KR101539470B1 - 키메라 ｐｕｆａ 폴리케타이드 신테이즈 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

키메라 ｐｕｆａ 폴리케타이드 신테이즈 시스템 및 이의 용도 Download PDF

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대니얼 에이치. 도허티
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Abstract

스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로부터 유래된 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 단백질 및 시스템을 포함하는, 키메라 PUFA PKS 단백질 및 키메라 PUFA PKS 시스템이 개시된다. 이러한 키메라 PUFA PKS 단백질 및 시스템을 코딩하는 핵산 및 단백질, 이러한 키메라 PUFA PKS 단백질 및 시스템을 포함하는 유전자 변형 생물, 및 이러한 키메라 PUFA PKS 단백질 및 시스템의 제조 및 사용 방법이 개시된다.
다중불포화 지방산 (PUFA), 폴리케타이드 신테이즈 (PKS), PUFA PKS 경로, 스키조키트리움, 트라우스토키트리움, 키메라 PUFA PKS

Description

키메라 ＰＵＦＡ 폴리케타이드 신테이즈 시스템 및 이의 용도{CHIMERIC PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS AND USES THEREOF}
관련 출원
각각의 하기의 특허 출원이 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다. 미국 특허 출원 번호 11/689,438 (2007년 3월 21일 출원); 미국 특허 출원 번호 10/965,017 (2004년 10월 13일 출원, 현재 미국 특허 번호 7,217,856); 미국 특허 출원 번호 10/810,352 (2004년 3월 26일 출원, 현재 미국 특허 번호 7,211,418); 미국 가출원 일련 번호 60/457,979 (2003년 3월 26일 출원); 미국 특허 출원 일련 번호 10/124,800 (2002년 4월 16일 출원); 미국 가출원 일련 번호 60/284,066 (2001년 4월 16일 출원); 미국 가출원 일련 번호 60/298,796 (2001년 6월 15일 출원); 미국 가출원 일련 번호 60/323,269 (2001년 9월 18일 출원); 미국 출원 일련 번호 09/231,899 (1999년 1월 14일 출원, 현재 미국 특허 번호 6,566,583); 미국 출원 번호 11/668,333 (2007년 1월 29일 출원); 미국 특허 출원 번호 11/452,096 (2006년 6월 12일 출원); 미국 가출원 번호 60/784,616 (2006년 3월 21일 출원); 미국 가출원 번호 60/689,167 (2005년 6월 10일 출원); 미국 특허 출원 번호 11/452,138 (2006년 6월 12일 출원); 미국 가출원 번호 60/784,616 (2006년 3월 21일 출원); 미국 가출원 번호 60/689,167 (2005년 6월 10일 출원); 미국 출원 일련 번호 09/090,793 (1998년 6월 4일 출원, 현재 미국 특허 번호 6,140,486).
본 발명은 키메라 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈(synthase) (PKS) 시스템, 특히 스키조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)으로부터의 키메라 PUFA PKS 시스템에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 이러한 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 핵산, 이러한 PUFA PKS 시스템, 이러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형 생물, 및 본원에 개시된 이러한 PUFA PKS 시스템의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템은 지방산 신테이즈 (FAS) 시스템에 관련되지만, 전형적으로 지방산에 대한 유사성을 거의 나타내지 않는 특수화된 생성물을 생산하도록 종종 고도로 변형되는 효소 복합체로서 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 그러나, 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 다중불포화 지방산 (PUFA)을 합성할 수 있는 PKS-유사 시스템 (본원에서 상호교환가능하게 PUFA PKS 시스템, PUFA 신테이즈 시스템, 또는 PUFA 생산용 PKS 시스템으로 또한 지칭됨)이 해양 박테리아 및 특정 진핵 생물에 존재하는 것으로 나타났다. 쉐와넬라(Shewanella) 및 또다른 해양 박테리아인 비브리오 마리누스(Vibrio marinus)에서의 PUFA 합성을 위한 PUFA PKS 경로가 미국 특허 번호 6,140,486에 상세하게 기술되어 있다. 진핵생물 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)인 스키조키트리움에서의 PUFA 합성을 위한 PUFA PKS 경로가 미국 특허 번호 6,566,583에 상세하게 기술되어 있다. 진핵생물 예컨대 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)의 구성원에서의 PUFA 합성 을 위한 PUFA PKS 경로가, 스키조키트리움에서의 PUFA PKS 시스템의 추가적인 기술 및 트라우스토키트리움에서의 PUFA PKS 시스템의 확인 (이러한 시스템들의 사용에 관한 상세사항 포함)을 포함하여, 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641 (2002년 12월 19일 공개), 및 미국 특허 출원 공개 번호 20070089199 (2007년 4월 19일 공개)에 기술되어 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127 (2004년 11월 25일 공개)에는 트라우스토키트리움에서의 PUFA PKS 시스템의 상세한 구조적 설명, 및 이러한 시스템을 사용하는 에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3) (EPA) 및 기타 PUFA의 생산에 관한 추가적인 상세사항이 개시되어 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995 (2005년 5월 12일 공개)에는 쉐와넬라 올레야나(Shewanella olleyana) 및 쉐와넬라 자포니카(Shewanella japonica)에서의 PUFA PKS 시스템의 구조적 및 기능적 설명, 및 이러한 시스템의 용도가 개시되어 있다. 이러한 출원들에는 PUFA PKS 경로를 이루는 유전자들로의 미생물 및 식물이 포함되는 생물의 유전자 변형, 및 이러한 생물에 의한 PUFA의 생산이 또한 개시되어 있다. 또한, PCT 특허 공개 번호 WO 05/097982에는 울케니아(Ulkenia)에서의 PUFA PKS 시스템이 기술되어 있고, 미국 특허 출원 공개 번호 20050014231에는 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum)으로부터의 PUFA PKS 유전자 및 단백질이 기술되어 있다. 상기에서 확인된 출원들 각각은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
연구원들은 제I형 (모듈형(modular) 또는 반복형(iterative)), 제II형 및 제III형으로 전형적으로 지칭되는 3가지 기본 유형 중 하나에 속하는 것으로 전통적으로 문헌에 기술된 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템을 활용하려고 시도하였 다. 명확하게 하기 위해, 제I형 모듈형 PKS 시스템은 기존에 간단히 "모듈형" PKS 시스템으로 또한 지칭되었고, 제I형 반복형 PKS 시스템은 기존에 간단히 "제I형" PKS 시스템으로 또한 지칭되었음을 유념한다. 제II형 시스템은 분리가능한 단백질들을 특징으로 하고, 이들 각각은 별개의 효소 반응을 수행한다. 효소들이 협력하여 작용하여 최종 생성물이 생산되고, 전형적으로 시스템의 각각의 개별적인 효소는 최종 생성물의 생산에 여러번 참여한다. 이러한 유형의 시스템은 식물 및 박테리아에서 발견되는 지방산 신테이즈 (FAS) 시스템과 유사한 방식으로 작동한다. 제I형 반복형 PKS 시스템은 효소들이 반복형 방식으로 사용되어 최종 생성물이 생산된다는 점에서 제II형 시스템과 유사하다. 제I형 반복형은 효소 활성들이, 분리가능한 단백질들과 관련되는 대신에, 더 큰 단백질의 도메인으로서 발생한다는 점에서 제II형과 상이하다. 이러한 시스템은 동물 및 진균에서 발견되는 제I형 FAS 시스템과 유사하다.
제II형 시스템과 달리, 제I형 모듈형 PKS 시스템에서는, 각각의 효소 도메인이 최종 생성물의 생산에서 한번만 사용된다. 이러한 도메인들이 매우 큰 단백질 내에서 발견되고, 각각의 반응의 생성물이 PKS 단백질 내의 또다른 도메인으로 전달된다. 추가적으로, 상기 기술된 PKS 시스템에서, 탄소-탄소 이중 결합이 최종 생성물 내로 혼입되는 경우, 이는 일반적으로 트랜스(trans) 배열이다.
제III형 시스템은 더욱 최근에 발견되었고, 식물 칼콘(chalcone) 신테이즈 패밀리의 축합 효소에 속한다. 제III형 PKS는 제I형 및 제II형 PKS 시스템과 다르고, 유리 아실-CoA 기질이 반복형 축합 반응에서 사용되어 헤테로고리형 최종 생성 물이 일반적으로 생산된다.
다중불포화 지방산 (PUFA)은 영양, 제약, 산업 및 기타 목적에 유용한 것으로 간주된다. 천연 공급원 및 화학적 합성으로부터의 현재의 PUFA 공급은 상업적인 요구에 충분하지 않다. 현재의 주요 PUFA 공급원은 해양 어류이지만, 어류 스톡(stock)이 감소하고 있고, 이는 지속가능한 자원이 아닐 수 있다. 추가적으로, 중금속 및 독성 유기 분자 양쪽으로부터의 오염이 해양 어류로부터 유래된 오일과의 심각한 문제이다. 오일 종자 작물로부터 유래된 식물성 오일은 비교적 저렴하고, 어류 오일과 관련된 오염 문제가 없다. 그러나, 상업적으로 개발된 식물 오일에서 발견되는 PUFA는 전형적으로 리놀레산 (18개의 탄소와 델타 9 및 12 위치에서의 2개의 이중 결합 - 18:2 델타 9,12) 및 리놀렌산 (18:3 델타 9,12,15)에 한정된다. 통상적인 PUFA 합성 경로 (즉, "표준" 경로 또는 "전통" 경로)에서, 중쇄(中鎖) 길이의 포화 지방산 (지방산 신테이즈 (FAS) 시스템의 생성물)이 일련의 신장 및 탈포화 반응에 의해 변형된다. 신장 반응의 기질은 지방 아실-CoA (신장될 지방산 사슬) 및 말로닐-CoA (각각의 신장 반응 동안 부가되는 2개의 탄소의 공급원)이다. 일롱게이즈(elongase) 반응의 생성물은 선형 사슬 내에 2개의 추가적인 탄소가 있는 지방 아실-CoA이다. 디세츄레이즈(desaturase)는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소를 추출함으로써 기존의 지방산 사슬 내에 시스(cis) 이중 결합을 생성시킨다. 디새츄레이즈의 기질은 인지질 (예를 들어 포스파티딜콜린)의 글리세롤 골격으로 에스테르화되는 지방산 또는 아실-CoA (일부 동물의 경우)이다.
따라서, 다수의 별도의 디새츄레이즈 및 일롱게이즈 효소들이 더욱 불포화되 고 더 긴 사슬의 PUFA를 생산하기 위한 리놀레산 및 리놀렌산으로부터의 지방산 합성에 필요하기 때문에, PUFA 예컨대 EPA 및 도코사헥사엔산 (DHA)의 발현을 위해 식물 숙주 세포를 조작하는 것은 합성을 달성하기 위해 여러 별도의 효소들의 발현을 요구할 수 있다. 추가적으로, 사용가능한 양의 이러한 PUFA의 생산을 위해, 추가적인 조작 노력이 요구될 수 있다. 따라서, PUFA를 천연적으로 생산하는 종으로부터 PUFA 생합성에 수반되는 유전자 물질을 수득하고 (예를 들어, PUFA PKS 시스템으로부터), 단리된 물질을 상업적인 양의 PUFA의 생산을 허용하도록 조작될 수 있는 이종성 시스템에서 단독으로 또는 조합하여 발현시키는 것이 흥미롭다.
내인성으로 생산된 지방산의 변형에 의해 오일-종자 작물 식물에서 PUFA를 생산하기 위한 많은 노력이 있었다. 이러한 식물들을 지방산 일롱게이즈 및 디새츄레이즈에 대한 다양한 개별적인 유전자로 유전자 변형시킴으로써 측정가능한 수준의 PUFA 예컨대 EPA를 함유하지만 사슬이 더 짧고 덜 불포화된 혼합된 PUFA를 현저한 수준으로 또한 함유하는 잎 또는 종자가 생산되었다 ([Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)]; PCT 공개 번호 WO 04/071467; [Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)); [Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387-393]; [Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479]; 또는 미국 특허 출원 공개 2004/0172682).
PUFA의 미생물 및 식물 생산에서의 개선은 고도로 요망되는 상업적 목표이다. 따라서, 특히 상업적으로 유용한 생물 예컨대 미생물 및 오일-종자 식물에서, 원하는 PUFA가 강화된 다량의 지질 (예를 들어, 트리아실글리세롤 (TAG) 및 인지질 (PL))을 효율적으로, 그리고 효과적으로 생산하는 방법이 당업계에서 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명의 한 실시양태는 제1 PUFA PKS 시스템과 비교하여 상이한 비율의 오메가-3 대 오메가-6 PUFA를 생산하는 키메라 PUFA PKS 시스템이 생산되도록, 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈(dehydrase) (DH) 도메인이 상이한 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인으로 교체된 키메라 PUFA PKS 시스템에 관한 것이다. 한 양상에서, 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인을 포함하는 단백질이 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인을 포함하는 상동성 단백질로 교체된다. 한 양상에서, 제1 또는 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인은 스키조키트리움 또는 트라우스토키트리움으로부터의 DH2 도메인에 상응한다. 한 양상에서, 제1 PUFA PKS 시스템은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 제2 PUFA PKS 시스템은 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템이다. 한 양상에서, 제1 PUFA PKS 시스템은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfC가 상이한 트라우스토키트리드로부터의 OrfC로 교체된다.
이러한 실시양태의 한 양상에서, 제1 PUFA PKS 시스템은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfC가 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC로 교체된다. 한 양상에서, 이러한 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC는 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열 에 의해 코딩된다. 예시적인 핵산 서열은 서열 70을 포함한다. 추가적인 양상에서, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfA가 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA로 교체된다. 한 양상에서, 이러한 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA는 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 예시적인 핵산 서열은 서열 71을 포함한다. 또다른 추가적인 양상에서, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfB가 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfB로 교체된다. 한 양상에서, 이러한 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfB는 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 예시적인 핵산 서열은 서열 72를 포함한다. OrfA, OrfB 및 OrfC의 또다른 조합이 본 명세서를 기초로 당업자에게 명백할 것이다.
이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 제1 PUFA PKS 시스템은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfC의 DH2 도메인이 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인으로 교체된다. 한 양상에서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 예시적인 핵산 서열은 서열 73을 포함한다. 한 양상에서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인은 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 이러한 핵산 서열이 서열 75를 포함하는 핵산 서열에 의해 예시된다.
이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 74에 대해 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 한 양상에 서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 2, 서열 4 및 서열 74를 포함한다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 39, 서열 4 및 서열 62를 포함한다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 39, 서열 4 및 서열 74를 포함한다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 1, 서열 3 및 서열 70을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 1, 서열 3 및 서열 73을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 1, 서열 3 및 서열 75를 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 서열 71, 서열 3 및 서열 70을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 키메라 PUFA PKS 시스템을 생물에서 발현시키는 것을 포함하는, 제1 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 다중불포화 지방산 (PUFA)의 오메가-3 대 오메가-6 비율을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 한 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 미생물에 의해 발현된다. 한 양상에서, 미생물은 스키조키트리움이다. 또다른 양상에서, 미생물은 효모이다. 한 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 식물에 의해 발현된다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 키메라 PUFA PKS 시스템을 포함하는, 유전자 변형된 미생물 또는 식물 또는 식물의 일부분에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 PUFA의 생산을 증가시키고 제1 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 다중불포화 지방산 (PUFA)의 오메가-3 대 오메가-6 비율을 변 경시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 제1 PUFA PKS 시스템과 비교하여 상이한 비율의 오메가-3 대 오메가-6 PUFA를 생산하는 키메라 PUFA PKS 시스템이 생산되도록 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인이 상이한 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인으로 교체된 키메라 PUFA PKS 시스템을 생물에서 발현시키는 것을 포함한다. 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH 도메인은 제1 PUFA PKS 시스템이 유래되는 생물의 코돈 사용빈도에 대해 최적화된다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 74에 대해 95％ 이상 동일한 키메라 OrfC 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 양상에서, 단리된 핵산 분자는 서열 73에 대해 95％ 이상 동일한 핵산 서열을 포함한다. 한 양상에서, 핵산 서열은 핵산 분자가 발현될 생물의 코돈 사용빈도에 대해 최적화된다. 예를 들어, 핵산 서열이 키메라 단백질의 일부분이 유래된 생물의 코돈 사용빈도에 대해 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 75에 대해 95％ 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 핵산 분자로 형질감염된 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 한 양상에서, 세포는 미생물이다. 한 양상에서, 미생물은 스키조키트리움이다. 한 양상에서, 미생물은 박테리아이다. 한 양상에서, 미생물은 효모이다. 한 양상에서, 세포는 식물 세포이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 재조합 숙주 세포를 포함하는, 유전자 변형된 식물 또는 이의 일부분에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕테이즈(reductase) (ER) 도메인; (b) 4개 이상의 ACP 도메인; (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼레이즈(acyltransferase) (AT) 도메인; (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 도메인; (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; (g) 1개 이상의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템에 관한 것이다. DH 도메인들 중 하나 이상은 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 것이고, 나머지 도메인 (a)-(h)는 상이한 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 PUFA PKS 시스템을 발현하는 생물에 의한 PUFA 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 PUFA PKS 시스템 내의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 생물 또는 관련된 생물의 최적화된 코돈 사용빈도에 대해 변형시키는 것을 포함한다. 한 양상에서, 생물은 이종성 재조합 PUFA PKS 시스템을 발현한다. 한 양상에서, 생물은 스키조키트리움이고, 내인성 PUFA PKS 시스템 내의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된다.
도 1은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조의 그래프식 설명이 다.
도 2a는 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC를 코딩하는, 스키조키트리움 코돈에 대해 최적화된 합성 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 (pThOrfC synPS)의 구축의 단계 1, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 2b는 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC를 코딩하는, 스키조키트리움 코돈에 대해 최적화된 합성 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 (pThOrfC synPS)의 구축의 단계 2, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 3a는 트라우스토키트리움 23B로부터의 천연 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDS49)의 구축의 단계 1-6, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 3b는 트라우스토키트리움 23B로부터의 천연 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDS49)의 구축의 단계 7, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 3c는 트라우스토키트리움 23B로부터의 천연 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDS49)의 구축의 단계 8-9, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 4a는 트라우스토키트리움 23B로부터의 스키조키트리움 코돈에 대해 최적화된 합성 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDD24)의 구축에서의 제1 단계로서의 플라스미드 DD21의 구축, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 4b는 트라우스토키트리움 23B로부터의 스키조키트리움 코돈에 대해 최적화된 합성 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDD24)의 구축에서의 제2 단계로서의 플라스미드 DD22의 구축, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 4c는 트라우스토키트리움 23B로부터의 스키조키트리움 코돈에 대해 최적화된 합성 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 플라스미드 (pDD24)의 구축에서의 최종 단계로서의 플라스미드 DD24의 구축, 뿐만 아니라 프로세스에 의해 생산되는 중간체 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 5는 대조군 효모 및 스키조키트리움 OrfsA, OrfsB, OrfC 및 Het I을 발현하는 효모의 FAME 프로파일이다.
도 6은 표적 PUFA의 생산을 도해하기 위해 확대된, 도 5로부터의 효모의 FAME 프로파일이다.
일반적으로 본 발명은 트라우스토키트리드 (예를 들어, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움), 라비린툴리드(labyrinthulid), 해양 박테리아, 및 기타 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS)-함유 생물로부터의 PUFA PKS 시스템이 포함되는 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신테이즈 시스템으로 또한 공지됨), 및 이로부터 생산된 키메라 PUFA PKS 단백질 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형 생물, 및 생체활성 분자가 포함되는 관심 생성물의 생산을 위한 이러한 시스템의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 PUFA PKS 시스템을 발현하도록 유전자 변형된 미생물 또는 오일-종자 식물 또는 식물의 일부분에서 PUFA를 생산하는 방법에 관한 것이다. 미생물 또는 식물에 의해 생산된 오일은 PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 하나 이상의 PUFA를 함유하고, 식물의 경우에는, FAS 시스템의 생성물의 변형에 의해 생산된 지방산 생성물인, 사슬이 더 짧고 덜 불포화된 PUFA가 실질적으로 혼합되어 있지 않다. 본 발명은 PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 PUFA의 양 및 PUFA의 비율, 및 본 발명의 한 양상의 경우에는 오메가-3 대 오메가-6 PUFA의 비율 또는 하나의 PUFA 대 또다른 PUFA(들)의 비율 (예를 들어, DHA 대 EPA의 비율)을 변형시키는 방법을 구체적으로 포함하고, 이는 본원에 상세하게 예시 및 기술된 바와 같이 임의의 PUFA PKS 구축물 및/또는 유전자 변형 생물의 생성 및 사용에 적용될 수 있다.
첫번째로, 본 발명가들은 한가지를 초과하는 PUFA가 생산되는 경우 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 PUFA들의 비율을 변형시키는데 필요충분한 PUFA PKS 시스템의 도메인을 본원에서 기술하고, 이러한 발견을 사용하는 신규 키메라 구축물, 신규 키메라 PUFA PKS 시스템, 신규 생물, 및 변형된 양의 PUFA들을 생산하는 신규 방법을 제공한다. 두번째로, 본 발명가들은 생물에 의한 PUFA 생산을 증가시키기 위해 이종성 숙주 (또는 내인성 숙주)에서 PUFA PKS 발현을 최적화하기 위한 방법, 변형, 및 다양한 키메라 PUFA PKS 시스템 및 구축물을 본원에서 기술한다. 본 발명은 생물에서 PUFA 생산을 강화시키고 지시하기 위해 이러한 2가지 발견을 단독으로 또는 함께 사용하는 것의 상세한 설명을 포함한다.
더욱 특히, 본 발명의 특정 실시양태들과 관련하여, 본 발명가들 및 동료들의 기존의 연구 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 실시예 8 참조)는 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 영역 (본원에서 서열 62로 표시됨)이 게놈 내의 orfC 유전자좌 내의 스키조키트리움 orfC 코딩 영역을 기능적으로 교체할 수 있음을 실연하였다. 이는 먼저 항생제 저항성 카셋트를 함유하는 스키조키트리움 orfC 코딩 영역을 이의 자리에서 완전히 결실 (ΔorfC::ZEO로 표시됨)시켜, DHA 및 Zeocin™에 대한 저항성이 성장에 필수적으로 필요한 균주 (B32-Z1로 표시됨)를 초래함으로써 결정되었다. 그후, Th.23B orfC 코딩 영역이 정확히 스키조키트리움 orfC 상류와 하류 비-코딩 영역 사이에 클로닝된 플라스미드를 구축하였다. 스키조키트리움 ΔorfC::ZEO 균주의 이러한 Th.23B orfC 구축물로의 형질전환으로 결실의 상보성, 및 자가영양성 (비-DHA-요구성)인 Zeocin-감수성 형질전환체가 초래되었다. 이러한 형질전환체들이 Th.23B orfC 코딩 영역이 스키조키트리움으로부터의 것을 정확하게 치환하도록 하는 orfC 유전자좌에서의 이중 교차 재조합 이벤트, 즉 유전자 교체로부터 유래되었음이 결정되었다. 이러한 형질전환체들의 지방산 함량의 분석은 DHA/DPA 비율이 약 2.3 (야생형 스키조키트리움 ATCC20888)에서 약 8.3 (대략적으로 Th.23B의 비율)으로 변화되었음을 나타냈다. 이러한 결과는 orfC 유전자 (스키조키트리움 및 트라우스토키트리움에서 DH1, DH2 및 ER의 3개의 도메인 함유)가 PUFA 생성물의 n-3/n-6 (오메가-3/오메가-6) 비율을 결정하는데 있어서 주요한 역할을 한다는 것을 가리켰다. 그러나, Th.23B orfC-함유 균주에서의 전체 PUFA 생산은, 상당하기는 하지만, 야생형 스키조키트리움 숙주 (약 60％)보다 더 낮았다.
이러한 2개의 orfC 코딩 영역의 검사는 Th.23B 유전자가 스키조키트리움과 트라우스토키트리움 간의 코돈 사용빈도의 명백하게 상이한 차이로 인해 스키조키트리움에서 불량하게 발현되는 것으로 본 발명가들이 간주하도록 하였다. 현재 본 발명가들은 코돈 사용빈도가 스키조키트리움 패턴에 대해 최적화된 "합성" Th.23B orfC 코딩 영역 (즉, 합성에 의해 생산된 코딩 영역)을 사용함으로써, 비-합성 Th.23B orfC에서 나타난 증가된 n-3/n-6 비율이 유지되면서 DHA 생산이 강화되었음을 발견하였다 (실시예 1 및 4 참조).
본 발명가들은 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움에 대한 OrfC 단백질 내의 확인가능한 도메인들인 디하이드라테이즈(dehydratase) 1 (DH1), 디하이드라테이즈 2 (DH2), 및 에노일 리덕테이즈 (ER)의 존재를 또한 기존에 기술하였고 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641 (상기); 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127 (상기) 참조), OrfC 내의 이러한 도메인들 중 하나 이상이 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 지방산의 유형 및/또는 비율을 제어하는데 수반되는 것으로 여겨졌음을 교시하였다. 여기에서, 본 발명가들은 스키조키트리움, 대장균, 및 효모 시스템에서, DH2 도메인 단독이 오메가-3 대 오메가-6 (n-3/n-6) 지방산 비율에 대한 PUFA PKS 시스템의 효과의 대부분 또는 전체를 담당한다는 것을 실연하였다. 특히, 본 발명가들은 다양한 트라우스토키트리움 23B OrfC 도메인이 스키조키트리움 OrfC 내의 상응하는 도메인을 교체하는데 사용된 실험들을 최초로 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음). 본 발명가들은 스키조키트리움 OrfC-ER 도메인을 트라우스토키트리움으로부터의 도메인으로 교체하는 것이 DHA/DPA 비율을 야생형 스키조키트리움 (역사상 대략 2.3)과 비교하여 현저하게 변화시키지 않았음을 발견하였다. 그러나, 스키조키트리움 DH 도메인 양쪽 모두를 트라우스토키트리움으로부터의 상응하는 도메인으로 교체하는 것은 DHA/DPA 비율을 야생형 트라우스토키트리움 23B의 비율 (역사상 대략 8.3-10)을 향해 현저하게 증가시켰고, 스키조키트리움 DH2 도메인만을 트라우스토키트리움 23B로부터의 도메인으로 교체하는 것이 동일한 결과를 효과적으로 달성하는데 충분하였다. 실시예 2, 3, 4, 5, 및 6은 PUFA PKS 시스템에서의 오메가-3 대 오메가-6 (n-3/n-6) 지방산 비율에 대한 DH2 도메인의 효과를 실연하는 다양한 실험 결과를 제공한다.
본 발명가들은 숙주 생물에 의한 PUFA의 생산을 증가시키기 위한 다양한 키메라 PUFA PKS 시스템의 용도를 또한 기술하고, 어떤 키메라 PUFA PKS 조합 (예를 들어, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로부터의 Orf들의 특정 조합으로 구성된 키메라 PUFA PKS 시스템)에 천연 생물 또는 다른 키메라 PUFA PKS 시스템에 비해 현저하게 더 높은 PUFA 생산, 한 예의 경우에는 DHA 생산이 있었음을 뜻밖에 발견하였다. 예를 들어, 본 발명가들은 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA 및 OrfC 및 스키조키트리움으로부터의 OrfB로 구성된 키메라 PUFA PKS 시스템이, 스키조키트리움 숙주 생물에서 발현되는 경우, 천연 스키조키트리움보다 또는 이러한 2가지 생물로부터 유래된 다른 키메라 PUFA PKS 시스템보다 현저하게 더 많은 지방산, 특히 현저하게 더 많은 DHA를 생산한다는 것을 실연한다 (실시예 8). 따라서, 본 발명은 일부 야생형 (비-키메라) PUFA 신테이즈와 비교하여 PUFA 생산이 증가되었고 n-3/n-6 비율이 개선된 여러 상이한 PUFA PKS 시스템의 생산에 대한 실질적인 안내를 제공한다.
본원에서 사용된 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신테이즈 시스템, PUFA 신테이즈, 또는 PUFA 생산을 위한 PKS-유사 시스템으로 또한 지칭될 수 있음)에는 일반적으로 하기의 식별 특색들이 있다: (1) PUFA, 특히, 장쇄 PUFA를 시스템의 천연 생성물로서 생산함; 및 (2) 지방산 사슬의 반복형 프로세싱, 뿐만 아니라 선택된 사이클에서의 트랜스-시스 이성화(isomerization) 및 에노일 환원 반응이 포함되는 비-반복형 프로세싱 양쪽 모두를 수행하는 복합체로 조립된 여러 다기능성 단백질을 포함함. 추가적으로, PUFA 신테이즈 효소 내에 존재하는 ACP 도메인은 보조인자 (4-포스포판테테인)의 부착에 의한 활성화를 필요로 한다. 이러한 보조인자의 부착은 포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase)에 의해 수행된다. 숙주 생물의 내인성 PPTase가 PUFA 신테이즈 ACP 도메인을 활성화시킬 수 없으면, 이러한 기능을 수행할 수 있는 PPTase를 제공하는 것이 필요하다. PUFA 신테이즈 ACP 도메인을 활성화시키기 위한 예시적이고 적절한 PPTase로서 노스톡(Nostoc) 종의 HetI 효소가 본 발명가들에 의해 확인되었다. PUFA PKS 시스템 또는 PUFA 신테이즈에 관한 언급은 생물에서 PUFA를 생산하기 위해 복합체로 작용하는 유전자들 및 이들의 코딩 생성물 모두를 총괄적으로 지칭한다. 따라서, PUFA PKS 시스템은 천연 생성물이 PUFA인 PKS 시스템을 구체적으로 지칭한다.
더욱 구체적으로, 본원에서 언급된 PUFA PKS 시스템은 다중불포화 지방산 (PUFA), 특히 장쇄 PUFA를 생성물로서 생산한다. 예를 들어, 내인성으로 (천연적으로) PUFA PKS 시스템을 함유하는 생물은 이러한 시스템을 사용하여 PUFA를 제조한다. 본 발명에 따르면, PUFA는 탄소 사슬 길이가 탄소 16개 이상, 더욱 바람직하게는 탄소 18개 이상, 더욱 바람직하게는 탄소 20개 이상, 더욱 바람직하게는 탄소 22개 이상이고, 3개 이상의 이중 결합, 바람직하게는 4개 이상, 더욱 바람직하게는 5개 이상, 더욱 더 바람직하게는 6개 이상의 이중 결합이 있으며, 이때 모든 이중 결합은 시스 배열인 지방산이다. 본원에서 장쇄 다중불포화 지방산 (LCPUFA)에 대한 언급은 탄소 사슬 길이가 18 이상, 바람직하게는 탄소 사슬 길이가 20 이상이고 3개 이상의 이중 결합을 함유하는 지방산을 더욱 특히 지칭한다. 오메가-6 시리즈의 LCPUFA에는 감마-리놀렌산 (C18:3), 디-호모-감마-리놀렌산 (C20:3n-6), 아라키돈산 (C20:4n-6), 아드렌산 (도코사테트라엔산 또는 DTA로 또한 칭해짐) (C22:4n-6), 및 도코사펜타엔산 (C22:5n-6)이 포함된다. 오메가-3 시리즈의 LCPUFA에는 알파-리놀렌산 (C18:3), 에이코사트리엔산 (C20:3n-3), 에이코사테트라엔산 (C20:4n-3), 에이코사펜타엔산 (C20:5n-3), 도코사펜타엔산 (C22:5n-3), 및 도코사헥사엔산 (C22:6n-3)이 포함된다. LCPUFA에는 C28:8(n-3)이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 탄소가 22개를 초과하고 이중 결합이 4개를 초과하는 지방산이 또한 포함된다.
두번째로, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 지방산 사슬의 반복형 프로세싱, 뿐만 아니라 선택된 사이클에서의 트랜스-시스 이성화 및 에노일 환원 반응이 포함되는 비-반복형 프로세싱 양쪽 모두를 수행하는 복합체로 조립된 여러 다기능성 단백질을 포함한다 (그리고, 단일 기능 단백질들, 특히 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 시스템을 위한 것을 포함할 수 있다). 이러한 단백질들은 본원에서 코어(core) PUFA PKS 효소 복합체 또는 코어 PUFA PKS 시스템으로 또한 지칭될 수 있다. 이러한 단백질들 내에 함유된 도메인 및 모티프(motif)들의 일반적인 기능은 개별적으로 당업계에 공지되어 있고, 해양 박테리아 및 진핵 생물로부터의 다양한 PUFA PKS 시스템과 관련하여 상세하게 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,140,486; 미국 특허 번호 6,566,583; [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641; 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127; 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995, 및 PCT 공개 번호 WO 2006/135866 참조). 상기 언급된 바와 같이, 도메인들은 단일 단백질로서 발견될 수 있거나 (즉, 도메인과 단백질이 동의어임), 또는 단일 단백질 내의 2개 이상 (다중) 도메인의 하나로서 발견될 수 있다.
해양 박테리아 내의 PUFA PKS 시스템의 발견 (미국 특허 번호 6,140,486 참조) 이전에, PKS 시스템은 반복형 및 선택형 효소 반응의 이러한 조합을 보유하는 것으로 공지되지 않았고, 시스 배열의 탄소-탄소 이중 결합을 생산할 수 있는 것으로 생각되지 않았다. 그러나, 본 발명에 의해 기술된 PUFA PKS 시스템에는 시스 이중 결합을 도입하는 능력 및 사이클 내의 반응 순서를 바꾸는 능력이 있다.
본 발명가들은 PUFA PKS 시스템의 이러한 특색을 사용하여 기존에 기술된 (제I형 반복형 또는 모듈형, 제II형, 또는 제III형) PKS 시스템에 의해 생산될 수 없는 다양한 생활성 분자를 생산하는 것을 제안한다. 이러한 생활성 분자는 다중불포화 지방산 (PUFA), 항생제 또는 기타 생활성 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이들 중 다수는 하기에 논의될 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 PUFA PKS 유전자 구조의 지식을 사용하여, 다수의 방법 중 임의의 방법이 새로운 생성물이 생산되도록 PUFA PKS 유전자를 변경시키거나, 또는 이러한 유전자들의 일부를 또다른 합성 시스템 (또다른 PKS 시스템 포함)과 조합하는데 사용될 수 있다. 반복형 및 선택형 반응 양쪽 모두를 수행하는 이러한 특정 유형의 시스템의 고유의 능력은 이러한 시스템이 유사한 방법이 다른 유형의 PKS 시스템에 적용되는 경우에는 발견되지 않을 생성물을 산출할 수 있게 할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 적어도 하기의 생물학적으로 활성인 도메인들 (전형적으로 3개 이상의 단백질 내에 함유됨)을 포함한다: (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인; (b) 다중 아실 캐리어(carrier) 단백질 (ACP) 도메인(들) (예를 들어, 적어도 1개 내지 4개, 바람직하게는 5개 이상의 ACP 도메인, 및 일부 실시양태에서는 6개, 7개, 8개, 9개, 10개까지의, 또는 10개를 초과하는 ACP 도메인); (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼레이즈 (AT) 도메인; (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 도메인; (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; (g) 1개 이상의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 디하이드라테이즈 (DH) 보존 활성 부위 모티프를 함유하는 하나 이상의 영역을 또한 포함한다.
한 실시양태에서, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템은 적어도 하기의 생물학적으로 활성인 도메인들을 포함한다: (a) 2개의 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인; (b) 4개 또는 5개 내지 10개 이상 사이의 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인, 및 한 양상에서는 9개의 ACP 도메인; (c) 2개의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (d) 1개의 아실트랜스퍼레이즈 (AT) 도메인; (e) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 도메인; (f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; (g) 1개의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템은 FabA-유사 DH 도메인의 일부가 아닌 디하이드라테이즈 (DH) 보존 활성 부위 모티프를 함유하는 하나 이상의 영역 또는 도메인을 또한 포함한다. 일반적으로 이러한 도메인들의 구조적 및 기능적 특징은 개별적으로 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련하여 하기에 상세하게 기술될 것이다.
또다른 실시양태에서, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템은 적어도 하기의 생물학적으로 활성인 도메인들을 포함한다: (a) 2개의 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인; (b) 4개 또는 5개 내지 10개 이상 사이의 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인, 및 한 양상에서는 8개의 ACP 도메인; (c) 2개의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (d) 1개의 아실트랜스퍼레이즈 (AT) 도메인; (e) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 도메인; (f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; (g) 1개의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템은 FabA-유사 DH 도메인의 일부가 아닌 디하이드라테이즈 (DH) 보존 활성 부위 모티프를 함유하는 하나 이상의 영역 또는 도메인을 또한 포함한다. 일반적으로 이러한 도메인들의 구조적 및 기능적 특징은 개별적으로 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련하여 하기에 상세하게 기술될 것이다.
PUFA PKS 시스템은 하나 이상의 부속 단백질을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 단백질은 상기 기술된 바와 같은 코어 PUFA PKS 시스템의 일부로 간주되지 않지만 (즉, PUFA 신테이즈 효소 복합체 자체의 일부분이 아님), 특히 특정 숙주 생물 (예를 들어, 식물)에서, 본 발명의 코어 PUFA 신테이즈 효소 복합체를 사용하는 PUFA 생산에, 또는 적어도 효율적인 PUFA 생산에 필요할 수 있거나 필요한 단백질로서 본원에서 정의된다. 예를 들어, PUFA를 생산하기 위해, PUFA PKS 시스템은 4'-포스포판테테이닐 모이어티(moiety)를 보조효소 A에서 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인(들)로 전달하는 부속 단백질과 함께 일해야 한다. 따라서, PUFA PKS 시스템이 하나 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase) 도메인을 포함하는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 이러한 도메인이 PUFA PKS 시스템에 대한 부속 도메인 또는 단백질인 것으로 간주될 수 있다. 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템을 발현하도록 생물 (예를 들어, 미생물 또는 식물)을 유전자 변형시키는 경우, 일부 숙주 생물은 PUFA를 생산하기 위해 PUFA PKS와 함께 일할 필요가 있는 부속 단백질 (예를 들어, PPTase)을 내인성으로 발현할 수 있다. 그러나, 일부 생물은, 생물이 상동성 부속 단백질을 내인성으로 생산하는 경우에도, 생물에 의한 PUFA의 생산을 가능하게 하고/하거나 강화하기 위해 하나 이상의 본원에 기술된 부속 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환될 수 있다 (즉, 일부 이종 부속 단백질이 숙주 세포의 내인성 부속 단백질보다 형질전환된 PUFA 신테이즈 단백질과 더욱 효과적으로 또는 효율적으로 작용할 수 있다). 본 발명 및 기존의 출원은 부속 PPTase를 포함하는 본 발명의 PUFA PKS 시스템으로 유전자 변형된 박테리아 및 효모의 예를 제공한다. 부속 PPTase를 포함하는 PUFA PKS 시스템으로 유전자 변형된 식물이 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20070089199 참조). PPTase의 구조적 및 기능적 특징들이 하기에 더욱 상세하게 기술될 것이다.
진핵 생물에서의 장쇄 PUFA (LCPUFA)의 합성을 위한 "표준" 또는 "전통" 경로는 중쇄-길이의 포화 또는 단일-불포화 지방산 (예를 들어, 상기 기술된 FAS 시스템의 생성물)의 변형을 수반한다. 이러한 변형은 신장 단계 및 탈포화 단계로 구성된다. 신장 반응의 기질은 지방 아실-CoA (신장될 지방산 사슬) 및 말로닐-CoA (각각의 신장 반응 동안 부가되는 2개의 탄소의 공급원)이다. 일롱게이즈 반응의 생성물은 선형 사슬 내에 2개의 추가적인 탄소가 있는 지방 아실-CoA이다. 일반적으로 유리 지방산 (FFA)은 이러한 반응 사이클에서 발생하지 않는다. 디새츄레이즈는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소를 추출함으로써 기존의 지방산 사슬 내에 시스 이중 결합을 생성시킨다. 디새츄레이즈의 기질은 PL (예를 들어, 포스파티딜콜린)의 글리세롤 골격으로 에스테르화되는 지방산 또는 아실-CoA (일부 동물의 경우)이다. 또다시, FFA는 이러한 반응 메커니즘에서 발생하지 않는다. 따라서, FFA가 "표준" 또는 "전통" LCPUFA 합성 경로에서 발생하는 유일한 시기는 일부 FAS 시스템으로부터 지방산이 방출되는 동안이다. 상기 논의된 바와 같이, 이는 전형적으로 탄소수 16 또는 18의 지방산이고, 일반적으로 포화 또는 단일불포화 지방산이며, 더 긴 사슬의 PUFA 예컨대 EPA 또는 DHA가 아니다. 장쇄 PUFA 생산을 위한 이러한 계획의 한가지 결과는 경로의 중간체가 종종 축적되어, 시스템에 의해 생산된 신규 지방산의 대부분을 종종 나타낸다는 것이다.
따라서, 본 발명에 따르면, PUFA의 생산을 위한 "표준" 또는 "전통" 경로에 대한 언급은 중쇄 길이의 포화 지방산 (예를 들어, 지방산 신테이즈 (FAS) 시스템의 생성물)이 일련의 신장 및 탈포화 반응에 의해 변형되는 지방산 합성 경로를 지칭한다. 신장 반응의 기질은 지방 아실-CoA (신장될 지방산 사슬) 및 말로닐-CoA (각각의 신장 반응 동안 부가되는 2개의 탄소의 공급원)이다. 일롱게이즈 반응의 생성물은 선형 사슬 내에 2개의 추가적인 탄소가 있는 지방 아실-CoA이다. 디새츄레이즈는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소를 추출함으로써 기존의 지방산 사슬 내에 시스 이중 결합을 생성시킨다. 이러한 경로 및 이러한 경로에서 수반되는 유전자는 문헌에 주지되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "지질"에는 인지질 (PL); 유리 지방산; 지방산의 에스테르; 트리아실글리세롤 (TAG); 디아실글리세리드; 모노아실글리세리드; 포스파티드; 왁스 (알콜과 지방산의 에스테르); 스테롤 및 스테롤 에스테르; 카로카로티노이드; 크산토필 (예를 들어, 옥시카로티노이드); 탄화수소; 및 당업자에게 공지된 기타 지질이 포함된다. 용어 "다중불포화 지방산" 및 "PUFA"은 유리 지방산 형태뿐만 아니라, 다른 형태, 예컨대 TAG 형태 및 PL 형태를 또한 포함한다.
생물/숙주에 의한 PUFA PKS 단백질, 도메인 또는 시스템의 발현과 관련하여 "이종" 생물 또는 "이종" 숙주에 대한 언급은, 비록 PUFA PKS 시스템이 숙주 생물에 의해 천연적으로 발현되는 단백질, 도메인 또는 일부분을 포함할 수 있지만, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 단백질, 도메인 또는 일부분이 생물에 의해 천연적으로 (내인성으로) 발현되는 단백질, 도메인 또는 일부분이 아니라는 것을 의미한다 (예를 들어, 숙주 생물로부터 유래된 서열 및 상이한 생물 또는 상이한 단백질로부터 유래된 서열을 함유하는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질).
다양한 키메라 단백질을 코딩하는 특정한 예시적인 핵산 분자 (구축물)들이 본원에 기술된다 (실시예 참조). 본 발명에 따르면, "키메라 단백질"은 2개 이상의 완전한 또는 부분적인 유전자 또는 핵산 서열을 함께 스플라이싱(splicing) 또는 연결 (결찰)시킴으로써 생산된 핵산 서열에 의해 코딩되는 조작된 단백질이다. "키메라 PUFA PKS 시스템"은 2개 이상의 상이한 PKS 시스템으로부터의 단백질 및/또는 도메인 (키메라 단백질 및/또는 도메인 포함)을 함유하는 PUFA PKS 시스템이다. 예를 들어, 스키조키트리움 PUFA PKS OrfA 및 OrfB 및 트라우스토키트리움 PUFA PKS OrfC로 구성된 키메라 PUFA PKS 시스템이 실시예에서 기술된다. 스키조키트리움 PUFA PKS OrfA, OrfB, 및 DH2 도메인을 제외한 모든 OrfC로 구성되고, 상기 DH2 도메인은 트라우스토키트리움 PUFA PKS로부터의 PUFA PKS DH2 도메인인 키메라 PUFA PKS 시스템이 또한 실시예에서 기술된다. 따라서 이러한 후자의 키메라 PUFA PKS 시스템은 키메라 단백질 (키메라 OrfC 단백질)을 포함한다. 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 트라우스토키트리움 핵산 서열을 사용하는 동일한 키메라가 또한 기술되어, PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 생성물을 변경시키는데 사용될 수 있는 유전자 조작의 조합을 실연한다 (실시예 참조). 다양한 또다른 키메라 PUFA PKS 시스템들이 또한 실시예에 기술된다.
본원에서 사용된 "코돈 최적화" 또는 이의 파생 구절은 소정의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 변형 (변경, 변화, 돌연변이)시켜, 서열 내의 하나 이상의 코돈을 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 발현될 특정 생물의 핵산 서열에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 교체하는 프로세스를 지칭한다. 당업자는 코돈 편향, 및 코돈 최적화의 일반적인 개념을 이해한다. 더욱 특히, 소정의 코돈이 유전자 코드에서 나타나는 정도는 생물들 사이에서 현저하게 다를 수 있다 (예를 들어, 하나의 속 내의 종들 사이 포함). 생물이 더 작은 비율의 시간 동안 또는 동일한 아미노산에 대한 또다른 코돈보다 덜 사용하는 임의의 코돈은 단백질 발현에 문제를 야기할 수 있다. 따라서, 사용될 핵산 서열의 코돈 빈도가 숙주 발현 시스템/생물의 것과 매칭되는 경우 (예를 들어, 아미노산 서열을 변형시키지 않으면서, 희귀하거나 드물거나 또는 덜 빈번하게 사용되는 코돈을 숙주 시스템의 천연 코돈 편향을 더욱 밀접하게 반영하는 코돈으로 교체함으로써), 단백질 발현이 극적으로 개선될 수 있다.
본 발명가들은 핵산 서열의 코돈 사용빈도를 스키조키트리움의 것에 대해 최적화하는 방법을 본원에서 기술하지만, 이는 본 발명에서의 코돈 최적화의 용도의 단지 하나의 예이다. 본 발명에 따르면, 소정의 단백질 (예를 들어, PUFA PKS 단백질)을 코딩하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열이 핵산 분자가 발현될 숙주 세포 또는 생물의 최적의 (최적화된) 코돈 사용빈도를 위해 변형 (예를 들어, 합성, 돌연변이, 재조합 기술 등에 의해)될 수 있거나, 또는 상이한 생물의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 변형될 수 있다 (예를 들어, 식물에서의 발현을 위한 트라우스토키트리움 PUFA PKS 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화될 수 있다). 실시예의 표 1은 스키조키트리움에 대한 최적화된 코돈 사용빈도를 나타낸다 .
또한, 본 발명가들은 소정의 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 핵산 서열을 핵산 서열이 유래, 습득 또는 수득된 동일한 숙주에 대해 이러한 숙주 (또는 또다른 숙주)에서의 발현을 위해 최적화하는 것을 본원에서 제안한다. 이러한 후자의 본 발명의 실시양태는, 예를 들어, 한 생물로부터의 단백질 (예를 들어, 스키조키트리움으로부터의 PUFA PKS 단백질)을 코딩하는 핵산 분자가 동일한 생물 (이러한 경우는 스키조키트리움)이 선호하는 코돈 사용빈도를 강화 (코돈 사용빈도를 최적화)하기 위해 변형 (예를 들어, 핵산 서열의 재합성 및 특정 뉴클레오티드의 교체에 의해)되는 일종의 "유도형(directed)" 또는 "가속화(accelerated)" 발달을 나타낸다. 그후, 이러한 핵산 분자가 스키조키트리움에서 (재조합 핵산 분자로서), 또는 또다른 숙주 세포 또는 생물에서 (예를 들어, 식물에서) 발현될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생물로부터의 소정의 핵산 서열이 이러한 생물에 대해 결정될 수 있는 최적의 코돈 (코돈 편향)을 사용하지 않을 수 있음이 제안된다. 따라서, 이러한 생물에서의 단백질 발현을 개선시키기 위해 핵산 서열을 재합성할 수 있다.
본 발명에서 유용한 PUFA PKS 시스템 및 이의 단백질 또는 도메인에는 박테리아 및 비-박테리아 양쪽 모두의 PUFA PKS 시스템이 포함된다. 비-박테리아 PUFA PKS 시스템은 박테리아가 아닌 생물, 예컨대 진핵생물 또는 원시박테리아(archaebacterium)로부터의 또는 이로부터 유래된 PUFA PKS 시스템이다. 진핵생물은 세포의 분화 정도를 기초로 원핵생물과 구별되고, 진핵생물이 원핵생물보다 더 분화된다. 일반적으로, 원핵생물은 핵막을 보유하지 않고, 세포 분열 동안 유사분열을 나타내지 않으며, 염색체가 1개만 있고, 세포질 내에 70S 리보솜을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체, 리소좀 또는 골치체를 보유하지 않으며, 편모 (존재하는 경우, 단일 원섬유(fibril)을 함유함)가 있을 수 있다. 반면에, 진핵생물은 핵막이 있고, 세포 분열 동안 유사분열을 나타내며, 다수의 염색체가 있고, 세포질 내에 80S 리보솜을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체 (조류의 경우), 리소좀 및 골지체를 보유하며, 편모 (존재하는 경우, 다수의 원섬유를 함유함)가 있을 수 있다. 일반적으로, 박테리아는 원핵생물인 한편, 조류, 진균, 원생생물, 원생동물 및 고등 식물은 진핵생물이다. 본 발명에 따르면, 비-박테리아 PUFA PKS 기능성 도메인과 박테리아 PUFA PKS 기능성 도메인, 뿐만 아니라 또다른 PKS 시스템 (제I형 반복형 또는 모듈형, 제II형, 또는 제III형) 또는 FAS 시스템으로부터의 PKS 기능성 도메인 또는 단백질이 혼입된 유전자 변형 생물이 생산될 수 있다.
