KR20070084187A - Ｐｕｆａ 폴리케티드 신타제 시스템 및 그의 용도 - Google Patents

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로스 지클
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마텍 바이오싸이언스스 코포레이션
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Abstract

본 발명은, 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나의 박테리아 미생물에서 유래된 완전한 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템, 및 그의 생물학적 활성 단편 및 상동체를 개시한다. 더욱 특히, 본 발명은 이러한 PUFA PKS 시스템, 이러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 단백질 및 그의 도메인, 이러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형된 유기체 (식물 및 미생물), 및 본원에 개시한 PUFA PKS 시스템의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PUFA 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템을 조작하여 각종 다중불포화 지방산 (PUFA) 및 다른 생물활성 분자가 풍부한 지질을 효과적으로 생산하는 유전자 변형 식물 및 미생물, 및 그러한 생산 방법에 관한 것이기도 하다.
다중불포화 지방산, 폴리케티드 신타제 시스템, 유전자 변형, 식물, 미생물

Description

ＰＵＦＡ 폴리케티드 신타제 시스템 및 그의 용도 {PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS AND USES THEREOF}
본 발명은 박테리아 미생물의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 핵산, PUFA PKS 시스템을 포함하는 그의 단백질 및 도메인, 이러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형 유기체, 및 본원에 기술된 PUFA PKS 시스템의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PUFA 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템 조작에 의해 각종 다중불포화 지방산 (PUFA)이 풍부한 지질을 효율적으로 생산하는 유전자 변형 식물과 유전자 변형 미생물 및 그러한 생산 방법에 관한 것이다.
폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템은 일반적으로 지방산 신타제 (FAS) 시스템과 관련이 있는 효소 복합체로서 당업계에 공지되어 있으나, 종종 크게 변형되어서 전형적으로는 지방산과의 유사성이 거의 없는 특이한 생성물이 생산된다. 그러나, 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 다중불포화 지방산 (PUFA)을 합성할 수 있는 해양 박테리아 및 특정 미세조류(microalgae)에 폴리케티드 신타제 시스템이 존재한다는 것이 알려져 있다. 쉐바넬라(Shewanella) 및 또다른 해양 박테리아인 비브리오 마 리누스(Vibrio marinus) 중 PUFA 합성의 PKS 경로는 미국 특허 제6,140,486호에 상세하게 기재되어 있다. 진핵 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 쉬조키트리움(Schizochytrium) 중 PUFA 합성의 PKS 경로는 미국 특허 제6,566,583호에 상세하게 기재되어 있다. 쉬조키트리움 중 PUFA PKS 경로의 완전한 구조적 설명 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 중 PUFA PKS 경로의 확인 및 이들 경로의 이용에 관한 세부사항 등을 비롯하여, 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)의 구성원과 같은 진핵생물 중 PUFA 합성의 PKS 경로는 2002년 12월 19일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 제20020194641호 (2002년 4월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/124,800호에 상응함)에 상세하게 기재되어 있다. 2004년 3월 24일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/810,352호는 트라우스토키트리움 중 PUFA PKS 경로의 완전한 구조적 설명을 기재하고 있고, 추가로 에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3) (EPA) 및 이러한 시스템을 이용하는 다른 PUFA의 생산에 관한 세부사항을 개시하고 있다.
연구가들은 전형적으로 제I형 (모듈형(modular) 또는 반복형(iterative)), 제II형 및 제III형이라고 지칭되는 3종의 기본 유형 중 하나에 속하는 것으로 문헌에 통상 기재되어 왔던 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템 연구를 시도하였다. 명확하게 하기 위해서, 제I형 모듈형 PKS 시스템은 이전에 단순히 "모듈형" PKS 시스템이라고도 지칭되어 왔고, 제I형 반복형 PKS 시스템은 이전에 단순히 "제I형" PKS 시스템이라고도 지칭되어 왔음을 염두에 두어야 한다. 제II형 시스템은 별개의 효소 반응을 수행하는 각각의 구별되는 단백질들을 특징으로 한다. 이 효소들은 함께 작용하여 최종 생성물이 생산되도록 하고, 시스템 중 각 개개의 효소는 전형적 으로 최종 생성물의 생산에 여러회 참여한다. 상기 유형의 시스템은 식물 및 박테리아 중에 존재하는 지방산 신타제 (FAS) 시스템과 유사한 방식으로 작동한다. 제I형 반복형 PKS 시스템은, 효소들이 반복적인 방식으로 이용되어 최종 생성물을 생산한다는 점에서 제II형 시스템과 유사하다. 제I형 반복형은 효소 활성이 별개의 단백질들에 의한 것이 아니라 더 커다란 단백질의 도메인으로서 발휘된다는 점에서 제II형과 차이가 있다. 이 시스템은 동물 및 진균 중 제I형 FAS 시스템과 유사하다.
제II형 시스템과는 달리, 제I형 모듈형 PKS 시스템에서는 각 효소 도메인이 최종 생성물의 생산에 1회씩만 사용된다. 상기 도메인은 매우 큰 단백질에 존재하며 각 반응의 생성물은 PKS 단백질의 또다른 도메인으로 이동된다. 추가로, 상기한 PKS 시스템에서 최종 생성물에 탄소-탄소 이중 결합이 혼입되는 경우, 이것은 통상적으로 트랜스 배위가 된다.
제III형 시스템은 보다 최근에 발견되었고, 축합 효소의 식물 칼콘(chalcone) 신타제 족에 속한다. 제III형 PKS는 제I형 및 제II형 PKS 시스템과 별개이며, 통상적으로 헤테로시클릭 최종 생성물을 생산하기 위한 반복적 축합 반응에서 유리 CoA 기질을 이용한다.
다중불포화 지방산 (PUFA)은 대개의 진핵생물 중 막 지질의 매우 중요한 성분이고 ([Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40 1 (2001)], [McConn et al., Plant J. 15, 521 (1998)]), 특정 호르몬 및 신호전달 분자의 전구체이다 ([Heller et al., Drugs 55, 487 (1998)], [Creelman et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355 (1997)]). PUFA 합성의 공지된 경로는 신장 및 호기성 탈포화 반응에 의해 지방산 신타제 (FAS)로부터 유래되는 16:0 또는 18:0 포화 지방산 (약어 X:Y는 X개의 탄소 원자 및 Y개의 이중 결합 (PUFA 중에서는 통상적으로 시스형)을 함유하는 아실기를 나타냄. PUFA 중 이중 결합 위치는 이중 결합의 전체적 메틸렌 개입과 더불어 지방산 쇄의 메틸 탄소에 대해 표시됨 (예컨대, ω3 또는 ω6))의 프로세싱(processing)을 포함한다 ([Sprecher, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2, 135 (1999)], [Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8284 (2000)], [Shanklin et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 611 (1998)]). 아세틸-CoA에서 출발하는 도코사헥사엔산 (DHA)의 합성에는 대략 30종의 별개의 효소 활성이 필요하고 지방산 합성 주기의 4회 반복 단계를 포함하는 대략 70가지 반응이 필요하다. 폴리케티드 신타제 (PKS)는 FAS와동일한 반응 중 일부를 수행하고 ([Hopwood et al., Annu. Rev. Genet. 24, 37 (1990)], [Bentley et al., Annu. Rev. Microbiol. 53, 411 (1999)]), 동일한 작은 단백질 (또는 도메인)인 아실 운반체 단백질 (ACP)을 탄소 쇄 성장을 위한 공유 부착 부위로서 이용한다. 그러나, 이들 효소 시스템에서는 FAS에서 보여지는 환원, 탈수 및 환원의 완전 주기가 종종 생략되어, 전형적으로 많은 케토기 및 히드록시기를 함유하고 또한 전형적으로 트랜스 배위인 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 고도로 유도체화된 탄소 쇄가 생산된다. PKS의 선형 생성물은 종종 고리화되어 항생제 및 많은 다른 2차 생성물을 비롯한 복잡한 생화학물질을 형성한다 ([Hopwood et al., (1990), (상기 문헌)], [Bentley et al., (1999), (상기 문헌)], [Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598 (1999)]).
도코사헥사엔산 (DHA, 22:6ω3) 및 에이코사펜타엔산 (EPA, 20:5ω3) 등과 같은 매우 장쇄의 PUFA는 쉐바넬라 종을 비롯한 여러가지 종의 해양 박테리아에서 보고된 바 있다 ([Nichols et al., Curr. Op. Biotechnol. 10, 240 (1999)], [Yazawa, Lipids 31, S (1996)], [DeLong et al., Appl. Environ. Microbiol. 51, 730 (1986)]). 쉐바넬라 종 균주 SCRC2738로부터의 게놈 단편 (플라스미드 pEPA로서 클로닝됨)을 분석하여, 이. 콜라이(E. coli)에서의 EPA 생산에 필요충분조건인 전체 20 Kb의 5개 오픈 리딩 프레임(open reading frame, Orf)을 확인하였다 [Yazawa, (1996), (상기 문헌)]. 예측된 단백질 도메인 중 여러개는 FAS 효소의 상동체였지만, 다른 영역은 공지된 기능의 단백질과 상동성이 없는 것으로 나타났다. 5개의 Orf 중 11개 이상의 영역이 추정적 효소 도메인으로서 확인될 수 있었다 (문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)] 참조). 유전자 데이타베이스의 서열과 비교할 때, 이들 중 7개는 FAS 단백질보다는 PKS 단백질과 더 큰 관련이 있었다. 상기 군에는, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT), β-케토아실-ACP 신타제 (KS), β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR), 아실트랜스퍼라제 (AT), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄 길이 (또는 쇄 개시) 인자 (CLF) 및 6개 ACP 도메인의 매우 특이한 클러스터(cluster) (즉, PKS 또는 FAS 서열에서 2개 초과의 ACP 도메인이 클러스터되어 존재한다는 것은 이전에는 보고된 바 없었음)를 코딩한다고 추정되는 도메인이 포함된다. 쉐바넬라에서 확인된 PUFA 합성의 PKS 경로는 해양 박테리아에 흔한 것으로 여겨진다. 쉐바넬라 유전자 클러스터와의 상동성이 높은 유 전자가 포토박테리아 프로펀덤(Photobacterium profundum) [Allen et al., Appli. Environ. Microbiol. 65:1710 (1999)] 및 모리텔라 마리나(Moritella marina) (비브리오 마리누스)에서 확인된 바 있다 (미국 특허 제6,140,486호 (동일 문헌) 및 문헌 [Tanaka et al., Biotechnol. Lett. 21:939 (1999)] 참조).
다중불포화 지방산 (PUFA)은 영양 제제, 제약 제제, 산업 및 기타 목적에 유용하다고 여겨진다. 현재로는 PUFA가 천연 공급원 및 화학적 합성으로 공급되지만, 상업적 요구에는 충분치 않다. 현재로는 PUFA의 주요 공급원이 해양 어류이지만, 어류 스톡(stock)은 감소하고 있고 이것이 지속적인 자원이 될 수는 없다. 추가로, 중금속과 독성 유기 분자 둘다로 인한 오염은 해양 어류에서 유래된 오일에서의 심각한 문제이다. 오일 종자 작물에서 유래된 식물성 오일은 비교적 저렴하고 어류 오일에서와 같은 오염 문제가 없다. 그러나, 상업적으로 개발된 식물 오일 중에 존재하는 PUFA는 전형적으로 리놀레산 (델타 9 및 12 위치에 2개의 이중 결합을 갖는 18개 탄소 - 18:2 델타 9,12) 및 리놀렌산 (18:3 델타 9,12,15)으로 한정된다. 통상의 PUFA 합성 경로에서, 중쇄-길이의 포화 지방산 (지방산 신타제 (FAS) 시스템의 생성물)은 일련의 신장 및 탈포화 반응에 의해 변형된다. 리놀레산 및 리놀렌산으로부터 지방산을 합성하여 더욱 포화되고 더욱 장쇄인 PUFA를 생산하기 위해서는 수많은 별개의 데새투라제 및 에롱가제 효소들이 요구되기 때문에, EPA 및 도코사헥사엔산 (DHA) 등과 같은 PUFA를 발현시키기 위해서 식물 숙주 세포를 유전자조작하는 데에는 합성 달성을 위한 여러 별개의 효소들의 발현이 요구된다. 추가로, 이러한 PUFA를 사용가능한 양으로 생산하기 위해서는, 예를 들어 기질에 대한 경쟁 효소를 하향 조절하기 위한 유전자 조작, 돌연변이유발법 등에 의해 더 높은 효소 활성을 보유하도록 하는 유전자조작 또는 색소체 세포소기관으로의 효소 표적화 등과 같은 추가의 유전자조작 노력이 요구될 수 있다. 따라서, 이들 지방산을 천연적으로 생산하고 단리된 물질을 단독으로 발현하거나 상업적 요구량의 PUFA가 생산되도록 조작될 수 있는 이종 시스템과 조합되어 발현하는 종으로부터 PUFA 생합성에 관여하는 유전 물질을 얻는 것에 관심이 있다.
상기 논의된 쉐바넬라 및 비브리오 마리누스 등과 같은 해양 박테리아 중 PUFA PKS 시스템의 발견 (미국 특허 제6,140,486호 (동일 문헌) 참조)은 상업적으로 PUFA를 생산하기 위한 새로운 방법의 자원을 제공하였다. 그러나, 현재까지 PUFA PKS 시스템을 함유하는 것으로 확인된 해양 박테리아에는 상업적 수준에서의 이들의 유용성을 궁극적으로 제한할 수 있는 한계가 있다. 특히, 미국 특허 제6,140,486호는 이들 해양 박테리아 PUFA PKS 시스템이 식물의 유전자 변형에 사용될 수 있다고 개시하고 있지만, 천연적으로 차가운 해양 환경 중에서 서식하고 성장하는 해양 박테리아 및 이들 박테리아의 효소 시스템은 22℃ 초과에서 제대로 기능하지 못하고, 훨씬 더 낮은 온도에서 최적으로 기능할 수 있다. 반대로, PUFA PKS 시스템을 이용한 유전자 조작에 있어서의 관심 표적인 많은 작물들은 정상적인 성장 조건 온도가 22℃ 초과 내지 40℃ 초과까지의 범위이다. 따라서, 이들 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 시스템이 정상적인 성장 조건하에서의 식물 발현에 쉽게 적용될 수 있다고 예측되지는 않는다.
연구가들은 특히 에이코사펜타엔산 (EPA)의 생산과 관련하여 미생물을 광합 성 및 종속영양 배양물 둘다에서 성장시킴으로써 이들 미생물을 이용하여 EPA를 생산하고자 하였다. 또한, 이들은 배양 조건하의 유기체 생산성을 높이고자 하는 시도에서 고전적인 유전적 접근법 및 지시된 유전적 접근법 둘다를 이용하였다. 다른 연구가들은 각종 데새투라제 및 에롱가제 효소를 코딩하는 유전자의 도입을 통해 오일-종자 작물에서 EPA를 생산하고자 시도하였다.
연구가들은 적색 미세조류 (모노두스(Monodus)), 규조류 (예컨대 패오닥틸룸(Phaeodactylum)), 다른 미세조류 및 진균 (예컨대 저온에서 배양되는 모르티에렐라(Mortierella))의 배양물을 이용하고자 하는 시도를 해왔다. 그러나, 모든 경우에서, DHA 등과 같은 다른 장쇄 PUFA를 위한 기존의 상업적 미생물 생성 시스템에 비하여 생산성이 낮았다. 많은 경우에서, EPA는 트리아실글리세롤 (TAG) 형태가 아닌 인지질 (PL) 형태로 주로 존재한다. 종속영양 성장 조건하에서의 미세조류의 생산성은 광영양 조건하에서보다 훨씬 더 높을 수 있기 때문에, 연구가들은 특정 당 수송자를 코딩하는 유전자의 도입을 이용하여 영양성의 전환을 시도하여 성공하였다. 그러나, 새로 획득된 종속영양 성능을 이용하더라도, 오일 생산성은 여전히 비교적 낮았다.
상기 논의된 바와 같이, 여러가지 해양 박테리아가 PUFA (EPA 및 DHA)를 생산하는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나, 이들 박테리아는 유의한 양의 TAG를 생산하지 못하며, EPA는 주로 PL 막 형태로 존재한다. 이들 특정 박테리아에 의한 EPA의 생산 수준 및 이들 박테리아의 성장 특성 (상기 논의됨)은 EPA의 상업적 생산에 있어서의 이들의 유용성을 제한한다.
내인성으로 생산된 지방산을 변형시켜서 오일-종자 작물에서 EPA를 생산하고자 하는 많은 노력이 있었다. 지방산 에롱가제 및 데새투라제에 대한 각종 개개의 유전자를 갖는 이들 식물의 유전자 변형으로, 유의한 수준의 EPA를 함유하지만 또한 유의한 수준의 더욱 단쇄이며 덜 불포화된 혼합된 PUFA도 함유하는 잎 또는 종자가 생산되었다 ([Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)], PCT 공개 제WO 04/071467호, [Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)]). 반대로, 본원에 기재한 바와 같은 공지된 EPA-생산 PUFA PKS 시스템은 본질적으로 순수한 EPA인 PUFA 프로파일을 만든다.
따라서, 당업계에는 상업적 용도에 보다 우수한 융통성을 갖는 다른 PUFA PKS 시스템 및 상업적으로 유용한 생산 공정에서 소정량의 원하는 PUFA, 예를 들어 EPA가 풍부한 지질 (예컨대, PL 및 TAG)을 효율적으로 생산하는 생물학적 시스템에 대한 요구가 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 실시양태는 일반적으로 쉐바넬라 자포니카(Shewanella japonica) 또는 쉐바넬라 올레야나(Shewanella olleyana)의 PUFA PKS 단백질 및 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 그의 생물학적 활성 상동체 및 단편에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은
(a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
(b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케 토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편을 코딩하는 핵산 서열,
(c) 서열 2 또는 서열 8과 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하며, KS 활성, MAT 활성, KR 활성, ACP 활성 및 비-FabA-유사 데히드라제 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
(d) 서열 3 또는 서열 9와 약 60％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하며, AT 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
(e) 서열 4 또는 서열 10과 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하며, KS 활성, CLF 활성 및 DH 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
(f) 서열 6 또는 서열 12와 약 60％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및
(g) 서열 11과 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하거나 서열 5와 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하며, ER 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
한 측면에서, (b)에 기재한 상기 단편은
(a) 서열 2의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
(b) 서열 2의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
(c) 서열 2의 위치 약 1264 내지 위치 약 1889로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 2의 단편,
(d) 서열 2의 위치 약 2264 내지 위치 약 2398로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
(e) 서열 2의 위치 약 2504 내지 위치 약 2516을 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 생물학적 활성을 보유하는 서열 2의 단편,
(f) 서열 3의 위치 약 378 내지 위치 약 684로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 3의 단편,
(g) 서열 4의 위치 약 5 내지 위치 약 483으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
(h) 서열 4의 위치 약 489 내지 위치 약 771로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
(i) 서열 4의 위치 약 1428 내지 위치 약 1570으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
(j) 서열 4의 위치 약 1881 내지 위치 약 2019로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
(k) 서열 5의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 5의 단편,
(l) 서열 6의 위치 약 40 내지 위치 약 186으로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 6의 단편,
(m) 서열 8의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
(n) 서열 8의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
(o) 서열 8의 위치 약 1275 내지 위치 약 1872로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 8의 단편,
(p) 서열 8의 위치 약 2240 내지 위치 약 2374로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
(q) 서열 8의 위치 약 2480 내지 2492를 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 활성을 보유하는 서열 8의 단편,
(r) 서열 9의 위치 약 366 내지 위치 약 703으로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 9의 단편,
(s) 서열 10의 위치 약 10 내지 위치 약 488로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
(t) 서열 10의 위치 약 502 내지 위치 약 750으로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
(u) 서열 10의 위치 약 1431 내지 위치 약 1573으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
(v) 서열 10의 위치 약 1882 내지 위치 약 2020으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
(w) 서열 11의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 11의 단편, 및
(x) 서열 12의 위치 약 29 내지 위치 약 177로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 12의 단편
으로부터 선택된다.
또한, 본 발명에는 임의의 상기 핵산 분자에 완전히 상보적인 핵산 서열로 본질적으로 구성된 핵산 분자가 포함된다. 추가로, 본 발명의 한 측면은 1개 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 임의의 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 이러한 임의의 재조합 핵산 분자로 형질감염된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 핵산 분자에 의해 코딩되는, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 생물학적 활성 단백질 또는 그의 도메인을 포함하는, PKS 시스템을 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부는 유전자 변형의 결과로서 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3)) 및/또는 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 다중불포화 지방산을 생산한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 식물 또는 상기 식물의 일부는 DHA, EPA, EPA와 DHA, ARA와 DHA, 또는 ARA와 EPA를 생산한다. 유전자 변형 식물은 작물 및 임의의 쌍떡잎 식물 또는 외떡잎 식물을 포함할 수 있다. 바람직한 식물로는 캐놀라, 대두, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 실시양태는 임의의 상기 단리된 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 미생물은 유전자 변형의 결과로서 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA (에이코 사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3)) 및/또는 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3)으로 구성된 군에서 선택된 다중불포화 지방산을 생산한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 유전자 변형의 결과로서 DHA, EPA, EPA와 DHA, ARA와 DHA, 또는 ARA와 EPA를 생산한다. 한 측면에서, 상기 미생물은 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 트라우스토키트리드이다. 한 측면에서, 상기 미생물은 박테리아이다.
한 측면에서, 상기한 유전자 변형 식물 또는 미생물은
(a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 및
(b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 한 측면에서, 상기 식물은 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및/또는 서열 6으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하 는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 식물 또는 미생물은 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 식물 또는 미생물은 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및/또는 서열 12로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 식물 또는 미생물은 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12를 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 식물 또는 미생물은 임의의 상기 단편을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다.
