与不存在基因修饰相比，该系统产生更多(量增加)或更少(量减少)给定产物)；PUFA合酶系统所产生的生物活性分子类型发生变化(例如，PUFA类型变化)(例如，该系统产生另外或不同的PUFA、新的或不同的产物、或该系统天然产生的PUFA或其他产物的变体)；和/或PUFA合酶系统所产生的多种生物活性分子的比例发生变化(例如，与不存在基因修饰相比，该系统所产生的一种PUF与另一种PUFA的比例不同，产生完全不同的脂质谱，或与天然构型相比，将各种PUFA放在三酰基甘油的不同位置)。这种基因修饰包括任何类型的基因修饰，且具体包括通过重组技术和/或经典诱变进行的修饰。
应该指出的是，提到增加PUFA合酶系统中功能结构域或蛋白的活性是指包含结构域或蛋白的生物体中的任何基因修饰(或欲引入结构域或蛋白的地方)，这导致结构域或蛋白系统的功能性增加，且可包括结构域或蛋白的更高活性(例如，特异性活性或体内酶活性)、结构域或蛋白系统的抑制和降解减少和结构域或蛋白过表达。例如，可增加基因拷贝数，可通过使用使表达水平高于天然启动子的启动子增加表达水平，或可通过遗传工程改造或经典诱变改变基因，以增加该基因所编码的结构域或蛋白的活性。
相似地，提到降低PUFA合酶系统中功能结构域或蛋白的活性是指包含此结构域或蛋白的生物体中的任何基因修饰(或欲引入结构域或蛋白的地方)，这导致结构域或蛋白系统的功能性降低，且包括结构域或蛋白活性降低、结构域或蛋白的抑制或降解增加和结构域或蛋白的表达减少或消失。例如，本发明结构域或蛋白的作用可通过阻断或减少结构域或蛋白的生产、“敲除”编码该结构域或蛋白的基因或其部分、降低该结构域或蛋白活性、或抑制该结构域或蛋白的活性而降低。阻断或减少结构域或蛋白的生产可包括将编码该结构域或蛋白的基因置于需要在生长培养基中存在诱导化合物的启动子的控制下。通过建立条件，使得培养基的诱导剂耗尽，可关闭编码该结构域或蛋白的基因的表达(及因此蛋白合成)。本发明人已在美国专利号7,217,856证实缺失(敲除)破囊壶菌微生物中靶基因的能力。阻断或降低结构域或蛋白的活性还可以包括利用类似于通过引用并入本文的美国专利号4,743,546中所述的切除技术方法。为使用这种方法，将编码感兴趣的蛋白的基因克隆到特异性基因序列之间，这样允许特异性地控制从基因组切除该基因。可以通过例如改变培养物的培养温度(如美国专利号4,743,546一样)或通过一些其他物理或营养信号来促进切除。
在本发明的一个具体实施方案中，通常产生DHA和DPAn-6的内源破囊壶菌PUFA合酶基因(诸如编码PUFA合酶的裂殖壶菌属基因)通过随机或定点诱变、用来自其他生物体的编码内源PUFA合酶蛋白的基因替代(例如，来自细菌或其他来源)和/或用基因修饰的裂殖壶菌属、破囊壶菌属或其他破囊壶菌PUFA合酶基因替代进行修饰。如本文所讨论的，编码来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的一种或多种PUFA合酶基因的核酸分子的组合将导致产生期望的PUFA或其他生物活性分子。由这些引入的和/或修饰的基因编码的酶的产物可以是例如EPA，或它可以是一些其他相关的分子，包括其他PUFA。该方法的一个特点是利用破囊壶菌PUFA合成的内源组分以及有效产生PUFA和将其并入磷脂(PL)和三酰基甘油(TAG)所必需的累积机制，同时进一步利用来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶例如生产EPA的能力。特别地，本发明的这个实施方案涉及修饰生物体产生的PUFA的类型，同时保持亲本菌株的高油产量。
虽然以下的一些讨论使用生物体裂殖壶菌属作为示例性宿主生物体，但可根据本发明修饰任何破囊壶菌，包括破囊壶菌属、网粘菌属和日本壶菌属的成员。此外，利用美国专利号7,247,461中所列的筛选生物体的方法，可以鉴定可用于本发明方法的其他生物体，且本文涵盖所有此类生物体。此外，PUFA合酶系统可利用本文提供的示例性信息构建，在其他微生物(如细菌或酵母)中产生，并转化至植物细胞中，以产生基因修饰的植物。本文讨论的概念可根据需要应用于各种系统。
上文关于重组核酸分子和宿主细胞转染的一般讨论旨在应用于本文讨论的任何重组核酸分子，包括编码具有来自PUFA合酶系统的至少一个结构域的生物活性的任何氨基酸序列的那些、编码来自其他PUFA合酶系统的氨基酸序列的那些以及编码其他蛋白或结构域的那些。
培养物和分离的生物质
本发明涉及包含本发明的一个或多个分离的重组宿主细胞的培养物。用于接种、生长和回收微生物区系(如微藻和破囊壶菌)的各种发酵参数在本领域是已知的。参见，例如美国专利号5.130.242，通过引用将其全文并入本文。液体或固体培养基可含有天然或人工海水。用于异养生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸钠和甘露醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、多聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白氨基酸、玉米浆、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵。
本发明涉及本发明的重组宿主细胞的分离的生物质。本发明的分离的生物质是通过分离生物质的任何常规方法获得的收获细胞生物质，诸如美国专利号5,130,242以及美国申请公开号2002/0001833中所述，其中每一个通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，在约pH 6.5至约9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下生长约6天至约8天后，从每升培养物分离的生物质的干细胞重量是至少约10g、至少约15g、至少约20g、至少约25g、至少约30g、至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g。在一些实施方案中，在约pH 6.5、约pH 7、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH8.5、约pH 9、或约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃下、在约18℃下、在约19℃下、在约20℃下、在约21℃下、在约22℃下、在约23℃下、在约24℃下、在约25℃下、在约26℃下、在约27℃下、在约28℃下、在约29℃下、或在约30℃下生长约6天、约7天、或约8天后，从每升培养物分离的生物质的干细胞重量是至少约10g、至少约15g、至少约20g、至少约25g、至少约30g、至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g。在一些实施方案中，在约pH 6.5至约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下生长约6天至约8天后，从每升培养物分离的生物质的干细胞重量是约10g至约200g。在一些实施方案中，在约pH6.5、约pH 7、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9、或约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃下、在约18℃下、在约19℃下、在约20℃下、在约21℃下、在约22℃下、在约23℃下、在约24℃下、在约25℃下、在约26℃下、在约27℃下、在约28℃下、在约29℃下、或在约30℃下生长约6天、约7天、或约8天后，从每升培养物分离的生物质的干细胞重量是约10g至约200g、约10g至约100g、约10g至约50g、约15g至约200g、约15g至约100g、约15g至约50g、约20g至约200g、约20g至约100g、约20g至约50g、约50g至约200g、或约50g至约100g。在一些实施方案中，分离的培养物不含聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，在约pH 6.5至约pH 8.5或约pH 6.5至约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下生长约6天、约7天、或约8天后，分离的培养物具有至少约0.2g/L/天、至少约0.3g/L/天、至少约0.4g/L/天、至少约0.5g/L/天、至少约1g/L/天、至少约1.2g/L/天、至少约1.5g/L/天、至少约1.7g/L/天、至少约2g/L/天、至少约3g/L/天、至少约3.5g/L/天、至少约4g/L/天、至少约4.5g/L/天、至少约5g/L/天、至少约6g/L/天、或至少约8g/L/天的ω-3脂肪酸产量。在一些实施方案中，在约pH 6.5至约pH 9.5含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下生长约6天、约7天、或约8天后，分离的培养物具有约0.2g/L/天至约20g/L/天、约0.4g/L/天至约20g/L/天、约0.4g/L/天至约2g/L/天、约1g/L/天至约2g/L/天、约1g/L/天至约20g/L/天、约2g/L/天至约15g/L/天、约2g/L/天至约10g/L/天、约3g/L/天至约10g/L/天、约4g/L/天至约9g/L/天、约4g/L/天至约8g/L/天、约4g/L/天至约7g/L/天、或约4g/L/天至约6g/L/天的ω-3脂肪酸产量。
在一些实施方案中，在约pH 6.5至约pH 8.5或约pH 6.5至约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下生长约6天、约7天、或约8天后，分离的培养物包含至少约0.2g/L/天、至少约0.3g/L/天、至少约0.4g/L/天、至少约0.5g/L/天、至少约0.6g/L/天、至少约0.7g/L/天、至少约0.8g/L/天、至少约0.9g/L/天、至少约1g/L/天、至少约1.2g/L/天、至少约1.5g/L/天、至少约1.7g/L/天、至少约2g/L/天、至少约3g/L/天、至少约4g/L/天、或至少约5g/L/天的EPA产量。在一些实施方案中，在约pH 6.5至约pH 8.5或约pH 6.5至约pH 9.5的含碳源、氮源和营养物以及约950ppm至约8500ppm氯离子的培养基中，在约15℃至约30℃下约6天、约7天、或约8天后，EPA产量是约0.2g/L/天至约5g/L/天、约0.2g/L/天至约4g/L/天、约0.2g/L/天至约3g/L/天、约0.2g/L/天至约2g/L/天、约0.2g/L/天至约1g/L/天、约0.2g/L/天至约0.8g/L/天、约0.2g/L/天至约0.7g/L/天、约1g/L/天至约5g/L/天、约1g/L/天至约4g/L/天、约1g/L/天至约3g/L/天、或约1g/L/天至约2g/L/天。在一些实施方案中，上述任何EPA产量与上述任何ω-3脂肪酸产量相关。在一些实施方案中，培养物还包含约0g/L/天至约5g/L/天、约0g/L/天至约4g/L/天、约0g/L/天至约3g/L/天、约0g/L/天至约2g/L/天、约0g/L/天至约1g/L/天、约0.2g/L/天至约5g/L/天、约0.2g/L/天至约4g/L/天、约0.2g/L/天至约3g/L/天、约0.2g/L/天至约2g/L/天、约0.2g/L/天至约1g/L/天、约1g/L/天至约5g/L/天、约2g/L/天至约5g/L/天、约2g/L/天至约4g/L/天、或约2g/L/天至约3g/L/天的DHA产量。在一些实施方案中，DHA产量少于约5g/L/天、少于约4g/L/天、少于约3g/L/天、少于约2g/L/天、少于约1g/L/天、少于约0.5g/L/天、少于约0.2g/L/天、或约0g/L/天。
在一些实施方案中，发酵体积(培养物体积)是至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10,000升、至少约20,000升、至少约50,000升、至少约100,000升、至少约150,000升、至少约200,000升、或至少约250,000升。在一些实施方案中，发酵体积是约2升至约300,000升、约2升、约10升、约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10,000升、约20,000升、约50,000升、约100,000升、约150,000升、约200,000升、约250,000升、或约300,000升。
在一些实施方案中，本发明涉及包含本发明的脂肪酸谱的分离的生物质。在一些实施方案中，生物质的干细胞重量的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％是脂肪酸。在一些实施方案中，生物质的干细胞重量的超过约20％、超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约55％、或超过约60％是脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质的干细胞重量的约20％至约55％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约30％至约55％、约30％至约70％、约30％至约80％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约55％至约70％、约55％至约80％、约60％至约70％、或约60％至约80％是脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含超过约10％、至少约12％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、或至少约45％的作为EPA的脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约10％至约55％、约12％至约55％、约15％至约55％、约20％至约55％、约20％至约40％、或约20％至约30％的作为EPA的脂肪酸。在一些实施方案中，生物质包含三酰基甘油级分，其中按重量计，三酰基甘油级分的至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、或至少约20％是EPA。在一些实施方案中，生物质包含三酰基甘油级分，其中按重量计，三酰基甘油级分的EPA含量是至少约12％至约55％、约12％至约50％、约12％至约45％、至少约12％至约40％、至少约12％至约35％、或至少约12％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、至少约20％至约40％、至少约20％至约35％、或约20％至约30％。在一些实施方案中，按重量计，生物质的干细胞重量的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、或至少约60％是DHA。在一些实施方案中，按重量计，生物质的干细胞重量的约20％至约60％、约25％至约60％、约25％至约50％、约25％至约45％、约30％至约50％、或约35％至约50％是DHA。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少的作为DHA的脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％、或约3％至约10％的作为DHA的脂肪酸。在一些实施方案中，生物质实质上不含DHA。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约0.1％或少于约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％或少于约5％、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约0.5％至约1.5％、或约1％至约1.5％的作为ARA的脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.4％或更少、约0.3％或更少、约0.2％或更少、或约0.1％或更少的作为ARA的脂肪酸。在一些实施方案中，生物质实质上不含ARA。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约0.4％至约2％、约0.4％至约3％、约0.4％至约4％、约0.4％至约5％、约0.4％或少于约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约0.5％或少于约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、或约1％或少于约5％的作为DPA n-6的脂肪酸。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含约5％或更少、少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.75％或更少、约0.6％或更少、或约0.5％或更少的作为DPA n-6的脂肪酸。在一些实施方案中，生物质基本上不含DPA n-6。在一些实施方案中，按重量计，生物质包含具有约5％或更少、少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、或约2％或更少的油酸(18:1n-9)、亚油酸(18:2n-6)、亚麻酸(18:3n-3)、二十碳烯酸(20:1n-9)、芥酸(22:1n-9)或其组合的脂肪酸。本发明的分离的生物质的特征与分离的生物质的内源性或天然性质相关，而与外源引入的材料无关。在一些实施方案中，分离的生物质不含聚乙烯吡咯烷酮或不是从含聚乙烯吡咯烷酮的培养物分离。
本发明涉及一种生产生物质的方法。在一些实施方案中，生产本发明生物质的方法包括在培养物中使本发明的任一分离的重组宿主细胞或其混合物生长，以产生生物质。本发明涉及由该方法产生的生物质。
微生物油
本发明涉及包含本发明脂肪酸谱的微生物油。本发明的微生物油是包含按重量计至少约35％的三酰基甘油级分的“粗油”或“精炼油”。“粗油”是从重组宿主细胞的生物质中提取而未进一步处理的油。“精炼油”是通过用精炼、漂白和/或除臭的标准加工处理粗油而获得的油。参见，例如美国专利号5,130,242，通过引用以其全部内容并入本文。微生物油还包括如本文所述的“最终油”，其是已用植物油稀释的精炼油。在一些实施方案中，最终油是已用高油酸向日葵油稀释的精炼油。如本文使用的术语“微生物”包括但不限于术语“微藻”、“破囊壶菌”和与本文所述的任何宿主细胞相关的分类学分类。参照本文所述宿主细胞的任何微生物油使用的术语“破囊壶菌目”、“破囊壶菌”、“裂殖壶菌属”、“破囊壶菌属”是基于当前的分类学分类，包括可获得的系统发育信息，且如果在本申请的申请日之后分类学分类发生改变，也并非旨在限制。
在一些实施方案中，如本文所述的脂肪酸可以是脂肪酸酯。在一些实施方案中，脂肪酸酯包括ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸的酯、及其组合。在一些实施方案中，脂肪酸酯是DHA酯、EPA酯、或其组合。在一些实施方案中，将如本文所述的油或其级分酯化产生包含脂肪酸酯的油或其级分。术语“酯”是指用另一取代基替代脂肪酸分子的羧酸基团中的氢。典型的酯是本领域技术人员已知的，Higuchi,T.和V.Stella在Pro-drugs as Novel DeliverySystems,第14卷,A.C.S.Symposium Series,Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编,American Pharmaceutical Association,Pergamon Press,1987以及Protective Groups in Organic Chemistry,McOmie编,Plenum Press,New York,1973中提供相关讨论。酯的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、叔丁基、苄基、硝基苄基、甲氧基苄基、二苯甲基和三氯乙基。在一些实施方案中，酯是羧酸保护酯基、具有芳烷基(例如苄基/苯乙基)的酯、具有低级烯基(例如烯丙基、2-丁烯基)的酯、具有低级烷氧基低级烷基(例如甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基)的酯、具有低级酰氧基低级烷基(例如乙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、1-新戊酰氧基乙基)的酯、具有低级烷氧基羰基低级烷基(例如甲氧基羰基甲基、异丙氧基羰基甲基)的酯、具有羧基低级烷基(例如羧甲基)的酯、具有低级烷氧基羰氧基低级烷基(例如1-(乙氧基羰氧基)乙基、1-(环己氧基羰氧基)乙基)的酯、具有氨基甲酰氧基低级烷基(例如氨基甲酰氧基甲基)的酯等。在一些实施方案中，添加的取代基是直链或环状烃基，例如C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6烯基或C1-C6芳基酯。在一些实施方案中，酯是烷基酯，例如甲酯、乙酯或丙酯。在一些实施方案中，当脂肪酸处于纯化或半纯化状态时，将酯取代基加入游离脂肪酸分子中。可替代地，脂肪酸酯在三酰基甘油转化为酯时形成。
本发明涉及生产微生物油的方法。在一些实施方案中，该方法包括在培养物中生长本发明的任一分离的重组宿主细胞或其混合物，以产生包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施方案中，该方法还包括提取微生物油。在一些实施方案中，该方法包括从本发明的任一生物质或其混合物提取包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施方案中，该方法包括异养生长分离的重组宿主细胞，其中培养物包含如本文所述的碳源。微生物油可以从新收获的生物质提取或可以从储存在防止腐败的条件下的先前收获的生物质提取。可使用已知方法培养本发明的重组宿主细胞，以从培养物分离生物质、从该生物质提取微生物油、以及分析从该生物质提取的油的脂肪酸谱。参见，例如美国专利号5,130,242，通过引用以其全部内容并入本文。本发明涉及由本发明任一方法生产的微生物油。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约0％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、或至少约5％的甾醇酯级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约0％至约1.5％、约0％至约2％、约0％至约5％、约1％至约1.5％、约0.2％至约1.5％、约0.2％至约2％、或约0.2％至约5％的甾醇酯级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.3％或更少、约0.2％或更少、约0.5％或更少、约0.4％或更少、约0.3％或更少、或约0.2％或更少的甾醇酯级分。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％的三酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约35％至约98％、约35％至约90％、约35％至约80％、约35％至约70％、约35％至约70％、约35％至约65％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约55％、约40％至约50％、约65％至约95％、约75％至约95％、约75％至约98％、约80％至约95％、约80％至约98％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％、约95％、约97％、或约98％的三酰基甘油级分。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、或至少约20％的二酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约15％至约40％、约15％至约35％、或约15％至约30％的二酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、或至少约20％的1,2-二酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约0.2％至约45％、约0.2％至约30％、约0.2％至约20％、约0.2％至约10％、约0.2％至约5％、约0.2％至约1％、约0.2％至约0.8％、约0.4％至约45％、约0.4％至约30％、约0.4％至约20％、约0.4％至约10％、约0.4％至约5％、约0.4％至约1％、约0.4％至约0.8％、约0.5％至约1％、约0.5％至约0.8％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、或约15％至约25％的二酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约2.5％、或至少约3％的1,3-二酰基甘油级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、或至少约5％的甾醇级分。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约0.3％至约5％、约0.3％至约2％、约0.3％至约1.5％、约0.5％至约1.5％、约1％至约1.5％、约0.5％至约2％、约0.5％至约5％、约1％至约2％、或约1％至约5％的甾醇级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、或约1％或更少的甾醇级分。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含至少约2％、至少约5％、或至少约8％的磷脂级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含约2％至约25％、约2％至约20％、约2％至约15％、约2％至约10％、约5％至约25％、约5％至约20％、约5％至约20％、约5％至约10％、或约7％至约9％的磷脂级分。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、或少于约8％的磷脂级分。在一些实施方案中，微生物油基本上不含磷脂。在一些实施方案中，按重量计，微生物油包含占油的少于约2％、少于约1.5％、少于约1％、或少于约0.5％的不皂化物。微生物油中存在的脂类(诸如三酰基甘油级分)可通过快速色谱分离，并通过薄层色谱(TLC)分析，或者通过本领域中已知的其他方法分离和分析。
在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、二酰基甘油级分、及其组合的一种或多种级分包含至少约5％、至少约10％、超过约10％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、或至少约45％EPA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、二酰基甘油级分、及其组合的一种或多种级分包含约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、至少约12％至约55％、至少约12％至约50％、至少约12％至约45％、至少约12％至约40％、至少约12％至约35％、或至少约12％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约15％至约25％、约15％至约20％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、或约20％至约30％EPA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、或至少约60％DHA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约5％至约60％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约40％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约60％、约25％至约60％、约25％至约50％、约25％至约45％、约30％至约50％、约35％至约50％、或约30％至约40％DHA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少的DHA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％、或约3％至约10％的脂肪酸作为DHA。在一些实施方案中，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分基本上不含DHA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约0.1％至约5％、约0.1％或少于约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至约5％、约0.2％或少于约5％、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约0.5％至约1.5％、或约1％至约1.5％ARA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约5％或更少、少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.4％或更少、约0.3％或更少、约0.2％或更少、或约0.1％或更少的ARA。在一些实施方案中，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分基本上不含ARA。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约0.4％至约2％、约0.4％至约3％、约0.4％至约4％、约0.4％至约5％、约0.4％或少于约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约0.5％或少于约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、或约1％或少于约5％DPA n-6。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含约5％、少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.75％或更少、约0.6％或更少、或约0.5％或更少的DPA n-6。在一些实施方案中，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分基本上不含DPA n-6。在一些实施方案中，按重量计，微生物油和/或其选自三酰基甘油级分、二酰基甘油级分、甾醇级分、甾醇酯级分、游离脂肪酸级分、磷脂级分、及其组合的一种或多种级分包含脂肪酸，约5％或更少、少于约5％、约4％或更少、约3％或更少、或约2％或更少是油酸(18:1n-9)、亚油酸(18:2n-6)、亚麻酸(18:3n-3)、二十碳烯酸(20:1n-9)、芥酸(22:1n-9)、十八碳四烯酸(18:4n-3)或其组合。