본 발명에 따르면, 3-케토 아실-ACP 신테이즈 (KS) 생물학적 활성 (기능)이 있는 도메인 또는 단백질은 FAS (및 PKS) 신장 반응 사이클의 초기 단계를 수행하는 효소로 특성화된다. 용어 "β-케토아실-ACP 신테이즈"는 용어 "3-케토 아실-ACP 신테이즈", "β-케토 아실-ACP 신테이즈", 및 "케토-아실 ACP 신테이즈", 및 유사한 파생어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 신장용으로 예정된 아실 기가 티오에스테르 결합에 의해 효소의 활성 부위의 시스테인 잔기에 연결된다. 다단계 반응에서, 아실-효소에 말로닐-ACP와의 축합이 진행되어 -케토 아실-ACP, CO2 및 유리 효소가 형성된다. KS는 신장 사이클에서 중요한 역할을 하고, 다수의 시스템에서 반응 사이클의 다른 효소보다 더 큰 기질 특이성을 보유하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 대장균에는 3개의 상이한 KS 효소가 있고, 각각은 생물의 생리학에서 자신의 특별한 역할이 있다 ([Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993)]). 본원에 기술된 트라우스토키트리드 및 해양 박테리아에서 기술된 PUFA-PKS 시스템의 2개의 KS 도메인은 PUFA 생합성 반응 순서에서 별개의 역할이 있을 수 있다. 효소의 한 클래스로서, KS가 잘 특성화되어 있다. 다수의 확인된 KS 유전자의 서열이 공지되어 있고, 활성 부위 모티프가 확인되어 있으며, 여러 결정 구조가 결정되어 있다. 단백질 (또는 단백질의 도메인)이 공지된 KS 서열에 대한 상동성에 의해 KS 패밀리의 효소에 속하는 것으로 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명에 따르면, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 생물학적 활성 (기능)이 있는 도메인 또는 단백질은 말로닐 모이어티를 말로닐-CoA에서 ACP로 전달하는 것으로 특성화된다. 용어 "말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈"는 "말로닐 아실트랜스퍼레이즈" 및 유사한 파생어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 활성 부위 모티프 (GxSxG)에 더하여, 이러한 효소는 주요 위치 내의 R 및 Q 아미노산의 연장된 모티프를 보유하고, 상기 모티프에 의해 효소가 MAT 효소로 확인된다 (예를 들어, 하기 기술되는 AT 도메인과 대조적). 일부 PKS 시스템에서 (그러나 PUFA PKS 도메인은 아님), MAT 도메인은 메틸- 또는 에틸-말로네이트를 (상응하는 CoA 에스테르로부터) ACP 기 상에 우선적으로 로딩(loading)함으로써, 가지를 선형 탄소 사슬 내로 도입할 것이다. MAT 도메인은 공지된 MAT 서열에 대한 상동성 및 연장된 모티프 구조에 의해 인식될 수 있다.
본 발명에 따르면, 아실 캐리어 단백질 (ACP) 생물학적 활성 (기능)이 있는 도메인 또는 단백질은 단백질의 공유결합된 보조인자에 대한 티오에스테르 결합을 통해 성장 중인 지방 아실 사슬에 대한 캐리어로서 기능하는 소형 폴리펩티드 (전형적으로, 아미노산 80개 내지 100개 길이)로 특성화된다. 이는 분리된 유닛(unit)들로서 또는 더 큰 단백질 내의 도메인으로서 발생한다. ACP의 고도로 보존된 세린 잔기에 CoA의 포스포판테테이닐 모이어티가 전달됨으로써 ACP가 비활성 애포(apo)-형태에서 기능성 홀로(holo)-형태로 전환된다. 아실 기는 포스포판테테이닐 모이어티의 유리 말단에서 티오에스테르 결합에 의해 ACP에 부착된다. 방사성 판테테인으로의 표지 및 공지된 ACP에 대한 서열 상동성에 의해 ACP가 확인될 수 있다. 상기 언급된 모티프 (LGIDS*)의 변동의 존재 또한 ACP의 서명이다.
본 발명에 따르면, 3-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 생물학적 활성 (기능)으로 또한 지칭되는 케토리덕테이즈 활성이 있는 도메인 또는 단백질은 3-케토 아실 형태의 ACP의 피리딘-뉴클레오티드-의존적 환원을 촉매하는 것으로 특성화된다. 이는 디노보(de novo) 지방산 생합성 신장 사이클에서의 첫번째 환원성 단계이고, 폴리케타이드 생합성에서 종종 수행되는 반응이다. 용어 "β-케토아실-ACP 리덕테이즈"는 용어 "케토리덕테이즈", "3-케토아실-ACP 리덕테이즈", "케토-아실 ACP 리덕테이즈" 및 이러한 용어의 유사한 파생어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. FAS의 또다른 리덕테이즈인 에노일 ACP 리덕테이즈 (ER)의 한 패밀리 (그러나, PUFA PKS 시스템 내에 존재하는 ER 패밀리는 아님), 및 단쇄 알콜 디하이드로게네이즈(dehydrogenase) 패밀리와 상당한 서열 유사성이 관찰된다. 상기에서 지시된 PUFA PKS 영역의 Pfam 분석은 코어 영역에서의 단쇄 알콜 디하이드로게네이즈 패밀리에 대한 상동성을 나타낸다. 동일한 영역의 Blast 분석은 공지된 KR 효소에 대한 코어 구역에서의 매치, 뿐만 아니라 또다른 특성화된 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인에 대한 상동성이 있는 연장된 영역을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 하기의 이론적 설명을 기초로 도메인 또는 단백질이 사슬 길이 인자 (CLF)로 지칭된다. CLF는 제II형 (해리된 효소들) PKS 시스템의 특징으로 본래 기술되었으며, 최종 생성물의 신장 사이클의 횟수를 결정하고 따라서 이의 사슬 길이를 결정하는데 역할을 하는 것으로 가정되었다. CLF 아미노산 서열은 KS 도메인에 대한 상동성을 나타내지만 (그리고, KS 단백질과 이종이량체를 형성하는 것으로 생각됨), 활성 부위 시스테인이 없다. PKS 시스템에서의 CLF의 역할은 논쟁의 여지가 있었다. 새로운 증거 ([C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999)])는 PKS 시스템의 프라이밍(priming) (신장될 최초 아실 기를 제공함)에서의 역할을 시사한다. 이러한 역할에서, CLF 도메인은 말로네이트를 탈카르복실화시켜 (말로닐-ACP로서), KS 활성 부위로 전달될 수 있는 아세테이트 기를 형성하는 것으로 생각된다. 따라서, 이러한 아세테이트가 최초의 신장 (축합) 반응이 진행될 수 있는 '프라이밍' 분자로 작용한다. 제II형 CLF의 상동체가 일부 모듈형 PKS 시스템에서 '로딩' 도메인으로 확인되었다. CLF의 서열 특색이 있는 도메인이 모든 현재 확인된 PUFA PKS 시스템에서 발견되고, 각각의 경우에 멀티도메인 단백질의 일부로서 확인된다.
"아실트랜스퍼레이즈" 또는 "AT"는 다수의 별개의 아실 전달 반응들을 수행할 수 있는 효소의 일반적인 클래스를 지칭한다. 용어 "아실트랜스퍼레이즈"는 용어 "아실 트랜스퍼레이즈"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에 기술된 PUFA PKS 시스템에서 확인된 AT 도메인들은 서로, 그리고 현재 시험된 다른 PUFA PKS 시스템 모두에 존재하는 도메인에 대해 양호한 상동성을 나타내고, 특이적 기능이 확인된 일부 아실트랜스퍼레이즈 (예를 들어, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈, MAT)에 대해서 매우 약한 상동성을 나타낸다. MAT에 대한 약한 상동성에도 불구하고, 이러한 AT 도메인은 이러한 효소의 연장된 모티프 구조 특성 (상기의 MAT 도메인 설명 참조)을 보유하지 않기 때문에 MAT로 기능하는 것으로 여겨지지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, PUFA PKS 시스템에서의 AT 도메인의 가능한 기능은 하기의 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: ORFA ACP 도메인(들)로부터 물로의 지방 아실 기의 전달 (즉, 티오에스테레이즈(thioesterase) - 유리 지방산으로서 지방 아실 기를 방출함), 어셉터(acceptor) 예컨대 CoA로의 지방 아실 기의 전달, 다양한 ACP 도메인들 간의 아실 기의 전달, 또는 친지성 어셉터 분자 (예를 들어, 라이소포스파드산)으로의 지방 아실 기의 전달.
본 발명에 따르면, 이러한 도메인에는 에노일 리덕테이즈 (ER)의 생물학적 활성이 있다. ER 효소는 지방 아실-ACP 내의 트랜스-이중 결합 (DH 활성에 의해 도입됨)을 환원시켜, 이러한 탄소들을 완전하게 포화시킨다. PUFA-PKS 내의 ER 도메인은 ER 효소의 새롭게 특성화된 패밀리에 대해 상동성을 나타낸다 ([Heath et al., Nature 406, 145 (2000)]). Heath 및 Rock은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로부터 관심 유전자를 클로닝하고, 이러한 유전자로부터 발현된 단백질을 정제하고, 시험관내 분석법에서 이러한 단백질에 ER 활성이 있음을 나타냄으로써 ER 효소의 이러한 새로운 클래스를 확인하였다. 현재 시험된 모든 PUFA PKS 시스템은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 ER 단백질에 대한 상동성을 나타내는 스키조키트리움 ER 도메인에 대한 서열 상동성이 매우 높은 하나 이상의 도메인을 함유한다.
본 발명에 따르면, 디하이드레이즈 또는 디하이드라테이즈 (DH) 활성이 있는 단백질 또는 도메인은 탈수 반응을 촉매한다. 본원에서 일반적으로 사용된, DH 활성에 대한 언급은 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 생물학적 활성을 전형적으로 지칭한다. FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 생물학적 활성은 β-케토아실-ACP로부터 HOH를 제거하고, 초기에 탄소 사슬 내에 트랜스 이중 결합을 생성시킨다. 용어 "FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈"는 용어 "FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 디하이드레이즈", "β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈", "디하이드레이즈" 및 유사한 파생어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. PUFA PKS 시스템의 DH 도메인은 (다른 PKS 시스템의 DH 도메인보다는) FAS 시스템과 관련된 박테리아 DH 효소에 대해 상동성을 나타낸다. 박테리아 DH의 하위집합인 FabA-유사 DH는 시스-트랜스 아이소머레이즈(isomerase) 활성을 보유한다 ([Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)]). FabA-유사 DH 단백질에 대한 상동성은 본원에 기술된 DH 도메인들 중 하나 또는 모두가 PUFA PKS 생성물 내에 시스 이중 결합을 삽입하는 것을 담당한다는 것을 시사한다.
본 발명에서 유용한 PUFA PKS 단백질에는 비-FabA-유사 DH 활성 또는 비-FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 생물학적 활성으로 본원에서 일반적으로 지칭되는, FabA-유사 (예를 들어, 상기 기술된 시스-트랜스 활성이 FabA-유사 활성과 관련됨)로 특성화되지 않는 디하이드라테이즈 활성이 또한 있을 수 있다. 더욱 구체적으로, 보존된 활성 부위 모티프 (아미노산 약 13개 길이: L*xxHxxxGxxxxP; *모티프에서, L은 또한 I일 수 있음)가 PKS 시스템 내의 디하이드라테이즈 도메인에서 발견된다 ([Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60). 이러한 보존된 모티프 (본원에서 디하이드라테이즈 (DH) 보존 활성 부위 모티프 또는 DH 모티프로 또한 지칭됨)은 현재까지 기술된 모든 공지된 PUFA-PKS 서열의 유사한 영역 및 본원에 기술된 PUFA PKS 서열에서 발견되지만, 이러한 모티프는 최근에야 검출된 것으로 여겨진다. 이러한 보존된 모티프는 PUFA-PKS 서열 내의 높은 상동성의 특성화되지 않는 영역 내에 있다. PUFA-PKS를 통한 PUFA의 제안된 생합성은 비-FabA 유사 탈수를 필요로 하고, 이러한 모티프가 상기 반응과 관련될 수 있다.
예시의 목적으로, 특정 PUFA PKS 시스템의 구조가 하기에 상세하게 기술된다. 그러나, 본 발명이 이러한 PUFA PKS 시스템의 사용에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 박테리아 PUFA PKS 시스템의 상세한 설명을 미국 특허 번호 6,140,486 및 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995에서 확인할 수 있고, 기타 PUFA PKS 유전자 또는 시스템에 대한 설명을 PCT 특허 공개 번호 WO 05/097982 및 미국 특허 출원 공개 번호 20050014231에서 확인할 수 있다.
스키조키트리움 PUFA PKS 시스템
스키조키트리움은 DHA 및 도코사펜타엔산 (DPA; 22:5 ω-6)이 풍부한, 예를 들어, DHA + DPA 건조 중량이 30％인 다량의 트리아실글리세롤을 축적하는 트라우스토키트리드 해양 미생물이다 ([Barclay et al., J. Appl. Phycol. 6, 123 (1994)]). 신장/탈포화 경로에 의해 20- 및 22-탄소 PUFA를 합성하는 진핵생물에서, 18-, 20- 및 22-탄소 중간체의 풀(pool)은 비교적 커서, [14C]-아세테이트를 사용하는 시험관내 표지 실험은 예측되는 중간체에 대한 명백한 전구체-생성물 동역학을 드러낸다 ([Gellerman et al., Biochim. Biophys. Acta 573:23 (1979)]). 또한, 이러한 생물에 외인성으로 제공된 방사능표지된 중간체가 최종 PUFA 생성물로 전환된다. 본 발명가들은 [1-14C]-아세테이트가 스키조키트리움 세포에 의해 신속하게 섭취되고 지방산 내로 혼입되었지만, 가장 짧은 표지 시간 (1분)에서, DHA는 지방산에서 회수된 표지 31％를 함유하였고, 이러한 백분율은 10-15분의 [14C]-아세테이트 혼입 및 이어지는 24시간의 배양 성장 동안 본질적으로 변하지 않고 유지되었음을 나타냈다 (미국 특허 출원 공개 번호 20020194641 (상기) 참조). 유사하게, DPA는 실험 전반에 걸쳐 표지의 10％를 나타냈다. 16- 또는 18-탄소 지방산과 22-탄소 다중불포화 지방산 간의 전구체-생성물 관계에 대한 증거가 없다. 이러한 결과는 중간체들의 매우 작은 (가능하게는, 효소에 결합된) 풀을 수반하는 [14C]-아세테이트로부터의 DHA의 신속한 합성과 일치한다.
도 1은 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 3개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 그래프식 설명이고, 이러한 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조를 포함한다. 코어 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템을 형성하는 3개의 오픈 리딩 프레임이 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 하기와 같다.
스키조키트리움 오픈 리딩 프레임 A (OrfA):
OrfA에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 1로 표시된다. OrfA는 뉴클레오티드 8730개의 서열 (정지 코돈 불포함)이고, 이는 본원에서 서열 2로 표시되는 아미노산 2910개의 서열을 코딩한다. OrfA 내에는 12개의 도메인이 있다: (a) 1개의 β-케토 아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인; (c) 9개의 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인; 및 (d) 1개의 케토리덕테이즈 (KR) 도메인. 스키조키트리움 종 ATCC 20888과 스키조키트리움 종, 균주 N230D로 표시되는 ATCC 20888의 딸 균주 양쪽 모두로부터의 OrfA를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)이 단리되어 서열분석되었다. N230D는 지방산 함량에서의 변동에 대해 스크리닝된, 화학적으로 돌연변이 (NTG; 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘)된 스키조키트리움 ATCC 20888의 1,000개를 초과하는 무작위로 선택된 생존물 중 하나이다. 이러한 특정 균주는 개선된 DHA 생산성의 가치가 있었다.
스키조키트리움 종 ATCC 20888으로부터 단리된, 본원에서 JK1126으로 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 1의 위치 1에서 8730까지 스패닝(spanning)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 2의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1126 (pJK1126 OrfA 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 ATCC 20888으로부터의 "OrfA" 유전자를 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC: American Type Culture Collection) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7648을 배정받았다. pJK1126 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
스키조키트리움 종 N230D로부터 단리된, pJK306 OrfA 게놈 클론 및 pJK320 OrfA 게놈 클론으로 본원에서 기술되는 2개의 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 함께 포함하고 (중첩 클론), 서열 2의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK306 (pJK306 OrfA 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 종 N230D로부터의 OrfA 유전자의 5' 부분을 함유하는 대장균 플라스미드 형태 (pJK320과 2.2kB 중첩됨))이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7641을 배정받았다. pJK306 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다. 게놈 클론 pJK320 (pJK320 OrfA 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 종 N230D로부터의 OrfA 유전자의 3' 부분을 함유하는 대장균 플라스미드 형태 (pJK306과 2.2kB 중첩됨))이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7644를 배정받았다. pJK320 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
OrfA 내의 제1 도메인은 본원에서 ORFA-KS로 또한 지칭되는 KS 도메인이고, ORFA-KS 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 7 (서열 1의 위치 1-1500)로 표시된다. ORFA-KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 8 (서열 2의 위치 1-500)로 표시된다. ORFA-KS 도메인이 활성 부위 모티프 DXAC* (*아실 결합 부위 C215)를 함유한다는 것을 유념한다. 또한, 스키조키트리움 KS 영역의 말단의 특징적인 모티프인 GFGG가 서열 2, 및 따라서 서열 8 내의 이러한 도메인에 존재한다.
OrfA 내의 제2 도메인은 본원에서 ORFA-MAT로 또한 지칭되는 MAT 도메인이고, ORFA-MAT 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 9 (서열 1의 위치 1723-3000)로 표시된다. ORFA-MAT 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 10 (서열 2의 위치 575-1000)으로 표시된다. MAT 도메인은 위치 93의 아스파르테이트 및 위치 94의 히스티딘 (각각 서열 2의 위치 667 및 668에 상응함)을 포함한다. ORFA-MAT 도메인이 본원에서 서열 11로 표시되는 활성 부위 모티프 GHS*XG (*아실 결합 부위 S706)를 함유한다는 것을 유념한다.
OrfA의 도메인 3-11은 본원에서 ORFA-ACP (서열 내의 제1 도메인은 ORFA-ACP1, 제2 도메인은 ORFA-ACP2, 제3 도메인은 ORFA-ACP3 등)로 또한 지칭되는 9개의 직렬(tandem) ACP 도메인이다. 제1 ACP 도메인인 ORFA-ACP1은 서열 1 (OrfA)의 대략적인 위치 3343에서 대략적인 위치 3600까지 스패닝된 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. ORFA-ACP1 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 12 (서열 1의 위치 3343-3600)로 표시된다. 제1 ACP 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 서열 2의 대략적인 위치 1115에서 대략적인 위치 1200까지 스패닝된다. ORFA-ACP1 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 13 (서열 2의 위치 1115-1200)으로 표시된다. ORFA-ACP1 도메인이 본원에서 서열 14로 표시되는 활성 부위 모티프 LGIDS* (*판테테인 결합 모티프 S1157)를 함유한다는 것을 유념한다.
9개의 ACP 도메인 모두의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 고도로 보존되고, 따라서, 각각의 도메인에 대한 서열은 본원에서 개별적인 서열 식별물로 표시되지 않는다. 그러나, 본원에 개시된 정보를 기초로, 당업자는 다른 나머지 8개의 ACP 도메인 각각을 함유하는 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 모두 9개의 ACP 도메인은 함께 서열 1의 대략적인 위치 3283에서 대략적인 위치 6288까지의 OrfA의 영역에 스패닝되고, 이는 서열 2의 약 1095에서 약 2096까지의 아미노산 위치에 상응한다. 9개의 도메인 모두를 함유하는 전체 ACP 영역에 대한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 16으로 표시된다. 서열 16으로 표시되는 영역은 개별적인 ACP 도메인들 간의 링커 절편을 포함한다. 9개의 도메인에 대한 반복 간격은 대략적으로 서열 16의 뉴클레오티드 330개마다이다 (인접한 활성 부위 세린들 간에 측정된 아미노산의 실제 개수는 아미노산 104개 내지 116개의 범위이다). 9개의 ACP 도메인 각각이 판테테인 결합 모티프 LGIDS* (서열 14로 표시됨) [식중, S*는 판테테인 결합 부위 세린 (S)이다]를 함유한다. 판테테인 결합 부위 세린 (S)은 각각의 ACP 도메인 서열의 중심 근처에 위치한다. ACP 도메인 영역의 각각의 말단 및 각각의 ACP 도메인 사이에는 프롤린(P) 및 알라닌 (A)이 고도로 풍부한 영역이 있고, 이는 링커 영역인 것으로 여겨진다. 예를 들어, ACP 도메인 1과 2 사이에 본원에서 서열 15로 표시되는 APAPVKAAAPAAPVASAPAPA 서열이 있다. 서열 2의 아미노산 서열을 참조로, 9개의 ACP 도메인 각각에 대한 활성 부위 세린 잔기 (즉, 판테테인 결합 부위)의 위치는 하기와 같다: ACP1 = S1157; ACP2 = S1266; ACP3 = S1377; ACP4 = S1488; ACP5 = S1604; ACP6 = S1715; ACP7 = S1819; ACP8 = S1930; 및 ACP9 = S2034. ACP 도메인의 평균 크기가 링커를 제외하고 아미노산 약 85개이고, 링커를 포함하면 아미노산 약 110개이며, 활성 부위 세린이 대략적으로 도메인의 중심에 있음을 가정하면, 당업자는 OrfA 내의 9개의 ACP 도메인 각각의 위치를 쉽게 결정할 수 있다.
OrfA 내의 도메인 12는 본원에서 ORFA-KR로 또한 지칭되는 KR 도메인이고, ORFA-KR 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 17 (서열 1의 위치 6598-8730)로 표시된다. ORFA-KR 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 18 (서열 2의 위치 2200-2910)로 표시된다. KR 도메인 내에 단쇄 알데히드-디하이드로게네이즈 (KR은 이러한 패밀리의 구성원임)에 대한 상동성이 있는 코어 영역이 존재한다. 이러한 코어 영역은 서열 1의 대략적인 위치 7198에서 대략적인 위치 7500까지 스패닝되고, 이는 서열 2의 아미노산 위치 2400-2500에 상응한다.
스키조키트리움 오픈 리딩 프레임 B (OrfB):
OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 3으로 표시된다. OrfB는 뉴클레오티드 6177개의 서열 (정지 코돈 불포함)이고, 이는 본원에서 서열 4로 표시되는 아미노산 2059개의 서열을 코딩한다. OrfB 내에서는 4개의 도메인이 있다: (a) 1개의 -케토 아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (b) 1개의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; (c) 1개의 아실 트랜스퍼레이즈 (AT) 도메인; 및 (d) 1개의 에노일 ACP-리덕테이즈 (ER) 도메인.
스키조키트리움 종 ATCC 20888과 스키조키트리움 종, 균주 N230D로 표시되는 ATCC 20888의 딸 균주 양쪽 모두로부터의 OrfB를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)이 단리되어 서열분석되었다.
스키조키트리움 종 ATCC 20888으로부터 단리된, 본원에서 pJK1129로 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1129 (pJK1129 OrfB 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 ATCC 20888으로부터의 "OrfB" 유전자를 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7649를 배정받았다. pJK1126 OrfB 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
스키조키트리움 종 N230D로부터 단리된, 본원에서 pJK324 OrfB 게놈 클론으로 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK324 (pJK324 OrfB 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 N230D로부터의 OrfB 유전자 서열을 함유하는 대장균 플라스미드 형태)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7643을 배정받았다. pJK324 OrfB 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
OrfB 내의 제1 도메인은 본원에서 ORFB-KS로 또한 지칭되는 KS 도메인이고, ORFB-KS 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 19 (서열 3의 위치 1-1350)로 표시된다. ORFB-KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 20 (서열 4의 위치 1-450)으로 표시된다. 이러한 KS 도메인은 서열 20의 위치 371 (또한 서열 4의 위치 371)에 발린을 포함한다. ORFB-KS 도메인이 활성 부위 모티프 DXAC* (*아실 결합 부위 C196)를 함유한다는 것을 유념한다. 또한, 이러한 KS 영역의 말단의 특징적인 모티프인 GFGG가 서열 4, 및 따라서 서열 20 내의 이러한 도메인에 존재한다.
OrfB 내의 제2 도메인은 본원에서 ORFB-CLF로 또한 지칭되는 CLF 도메인이고, ORFB-CLF 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 21 (서열 3의 위치 1378-2700)로 표시된다. ORFB-CLF 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 22 (서열 4의 위치 460-900)로 표시된다. ORFB-CLF 도메인이 아실-결합 시스테인이 없는 KS 활성 부위 모티프를 함유한다는 것을 유념한다.
OrfB 내의 제3 도메인은 본원에서 ORFB-AT로 또한 지칭되는 AT 도메인이고, ORFB-AT 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 23 (서열 3의 위치 2701-4200)로 표시된다. ORFB-AT 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 24 (서열 4의 위치 901-1400)로 표시된다. ORFB-AT 도메인이 아실트랜스퍼레이즈 (AT) 단백질의 특성인 GxS*xG (*아실 결합 부위 S1140)의 활성 부위 모티프를 함유한다는 것을 유념한다.
OrfB 내의 제4 도메인은 본원에서 ORFB-ER로 또한 지칭되는 ER 도메인이고, ORFB-ER 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 25 (서열 3의 위치 4648-6177)로 표시된다. ORFB-ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 26 (서열 4의 위치 1550-2059)로 표시된다.
스키조키트리움 오픈 리딩 프레임 C (OrfC):
OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 5로 표시된다. OrfC는 뉴클레오티드 4506개의 서열 (정지 코돈 불포함)이고, 이는 본원에서 서열 6으로 표시되는 아미노산 1502개의 서열을 코딩한다. OrfC 내에서는 3개의 도메인이 있다: (a) 2개의 FabA-유사 -히드록시 아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; 및 (b) 1개의 에노일 ACP-리덕테이즈 (ER) 도메인.
스키조키트리움 종 ATCC 20888과 스키조키트리움 종, 균주 N230D로 표시되는 ATCC 20888의 딸 균주 양쪽 모두로부터의 OrfC를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)이 단리되어 서열분석되었다.
스키조키트리움 종 ATCC 20888으로부터 단리된, 본원에서 pJK1131로 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 6의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1131 (pJK1131 OrfC 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 ATCC 20888으로부터의 "OrfC" 유전자를 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7650을 배정받았다. pJK1131 OrfC 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
스키조키트리움 종 N230D로부터 단리된, 본원에서 pBR002 OrfC 게놈 클론으로 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 6의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pBR002 (pBR002 OrfC 게놈 클론으로 표시됨; 스키조키트리움 N230D로부터의 OrfC 유전자를 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2006년 6월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-7642를 배정받았다. pBR002 OrfC 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
OrfC 내의 제1 도메인은 본원에서 ORFC-DH1으로 또한 지칭되는 DH 도메인이다. 이는 OrfC 내의 2개의 DH 도메인 중 하나이고, 따라서 DH1으로 지정된다. ORFC-DH1 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 27 (서열 5의 위치 1-1350)로 표시된다. ORFC-DH1 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 28 (서열 6의 위치 1-450)로 표시된다.
OrfC 내의 제2 도메인은 본원에서 ORFC-DH2로 또한 지칭되는 DH 도메인이다. 이는 OrfC 내의 2개의 DH 도메인 중 두번째이고, 따라서 DH2로 지정된다. ORFC-DH2 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 29 (서열 5의 위치 1351-2847)로 표시된다. ORFC-DH2 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 30 (서열 6의 위치 451-949)로 표시된다. 이러한 DH 도메인은 서열 30의 위치 426-440에 아미노산 H-G-I-A-N-P-T-F-V-H-A-P-G-K-I (서열 6의 위치 876-890)를 포함한다.
OrfC 내의 제3 도메인은 본원에서 ORFC-ER로 또한 지칭되는 ER 도메인이고, ORFC-ER 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 31 (서열 5의 위치 2995-4506)로 표시된다. ORFC-ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에서 서열 32 (서열 6의 위치 999-1502)로 표시된다.
트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템
코어 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS 시스템을 형성하는 3개의 오픈 리딩 프레임이 있다. Th. 23B OrfA에는 8개의 인접한 ACP 도메인이 있는 반면, 스키조키트리움 OrfA에는 9개의 인접한 ACP 도메인이 있다는 것을 제외하고는 도메인 구성이 스키조키트리움의 구성과 동일하다. 각각의 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 하기와 같다.
트라우스토키트리움 23B 오픈 리딩 프레임 A (OrfA):
Th. 23B OrfA에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 38로 표시된다. Th. 23B OrfA는 뉴클레오티드 8433개의 서열 (정지 코돈 불포함)이고, 이는 본원에서 서열 39로 표시되는 아미노산 2811개의 서열을 코딩한다. 서열 38은 Th. 23B OrfA 내의 하기의 도메인들을 코딩한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈 (MAT) 도메인; (c) 8개의 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인; 및 (d) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕테이즈 (KR) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 단리된, Th23BOrfA_pBR812.1 및 Th23BOrfA_pBR811 (OrfA 게놈 클론)으로 본원에서 기술되는 2개의 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 38의 뉴클레오티드 서열을 함께 포함하고 (중첩 클론), 서열 39의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfA_pBR812.1 (Th23BOrfA_pBR812.1 게놈 클론으로 표시됨; 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA 유전자 서열을 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8232를 배정받았다. OrfA 게놈 클론인 Th23BOrfA_pBR812.1의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다. 게놈 클론 Th23BOrfA_pBR811 (Th23BOrfA_pBR811 게놈 클론으로 표시됨, 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA 유전자 서열을 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8231을 배정받았다. OrfA 게놈 클론인 Th23BOrfA_pBR811의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfA 내의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-KS로 또한 지칭되는 KS 도메인이고, 이는 본원에서 서열 40으로 표시되는, 서열 38의 대략적인 위치 1에서 대략적인 위치 1500까지 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 41로 표시되는, 서열 39의 대략적인 위치 1에서 대략적인 위치 500까지 스패닝되는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 이러한 영역에는 서열 39의 위치 1에서 대략적인 위치 450 (또한 서열 41의 위치 1 내지 약 450)에 스패닝되는 FabB (β-케토아실-ACP 신테이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다. Th. 23B OrfA-KS 도메인이 활성 부위 모티프 DXAC* (*아실 결합 부위 C207)를 함유한다는 것을 유념한다. 또한, Th. 23B KS 영역의 말단의 특징적인 모티프인 GFGG가 서열 39의 위치 453-456 (또한 서열 41의 위치 453-456) 내에 존재한다.
Th. 23B OrfA 내의 제2 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-MAT로 또한 지칭되는 MAT 도메인이고, 이는 본원에서 서열 42로 표시되는, 서열 38의 대략적인 위치 1503와 대략적인 위치 3000 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B MAT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 43으로 표시되는, 대략적인 위치 501에서 대략적인 위치 1000까지 스패닝되는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 이러한 영역에는 서열 39의 대략적인 위치 580 내지 대략적인 위치 900 (또한 서열 43의 위치 80-400)에 스패닝되는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다. Th. 23B OrfA-MAT 도메인이 서열 39의 위치 695-699로 표시되는 활성 부위 모티프 GHS*XG (*아실 결합 부위 S697)를 함유한다는 것을 유념한다.
Th. 23B OrfA의 도메인 3-10은 본원에서 Th. 23B OrfA-ACP (서열 내의 제1 도메인은 OrfA-ACP1, 제2 도메인은 OrfA-ACP2, 제3 도메인은 OrfA-ACP3 등)로 또한 지칭되는 8개의 직렬 ACP 도메인이다. 제1 Th. 23B ACP 도메인인 Th. 23B OrfA-ACP1은 본원에서 서열 44로 표시되는, 서열 38 (OrfA)의 대략적인 위치 3205에서 대략적인 위치 3555까지 스패닝된 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. 제1 Th. 23B ACP 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 45로 표시되는, 서열 39의 대략적인 위치 1069에서 대략적인 위치 1185까지 스패닝되는 서열 39의 영역이다.
Th. 23B OrfA 내의 8개의 ACP 도메인은 서로 인접하고, 포스포판테테인 결합 부위 모티프인 LGXDS* (서열 46으로 표시됨) [식중, S*는 포스포판테테인 부착 부위이다]의 존재에 의해 확인될 수 있다. 서열 39를 참조로, 8개의 S* 부위 각각의 아미노산 위치는 1128 (ACP1), 1244 (ACP2), 1360 (ACP3), 1476 (ACP4), 1592 (ACP5), 1708 (ACP6), 1824 (ACP7) 및 1940 (ACP8)이다. 8개의 Th. 23B ACP 도메인 모두의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 고도로 보존되고, 따라서, 각각의 도메인에 대한 서열은 본원에서 개별적인 서열 식별물로 표시되지 않는다. 그러나, 본원에 개시된 정보를 기초로, 당업자는 서열 38 및 39에서 다른 7개의 ACP 도메인 각각을 함유하는 서열을 쉽게 결정할 수 있다.
모두 8개의 Th. 23B ACP 도메인은 함께 서열 38의 대략적인 위치 3205에서 대략적인 위치 5994까지의 Th. 23B OrfA의 영역에 스패닝되고, 이는 서열 39의 약 1069에서 약 1998까지의 아미노산 위치에 상응한다. 8개의 도메인 모두를 함유하는 전체 ACP 영역에 대한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 47로 표시된다. 서열 47은 본원에서 서열 48로 표시되는 아미노산 서열을 코딩한다. 서열 48은 개별적인 ACP 도메인들 간의 링커 절편을 포함한다. 8개의 도메인에 대한 반복 간격은 대략적으로 서열 48의 뉴클레오티드 116개마다이고, 각각의 도메인은 활성 부위 모티프에 중심이 있는 약 116개의 아미노산을 구성되는 것으로 간주될 수 있다 (상기 기술됨).
Th. 23B OrfA 내의 마지막 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-KR로 또한 지칭되는 KR 도메인이고, 본원에서 서열 49로 표시되는, 서열 38의 대략적인 위치 6001에서 대략적인 위치 8433 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B KR 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 50으로 표시되는, 서열 39의 대략적인 위치 2001에서 대략적인 위치 2811까지 스패닝되는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 이러한 영역에는 서열 39의 대략적인 위치 2300 내지 약 2550 (또한 서열 50의 위치 300-550)에 스패닝되는 FabG (β-케토아실-ACP 리덕테이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다.
트라우스토키트리움 23B 오픈 리딩 프레임 B (OrfB):
Th. 23B OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 뉴클레오티드 5805개의 서열 (정지 코돈 불포함)인 서열 51로 표시되고, 이는 본원에서 서열 52로 표시되는 아미노산 1935개의 서열을 코딩한다. 서열 51은 Th. 23B OrfB 내의 하기의 도메인들을 코딩한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신테이즈 (KS) 도메인; (b) 1개의 사슬 길이 인자 (CLF) 도메인; (c) 1개의 아실트랜스퍼레이즈 (AT) 도메인; 및 (d) 1개의 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 단리된, Th23BOrfB_pBR800 (OrfB 게놈 클론)으로 본원에서 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 51의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 52의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfB_pBR800 (Th23BOrfB_pBR800 게놈 클론으로 표시됨; 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfB 유전자 서열을 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8227을 배정받았다. OrfB 게놈 클론인 Th23BOrfB_pBR800의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfB 내의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-KS로 또한 지칭되는 KS 도메인이고, 이는 본원에서 서열 53으로 표시되는, 서열 51 (Th. 23B OrfB)의 대략적인 위치 1과 대략적인 위치 1500 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 54로 표시되는, 서열 52의 대략적인 위치 1에서 대략적인 위치 500까지 스패닝되는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 이러한 영역에는 위치 1에서 대략적인 위치 450 (또한 서열 54의 위치 1-450)에 스패닝되는 FabB (β-케토아실-ACP 신테이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다. Th. 23B OrfB-KS 도메인이 활성 부위 모티프 DXAC* [식중, C*는 아실 기 부착 부위이고, C*는 서열 52의 위치 201에 있다]를 함유한다는 것을 유념한다. 또한, KS 영역의 말단의 특징적인 모티프인 GFGG가 서열 52의 위치 434-437 내에 존재한다.
Th. 23B OrfB 내의 제2 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-CLF로 또한 지칭되는 CLF 도메인이고, 이는 본원에서 서열 55로 표시되는, 서열 51 (Th. 23B OrfB)의 대략적인 위치 1501과 대략적인 위치 3000 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. CLF 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 56으로 표시되는, 서열 52의 대략적인 위치 501에서 대략적인 위치 1000까지 스패닝되는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 이러한 영역에는 대략적인 위치 550 내지 대략적인 위치 910 (서열 56의 위치 50-410)에 스패닝되는 FabB (β-케토아실-ACP 신테이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다. CLF에 KS 단백질에 대한 상동성이 있지만, CLF에는 KS 단백질 내의 아실 기가 부착되는 활성 부위 시스테인이 없다.
Th. 23B OrfB 내의 제3 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-AT로 또한 지칭되는 AT 도메인이고, 이는 본원에서 서열 57로 표시되는, 서열 51 (Th. 23B OrfB)의 대략적인 위치 3001과 대략적인 위치 4500 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B AT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 58으로 표시되는, 서열 52의 대략적인 위치 1001에서 대략적인 위치 1500까지 스패닝되는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 이러한 영역에는 대략적인 위치 1100 내지 대략적인 위치 1375 (서열 58의 위치 100-375)에 스패닝되는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼레이즈)에 대한 Pfam 매치가 있다. PUFA 신테이즈의 이러한 AT 도메인에 MAT 단백질에 대한 상동성이 있지만, AT 도메인에는 MAT의 연장된 모티프 (주요 아르기닌 및 글루타민 잔기)가 없고, AT 도메인은 말로닐-CoA 전달에 수반되는 것으로 생각되지 않는다. 아실트랜스퍼레이즈의 GXS*XG 모티프가 존재하고, 이때 S*는 아실 부착 부위이고, 서열 52와 관련하여 위치 1123에 위치한다.
Th. 23B OrfB 내의 제4 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-ER로 또한 지칭되는 ER 도메인이고, 이는 본원에서 서열 59로 표시되는, 서열 51 (OrfB)의 대략적인 위치 4501과 대략적인 위치 5805 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 60으로 표시되는, 서열 52의 대략적인 위치 1501에서 대략적인 위치 1935까지 스패닝되는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 이러한 영역에는 대략적인 위치 1501 내지 대략적인 위치 1810 (서열 60의 위치 1-310)에 스패닝되는 2-니트로프로판 디옥시게네이즈(dioxygenase)와 관련된 디옥시게네이즈 패밀리에 대한 Pfam 매치가 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 새롭게 특성화된 ER 효소에 대한 상동성으로 인해 이러한 도메인이 ER로 기능한다는 것이 추가로 예측될 수 있다.
트라우스토키트리움 23B 오픈 리딩 프레임 C (OrfC):
Th. 23B OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 뉴클레오티드 4410개의 서열 (정지 코돈 불포함)인 서열 61로 표시되고, 이는 본원에서 서열 62로 표시되는 아미노산 1470개의 서열을 코딩한다. 서열 61은 Th. 23B OrfC 내의 하기의 도메인들을 코딩한다: (a) 양쪽 모두 FabA 단백질 (트랜스-1-데케노일-ACP의 합성 및 이러한 생성물의 시스-3-데케노일-ACP로의 가역적인 이성화를 촉매하는 효소)에 대한 상동성이 있는, 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인; 및 (b) 스키조키트리움 OrfB의 ER 도메인에 대한 상동성이 높은 1개의 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 단리된, Th23BOrfC_pBR709A (OrfC 게놈 클론)로 본원에서 기술되는 게놈 클론은, 본 발명가들이 아는 한, 서열 61의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 62의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfC_pBR709A (Th23BOrfC_pBR709A 게놈 클론으로 표시됨; 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC 유전자 서열을 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8228을 배정받았다. OrfC 게놈 클론인 Th23BOrfC_pBR709A의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfC 내의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfC-DH1으로 또한 지칭되는 DH 도메인이고, 이는 본원에서 서열 63으로 표시되는, 서열 61 (OrfC)의 대략적인 위치 1과 대략적인 위치 1500 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B DH1 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 64로 표시되는, 서열 62의 대략적인 위치 1에서 대략적인 위치 500까지 스패닝되는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 이러한 영역에는 대략적인 위치 275에서 대략적인 위치 400 (서열 64의 위치 275-400)에 스패닝되는 FabA (상기 언급된 바와 같음)에 대한 Pfam 매치가 있다.
Th. 23B OrfC 내의 제2 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfC-DH2로 또한 지칭되는 DH 도메인이고, 이는 본원에서 서열 65로 표시되는, 서열 61 (OrfC)의 대략적인 위치 1501 내지 대략적인 3000 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B DH2 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 66으로 표시되는, 서열 62의 대략적인 위치 501에서 대략적인 위치 1000까지 스패닝되는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 이러한 영역에는 대략적인 위치 800에서 대략적인 위치 925 (서열 66의 위치 300-425)에 스패닝되는 FabA (상기 언급된 바와 같음)에 대한 Pfam 매치가 있다.
Th. 23B OrfC 내의 제3 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfC-ER로 또한 지칭되는 ER 도메인이고, 이는 본원에서 서열 67로 표시되는, 서열 61 (OrfC)의 대략적인 위치 3001 내지 대략적인 위치 4410 사이에 스패닝되는 뉴클레오티드 서열 내에 함유된다. Th. 23B ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 68로 표시되는, 서열 62의 대략적인 위치 1001에서 대략적인 위치 1470까지 스패닝되는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 이러한 영역에는 대략적인 위치 1025 내지 대략적인 위치 1320 (서열 68의 위치 25-320)에 스패닝되는 2-니트로프로판 디옥시게네이즈와 관련된 디옥시게네이즈 (상기 언급된 바와 같음)에 대한 Pfam 매치가 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 새롭게 특성화된 ER 효소에 대한 상동성으로 인해 이러한 도메인이 ER로 기능한다는 것이 추가로 예측될 수 있다.
코돈-최적화 합성 구축물
본 발명은 주로 이종 생물 (이종 숙주)에 대해 코돈 사용빈도가 최적화된, 본원에서 기술된 핵산 서열 중 임의의 것의 재합성 버젼을 또한 포함하고, 이때 코딩되는 아미노산 서열은 천연, 야생형 또는 공급원 아미노산 서열에 관하여 변화되지 않는다. 본 발명가들은 최적의 코돈 사용빈도에 대해 핵산 서열을 재합성하는 것이 PUFA PKS 시스템으로부터의 핵산 분자로 형질전환된 이종 숙주에서의 PUFA 생산을 개선하기 위한 효과적인 방식이라는 것을 발견하였다. PUFA PKS 시스템 내의 모든 핵산 분자의 재합성이 이종 숙주에서의 최적의 발현 및 PUFA 생산을 위해 반드시 필요하지는 않다. 실제로, 본 발명가들은 단지 약간의 핵산 분자의 재합성이 PUFA 생산을 개선하는데 충분하다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 스키조키트리움 OrfA 및 OrfB의 재합성이 효모에서의 PUFA 신테이즈 발현 및 PUFA 생산을 개선한 한편, 천연 스키조키트리움 OrfC 및 천연 노스톡 HetI PPTase의 사용이 충분하였다. 또한, 한 이종 숙주에서의 사용을 위한 구축물의 코돈 최적화가 상이한 이종 숙주에서의 PUFA 생산을 개선하는데 또한 유용할 수 있다 (예를 들어, 스키조키트리움에서 사용하기 위한 트라우스토키트리움으로부터의 OrfC-코딩 서열의 코돈 사용빈도의 최적화가 또다른 이종 숙주 생물, 예컨대 식물에서 PUFA 생산을 증진시키는데 또한 효과적일 수 있다).
또한, 코돈-최적화 합성 구축물의 사용이 하나의 PUFA PKS 시스템 (예를 들어, 제1 생물로부터의 것)으로부터의 도메인 또는 단백질이 제2 PUFA PKS 시스템 (예를 들어, 제2 생물로부터의 것) 내로 도입되는 키메라 PUFA PKS 구축물 및/또는 키메라 PUFA PKS 시스템의 생산에 유용할 수 있다. 이러한 시스템에서, PUFA 프로파일이 조작될 수 있을 뿐만 아니라 (예를 들어, 키메라 구축물 및/또는 키메라 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해), 코돈-최적화 합성 키메라 구축물의 사용에 의해 PUFA 생산이 또한 개선될 수 있다. 실제로, 2가지 개념 (키메라 및 코돈 최적화)의 조합은 PUFA 프로파일 및/또는 PUFA 생산과 관련하여 상승작용적인 결과를 일으킬 수 있다. 숙주에 대해 코돈-최적화된 일부 서열 및 숙주에 대해 코돈-최적화되지 않은 일부 서열을 함유하는 키메라 시스템이 본 발명에 포함된다.
특정 코돈-최적화 서열이 예로서 하기에 기술된다. 또다른 코돈-최적화 서열들이 이러한 기술에 따라 당업자에게 명백할 것이다.
sOrfA
sOrfA로 표시되는 서열 35는 효모에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 재합성된 스키조키트리움로부터의 OrfA를 코딩하는 핵산 서열 (서열 1)을 나타낸다. 서열 1 및 서열 35은 각각 서열 2를 코딩한다.
sOrfB
sOrfB로 표시되는 서열 36은 효모에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 재합성된 스키조키트리움로부터의 OrfB를 코딩하는 핵산 서열 (서열 3)을 나타낸다. 서열 3 및 서열 36은 각각 서열 4를 코딩한다.
OrfB*
OrfB* (pJK962)로 표시되는 서열 37은 식물 세포에서의 사용을 위해 서열 3 (서열 4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 일부분 내에서 재합성되고, OrfB* (pJK780)로 또한 지칭되는, 대장균에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 최초로 개발된 매우 유사한 서열 (하기에 기술됨)로부터 유래된, 스키조키트리움으로부터의 OrfB (서열 4)를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 양쪽 모두 (대장균용 및 식물용)의 형태의 OrfB*는 재합성된 BspHI (서열 3의 뉴클레오티드 4415) 내지 SacII 단편 (서열 3 내의 유일한 부위)를 제외하고는 서열 3과 동일하다. 양쪽 버젼 (대장균 및 식물) 모두에 orfB의 원래의 게놈 서열 (서열 3)과 비교하여 유전자의 시작부 근처에 2개의 또다른 코돈 변형이 있다. 첫번째로, 4번째 코돈인 아르기닌 (R)이 게놈 서열의 CGG로부터 orfB*의 CGC로 변화되었다. 두번째로, 5번째 코돈인 아스파라긴 (N)이 게놈 서열의 AAT로부터 orfB*의 AAC로 변화되었다. 서열 37이 생성되도록 이러한 유전자를 식물 벡터 내로 클로닝하는 것을 용이하게 하기 위해, PstI 부위 (CTGCAG)가 유전자의 시작부로부터 염기 20개만큼 떨어진 대장균 orfB* 서열 내로 또한 조작되었다. 이러한 변화는 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않았다. 서열 37 및 서열 3 양쪽 모두 (뿐만 아니라, 하기에 서열 69로 기술된, 대장균으로부터의 OrfB*)는 서열 4를 코딩한다.
OrfB* (pJK780)로 표시되는 서열 69는 대장균에서의 사용을 위해 서열 3 (서열 4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 일부분 내에서 재합성된 스키조키트리움으로부터의 OrfB (서열 4)를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 양쪽 형태 (대장균용 및 식물용)의 OrfB* 구축물의 서열이 상기 기술되었다. 서열 69 및 서열 3은 서열 4를 코딩한다.
OrfB*_pJK780으로 본원에 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 69의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 OrfB*_pJK780 (OrfB*_pJK780 클론으로 표시됨; 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8225를 배정받았다. OrfB*_pJK780의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
pThOrfC-synPS
서열 70은 스키조키트리움에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 재합성된 트라우스토키트리움 23B OrfC를 코딩하는 핵산 서열 (서열 61; 서열 62를 코딩함)을 나타낸다. 서열 70의 위치 2000-6412는 트라우스토키트리움 23B OrfC 단백질에 대한 코딩 영역 (정지 코돈 포함)을 나타낸다. 서열 70의 위치 1-1999 및 6413-8394는 상류 및 하류 스키조키트리움 OrfC 서열 (비-코딩 영역)을 각각 나타낸다. pThOrfC-synPS로 표시되는, 서열 70을 함유하는 플라스미드의 구축이 실시예 1에 상세하게 기술된다. 서열 70 및 서열 61은 각각 서열 62를 코딩한다. pThOrfC-synPS는 스키조키트리움 orfC의 코딩 영역 (CDS) (서열 5)을 상기 논의된 바와 같이 재합성된 트라우스토키트리움 23B orfC에 대한 코딩 영역 (서열 70)으로 정확하게 교체하기 위해 디자인된다. 이러한 구축물로 형질전환된 생물의 생산 및 용도가 하기 및 실시예에서 상세하게 기술된다.
상기에서 pThOrfC-synPS로 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 70의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 62의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 pThOrfC-synPS (pThOrfC-synPS로 표시됨; 스키조키트리움 또는 기타 이종 숙주에서의 발현을 위해 최적화된 "완벽한 스티치(stitch)"의 합성 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS OrfC 코돈을 함유하는 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8229를 배정받았다. pThOrfC-synPS의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
pDD26
서열 71은 스키조키트리움에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 재합성된 트라우스토키트리움 23B OrfA를 코딩하는 핵산 서열 (서열 38; 서열 39를 코딩함)을 나타낸다. 서열 71의 위치 2044-10479는 트라우스토키트리움 23B OrfA 단백질에 대한 코딩 영역 (정지 코돈 포함)을 나타낸다. 서열 71의 위치 1-2043 및 10480-12495는 상류 및 하류 스키조키트리움 OrfA 서열 (비-코딩 영역)을 각각 나타낸다. pDD26으로 표시되는, 서열 71을 함유하는 플라스미드의 구축이 실시예 8에 상세하게 기술된다. 서열 71 및 서열 38은 각각 서열 39를 코딩한다. pDD26은 스키조키트리움 orfA의 코딩 영역 (CDS) (서열 1)을 상기 논의된 바와 같이 재합성된 트라우스토키트리움 23B OrfA에 대한 코딩 영역 (서열 71)로 정확하게 교체하기 위해 디자인된다. 이러한 구축물로 형질전환된 생물의 생산 및 용도가 하기 및 실시예에서 상세하게 기술된다.
상기에서 pDD26으로 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 71의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 39의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 pDD26 (pDD26으로 표시됨; 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 5월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8411을 배정받았다. pDD26의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
pDD32
서열 72는 스키조키트리움에서의 최적화된 코돈 사용빈도를 위해 재합성된 트라우스토키트리움 23B OrfB를 코딩하는 핵산 서열 (서열 51; 서열 52를 코딩함)을 나타낸다. 서열 72의 위치 1452-7259는 트라우스토키트리움 23B OrfB 단백질에 대한 코딩 영역 (정지 코돈 포함)을 나타낸다. 서열 72의 위치 1-1451 및 7260-8647은 상류 및 하류 스키조키트리움 OrfB 서열 (비-코딩 영역)을 각각 나타낸다. pDD32으로 표시되는, 서열 72를 함유하는 플라스미드의 구축이 실시예 8에 상세하게 기술된다. 서열 72 및 서열 51은 각각 서열 52를 코딩한다. pDD32는 스키조키트리움 orfB의 코딩 영역 (CDS) (서열 3)을 상기 논의된 바와 같이 재합성된 트라우스토키트리움 23B orfB에 대한 코딩 영역 (서열 72)로 정확하게 교체하기 위해 디자인된다. 이러한 구축물로 형질전환된 생물의 생산 및 용도가 하기 및 실시예에서 상세하게 기술된다.