본 발명의 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부 또는 미생물 실시양태의 한 측면에서, 상기 식물 또는 미생물은 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 트라우스토키트리드의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 생물학적 활성 단백질 또는 도메인을 발현하도록 추가로 유전자 변형된 것이다. 한 측면에서, 이러한 단백질 또는 도메인은 (a) 서열 14, 서열 16 및 서열 18, 및 (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인은 (a) 서열 20, 서열 22 및 서열 24, 및 (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
유전자 변형된 미생물에 관한 본 발명의 실시양태의 한 측면에서, 상기 미생물은 내인성 PUFA PKS시스템을 포함한다. 이러한 측면에서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 내인성 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 상이한 PKS 시스템의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 또다른 단리된 핵산 분자로 치환하여 변형될 수 있다. 상이한 PKS 시스템으로는 비-박테리아 PUFA PKS 시스템, 박테리아 PUFA PKS 시스템, 제I형 모듈형 PKS 시스템, 제I형 반복형 PKS 시스템, 제II형 PKS 시스템 및 제III형 PKS 시스템 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 또다른 측면에서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 내인성 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 본 발명의 임의의 상기 단리된 핵산 분자로 치환하여 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 미생물은 C20 단위의 합성을 지시하는 쇄 길이 인자 또는 쇄 길이 인자와 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 것이다. 또다른 측면에서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인을 코딩하는 도메인 및 β-케토아실-ACP 신타제 (KS)를 코딩하는 도메인으로 구성된 군에서 선택된 도메인(들)에서 변형된 것이고, 이때 상기 변형은 변형되지 않은 경우에 비하여 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 장쇄 지방산의 비율을 변경한다. 이러한 변형은 내인성 PUFA PKS 시스템의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH)를 이성질체화 활성을 보유하지 않는 DH 도메인으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 상기 도메인의 전부 또는 일부의 결실, 상이한 유기체 중 상기 도메인의 상동성 도메인에 의한 상기 도메인의 치환, 및 상기 도메인의 돌연변이를 포함할 수도 있다. 한 측면에서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인에서 변형된 것이고, 이때 상기 변형은 변형되지 않은 경우에 비하여 상이한 화합물을 생산한다. 이러한 측면에서, 상기 변형은 ER 도메인의 전부 또는 일부의 결실, 상이한 유기체로부터의 ER 도메인에 의한 상기 ER 도메인의 치환, 및 상기 ER 도메인의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산에 효과적인 조건하에 상기한 유전자 변형 식물을 성장시키는 것을 포함하는, 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산에 효과적인 조건하에 상기한 유전자 변형 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산 방법에 관한 것이다.
바로 앞에 기재한 2가지 실시양태 중 어느 하나에서, 한 측면에서는 상기 유전자 변형이 내인성 PKS 시스템에 의해 생산되는 1종 이상의 생성물을 야생형 유기체에 비해 변화시킨다. 또다른 측면에서, 상기 유기체는 유전자 변형이 없는 천연 발생 유기체와는 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로파일을 생성한다. 한 측면에서, 상기 생물활성 분자는 소염 제제, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울제, 항-경련제, 항-헬리오박터 파일로리(Heliobactor pylori) 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환의 치료용 약물, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제제로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 상기 생물활성 분자는 항생제이다. 또다른 측면에서, 상기 생물활성 분자는 다중불포화 지방산 (PUFA)이다. 또다른 측면에서, 상기 생물활성 분자는 시스 배위의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 분자이다. 또다른 측면에서, 상기 생물활성 분자는 매 3번째 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기한 본 발명의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 식물 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 천연 발생 식물과는 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로파일을 갖는 식물의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기한 본 발명의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하도록 미생물 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 재조합 미생물의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 최종 생성물에 상기 기재한 바와 같은 본 발명의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 오일을 첨가하는 것을 포함하는, 최종 생성물이 1종 이상의 지방산을 함유하도록 최종 생성물을 변형하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 상기 최종 생성물로는 식이보조제, 식품, 제약 제제, 인간화된 동물 유즙(乳汁)(milk) 및 분유(infant formula) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기 기재한 바와 같은 본 발명의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 사용하여 유즙-생산 동물의 유즙-생산 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 인간화된 동물 유즙의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 재조합 박테리아 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템을 발현하도록 변형되고, 이때 상기 PUFA PKS가 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 상기 PUFA PKS 시스템이
(a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
(b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
(c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
(d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
(e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
(f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
(g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
(h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
(i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 PUFA PKS 시스템은 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산한다. 한 측면에서, 상기 PUFA PKS 시스템은
(a) 1개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
(b) 6개의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
(c) 2개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
(d) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
(e) 1개의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
(f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
(g) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
(h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
(i) 1개의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
을 포함한다. 한 측면에서, 상기 PUFA PKS 시스템은 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로 구성된 군에서 선택된 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 박테리아 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티 드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 도메인을 포함하며, 이때 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템이 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산하고
(a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
(b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
(c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
(d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
(e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
(f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
(g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
(h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
(i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
을 포함하는 것인 유전자 변형 유기체에 관한 것이다. 상기 유전자 변형은 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 준다. 한 측면에서, 상기 유기체는 박테리아 PUFA PKS 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 도메인을 재조합 발현하도록 변형된다. 또다른 측면에서, 상기 유기체는 박테리아 PUFA PKS 시스템을 재조합 발현하도록 변형된다. 상기 유기체는 식물 또는 미생물을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템은 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로 구성된 군에서 선택된 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템이다. 또다른 측면에서, 상기 유기체는 제2의 상이한 PKS 시스템의 1종 이상의 추가의 단백질 또는 도메인을 발현한 다.
본 발명의 또다른 실시양태는 박테리아 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 기능적 도메인을 코딩하며, 이때 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템이 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산하고
(a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
(b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
(c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
(d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
(e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
(f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
(g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
(h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
(i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
을 포함하는 것인 단리된 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
도 1은 쉐바넬라 종 SCRC-2738, 쉐바넬라 자포니카, 및 쉐바넬라 올레야나 유래의 EPA 생산 클러스터의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 구조를 예시하는 모식도이다.
도 2는 쉐바넬라 종 SCRC-2738, 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나 유래의 EPA 생산 유전자 클러스터의 도메인 구조를 예시하는 모식도이다.
도 3A는 쉐바넬라 자포니카 (코스미드 3F3)의 pfaB ORF의 말단부와 pfaC ORF의 출발부 사이의 중복 (서열 1의 뉴클레오티드 21101 내지 21150을 나타냄, 상보적 가닥 포함) 및 이들의 상응하는 아미노산 번역 (pfaB: 서열 3의 위치 751 내지 759, pfaC: 서열 4의 위치 1 내지 9)을 보여주는 서열 정렬이다
도 3B는 쉐바넬라 올레야나 (코스미드 9A10)의 pfaB ORF의 말단부와 pfaC ORF의 출발부 (서열 7의 뉴클레오티드 27943 내지 28008을 나타냄, 상보적 가닥 포함) 사이의 중복 및 이들의 상응하는 아미노산 번역 (pfaB: 서열 9의 위치 735 내지 742, pfaC: 서열 10의 위치 1 내지 9)을 보여주는 서열 정렬이다.
도 4는 pfaE ORF의 N-말단의 말단부 (Sja_pfaE: 서열 6의 위치 1 내지 70, Sol_pfaE: 서열 12의 위치 1 내지 59) vs . 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf2의 표시된 출발부 (orf2_ATG: 서열 61) 및 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf2의 실험적 기능성 출발부 (WO 98/55625) (orf2_TTG: 서열 62)를 보여주는 서열 정렬이다.
본 발명은 일반적으로 EPA를 천연 생산하고 약 30℃ 이하의 온도와 더 높은 (예컨대, 35℃ 이하 또는 그 이상) 온도에서 잘 성장하는 해양 박테리아의 서브세트로부터의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템, 상기 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형 유기체, 및 생물활성 분자, 특히 DHA, DPA 및 EPA와 같은 PUFA를 비롯한 관심 생산물의 생산을 위한 상기 시스템의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제 시스템이라고 지칭될 수도 있음)은 일반적으로 (1) 시스템의 천연 생산물로서 PUFA를 생산하고, (2) 선택된 주기에서 지방산 쇄의 반복형 프로세싱, 및 트랜스-시스 이성질체화 및 에노일 환원 반응을 비롯한 비-반복형 프로세싱 둘다를 수행하는 복합체 내에 집합된 다수의 다기능적 단백질을 포함한다는 구별되는 특징을 갖는다. 언급되는 PUFA PKS 시스템은 유기체내에서 복합체로 작용하여 PUFA를 생산하는 유전자 및 그의 코딩 생산물 모두를 통칭하여 지칭한다. 따라서, PUFA PKS 시스템은 구체적으로 천연 생산물이 PUFA인 PKS 시스템을 지칭한다.
더욱 구체적으로, 첫째, 본 발명의 기초를 이루는 PUFA PKS 시스템은 생산물로서 다중불포화 지방산 (PUFA)을 생산한다 (즉, 이러한 PKS 시스템을 내인성으로 (천연적으로) 함유하는 유기체는 상기 시스템을 사용하여 PUFA를 제조함). 본원에서 지칭되는 PUFA는 바람직하게는 16개 이상의 탄소, 더욱 바람직하게는 18개 이상의 탄소, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 탄소, 더욱 바람직하게는 22개 이상의 탄소의 탄소 쇄 길이, 및 모두 시스 배위인 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 더욱 바람직하게는 5개 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 6개 이상의 이중 결합을 갖는 다중불포화 지방산이다. 본 발명의 목적은 유전자 조작 또는 최종 생산물의 조작을 통해 목적하는 쇄 길이 및 목적하는 수의 이중 결합을 가진 다중불포화 지방산을 생산하는 PKS 시스템을 발견 또는 제조하는 것이다. PUFA의 예로는 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3)) 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3)) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
둘째, 본원에 기재한 PUFA PKS 시스템은 일반적으로 상기 시스템과 선행 기재된 PKS 시스템 (예컨대, 제I형 모듈형 또는 반복형, 제II형 또는 제III형)을 구별짖는 반복적 반응 및 비-반복적 반응 둘다를 포함하고 있다. 더욱 특히, 본원에 기재한 PUFA PKS 시스템은 매 주기 동안에 기능한다고 여겨지는 도메인뿐만 아니라 단지 일부 주기 동안에 기능한다고 여겨지는 도메인을 함유한다. 이러한 기능성의 주요 측면은 박테리아 Fab-A 효소에 대한 상동성을 나타내는 도메인과 연관이 있을 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이의 Fab-A 효소는 2종의 효소 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 이 효소는 히드록시기를 함유하는 탄소 쇄로부터 물 분자 (H2O)가 제거되어 상기 탄소 쇄에 트랜스 이중 결합이 생기게 되는 탈수 활성을 갖고 있다. 또한, 이는 트랜스 이중 결합이 시스 배위로 전환되는 이소머라제 활성을 보유한다. 이러한 이성질체화는 인접한 탄소로의 이중 결합 위치의 이동과 함께 달성된다. PKS (및 FAS) 시스템에서, 탄소 주쇄는 탄소 2개씩의 증가분으로 연장된다. 따라서, 이들 PKS 시스템의 PUFA 생산물을 생산하는데 요구되는 연장 반응의 수를 예측할 수 있다. 예를 들어, DHA (C22:6, 모두 시스)를 생산하기 위해서는 10회의 연장 반응이 요구된다. 최종 생산물에는 단지 6개의 이중 결합이 있기 때문에, 이는 일부 반응 주기 동안에는 이중 결합이 (시스 이성질체로서) 유지되고, 다른 주기에서는 이중 결합이 다음 연장 전에 환원된다는 것을 의미한다.
해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템의 발견 (미국 특허 제6,140,486호 참조) 이전에는, PKS 시스템이 반복적 및 선택적 효소 반응의 조합을 보유하는 것으로 알려지지 않았고, 시스 배위의 탄소-탄소 이중 결합을 생산할 수 있는 것으로 여겨지지도 않았다. 그러나, 본 발명에 의해 기재된 PUFA PKS 시스템은 시스 이중 결합의 도입 능력 및 주기 중 반응 순서의 변경 능력을 갖는다.
본원 발명의 발명자들은 PUFA PKS 시스템의 이러한 특징을 선행 기재된 (제I형 반복형 또는 모듈형, 제II형 또는 제III형) PKS 시스템에 의해 생산될 수 없는 범위의 생물활성 분자를 생산하는데 사용할 것을 제안한다. 이들 생물활성 분자로는 대다수가 하기에서 논의되어질 다중불포화 지방산 (PUFA), 항생제 또는 다른 생물활성 화합물 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재한 PUFA PKS 유전자 구조의 지식을 사용한 임의의 수많은 방법이, PUFA PKS 유전자를 변경하거나 또는 이들 유전자의 일부를 다른 PKS 시스템을 비롯한 다른 합성 시스템과 조합하는데 사용되어 신규 생산물을 생산할 수 있다. 반복적 반응 및 선택적 반응이 둘다 일어나는 이들 특정 유형 시스템의 고유 능력으로 인해, 상기 시스템은 유사한 방법이 다른 유형의 PKS 시스템에 적용되는 경우에 발견되지 않는 생산물을 수득할 수 있다.
미국 특허 출원 제10/810,352호 (상기 문헌)에서, 본건의 발명자들은 PUFA를 전형적으로 생산하고 훨씬 더 낮은 온도에서 성장하는 다른 종 및 쉐바넬라 내의 균주를 비롯한 해양 박테리아를 함유하는 선행 기재된 PUFA PKS와는 대조적으로, PUFA (예컨대, EPA)를 생산하고 약 30℃ 이하의 온도에서 성장할 수 있는 놀라운 특징을 가지기 때문에 PUFA PKS 유전자의 공급원으로 사용하기에 특히 적합한 2종의 예시적 해양 박테리아 (예컨대 쉐바넬라 올레야나 및 쉐바넬라 자포니카)를 동정하였다. 발명자들은 드디어 쉐바넬라 올레야나 (오스트레일리안 콜렉션 오브 앤타르크틱 마이크로오르가니즘스(Australian Collection of Antarctic Microorganisms, ACAM) 균주 번호 644, 문헌 [Skerratt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 52, 2101 (2002)]) 및 쉐바넬라 자포니카 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC) 균주 번호 BAA-316, 문헌 [Ivanova et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1027 (2001)]) 각각의 모든 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임 (Orf)의 전장 게놈 서열을 클로닝하고 서열결정하였으며, 이들 특정 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템을 포함하는 도메인을 동정하였다. 따라서, 본 발명은 상업적 용도에 융통성을 갖는 추가의 PUFA PKS 시스템의 제공에 관한 상기 문제를 해결한다.
본원 발명의 발명자들이, 트라우스토키트리알레스 목(目)의 구성원, 예컨대 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움을 비롯한 진핵생물에서 PUFA를 생산하는 폴리케티드 신타제-유사 시스템의 조작에 의해, 하나 이상의 다양한 형태 (예컨대, 트리아실글리세롤 (TAG) 및 인지질 (PL))의 PUFA가 풍부한 지질을 효율적으로 생산하는 유전자 변형 미생물 및 생산 방법을 개발함으로써, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 또한 목적하는 PUFA, 예컨대 EPA가 풍부한 상업적으로 유용한 지질의 생산에 관련한 상기 문제를 해결하는 전략의 한 수단으로서 사용될 수 있다. 구체적인 예로써, 본원 발명의 발명자들은 종래 PUFA, 주로 도코사헥사엔산 (DHA, C22:6 n-3) 및 도코사펜타엔산 (DPA, C22:5 n-6)이 풍부한 오일의 상업적 생산용으로 최적화되었고, 이제 유기체의 오일 생산능 특징은 없애지 않으면서 DHA 생산이 EPA (C20:5 n-3) 생산 (또는 다른 PUFA 생산)으로 대체되도록 유전자 변형되어질 쉬조키트리움의 균주를 본원에 기재하고 있다. 본 발명의 한 실시양태에 기재한 해양 박테리아로부터의 해양 박테리아 PUFA PKS 유전자를 사용하여 이러한 유전자 변형 미생물을 생산할 수 있다. 본 발명의 개념은 하기 상세하게 기재된 다른 생산 유기체 및 다른 목적하는 PUFA에 쉽게 적용될 수 있기 때문에, 이것은 본 발명에 포함되는 기술의 단지 한 예이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "지질"은 인지질, 유리 지방산, 지방산의 에스테르, 트리아실글리세롤, 디아실글리세리드, 포스파티드, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필 (예컨대, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 및 당업자에게 공지된 다른 지질을 포함한다. 용어 "다중불포화 지방산" 및 "PUFA"는 유리 지방산 형태뿐만 아니라 동등한 다른 형태, 예컨대 TAG 형태 및 PL 형태를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 적어도 (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인, (b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인, (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인, (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인, (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인, (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인, (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인, 및 (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인을 포함한다. PUFA PKS 시스템은 또한 PUFA PKS 시스템의 한 부분이거나 또는 PUFA PKS 시스템에 보조적인 도메인 또는 단백질인 것으로 간주될 수 있는 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 또한 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 1개 이상의 영역을 포함한다. 이들 도메인 및 모티프의 기능은 일반적으로 당업계에 개별적으로 공지되어 있으며, 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련하여 하기에 상세하게 기재될 것이다. 본 발명의 도메인은 단일 단백질로서 (즉, 도메인 및 단백질은 동일함), 또는 단일 단백질내 2개 이상의 (다중) 도메인 중 하나로서 발견될 수 있다. 상기 쉐바넬라 종의 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조는 하기에 보다 상세하게 기재되며, 도 2에 예시되어 있다.
또다른 실시양태에서, PUFA PKS 시스템은 적어도 (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인, (b) 다중 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인(들) (적어도 1개 내지 4개, 바람직하게는 5개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 7개, 8개, 9개, 또는 9개 이상), (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인, (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인, (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인, (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인, (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인, (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및 (i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 또한 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 1개 이상의 영역을 포함한다.
본 발명에 따라, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 생물학적 활성 (기능)을 보유하는 도메인 또는 단백질은 FAS (및 PKS) 신장 반응 주기의 개시 단계를 수행하는 효소로서 특성화된다. 용어 "β-케토아실-ACP 신타제"는 용어 "3-케토아실-ACP 신타제", "β-케토아실-ACP 신타제" 및 "케토-아실 ACP 신타제", 및 유사한 파생어와 구별없이 사용될 수 있다. 신장되도록 정해진 아실기는 티오에스테르 결합에 의해 효소의 활성 부위의 시스테인 잔기에 연결된다. 다중-단계 반응에서, 아실-효소는 말로닐-ACP와의 축합을 진행시켜 -케토아실-ACP, CO2 및 유리 효소를 형성한다. KS는 신장 주기에서 중요한 역할을 하고, 많은 시스템에서 반응 주기의 다른 효소들보다 더 큰 기질 특이성을 보유하는 것으로 제시되어 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 유기체의 생리학에서 각각 그만의 특정한 역할을 하는 3개의 별개의 KS 효소를 가지고 있다 (문헌 [Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993)] 참조). 본원에 기재한 PUFA-PKS 시스템의 2개의 KS 도메인은 연속적인 PUFA 생합성 반응에서 별개의 역할을 할 수 있다.
KS는 효소의 한 부류로서 익히 특성화되어 있다. 많은 입증된 KS 유전자의 서열이 공지되어 있고, 활성 부위 모티프가 확인되었으며, 다수의 결정 구조가 결정되었다. 공지된 KS 서열과의 상동성에 의해 단백질 (또는 단백질의 도메인)이 KS 족의 효소에 속하는지 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명에 따라, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 생물학적 활성 (기능)을 보유하는 도메인 또는 단백질은 말로닐-CoA의 말로닐 부분을 ACP에 전달하는 것으로서 특성화된다. 용어 "말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제"는 "말로닐 아실트랜스퍼라제" 및 유사한 파생어와 구별없이 사용될 수 있다. 상기 효소는 활성 부위 모티프 (GxSxG) 이외에, 이들을 MAT 효소로서 규명하는 연장된 모티프 (주요 위치에서의 R 및 Q 아미노산)를 보유한다 (하기에서 논의되는 AT 도메인과 대조적). 일부 PKS 시스템 (PUFA PKS 도메인은 제외)에서, MAT 도메인은 메틸- 또는 에틸-말로네이트를 (상응하는 CoA 에스테르로부터의) ACP 기 상에 우선적으로 로딩(loading)하고, 이에 의해 선형 탄소 쇄 내에 측쇄가 도입될 것이다. MAT 도메인은 공지된 MAT 서열과의 상동성 및 연장된 모티프 구조로써 알 수 있다.
본 발명에 따라, 아실 운반체 단백질 (ACP) 생물학적 활성 (기능)을 보유하는 도메인 또는 단백질은 단백질의 공유 결합된 보조인자에 티오에스테르 결합을 통해 성장되는 지방 아실 쇄의 운반체로서 기능하는 소 폴리펩티드 (전형적으로, 80 내지 100개 아미노산의 길이)인 것으로서 특성화된다. 이들 폴리펩티드는 개별적 단위로서, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인으로서 존재한다. ACP는 CoA의 포스포판테테이닐 부분이 ACP의 고도로 보존된 세린 잔기로 전달됨으로써 불활성 아포-형태로부터 관능적 홀로-형태로 전환된다. 아실기는 포스포판테테이닐 부분의 유리 말단에서 티오에스테르 결합에 의해 ACP에 부착된다. ACP는 방사성 판테테인에 의한 표지화 및 공지된 ACP와의 서열 상동성에 의해 확인될 수 있다. 활성 부위 모티프의 변이의 존재 (LGIDS*, 예컨대 서열 2의 아미노산 1296 내지 1300 참조)는 또한 ACP의 표시이다.
본 발명에 따라, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성을 보유하는 도메인 또는 단백질은 3-케토아실 형태 ACP의 피리딘-뉴클레오티드-의존적 환원을 촉매하는 것으로서 특성화된다. 용어 "β-케토아실-ACP 리덕타제"는 용어 "케토리덕타제", "3-케토아실-ACP 리덕타제", "케토-아실 ACP 리덕타제", 및 상기 용어의 유사한 파생어와 구별없이 사용될 수 있다. 이는 데 노보(de novo) 지방산 생합성 신장 주기에서의 제1 환원 단계이며 폴리케티드 생합성에서 종종 수행되는 반응이다. 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 중의 일족, FAS의 다른 리덕타제 족 (PUFA PKS 시스템 중에 존재하는 ER 족 제외), 및 단쇄 알콜 데히드로게나제 족과는 상당한 서열 유사성이 관찰된다. 이 PUFA PKS 영역의 Pfam 분석은 코어 영역에서 단쇄 알콜 데히드로게나제 족과의 상동성을 보여줄 수 있다. 상기 영역의 블라스트(Blast) 분석은 코어 영역에서 공지된 KR 효소에 대한 매치(match), 및 다른 특성화된 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인과 상동성을 갖는 연장된 영역을 보여줄 수 있다.