三酰基甘油分子含有3个中心碳原子(C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3)，允许形成不同的位置异构体。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％、或至少约40％的三酰基甘油在三酰基甘油(二取代的DHA)中选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任两个的两个位置处含有DHA，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中约2％至约55％、约2％至约50％、约2％至约45％、约2％至约40％、约2％至约35％、约2％至约30％、约2％至约25％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约20％至约40％、约20％至约35％、或约20％至约25％的三酰基甘油在三酰基甘油中选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任两个的两个位置处含有EPA，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、或至少约2％的三酰基甘油在所有的sn-1、sn-2和sn-3位置含有DHA(三取代的DHA)，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中约0.5％至约5％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约2％、约1％至约5％、约1％至约3％、或约1％至约2％的三酰基甘油在所有的sn-1、sn-2和sn-3位置含有DHA，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、或至少约60％的三酰基甘油在三酰基甘油中选自sn-1、sn-2和sn-3位置中任一个的一个位置处含有DHA，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。在一些实施方案中，微生物油包含三酰基甘油级分，其中该三酰基甘油级分中约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约15％至约80％、约15％至约75％、约15％至约70％、约15％至约65％、约15％至约60％、约35％至约80％、约35％至约75％、约35％至约65％、约35％至约60％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、或约40％至约55％的三酰基甘油在三酰基甘油中选自sn-1、sn-2和sn-3位置中任一个的一个位置处含有DHA，这是基于HPLC色谱图上的相对峰面积百分比。
组合物
本发明涉及包含本发明的重组宿主细胞、本发明的分离的生物质、本发明的微生物油或其组合的组合物。
本发明的重组宿主细胞、生物质或微生物油可以根据组合物的要求，通过任何已知技术进一步进行化学或物理修饰或加工。
重组宿主细胞或生物质可以在用于组合物中之前通过以下方法干燥，包括但不限于冷冻干燥、风干、喷雾干燥、隧式干燥、真空干燥(冻干)和类似方法。可替代地，收获并经洗涤的生物质可直接用于组合物中，无需干燥。参见，例如美国专利号5,130,242和6,812,009，其各自的全部内容通过引用并入本文。
本发明的微生物油可用作起始材料，以更有效地产生富含脂肪酸诸如EPA的产物。例如，本发明的微生物油可接受本领域中已知的各种纯化技术(诸如蒸馏或尿素包合)，以产生具有较高浓度的EPA或另一脂肪酸的较高效产物。本发明的微生物油还可用于化学反应中，以产生从油中的脂肪酸衍生的化合物，诸如EPA或另一脂肪酸的酯和盐。
本发明的组合物可包含一种或多种赋形剂。如本文所用，“赋形剂”是指用于本发明组合物中以赋予该组合物(包括食品以及医药组合物、美容组合物和工业组合物)期望特性的组分或组分混合物。本发明的赋形剂在添加至药物组合物时可表述为“药学上可接受的”赋形剂，意味着赋形剂是化合物、材料、组合物、盐和/或剂型，其在可靠的医疗判断的范围内适合与人类和非人类动物的组织在期望的接触时间内接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题并发症，与合理的效益/风险比相称。在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或用于动物(更特别地用于人)的其他公认的国际药典中列出的。可使用各种赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂可以是但不限于碱性试剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、分离剂、包衣剂、外相组分、控释组分、溶剂、表面活性剂、保湿剂、缓冲剂、填充剂、润肤剂或其组合。除本文讨论的那些以外，赋形剂可包括但不限于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版(2005)中列出的赋形剂。包含本文的特定分类中的赋形剂(例如“溶剂”)旨在说明而不是限制赋形剂的作用。特定赋形剂可落入多个分类中。
本发明的组合物包括但不限于食物产品、药物组合物、化妆品和工业组合物。
在一些实施方案中，组合物是食物产品。食物产品是用于非人类动物或人类消费的任何食物，且包括固体和液体组合物。食物产品可以是动物或人类食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗饮料和营养饮料；功能性食物；补充剂；保健食品；婴儿配方奶粉，包括早产儿配方奶粉；孕妇或哺乳期妇女的食物；成人食物；老年食物；和动物食物。
在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞、生物质或微生物油可直接作为添加剂用于或包含于以下一者或多者中：油、起酥油、涂抹酱、其他脂肪成分、饮料、调味汁、基于乳制品或基于大豆的食物(如牛奶、酸奶、奶酪和冰淇淋)、烘焙食品、营养产品(例如营养补充剂(胶囊或片剂形式))、维生素补充剂、膳食补充剂、粉状饮料、以及成品或半成品粉状食物产品。在一些实施方案中，营养补充剂是素食胶囊的形式，其不由动物来源的任何形成并且不包含动物来源的任何组分。
可包括本发明的微生物油的食物组合物的部分列表包括但不限于基于大豆的产品(牛奶、冰淇淋、酸奶、饮料、乳膏、涂抹酱、增白剂)；汤和汤混合物；面团、面糊和烘焙食品，包括精美的烘焙制品、早餐谷类食物、蛋糕、芝士蛋糕、馅饼、纸杯蛋糕、饼干、条状物、面包、面包卷、小面包、松饼、糕点、烤饼、油炸面包块、咸饼干、甜食、小吃蛋糕、馅饼、格兰诺拉麦片/干棒小吃和烤面包机糕点；糖果；硬糖；巧克力和其他糖果；口香糖；液体食物产品，例如牛奶、能量饮料、婴儿配方奶粉、碳酸饮料、茶、液体膳食、果汁、水果饮料、蔬菜饮料；多种维生素糖浆、代餐、药用食品和糖浆；粉状饮料混合物；意大利面食；加工鱼产品；加工肉产品；加工家禽产品；肉汁和调味汁；调味品(番茄酱、蛋黄酱等)；植物油基涂抹酱；乳制品；酸奶；黄油；冷冻乳制品；冰淇淋；冷冻甜点；冷冻酸奶；半固体食物产品，诸如婴儿食品；布丁和明胶甜点；加工和未加工的奶酪；煎饼混合物；食物棒，包括能量棒；华夫饼混合物；沙拉酱；替代鸡蛋混合物；坚果和坚果涂抹酱；咸味小吃，如马铃薯片和其他薯片(chips或crisps)、玉米片、墨西哥玉米片、挤压膨化食品、爆米花、椒盐脆饼干、油炸土豆片和坚果；和特色小吃，如蘸酱、干果零食、肉类零食、猪皮、健康食物棒和米/玉米饼。
在一些实施方案中，本发明的微生物油可用于补充婴儿配方奶粉。婴儿配方奶粉可以只补充本发明的微生物油或与源自产花生四烯酸(ARA)的微生物的物理精炼油的组合。产ARA的微生物例如是高山被孢霉(Mortierella alpina)或Mortierellasect.schmuckeri。可替代地，婴儿配方奶粉可补充本发明的微生物油与富含ARA的油(包括(Martek Biosciences,Columbia,MD))的组合。
在一些实施方案中，组合物是动物饲料。“动物”包括属于动物界的非人生物，包括但不限于水生动物和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”是指用于非人类动物的任何食物，无论是用于鱼类；商业鱼；观赏鱼；仔鱼；双壳类；软体动物；甲壳类动物；贝类；虾；仔虾；卤虫；轮虫；丰年虾；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；农场动物；动物园动物；运动动物；种畜；竞速动物；展示动物；祖传动物；稀有或濒临灭绝的动物；伴侣动物；宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠或马；灵长类动物，如猴子(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿、赤猴、猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食用动物，如奶牛、家牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；或啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、包括宠物饲料在内的家畜饲料、动物饲料、役用动物饲料、牲畜饲料及其组合。
在一些实施方案中，组合物是肉或产品被人类消费的任何动物的饲料或饲料补充剂，如肉、蛋或奶供人类消费的任何动物。当饲喂此类动物时，诸如LC-PUFA的营养物可被掺入此类动物的肉、奶、蛋或其他产品中，以增加这些营养物的含量。
在一些实施方案中，组合物是喷雾干燥的材料，其可以被粉碎以形成适当大小的颗粒，供浮游动物、卤虫、轮虫和滤食动物消耗。在一些实施方案中，由该组合物饲养的浮游动物、卤虫或轮虫进而喂养仔鱼、鱼、贝类、双壳类或甲壳类动物。
在一些实施方案中，组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括但不限于抗炎组合物、用于治疗冠心病的药物、用于治疗动脉硬化的药物、化学治疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)药、用于治疗神经退行性疾病的药、用于治疗退行性肝病的药、抗生素、降低胆固醇的组合物和降低三酰基甘油的组合物。在一些实施方案中，组合物是医疗食物。医疗食物包括在医生的监督下服用或外部给予的组合物中的食物，其用于病症的特定饮食管理，基于公认的科学原理，通过医学评估，为其建立独特的营养要求。
在一些实施方案中，可将微生物油配制成剂型。剂型可包括但不限于包含有效量的微生物油的片剂、胶囊、扁囊剂、丸粒、丸剂、粉剂和颗粒剂以及肠胃外剂型，其包括但不限于溶液、悬浮液、乳液和干粉的溶液、悬浮液、乳液和干粉。本领域还已知，这些制剂还可含有药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水载体、水溶性载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。给药形式可包括但不限于、片剂、糖衣丸、胶囊、扁囊剂和丸剂，其包含微生物油以及一种或多种合适的药学上可接受的载剂。
对于口服给药，微生物油可以与本领域熟知的药学上可接受的载体组合。此类载体能够将本发明的微生物油配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于待治疗的受试者口服摄取。在一些实施方案中，剂型是片剂、丸剂或扁囊剂。口服使用的药物制剂可以通过添加固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在添加合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心来获得。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，诸如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制剂，诸如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。可口服使用的药物制剂包括但不限于由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。在一些实施方案中，剂型是素食剂型，其中该剂型不是由来自动物来源的任何组分形成，且不含来自动物来源的任何组分。在一些实施方案中，素食剂型是素食胶囊。
在一些实施方案中，组合物是化妆品。化妆品包括但不限于乳液、乳膏、洗剂、面膜、肥皂、洗发剂、洗涤剂、面霜、护发素、化妆品、沐浴剂和分散液。化妆剂可以是药用的或非药用的。
在一些实施方案中，组合物是工业组合物。在一些实施方案中，组合物是用于一种或多种制品的起始材料。制品包括但不限于聚合物；照相感光材料；洗涤剂；工业用油；或工业洗涤剂。例如，美国专利号7,259,006描述了使用含DHA的脂肪和油来生产二十二烷酸和使用二十二烷酸生产照相感光材料。
利用组合物的方法
在一些实施方案中，组合物可用于治疗人或非人动物的病症。在一些实施方案中，组合物可用于在人类或非人类动物的营养。
术语“治疗(treat和treatment)”是指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理病症、疾病或障碍，或获得有益或期望的临床结果。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻或消除与病症、疾病或障碍相关的症状或体征；减少病症、疾病或障碍的程度；稳定病症、疾病或障碍(即，病症、疾病或障碍不会恶化)；延迟病症、疾病或障碍的发作或进展；改善病症、疾病或障碍；缓解病症、疾病或障碍(无论是部分或是全部以及无论是可检测或是不可检测)；或增强或改善病症、疾病或障碍。治疗包括引起临床上显著的反应而没有过多的副作用。治疗也包括与如果不接受治疗的预期存活时间相比延长存活时间。
在一些实施方案中，将组合物用于治疗病症、疾病或障碍，诸如痤疮、急性炎症、年龄相关性黄斑病变、过敏症、阿兹海默症(Alzheimer's)、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、血脂病症、乳腺囊肿、恶病质、癌症、心脏再狭窄、心血管疾病、慢性炎症、冠心病、囊性纤维化、肝脏退行性疾病、糖尿病、湿疹、胃肠道疾病、心脏病、高三酰甘油水平、高血压、多动、免疫性疾病、抑制肿瘤生长、炎症、肠道疾病、肾功能障碍、白血病、严重抑郁、多发性硬化症、神经退行性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、过氧化物酶体病、子痫前期、早产、牛皮癣、肺病、类风湿性关节炎、心脏病或血栓形成的风险。
在一些实施方案中，组合物用于增加妊娠晚期胎儿的妊娠长度。
在一些实施方案中，组合物用于控制血压。
在一些实施方案中，组合物用于改善或维持认知功能。
在一些实施方案中，组合物用于改善或维持记忆。
组合物或剂型可通过与该组合物或剂型相容的任何途径给予受试者体内。如果物质被受试者引入受试者体内，或者如果另一个人、机器或装置将物质引入受试者体内，则认为“给予”了该物质。因此，“给予”包括例如自我给予、通过其他方式给予和间接给予。如本文所用，术语“连续(continuous或consecutive)”就“给予”而言意指给予频率是至少每天一次。然而，注意，给予频率可以大于每天一次并且仍然是“连续的”，例如每天两次或甚至三次，只要不超过本文指定的剂量水平即可。给予的手段和方法在本领域中是已知的，且技术人员可以参考各种药理学参考文献寻求指导。例如，可以查阅"Modern Pharmaceutics,"Banker&Rhodes,Informa Healthcare,USA,第4版(2002)；和"Goodman&Gilman’s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics,"McGraw-Hill Companies,Inc.,New York,第10版(2001)。
所谓“受试者”、“个体”或“患者”是指需要进行诊断、预后、治疗或给予组合物或剂型的任何受试者，无论是人或是非人。哺乳动物受试者包括但不限于人类；家畜；农场动物；动物园动物；运动动物；宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠或马；灵长类动物，如猴子(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿、赤猴、猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食用动物，如奶牛、家牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。术语受试者还包括模型动物，例如疾病模型动物。在一些实施方案中，术语受试者包括经济上或其他方面的有价值的动物，例如经济上重要的种畜、竞速动物、表演动物、祖传动物、稀有或濒危动物或伴侣动物。在某些实施方案中，受试者是人类受试者。在某些实施方案中，受试者是非人类受试者。
组合物可以“营养量”、“治疗有效量”、“预防有效量”、“治疗剂量”或“预防剂量”给予。“营养量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需营养结果的量。营养结果可以是例如受试者中所需脂肪酸组分的水平增加。“治疗有效量”或“治疗剂量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗结果可以是例如减轻症状、延长存活期、改善活动性等。治疗结果不一定是“治愈”。“预防有效量”或“预防剂量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常，由于在疾病之前或疾病的早期在受试者中使用预防剂量，预防有效量将小于治疗该疾病的晚期的治疗有效量。
基于待给予至受试者的微生物、生物质或微生物油的EPA或其他脂肪酸组分的量，可将各种剂量的组合物、剂型或药物组合物给予至受试者。术语“每日剂量”、“每日剂量水平”和“每日剂量”在本文中是指每天(每24小时)给予的EPA或其他脂肪酸组分的总量。因此，例如，以2mg的每日剂量将EPA给予至受试者意指受试者每日接受总量2mg的EPA，无论EPA作为包含2mg EPA的单一剂型，或者可替代地，每个包含0.5mg EPA的四个剂型(总量2mgEPA)给予。在一些实施方案中，每日量的EPA以单一剂型或两个剂型给予。本发明的剂型可以单次施用或多次施用服用。例如，如果每天服用四片，每片含有0.5mg EPA，那么所有四片可以每天服用一次，或者可以每天两次服用两片，或者可以每6小时服用一片。在一些实施方案中，每日剂量是约100mg至约15g EPA。在一些实施方案中，每日剂量是约0.5mg至约250mg、约100mg至约250mg、约100mg至约500mg、约100mg至约1g、约1g至约2.5g、约1g至约5g、约1g至约10g、约1g至约15g、约5g至约10g、约5g至约15g、约10g至约15g、约100mg至约10g、约100mg至约5g、或约100mg至约2.5g EPA、DHA、或其组合。在一些实施方案中，组合物是包含约0.5mg至约250mg,100mg至约250mg、约0.5mg至约500mg、约100mg至约500mg、约0.5mg至约1g、或约100mg至约1g EPA、DHA、或其组合/剂型的剂型。
给予本发明的组合物或剂型可利用各种方案实现。例如，在一些实施方案中，连续几天每天给予，或者可替代地，每隔一天(每两天一次)给予。可以在一天或多天给予。
给予组合物和剂型可以与用于治疗病症的其他方案组合。例如，本发明的方法可以与饮食方案(例如低碳水化合物饮食、高蛋白饮食、高纤维饮食等)、锻炼方案、减肥方案、戒烟方案或其组合相结合。本发明的方法还可以与其他药物产品组合用于治疗病症。本发明的组合物或剂型可以在其他方案或药物产品之前或之后给予。
包含组合物的试剂盒
本发明涉及含有一个或多个单元的本发明组合物的试剂盒或包装。试剂盒或包装可以包含食物产品、药物组合物、化妆品或工业组合物单元，其包含本发明的重组宿主细胞、生物质或微生物油或其组合。试剂盒或包装还可包括含本发明的重组宿主细胞、生物质或微生物油或其组合的添加剂，以制备食物、化妆品、药物组合物或工业组合物。
在一些实施方案中，试剂盒或包装含有一个或多个单元的药物组合物，以根据本发明方法给予。试剂盒或包装可含有一个剂量单位或超过一个剂量单位(即，多个剂量单位)。如果多个剂量单位存在于试剂盒或包装中，多个剂量单位可以任选地安排成按顺序给予。
本发明的试剂盒可任选地含有与试剂盒的单位或剂型相关的说明书。这些说明书可以是由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，其公告反映了该机构批准制造、使用或销售用于给予人类以治疗病症或障碍。说明书可以是任何形式，其传达关于根据本发明的方法使用试剂盒中单元或剂型的信息。例如，说明书可以是印刷品的形式，或者是预先记录的媒体设备的形式。
在检查患者的过程中，医学专业人员可以确定本发明的方法之一的给予适合患者，或者医生可以通过给予本发明的方法之一来确定患者的状况可以得到改善。在开具任何方案之前，医生可以咨询患者例如与该方案相关的各种风险和益处。可以向患者完全披露与该方案相关的所有已知和可疑风险。这种咨询可以口头提供，也可以书面形式提供。在一些实施方案中，医生可以向患者提供关于方案的文献材料，例如产品信息、教育材料等。
本发明涉及教育消费者关于治疗方法的方法，该方法包括在销售点分发具有消费者信息的剂型。在一些实施方案中，将在有药剂师或医疗保健提供者的销售点分发。
术语“消费者信息”可以包括但不限于英语语言文本、非英语语言文本、视觉图像、图表、电话记录、网站以及接入现场客户服务代表的入口。在一些实施方案中，消费者信息将提供根据本发明的方法使用剂型的指导、适用年龄、适应症、禁忌症、适当的剂量、警告、电话号码或网站地址。在一些实施方案中，该方法还包括向能够回答消费者关于使用根据本发明的方法的公开方案的问题的相关人员提供专业信息。术语“专业信息”包括但不限于关于根据本发明的方法给予的方案的信息，其设计目的是使医学专业人员能够回答消费者的问题。
“医疗专业人员”包括例如医生、医生助理、护士、执业护士、药剂师和客户服务代表。
已经一般性地描述了本发明，通过参考本文提供的实施例可以获得进一步的理解。这些实施例仅用于说明的目的，而不具有限制性。
实施例
总协议
除非另有说明，否则后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作是以标准方法进行，如例如Ausubel等人(1995)Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press；等中所披露。
用酶预处理来电穿孔
使细胞在30℃的50mL M50-20培养基(参见美国专利号8,859,855,Weaver等人2014)中生长，在摇床上以200rpm摇动2天。以1:100将细胞稀释到M2B培养基中(参见美国专利号8,859,855,Weaver等人2014)并生长过夜(16-24h)，试图达到对数生长中期(OD600为1.5-2.5)。使细胞在50mL圆锥管中以约3000x g离心5min。移除上清液，并将细胞重新悬浮到1M甘露糖醇(pH 5.5)中，体积适当，以达到2OD600单位的最终浓度。将5mL细胞等分到25mL摇瓶中，并用10mM CaCl2(1.0M原液，过滤灭菌)和0.25mg/mL蛋白酶XIV(10mg/mL原液，过滤灭菌；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)改进。在30℃摇床上培育烧瓶，并以约100rpm摇动4h。在显微镜下监测细胞，以确定原生质体程度，需要单细胞。在圆底试管(即，14mLFalconTMtubes,BD Biosciences,San Jose,CA)中以约2500x g使细胞离心5min。移除上清液，并用5mL冰冷10％甘油轻轻使细胞重新悬浮。在圆底试管中以约2500x g使细胞重新离心5min。移除上清液，并用大口径移液管尖端，用500μL冰冷10％甘油轻轻使细胞重新悬浮。将90μL细胞等分到预冷电比色杯(Gene比色杯-0.1cm间隔或0.2cm间隔，Bio-Rad,Hercules,CA)中。将1μg至5μg of DNA(体积小于或等于10μL)加入比色杯中，用移液管尖端轻轻混合，并放在冰上5min。在200ohms(电阻)、25μF(电容)以及250V(对于0.1cm间隔)或500V(0.2cm间隔)下使细胞电穿孔。立即将0.5mL M50-20培养基加入比色杯。然后将细胞转移到25mL摇瓶中的4.5mL M50-20培养基中，并在30℃下，在摇床上以约100rpm培育2-3h。在圆底试管中以约2500x g使细胞离心5min。移除上清液，并将细胞沉淀重新悬浮到0.5mLM50-20培养基中。经适当选择，将细胞接种到适量(2至5个)M2B板上，并在30℃下培育。
总脂肪酸甲酯(FAME)生产
简而言之，细胞在M2B液体培养基(参见美国专利号8,637,651)中，在30℃和200rpm振荡下生长3天。可替代地，细胞还在M50-20液体培养基中生长1-2天，随后转移2OD单位到50mL新的SSFM液体培养基(参见美国专利号8637651)中，并在带挡板的250mL摇瓶中，在27℃下生长约4天，以200rpm摇动。收获细胞，并用标准技术将脂肪酸转化为甲酯。用气相色谱法联用火焰离子化检测(GC-FID)测定脂肪酸谱为脂肪酸甲酯(FAME)。
实施例1
用来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶基因靶向替代裂殖壶菌属物种 N230D中的天然PUFA合酶基因
裂殖壶菌属物种N230D是裂殖壶菌属物种ATCC 20888的后代，使裂殖壶菌属物种ATCC 20888的细胞接受化学诱变，并分析来自该程序的克隆的期望生长特征，导致鉴定裂殖壶菌属物种N230D。如同裂殖壶菌属物种ATCC20888，裂殖壶菌属物种N230D是单倍体，且没有PUFA生物合成的完整经典途径。它缺失Δ12去饱和酶，且对该途径的其他酶示出极为有限的活性。(参见Metz等人,Plant Physiol.Biochem.47(6):472-478(2009))；Lippmeier等人Lipids.44:621-630(2009))。该生物体的天然PUFA合酶所产生的DHA与二十二碳五烯酸(DPA n-6)的比例与裂殖壶菌属物种ATCC 20888中观察到的类似。
裂殖壶菌属物种ATCC 20888和裂殖壶菌属物种N230D的PFA1、PFA2和PFA3的编码区的核苷酸序列相同。先前已经证实和描述了重组表达PFA1、PFA2和PFA3的载体的产生。参见，例如美国专利号8.940.884，通过引用将其全文并入本文。
通过同源重组，然后用含有被来自PFA3侧翼区的序列围绕的巴龙霉素(paromomycin)抗性标记物的线性载体(质粒pDS97)转化来替代裂殖壶菌属物种N230D中的天然PFA3基因。所产生的突变菌株缺少PFA3基因(B142)。突变菌株是营养缺陷型并且需要补充PUFA用于生长。
将裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3(SEQ ID NO:5)克隆到表达载体pREZ22以产生pREZ324。表达载体含有来自裂殖壶菌属物种ATCC20888的天然PFA3基因座的侧翼区的约2kb DNA。
用用含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3的线性pREZ324使缺少功能PFA3的裂殖壶菌属物种N230D突变体转化。基于侧翼是突变体中巴龙霉素抗性标记物以及侧翼是pREZ324中裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3基因的同源区，发生重组，使得裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3插入天然PFA3基因组。这个突变菌株称为B154。
利用与针对PFA3基因替代所述类似的策略，用来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1和PFA2基因替代裂殖壶菌属突变菌株B154中天然PFA1和PFA2基因。这两个基因的替代受到其头对头排列的促进(参见图1)。用含有被来自PFA1和PFA2下游侧翼区的序列围绕的巴龙霉素抗性标记物的载体(质粒pCX023)使菌株B154转化导致抗性标记物替代PFA1和PFA2基因座。这个营养缺陷型突变菌株被称为B155。用pLP112使菌株B155转化，该pLP112含有与基因间的天然裂殖壶菌属物种ATCC 20888基因间区域和与约2kb裂殖壶菌属物种ATCC 20888 PFA1和PFA2下游侧翼区头对头排列的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695PFA1(SEQ ID NO:1)和裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA2(SEQ ID NO:3)。发生重组，使得裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1插入天然PFA1基因座，且裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695PFA2插入菌株的天然PFA2基因座。所得重组菌株(B156)缺少天然PFA1、PFA2和PFA3编码序列，且含有分别插入PFA1、PFA2和PFA3基因座的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695PFA1、PFA2和PFA3。分别通过天然PFA1/2和PFA3启动子驱动基因。B156恢复了PUFA原养型，并且不含任何抗性标记物。通过PCR和Southern印迹确认所有感兴趣的转基因菌株的基因组结构。图3中提供了该过程的示意图。