상기에서 pDD32로 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 72의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 52의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 pDD32 (pDD32로 표시됨; 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 5월 8일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8412를 배정받았다. pDD32의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
키메라 PUFA PKS 구축물
본 발명은 키메라 PUFA PKS 단백질을 생산하기 위해 2가지 이상의 상이한 PUFA PKS 핵산 서열, 예컨대 본원에 기술된 것들의 일부분을 사용하는 키메라 구축물을 또한 포함한다. 본 발명가들은 상이한 생물들로부터의 PUFA PKS 단백질의 도메인들 또는 일부분들을 "혼합하고 매칭(matching)"시킴 (즉, 2가지 이상의 상이한 생물로부터의 도메인 또는 폴리펩티드로 구성된 키메라 PUFA PKS 단백질을 생성시킴)으로써, 이러한 키메라 단백질을 함유하는 PUFA PKS 시스템을 발현하는 생물에 의해 생산된 PUFA의 프로파일이 천연 (천연 발생) PUFA PKS 시스템과 비교하여 변형될 수 있다는 것을 본원에서 여러 상이한 예에서 실연하였다. 예를 들어, 본 발명가들은 생성된 키메라 OrfC 단백질이 스키조키트리움으로부터의 DH1 및 ER 도메인 및 트라우스토키트리움으로부터의 DH2 도메인을 함유하도록, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 스키조키트리움 단백질의 OrfC 단백질에서 사용하는 것을 본원에서 기술한다. 한 구축물에서는 코돈-최적화 (스키조키트리움에 대한 최적화) 트라우스토키트리움 DH2 도메인, 또다른 구축물에서는 천연 트라우스토키트리움 DH2 도메인을 사용하는 것에 의해 키메라 구축물이 추가로 변형되고, 이는 본원에 기술된 다양한 변형의 유연성 및 효과를 실연한다.
특정 키메라 구축물이 예로서 하기에 기술된다. 또다른 키메라 구축물들이 이러한 기술에 따라 당업자에게 명백할 것이다.
pDS49
서열 73은 DH2 도메인 (서열 30)이 트라우스토키트리움 23B OrfC (서열 62)로부터의 DH2 도메인 (서열 66을 포함하는 서열)로 교체된 스키조키트리움 OrfC 단백질 (서열 6)을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 이러한 키메라 구축물에서, 트라우스토키트리움으로부터의 DH2-코딩 서열은 천연 (코돈-최적화되지 않은) 서열이다. pDS49로 표시되는, 서열 73을 함유하는 플라스미드의 구축이 실시예 2에 상세하게 기술된다. pDS49에서 서열 73에 플랭킹(flanking)되는 스키조키트리움 OrfC 상류 및 하류 비-코딩 서열은 서열 70과 관련하여 상기 기술된 것들과 동일하다 (서열 73에서 표시되지 않음). 서열 73은 서열 74의 아미노산 서열을 코딩한다. 서열 74에 대해 언급하자면, 이러한 키메라 OrfC 폴리펩티드는 아미노산 잔기 1493개의 길이이다. 서열 74의 아미노산 516-1041으로 정의되는 DH2 영역은 Th.23B OrfC 단백질의 DH2 영역의 아미노산 서열, 즉 서열 62의 아미노산 491-1016으로 구성되고, 이는 서열 66 모두 및 서열 62로부터의 일부 플랭킹 아미노산 서열을 포함한다. 키메라 OrfC 아미노산 서열의 나머지와 관련하여, 서열 74의 잔기 1-515 및 1042-1493는 각각 서열 6의 스키조키트리움 OrfC 잔기 1-515 및 1051-1502와 동일하다. 이러한 구축물로 형질전환된 생물의 생산 및 용도가 하기 및 실시예에서 상세하게 기술된다.
상기에서 pDS49로 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 73의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 74의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 pDS49 (pDS49로 표시됨; 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8230을 배정받았다. pDS49의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
pDD24
서열 75는 DH2 도메인 (서열 30)이 트라우스토키트리움 23B OrfC (서열 62)로부터의 DH2 도메인 (서열 66을 포함하는 서열)로 교체된 스키조키트리움 OrfC 단백질 (서열 6)을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 또다른 핵산 서열을 나타낸다. 이러한 키메라 구축물에서, 트라우스토키트리움으로부터의 DH2-코딩 서열은 스키조키트리움에서의 사용을 위해 코돈-최적화된 서열이다. pDD24로 표시되는, 서열 75를 함유하는 플라스미드의 구축이 실시예 3에 상세하게 기술된다. pDD24에서 서열 75에 플랭킹되는 스키조키트리움 OrfC 상류 및 하류 비-코딩 서열은 서열 70과 관련하여 상기 기술된 것들과 동일하다 (서열 75에서 표시되지 않음). 서열 75는 서열 74의 아미노산 서열을 코딩한다. 서열 74는 서열 73 (서열 74를 또한 코딩함)과 관련하여 상기에서 상세하게 기술되었다. 그러나, 이러한 구축물에서, 상기 논의된 바와 같이, 서열 74의 아미노산 516-1041을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 플라스미드 pThOrfC-synPS 내에 함유되고 스키조키트리움에서의 유전자 발현을 위해 선호되는 코돈을 사용하는 트라우스토키트리움.23B의 OrfC에 대한 "합성 유전자 서열"로부터 유래되었다 (실시예 1 및 서열 70 참조). 이러한 구축물로 형질전환된 생물의 생산 및 용도가 하기 및 실시예에서 상세하게 기술된다.
상기에서 pDD24로 기술된 플라스미드는, 본 발명가들이 아는 한, 서열 75의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상응하는 서열 74의 아미노산 서열을 코딩한다. 플라스미드 pDD24 (pDD24로 표시됨; 대장균 플라스미드 벡터 형태)가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2007년 3월 1일 기탁되었고, ATCC 접속 번호 PTA-8226을 배정받았다. pDD24의 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 본 발명에 포함된다.
키메라 PUFA PKS 시스템
상기 기술된 코돈-최적화 및 키메라 구축물의 용도에 더하여, 본 발명은 키메라 PUFA PKS 시스템의 생산 및 용도를 포함한다. 키메라 PUFA PKS 시스템은 키메라 PUFA PKS 단백질이 PUFA PKS 시스템에서 생성 및 사용되는 상기 기술된 키메라 구축물의 사용을 포함하지만, 이러한 시스템은 생성된 PUFA PKS 시스템이 2가지 이상의 상이한 PUFA PKS 시스템으로부터의 단백질들을 포함하도록 하나 이상의 PUFA PKS 시스템(들)로부터의 하나 이상의 전체 단백질 또는 단백질들이 또다른 PUFA PKS 시스템으로부터의 상응하는 전체 단백질 또는 단백질들로 교환되거나 이에 부가된 PUFA PKS 시스템을 또한 포함한다. 이러한 시스템은 상기 기술된 바와 같은 키메라 단백질 (예를 들어, 키메라 단백질, 및 모든 단백질의 치환)의 사용을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, pTh23B_synPS (스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 트라우스토키트리움 23B OrfC-코딩 서열 포함)으로 상기 기술된 구축물이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템 내로 치환되어, 천연 스키조키트리움 OrfC-코딩 서열을 완벽하게 교체함으로써, 키메라 PUFA PKS 시스템이 생성될 수 있다. 또다른 예로서, 천연 트라우스토키트리움 23B OrfC-코딩 서열 (코돈-최적화되지 않음)이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템 내로 치환되어, 천연 스키조키트리움 OrfC-코딩 서열을 완벽하게 교체함으로써, 또다른 키메라 PUFA PKS 시스템이 생성될 수 있다. 또다른 예로서, 천연 트라우스토키트리움 23B OrfA- 및 OrfC-코딩 서열 (코돈-최적화되거나 최적화되지 않음)이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템 내로 치환되어, 각각 천연 스키조키트리움 OrfA- 및 OrfC-코딩 서열을 완벽하게 교체함으로써, 또다른 키메라 PUFA PKS 시스템이 생성될 수 있다. 이러한 키메라 PUFA PKS 시스템 및 또다른 키메라 PUFA PKS 시스템이 하기 실시예에서 기술된다. (1) 스키조키트리움 (S) OrfA, SOrfB, 및 트라우스토키트리움 (Th) OrfC; (2) SOrfA, ThOrfB, 및 SOrfC; (3) ThOrfA, SOrfB, 및 SOrfC; (4) SOrfA, ThOrfB, 및 ThOrfC; (5) ThOrfA, SOrfB, 및 ThOrfC; (6) ThOrfA, ThOrfB, 및 SOrfC; 및 (7) ThOrfA, ThOrfB, 및 ThOrfC로 구성된 키메라 PUFA PKS 시스템을 발현하는 스키조키트리움 숙주들이 실시예에 포함된다.
본원에서 제공된 논의 및 예시적인 실험들을 기초로, 이제는 숙주 코돈 사용빈도를 위한 PUFA PKS 핵산 분자의 선택된 재합성, 및/또는 다양한 숙주 생물 (PUFA의 생산을 위한 PUFA PKS 시스템이 내인성으로 없는 숙주 생물 포함)에서의 키메라 PUFA PKS 구축물 및/또는 키메라 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해 PUFA 생산을 개선 및/또는 변형하는 것이 가능하다.
포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase)
본 발명에 따르면, 이종 숙주에서의 PUFA의 생산 및/또는 축적 또는 내인성 숙주에서의 PUFA의 개선된 생산 및/또는 축적을 위한 PUFA PKS 시스템은 다양한 부속 단백질을 사용할 수 있고, 상기 단백질은 상기 기술된 바와 같은 코어 PUFA PKS 시스템의 일부로 간주되지 않지만 (즉, PUFA 신테이즈 효소 복합체 자체의 일부가 아님), 본 발명의 코어 PUFA 신테이즈 효소 복합체를 사용하는 PUFA 생산에 또는 적어도 효율적인 PUFA 생산에 필요할 수 있거나 필요한 단백질로 본원에서 정의된다.
PUFA를 생산하기 위해, PUFA PKS 시스템은 4'-포스포판테테이닐 모이어티를 보조효소 A에서 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인(들)로 전달하는 부속 단백질과 함께 일해야 한다. 따라서, PUFA PKS 시스템이 하나 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase) 도메인을 포함하는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 이러한 도메인이 PUFA PKS 시스템에 대한 부속 도메인 또는 단백질인 것으로 간주될 수 있다. PPTase의 구조적 및 기능적 특성들이, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641; 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명에 따르면, 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase) 생물학적 활성 (기능)이 있는 도메인 또는 단백질은 4'-포스포판테테이닐 모이어티를 보조효소 A에서 아실 캐리어 단백질 (ACP)로 전달하는 효소로 특성화된다. ACP의 불변성 세린 잔기로의 이러한 전달은 불활성 애포-형태를 홀로-형태로 활성화시킨다. 폴리케타이드 및 지방산 합성 양쪽 모두에서, 포스포판테테인 기는 성장 중인 아실 사슬과 티오에스테르를 형성한다. PPTase는 지방산 합성, 폴리케타이드 합성, 및 비-리보솜성 펩티드 합성에서 잘 특성화된 효소 패밀리이다. 다수의 PPTase의 서열이 공지되어 있고, 결정 구조가 결정되었을 뿐만 아니라 (예를 들어, [Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. "Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily" EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31]), 활성에 중요한 아미노산 잔기의 돌연변이 분석이 수행되었다 ([Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. "Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism" Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36]). PPTase 내의 이러한 불변성 및 고도로 보존된 아미노산은 상기 기술된 쉐와넬라 균주 양쪽 모두로부터의 pfaE ORF 내에 함유된다.
본원에 기술된 OrfA ACP 도메인을 기질로 인식하는 것으로 기존에 실연된 한 이종성 PPTase는 노스톡 종 PCC 7120 (기존에는 아나바에나(Anabaena) 종 PCC 7120으로 칭해짐)의 Het I 단백질이다. Het I은 이러한 생물의 이질세포(heterocyst)에 존재하는 글리코-지질 층의 성분인 장쇄 히드록시-지방산의 합성을 담당하는 것으로 공지된 노스톡의 유전자들의 클러스터 내에 존재한다 ([Black and Wolk, 1994, J. Bacteriol 176, 2282-2292]; [Campbell et al., 1997, Arch. Microbiol 167, 251-258]). Het I은 이러한 클러스터 내에 존재하는 단백질인 HgI E의 ACP 도메인을 활성화시킬 것이다. HgI E의 2개의 ACP 도메인은 스키조키트리움 OrfA에서 발견되는 ACP 도메인에 대한 고도의 서열 상동성이 있다. 서열 34는 노스톡 Het I 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템이 포함되는 본원에 기술된 PUFA PKS 시스템과 함께 사용될 수 있는 기능성 PPTase이다. 서열 34는 서열 33에 의해 코딩된다. Het I의 내인성 시작 코돈은 확인되지 않았다 (추정 단백질 내에 존재하는 메티오닌이 없다). 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 근처에 여러 잠재적인 별법적인 시작 코돈 (예를 들어, TTG 및 ATT)이 있다. 서열 내에 메티오닌 코돈 (ATG)이 존재하지 않는다. 그러나, PCR을 사용하여 가장 5' 쪽의 잠재적인 별법적인 시작 코돈 (TTG)을 메티오닌 코돈 (ATG, NdeI 제한 효소 인식 부위의 일부)으로 교체하고, 코딩 서열의 3' 말단에 XhoI 부위를 도입하여 Het I 발현 구축물의 구축이 완료되었고, 코딩된 PPTase (서열 34)는 기능성인 것으로 나타났다.
본원에 기술된 OrfA ACP 도메인을 기질로 인식하는 것으로 기존에 실연된 또다른 이종성 PPTase는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 sfp이다. sfp는 잘 특성화되어 있고, 광범위한 기질을 인식하는 능력으로 인해 널리 사용된다. 공개된 서열 정보 ([Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232: 313-321])를 기초로, 코딩 영역을 정해진 상류 및 하류 플랭킹 DNA 서열과 함께 pACYC-184 클로닝 벡터 내로 클로닝함으로써 sfp에 대해 발현 벡터가 기존에 생산되었다. 대장균에서 스키조키트리움 OrfA, OrfB*, 및 OrfC와 함께 공동-발현되어, 적절한 조건 하에 이러한 세포 내의 DHA의 축적을 초래한 능력에 의해 실연되는 바와 같이, 이러한 구축물은 기능성 PPTase를 코딩한다 (미국 특허 출원 공개 번호 20040235127 참조).
본 발명에 따른 시스템을 발현하도록 생물 (예를 들어, 미생물 또는 식물)을 유전자 변형시키는 경우, 일부 숙주 생물은 PUFA를 생산하기 위해 PUFA PKS와 함께 일할 필요가 있는 부속 단백질 (예를 들어, PPTase)을 내인성으로 발현할 수 있다. 그러나, 일부 생물은, 생물이 상동성 부속 단백질을 내인성으로 생산하는 경우에도, 생물에 의한 PUFA의 생산을 가능하게 하고/하거나 강화하기 위해 하나 이상의 본원에 기술된 부속 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환될 수 있다 (즉, 일부 이종 부속 단백질이 숙주 세포의 내인성 부속 단백질보다 형질전환된 PUFA 신테이즈 단백질과 더욱 효과적으로 또는 효율적으로 작용할 수 있다). 한 실시양태에서, 이러한 부속 단백질에는 부속 PPTase가 포함된다.
본 발명의 한 실시양태는 PUFA PKS 시스템으로부터의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 이의 상동체, 이의 단편, 및/또는 임의의 이러한 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 39, 서열 52, 서열 62, 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; (b) 서열 8, 서열 10, 서열 13, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 48, 서열 50, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; (c) (a)의 아미노산 서열들 중 임의의 것의 500개 이상의 연속적인 아미노산과 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 이때 아미노산 서열에 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템의 적어도 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 핵산 서열; (d) (b)의 아미노산 서열들 중 임의의 것과 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 이때 상기 아미노산 서열에 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템의 적어도 1개의 도메인의 생물학적 활성이 있는 핵산 서열; 또는 (e) (a), (b), (c), 또는 (d)의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 여러 PUFA PKS 도메인에 대해 상기 기술된 활성 부위 도메인 또는 기타 기능성 모티프를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템에서 유용한 키메라 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 독특한 품질이 있는 신규 PUFA PKS 시스템을 생성시키기 위해 한 PUFA PKS 시스템으로부터의 또는 이로부터 유래된 임의의 도메인 또는 단백질을 또다른 PUFA PKS 시스템으로부터의 또는 이로부터 유래된 도메인에서 및/또는 또다른 PUFA PKS 시스템으로부터의 또는 이로부터 유래된 단백질과 함께 사용하는 것을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 한 실시양태는 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 상이한 생물 또는 생물들로부터의 단백질/도메인으로 구성된 PUFA PKS 시스템을 변형시키기 위해 사용하는 것에 관한 것이고, 이때 DH2 도메인의 도입 (예를 들어, 한 실시양태에서, 숙주 내의 내인성 DH2 도메인 또는 유사한 도메인의 치환에 의한 도입)은 시스템에 의해 생산되는 PUFA들의 비율, 특히 시스템에 의해 생산되는 오메가-3 대 오메가-6 PUFA의 비율을 변형시킨다. 이러한 실시양태가 하기에 상세하게 기술된다.
일부 바람직한 핵산 분자에는 서열 74의 아미노산 서열 및 이의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 핵산 서열, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템의 적어도 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는, 서열 74에 대해 약 60％ 이상 동일한 아미노산을 코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열들에 대해 완전히 상보적인 핵산 서열이 포함된다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 73 및 서열 75로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 pDS49 및 pDD24의 군으로부터 선택된 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 키메라 OrfC 단백질을 코딩하는 pDS49 및 pDD24의 군으로부터 선택된 플라스미드의 핵산 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 실시양태는 한 PUFA PKS 시스템으로부터의 PUFA PKS 단백질 또는 도메인 또는 이의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 이때 상이한 생물, 예컨대 핵산 서열이 발현될 숙주의 코돈 사용빈도에 대해 상기 핵산 서열이 최적화된 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 서열의 예가 본원에서 기술되고, 서열 70, 서열 71, 및 서열 72, 뿐만 아니라 서열 75로 표시되는 핵산 서열을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 임의의 PUFA PKS 단백질 또는 도메인, 특히 본원에 기술된 아미노산 서열들 중 임의의 것을 코딩하는 코돈 최적화 핵산 서열이 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 pThOrfC-synPS, pDD26, pDD32, 또는 pDD24의 군으로부터 선택된 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 PUFA PKS 시스템에서 유용한 단백질 또는 키메라 단백질을 코딩하는 pThOrfC-synPS, pDD26, pDD32, 또는 pDD24로부터 선택된 플라스미드의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열은 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템에 의해 예시되고 미국 특허 번호 6,140,486, 미국 특허 번호 6,566,583, 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641, 미국 특허 출원 공개 번호 20070089199, 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127, 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995, PCT 특허 공개 번호 WO 05/097982, 또는 미국 특허 출원 공개 번호 20050014231 (상기)에 기술된 PUFA PKS 시스템 중 임의의 것에서의 단백질 및 도메인 중 임의의 것의 기술된 생물학적 활성에 의해 추가적으로 예시되는 바와 같은, 본원에 상세하게 기술된 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열이다.
따라서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 생물학적 활성이 있는 임의의 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임, PUFA PKS 도메인, 이의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 천연 발생 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임 또는 도메인의 임의의 상동체의 번역 생성물을 코딩할 수 있다. 소정의 단백질 또는 도메인의 상동체는 적어도 1개 또는 수개의, 그러나 1개 또는 수개에 한정되지 않는 아미노산이 결실 (예를 들어, 펩티드 또는 단편과 같은 단백질의 말단절단(truncated) 버젼), 삽입, 역전, 치환 및/또는 유도체화 (예를 들어, 당화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미테이트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 부가에 의한 유도체화)되었다는 점에서 천연 발생 기준 아미노산 서열 (즉, 기준 단백질 또는 도메인의 서열)과 아미노산 서열이 상이한 단백질 또는 폴리펩티드이다. PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 바람직한 상동체가 하기에 상세하게 기술된다. 상동체는 합성에 의해 생산된 상동체, 소정의 단백질 또는 도메인의 천연 발생 대립유전자 변이체, 또는 기준 서열이 유래된 생물 이외의 생물로부터의 상동성 서열을 포함할 수 있다는 것을 유념한다.
일반적으로, 단백질 또는 도메인의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체 내에서 (즉, 단백질의 천연의 생리학적 환경에서) 또는 시험관 내에서 (즉, 실험실 조건 하에서) 측정 또는 관찰되는 바와 같이, 천연 발생 형태의 단백질 또는 도메인에 기인하는 단백질 또는 도메인이 나타내거나 수행하는 임의의 기능(들)을 지칭한다. PUFA PKS 시스템 및 PUFA PKS 시스템을 구성하는 개별적인 단백질/도메인의 생물학적 활성이 본원의 다른 곳에서 상세하게 기술된다. 단백질 또는 도메인의 변형, 예컨대 상동체 또는 모방체 (하기 논의됨)에서의 변형으로 천연 발생 단백질 또는 도메인과 생물학적 활성이 동일한 단백질 또는 도메인, 또는 천연 발생 단백질 또는 도메인과 비교하여 생물학적 활성이 감소 또는 증가된 단백질 또는 도메인이 초래될 수 있다. 단백질 또는 도메인의 발현에서의 감소 또는 활성에서의 감소를 초래하는 변형은 단백질 또는 도메인의 불활성화 (완전 또는 부분적), 하향-조절, 또는 감소된 작용으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 단백질 또는 도메인의 발현에서의 증가 또는 활성에서의 증가를 초래하는 변형은 단백질 또는 도메인의 증폭, 과잉생산, 활성화, 강화, 상향-조절 또는 증가된 작용으로 지칭될 수 있다. PUFA PKS 시스템의 기능성 도메인은 생물학적 기능을 수행할 수 있는 (즉, 생물학적 활성이 있는) 도메인이다 (즉, 도메인은 단백질의 일부분일 수 있다).
본 발명에 따르면, 단리된 핵산 분자는 천연에서 핵산 분자가 발견되는 게놈 또는 염색체인 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간의 조작이 적용된) 핵산 분자이다. 따라서, "단리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 반드시 반영하여야 하지는 않지만, 분자가 천연에서 핵산 분자가 발견되는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 가리킨다. 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 이러한 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니고, 그보다는, 유전자와 관련된 코딩 영역 및 조절 영역은 포함하지만, 동일한 염색체 상에서 천연적으로 발견되는 추가적인 유전자는 전형적으로 포함하지 않는다 (일부 핵산 분자는 반드시 PUFA PKS 유전자 또는 시스템의 일부이지는 않은 가까운/연결된 유전자들을 포함할 수 있음). 단리된 핵산 분자는 천연에서는 일반적으로 특정 핵산 서열에 플랭킹되지 않는 추가적인 핵산 (즉, 이종 서열)이 플랭킹 (즉, 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹)된 특정 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예를 들어, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예를 들어, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"라는 구절은 물리적인 핵산 분자를 주로 지칭하고, "핵산 서열"이라는 구절은 핵산 분자 상의 뉴클레오티드의 서열을 주로 지칭하지만, 이러한 2개의 구절은, 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열과 관련하여, 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 본 발명의 단리된 핵산 분자가 생산된다. 단리된 핵산 분자는 천연 대립유전자 변이체 및 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템 생물학적 활성에 대한 원하는 효과를 변형이 제공하도록 하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실. 치환 및/또는 역전된 변형된 핵산 분자가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 천연 핵산 분자 및 이의 상동체를 포함한다. 단백질 상동체 (예를 들어, 핵산 상동체에 의해 코딩되는 단백질)는 상기에 상세하게 논의되어 있다.
당업자에게 공지된 다수의 방법을 사용하여 핵산 분자 상동체를 생산할 수 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989] 참조). 예를 들어, 전통적인 돌연변이유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 결찰, 핵산 서열의 선택된 영역의 PCR 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자들의 혼합물을 "건설"하기 위한 혼합물 군들의 결찰, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술을 사용하여 핵산 분자를 변형시킬 수 있다. 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 기능에 대한 스크리닝에 의해 및/또는 야생형 유전자와의 혼성화에 의해 핵산 분자 상동체를 변형된 핵산들의 혼합물로부터 선별할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 최소 크기는 본 발명에서 유용한 핵산 분자의 상보적인 서열과 안정적인 하이브리드 (예를 들어, 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에)를 형성할 수 있는 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하는데 충분한 크기, 또는 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는데 충분한 크기이다. 따라서, 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 크기는 핵산 조성 및 핵산 분자와 상보적인 서열 간의 백분율 상동성 또는 동일성 백분율, 뿐만 아니라 혼성화 조건 그 자체 (예를 들어, 온도, 염 농도, 및 포름아미드 농도)에 좌우될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 핵산 분자의 최소 크기는 핵산 분자에 GC가 풍부한 경우에는 적어도 약 12개 내지 약 15개의 뉴클레오티드의 길이이고, 핵산 분자에 AT가 풍부한 경우에는 적어도 약 15개 내지 약 18개의 뉴클레오티드의 길이이다. 핵산 분자가 PUFA PKS 시스템의 도메인의 생물학적으로 활성인 단편, PUFA PKS 시스템의 전체 도메인, PUFA PKS 시스템의 오픈 리딩 프레임 (Orf) 내의 여러 도메인, PUFA PKS 시스템의 전체 Orf, 또는 PUFA PKS 시스템의 1개를 초과하는 Orf를 코딩하는데 충분한 서열을 포함할 수 있다는 점에서, 실용적인 제한을 제외하고는 본 발명의 핵산 분자의 최대 크기는 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 13, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 또는 서열 74, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이러한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 서열로 구성된다. 한 양상에서, 핵산 서열은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 12, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 34, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 서열 67, 서열 69, 서열 70, 서열 71, 서열 72, 서열 73, 또는 서열 75로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 임의의 상기 기술된 PUFA PKS 아미노산 서열, 뿐만 아니라 이러한 서열의 상동체가 소정의 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 끝부분 각각에 플랭킹된 1개 이상, 약 20개 이하의 추가적인 이종 아미노산과 함께 생산될 수 있다. 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 소정의 아미노산 서열로 "본질적으로 구성"되는 것으로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이종 아미노산은 천연적으로 소정의 아미노산 서열에 플랭킹되는 것으로 발견되지 않는 (즉, 생체 내에서 사실상 발견되지 않는) 아미노산의 서열, 또는 소정의 아미노산 서열이 유래된 생물에 대한 표준 코돈 사용빈도를 사용하여 천연 발생 서열 내의 뉴클레오티드가 번역된다면, 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 천연 발생 핵산 서열이 유전자 내에서 발생하는 경우에 이에 플랭킹되는 뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않을 아미노산의 서열이다. 유사하게, "본질적으로 구성되는"이라는 구절은, 본원에서의 핵산 서열을 언급하면서 사용되는 경우, 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 말단 각각에서 적어도 약 1개, 많게는 약 60개까지의 추가적인 이종 뉴클레오티드가 플랭킹될 수 있는 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 천연적으로는 이종 뉴클레오티드는 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 천연 유전자 내에서 발생하는 경우에 이에 플랭킹되는 것으로 발견되지 않는다 (즉, 생체 내에서 사실상 발견되지 않는다).
본 발명은 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 또한 포함한다. 한 양상에서, 이러한 핵산 서열은 상기 기술된 PUFA PKS 단백질 또는 도메인 중 임의의 것의 상동체를 코딩하고, 이때 상동체에는 본원에서 이전에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 1개 이상 (또는 2개, 3개, 4개 이상)의 도메인의 생물학적 활성이 있다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 상동체는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 39, 서열 52, 서열 62 또는 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열의 500개 이상의 연속적인 아미노산에 대해 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 아미노산 서열에는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있다. 추가적인 양상에서, 상동체의 아미노산 서열은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 39, 서열 52, 서열 62, 또는 서열 74 중 임의의 것의 약 600개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 700개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 800개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 900개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1000개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1100개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1200개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1300개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1400개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1500개 이상의 연속적인 아미노산, 또는 서열 6, 서열 62, 또는 서열 74의 전장에 대해 약 60％ 이상 동일하다. 추가적인 양상에서, 상동체의 아미노산 서열은 서열 2, 서열 4, 서열 39, 또는 서열 52 중 임의의 것의 약 1600개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1700개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1800개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1900개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2000개 이상의 연속적인 아미노산, 또는 서열 4 또는 서열 52의 전장에 대해 약 60％ 이상 동일하다. 추가적인 양상에서, 상동체의 아미노산 서열은 약 2100개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2200개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2300개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2400개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2500개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2600개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2700개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 2800개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 서열 2 또는 서열 39의 전장에 대해 약 60％ 이상 동일하다.
또다른 양상에서, 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 상동체는 상기 단락에서 기술된 연속적인 아미노산 길이 중 임의의 것에 걸쳐 상기 기술된 아미노산 서열들 중 임의의 것에 대해 약 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 아미노산 서열에는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 상동체는 서열 8, 서열 10, 서열 13, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 48, 서열 50, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 또는 이러한 아미노산 서열들 중 임의의 것의 조합을 포함하는 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 아미노산 서열에는 PUFA PKS 시스템 또는 이의 부속 단백질의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있다. 추가적인 양상에서, 상동체의 아미노산 서열은 상기 기술된 아미노산 서열들 중 임의의 것에 대해 약 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 99％ 이상 동일하고, 이때 상기 아미노산 서열에는 PUFA PKS 시스템 또는 이의 부속 단백질의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있다.
본 발명에 따르면, 본원에 기술된 핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 용어 "인접한" 또는 "연속적인"은 중단되지 않은 서열에서 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어, 제1 서열이 제2 서열의 30개의 인접한 (또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은 제1 서열이 제2 서열 내의 아미노산 잔기 30개의 중단되지 않은 서열과 100％ 동일한 아미노산 잔기 30개의 중단되지 않은 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 유사하게, 제1 서열에 제2 서열과의 "100％ 동일성"이 있다는 것은 제1 서열이 뉴클레오티드 또는 아미노산들 사이에 갭(gap)이 없으면서 제2 서열과 정확하게 매칭된다는 것을 의미한다.
달리 명시되지 않는 경우, 본원에서 사용된, 동일성 백분율 (％)에 대한 언급은 (1) 모두 6개의 오픈 리딩 프레임에서 아미노산 검색을 위한 blastp, 핵산 검색을 위한 blastn, 및 핵산 검색 및 번역된 아미노산의 검색을 위한 blastX (모두 표준 디폴트 파라메터)를 사용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 검색으로, 이때 질의 서열이 디폴트에 의해 복잡성이 낮은 영역에 대해 필터링되는 검색 (전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술됨); (2) BLAST 2 정렬 (하기에 기술된 파라메터 사용); (3) 및/또는 표준 디폴트 파라메터로의 PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)를 사용하여 수행된 상동성의 평가를 지칭한다. BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 간의 표준 파라메터에서의 약간의 차이로 인해, 2개의 특정 서열이 BLAST 2 프로그램을 사용하여 유의한 상동성이 있는 것으로 인식될 수 있는 반면, 서열들 중 하나를 질의 서열로 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행된 검색에서는 최상의 매치에서 제2 서열이 확인되지 않을 수 있다는 것을 유념한다. 또한, PSI-BLAST는 사용하기 쉬운 자동화 버젼의 "프로파일" 검색을 제공하고, 이는 서열 상동체를 찾기 위한 감도높은 방식이다. 이 프로그램은 먼저 갭(gapped) BLAST 데이터베이스 검색을 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 위치-특이적 스코어 매트릭스를 구축하도록 복귀된 임의의 유의한 정렬로부터의 정보를 사용하고, 상기 매트릭스는 다음 회차의 데이터베이스 검색을 위해 질의 서열을 교체한다. 따라서, 이러한 프로그램들 중 임의의 하나를 사용함으로써 동일성 백분율이 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된 [Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250]에 기술된 바와 같은 BLAST 2 서열을 사용하여 2개의 특정 서열을 서로 정렬할 수 있다. 2개의 서열 간의 Gapped BLAST 검색 (BLAST 2.0)을 수행하기 위해 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 blastp 또는 blastn에서 BLAST 2 서열 정렬을 수행하여, 생성된 정렬에 갭 (결실 및 삽입)을 도입한다. 본원에서의 명확성을 위해, 하기와 같은 표준 디폴트 파라메터를 사용하여 BLAST 2 서열 정렬을 수행한다.
blastn의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스를 사용한다:
Figure 112009077242410-pct00001
blastp의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스를 사용한다:
Figure 112009077242410-pct00002
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열은 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드와 충분히 유사하여, 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 (하기 기술됨) 하에 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (즉, 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 가닥의 상보체)에 (즉, 이러한 분자와) 혼성화할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열은 본원에 기술된 아미노산 서열들 중 임의의 것에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 상보체에 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 스키조키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열로부터 단리된 (이로부터 수득가능한) 뉴클레오티드 서열이거나, 스키조키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 스키조키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열의 상동체이고, 이때 스키조키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열 (스키조키트리움으로부터의 DNA 분자의 어느 한쪽 가닥 포함)은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 13, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 또는 서열 32 중 임의의 것으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다. 한 실시양태에서, 스키조키트리움은 스키조키트리움 ATCC 20888이다. 또다른 실시양태에서, 스키조키트리움은 돌연변이된 균주 (예를 들어, N230D)를 포함하는 스키조키트리움 20888의 딸 균주이다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 12, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 또는 서열 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 트라우스토키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열로부터 단리된 (이로부터 수득가능한) 뉴클레오티드 서열이거나, 트라우스토키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 트라우스토키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열의 상동체이고, 이때 트라우스토키트리움으로부터의 뉴클레오티드 서열 (트라우스토키트리움으로부터의 DNA 분자의 어느 한쪽 가닥 포함)은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68 중 임의의 것으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다. 한 실시양태에서, 트라우스토키트리움은 트라우스토키트리움 23B (ATCC 20892)이다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 또는 서열 67로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 진핵생물 (예를 들어, 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드) 또는 해양 생물로부터의 뉴클레오티드 서열로부터 단리된 (이로부터 수득가능한) 뉴클레오티드 서열이거나, 진핵생물 (예를 들어, 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드) 또는 해양 생물로부터의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 진핵생물 (예를 들어, 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드) 또는 해양 생물로부터의 뉴클레오티드 서열의 상동체이고, 이때 뉴클레오티드 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 본원에서 표시된 아미노산 서열들 중 임의의 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 부속 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 단리된 (이로부터 수득가능한) 뉴클레오티드 서열이거나, 본원에 기술된 부속 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 본원에 기술된 부속 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열의 상동체이고 (DNA 분자의 어느 한쪽 가닥 포함), 이때, 한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 34로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 33으로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 임의의 코돈-최적화 또는 키메라 뉴클레오티드 서열로부터 단리된 (이로부터 수득가능한) 뉴클레오티드 서열이거나, 본원에 기술된 임의의 코돈-최적화 또는 키메라 뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 본원에 기술된 임의의 코돈-최적화 또는 키메라 뉴클레오티드 서열의 상동체이고 (DNA 분자의 어느 한쪽 가닥 포함), 이때, 한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 74로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 중도, 고도 또는 초고도 엄격성 조건 하에 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 69, 서열 70, 서열 71, 서열 72, 서열 73, 또는 서열 75로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.
상보성 서열을 추론하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 아미노산 서열분석 및 핵산 서열분석 기술에 전적으로 오차가 없지 않기 때문에, 본원에서 제시된 서열은 본 발명의 PUFA PKS 도메인 및 단백질, 또는 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 식별할 수 있는(apparent) 서열을 최대한으로 나타낸다는 것을 유념하여야 한다.
본원에서 사용된 혼성화 조건은 핵산 분자를 사용하여 유사한 핵산 분자를 확인하는 표준 혼성화 조건을 지칭한다. 이러한 표준 조건이, 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989]에 개시되어 있다. [Sambrook et al., 동일 문헌]은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다 (특히, pp. 9.31-9.62 참조). 또한, 뉴클레오티드들의 다양한 정도의 미스매치를 허용하는 혼성화를 달성하기 위해 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하기 위한 식이, 예를 들어, [Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284]에 개시되어 있고; [Meinkoth et al., 동일 문헌]은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
더욱 특히, 본원에서 지칭되는 중도 엄격성 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와의 핵산 서열 동일성이 약 70％ 이상인 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드들의 약 30％ 이하의 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 본원에서 지칭되는 고도 엄격성 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드들의 약 20％ 이하의 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 본원에서 지칭되는 초고도 엄격성 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와의 핵산 서열 동일성이 약 90％ 이상인 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드들의 약 10％ 이하의 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 당업자는 [Meinkoth et al., 동일 문헌]의 식을 사용하여 이러한 특정 수준의 뉴클레오티드 미스매치를 달성하기 위한 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산할 수 있다. 이러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드가 형성되는지 여부에 따라 변할 것이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 계산된 용융 온도는 DNA:RNA 하이브리드에 대해 10℃ 더 낮다. 특정 실시양태에서, DNA:DNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은, 적합한 세정 조건과 함께, 6× SSC (0.9 M Na+)의 이온 강도, 약 20℃ 내지 약 35℃ 사이 (낮은 엄격성), 더욱 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃ 사이 (더욱 엄격함), 더욱 더 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 45℃ 사이 (더욱 더 엄격함)의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA:RNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은, 유사하게 엄격한 세정 조건과 함께, 6× SSC (0.9 M Na+)의 이온 강도, 약 30℃ 내지 약 45℃ 사이, 더욱 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃ 사이, 더욱 더 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 55℃ 사이의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 이러한 값들은 약 100개의 뉴클레오티드보다 큰 분자, 0％ 포름아미드 및 약 40％의 G + C 함량에 대한 용융 온도의 계산을 기초로 한다. 별법적으로, [Sambrook et al., 상기 문헌, 9.31-9.62면]에 기재된 바와 같이 경험적으로 Tm을 계산할 수 있다. 일반적으로, 세정 조건은 가능한 한 엄격하여야 하고, 선택된 혼성화 조건에 적합하여야 한다. 예를 들어, 혼성화 조건은 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 20-25℃ 낮은 온도 및 염 조건들의 조합을 포함할 수 있고, 전형적으로 세정 조건은 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 12-20℃ 낮은 온도 및 염 조건들의 조합을 포함한다. DNA:DNA 하이브리드와 사용하기에 적절한 혼성화 조건의 한 예는 6× SSC (50％ 포름아미드), 약 42℃에서 2-24시간 혼성화시킨 후, 실온, 약 2× SSC에서의 1회 이상의 세정에 이은 더 높은 온도 및 더 낮은 이온 강도에서 추가적인 세정 (예를 들어, 약 37℃, 약 0.1×-0.5× SSC에서의 1회 이상의 세정에 이은 약 68℃, 약 0.1×-0.5× SSC에서의 1회 이상의 세정)을 포함하는 세정 단계가 이어지는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 pJK1126 (ATCC 접속 번호 PTA-7648), pJK1129 (ATCC 접속 번호 PTA-7649), pJK1131 (ATCC 접속 번호 PTA-7650), pJK306 (ATCC 접속 번호 PTA-7641), pJK320 (ATCC 접속 번호 PTA-7644), pJK324 (ATCC 접속 번호 PTA-7643), pBR002 (ATCC 접속 번호 PTA-7642), Th23BOrfA_pBR812.1 (ATCC 접속 번호 PTA-8232), Th23BOrfA_pBR811 (ATCC 접속 번호 PTA-8231), Th23BOrfB_pBR800 (ATCC 접속 번호 PTA-8227) 또는 Th23BOrfC_pBR709A (ATCC 접속 번호 PTA-8228)로부터 선택된 플라스미드의 핵산 서열과 동일하거나 이의 상동체 (상기 정의된 바와 같음)인 핵산 서열을 포함하거나, 이러한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 핵산 서열로 구성되는 핵산 분자를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 pThOrfC-synPS (ATCC 접속 번호 PTA-8229), pDS49 (ATCC 접속 번호 PTA-8230), pDD24 (ATCC 접속 번호 PTA-8226), pDD26 (ATCC 접속 번호 PTA-8411), pDD32 (ATCC 접속 번호 PTA-8412), 또는 OrfB*_pJK780 (ATCC 접속 번호 PTA-8225)으로부터 선택된 플라스미드의 핵산 서열과 동일하거나 이의 상동체 (상기 정의된 바와 같음)인 핵산 서열을 포함하거나, 이러한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 핵산 서열로 구성되는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 pJK1126 (ATCC 접속 번호 PTA-7648), pJK1129 (ATCC 접속 번호 PTA-7649), pJK1131 (ATCC 접속 번호 PTA-7650), pJK306 (ATCC 접속 번호 PTA-7641), pJK320 (ATCC 접속 번호 PTA-7644), pJK324 (ATCC 접속 번호 PTA-7643), pBR002 (ATCC 접속 번호 PTA-7642), Th23BOrfA_pBR812.1 (ATCC 접속 번호 PTA-8232) Th23BOrfA_pBR811 (ATCC 접속 번호 PTA-8231), Th23BOrfB_pBR800 (ATCC 접속 번호 PTA-8227) 또는 Th23BOrfC_pBR709A (ATCC 접속 번호 PTA-8228)로부터 선택된 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 동일하거나 이의 상동체 (상기 정의된 바와 같음)인 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이러한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 핵산 서열로 구성되는 핵산 분자를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 pThOrfC-synPS (ATCC 접속 번호 PTA-8229), pDS49 (ATCC 접속 번호 PTA-8230), pDD24 (ATCC 접속 번호 PTA-8226), pDD26 (ATCC 접속 번호 PTA-8411), pDD32 (ATCC 접속 번호 PTA-8412), 또는 OrfB*_pJK780 (ATCC 접속 번호 PTA-8225)으로부터 선택된 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 동일하거나 이의 상동체 (상기 정의된 바와 같음)인 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이러한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 핵산 서열로 구성되는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 단백질의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 재조합 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 서열 및 도메인 또는 단백질은 상기에 상세하게 기술되어 있다. 본 발명에 따르면, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열의 조작 및 이러한 핵산 서열의 숙주 세포 내로의 도입을 위한 도구로서 사용되는 조작된 (즉, 인공적으로 생산된) 핵산 분자이다. 따라서, 재조합 벡터는, 예컨대 선택된 핵산 서열을 숙주 세포 내로 발현시키고/시키거나 전달하여 재조합 세포를 형성시키는 것에 의한, 선택된 핵산 서열의 클로닝, 서열분석 및/또는 기타 조작에서 사용하기에 적절하다. 이러한 벡터는 전형적으로 이종 핵산 서열, 즉 천연적으로는 클로닝 또는 전달될 핵산 서열에 인접하여 발견되지 않는 핵산 서열을 함유하지만, 천연적으로 본 발명의 핵산 분자에 인접하여 발견되거나 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터, 번역되지 않는 영역)을 벡터가 또한 함유할 수 있다 (하기에 상세하게 논의됨). 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵생물성 또는 진핵생물성일 수 있고, 전형적으로는 플라스미드이다. 벡터는 염색체외 요소 (예를 들어, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 재조합 생물 (예를 들어, 미생물 또는 식물)의 염색체 내로 통합될 수 있다. 전체 벡터가 숙주 세포 내에서 제자리에서 유지될 수 있거나, 또는 특정 조건 하에서 본 발명의 핵산 분자를 남기면서 플라스미드 DNA가 결실될 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터의 제어, 천연 또는 플라스미드 프로모터의 제어, 또는 여러 프로모터들의 제어의 조합 하에 놓일 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다중 복사본이 염색체 내로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 사용되는 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본원에서 사용된 "발현 벡터"라는 구절은 코딩 생성물 (예를 들어, 관심 단백질)의 생산에 적절한 벡터를 지칭하도록 하용된다. 이러한 실시양태에서, 생산될 생성물 (예를 들어, PUFA PKS 도메인)을 코딩하는 핵산 서열이 재조합 벡터 내로 삽입되어, 재조합 핵산 분자가 생산된다. 생산될 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 전사 및 번역을 가능하게 하는 벡터 내의 조절 서열에 핵산 서열을 작동가능하게 연결시키는 방식으로 벡터 내로 삽입된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 사용되는 재조합 벡터는 표적화 벡터이다. 본원에서 사용된 "표적화 벡터"라는 구절은 숙주 세포 또는 미생물 내의 내인성 유전자를 결실 또는 불활성화시키기 위해 사용되는 (즉, 표적화된 유전자 파괴 또는 녹아웃(knock-out) 기술용으로 사용되는) 특정 핵산 분자를 재조합 숙주 세포 내로 전달하기 위해 사용되는 벡터를 지칭하도록 사용된다. 이러한 벡터는 당업계에서 "녹아웃" 벡터로 또한 공지될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 양상에서, 벡터의 일부분, 더욱 전형적으로는 벡터 내로 삽입된 핵산 분자 (즉, 삽입물)는 핵산 서열이 숙주 세포 내의 표적 유전자 (즉, 결실 또는 불활성화되도록 표적화되는 유전자)의 핵산 서열과 상동성이다. 벡터 삽입물의 핵산 서열은 표적 유전자 및 삽입물에 상동 재조합이 진행됨으로써 내인성 표적 유전자가 결실, 불활성화 또는 약화 (즉, 내인성 표적 유전자의 적어도 일부분이 돌연변이 또는 결실되는 것에 의해)되도록 벡터 삽입물의 핵산 서열이 표적 유전자에 결합하도록 디자인된다.
전형적으로, 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 사용된 "재조합 분자" 또는 "재조합 핵산 분자"는 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 주로 지칭하지만, "핵산 분자"라는 구절과 상호교환가능하게 사용될 수 있는데, 이때 이러한 핵산 분자는 본원에 논의된 바와 같은 재조합 분자이다. 본 발명에 따르면, "작동가능하게 연결된"이라는 구절은 숙주 세포 내로 형질감염 (즉, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 안내)되었을 때 핵산 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 핵산 분자를 전사 제어 서열에 연결시키는 것을 지칭한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장, 또는 종결을 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 전사 개시를 제어하는 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서(enhancer), 오퍼레이터(operator) 및 리프레서(repressor) 서열이다. 적절한 전사 제어 서열에는 재조합 핵산 분자가 내부로 도입될 숙주 세포 또는 생물에서 기능할 수 있는 임의의 전사 제어 서열이 포함된다.
본 발명의 재조합 핵산 분자는 추가적인 조절 서열, 예컨대 번역 조절 서열, 복제 기원, 및 재조합 세포와 상용성인 기타 조절 서열을 또한 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자 (숙주 세포 염색체 내로 통합된 것 포함)는 발현된 단백질이 단백질을 생산하는 세포로부터 분비될 수 있도록 하는 분비 신호 (즉, 신호 절편 핵산 서열)을 또한 함유한다. 적절한 신호 절편에는 발현될 단백질과 천연적으로 회합되는 신호 절편, 또는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종성 신호 절편이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질이 숙주 세포의 막으로 전달되어 막 내로 삽입되도록 할 수 있는 리더(leader) 서열을 포함한다. 적절한 리더 서열에는 단백질과 천연적으로 회합되는 리더 서열, 또는 세포의 막으로의 단백질의 전달 및 삽입을 지시할 수 있는 임의의 이종성 리더 서열이 포함된다.
본 발명가들은 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움 PUFA PKS OrfA 및 OrfB가 게놈 내에서 가깝게 연관된다는 것을 발견하였고, Orf들 사이의 영역을 서열분석하였다. 스키조키트리움에서, Orf들은 반대 방향으로 배향되고, 4244개의 염기쌍이 시작 (ATG) 코돈들을 분리한다 (즉, 하기와 같이 배열된다: 3'0rfA5'-4244 bp-5'OrfB3'). 4244 bp의 유전자간 영역의 검사에서 어떠한 명백한 Orf도 밝혀지지 않았다 (BlastX 검색에서 유의한 매치가 발견되지 않았다). Orf A 및 B 양쪽 모두, 적어도 오일 생산 시기 동안, 스키조키트리움에서 고도로 발현되고, 이는 활성 프로모터 요소가 이러한 유전자간 영역 내에 끼워져있음을 암시한다. 이러한 유전자 요소는 트랜스제닉(transgenic) 용도를 위한 2방향성 프로모터 서열로서의 유용성이 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 이러한 영역을 클로닝하고, 각각의 말단에 임의의 관심 유전자를 놓고, 구축물을 스키조키트리움 (또는 프로모터가 기능하는 것으로 나타날 수 있는 일부 다른 숙주) 내로 도입할 수 있다. 조절 요소가, 적합한 조건 하에, 2개의 도입된 유전자의 조화로운 높은 수준의 발현을 제공할 것으로 예측된다. 스키조키트리움 PUFA PKS 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 함유하는 조절 영역에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 76으로 표시된다.
유사한 방식으로, OrfC가 오일 생산 시기 동안 스키조키트리움에서 고도로 발현되고, 조절 요소들이 이의 시작 코돈의 상류의 영역 내에 있는 것으로 예상된다. OrfC의 상류의 게놈 DNA 영역이 클로닝 및 서열분석되었고, 본원에서 서열 77로 표시된다. 이러한 서열은 OrfC 시작 코돈 바로 상류의 3886 nt를 함유한다. 이러한 영역의 검사에서 어떠한 명백한 Orf도 밝혀지지 않았다 (즉, BlastX 검색에서 유의한 매치가 발견되지 않았다). 이러한 영역 내에 함유된 조절 요소들이, 적합한 조건 하에, 이들 뒤에 놓인 유전자의 높은 수준의 발현을 제공할 것으로 여겨진다. 추가적으로, 적합한 조건 하에, 발현 수준은 A-B 유전자간 영역 (서열 76)의 제어 하에 있는 유전자와 조화될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은, 본 발명에서 유용한 재조합 핵산 분자는 서열 76 및/또는 서열 77 내에 함유된 PUFA PKS 조절 영역을 포함할 수 있다. 이러한 조절 영역은 서열 76 및/또는 서열 77의 적어도 기본적인 PUFA PKS 전사 활성 (적어도 기본적인 프로모터 활성)이 있는 임의의 일부분 (단편)을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 재조합 분자는 본 발명의 코딩 생성물 (예를 들어, PUFA PKS 도메인, 단백질, 또는 시스템)을 생산하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자를 단백질을 생산하는데 효과적인 조건 하에 발현시킴으로써 코딩 생성물이 생산된다. 코딩된 단백질을 생산하는 바람직한 방법은 숙주 세포를 하나 이상의 재조합 분자로 형질감염시켜 재조합 세포를 형성시키는 것에 의한 것이다. 형질감염시킬 적절한 숙주 세포는 형질전감염될 수 있는 임의의 박테리아, 진균 (예를 들어, 효모), 곤충, 식물 또는 동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 형질감염되지 않은 세포, 또는 하나 이상의 다른 재조합 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)가 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 방법을 지칭하도록 사용된다. 용어 "형질전환"은 이러한 용어가 미생물 세포, 예컨대 조류, 박테리아 및 효모 내로의 핵산 분자의 도입을 지칭하도록 사용되는 경우 용어 "형질감염"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 미생물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외인성 핵산의 취득으로 인한 유전되는 변화를 기술하도록 사용되고, 본질적으로 용어 "형질감염"과 동의어이다. 그러나, 동물 세포에서, 형질전환에는 제2의 의미가 있고, 이는 예를 들어 세포가 암성이 된 후 배양 중인 세포의 성장 성질에서의 변화를 지칭할 수 있다. 따라서, 혼동을 방지하기 위해, 용어 "형질감염"은 바람직하게는 동물 세포 내로의 외인성 핵산의 도입과 관련하여 사용되고, 상기 용어들이 세포 내로의 외인성 핵산의 도입에 관련되는 한, 용어 "형질감염"은 동물 세포, 식물 세포의 형질감염 및 미생물 세포의 형질전환을 일반적으로 포함하도록 본원에서 사용될 것이다. 따라서, 형질감염 기술은 형질전환, 입자 포격, 전기천공, 미세주입, 리포펙션(lipofection), 흡착, 감염 및 원형질체 융합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
재조합 DNA 기술의 사용이 숙주 세포 내의 핵산 분자의 복사본의 수, 핵산 분자들이 전사되는 효율, 생성된 전사물이 번역되는 효율, 및 번역후 변형의 효율을 예를 들어 조작함으로써 형질감염된 핵산분자의 발현의 제어를 개선할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가적으로, 프로모터 서열을 유전자 조작하여, 천연 프로모터와 비교하여 발현 수준을 개선할 수 있다. 핵산 분자의 발현을 제어하는데 유용한 재조합 기술에는 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로의 핵산 분자의 통합, 벡터 안정성 서열을 플라스미드에 부가하는 것, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용빈도에 상응하도록 핵산 분자를 변형시키는 것, 및 전사물을 불안정화시키는 서열의 결실이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
재조합 핵산 분자 및 숙주 세포의 형질감염과 관련된 상기의 일반적인 논의는 PUFA PKS로부터의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 것, 기타 PKS 시스템으로부터의 아미노산 서열을 코딩하는 것, 및 기타 단백질 또는 도메인을 코딩하는 것을 포함하는, 임의의 본원에 논의된 재조합 핵산 분자에 적용되도록 의도된다.