본 발명에 따라, 소정의 도메인 또는 단백질은 하기의 이론적 근거에 기초하여 쇄 길이 인자 (CLF)라고 지칭된다. CLF는 원래는 제II형 (해리된 효소) PKS 시스템의 특성으로서 기재되어 있으며, 최종 생산물의 신장 주기의 수 및 이에 따른 쇄 길이를 결정하는데 있어 역할을 한다고 가정되었다. CLF 아미노산 서열은 KS 도메인과의 상동성을 보여주지만 (KS 단백질과 이종이합체를 형성하는 것으로 생각되어짐), 활성 부위 시스테인이 없다. PKS 시스템에서 CLF의 역할은 논란의 소지가 있다. 증거 (문헌 [C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999)])는 (신장될 초기 아실기를 제공함으로써) PKS 시스템의 프라이밍(priming)에서의 역할을 시사한다. 이러한 역할에서, CLF 도메인은 (말로닐-ACP로서의) 말로네이트를 탈카르복실화하여 KS 활성 부위로 전달될 수 있는 아세테이트 기를 형성하는 것으로 생각되어진다. 따라서, 이러한 아세테이트는 초기 신장 (축합) 반응을 일으킬 수 있는 '프라이밍' 분자로서 작용한다. 제II형 CLF의 상동체는 일부 제I형 모듈형 PKS 시스템에서 '로딩' 도메인으로서 확인되었다. 그러나, 다른 최근의 증거는 쇄 길이를 결정하는데 있어 CLF 도메인의 진정한 역할을 시사한다 (문헌 [Yi et al., J. Am. Chem. Soc. 125:12708 (2003)] 참조). CLF의 서열 특징을 갖는 도메인이 모든 최근 확인된 PUFA PKS 시스템에서 발견되었고, 각각의 경우에 다중도메인 단백질의 부분으로서 발견되었다.
언급되는 "아실트랜스퍼라제" 또는 "AT"는 수많은 별개의 아실 전달 반응을 수행할 수 있는 일군의 효소를 지칭한다. 용어 "아실트랜스퍼라제"는 용어 "아실 트랜스퍼라제"와 구별없이 사용될 수 있다. 쉬조키트리움 도메인은 현재 검사된 다른 PUFA PKS 시스템 모두에 존재하는 도메인과의 양호한 상동성, 및 특정 기능이 확인된 일부 아실트랜스퍼라제 (예컨대 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, MAT)와의 매우 약한 상동성을 보여준다. MAT와의 약한 상동성에도 불구하고, AT 도메인은 상기 효소의 연장된 모티프 구조 특성을 보유하지 않기 때문에 MAT로서 기능하는 것으로 간주되지 않는다 (상기 MAT 도메인 설명부분 참조). 이 개시내용의 목적을 위해, PUFA PKS 시스템의 AT 도메인의 기능으로는 지방 아실기를 OrfA ACP 도메인(들)로부터 물로 전달 (즉 지방 아실기를 유리 지방산으로서 방출하는 티오에스테라제), 지방 아실기를 CoA와 같은 수용자에게로 전달, 아실기를 다양한 ACP 도메인 중으로 전달, 또는 지방 아실기를 친지성 수용자 분자 (예컨대, 리소포스파드산)에게로 전달 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라, 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 도메인은 지방 아실-ACP에서의 (DH 활성에 의해 도입된) 트랜스-이중 결합을 환원시켜 상기 탄소를 완전히 포화시킨다. PUFA-PKS의 ER 도메인은 새롭게 특성화된 ER 효소 족 (문헌 [Heath et al., Nature 406, 145 (2000)] 참조)과의 상동성을 보여준다. 본 발명에 따라, 용어 "에노일-ACP 리덕타제"는 "에노일 리덕타제", "에노일 ACP-리덕타제" 및 "에노일 아실-ACP 리덕타제"와 구별없이 사용될 수 있다. 헤쓰(Heath) 및 록(Rock)은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 관심 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 정제하고, 이것이 시험관내 검정에서 ER 활성을 보유한다는 것을 입증함으로써, 상기 신규 부류의 ER 효소를 확인하였다. 본원에 기재한 박테리아 PUFA PKS 시스템은 1개의 ER 도메인을 함유한다.
본 발명에 따라, 데히드라제 또는 데히드라타제 (DH) 활성을 보유하는 단백질 또는 도메인은 탈수 반응을 촉매한다. 본원에서 일반적으로 사용되는 DH 활성에 대한 언급은 전형적으로 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성을 지칭한다. FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성은 β-케토아실-ACP로부터 HOH를 제거하여, 먼저 탄소 쇄에 트랜스 이중 결합을 만든다. 용어 "FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제"는 용어 "FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제", "β-히드록시아실-ACP 데히드라제", "데히드라제" 및 유사한 파생어와 구별없이 사용될 수 있다. PUFA PKS 시스템의 DH 도메인은 (다른 PKS 시스템의 DH 도메인보다) 자신의 FAS 시스템과 연관된 박테리아 DH 효소와 상동성을 보인다. 박테리아 DH의 서브세트인 FabA-유사 DH는 시스-트랜스 이소머라제 활성을 보유한다 (문헌 [Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)] 참조). FabA-유사 DH 단백질과의 상동성은 본원에 기재한 DH 도메인 중의 1개 또는 모두로 인해 PUFA PKS 생산물에 시스 이중 결합이 삽입된다는 것을 나타낸다.
본 발명의 단백질은 또한 일반적으로 본원에서 비-FabA-유사 DH 활성, 또는 비-FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성이라고 지칭되는, FabA-유사 (예컨대, 상기 기재된 시스-트랜스 활성은 FabA-유사 활성과 연관이 있음)로서 특성화되지 않은 데히드라타제 활성을 보유할 수 있다. 더욱 구체적으로, 보존된 활성 부위 모티프 (대략 13개 아미노산의 길이: L*xxHxxxGxxxxP, 서열 2의 아미노산 2504 내지 2516, 모티프 L*은 I일 수도 있음)는 PKS 시스템의 데히드라타제 도메인에서 발견된다 (문헌 [Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60] 참조). 본원에서 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 또는 DH 모티프라고도 지칭되는 상기 보존된 모티프가 현재까지 개시되어 있는 모든 공지된 PUFA-PKS 서열의 유사 영역 및 본원에 기재한 PUFA PKS 서열 (예컨대, 서열 2의 아미노산 2504 내지 2516, 또는 서열 8의 아미노산 2480 내지 2492)에서 발견되지만, 그의 모티프는 본 발명 이전에는 탐지되지 않은 것이다. 상기 보존된 모티프는 PUFA-PKS 서열 중에 고도의 상동성을 갖는 비-특성화된 영역 내에 있다. PUFA-PKS를 통한 PUFA의 제안된 생합성은 비-FabA 유사 탈수를 필요로 하고, 상기 모티프로 인해 반응이 일어날 것이다.
본 발명에 따라, 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 생물학적 활성 (기능)을 보유하는 도메인 또는 단백질은 4'-포스포판테테이닐 부분을 코엔자임(Coenzyme) A로부터 아실 운반체 단백질 (ACP)로 전달하는 효소로서 특성화된다. ACP의 불변의 세린 잔기로의 이러한 전달은 불활성 아포-형태를 홀로-형태로 활성화시킨다. 폴리케티드 및 지방산 합성 둘다에서, 포스포판테테인기는 성장하는 아실 쇄와 티오에스테르를 형성한다. PPTase는 지방산 합성, 폴리케티드 합성 및 비-리보솜 펩티드 합성에서 익히 특성화된 효소의 일족이다. 많은 PPTase의 서열이 공지되어 있고, 결정 구조가 결정되었으며 (예컨대, 문헌 [Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. "Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily" EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31] 참조), 활성에 중요한 아미노산 잔기의 돌연변이 분석을 행하였다 (문헌 [Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. "Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism" Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36] 참조). PPTase에서의 이들 불변의 고도로 보존된 아미노산은 본원에 기재한 모든 쉐바넬라 균주로부터의 pfaE ORF 내에 함유된다. 추가로, 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf2의 pfaE ORF 상동체는 천연 균주에서의 활성 (문헌 [Yazawa K. "Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria". Lipids. 1996 Mar;31 Suppl:S297-300]), 및 이의 PPTase 활성을 확인하는 표지화 실험 (WO 98/55625)에 요구되는 것으로 제시되어 있다.
PUFA를 생산하고 약 25 내지 3O℃ 이하의 온도 및 더 높은 (예컨대, 35℃) 온도에서 잘 성장하는 특정 해양 박테리아 (예컨대, 쉐바넬라 올레야나 및 쉐바넬라 자포니카)의 PUFA PKS 시스템이 본 발명의 기본이지만, 본 발명은 예를 들어 미국 특허 제6,140,486호, 미국 특허 제6,566,583호, 미국 특허 출원 제10/124,800호 및 미국 특허 출원 제10/810,352호에 기재되어 있는 다른 박테리아 및 비-박테리아 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인과 관련한 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인의 용도를 고려한다. 더욱 특히, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 유전자 변형 미생물 및 식물에 의한 생물학적 생산물의 개선 및/또는 변형된 생산을 위해, 다른 PUFA PKS 시스템과 함께 사용되어 하이브리드 구조물 및 유전자 변형 미생물 및 식물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라, 비-박테리아 PUFA PKS 기능적 도메인과 박테리아 PUFA PKS 기능적 도메인 (바람직하게는 본 발명의 것)뿐만 아니라 다른 PKS 시스템 (제I형, 제II형, 제III형) 또는 FAS 시스템으로부터의 PKS 기능적 도메인 또는 단백질을 포함하는 유전자 변형 유기체를 생산할 수 있다.
본원에서 언급되는 "비-박테리아 PUFA PKS" 시스템은 박테리아가 아닌 유기체로부터 단리된 PUFA PKS 시스템에 대한 언급이거나, 또는 박테리아가 아닌 유기체, 예컨대 진핵생물 또는 아르캐박테리아(archaebacterium)로부터의 PUFA PKS 시스템의 상동체, 또는 이로부터 유래된 상동체이다. 진핵생물은 더 고도로 분화된 세포를 가지고, 원핵생물은 덜 분화된 세포를 가진다는 세포의 분화 정도를 기초로 하여 진핵생물이 원핵생물과 구별된다. 일반적으로, 원핵생물은 핵막이 없고, 세포 분열 동안 유사분열이 나타나지 않고, 오직 하나의 염색체를 가지고, 이의 세포질이 70S 리보솜을 함유하고, 어떤 미토콘드리아, 세포질세망, 엽록체, 용해소체 또는 골지(Golgi) 장치도 보유하지 않으며, 이의 편모 (존재하는 경우)는 단일 원섬유로 구성되어 있다. 반대로, 진핵생물은 핵막이 있고, 세포 분열 동안 유사분열이 나타나고, 많은 염색체를 가지고, 이의 세포질이 80S 리보솜을 함유하고, 미토콘드리아, 세포질세망, 엽록체 (조류에서), 용해소체 및 골지 장치를 보유하며, 이의 편모 (존재하는 경우)는 많은 원섬유로 구성되어 있다. 일반적으로, 박테리아는 원핵생물이지만, 조류, 진균, 원생생물, 원충 및 고등 식물은 진핵생물이다.
비-박테리아 PUFA PKS 시스템은 상기 특허 및 특허 출원에 기재되어 있는 것을 포함하고, 특히 임의의 트라우스토키트리드로부터 단리되거나 유래된 임의의 PUFA PKS 시스템을 포함한다. 미국 특허 제6,566,583호에서, 쉐바넬라 종 균주 SCRC2738 PKS 유전자와의 상동성을 보여주는 쉬조키트리움으로부터 다수 cDNA 클론이 서열결정되었고, 다양한 클론이 2개의 부분적 오픈 리딩 프레임 및 1개의 완전한 오픈 리딩 프레임을 나타내는 핵산 서열로 조립되었다. 본원 발명의 발명자들에 의한 cDNA 및 게놈 클론의 추가의 서열결정으로 쉬조키트리움의 OrfA, OrfB 및 OrfC 각각의 전장 게놈 서열이 확인되었고, 쉐바넬라에서의 도메인과 상동성을 갖는 쉬조키트리움의 도메인이 완전히 확인되었다. 이들 유전자는 미국 특허 출원 제10/124,800호 (상기 문헌)에 상세하게 기재되어 있고, 하기에 약간 상세하게 기재되어 있다. 유사하게, 미국 특허 출원 제10/810,352호에 트라우스토키트리움 (구체적으로, 트라우스토키트리움 종 23B (ATCC 20892))의 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 유전자의 전장 게놈 서열, 및 트라우스토키트리움의 PUFA PKS 시스템을 포함하는 도메인이 상세하게 기재되어 있다.
본 발명에 따라, 어구 "오픈 리딩 프레임"은 약어 "Orf"로 표기된다. 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질은 모두 대문자로 "ORF"로서 표기될 수도 있고, 오픈 리딩 프레임의 핵산 서열은 모두 소문자로 "orf"로서 표기될 수도 있지만, 일관성을 위해 핵산 서열 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 기재하기 위해 본원에서는 "Orf"라는 철자가 우선적으로 사용됨을 염두에 두어야 한다. 언급되는 것이 단백질인지 핵산 서열인지의 여부는 용어 사용의 맥락으로부터 명백할 것이다.
도 1은 쉐바넬라 종 SCRC-2738 ("야자와(Yazawa)" 균주, 문헌 [Yazawa K. "Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria" Lipids. 1996 Mar;31 Suppl:S297-300])로부터의 PUFA PKS ("EPA 생산"이라고도 지칭됨) 클러스터 vs. 쉐바넬라 자포니카 (코스미드 3F3) 및 쉐바넬라 올레야나 (코스미드 9A10)로부터의 본 발명의 유전자 클러스터의 구조를 보여준다. 도 2는 쉐바넬라 종 SCRC-2738 ("야자와" 균주)로부터의 PUFA PKS 유전자 클러스터의 도메인 구조 vs. 쉐바넬라 자포니카 (코스미드 3F3) 및 쉐바넬라 올레야나 (코스미드 9A10)로부터의 유전자 클러스터에 의해 코딩된 것을 보여준다. 각각의 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 하기에 기재되어 있다.
쉐바넬라 자포니카 PUFA PKS
서열 1은 쉐바넬라 자포니카 코스미드 3F3에 대한 뉴클레오티드 서열이고, 표 1에 개시된 바와 같은 15개의 ORF를 함유하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 2 참조). 상기 미생물의 PUFA PKS 시스템에 관한 ORF는 하기와 같이 특성화된다.
pfaA (서열 1의 뉴클레오티드 10491 내지 18854)는 β-케토아실-신타제 (KS) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 10575 내지 12029, 서열 2의 아미노산 29 내지 513), 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 12366 내지 13319, 서열 2의 아미노산 625 내지 943), 6개의 일렬식(tandem) 아실-운반체 단백질 (ACP) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 14280 내지 16157, 서열 2의 아미노산 1264 내지 1889), β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 17280 내지 17684, 서열 2의 아미노산 2264 내지 2398), 및 본원에서 DH-모티프 영역이라고 지칭되는 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 2의 아미노산 2504 내지 2516)를 함유하는 서열 2의 아미노산 2399 및 2787 사이의 PFAS A 단백질 영역을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS A (서열 2)를 코딩한다.
PFAS A에서, C*가 아실 부착 부위인 KS 활성 부위 DXAC*는 서열 2의 아미노산 226 내지 229에 위치한다. S*가 아실 결합 부위인 MAT 활성 부위 GHS*XG는 서열 2의 아미노산 721 내지 725에 위치한다. S*가 포스포판테테인 부착 부위인 ACP 활성 부위 LGXDS*는 서열 2의 아미노산 1296 내지 1300, 아미노산 1402 내지 1406, 아미노산 1513 내지 1517, 아미노산 1614 내지 1618, 아미노산 1728 내지 1732, 및 아미노산 1843 내지 1847에 위치한다. 서열 2의 아미노산 2399와 2787 사이에, PFAS A는 또한 상기 언급된 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 2의 아미노산 2504 내지 2516)를 함유한다.
pfaB (서열 1의 뉴클레오티드 18851 내지 21130)는 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 19982 내지 20902, 서열 3의 아미노산 378 내지 684)을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS B (서열 3)를 코딩한다.
PFAS B에서, S*가 아실-부착 부위인 활성 부위 GXS*XG 모티프는 서열 3의 아미노산 463 내지 467에 위치한다.
pfaC (서열 1의 뉴클레오티드 21127 내지 27186)는 KS 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 21139 내지 22575, 서열 4의 아미노산 5 내지 483), 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 22591 내지 23439, 서열 4의 아미노산 489 내지 771), 및 DH1 (서열 1의 뉴클레오티드 25408 내지 25836, 서열 4의 아미노산 1428 내지 1570) 및 DH2 (서열 1의 뉴클레오티드 26767 내지 27183, 서열 4의 아미노산 1881 내지 2019)라고 지칭되는 2개의 FabA 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS C (서열 4)를 코딩한다.
PFAS C에서, C*가 아실 부착 부위인 KS 활성 부위 DXAC*는 서열 4의 아미노산 211 내지 214에 위치한다.
pfaD (서열 1의 뉴클레오티드 27197 내지 28825)는 에노일 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 27446 내지 28687, 서열 5의 아미노산 84 내지 497)을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS D (서열 5)를 코딩한다.
pfaE (역방향 상보적 가닥 상의 서열 1의 뉴클레오티드 6150 내지 7061)는 동정된 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 6504 내지 6944, 서열 6의 아미노산 40 내지 186)을 갖는 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)인 PFAS E (서열 6)를 코딩한다.
쉐바넬라 올레야나 PUFA PKS
서열 7은 쉐바넬라 올레야나 코스미드 9A10에 대한 뉴클레오티드 서열이고, 표 2에 개시된 바와 같이 17개의 ORF를 함유하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 2 참조). 상기 미생물의 PUFA PKS 시스템에 관한 ORF는 하기와 같이 특성화된다.
pfaA (서열 7의 뉴클레오티드 17437 내지 25743)는 β-케토아실-신타제 (KS) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 17521 내지 18975, 서열 8의 아미노산 29 내지 513), 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 19309 내지 20265, 서열 8의 아미노산 625 내지 943), 6개의 일렬식 아실-운반체 단백질 (ACP) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 21259 내지 23052, 서열 8의 아미노산 1275 내지 1872), β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 24154 내지 24558, 서열 8의 아미노산 2240 내지 2374), 및 본원에서 DH-모티프 영역이라고 지칭되는 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 8의 아미노산 2480 내지 2492)를 함유하는 서열 8의 아미노산 2241과 2768 사이에 PFAS A 단백질 영역을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS A (서열 8)를 코딩한다.
PFAS A에서, C*가 아실 부착 부위인 KS 활성 부위 DXAC*는 서열 8의 아미노산 226 내지 229에 위치한다. S*가 아실 결합 부위인 MAT 활성 부위 GHS*XG는 서열 8의 아미노산 721 내지 725에 위치한다. S*가 포스포판테테인 부착 부위인 ACP 활성 부위 LGXDS*는 서열 8의 아미노산 1307 내지 1311, 아미노산 1408 내지 1412, 아미노산 1509 내지 1513, 아미노산 1617 내지 1621, 아미노산 1721 내지 1725, 및 아미노산 1826 내지 1830에 위치한다. 서열 8의 아미노산 2241과 2768 사이에 PFAS A는 또한 상기 언급된 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 8의 아미노산 2480 내지 2492)를 함유한다.
pfaB (서열 7의 뉴클레오티드 25740 내지 27971)는 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 26837 내지 27848, 서열 9의 아미노산 366 내지 703)을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS B (서열 9)를 코딩한다.
PFAS B에서, S*가 아실-부착 부위인 활성 부위 GXS*XG 모티프는 서열 9의 아미노산 451 내지 455에 위치한다.
pfaC (서열 7의 뉴클레오티드 27968 내지 34030)는 KS 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 27995 내지 29431, 서열 10의 아미노산 10 내지 488), 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 29471 내지 30217, 서열 10의 아미노산 502 내지 750), 및 DH1 (서열 7의 뉴클레오티드 32258 내지 32686, 서열 10의 아미노산 1431 내지 1573) 및 DH2 (서열 7의 뉴클레오티드 33611 내지 34027, 서열 10의 아미노산 1882 내지 2020)라고 지칭되는 2개의 FabA 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS C (서열 10)를 코딩한다.
PFAS C에서, C*가 아실 부착 부위인 KS 활성 부위 DXAC*는 서열 10의 아미노산 216 내지 219에 위치한다.
pfaD (서열 7의 뉴클레오티드 34041 내지 35669)는 에노일 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 34290 내지 35531, 서열 11의 아미노산 84 내지 497)을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS D (서열 11)를 코딩한다.
pfaE (역방향 상보적 가닥 상의 서열 7의 뉴클레오티드 13027 내지 13899)는 동정된 도메인 (서열 7의 뉴클레오티드 13369 내지 13815, 서열 12의 아미노산 29 내지 177)을 갖는 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)인 PFAS E (서열 12)를 코딩한다.
상기 기재된 쉐바넬라 균주로부터의 pfaC ORF 및 쉐바넬라 올레야나로부터의 pfaE ORF 둘다 이들의 출발 코돈으로서 TTG를 갖는 것으로 예측된다. TTG가 ATG 및 GTG보다 박테리아에서 덜 통상적인 출발 코돈이기 때문에, 이는 이. 콜라이 유전자의 1.1％ 및 바실러스 섭틸리스 유전자의 11.2％에 대해 출발 코돈인 것으로 예측된다 (문헌 [Hannenhalli SS, Hayes WS, Hatzigeorgiou AG, Fickett JW. "Bacterial start site prediction". Nucleic Acids Res. 1999 Sep 1;27(17):3577-82] 참조). 이들 ORF가 TTG 코돈에서 출발한다는 여러 일련의 증거가 있다. 첫째, 모든 컴퓨터 유전자 검색 툴 (이지젠(EasyGene) 및 젠마크(GeneMark).hmm)는 이들 3개의 ORF에 대한 TTG 출발 코돈을 예측한다. 둘째, 이들 3개의 ORF 중 TTG 출발부로부터의 번역은 진뱅크(GenBank) 데이타베이스의 상동성 유전자와 동일 및 유사한 단백질 잔기의 공간적 배치 및 범위를 보존한다. 이들 유전자의 TTG 출발 코돈에 대한 또다른 일련의 증거는 예측된 리보솜 결합 부위 (RBS)이다. RBS는 출발 코돈의 대략 7 내지 12개의 상류 뉴클레오티드이고, 통상적으로 퓨린이 풍부하다. 표 5 (실시예 2 참조)는 모든 pfa ORF의 상류 영역 및 가능한 RBS를 보여준다. 모든 pfaC ORF는 TTG 출발 코돈의 표준적 RBS 상류에 대한 매우 고도의 상동성을 나타낸다. TTG 출발 코돈을 갖는 이들 3개의 ORF에 대한 대안적인 출발 코돈 및 RBS가 또한 표 5에 제시되어 있다. 또한 본원에 기재한 쉐바넬라 균주로부터의 pfaE ORF가 쉐바넬라 종 SCRC-2738 (진뱅크 관리 번호 U73935)로부터의 EPA 생합성 클러스터로부터의 orf2에 대해 상동적이라는 것을 염두에 두어야 한다. 표시된 ATG로부터의 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf2의 발현은 이종 발현 시스템에서의 EPA 생산을 지지하지 않는 것으로 제시되어 있다 (PCT 공개 제WO 98/55625호 참조). 별도의 상류 출발 코돈 TTG가 발현에 사용되는 경우에 EPA 생산이 이종 발현 시스템에서 관찰되었다. 본원에 기재한 두 개의 pfaE ORF에 대한 출발 코돈은 쉐바넬라 종 SCRC-2738의 orf2로부터의 별도의 TTG 출발 코돈으로부터 코딩되는 것과 유사 및 동일한 아미노산을 코딩한다 (도 4). 이 역시 쉐바넬라 올레야나로부터의 pfaE ORF에 대한 TTG 출발을 지지한다. 최종적으로, 두 쉐바넬라 균주로부터의 pfaC ORF 출발 코돈은 pfaB 정지 코돈과 중복된다 (도 3). ORF의 중복은 박테리아 오페론의 공통적 특징이며, 전사 수준에서 2개 이상의 유전자를 커플링시키는 하나의 수단인 것으로 생각되어진다.