如图4A中所示，在25℃下生长后，含其天然PFA1、PFA2和PFA3基因的裂殖壶菌属物种N230D菌株产生0.39％EPA(占所产生的总FAME的％)、8.20％DPAn-6和28.39％DHA。在25℃下培养后，含有替代缺失的天然PFA1、PFA2和PFA3编码区的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1(SEQ ID NO:1)、PFA2(SEQ ID NO:3)和PFA3(SEQ ID NO:5)的重组菌株B156-2产生1.12％EPA、1.78％DPAn-6和28.56％DHA。
在30℃下生长后，还测定了菌株的FAME组成，如图4B中所示。在30℃下培养后，含其天然PFA1、PFA2和PFA3基因的裂殖壶菌属物种N230D菌株产生0.60％EPA(占所产生的总FAME的％)、13.16％DPAn-6和32.34％DHA。在30℃下生长后，含有替代失活的PFA1、PFA2和PFA3基因的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1(SEQ ID NO:1)、PFA2(SEQ ID NO:3)和PFA3(SEQ ID NO:5)的重组菌株B156产生1.17％EPA、3.03％DPA n-6和28.46％DHA。
实施例2
用以随机方式整合进基因组中的来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PUFA合酶 亚基基因替代裂殖壶菌属物种ATCC 20888中的天然PUFA合酶亚基基因
先前已经证明和描述了使裂殖壶菌属物种ATCC 20888中的天然PUFA合酶基因失活以产生PUFA营养缺陷型，和用外源引入的同源基因替代该失活基因以恢复PUFA合成。参见，例如美国专利号7,217,856(通过引用以其全部内容并入本文)以及上文实施例1。
通过同源重组，后用含有位于约2kb PFA1与PFA2下游侧翼DNA之间的ZeocinTM抗性盒的质粒转化敲除裂殖壶菌属物种ATCC 20888中的天然PFA1和PFA2编码区。相似地，通过用含有上游和下游DNA侧翼是天然PFA3的巴龙霉素抗性盒的质粒转化来使PFA3编码区缺失。所得菌株被称为B122-17(裂殖壶菌属物种ATCC 20888ΔPFA1,2,3–还称为ΔorfA,B,C)。B122-17是营养缺陷型，且需要补充PUFA。
同时用含有来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1、PFA2和PFA3的基因Orfs的环形载体pREZ345、pREZ331和pREZ324使裂殖壶菌属菌株B122-17转化(关于载体的细节，参见美国专利号8,940,884、实施例7和9)。简而言之，pREZ345含有裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695 PFA1的序列，其被来自天然PFA1的侧翼区域的约2kb DNA围绕。pREZ331含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA2的序列，其被来自天然PFA2的侧翼区域的约2kb DNA围绕。pREZ324含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3的序列，其被来自天然PFA3的侧翼区域的约2kb DNA围绕。基于在没有PUFA补充的培养基上的生长选择转化体。表明发生了所有三个PUFA合酶亚基基因的功能整合。这种转化中产生的原养型菌株称为B149，并用破折号#标明单个分离物(例如B149-E1或B149-3)。由于用于转化的菌株(B122-17)缺少PFA1/PFA2基因间DNA，PFA1和PFA2基因的同源双交叉事件以外的机制可能解释其整合事件。新引入的PFA3基因可以整合在PFA3基因座(通过同源双交叉重组)或其他地方。此外，使用环形载体可能有利于单交叉事件或异位整合。
在30℃下在M2B培养基中生长后测定所得原养型转化体的脂肪酸谱，且鉴定出几种所得菌株具有增加的EPA产量。如图5中所示，在30℃下培养后，含其天然PFA1、PFA2和PFA3基因的裂殖壶菌属物种ATCC 20888菌株产生0.98％EPA(占所产生的总FAME的％)、13.75％DPA n-6和34.95％DHA。在30℃下培养后，三个重组B149菌株[B149-E1(还称为“B9”)、B149-3和B149-4]产生10.06％与21.06％之间的EPA、0.70％与1.98％之间的DPA n-6和15.01％与20.17％之间的DHA。
通过Southern印迹，用PFA1探针进一步分析改进的EPA菌株，表明其含有多个PFA1基因拷贝(参见图6)。包括来自其中裂殖壶菌属物种ATCC 20888的天然PFA1基因被来自裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695的PFA1基因以靶向方式替代的菌株的DNA样品供参考(即，菌株B145-16和B145-33)。这些菌株具有单拷贝的PFA1基因(参见上文实施例1)。这些结果的光密度计算表明，B149-E1(B9)菌株含有约6个拷贝的PFA1基因，且B149-3菌株含有约5-6个拷贝，且B-149-4含有约4-5个拷贝的PFA1。图6的数据表明，多个拷贝的PFA1基因整合在基因组的一个位点。这示意性地示出在图7中。
实施例3
将额外拷贝的PFA1和/或PFA3基因加入转基因裂殖壶菌属菌株B156-2中
上文实施例1中所述裂殖壶菌属菌株B156-2缺少功能天然PFA1、PFA2和PFA3基因，且含有插入对应PFA1、PFA2和PFA3基因座中的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1、PFA2和PFA3基因。
用携带含有延长因子1(EF1)的天然强启动子和天然orfC基因的终止子的表达盒的环形质粒使这个菌株转化，该延长因子1在PFA1基因或PFA3基因的5’加入阅读框)(参见美国专利8,637,651)。具体地，质粒pTH049含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA3基因，且质粒pTH050含有裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695 PFA1基因。pTH049和pTH050还含有分别用巴龙霉素和博莱霉素选择的抗性标记物。假定这些基因随机整合到基因组中。所得转基因菌株含有一个拷贝的PFA2以及至少2个拷贝的PFA1和/或PFA3基因。
筛选所得转化体(参见图8)显示，与裂殖壶菌属物种菌株N230D或裂殖壶菌属物种菌株B156-2相比，额外拷贝的PFA1(T195)导致EPA产量增加(占总FAME的约2％-3％)。相反，DHA产量不受只有PFA1过表达的影响。
额外拷贝的PFA3(T194)导致EPA略微增加(占总FAME的约1.6％-2.6％)，但DHA显著增加(占总FAME的约35％-41％)。
额外拷贝的PFA1和PFA3(T196)导致EPA和DHA产量都显著增加。EPA产量增加至总FAME的约2.6％-5.6％(相比之下，在菌株N230D和B156-2中是约1.3％-1.5％)，且DHA产量增加至总FAME的约33.5％-44.5％(相比之下，在菌株N230D和B156.2中是约33.0％-35.5％)。此外，根据基因组内的插入位点以及可能插入的拷贝数，转基因裂殖壶菌属菌株间的EPA和DHA含量略微不同。
实施例4
累积不同量的DHA和EPA的裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695和相对ATCC PTA-10208菌株中PUFA合酶亚基基因PFA1、PFA2和PFA3的表达
裂殖壶菌属物种ATCC PTA-9695菌株和相关裂殖壶菌属物种ATCC PTA-10208菌株都含相同拷贝的相同基因PFA1、PFA2和PFA3。然而，尽管如此，它们产生不同量的EPA和DHA。具体地说，以10L规模在“标准”条件下发酵96小时后，裂殖壶菌属物种ATCC PTA-10208含有总FAME的约24％EPA和总FAME的约31％DHA。以10L规模发酵96小时后，裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695含有相同PUFA合酶亚基基因集，DNA含有总FAME的约9％EPA和总FAME的约55％DHA。对在“标准”摇瓶条件下生长的两种菌株进行PFA1、PFA2和PFA3的qPCR分析。结果表明，PFA1和PFA3在菌株PTA-10208中的表达水平高于菌株PTA-9695。参见图9。
实施例5
利用转化用的土壤杆菌属质粒载体，用该领域的标准实践将裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695的PUFA合酶基因和额外拷贝的PFA1和PFA3基因安装在卡诺拉植物中。此外，还连同催化长链多不饱和游离脂肪酸(FFA)转化为酰基-CoA的酰基-CoA合成酶将念珠藻属物种的HetI基因或另一合适的PPTase安装在该植物中。
简而言之，构建含有植物转录单位(PTU)的二元载体，该植物转录单位包含可操作地连接至启动子和3'-UTR的天然或密码子优化的PUFA合酶基因(PFA1、PFA2和PFA3)或感兴趣的其他基因(PPTase和ACS基因)。将不同的启动子和3'-UTR序列的组合并入二元载体中，以驱动PUFA合酶基因和其他基因的表达。用这些不同的调节基因元件并入PTU设计中，以改变转基因的表达水平。以不同方向将PTU放在二元载体内，以测试PTU的方向是否改变转基因的表达水平。根据标准方案将所得构建体转化到根癌土壤杆菌中，并通过限制酶消化和测序确认。
为使卡诺拉转化，首先根据本领域的标准方案使种子发芽。简而言之，在10％Clorox中对感兴趣的卡诺拉种子进行表面灭菌10分钟，并用无菌蒸馏水冲洗三次。将种子种在例如容纳在phytatray中的1/2MS卡诺拉培养基(1/2X Ms，2％蔗糖，0.8％琼脂)中发芽，每个phytatray 25粒种子，并置于Percival Growth ChamberTM中，生长状况设置为25℃，光周期为16小时光照、8小时黑暗；发芽5天。
然后根据本领域的标准方案对发芽的种子进行预处理。简而言之，在第5天，无菌切除长约3mm的下胚轴切段，弃去根和嫩枝部分(在切除过程中，通过将下胚轴切段放在10ml无菌水中防止下胚轴干燥)。在Percival Growth ChamberTM中，将下胚轴切段水平放置在愈伤组织诱导培养基MSK1D1(1X MS，1mg/L激动素，1mg/L 2,4-D，3％蔗糖，0.7％)上的无菌滤纸上预处理3天，生长状况设置为22℃-23℃，且光周期为16小时光照，8小时黑暗。
然后开始与含有指示构建体的土壤杆菌属共培养。处理土壤杆菌属的前一天，接种含有适当抗生素的YEP培养基的烧瓶。将下胚轴切段从滤纸转移到含有10mL液体M培养基的100x 25mm空培养皿，防止下胚轴切段干燥。在这个阶段，用刮刀铲起切段并转移。用移液管移除液体M培养基，并将40mL土壤杆菌属悬浮液加入培养皿(500个切段加40mL土壤杆菌属溶液)。定期旋转培养皿处理切段30分钟，使得下胚轴可保持浸没在土壤杆菌属溶液中。
在处理期结束时，将土壤杆菌属溶液移到废水烧杯中，高压消毒并弃去(完全移除土壤杆菌属溶液以防止土壤杆菌属过度生长)。用镊子将经处理的下胚轴移回含MSK1D1和滤纸的板上(注意确保切段不干燥)。将下胚轴切段连同对照切段返回光强度减弱的Percival Growth ChamberTM(通过用铝箔覆盖板)，并使经处理的下胚轴与土壤杆菌属共培养3天。
在共培养3天后，使用选择培养基诱导形成愈伤组织。用镊子将下胚轴切段单个转移至愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(1X MS，1mg/L激动素，1mg/L 2,4-D，0.5gm/L MES，5mg/L AgNo3，300mg/L200mg/L CarbenicillinTM，1mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％)。将下胚轴切段锚定在培养基上，但不埋在培养基中。
在愈伤组织诱导培养基上7天后，将形成愈伤组织的下胚轴切段转移到具有选择MSB3Z1H1的嫩枝再生培养基1(1X MS，3mg/L BAP，1mg/L玉米素，0.5gm/L MES，5mg/L AgN<3/4，300mg/L200mg/L CarbenicillinTM，1mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％)。14天后，将带有嫩枝的下胚轴转移到具有增加选择MSB3Z1H3的再生培养基2(IX MS，3mg/L BAP，1mg/L玉米素，0.5gm/L MES，5mg/L AgN03，300mg/L200mg/L CarbenicillinTM，3mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％)。
14天后，将具有嫩枝的切段转移至嫩枝伸长培养基MSMESH5(1X MS，300mg/L5mg L HerbiaceTM，2％蔗糖，0.7％TC AgarTM)。分离已经伸长的嫩枝，并转移到MSMESH5。14天后，将在第一轮伸长的剩余嫩枝放在MSMESH5上，并转移到组成相同的新选择培养基。在这个阶段，弃去所有剩下的下胚轴切段。分离在MSB3Z1H3培养基上2周后伸长的嫩枝，并转移到MSMESH5培养基。分离第一轮在MSMESH5上伸长的剩余嫩枝，并转移至组成相同的新选择培养基。在这个阶段，弃去所有剩下的下胚轴切段。
又14天后，将嫩枝转移到MSMEST培养基(IX MS，0.5g/L MES，300mg/L2％蔗糖，0.7％TC AgarTM)以诱导根。第二或第三循环将第一次转移到MSMEST培养基上未生根的嫩枝转移到MSMEST培养基上，直到获得有根的植物。
嫩枝在MSMESH5培养基上培养至少14天后分离PCR用样品。通过PCR测试来自绿色嫩枝的叶组织的选择标记物基因的存在。弃去所有萎黄的嫩枝，且不接受PCR测定。保留对PCR反应呈阳性的样品，并将嫩枝留在MSMEST培养基上伸长和发育出根。弃去根据PCR测定为阴性的嫩枝。将在MSMESH5或MSMEST上生根且呈PCR阳性的植物移植到土壤中。硬化后，进一步分析转基因卡诺拉植物的含有所有转基因PTU盒的事件，并将这些植物转移到温室，生长至成熟，并收获Ti种子进行脂肪酸组成分析。还通过定量PCR分析转基因存在和拷贝数，并通过免疫印迹分析来分析蛋白量。
在卡诺拉种子中检测LC-PUFA产量，特别是EPA和DHA。额外拷贝的PFA1和PFA3和/或促进相对于PFA2增加PFA1和PFA3表达的调节序列的存在导致累积更多EPA。
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应当理解，上述每个元件，或者两个或更多个元件一起也可以有效应用在与上述类型不同的其他类型的方法中。在没有进一步分析的情况下，前述内容将如此充分地揭示本公开文本的要点，其他人可以通过应用当前知识，容易地将其改编以用于各种应用而不会遗漏(从现有技术的观点来看)公正地构成所附权利要求书中阐述的本公开内容的一般或具体方面的基本特征的特征。前述实施方案只是为了举例而提供；本公开文本的范围仅受以下权利要求书的限制。
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司（DSM IP ASSETS B.V.）
<120> 增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法
<130> 32068-US-PSP
<140> 待转让
<141> 与此
<160> 42
<170> PatentIn 3.3版
<210> 1
<211> 7824
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 1
atggatactc gcatcgcgat cgtggggatg tcggcgatcc tgccgagcgg ggagaacgtg 60
cgcgagagct gggaggcgat ccgcgatggg ctggattgcc tgagcgatct gccggcggac 120
cgcgtggacg tgacggccta ctacaacccg gagaagacga ccaaggacaa gatctactgc 180
aagcgcggcg ggttcatccc ggagtacgac ttcgacgcgc gtgagttcgg gctcaacatg 240
ttccagatgg aggactcgga cgccaaccag acgatctcgc tgctcaaggt gaaggaggcg 300
ctgacggacg ccaacatccc ggcgttctcg agcggtaaga agaacatcgg ctgcgtgctg 360
ggcatcggcg gcggccagaa ggcgagccac gagttctact cgcggctcaa ctacgtggtc 420
gtggacaagg tgctgcgcaa gatgggcctg ccggaggaag acgtggcggc ggcggtggac 480
aagtacaagg cgagtttccc cgagtggcgc ctcgactctt tccccgggtt cctgggcaac 540
gtcacggcgg ggcgctgctg caataccttc aacatggagg gcatgaactg cgtcgtggac 600
gcggcctgcg cgtcgtcgct gatcgcggtc aaagtggcga tcgaggagct gctctacggc 660
gactgcgatg cgatgatcgc gggtgccacc tgcacggaca actcgatcgg gatgtacatg 720
gccttctcca agacgcccgt gttttccacg gacccgagcg tcaaggcgta cgacgccgcc 780
accaaaggca tgctcatcgg cgagggctcg gcgatgctcg tgctgaagcg ctacgcggac 840
gccgtgcgcg acggcgacac cgtgcacgcc gtcatcaagg ggtgcgcgtc ctcgagcgac 900
ggcaaggcgg cgggcatcta cacgccgaca atctcgggcc aggaggaggc cctgcgccgc 960
gcctacgccc gcgccaatgt cgacccggcc actgtgacgc tggtggaggg ccacggcacg 1020
ggtacgccgg tgggcgacaa gatcgagctg acggcgctga gcaacctctt ctccaaggcg 1080
ttttctgcca acggtggcgg cgcggaggaa gcagagcagg tggcggtggg cagcatcaag 1140
tcgcagatcg ggcacctcaa ggcggtggcc gggctggccg ggctggtcaa ggtggtgctg 1200
gcgctcaagc acaagacgct gccgcagacg atcaacgtcg acaagccgcc gtcgctggtg 1260
gacgggaccc cgatccagca gtcgccgctg tacgtcaaca cgatgaaccg cccctggttc 1320
acgcccgtag gggtgccgcg ccgcgccggc gtgtcgtcgt ttgggtttgg cggtgccaac 1380
taccacgccg tgctggagga gtttgagccc gagcacgaga gcgcgtaccg gtacaacaac 1440
ctgccgcagg tggcgctgct gcacgcgggg gacgtcgcga ccttggcggc gacggttcgc 1500
gccaagctgg cgctggccac cgccgagcag gaagaggcgc gtgtggtgaa gaacgcggac 1560
tacatcgcgt accaccggtt cctggacgag tgcaagttgc gcggcgctgt gccgcaggcg 1620
cacgcgcggg tgggactgct cgtacgggac ctgagctcgc tcatcgccgt gctcgaggcc 1680
gctgccgcca agctcgcggg cgaagagagc gcgacggagt ggacggtcag cgttgctacg 1740
ggcgaggcgg ccttccgcgt gcgcggtgtg gctacggagg ccaacgtggc ggcgctgttc 1800
tcgggccagg gcgcgcagta cacgcacatg ttcagcgacg tggcgatgaa ctggcccccg 1860
ttccgcgaga gcgtcgccgc catggaccgc gcccagcgcg agcgcttcgg gcggcctgcc 1920
aagcgcgtga gcagcgtgct gtacccgcgc aagccgtacg gcgacgaacc gcggcaggac 1980
cacaaggaga tctcgcaaac gcgctactcg cagcccgcaa cgctcgcgtg ctcggtcggc 2040
gcctttgaca tcttcaaagc ggcgggactg gcgccgagct ttgcggcggg ccactcgctg 2100
ggcgagtttg cggcgctcta cgcggccggg tcgctcgatc gcgacgccgt cttcgacctg 2160
gtctgcgcgc gcgccaaggc catgagcgac ttcacggccc aggccagcag cagcggtggc 2220
gccatggcgg ccgtgattgg cgccaaggcg gaccagctct cgctgggtgg cgcgcccgac 2280
gtgtggctcg ccaacagcaa ctcgccctcg cagaccgtga tcacgggaac cgccgaagca 2340
gtggctgcgg cctctgacaa gttgcgctgc agcggcaact tccgcgtcgt gcctctggcc 2400
tgcgaggcgg ccttccactc gccgcacatg cgcggcgcgg agcagacgtt tgcgtcggcg 2460
ctcgcgcagg cgcccgtgtc ggcaccggcg gctgctcggt tctactctaa cgtgacgggg 2520
ggcgccgcgg taacctcgcc cgcggacgtc aaaacgaacc tgggcaagca catgacgagc 2580
cctgtgcagt tcgtgcagca ggtgcgagcc atgcacgcgg cgggcgcgcg tgtgtttgtg 2640
gagtttgggc ccaagcaggt cctgtcgcgc ctcgtcaagg agacccttgg cgaggccggc 2700
gacgtggtca cggtcgccgt caacccagac tcggccaagg acagcgacac gcagctgcgc 2760
caggcggcgc tcacgttggc ggtcgccggc gtgccgctca aggactttga ccgctggcag 2820
ctgccggatg ccacgcgcct cgagcctgtc aagaagaaga agaccacgtt gcggctctcg 2880
gcagccacct acgtctccgc caagacgttg cgccagcgcg aggccgtgct caacgacggc 2940
tacactgtca gtggtgccac ggcggtagtc aaggaagtgg acacggccaa cgaggagcgt 3000
ctcgtccgcc aagcccagga tctccagcgc cagctcgcgg aggcctcgac ggcagcccag 3060
gcggcgcagt ccaaggtcgc ggagctcgag cgcacgatcc aggacttgga gcgcaaggtg 3120
cagcagcagc agcaagagaa gggtgagaac tcagacagca acgctgccgc cgaagtgctg 3180
cggcgccaca aggagctgct ccagcgcatg ctgcaggact gtgacgagca ggcagtgccc 3240
gtagccacgg tggttccgac acctacgtcc tccccgacgc ctacatcctc acccgtatcc 3300
ggcaacagca agagcactcg tggcagtgct gatctgcaag cgctgctggc caaggcggag 3360
actgtggtga tggctgtgct ggctgccaag actggctacg aggccgacat ggttgaggcg 3420
gacatggacc tggaggccga gctcggcatc gactcgatca agcgcgtgga gatcctttcc 3480
gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc 3540
acggtcggtg aggttgtgga cgccatgaag gcggagatcg tggctgcctc tggtggtagt 3600
gctcctgcgg ttccttcggc gcccgctgct tctgcagctc cgactcccgc tgcttcgact 3660
gcgccttctg ctgatctgca agcgctgctg tccaaggcgg agactgtggt gatggctgtg 3720
ctggcggcca agactggcta cgaggccgac atggtcgagg cggacatgga cctggaggcc 3780
gagctcggca tcgactcgat caagcgcgtg gagatcctct cggaggtgca gggccagctg 3840
ggcgtcgagg ccaaggacgt ggatgcgctg agccgcacgc gcacggtcgg tgaggttgtg 3900
gatgccatga aggcggaaat cgtggctgcc tctgctggta gtgctcctgc tcctgctgtt 3960
ccttcggcgc ccgctgcttc tgcagctccg actcccgctg cttcgactgc gccttctgct 4020
gatctgcaag cgctgctgtc caaggcggag acggtggtga tggctgtgct ggcggccaag 4080
actggctacg aggccgacat ggtcgaggcg gacatggacc tggaggccga gctcggcatc 4140
gactcgatca agcgcgtgga gatcctctcg gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc 4200
aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc acggtcggtg aggttgtgga tgccatgaag 4260
gcggaaatcg tggctgcctc tggtggtagt gctcctgctc ctgcggttcc ttcggcgccc 4320
gctgcttctg cagctccgac tcccgcggct gcgacagcgc cttctgctga tctgcaagcg 4380
ctgctggcca aggcggagac tgtggtgatg gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag 4440
gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag 4500
cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat 4560
gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgag gttgtggatg ccatgaaggc ggagatcgtg 4620
gctgcctctg ctggtagtgc tcctgctcct gctgttcctt cggcgcccgc tgcttctgca 4680
gctccgactc ccgctgcttc gactgcgcct tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag 4740
gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc 4800
gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc 4860
ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc 4920
acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctggt 4980
ggtagtgctc ctgctgctgc tgttccttcg gcgcccgctg cttctgcagc tccgactcct 5040
gcgactgcgc cttctgctga tctgcaagcg ctgctgtcca aggcggagac tgtggtgatg 5100
gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg 5160
gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc 5220
cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgaa 5280
gtggtggacg ccatgaaggc ggagatcgtg gctgcctctg gtggtagtgc tcctgctgct 5340
ccttcggcgc ccgcgcttct tccaacgctg tttggttccg agtgcgagga cctgtctctg 5400
acctttcccg tgataacgac cctgccgctt cctgcagagc ttgtgctggc cgagggcggc 5460
gctcgccctg tagtcgtggt ggatgatgga tctgcactca cctcgtcgct ggtgtcctcg 5520
ctcggcgatc gtgcggtgct gctgcaggtg cagtcttcct ctgcctgctc gccgcgctcg 5580