본 발명은 구조, 도메인 구성 및/또는 기능 면에서 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템 (및 이의 단백질 또는 도메인) 중 임의의 것과 상동성인, 본원에 구체적으로 기술된 것들 이외의 미생물로부터의 PUFA PKS 시스템 (및 이의 단백질 또는 도메인)에 또한 관련된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템 을 위한 다양한 용도 (예를 들어, 유전자 변형 생물, 및 생체활성 분자의 생산 방법)에서 이러한 미생물 및 이러한 미생물로부터의 PUFA PKS 시스템 또는 이의 성분 (예를 들어, DH2 도메인)을 사용하는 것에 관련된다. PUFA PKS 시스템을 포함하는 미생물의 확인을 위한 스크리닝 프로세스가 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641 (상기)에 상세하게 기술되어 있다. 본원에 기술된 PUFA PKS 단백질 및 도메인의 구조 및 기능, 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 지식은 이러한 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 상동체의 확인, 확증 및/또는 단리를 위한 유용한 도구이다.
본 발명에 따르면, 용어 "트라우스토키트리드"는 트라우스토키트리아세아에 과를 포함하는 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 구성원을 지칭하고, 용어 "라비린툴리드"는 라비린툴라세아에(Labyrinthulaceae) 과를 포함하는 라비린툴라레스(Labyrinthulales) 목의 임의의 구성원을 지칭한다. 라비린툴라세아에 과의 구성원은 한때 트라우스토키트리알레스 목의 구성원인 것으로 간주되었지만, 이러한 생물의 분류학의 더욱 최근의 개정에서, 이러한 과는 이제 라비린툴라레스 목의 구성원인 것으로 간주되고, 라비린툴라레스와 트라우스토키트리알레스 양쪽 모두는 라비린툴로마이코타(Labyrinthulomycota) 문의 구성원인 것으로 간주된다. 트라우스토키트리드 및 라비린툴리드의 분류학은 발전으로 인해 빈번하게 개정되었다. 그러나, 현재 일반적으로 분류학 이론가들은 이러한 미생물 군 양쪽 모두를 조류 또는 조류-유사 원생생물과 함께 스트라메노파일(Stramenopile) 계통 내에 놓는다. 트라우스토키트리드 및 라비린툴리드의 현재의 분류학적 배치는 다음과 같이 요약될 수 있다:
계: 스트라메노필라(Stramenopila) (크로미스타(Chromista))
문: 라비린툴로마이코타
강: 라비린툴로마이세테스(Labyrinthulomycetes)
목: 라비린툴라레스
과: 라비린툴라세아에
목: 트라우스토키트리알레스
과: 트라우스토키트리아세아에
그러나, 잔존하는 분류학적 불확실성으로 인해, 본 발명의 목적을 위해 본 발명에서 트라우스토키트리드로서 기술된 균주들이 하기 생물들을 포함하는 것으로 간주하는 것이 최상일 것이다: 목: 트라우스토키트리알레스; 과: 트라우스토키트리아세아에; 속: 트라우스토키트리움 (종: 아루디멘탈레(arudimentale), 아우레움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보섬(globosum), 키네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘탈레(multirudimentale), 파키데르뭄(pachydermum), 프롤리페룸(proliferum), 로세움(roseum), 스트리아툼(striatum)), 울케니아 (종: 아모에보이데아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로푼다(profunda), 라디아타(radiata), 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis)), 스키조키트리움 (종: 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 만그로베이(mangrovei), 미누툼(minutum), 옥토스포룸(octosporum)), 자포노키트리움(Japonochytrium) (종: 마리눔(marinum)), 아플라노키트리움(Aplanochytrium) (종: 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 프로푼다(profunda), 스토키노이(stocchinoi)), 알토르니아(Althornia) (종: 크로우키이(crouchii)), 또는 엘리나(Elina) (종: 마리살바(marisalba), 시노리피카(sinorifica)). 울케니아 속의 최초의 기술은 논문 심사를 거친 저널에서 공개되지 않았고, 따라서 이러한 속 및 이러한 속 내에 배치된 종의 타당성에 관하여 약간의 의문의 여지가 남아 있다는 것을 유념하여야 한다. 본 발명의 목적을 위해, 울케니아 내에 기술된 종은 트라우스토키트리움 속의 구성원인 것으로 간주될 것이다.
본 발명에서 라비린툴리드로서 기술된 균주는 하기 생물들을 포함한다: 목: 라비린툴라레스, 과: 라비린툴라세아에, 속: 라비린툴라 (종: 알게리엔시스(algeriensis), 코에노사이스티스(coenocystis), 카토니이(chattonii), 마크로시스티스(macrocystis), 마크로시스티스 아틀란티카(macrocystis atlantica), 마크로시스티스 마크로시스티스(macrocystis macrocystis), 마리나(marina), 미누타(minuta), 로스코펜시스(roscoffensis), 발카노비이(valkanovii), 비텔리나(vitellina), 비텔리나 파시피카(vitellina pacifica), 비텔리나 비텔리나(vitellina vitellina), 조프피이(zopfii)), 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides) (종: 할리오티디스(haliotidis), 요르켄시스(yorkensis)), 라비린토믹사(Labyrinthomyxa) (종: 마리나(marina)), 디플로프리스(Diplophrys) (종: 아르케리(archeri)), 파이르호소루스(Pyrrhosorus) (종: 마리누스(marinus)), 소로디플로프리스(Sorodiplophrys) (종: 스테르코레아(stercorea)) 또는 클라마이도믹사(Chlamydomyxa) (종: 라비린툴로이데스(labyrinthuloides), 몬타나(montana)) (그러나, 현재 파이르호소루스, 소로디플로프리스 또는 클라마이도믹사의 정확한 분류학적 배치는 합의되지 않음).
본 발명의 PUFA PKS 시스템을 사용하여 현저하게 높은 수율의 다양한 생체활성 분자들을 생산하기 위해, 생물, 바람직하게는 미생물 또는 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어, 식물 세포)을 유전자 변형시켜 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 한 양상에서, 이러한 생물이 PUFA PKS 시스템을 내인성으로 함유하여 발현할 수 있고, 유전자 변형은 내인성 PUFA PKS 시스템의 기능성 도메인들 중 하나 이상의 유전자 변형일 수 있으며, 이에 의해 변형은 PUFA PKS 시스템의 활성에 대한 일부 효과가 있다. 또다른 양상에서, 이러한 생물이 PUFA PKS 시스템을 내인성으로 함유하여 발현할 수 있고, 유전자 변형은 하나 이상의 외인성 핵산 서열 (예를 들어, 재조합 핵산 분자)의 도입일 수 있으며, 이때 외인성 핵산 서열은 동일한 PKS 시스템 또는 제2의 PKS 시스템으로부터의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 도메인 또는 단백질 및/또는 상기 PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질 (예를 들어, 하기 논의되는 포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase))을 코딩한다. 또다른 양상에서는, 생물이 반드시 PUFA PKS 시스템을 내인성으로 (천연적으로) 포함하지는 않지만, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자가 도입되도록 유전자 변형된다. 이러한 양상에서, 생물 내에 PUFA PKS 활성을 도입하거나 이를 증가시킴으로써 PUFA PKS 활성이 영향을 받는다. 이러한 양상들 각각과 관련된 다양한 실시양태들이 하기에 더욱 상세하게 논의될 것이다.
따라서, 본 발명에 따르면, 한 실시양태는 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하는 유전자 변형 미생물에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인은 본원에 기술된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 유전자 변형은 생물 내의 PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. 유전자 변형 미생물은 상기에서 확인된 핵산 서열들 중 임의의 하나 이상, 및/또는 상기에 상세하게 기술된 바와 같은 PUFA PKS ORF 또는 도메인 중 임의의 것의 또다른 상동체들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 유전자 변형 미생물은 유전자 변형 박테리아, 원생생물, 미세조류, 진균, 또는 기타 미생물, 특히 본원에 기술된 트라우스토키트리알레스 목의 속들 중 임의의 것 (예를 들어, 트라우스토키트리드)을 포함할 수 있다. 이러한 유전자 변형 미생물에는 원하는 결과 (즉, 증가된 또는 변형된 PUFA PKS 활성 및/또는 PUFA PKS 시스템 또는 이의 성분을 사용한 원하는 생성물의 생산)가 달성되도록 정상 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 변형 (즉, 돌연변이 또는 변화)된 게놈이 있다. 전통적인 계통 개발 및/또는 분자 유전학 기술을 사용하여 미생물의 유전자 변형을 달성할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press]에, 미생물에 대해 일반적으로 개시되어 있다. 참고문헌 [Sambrook et al., 동일문헌]은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다. 유전자 변형 미생물은 변형이 미생물 내에서 원하는 효과를 제공하도록 하는 방식으로 핵산 분자가 삽입, 결실 또는 변형 (즉, 돌연변이; 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역전에 의한 돌연변이)된 미생물을 포함한다.
본 발명에 따라 변형될 바람직한 미생물 숙주 세포는 임의의 박테리아, 원생생물, 미세조류, 진균, 또는 원생동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 한 양상에서, 유전자 변형시키기에 바람직한 미생물에는 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 미생물 또는 라비린툴라레스 목의 임의의 미생물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 숙주 세포에는 트라우스토키트리움, 울케니아, 스키조키트리움, 자포노키트리움, 아플라노키트리움, 알토르니아, 엘리나, 라비린툴라, 라비린툴로이데스, 라비린토믹사, 디플로프리스, 파이르호소루스, 소로디플로프리스 또는 클라마이도믹사를 포함하지만 이에 한정되지 않는 속으로부터의 미생물이 포함될 수 있다. 유전자 변형을 위한 적절한 숙주 미생물의 또다른 예로는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 또는 기타 효모 예컨대 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)가 포함되는 효모, 또는 기타 진균, 예를 들어, 필라멘트형 진균 예컨대 아스페르길루스(Aspergillus), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 박테리아 세포 또한 숙주로 사용될 수 있다. 여기에는 대장균이 포함되고, 이는 발효 공정에서 유용할 수 있다. 별법적으로, 락토바실루스(Lactobacillus) 종 또는 바실루스(Bacillus) 종과 같은 숙주가 숙주로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 식물이 PUFA를 생산하도록, 적어도 코어 PUFA PKS 효소 복합체를 포함하고, 일부 실시양태에서는 하나 이상의 PUFA PKS 부속 단백질 (예를 들어, PPTase)을 포함하는 유전자 변형 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어, 식물이 본원에 기술된 PUFA PKS 시스템을 발현하도록 유전자 변형된 경우)에 관한 것이다. 바람직하게는, 식물은 오일 종자 식물이고, 이때 오일 종자 또는 오일 종자 내의 오일이 PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 PUFA를 함유한다. 이러한 오일은 PUFA PKS 시스템의 생성물인 하나 이상의 표적 또는 주요 PUFA를 검출가능한 양으로 함유한다. 식물은 PUFA PKS 시스템을 내인성으로 함유하는 것으로 공지되어 있지 않고, 따라서, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 독특한 지방산 생산 능력이 있는 식물을 생산하는 기회를 나타낸다. EPA, DHA, DPA (n-3 및/또는 n-6), ARA, GLA, SDA 등이 포함되는 하나 이상의 PUFA를 동일한 식물 내에서 생산하도록 식물을 유전자 조작하는 것은 본 발명의 특히 바람직한 실시양태이다. 본 발명은 다양한 비율 및 형태의 다수의 "디자이너 오일" 중 임의의 하나를 생성시키는 능력을 제공한다.
식물의 유전자 조작을 위한 방법이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 포함하는 식물 형질전환을 위한 수많은 방법들이 개발되어 있다. 예를 들어, [Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88] 참조. 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용가능하다. 예를 들어, [Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119] 참조.
발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)의 천연 형질전환 시스템을 기초로 한다. 예를 들어, [Horsch et al., Science 227:1229 (1985)] 참조. 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원체성 토양 박테리아이다. 아그로박테리움 투메파시엔스 및 아그로박테리움 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자들을 보유한다. 예를 들어, [Kado, C.I, Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)] 참조. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달을 위한 방법의 설명이 [Gruber et al., 상기 문헌], [Miki et al., 상기 문헌], [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 번호 4,940,838 및 5,464,763이 포함되는 다수의 참조문헌에서 제공된다.
또다른 일반적으로 이용가능한 식물 형질전환 방법은 DNA가 미세발사체(microprojectile)의 표면 상에서 운반되는 미세발사체-매개 형질전환이다. 식물 세포벽 및 세포막을 통과하는데 충분한 속도로 미세발사체를 가속시키는 생체탄도(biolistic) 장치로 발현 벡터가 식물 조직 내로 도입된다. [Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987)], [Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988)], [Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990)], [Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)].
DNA를 식물에 물리적으로 전달하기 위한 또다른 방법은 표적 세포의 초음파처리이다. [Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)]. 별법적으로, 리포솜 또는 스페로플라스트 융합이 발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 사용되었다. [Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985)], [Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)]. CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 사용하여 원형질체 내로 DNA을 직접 섭취시키는 것이 또한 보고되었다. [Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)] 및 [Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)]. 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기천공이 또한 기술되었다. [Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990)]; [D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)] 및 [Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)].
유전자 구축물을 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 세포가 성장되고, 새싹(shoot) 및 뿌리와 같은 분화 조직이 출현하면, 성숙한 식물이 생성된다. 전형적으로, 다수의 식물이 생성된다. 식물을 재생시키기 위한 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있을 것이며, 예를 들어, [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers] 및 [Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 유전자 변형 식물에는 고등 식물, 특히 임의의 소비성 식물 또는 본 발명의 원하는 생체활성 분자를 생산하는데 유용한 식물이 포함되는 임의의 유전자 변형 식물이 포함될 수 있다. 본원에서 사용된 "식물의 일부분"에는 종자 (미성숙형 또는 성숙형), 오일, 화분, 배아, 꽃, 과실, 새싹, 잎, 뿌리, 줄기, 외식편 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 식물의 임의의 부분이 포함된다. 유전자 변형 식물에는 원하는 결과 (예를 들어, PUFA PKS 활성 및 PUFA의 생산)이 달성되도록 천연 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 변형 (즉, 돌연변이 또는 변화)된 게놈이 있다. 전통적인 계통 개발 및/또는 분자 유전학 기술을 사용하여 식물의 유전자 변형을 달성할 수 있다. 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자가 식물의 게놈 내로 혼입된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법이 당업계에 주지되어 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 유전자 변형시키기 위한 바람직한 식물은 인간을 포함하는 동물에 의한 소비에 적절한 식물이다.
본 발명에 따라 유전자 변형시키기 위한 바람직한 식물 (즉, 식물 숙주 세포)에는 쌍자엽 및 단자엽 식물 양쪽 모두가 포함되는 임의의 고등 식물, 특히 소비성 식물 (작물 식물 및 특별하게는 오일용으로 사용되는 식물 포함)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 식물에는, 예를 들어, 카놀라, 대두, 평지씨, 아마인, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배가 포함될 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포를 선택할 수 있다. 본원에서 사용되는 특정 세포, 및 이로부터 성장 또는 유래되는 식물에는 카놀라 (브라시카 라파(Brassica rapa L.); 대두 (글리신 막스(Glycine max)); 평지씨 (브라시카(Brassica) 종); 아마인/아마 (리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum)); 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)); 잇꽃 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)); 해바라기 (헬리안투스 아누스(Helianthus annuus)); 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라질 견과 (베톨레티아 엑셀사(Betholettia excelsa)); 아주까리 종자 (리시누스 콤무니스(Riccinus communis)); 코코넛 (코쿠스 누시페라(Cocus nucifera)); 고수풀 (코리안드룸 사티붐(Coriandrum sativum)); 목화 (고시피움(Gossypium) 종); 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)); 호호바 (시몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)); 머스타드 (브라시카(Brassica) 종 및 시나피스 알바(Sinapis alba)); 야자유 (엘라에이스 구이네이스(Elaeis guineeis)); 올리브 (올레아 에우르파에아(Olea eurpaea)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)); 스쿼시 (쿠쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima)); 보리 (호르데움 불가레(Hordeum vulgare)); 밀 (트라에티쿰 아에스티붐(Traeticum aestivum)); 및 개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae) 종)으로부터 수득가능한 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이와 함께 식물 종 내의 유전자 배경이 변할 수 있음을 유념하여야 한다.
또다른 바람직한 식물에는 약제, 풍미제, 영양보조제, 기능성 식품 성분 또는 화장용 활성 작용제로서 사용되는 화합물을 생산하는 것으로 공지된 식물, 또는 이러한 화합물/작용제를 생산하도록 유전자 조작된 식물이 포함된다.
추가적인 실시양태에서, 식물 세포 배양물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 식물 세포는 분화된 식물로 성장되지 않고, 통상적인 농업 실무를 사용하여 경작되지 않으며, 대신 액체 배지에서 성장 및 유지된다.
본 발명에 따르면, 유전자 변형 미생물 또는 식물에는 재조합 기술을 사용하여 변형된 미생물 또는 식물이 포함된다. 본원에서 사용된, 유전자 발현, 유전자의 기능 또는 유전자 생성물 (즉, 유전자에 의해 코딩되는 단백질)의 기능에서의 감소를 초래하는 유전자 변형은 유전자의 불활성화 (완전 또는 부분적), 결실, 중단, 차단 또는 하향-조절로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능에서의 감소를 초래하는 유전자에서의 유전자 변형은 유전자의 완전한 결실 (즉, 유전자가 존재하지 않고, 따라서 단백질이 존재하지 않음), 단백질의 불완전한 번역 또는 번역되지 않음을 초래하는 유전자에서의 돌연변이 (예를 들어, 단백질이 발현되지 않음), 또는 단백질의 천연 기능을 감소시키거나 폐지하는 유전자에서의 돌연변이 (예를 들어, 효소 활성 또는 작용이 감소되었거나 없는 단백질이 발현됨)의 결과일 수 있다. 유전자 발현 또는 기능에서의 증가를 초래하는 유전자 변형은 유전자의 증폭, 과잉생산, 과발현, 활성화, 강화, 부가, 또는 상향조절로 지칭될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 또는 식물의 유전자 변형은, PKS 시스템이 내인성이고 유전자 변형되었는지, 재조합 핵산 분자의 생물 내로의 도입으로 내인성인지, 또는 완전히 재조합 기술에 의해 제공되는지 여부와 상관없이, 식물에 의해 발현되는 PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. 본 발명에 따르면, "PKS 시스템의 활성에 영향을 미침"은 유전자 변형의 부재 시와 비교하여 생물에 의해 발현되는 PKS 시스템에서의 임의의 검출가능하거나 측정가능한 변화 또는 변형을 야기하는 임의의 유전자 변형을 포함한다. PKS 시스템에서의 검출가능한 변화 또는 변형에는 생물 내로 PKS 시스템 활성을 도입하여, 이제는 생물에 측정가능한/검출가능한 PKS 시스템 활성이 있도록 하는 것 (즉, 생물이 유전자 변형 전에는 PKS 시스템을 함유하지 않았음), 생물에 의해 내인성으로 발현되는 PKS 시스템 이외의 상이한 PKS 시스템으로부터의 기능성 도메인을 생물 내로 도입하여, PKS 시스템 활성을 변형시키는 것 (예를 들어, 하나의 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인이 상이한 생물의 PUFA PKS 시스템 내로 도입됨), PKS 시스템에 의해 생산되는 생체활성 분자의 양에서의 변화 (예를 들어, 시스템이 유전자 변형의 부재 시와 비교하여 더 많은 (증가된 양) 또는 더 적은 (감소된 양) 소정의 생성물을 생산함), PKS 시스템에 의해 생산되는 생체활성 분자의 유형에서의 변화 (예를 들어, 시스템이 새롭거나 상이한 생성물, 또는 시스템에 의해 천연적으로 생산되는 생성물의 변이체를 생산함), 및/또는 PKS 시스템에 의해 생산되는 다중 생체활성 분자들의 비율에서의 변화 (예를 들어, 시스템이 상이한 비율의 하나의 PUFA 대 또다른 PUFA를 생산하거나, 유전자 변형의 부재 시와 비교하여 완전히 상이한 지질 프로파일을 생산하거나, 또는 각종 PUFA를 천연 형상과 비교하여 트리아실글리세롤 내의 상이한 위치에 배치시킴)이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 유전자 변형에는 임의 유형의 유전자 변형이 포함되고, 재조합 기술 및 전통적인 돌연변이유발에 의해 이루어진 변형이 특히 포함된다.
PUFA PKS 시스템 내의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키는 것에 관한 언급은 도메인 또는 단백질 시스템의 증가된 기능성을 초래하는 도메인 또는 단백질을 함유하는 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 생물에서의 임의의 유전자 변형을 지칭하고, 도메인 또는 단백질의 더 높은 활성 (예를 들어, 특이적 활성 또는 생체내 효소 활성), 도메인 또는 단백질 시스템의 감소된 억제 또는 분해, 및 도메인 또는 단백질의 과발현을 포함할 수 있다는 것을 유념하여야 한다. 예를 들어, 유전자 복사본 수가 증가될 수 있거나, 천연 프로모터보다 더 높은 수준의 발현을 제공하는 프로모터의 사용에 의해 발현 수준이 증가될 수 있거나, 또는 유전자 조작 또는 전통적인 돌연변이유발에 의해 유전자가 변경되어, 유전자에 의해 코딩되는 도메인 또는 단백질의 활성이 증가될 수 있다.
유사하게, PUFA PKS 시스템 내의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 감소시키는 것에 관한 언급은 도메인 또는 단백질 시스템의 감소된 기능성을 초래하는 도메인 또는 단백질을 함유하는 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 생물에서의 임의의 유전자 변형을 지칭하고, 도메인 또는 단백질의 감소된 활성, 도메인 또는 단백질의 발현의 감소 또는 제거를 포함한다. 예를 들어, 도메인 또는 단백질의 생산을 차단하거나 감소시킴으로써, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 일부분을 "녹아웃"시킴으로써, 도메인 또는 단백질 활성을 감소시킴으로써, 또는 도메인 또는 단백질의 활성을 억제함으로써 본 발명의 도메인 또는 단백질의 작용이 감소될 수 있다. 도메인 또는 단백질의 생산을 차단하거나 감소시키는 것은 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 성장 배지 내에 유도 화합물이 존재하는 것을 필요로 하는 프로모터의 제어 하에 놓는 것을 포함할 수 있다. 유도인자가 배지로부터 고갈되도록 하는 조건을 확립함으로써, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 (및 이에 따른 단백질 합성의 발현)이 중지될 수 있다. 도메인 또는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시키는 것은 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 4,743,546에 기술된 것과 유사한 절단 기술 접근법을 사용하는 것을 또한 포함할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하기 위해, 관심 단백질을 코딩하는 유전자가 특이적 유전자 서열들 사이에 클로닝되고, 이들은 게놈으로부터의 유전자의 특이적이고 제어된 절단을 허용한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,743,546에서와 같이, 배양물의 배양 온도에서의 변화에 의해, 또는 일부 또다른 물리 또는 영양 신호에 의해 절단이 자극될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 유전자 변형은 내인성으로 (천연적으로) 발현되는 PUFA PKS 시스템의 단백질 또는 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 변형됨으로써, 이러한 시스템을 천연적으로 함유하는 미생물이, 예를 들어, 전통적인 돌연변이유발 및 선별 기술 및/또는 분자 유전학 기술 (유전자 공학 기술 포함)에 의해 유전자 변형되는 것을 포함한다. 유전자 공학 기술은, 예를 들어, 표적화 재조합 벡터를 사용하여 내인성 유전자의 일부분을 결실시키거나 내인성 유전자의 일부분을 이종 서열로 교체하는 것을 포함할 수 있다. 숙주 게놈 내로 도입될 수 있는 이종 서열의 예에는 또다른 PKS 시스템, 예컨대 상이한 PUFA PKS 시스템 (박테리아 또는 비-박테리아), 제I형 PKS 시스템 (반복형 또는 모듈형), 제II형 PKS 시스템, 또는 제III형 PKS 시스템으로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 코딩하는 서열이 포함된다. 숙주의 게놈 내로 도입하기 위한 또다른 이종 서열에는 코어 PKS 시스템의 도메인은 아니지만 내인성 PKS 시스템의 활성에 영향을 미칠 단백질 또는 기능성 도메인을 코딩하는 서열이 포함된다. 예를 들어, 숙주 게놈 내로 포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (하기 논의됨)를 코딩하는 핵산 분자를 도입할 수 있다. 내인성 PUFA PKS 시스템에 이루어질 수 있는 특정 변형들이 하기에 상세하게 논의된다.
본 발명의 이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 유전자 변형에는 (1) 동종 또는 이종 숙주 세포 또는 생물 내로 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 도입하는 것; 및/또는 (2) 숙주 세포 또는 생물 내로 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질 또는 기능성 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 도입하는 것이 포함된다. 숙주에는 (1) PUFA 생산을 위한 어떠한 PKS 시스템도 발현하지 않고, PUFA PKS 시스템의 모든 기능성 도메인이 숙주 세포 내로 도입되는 숙주 세포 또는 생물; (2) PUFA 생산을 위한 PKS 시스템 (내인성 또는 재조합)을 발현하고, 하나 이상의 추가적인 PUFA PKS 도메인 또는 단백질이 세포 또는 생물 내로 도입되는 숙주 세포가 포함된다. 바꿔 말하면, 본 발명은 하나 이상의 본원에 기술된 PUFA PKS 도메인 또는 단백질을 포함하거나, 본원에 기술된 바와 같은 재합성 및/또는 키메라 PUFA PKS 도메인 또는 단백질을 생산하도록 변형된, 임의의 유전자 변형 세포 또는 생물 (예를 들어, 미생물 또는 식물)을 포함하도록 의도된다.
따라서, 본원에서 제공된 지침, 뿐만 아니라 본원에 기술되고 본 발명 이전에 공지되어 있는 PUFA PKS 시스템의 설명을 사용하여, 유전자 혼합 (또는 핵산 분자들의 혼합), 예를 들어, 본원에 상세하게 기술된 바와 같은 키메라 단백질 및/또는 키메라 PUFA PKS 시스템의 생산에 의한 혼합을 PUFA PKS 시스템을 발현하는 생물에 의한 PUFA 생성물의 범위, 이들의 비율, 및 이들의 생산 수준을 확장시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 생산되는 PUFA들의 양을 개선시키고, 하나의 PUFA 대 또다른 PUFA의 비율 (오메가-3 대 오메가-6 PUFA의 비율 포함)을 변화시키고, EPA, DPA (n-3 또는 n-6), DHA, ARA, GLA, SDA 등을 포함하도록 PUFA PKS 생성물의 범위를 확장시킬 뿐만 아니라, 항생제, 기타 제약 화합물 및 기타 원하는 생성물이 포함되는 광범위한 생체활성 분자를 생산하기 위해 본원에서 제공된 기술을 사용할 수 있다. 이러한 개선을 수득하기 위한 방법에는 다양한 생물로부터의 유전자들을 혼합하는 것뿐만 아니라, 본원에 개시된 PUFA PKS 유전자 및 핵산 분자를 유전자 변형시키는 다양한 방법이 또한 포함된다. 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 유전학적 기초 및 도메인 구조에 대한 지식은 신규 유전자 변형 생물을 디자인하기 위한 기초를 제공한다. 예를 들어, PUFA PKS 시스템의 다양한 가능한 조작이 유전자 변형 및 생체활성 분자 생산과 관련하여 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641, 미국 특허 출원 공개 번호 20040235127 및 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995 (상기)에 논의되어 있다. 그러나, 본 발명은 숙주 생물에 의한 PUFA 생산 수준의 조작 및 숙주 생물에 의해 생산되는 PUFA들의 비율의 조작과 관련하여 신규 실시양태들을 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인의 생물학적 활성이 있는 아미노산 서열을 코딩하는 생물 내의 하나 이상의 핵산 서열을 유전자 변형시키고/시키거나 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 발현시킴으로써 미생물 또는 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법이 본 발명에 포함된다. 이러한 서열, 생물을 유전자 변형시키는 방법 및 특정 변형의 다양한 실시양태들이 상기에 상세하게 기술되어 있다. 전형적으로, 이 방법은 특정 생체활성 분자 또는 분자들을 생산하는 특정 유전자 변형 생물을 생산하기 위해 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 돌연변이유발 프로그램을 선별성 스크리링 프로세스와 조합하여 관심 생체활성 분자를 수득할 수 있음이 구현된다. 이는 광범위한 생체활성 화합물을 검색하는 방법들을 포함할 것이다. 이러한 검색은 시스 이중 결합이 있는 분자들의 생산에 한정되지 않을 것이다. 돌연변이유발 방법에는 화학적 돌연변이유발, 유전자 셔플링(shuffling), 특정 효소 도메인을 코딩하는 유전자의 영역 스위칭, 또는 이러한 유전자들의 특정 영역에 제한된 돌연변이유발, 뿐만 아니라 기타 방법이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 고처리량 돌연변이유발 방법이 원하는 생체활성 분자의 생산에 영향을 미치거나 이를 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 일단 효과적인 모델 시스템이 개발되면, 이러한 유전자들을 고처리량 방식으로 변형시킬 수 있다. 이러한 기술의 활용은 2가지 수준에서 구현될 수 있다. 첫번째로, 관심 생성물 (예를 들어, ARA)의 생산을 위한 충분하게 선별성인 스크린이 고안될 수 있다면, 이를 이러한 생성물을 생산하도록 시스템을 변경시키려 시도하는데 사용할 수 있다 (예를 들어, 상기 논의된 것들과 같은 다른 전략들 대신 또는 이와 협력하여). 추가적으로, 상기 개요된 전략으로 관심 생성물을 생산하는 유전자들의 셋트가 초래되었다면, 고처리량 기술을 사용하여 시스템을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 도입된 도메인이 비교적 낮은 온도에서만 기능하였다면, 이러한 제한의 제거를 허용하도록 선별 방법이 고안될 수 있다.
천연 (내인성, 자연적) PUFA PKS 시스템 내로 도입할 수 있는 다수의 유전적 변경 (무작위 또는 지향성)으로 효소 기능의 불활성화가 초래될 것으로 이해된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 생성물을 생산하는 PUFA PKS 시스템의 능력을 차단하지 않는 변형만을 선별하기 위한 시스템을 포함한다. 예를 들어, 대장균의 FabB-균주는 불포화 지방산을 합성할 수 없고, 성장하기 위해 이의 정상적인 불포화 지방산을 대신할 수 있는 지방산을 배지에 보충하는 것을 요구한다 ([Metz et al., 2001, 상기 문헌] 참조). 그러나, 균주가 기능성 PUFA PKS 시스템 (즉, 대장균 숙주에서 PUFA 생성물을 생산하는 것 - [Metz et al., 2001, 상기 문헌], 도 2a 참조)으로 형질전환되면 이러한 요구 (배지의 보충에 대한 요구)가 제거될 수 있다. 형질전환된 FabB-균주는 이제 보충 없는 성장을 위해 기능성 PUFA-PKS 시스템 (불포화 지방산 생산용)을 요구한다. 이러한 예의 주요 요소는 광범위한 불포화 지방산 (심지어 불포화 지방산 치환물, 예컨대 분지쇄 지방산)의 생산이 충분할 것이라는 것이다. 따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 PUFA PKS 유전자들 중 하나 이상에서 다수의 돌연변이를 생성시킨 후, 적합하게 변형된 FabB-균주를 형질전환시키고 (예를 들어, ER 도메인을 함유하는 발현 구축물 내에 돌연변이를 생성시키고, 다른 필수 도메인이 별도의 플라스미드 상에 있거나 염색체 내로 통합된 FabB-계통을 형질전환시킴), 배지의 보충 없이 성장하는 형질전환체 (즉, FabB-결점을 보완할 수 있는 분자를 생산하는 능력을 여전히 보유하는 것)만을 선별할 수 있다. 활성 PKS 시스템의 이러한 선별성 하위셋트에서 생산되는 특정 화합물을 찾기 위한 추가적인 스크린이 개발될 수 있다 (예를 들어, 지방산에 대한 GC의 사용). 관심 생체활성 분자를 위한 다수의 유사한 선별 스크린을 구상할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 유전자 변형 생물에 야생형 생물과 비교하여 내인성 PKS 시스템에 의해 생산되는 하나 이상의 생성물을 변화시키는 변형이 있다. 이러한 변형 생물을 생산하기 위해 사용되는 신규 구축물, 뿐만 아니라 이러한 구축물을 사용하여 생산되는 단백질 및 생물, 및 이러한 변형과 관련되는 방법이 모두 본 발명에 포함된다.
한 바람직한 실시양태에서, 유전자 변형 생물은 스키조키트리움 또는 트라우스토키트리움의 DH2 도메인에 상응하는 β-히드록시 아실-ACP 디하이드레이즈 (DH) 도메인 내에 유전자 변형을 포함하는 PUFA PKS 시스템을 발현하고, 이때 상기 변형은 변형의 부재 시와 비교하여 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 장쇄 지방산들의 비율, 특히 오메가-3 대 오메가-6 장쇄 지방산의 비율을 변경시킨다. 이러한 실시양태의 한 양상에서, 변형은 도메인 모두 또는 일부의 결실, 도메인 모두 또는 일부의 상이한 생물 (예를 들어, 천연적으로는 상이한 비율 및/또는 양의 PUFA들을 생산하는 상이한 생물)로부터의 상동성 도메인 또는 이의 일부로의 치환, 및 도메인의 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 구체적으로, 본원에 설명된 바와 같이, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움 PUFA PKS 구조 (도메인 구성)와 다른 PUFA PKS 시스템 구조의 비교는, 예를 들어, 도메인 순서를 변경시킬 뿐만 아니라, 새로운 도메인을 혼입시켜 신규 최종 생성물을 생성시키거나 최종 생성물의 비율을 변경시키는 자연의 능력을 설명하였다. 또한, 실시예에 기술된 바와 같이, 이제 실험실에서 유전자를 조작하여 새로운 생성물을 생성시킬 수 있다. 본 발명가들은 이러한 능력을 이용하고, 이를 사용하여 신규 PUFA 프로파일 및 생산량이 있는 신규 생물을 생성시키는 능력을 실연하였다. 최종 생성물에 영향을 미치기 위한 지향성 또는 무작위 방식의 PUFA PKS 시스템의 조작이 본원에 기술된다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 제1 PUFA PKS 시스템의 DH (FabA-유사) 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분, 특히 본원에 기술된 DH2 도메인으로 상이한 제2 PUFA PKS 시스템 내의 상동성 DH 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분을 치환하는 것이 제2 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 PUFA들의 비율을 변경시키는데, 특히 제2 PUFA PKS 시스템에 생산되는 오메가-3 대 오메가-6 지방산의 비율을 조작하는데 사용된다. 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 이러한 DH2 도메인을 함유하는 전체 단백질 또는 임의의 이의 생물학적으로 활성인 부분 (예를 들어, 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC)로 제2 PUFA PKS 시스템 내의 상동성 단백질 또는 이의 일부분을 치환함으로써 유사한 결과가 달성될 수 있다. 본원에 기술된 예들에서 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템이 이용되지만, DH2 단백질 또는 DH2-유사 도메인의 변형에 의한 PUFA의 생산을 위한 임의의 PKS 또는 PKS-유사 시스템의 유사한 조작이 본 발명에 포함된다. 이러한 변형은 단독으로 또는 PUFA PKS 시스템에 대한 또다른 변형과 함께 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 키메라 PUFA PKS 시스템 및 이러한 키메라 PUFA PKS 시스템을 발현하는 생물을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 DH2 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분에 상응하는 제1 PUFA PKS 시스템의 도메인 또는 단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 스키조키트리움 또는 트라우스토키트리움으로부터의 것)이 제2의 상이한 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인 또는 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분으로 변형 또는 치환된 제1 PUFA PKS 시스템을 포함한다. "상이한 PUFA PKS 시스템"은 상이한 계통, 종, 속 또는 생물로부터의 PUFA PKS 시스템, 또는 심지어는 천연 또는 야생형 PUFA PKS 시스템의 상동체를 의미한다. 이러한 키메라 단백질을 생산하는 목적은 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 PUFA들의 비율, 특히 오메가-3 대 오메가-6 PUFA의 비율을 변경시키는 것이다. 따라서, 상이한 PUFA PKS 시스템의 선택은 제1 PUFA PKS 시스템에 비해 상이한 또는 원하는 비율의 PUFA를 생산하는 제2의 시스템의 선택을 기초로 하여야 한다.
본 발명의 한 양상에서, 이러한 키메라 PUFA PKS 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 스키조키트리움 OrfA (서열 2) 및 OrfB (서열 4) 단백질, 및 본원에 기술된 바와 같은 트라우스토키트리움 OrfC (서열 62) 단백질을 포함한다. 이러한 키메라 PUFA PKS 시스템을 발현하는 식물 및 식물의 일부분에 더하여, 이러한 키메라 PUFA PKS 시스템을 발현하는 스키조키트리움, 대장균, 및 효모 생물이 실시예에 기술되어 있고 본 발명에 포함된다. 실시예에 예시된 또다른 실시양태에서, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움 OrfA, OrfB 및 OrfC의 모든 조합을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템이 생산된다.
본 발명의 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 스키조키트리움 OrfA (서열 2) 및 OrfB (서열 4) 단백질, 및 키메라 OrfC 단백질 (서열 73에 의해 코딩되는 서열 74로 본원에서 표시됨)을 포함한다. 키메라 OrfC 폴리펩티드는 아미노산 잔기 1493개의 길이이다. 서열 74의 아미노산 516-1041로 정의되는 DH2 영역은 Th.23B OrfC 단백질의 DH2 영역의 아미노산 서열, 즉 서열 62의 아미노산 491-1016으로 구성되고, 이는 서열 66 모두 및 서열 62로부터의 일부 플랭킹 아미노산 서열을 포함한다. 키메라 OrfC 아미노산 서열의 나머지와 관련하여, 서열 74의 잔기 1-515 및 1042-1493은 각각 서열 6의 스키조키트리움 OrfC 잔기 1-515 및 1051-1502와 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 키메라 PUFA PKS 시스템을 포함하는 PUFA PKS 시스템 또는 이의 일부분을 발현하도록 유전자 변형 세포 또는 생물이 변형되었고, 이때 숙주 세포 또는 생물의 바람직한 코돈 사용빈도를 이용하도록 PUFA PKS 시스템 또는 이의 일부분을 코딩하는 핵산 서열(들)이 전체적으로 또는 부분적으로 최적화된다. 이러한 실시양태가 하기에 예시되고, 이러한 변형을 제조함으로써 어떻게 생체활성 분자 (예를 들어, PUFA)의 생산이 증가될 수 있는지를 예증한다. 숙주 생물에서의 생체활성 분자의 생산을 개선하기 위해, 이러한 실시양태가 본원에 기술된 다른 유전자 변형 (예를 들어, 키메라 PUFA PKS 및 단백질 실시양태)와 함께 사용될 수 있다.
이러한 실시양태의 한 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 스키조키트리움 OrfA (서열 2) 및 OrfB (서열 4) 단백질, 및 본원에 기술된 바와 같은 트라우스토키트리움 OrfC (서열 62) 단백질을 포함하고, 이때 서열 62를 코딩하는 핵산 서열이 숙주 코돈 사용빈도에 대해 최적화된다. 본원에서 서열 70으로 표시되는 트라우스토키트리움 OrfC (합성 또는 코돈-최적화 OrfC)를 코딩하는 이러한 핵산 서열과 함께 스키조키트리움에서의 발현에 대해 최적화된 이러한 분자의 예가 실시예에서 기술된다. 또다른 실시양태에서, 트라우스토키트리움 OrfA (서열 39) 및/또는 트라우스토키트리움 OrfB (서열 52)가 스키조키트리움에서의 발현을 위해 스키조키트리움 OrfA, OrfB 및/또는 OrfC 중 임의의 하나 이상과, 및/또는 트라우스토키트리움 OrfC와 조합될 수 있다. 또다시, 이러한 예에서, 트라우스토키트리움 OrfA 및/또는 트라우스토키트리움 OrfB를 코딩하는 핵산 분자가 숙주 코돈 사용빈도에 대해 최적화될 수 있다. 본원에서 서열 71로 표시되는 트라우스토키트리움 OrfA (합성 또는 코돈-최적화 OrfA)를 코딩하는 핵산 서열 및 본원에서 서열 72로 표시되는 트라우스토키트리움 OrfB (합성 또는 코돈-최적화 OrfB)를 코딩하는 핵산 서열과 함께 스키조키트리움에서의 발현에 대해 최적화된 이러한 분자의 예가 실시예에서 기술된다.
이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 키메라 PUFA PKS 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 스키조키트리움 OrfA (서열 2) 및 OrfB (서열 4) 단백질, 및 부분적으로 코돈-최적화된 키메라 OrfC 단백질 (본원에서 서열 75로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩됨)을 포함한다. 서열 75에 의해 코딩되는 단백질은 서열 74로 또한 표시되고, 이는 서열 73과 관련하여 상기에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 경우에, 트라우스토키트리움으로부터 유래된, 서열 66 (DH2 도메인)을 코딩하는 핵산 서열의 일부분이 실시예에 기술된 바와 같이 스키조키트리움에서의 발현에 대해 최적화된다.
대장균, 효모 및 식물에서 사용하기 위한 기타 코돈-최적화 핵산 서열이 상기 및 하기의 실시예에서 기술된다.
또다른 실시양태에서, PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 지방산의 사슬 길이를 조절하는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 생물을 형질감염시킴으로써 유전자 변형 생물이 변형되었다. 예를 들어, PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 지방산의 사슬 길이를 조절하는 단백질은 C20 유닛 및/또는 C22 유닛의 합성을 지시하는 사슬 길이 인자일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 유전자 변형 생물은 에노일-ACP 리덕테이즈 (ER) 도메인에서의 변형을 포함하는 PUFA PKS 시스템을 발현하고, 이때 상기 변형은 변형의 부재 시와 비교하여 상이한 화합물의 생산을 초래한다. 이러한 실시양태의 한 양상에서, 변형은 ER 도메인 모두 또는 일부의 결실, ER 도메인의 상이한 생물로부터의 ER 도메인으로의 치환 및 ER 도메인의 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 유전자 변형 생물은 유전자 변형이 없는 천연 발생 생물과 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로파일을 생산한다.
본 개시내용이 주어지면, 생체활성 분자를 생산하는데 유용한 다수의 또다른 유전자 변형이 당업자에게 명백할 것이고, 다양한 기타 변형이 본원에서 앞서 논의되어 있다. 원하는 생체활성 분자의 생산을 초래하는 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템에 관련된 임의의 유전자 변형이 본 발명에서 구현된다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서, 유전자 변형 생물, 예컨대 유전자 변형 미생물 또는 식물은 원하는 생체활성 분자 (생성물)를 합성하는 능력이 강화되었거나 특정 생성물을 합성하는 능력 (예를 들어, PUFA를 합성하는 능력, 상이한 프로파일의 PUFA들을 합성하는 능력 또는 특정 항생제를 합성하는 능력)이 새롭게 도입된 생물을 포함한다. 본 발명에 따르면, 생성물을 "합성하는 능력 강화"는 이러한 미생물 또는 식물이 동일한 조건 하에 배양 또는 성장된 야생형 미생물 또는 식물과 비교하여 증가된 양의 생성물 (이전에는 없었던 경우에는 생성물의 임의의 생산 포함)을 생산하도록 하는, 생성물의 합성과 관련된 경로에서의 임의의 강화 또는 상향조절을 지칭한다. 이러한 유전자 변형 생물을 생산하는 방법은 상기에 상세하게 기술되어 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 식물이 PUFA를 생산하도록, 적어도 코어 PUFA PKS 효소 복합체를 포함하고, 한 실시양태에서는 하나 이상의 PUFA PKS 부속 단백질 (예를 들어, PPTase)을 포함하는 유전자 변형 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어, 식물이 본원에 기술된 PUFA PKS 시스템 (키메라 PUFA PKS 시스템 포함)을 발현하도록 유전자 변형된 경우)에 관한 것이다. 바람직하게는, 식물은 오일 종자 식물이고, 이때 오일 종자 또는 오일 종자 내의 오일이 PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 PUFA를 함유한다. 이러한 오일은 PUFA PKS 시스템의 생성물인 하나 이상의 표적 또는 주요 PUFA를 검출가능한 양으로 함유한다.
본 발명가들은 스키조키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템 및 PUFA PKS 부속 효소인 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼레이즈 (PPTase)를 코딩하는 유전자들을 발현하도록 유전자 변형된 식물에서의 PUFA의 생산을 실연하였다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20070089199 (상기 문헌) 참조). 이러한 식물에 의해 생산된 오일은 PUFA PKS 유전자들이 유래된 스키조키트리움에 의해 생산되는 우세한 PUFA (주요 PUFA)인 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, n-3)) 및 DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, n-6)) 양쪽 모두를 상당한 양으로 함유한다. 두드러지게, PUFA PKS 경로를 사용하여 PUFA를 생산하는 식물로부터의 오일은 상기 기술된 "표준" 경로에 의해 동일한 PUFA를 생산하도록 유전자 조작된 식물과 지방산 프로파일이 상이하다. 특히, PUFA PKS 경로에 의해 특정 PUFA를 생산하도록 유전자 조작된 식물로부터의 오일에는 표준 PUFA 합성 경로를 사용한 결과로 생산되는 오일 내에 축적되는 다양한 중간 생성물 및 부산물이 실질적으로 없다. 이러한 특성이 하기에 상세하게 논의된다.
더욱 특히, "표준" 경로 (상기 기술됨)에 의해 식물에서 장쇄 PUFA를 생산하기 위한 노력은 이러한 합성 경로에 의해 구술되는 동일한 기본적인 접근법을 취하였다. 이러한 노력들은 다양한 일롱게이즈 및 디새츄레이즈를 코딩하는 유전자들의 도입에 의한 식물의 내인성 지방산의 변형에 의존한다. 전형적으로 식물은 이의 색소체에서 제II형 지방산 신테이즈 (FAS)를 통해 탄소수 18의 지방산 (예를 들어, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산)을 생산한다. 종종, 이러한 지방산이 ACP에 부착되는 동안 단일 이중 결합이 형성된 후, 아실-ACP 티오에스테레이즈의 작용에 의해 올레산 (18:1)이 ACP로부터 절단된다. 이러한 유리 지방산이 색소체로부터 이출되고, 아실-CoA로 전환된다. 18:1이 포스파티딜콜린 (PC)으로 에스테르화될 수 있고, 2개까지의 추가적인 시스 이중 결합이 부가될 수 있다. 새롭게 도입된 일롱게이즈는 아실-CoA 풀 내의 기질을 이용하여, 탄소 2개의 증분으로 탄소를 부가할 수 있다. 새롭게 도입된 디새츄레이즈는, 효소의 공급원에 따라, PC로 에스테르화된 지방산 또는 아실-CoA 풀 내의 것들을 이용할 수 있다. 그러나, 장쇄 PUFA 생산을 위한 이러한 계획의 한가지 결과는 경로 내의 중간체 또는 부산물이 축적된다는 것이고, 종종 이들이, 오히려 표적 장쇄 PUFA보다, 식물 오일 내의 신규 지방산의 대부분을 나타낸다.
예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 표준 또는 전통 경로를 사용하면, 표적 PUFA 생성물 (즉, 표준 경로를 사용함으로써, 생산용으로 표적화하거나, 생산하려고 노력하거나, 생산하려고 시도하는 PUFA 생성물)이 예를 들어 DHA 또는 EPA인 경우 (예를 들어, FAS 시스템의 생성물로부터 DHA 또는 EPA를 생산할 일롱게이즈 및 디새츄레이즈를 사용하여 생산됨), 다양한 중간 생성물 및 부산물이 DHA 또는 EPA에 더하여 생산될 것이고, 이러한 중간체 또는 부산물이 경로에 의해 생산되는 생성물의 대부분을 빈번하게 나타내거나, 또는 적어도 생산 생물의 지질 내에 상당한 양으로 존재한다. 이러한 중간체 및 부산물은 표적 또는 주요 PUFA보다 탄소수가 적고/적거나 이중 결합이 적은 지방산을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 표적 또는 주요 PUFA와 탄소수가 동일할 수 있지만 일반적이지 않은 위치에 이중 결합이 있을 수 있는, 일반적이지 않은 지방산 부산물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표준 경로를 사용하는 EPA의 생산에서 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2004/0172682 참조), 경로의 표적 PUFA는 EPA이지만 (즉, EPA를 생산하도록 FAS 시스템의 생성물 상에 특이적으로 작용하는 일롱게이즈 및 디새츄레이즈의 사용으로 인해), 시스템에 의해 생산되는 오일은 하기를 포함하는 다양한 중간체 및 부산물을 포함한다: 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 각종 기타 중간체 또는 부산물, 예컨대 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산(mead acid) (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14, 17). 시스템의 중간체는 유전자 변형의 표적이 아닌 장쇄 PUFA를 또한 포함한다 (예를 들어, DHA를 생산하기 위한 표준 경로 효소 시스템이 실제로는 DHA 이외의 중간 생성물로서 더 많은 EPA를 생산할 수 있다).