본 발명의 한 실시양태는 본원에 기재한 박테리아 PUFA PKS 시스템으로부터 단리된 단백질 또는 도메인, 그의 상동체, 및/또는 그의 단편에 관한 것이다. 또한, 본원에 기재한 임의의 단백질, 도메인 또는 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 (하기에서 상세하게 논의됨)가 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따라, 단리된 단백질 또는 펩티드, 예컨대 PUFA PKS 시스템으로부터의 단백질 또는 펩티드는 그의 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간 조작을 가한) 그의 단백질 또는 단편 (폴리펩티드 또는 펩티드를 포함)이며, 예를 들어 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합으로 생산된 단백질, 및 합성적으로 생산된 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, "단리된"은 단백질이 정제된 정도를 반영하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 단백질은 재조합으로 생산된다. 단리된 펩티드는 합성적으로 (예컨대, 펩티드 합성과 같은 화학적으로) 또는 재조합으로 생산될 수 있다. 또한, 예로써 "쉐바넬라 자포니카 PUFA PKS 단백질"은 쉐바넬라 자포니카 미생물로부터의 PUFA PKS 단백질 (일반적으로 천연 발생 PUFA PKS 단백질의 상동체를 포함), 또는 쉐바넬라 자포니카로부터의 천연 발생 PUFA PKS 단백질의 구조 (예컨대, 서열) 및 혹은 기능에 대한 지식으로부터 다른 방법으로 생산된 PUFA PKS 단백질을 지칭한다. 바꿔 말하면, 일반적으로 언급되는 쉐바넬라 자포니카 PUFA PKS 단백질은 쉐바넬라 자포니카로부터의 천연 발생 PUFA PKS 단백질과 실질적으로 유사한 구조 및 기능을 가지거나, 또는 본원에 상세하게 기재된 바와 같은 쉐바넬라 자포니카로부터의 천연 발생 PUFA PKS 단백질의 생물학적으로 활성인 (즉, 생물학적 활성을 보유하는) 상동체인 임의의 PUFA PKS 단백질을 포함한다. 따라서, 쉐바넬라 자포니카 PUFA PKS 단백질은 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합 단백질, 돌연변이/변형된 단백질 및 합성 단백질을 포함할 수 있다. 동일한 설명이 본원에 기재한 다른 단백질 또는 펩티드, 예컨대 쉐바넬라 올레야나로부터의 PUFA PKS 단백질 및 도메인에 대해 적용된다.
본 발명에 따라, 용어 "변형" 및 "돌연변이"는 특히 본원에 기재한 단백질 또는 펩티드의 제1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 변형/돌연변이에 대해 구별없이 사용될 수 있다. 용어 "변형"은 또한 메틸화, 파르네실화, 카르복시메틸화, 게라닐 게라닐화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화 및/또는 아미드화 등이 있으나 이에 제한되지 않는, 단백질 또는 펩티드에서의 번역후 변형을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 변형은 또한 예를 들어, 단백질 또는 펩티드의 또다른 화합물과의 착화를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 변형이 천연 야생형 단백질 또는 펩티드에서 발생하는 번역후 변형과 다른 경우에 돌연변이인 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상동체"는 천연 발생 단백질 또는 펩티드에서의 1회 이상의 소 변형 또는 돌연변이에 의해 천연 발생 단백질 또는 펩티드 (즉, "원형" 또는 "야생형" 단백질)와는 다르지만, 천연 발생 형태의 전반적인 기본 단백질 및 측쇄 구조를 유지하는 (즉, 상동체가 야생형 단백질과 관련되는 것임을 식별할 수 있도록) 단백질 또는 펩티드를 지칭하는데 사용된다. 이러한 변화로는 하나 이상의 아미노산 측쇄의 변화, 결실 (예컨대, 단백질 또는 펩티드의 말단절단형(truncated) 버전), 삽입 및/또는 치환을 비롯한 하나 이상의 아미노산의 변화, 하나 이상의 원자의 입체화학 변화, 및/또는 메틸화, 파르네실화, 게라닐 게라닐화, 글리코실화, 카르복시메틸화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화 및/또는 아미드화 등이 있으나 이에 제한되지 않는 부차적인 유도체화 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상동체는 천연 발생 단백질 또는 펩티드와 비교하여 증진 또는 감소되거나, 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 바람직한 상동체는 하기에 상세하게 기재되어 있다. 상동체는 합성적으로 생산된 상동체, 주어진 단백질 또는 도메인의 천연 발생 대립유전자 변이체, 또는 기준 서열이 유래된 유기체 이외의 유기체로부터의 상동성 서열을 포함할 수 있음을 염두에 두어야 한다.
보존적 치환은 전형적으로 글리신 및 알라닌, 발린, 이소루이신 및 루이신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 및 글루타민, 세린 및 트레오닌, 리신 및 아르기닌, 및 페닐알라닌 및 티로신 기 내에서의 치환을 포함한다. 치환은 또한 보존된 소수성 또는 친수성 (문헌 [Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105 (1982)])에 근거하거나, 또는 유사한 폴리펩티드 2차 구조의 추정 능력 (문헌 [Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978)])에 근거하여 이루어질 수 있다.
상동체는 천연 대립유전자 변이 또는 천연 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산의 천연 발생 대립유전자 변이체는 상기 단백질을 코딩하는 유전자와 본질적으로 동일한 게놈의 유전자좌 (또는 유전자좌들)에서 발생하는 유전자이지만, 예를 들어 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발되는 천연 변이로 인해 유사하지만 동일하지는 않은 서열을 가진다. 대립유전자 변이체는 전형적으로 비교대상 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성과 유사한 활성을 보유하는 단백질을 코딩한다. 대립유전자 변이체의 한 부류는 동일한 단백질을 코딩할 수 있지만, 유전자 코드의 동의성(degeneracy)으로 인해 상이한 핵산 서열을 갖는다. 대립유전자 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3' 비-번역 영역 (예컨대, 조절성 제어 영역)에서의 변경을 포함할 수 있다. 대립유전자 변이체는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
상동체는 예를 들어, 무작위 또는 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위해 전형적 또는 재조합 DNA 기술을 사용한 단리된 천연 발생 단백질에 대한 직접 변형, 직접 단백질 합성, 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 변형 등이 있으나 이에 제한되지 않는, 단백질의 생산에 대한 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
야생형 단백질과 비교한 단백질 상동체에서의 변형 또는 돌연변이는 천연 발생 (야생형) 단백질과 비교하여 상동체의 기본적인 생물학적 활성을 증가, 또는 감소시키거나, 또는 실질적으로 변화시키지 않는다. 일반적으로, 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체내 (즉, 단백질의 천연 생리적 환경 내) 또는 시험관내 (즉, 실험실 조건 하에) 측정 또는 관찰된 바와 같은, 단백질의 천연 발생 형태라고 일컬어지는 단백질에 의해 제시 또는 수행되는 임의의 기능(들)을 지칭한다. PUFA PKS 시스템, 및 PUFA PKS 시스템을 구성하는 각각의 단백질/도메인의 생물학적 활성은 본원의 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다. 단백질, 예컨대 상동체에서의 변형은 천연 발생 단백질과 동일한 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 또는 천연 발생 단백질과 비교하여 감소 또는 증가된 생물학적 활성을 보유하는 단백질을 야기할 수 있다. 단백질 발현의 감소 또는 단백질 활성의 감소를 야기하는 변형은 단백질의 불활성화 (완전 또는 부분), 하향 조절, 또는 감소된 작용 (또는 활성)이라고 지칭될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현의 증가 또는 단백질 활성의 증가를 야기하는 변형은 단백질의 증폭, 과다생산, 활성화, 증대, 상향 조절, 또는 증가된 작용 (또는 활성)이라고 지칭될 수 있다. 일반적으로 언급되는 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 상동체는 상동체가 특히 생물학적 활성의 수준에 대해 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 보유한다는 것을 반드시 의미하는 것이 아니라는 사실을 염두에 두어야 한다. 오히려, 상동체는 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성보다는 야생형 단백질과 비교하여 감소 또는 증가된 수준의 활성에서 수행할 수 있다. PUFA PKS 시스템의 기능적 도메인은 생물학적 기능을 수행할 수 있는 (즉, 생물학적 활성을 보유하는) 도메인이다 (즉, 도메인은 단백질의 일부가 될 수 있음).
PUFA PKS 단백질 또는 도메인 생물학적 활성을 탐지 및 측정하는 방법으로는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 전사의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 번역의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 번역후 변형의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 효소 활성의 측정, 및/또는 PUFA PKS 시스템의 1종 이상의 생산물의 생산 (예컨대, PUFA 생산) 측정 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 단리된 단백질 (상동체 포함)이 반드시 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유할 필요가 없다는 것을 염두에 두어야 한다. 예를 들어, PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 예를 들어 말단절단형, 돌연변이형 또는 불활성 단백질일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 스크리닝 분석에 유용하거나, 또는 항체 생성과 같은 다른 목적에 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질은 (상기 논의된 바와 같이, 반드시 동등하지는 않지만) 야생형 단백질의 활성과 유사한 생물학적 활성을 보유한다.
단백질 발현 수준의 측정 방법으로는 일반적으로 웨스턴(Western) 블럿팅, 면역블럿팅, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사면역검정법 (RIA), 면역침강법, 표면 플라즈몬 공명법, 화학발광법, 형광 편광법, 인광법, 면역조직화학 분석법, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 (MALDI-TOF) 질량 분광법, 미세유세포분석법, 미세배열법, 현미경검사법, 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 및 유세포분석법뿐만 아니라, 효소 활성 또는 다른 단백질 파트너와의 상호작용이 있으나 이에 제한되지 않는 단백질의 특성에 근거한 검정법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 결합 분석은 또한 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 비아코어(BIAcore) 기기를 사용하여 2종의 단백질 사이의 복합체 결합 상수를 측정할 수 있다. 복합체에 대한 해리 상수는 완충제가 칩 위를 통과할 때의 시간에 대한 굴절률의 변화를 모니터링함으로써 측정될 수 있다 (문헌 ([O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457 (1993)] 및 [Schuster et al., Nature 365:343 (1993)]) 참조). 한 단백질의 또다른 단백질에의 결합을 측정하는 다른 적합한 검정은 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA) 및 방사면역검정법 (RIA)과 같은 면역검정법, 또는 형광, UV 흡수, 원편광 2색성 또는 핵자기공명 (NMR)을 통해 단백질의 분광학적 또는 광학적 특성의 변화를 모니터링함으로써 결합을 측정하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나, 또는 그의 생물학적 활성 도메인 또는 단편으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 단리된 단백질에 관한 것이다. 서열 2 내지 서열 6 및 서열 8 내지 서열 12로 나타내어지는 PUFA PKS 단백질 내에 함유되는 도메인은 상기에 상세하게 기재되어 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 내지 서열 6 및 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 이러한 상동체는 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되고, 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나로부터의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 하나로부터의 도메인와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 하나로 나타내어지는 PUFA PKS 단백질의 도메인의 상동체에 관한 것이다. 추가의 다른 실시양태에서, 상기 상동체는 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나, 또는 이들 서열 내에 함유된 도메인와 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다. 상기와 같이, 상동체는 바람직하게는 자신이 유래된 또는 관련된 단백질 또는 도메인 (즉, 기준 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 도메인)의 생물학적 활성을 보유한다.
본 발명의 한 실시양태는 서열 2로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 2 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 2 내의 생물학적 활성 도메인와 약 65％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 2로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 2 또는 그의 도메인과 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 65％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 3으로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 3 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 3 내의 생물학적 활성 도메인와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 3으로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 3 또는 그의 도메인와 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 4로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 4 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 4 내의 생물학적 활성 도메인과 약 70％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 4로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 4 또는 그의 도메인과 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 5로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 5 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 5 내의 생물학적 활성 도메인과 약 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 5로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 5 또는 그의 도메인과 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 6으로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 6 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 6 내의 생물학적 활성 도메인와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 6으로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 6 또는 그의 도메인와 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 8로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 8 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 8 내의 생물학적 활성 도메인와 약 65％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 8로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 8 또는 그의 도메인과 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 9로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 9 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 9 내의 생물학적 활성 도메인와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 9로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 9 또는 그의 도메인와 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 10으로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 10 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 10 내의 생물학적 활성 도메인과 약 70％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 10으로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 10 또는 그의 도메인과 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 11로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 11 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 11 내의 생물학적 활성 도메인과 약 85％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 11로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 11 또는 그의 도메인과 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 서열 12로 나타내어지는 상응하는 단백질 내에 함유된 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하며, 서열 12 또는 본원에 상술된 바와 같은 서열 12 내의 생물학적 활성 도메인와 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열 12로 나타내어지는 단백질의 단리된 상동체에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상동체는 서열 12 또는 그의 도메인와 약 65％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 96％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 97％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 98％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 약 99％ (또는 60％ 내지 99％ 사이에서 1％씩의 증가분을 갖는 임의의 비율(％)) 이상 동일하다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재한 특정 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 상동체를 비롯하여 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은, 본원에 기재한 바와 같은 하나 이상의 도메인 또는 단백질의 생물학적 활성을 보유하며 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열의 약 100개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 측면에서, 단백질의 아미노산 서열은 임의의 서열 2 내지 서열 6 또는 서열 8 내지 서열 12의 약 200개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 300개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 400개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 500개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 600개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 700개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 800개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 900개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 1000개 이상의 연속적인 아미노산을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질 또는 도메인은 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 또는 그의 임의의 생물학적 활성 단편 또는 도메인으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재한 상기 언급된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 생물학적 활성 도메인은 1) 서열 2의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 2) 서열 2의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 3) 서열 2의 위치 약 1264 내지 위치 약 1889로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인, 4) 서열 2의 위치 약 2264 내지 위치 약 2398로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 5) 서열 2의 위치 약 2504 내지 위치 약 2516을 포함하는 서열이며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 비-FabA-유사 DH 활성을 보유하는 도메인, 6) 서열 3의 위치 약 378 내지 위치 약 684로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 7) 서열 4의 위치 약 5 내지 위치 약 483으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 8) 서열 4의 위치 약 489 내지 위치 약 771로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 9) 서열 4의 위치 약 1428 내지 위치 약 1570으로 이루어지며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 FabA-유사 DH 활성을 보유하는 도메인, 10) 서열 4의 위치 약 1881 내지 위치 약 2019로 이루어지며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 FabA-유사 DH 활성을 보유하는 도메인, 11) 서열 5의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 12) 서열 6의 위치 약 40 내지 위치 약 186으로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 13) 서열 8의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 14) 서열 8의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 15) 서열 8의 위치 약 1275 내지 위치 약 1872로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인, 16) 서열 8의 위치 약 2240 내지 위치 약 2374로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 17) 서열 8의 위치 약 2480 내지 위치 약 2492를 포함하며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 비-FabA-유사 DH 활성을 보유하는 서열, 18) 서열 9의 위치 약 366 내지 위치 약 703으로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 19) 서열 10의 위치 약 10 내지 위치 약 488로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 20) 서열 10의 위치 약 502 내지 위치 약 750으로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 21) 서열 10의 위치 약 1431 내지 위치 약 1573으로 이루어지며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 FabA-유사 DH 활성을 보유하는 도메인, 22) 서열 10의 위치 약 1882 내지 위치 약 2020으로 이루어지며, DH 생물학적 활성, 바람직하게는 FabA-유사 DH 활성을 보유하는 도메인, 23) 서열 11의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인, 또는 24) 서열 12의 위치 약 29 내지 위치 약 177로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다.
본 발명에 따라, 본원에 기재한 핵산 또는 아미노산 서열과 관련된 용어 "인접한(contiguous)" 또는 "연속적인(consecutive)"은 하나의 파손되지 않은 서열로 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 제1 서열이 제2 서열의 30개의 인접한 (또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은 제2 서열 내의 30개의 아미노산 잔기의 파손되지 않은 서열과 100％ 동일한 30개의 아미노산 잔기의 파손되지 않은 서열을 제1 서열이 포함한다는 것을 의미한다. 유사하게, 제1 서열이 제2 서열과 "100％ 동일성"을 갖는다는 것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 사이의 갭 없이 제1 서열이 제2 서열에 정확하게 매치한다는 것을 의미한다.
달리 명시하지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같은 동일성(％)은 (1) 모두 표준 디폴트 파라미터를 이용하며 검색 서열의 낮은 복합도 영역은 디폴트에 의해 필터링되는, 아미노산 서치용 blastp, 핵산 서치용 blastn, 및 모든 6개 오픈 리딩 프레임에서의 핵산 서치 및 번역된 아미노산의 서치용 blastX를 사용한 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 서치 (그 전문이 본원에 참고로 도입되어 있는 문헌 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. ＆ Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기재됨), (2) BLAST 2 정렬 (하기 기재되는 파라미터를 사용함), 및/또는 (3) 표준 디폴트 파라미터로의 PSI-BLAST (위치-특이적 반복 블라스트(Position-Specific Iterated BLAST)를 사용하여 수행되는 상동성의 평가를 지칭한다. BLAST 2.0 Basic BLAST 및 BLAST 2 사이의 표준 파라미터의 약간의 차이로 인해, 2개의 특정 서열이 BLAST 2 프로그램을 사용한 경우 상당한 상동성을 갖는 것으로 인식되는 반면, 그 서열 중 하나를 검색 서열로서 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행된 서치는 제2 서열을 최고 매치로 식별하지 않을 수 있음을 염두에 두어야 한다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체의 탐색에 대한 고감도 방식인, "프로파일" 서치의 사용하기 쉬운 자동화 버전을 제공한다. 이 프로그램은 먼저 gapped BLAST 데이타베이스 서치를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 얻어진 임의의 유의한 정렬로부터의 정보를 사용하여 위치-특이적 스코어 매트릭스를 구축하고, 이는 다음 라운드의 데이타베이스 서치에서 검색 서열을 대체한다. 따라서, 동일성(％)은 이들 프로그램 중 어느 하나를 사용함으로써 결정될 수 있는 것으로 이해되어진다.
2개의 특정 서열을 그 전문이 본원에 참고로 도입되어 있는 문헌 [Tatusova and Madden, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247 (1999)]에 기재된 바와 같은 BLAST 2 서열을 사용하여 서로 정렬할 수 있다. BLAST 2 서열 정렬은 2개의 서열 사이의 Gapped BLAST 서치 (BLAST 2.0)를 수행하여 생성된 정렬에 갭의 도입 (결실 및 삽입)을 허용하는 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 blastp 또는 blastn에서 수행된다. 본원에서 명확하게 하기 위해, BLAST 2 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 사용하여 수행된다:
blastn의 경우, 0 블로섬(BLOSUM)62 매트릭스를 사용:
Figure 112007034967763-PCT00001
blastp의 경우, 0 블로섬62 매트릭스를 사용:
Figure 112007034967763-PCT00002
본 발명에 따라, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열은 본원에 상세하게 기재한 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 (예컨대, KS 도메인, AT 도메인, CLF 도메인 등)의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열이다. 따라서, 본 발명에 유용한 단리된 단백질은 임의의 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임의 번역 생산물, 임의의 PUFA PKS 도메인, 이러한 번역 생산물 또는 도메인의 임의의 생물학적 활성 단편, 또는 생물학적 활성을 보유하는 천연 발생 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임 생산물 또는 도메인의 임의의 상동체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열은, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 중간 정도, 높은, 또는 매우 높은 엄격도 조건 (하기에 기재됨) 하에 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (즉, 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 가닥의 상보체)에 혼성화할 수 있다고 본원에 구체적으로 기재한 천연 발생 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩티드와 충분히 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열은 중간 정도, 높은, 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에 PUFA PKS 단백질 또는 도메인에 대한 임의의 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 상보적 서열의 추론 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 아미노산 서열결정 및 핵산 서열결정 기술이 오차가 전혀 없는 것은 아니기 때문에, 본원에 나타내는 서열은 본 발명의 PUFA PKS 도메인 및 단백질의 식별할 수 있는 서열을 최대한으로 나타내는 것임을 염두에 두어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 혼성화 조건은 핵산 분자를 사용해 유사한 핵산 분자를 확인하는 표준 혼성화 조건을 지칭한다. 이러한 표준 조건은 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)]에 개시되어 있다. 동일 문헌 [Sambrook et al]은 그 전문이 본원에 참고로 도입되어 있다 (구체적으로, 9.31-9.62 면 참조). 또한, 뉴클레오티드의 미스매치 정도를 다양하게 하는 혼성화를 달성하기 위한 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산하는 식은 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 도입되어 있는 문헌 [Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267 (1984)]에 개시되어 있다.