accacgcaca agttggtgac cgtagcagac cgctctgaag cggcgctaca ggcggcgctc 5640
acgtccgtcg aggcgcagtt cggcaaggtg ggtggctttg tgttccagtt cggcgacgac 5700
gacgtgcaag cgcagctcgg ctgggcgctg ctcgcggcca agcacctcaa aacttcgctg 5760
tcagaacaga tcgagggcgg tcgcaccttt ttcgtggccg tcgcgcggct cgacggccag 5820
ctggggctct ccggcaagtc gacgaccgct accgttgatc tctcccgcgc gcagcagggc 5880
agcgtgttcg gcctgtgcaa gacactcgac ctggagtggc ccgctgtctt ctgccgcgga 5940
atcgacctgg ccgccgacct cgacgccgca caggccgcgc ggtgcctgct gggcgagctg 6000
tcagaccccg acgtggccgt gcgcgagtct ggttactccg cctcgggcca gcgctgcacg 6060
acaactacga agtcgctgac tacgggcaag ccgcaccagc cgatctcctc gtcggacctc 6120
tttctggtgt cgggcggcgc gcgcggcatc accccgctgt gcgtgcgcga gctggcgcag 6180
cgcgtgggcg gcggcacgta cgtgctcatc ggccgctcgg agctgcccac gacggagcct 6240
gcctgggcgg tcggcgtgga gtctggcaag ccgctggaga aggccgcgct ggcgttcctg 6300
aaggcggagt ttgcagcggg ccgcggggcc aagccgacgc cgatgctgca caagaagctc 6360
gtgggcgccg tggtcggagc gcgcgaggtg cgagcctcgc tcgccgagat cactgcacag 6420
ggcgccacgg ctgtgtacga gtcgtgcgac gtgagctctg ccgccaaggt gcgtgagatg 6480
gtagagcgcg tgcagcagca gggcgggcgg cgcgtgtcgg gcgtgttcca cgcgtcgggc 6540
gtgctgcgcg acaagctcgt ggagaacaag tcgctggcgg acttcagcgc cgtgtacgac 6600
accaaggtgg gcggcctcat caacctgctg gcctgcgtgg acctggcgca gctgcgtcac 6660
ctcgtgctct tcagctcgct cgcgggcttc cacggcaacg tcgggcagtc ggactacgca 6720
atggccaacg aggcgctcaa caagctggcg gcgcacctgt cggcggtgca cccgcagctg 6780
tgcgcgcgct cgatctgctt cggaccgtgg gacggcggca tggtgacccc cgcgctcaag 6840
gccaacttca tccgcatggg catccagatc atcccgcgcc aaggcggcgc gcagaccgtc 6900
gccaacatgc tcgtcagtag ctcccccggt cagctgctcg tgggcaactg gggcgtgcca 6960
cccgtcgtgc cgagtgccac cgagcacacc gtgctgcaga cgctccgcca gagcgacaac 7020
cccttcctcg actcgcacgt gatccagggc cgccgcgtgc tgcccatgac cctggccgtg 7080
ggctacatgg cgcaccaggc gcagagcatc tacgcgggcc accagctgtg ggccgtcgag 7140
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gtgctgctca aatcgcaggt caacggcaag tcggtgcccg cgtacaaggc gaccgtcgtg 7320
ctgtcccctg cgccgcgccc cagcgtcatc acgcgtgact tcgacctcac cccggacccg 7380
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ggcatcgagc aggtgctctc ggcgacgccc aagcagctca ccgccaagtg ccgcaatttg 7500
cccctcacgc ccgagcagcg cggccagttc gtcgttaacc tcagccagca ggacccgttc 7560
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accgtggcga tgcacgatga gcaaggtgag gtgtactttt ctgctcgtgc cagcgtcgtc 7800
ctcaacaaga ccctcacgta ctaa 7824
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<211> 2607
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 2
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Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Tyr
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Phe Ile Pro Glu Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met
65 70 75 80
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100 105 110
Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ala
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Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Glu Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Asp
145 150 155 160
Lys Tyr Lys Ala Ser Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly
165 170 175
Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Cys Asn Thr Phe Asn Met
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Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile
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Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met
225 230 235 240
Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Lys Ala
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Tyr Asp Ala Ala Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met
260 265 270
Leu Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Thr Val
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His Ala Val Ile Lys Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala
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325 330 335
Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Lys Ile Glu Leu Thr Ala
340 345 350
Leu Ser Asn Leu Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ala
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370 375 380
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515 520 525
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Gly Leu Leu Val Arg Asp Leu Ser Ser Leu Ile Ala Val Leu Glu Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gly Glu Glu Ser Ala Thr Glu Trp Thr Val
565 570 575
Ser Val Ala Thr Gly Glu Ala Ala Phe Arg Val Arg Gly Val Ala Thr
580 585 590
Glu Ala Asn Val Ala Ala Leu Phe Ser Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr
595 600 605
His Met Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Glu Ser
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Val Ala Ala Met Asp Arg Ala Gln Arg Glu Arg Phe Gly Arg Pro Ala
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Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Ser Leu Asp Arg Asp Ala Val Phe Asp Leu
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Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala Met Ser Asp Phe Thr Ala Gln Ala Ser
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Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val
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Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro
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Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu
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Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val
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Thr Ser Ser Leu Val Ser Ser Leu Gly Asp Arg Ala Val Leu Leu
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Gly Gln Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Thr Thr Ala Thr Val Asp
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Leu Ser Arg Ala Gln Gln Gly Ser Val Phe Gly Leu Cys Lys Thr
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Leu Asp Leu Glu Trp Pro Ala Val Phe Cys Arg Gly Ile Asp Leu
1970 1975 1980
Ala Ala Asp Leu Asp Ala Ala Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Gly
1985 1990 1995
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Met His Asp Glu Gln Gly Glu Val Tyr Phe Ser Ala Arg Ala Ser
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Val Val Leu Asn Lys Thr Leu Thr Tyr
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<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 3
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gacaccttct gcaacgatcg ctacggctgc gtcgatgcca gcgtcgacaa cgagcacgac 240
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gaccgcgtcg cgttcatgta cggcgagggc cgcagcccct actacggcgt cgggctcgac 3180
ctgcaccgcc tgtggccggc tttgcacgag cgcatcaacg acaagaccgc ggcgctgtgg 3240
gagaacggcg actcgtggct catgccgcgc gcggtggatg ccgactcgca gcgcgccgtg 3300
cagacggcct ttgacgcgga ccagatcgag atgttccgca cgggcatctt cgtgtccatc 3360
tgcctcaccg actacgcgcg cgacgtgctc ggggtgcagc ccaaggcgtg cttcggcctc 3420
agcctcggcg agatctccat gctctttgcg ctgtcgcgac gcaactgcgg cctgtcggac 3480
cagctcacgc agcgcctacg cacctcgccg gtgtggtcga cacagctggc ggtggagttc 3540
caggccttgc gcaagctatg gaacgtgccg gcggacgccc ccgtggagtc cttctggcag 3600
ggctacttgg ttcgcgccag ccgcgccgaa atcgagaagg cgatcgggcc cgacaaccgc 3660
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gagattttgg agattccgga cagccccgtc aagatgtaca cctcggtcac caacgccgag 3900
ctgcgcgggg gcagcaacag cagcatcacc gagttcgtgc agaagttgta cacgcgcatc 3960
gccgactttc cgggcatcgt cgacaaggtc agccgtgacg gccacgatgt cttcgtcgag 4020
gtggggccga acaacatgcg ctccgccgcg gtcagtgaca ttcttggcaa ggctgccacc 4080
ccgcatgtct ccgtggcgct ggaccgcccc agtgagtcgg cgtggacgca gaccctcaag 4140
tcgctggcgc tgctgaccgc ccaccgcgtg cccctgcaca acccgactct gtttgcggac 4200
ctgtaccacc ccacgttcct gacggctatc gactctgcga tgcaggagcc cccgcccaag 4260
cccaaccgct tccttcgcag cgtagaggtc aacgggtact tttgccccga cggcatcagc 4320
aagcaggttg ctgctgcaag tgccaaaccc tcgacgcatt gcatggttcg tttgcaccca 4380
gccaaggcag ttgtggttgc tgctgctggt gctgtggttg ctgattcgac gcccgtggtc 4440
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gtggtcgctg ccgccgaggc ccgcatgctg gcatcattcg gagcggcccg cttgcctatg 4620
gaccaggtgg aactccagat ccgtgagatc cagcaacgca cctccaacgc ctttgctgtc 4680
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atgctcgccc agctgcaggc caagttcggc tcctttgacg ccgtgccgga gccgcagctg 5400
cgcaagctcg agcgctccgt gttcaagcag tccgtggcgg acgtgtgggc tgctgcacgc 5460
gaaaagtttg gtgtcgacgc taccgctgca agtccgcagg agaggatggc gctctgtgtg 5520
cgctggtaca tgtcgcagtc gtcgcgatgg gctaccgagg cgacgtccgc gcgcaaggcg 5580
gactaccaga tctggtgcgg ccccgccatc ggcagcttca acgacttcgt tcgcggcacc 5640
aagctggacg cgaccgctgg caccggcgag tttccgcgcg tcgtggacat caaccagcac 5700
atcctcctcg gagcctcgca ctaccgccgc gtgcagcaac aacaacagga cgacgacgta 5760
gaatacatca tcgtataa 5778
<210> 4
<211> 1925
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 4
Met Pro Cys Asp Asn Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala
1 5 10 15
Gly Cys Lys Asn Gln Asp Glu Phe Trp Asp Thr Leu Met Arg Lys Glu
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Ile Asn Ser Ser Pro Ile Ser Ala Glu Arg Leu Gly Thr Arg Tyr Arg
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Asp Leu His Phe His Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys
50 55 60
Asn Asp Arg Tyr Gly Cys Val Asp Ala Ser Val Asp Asn Glu His Asp
65 70 75 80
Leu Leu Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asn
85 90 95
Leu Asp Asp Ala Ser Thr Thr Ala Asn Leu Arg Asp Phe Gly Ile Val
100 105 110
Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu
115 120 125
Asn Leu Tyr Gln Val His Val Glu Asn Arg Val Gly Ala Gln Arg Phe
130 135 140
Arg Asp Ser Arg Pro Trp Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ser Pro Glu
145 150 155 160
Ala Ser Asp Pro Arg Val Tyr Ser Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asn
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Gln Leu Gly Leu Gly Pro Val Arg Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Cys Ala
180 185 190
Ser Ala Leu Tyr Cys Leu Lys Leu Ala Ser Asp His Leu Leu Ser Arg
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Ser Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Asp Pro Phe
210 215 220
Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Leu Gly Gly
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Pro Asp Asp Asn Pro Leu Ser Val Pro Leu Arg Gln Gly Ser Gln Gly
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Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ala Ile Met Val Leu Lys Arg Leu Glu
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Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Arg Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Gly Thr
275 280 285
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Pro Ser Glu Val Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Gln
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Gly Asp Val Val Glu Val Glu Ala Leu Arg His Cys Phe Arg Gly Asn
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Thr Asp His Pro Pro Arg Met Gly Ser Thr Lys Gly Asn Phe Gly His
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Thr Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala Lys Val Leu Leu Ser
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Cys Ile Asp Pro Leu Val Val Asp Glu Ala Ile Pro Trp Pro Tyr Ser
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Ser Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Cys Val Phe
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Arg Glu His Arg Gln Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ser Pro Val Leu
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Phe Gly Thr Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Gln Ala Ile Tyr Lys
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Gly Thr Asp Gly Ala Ser Asp Leu Pro Ser Lys Arg Trp Arg Phe Leu
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Gly Ala Asp Thr Asp Phe Leu Thr Ala Met Gly Leu Asp Ala Val Pro
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Arg Gly Cys Tyr Val Arg Asp Val Asp Val Asp Tyr Lys Arg Leu Arg
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Ser Pro Met Ile Pro Glu Asp Val Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala
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Val Ala Thr Met Asp Arg Ala Leu Gln Asp Ala Gly Met Ala Thr Gly
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Gly Lys Val Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Thr Glu Leu Tyr
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Arg His Arg Ala Arg Val Thr Leu Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ala Ala
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Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr
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Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr
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Glu Gly Ala Asn Ser Val Tyr Arg Cys Leu Glu Leu Gly Lys Phe Leu
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Leu Asp Thr His Gln Val Asp Ala Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu
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Tyr Phe Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Gln Ala
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Val Arg Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Gly Pro Asp
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Asn Arg Phe Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Ser Ser Ala
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Leu Ile Ala Gly Lys Pro Ala Glu Cys Leu Arg Val Leu Glu Arg
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His Pro Ala Lys Ala Val Val Val Ala Ala Ala Gly Ala Val Val