반면에, 본 발명의 PUFA PKS 신테이즈는 FAS 시스템의 지방산 생성물을 이용하지 않는다. 대신, 이는 FAS 및 일롱게이즈가 이용하는 동일한 소형 전구체 분자 (말로닐-CoA)로부터 최종 PUFA 생성물 (주요 PUFA 생성물)을 생산한다. 따라서, 합성 사이클 내의 중간체가 어떠한 현저한 양으로도 방출되지 않고, PUFA 생성물 (본원에서 주요 PUFA 생성물로 또한 지칭됨)이 지질의 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG) 분획으로 효율적으로 전달된다. 실제로, PUFA PKS 시스템은 2개의 표적 또는 주요 PUFA 생성물을 생산할 수 있지만 (예를 들어, 스키조키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템은 주요 생성물로서 DHA 및 DPAn-6 양쪽 모두를 생산한다), DHA를 생산하기 위한 경로에서 DPA가 중간체가 아니다. 오히려, 각각은 동일한 PUFA PKS 시스템의 별도의 생성물이다. 따라서, 본 발명의 PUFA PKS 유전자들은 "표준" PUFA 경로에 의해 생산되는 오일을 오염시키는 중간체 및 부산물이 실질적으로 없는 (하기에 정의됨), PUFA, 특히 LCPUFA를 함유하는 오일을 이종 숙주, 예컨대 식물에서 생산하는 우수한 수단이다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같은 식물의 유전자 조작을 통해, 다중불포화 지방산, 확대하자면 이러한 PUFA를 포함하는 이러한 식물로부터 수득되는 (예를 들어, 이러한 식물의 오일 종자로부터 수득되는) 오일을 생산하는 것이 본 발명의 목표이다. 본 발명에 의해 생산될 수 있는 PUFA의 예로는 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, n-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, n-6 또는 n-3)), 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, n-3))이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. PUFA를 생산하는 본 발명의 폴리케타이드 신테이즈 시스템, 뿐만 아니라 이의 성분들의 사용을 통해 본 발명가들이 개발한 유전자 변형 식물에 의해 본 발명은 하나 이상의 원하는 (표적 또는 주요) PUFA가 풍부해진 상업적으로 가치가 있는 지질의 생산을 허용한다.
본 발명에 따르면, "주요 PUFA", "표적 PUFA", "의도되는 PUFA", 또는 "원하는 PUFA"에 대한 언급은 PUFA(들)를 생산하는데 사용되는 효소 경로의 의도된 또는 표적화된 생성물인 특정 PUFA 또는 PUFA들을 지칭한다. 예를 들어, FAS 시스템의 생성물을 변형시키기 위해 일롱게이즈 및 디새츄레이즈를 사용하는 경우, 함께 사용될 때 표적 또는 원하는 PUFA (예를 들어, DHA 또는 EPA)를 생산할 일롱게이즈와 디새츄레이즈의 특정 조합을 선택할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 표준 경로에 의해 생산된 이러한 표적 또는 원하는 PUFA는 중간체 및 부산물 (실제로는 시스템에 의해 생산된 생성물의 대부분을 나타낼 수 있음)의 형성으로 인해 시스템에 의해 생산된 전체 지방산의 백분율로서의 PUFA의 양의 관점에서 실제로는 "주요" PUFA가 아닐 수 있다. 그러나, 이러한 경우에도, 시스템에서 사용된 일롱게이즈 또는 디새츄레이즈에 의해 생산되는 표적 또는 의도된 PUFA 생성물을 지칭하기 위해 "주요 PUFA"라는 용어를 사용할 수 있다.
본 발명에서 선호되는 바와 같은 PUFA PKS 시스템을 사용하는 경우, 특정 생물로부터의 PUFA PKS 시스템의 선택이 특수화된 표적 또는 주요 PUFA의 생산을 초래하도록, 특정 생물로부터 유래된 소정의 PUFA PKS 시스템이 특정 PUFA(들)를 생산할 것이다. 예를 들어, 스키조키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템의 사용은 표적 또는 주요 PUFA로서 DHA 및 DPAn-6의 생산을 초래할 것이다. 반면에, 다양한 쉐와넬라 종으로부터의 PUFA PKS 시스템의 사용은 표적 또는 주요 PUFA로서 EPA의 생산을 초래할 것이다. 주요 또는 표적 PUFA들의 비율이 특정 PUFA PKS 시스템의 선택 및 이러한 시스템이 자신이 발현되는 특정 조건에 어떻게 응답하는지에 따라 상이할 수 있다는 것을 유념한다. 예를 들어, 트라우스토키트리움 23B (ATCC 번호 20892)으로부터의 PUFA PKS 시스템의 사용 또한 표적 또는 주요 PUF로서 DHA 및 DPAn-6의 생산을 초래할 것이다; 그러나, 트라우스토키트리움 23B의 경우에, DHA 대 DPAn-6의 비율은 약 10:1인 반면 (그리고, 약 8:1 내지 약 40:1 범위일 수 있음), 스키조키트리움에서는 이러한 비율은 전형적으로 약 2.5:1이다. 따라서, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템 또는 단백질 또는 도메인의 사용은, 비록 표적 PUFA는 동일하지만, 스키조키트리움과 비교하여 생물에 의해 생산되는 PUFA들의 비율을 변경시킬 수 있다. 그러나, 상기에 상세하게 기술된 바와 같이, 키메라 단백질 및/또는 키메라 PUFA PKS 시스템 (상기 기술됨)을 생산하기 위해 다양한 단백질 및 도메인들을 또다른 PUFA PKS 시스템 또는 또다른 PKS 시스템 (PUFA 이외의 생체활성 분자를 생산함)으로부터의 단백질 및 도메인과 조합 ("혼합 및 매칭")할 수 있어, 상이한 PUFA 유형, 양 및/또는 한 PUFA 대 또다른 PUFA의 비율을 포함하는 상이한 PUFA 프로파일의 생성이 초래된다.
본 발명의 PUFA PKS 시스템을 사용하는 경우, 생물 예컨대 식물에 의해 생산된 오일에는 표적 또는 주요 PUFA 생성물이 아닌, 그리고 야생형 생물에서 내인성 FAS 시스템에 의해 천연적으로 생산되지 않는 중간체 또는 부산물이 실질적으로 없다 (예를 들어, 야생형 식물이 약간의 더 짧은 사슬 또는 중쇄 PUFA, 예컨대 탄소수 18의 PUFA를 FAS 시스템을 통해 생산하지만, PUFA PKS 시스템으로의 유전자 변형의 결과로 새로운 또는 추가적인 지방산이 식물에서 생산되지 않는다). 바꿔 말하면, 야생형 식물 (유전자 변형되지 않음) 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로 사용되는 어버이 식물로부터의 전체 지방산의 프로파일과 비교하여, 본 발명의 PUFA PKS 시스템 (또는 이의 성분)으로 유전자 변형된 식물에 의해 생산된 전체 지방산의 프로파일 내의 추가적인 지방산의 대부분은 PUFA PKS 시스템의 표적 또는 의도된 PUFA 생성물을 포함한다 (즉, 유전자 변형 식물에 의해 생산된 전체 지방산 내의 추가적인 지방산의 대부분은 표적 PUFA(들)이다).
본 발명에 따르면, PUFA를 생산하는 효소 시스템의 "중간 생성물" 또는 "부산물"에 대한 언급은 효소 시스템의 표적 또는 주요 PUFA(들)의 생산의 결과로서 효소 시스템에 의해 생산되지만, 주요 또는 표적 PUFA(들)이 아닌 임의의 생성물, 특히 지방산 생성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 중간체 및 부산물은 야생형 식물에 의해 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물에 의해 천연적으로 생산되지만, 유전자 변형의 결과로서 야생형 식물에 의해 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물에 의해 생산되는 수준에 비해 더 큰 수준으로 생산되기 때문에 중간체 또는 부산물로 분류되는 비-표적 지방산을 또한 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 중간체 및 부산물은 PUFA 합성을 위한 표준 경로에서 특히 상당하고, PUFA PKS 경로에서는 실질적으로 덜 상당하다. 한 효소 시스템의 주요 또는 표적 PUFA이 주요 또는 표적 생성물이 다른 PUFA인 다른 효소 시스템의 중간체일 수 있음을 유념하고, 이는 PUFA PKS 시스템에서는 중간체의 생산이 실질적으로 방지되기 때문에 PUFA 생산의 표준 경로의 생성물에 경우에 특히 그러하다. 예를 들어, EPA를 생산하기 위해 표준 경로를 사용하는 경우, GLA, DGLA 및 SDA와 같은 지방산이 상당한 양으로 중간 생성물로 생산된다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2004/0172682가 이러한 점을 예시한다). 유사하게, 그리고 또한 미국 특허 출원 공개 2004/0172682에 예시된 바와 같이, DHA를 생산하기 위해 표준 경로를 사용하는 경우, 상기 언급된 지방산들에 더하여, ETA 및 EPA (특히, 상기의 첫번째 예의 표적 PUFA)가 상당한 양으로 생산되고, 실제로는 표적 PUFA 자체보다 전체 지방산 생성물과 비교하여 상당히 더 큰 양으로 존재할 수 있다. 이러한 후자의 점 또한 미국 특허 출원 공개 2004/0172682에서 제시되고, 이때 표준 경로에 의해 DHA를 생산하도록 조작된 식물이 표적화된 DHA보다 전체 지방산의 백분율로서 더 많은 EPA를 생산하였다.
또한, PUFA를 합성하기 위한 시스템의 중간체 또는 부산물이 "실질적으로 없는" 것 또는 중간체 또는 부산물이 실질적인 양으로 존재하지 않는 것은 PUFA 생산을 위한 효소 시스템의 도입 또는 존재의 결과로 유전자 변형 식물 (및/또는 식물의 일부분 및/또는 종자 오일 분획)에서 생산된 임의의 중간체 또는 부산물 지방산 (비-표적 PUFA) (즉, 야생형 식물 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물에 의해 생산되지 않는 것)이 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 10 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 1 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 0.5 중량％ 미만인 양으로 존재한다는 것을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, PUFA를 합성하기 위한 시스템의 중간체 또는 부산물이 "실질적으로 없는" 것 또는 중간체 또는 부산물이 실질적인 양으로 존재하지 않는 것은 PUFA 생산을 위한 효소 시스템의 결과로 유전자 변형 식물 (및/또는 식물의 일부분 및/또는 종자 오일 분획)에서 생산된 임의의 중간체 또는 부산물 지방산 (즉, 야생형 식물에 의해 또는 표적 PUFA의 생산을 위한 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물에 의해 생산되지 않는 것)이 식물에 의해 생산된 전체적인 추가적인 지방산 (추가적인 지방산은 야생형 식물에 의해 또는 표적 PUFA의 생산을 위한 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물에 의해 천연적으로 생산되지 않는 지방산들 또는 이러한 지방산들의 수준으로 정의됨)의 약 10 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 식물에 의해 생산되는 전체적인 추가적인 지방산의 약 1％ 미만인 양으로 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 표준 경로를 통해 PUFA를 생산하도록 유전자 변형된 식물의 지방산 프로파일과 달리, PUFA PKS 시스템으로의 유전자 변형으로부터 초래된 지방산 생성물의 대부분은 표적 또는 의도된 지방산 생성물일 것이다.
PUFA PKS 시스템의 표적 생성물이 본원에 기술된 본 발명의 PUFA PKS 시스템에 생산되는 DHA 또는 DPA (n-6 또는 n-3)와 같은 장쇄 PUFA인 경우, 이러한 PUFA PKS로 유전자 변형된 식물의 전체 지질 내에 실질적인 양으로 존재하지 않는 중간 생성물에는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 각종 기타 중간체 또는 부산물, 예컨대 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 표적 생성물이 특정 PUFA, 예컨대 DHA인 경우, 유전자 변형 식물의 전체 지질 내에 실질적인 양으로 존재하지 않는 중간 생성물 및 부산물에는 상이한 PUFA PKS 시스템의 천연 생성물인 기타 PUFA, 예컨대 이러한 예의 EPA가 포함되는 기타 PUFA가 또한 포함된다. 일부 시스템에서, PUFA PKS 시스템은 하나를 초과하는 PUFA, 예컨대 C22 및 C20 PUFA 양쪽 모두를 제조할 수 있고, PUFA의 이러한 조합이 표적 생성물을 나타낼 수 있는 한편, 또다른 PUFA들은 중간체 또는 부산물을 나타낼 수 있다. 원한다면, GLA, SDA 또는 DGLA를 포함할 수 있는 PUFA를 표적 PUFA로서 생산하기 위해 본 발명의 PUFA PKS 시스템이 또한 사용될 수 있다는 것을 유념한다 (본원에 기술된 PUFA PKS 시스템의 성분들을 사용하여 오일이 생산되는 경우의 실시양태 참조).
본원에 기술된 PUFA PKS 시스템의 유전학적 기초 및 도메인 구조의 지식을 사용하여, 본 발명가들은 이러한 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 구축물을 디자인하여 생산하였고, PUFA PKS 시스템을 발현하는 트랜스제닉 식물을 성공적으로 생산하였다. 이러한 트랜스제닉 식물은 PUFA를 함유하는 오일을 생산하고, 상기 오일에는 표준 PUFA 경로에서 축적되는 중간 생성물이 실질적으로 없다 (미국 특허 출원 공개 번호 20070089199 (상기 문헌) 참조). 또한 본 발명가들은 트랜스제닉 식물의 생산에 앞서 개념 증명 실험으로서 이러한 구축물을 사용하여 대장균에서, 또한 또다른 진핵생물인 효모에서 PUFA를 생산하는 것을 실연하였다 (미국 특허 출원 공개 번호 20070089199 (상기 문헌)). 이러한 예는 DHA 및 DPAn-6을 표적 PUFA로 생산하는 PUFA PKS 시스템으로의 효모 및 식물 양쪽 모두의 형질전환으로 이러한 PUFA 양쪽 모두가 식물의 전체 지방산에서 주요 추가적인 지방산 (즉, 야생형 식물에서 생산되는 지방산을 차감함)으로서, 그리고 효모에서 생산된다는 것을 실연하고, 추가로, 야생형 식물의 지방산에 존재하지 않는 임의의 또다른 지방산은 실제로 검출가능하지 않다는 것을 실연한다. 유전자 변형 식물 및 이의 일부분 및 오일의 구체적인 특징들이 본원의 다른 곳에서 상세하게 기술된다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 유전자 변형 미생물 또는 유전자 변형 식물 (상기에 상세하게 기술됨)을 성장시키거나 배양함으로써 원하는 생체활성 분자 (생성물 또는 화합물로 또한 지칭됨)를 생산하는 방법이다. 이러한 방법은 본원에 앞서 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 유전자 변형이 있는 미생물 또는 식물을 각각 성장 또는 발효 배지에서 배양하거나 적절한 환경, 예컨대 토양에서 성장시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 생체활성 분자를 생산하는 방법은 본원에 기술된 바와 같은 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신테이즈 (PKS) 시스템의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하는 유전자 변형 생물을 생체활성 분자를 생산하는데 효과적인 조건 하에 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 원하는 생체활성 화합물의 생산 방법에서, 생체활성 화합물을 생산하는데 효과적인 조건 하에, 적절한 배지에서 유전자 변형 미생물이 배양 또는 성장된다. 적합한 또는 효과적인 배지는 본 발명의 유전자 변형 미생물이 배양되는 경우 원하는 생성물을 생산할 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 전형적으로 이러한 배지는 동화될 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원을 포함하는 수성 배지이다. 이러한 배지는 적합한 염, 미네랄, 금속 및 기타 영양소를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 통상적인 발효 생물반응기에서 배양될 수 있다. 뱃치(batch), 페드(fed)-뱃치, 세포 리사이클 및 연속 발효를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 발효 공정에 의해 미생물이 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 잠재적인 숙주 미생물에 대한 바람직한 성장 조건은 당업계에 주지되어 있다. 유전자 변형 미생물에 의해 생산된 원하는 생체활성 분자를 통상적인 분리 및 정제 기술을 사용하여 발효 배지로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 발효 배지를 여과 또는 원심분리하여, 미생물, 세포 잔해물 및 기타 입상 물질을 제거할 수 있고, 통상적인 방법, 예를 들어, 이온 교환, 크로마토그래피, 추출, 용매 추출, 막 분리, 전기투석, 역삼투, 증류, 화학적 유도체화 및 결정화에 의해 무세포 상등액으로부터 생성물을 회수할 수 있다. 별법적으로, 원하는 화합물을 생산하는 미생물, 또는 이의 추출물 및 다양한 분획을 생성물로부터 미생물 성분을 제거하지 않고 사용할 수 있다.
본 발명의 원하는 생체활성 화합물의 생산 방법에서, 유전자 변형 식물 또는 식물의 일부분 (식물 세포 포함)이, 적합한 대로, 성장 배지에서 배양되거나 토양과 같은 적절한 배지에서 성장된다. 적합한 또는 효과적인 성장 또는 배양 배지는 상기에 상세하게 논의되어 있다. 고등 식물을 위한 적절한 성장 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지하는 임의의 기타 입상 배지 (예를 들어, 질석, 진주암 등) 또는 수경 배양을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 식물용 성장 배지, 뿐만 아니라 고등 식물의 성장을 최적화하는 적절한 빛, 물 및 영양 보충물을 포함한다. 본 발명의 유전자 변형 식물은 본 발명에 따라 유전자 변형된 PUFA PKS 시스템의 활성을 통해 상당한 양의 원하는 생성물을 생산하도록 조작된다. 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 공정을 통해 화합물이 회수될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 식물을 수확함으로써 화합물이 회수된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 식물 또는 식물의 일부분으로부터 (예를 들어, 오일 종자로부터) 오일을 회수함으로써 식물 또는 식물의 일부분으로부터 PUFA가 회수된다. 이러한 실시양태에서, 식물은 이의 천연 상태로 소비될 수 있거나, 또는 소비가능한 제품으로 추가로 가공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생체활성 분자에는 생물학적 활성이 있고, 본원에 기술된 바와 같은 비-박테리아 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인의 생물학적 활성이 있는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 PKS 시스템에 의해 생산될 수 있는 임의의 분자 (화합물, 생성물 등)가 포함된다. 이러한 생체활성 분자는 다중불포화 지방산 (PUFA), 항-염증성 제형, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파일로리(Heliobactor pylori) 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환 치료용 약물, 항생제, 및 콜레스테롤 저하 제형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 비-박테리아 PUFA PKS 시스템의 한 장점은 3번째 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자, 및 시스 배열의 탄소-탄소 이중 결합을 도입하는 이러한 시스템의 능력이다. 이러한 능력은 다양한 화합물을 생산하는데 이용될 수 있다.
미생물과 관련하여, 바람직하게는, 관심 생체활성 화합물은 미생물의 건조 중량의 약 0.05％ 초과, 바람직하게는 약 0.1％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.25％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.75％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 1％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 2.5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 10％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 15％ 초과, 더욱 더 바람직하게는 약 20％ 초과의 양으로 유전자 변형 미생물에 의해 생산된다. 지질 화합물에 대해, 바람직하게는, 이러한 화합물은 미생물의 건조 중량의 약 5％를 초과하는 양으로 생산된다. 더 적은 양으로 합성되는 화합물 또는 항생체와 같은 기타 생체활성 화합물이 당업자에게 공지된 양으로 생산될 수 있고, 이러한 화합물을 보유하는 균주들은 본원에 기술된 유형의 신규 PKS 시스템을 예상대로 함유하는 것으로 확인된다.
일부 실시양태에서, 특정 생체활성 분자 (화합물)은 세포 내에 축적되기보다는 미생물에 의해 분비된다. 따라서, 이러한 생체활성 분자는 일반적으로 배양 배지로부터 회수되고, 생산된 분자의 농도는 미생물 및 배양물의 크기에 따라 변할 것이며, 건조 세포 중량보다는 g/ℓ로 측정될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 변형 생물 (예를 들어, 미생물 또는 식물)은 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), ALA (C18:3, n-3), 및/또는 SDA (C18:4, n-3)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다중불포화 지방산, 더욱 바람직하게는, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 DTA (C22:4, n-6)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 장쇄 지방산 (LCPUFA)을 생산한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형 생물은 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), 및/또는 DPA (C22:5, n-6 또는 n-3)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다중불포화 지방산을 생산한다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 변형 생물은 하나 이상의 PUFA (표적 PUFA)를 생산하고, 이때 생물 (또는 PUFA가 축적되는 생물의 일부분, 예컨대 생물이 오일 종자 식물인 경우, 성숙된 종자 또는 이러한 종자로부터의 오일)에서의 전체 지방산 프로파일은 검출가능한 양의 이러한 PUFA 또는 PUFA들을 포함한다. 바람직하게는, PUFA는 탄소수 20 이상의 PUFA이고, 3개 이상의 이중 결합, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 이중 결합, 더욱 더 바람직하게는 5개 이상의 이중 결합을 포함한다. 한 실시양태에서, PUFA는 천연적으로는 생물 (예를 들어, 유전자 변형의 부재 하의 야생형 생물, 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 생물)에 의해 검출가능한 또는 상당한 양으로 생산되지 않는 PUFA이다.
바람직하게는, 생물 (또는 PUFA가 축적되는 생물의 일부분) 내의 전체 지방산 프로파일은 전체 지방산의 중량 기준으로 0.1％ 이상의 표적 PUFA(들), 더욱 바람직하게는 약 0.2％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.3％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.4％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.5％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 1％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 2 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 3％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 4％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 5％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 15％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 25％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 30％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 35％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 40％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 45％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 55％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 전체 지방산의 중량 기준으로 75％ 초과의 하나 이상의 다중불포화 지방산 (표적 PUFA), 또는 0.1％ 내지 75％, 또는 75％ 초과 (100％까지 또는 약 100％)의 0.1％ 증분으로의 임의의 백분율의 표적 PUFA(들)를 포함한다. 본원에서 일반적으로 사용되는, PUFA 생산량 백분율에 대한 언급은, 달리 언급되지 않는 한 (예를 들어, 일부 경우에는, 중량 백분율이 효소 복합체, 예컨대 PUFA PKS 시스템에 의해 생산된 전체 지방산에 대한 비율이다), 생물에 의해 생산되는 전체 지방산의 중량을 기준으로 한다. 한 실시양태에서, 식물에 의해 생산되는 전체 지방산은 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 제제의 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의해 결정되는 중량 백분율로 제시된다.
상기 기술된 바와 같이, 상기 기술된 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 생산되는 전체 지방산의 추가적인 특징은 식물에 의해 생산되는 이러한 전체 지방산이 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 표적 PUFA(들) 이외의 임의의 지방산을 약 10 중량％ 미만으로 포함한다 (또는 이러한 양보다 더 많이 함유하지 않는다)는 것이다. 바람직하게는, 표적 PUFA(들) 이외의, 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 임의의 지방산 (예를 들어, 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 또는 효소 복합체로의 식물의 유전자 변형의 결과로서 생산됨)은 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1 중량％ 미만으로 존재한다.
또다른 실시양태에서, 표적 PUFA(들) 이외의, 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 임의의 지방산은 식물에서 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 전체 지방산 (즉, 이러한 측정은 표적 PUFA를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 전체 지방산에 대해 한정됨)의 약 10 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 전체 지방산의 약 1 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 식물에서 표적 PUFA(들)를 생산하는 효소 복합체에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 0.5 중량％ 미만으로 존재한다 (또는 이보다 더 많이 함유하지 않는다).
본 발명의 이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 생산되는 전체 지방산은 야생형 식물 (유전자 변형되지 않음) 내에 또는 지시된 (최초의 또는 순차적) 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물 내에 존재하는 PUFA 또는 표적 PUFA(들) 이외의 탄소수가 18 이상인 PUFA를 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 중량 기준으로 10％ 미만으로 함유한다 (또는 이보다 더 많이 함유하지 않는다). 추가적인 양상에서, 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 생산되는 전체 지방산은 야생형 식물 (유전자 변형되지 않음) 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물 내에 존재하는 PUFA 또는 표적 PUFA(들) 이외의, 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 중량을 기준으로 9％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 8％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 7％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 6％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 5％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 4％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 3％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 2％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA, 또는 1％ 미만의 탄소수가 18 이상인 PUFA를 함유한다.
본 발명의 이러한 실시양태의 또다른 양상에서, 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 생산되는 전체 지방산은 야생형 식물 (유전자 변형되지 않음) 내에 또는 지시된 (최초의 또는 순차적) 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물 내에 존재하는 PUFA 또는 표적 PUFA(들) 이외의 탄소수가 20 이상인 PUFA를 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 중량 기준으로 10％ 미만으로 함유한다 (또는 이보다 더 많이 함유하지 않는다). 추가적인 양상에서, 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 생산되는 전체 지방산은 야생형 식물 (유전자 변형되지 않음) 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용되는 어버이 식물 내에 존재하는 PUFA 또는 표적 PUFA(들) 이외의, 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 중량을 기준으로 9％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 8％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 7％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 6％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 5％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 4％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 3％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 2％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA, 또는 1％ 미만의 탄소수가 20 이상인 PUFA를 함유한다.
한 실시양태에서, 식물 (및/또는 식물의 일부분 또는 종자 오일 분획) 내의 전체 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 각종 기타 지방산, 예컨대 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11, 14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17) 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 지방산을 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 약 10 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
또다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 생산하는 효소 시스템에 의해 생산되는 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 각종 기타 지방산, 예컨대 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)로부터 선택된 지방산을 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 백분율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하고, 더욱 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 각종 기타 지방산, 예컨대 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5, 11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)으로부터 선택된 지방산을 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
또다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 생산하는 효소 시스템에 의해 생산되는 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 모두를 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 백분율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하고, 더욱 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 모두를 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
또다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 생산하는 효소 시스템에 의해 생산되는 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 각각을 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 백분율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하고, 더욱 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 각각을 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
또다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 생산하는 효소 시스템에 의해 생산되는 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 중 임의의 하나 이상을 식물에 의해 생산되는 전체 지방산의 백분율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하고, 더욱 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 탄소수가 18이고 4개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 탄소수가 20이고 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA, 및 탄소수가 22이고 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 PUFA 중 임의의 하나 이상을 약 9％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 8％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 2％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
본 발명의 이러한 실시양태의 한 양상에서, 식물은 2개 이상의 표적 PUFA를생산하고, 식물 또는 PUFA가 축적되는 식물의 일부분 (오일 종자로부터의 오일 포함)에서의 전체 지방산 프로파일은 검출가능한 양의 이러한 PUFA들을 포함한다. 이러한 실시양태에서, PUFA들은 바람직하게는 각각 탄소수 20 이상의 PUFA이고, 3개 이상의 이중 결합, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 이중 결합, 더욱 더 바람직하게는 5개 이상의 이중 결합을 포함한다. 이러한 PUFA들은 가장 바람직하게는 DHA, DPAn-6 및 EPA로부터 선택된다. 한 양상에서, 식물은 DHA 및 DPAn-6를 생산하고, DHA 대 DPAn-6의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1 이상이다 (이들 사이의 임의의 비율 포함). 한 실시양태에서, DHA 대 DPA의 비율은 약 1:1 내지 약 3:1이고, 또다른 실시양태에서는 약 2.5:1이다. 한 실시양태에서, 식물은 DHA 및 EPA를 생산한다.
본 발명은 상기 기술된 식물에 의해 생산된 임의의 종자, 뿐만 아니라 임의의 식물의 일부분, 식물에 의해 생산된 오일 또는 식물에 의해 생산된 종자를 추가로 포함한다. 본 발명은 본원에 기술된 식물, 식물의 일부분, 종자 또는 오일을 사용하여 생산된 임의의 제품을 또한 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 오일을 하나 이상의 지방산을 함유하는 최종생성물에 첨가하는 것을 포함하는, 하나 이상의 지방산을 함유하는 최종생성물을 변형시키는 방법에 관한 것이다..
바람직하게는, 최종생성물은 식품, 식이 보충물, 제약 제형, 인간화된 동물 밀크, 및 유아용 조제식으로 구성된 군으로부터 선택된다. 적절한 제약 제형에는 항염증성 제형, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파일로리 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환 치료용 약물, 항생제, 및 콜레스테롤 저하 제형이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 최종생성물은 만성 염증, 급성 염증, 위장관 장애, 암, 악액질, 심장 재협착, 신경변성 장애, 간의 퇴행성 장애, 혈액 지질 장애, 골다공증, 골관절염, 자가면역 질환, 자간전증, 조산, 연령-관련 황반변증, 폐 장애 및 과산화소체(peroxisome) 장애로 구성된 군으로부터 선택된 용태를 치료하는데 사용된다.
적절한 식품 제품에는 고급 베이커리 제품, 빵 및 롤(roll), 아침식사용 시리얼, 가공 및 비가공 치즈, 양념 (케첩, 마요네즈 등), 유제품 (밀크, 요거트), 푸딩 및 젤라틴 디저트, 탄산 음료, 차, 분말 음료 믹스, 가공된 어류 제품, 과일-기재 음료, 츄잉검, 경질 과자류, 냉동 유제품, 가공된 육류 제품, 견과 및 견과-기재 스프레드, 파스타, 가공된 가금류 제품, 그레이비 및 소스, 감자칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crisp), 초콜렛 및 기타 과자류, 수프 및 수프 믹스, 대두-기재 제품 (밀크, 음료, 크림, 분말크림(whitener)), 식물성 오일-기재 스프레드, 및 식물-기재 음료가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 실시양태는 인간화된 동물 밀크를 생산하는 방법에 관련된다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 밀크-생산 동물의 밀크-생산 세포를 유전자 변형시키는 것을 포함한다.
숙주 세포를 유전자 변형시키고, 유전자 변형된, 밀크를 생산하는 비-인간 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변형시킬 숙주 동물의 예로는 트랜스진 발현 집단의 신속한 확장을 위한 유전자 조작 및 클로닝을 받을 수 있는 소, 양, 돼지, 염소, 야크 등이 포함된다. 동물용으로, PKS-유사 트랜스진이 유전자 조절 영역의 변형을 통해 표적 소기관, 조직 및 체액에서의 발현을 위해 개조될 수 있다. 숙주 동물의 모유에서의 PUFA의 생산이 특히 흥미롭다.
본원에서 인용된 각각의 간행물 또는 참고문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
하기의 예들은 예시의 목적으로 제공되고, 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
하기의 실시예는 스키조키트리움에서 사용하기 위한 합성 Th.23B OrfC 클로닝 벡터의 구축을 기술한다.
스키조키트리움 (예를 들어, ATCC 20888 또는 스키조키트리움 N230D)으로부터의 4개의 대형 유전자 (orfA, orfB, orfC, 및 FAS; 미국 특허 출원 공개 번호 20020194641, 미국 특허 출원 공개 번호 20070089199, 또는 미국 특허 출원 공개 번호 20050191679에 기술됨)에 대한 코돈 사용빈도 데이터가 조합되었다. 스키조키트리움 ATCC 20888이 높은 수준의 지방산을 생산한다면, 이러한 유전자들이 고도로 발현되는 것으로 예상된다. 약 3％ 미만 (소정의 아미노산에 대한 것들 내에서)으로 나타나는 코돈을 제거하였고, 나머지 코돈들의 상대적인 사용빈도를 조정하였다. 표 1은 스키조키트리움 코돈 사용빈도, 조정된 사용빈도, 및 비-합성 Th.23B orfC에 대한 코돈 사용빈도를 나타낸다. DNA2.0 (Menlo Park, CA)를 사용하여 이러한 코돈 사용빈도 데이터를 분석하여, 트라우스토키트리움 23B orfC에 대한 코딩 영역을 디자인하고 합성하였다. 합성 유전자의 후속 조작을 용이하게 할 제한 효소 인식 부위를 코딩하도록 뉴클레오티드들을 코딩 영역의 양쪽 끝부분에 부가하였다. 특정 제한 효소 인식 서열을 제거하거나 부가하기 위해 (서열 62의 코딩된 아미노산을 변화시키지 않으면서) 소수의 코돈이 조정되었다 (한 예에 대해 하기 참조). 생성된 합성 서열이 플라스미드 벡터 내에 DNA2.0에 의해 개발되었고, 도 2b에서 "pThOrfC synth"로 제시된다. 표 1은 합성 코딩 영역의 코돈 사용빈도를 나타낸다.
Figure 112009077242410-pct00003
Figure 112009077242410-pct00004
Figure 112009077242410-pct00005
상기 기술된 바와 같이, 본 발명가들 및 동료들에 의한 기존의 작업 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 실시예 8 참조)에서 (비-합성) Th.23B orfC 코딩 영역이 Th.23B 코딩 영역이 있는 "완벽한 스티치"가 생성되도록 스키조키트리움 orfC 상류와 하류의 비-코딩 영역들 사이에 클로닝된 플라스미드의 생성이 초래되었다. 이러한 프로세스에서의 중간체 플라스미드를 사용하여 합성 Th.23B orfC 코딩 영역을 클로닝할 수 있다 (도 2a 및 2b 참조). 이러한 중간체 구축물들 중 하나를 가장 쉽게 이용하기 위해, "완벽한 스티치" 접합점을 생성시키고 스키조키트리움 orfC 상류/하류 영역 내에 있고 후속 클로닝 반응을 위해 합성 Th.23B orfC 유전자 내로 디자인된 제한 부위를 이용하도록 본 발명가들에 의해 283bp 뉴클레오티드 서열이 디자인되고 DNA2.0에 의해 합성되었다. 이러한 짧은 DNA 서열은 "Th23B synth orfC INT"로 칭해지고, 플라스미드 "pThOrfC 스티치 INT" 내에 함유되었다.
283bp "Th23B synth orfC INT"는 5개의 절편으로 구성된다. 제1 절편은 SpeI 부위에서 스키조키트리움 orfC의 ATG 시작 코돈까지의 (그러나, 이러한 시작 코돈을 포함하지는 않는) 스키조키트리움 orfC 상류 (비-코딩) 영역의 최종 102 bp로 구성된다 (서열 77 참조). 제2 절편은 합성 Th.23B orfC 코딩 영역 (서열 61)의 최초의 9개의 bp로 구성되고, 시작 ATG를 함유하며, 이는 디자인된 SanDI 부위 (GGGTCCC)와 중첩된다. 이러한 절편들은 상류 "완벽한 스티치" 접합점을 생성시킨다. 제3 절편은 스페이서로 기능하는 6bp BamHI 제한 부위 (GGATCC)이다. 제4 절편은 디자인된 ClaI 부위에서 TAA 정지 코돈까지의 Th.23B orfC 코딩 영역 (서열 61)의 최종 45bp로 구성된다. 제5 절편은 "역" BsmI 부위에 대한 스키조키트리움 orfC (비-코딩) 하류 영역 (정지 코돈 불포함)의 최초의 121bp로 구성된다. "전방향" 배향의 "Th23B synth orfC INT" 단편의 마지막 6개의 뉴클레오티드는 5'>GCATTC>3'이다. 역 상보물 5'>GAATGC>3'은 BsmI에 대한 인식 서열이다. 제4 및 제5 절편이 하류 "완벽한 스티치" 접합점을 생성시킨다.
합성 Th.23B orfC 코딩 서열의 "완벽한 스티치" 버젼의 구축에 대한 상세사항이 하기에 제공된다 (도 2a 및 2b를 또한 참조).
단계 1 (도 2a). pThOrfC 스티치 INT로부터의 "Th23B synth orfC INT" 단편을 SpeI 및 BsmI 제한 효소로의 소화로 제거하고, 단편을 아가로스 젤 전기영동 (GeneClean Turbo 키트, QBioGene)에 의해 정제하였다. 유사하게, pBlueScriptII SK(+) 내로 클로닝된 BamHI 인식 부위 스페이서에 의해 분리된 각각 약 2000bp의 스키조키트리움 orfC 상류 및 하류 영역을 함유하는 pREZ22 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995 참조)로부터의 대형 SpeI/BsmI 벡터 단편을 수득하였다. 이러한 2개의 단편을 결찰시키고, 대장균 XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) 내로 형질전환시켰다. 원하는 플라스미드인 "pREZ22 orfC INT"를 함유하는 클론들을 제한 소화 및 부분적인 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 이러한 플라스미드는 합성 orfC 코딩 영역의 5-프라임 및 3-프라임 영역에 각각 완벽하게 스티치된 스키조키트리움 orfC 상류 및 하류 영역을 함유하지만, 코딩 영역의 대부분이 없다.
단계 2 (도 2b). SanDI 및 ClaI 제한 효소로의 소화 및 원하는 DNA 단편의 정제 (상기와 같음)에 의해 합성 Th.23B orfC 코딩 영역의 대부분이 "pThOrfC synth"로부터 수득되었다. 이러한 단편을 pREZ22 orfC INT로부터의 유사하게 수득된 벡터 단편과 결찰시키고, 대장균 내로 클로닝하였다 (상기와 같음). 생성된 플라스미드 "pThOrfC-synPS"는 스키조키트리움 orfC 유전자의 상류 및 하류 영역에 완벽하게 스티치된 전장 합성 Th.23B orfC 코딩 영역을 함유한다. pThOrfC-synPS의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 70으로 표시된다. 서열 70은 서열 62를 코딩한다. pThOrfC-synPS는 본원에서 앞서 기술된 바와 같이 ATCC 접속 번호 PTA-8229로 기탁되었다.
실시예 2
하기의 실시예는 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 구축물의 생성을 기술한다.
스키조키트리움 ATCC20888 OrfC의 DH2 영역 (서열 30)을 PCR-기반 중첩 확장 ("중첩 확장에 의한 스플라이싱(Splicing by Overlap Extension)" 또는 "SOEing" ([Horton, R.M., (1993) In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA. SOEing together tailor-made genes. Methods in molecular Biology Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications Chapter 25 pp 251-266 (B.A. White, Ed.) Humana Press, Totawa, NJ]))과 제한 클로닝의 조합에 의해 특정 5-프라임 및 3 -프라임 교차 지점에서 트라우스토키트리움 23B ATCC 20892으로부터의 것 (서열 66)으로 교체하였다.
더욱 구체적으로, 이러한 실시예에서, 본 발명가들은 아미노산 잔기 1493개 길이의 하이브리드 (키메라) OrfC 폴리펩티드 (본원에서 서열 74로 표시되는 아미노산 서열)를 코딩하는 핵산 분자를 구축하였고, 이때 이러한 하이브리드의 아미노산 516-1041로 정의되는 DH2 영역은 Th.23B OrfC 단백질의 DH2 영역의 아미노산 서열, 즉 서열 66 모두를 포함하는 서열 62의 아미노산 491-1016 (본원에서 트라우스토키트리움 23B의 DH2 도메인으로 정의됨)으로 구성된다. 이러한 하이브리드 OrfC 아미노산 서열의 나머지 부분인 서열 74의 잔기 1-515 및 1042-1493은 각각 서열 6의 스키조키트리움 OrfC 잔기 1-515 및 1051-1502와 동일하다.
이러한 키메라 단백질을 코딩하는 플라스미드의 구축이 도 3a-3c에 도해된다.
단계 1 변형되지 않은 스키조키트리움 orfC 유전자를 주형으로 사용하여 DH2 영역 상류의 스키조키트리움 orfC 리딩 프레임 약 1.5Kb를 증폭시키기 위해 프라이머 prREZ197 (서열 78) 및 prREZ198 (서열 79)을 사용하였다:
prREZ197 CATATGGCGCTCCGTGTCAA
prREZ198 GCCAGGAAGCTTTGACATGGGGTGCCAGGACATCT
프라이머 prREZ197은 시작 ATG 코돈에 NdeI 부위 (밑줄)를 생성시켰다. 역방향 프라이머 prREZ198 (35량체)는 스키조키트리움 OrfC 서열에 대한 20bp의 상동성 (볼드체) 및 Th.23B OrfC 서열에 대한 15bp의 상동성에 의해 생성된 5-프라임 교차 지점을 함유하였다. PCR 조건: 50 ㎕ 반응, 1 ㎕ PfuUltra 중합효소 (Stratagene) 및 1× PfuUltra 완충제, 2％ DMSO, 0.5 μM의 각각의 dNTP, 0.4 μM의 각각의 prRZ197 및 prRZ198, 10 ng의 주형 (클로닝된 스키조키트리움 orfC 코딩 영역), 94℃에서의 1분의 최초의 변성, 94℃에서의 1분 변성, 52℃에서의 1분 어닐링(annealing) 및 72℃에서의 90초 연장 20사이클, 및 최종 연장 10분. QIAquick® 젤 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용한 아가로스 젤 전기영동 후에 PCR 생성물을 정제하였다.
단계 2 Th.23B orfC 유전자를 주형으로 사용하여 Th.23B DH2 영역 (약 1.5Kb)을 증폭시키기 위해 프라이머 prREZ199 (서열 80) 및 prREZ200 (서열 81)을 사용하였다.
prREZ199 TCCTGGCACCCCATGTCAAAGCTTCCTGGCAACCCTA
prREZ200 AGTATACAGAGGTGCTGACA
프라이머 prREZ199 (37량체)는 Th.23B orfC (DH2) 서열에 대한 22bp의 상동성 및 스키조키트리움 orfC 서열에 대한 15bp의 상동성 (볼드체)에 의해 생성된 5-프라임 교차 지점을 함유하였다. 이러한 후자의 15bp는 prREZ198, 및 따라서 단계 1의 PCR 생성물과의 중첩을 또한 제공하였다. 역방향 프라이머 prREZ200은 3-프라임 교차 지점 (밑줄)에서 Th.23B orfC 내에 천연 BstZ17I 부위를 혼입시켰다. 주형으로서의 10 ng의 클로닝된 Th.23B orfC 코딩 영역과 함께 프라이머 prREZ199 및 prREZ200를 사용한 것을 제외하고는 PCR 조건 및 단편 정제는 상기와 같았다.
단계 3. 중첩 연장을 사용하여, 스키조키트리움 orfC 코딩 영역의 5-프라임 끝부분과 Th.23B DH2 영역 간의 전장 융합물을 생성시켰다. 주형으로서의 단계 1 (prREZ197 × prREZ198) 및 단계 2 (prREZ199×prREZ200)의 생성물 및 외부 프라이머 prREZ197 및 prREZ200을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건: 50 ㎕ 반응, 1 ㎕ PfuUltra 중합효소 (Stratagene) 및 1× PfuUltra 완충제, 2％ DMSO, 0.5 μM의 각각의 dNTP, 0.4 μM의 각각의 prRZ197 및 prRZ200, 50 ng의 단계 1 및 2로부터의 각각의 PCR 생성물, 94℃에서의 1분의 최초의 변성, 94℃에서의 1분 변성, 52℃에서의 1분 어닐링 및 72℃에서의 3.5분 연장 20사이클, 및 최종 연장 10분. PCR 생성물을 단계 1에서와 같이 정제하였다.
단계 4 단계 3에서의 PCR 반응의 생성물을 pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen) 내로 클로닝하고, TOP10 대장균 (Invitrogen) 내로 제조업자가 권장하는 조건을 사용하여 형질전환시켜, pREZ171을 생성시켰다. 삽입물 DNA의 서열은 디자인된 대로인 것으로 확증되었다.
단계 5 각각의 벡터 서열 내의 제한 부위를 사용하여, pREZ171 내의 클로닝된 DNA를 XbaI/SpeI 단편으로서 벡터 pBC KS(+) (Stratagene)으로 전달하여 pREZ175를 생성시켰다.
단계 6 플라스미드 pREZ175를 BstZ17I로 소화 (선형화)시킨 후, NdeI로 부분적으로 소화시켰다. 융합된 스키조키트리움 orfC 5-프라임 영역 및 Th.23B DH2 영역을 나타내는 약 6Kb 단편을 pREZ172 NdeI/BstZ17I 벡터 단편 내로 클로닝하여, pREZ177를 생성시켰다. 플라스미드 pREZ172는 시작 ATG 코돈에 NdeI 부위가 혼입되도록 대장균 발현 벡터 pColADuet-1 (Novagen) 내로 클로닝된 전체 스키조키트리움 orfC 코딩 영역을 함유한다. 이는 pREZ101로부터 유래되고 (실시예 5 참조), 3-프라임 교차 부위에 아미노산-중성 BstZ17I 부위를 삽입하기 위해 부위-지정 돌연변이유발 (Quik Change 키트, Stratagene)에 의해 변형되었다. 구체적으로, 아미노산 위치 1051의 TAC 타이로신 코돈이 TAT로 변형되었다.
단계 7 DNA 서열분석에 의해 pREZ177을 분석했을 때, BstZ17I 부위의 단일 염기쌍이 결실되었음이 발견되었다. 구체적으로, 예상된 <GTATAC> 대신 <GTAAC>였다. 이러한 오차를 수정하기 위해, pDS26으로부터의 올바른 BstZ17I 교차 지점을 함유하는 PciI 제한 단편을 사용하여, pREZ177 내의 결함이 있는 PciI 단편을 교체하였다. 플라스미드 pDS26은 또다른 목적을 위해 기존에 생성된 하이브리드 orfC 코딩 영역을 함유한다. 따라서, 생성된 플라스미드 pREZ179는 주로 스키조키트리움으로부터의 것이지만 DH2 영역은 Th.23B로부터의 것으로 정확하게 교체된 전체 orfC 코딩 영역 (본원에서 서열 74로 표시되는 아미노산 서열)을 함유한다. 플라스미드 pREZ179는 추가적으로 대장균에서의 하이브리드 유전자의 기능을 연구하기 위한 독특한 도구를 나타내고, 또다른 생물용 발현 벡터의 개발을 위한 출발점을 제공한다.
하기의 추가적인 단계들 (도 3c 참조)은 pREZ179로부터 스키조키트리움에서의 유전자 교체를 위한 벡터로의 하이브리드 유전자의 전달을 기술한다.
단계 8 (변형되지 않은) 스키조키트리움 orfC 코딩 영역 + 상류 및 하류 플랭킹 서열의 짧은 부분들을 pBR002 (orfC 게놈 영역의 클론)로부터 NheI/BspEI 단편으로서 단리하였다. 그후, 이러한 단편을 NheI/BspEI로 소화된 pREZ31 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 실시예 8에 기술된 pREZ33과 기능적으로 등가)의 벡터 부분 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pDS48은 (변형되지 않은) 스키조키트리움 orfC 코딩 영역 + 동일한 상류 및 하류 서열 (orfC 유전자좌의 유전자 교체를 구동하기 위해 사용됨)을 함유한다.
단계 9 전체적인 교환된 Th.23B DH2 영역을 함유하는 하이브리드 orfC 리딩 프레임의 일부분을 pREZ179로부터 PstI/PflMI 단편으로서 단리하였다. 이러한 단편을 PstI/PflMI로 소화된 pDS48의 벡터 부분 내로 클로닝하여, pDS49가 산출되었다. 결과적으로, 플라스미드 pDS49는 pREZ33 ("완벽한 스티치" 유전자 교체로서의 전장 Th.23B orfC 코딩 영역; 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995, 실시예 8 참조)와 동일한 정황 내의 하이브리드 orfC를 함유한다. pDS49의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 73으로 표시된다. 서열 73은 서열 74를 코딩한다. 플라스미드 pDS49는 본원에서 앞서 상세하게 기술된 바와 같이 ATCC 접속 번호 PTA-8230으로 기탁되었다.
실시예 3
하기의 실시예는 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 스키조키트리움 OrfC를 코딩하는 구축물의 구축을 기술하고, 이때 DH2 도메인은 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화되도록 재합성되었다.
이러한 실시예에서, 본 발명가들은 아미노산 잔기 1493개 길이의 하이브리드 OrfC 폴리펩티드 (서열 74)를 코딩하는 핵산 분자를 구축하였고, 이때 이러한 하이브리드의 아미노산 516-1041로 정의되는 DH2 영역은 Th.23B OrfC 단백질의 DH2 영역의 아미노산 서열, 즉 서열 66 모두를 포함하는 서열 62의 아미노산 491-1016 (본원에서 트라우스토키트리움 23B의 DH2 도메인으로 정의됨)으로 구성된다. 하이브리드 OrfC 아미노산 서열의 나머지 부분인 서열 74의 잔기 1-515 및 1042-1493은 각각 서열 6의 스키조키트리움 OrfC 잔기 1-515 및 1051-1502와 동일하다. 또한, 이러한 구축물에서, 아미노산 516-1041을 코딩하는 DNA 서열은 플라스미드 pThOrfC synth 및 pThOrfC synPS (실시예 1 및 서열 70 참조) 내에 함유되고 스키조키트리움에서의 유전자 발현에 선호되는 코돈을 사용하는 Th.23B의 OrfC에 대한 "합성 유전자 서열"로부터 유래되었다. 구축의 상세사항이 도 4a-4c에서 도해되고, 하기에 기술된다.
T23B OrfC 폴리펩티드의 DH2 영역을 코딩하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오티드 프라이머 dhd59 (5> G CAC CCC ATG AGC AAG CTC CCC GGC AAC >3; 서열 82) 및 dhd60 (
Figure 112009077242410-pct00006
; 서열 83)을 사용하여 pThOrfC synth로부터 PCR에 의해 증폭시켰다 (반응 59/60). "전방향" 또는 센스(sense)-가닥 프라이머 dhd59는 Th.23B OrfC 단백질의 아미노산 잔기 491-501 (WHPMSKLPGNP; 서열 62의 위치 491-501)을 코딩하는 DNA 서열과 중첩된다. "역방향" 또는 안티센스(antisense)-가닥 프라이머 dhd60은 Th.23B OrfC 단백질의 아미노산 잔기 1008-1017 (TYNVSAPLYT; 서열 62의 위치 1008-1017)을 코딩하는 DNA 서열과 중첩된다. 프라이머 dhd60은 pThOrfC synth 서열과의 2개의 미스매치 (상기의 dhd60 서열에서 상자에 담긴 잔기로 표시됨)를 함유한다. 이러한 변화는 후속 클로닝 단계를 용이하게 하기 위해 상기 dhd60 서열에서 이중-밑줄 부분으로 표시되는 BstZ17I 제한 엔도뉴클리에이즈(endonuclease) 부위를 생성시켰고, 또한 하이브리드 단백질의 코딩 서열 내로 2개의 "침묵 돌연변이"를 도입하였다: CTT(L) → CTG(L) 및 TAC(Y) → TAT(Y). 이러한 증폭은 각각 0.5 μM의 dhd59 및 dhd60, 200 μM dNTP, 2 유닛의 PfuUltra™ 고-정확도 DNA 중합효소 (Stratagene, LaJolla, CA) 및 1 ng의 pThOrfC synth DNA를 함유하는 40 ㎕의 1× PfuUltra™ HF 반응 완충제 (Stratagene, LaJolla, CA)의 반응 부피로 수행되었다. 사이클링 파라메터는 하기와 같았다: 1× [94℃에서 1분], 28× [(94℃에서 1분), (60℃에서 0.5분), (72℃에서 1.5분)], 1× [72℃에서 8.5분], 및 4℃에서 유지. Perkin Elmer GeneAmp® PCR System 2400 써모사이클러(thermocycler) (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 반응을 수행하였다.
pREZ179에 의해 코딩되는 하이브리드 OrfC 단백질의 아미노산 잔기 331-522를 코딩하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오티드 프라이머 dhd57 (5> C TGC AGC CAG ATG CTC AAG ATG TAC ATG >3; 서열 84) 및 dhd58 (5> G GAG CTT GCT CAT GGG GTG CCA GGA CAT CTC >3; 서열 85)를 사용하여 pREZ179로부터 PCR에 의해 증폭시켰다 (반응 57/58). "전방향" 또는 센스-가닥 프라이머 dhd57은 pREZ179에 의해 코딩되는 하이브리드 OrfC 단백질의 아미노산 잔기 330-339 (GCSQMLKMYM; 서열 74의 위치 330-339)를 코딩하는 DNA 서열과 중첩된다. "역방향" 또는 안티센스-가닥 프라이머 dhd58은 하이브리드 OrfC 단백질의 아미노산 잔기 513-523 (EMSWHPMSKLP; 서열 74의 위치 513-523)을 코딩하는 DNA 서열과 중첩된다. 전방향 프라이머 dhd57의 5' 끝부분은 pREZ179 내에 함유된 하이브리드 OrfC 코딩 서열 내에 존재하는 PstI 부위와 중첩된다. 이러한 증폭은 각각 0.5 μM의 dhd57 및 dhd58, 200 μM dNTP, 2 유닛의 PfuUltra™ 고-정확도 DNA 중합효소 (Stratagene, LaJolla, CA) 및 1 ng의 pREZ179 DNA를 함유하는 40 ㎕의 1× PfuUltra™ HF 반응 완충제 (Stratagene, LaJolla, CA)의 반응 부피로 수행되었다. 사이클링 파라메터는 하기와 같았다: 1× [94℃에서 1분], 28× [(94℃에서 1분), (60℃에서 0.5분), (72℃에서 1.5분)], 1× [72℃에서 8.5분], 및 4℃에서 유지. Perkin Elmer GeneAmp System 2400 써모사이클러에서 반응을 수행하였다.