더욱 특히, 본원에 지칭된 바와 같은 중간 정도의 엄격도 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브(probe)로 사용되는 핵산 분자와 약 70％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드가 약 30％ 이하 미스매치되도록 하는 조건)을 지칭한다. 본원에 지칭된 바와 같은 높은 엄격도 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드가 약 20％ 이하 미스매치되도록 하는 조건)을 지칭한다. 본원에 지칭된 바와 같은 매우 높은 엄격도 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 약 90％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자가 단리되도록 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드가 약 10％ 이하 미스매치되도록 하는 조건)을 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 당업자는 동일 문헌 [Meinkoth et al]에서의 식을 사용하여 이러한 특정 수준의 뉴클레오티드 미스매치를 달성하기 위한 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산할 수 있다. 상기 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드가 형성되는지의 여부에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 계산된 융점은 DNA:RNA 하이브리드에서보다 10℃ 낮다. 특정 실시양태에서, DNA:DNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은 적절한 세척 조건과 함께, 약 20℃ 내지 약 35℃ (낮은 엄격도), 더욱 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃ (더욱 엄격함), 훨씬 더욱 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 45℃ (훨씬 더욱 엄격함) 온도에서 6X SSC (0.9 M Na+)의 이온 강도에서의 혼성화를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA:RNA 하이브리드에 대한 엄격한 혼성화 조건은 유사하게 엄격한 세척 조건과 함께, 약 30℃ 내지 약 45℃, 더욱 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 55℃ 온도에서 6X SSC (0.9 M Na+)의 이온 강도에서의 혼성화를 포함한다. 이들 값은 약 100개 뉴클레오티드보다 큰 분자, 0％ 포름아미드 및 약 40％의 G + C 함량에 대한 융점의 계산을 기초로 한다. 별법으로, Tm은 상기 문헌 [Sambrook et al]의 9.31 내지 9.62 면에 기술된 바와 같이 경험적으로 계산될 수 있다. 일반적으로, 세척 조건은 가능한 한 엄격해야 하고, 선택된 혼성화 조건에 대해 적합해야 한다. 예를 들어, 혼성화 조건은 특정 하이브리드의 계산된 Tm의 대략 20 내지 25℃ 낮은 온도 조건 및 염의 조합을 포함할 수 있고, 세척 조건은 전형적으로 특정 하이브리드의 계산된 Tm의 대략 12 내지 20℃ 낮은 온도 조건 및 염의 조합을 포함한다. DNA:DNA 하이브리드와 함께 사용하기에 적합한 혼성화 조건의 한 예는 약 42℃에서 6X SSC (50％ 포름아미드)에서의 2 내지 24시간 혼성화 후에, 약 2X SSC 및 실온에서 1회 이상 세척한 다음 더 높은 온도 및 더 낮은 이온 강도에서 추가로 세척 (예컨대, 약 0.1X 내지 0.5X SSC 및 약 37℃에서 1회 이상 세척한 다음, 약 0.1X 내지 0.5X SSC 및 약 68℃에서 1회 이상 세척)하는 것을 포함하는 세척 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 융합 절편에 부착되어 있는 임의의 PUFA PKS 단백질 또는 도메인, 또는 그의 임의의 상동체 또는 단편을 포함한다. 본 발명으로 사용하기에 적합한 융합 절편으로는 단백질의 안정성을 증진시킬 수 있고, 다른 바람직한 생물학적 활성을 제공할 수 있고/있거나, (예컨대, 친화 크로마토그래피에 의해) 단백질의 정제를 보조할 수 있는 절편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 적합한 융합 절편은 목적하는 기능 (예컨대, 증가된 안정성, 용해도, 생물학적 활성을 부여하고/하거나, 단백질의 정제를 단순화시킴)을 갖는 임의 크기의 도메인일 수 있다. 융합 절편은, 목적하는 단백질의 간편한 회수를 가능케 하기 위해 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단에 결합되어 절단하기 쉬울 수 있다. 융합 단백질은 바람직하게는 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 단백질의 카르복실 및/또는 아미노 말단 말단부에 부착되어 있는 융합 절편을 포함하는 단백질을 코딩하는 융합 핵산 분자로 형질감염된 재조합 세포를 배양함으로써 생산된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기-기재된 임의의 PUFA PKS 아미노산 서열 및 상기 서열의 상동체는 주어진 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 말단부 각각에 플랭킹(flanking)된 1개 이상 내지 약 20개 이하의 추가의 이종 아미노산과 함께 생산될 수 있다. 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 주어진 아미노산 서열을 "으로 본질적으로 구성되는"이라고 지칭될 수 있다. 본 발명에 따라, 이종 아미노산은 주어진 아미노산 서열에 플랭킹되는 천연적으로는 발견되지 않는 (즉, 생체내에서 천연 발견되지 않는) 아미노산의 서열, 또는 유전자에 존재할 때 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 천연 발생 핵산 서열에 플랭킹된 천연 발생 서열 내의 뉴클레오티드가 주어진 아미노산 서열이 유래된 유기체에 대한 표준 코돈 사용법을 사용하여 번역되는 경우에 상기 뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 아미노산의 서열이다. 유사하게, 어구 "으로 본질적으로 구성되는"은 본원에서 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 말단부 각각에서 1개 이상 내지 약 60개 이하의 추가의 이종 뉴클레오티드에 의해 플랭킹될 수 있는 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 플랭킹된 이종 뉴클레오티드는 천연 유전자에 존재할 때 천연적으로는 발견되지 않는다 (즉, 생체내에서 천연 발견되지 않음).
본 발명의 단백질 또는 도메인, 및/또는 그의 상동체 또는 단편의 최소 크기는 한 측면에서, 필수적 생물학적 활성을 보유하기에 충분한 크기, 또는 항체 생성에 대한 항원으로서 또는 시험관내 검정에서의 표적으로서 작용하기에 충분한 크기이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 약 8개 이상 아미노산의 길이 (예컨대, 항체 에피토프에 적합하거나 또는 검정에서 검출가능한 펩티드로서 적합함), 또는 약 25개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 50개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 100개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 150개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 200개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 250개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 300개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 350개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 400개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 450개 이상 아미노산의 길이, 또는 약 500개 이상 아미노산의 길이, 또는 8개 아미노산 내지 본 발명의 단백질 또는 도메인의 전장 또는 정수 단위 (예컨대, 8, 9, 10,...25, 26,...500, 501,...)로 더 긴 길이 이하의 임의의 길이이다. 단백질이 PUFA PKS 단백질, 도메인의 일부, 또는 그의 생물학적으로 활성이거나 유용한 단편, 또는 전장 PUFA PKS 단백질 또는 도메인, 및 필요한 경우 추가의 서열 (예컨대, 융합 단백질 서열)을 포함할 수 있다는 점에서 상기 단백질의 최대 크기에는 실제적인 제한 이외에 제한이 없다.
본 발명의 한 실시양태는 본원에 기재한 임의의 PUFA PKS 단백질 또는 도메인, 및 임의의 상기 단백질 또는 도메인의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 그에 완전히 상보적인 핵산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 천연 발견되는 게놈 또는 염색체인 그의 천연 환경으로부터 수거된 (즉, 인간 조작을 가한) 핵산 분자이다. 따라서, "단리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 반드시 반영하지는 않지만, 분자는 핵산 분자가 천연 발견되는 완전한 게놈 또는 완전한 염색체를 포함하지 않는다는 것을 나타낸다. 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라 유전자와 연관된 코딩 영역 및 조절성 영역을 포함하는 염색체의 단편이며, 본원에 기재한 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 다른 단백질을 코딩하는 다른 유전자 이외에 상기 염색체 상에서 천연 발견되는 추가의 유전자는 없다. 단리된 핵산 분자는 또한 통상적으로 특정한 천연 핵산 서열에 플랭킹되지 않는 추가의 핵산 (즉, 이종 서열)이 (즉, 서열의 5' 및/또는 3' 말단부에서) 플랭킹된 특정 핵산 서열을 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예컨대, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예컨대, cDNA)를 포함할 수 있다. 어구 "핵산 분자"가 주로 물리적 핵산 분자를 지칭하고, 어구 "핵산 서열"이 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드의 서열을 지칭하지만, 2개의 어구는 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대해 구별없이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 생산된다. 단리된 핵산 분자는, 변형이 본원에 기재한 바와 같은 PUFA PKS 시스템 생물학적 활성에 대한 목적하는 효과를 제공하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환, 및/또는 반전된 천연 대립유전자 변이체 및 변형된 핵산 분자 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 천연 핵산 분자 및 이의 상동체를 포함한다. 단백질 상동체 (예컨대, 핵산 상동체에 의해 코딩된 단백질)는 상기에 상세하게 논의되었다.
핵산 분자 상동체는 당업자에게 공지된 수많은 방법을 사용하여 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)] 참조). 예를 들어, 핵산 분자는 전형적인 돌연변이유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이의 유도를 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 PCR 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "형성"하기 위한 혼합물 군의 라이게이션, 및 이들의 조합 등이 있으나 이에 제한되지 않는 다양한 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 핵산 분자 상동체는 핵산 및/또는 야생형 유전자와의 혼성화에 의해 코딩되는 단백질의 기능에 대해 스크리닝하여 변형된 핵산의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 최소 크기는 본 발명의 핵산 분자의 상보적 서열과 (예컨대, 중간 정도, 높은 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에) 안정한 하이브리드를 형성할 수 있는 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하기에 충분한 크기, 또는 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하기에 충분한 크기이다. 따라서, 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 크기는 핵산 조성, 및 핵산 분자와 상보적 서열 사이의 상동성(％) 또는 동일성(％)뿐만 아니라 혼성화 조건 그 자체 (예컨대, 온도, 염 농도 및 포름아미드 농도)에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 핵산 분자의 최소 크기는 전형적으로 핵산 분자에 GC가 풍부한 경우에는 약 12 이상 내지 약 15개 뉴클레오티드의 길이이고, AT가 풍부한 경우에는 약 15 이상 내지 약 18개 염기의 길이이다. 핵산 분자가 PUFA PKS 시스템의 도메인의 생물학적 활성 단편, PUFA PKS 시스템의 전체 도메인, PUFA PKS 시스템의 오픈 리딩 프레임 (Orf) 내의 다수의 도메인, PUFA PKS 시스템의 전체 단일- 또는 다중-도메인 단백질, 또는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 단백질을 코딩하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다는 점에서 본 발명의 핵산 분자의 최대 크기에는 실제적인 제한 이외에 제한이 없다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 본원에 기재한 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나로부터의 임의의 아미노산 서열 또는 이의 상동체를 비롯한 임의의 상기-기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 한 측면에서, 상기 핵산 서열은 본원에 기재한 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 단백질을 코딩하는 서열 1 또는 서열 7, 또는 서열 1 또는 서열 7의 임의의 단편 (절편, 일부)의 군으로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 상기 핵산 서열은 본원에 기재한 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 단백질을 코딩하는 서열 1 또는 서열 7의 임의의 상동체, 또는 서열 1 또는 서열 7의 임의의 단편을 포함한다 (상기 서열과 약 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 서열 포함). 또다른 측면에서, 상기 핵산 서열의 단편 및 임의의 상보적 서열은 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인 (또는 그의 상동체 또는 단편)을 갖는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 재조합 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 서열은 상기에 상세하게 기재되어 있다. 본 발명에 따라, 재조합 벡터는, 선택된 핵산 서열을 조작하고 그 핵산 서열을 숙주 세포에 도입시키기 위한 도구로서 사용되는 유전자조작된 (즉, 인공적으로 생산된) 핵산 분자이다. 따라서, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 클로닝, 서열결정 및/또는 (예를 들어, 선택된 핵산 서열을 발현시키고/거나 숙주 세포에 전달하여 재조합 세포를 형성함으로써) 달리 조작하기 위한 용도로 적합하다. 전형적으로, 이러한 재조합 벡터는 이종 핵산 서열 (즉, 클로닝 또는 전달될 핵산 서열에 천연적으로 인접하여 존재하지 않는 핵산 서열)을 함유하나, 상기 벡터는 본 발명의 핵산 분자에 천연적으로 인접하여 존재하거나 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절성 핵산 서열 (예컨대, 프로모터, 비번역 영역)도 함유할 수 있다 (아래에서 상세하게 논의됨). 상기 벡터는 원핵성 또는 진핵성의 RNA 또는 DNA일 수 있고, 전형적으로는 플라스미드이다. 상기 벡터는 염색체외 요소 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 재조합 유기체 (예컨대, 미생물 또는 식물)의 염색체 내로 통합될 수 있다. 상기 벡터 전체는 숙주 세포 내의 적절한 장소에 남아 있을 수 있거나, 또는 특정 조건 하에 플라스미드 DNA가 결실되어 본 발명의 핵산 분자를 남길 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터 제어 하에 있거나, 천연 또는 플라스미드 프로모터 제어 하에 있거나, 또는 여러 프로모터 제어들의 조합 하에 있을 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다중 카피는 염색체 내로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 1종 이상의 선별 마커를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 사용되는 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본원에서 사용된 "발현 벡터"란 어구는 코딩 생성물 (예컨대, 관심 단백질)의 생산에 적합한 벡터를 지칭한다. 이 실시양태에서, 생산될 생성물 (예컨대, PUFA PKS 도메인 또는 단백질)을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 벡터에 삽입되어 재조합 핵산 분자를 생산한다. 생산될 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 재조합 숙주 세포 내에서 핵산 서열이 전사 및 번역될 수 있도록 하는 벡터 중의 조절 서열에 핵산 서열을 작동가능하게 연결하는 방식으로 벡터에 삽입된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 사용되는 재조합 벡터는 표적화 벡터이다. 본원에서 사용된 "표적화 벡터"란 어구는 특정 핵산 분자를 재조합 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 벡터를 지칭하며, 여기서 상기 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물 내에서 내인성 유전자 또는 유전자의 일부를 결실, 불활성화 또는 대체시키는 데 사용된다 (즉, 표적화된 유전자 파괴 또는 넉아웃(knock-out) 기술을 위해 사용됨). 이러한 벡터는 당업계에 "넉아웃" 벡터로 알려져 있을 수도 있다. 이 실시양태의 한 측면에서, 벡터의 일부 (보다 전형적으로는, 벡터에 삽입된 핵산 분자 (즉, 삽입물))는 숙주 세포 내에 있는 표적 유전자 (즉, 결실 또는 불활성화되도록 표적화된 유전자)의 핵산 서열과 상동성인 핵산 서열을 갖는다. 벡터 삽입물의 핵산 서열은, 표적 유전자와 결합하여 표적 유전자 및 삽입물에 상동성 재조합 (이로써 내인성 표적 유전자가 결실, 불활성화, 감쇠 (즉, 돌연변이되거나 결실되는 내인성 표적 유전자 중 적어도 일부에 의함) 또는 대체됨)이 일어날 수 있도록 설계된다. 실시예 단락에는 예를 들어, 내인성 쉬조키트리움 유전자를 재조합 유전자로 대체하기 위한, 상기 유형의 재조합 벡터의 용도가 기재되어 있고, 미국 특허 출원 제10/124,807호 (미국 특허 출원 공보 제20030166207호로 2003년 9월 4일자 공개됨)에는 트라우스토키트리드의 유전적 형질전환을 위한 일반 기술이 상세하게 기재되어 있다. 식물을 위한 유전적 형질전환 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시양태에서, 본원에 기재된 해양 박테리아 유전자들은, 식물 또는 미생물 (예를 들어, 트라우스토키트리드)의 PUFA PKS 생산능을 개선 및/또는 변경 (변형, 변화)하기 위해 이들 식물 또는 미생물을 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
전형적으로, 재조합 핵산 분자는 1개 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 1종 이상의 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 사용된 "재조합 분자" 또는 "재조합 핵산 분자"란 어구는 1차적으로는, 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 의미하나, 어구 "핵산 분자"와 구별없이 사용될 수 있다 (이러한 핵산 분자는 본원에서 논의된 바와 같은 재조합 분자임). 본 발명에 따라, "작동가능하게 연결된"이란 어구는 숙주 세포 내로 형질감염 (예를 들어, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 전도(conduced))되었을 때 분자가 발현될 수 있도록, 핵산 분자를 발현 제어 서열 (예컨대, 전사 제어 서열 및/또는 번역 제어 서열)에 연결시킨 경우를 지칭한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장, 또는 종결을 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 전사 개시를 제어하는 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이다. 적합한 전사 제어 서열에는 재조합 핵산 분자가 도입될 숙주 세포 또는 유기체에서 기능할 수 있는 임의의 전사 제어 서열이 포함된다.
또한, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 추가의 조절 서열, 예를 들어 번역 조절 서열, 복제 개시점, 및 재조합 세포와 상용성인 여타 조절 서열을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자 (숙주 세포 염색체 내로 통합된 분자 포함)는 또한, 발현된 단백질이, 단백질을 생산하는 세포로부터 분비되게 하는 분비 신호 (즉, 신호 절편 핵산 서열)를 함유한다. 적합한 신호 절편에는 발현될 단백질과 천연적으로 관련된 신호 절편, 또는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종 신호 절편이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자는, 발현된 단백질이 숙주 세포의 막에 전달 및 삽입되도록 하는 선도 서열을 포함한다. 적합한 선도 서열로는 단백질과 천연적으로 관련된 선도 서열, 또는 단백질이 세포의 막에 전달 및 삽입되도록 지시할 수 있는 임의의 이종 선도 서열이 포함된다.
본 발명의 1종 이상의 재조합 분자는 본 발명의 코딩 생성물 (예컨대, PUFA PKS 도메인, 단백질 또는 시스템)을 생산하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩 생성물은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 단백질 생산에 효과적인 조건 하에 발현시킴으로써 생산된다. 코딩 단백질을 생산하기에 바람직한 방법은 숙주 세포를 1개 이상의 재조합 분자로 형질감염시켜 재조합 세포를 형성하는 것이다. 형질감염시키기에 적합한 숙주 세포로는, 형질감염될 수 있는 임의의 박테리아, 진균 (예컨대, 효모), 곤충, 식물 또는 동물 세포가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 바람직한 숙주 세포는 트라우스토키트리드 숙주 세포 (하기에 상세하게 기재되어 있음) 또는 식물 숙주 세포이다. 숙주 세포는 비-형질감염 세포, 또는 이미 1종 이상의 다른 재조합 핵산 분자로 형질감염된 세포일 수 있다.
본 발명에 따라, "형질감염"이란 용어는 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)가 세포에 삽입될 수 있는 임의의 방법을 나타낸다. "형질전환"이란 용어는, 핵산 분자가 미생물 세포 (예를 들어, 조류, 박테리아 및 효모) 또는 식물 세포에 도입되는 경우를 나타내는 데 사용되는 경우에 용어 "형질감염"과 구별없이 사용될 수 있다. 미생물 및 식물 시스템에서는, "형질전환"이란 용어가 미생물 또는 식물에 의한 외인성 핵산의 취득으로 인한 유전되는 변화를 기술하기 위해 사용되며, 용어 "형질감염"과 본질적으로 동의어이다. 그러나, 동물 세포의 경우, "형질전환"은 예를 들어, 동물 세포가 악성이 된 후에 배양시 세포의 성장 특성의 변화를 나타낼 수 있는 제2의 의미를 획득하였다. 따라서, 혼동을 피하기 위해, "형질감염"이란 용어는 동물 세포로의 외인성 핵산 도입과 관련하여 사용되는 것이 바람직하며, 이들 용어가 외인성 핵산을 세포에 도입하는 것과 관련되어 있다면, 본원에서 사용된 용어 "형질감염"은 동물 세포의 형질감염, 및 미생물 세포 및 식물 세포의 형질전환을 일반적으로 포함할 것이다. 따라서, 형질감염 기술로는 형질전환, 입자 충격(particle bombardment), 확산, 활성 수송, 배스 초음파 처리, 전기천공, 미량주사, 리포펙션(lipofection), 흡수, 감염 및 원형질체 융합이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 DNA 기술을 이용하면, 예를 들어 숙주 세포 내에 있는 핵산 분자 카피 개수, 핵산 분자의 전사 효율, 생성된 전사물의 번역 효율, 및 번역후 변형 효율을 조작함으로써, 형질감염된 핵산 분자 발현의 제어를 개선할 수 있음을 당업자는 알 것이다. 또한, 프로모터 서열은 천연 프로모터에 비해 발현 수준을 개선하기 위해 유전공학적으로 조작될 수 있다. 핵산 분자 발현의 제어에 있어 유용한 재조합 기술로는 하나 이상의 숙주 세포 염색체로의 핵산 분자 통합, 벡터 안정성 서열로의 플라스미드 부가, 전사 제어 신호 (예컨대, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예컨대, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 용도에 부합하는 핵산 분자의 변형, 및 전사물을 불안정화시키는 서열의 결실이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 핵산 분자 및 숙주 세포의 형질감염과 관련된 상기한 전반적인 논의는, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인을 갖는 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 것들, 여타 PKS 시스템의 아미노산 서열을 코딩하는 것들, 여타 단백질 또는 도메인을 코딩하는 것들을 비롯하여, 본원에서 논의된 모든 재조합 핵산 분자에 적용된다.
다중불포화 지방산 (PUFA)은 고급 진핵생물에 있어서 필수적인 막 구성요소이고, 수많은 지질-유래 신호전달 분자의 전구체이다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 포화 지방산의 탈포화 및 신장이 요구되지 않는 PUFA 합성 경로를 이용한다. PUFA PKS 시스템이 촉매로 작용하는 경로는, 구조 및 메카니즘에 있어서 이전까지 알려져 있던 PKS 시스템의 경우와 구별된다. 시스 이중 결합의 생성은 위치-특이적 이소머라제와 관련이 있는 것으로 판단되며, 이들 효소는 새로운 항생제군의 생산에 유용한 것으로 생각된다.