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Gly Ala Ala Arg Leu Pro Met Asp Gln Val Glu Leu Gln Ile Arg
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Glu Ile Gln Gln Arg Thr Ser Asn Ala Phe Ala Val Asn Leu Met
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Pro Gly Pro Asp Glu Ala Ala Thr Val Asp Ala Leu Leu Arg Thr
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Gly Val Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Leu Ser
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Cys Gly Ala Ser Val Ser Ala Thr His Arg Val Val Ala Lys Val
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Ser Arg Thr Glu Val Ala Glu His Phe Leu Arg Pro Ala Pro Ala
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Val Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Gln Arg Asn Arg Trp Arg His
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Val Val Thr Gly Ser Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ala Gly Thr
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Ser Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr Tyr Ser Asp
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Val Ala Met Ala Pro Gly Gly Val Gln Val Leu Lys Lys Gln Thr
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Glu Arg Ser Val Phe Lys Gln Ser Val Ala Asp Val Trp Ala Ala
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Val Val Asp Ile Asn Gln His Ile Leu Leu Gly Ala Ser His Tyr
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Arg Arg Val Gln Gln Gln Gln Gln Asp Asp Asp Val Glu Tyr Ile
1910 1915 1920
Ile Val
1925
<210> 5
<211> 4308
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 5
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aagacggtgg tcttcgacta caacgagctg ctcgaattcg ccgagggcga cgtgggccaa 120
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aagggcacga tgtttccctc gcgcgccaag aagctgttcg agctgtttca caagtacgac 3840
tcgttcgagg cgatgccggc ggacgagctg gcgcgcgtcg agaagcgcat cttcagcaag 3900
tcactcgccg aggtgtgggc cgagaccaag gacttctaca tcacgcggct caacaacccg 3960
gagaagatcc gcaaggcgga gaacgaggac cccaagctca agatgtcact ctgcttccgc 4020
tggtacctcg ggctcagctc gttctgggcc aacaacggca tcgcggaccg cacgatggac 4080
taccagatct ggtgcggccc tgccatcggc gccttcaacg acttcatcgc cgactcgtac 4140
ctcgacgtgg ccgtctcggg cgagttcccc gacgtcgtgc agatcaacct gcagatcctg 4200
tcgggcgcag cctacctcca gcgcctcctc tccgtcaagc tcgcaccgcg gatcgacgtc 4260
gacaccgagg acgacctctt cacctaccgc cccgaccacg cactctaa 4308
<210> 6
<211> 1435
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 6
Met Thr Ser Ser Lys Lys Thr Pro Val Trp Glu Met Ser Lys Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr Asn Glu Leu Leu Glu
20 25 30
Phe Ala Glu Gly Asp Val Gly Gln Val Phe Gly Pro Glu Phe Asp Ile
35 40 45
Ile Asp Lys Tyr Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Leu
50 55 60
Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn Asn Phe Arg
65 70 75 80
Val Gly Ser Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val Asn Gly Glu
85 90 95
Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val Glu Ser Gly
100 105 110
Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp Phe Gln Cys
115 120 125
Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Ser Leu Thr Phe Phe
130 135 140
Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile Arg Val Thr
145 150 155 160
Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser Met Phe Phe Phe Glu
165 170 175
Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met Arg Asp Gly
180 185 190
Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val
195 200 205
Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gln Ile Gln Lys Gln
210 215 220
Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser His Lys Thr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Ala Arg Glu Met Arg Leu Leu Val Asp Arg Gln Trp Ala Arg Val
245 250 255
Phe Gly Ser Gly Met Ala Gly Ile Asp Tyr Lys Leu Cys Ala Arg Lys
260 265 270
Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp Pro Arg Gly Gly Ala
275 280 285
His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp His
290 295 300
Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu Val Met Ala Gly Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys Val Tyr Met Leu Trp
325 330 335
Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp Phe Arg Pro Val Ser
340 345 350
Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln Ile Ser Pro His Lys
355 360 365
Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu Met Gly Phe Asp Ala
370 375 380
Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val Asp Ile Ile Asp Val
385 390 395 400
Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val Glu Asp Leu His Ser
405 410 415
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420 425 430
Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln Gln Lys Glu Ser Met
435 440 445
Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg Val Ile Ala Pro Pro
450 455 460
Ser Gly Cys Leu Lys Gly Asp Pro Thr Ala Pro Thr Ser Val Thr Trp
465 470 475 480
His Pro Met Ala Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Pro Thr Pro Ser Phe
485 490 495
Ser Pro Ser Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys Phe Ser Pro Phe Pro
500 505 510
Asn Asn Pro Leu Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Gln Met Pro Leu Thr
515 520 525
Trp Phe Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu
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Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys Thr Ser Arg Ser Pro
545 550 555 560
Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Thr Ser Val Ala Asp Met
565 570 575
Glu His Gly Pro Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn Pro Gly Gln Gly Thr
580 585 590
Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Phe Gly Ala
595 600 605
Ser Ser Arg Asp Asp His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala
610 615 620
Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr
625 630 635 640
Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ala Glu
645 650 655
Leu Val Gly Asp Ala Met Pro Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn
660 665 670
Phe Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His
675 680 685
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690 695 700
Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Glu Ser Gln Thr
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Val Val Ala Asp Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Ser
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Ala Val Ser Asp Leu Gly Asp Arg Gly Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val
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Val Ala Pro Leu Tyr Ser Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala
980 985 990
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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Arg Asp Ala Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr Ala His Lys Ile Ile
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Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro
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Met Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Phe Glu Leu Phe His Lys
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Arg Lys Ala Glu Asn Glu Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys
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Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn Asn Gly
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Ile Ala Asp Arg Thr Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala
1355 1360 1365
Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Ala Asp Ser Tyr Leu Asp Val
1370 1375 1380
Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln Ile Asn Leu Gln
1385 1390 1395
Ile Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Ser Val Lys
1400 1405 1410
Leu Ala Pro Arg Ile Asp Val Asp Thr Glu Asp Asp Leu Phe Thr
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Tyr Arg Pro Asp His Ala Leu
1430 1435
<210> 7
<211> 1395
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 7
actcgcatcg cgatcgtggg gatgtcggcg atcctgccga gcggggagaa cgtgcgcgag 60
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gacgtgacgg cctactacaa cccggagaag acgaccaagg acaagatcta ctgcaagcgc 180
ggcgggttca tcccggagta cgacttcgac gcgcgtgagt tcgggctcaa catgttccag 240
atggaggact cggacgccaa ccagacgatc tcgctgctca aggtgaagga ggcgctgacg 300
gacgccaaca tcccggcgtt ctcgagcggt aagaagaaca tcggctgcgt gctgggcatc 360
ggcggcggcc agaaggcgag ccacgagttc tactcgcggc tcaactacgt ggtcgtggac 420
aaggtgctgc gcaagatggg cctgccggag gaagacgtgg cggcggcggt ggacaagtac 480
aaggcgagtt tccccgagtg gcgcctcgac tctttccccg ggttcctggg caacgtcacg 540
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tgcgcgtcgt cgctgatcgc ggtcaaagtg gcgatcgagg agctgctcta cggcgactgc 660
gatgcgatga tcgcgggtgc cacctgcacg gacaactcga tcgggatgta catggccttc 720
tccaagacgc ccgtgttttc cacggacccg agcgtcaagg cgtacgacgc cgccaccaaa 780
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cgcgacggcg acaccgtgca cgccgtcatc aaggggtgcg cgtcctcgag cgacggcaag 900
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gccgtgctgg aggag 1395
<210> 8
<211> 465
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 8
Thr Arg Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Ser Gly Glu
1 5 10 15
Asn Val Arg Glu Ser Trp Glu Ala Ile Arg Asp Gly Leu Asp Cys Leu
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Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys
85 90 95
Glu Ala Leu Thr Asp Ala Asn Ile Pro Ala Phe Ser Ser Gly Lys Lys
100 105 110
Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ala Ser His
115 120 125
Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Asp Lys Val Leu Arg
130 135 140
Lys Met Gly Leu Pro Glu Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Asp Lys Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Ser Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu
165 170 175
Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Cys Asn Thr Phe Asn Met Glu Gly
180 185 190
Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile Ala Val
195 200 205
Lys Val Ala Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Ala Met Ile
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Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met Ala Phe
225 230 235 240
Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Lys Ala Tyr Asp
245 250 255
Ala Ala Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met Leu Val
260 265 270
Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Thr Val His Ala
275 280 285
Val Ile Lys Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ile
290 295 300
Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Tyr
305 310 315 320
Ala Arg Ala Asn Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu Gly His
325 330 335
Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Lys Ile Glu Leu Thr Ala Leu Ser
340 345 350
Asn Leu Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ala Glu Glu
355 360 365
Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu
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Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Val Leu Ala Leu
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Lys His Lys Thr Leu Pro Gln Thr Ile Asn Val Asp Lys Pro Pro Ser
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Leu Val Asp Gly Thr Pro Ile Gln Gln Ser Pro Leu Tyr Val Asn Thr
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Met Asn Arg Pro Trp Phe Thr Pro Val Gly Val Pro Arg Arg Ala Gly
435 440 445
Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu
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Glu
465
<210> 9
<211> 903
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 9
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ggc 903
<210> 10
<211> 301
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 10
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Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Glu Ser Val Ala Ala Met Asp Arg Ala
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Gln Arg Glu Arg Phe Gly Arg Pro Ala Lys Arg Val Ser Ser Val Leu
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Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Gly Asp Glu Pro Arg Gln Asp His Lys Glu
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Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Ala Pro Ser Phe Ala
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Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Ser
100 105 110
Leu Asp Arg Asp Ala Val Phe Asp Leu Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala
115 120 125
Met Ser Asp Phe Thr Ala Gln Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ala Met Ala
130 135 140
Ala Val Ile Gly Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ser Leu Gly Gly Ala Pro
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Gly Thr Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala Ser Asp Lys Leu Arg Cys Ser
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Gly Asn Phe Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ala Ala Phe His Ser
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Pro His Met Arg Gly Ala Glu Gln Thr Phe Ala Ser Ala Leu Ala Gln
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Ala Pro Val Ser Ala Pro Ala Ala Ala Arg Phe Tyr Ser Asn Val Thr
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Gly Gly Ala Ala Val Thr Ser Pro Ala Asp Val Lys Thr Asn Leu Gly
245 250 255
Lys His Met Thr Ser Pro Val Gln Phe Val Gln Gln Val Arg Ala Met
260 265 270
His Ala Ala Gly Ala Arg Val Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val
275 280 285
Leu Ser Arg Leu Val Lys Glu Thr Leu Gly Glu Ala Gly