4 ㎕의 각각의 57/58 및 59/60 반응물을 1.2％ 아가로스 젤 상에 러닝(running)시켰다. 예상 생성물 크기와 일치하는 DNA 밴드가 각각의 경우에 관찰되었다: 57/58 생성물에 대한 578 bp 및 59/60 생성물에 대한 1578 bp. 이러한 밴드들을 젤로부터 절제하고, QIAquick® 젤 추출 키트 (QIAGEN, Inc. Valencia, CA)를 사용하여 판매자의 프로토콜에 따라 아가로스 슬라이스로부터 DNA를 회수하였다. PCR 생성물이 40 ㎕의 용출 완충제 내에 회수되었다.
역방향 프라이머 dhd58의 5'의 20개의 뉴클레오티드 (상기에서 밑줄그어짐)는 dhd59의 5'의 20개의 뉴클레오티드 (또한 상기에서 밑줄그어짐)의 역방향 상보물을 포함한다. 그 결과, 반응 57/58 생성물의 3' 끝부분과 반응 59/60 생성물의 5' 끝부분 간에 20 bp의 동일한 중첩이 있고, 이러한 중첩은 이러한 두 생성물의 PCR 기술 "중첩 확장에 의한 스플라이싱(Splicing by Overlap Extension)" 또는 "SOEing" ([Horton, R.M., (1993) In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA. SOEing together tailor-made genes. Methods in molecular Biology Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications Chapter 25 pp 251-266 (B. A. White, Ed.) Humana Press, Totawa, NJ])에 의한 후속 PCR 스플라이싱을 허용한다. 그러면, 이러한 스플라이싱된 단편은 이의 끝부분 ((BstZ17I & PstI)에 또는 이의 끝부분 근처 (BsiW I)에 유용한 제한 부위를 함유한다.
PCR 스플라이싱 반응 (반응 57/60)을 하기와 같이 수행하였다. 40 ㎕ 반응 부피의 1× PfuUltra™ HF 반응 완충제는 0.5 μM의 프라이머 dhd57 및 dhd60 각각, 200 μM dNTP, 2 유닛의 PfuUltra™ 고-정확성 DNA 중합효소 (Stratagene, LaJolla, CA) 및 0.8 ㎕의 젤-정제된 PCR 생성물 57/58 및 59/60 각각의 50배 희석물. 어닐링 온도가 66-70℃ 사이에서 1℃ 증분으로 변화되는 일련의 PCR 스플라이싱 반응을 수행하였다. 기타 사이클링 파라메터는 일정하였다: 1× [98℃에서 1분], 33× [(98℃에서 1분), (66-70℃에서 1분), (72℃에서 2.5분)], 1× [72℃에서 7.5분], 및 6℃에서 유지. RoboCycler® 온도 사이클러 (Stratagene, LaJolla, CA)에서 반응을 수행하였다. 이러한 반응들의 분취량을 1％ 아가로스 젤 상에 러닝시켰고, 모든 반응물이 예상 생성물 (2136 bp)과 크기가 일치하는 생성물을 함유하는 것으로 관찰되었지만, 또다른 밴드들이 또한 모든 어닐링 온도에서 관찰되었다. 따라서, 67, 68 및 69℃에서 어닐링된 3개의 반응물을 풀링(pooling)하고, 1％ 아가로스 젤 상에 러닝시키고, 관심이 있는 약 2.1 kb 밴드를 절제하고, DNA 단편을 QIAquick® 젤 추출 키트 (QIAGEN, Inc. Valencia, CA)를 사용하여 판매자의 프로토콜에 따라 회수하였다. 용출된 DNA를 30 ㎕의 용출 완충제 내에 회수하고, Zero Blunt® TOPO® PCR 클로닝 키트 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 사용하여 판매자의 프로토콜에 따라 PCR 단편 클로닝 벡터 pCR®-Blunt II TOPO® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 내로 클로닝하였다. TOPO 클로닝 반응의 생성물을 사용하여, One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 (Invitrogen)을 판매자의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체 8개를 하룻밤 동안 성장시키고, 플라스미드 DNA를 제조하여, 제한 엔도뉴클리에이즈 소화 및 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 8개 중 7개가 클로닝된 2.1 kb PCR 생성물 57/60을 함유하는 것으로 발견되었다. 한 단리물의 클로닝된 PCR 57/60 생성물을 서열분석하였고, 이는 예상 서열과 정확하게 매칭되는 것으로 나타났다. DNA 서열분석은 Applied Biosystems의 자동화 3730 DNA 분석기를 Big Dye Terminator 화학 및 AmpliTaq-FS DNA 중합효소 (Applied Biosystems, Foster City, CA)와 함께 사용하여 서비스별 수가제(fee for service)로 <Biotechnology Resource Center of Cornell University (Ithaca, New York)>에 의해 수행되었다. 서열이 증명된 삽입물을 함유하는 플라스미드를 pDD21로 칭하였고, 하기 기술되는 추가적인 구축 단계들에서 사용하였다.
스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 Th.23B DH2 도메인을 코딩하는 DNA 절편을 pDD21로부터 절제하고, pREZ179 (실시예 2 참조) 내로 이러한 구축물 내에 존재하는 천연 Th.23B DH2 도메인 코딩 서열을 교체하도록 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pDD22는 하와 같이 구축되었다. 정제된 pDD21 DNA를 BsiWI 및 BstZ17I (New England BioLabs, Beverly MA)로 판매자의 프로토콜에 따라 소화시켰다. 이어서 반응물을 QIAquick® 스핀(Spin) 정제 절차 및 QIAquick® PCR 정제 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 판매자의 프로토콜에 따라 사용하는 처리에 적용하였다. 정제된 소화 생성물을 1％ 아가로스 젤 상에 러닝시키고, 1940 bp의 BsiWI-BstZ17I 단편을 절제하고, QIAEX II 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 판매자의 프로토콜에 따라 사용하여 아가로스로부터 용출시켰다. 정제된 pREZ179 DNA를 또한 BsiWI 및 BstZ17I로 소화시키고, 이어서 판매자의 프로토콜에 따라 남극 포스파테이즈(Antarctic Phosphatase) (New England BioLabs, Beverly, MA)로 처리하였다. 포스파테이즈 처리된 소화 생성물을 상기 기술된 바와 같은 QUIquick® 절차를 사용하는 처리에 또한 적용하고, 0.7％ 아가로스 젤 상에 러닝시켰다. 약 6.1 Kb의 BsiWI-BstZ17I 벡터 단편을 젤로부터 절제하고, 상기 기술된 QIAEX II 젤 추출 키트를 사용하여 아가로스로부터 용출시켰다. 이러한 2개의 단편을 T4 라이게이즈(ligase)를 사용하여 1× T4 라이게이즈 반응 완충제에서 결찰시켰다 (양쪽 모두 New England BioLabs (Beverly, MA)). 결찰 생성물을 사용하여, One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 (Invitrogen)을 판매자의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체들 중 3개로부터의 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클리에이즈 소화 및 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였고, 3개 모두 예상 재조합체의 구조를 갖는 것으로 확인되었다. 1개의 플라스미드를 pDD22로 칭하였고, 추후의 구축에서 사용하였다.
스키조키트리움이 선호하는 코돈에 의해 코딩되는 Th.23B DH2 영역을 함유하는 하이브리드 OrfC를 코딩하는 DNA를 스키조키트리움 게놈 내로 도입하는 것을 용이하게 하기 위해, DH2 영역을 코딩하는 서열에 스패닝되는 PstI-PflMI DNA 절편을 pDD22로부터 절제하고, 스키조키트리움 내의 orfC 유전자 유전자좌의 서열에서의 유전자 교체를 위해 디자인된 벡터인 pDS48 (실시예 2 참조) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pDD24 (후속 유전자 교체에서 사용됨)는 하기와 같이 구축되었다. T23B DH2 도메인을 코딩하고 코돈 사용빈도가 최적화된 DNA 절편을 pDD22로부터 절제하고, pDS48 내로 이러한 구축물 내에 존재하는 천연 스키조키트리움 DH2 도메인 코딩 서열을 교체하도록 클로닝하였다. 정제된 pDD22 DNA를 PstI, PflMI 및 ClaI (New England BioLabs, Beverly MA)로 판매자의 프로토콜에 따라 소화시켰다. ClaI로의 소화는 PflMI-PflMI 단편을 절단하였고, 이러한 단편은 그렇지 않으면 관심이 있는 약 3.2 Kb의 PstI-PflMI 단편의 위치에 인접하게 이동하였을 것이다. 이어서 반응물을 QIAquick® 스핀 정제 절차 및 QIAquick® PCR 정제 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 판매자의 프로토콜에 따라 사용하는 처리에 적용하였다. 정제된 소화 생성물을 0.7％ 아가로스 젤 상에 러닝시키고, 관심이 있는 약 3.2 Kb의 PstI-PflMI 단편을 절제하고, QIAEX II 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 판매자의 프로토콜에 따라 사용하여 아가로스로부터 용출시켰다. 정제된 pDS48 DNA를 유사하게 PflMI 및 PstI로 소화시키고, 상기 기술된 바와 같이 QIAquick® 처리에 적용하고, 0.7％ 아가로스 젤 상에 러닝시켰다. 약 8.0 Kb의 PstI-PflMI 벡터 단편을 젤로부터 절제하고, 상기 기술된 바와 같이 QIAEX II 젤 추출 키트를 사용하여 아가로스로부터 용출시켰다. 이러한 2개의 단편을 T4 라이게이즈를 사용하여 1× T4 라이게이즈 반응 완충제에서 결찰시켰다 (양쪽 모두 New England BioLabs (Beverly, MA)). 결찰 생성물을 사용하여, One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 (Invitrogen)을 판매자의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체들을 30℃에서 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지의 액체 배양으로 하룻밤 동안 성장시켰다. 액체 배양물에서의 37℃에서의 이러한 형질전환체들의 증식은 일부 환경 하에서 플라스미드 불안정성을 초래하는 것으로 발견되었다. 생성된 형질전환체들 중 3개로부터의 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클리에이즈 소화 및 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였고, 3개 모두 예상 재조합체의 구조를 갖는 것으로 확인되었다. 1개의 플라스미드를 pDD24로 칭하였고, 추가적인 제한 엔도뉴클리에이즈 분석에 적용하였으며, 스키조키트리움에서의 유전자 교체 실험 (실시예 4 참조)에서 사용하였다. pDD24의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 75로 표시된다. 서열 75는 서열 74를 코딩한다. 플라스미드 pDD24는 본원에서 앞서 기술된 바와 같이 ATCC 접속 번호 PTA-8226으로 기탁되었다.
실시예 4
하기의 실시예는 스키조키트리움에서의 상기 실시예 1-3에서 기술된 다양한 Th. 23B orfC 구축물의 발현, 및 이러한 생물에 의해 생산된 PUFA의 분석을 기술한다.
스키조키트리움에서의 변이체 Th.23B orfC 유전자의 발현
스키조키트리움 orfC 코딩 영역이 정확하게 결실된 스키조키트리움인 스키조키트리움 균주 B32-Z1 (상기 및 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 실시예 8 참조)을 기존에 기술된 기술 (미국 특허 출원 공개 번호 2003/0166207 참조)을 사용하여 입자 포격에 의해 플라스미드 pThOrfC-synPS (전장 합성 Th.23B orfC; 실시예 1 참조), pDS49 (비-합성 Th.23B DH2 영역; 실시예 2 참조), 및 pDD24 (합성 Th.23B DH2 영역; 실시예 3 참조)로 형질전환시켰다. 자가영양성 Zeocin™-감수성 형질전환체들이 수득되었다. 이러한 형질전환체들은 선별된 균주에 대한 PCR 및/또는 서던 블롯(Southern blot)에 의해 확증되는 바와 같이 이중 교차 유전자 교체 이벤트로부터 발생하였다.
간략하게, 입자 포격은 BioRad (Hercules, CA)의 Biolistic® PDS-1000/He 입자 전달 시스템을 사용하였다. 형질전환용 스키조키트리움 균주를 회전 플랫폼 (200 rpm) 상에서 M2B 배지 (적합한 경우 + DHA), 29-30℃에서 OD600 (BioPhotometer, Eppendorf) = 1 내지 2.5까지 성장시켰다. 세포를 원심분리 (3000 rpm, 5분)에 의해 회수하고, 무균성 7.5 g/ℓ Na2SO4에 OD600 = 30으로 재현탁시켰다. 150 ㎕ 부피의 현탁된 세포를 원형 패치 (직경 6cm)로 M2B 한천 (DHA 없음)을 함유하는 페트리 플레이트 상에 도말하였다. PUFA 영양요구체의 성장을 위해, 40％ (w/v) 무작위 메틸화 β-시클로덱스트린 (CTD Inc, High Springs, FL.) 내의 25 mM DHA의 모액으로부터 0.25 mM로 DHA를 M2B에 보충하였다. DHA 영양요구성의 보완을 위한 포격을 수행하기 위해, DHA를 한천 배지로부터 제거하였다. 1100 psi 파열 디스크, 디스크 유지 캡(cap)과 마크로캐리어(macrocarrier) 커버 뚜껑 간의 0.25 인치의 갭, 및 중간 위치의 정지 스크린 지지체를 사용하여 층류 후드에서 포격을 수행하였다. 표적 선반은 L2 (6 cm) 위치에 있다. (예상되는 자가영양성) 콜로니가 발달될 때까지 (3-5일), 포격된 DHA 영양요구성 스키조키트리움 균주를 함유하는 페트리 플레이트를 29-30℃에서 인큐베이션하였다. 무작위로 선별된 콜로니들을 M2B 한천 플레이트에 스트리킹(streaking)하였다. 성장 후, 몇몇개의 잘 단리된 콜로니들을 Zeocin® (50 ㎍/㎖)이 있는 M2B 플레이트 또는 Zeocin®이 없는M2B 플레이트로 옮겼다. Zeocin-감수성 DHA 원시영양체 (유전자 교체 이벤트를 시사함)를 추후의 연구용으로 선별하였다.
지방산 분석을 위한 스키조키트리움의 성장
50 ㎖의 M50-20 배지를 함유하는 삼각 플라스크 (250 ㎖)에 지시된 균주의 냉동바이알(cryovial)의 내용물 (1 ㎖)을 접종하였다. 플라스크를 200 rpm의 회전 진탕기 상에서 72시간 동안 29-30℃에서 인큐베이션하였다. SSFM 배지를 함유하는 유사한 플라스크에 0.5 ㎖의 M50-20 배양물을 접종하고, 상기와 같이 5일 동안 인큐베이션하였다. 브로스(broth)를 동일한 부피의 70％ 이소프로판올로 희석한 후 원심분리 (4000 g, 5분)에 의해 세포를 수확하였다. 생성된 세포 펠렛을 원래의 부피의 35％ 이소프로판올 물에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 세정된 세포 펠렛을 즉시 -70℃에서 냉동한 후, 동결건조시켰다. 산성 메탄올을 사용하여 지방산 메틸 에스테르 (FAME)를 제조하고, 이를 헥산 내로 추출하고, 기체-액체 크로마토그래피에 의해 분석함으로써, 건조된 생물량의 지방산 함량을 결정하였다.
M50-20 Medium
1 ℓ의 M50-20 배지 당 성분은 하기와 같다: 12.5 g NaCl, 2.5 g MgSO4·7H2O, 0.5 g KCl, 0.05 g CaCl2, 20.0 g 글루코스, 20.0 g 글루탐산나트륨, 0.4 g KH2PO4, 1.0 g 효모 추출물, 0.4 g NaHCO3, 5 ㎖ PII 미량 금속 (200× PII 미량 금속 용액은 리터 당 6.0 g Na2EDTA, 0.29 g FeCl3·6H2O, 6.84 g H3BO3, 0.86 g MnCl2·4H2O, 60 ㎎ ZnCl2, 26 ㎎ CoCl2·6H2O, 52 ㎎ NiSO4·6H2O, 2 ㎎ CuSO4·5H2O, 및 5 ㎎ NaMoO4·2H2O를 함유한다 (pH 8.0)), 1 ㎖ PII 비타민 믹스 (1000× PII 비타민 믹스는 리터 당 100 ㎎ 티아민, 0.5 ㎎ 비오틴, 및 0.5 ㎎ 비타민 B12를 함유한다), pH7.0.
SSFM 배지
1 ℓ의 SSFM 배지 당 성분은 하기와 같다: 13.62 g Na2SO4, 0.72 g K2SO4, 0.56 g KCl, 2.27 g MgSO4·7H2O, 0.19 g CaCl2, 0.0565 g KH2PO4, 0.57 g (NH4)2SO4, 0.13 g 글루탐산나트륨, 100 mM MES (4-모르폴린 에탄술폰산) pH 6.0, 50.0 g 글루코스, 0.16 ㎎ 비타민 B12, 9.75 ㎎ 티아민, 3.33 ㎎ 판토텐산칼슘, 10.3 ㎎ FeSO4·7H2O, 3.1 ㎎ MnCl2·4H2O, 1.93 ㎎ ZnSO4·7H2O, 0.04 ㎎ CoCl2·6H2O, 0.04 ㎎ NaMoO4·2H2O, 2.07 ㎎ CuSO4·5H2O, 2.07 ㎎ NiSO4·6H2O, 2.0 ㎎ 시트르산.
M2B 배지
M2B 배지의 성분은 하기와 같다 (리터 당): 글루코스 10 g, (NH4)2SO4 0.8 g, Na2SO4 5.0 g, MgSO4·7H2O 2.0 g, KH2PO4 0.5 g, KCl 0.5 g, CaCl2·2H2O 0.1 g, 비타민 B12 0.05 ㎎, 티아민·HCl 0.2 ㎎, 판토텐산칼슘 0.2 ㎎, FeSO4·7H2O 3.0 ㎎, MnCl2·4H2O 1.0 ㎎, ZnSO4·7H2O 0.8 ㎎, CoCl2·6H2O 0.02 ㎎, Na2MoO4·2H2O 0.01 ㎎, CuSO4·5H2O 0.6 ㎎, NiSO4·6H2O 0.8 ㎎, MES 완충제 0.1 M, pH 6.0 (NaOH로 조정됨).
재조합 스키조키트리움 균주의 PUFA 분석
표 2는 스키조키트리움 ATCC 20888 및 천연 orfC 코딩 영역이 트라우스토키트리움 23B의 orfC 코딩 영역 모두 또는 이의 일부분으로 교체된 유도체 균주 (실시예 1-3에 기술됨)의 전체 지방산, DHA, 및 DPAn-6 함량 (FAME (지방산 메틸 에스테르)로 표현됨)을 나타낸다. 전체 스키조키트리움 ATCC 20888 orfC 코딩 영역의 Th.23B로부터의 것으로의 교체 (균주 B34-1)는 더 높은 DHA/DPAn-6 비율 (Th.23B의 비율에 근접함)을 초래하였지만, 전체 PUFA 함량은 더 낮았다. 단백질 발현이 더 낮은 전체 PUFA 함량의 가능한 원인이라는 것이 강화된 DHA/DPAn-6 비율이 유지되면서 PUFA 생산이 야생형 수준에 비해 증가된 코돈-최적화 (합성) Th.23B orfC 코딩 영역의 사용 (예를 들어, 균주 B67-5; pThOrfC_syn-PS로 형질전환됨)에 의해 실연되었다. 스키조키트리움 DH2 영역만을 트라우스토키트리움의 것으로 치환하는 것이 유사한 패턴을 나타냈다. 코돈-최적화 Th.23B DH2 영역이 있는 균주 (B69-2; pDD24로 형질전환됨)에서 최적화되지 않은 DH2 영역이 있는 균주 (B105-1A1; pDS49로 형질전환됨)보다 더 높은 PUFA가 산출되었다. 그러나, 균주 B105-1A1 (최적화되지 않은 DH2 영역)에서의 DHA/DPA 비율이 두드러지게 높았다.
흥미롭게, 균주 B69-6에서 높은 수준의 DHA 및 비교적 높은 DHA/DPA 비율이 생산되었다. 이러한 균주는 균주 B69-2가 생산된, 플라스미드 pDD24로의 균주 B32-Z1의 동일한 형질전환으로부터 초래되었다. 그러나, 불일치의 정확한 성질은 알려지지 않았지만, 균주 B69-6에는 변형된 orfC 코딩 영역의 올바른 통합/유전자 교체가 없었다 (PCR 분석에 의해 결정했을 때).
이러한 데이터가 주어지면, 최대의 DHA 생산을 달성하기 위해 균주 B69-2를 사용하여, 또는 최고의 DHA/DPA 비율을 원하는 경우에는 균주 B69-6 또는 B105-1A1을 사용하여 생산-규모의 발효를 개발할 수 있다.
Figure 112009077242410-pct00007
실시예 5
하기의 실시예는 다중-플라스미드 시스템에 의한 대장균에서의 DHA 및 DPA의 생산을 기술하고, PUFA PKS 시스템의 DH2 도메인이 시스템에 의한 지방산 생산의 비율을 제어한다는 것을 추가로 예증한다.
본 발명가들은 스키조키트리움으로부터의 OrfA, OrfB*, OrfC 및 노스톡으로부터의 HetI를 발현시키기 위한 T7 유도성 시스템의 사용에 의한 대장균에서의 DHA 및 DPA의 생산을 기존에 실연하였다 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 41면, 실시예 3). 이러한 기존의 예에서, OrfA, OrfB* 및 OrfC는 단일 플라스미드 상에 함유되었다. 유전자 조작에 대한 여지가 더 많은 시스템을 생성시키기 위해, 스키조키트리움으로부터의 개별적인 코딩 영역들을 다중 표적 유전자들의 공동 발현을 위해 디자인된, 양립가능한 발현 플라스미드들의 셋트 상에 클로닝하였다. 표적 유전자들의 발현은 이러한 듀엣(Duet) 시리즈의 플라스미드들 (Novagen) 상의 유도성 T7 프로모터에 의해 유사하게 구동된다. 스키조키트리움 orfA가 pBR115L1으로부터의 NdeI-XbaI 단편으로서 발현 벡터 pETDuet-1 내로 클로닝되어, pREZ91이 생성되었다 (pBR115L1은 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 41면, 실시예 3에서 최종 발현 플라스미드의 생성에서 언급된다). 스키조키트리움 orfB*가 pJK780으로부터의 NdeI-XbaI 단편으로서 발현 벡터 pCDFDuet-1 내로 클로닝되어, pREZ96이 생성되었다 (pJK780은 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 41면, 실시예 3에서 최종 발현 플라스미드의 생성에서 언급된다). 스키조키트리움 orfC가 pJK510으로부터의 NdeI-XbaI 단편으로서 pColADuet-1 내로 클로닝되어, pREZ101이 생성되었다 (pJK510은 미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 41면, 실시예 3에서 최종 발현 플라스미드의 생성에서 언급된다). 포스포판테테인 트랜스퍼레이즈 (PPTase)를 코딩하는 필수 부속 유전자 hetI는 기존에 기술된 pACYC 184-기반 플라스미드 pJK737 상에서 공급되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995의 41면, 실시예 3). 플라스미드 pREZ91, pREZ96, pREZ101 및 pJK737 상에 각각 별도로 함유된 OrfA, OrfB*, OrfC 및 hetI를 유도성 T7 RNA 중합효소를 함유하는 대장균 균주 BLR (DE3) (Novagen) 내로 형질전환시켰다.
이러한 다중-플라스미드 균주를 사용하여 루리아 브로스 (LB: Luria Broth)에서 25℃ 및 30℃ (하기 표 3 참조)에서 성장된 대장균 세포에서 DHA 및 DPA의 생산을 검출하였다. 소정의 균주 내에 각각의 플라스미드를 유지하도록 항생제가 보충된 LB 브로스 내로 단일 콜로니를 접종하고, 원하는 온도 (25℃ 또는 30℃)에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 그후, 이러한 배양물의 300 ㎕ 부피를 사용하여, 적합한 항생제가 있는 30 ㎖ LB의 주요 배양물에 접종하였다. 주요 배양물을 OD600 (BioPhotometer, Eppendorf)이 0.45 내지 0.55 사이일 때까지 지시된 온도에서 성장시켰고, 이러한 시점에 배양물을 IPTG로 1 mM의 최종 농도로 유도하였다. 그후, 배양물을 이러한 발현 조건 하에 24시간 동안 유지시키고 나서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고, FAME 분석용으로 준비시켰다. 30℃에서 생산되는 PUFA의 전형적인 수준 (전체 FAME의 백분율)은 스키조키트리움 orfC를 보유하는 균주에 대해 10％ DHA 및 6％ DPA (16％의 전체 PUFA)였다. 1.7의 DHA/DPA 비율은 스키조키트리움에서 나타난 것과 비슷하였다 (하기 표 3 참조).
별도의 플라스미드들 상에 있는 대장균에서의 DHA 및 DPA 생산에 필요한 스키조키트리움 유전자들의 발현은 PUFA 생합성 유전자들을 더욱 쉽게 연구하고 조작하는 능력을 본 발명가들에게 제공하였다. 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100995의 실시예 8에 기술된 바와 같이, 스키조키트리움에서, orfC를 트라우스토키트리움 23B로부터의 상동성 유전자로 교체하는 것은 DHA 대 DPA 비율에서의 이동과 함께 PUFA 프로파일을 변경시켰다. 상기 기술된 대장균 다중-플라스미드 발현 시스템으로 유사한 실험이 수행되었고, 이때 스키조키트리움 orfC 발현 플라스미드 (pREZ101)가 유사한 트라우스토키트리움 23B orfC 발현 플라스미드 (pREZ142)로 교체되었다.
pREZ142를 생성시키기 위해, pREZ31로부터의 Th.23B orfC 코딩 영역을 NcoI/SalI 단편으로서 듀엣 벡터 pColADuet-1 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pREZ31은 BamHI 제한 부위 (하기에서 밑줄그어짐)가 시작 ATG (하기에서 소문자로 표시됨)의 바로 상류에 조작된, "완벽한 스티치" 유전자 교체 벡터인 pREZ33 (상기 실시예 1 및 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100995의 실시예 8에 기술됨)의 변이체이다. 이러한 조작은 pREZ31 내에 시작 ATG를 함유하는 NcoI 제한 부위 (하기에서 이탤릭체로 표시됨)를 뜻밖에 생성시켰고, 이는 BamHI 부위의 마지막 2개의 염기 및 Th.23B orfC 코딩 영역의 처음 4개의 염기로 구성되었다: GGAT CC atsG (서열 86).
이러한 클로닝에서 사용된 SalI 제한 부위는 스키조키트리움 orfC 하류 영역에 대해 천연이고, TAA 정지 코돈의 약 250bp 하류이다. 스키조키트리움 orfC에 대한 Th.23B orfC 또는 대장균 발현 시스템에서의 이러한 교체로 DHA 대 DPA 비율이 1.5에서 6.8으로 이동하면서 PUFA 프로파일이 변경되었고, 25℃에서 균주가 성장 및 유도되었을 때 DHA + DPA의 전체적인 양이 10％에서 4％로 감소되었다 (하기 표 참조).
DHA 대 DPA의 비율의 제어를 담당하는 유전자의 영역 또는 도메인을 결정하기 위해, 하이브리드 orfC 코딩 영역들이 생성되었다. 발현 플라스미드 pREZ179 내의 하이브리드 orfC는 트라우스토키트리움 23B orfC로부터 유래된 중앙의 DH2 영역을 함유하고, 상류 및 하류에 스키조키트리움 orfC 서열이 플랭킹된다 (실시예 2 참조). pREZ179가 pREZ101 대신 상기 시스템에서 발현되는 경우, 6.5의 DHA 대 DPA 비율이 나타났고, 전체적인 PUFA 양은 25℃에서 발현 및 유도되었을 때 9％였다 (하기 표 참조). 대장균 모델 발현에서의 DHA 대 DPA 비율에서의 이러한 이동 및 수율의 유지는 orfC의 중앙 DH2 영역이 PUFA 생합성에서의 DHA 대 DPA 비율의 대부분 또는 모두를 제어한다는 것을 가리켰다. 그후, 이러한 구축물이 추가적인 플랭킹 DNA로 변형되고, 천연 orfC를 교체하도록 스키조키트리움 내로 형질전환되었을 때, DHA 대 DPA 비율에서의 유사한 이동이 나타났을 뿐만 아니라, 생산이 감소되지 않았다 (실시예 4 참조). 유사하게, 하이브리드 orfC가 효모 시스템에서 발현되었을 때, DHA 대 DPA 비율에서의 이동이 다시 나타났다 (실시예 6 참조).
Figure 112009077242410-pct00008
다중 발현 플라스미드 시스템의 용도
PUFA 생합성에서 DHA 대 DPA 비율을 제어하는 것에서의 orfC, 특히 DH2 영역의 역할을 해명하기 위해 대장균 및 효모 다중-플라스미드 발현 모델 시스템이 사용된 상기 실시예들은 이러한 이종성 시스템들의 유용성을 실연한다. 대장균 및 효모에서 나타난 결과들은 DHA/DPA 비율에 대한 orfC 공급원의 상대적인 효과의 관점에서 스키조키트리움에서 나타난 것에 필적하였다. 유사한 방식으로, PUFA 사슬 길이, 지방산 포화 정도, 및 이중 결합의 위치 결정이 포함되는 PUFA 생합성의 또다른 양상들을 조사하고 조작하기 위해 대장균 및 효모에서의 다중-플라스미드 발현 모델 시스템이 본원에서 기술된다. 이러한 시스템들은 또다른 유형의 지방산 변형 예컨대 히드록실화 및 글리코실화에서 수반되는 유전자들의 용이한 발현을 또한 허용할 것이다. 유사한 방식으로, 단일 생물 (미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100995의 실시예 2에 기술된 쉐와넬라 자포니카 클러스터에 대해 수행된 바와 같이), 또는 하나를 초과하는 생물로부터의 기타 PUFA 생합성 유전자가 연구를 용이하게 하기 위해 이러한 대장균 시스템 내로 클로닝될 수 있다.
실시예 6
하기의 실시예는 스키조키트리움의 PUFA 신테이즈 서브유닛 A, B 및 C 및 노스톡 hetI이 효모에서 발현되는 방법을 기술하고, PUFA PKS 시스템의 DH2 도메인이 시스템에 의한 지방산 생산의 비율을 제어한다는 것을 추가로 예증한다.
파트 A
예비 발현 실험은 스키조키트리움 OrfC 및 Het I이 천연 코딩 영역을 사용하여 효모에서 전장 단백질로서 생산될 수 있음을 가리켰다. 반면에, 스키조키트리움 OrfA 및 OrfB에 대한 천연 코딩 영역의 발현은 검출가능한 양의 예상 단백질의 생산을 초래하지 않았다. 문제는 mRNA의 번역과 관련되는 것으로 보였다. (노던 블롯이 정확한 크기의 mRNA의 존재를 나타냈다.) 따라서, 효모에서의 발현을 개선하기 위한 목적으로 이러한 2개의 코딩 영역의 합성 버젼을 제조하였다. 합성 유전자에 의해 코딩되는 단백질들의 아미노산 서열은 천연 유전자에 의해 코딩되는 것 (즉, 서열 2 및 서열 4)과 동일하다. orfA 및 orfB의 초기의 유전자 디자인 및 완전한 유전자 합성은 Blue Heron Biotechnology, Inc. (Bothell, WA)에 의해 수행되었다. 코돈 최적화는 사카로마이세스 세레비지아에의 코돈 선호도를 고려하였다. 합성 코딩 영역의 완전한 서열 (sOrfA 및 sOrfB로 칭해짐)이 서열 35 (sOrfA) 및 서열 36 (sOrfB)로 열거된다. 각각의 합성 코딩 영역에 하기와 같이 효모 형질전환 벡터에서의 클로닝을 용이하게 하기 위한 DNA가 첨부되었다:
상류 서열 (서열 87)
AAGCTTGTGCAGTCAAGTGCGCAAAACCATG
하류 서열 (서열 88)
TAACCCGGGTCTAGA.
시작 및 정지 코돈 위치에 밑줄이 그어지고, HindIII (상류) 및 XbaI (하류)에 대한 제한 효소 인식 부위가 볼드체로 표시된다.
사카로마이세스 세레비지아에 균주 InvSC1 (MATa his3-Δ1, leu2, trp1-289, ura3-52) (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 이러한 실험에 사용되었다. 공급자의 권고사항대로 균주를 유지시키고 형질전환시켰다. 형질전환체들을 글루코스 고체 배지, 라피노스 브로스(broth) 및 갈락토스 유도 배지 상에서 제조업자의 설명서 (Invitrogen)에 따라 성장시켰다. 모든 효모 배지 성분은 Q-BIOgene (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다.
스키조키트리움 PUFA 신테이즈 유전자 및 hetI을 하기의 형질전환 벡터들 내로 클로닝하였다: pYES-Leu* (sOrfA; 서열 35), pYES3-Tryp (sOrfB; 서열 36), pYES2/CT (OrfC; 서열 5) 및 pYES-His* (hetI; 서열 33). 이러한 벡터들의 생성이 하기에 상세하게 기술된다. 일부 벡터 및 유전자는 특정한 클로닝 및 발현 요구사항에 맞도록 변형되었다 (하기에 상세하게 기술됨). 특정 실험에 따라, 적합한 서열 배지를 사용하였다. 각각의 경우에 GAL1 프로모터 뒤에 유전자들을 클로닝하였고, 세정된 세포를 Invitrogen이 제공한 지침에 따라 갈락토스를 함유하는 배지에 재현탁시킴으로써 발현을 유도하였다. 유도 배지로 옮긴 후에 세포를 30℃에서 성장시키고, 지시된 시간에 수확하였다 (원심분리에 의해). 세포 펠렛을 동결 건조시키고, 산성 메탄올을 사용하여 FAME을 제조하고, 헥산 내로 추출하고, GC에 의해 분석하였다.
sOrfA 발현 구축물: sOrfA를 하기와 같이 구축된 주문제작 벡터 pYES-Leu/CT 내로 클로닝하였다, pYES6/CT 벡터 (Invitrogen)를 블라스티시딘 저항성 유전자를 함유하는 이의 DNA 영역을 leu2 유전자를 함유하는 DNA 절편으로 교체함으로써 변형시켰다 (류신이 없는 배지 상에서의 선별을 위해). pYES6/CT를 BglII 및 NheI으로 소화시키고, 생성된 약 4913 bp 벡터 단편을 젤 정제함으로써 블라스티시딘 유전자를 제거하였다. leu2 유전자를 효모 벡터 pRS425 (ATCC 77106, GenBank # U03452)로부터 수득하였다. 프라이머 PO-Leu5' (서열 89) 및 PO-Leu3' (서열 90)을 pRS425를 주형으로 하여 PCR 반응에서 사용하여, leu2 유전자를 함유하는 약 1812 bp의 DNA 단편 (pRS425의 bp 664 내지 2475)을 생성시켰다.
PO-Leu5' GACTGCTAGCTTAAGCAAGGATTTTCTTAAC
PO-Leu3' GACTGGATCCTCCTGATGCGGTATTTTCTCC
클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 효소 인식 부위가 프라이머 내로 혼입되었다 (5' NheI 및 3' BamHI; 밑줄). PCR 단편을 BamHI 및 NheI으로 소화시키고, pYES6/CT BglII/NheI 소화물로부터 수득된 4913 bp 벡터 단편에 결찰시켜, pYES6-Leu가 형성되었다. 이러한 벡터를 sOrfA의 삽입에 대비하여 HindIII 및 XbaI로 소화시켰다. sOrfA 및 적합한 플랭킹 DNA를 함유하는 Blue Heron으로부터의 플라스미드를 HindIII 및 XbaI로 소화시켰다. 완전한 sOrfA가 있는 8.8 kb 단편을 젤 정제하고, 준비된 pYES6-Leu 벡터와 결찰시켜, pBR882 (pYES6-Leu:sOrfA)가 형성되었다.
sOrfB 발현 구축물: 본 발명가들은 트립토판 선별 마커가 있는 pYES3 효모 발현 벡터 내로 sOrfB를 클로닝하기를 원했다. pYES3 벡터는 제2의 XbaI 제한 부위를 함유하기 때문에 (제2의 부위는 trp1 유전자 내에 있음), 이러한 제한 효소는 sOrfB DNA 단편의 도입에 편리하게 사용될 수 없었다. sOrfB의 하류에 XbaI 부위를 함유하는 영역을 독특한 NotI 부위 (pYES3 내의 유전자 삽입 클로닝 부위로서 또한 이용가능함)가 도입되도록 하기와 같이 변형시켰다. Blue Heron으로부터의 sOrfB 단편을 함유하는 플라스미드를 HindIII 및 XbaI로 소화시키고, 생성된 관심이 있는 6.2 kb 단편을 젤 정제하였다. 이러한 단편을 동일한 효소로 절단된 pYES2/CT (Invitrogen) 내로 결찰시켜, 플라스미드 pBR879가 산출되었다. 독특한 XbaI 부위에서 절단함으로써 이러한 플라스미드를 개방시켰다. 자가 상보적 올리고 링커 5'-CTAGGCGGCCGC-3' (서열 91)을 사용하여, 독특한 NotI 부위를 생성시켰다 (밑줄; 이는 XbaI 부위를 또한 제거한다). 이에 의해 플라스미드 pJK894가 산출되었다. 이러한 구축물을 HindIII 및 NotI으로 소화시키고, 생성된 관심이 있는 6.2 kb 단편을 젤 정제하였다. 이러한 단편을 동일한 효소로 절단된 pYES3/CT (Invitrogen) 내로 결찰시켜, 플라스미드 pJK908 (pYES3:sOrfB)가 산출되었다.
OrfC 발현 구축물: 천연 orf가 기존에 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝되었고, 이러한 벡터가 효모 발현을 위한 유전자의 공급원으로 사용되었다. 박테리아 벡터는 pBluescript II KS (Stratagene)였고, 코딩 영역 + 플랭킹 DNA가 벡터의 EcoRI (5') 및 XbaI (3') 부위 내로 클로닝되었다. 삽입 DNA는 ATG 개시 코돈의 일부로서의 NdeI 제한 부위 및 XbaI 부위 바로 앞의 TAA 정지 코돈을 포함하였다. 박테리아 리보솜 결합 부위 서열이 EcoRI 부위와 개시 코돈을 함유하는 NdeI 부위 사이의 영역에 포함되었다. 효모 벡터에서의 클로닝 전에, 리보솜 결합 부위 DNA가 제거되었고, 효모 시스템에서의 발현에 적합한 DNA로 교체되었다. orfC가 있는 pBluescript 플라스미드를 EcoRI 및 NdeI로 소화시키고, 올리고뉴클레오티드 링커 FL5' (AATTCAA) 및 FL3' (TATTG)에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 (pKCFL로 칭해짐)를 HindIII (KS 폴리링커 내의 EcoRI 부위의 바로 상류) 및 XbaI로 소화시켜, 약 4526 bp의 단편을 유리시켰다. 이러한 단편을 HindIII/XbaI-소화 pYES2/CT에 결찰시켜, pYES2/ORFCwt (pYES2:OrfC)가 생성되었다.
HetI 구축물: PPTase를 코딩하는, 노스톡으로부터의 hetI 유전자를 하기와 같이 구축된 주문제작 벡터 pYES6-His/CT 내로 클로닝하였다. pYES6/CT 벡터 (Invitrogen)를 블라스티시딘 저항성 유전자를 함유하는 이의 DNA 영역을 his3 유전자를 함유하는 DNA 절편으로 교체함으로써 변형시켰다 (히스티딘이 없는 배지 상에서의 선별을 위해). pYES6/CT를 BglII 및 NheI으로 소화시키고, 생성된 약 4913 bp 벡터 단편을 젤 정제함으로써 블라스티시딘 유전자를 제거하였다. his3 유전자를 효모 벡터 pRS423 (ATCC 77104, GenBank # U03454)로부터 프라이머 PO-His5' (서열 92) 및 PO-His3 (서열 93)을 사용하여 증폭시켰다.
PO-His5' GACTACTAGTCTAAGAAACCATTATTATCAT
PO-His3' GACTGGATCCAGCTTTAAATAATCGGTGTCA
이에 의해 his3 유전자를 함유한, pRS423 플라스미드의 약 1251 bp의 영역이 생성되었다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 효소 인식 부위가 프라이머 내로 혼입되었다 (5' SpeI, 및 3' BamHI; 밑줄). PCR 단편을 SpeI 및 BamHI으로 소화시키고, pYES6/CT로부터 수득된 약 4913 bp의 벡터 단편에 결찰시켜, pYES6-His가 형성되었다. 이러한 벡터를 hetI 유전자의 삽입에 대비하여 BamHI 및 XbaI로 소화시켰다.
대장균에서의 PUFA 생산을 위해 기존에 hetI 유전자가 클로닝되어 스키조키트리움 PUFA 신테이즈 유전자와 함께 사용되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 20040235127, 실시예 2). 상기 출원에 지시된 바와 같이, 오픈 리딩 프레임 내에 메티오닌 코돈이 존재하지 않지만, 여러 잠재적인 별법적인 시작 코돈들 (TTG 및 ATT)이 5' 말단 근처에 있다 ([Black and Wolk, 1994, JBC 176, 2282-2292]). PCR을 사용하여 노스톡 게놈 DNA로부터 Orf를 증폭시켰다. 가장 5' 쪽의 TTG 코돈의 첫번째 T가 A로 교체되어 메티오닌 코돈 (ATG)이 생성되도록 5' 프라이머가 디자인되었다. 3' 프라이머는 TGA 정지 코돈을 포함하였다. 증폭된 영역은 GenBank # L22883으로 기탁된 노스톡 뉴클레오티드 서열의 bp 3994에서 bp 3282까지 걸쳐졌다 (뉴클레오티드 3994는 ATG 코돈을 형성하도록 변경된 TTG 코돈의 두번째 T이다). 이러한 증폭된 hetI Orf를 대장균에서의 발현을 위한 플랭킹 조절 요소들과 함께 pACYC184 벡터 내에 클로닝하였다. hetI Orf의 이러한 클론을 주형 DNA로 사용하여, pYES6-His 내로의 클로닝에 대비하여 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 HetI 5' (서열 94) 및 HetI 3' (서열 95)를 사용하여 hetI Orf를 함유하는 740 bp 단편을 생성시켰다.
HetI 5' GACTGGATCCGCCACCATGTTGCAGCATACTTGGCTACCAAAACCC
HetI 3' GACTTCTAGA TCAATAATGCCAGAATTTTGGCTGC
클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 효소 인식 부위가 프라이머 내로 혼입되었다 (5' BamHI, 및 3' XbaI; 밑줄). ATG 메티오닌 시작 코돈 (5' 프라이머) 및 TGA 정지 코돈 (3' 프라이머에서 역 TCA 3문자로 표시됨)이 볼드체로 표시된다. PCR 생성물을 BamHI 및 XbaI로 소화시키고, 이전에 제조된 pYES6-His 벡터 내로 결찰시켜, pYES-His/Het/CT (pYES6-His:HetI)가 형성되었다.
효모에서의 PYES6-Leu:s0rfA, PYES3:s0rfB, PYES2:OrfC 및 pYES6-His:HetI의 발현의 결과
도 5는 스키조키트리움 PUFA 신테이즈 시스템 (sOrfA, sOrfB, OrfC 및 hetI)을 발현하는 효모 세포들로부터 유래된 FAME의 GC 프로파일과 대조군 세포 (sOrfA 유전자가 없음)로부터 수득된 것의 비교를 나타내고, 이러한 효모 균주들은 각각 본원에서 균주 BRY 4.5 및 BRY 3.3로 표시된다. 약 20시간의 유도 후 세포를 수집하였다. 2개의 신규 FAME 피크가 완전한 PUFA 신테이즈 시스템을 발현하는 균주의 프로파일에서 나타났음을 볼 수 있다. 이러한 2개의 피크는 인증된 표준물과의 용출 시간의 비교 및 이어지는 MS 분석에 의해 DPAn-6 및 DHA로 확인되었다. 스키조키트리움 PUFA 신테이즈의 본 발명가들의 특성화로부터 예상된 바와 같이, DHA 및 DPAn-6 이외에, 어떠한 다른 신규 피크도 프로파일에서 명백하지 않다. 도 6은 PUFA FAME을 함유하는, 도 5의 GC 크로마토그램의 영역을 나타낸다. 대조군 세포 및 PUFA 신테이즈를 발현하는 세포 양쪽 모두 DHA FAME 근처에서 용출되는 피크를 함유한다. 이는 C26:0 FAME으로 확인되었고 (질량 스펙트럼 분석에 의해), 스핑고지질로부터 유래되었을 것이다. 이는 DHA 피크에 인접하여 용출되지만, DHA의 정량을 방해하지 않도록 해상도가 충분하다. DPAn-6 피크는 FAME 프로파일에서 다른 내인성 효모 지질로부터 잘 분리된다. 균주 BRY 4.5의 이러한 특정한 예에서, 스키조키트리움 PUFA 신테이즈 시스템을 발현하는 세포에서 2.4％ DHA 및 2.0％ DPAn-6가 축적되었다 (전체 FAME의 백분율; 하기 표 4 참조). DHA와 DPAn-6의 합계는 세포 내의 측정된 지방산의 4.4％이다. 세포에서 관찰된 DHA 대 DPAn-6의 비율은 약 1.2:1이었다.
효모에서의 스키조키트리움 PUFA 신테이즈의 발현을 나타내는 상기에 제시된 결과들은 기존의 출원에서 제안된 경로들의 확증, 뿐만 아니라 효모에서, 그리고 또한 식물에서 예상될 수 있는 지방산 프로파일에 대한 변경의 관점에서의 예측을 제공한다.
파트 B
트라우스토키트리움 23B의 orfC 상동체로부터 유래된 DH2 영역을 함유하는 OrfC를 코딩하는 하이브리드 유전자와 조합된 효모에서의 스키조키트리움의 PUFA 신테이즈 OrfA, OrfB 및 노스톡 Het I의 발현.
효모에서의 하이브리드 스키조키트리움/Th.23B OrfC 유전자의 발현: 본 출원의 다른 섹션에 기술된 바와 같이, 본 발명가들은 PUFA 신테이즈의 n-3 대 n-6 PUFA 생성물의 비율의 주요 결정인자가 OrfC 단백질 내에, 더욱 구체적으로는 이러한 단백질의 DH2 영역 내에 있다는 것을 발견하였다. 스키조키트리움-유래 PUFA 신테이즈 유전자들과 조합된 Th.23B로부터 유래된 OrfC 상동체를 사용한 대장균 및 스키조키트리움 양쪽 모두에서의 유전자 교체 실험으로 이러한 혼합 시스템에 의해 생산되는 DHA 대 DPAn-6 비율의 변경이 초래되었다. 대장균에서는, PUFA 신테이즈의 생성물이, 아마도 숙주 생물의 지질 합성 효소가 효소의 주요 생성물의 축적에 대해 영향을 미치지 않으면서, 유리 지방산으로 축적된다. 스키조키트리움에서는, PUFA 생성물이 에스테르화 지질로 축적되지만, DHA 및 DPAn-6 양쪽 모두가 변형되지 않은 숙주의 지질 분획의 주요 성분이기 때문에 내인성 지질 합성 효소가 이들을 쉽게 조절할 수 있을 것이다. 효모에서의 혼합형 PUFA 신테이즈 시스템의 발현은 이종성 진핵생물 숙주 (예를 들어, 식물)에 대한 모델을 제공할 것이다.
예상 단백질이 검출될 수 없었기 때문에, 비-합성 또는 완전 합성 Th.23B orfC 유전자를 효모에서 발현시키려는 시도는 성공적이지 않았다. 반면에, 하이브리드 orfC 구축물의 발현 (하기에 기술됨)은 활성 단백질의 생산을 초래하였다.
pYES2 내의 하이브리드 스키조키트리움 / Th.23B OrfC: 천연 스키조키트리움 orfC를 함유하는 플라스미드인 pYES2:OrfC (상기 기술됨)을 BsiWI 및 PmlI로 소화시켜, DH2 영역을 코딩하는 DNA 섹션 및 일부 플랭킹 DNA를 제거하였다. 제거된 영역은 스키조키트리움 orfC 서열 (서열 5)의 약 1179 bp (BsiWI 부위)에서 약 3256 bp (PmlI 부위)까지였다. 생성된 8.4 kb 단편 (벡터, 뿐만 아니라 orfC의 5' 및 3' 부분 함유)을 젤 정제하였다. 하이브리드 스키조키트리움/Th.23B orfC를 함유하는 앞서 기술된 플라스미드 (실시예 2 참조) (pREZ179 = pColA DUET-Schizo. orfC-Th.23B DH2 하이브리드)를 BsiWI 및 PmlI로 소화시키고, Th.23B DH2 영역 및 플랭킹된 스키조키트리움 DNA를 함유하는 2 kb 단편을 젤 정제하였다. 2개의 정제된 단편을 함께 결찰시켜, pYES2: OrfC-23BDH2가 형성되었다.
유사한 전략을 사용하여 pYES2: OrfC-s23BDH2가 생성되었다. 이러한 경우에, 합성 Th.23B DH2 영역에 대한 공급원으로 사용된 플라스미드 (pDD22; 실시예 3 참조)는 스키조키트리움의 선호도에 더욱 가깝게 매칭되도록 코돈이 변형된 합성 코딩 영역으로부터 Th.23B DH2 도메인을 코딩하는 DNA가 유래된 하이브리드 orfC였다 (실시예 3 참조).