1종 이상의 원하는 다중불포화 지방산 또는 여타 생물활성 분자를 유의하게 높은 수율로 생산하기 위해, 유기체, 바람직하게는 미생물 또는 식물의 유전자를 변형시켜, 미생물 또는 식물의 PUFA PKS 시스템의 활성 (특히, 최종 생성물)을 변경하거나, PUFA PKS 시스템을 미생물 또는 식물에 도입할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는, 본원에 기재된 바와 같은 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인 (예컨대, 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나로부터의 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 단백질, 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 상동체)을 포함하는 PKS 시스템을 발현하는 유전자 변형 미생물에 관한 것이다. 미생물의 유전자 변형은 유기체의 PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. PUFA PKS 시스템의 도메인은 상기 기재된 바와 같은 해양 박테리아 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인 (그의 상동체 포함)을 포함할 수 있고, 또한 임의의 다른 박테리아 또는 비-박테리아 미생물, 예를 들어 임의의 진핵 미생물, 특히 임의의 트라우스토키트리드 미생물로부터의 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인, 또는 상기 미국 특허 출원 제10/124,800호에 기재된 스크리닝 방법에 의해 동정된 미생물로부터의 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인을 포함할 수 있다. 간단히, 미국 특허 출원 제10/124,800호에 기재된 스크리닝 방법은 (a) 1종 이상의 PUFA를 생산하는 미생물을 선별하는 단계, 및 (b) 발효 배지 중 용존 산소량이 포화 상태의 약 5％ 초과, 바람직하게는 약 10％, 보다 바람직하게는 약 15％, 더욱 바람직하게는 약 20％인 조건 하에 미생물이 생산하는 PUFA의 양보다 증가된 양으로, 발효 배지 중 용존 산소량이 포화 상태의 약 5％ 미만인 조건 하에 PUFA를 생산할 수 있는, 단계 (a)로부터의 미생물을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 미국 특허 제6,140,486호 (그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에는 여타 박테리아 PUFA PKS 시스템의 단백질, 도메인 및 이들의 상동체가 기재되어 있다. 상기 미국 특허 제6,566,583호, 상기 미국 특허 출원 제10/124,800호, 및 상기 미국 특허 출원 제10/810,352호 (이들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에는 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템의 단백질, 도메인 및 이들의 상동체가 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 유전자 변형 유기체는 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 함유 및 발현할 수 있고, 이때 유전자 변형이란 내인성 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인의 유전자 변형일 수 있다 (이로써 상기 유전자 변형은 PUFA PKS 시스템의 활성에 어느 정도의 영향을 미침). 예를 들어, 본원에 기재된 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나 종은, 그 미생물의 PUFA PKS 기능의 어떤 변경 (변화, 변형)을 유발하는 내인성 PUFA PKS 유전자(들)을 변형시킴으로써 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 유전자 변형 유기체는 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 함유 및 발현할 수 있고, 이때 유전자 변형이란 1개 이상의 외인성 핵산 서열 (예컨대, 재조합 핵산 분자)의 도입일 수 있다 (여기서, 상기 외인성 핵산 서열은 제2 PKS 시스템 (소정의 PUFA PKS 시스템 또는 또다른 유형의 PKS 시스템 포함)로부터의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인 또는 단백질, 및/또는 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질을 코딩함). 본 발명의 이 측면에서, 유기체에서는 또한, 내인성 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자(들)에 대한 하나 이상의 변형이 존재할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 유전자 변형 유기체는 PUFA PKS 시스템을 반드시 내인적으로 (천연적으로) 함유하는 것은 아니며, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하도록 유전자 변형된다. 상기 유기체는 PUFA PKS 시스템 생성물 (생물활성 분자, 예를 들어 PUFA 또는 항생제)의 생산을 위한 PUFA PKS 시스템의 필수 구성요소들을 함께 코딩하는 2개 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하거나, PUFA PKS 생성물의 생산을 위한 PUFA PKS 시스템의 필수 구성요소들을 포함하는 다수의 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하도록 유전자 변형되는 것이 바람직하다. 이들 측면 각각과 관련된 각종 실시양태가 아래에서 더욱 상세하게 논의될 것이다.
PUFA PKS 시스템, 또는 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유기체의 유전자 변형에는, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 (도메인의 일부 포함), PUFA PKS 시스템의 둘 이상 또는 여러 도메인 (인접 도메인, 비-인접 도메인, 또는 PUFA PKS 시스템의 상이한 단백질 상에 있는 도메인 포함), PUFA PKS 시스템의 전체 단백질, 및 전체 PUFA PKS 시스템 (예컨대, PUFA PKS 유전자에 의해 코딩된 모든 단백질) 또는 심지어 둘 이상의 PUFA PKS 시스템 (예컨대, DHA를 천연적으로 생산하는 유기체로부터의 시스템 및 EPA를 천연적으로 생산하는 유기체로부터의 시스템)의 변형 및/또는 이용이 포함될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 이러한 변형에는 내인성 PUFA PKS 시스템의 단일 도메인의 작은 변형, 내인성 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 단백질의 치환, 결실 또는 부가, 재조합 PUFA PKS 시스템으로부터의 하나 이상의 도메인 또는 단백질의 도입, 내인성 PUFA PKS 시스템을 갖는 유기체에서의 제2 PUFA PKS 시스템 도입, 유기체의 전체 PUFA PKS 시스템을 상이한 유기체로부터의 PUFA PKS 시스템으로 대체, 또는 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 갖지 않는 유기체로의 하나, 둘 또는 그 이상의 전체 PUFA PKS 시스템 도입이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는, PUFA PKS 시스템의 모든 유전자 변형이 본 발명에 포함된다는 점을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 변형 미생물에는 유전자 변형 박테리아, 원생생물, 미세조류, 진균 또는 여타 미생물, 특히 트라우스토키트리알레스 목의 속들 중 임의의 것 (예컨대, 트라우스토키트리드), 예를 들어 본원에 기재된 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 과 및 라비린툴라세애(Labyrinthulaceae) 과에 속하는 임의의 미생물 (예컨대, 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움, 자포노키트리움(Japonochytrium), 라비린툴라(Labyrinthula), 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides) 등)이 포함될 수 있다. 이러한 유전자 변형 미생물은, 원하는 결과 (즉, PUFA PKS 활성의 증가 또는 변형, 및/또는 PKS 시스템을 이용한 원하는 생성물의 생산)가 달성되도록 정상 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 변형된 (즉, 돌연변이 또는 변화된) 게놈을 갖는다. 미생물의 유전자 변형은 전통적인 균주 개발 및/또는 분자유전학적 기술에 의해 달성될 수 있다. 당업계에 공지된 이러한 기술은 일반적으로, 미생물을 위한 용도로 개시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press]). 상기 샘브룩 등의 문헌은 본원에 그 전문이 참고로 도입된다. 유전자 변형 미생물에는, 미생물 내에서 원하는 효과를 제공하도록 핵산 분자들이 삽입, 결실 또는 변형된 (즉, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위에 의한 돌연변이된) 미생물이 포함될 수 있다.
유전자 변형에 적합한 숙주 미생물의 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)를 비롯한 효모, 또는 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 여타 효모, 또는 다른 진균, 예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium) 등과 같은 사상성 진균이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 박테리아 세포가 숙주로서 사용될 수 있다. 이러한 것들로는 발효 공정에서 유용할 수 있는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 비제한적인 예로서 락토바실루스(Lactobacillus) 종 또는 바실루스(Bacillus) 종이 숙주로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 숙주 세포로는 트라우스토키트리아세애에 속하는 트라우스토키트리움, 자포노키트리움, 아플라노키트리움(Aplanochytrium), 엘리나 및 쉬조키트리움, 및 라비린툴라세애에 속하는 라비린툴라, 라비린툴로이데스 및 라비린토믹사(Labyrinthomyxa)를 비롯한 속으로부터의 미생물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 속에 속하는 바람직한 종으로는 라비린툴라에 속하는 임의의 종, 예를 들어 라비린툴라 에스피., 라비린툴라 알게리엔시스(Labyrinthula algeriensis), 라비린툴라 치엔코우스키이(Labyrinthula cienkowskii), 라비린툴라 카토니이(Labyrinthula chattonii), 라비린툴라 코에노키스티스(Labyrinthula coenocystis), 라비린툴라 마크로키스티스(Labyrinthula macrocystis), 라비린툴라 마크로키스티스 아틀란티카(Labyrinthula macrocystis atlantica), 라비린툴라 마크로키스티스 마크로키스티스(Labyrinthula macrocystis macrocystis), 라비린툴라 마그니피카(Labyrinthula magnifica), 라비린툴라 미누타(Labyrinthula minuta), 라비린툴라 로스코펜시스(Labyrinthula roscoffensis), 라비린툴라 발카노비이(Labyrinthula valkanovii), 라비린툴라 비텔리나(Labyrinthula vitellina), 라비린툴라 비텔리나 파키피카(Labyrinthula vitellina pacifica), 라비린툴라 비텔리나 비텔리나(Labyrinthula vitellina vitellina), 라비린툴라 좁피이(Labyrinthula zopfii), 임의의 라비린툴로이데스 종, 예를 들어 라비린툴로이데스 에스피., 라비린툴로이데스 미누타, 라비린툴로이데스 스키조키트롭스(Labyrinthuloides schizochytrops), 임의의 라비린토믹사 종, 예를 들어 라비린토믹사 에스피., 라비린토믹사 폴리아(Labyrinthomyxa pohlia), 라비린토믹사 사우바게아우이(Labyrinthomyxa sauvageaui), 임의의 아플라노키트리움 종, 예를 들어 아플라노키트리움 에스피. 및 아플라노키트리움 케르구엘렌시스(Aplanochytrium kerguelensis), 임의의 엘리나 종, 예를 들어 엘리나 에스피., 엘리나 마리살바(Elina marisalba), 엘리나 시노리피카(Elina sinorifica), 임의의 자포노키트리움 종, 예를 들어 자포노키트리움 에스피., 자포노키트리움 마리눔(Japonochytrium marinum), 임의의 쉬조키트리움 종, 예를 들어 쉬조키트리움 에스피., 쉬조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum), 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum), 쉬조키트리움 미누툼(Schizochytrium minutum), 쉬조키트리움 옥토스포룸(Schizochytrium octosporum), 및 임의의 트라우스토키트리움 종, 예를 들어 트라우스토키트리움 에스피., 트라우스토키트리움 아그레가툼, 트라우스토키트리움 아루디멘탈레(Thraustochytrium arudimentale), 트라우스토키트리움 아우레움, 트라우스토키트리움 벤티콜라(Thraustochytrium benthicola), 트라우스토키트리움 글로보숨(Thraustochytrium globosum), 트라우스토키트리움 킨네이(Thraustochytrium kinnei), 트라우스토키트리움 모티붐(Thraustochytrium motivum), 트라우스토키트리움 파키데르뭄(Thraustochytrium pachydermum), 트라우스토키트리움 프롤리페룸(Thraustochytrium proliferum), 트라우스토키트리움 로세움(Thraustochytrium roseum), 트라우스토키트리움 스트리아툼(Thraustochytrium striatum), 울케니아 에스피.(Ulkenia sp.), 울케니아 미누타(Ulkenia minuta), 울케니아 프로푼다(Ulkenia profunda), 울케니아 라디아테(Ulkenia radiate), 울케니아 사르카리아나(Ulkenia sarkariana) 및 울케니아 비수르겐시스(Ulkenia visurgensis)가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 속에 속하는 특히 바람직한 종으로는 임의의 쉬조키트리움 종, 예를 들어 쉬조키트리움 아그레가툼, 쉬조키트리움 리마시눔, 쉬조키트리움 미누툼, 또는 임의의 트라우스토키트리움 종 (울케니아 비수르겐시스, 울케니아 아모에보이다(Ulkenia amoeboida), 울케니아 사르카리아나, 울케니아 프로푼다, 울케니아 라디아타(Ulkenia radiata), 울케니아 미누타 및 울케니아 에스피. BP-5601과 같은 상기한 울케니아 종 포함), 및 트라우스토키트리움 스트리아툼, 트라우스토키트리움 아우레움, 트라우스토키트리움 로세움, 및 임의의 자포노키트리움 종이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직한 트라우스토키트리알레스 균주로는 쉬조키트리움 에스피. (S31)(ATCC 20888), 쉬조키트리움 에스피. (S8)(ATCC 20889), 쉬조키트리움 에스피. (LC-RM)(ATCC 18915), 쉬조키트리움 에스피. (SR21), 쉬조키트리움 아그레가툼 (골드스타인 및 벨스키)(ATCC 28209), 쉬조키트리움 리마시눔 (혼다 및 요코치)(IFO 32693), 트라우스토키트리움 에스피. (23B)(ATCC 20891), 트라우스토키트리움 스트리아툼 (슈나이더)(ATCC 24473), 트라우스토키트리움 아우레움 (골드스타인)(ATCC 34304), 트라우스토키트리움 로세움 (골드스타인)(ATCC 28210), 및 자포노키트리움 에스피. (L1)(ATCC 28207)가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라, "트라우스토키트리드", "트라우스토키트리알레스 미생물" 및 "트라우스토키트리알레스 목의 미생물"이란 용어/어구는 구별없이 사용될 수 있으며, 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 구성원 (트라우스토키트리아세애 과 및 라비린툴라세애 과 포함)을 지칭한다. 본원에서 사용된 "라비린툴리드(Labyrinthulid)" 및 "라비린툴라세애"란 용어는 구체적으로 라비린툴라세애 과의 구성원을 나타낸다. 본원에서 사용된 "트라우스토키트리아세애"란 용어는 구체적으로, 트라우스토키트리아세애 과의 구성원인 트라우스토키트리드를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 있어서, 라비린툴리드의 구성원들은 트라우스토키트리드에 포함되는 것으로 간주된다.
개발로 인해, 트라우스토키트리드의 분류학에 대한 개정이 자주 이루어져 왔다. 일반적으로, 분류 이론가들은 트라우스토키트리드를 조류 또는 조류-유사 원생생물에 배치한다. 그러나, 분류학적 불확실성으로 인해, 본 발명에 기재된 균주들을, 다음 유기체들을 포함하는 트라우스토키트리드로 간주하는 것이 본 발명의 목적을 위한 최선이 될 것이다: 목: 트라우스토키트리알레스, 과: 트라우스토키트리아세애 (속: 트라우스토키트리움, 쉬조키트리움, 자포노키트리움, 아플라노키트리움 또는 엘리나) 또는 라비린툴라세애(속: 라비린툴라, 라비린툴로이데스, 또는 라비린토믹사). 또한, 알토르니아(Althornia) 속, 코랄로키트리움(Corallochytrium) 속, 디플로피리스(Diplophyrys) 속 및 피로소루스(Pyrrhosorus) 속은 때때로 트라우스토키트리아세애 과 또는 라비린툴라세애 과에 포함되고, 본 발명의 목적상 트라우스토키트리드 또는 트라우스토키트리알레스 목의 구성원에 포함된다. 본 발명 당시에는 트라우스토키트리드의 분류학에 대한 개정시, 라비린툴로이데스 속이 라비린툴라세애 과에 배치되었고, 트라우스토키트리아세애 과 및 라비린툴라세애 과 둘다가 스트라메노필레(Stramenopile) 계통에 배치된 것임을 인지해야 한다. 때때로, 라비린툴라세애는 라비린툴리드 또는 라비린툴라로 통칭되고, 라비린툴로이데스 또는 트라우스토키트리아세애는 트라우스토키트리드로 통칭되나, 상기 논의된 바와 같이 본 발명의 명료성을 위한 목적상, 트라우스토키트리드는 트라우스토키트리알레스 목의 모든 구성원을 포함하고/거나 트라우스토키트리아세애 및 라비린툴라세애의 구성원을 포함함을 유의해야 한다. 최근의 분류학적 변화가 하기에 요약되어 있다.
본원에 기술된 특정 단세포 미생물 균주들은 트라우스토키트리알레스 목의 구성원이다. 트라우스토키트리드는 진화 분류학적 이력을 갖는 해양 진핵생물이다. 트라우스토키트리드의 분류학적 배치에 관한 문제들은 모스(Moss) (문헌 ["The Biology of Marine Fungi", Cambridge University Press p. 105 (1986)]), 반웹(Bahnweb) 및 잭키(Jackie) (상기 문헌 p. 131) 및 챔벌레인(Chamberlain) 및 모스 (문헌 [Biosystems 21:341 (1988)])가 검토한 바 있다.
편의를 목적으로, 트라우스토키트리드는 처음에는 분류학자들에 의해 다른 무색의 유주자 진핵생물들과 함께 조균류(Phycomycetes) (조류-유사 진균)에 배치되었다. 그러나, 결국 분류명에서 조균류란 명칭이 사라지게 되었고, 트라우스토키트리드는 난균강(Oomycetes) (쌍편모 유주자균(zoosporic fungus))에 배치되었다. 최초에는, 난균강이 이형편모성(heterokont) 조류와 관련이 있는 것으로 가정되었는데, 최종적으로는 광범위한 초미세구조적 및 생화학적 연구 (바(Barr)의 문헌 [Barr. Biosystems 14:359 (1981)]에 요약됨)가 이러한 가정을 뒷받침하였다. 실제, 난균강은 리데일(Leedale) (문헌 [Leedale. Taxon 23:261 (1974)]) 및 다른 조류학자들에 의해 이형편모성 조류의 일부로서 받아들여진 바 있다. 그러나, 난균강 및 트라우스토키트리드는 이들의 종속영양성으로 인한 편의 문제로, 편의상 조류학자 (조류를 연구하는 과학자)보다는 진균학자 (진균을 연구하는 과학자)에 의해 주로 연구되어 왔다.
또다른 분류학적 시각에서, 진화생물학자들은 진핵생물이 어떻게 진화하는지에 대한 2가지 일반 이론을 수립하였다. 한 이론은 일련의 내공생(內共生)을 통한 막-결합 세포소기관의 외인성 기원을 제안하는데 (문헌 [Margulis, 1970, Origin of Eukaryotic Cells. Yale University Press, New Haven]), 예를 들어 미토콘드리아는 박테리아 내공생 생물로부터, 엽록체는 남조류(cyanophytes)로부터, 편모는 스피로캐테스(spirochaetes)로부터 유래된다. 다른 한 이론은 선조 원핵생물의 비-막-결합 시스템으로부터의 막-결합 세포소기관이 자생 프로세스를 통해 단계적으로 진화하는 것을 제안한다 (문헌 [Cavalier-Smith, 1975, Nature (Lond.) 256:462-468]). 그러나, 두 부류의 진화생물학자들 모두 난균강 및 트라우스토키트리드를 진균으로부터 분리시켜 이들을 황조류(chromophyte) 조류와 함께 황색조식물(Chromophyta) 계 (문헌 [Cavalier-Smith BioSystems 14:461 (1981)]) (이 계는 더욱 최근에 다른 원생생물을 포함하도록 확장되었고, 상기 계의 구성원은 현재 스트라메노필레로 지칭됨)에 배치하거나, 또는 모든 조류와 함께 원생생물계 (문헌 [Margulis and Sagen. Biosystems 18: 141 (1985)])에 배치하였다.
전자 현미경의 발달로, 트라우스토키트리드의 두 속인 트라우스토키트리움 및 쉬조키트리움의 유주자의 초미세구조에 대한 연구 (문헌 [Perkins, 1976, "Recent Advances in Aquatic Mycology" (ed. E. B. G. Jones), pp. 279-312, John Wiley ＆ Sons, New York], [Kazama. Can. J. Bot. 58:2434 (1980)], [Barr, 1981, Biosystems 14:359-370])는 트라우스토키트리아세애가 난균강에 막연하게만 관련되어 있다는 우수한 증거를 제공하였다. 또한, 5-S 리보좀 RNA 서열의 상응하는 분석을 제공하는 유전자 데이타 (다변량 통계학의 형태)는, 트라우스토키트리알레스가 진균류와는 완전히 별개이며 적조류(red algae) 및 갈조류(brown algae) 및 난균강의 구성원과 가장 밀접하게 관련된, 명백히 독특한 진핵생물 군임을 시사한다 (문헌 [Mannella et al. Mol. Evol. 24:228 (1987)]). 대부분의 분류학자들은 트라우스토키트리드를 난균강으로부터 분리하는 것에 동의하였다 (문헌 [Bartnicki-Garcia. "Evolutionary Biology of the Fungi" (eds. Rayner, A. D. M., Brasier, C. M. ＆ Moore, D.), p. 389, Cambridge University Press, Cambridge]).
요약하면, 카발리에-스미스 (Cavalier-Smith) (문헌 [Cavalier-Smith. BioSystems 14:461 (1981)], [Cavalier-Smith. Microbiol Rev. 57: 953 (1993)])의 분류학 시스템에 따르면, 트라우스토키트리드는 황색조식물 (스트라메노필레) 계에 속하는 황조류 조류로 분류된다. 보다 최근에는, 트라우스토키트리드가 진균류가 아니라 크로미스트(chromist)임을 입증하는 이형편모류(Heterokonta)의 18s rRNA 서명을 이용한 카발리에-스미스 등에 의해 상기 분류학적 배치가 재확인되었다 (문헌 [Cavalier-Smith et al. Phil. Tran. Roy. Soc. London Series BioSciences 346:387 (1994)]). 이에 따라 트라우스토키트리드는 진균류와 완전히 상이한 계에 배치되는데, 모두 진진균류(Eufungi) 계에 배치된다.
현재, 71개의 개별적인 진핵 유기체 군이 존재하고 (문헌 [Patterson. Am. Nat. 154:S96 (1999)]), 이들 군 중 4개의 주요 계통이 어느 정도 확실하게 확인되었다: (1) 알베오라테(Alveolate), (2) 스트라메노필레, (3) 육지 식물-녹조류-홍조류_회조류(Rhodophyte_Glaucophyte) ("식물") 클레이드(clade) 및 (4) 후편모성(Opisthokont) 클레이드 (진균류 및 동물). 이전까지는, 상기 4개의 주요 계통이 계로 분류되었으나, 일부 연구자들은 "계" 개념을 사용하는 것이 더 이상 유용하지 않다고 생각한다.
암스트롱(Armstrong)이 언급한 바와 같이, 스트라메노필레는 3부분으로 갈라진 관상형 헤어(hair)를 지칭하고, 이러한 계통의 대부분의 구성원은 그와 같은 헤어를 갖는 편모를 갖는다. 스트라메노필레 (단세포성 생물, 정자, 유주자)의 운동성 세포는 측면으로 삽입된 2개의 편모, 즉 편모의 추력(thrust)에 역행하는 3부분으로 갈라진 관상형 헤어를 갖는 긴 편모와 짧고 매끄러운 편모를 갖는 비대칭형이다. 이전에는, 군이 덜 광범위했을 때, 스트라메노필레는 크로미스타 (Chromista) 계 또는 이형편모성 (=상이한 편모) 조류로 칭해졌는데, 이러한 군들이 황녹 조류(yellow-green Algae), 황갈 조류(Golden-brown Algae), 유스티그마토파이트(Eustigmatophyte) 및 규조류(Diatom)와 함께 갈조류(Brown Algae 또는 Phaeophyte)로 구성되었기 때문이다. 그후, 일부 타가영양성 진균-유사 유기체, 수생 균류, 및 라비린툴리드 (점액 망상(net) 아메바)가 유사한 운동성 세포를 갖는 것으로 발견되어, 광합성 색소 또는 조류를 지칭하는 군 명칭이 부적절하게 되었다. 현재, 스트라메노필레 계통에 속하는 2개의 과는 라비린툴라시애 및 트라우스토키트리아세애이다. 역사적으로, 이러한 독특한 미생물에 대한 수많은 분류 전략이 존재하였으며, 이들 미생물은 종종, 동일한 목 (즉, 트라우스토키트리알레스) 하에 분류된다. 이러한 군의 구성원들의 관계는 여전히 밝혀지고 있다. 포터(Porter) 및 리앤더(Leander)는 단일 계통 내의 트라우스토키트리드-라비린툴리드 클레이드를 가리키는 18S 소형 서브유닛 리보좀 DNA를 기초로 하는 데이타를 수립하였다. 그러나, 상기 클레이드는 2개의 분지에 의해 뒷받침되고, 제1 분지는 트라우스토키트리움의 3가지 종 및 울케니아 프로푼다를 포함하며, 제2 분지는 라비린툴라의 3가지 종, 라비린툴로이데스의 2가지 종 및 쉬조키트리움 아그레가툼을 포함한다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 트라우스토키트리드의 분류학적인 배치는 다음과 같이 요약된다:
계: 황색조식물 (스트라메노필레)
문: 이형편모류
목: 트라우스토키트리알레스 (트라우스토키트리드)
과: 트라우스토키트리아세애 또는 라비린툴라시애
속: 트라우스토키트리움, 쉬조키트리움, 자포노키트리움, 아플라노키트리움, 엘리나, 라비린툴라, 라비린툴로이데스 또는 라비린툴로믹사.