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<210> 11
<211> 2103
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 11
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ggtggtagtg ctcctgctgc tgctgttcct tcggcgcccg ctgcttctgc agctccgact 1740
cctgcgactg cgccttctgc tgatctgcaa gcgctgctgt ccaaggcgga gactgtggtg 1800
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ctggaggccg agctcggcat cgactcgatc aagcgcgtgg agatcctttc cgaggtgcag 1920
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ctg 2103
<210> 12
<211> 701
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 12
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Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr
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130 135 140
Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu
145 150 155 160
Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu
165 170 175
Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser
180 185 190
Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile
195 200 205
Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser
225 230 235 240
Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala
245 250 255
Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp
260 265 270
Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu
275 280 285
Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val
290 295 300
Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met
305 310 315 320
Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala
325 330 335
Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala
340 345 350
Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr
355 360 365
Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met
370 375 380
Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile
385 390 395 400
Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu
405 410 415
Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val
420 425 430
Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala
435 440 445
Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr
450 455 460
Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser
465 470 475 480
Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr
485 490 495
Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly
500 505 510
Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln
515 520 525
Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr
530 535 540
Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser
545 550 555 560
Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser
565 570 575
Ala Ala Pro Thr Pro Ala Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu
580 585 590
Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr
595 600 605
Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu
610 615 620
Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln
625 630 635 640
Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr
645 650 655
Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala
660 665 670
Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Leu Leu
675 680 685
Pro Thr Leu Phe Gly Ser Glu Cys Glu Asp Leu Ser Leu
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<210> 13
<211> 276
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 13
agtgctgatc tgcaagcgct gctggccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggct 60
gccaagactg gctacgaggc cgacatggtt gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120
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<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 14
Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
20 25 30
Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
35 40 45
Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
50 55 60
Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala
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Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser
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<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 15
tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60
gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120
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<213> 裂殖壶菌属物种
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Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met
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Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
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Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
35 40 45
Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
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<213> 裂殖壶菌属物种
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tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagacgg tggtgatggc tgtgctggcg 60
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<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
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Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met
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Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
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Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
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Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
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<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 19
tctgctgatc tgcaagcgct gctggccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60
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<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 20
Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met
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Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
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Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
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Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
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Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala
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<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 21
tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60
gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120
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<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 22
Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
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Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
35 40 45
Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
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Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala
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<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 23
tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60
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<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 24
Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met
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Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala
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Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val
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Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp
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Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala
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85 90
<210> 25
<211> 2178
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 25
gcgctacagg cggcgctcac gtccgtcgag gcgcagttcg gcaaggtggg tggctttgtg 60
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tcgggccagc gctgcacgac aactacgaag tcgctgacta cgggcaagcc gcaccagccg 480
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gtgcgcgagc tggcgcagcg cgtgggcggc ggcacgtacg tgctcatcgg ccgctcggag 600
ctgcccacga cggagcctgc ctgggcggtc ggcgtggagt ctggcaagcc gctggagaag 660
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atgctgcaca agaagctcgt gggcgccgtg gtcggagcgc gcgaggtgcg agcctcgctc 780
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gccaaggtgc gtgagatggt agagcgcgtg cagcagcagg gcgggcggcg cgtgtcgggc 900
gtgttccacg cgtcgggcgt gctgcgcgac aagctcgtgg agaacaagtc gctggcggac 960
ttcagcgccg tgtacgacac caaggtgggc ggcctcatca acctgctggc ctgcgtggac 1020
ctggcgcagc tgcgtcacct cgtgctcttc agctcgctcg cgggcttcca cggcaacgtc 1080
gggcagtcgg actacgcaat ggccaacgag gcgctcaaca agctggcggc gcacctgtcg 1140
gcggtgcacc cgcagctgtg cgcgcgctcg atctgcttcg gaccgtggga cggcggcatg 1200
gtgacccccg cgctcaaggc caacttcatc cgcatgggca tccagatcat cccgcgccaa 1260
ggcggcgcgc agaccgtcgc caacatgctc gtcagtagct cccccggtca gctgctcgtg 1320
ggcaactggg gcgtgccacc cgtcgtgccg agtgccaccg agcacaccgt gctgcagacg 1380
ctccgccaga gcgacaaccc cttcctcgac tcgcacgtga tccagggccg ccgcgtgctg 1440
cccatgaccc tggccgtggg ctacatggcg caccaggcgc agagcatcta cgcgggccac 1500
cagctgtggg ccgtcgagga cgcccagctc ttcaagggca tcgccatcga caatggcgcc 1560
gacgtgcccg tgcgcgtgga gctgtcgcgc cgcaaggagg agcaggagga cgccggcaag 1620
gtcaaggtca aggtgcaggt gctgctcaaa tcgcaggtca acggcaagtc ggtgcccgcg 1680
tacaaggcga ccgtcgtgct gtcccctgcg ccgcgcccca gcgtcatcac gcgtgacttc 1740
gacctcaccc cggacccggc ctgcacggag cacgacctct acgacggcaa gacgctcttc 1800
cacggcaagg ccttccaggg catcgagcag gtgctctcgg cgacgcccaa gcagctcacc 1860
gccaagtgcc gcaatttgcc cctcacgccc gagcagcgcg gccagttcgt cgttaacctc 1920
agccagcagg acccgttcca ggcggacatt gcgttccagg cgatgctcgt ctgggcgcgc 1980
atgctgcgcc aatcggcggc cctgcccaac aactgcgagc gcttcgactt ttacaagccg 2040
atggccccgg gcgccaccta ctacacgtcg gtcaagctgg cctcggcctc acccttggtg 2100
gactctgtgt gcaagtgcac cgtggcgatg cacgatgagc aaggtgaggt gtacttttct 2160
gctcgtgcca gcgtcgtc 2178
<210> 26
<211> 726
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 26
Ala Leu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Val Glu Ala Gln Phe Gly Lys Val
1 5 10 15
Gly Gly Phe Val Phe Gln Phe Gly Asp Asp Asp Val Gln Ala Gln Leu
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Gly Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Thr Ser Leu Ser Glu
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Gln Ile Glu Gly Gly Arg Thr Phe Phe Val Ala Val Ala Arg Leu Asp
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Gly Gln Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu
65 70 75 80
Ser Arg Ala Gln Gln Gly Ser Val Phe Gly Leu Cys Lys Thr Leu Asp
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Leu Glu Trp Pro Ala Val Phe Cys Arg Gly Ile Asp Leu Ala Ala Asp
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Leu Asp Ala Ala Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Gly Glu Leu Ser Asp
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Pro Asp Val Ala Val Arg Glu Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Gly Gln Arg
130 135 140
Cys Thr Thr Thr Thr Lys Ser Leu Thr Thr Gly Lys Pro His Gln Pro
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ser Asp Leu Phe Leu Val Ser Gly Gly Ala Arg Gly Ile
165 170 175
Thr Pro Leu Cys Val Arg Glu Leu Ala Gln Arg Val Gly Gly Gly Thr
180 185 190
Tyr Val Leu Ile Gly Arg Ser Glu Leu Pro Thr Thr Glu Pro Ala Trp
195 200 205
Ala Val Gly Val Glu Ser Gly Lys Pro Leu Glu Lys Ala Ala Leu Ala
210 215 220
Phe Leu Lys Ala Glu Phe Ala Ala Gly Arg Gly Ala Lys Pro Thr Pro
225 230 235 240
Met Leu His Lys Lys Leu Val Gly Ala Val Val Gly Ala Arg Glu Val
245 250 255
Arg Ala Ser Leu Ala Glu Ile Thr Ala Gln Gly Ala Thr Ala Val Tyr
260 265 270
Glu Ser Cys Asp Val Ser Ser Ala Ala Lys Val Arg Glu Met Val Glu
275 280 285
Arg Val Gln Gln Gln Gly Gly Arg Arg Val Ser Gly Val Phe His Ala
290 295 300
Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Asn Lys Ser Leu Ala Asp
305 310 315 320
Phe Ser Ala Val Tyr Asp Thr Lys Val Gly Gly Leu Ile Asn Leu Leu
325 330 335
Ala Cys Val Asp Leu Ala Gln Leu Arg His Leu Val Leu Phe Ser Ser
340 345 350
Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp Tyr Ala Met Ala
355 360 365
Asn Glu Ala Leu Asn Lys Leu Ala Ala His Leu Ser Ala Val His Pro
370 375 380
Gln Leu Cys Ala Arg Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly Gly Met
385 390 395 400
Val Thr Pro Ala Leu Lys Ala Asn Phe Ile Arg Met Gly Ile Gln Ile
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Ile Pro Arg Gln Gly Gly Ala Gln Thr Val Ala Asn Met Leu Val Ser
420 425 430
Ser Ser Pro Gly Gln Leu Leu Val Gly Asn Trp Gly Val Pro Pro Val
435 440 445
Val Pro Ser Ala Thr Glu His Thr Val Leu Gln Thr Leu Arg Gln Ser
450 455 460
Asp Asn Pro Phe Leu Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu
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Pro Met Thr Leu Ala Val Gly Tyr Met Ala His Gln Ala Gln Ser Ile
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Gly Ile Ala Ile Asp Asn Gly Ala Asp Val Pro Val Arg Val Glu Leu
515 520 525
Ser Arg Arg Lys Glu Glu Gln Glu Asp Ala Gly Lys Val Lys Val Lys
530 535 540
Val Gln Val Leu Leu Lys Ser Gln Val Asn Gly Lys Ser Val Pro Ala
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Thr Val Val Leu Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Val Ile
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Thr Arg Asp Phe Asp Leu Thr Pro Asp Pro Ala Cys Thr Glu His Asp
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Leu Tyr Asp Gly Lys Thr Leu Phe His Gly Lys Ala Phe Gln Gly Ile
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Glu Arg Phe Asp Phe Tyr Lys Pro Met Ala Pro Gly Ala Thr Tyr Tyr
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Lys Cys Thr Val Ala Met His Asp Glu Gln Gly Glu Val Tyr Phe Ser