효모에서의 pYES6-Leu:sOrfA, pYES3:sOrfB, pYES6-His:HetI 및 PYES2:OrfC-23BDH2 또는 pYES2:OrfC-s23BDH2의 발현의 결과: 표 4는 스키조키트리움 서브유닛 A 및 B 및 노스톡 HetI와 함께 하이브리드 OrfC를 발현하는 효모에서 생산된 PUFA를 나타낸다. 상기 파트 A에서 관찰된 바와 같이, 이러한 효모 샘플에서만 검출된 신규 피크는 DHA 및 DPAn-6이었다. 성장 조건 및 샘플 제조는 상기 기술된 바와 같았다. 관련된 PUFA 데이터만이 제시된다 (면적％로 제공되는 FAME으로서). BRY 4.21로 표지된 샘플은 천연 Th.23B DH2 영역이 있는 하이브리드 orfC를 함유하는 한편, BRY 4.23으로 표지된 샘플은 합성 유전자로부터 유래된 Th.23B DH2 영역이 있는 하이브리드 orfC를 함유한다. 2개의 샘플 (a 및 b, 독립적인 단리물들로부터의 것)을 BRY 4.21 균주에 대해 테스트한 한편, BRY 4.23 균주는 1개의 단리물을 테스트하였다. 스키조키트리움 orfC를 발현하는 세포에 비해, 어느 한쪽 형태의 하이브리드 orfC를 발현하는 세포들은 DHA/DPAn-6 비율이 더 높았다 (천연 Th.23B DH2가 있는 것들은 평균 약 2.6, 합성 Th.23B DH2가 있는 샘플은 약 2.9의 값). 효모에서의 하이브리드 orfC 유전자의 발현은 천연 스키조키트리움 orfC 유전자를 발현하는 효모에 비해 DHA 대 DPAn-6 비율에서의 증가를 명백하게 초래하였다. Th.23B 세포 또는 하이브리드 orfC를 발현하는 스키조키트리움에서의 DHA/DPAn-6 비율이 더 높다 (약 8-10)는 사실은 다른 인자들이 DPAn-6에 비해 DHA의 축적을 향하는 편향에 기여하고 있다는 것을 가리킨다. 효모에서 비율이 증가하였다는 관찰은 이러한 구축물이 PUFA 신테이즈 시스템을 이종성 진핵생물 숙주 (예를 들어, 효모 또는 식물)에서 발현시키기 위한 유용한 모델이라는 것을 가리킨다.
Figure 112009077242410-pct00009
실시예 7
하기의 실시예는 실시예 4에서 기술된 다양한 유전자 변형 스키조키트리움 균주를 사용하는 발효 규모 실험에서의 PUFA의 생산을 실연한다.
실험 1
2ℓ 발효기를 전형적인 발효 조건 하에 사용하여, 야생형 스키조키트리움 (ATCC 20888)의 2개의 배양물 및 트랜스제닉 스키조키트리움 (천연 스키조키트리움 orfC 코딩 영역 대신 코돈-최적화 (합성) Th.23B orfC 코딩 영역이 있는 B67-5; 실시예 4 참조)의 2개의 배양물을 배양하여, 지방산 프로파일을 비교하였다. 각각의 균주를 탄소, 질소, 인, 염, 미량 금속 및 비타민을 함유하는 배지에서 발효시켰다. 각각의 발효기에 전형적인 종자 배양물을 접종한 후, 80시간 동안 배양하고, 배양 동안 탄소 공급원 및 질소 공급원 양쪽 모두를 공급하였다. 질소 공급원은 성장 단계 동안만 공급 및 소비되는 한편, 탄소 공급원은 발효 전반에 걸쳐 공급 및 소비되었다. 80시간 후, 각각의 발효기로부터의 샘플을 원심분리하고, 동결건조시키고, 지방산 함량에 대해 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
전형적인 발효 조건:
온도: 28- 30 ℃
pH: 5.0 - 7.5
진탕: 100 - 300 cps
기류: 0.25 - 2.0 vvm
글루코스: 5 - 35 g/ℓ (농도)
접종물: 7.5％ - 15％
결과가 하기 표 5에서 제시된다:
Figure 112009077242410-pct00010
표 5에 나타난 바와 같이, 천연 스키조키트리움 코딩 영역 대신 합성 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 영역을 함유하는 균주 B67-5은 야생형 스키조키트리움 균주보다 더 많은 DHA를 생산하였고 DHA 대 DPAn-6 비율이 더 컸다.
실험 2
10ℓ 발효기를 전형적인 발효 조건 하에 사용하여, 야생형 스키조키트리움 (ATCC 20888)의 1개의 배양물 및 트랜스제닉 스키조키트리움 (천연 스키조키트리움 DH2 영역 대신 코돈-최적화되지 않은 (트라우스토키트리움 천연의) Th.23B DH2 영역을 함유하는 B105-1A1; 실시예 4 참조)의 1개의 배양물을 배양하여, 지방산 프로파일을 비교하였다. 각각의 균주를 탄소, 질소, 인, 염, 미량 금속 및 비타민을 함유하는 배지에서 발효시켰다. 각각의 발효기에 전형적인 종자 배양물을 접종한 후, 72시간 동안 배양하고, 배양 동안 탄소 공급원 및 질소 공급원 양쪽 모두를 공급하였다. 질소 공급원은 성장 단계 동안만 공급 및 소비되는 한편, 탄소 공급원은 발효 전반에 걸쳐 공급 및 소비되었다. 72시간 후, 각각의 발효기로부터의 샘플을 원심분리하고, 동결건조시키고, 지방산 함량에 대해 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
전형적인 발효 조건:
온도: 28 - 30 ℃
pH: 5.0 - 7.5
진탕: 100 - 300 cps
기류: 0.25 - 2.0 vvm
글루코스: 5 - 35 g/ℓ (농도)
접종물: 7.5％ - 15％
결과가 하기 표 6에서 제시된다:
Figure 112009077242410-pct00011
표 6은 스키조키트리움 DH2 영역 대신 트라우스토키트리움 23B DH2 영역을 함유하는 균주가 DHA/DPAn-6 비율이 더 높다는 것을 나타내어, 본원에 기술된 키메라 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해 달성된 개선된 DHA 비율을 또다시 예증한다.
실시예 8
이러한 실시예는 스키조키트리움에서 발현되는 코돈-최적화 합성 Th.23B orfA, orf B, 및 orfC 코딩 영역의 모든 조합의 구축 및 평가를 기술한다.
스키조키트리움 orfC 코딩 영역의 Th.23B의 코돈-최적화된 합성 orfC 코딩 영역으로의 정확한 교체를 위한 방법의 상세한 설명이 상기에서 제공되었다 (실시예 1 및 4). 당업자는 이러한 기술이 대부분의 관심 유전자에 일반적으로 적용될 수 있음을 인지한다. 당업자는 이러한 유전자 디자인 및 교체가 이러한 방법들 또는 기타 방법들에 대한 전적인 변동에 의해 달성될 수 있다는 것을 추가로 인지한다. 예를 들어, 다중 유전자/코딩 영역들이 동시에 결실될 수 있고, 동시에 교체될 수 있다. 스키조키트리움에서, orfA 및 ofB 유전자는 유전자간 영역 (서열 76 포함)에 의해 분리되어 게놈에서 서로 인접하여 발견된다 ("연관"됨). (유전자간 영역과 함께) 이러한 2개의 코딩 영역이 orfC에 대해 기존에 기술된 것과 유사한 방법에 의해 동시에 결실될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 번호 20050100995). 그후, 상기 실시예 1 및 4에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여, 코돈-최적화 합성 Th.23B orfA 및 orfB 코딩 영역 (전체적인 스키조키트리움 유전자간 영역 포함)의 스키조키트리움 orfA/orfB 유전자좌 내로의 "완벽한 스티치" 교체를 동시에 생성시킬 수 있다. B80-1 및 B80-20 (표 7)과 같은 균주가 이러한 방식으로 생성되었다.
또다른 예에서, "2-단계" 방법에 의해 코딩 영역 결실이 생성될 수 있고, 이때 처음에는, 표시된 결실 구조물 + 제2의 선별가능 마커를 보유하는 플라스미드가 단일 교차 이벤트에 의해 온전히 그대로 표적 유전자좌 내로 재조합된다. 그후, 제2의 선별가능 마커가 손실되고 결실 구조물이 원래의 유전자 구조 대신에 유지되도록 결실 구조물의 반대쪽 측면 상의 부위에서의 단일 교차 이벤트에 의해 구성(integrant) 구조물이 "리졸빙(resolving)"된다 ([Rothstein R., "Targeting, Disruption, Replacement, and Allele Rescue: Integrative DNA Transformation in Yeast", pp281-301, Methods in Enzvmology, vol. 194 (1991), Elsevier/Academic Press, Amsterdam]). 균주 B71-1 (표 7)에 대한 전구체가 이러한 방식으로 생성되었다.
여기에서 개요된 방법에 의해, 합성 (코돈-최적화) Th.23B orfA, orfB, 및 orfC 코딩 영역의 모든 조합이 동족 스키조키트리움 코딩 영역을 교체한 스키조키트리움 균주들의 셋트가 생성되었다. Th.23B 유전자를 함유하지 않는 셋트 구성원은 야생형 스키조키트리움 ATCC20888이고, 유일하게 (전장) 코돈-최적화 합성 Th.23B orfC 코딩 영역을 함유하는 셋트 구성원인 B67-5이 상기 실시예 4 및 표 1에서 기술되었다. 균주 8개의 이러한 셋트를 상기 실시예 4에 기술된 바와 같이 SSFM 배지에서의 성장 동안 지방산 생산에 대해 평가하였고, 데이터가 표 7에서 제공된다.
플라스미드 pDD26은 스키조키트리움 orfA 유전자의 상류 및 하류 영역에 완벽하게 스티치된 전장 합성 Th.23B orfA 코딩 영역을 함유한다. pDD26의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 71로 표시된다. 서열 71은 서열 39를 코딩한다. pDD26은 본원에서 앞서 기술된 바와 같이 ATCC 접속 번호 PTA-8411로 기탁되었다.
플라스미드 pDD32는 스키조키트리움 orfB 유전자의 상류 및 하류 영역에 완벽하게 스티치된 전장 합성 Th.23B orfB 코딩 영역을 함유한다. pDD32의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열이 본원에서 서열 72로 표시된다. 서열 72는 서열 52를 코딩한다. pDD32는 본원에서 앞서 기술된 바와 같이 ATCC 접속 번호 PTA-8412로 기탁되었다.
코돈-최적화 합성 Th.23B orf 코딩 영역 3개 모두의 단백질 생성물이 스키조키트리움에서 기능하였고, 공급원과 상관 없이 다른 PUFA 신테이즈 성분과 성공적으로 상호작용하였다. Th.23B OrfC 단백질 (균주 B67-5)은 실시예 4에서 앞서 실연된 결과인, 천연 Th.23B 균주에서의 값에 근접하는 값으로의 DHA/DPA 비율에서의 증가를 야기하였다. 이러한 현상이 Th.23B OrfC 단백질을 발현하는 모든 조합 (B67-5, B79-11, B79-1, 및 B80-20)에 대해 나타났다. 뜻밖에, 코돈-최적화 합성 Th.23B orfC + 코돈-최적화 합성 Th.23B orfA 코딩 영역의 조합 (균주 B79-1)이, 높은 DHA/DPA 비율을 유지하면서, 최고 수준의 DHA 생산에 이르렀다. 이러한 스키조키트리움 균주에서의 증가된 DHA 생산은 Th.23B OrfC에 의해 야기된 증가된 n-3/n-6 비율 및 Th.23B OrfA와 Th.23B OrfC의 상호작용에 의해 야기된 증가된 전체 PUFA 생산 양쪽 모두로 인한 것으로 보인다.
이러한 데이터는 상이한 생물들로부터의 PUFA 신테이즈 복합체의 성분들이 성공적으로 공동으로 기능할 수 있고, 공급원 생물의 특이적 특성을 새로운 숙주에 부여할 수 있다는 것을 실연한다. 또한, PUFA 신테이즈 성분들의 공급원 및 발현 수준의 조작이 표적 지방산들의 신규 프로파일, 더 높은 생산성 및 더 낮은 비용에 이를 수 있다.
Figure 112009077242410-pct00012
본원에서 인용된 각각의 참조문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
본 발명의 다양한 실시양태들이 상세하게 기술되었지만, 이러한 실시양태들의 변형 및 개조가 당업자에게 발생할 것이라는 것이 명백하다. 그러나, 이러한 변형 및 개조가 하기의 청구항에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 확실하게 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Martek Biosciences Corporation <120> CHIMERIC PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS <130> 2997-49-2-PCT <150> 11/749,686 <151> 2007-05-16 <160> 95 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8733 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(8733) <400> 1 atg gcg gcc cgt ctg cag gag caa aag gga ggc gag atg gat acc cgc 48 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 att gcc atc atc ggc atg tcg gcc atc ctc ccc tgc ggc acg acc gtg 96 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 cgc gag tcg tgg gag acc atc cgc gcc ggc atc gac tgc ctg tcg gat 144 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 ctc ccc gag gac cgc gtc gac gtg acg gcg tac ttt gac ccc gtc aag 192 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 acc acc aag gac aag atc tac tgc aag cgc ggt ggc ttc att ccc gag 240 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 tac 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Ile 290 295 300 cgc ggc tgc gcc tcc tcc agt gat ggc aag gcc gcc ggc atc tac acg 960 Arg Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr 305 310 315 320 ccc acc att tcg ggc cag gag gag gcc ctc cgc cgc gcc tac aac cgc 1008 Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Asn Arg 325 330 335 gcc tgt gtc gac ccg gcc acc gtc act ctc gtc gag ggt cac ggc acc 1056 Ala Cys Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu Gly His Gly Thr 340 345 350 ggt act ccc gtt ggc gac cgc atc gag ctc acc gcc ttg cgc aac ctc 1104 Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu 355 360 365 ttt gac aag gcc tac ggc gag ggc aac acc gaa aag gtc gct gtg ggc 1152 Phe Asp Lys Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Thr Glu Lys Val Ala Val Gly 370 375 380 agc atc aag tcc agc atc ggc cat ctc aag gcc gtc gcc ggt ctc gcc 1200 Ser Ile Lys Ser Ser Ile Gly His Leu Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala 385 390 395 400 ggt atg atc aag gtc atc atg gcg ctc aag cac aag act ctc ccg ggc 1248 Gly Met Ile Lys Val Ile Met Ala Leu 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1920 Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser Lys Val 625 630 635 640 gct gga agc gac aag gac ttt gag cgc gtc tcc cag gtc ctc tac ccg 1968 Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu Tyr Pro 645 650 655 cgc aag ccg tac gag cgt gag ccc gag cag gac cac aag aag atc tcc 2016 Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asp His Lys Lys Ile Ser 660 665 670 ctc acc gcc tac tcg cag ccc tcg acc ctg gcc tgc gct ctc ggt gcc 2064 Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu Gly Ala 675 680 685 ttt gag atc ttc aag gag gcc ggc ttc acc ccg gac ttt gcc gcc ggc 2112 Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala Ala Gly 690 695 700 cat tcg ctc ggt gag ttc gcc gcc ctc tac gcc gcg ggc tgc gtc gac 2160 His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys Val Asp 705 710 715 720 cgc gac gag ctc ttt gag ctt gtc tgc cgc cgc gcc cgc atc atg ggc 2208 Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile Met Gly 725 730 735 ggc aag gac gca ccg gcc acc ccc aag ggc 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atg ttt ccc tcg cgc gcc aac aag 5679 Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys 1880 1885 1890 ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac gac tcg ttc gag tcc atg ccc 5724 Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro 1895 1900 1905 ccc gca gag ctt gcg cgc gtc gag aag cgc atc ttc agc cgc gcg 5769 Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Arg Ala 1910 1915 1920 ctc gaa gag gtc tgg gac gag acc aaa aac ttt tac att aac cgt 5814 Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn Phe Tyr Ile Asn Arg 1925 1930 1935 ctt cac aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag cgc gac ccc aag 5859 Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu Arg Asp Pro Lys 1940 1945 1950 ctc aag atg tcg ctg tgc ttt cgc tgg tac ctg agc ctg gcg agc 5904 Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser Leu Ala Ser 1955 1960 1965 cgc tgg gcc aac act gga gct tcc gat cgc gtc atg gac tac cag 5949 Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln 1970 1975 1980 gtc tgg tgc ggt cct gcc att ggt tcc ttc aac gat 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Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser 195 200 205 gtc gaa ggt atc cag gcc gag agc gcc cgc ctc cag aag gag ggc ttc 672 Val Glu Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe 210 215 220 cgc gtc gtg cct ctt gcc tgc gag agc gcc ttc cac tcg ccc cag atg 720 Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met 225 230 235 240 gag aac gcc tcg tcg gcc ttc aag gac gtc atc tcc aag gtc tcc ttc 768 Glu Asn Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe 245 250 255 cgc acc ccc aag gcc gag acc aag ctc ttc agc aac gtc tct ggc gag 816 Arg Thr Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu 260 265 270 acc tac ccc acg gac gcc cgc gag atg ctt acg cag cac atg acc agc 864 Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser 275 280 285 agc gtc aag ttc ctc acc cag gtc cgc aac atg cac cag gcc ggt gcg 912 Ser Val Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala 290 295 300 cgc atc ttt gtc gag ttc gga ccc aag cag gtg ctc tcc aag ctt gtc 960 Arg Ile Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 tcc gag acc ctc aag gat gac ccc tcg gtt gtc acc gtc tct gtc aac 1008 Ser Glu Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn 325 330 335 ccg gcc tcg ggc acg gat tcg gac atc cag ctc cgc gac gcg gcc gtc 1056 Pro Ala Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val 340 345 350 cag ctc gtt gtc gct ggc gtc aac ctt cag ggc ttt gac aag tgg gac 1104 Gln Leu Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp 355 360 365 gcc ccc gat gcc acc cgc atg cag gcc atc aag aag aag cgc act acc 1152 Ala Pro Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr 370 375 380 ctc cgc ctt tcg gcc gcc acc tac gtc tcg gac aag acc aag aag gtc 1200 Leu Arg Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val 385 390 395 400 cgc gac gcc gcc atg aac gat ggc cgc tgc gtc acc tac ctc aag ggc 1248 Arg Asp Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly 405 410 415 gcc gca ccg ctc atc aag gcc ccg gag ccc 1278 Ala Ala Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro 420 425 <210> 10 <211> 426 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 10 Asp Val Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe 1 5 10 15 Arg Ala Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn 35 40 45 Trp Pro Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser 50 55 60 Lys Val Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu 65 70 75 80 Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asp His Lys Lys 85 90 95 Ile Ser Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala 115 120 125 Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys 130 135 140 Val Asp Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile 145 150 155 160 Met Gly Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala 165 170 175 Val Ile Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val 180 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atg 240 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met 65 70 75 80 aag gcc gag atc gct ggc 258 Lys Ala Glu Ile Ala Gly 85 <210> 13 <211> 86 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 13 Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ala Asp 20 25 30 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 35 40 45 Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val 50 55 60 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met 65 70 75 80 Lys Ala Glu Ile Ala Gly 85 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 14 Leu Gly Ile Asp Ser 1 5 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 15 Ala Pro Ala Pro Val Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala 20 <210> 16 <211> 3006 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 16 gcccccgccc cggtcaaggc tgctgcgcct gccgcccccg ttgcctcggc ccctgccccg 60 gctgtctcga acgagcttct tgagaaggcc gagactgtcg tcatggaggt cctcgccgcc 120 aagaccggct acgagaccga catgatcgag gctgacatgg agctcgagac cgagctcggc 180 attgactcca tcaagcgtgt cgagatcctc tccgaggtcc aggccatgct caatgtcgag 240 gccaaggatg tcgatgccct cagccgcact cgcactgttg gtgaggttgt caacgccatg 300 aaggccgaga tcgctggcag ctctgccccg gcgcctgctg ccgctgctcc ggctccggcc 360 aaggctgccc ctgccgccgc tgcgcctgct gtctcgaacg agcttctcga gaaggccgag 420 accgtcgtca tggaggtcct cgccgccaag actggctacg agactgacat gatcgagtcc 480 gacatggagc tcgagactga gctcggcatt gactccatca agcgtgtcga gatcctctcc 540 gaggttcagg ccatgctcaa cgtcgaggcc aaggacgtcg acgctctcag ccgcactcgc 600 actgtgggtg aggtcgtcaa cgccatgaag gctgagatcg ctggtggctc tgccccggcg 660 cctgccgccg ctgccccagg tccggctgct gccgcccctg cgcctgccgc cgccgcccct 720 gctgtctcga acgagcttct tgagaaggcc gagaccgtcg tcatggaggt cctcgccgcc 780 aagactggct acgagactga catgatcgag tccgacatgg agctcgagac cgagctcggc 840 attgactcca tcaagcgtgt cgagattctc tccgaggtcc aggccatgct caacgtcgag 900 gccaaggacg tcgacgctct cagccgcacc cgcactgttg gcgaggtcgt cgatgccatg 960 aaggccgaga tcgctggtgg ctctgccccg gcgcctgccg ccgctgctcc tgctccggct 1020 gctgccgccc ctgcgcctgc cgcccctgcg cctgctgtct cgagcgagct tctcgagaag 1080 gccgagactg tcgtcatgga ggtcctcgcc gccaagactg gctacgagac tgacatgatc 1140 gagtccgaca tggagctcga gaccgagctc ggcattgact ccatcaagcg tgtcgagatt 1200 ctctccgagg tccaggccat gctcaacgtc gaggccaagg acgtcgacgc tctcagccgc 1260 acccgcactg ttggcgaggt cgtcgatgcc atgaaggccg agatcgctgg tggctctgcc 1320 ccggcgcctg ccgccgctgc tcctgctccg gctgctgccg cccctgcgcc tgccgcccct 1380 gcgcctgccg cccctgcgcc tgctgtctcg agcgagcttc tcgagaaggc cgagactgtc 1440 gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc tacgagactg acatgattga gtccgacatg 1500 gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt 1560 caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt 1620 ggtgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag atcgctggca gctccgcctc ggcgcctgcc 1680 gccgctgctc ctgctccggc tgctgccgct cctgcgcccg ctgccgccgc ccctgctgtc 1740 tcgaacgagc ttctcgagaa agccgagact gtcgtcatgg aggtcctcgc cgccaagact 1800 ggctacgaga ctgacatgat cgagtccgac atggagctcg agactgagct cggcattgac 1860 tccatcaagc gtgtcgagat cctctccgag gttcaggcca tgctcaacgt cgaggccaag 1920 gacgtcgatg ccctcagccg cacccgcact gttggcgagg ttgtcgatgc catgaaggcc 1980 gagatcgctg gtggctctgc cccggcgcct gccgccgctg cccctgctcc ggctgccgcc 2040 gcccctgctg tctcgaacga gcttctcgag aaggccgaga ctgtcgtcat ggaggtcctc 2100 gccgccaaga ctggctacga gaccgacatg atcgagtccg acatggagct cgagaccgag 2160 ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctccg aggttcaggc catgctcaac 2220 gtcgaggcca aggacgtcga tgctctcagc cgcactcgca ctgttggcga ggtcgtcgat 2280 gccatgaagg ctgagatcgc cggcagctcc gccccggcgc ctgccgccgc tgctcctgct 2340 ccggctgctg ccgctcctgc gcccgctgcc gctgcccctg ctgtctcgag cgagcttctc 2400 gagaaggccg agaccgtcgt catggaggtc ctcgccgcca agactggcta cgagactgac 2460 atgattgagt ccgacatgga gctcgagact gagctcggca ttgactccat caagcgtgtc 2520 gagatcctct ccgaggttca ggccatgctc aacgtcgagg ccaaggacgt cgatgccctc 2580 agccgcaccc gcactgttgg cgaggttgtc gatgccatga aggccgagat cgctggtggc 2640 tctgccccgg cgcctgccgc cgctgcccct gctccggctg ccgccgcccc tgctgtctcg 2700 aacgagcttc ttgagaaggc cgagaccgtc gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc 2760 tacgagaccg acatgatcga gtccgacatg gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc 2820 atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac 2880 gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt ggcgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag 2940 atcgctggtg gctctgcccc ggcgcctgcc gccgctgctc ctgcctcggc tggcgccgcg 3000 cctgcg 3006 <210> 17 <211> 2133 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2133) <400> 17 ttt ggc gct ctc ggc ggc ttc atc tcg cag cag gcg gag cgc ttc gag 48 Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu 1 5 10 15 ccc gcc gaa atc ctc ggc ttc acg ctc atg tgc gcc aag ttc gcc aag 96 Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys 20 25 30 gct tcc ctc tgc acg gct gtg gct ggc ggc cgc ccg gcc ttt atc ggt 144 Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly 35 40 45 gtg gcg cgc ctt gac ggc cgc ctc gga ttc act tcg cag ggc act tct 192 Val Ala Arg Leu Asp Gly Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser 50 55 60 gac gcg ctc aag cgt gcc cag cgt ggt gcc atc ttt ggc ctc tgc aag 240 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys 65 70 75 80 acc atc ggc ctc gag tgg tcc gag tct gac gtc ttt tcc cgc ggc gtg 288 Thr Ile Gly Leu Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val 85 90 95 gac att gct cag ggc atg cac ccc gag gat gcc gcc gtg gcg att gtg 336 Asp Ile Ala Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val 100 105 110 cgc gag atg gcg tgc gct gac att cgc att cgc gag gtc ggc att ggc 384 Arg Glu Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly 115 120 125 gca aac cag cag cgc tgc acg atc cgt gcc gcc aag ctc gag acc ggc 432 Ala Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 130 135 140 aac ccg cag cgc cag atc gcc aag gac gac gtg ctg ctc gtt tct ggc 480 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser Gly 145 150 155 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atc agc gac aaa cga ctc ggc tcc aac tac cgc gcc gag cac tac 192 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 aaa gca gag cgc agc aag tat gcc gac acc ttt tgc aac gaa acg tac 240 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 ggc acc ctt gac gag aac gag atc gac aac gag cac gaa ctc ctc ctc 288 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 aac ctc gcc aag cag gca ctc gca gag aca tcc gtc aaa gac tcg aca 336 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 cgc tgc ggc atc gtc agc ggc tgc ctc tcg ttc ccc atg gac aac ctc 384 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 cag ggt gaa ctc ctc aac gtg tac caa aac cat gtc gag aaa aag ctc 432 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 ggg gcc cgc gtc ttc aag gac gcc tcc cat tgg tcc gaa cgc gag cag 480 Gly Ala Arg Val Phe Lys Asp Ala Ser His Trp Ser Glu Arg Glu Gln 145 150 155 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384 Met Lys Lys Gly Gly Asn Val Ala Val Phe Val Gly Leu Gly Thr Asp 115 120 125 ctc gag ctc tac cgt cac cgt gct cgc gtc gct ctc aag gag cgc gtc 432 Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Arg Val 130 135 140 cgc cct gaa gcc tcc aag aag ctc aat gac atg atg cag tac att aac 480 Arg Pro Glu Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asp Met Met Gln Tyr Ile Asn 145 150 155 160 gac tgc ggc aca tcc aca tcg tac acc tcg tac att ggc aac ctc gtc 528 Asp Cys Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val 165 170 175 gcc acg cgc gtc tcg tcg cag tgg ggc ttc acg ggc ccc tcc ttt acg 576 Ala Thr Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr 180 185 190 atc acc gag ggc aac aac tcc gtc tac cgc tgc gcc gag ctc ggc aag 624 Ile Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Gly Lys 195 200 205 tac ctc ctc gag acc ggc gag gtc gat ggc gtc gtc gtt gcg ggt gtc 672 Tyr Leu Leu Glu Thr Gly Glu Val Asp Gly Val Val Val Ala Gly Val 210 215 220 gat ctc tgc ggc agt gcc gaa aac ctt tac gtc aag tct 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cag acg atc ctt cgt gac gat 1056 Thr Ala Glu Glu Glu Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp 340 345 350 gac aag ctc ccg cgc aac gtc gca acg ggc agt gtc aag gcc acc gtc 1104 Asp Lys Leu Pro Arg Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val 355 360 365 ggt gac acc ggt tat gcc tct ggt gct gcc agc ctc atc aag gct gcg 1152 Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala 370 375 380 ctt tgc atc tac aac cgc tac ctg ccc agc aac ggc gac gac tgg gat 1200 Leu Cys Ile Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp 385 390 395 400 gaa ccc gcc cct gag gcg ccc tgg gac agc acc ctc ttt gcg tgc cag 1248 Glu Pro Ala Pro Glu Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln 405 410 415 acc tcg cgc gct tgg ctc aag aac cct ggc gag cgt cgc tat gcg gcc 1296 Thr Ser Arg Ala Trp Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala 420 425 430 gtc tcg ggc gtc tcc gag acg cgc tcg 1323 Val Ser Gly Val Ser Glu Thr Arg Ser 435 440 <210> 22 <211> 441 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 22 Ser Ala Arg 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ctg gcg agc cgc tgg gcc aac act gga gct tcc gat cgc gtc atg gac 1296 Leu Ala Ser Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp 420 425 430 tac cag gtc tgg tgc ggt cct gcc att ggt tcc ttc aac gat ttc atc 1344 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile 435 440 445 aag gga act tac ctt gat ccg gcc gtc gca aac gag tac ccg tgc gtc 1392 Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 450 455 460 gtt cag att aac aag cag atc ctt cgt gga gcg tgc ttc ttg cgc cgt 1440 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg Arg 465 470 475 480 ctc gaa att ctg cgc aac gca cgc ctt tcc gat ggc gct gcc gct ctt 1488 Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala Ala Leu 485 490 495 gtg gcc agc atc gat gac aca tac gtc ccg gcc gag aag ctg 1530 Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys Leu 500 505 510 <210> 26 <211> 510 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 26 Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gly 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ctgctgatgg ttactttgtt 2160 ggtgaaggtt gtggtgcttt tgttttgaaa agagaaactt cttgtactaa agatgataga 2220 atctatgctt gcatggatgc tattgttcca ggtaatgttc catctgcttg tttgagagaa 2280 gcattggatc aagctagagt taaaccaggt gatattgaaa tgttggaatt gtctgctgat 2340 tctgctagac atttgaaaga tccatctgtt ttgccaaaag aattgactgc tgaagaagaa 2400 attggtggtt tgcaaactat tttgagagat gatgataaat tgccaagaaa tgttgctact 2460 ggttctgtta aagctactgt tggtgatact ggttatgctt ctggtgctgc ttctttgatt 2520 aaagctgctt tgtgcatcta taataggtat ttgccatcta atggtgatga ttgggatgaa 2580 ccagctccag aagctccttg ggattctact ttgtttgctt gtcaaacttc aagagcttgg 2640 ttgaaaaatc ctggagagag aagatatgct gctgtttctg gtgtttctga aactaggtct 2700 tgttattctg ttttgttgtc tgaagctgaa ggtcattatg aaagagaaaa tagaatttct 2760 ttggatgaag aagctccaaa attgattgtt ttgagagctg attctcatga agaaattttg 2820 ggtaggttgg ataaaattag agaaagattt ttgcaaccaa ctggtgctgc tccaagagaa 2880 tctgaattga aagctcaagc tagaagaatt ttcttggaat tgttgggtga aactttggct 2940 caagatgctg cttcttctgg ttctcaaaaa ccattggctt 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caagggaact 6000 taccttgatc cggccgtcgc aaacgagtac ccgtgcgtcg ttcagattaa caagcagatc 6060 cttcgtggag cgtgcttctt gcgccgtctc gaaattctgc gcaacgcacg cctttccgat 6120 ggcgctgccg ctcttgtggc cagcatcgat gacacatacg tcccggccga gaagctgtaa 6180 <210> 38 <211> 8436 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(8433) <400> 38 atg aag gac atg gaa gat aga cgg gtc gct att gtg ggc atg tca gct 48 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 cac ttg cct tgt ggg aca gat gtg aag gaa tca tgg cag gct att cgc 96 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 gat gga atc gac tgt cta agt gac cta ccc gcg gat cgt ctc gac gtt 144 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 aca gct tac tac aat ccc aac aaa gcc acg aaa gac aag atc tac tgc 192 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 aaa cgg ggt ggc ttc atc ccg aac tat gac ttc gac ccc cgc gaa ttt 240 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp 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Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 acc ttc aac atg gaa ggt atg aac tgc gtt gtg gat gct gca tgt gcc 624 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 agt tct cta att gca atc aag gtt gca gtt gaa gag cta ctc ttt ggt 672 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 gac tgt gac acc atg att gca ggt gcc acc tgc acg gac aat tca ctt 720 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 ggc atg tac atg gcc ttc tct aaa acg cca gtt ttt tct act gac cca 768 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 agt gtc cgc gcg tat gat gag aaa aca aaa ggg atg cta att gga gaa 816 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 ggt tca gca atg ttc gtt ctt aaa cgc tat gcg gat gcc gta cgt gat 864 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 ggc gac aca att cac gcg gtt ctg cgt tct tgc tct tcg tct agt gat 912 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 gga aaa gcg gca gga att tat act cct act ata tct gga caa gaa gaa 960 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 gct ttg cgt cga gcg tat gcc cgt gcg ggg gta tgt cca tct acg atc 1008 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 ggg ctt gtt gag ggt cac ggg aca ggg acc cct gtt gga gat cgc att 1056 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 gag tta aca gct ctg cgg aac ttg ttt gac aaa gct ttt ggt agc aag 1104 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 aag gaa caa ata gca gtt ggc agc ata aag tct cag ata ggt cac ctg 1152 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 aaa tct gtt gcc ggc ttt gcc ggc ttg gtc aaa gct gtg ctt gcg ctt 1200 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 aaa cac aaa acg ctc cca ggt tcg att aat gtc gac cag cca cct ttg 1248 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 ttg tat gac ggt act caa att caa gac tct tct tta tat atc aac aag 1296 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 aca aat aga cca tgg ttt acg caa aac aag ctt ccg cgt cgg gct ggt 1344 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 gtc tca agt ttt gga ttt gga ggt gca aac tac cac gcg gtt ctg gaa 1392 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 gaa ttc gag ccc gag cat gaa aaa cca tac cgc ctc aat act gtt gga 1440 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 cat cct gtc ctc ttg tac gct ccg tct gtg gaa gcc ctc aaa gta ctt 1488 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 tgc aac gac cag ctt gcg gag ctc aca att gca ttg gaa gag gca aaa 1536 Cys Asn Asp Gln Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys 500 505 510 aca cat aaa aat gtt gac aaa gtt tgt ggc tac aag ttt att gac gaa 1584 Thr His Lys Asn Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu 515 520 525 ttt cag ctc caa gga agc tgt cct cca gaa aat ccg aga gta gga ttt 1632 Phe Gln Leu Gln Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe 530 535 540 tta gca aca ctg cct act tca aat atc att gtc gcg ctt aag gca att 1680 Leu Ala Thr Leu Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile 545 550 555 560 ctc gcg cag ctt gat gca aaa cca gat gcg aag aaa tgg gat ttg cct 1728 Leu Ala Gln Leu Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro 565 570 575 cat aaa aag gct ttt ggg gct acc ttc gca tcg tct tca gtg aaa ggc 1776 His Lys Lys Ala Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly 580 585 590 tct gtt gct gcg ctc ttc gca gga cag ggt acc cag tac tta aac atg 1824 Ser Val Ala Ala Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met 595 600 605 ttc tct gat gtg gca atg aac tgg cca ccg ttc cgt gac agc att gtc 1872 Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val 610 615 620 gca atg gaa gaa gct caa act gag gta ttt gag ggc caa gtt gaa cca 1920 Ala Met Glu Glu Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro 625 630 635 640 att agc aaa gtt ctg ttt cca cga gag cgc tat gca tcc gaa agt gaa 1968 Ile Ser Lys Val Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu 645 650 655 cag ggg aat gaa ctt ctt tgc tta aca gag tac tct cag cca act acg 2016 Gln Gly Asn Glu Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr 660 665 670 ata gca gcc gca gta ggg gcc ttc gat att ttc aaa gcg gct ggc ttt 2064 Ile Ala Ala Ala Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe 675 680 685 aag cca gac atg gtt gga ggg cat tca ctt ggc gaa ttt gct gct ttg 2112 Lys Pro Asp Met Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu 690 695 700 tac gcg gct ggg tcc att tcg cgt gac gac ctg tac aag ctt gtg tgc 2160 Tyr Ala Ala Gly Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys 705 710 715 720 aaa cgg gca aag gca atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca 2208 Lys Arg Ala Lys Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala 725 730 735 gtg att ggc cca gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt 2256 Val Ile Gly Pro Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val 740 745 750 tat gtc gca aac ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act 2304 Tyr Val Ala Asn Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr 755 760 765 gtt caa ggt gtg aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc 2352 Val Gln Gly Val Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe 770 775 780 cgc gta ctg cca ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg 2400 Arg Val Leu Pro Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met 785 790 795 800 ggg cct tct gag gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc 2448 Gly Pro Ser Glu Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile 805 810 815 tcg ccg cca aaa aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa 2496 Ser Pro Pro Lys Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu 820 825 830 agc cca aac cca aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt 2544 Ser Pro Asn Pro Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val 835 840 845 cag ttc gag gag cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt 2592 Gln Phe Glu Glu Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val 850 855 860 ttt ctg gag ttt gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa 2640 Phe Leu Glu Phe Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu 865 870 875 880 atg ttt ccc tcg tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt 2688 Met Phe Pro Ser Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly 885 890 895 gac agt gac gtg caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg 2736 Asp Ser Asp Val Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser 900 905 910 ggt gca gcc ctt agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa 2784 Gly Ala Ala Leu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln 915 920 925 gat ctt ctt att cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca 2832 Asp Leu Leu Ile Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala 930 935 940 gca aca tat gtt tcc cca aag act ctt gca gaa cgt aaa aag gct atg 2880 Ala Thr Tyr Val Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met 945 950 955 960 gaa gat atc aag cta gta tcc att aca cca aga gat agt atg gta tca 2928 Glu Asp Ile Lys Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser 965 970 975 att gga aaa atc gcg caa gaa gta cgg aca gct aaa cag cct tta gaa 2976 Ile Gly Lys Ile Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu 980 985 990 acc gaa att cga aga ctc aac aaa gaa tta gaa cat ctc aag aga gag 3024 Thr Glu Ile Arg Arg Leu Asn Lys Glu Leu Glu His Leu Lys Arg Glu 995 1000 1005 cta gca gca gcc aaa gcg agt gtc aag tct gca tca aaa agc tct 3069 Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Val Lys Ser Ala Ser Lys Ser Ser 1010 1015 1020 aaa gag cga tct gtc cta tca aag cac cgc gct ttg ctt caa aac 3114 Lys Glu Arg Ser Val Leu Ser Lys His Arg Ala Leu Leu Gln Asn 1025 1030 1035 att ttg caa gac tac gat gat ctt cgt gtg gtg cca ttc gct gtt 3159 Ile Leu Gln Asp Tyr Asp Asp Leu Arg Val Val Pro Phe Ala Val 1040 1045 1050 cgt tct gtt gca gtg gac aac acc gcg ccg tat gct gac caa gtt 3204 Arg Ser Val Ala Val Asp Asn Thr Ala Pro Tyr Ala Asp Gln Val 1055 1060 1065 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa 3249 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys 1070 1075 1080 cgc agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg 3294 Arg Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala 1085 1090 1095 gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg 3339 Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met 1100 1105 1110 atc gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc 3384 Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 1115 1120 1125 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc 3429 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser 1130 1135 1140 gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt 3474 Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val 1145 1150 1155 ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa 3519 Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln 1160 1165 1170 ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 3564 Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 1175 1180 1185 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt 3609 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val 1190 1195 1200 tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gct gcg gta ctg agc gtt 3654 Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val 1205 1210 1215 ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac 3699 Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp 1220 1225 1230 atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 3744 Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 1235 1240 1245 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc 3789 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser 1250 1255 1260 gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac gtc atc 3834 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile 1265 1270 1275 gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg 3879 Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu 1280 1285 1290 acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 3924 Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 1295 1300 1305 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc 3969 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg 1310 1315 1320 ctc gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag 4014 Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys 1325 1330 1335 aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag 4059 Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu 1340 1345 1350 agc gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 4104 Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 1355 1360 1365 gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct 4149 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala 1370 1375 1380 ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag 4194 Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys 1385 1390 1395 ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg 4239 Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser 1400 1405 1410 atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 4284 Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 1415 1420 1425 tca agc agt att gct aat gtt ttg tca gca cgc ctc gct gaa gct 4329 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala 1430 1435 1440 gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac 4374 Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp 1445 1450 1455 agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc 4419 Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly 1460 1465 1470 gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 4464 Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 1475 1480 1485 ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc 4509 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1490 1495 1500 aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt 4554 Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly 1505 1510 1515 gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca 4599 Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro 1520 1525 1530 ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 4644 Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 1535 1540 1545 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta 4689 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val 1550 1555 1560 ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc 4734 Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile 1565 1570 1575 gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc 4779 Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile 1580 1585 1590 aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 4824 Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 1595 1600 1605 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc 4869 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly 1610 1615 1620 gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc 4914 Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly 1625 1630 1635 cag act ttg acc tct gaa ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag 4959 Gln Thr Leu Thr Ser Glu Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu 1640 1645 1650 cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tct 5004 Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 1655 1660 1665 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc 5049 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu 1670 1675 1680 gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg 5094 Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met 1685 1690 1695 gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gaa 5139 Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 1700 1705 1710 atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 5184 Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 1715 1720 1725 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag 5229 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu 1730 1735 1740 gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc 5274 Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr 1745 1750 1755 gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg 5319 Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro 1760 1765 1770 acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 5364 Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 1775 1780 1785 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca 5409 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr 1790 1795 1800 ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc 5454 Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser 1805 1810 1815 gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag 5499 Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu 1820 1825 1830 gtt caa gcg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 5544 Val Gln Ala Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 1835 1840 1845 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg 5589 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met 1850 1855 1860 gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc 5634 Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile 1865 1870 1875 cgt gag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca 5679 Arg Glu Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser 1880 1885 1890 agt agt atc gct aat gtt tct tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa 5724 Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 1895 1900 1905 gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc 5769 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser 1910 1915 1920 tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc 5814 Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val 1925 1930 1935 gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ttg 5859 Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu 1940 1945 1950 ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 5904 Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 1955 1960 1965 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctt ggg gaa 5949 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Glu 1970 1975 1980 tca tca agt att gag act ctc aat tgt acc gag gtt gag cac acg 5994 Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu His Thr 1985 1990 1995 agc tac aaa agt gtc aag gct tca ggg tgt gag aat gta gat acc 6039 Ser Tyr Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr 2000 2005 2010 cgt ttc gct aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa 6084 Arg Phe Ala Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys 2015 2020 2025 tcc act gtg tcg cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga 6129 Ser Thr Val Ser His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly 2030 2035 2040 acg ccc tta acc acg gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att 6174 Thr Pro Leu Thr Thr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile 2045 2050 2055 gtg gtt ctc tct tat caa ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc 6219 Val Val Leu Ser Tyr Gln Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val 2060 2065 2070 gag gtg cca gat ctt tcc gag gaa gcc cta att caa gct ctt gca 6264 Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala 2075 2080 2085 ttg att cgg tct aca tat gga gtt cca att ggt ttt att tgt cag 6309 Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln 2090 2095 2100 caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca cag ctt tgt tgg gca ctc 6354 Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala Gln Leu Cys Trp Ala Leu 2105 2110 2115 ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg aat gct gtc tta ccc 6399 Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu Asn Ala Val Leu Pro 2120 2125 2130 gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc ttg aac ggg aaa 6444 Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg Leu Asn Gly Lys 2135 2140 2145 ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa ttt gat ttg 6489 Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys Phe Asp Leu 2150 2155 2160 acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta ggc ctg 6534 Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu Gly Leu 2165 2170 2175 tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt gga 6579 Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg Gly 2180 2185 2190 ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 6624 Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 2195 2200 2205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt 6669 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val 2210 2215 2220 ggg tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca acc gat gac 6714 Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp 2225 2230 2235 ctg cta tgt gga ccc tcg aag gct aaa gta gag gcc gca gac ttg 6759 Leu Leu Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu 2240 2245 2250 ttt ctt gtg aca ggt ggc gca cga ggt att aca cct cat tgt gtt 6804 Phe Leu Val Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val 2255 2260 2265 cgt gag att gca agt cga tcc ccc gga acc aca ttt gtg ctg gtt 6849 Arg Glu Ile Ala Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val 2270 2275 2280 gga aga agc gaa atg tcc gac gag cct gac tgg gct gtt ggc cac 6894 Gly Arg Ser Glu Met Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His 2285 2290 2295 tac aat aaa gac ctg gac caa agc aca atg aaa cac ttg aaa gca 6939 Tyr Asn Lys Asp Leu Asp Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala 2300 2305 2310 acg cat gct gct gga ggg gta aaa cct acg cct aaa gca cat cgt 6984 Thr His Ala Ala Gly Gly Val Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg 2315 2320 2325 gca ctt gtg aac agg gtc act ggc tca cgg gag gta cga gaa tct 7029 Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser 2330 2335 2340 ctt aga gca atc cag gag gca ggg gca aat gtc gaa tat atc 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2560 2565 Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro 2570 2575 2580 Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn Ala Gln Leu Phe Gln Gly 2585 2590 2595 Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln Ile Thr Leu Ile Glu 2600 2605 2610 Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu Thr Ser Leu Gly 2615 2620 2625 Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr Arg Cys Val 2630 2635 2640 Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser Pro Lys 2645 2650 2655 Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro Tyr 2660 2665 2670 Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 2675 2680 2685 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg 2690 2695 2700 Ala Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln 2705 2710 2715 Thr Leu His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met 2720 2725 2730 Leu Val Trp Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn 2735 2740 2745 Arg Ile Glu Lys Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser 2750 2755 2760 Thr Phe Phe Ala Ser Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys 2765 2770 2775 Asp Pro Val Ile Lys Met Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly 2780 2785 2790 Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu 2795 2800 2805 Leu Val Phe 2810 <210> 40 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 40 atg aag gac atg gaa gat aga cgg gtc gct att gtg ggc atg tca gct 48 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 cac ttg cct tgt ggg aca gat gtg aag gaa tca tgg cag gct att cgc 96 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 gat gga atc gac tgt cta agt gac cta ccc gcg gat cgt ctc gac gtt 144 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 aca gct tac tac aat ccc aac aaa gcc acg aaa gac aag atc tac tgc 192 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 aaa cgg ggt ggc ttc atc ccg aac tat gac ttc gac ccc cgc gaa ttt 240 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 ggg ctc aac atg ttt caa atg gaa gac tct gat gcg aat cag aca ctt 288 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 acc ttg ctc aaa gtc aaa caa gct ctc gaa gat gca agc ata gag cct 336 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 ttc acc aag gag aag aag aac att gga tgt gtt tta ggt att ggt ggg 384 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 ggc caa aag gcg agt cat gag ttc tac tct cgt ctc aac tac gtt gtc 432 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 gtt gaa aag gta ctt cgg aaa atg ggt tta cca gat gct gat gtt gaa 480 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 gaa gct gtg gag aaa tac aag gca aat ttt ccc gag tgg cgc cta gac 528 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 tct ttc cct ggg ttt ctt ggg aat gta acg gct ggt cgg tgc agt aac 576 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 acc ttc aac atg gaa ggt atg aac tgc gtt gtg gat gct gca tgt gcc 624 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 agt tct cta att gca atc aag gtt gca gtt gaa gag cta ctc ttt ggt 672 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 gac tgt gac acc atg att gca ggt gcc acc tgc acg gac aat tca ctt 720 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 ggc atg tac atg gcc ttc tct aaa acg cca gtt ttt tct act gac cca 768 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 agt gtc cgc gcg tat gat gag aaa aca aaa ggg atg cta att gga gaa 816 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 ggt tca gca atg ttc gtt ctt aaa cgc tat gcg gat gcc gta cgt gat 864 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 ggc gac aca att cac gcg gtt ctg cgt tct tgc tct tcg tct agt gat 912 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 gga aaa gcg gca gga att tat act cct act ata tct gga caa gaa gaa 960 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 gct ttg cgt cga gcg tat gcc cgt gcg ggg gta tgt cca tct acg atc 1008 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 ggg ctt gtt gag ggt cac ggg aca ggg acc cct gtt gga gat cgc att 1056 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 gag tta aca gct ctg cgg aac ttg ttt gac aaa gct ttt ggt agc aag 1104 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 aag gaa caa ata gca gtt ggc agc ata aag tct cag ata ggt cac ctg 1152 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 aaa tct gtt gcc ggc ttt gcc ggc ttg gtc aaa gct gtg ctt gcg ctt 1200 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 aaa cac aaa acg ctc cca ggt tcg att aat gtc gac cag cca cct ttg 1248 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 ttg tat gac ggt act caa att caa gac tct tct tta tat atc aac aag 1296 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 aca aat aga cca tgg ttt acg caa aac aag ctt ccg cgt cgg gct ggt 1344 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 gtc tca agt ttt gga ttt gga ggt gca aac tac cac gcg gtt ctg gaa 1392 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 gaa ttc gag ccc gag cat gaa aaa cca tac cgc ctc aat act gtt gga 1440 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 cat cct gtc ctc ttg tac gct ccg tct gtg gaa gcc ctc aaa gta ctt 1488 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 tgc aac gac cag 1500 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 41 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 41 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 42 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 42 ctt gcg gag ctc aca att gca ttg gaa gag gca aaa aca cat aaa aat 48 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 gtt gac aaa gtt tgt ggc tac aag ttt att gac gaa ttt cag ctc caa 96 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 gga agc tgt cct cca gaa aat ccg aga gta gga ttt tta gca aca ctg 144 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 cct act tca aat atc att gtc gcg ctt aag gca att ctc gcg cag ctt 192 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 gat gca aaa cca gat gcg aag aaa tgg gat ttg cct cat aaa aag gct 240 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 ttt ggg gct acc ttc gca tcg tct tca gtg aaa ggc tct gtt gct gcg 288 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 ctc ttc gca gga cag ggt acc cag tac tta aac atg ttc tct gat gtg 336 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 gca atg aac tgg cca ccg ttc cgt gac agc att gtc gca atg gaa gaa 384 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 gct caa act gag gta ttt gag ggc caa gtt gaa cca att agc aaa gtt 432 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 ctg ttt cca cga gag cgc tat gca tcc gaa agt gaa cag ggg aat gaa 480 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 ctt ctt tgc tta aca gag tac tct cag cca act acg ata gca gcc gca 528 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 gta ggg gcc ttc gat att ttc aaa gcg gct ggc ttt aag cca gac atg 576 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 gtt gga ggg cat tca ctt ggc gaa ttt gct gct ttg tac gcg gct ggg 624 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 tcc att tcg cgt gac gac ctg tac aag ctt gtg tgc aaa cgg gca aag 672 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 gca atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca gtg att ggc cca 720 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt tat gtc gca aac 768 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act gtt caa ggt gtg 816 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc cgc gta ctg cca 864 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg ggg cct tct gag 912 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc tcg ccg cca aaa 960 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa agc cca aac cca 1008 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt cag ttc gag gag 1056 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt ttt ctg gag ttt 1104 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa atg ttt ccc tcg 1152 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt gac agt gac gtg 1200 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg ggt gca gcc ctt 1248 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa gat ctt ctt att 1296 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca gca aca tat gtt 1344 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 tcc cca aag act ctt gca gaa cgt aaa aag gct atg gaa gat atc aag 1392 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 cta gta tcc att aca cca aga gat agt atg gta tca att gga aaa atc 1440 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 gcg caa gaa gta cgg aca gct aaa cag cct tta gaa acc gaa att cga 1488 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 aga ctc aac aaa 1500 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 43 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 43 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 44 <211> 351 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 44 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca 351 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 45 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa = any amino acid <400> 46 Leu Gly Xaa Asp Ser 1 5 <210> 47 <211> 2790 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2790) <400> 47 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 384 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 432 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 gct gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 480 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 528 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 576 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac 624 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 672 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 720 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 768 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 816 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 864 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 912 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 960 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc 1008 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 1056 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt ttg 1104 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 1152 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 1200 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 1248 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 1296 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 1344 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag 1392 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 1440 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 1488 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 1536 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg 1584 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 1632 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 1680 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc tct gaa 1728 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 1776 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 tca agc agt att gct aat gtt tct tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 1824 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 1872 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 1920 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 atc aaa cgc gtg gaa atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 1968 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac 2016 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 2064 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 2112 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 2160 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 2208 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 2256 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa gcg 2304 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 2352 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc 2400 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc cgt gag cca ccg gtg tct 2448 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agt agt atc gct aat gtt tct 2496 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 2544 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 2592 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 2640 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 2688 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 2736 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 ctt ggg gaa tca tca agt att gag act ctc aat tgt acc gag gtt gag 2784 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 cac acg 2790 His Thr 930 <210> 48 <211> 930 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 His Thr 930 <210> 49 <211> 2433 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2433) <400> 49 aaa agt gtc aag gct tca ggg tgt gag aat gta gat acc cgt ttc gct 48 Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr Arg Phe Ala 1 5 10 15 aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa tcc act gtg tcg 96 Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys Ser Thr Val Ser 20 25 30 cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga acg ccc tta acc acg 144 His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly Thr Pro Leu Thr Thr 35 40 45 gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att gtg gtt ctc tct tat caa 192 Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile Val Val Leu Ser Tyr Gln 50 55 60 ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc gag gtg cca gat ctt tcc gag 240 Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu 65 70 75 80 gaa gcc cta att caa gct ctt gca ttg att cgg tct aca tat gga gtt 288 Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val 85 90 95 cca att ggt ttt att tgt cag caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca 336 Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala 100 105 110 cag ctt tgt tgg gca ctc ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg 384 Gln Leu Cys Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125 aat gct gtc tta ccc gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc 432 Asn Ala Val Leu Pro Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg 130 135 140 ttg aac ggg aaa ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa 480 Leu Asn Gly Lys Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys 145 150 155 160 ttt gat ttg acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta 528 Phe Asp Leu Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu 165 170 175 ggc ctg tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt 576 Gly Leu Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg 180 185 190 gga ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 624 Gly Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 195 200 205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt ggg 672 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val Gly 210 215 220 tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca acc gat gac ctg cta 720 Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp Leu Leu 225 230 235 240 tgt gga ccc tcg aag gct aaa gta gag gcc gca gac ttg ttt ctt gtg 768 Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu Phe Leu Val 245 250 255 aca ggt ggc gca cga ggt att aca cct cat tgt gtt cgt gag att gca 816 Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val Arg Glu Ile Ala 260 265 270 agt cga tcc ccc gga acc aca ttt gtg ctg gtt gga aga agc gaa atg 864 Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val Gly Arg Ser Glu Met 275 280 285 tcc gac gag cct gac tgg gct gtt ggc cac tac aat aaa gac ctg gac 912 Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His Tyr Asn Lys Asp Leu Asp 290 295 300 caa agc aca atg aaa cac ttg aaa gca acg cat gct gct gga ggg gta 960 Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala Thr His Ala Ala Gly Gly Val 305 310 315 320 aaa cct acg cct aaa gca cat cgt gca ctt gtg aac agg gtc act ggc 1008 Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly 325 330 335 tca cgg gag gta cga gaa tct ctt aga gca atc cag gag gca ggg gca 1056 Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala 340 345 350 aat gtc gaa tat atc gcc tgt gat gtt tcg gat gaa aac aag gtc cgc 1104 Asn Val Glu Tyr Ile Ala Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg 355 360 365 caa ctt gtg caa aga gtg gag caa aag tat ggc tgt gaa ata act ggg 1152 Gln Leu Val Gln Arg Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly 370 375 380 att tgg cat gca agc ggg gtt ctt cgt gac aaa ctt gtc gag caa aag 1200 Ile Trp His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys 385 390 395 400 act aca gac gac ttt gag gca gtt ttt ggg acc aag gtg act ggc ctt 1248 Thr Thr Asp Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu 405 410 415 gta aac atc gtg tca caa gtc aat atg tct aag cta cga cac ttc atc 1296 Val Asn Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 ctc ttc agt tct ttg gct gga ttt cat ggg aac aag ggc caa acg gat 1344 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 tat gca att gct aat gaa gcc ttg aac aaa atc gcg cat act ctc tca 1392 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 gcg ttt ttg ccc aaa ctg aat gca aag gtg cta gac ttc ggt ccg tgg 1440 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 gta ggt tca gga atg gta acc gaa aca ctt gag aag cat ttt aaa gct 1488 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 atg ggg gtt cag act att cct ctc gag cca gga gca cgg act gtt gcg 1536 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 caa atc att ttg gca agt tcg cca ccg caa tcg ctt ttg ggg aac tgg 1584 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 ggc ttt cca gcc acc aaa ccg cta caa cgc tct aat gta gtc acg ggc 1632 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 aca ctc tct ccg gaa gag ata gaa ttc atc gca gac cac aaa att caa 1680 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 ggc cgc aag gtg ctt ccc atg atg gct gca atc ggg ttc atg gcc tct 1728 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 att gcg gaa gga ctc tac ccg ggg tac aat ctg caa ggc gtg gaa aat 1776 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 gct cag ctc ttt caa ggc ttg act atc aac caa gag aca aaa ttt caa 1824 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 atc act ctc att gag gag cac aac tct gag gaa aac ctg gat gtc ctg 1872 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 aca tcc ctt ggt gta atg ttg gaa agc ggg aag gtg ctt ccc gct tac 1920 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 cga tgt gtt gta tgc ttg aat aca acc cag cag cag ccc aag cta tct 1968 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 cca aaa att ctt aac ttg gaa gtt gac cct gca tgc gag gtt aac ccc 2016 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro 660 665 670 tat gat gga aag tcg ttg ttc cac ggt ccg ctt ttg caa ttc gtt caa 2064 Tyr Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 675 680 685 caa gtg ttg cac tca agt acc aaa ggc ctc gtt gcc aag tgc cgc gcg 2112 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg Ala 690 695 700 ctt cca atc aaa gaa gcc atc cga ggg cca ttt atc aag caa aca ctc 2160 Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln Thr Leu 705 710 715 720 cat gat cca att cta gac gac gtc att ttt cag cta atg ctc gtg tgg 2208 His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met Leu Val Trp 725 730 735 tgt cgt aat gct cta gga agt gca tcg cta ccc aac aga att gaa aag 2256 Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Glu Lys 740 745 750 atg tca tac ttt ggg aat gtc tca gaa ggt agc act ttc ttt gcc tca 2304 Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser Thr Phe Phe Ala Ser 755 760 765 gtt aca cct gtg gga cca aga gta cca aag gat ccc gtg atc aaa atg 2352 Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys Asp Pro Val Ile Lys Met 770 775 780 cag ttt ctt ctc caa gat gaa tcc ggc aac aca ttt tca tcg ggg gag 2400 Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu 785 790 795 800 ggc tcg gtt gtg ctt agt gac gaa ctc gtc ttt 2433 Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu Leu Val Phe 805 810 <210> 50 <211> 811 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 50 Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr Arg Phe Ala 1 5 10 15 Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys Ser Thr Val Ser 20 25 30 His Asp Arg Pro Val 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Glu Ala Ala Asp Leu Phe Leu Val 245 250 255 Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val Arg Glu Ile Ala 260 265 270 Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val Gly Arg