예전 분류학자들 중 일부는 트라우스토키트리움 속의 몇몇의 고유 구성원들 (아메바 모양의 생활 단계를 갖는 미생물)을, 울케니아로 불리는 별개의 속으로 분리하였다. 그러나, (모두는 아니어도) 거의 대부분의 트라우스토키트리드 (트라우스토키트리움 및 쉬조키트리움 포함)가 아메바 모양의 단계를 나타내고, 따라서 일부는 울케니아를 유용한 속으로 간주하지 않는 것으로 현재 알려져 있다. 본원에서 사용된 트라우스토키트리움 속은 울케니아를 포함할 것이다.
문 및 계의 상위 분류 내에서의 분류학적 배치의 불확실성에도 불구하고, 트라우스토키트리드는 그 구성원이 여전히 트라우스토키트리알레스 목 내에서 분류가능한 개별적이고 특징적인 분류를 유지한다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본원에 기재된 바와 같은 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인 또는 단백질을 포함하는 PKS 시스템을 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템의 도메인에는, 상기 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인 (그의 상동체 포함)이 포함될 수 있고, 또한 임의의 박테리아 또는 비-박테리아 미생물 (임의의 진핵 미생물 및 임의의 트라우스토키트리드 미생물, 예를 들어 쉬조키트리움 및/또는 트라우스토키트리움 포함)로부터의 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인, 또는 상기 미국 특허 출원 제10/124,800호에 기재된 스크리닝 방법에 의해 동정된 미생물로부터의 PUFA PKS 시스템의 임의의 도메인이 포함될 수 있다. 또한, 식물은 또다른 PKS 시스템, 예를 들어 제I형 PKS 시스템 (반복형 또는 모듈형), 제II형 PKS 시스템 및/또는 제III형 PKS 시스템 (이에 제한되지는 않음)의 하나 이상의 도메인 또는 그의 생물학적 활성 단편으로 추가로 변형시킬 수 있다. 식물의 변형에는, PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 (도메인의 일부 포함), PUFA PKS 시스템의 둘 이상 또는 여러 도메인 (인접 도메인, 비-인접 도메인, 또는 PUFA PKS 시스템의 상이한 단백질 상에 있는 도메인 포함), PUFA PKS 시스템의 전체 단백질, 및 전체 PUFA PKS 시스템 (예컨대, PUFA PKS 유전자에 의해 코딩된 모든 단백질) 또는 심지어 둘 이상의 PUFA PKS 시스템 (예컨대, DHA를 천연적으로 생산하는 유기체로부터의 시스템 및 EPA를 천연적으로 생산하는 유기체로부터의 시스템)의 변형 및/또는 이용이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 유전자 변형 식물에는 고급식물, 특히 임의의 소비가능한 식물, 또는 본 발명의 원하는 생물활성 분자의 생산에 유용한 식물을 비롯한 임의의 유전자 변형 식물이 포함될 수 있다. 본원에서 사용된 "식물의 일부"에는 식물의 임의의 부분, 예를 들어 씨, 꽃가루, 배아, 꽃, 열매, 새싹, 잎, 뿌리, 줄기, 외식편 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자 변형 식물은, 원하는 결과 (즉, PUFA PKS 활성의 증가 또는 변형, 및/또는 PKS 시스템을 이용한 원하는 생성물의 생산)가 달성되도록 정상 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 변형된 (즉, 돌연변이 또는 변화된) 게놈을 갖는다. 식물의 유전자 변형은 전통적인 균주 개발 및(또는) 분자유전학적 기술에 의해 달성될 수 있다. 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자가 식물의 게놈에 도입된 트랜스제닉(transgenic) 식물의 생산 방법은 당업계에 알려져 있다. 본 발명에 따라 유전자 변형시키기에 바람직한 식물로는 인간을 비롯한 동물이 소비하기에 적합한 식물이 바람직하다.
본 발명에 따라 유전자 변형시키기에 바람직한 식물 (즉, 식물 숙주 세포)로는 쌍떡잎 및 외떡잎 식물을 비롯한 임의의 고등 식물, 특히 작물 (특히, 오일이 사용되는 식물)을 비롯한 소비가능한 식물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 식물에는, 예를 들어 캐놀라, 대두, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배가 포함될 수 있다. 여타 바람직한 식물로는 약제, 향미료, 영양 약제(neutraceutical agent), 기능성 식품 원료 또는 화장 활성 작용제로서 사용되는 화합물을 생산하는 것으로 알려져 있는 식물, 또는 이들 화합물/작용제의 생산을 위해 유전공학적으로 조작된 식물이 포함된다.
본 발명에 따라, 유전자 변형 미생물 또는 식물에는 재조합 기술이나, 전통적인 돌연변이유발법 및 스크리닝 기술에 의해 변형된 미생물 또는 식물이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현, 유전자 기능, 또는 유전자 생성물 (즉, 유전자에 의해 코딩된 단백질)의 기능의 감소를 초래하는 유전자 변형은 유전자의 (완전 또는 부분) 불활성화, 결실, 중단, 차단 또는 하향-조절을 의미할 수 있다. 예를 들어, 코딩된 단백질의 기능의 감소를 초래하는 유전자에서의 유전자 변형은 유전자의 완전한 결실 (즉, 유전자가 존재하지 않고, 따라서 단백질이 존재하지 않음), 단백질의 불완전한 번역 또는 무번역을 초래하는 유전자 돌연변이 (예를 들어, 단백질이 발현되지 않음), 또는 단백질의 고유 기능을 감소 또는 파괴시키는 유전자 돌연변이 (예를 들어, 효소적 활성 또는 작용이 감소되었거나 없는 단백질이 발현됨)의 결과일 수 있다. 유전자 발현 또는 기능의 증가를 초래하는 유전자 변형은 유전자의 증폭, 과다생산, 과발현, 활성화, 증대, 부가 또는 상향-조절을 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 또는 식물의 유전자 변형은, 미생물 또는 식물에 의해 발현된 PKS 시스템의 활성에 바람직하게 영향을 미치며, 여기서 상기 PKS 시스템은 내인성이면서 유전자 변형되었거나, 또는 내인성이면서 유기체로 재조합 핵산 분자가 도입되었거나 (내인성 시스템의 변형은 선택적임), 또는 완전히 재조합 기술에 의해 제공된 시스템이다. PUFA PKS 시스템, 또는 이러한 시스템을 발현하는 유기체의 PUFA 생산 프로파일을 변경하는 경우는, 숙주 미생물 또는 식물이 1종 이상의 임의의 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 다른 생물활성 분자)를 생산시, 유전자 변형이 없는 경우에 비해 (즉, 변형되지 않은 야생형 미생물 또는 식물, 또는 적어도 PUFA 합성과 관련하여 변형되지 않은 미생물 또는 식물 (즉, 유기체는 PUFA 합성과 관련되지 않은 여타 변형은 가질 수 있음)에 비해) 검출가능하거나 측정가능한 임의의 변화가 초래되는 경우를 포함한다. PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 경우는, 유전자 변형이 없는 경우에 비해, 임의의 유전자 변형이, 유기체에 의해 발현된 PKS 시스템에서의 검출가능하거나 측정가능한 임의의 변화를 초래하는 경우를 포함한다. PKS 시스템 상의 검출가능한 변화 또는 변형에는, 유전자 변형이 없는 내인성 PUFA PKS 시스템과 비교시 변형된 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 임의의 도메인의 발현 및/또는 생물학적 활성의 변화 또는 변형 (도입, 증가 또는 감소), 유기체가 측정가능한/검출가능한 PKS 시스템 활성 (예를 들어, PUFA PKS 시스템의 생성물의 생산)을 갖도록 유기체로의 PKS 시스템 활성 도입 (즉, 유기체는 유전자 변형 전 PKS 시스템 또는 PUFA PKS 시스템을 함유하지 않음), PKS 시스템 활성이 변형되도록, 유기체에 의해 내인적으로 발현된 PKS 시스템과 상이한 PKS 시스템으로부터의 기능성 도메인을 유기체로 도입 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 PUFA PKS 도메인을, 비-박테리아 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 발현하는 유기체 (예를 들어, 트라우스토키트리드)에 도입함), PKS 시스템에 의해 생산된 생물활성 분자 (예컨대, PUFA)의 양의 변화 (예컨대, PKS 시스템은 유전자 변형이 없는 경우에 비해 주어진 생성물을 보다 많거나 (양의 증가) 또는 보다 적게 (양의 감소) 생산함), PKS 시스템에 의해 생산된 생물활성 분자 유형의 변화, 예를 들어 PUFA 유형의 변화 (예컨대, PKS 시스템은 또다른 PUFA 또는 상이한 PUFA, 또는 새롭거나 상이한 생성물, 또는 PKS 시스템에 의해 천연적으로 생단된 PUFA 또는 여타 생성물의 변이체를 생산함), 및/또는 PKS 시스템에 의해 생산된 다수의 생물활성 분자들의 비율 변화 (예컨대, PKS 시스템은 특정 PUFA 대 또다른 PUFA의 상이한 비율을 생성하거나, 유전자 변형이 없는 경우와 비교시 완전하게 상이한 지질 프로파일을 생성하거나, 또는 천연 배열과 비교시 각종 PUFA를 트리아실글리세롤 중의 상이한 위치에 배치함)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 유전자 변형에는 임의 유형의 유전자 변형이 포함되고, 구체적으로는 재조합 기술 및/또는 전통적인 돌연변이유발법에 의한 변형이 포함된다.
PUFA PKS 시스템의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키는 것은, 도메인 또는 단백질 시스템의 기능성의 증가를 초래하는, 도메인 또는 단백질을 함유하는 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 유기체에서의 임의의 유전자 변형을 의미하고, 도메인 또는 단백질의 활성 (예를 들어, 특이적 활성 또는 생체내 효소 활성)의 증가, 도메인 또는 단백질 시스템의 억제 또는 분해의 감소, 및 도메인 또는 단백질의 과발현을 포함할 수 있음을 유의해야 한다. 예를 들어, 유전자 카피수가 증가될 수 있거나, 천연 프모로터보다 더 높은 수준의 발현을 제공하는 프로모터의 사용에 의해 발현 수준이 증가될 수 있거나, 또는 유전자에 의해 코딩된 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키기 위한 유전공학적 조작 또는 전통적인 돌연변이유발법에 의해 유전자가 변경될 수 있다.
이와 유사하게, PUFA PKS 시스템의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성이 감소하는 것은, 도메인 또는 단백질의 기능성의 감소를 초래하는, 이러한 도메인 또는 단백질을 함유하는 유기체 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될 유기체)에서의 임의의 유전자 변형을 의미하고, 도메인 또는 단백질 활성의 감소, 도메인 또는 단백질의 억제 또는 분해의 증가, 및 도메인 또는 단백질 발현의 감소 또는 제거를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 도메인 또는 단백질의 생산을 차단 또는 감소시키거나, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그의 일부를 "넉아웃"시키거나, 도메인 또는 단백질 활성을 감소시키거나, 또는 도메인 또는 단백질 활성을 억제함으로써 본 발명의 도메인 또는 단백질의 작용을 감소시킬 수 있다. 도메인 또는 단백질의 생산을 차단 또는 감소시키는 경우는, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 성장 배지 내에서 유도 화합물의 존재가 요구되는 프로모터의 제어 하에 놓는 것을 포함할 수 있다. 유도인자가 배지로부터 고갈되도록 하는 조건을 구축함으로써, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 (및 이에 따른 단백질 합성의 발현)이 중지될 수 있다. 본 발명자들은 실시예 단락에서, 트라우스토키트리드 미생물의 표적화 유전자를 결실 (넉아웃)시킬 수 있는 능력을 입증한다. 또한, 도메인 또는 단백질 활성을 차단 또는 감소시키는 경우는 미국 특허 제4,743,546호 (본원에 참고로 도입됨)에 기재된 것과 유사한 절단 기술 방법을 이용하는 경우를 포함할 수 있다. 이러한 방법을 이용하기 위해서는, 유전자가 게놈으로부터 특이적으로 제어 절단될 수 있도록 하는 특정 유전자 서열들 사이에, 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,743,546호에서와 같은 배양물의 배양 온도의 이동에 의해, 또는 일부 다른 물리적 또는 영측면의 신호에 의해 절단을 촉진할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 미생물의 내인성 PUFA PKS 시스템은 예를 들어, 전통적인 돌연변이유발법 및 선별 기술 및/또는 분자유전학적 기술 (유전공학적 기술 포함)에 의해 유전자 변형된다. 유전공학적 기술에는 예를 들어, 표적화 재조합 벡터를 이용하여 내인성 유전자의 일부를 결실시키거나 (실시예에서 입증됨) 내인성 유전자의 일부를 이종 서열로 대체하는 기술이 포함될 수 있다 (실시예에서 입증됨). 숙주 게놈에 도입될 수 있는 이종 서열의 예로는 또다른 PKS 시스템 또는 심지어 전체 PUFA PKS 시스템 (예컨대, PUFA PKS 시스템과 관련된 모든 유전자)으로부터의 하나 이상의 기능성 PUFA PKS 도메인 또는 단백질을 코딩하는 서열이 포함된다. 또한, 이종 서열은 PUFA PKS 시스템으로부터의 천연 도메인의 변형된 기능성 도메인 (상동체)을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 숙주 게놈에 도입될 수 있는 여타 이종 서열에는, PKS 시스템 자체의 도메인은 아니나 내인성 PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질 또는 기능성 도메인을 코딩하는 서열이 포함된다. 예를 들어, 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 게놈에 도입할 수 있다. 내인성 PUFA PKS 시스템에 가해질 수 있는 특이적 변형은 본원에 상세하게 논의되어 있다.
또한, 유전자 변형 식물의 생성과 관련하여, 식물의 유전공학적 조작을 위한 방법들이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 비롯한 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88]을 참조한다. 또한, 식물 세포 또는 조직의 형질전환 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gruber et al.,"Vectors for Plant Transformation", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119]를 참조한다.
발현 벡터를 식물에 도입하기 위해 가장 널리 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기초로 한다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al., Science 227:1229 (1985)]를 참조한다. 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 아그로박테리움 투메파시엔스 및 아그로박테리움 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 초래하는 유전자를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)]을 참조한다. 그루버 등의 상기 문헌, 미키 등의 상기 문헌, 문헌 [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 제4,940,838호 및 제5,464,763호를 비롯한 수많은 참고문헌에는 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달 방법에 대한 설명이 제공되어 있다.
일반적으로 적용가능한 또다른 식물 형질전환 방법은 미세발사체(microprojectile)의 표면 상으로 DNA가 운반되는 미세발사체-매개 형질전환이다. 발현 벡터는, 식물 세포의 벽 및 막을 관통하기에 충분한 속도로 미세발사체를 가속시키는 생탄도 장치에 의해 식물 조직 내로 도입된다. 문헌 [Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987)], [Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988)], [Sanford, J. C., Physio. Plant 79:206 (1990)], [Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)]를 참조한다.
DNA를 식물에게 물리적으로 전달하기 위한 또다른 방법은 표적 세포의 초음파 처리이다 (문헌 [Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)]). 별법으로, 리포좀 또는 스페로플라스트(speroplast) 융합물을 이용하여 발현 벡터를 식물에 도입하는 방법이 있다 (문헌 [Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985)], [Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)]). 또한, CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 이용하여 DNA를 원형질체로 직접 흡수시키는 방법이 보고된 바 있다 (문헌 [Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)] 및 [Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)]). 또한, 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기천공이 기술된 바 있다 (문헌 [Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990)], [D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)] 및 [Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)]).
본 발명의 상기 실시양태의 한 측면에서, 유기체 (미생물 또는 식물)의 유전자 변형에는 (1) PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인을 갖는 아/미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 숙주에 도입하는 것, 및/또는 (2) PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 1종 이상의 단백질 또는 기능성 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 숙주에 도입하는 것이 포함될 수 있다. 숙주에는 (1) 임의의 PKS 시스템을 발현하지 않는 숙주 세포 (PKS 시스템의 모든 기능성 도메인이 숙주 세포에 도입되고, 적어도 하나의 기능성 도메인이 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템으로부터 나옴), (2) 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인을 갖는 (내인성 또는 재조합) PKS 시스템을 발현하는 숙주 세포, 및 (3) 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인 기능을 반드시 포함하지는 않는 (내인성 또는 재조합) PKS 시스템을 발현하는 숙주 세포 (이 경우, 숙주 세포에 도입된 재조합 핵산 분자는, 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함함)가 포함될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명은 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템 (예컨대, 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나로부터의 시스템, 또는 이들 미생물로부터 유래된 시스템)으로부터의 하나 이상의 도메인을 (내인적으로, 또는 재조합 변형에 의한 도입을 통해) 포함하는 임의의 유전자 변형 유기체 (예컨대, 미생물 또는 식물)를 포함한다 (여기서, 유전자 변형은 숙주 세포의 PUFA PKS 활성에 상당한 영향을 미침).
본 발명은 특히, 미생물 및 식물을 유전자 변형시켜, 그 미생물 및 식물에 의한 PUFA PKS 생성물의 생산에 영향을 주기 위한, 본원에 기재된 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 시스템 및 그의 일부의 용도에 관한 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 실시양태에서 유용한 박테리아는 약 20℃에 근접하거나 이를 초과하는 온도, 바람직하게는 약 25℃에 근접하거나 이를 초과하는 온도, 훨씬 더 바람직하게는 약 30℃에 근접하거나 이를 초과하는 온도 (또는, 20℃ 내지 3O℃ 또는 그 이상 사이에서 1℃씩 증가시킨 임의의 온도, 예컨대 21℃, 22℃, 23℃ ...)에서 성장할 수 있으며, 상기 온도에서 PUFA를 생산할 수 있는 PUFA PKS 시스템 (예컨대, 상기 온도에서 잘 기능할 수 있는 효소 및 단백질)을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 상기 온도에서 PUFA를 생산한다. 본원에서 앞서 기재된 바와 같이, 해양 박테리아인 다른 쉐바넬라 에스피. (예컨대, 균주 SCRC2738) 및 비브리오 마리누스 (미국 특허 제6,140,486호에 기재되어 있음)는 PUFA를 생산하지 않고 (또는, 실질적으로 검출가능한 수준 미만으로 PUFA를 생산하고), (성장하더라도) 보다 높은 온도 (예컨대, 20℃ 이상의 온도)에서는 잘 성장하지 않는데, 이로써 특히 현장 조건 하의 식물 용도에 있어서, 상기 박테리아로부터 유래된 PUFA PKS 시스템의 유용성이 제한된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PUFA PKS 시스템을 가지며, 높은 온도에서 성장 및 PUFA를 생산할 수 있는 추가적인 박테리아를 확인할 수 있다. 예를 들어, 진핵세포 성장 억제제, 예를 들어 니스타틴(nystatin) (항진균제) 또는 시클로헥스이미드 (진핵생물 단백질 합성의 억제제)를, 해양 또는 하구 서식지와 같은 유형의 서식지/적소 또는 박테리아가 발견될 수 있는 여타 임의의 서식지로부터 수집된 물 샘플/토양 샘플로부터의 최초 균주를 배양/선별하는 데 사용되는 한천 플레이트에 첨가할 수 있다. 이러한 프로세스는 진핵생물 균주의 오염 없이 (또는 최소한으로 오염된) 박테리아 균주를 풍부화하기 위한 선별을 보조할 것이다. 이러한 선별 프로세스는, 플레이트를 승온 (예컨대, 20 내지 30℃, 또는 25 내지 30℃)에서 배양한 후에 1종 이상의 PUFA를 생산하는 균주를 선별하는 단계와 병행되어, 최초에는 (약 20℃ 미만, 더욱 바람직하게는 약 5℃ 미만의 온도에서만 PUFA를 생산하는 선행 기술의 박테리아 균주와는 달리) 승온에서 작용하는 PUFA PKS 시스템을 갖는 후보 박테리아 균주를 확인한다. 임의의 박테리아 공급원으로부터의 유전자에 있어서 보다 높은 온도에서의 PUFA PKS 기능을 평가하기 위해, 세포-무함유 추출물을 생산하고, 다양한 온도에서 PUFA 생산에 대해 시험한 다음, 보다 높은 온도 범위 (예컨대, 15℃, 20℃, 25℃, 또는 3O℃ 또는 심지어 그 이상)에서 효소적/생물학적 활성을 갖는 PUFA PKS 유전자를 함유하는 미생물을 선별할 수 있다. 본 발명자들은 PUFA PKS 유전자의 공급원으로서 특히 적합한 2종의 예시적인 박테리아 (예컨대, 쉐바넬라 올레야나 및 쉐바넬라 자포니카, 실시예 참조)를 확인하였고, 쉽게 확인될 수 있거나 PUFA PKS 유전자를 포함하는 것으로 알려져 있는 여타 미생물도 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있다 (예컨대, 쉐바넬라 겔리디마리나(Shewanella gelidimarina)).