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Ala Arg Ala Ser Val Val
725
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 27
ctcgactcgc acgtgatcca gggccgccgc gtgctgccc 39
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 28
Leu Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 1341
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 29
gataacattg cggtcgtggg catggcggtg cagtatgccg gatgcaagaa ccaggacgag 60
ttctgggata cgctgatgcg taaggagatc aactcgagcc cgatctcggc ggagcgcctc 120
ggtacgcgct accgcgacct ccacttccac ccgcagcgca gcaagtacgc cgacaccttc 180
tgcaacgatc gctacggctg cgtcgatgcc agcgtcgaca acgagcacga cctcctcgcc 240
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gccaacctac gcgacttcgg catcgtgagc ggctgcctgt cgttccccat ggacaatctg 360
cagggcgagc tgctcaatct gtaccaagtg catgtggaga accgcgtggg cgcccagcgc 420
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ccgcgcgtgt actccgaccc ggcgtccttc gtggccaacc agctcggcct ggggcccgtg 540
cgctacagcc tcgatgcagc ctgcgcgtcg gcgctgtact gcctcaagct ggcgtccgac 600
cacttgctct cgcgcagcgc ggacgtgatg ctgtgcggcg ccacatgctt tccggacccg 660
ttcttcattc tctcggggtt ctccaccttc caggcgatgc cgctgggcgg accggacgat 720
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gtgcagtacg tggagtgcca cgccacgggc actccgcagg gcgacgtcgt ggaggtagag 1020
gcgctgcgcc actgctttcg aggtaacacg gaccacccgc cgcgcatggg ctccaccaag 1080
ggcaactttg gccacactct cgtggcggcc gggttcgcag gcatggccaa ggtgctgctg 1140
tcgatgcagc acggcacgat cccgcccacg cccggtgtcg accgctccaa ctgcatcgac 1200
ccgctcgtcg tggacgaggc catcccttgg ccgtactcgt cggcgcaggc gcgggcaggc 1260
aaaccaggcg atgagctcaa gtgcgcctcg ctctccgcct ttggctttgg tggaaccaac 1320
gcgcactgtg tcttccgtga g 1341
<210> 30
<211> 447
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 30
Asp Asn Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys
1 5 10 15
Asn Gln Asp Glu Phe Trp Asp Thr Leu Met Arg Lys Glu Ile Asn Ser
20 25 30
Ser Pro Ile Ser Ala Glu Arg Leu Gly Thr Arg Tyr Arg Asp Leu His
35 40 45
Phe His Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Asp Arg
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Tyr Gly Cys Val Asp Ala Ser Val Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Ala
65 70 75 80
Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asn Leu Asp Asp
85 90 95
Ala Ser Thr Thr Ala Asn Leu Arg Asp Phe Gly Ile Val Ser Gly Cys
100 105 110
Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr
115 120 125
Gln Val His Val Glu Asn Arg Val Gly Ala Gln Arg Phe Arg Asp Ser
130 135 140
Arg Pro Trp Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ser Pro Glu Ala Ser Asp
145 150 155 160
Pro Arg Val Tyr Ser Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asn Gln Leu Gly
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Leu Gly Gly Pro Asp Asp
225 230 235 240
Asn Pro Leu Ser Val Pro Leu Arg Gln Gly Ser Gln Gly Leu Thr Pro
245 250 255
Gly Glu Gly Gly Ala Ile Met Val Leu Lys Arg Leu Glu Asp Ala Val
260 265 270
Arg Asp Gly Asp Arg Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ser
275 280 285
Asn Ala Gly Cys Gly Leu Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Lys
290 295 300
Ser Cys Met Glu Asp Leu Tyr Thr Ser Val Gly Ile Asp Pro Ser Glu
305 310 315 320
Val Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Gln Gly Asp Val
325 330 335
Val Glu Val Glu Ala Leu Arg His Cys Phe Arg Gly Asn Thr Asp His
340 345 350
Pro Pro Arg Met Gly Ser Thr Lys Gly Asn Phe Gly His Thr Leu Val
355 360 365
Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala Lys Val Leu Leu Ser Met Gln His
370 375 380
Gly Thr Ile Pro Pro Thr Pro Gly Val Asp Arg Ser Asn Cys Ile Asp
385 390 395 400
Pro Leu Val Val Asp Glu Ala Ile Pro Trp Pro Tyr Ser Ser Ala Gln
405 410 415
Ala Arg Ala Gly Lys Pro Gly Asp Glu Leu Lys Cys Ala Ser Leu Ser
420 425 430
Ala Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Cys Val Phe Arg Glu
435 440 445
<210> 31
<211> 1293
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 31
ggaccgattg ccatcatcgg gatggacgcg acgtttggta ccctcaaggg cctggacgcg 60
tttgagcagg ccatctacaa gggcacggac ggcgccagcg acctgccgag caagcgctgg 120
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gaggacgtcc tgcgcccgca acagctgctg gcggtggcta cgatggaccg cgcgctgcag 300
gacgctggaa tggcgacggg aggcaaggtg gcggtgctgg tggggctcgg cacggacacc 360
gagctgtacc ggcaccgcgc gcgcgtgaca ctcaaggagc ggctcgaccc ggccgcgttc 420
tcgcccgagc aggtgcagga gatgatggac tacatcaacg actgcggcac ctcgacgtcg 480
tacacgtcgt acatcggcaa cctcgtggcc acgcgcgtgt cctcgcagtg gggctttacg 540
ggcccgtcct tcaccgtcac cgaaggcgca aactcggtct accgctgcct cgagctgggc 600
aagttcctgc tcgacacgca ccaggtggac gccgtcgtgg tggccggcgt cgacctctgt 660
gccaccgccg agaaccttta cctcaaggcg cgccgctccg ccatcagccg acaggaccac 720
cctcgcgcca actttgaggc cagcgccgac gggtactttg ccggcgaggg cagcggcgcc 780
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ggcctcacgt gcgccgcgca gcccgctgaa gccgtgtcgc cgctactact ccaagtccac 900
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ggagacgtcg ggtacgcctc gggcgccgcg agcctcatca agacggcgct gtgcctccac 1140
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ctgtttactt gcccgcgctc gcgtgcctgg ctgaagaacc cgggcgagtc gcgactggcg 1260
gctgtcgcca gtgcctccga gagcgggtcc tgc 1293
<210> 32
<211> 431
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 32
Gly Pro Ile Ala Ile Ile Gly Met Asp Ala Thr Phe Gly Thr Leu Lys
1 5 10 15
Gly Leu Asp Ala Phe Glu Gln Ala Ile Tyr Lys Gly Thr Asp Gly Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Pro Ser Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Ala Asp Thr Asp
35 40 45
Phe Leu Thr Ala Met Gly Leu Asp Ala Val Pro Arg Gly Cys Tyr Val
50 55 60
Arg Asp Val Asp Val Asp Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Pro Met Ile Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ala Thr Met Asp
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Arg Ala Leu Gln Asp Ala Gly Met Ala Thr Gly Gly Lys Val Ala Val
100 105 110
Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Thr Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg
115 120 125
Val Thr Leu Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ala Ala Phe Ser Pro Glu Gln
130 135 140
Val Gln Glu Met Met Asp Tyr Ile Asn Asp Cys Gly Thr Ser Thr Ser
145 150 155 160
Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Val Ser Ser Gln
165 170 175
Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Ala Asn Ser
180 185 190
Val Tyr Arg Cys Leu Glu Leu Gly Lys Phe Leu Leu Asp Thr His Gln
195 200 205
Val Asp Ala Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu Cys Ala Thr Ala Glu
210 215 220
Asn Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ser Ala Ile Ser Arg Gln Asp His
225 230 235 240
Pro Arg Ala Asn Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly Tyr Phe Ala Gly Glu
245 250 255
Gly Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Gln Ala Asp Val Gly Ser Asp
260 265 270
Asp Lys Val Tyr Ala Ser Val Ala Gly Leu Thr Cys Ala Ala Gln Pro
275 280 285
Ala Glu Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Gln Val His Asn Asp Asp Asn
290 295 300
Glu Lys Arg Val Val Glu Met Val Glu Leu Ala Ala Asp Ser Gly Arg
305 310 315 320
His Ala Pro His Leu Ala Asn Ser Pro Leu Ser Ala Glu Ser Gln Leu
325 330 335
Glu Gln Val Ser Lys Leu Leu Ala His Gln Val Pro Gly Ser Val Ala
340 345 350
Ile Gly Ser Val Arg Ala Asn Val Gly Asp Val Gly Tyr Ala Ser Gly
355 360 365
Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu His Asn Arg Tyr Leu
370 375 380
Pro Ala Asn Pro Gln Trp Glu Arg Pro Val Ala Pro Val Ser Glu Ala
385 390 395 400
Leu Phe Thr Cys Pro Arg Ser Arg Ala Trp Leu Lys Asn Pro Gly Glu
405 410 415
Ser Arg Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ser Glu Ser Gly Ser Cys
420 425 430
<210> 33
<211> 1203
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 33
acgccggaga agctggagaa ggagttggag ctggcagcca agggtgtacc gcgaagcgcc 60
aaggccgggc gcaactggat gtcgccatcg ggcagcgcct ttgcgccgac acctgtgacc 120
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ctcagcctcg gcgagatctc catgctcttt gcgctgtcgc gacgcaactg cggcctgtcg 480
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gaggtggggc cgaacaacat gcgctccgcc gcggtcagtg acattcttgg caaggctgcc 1080
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gac 1203
<210> 34
<211> 401
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 34
Thr Pro Glu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Leu Ala Ala Lys Gly Val
1 5 10 15
Pro Arg Ser Ala Lys Ala Gly Arg Asn Trp Met Ser Pro Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Phe Ala Pro Thr Pro Val Thr Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr
35 40 45
Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Val Gly Leu Asp Leu His Arg
50 55 60
Leu Trp Pro Ala Leu His Glu Arg Ile Asn Asp Lys Thr Ala Ala Leu
65 70 75 80
Trp Glu Asn Gly Asp Ser Trp Leu Met Pro Arg Ala Val Asp Ala Asp
85 90 95
Ser Gln Arg Ala Val Gln Thr Ala Phe Asp Ala Asp Gln Ile Glu Met
100 105 110
Phe Arg Thr Gly Ile Phe Val Ser Ile Cys Leu Thr Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Asp Val Leu Gly Val Gln Pro Lys Ala Cys Phe Gly Leu Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Ile Ser Met Leu Phe Ala Leu Ser Arg Arg Asn Cys Gly Leu Ser
145 150 155 160
Asp Gln Leu Thr Gln Arg Leu Arg Thr Ser Pro Val Trp Ser Thr Gln
165 170 175
Leu Ala Val Glu Phe Gln Ala Leu Arg Lys Leu Trp Asn Val Pro Ala
180 185 190
Asp Ala Pro Val Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val Arg Ala Ser
195 200 205
Arg Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Gly Pro Asp Asn Arg Phe Val Arg
210 215 220
Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Ser Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro
225 230 235 240
Ala Glu Cys Leu Arg Val Leu Glu Arg Leu Gly Gly Arg Leu Pro Pro
245 250 255
Met Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Ala Pro
260 265 270
Tyr Thr Pro Gly Ile Ala His Ile His Glu Ile Leu Glu Ile Pro Asp
275 280 285
Ser Pro Val Lys Met Tyr Thr Ser Val Thr Asn Ala Glu Leu Arg Gly
290 295 300
Gly Ser Asn Ser Ser Ile Thr Glu Phe Val Gln Lys Leu Tyr Thr Arg
305 310 315 320
Ile Ala Asp Phe Pro Gly Ile Val Asp Lys Val Ser Arg Asp Gly His
325 330 335
Asp Val Phe Val Glu Val Gly Pro Asn Asn Met Arg Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Asp Ile Leu Gly Lys Ala Ala Thr Pro His Val Ser Val Ala Leu
355 360 365
Asp Arg Pro Ser Glu Ser Ala Trp Thr Gln Thr Leu Lys Ser Leu Ala
370 375 380
Leu Leu Thr Ala His Arg Val Pro Leu His Asn Pro Thr Leu Phe Ala
385 390 395 400
Asp
<210> 35
<211> 1273
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 35
tacgacgtgg actggccgct ctacatgggc gccatggcgg aaggcatctc gtcggtagac 60
ctggtggtcg ctgccgccga ggcccgcatg ctggcatcat tcggagcggc ccgcttgcct 120
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gtagaataca tca 1273
<210> 36
<211> 401
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 36
Tyr Asp Val Asp Trp Pro Leu Tyr Met Gly Ala Met Ala Glu Gly Ile
1 5 10 15
Ser Ser Val Asp Leu Val Val Ala Ala Ala Glu Ala Arg Met Leu Ala
20 25 30
Ser Phe Gly Ala Ala Arg Leu Pro Met Asp Gln Val Glu Leu Gln Ile
35 40 45
Arg Glu Ile Gln Gln Arg Thr Ser Asn Ala Phe Ala Val Asn Leu Met
50 55 60
Pro Gly Pro Asp Glu Ala Ala Thr Val Asp Ala Leu Leu Arg Thr Gly
65 70 75 80
Val Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Leu Ser Ala Asp
85 90 95
Leu Val Arg Tyr Arg Val Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ser Cys Gly Ala
100 105 110
Ser Val Ser Ala Thr His Arg Val Val Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu
115 120 125
Val Ala Glu His Phe Leu Arg Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Glu Ala
130 135 140
Leu Val Ala Ala Lys Gln Ile Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ser
145 150 155 160
Arg Val Ala Met Ala Asp Asp Val Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly
165 170 175
His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Leu Leu Pro Leu Val Val Ala
180 185 190
Gln Arg Asn Arg Trp Arg His Leu Val Asp Thr Pro Val Arg Val Gly
195 200 205
Ala Gly Gly Gly Ile Ala Cys Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ser
210 215 220
Leu Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly Ser Val Asn Gln Leu Ala Arg
225 230 235 240
Glu Ala Gly Thr Ser Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr
245 250 255
Tyr Ser Asp Val Ala Met Ala Pro Gly Gly Val Gln Val Leu Lys Lys
260 265 270
Gln Thr Met Phe Ala Ala Arg Ala Thr Met Leu Ala Gln Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Phe Gly Ser Phe Asp Ala Val Pro Glu Pro Gln Leu Arg Lys Leu
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Glu Arg Ser Val Phe Lys Gln Ser Val Ala Asp Val Trp Ala Ala Ala
305 310 315 320
Arg Glu Lys Phe Gly Val Asp Ala Thr Ala Ala Ser Pro Gln Glu Arg
325 330 335
Met Ala Leu Cys Val Arg Trp Tyr Met Ser Gln Ser Ser Arg Trp Ala
340 345 350
Thr Glu Ala Thr Ser Ala Arg Lys Ala Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly
355 360 365
Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Val Arg Gly Thr Lys Leu Asp
370 375 380
Ala Thr Ala Gly Thr Gly Glu Phe Pro Arg Val Val Asp Ile Asn Gln
385 390 395 400
His
<210> 37
<211> 1350
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 37
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<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 38
Met Thr Ser Ser Lys Lys Thr Pro Val Trp Glu Met Ser Lys Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr Asn Glu Leu Leu Glu
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50 55 60
Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn Asn Phe Arg
65 70 75 80
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Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val Glu Ser Gly
100 105 110
Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp Phe Gln Cys
115 120 125
Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Ser Leu Thr Phe Phe
130 135 140
Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile Arg Val Thr
145 150 155 160
Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser Met Phe Phe Phe Glu
165 170 175
Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met Arg Asp Gly
180 185 190
Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val
195 200 205
Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gln Ile Gln Lys Gln
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Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser His Lys Thr Ser Leu
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260 265 270
Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp Pro Arg Gly Gly Ala
275 280 285
His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp His
290 295 300
Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu Val Met Ala Gly Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys Val Tyr Met Leu Trp
325 330 335
Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp Phe Arg Pro Val Ser
340 345 350
Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln Ile Ser Pro His Lys
355 360 365
Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu Met Gly Phe Asp Ala
370 375 380
Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val Asp Ile Ile Asp Val
385 390 395 400
Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val Glu Asp Leu His Ser
405 410 415
Tyr Gly Gln Gly Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val Val Asp Phe Lys Gly
420 425 430
Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln Gln Lys Glu Ser Met
435 440 445
Thr Val
450
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<211> 1200
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 39
tacccgccgc gggcggtgtg cttctcgccg ttccccaaca acccgcttga caacgaccac 60
acgccgggcc agatgccgtt gacctggttc aacatgtccg aattcatgtg cggcaaagtg 120
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acgctctccg cgcccgcctc cgcttcctcc gcgcaaggtc agctgcagct gcagcgacgc 780
gggtcgcagg cgcagttcct ggacacaatc cacctggcgg gcagcggcgc cggcgtgcac 840
ggccagggct acgcgcacgg ggagaaggcc gtgaacaagc aagattggtt cttctcgtgc 900
cacttctggt tcgaccccgt gatgcccggg tccctgggca tcgagtcgat gttccagctc 960
gtcgaggcgt ggtgcgtgaa gcagggactc gcggcgcggc acggcatcgc tcacccagtg 1020
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gtcgtcgcgg acgggttcct cttcgtcgac ggcctccgcg tctactcggc agacaacctc 1200
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Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys Phe Ser Pro Phe Pro Asn Asn Pro Leu
1 5 10 15
Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Gln Met Pro Leu Thr Trp Phe Asn Met
20 25 30
Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe
35 40 45
Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu
50 55 60
Ala Leu Val Thr Arg Val Thr Ser Val Ala Asp Met Glu His Gly Pro
65 70 75 80
Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn Pro Gly Gln Gly Thr Met Val Gly Glu
85 90 95
Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Phe Gly Ala Ser Ser Arg Asp
100 105 110
Asp His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala Leu Gln Thr Ser
115 120 125
Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp
130 135 140
Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ala Glu Leu Val Gly Asp
145 150 155 160
Ala Met Pro Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Phe Thr Lys Cys
165 170 175
Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe
180 185 190
Glu Leu Ser Val Asp Gly Ala Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe
195 200 205
Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Glu Ser Gln Thr Gly Leu Asp Asn
210 215 220
Gly Lys Pro Arg Leu Pro Trp Tyr Arg Glu Asn Asn Val Ala Val Asp
225 230 235 240
Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gln Gly Gln Leu Gln
245 250 255
Leu Gln Arg Arg Gly Ser Gln Ala Gln Phe Leu Asp Thr Ile His Leu
260 265 270
Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val His Gly Gln Gly Tyr Ala His Gly Glu
275 280 285
Lys Ala Val Asn Lys Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe
290 295 300
Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu
305 310 315 320
Val Glu Ala Trp Cys Val Lys Gln Gly Leu Ala Ala Arg His Gly Ile
325 330 335
Ala His Pro Val Phe Ala His Ala Pro Gly Ala Thr Ser Trp Lys Tyr
340 345 350
Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Asp Arg Met Asp Ser Glu Val His
355 360 365
Ile Lys Ser Val Ala Ala Phe Ser Ser Trp Val Asp Val Val Ala Asp
370 375 380
Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Ser Ala Asp Asn Leu
385 390 395 400
<210> 41
<211> 1353
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 41
cagctggacg cggggagcga ggtgcccgcc tgcgcggtga gcgacctggg cgataggggc 60
ttcatggaga cgtacggggt ggtggcgccg ctgtacagcg gggcgatggc caagggcatc 120
gcgtcggcgg acctggtgat cgcgatgggc cagcgcaaga tgctggggtc gtttggcgcg 180
ggcgggctcc cgatgcacgt cgtgcgcgcg gggattgaga agatccaggc agcgctgcca 240
gcggggccat acgcggtcaa cctgattcac tcgccttttg acgccaacct ggagaagggc 300
aacgtggacc tcttcctgga gaagggcgtg cgcgtcgtgg aggcgtcggc cttcatggag 360
ctcacgcccc aggtggtgcg ctaccgcgcg acgggcctct ctcgcgacgc gcgcggcggc 420
tccgtgcgca cggcccacaa gatcatcggc aaggtcagcc gcaccgagct ggccgagatg 480
tttatccggc ccgcgccgca agccattctc gacaagcttg tggcgtccgg cgagatcacc 540
cccgagcagg cggcgctggc gctcgaggtg cccatggcgg acgacatcgc cgtcgaggcc 600
gattcgggcg ggcacaccga caaccgcccc atccacgtca tcctgcccct catcctcagc 660
ctgcgcaacc gcctccagcg cgagctcaag taccctgcgc gacaccgcgt gcgcgtcggc 720
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<210> 42
<211> 451
<212> PRT
<213> 裂殖壶菌属物种
<400> 42
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115 120 125
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Asp Val Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln Ile Asn Leu
435 440 445
Gln Ile Leu
450

Claims (91)

1.一种重组微藻，其中该重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、和/或其功能等效物的表达；并且其中当与宿主微藻相比时，该重组微藻产生的脂质中的二十碳五烯酸(EPA)的水平增加。
2.权利要求1的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以与该宿主微藻相比时增加PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平。
3.权利要求2的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，PFA1和/或PFA3的表达增加至少1.5倍。
4.权利要求1-3中任一项的重组微藻，其中该微藻是网粘菌纲。
5.权利要求4的重组微藻，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。
6.权利要求5的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。
7.权利要求6的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。
8.权利要求1-7中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1的表达。
9.权利要求1-8中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。
10.权利要求1-9中任一项的重组微藻，其中该微藻经修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物。
11.权利要求1-10中任一项的重组微藻，其中通过源自于该宿主微藻的启动子驱动PFA1和/或PFA3的表达。
12.权利要求1-11中任一项的重组微藻，其中该微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的多个拷贝。
13.权利要求10-13中任一项的重组微藻，其中该编码PFA1的基因与SEQ ID NO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQ ID NO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列。
14.权利要求12-13中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。
15.权利要求12-14中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。
16.权利要求12-15中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。
17.权利要求1-16中任一项的重组微藻，其中使内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶基因中的一个或多个缺失。
18.权利要求1-16中任一项的重组微藻，其中使内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶基因中的一个或多个突变。
19.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，该脂质中的EPA增加至少2倍。
20.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，该脂质富含二十二碳六烯酸(DHA)。
21.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中当与该宿主微藻相比时，EPA:DHA比例增加至少2倍。
22.一种在微藻中生产富含ω-3PUFA的脂质的方法，其包括：
a)修饰该微藻以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3和/或其功能等效物的表达；并且
b)培养该经修饰的微藻；
其中当与该宿主微藻相比时，产生富含ω-3PUFA的脂质。
23.权利要求22的方法，其中该重组微藻经修饰以与该宿主微藻相比时增加PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平。
24.权利要求23的方法，其中相对于该宿主微藻，PFA1和/或PFA3的表达增加1.5倍。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中该微藻是网粘菌纲。
26.权利要求25的方法，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。
27.权利要求26的方法，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。
28.权利要求26的方法，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。
29.权利要求22-28中任一项的方法，其中该微藻经修饰以增加PFA1表达。
30.权利要求22-29中任一项的方法，其中该微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。
31.权利要求22-30中任一项的方法，其中该微藻经修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物。
32.权利要求22-31中任一项的方法，其中通过源自于该宿主微藻的启动子驱动PFA1和/或PFA3的表达。
33.权利要求22-32中任一项的方法，其中该微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物的多个拷贝。
34.权利要求31-33中任一项的方法，其中该编码PFA1的基因与SEQ ID NO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQ ID NO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列。
35.权利要求33-34中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。
37.权利要求33-36中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。
38.权利要求22-37中任一项的方法，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个缺失。
39.权利要求22-37中任一项的方法，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个突变。
40.权利要求22-39中任一项的方法，其中ω-3PUFA增加的脂质包含EPA。
41.权利要求40的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中的EPA增加至少2倍。
42.权利要求22-41中任一项的方法，其中富含ω-3PUFA的脂质包含二十二碳六烯酸(DHA)。
43.权利要求42的方法，其中相对于该宿主微藻，EPA:DHA比例增加至少2倍。
44.权利要求22-43中任一项的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中ω-3PUFA:ω-6PUFA的比例增加。
45.一种重组微藻，其中该重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、和/或其功能等效物；并且其中当与宿主微藻相比时，该重组微藻产生富含ω-3PUFA的脂质。
46.权利要求45的重组微藻，其中当与该宿主微藻相比时，该脂质的ω-3PUFA:ω-6PUFA比例增加。
47.一种在微藻中产生具有降低的ω-6PUFA水平的脂质的方法，其包括：
a)修饰该微藻以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3和/或其功能等效物的表达；并且
b)培养该经修饰的微藻；
其中相对于宿主微藻，产生具有降低的ω-6PUFA水平的脂质。
48.权利要求47的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中ω-6PUFA:ω-3PUFA的比例下降。
49.权利要求47或48的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中二十二碳五烯酸(DPA)n-6:EPA的比例下降。
50.权利要求47-49中任一项的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中DPA n-6:DHA的比例下降。
51.一种重组微藻，其包含：a)编码如下多肽的基因，其中该多肽是异源多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶亚基1(PFA1)或其功能等效物；b)编码如下多肽的基因，其中该多肽是异源PUFA合酶亚基2(PFA2)或其功能等效物；和c)编码如下多肽的基因，其中该多肽是异源PUFA合酶亚基3(PFA3)，其中a)、b)和c)的基因来自网粘菌纲，该网粘菌纲产生具有显著水平的二十碳五烯酸(C20:5,n-3)(EPA)的脂质，并且其中该重组微藻经修饰以增加PFA1和/或PFA3的表达。
52.权利要求51的重组微藻，其中与宿主微藻相比，衍生异源PFA1、PFA2和PFA3的该网粘菌纲产生更多的EPA。
53.权利要求51或权利要求52的重组微藻，其中该微藻经修饰以含有一个或多个启动子，其中该启动子可操作地连接至该编码PFA1的基因和/或该编码PFA3的基因。
54.权利要求51-53中任一项的重组微藻，其中该微藻经修饰以含有该编码PFA1的基因和/或该编码PFA3的基因的两个或更多个拷贝。
55.权利要求51-54中任一项的重组微藻，其中该编码PFA1的基因与SEQ ID NO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQ ID NO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列。
56.权利要求51-55中任一项的重组微藻，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个缺失。
57.权利要求51-55中任一项的重组微藻，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个突变。
58.权利要求51-57中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1的表达。
59.权利要求51-58中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。
60.权利要求51-59中任一项的重组微藻，其中该微藻是网粘菌纲。
61.权利要求60的重组微藻，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。
62.权利要求61的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。
63.权利要求62的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。
64.一种重组植物，其中该重组植物经修饰以改变编码异源多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达，其中该修饰涉及改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、或其功能等效物的表达；其中该重组植物还包括编码至少一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的多核苷酸，并且其中与宿主植物相比，该修饰的重组植物产生的脂质中的二十碳五烯酸(EPA)的水平增加。
65.权利要求64的重组植物，其中先前将基因PFA1、基因PFA2和PFA3转化至该重组植物。
66.权利要求64或权利要求65的重组植物，其中该重组植物经修饰以与该宿主植物相比时增加PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平。
67.权利要求66的重组植物，其中相对于该宿主植物，PFA1和/或PFA3的表达水平增加1.5倍。
68.权利要求64-67中任一项的重组植物，其中该重组植物经修饰以增加PFA1的表达。
69.权利要求64-68中任一项的重组植物，其中该重组植物经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。
70.权利要求64-69中任一项的重组植物，其中该植物经修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物。
71.权利要求64-70中任一项的重组植物，其中该植物经修饰以含有一个或多个植物特异性启动子，其中该启动子可操作地连接至该编码PFA1的基因和/或该编码PFA3的基因、或其功能等效物。
72.权利要求64-71中任一项的重组植物，其中该植物经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的多个拷贝。
73.权利要求70-72中任一项的重组植物，其中该编码PFA1的基因与SEQ ID NO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQ ID NO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列。
74.权利要求70-73中任一项的重组植物，其中该植物包含该编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。
75.权利要求70-74中任一项的重组植物，其中该植物包含该编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。
76.权利要求70-75中任一项的重组植物，其中该植物包含该编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。
77.权利要求64-76中任一项的重组植物，其中相对于该宿主植物，该脂质中的EPA增加至少2倍。
78.权利要求64-77中任一项的重组植物，其中相对于该宿主植物，该脂质中的EPA:二十二碳六烯酸(DHA)的比例增加至少2倍。
79.权利要求64-78中任一项的重组植物，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：高等植物；双子叶植物；单子叶植物；拟南芥；可消耗植物；油料植物；大豆；油菜籽；卡诺拉；亚麻籽；玉米；红花；向日葵；烟草；豆科植物；大豆属植物；花生；菜豆；蚕豆；和豌豆。
80.一种突变微藻，其中该微藻已经经历导致编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平改变的突变过程，其中该编码多不饱和脂肪酸合酶的基因包括编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、或其功能等效物；并且其中与野生型微藻相比，该突变微藻产生的脂质中的二十碳五烯酸(EPA)的水平增加。
81.权利要求80的突变微藻，其中PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平与该野生型微藻中PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平相比增加。
82.权利要求81的突变微藻，其中相对于该野生型微藻，PFA1和/或PFA3的表达水平增加至少2倍。
83.权利要求80-82中任一项的突变微藻，其中该微藻是网粘菌纲。
84.权利要求83的突变微藻，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。
85.权利要求84的突变微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。
86.权利要求85的突变微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。
87.权利要求80-86中任一项的突变微藻，其中PFA1或其功能等效物的表达与该野生型微藻中PFA1或其功能等效物的表达相比增加。
88.权利要求80-86中任一项的突变微藻，其中PFA1和PFA3、或其功能等效物的表达与该野生型微藻中PFA1和PFA3、或其功能等效物的表达相比增加。
89.权利要求80-88中任一项的突变微藻，其中相对于该野生型微藻，该脂质中的EPA增加至少2倍。
90.权利要求80-89中任一项的突变微藻，其中相对于该野生型微藻，该脂质中EPA:二十二碳六烯酸(DHA)的比例增加至少2倍。
91.权利要求80-89中任一项的突变微藻，其中相对于该野生型微藻，该脂质中的DHA增加。
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