Ser Glu Met 275 280 285 Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His Tyr Asn Lys Asp Leu Asp 290 295 300 Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala Thr His Ala Ala Gly Gly Val 305 310 315 320 Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly 325 330 335 Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala 340 345 350 Asn Val Glu Tyr Ile Ala Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg 355 360 365 Gln Leu Val Gln Arg Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly 370 375 380 Ile Trp His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys 385 390 395 400 Thr Thr Asp Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu 405 410 415 Val Asn Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp 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Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac 1536 Ala Ala Arg Asp Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp 500 505 510 ttg gag ttt ctc cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt 1584 Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys 515 520 525 ttt gtg gag agt gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg 1632 Phe Val Glu Ser Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu 530 535 540 aca cca gaa gat atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg 1680 Thr Pro Glu Asp Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr 545 550 555 560 atg gac cga gca att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta 1728 Met Asp Arg Ala Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val 565 570 575 gca gtt ctt gtt ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga 1776 Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg 580 585 590 gca aga gtc gcg ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac 1824 Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp 595 600 605 act gca att ctc cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act 1872 Thr Ala Ile Leu Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr 610 615 620 tcg act tca tac aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att 1920 Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile 625 630 635 640 tcg tct cag tgg gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga 1968 Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly 645 650 655 aat aat tcc gtg tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag 2016 Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln 660 665 670 gtt aac cga gtt gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga 2064 Val Asn Arg Val Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly 675 680 685 agc gcc gaa agt ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag 2112 Ser Ala Glu Ser Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys 690 695 700 cta agt cat cca tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc 2160 Leu Ser His Pro Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe 705 710 715 720 gca ggt gag ggc tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt 2208 Ala Gly Glu Gly Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys 725 730 735 gct cct cag gaa aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat 2256 Ala Pro Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp 740 745 750 aaa gag cct act agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg 2304 Lys Glu Pro Thr Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser 755 760 765 agt ctc tcc gat att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg 2352 Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg 770 775 780 ttt gca gca ttc gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc 2400 Phe Ala Ala Phe Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala 785 790 795 800 cag cta aaa gga ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc 2448 Gln Leu Lys Gly Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly 805 810 815 gta gcg gtg gga agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct 2496 Val Ala Val Gly Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala 820 825 830 aca gga gcg gca agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc 2544 Thr Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg 835 840 845 tac ctt ccg gca tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc 2592 Tyr Leu Pro Ala Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala 850 855 860 tgg ggc tca aac atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa 2640 Trp Gly Ser Asn Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys 865 870 875 880 aac cag aat gaa aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct 2688 Asn Gln Asn Glu Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser 885 890 895 cat aca tgc ttt tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag 2736 His Thr Cys Phe Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu 900 905 910 cac aat cga acg tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata 2784 His Asn Arg Thr Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile 915 920 925 cac gga ttc gat gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc 2832 His Gly Phe Asp Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu 930 935 940 ctt gaa ctt gtt gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa 2880 Leu Glu Leu Val Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys 945 950 955 960 ctg att gga caa agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca 2928 Leu Ile Gly Gln Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr 965 970 975 ctt tcg ctt gtg tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt 2976 Leu Ser Leu Val Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu 980 985 990 gct atc aaa gga gta caa cga agc atg tta aca ggg aag gat tgg gtc 3024 Ala Ile Lys Gly Val Gln Arg Ser Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val 995 1000 1005 agt cca tca gga agt tgt ttt gcc cca aat ccg tta tca agc gca 3069 Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala 1010 1015 1020 aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc cga agc ccg tac tgt ggt 3114 Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Cys Gly 1025 1030 1035 gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc ggt ctc cat gaa aat 3159 Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro Gly Leu His Glu Asn 1040 1045 1050 gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa gga gat ggt tgg 3204 Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu Gly Asp Gly Trp 1055 1060 1065 tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca aaa gcc atc 3249 Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct ggg att 3294 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc ggt 3339 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 3384 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa 3429 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 atg acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt 3474 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 gct atc aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga 3519 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 gga gct ccc tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc 3564 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 aca aga gaa gaa gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat 3609 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 gta cgt ctg ctt att gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct 3654 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 gga aaa cca gac gcc tgt cag gca gta atc agt aga cta aac tcc 3699 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 aag ttc cct tct ctg ccg gta aag caa gga atg att ggt cat tgc 3744 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa gat att ggg tac atc cat gaa 3789 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg gat tgt cag ctt ttc tca 3834 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp Cys Gln Leu Phe Ser 1265 1270 1275 gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc aca atg gaa atc aaa 3879 Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser Thr Met Glu Ile Lys 1280 1285 1290 cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca gac ttt cct caa 3924 His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Phe Pro Gln 1295 1300 1305 atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta ttt ctt gag 3969 Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val Phe Leu Glu 1310 1315 1320 ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac att ctt 4014 Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn Ile Leu 1325 1330 1335 ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa gga 4059 Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys Gly 1340 1345 1350 cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 4104 His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 1355 1360 1365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca 4149 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro 1370 1375 1380 aat ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg 4194 Asn Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val 1385 1390 1395 gaa gat aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa 4239 Glu Asp Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu 1400 1405 1410 aaa gaa atg att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc 4284 Lys Glu Met Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro 1415 1420 1425 gct cca agt gaa gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att 4329 Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile 1430 1435 1440 cga tct gct gcg gcg cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc 4374 Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser 1445 1450 1455 cat agc cat gaa gaa aat aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag 4419 His Ser His Glu Glu Asn Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys 1460 1465 1470 ctt gat tct gtg tcc gtc gcc ata aat ttc gac aat gat gac cgc 4464 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt cgg gag atg tac aat aca aga 4509 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca tct gca 4554 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc tat 4599 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 4644 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt 4689 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 att cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat 4734 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 ttg ttc ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt 4779 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 aca acg cta aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt 4824 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 gtt cgg cgc caa gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att 4869 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 gct aaa gta tct agg aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg 4914 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 gca cct caa atc atc ctc gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att 4959 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 tca tct gac caa gcg cgt atg gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac 5004 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 gac atc gca gtc gaa gcc gac tct ggt ggg cac acg gat aat cgg 5049 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata att caa ctc cgc aat act 5094 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct ttt cgt acc cgt ata 5139 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg gcc ctc gca gcc 5184 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc ata aat caa 5229 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag cta ctt 5274 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca gac 5319 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 5364 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac 5409 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 tac gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg 5454 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 gaa aac atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa 5499 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 aca aag cgc ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att 5544 Thr Lys Arg Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile 1835 1840 1845 gca agg gcc atg aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt 5589 Ala Arg Ala Met Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe 1850 1855 1860 cgg tgg tat ctc tcc aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att 5634 Arg Trp Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile 1865 1870 1875 aaa tct cgt gca ctc gac tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg 5679 Lys Ser Arg Ala Leu Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met 1880 1885 1890 ggc tcg ttc aac aat ttc gcc agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa 5724 Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys 1895 1900 1905 gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt gcg gaa gta aac atg gcc att 5769 Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val Ala Glu Val Asn Met Ala Ile 1910 1915 1920 tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct aaa cga aat taa 5808 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asn 1925 1930 1935 <210> 52 <211> 1935 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 52 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser 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Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Arg Asp Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp 500 505 510 Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys 515 520 525 Phe Val Glu Ser Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu 530 535 540 Thr Pro Glu Asp Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr 545 550 555 560 Met Asp Arg Ala Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val 565 570 575 Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg 580 585 590 Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp 595 600 605 Thr Ala Ile Leu Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr 610 615 620 Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile 625 630 635 640 Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly 645 650 655 Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln 660 665 670 Val Asn Arg Val Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly 675 680 685 Ser Ala Glu Ser Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys 690 695 700 Leu Ser His Pro Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe 705 710 715 720 Ala Gly Glu Gly Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys 725 730 735 Ala Pro Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp 740 745 750 Lys Glu Pro Thr Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser 755 760 765 Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg 770 775 780 Phe Ala Ala Phe Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala 785 790 795 800 Gln Leu Lys Gly Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly 805 810 815 Val Ala Val Gly Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala 820 825 830 Thr Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg 835 840 845 Tyr Leu Pro Ala Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala 850 855 860 Trp Gly Ser 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Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp 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1465 1470 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 Thr Lys Arg Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile 1835 1840 1845 Ala Arg Ala Met Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe 1850 1855 1860 Arg Trp Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile 1865 1870 1875 Lys Ser Arg Ala Leu Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met 1880 1885 1890 Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys 1895 1900 1905 Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val Ala Glu Val Asn Met Ala Ile 1910 1915 1920 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asn 1925 1930 1935 <210> 53 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1500) <223> n = a c t or g <400> 53 atg caa ctt cct cca gcg cat tct gcc gat gag aat cgc atc gcg gtc 48 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 gtg ggc atg gcc gtc aaa tat gcg ggc tgt gac aat aaa gaa gag ttt 96 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 tgg aag act ttg atg aat ggt agt atc aat acc aag tcg att tcg gca 144 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 gca agg ttg ggc agc aat aag cgt gac gaa cac tat gtt cct gaa cga 192 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 tcg aaa tat gca gat acg ttc tgt aac gaa agg tac ggt tgt atc cag 240 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 caa ggt acg gat aat gag cat gac ctc ctc cta ggt ctt gct caa gaa 288 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 gct ctc gct gac gct gcc ggg cgg atg gag aaa caa cct tcg gag gcg 336 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 ttc gat ctg gaa aat act ggc atc gtg agt ggg tgc tta tct ttt cca 384 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 atg gat aac ctg caa gga gag ttg ttg aac ttg tat caa agc cat gtg 432 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 gag aaa caa ctt cca cct agt gcc ttg gta gaa gcc gtg aag ctt tgg 480 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 tct gag cga cag aaa tct acg aaa gca cat gca ggg gac aag cgc cgg 528 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 ttc att gac cca gct tct ttt gta gct gat aaa ctg aac cta ggc cca 576 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 cta cat tat gcg atc gat gca gca tgc gct tct gca ttg tac gtg tta 624 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 aaa tta gct caa gac cac ctt gtt tca ggt gcc gtt gat atg atg tta 672 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 tgt gga gcg acg tgc ttc cca gaa cca ttc ttc atc ttg tct ggg ttc 720 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 tcg act ttt caa gcg atg cct gnt ggg gca gat gga gtc tca cta cct 768 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 ctc cat aaa acg agt gct ggg ctc act cca ggt gaa ggg ggg tcc att 816 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 atg gtg ctc aag cga ctg aaa gac gct atc aga gat gga aat cac att 864 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 tat ggt gtg ctc ctt gaa gca aat tta agt aac gca ggt tgt ggg ctt 912 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 cca ctc agc ccg cac tta ccg agc gaa gaa tca tgt att cgt gat acc 960 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 tac cgc cgt gct gga gtt gct gca gat caa agt att cag tat att gag 1008 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 tgc cac gct acg gga acc cct cga ggg gat gtc gtg gaa att gag gcg 1056 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac 1500 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 54 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 54 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 55 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 55 tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac ttg gag ttt ctc 48 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt ttt gtg gag agt 96 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg aca cca gaa gat 144 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg atg gac cga gca 192 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta gca gtt ctt gtt 240 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga gca aga gtc gcg 288 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac act gca att ctc 336 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act tcg act tca tac 384 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att tcg tct cag tgg 432 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga aat aat tcc gtg 480 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag gtt aac cga gtt 528 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga agc gcc gaa agt 576 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag cta agt cat cca 624 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc gca ggt gag ggc 672 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt gct cct cag gaa 720 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat aaa gag cct act 768 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg agt ctc tcc gat 816 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg ttt gca gca ttc 864 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc cag cta aaa gga 912 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc gta gcg gtg gga 960 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct aca gga gcg gca 1008 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc tac ctt ccg gca 1056 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc tgg ggc tca aac 1104 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa aac cag aat gaa 1152 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct cat aca tgc ttt 1200 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag cac aat cga acg 1248 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata cac gga ttc gat 1296 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc ctt gaa ctt gtt 1344 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa ctg att gga caa 1392 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca ctt tcg ctt gtg 1440 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt gct atc aaa gga 1488 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 gta caa cga agc 1500 Val Gln Arg Ser 500 <210> 56 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 56 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 Val Gln Arg Ser 500 <210> 57 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 57 atg tta aca ggg aag gat tgg gtc agt cca tca gga agt tgt ttt gcc 48 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 cca aat ccg tta tca agc gca aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc 96 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 cga agc ccg tac tgt ggt gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc 144 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 ggt ctc cat gaa aat gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa 192 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 gga gat ggt tgg tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca 240 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 aaa gcc atc gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct 288 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 ggg att ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc 336 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 ggt gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 384 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa atg 432 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt gct atc 480 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga gga gct ccc 528 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc aca aga gaa gaa 576 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat gta cgt ctg ctt att 624 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct gga aaa cca gac gcc tgt 672 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 cag gca gta atc agt aga cta aac tcc aag ttc cct tct ctg ccg gta 720 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 aag caa gga atg att ggt cat tgc cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa 768 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 gat att ggg tac atc cat gaa aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg 816 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 gat tgt cag ctt ttc tca gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc 864 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 aca atg gaa atc aaa cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca 912 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 gac ttt cct caa atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta 960 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 ttt ctt gag ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac 1008 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 att ctt ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa 1056 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 gga cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 1104 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca aat 1152 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg gaa gat 1200 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa aaa gaa atg 1248 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc gct cca agt gaa 1296 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att cga tct gct gcg gcg 1344 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc cat agc cat gaa gaa aat 1392 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag ctt gat tct gtg tcc gtc gcc 1440 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 ata aat ttc gac aat gat gac cgc att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt 1488 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 cgg gag atg tac 1500 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 58 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 58 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 59 <211> 1305 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <400> 59 aat aca aga tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca 48 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 1 5 10 15 tct gca gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc 96 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser 20 25 30 tat gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 144 Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 35 40 45 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt att 192 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 50 55 60 cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat ttg ttc 240 His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt aca acg cta 288 Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe Thr Thr Leu 85 90 95 aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt gtt cgg cgc caa 336 Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Val Arg Arg Gln 100 105 110 gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att gct aaa gta tct agg 384 Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile Ala Lys Val Ser Arg 115 120 125 aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg gca cct caa atc atc ctc 432 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro Ala Pro Gln Ile Ile Leu 130 135 140 gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att tca tct gac caa gcg cgt atg 480 Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met 145 150 155 160 gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac gac atc gca gtc gaa gcc gac tct 528 Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 165 170 175 ggt ggg cac acg gat aat cgg cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata 576 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile 180 185 190 att caa ctc cgc aat act ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct 624 Ile Gln Leu Arg Asn Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala 195 200 205 ttt cgt acc cgt ata ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg 672 Phe Arg Thr Arg Ile Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala 210 215 220 gcc ctc gca gcc ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc 720 Ala Leu Ala Ala Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser 225 230 235 240 ata aat caa att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag 768 Ile Asn Gln Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu 245 250 255 cta ctt gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca 816 Leu Leu Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala 260 265 270 gac atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 864 Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 275 280 285 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac tac 912 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn Tyr 290 295 300 gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg gaa aac 960 Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Glu Asn 305 310 315 320 atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa aca aag cgc 1008 Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu Thr Lys Arg 325 330 335 ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att gca agg gcc atg 1056 Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile Ala Arg Ala Met 340 345 350 aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt cgg tgg tat ctc tcc 1104 Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 355 360 365 aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att aaa tct cgt gca ctc gac 1152 Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Asp 370 375 380 tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg ggc tcg ttc aac aat ttc gcc 1200 Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala 385 390 395 400 agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt 1248 Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val 405 410 415 gcg gaa gta aac atg gcc att tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct 1296 Ala Glu Val Asn Met Ala Ile Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala 420 425 430 aaa cga aat 1305 Lys Arg Asn 435 <210> 60 <211> 435 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 60 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 1 5 10 15 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser 20 25 30 Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 35 40 45 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 50 55 60 His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe Thr Thr Leu 85 90 95 Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Val Arg Arg Gln 100 105 110 Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile Ala Lys Val Ser Arg 115 120 125 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro Ala Pro Gln Ile Ile Leu 130 135 140 Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met 145 150 155 160 Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 165 170 175 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile 180 185 190 Ile Gln Leu Arg Asn Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala 195 200 205 Phe Arg Thr Arg Ile Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala 210 215 220 Ala Leu Ala Ala Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ile Asn Gln Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu 245 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aag gtg ccg gct tgg gag atg agc 48 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 aag tcc gag ctg tgt gat gac cgc acg gta gtc ttt gac tat gag gag 96 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 ctg ctg gag ttc gct gag ggc gat atc agt aag gtt ttt ggg ccg gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc aaa gtg gtg gac ggg ttt agg cgc agg gtg agg ttg ccc gct cga 192 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctg gtg acc cgg gtt acg ctg atg gat gcc gag gtg ggc 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 aac ttt cga gtg gga gca cgt atg gtg aca gag tat gac gta cct gtg 288 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcg gaa ggg gga gat gtg ccg tgg gct gtg ttg gtg 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gaa gcc ggg cag tgc gac ttg ctg cta att tct tac atg ggc atc gat 384 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag tgc aaa gga gag cgg gtc tac cgg ctg ctg aac acc acc ttg 432 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acg ttt ttt ggc gtc gcg aaa gaa ggg gaa acg ctt gtg tac gat att 480 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acg ggt ttc gcc aag agg ccg gac gga gat atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttt ttc gaa tat gat tgc tac tgc aat ggc aag ctt ctc atc gaa atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cga gat ggc tct gca ggc ttc ttc acg gac gaa gag ctc gct gcc ggc 624 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 aaa gga gtg gtc gtc act cgt gca cag caa aac atg cgg gac aaa att 672 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 gta cgg cag tcc att gag cct ttt gca ctg gcg gct tgc acg cac aaa 720 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 acg act ctg aac gag agt gac atg cag tcc ctt gtg gag cga aac tgg 768 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 gca aac gtt ttt ggc acc agt aac aag atg gcg gag ctc aac tat aaa 816 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 att tgc gcc agg aaa atg ctc atg atc gac agg gtt acc cac att gac 864 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 cac cac ggt ggg gcg tat ggc ctc gga cta ctt gtt gga gag aag atc 912 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ttg gat cga aac cat tgg tac ttt cct tgt cac ttt gtc aat gat caa 960 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gca ggg tca ctg gtc agc gat ggt tgc agc cag ctc tta aaa 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 ctc tat atg atc tgg ctt ggc ctc cac ctg aaa atg gag gaa ttt gat 1056 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 ttt ctc cca gtt agc ggc cac aaa aac aag gtg cga tgc agg gga caa 1104 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 att tca ccg cat aaa ggc aag ctt gtc tac gtc atg gaa atc aaa aag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 atg ggt tac gat caa gca tct gga agc cca tac gcc atc gcg gac gtt 1200 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 gat atc att gac gtc aac gaa gag ctg ggt caa agt ttt gac atc aac 1248 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 gac ctt gcg agc tac gga aaa ggt gac ctg agc aaa aaa atc gtg gtt 1296 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac cct acg ccg ttc ttc tcc cct tca tct tac cct ccg 1536 Leu Pro Gly Asn Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro 500 505 510 agg gca att tgc ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac 1584 Arg Ala Ile Cys Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn 515 520 525 tgc aag gct gga gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc 1632 Cys Lys Ala Gly Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe 530 535 540 atg tgt ggc aag gtt tct aac tgc ttg ggc cca gaa ttc gca cgc ttt 1680 Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe 545 550 555 560 gac aag tcg aac acc agc cgg agc cct gct ttt gac ttg gct ctg gtg 1728 Asp Lys Ser Asn Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val 565 570 575 acc cga gtt gtt gaa gtc aca aac atg gaa cac ggc aag ttt cta aac 1776 Thr Arg Val Val Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn 580 585 590 gtt gat tgc aat cca agc aaa ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt 1824 Val Asp Cys Asn Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys 595 600 605 ccc caa gac gcg tgg ttc ttt gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg 1872 Pro Gln Asp Ala Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met 610 615 620 ccg tat tcc att atc atg gaa atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc 1920 Pro Tyr Ser Ile Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu 625 630 635 640 acc tcg gtg ttg aag gca ccg ctg act atg gac aag gat gac att ctc 1968 Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu 645 650 655 ttt cga aac ctc gat gca agt gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat 2016 Phe Arg Asn Leu Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp 660 665 670 gtt cgc ggc aaa acg att cga aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca 2064 Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala 675 680 685 atg ttg gga aag atg ggg att cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt 2112 Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val 690 695 700 gac ggc gtg gta ttt tat aaa gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act 2160 Asp Gly Val Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr 705 710 715 720 ccc gag gtg ttt gct cag caa gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg 2208 Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr 725 730 735 gag ccc tgg tgc aag act aac aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc 2256 Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile 740 745 750 gca tcc gcc aaa gga aaa gag cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca 2304 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 act aat gct caa gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat 2352 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 tac ctc aat att gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc 2400 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 cac gga cac aaa gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac 2448 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 ttt tgg ttc gat cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg 2496 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 ttc cag ctt atc gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag 2544 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 tac aac gta tcc aat ccg acc ttt gcc cat gca cca ggc aaa acg gcg 2592 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 tgg aaa tac cga ggc cag ctc aca cca aag aac cgt gcg atg gac tgc 2640 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 gag gtg cat atc gtt tca att acc gcc tcc ccc gag aac ggg ggc tac 2688 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 gtt gac atc gtg gcc gat gga gcg ctt tgg gta gat gga ctt cgc gtg 2736 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val 900 905 910 tac gaa gcc aaa gag ctt cga gtt cgt gtc gtt tcg gca aaa cct caa 2784 Tyr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln 915 920 925 gca att ccg gat gta caa caa cag cca cct agc gca aag gcg gac ccg 2832 Ala Ile Pro Asp Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro 930 935 940 ggg aaa aca gga gtt gca ctt tcg ccc act cag cta cgc gac gtc ctg 2880 Gly Lys Thr Gly Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu 945 950 955 960 ctt gaa gtg gac aat cca ttg tat ctt ggt gta gag aac tcc aat ttg 2928 Leu Glu Val Asp Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu 965 970 975 gtg cag ttt gag tcg aaa cct gca act tct tca cgt atc gtt tcg atc 2976 Val Gln Phe Glu Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile 980 985 990 aaa ccg tgc tcg att agt gac ctt ggc gat aag tct ttt atg gaa acg 3024 Lys Pro Cys Ser Ile Ser Asp Leu Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr 995 1000 1005 tac aac gtg tca gca cct ctg tat act gga gca atg gcc aag ggc 3069 Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly 1010 1015 1020 att gca tcc gcc gac ttg gtc att gct gct ggg aaa cgc aag ata 3114 Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile 1025 1030 1035 ctt gga tcg ttt ggt gcg gga ggg ctg cct att tcc ata gtc cgt 3159 Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ile Ser Ile Val Arg 1040 1045 1050 gaa gca ctg gag aaa att caa caa cac ctg ccc cac ggc ccc tac 3204 Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro His Gly Pro Tyr 1055 1060 1065 gct gtt aac ctc att cac tcg cct ttc gac agc aac ttg gaa aag 3249 Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys 1070 1075 1080 ggc aac gtt gac ctc ttt ctc gag atg ggc gtg aca gtg gta gaa 3294 Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val Val Glu 1085 1090 1095 tgc agc gcg ttc atg gaa ctc acg gcc cag gtt gtc cgg tac cgc 3339 Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr Arg 1100 1105 1110 gcg tct ggt cta agc aaa agt gcg gac ggt tcg att cgc att gct 3384 Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 1115 1120 1125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg 3429 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 1130 1135 1140 ttt att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc 3474 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala 1145 1150 1155 tcc ggc gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt 3519 Ser Gly Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val 1160 1165 1170 ccg gtg gcg gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat 3564 Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 1175 1180 1185 acc gac aac agg cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac 3609 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn 1190 1195 1200 cta cgc aac cgt ttg cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc 3654 Leu Arg Asn Arg Leu His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu 1205 1210 1215 cgg gta cgt gtg ggt gct ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc 3699 Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 1220 1225 1230 gct ctt gca gca ttt caa atg ggg gca gcg ttt tta atc act gga 3744 Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly 1235 1240 1245 acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa agt ggc act tgt gac aac gtc 3789 Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val 1250 1255 1260 cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat agc gac gtg tgt atg gct 3834 Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala 1265 1270 1275 cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg gag ctg caa gta ttg 3879 Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu 1280 1285 1290 aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag aag ctg tac gag 3924 Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Tyr Glu 1295 1300 1305 ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg gct gaa gaa 3969 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt gct gaa 4014 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag aac 4059 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 4104 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc 4149 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 aac tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt 4194 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 ggc cct gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac 4239 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 ctt gac gtg act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc 4284 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 aat ttg caa att ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt 4329 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 gtc att cgt ttt gac cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac 4374 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 gat cct gta ttt act tac gtg ccg acc cag cca ctt 4410 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 62 <211> 1470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 62 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp 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Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 att tca ccg cat aaa ggc aag ctt gtc tac gtc atg gaa atc aaa aag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 atg ggt tac gat caa gca tct gga agc cca tac gcc atc gcg gac gtt 1200 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 gat atc att gac gtc aac gaa gag ctg ggt caa agt ttt gac atc aac 1248 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 gac ctt gcg agc tac gga aaa ggt gac ctg agc aaa aaa atc gtg gtt 1296 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac 1500 Leu Pro Gly Asn 500 <210> 64 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 64 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 Leu Pro Gly Asn 500 <210> 65 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 65 cct acg ccg ttc ttc tcc cct tca tct tac cct ccg agg gca att tgc 48 Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Ala Ile Cys 1 5 10 15 ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac tgc aag gct gga 96 Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn Cys Lys Ala Gly 20 25 30 gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc atg tgt ggc aag 144 Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys 35 40 45 gtt tct aac tgc ttg ggc cca gaa ttc gca cgc ttt gac aag tcg aac 192 Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Ser Asn 50 55 60 acc agc cgg agc cct gct ttt gac ttg gct ctg gtg acc cga gtt gtt 240 Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Val 65 70 75 80 gaa gtc aca aac atg gaa cac ggc aag ttt cta aac gtt gat tgc aat 288 Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn 85 90 95 cca agc aaa ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt ccc caa gac gcg 336 Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala 100 105 110 tgg ttc ttt gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg ccg tat tcc att 384 Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile 115 120 125 atc atg gaa atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc acc tcg gtg ttg 432 Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu 130 135 140 aag gca ccg ctg act atg gac aag gat gac att ctc ttt cga aac ctc 480 Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu 145 150 155 160 gat gca agt gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat gtt cgc ggc aaa 528 Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys 165 170 175 acg att cga aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca atg ttg gga aag 576 Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys 180 185 190 atg ggg att cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt gac ggc gtg gta 624 Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val 195 200 205 ttt tat aaa gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act ccc gag gtg ttt 672 Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe 210 215 220 gct cag caa gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg gag ccc tgg tgc 720 Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys 225 230 235 240 aag act aac aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc gca tcc gcc aaa 768 Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys 245 250 255 gga aaa gag cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca act aat gct caa 816 Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln 260 265 270 gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat tac ctc aat att 864 Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile 275 280 285 gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc cac gga cac aaa 912 Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys 290 295 300 gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac ttt tgg ttc gat 960 Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp 305 310 315 320 cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg ttc cag ctt atc 1008 Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Ile 325 330 335 gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag tac aac gta tcc 1056 Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Asn Val Ser 340 345 350 aat ccg acc ttt gcc cat gca 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ttg tat ctt ggt gta gag aac tcc aat ttg gtg cag ttt gag 1440 Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu Val Gln Phe Glu 465 470 475 480 tcg aaa cct gca act tct tca cgt atc gtt tcg atc aaa ccg tgc tcg 1488 Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile Lys Pro Cys Ser 485 490 495 att agt gac ctt 1500 Ile Ser Asp Leu 500 <210> 66 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 66 Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Ala Ile Cys 1 5 10 15 Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn Cys Lys Ala Gly 20 25 30 Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys 35 40 45 Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Ser Asn 50 55 60 Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Val 65 70 75 80 Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn 85 90 95 Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala 100 105 110 Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile 115 120 125 Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu 130 135 140 Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu 145 150 155 160 Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys 165 170 175 Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys 180 185 190 Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val 195 200 205 Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe 210 215 220 Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys 225 230 235 240 Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys 245 250 255 Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln 260 265 270 Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile 275 280 285 Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys 290 295 300 Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp 305 310 315 320 Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Ile 325 330 335 Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Asn Val Ser 340 345 350 Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala Trp Lys Tyr Arg 355 360 365 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys Glu Val His Ile 370 375 380 Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Asp Ile Val 385 390 395 400 Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Glu Ala Lys 405 410 415 Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln Ala Ile Pro Asp 420 425 430 Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro Gly Lys Thr Gly 435 440 445 Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu Leu Glu Val Asp 450 455 460 Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu Val Gln Phe Glu 465 470 475 480 Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile Lys Pro Cys Ser 485 490 495 Ile Ser Asp Leu 500 <210> 67 <211> 1410 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 67 ggc gat aag tct ttt atg gaa acg tac aac gtg tca gca cct ctg tat 48 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro 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115 120 125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg ttt 432 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe 130 135 140 att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc tcc ggc 480 Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt ccg gtg gcg 528 Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val Pro Val Ala 165 170 175 gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat acc gac aac agg 576 Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 180 185 190 cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac cta cgc aac cgt ttg 624 Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu 195 200 205 cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc cgg gta cgt gtg ggt gct 672 His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala 210 215 220 ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc gct ctt gca gca ttt caa atg 720 Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met 225 230 235 240 ggg gca gcg ttt tta atc act gga acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa 768 Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu 245 250 255 agt ggc act tgt gac aac gtc cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat 816 Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr 260 265 270 agc gac gtg tgt atg gct cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg 864 Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val 275 280 285 gag ctg caa gta ttg aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag 912 Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys 290 295 300 aag ctg tac gag ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg 960 Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro 305 310 315 320 gct gaa gaa ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt 1008 Ala Glu Glu Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu 325 330 335 gct gaa gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag 1056 Ala Glu Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys 340 345 350 aac cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 1104 Asn Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 355 360 365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc aac 1152 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn 370 375 380 tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt ggc cct 1200 Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro 385 390 395 400 gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac ctt gac gtg 1248 Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Val 405 410 415 act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc aat ttg caa att 1296 Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile Asn Leu Gln Ile 420 425 430 ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt gtc att cgt ttt gac 1344 Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Ile Arg Phe Asp 435 440 445 cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac gat cct gta ttt act tac 1392 Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp Asp Pro Val Phe Thr Tyr 450 455 460 gtg ccg acc cag cca ctt 1410 Val Pro Thr Gln Pro Leu 465 470 <210> 68 <211> 470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 68 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 35 40 45 Ile Ser Ile Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro 50 55 60 His Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val 85 90 95 Val Glu Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr 100 105 110 Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 115 120 125 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe 130 135 140 Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val Pro Val 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gagaaaaagc tcggggcccg cgtcttcaag gacgcctccc attggtccga acgcgagcag 480 tccaacaaac ccgaggccgg tgaccgccgc atcttcatgg acccggcctc cttcgtcgcc 540 gaagaactca acctcggcgc ccttcactac tccgtcgacg cagcatgcgc cacggcgctc 600 tacgtgctcc gcctcgcgca ggatcatctc gtctccggcg ccgccgacgt catgctctgc 660 ggtgccacct gcctgccgga gccctttttc atcctttcgg gcttttccac cttccaggcc 720 atgcccgtcg gcacgggcca gaacgtgtcc atgccgctgc acaaggacag ccagggcctc 780 accccgggtg agggcggctc catcatggtc ctcaagcgtc tcgatgatgc catccgcgac 840 ggcgaccaca tctacggcac ccttctcggc gccaatgtca gcaactccgg cacaggtctg 900 cccctcaagc cccttctccc cagcgagaaa aagtgcctca tggacaccta cacgcgcatt 960 aacgtgcacc cgcacaagat tcagtacgtc gagtgccacg ccaccggcac gccccagggt 1020 gatcgtgtgg aaatcgacgc cgtcaaggcc tgctttgaag gcaaggtccc ccgtttcggt 1080 accacaaagg gcaactttgg acacaccctc gtcgcagccg gctttgccgg tatgtgcaag 1140 gtcctcctct ccatgaagca tggcatcatc ccgcccaccc cgggtatcga tgacgagacc 1200 aagatggacc ctctcgtcgt ctccggtgag gccatcccat ggccagagac caacggcgag 1260 cccaagcgcg 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gat tgc aat cca agc aaa 1872 Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn Pro Ser Lys 610 615 620 ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt ccc caa gac gcg tgg ttc ttt 1920 Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala Trp Phe Phe 625 630 635 640 gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg ccg tat tcc att atc atg gaa 1968 Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile Ile Met Glu 645 650 655 atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc acc tcg gtg ttg aag gca ccg 2016 Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro 660 665 670 ctg act atg gac aag gat gac att ctc ttt cga aac ctc gat gca agt 2064 Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Ser 675 680 685 gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat gtt cgc ggc aaa acg att cga 2112 Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg 690 695 700 aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca atg ttg gga aag atg ggg att 2160 Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys Met Gly Ile 705 710 715 720 cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt gac ggc gtg gta ttt tat aaa 2208 His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val Phe Tyr Lys 725 730 735 gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act ccc gag gtg ttt gct cag caa 2256 Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln 740 745 750 gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg gag ccc tgg tgc aag act aac 2304 Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn 755 760 765 aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc gca tcc gcc aaa gga aaa gag 2352 Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu 770 775 780 cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca act aat gct caa gtt ctt cgg 2400 Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg 785 790 795 800 cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat tac ctc aat att gcc cct gac 2448 Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp 805 810 815 tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc cac gga cac aaa gac gtt aac 2496 Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys Asp Val Asn 820 825 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gccagcagcg cagcggagga 1680 agagcgcgca ggcgcggcgg gagggcggcc gcggagcagc gcagagcggg gcggagcagc 1740 gcggagcaga acgggcagac tcggagcggg cagggcgggc agagctttgg ggtttaagga 1800 ccgggttacc ggcgaagtga gcggctgcgg ggagcggctg tgggaggggt gagtacgcaa 1860 gcacgatgcg agcgagagag agacgctgcc gcgaatcaag aaggtaggcg cgctgcgagg 1920 cgcggcggcg gagcggagcg agggagaggg agagggagag agagggaggg agacgtcgcc 1980 gcggcggggc ctggcctggc ctggtttggc ttggtcagcg cggccttgtc cgagcgtgca 2040 gctggagttg ggtggattca tttggatttt cttttgtttt tgtttttctc tctttcccgg 2100 aaagtgttgg ccggncggtg ttctttgttt tgatttcttc aaaagttttg gtggttggtt 2160 ctctctcttg gctctctgtc aggcggtccg gtccacgccc cggcctctcc tctcctctcc 2220 tctcctctcc tctccgtgcg tatacgtacg tacgtttgta tacgtacata catcccgccc 2280 gccgtgccgg cgagggtttg ctcagcctgg agcaatgcga tgcgatgcga tgcgatgcga 2340 cgcgacgcga cgcgagtcac tggttcgcgc tgtggctgtg gcttgcttgc ttacttgctt 2400 tcgagctctc ccgctttctt ctttccttct cacgccacca ccaacgaaag aagatcggcc 2460 ccggcacgcc gctgagaagg gctggcggcg atgacggcac gcgcgcccgc tgccacgttg 2520 gcgctcgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgcttct 2580 gcgcgcaggc tttgccacga ggccggcgtg ctggccgctg ccgcttccag tccgcgtgga 2640 gagatcgaat gagagataaa ctggatggat tcatcgaggg atgaatgaac gatggttgga 2700 tgcctttttc ctttttcagg tccacagcgg gaagcaggag cgcgtgaatc tgccgccatc 2760 cgcatacgtc tgcatcgcat cgcatcgcat gcacgcatcg ctcgccggga gccacagacg 2820 ggcgacaggg cggccagcca gccaggcagc cagccaggca ggcaccagag ggccagagag 2880 cgcgcctcac gcacgcgccg cagtgcgcgc atcgctcgca gtgcagacct tgattccccg 2940 cgcggatctc cgcgagcccg aaacgaagag cgccgtacgg gcccatccta gcgtcgcctc 3000 gcaccgcatc gcatcgcatc gcgttcccta gagagtagta ctcgacgaag gcaccatttc 3060 cgcgctcctc ttcggcgcga tcgaggcccc cggcgccgcg acgatcgcgg cggccgcggc 3120 gctggcggcg gccctggcgc tcgcgctggc ggccgccgcg ggcgtctggc cctggcgcgc 3180 gcgggcgccg caggaggagc ggcagcggct gctcgccgcc agagaagagc gcgccgggcc 3240 cggggaggga cggggaggag aaggagaagg cgcgcaaggc ggccccgaaa gagaagaccc 3300 tggacttgaa cgcgaagaag aagaagaagg agaagaagtt gaagaagaag aagaagaagg 3360 agaggaagtt gaagaagacg aggagcaggc gcgttccaag gcgcgttctc ttccggaggc 3420 gcgttccagc tgcggcggcg gggcgggctg cggggcgggc gcgggcgcgg gtgcgggcag 3480 aggggacgcg cgcgcggagg cggagggggc cgagcgggag cccctgctgc tgcggggcgc 3540 ccgggccgca ggtgtggcgc gcgcgacgac ggaggcgacg acgccagcgg ccgcgacgac 3600 aaggccggcg gcgtcggcgg gcggaaggcc ccgcgcggag caggggcggg agcaggacaa 3660 ggcgcaggag caggagcagg gccgggagcg ggagcgggag cgggcggcgg agcccgaggc 3720 agaacccaat cgagatccag agcgagcaga ggccggccgc gagcccgagc ccgcgccgca 3780 gatcactagt accgctgcgg aatcacagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 3840 gcagcagcag ccacgagagg gagataaaga aaaagcggca gagacg 3886 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 78 catatggcgc tccgtgtcaa 20 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 79 gccaggaagc tttgacatgg ggtgccagga catct 35 <210> 80 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 80 tcctggcacc ccatgtcaaa gcttcctggc aacccta 37 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 81 agtatacaga ggtgctgaca 20 <210> 82 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 82 gcaccccatg agcaagctcc ccggcaac 28 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 83 gtatacagag gcgcagacac gttgtaag 28 <210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 84 ctgcagccag atgctcaaga tgtacatg 28 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 85 ggagcttgct catggggtgc caggacatct c 31 <210> 86 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 86 ggatccatgg 10 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 87 aagcttgtgc agtcaagtgc gcaaaaccat g 31 <210> 88 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 88 taacccgggt ctaga 15 <210> 89 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 89 gactgctagc ttaagcaagg attttcttaa c 31 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 90 gactggatcc tcctgatgcg gtattttctc c 31 <210> 91 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 91 ctaggcggcc gc 12 <210> 92 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 92 gactactagt ctaagaaacc attattatca t 31 <210> 93 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 93 gactggatcc agctttaaat aatcggtgtc a 31 <210> 94 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 94 gactggatcc gccaccatgt tgcagcatac ttggctacca aaaccc 46 <210> 95 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 95 gacttctaga tcaataatgc cagaattttg gctgc 35

Claims (59)

  1. 제1 다중불포화 지방산 폴리케타이드 신테이즈 (PUFA PKS) 시스템과 비교하여 상이한 비율의 오메가-3 대 오메가-6 PUFA를 생산하는 키메라 PUFA PKS 시스템이 생산되도록, 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 FabA-유사 β-히드록시아실-아실 캐리어(carrier) 단백질 디하이드레이즈(dehydrase)-2 (DH2) 도메인이 상이한 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인으로 교체된 키메라 PUFA PKS 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 포함하는 단백질이 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 포함하는 상동성 단백질로 교체되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 또는 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인이 스키조키트리움(Schizochytrium) 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)으로부터의 DH2 도메인을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  4. 제1항에 있어서, (a) 제1 PUFA PKS 시스템이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 제2 PUFA PKS 시스템이 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템이거나; (b) 제1 PUFA PKS 시스템이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 제2 PUFA PKS 시스템이 상이한 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)로부터의 것이고, 여기서 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 포함하는 OrfC가 상이한 트라우스토키트리드로부터의 DH2 도메인을 포함하는 OrfC로 교체되는 것이거나; (c) 제1 PUFA PKS 시스템이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 제2 PUFA PKS 시스템이 트라우스토키트리움 23B로부터의 것이고, 여기서 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인을 포함하는 OrfC가 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 OrfC로 교체되는 것이거나; 또는 (d) 제1 PUFA PKS 시스템이 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템이고, 제2 PUFA PKS 시스템이 트라우스토키트리움 23B로부터의 것이고, 여기서 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 생산하도록 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfC의 DH2 도메인이 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인으로 교체되는 것인 키메라 PUFA PKS 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC가 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 서열 70을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  7. 제4항에 있어서, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfA가 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA로 교체되거나, 스키조키트리움 PUFA PKS 시스템으로부터의 OrfB가 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfB로 교체되거나, 또는 그의 조합인 키메라 PUFA PKS 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA, OrfB, 또는 그의 조합이 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  9. 제8항에 있어서, OrfA를 코딩하는 핵산 서열이 서열 71을 포함하고 OrfB를 코딩하는 핵산 서열이 서열 72를 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  10. 제4항에 있어서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 키메라 단백질이 서열 73을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  11. 제4항에 있어서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2가 스키조키트리움 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  12. 제4항 또는 제11항에 있어서, 트라우스토키트리움 23B로부터의 DH2 도메인을 포함하는 키메라 단백질이 서열 75를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 키메라 PUFA PKS 시스템이 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  14. 제1항에 있어서, a) 서열 2, 서열 4 및 서열 74; b) 서열 39, 서열 4 및 서열 62; c) 서열 39, 서열 4 및 서열 74; d) 서열 1, 서열 3 및 서열 70; e) 서열 1, 서열 3 및 서열 73; f) 서열 1, 서열 3 및 서열 75; 또는 g) 서열 71, 서열 3 및 서열 70을 포함하는 키메라 PUFA PKS 시스템.
  15. 제1항 또는 제4항의 키메라 다중불포화 지방산 (PUFA) PKS 시스템을 생물에서 발현시키는 것을 포함하는, 제1 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 PUFA의 오메가-3 대 오메가-6 비율을 변경시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 키메라 PUFA PKS 시스템이 미생물 또는 식물에 의해 발현되는 방법.
  17. 제1항, 제4항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항의 키메라 PUFA PKS 시스템을 포함하는, 유전자 변형된 미생물 또는 식물 또는 식물의 일부분.
  18. 제1 다중불포화 지방산 (PUFA) PKS 시스템과 비교하여 상이한 비율의 오메가-3 대 오메가-6 PUFA를 생산하는 키메라 PUFA PKS 시스템이 생산되도록 제1 PUFA PKS 시스템으로부터의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 디하이드레이즈-2 (DH2) 도메인이 상이한 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인으로 교체되고, 제2 PUFA PKS 시스템으로부터의 DH2 도메인이 제1 PUFA PKS 시스템이 유래되는 생물의 코돈 사용빈도에 대해 최적화된 키메라 PUFA PKS 시스템을 생물에서 발현시키는 것을 포함하는, PUFA의 생산을 증가시키고 제1 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 PUFA의 오메가-3 대 오메가-6 비율을 변경시키는 방법.
  19. 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 OrfC 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  20. 제19항의 핵산 분자로 형질감염된 재조합 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 세포가 미생물이거나 식물 세포인 재조합 숙주 세포.
  22. 제20항 또는 제21항의 재조합 숙주 세포를 포함하는, 유전자 변형된 식물 또는 그의 일부분.
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