본원에 기재된 특정 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 시스템 뿐만 아니라, 선행 기술의 비-박테리아 PUFA PKS 시스템 (예를 들어, 트라우스토키트리드로부터의 PUFA PKS 유전자를 이용함) 및 여타 진핵생물 PUFA PKS 시스템을 이용하고, PUFA 생성물의 범위에 EPA, DHA, ARA, GLA, SDA 등 (하기에 상세하게 기재되어 있음)이 포함되도록 그 범위를 확장하면서, 다양한 생물활성 분자 (항생제 포함), 다른 제약 화합물, 및 여타 바람직한 생성물을 생산하기 위해 유전자 혼합을 이용할 수 있다. 상기 생물활성 분자를 얻기 위한 방법에는 각종 유기체로부터의 유전자의 혼합 뿐만 아니라, 본원에 개시된 PUFA PKS 유전자를 유전자 변형시키기 위한 각종 방법도 포함된다. 본 발명의 박테리아 PUFA PKS 시스템의 유전적 기반 및 도메인 구조에 대한 정보는 다양한 생물활성 분자를 생산하는 새로운 유전자 변형 유기체를 설계하기 위한 토대를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 박테리아 PUFA PKS 유전자를 사용함으로써, 선행 기술의 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 유전자를 이용시에 가능했던 것보다 높은 온도에서 기능하며 높은 수준으로 생성물을 생산하는 변형된 PUFA PKS 시스템을 생산할 수 있는 능력이 신장된다. 임의의 PKS 도메인 및 관련 유전자의 혼합 및 변형이 본 발명자들에 의해 고려되나, 예를 들어 유전자 변형 및 생물활성 분자 생산과 관련하여 PUFA-PKS 시스템의 가능한 각종 조작이 아래에서 논의된다.
상기 기재된 해양 박테리아 PUFA PKS 유전자와 함께 사용하기에 특히 유용한 PUFA PKS 유전자 및 단백질에는, 트라우스토키트리드로부터의 PUFA PKS 유전자, 예를 들어 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 동정된 것들이 포함된다. 이러한 유전자는 본원에 기재된 해양 박테리아 유전자로부터의 각종 유전자, 그의 일부 및 그의 상동체와 함께, 변형, 표적화, 숙주 세포로의 도입 및/또는 달리 상기 논의된 유전자 혼합 및 변형에 있어 특히 유용하다. 이들은 상기 미국 특허 출원 제10/810,352호 (트라우스토키트리움), 상기 미국 특허 출원 제10/124,800호 (쉬조키트리움) 및 상기 미국 특허 제6,566,583호 (쉬조키트리움)에 상세하게 기재되어 있다. 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움의 PUFA PKS 유전자들은 3종의 다중-도메인-코딩 오픈 리딩 프레임 (본원에서 OrfA, OrfB 및 OrfC로 지칭됨)으로 구분된다.
쉬조키트리움 OrfA에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 13으로 표시된다. OrfA는 본원에서 서열 14로 표시되는 2910개 아미노산 서열을 코딩하는 8730개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfA 내에는 12개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인 (서열 14의 위치 약 1 내지 위치 약 500으로 표시됨), (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인 (서열 14의 위치 약 575 내지 위치 약 1000으로 표시됨), (c) 9개의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인 (서열 14의 위치 약 1095 내지 위치 약 2096으로 표시됨, 9개의 ACP 도메인 각각에 대한 활성 부위 세린 잔기 (즉, 판테테인 결합 부위)의 위치는 서열 14의 아미노산 서열을 기준으로 ACP1 = S1157, ACP2 = S1266, ACP3 = S1377, ACP4 = S1488, ACP5 = S1604, ACP6 = S1715, ACP7 = S1819, ACP8 = S1930, 및 ACP9 = S2034임), 및 (d) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인 (서열 14의 위치 약 2200 내지 위치 약 2910으로 표시됨).
쉬조키트리움 OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 15으로 표시된다. OrfB는 본원에서 서열 16으로 표시되는 2059개 아미노산 서열을 코딩하는 6177개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfB 내에는 4개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인 (서열 16의 위치 약 1 내지 위치 약 450으로 표시됨), (b) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인 (서열 16의 위치 약 460 내지 위치 약 900으로 표시됨), (c) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인 (서열 16의 위치 약 901 내지 위치 약 1400으로 표시됨), 및 (d) 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 16의 위치 약 1550 내지 위치 약 2059로 표시됨).
쉬조키트리움 OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 17로 표시된다. OrfC는 본원에서 서열 18로 표시되는 1503개 아미노산 서열을 코딩하는 4509개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfC 내에는 3개의 도메인이 존재한다: (a) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인 (각각 서열 18의 위치 약 1 내지 위치 약 450으로 표시되고, 서열 18의 위치 약 451 내지 위치 약 950으로 표시됨), 및 (b) 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 18의 위치 약 1000 내지 위치 약 1502로 표시됨).
트라우스토키트리움 OrfA에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 19로 표시된다. OrfA는 본원에서 서열 20으로 표시되는 2811개 아미노산 서열을 코딩하는 8433개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfA 내에는 11개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인 (서열 20의 위치 약 1 내지 위치 약 500으로 표시됨), (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인 (서열 20의 위치 약 501 내지 위치 약 1000으로 표시됨), (c) 8개의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인 (서열 20의 위치 약 1069 내지 위치 약 1998로 표시됨, 8개의 ACP 도메인 각각에 대한 활성 부위 세린 잔기 (즉, 판테테인 결합 부위)의 위치는 서열 20의 아미노산 서열을 기준으로 1128 (ACP1), 1244 (ACP2), 1360 (ACP3), 1476 (ACP4), 1592 (ACP5), 1708 (ACP6), 1824 (ACP7) 및 1940 (ACP8)임), 및 (d) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인 (서열 20의 위치 약 2001 내지 위치 약 2811로 표시됨).
트라우스토키트리움 OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 21로 표시된다. OrfB는 본원에서 서열 22로 표시되는 1935개 아미노산 서열을 코딩하는 5805개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfB 내에는 4개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인 (서열 22의 위치 약 1 내지 위치 약 500으로 표시됨), (b) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인 (서열 22의 위치 약 501 내지 위치 약 1000으로 표시됨), (c) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인 (서열 22의 위치 약 1001 내지 위치 약 1500으로 표시됨), 및 (d) 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 22의 위치 약 1501 내지 위치 약 1935로 표시됨).
트라우스토키트리움 OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 23으로 표시된다. OrfC는 본원에서 서열 24로 표시되는 1470개 아미노산 서열을 코딩하는 4410개 뉴클레오티드 서열 (정지 코돈 미포함)이다. OrfC 내에는 3개의 도메인이 존재한다: (a) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인 (각각 서열 24의 위치 약 1 내지 위치 약 500으로 표시되고, 서열 24의 위치 약 501 내지 위치 약 1000으로 표시됨), 및 (b) 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인 (서열 24의 위치 약 1001 내지 위치 약 1470으로 표시됨).
따라서, 본 발명은, 본원에 기재된 박테리아 PUFA PKS 시스템의 (예컨대, 본원에 기재된 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나 PUKA PKS 시스템으로부터의, 또는 이들로부터 유래된) 하나 이상의 기능성 도메인 또는 단백질 (또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 상동체)을 코딩하는 유기체에서의 1개 이상의 핵산 서열을 유전자 변형시키고/거나, 이러한 도메인 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현함으로써 미생물 또는 식물 세포를 유전자 변형시키는 방법을 포함한다. 이러한 서열의 각종 실시양태, 유기체를 유전자 변형시키는 방법, 및 특이적 변형이 상기에 상세하게 기재되어 있다. 전형적으로, 특정 생물활성 분자(들)을 생산하는 특정 유전자 변형 유기체를 생산하기 위해 상기 방법이 이용된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태는, PUFA PKS 시스템의 원하는 생성물 (예컨대, PUFA 또는 다른 생물활성 분자)을 생산하도록 본원에 기재된 PUFA PKS 유전자를 이용하여 유전자 변형시킨 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부에 관한 것이다. 본 발명의 박테리아 PUFA PKS 시스템의 유전적 기반 및 도메인 구조에 관한 정보는 각종 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템의 유전적 기반 및 도메인 구조에 관한 정보와 함께, 다양한 생물활성 분자를 생산하는 새로운 유전자 변형 식물의 설계를 위한 토대를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인들의 각종 조합으로부터 유래된 새로운 PUFA PKS 구조물을 설계 및 유전자 조작할 수 있다. 우선, 원하는 생물활성 분자의 생산을 달성하기 위해, 상기 구조물을 미생물, 예를 들어 이. 콜라이, 효모 또는 트라우스토키트리드에서 생성하고, 예를 들어 구조물을 단리하고, 이를 식물의 형질전환에 사용하여 유사한 생물활성 분자 생산 특성을 식물에 부여할 수 있다. 식물이 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 함유하는 것으로 알려져 있지는 않고, 따라서 본 발명의 PUFA PKS 시스템은, 독특한 지방산 생산능을 갖는 식물을 생성할 수 있는 기회를 제공한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는, 동일 식물 내에서 1종 이상의 PUFA (예를 들어, EPA, DHA, DPA, ARA, GLA, SDA 등)를 생산하도록 식물을 유전공학적으로 조작하는 것이다. 본 발명은 수많은 "디자이너 오일(designer oil)" 중 어느 하나를 다양한 비율 및 형태로 생산할 수 있는 능력을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 특정 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 유전자에 대한 개시는 PUFA 생산의 범위를 보다 쉽게 확장시키고, 대부분의 작물의 성장에 이용되는 온도 범위 내에서 PUFA를 성공적으로 생산시킬 수 있는 기회를 제공한다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 내인성 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템을 갖는 유전자 변형 트라우스토키트리드 미생물에 관한 것이며, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 유전자 변형이 없는 트라우스토키트리드 미생물과 비교시, 미생물에 의한 다중불포화 지방산 (PUFA)의 발현 프로파일을 변경하기 위해 유전자 변형되었다. 본 발명에서 숙주 유기체로서 유용한 트라우스토키트리드 미생물은 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 함유 및 발현한다. 본 발명에 근거한 유전자 변형에는, 본원에 기재된 박테리아 PUFA PKS 시스템으로부터의 PUFA PKS 도메인 또는 단백질 (또는 그의 상동체 또는 기능성 단편)을 코딩하는 1개 이상의 재조합 핵산 서열을 트라우스토키트리드에 도입하는 것이 포함된다. 또한, 트라우스토키트리드는 그의 내인성 PUFA PKS 유전자 내에 유전자 변형, 예를 들어 치환, 부가, 결실, 돌연변이 (예를 들어, 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자의 부분적 또는 완전한 결실, 및 본 발명의 바람직한 해양 박테리아로부터의 PUFA PKS 유전자로 대체)를 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 실시양태는, 본 발명자들이 개발한 유전자 변형 미생물 및 PUFA가 풍부화된 지질 (트리아실글리세롤 (TAG) 및 막-결합 인지질 (PL))의 효율적 생산 방법을 통해 원하는 PUFA (예를 들어, EPA)가 풍부화된 상업적으로 유용한 지질을 생산하는 데 특히 유용하다. 또한, 이러한 미생물은 추후에 식물 세포의 형질전환시 이용하기 위한 최적의 유전자 조합을 결정하는 "대리(surrogate)" 숙주로서 유용하나, 예를 들어 수많은 박테리아 및 효모 숙주를 비롯한 여타 미생물도 "대리" 숙주로서 사용될 수 있다.
본 발명의 이 특정 실시양태는 다음 정보로부터 부분적으로 유래된 것이다: (1) 선별된 미생물, 특히 트라우스토키트리드 (예를 들어, 상업적으로 개발된 쉬조키트리움 균주 ATCC 20888)의 유전적인 TAG 생산능의 이용, (2) 진핵생물 (특히, 트라우스토키트리알레스 목의 구성원) 및 본 발명에서 사용된 해양 박테리아에서의 PUFA PKS 생합성 경로 (즉, PUFA PKS 시스템)에 대한 본 발명자들의 상세한 이해, 및 (3) 쉬조키트리움에서의 상동성 유전자 재조합 시스템의 이용. 관여된 시스템들에 대한 본 발명의 발명자들의 정보를 기초로 하여, EPA 이외의 PUFA들을 생산하기 위한 일반적인 방법을 개발할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 내인성 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자, 예를 들어 DHA 및 DPA를 정상적으로 생산하는 PUFA PKS 효소를 코딩하는 쉬조키트리움 유전자는 무작위 또는 표적화된 돌연변이유발법에 의해 변형되고/거나, (예컨대, 박테리아 또는 여타 공급원으로부터의) 상동성 PKS 단백질을 코딩하는 다른 유기체로부터의 유전자, 예를 들어 본원에 상세하게 기재된 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나로부터의 해양 박테리아 PUFA PKS 유전자로 대체되고/거나, 유전자 변형된 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움 또는 여타 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자로 대체된다. 상기 논의된 바와 같이, 해양 박테리아 및 트라우스토키트리드 또는 여타 PKS 시스템으로부터의 각종 도메인을 코딩하는 핵산 분자들의 조합은 "혼합 및 매치"되어 원하는 PUFA 또는 다른 생물활성 분자를 생산하게 될 구조물(들)을 생성할 수 있다. 도입 및/또는 변형된 유전자에 의해 코딩된 효소들의 생성물은 예를 들어, EPA일 수 있거나, 또는 그밖의 PUFA들을 비롯한 특정한 여타 관련 분자일 수 있다. 상기 방법의 한 특징은, 효율적 생산 및 PL 및 TAG로의 PUFA 도입에 필수적인 트라우스토키트리드 PUFA 합성 및 축적 기구의 내인성 구성요소들을 이용하면서, 예를 들어 해양 박테리아 유전자의 EPA 생산능을 이용하는 것이다. 특히, 본 발명의 상기 실시양태는, 유기체에 의해 생산되는 유형의 PUFA를 변형시키면서 모(parent) 균주의 높은 오일 생산성을 유지하는 것에 관한 것이다.
하기 논의 중 일부에서, 유기체인 쉬조키트리움이 예시적인 숙주 유기체로 이용되고 있지만, 트라우스토키트리움 속, 라비린툴로이데스 속 및 자포노키트리움 속의 구성원을 비롯한 임의의 트라우스토키트리드가 본 발명에 따라 변형될 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 트라우스토키트리움은 본원에 기재된 방법에 의한 유전자 변형을 위한 숙주 유기체로서 기능할 수 있으나, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 유전자는 또다른 트라우스토키트리드 (예를 들어, 쉬조키트리움)의 내인성 PUFA PKS 유전자를 변형시키기 위해 사용될 가능성이 보다 높다. 또한, 상기 미국 출원 제10/124,800호에 설명된 유기체의 스크리닝 방법을 이용하여, 본 발명의 방법에서 유용한 여타 유기체를 동정할 수 있고, 이러한 모든 유기체들은 본원에 포함된다. 또한, 본원에 제공된 예시적인 정보를 이용하여 PUFA PKS 시스템을 구축하고, 다른 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 효모 내에서 생산하고, 식물 세포 내로 형질전환시켜 유전자 변형 식물을 생성할 수 있다. 본원에서 논의된 개념들은 필요에 따라 다양한 시스템에 적용될 수 있다.
본 발명의 상기 실시양태는 다음과 같이 설명될 수 있다. 예를 들어, 쉬조키트리움에서의 PUFA 합성 및 축적에 대한 본 발명자들의 현재적 이해를 바탕으로, 전반적인 생화학적 프로세스는 세 부분으로 나뉠 수 있다.
첫째, 쉬조키트리움 오일 중에 축적된 PUFA (DHA 및 DPA)는 상기 논의된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 생성물이다. 쉬조키트리움의 PUFA PKS 시스템은 유의한 양의 중간체 화합물의 방출 없이 말로닐-CoA를 최종 생성물로 전환시킨다. 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움의 경우, 이들 유기체에서의 실제적인 PUFA 합성에 필요한 것으로 공지된 모든 효소 도메인을 코딩하는 3개의 유전자가 앞서 확인된 바 있다 (Orfs A, B 및 C, 이들은 각각 쉬조키트리움의 경우 서열 13, 서열 15 및 서열 17로 표시되고, 트라우스토키트리움의 경우 서열 19, 서열 21 및 서열 23으로 표시됨). (일련의 상동성 효소 도메인을 함유하는 단백질을 코딩하는) 일련의 유사 유전자는 PUFA를 생산하는 여러 여타 비-진핵 유기체 (즉, 여러 해양 박테리아 균주)에서 클로닝 및 특성 분석되어 왔으나, 본 발명자들은 본 발명에서 2종의 특히 유용한 해양 박테리아 균주인 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로부터의 PUFA PKS 유전자를 확인 및 서열 결정하였다. 이들 해양 박테리아의 PUFA 생성물은 EPA이다. 본 발명의 실시양태에서, 발효 조건 중 생산 유기체 (예컨대, 쉬조키트리움)의 생리적 성장 요건이 충족된다면, 임의의 PUFA PKS 유전자 집합 또는 이들의 조합이 본원의 실시예에 기재된 쉬조키트리움 유전자를 대체하도록 구상될 수 있다. 특히, 상기 기재된 PUFA-생산 박테리아 균주는 비교적 높은 온도 (예컨대, 25℃ 초과)에서 잘 성장하고, 이는 또한 PUFA PKS 유전자 생성물이 쉬조키트리움의 표준 성장 온도 (25 내지 3O℃)에서 기능할 것임을 시사한다. 이러한 개시로부터, 현재로서는 연구되지 않거나 동정되지 않은 다른 PUFA-생산 박테리아도, 트라우스토키트리드의 변형에 유용한 PUFA PKS 유전자를 함유할 수 있다는 점이 당업자에게 명백할 것이다.
둘째, PUFA 합성에 직접적으로 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 이외에도 "액세서리" 효소가 요구된다. 이러한 유전자는 PUFA PKS 복합체 중에 존재하는 아실-운반체 단백질 (ACP) 도메인을 활성화시키는 포스포판테테인 트랜스퍼라제 (PPTase)를 코딩한다. PUFA PKS 효소 복합체가 기능하기 위해서는 이러한 보조인자를 부가함으로써 ACP 도메인을 활성화시키는 것이 필요하다. 지금까지 확인된 PUFA PKS 시스템의 모든 ACP 도메인은 높은 수준의 아미노산 서열 보존 상태를 나타내는데, 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명자들은 쉬조키트리움 및 여타 트라우스토키트리드의 PPTase가 다른 PUFA PKS 시스템으로부터의 ACP 도메인을 인식 및 활성화시킬 것이며 역으로도 가능할 것으로 생각한다. 이러한 유전자는 본원에 기재된 해양 박테리아 PUFA PKS 시스템에 PUFA PKS 시스템의 일부로서 확인 및 포함되고, 본 발명에 포함되는 유전자 변형 시나리오에서 이용될 수 있다. 이종 PPTase 및 PUFA PKS 유전자는 함께 작용하여 PUFA 생성물을 생산할 수 있다는 원리의 증거로서, 본 발명자들은 2종의 상이한 이종 PPTase와, 쉬조키트리움으로부터의 PUFA PKS 유전자를 이용하여 박테리아 숙주 세포에서 PUFA를 생산할 수 있음을 입증하였다.
셋째, 쉬조키트리움 및 여타 트라우스토키트리드의 경우, PUFA PKS 시스템의 생성물은 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG)에 효율적으로 전달된다. 본 발명자들의 데이타는, PUFA가 PKS 복합체의 ACP 도메인으로부터 조효소 A (CoA)로 전달됨을 시사한다. 여타 진핵 유기체에서와 같이, 아실-CoA는 PL 및 TAG 분자를 형성하는 각종 아실-트랜스퍼라제를 위한 기질로서 기능할 것이다. 한편, 데이타는, 박테리아 내에서 CoA로의 전달이 이루어지지 않고, 오히려 PKS 복합체의 ACP 도메인으로부터, PL을 형성하는 아실-트랜스퍼라제로 직접 전달됨을 시사한다. PUFA를 ACP로부터 CoA로 전달하는 쉬조키트리움의 효소 시스템은 DHA 및 DPA를 명확하게 인식할 수 있고, 따라서 본 발명자들은, (PUFA PKS ACP 도메인에 부착된) PUFA PKS 시스템의 임의의 PUFA 생성물이 기질로서 작용할 것이라는 점을 예측할 수 있는 것으로 생각한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명자들은 또다른 트라우스토키트리드 숙주인 쉬조키트리움으로부터의 내인성 PPTase 또는 본 발명의 해양 박테리아로부터의 PPTase, 및 PUFA-ACP → PUFA-CoA 트랜스퍼라제 활성 및 TAG/PL 합성 시스템 (또는 다른 내인성 PUFA ACP → TAG/PL 메카니즘)을 이용하면서, 트라우스토키트리드 숙주에 있는 PUFA PKS 효소 복합체의 구성요소를 코딩하는 유전자를 (예를 들어, 본 발명의 해양 박테리아 PUFA PKS 시스템으로부터의 하나 이상의 도메인 또는 그의 기능성 부분을 코딩하는 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 도입함으로써) 변경시키는 것을 제안한다. 본 발명의 상기 방법은 실험 데이타에 의해 뒷받침되며, 그 일부가 실시예 단락에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명자들 및 다른 발명자들은 앞서 PUFA PKS 시스템이 유기체들 사이에서 전달될 수 있으며, 특정 부분들은 상호교환적임을 밝혔다. 보다 구체적으로, (쉐바넬라로부터의 PPTase와 함께) 해양 박테리아인 쉐바넬라 SCRC2738 (문헌 [Yazawa Lipids 31:S297 (1996)]) 및 비브리오 마리누스의 PUFA PKS 경로 (미국 특허 제6,140,486호)가 이종 숙주 (즉, 이. 콜라이)로 성공적으로 전달될 수 있는 것으로 앞서 밝힌 바 있다. 또한, 이들 2종의 유기체 (쉐바넬라 SCRC2738 및 비브리오 마리누스)로부터의 PUFA PKS 효소들의 서브유닛들간 구조적 상동성의 수준은 두 시스템으로부터의 유전자들을 혼합 및 매치시킬 수 있는 정도이다 (상기 미국 특허 제6,140,486호). 지금까지 확인된 모든 PUFA PKS 효소들의 기능성 도메인은 서로간에 특정한 서열 상동성을 나타낸다. 이와 유사하게, 데이타는 PUFA PKS 시스템 (해양 박테리아로부터의 시스템 포함)이 쉬조키트리움 및 여타 트라우스토키트리드로 전달될 수 있으며 이들 내에서 기능하게 될 것임을 시사한다.
본 발명자들은 이. 콜라이 숙주에서 쉬조키트리움으로부터의 PUFA PKS 유전자 (Orfs A, B 및 C)를 발현시켰으며, 세포가 DHA 및 DPA를, 쉬조키트리움에서의 PUFA의 내인적 생산의 경우와 대략 동일한 비율로 생산하였음을 입증하였다. 따라서, 재조합 쉬조키트리움 PUFA PKS 유전자는 기능성 PUFA 합성 시스템을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 트라우스토키트리움 23B OrfA 및 OrfC 유전자의 일부 또는 전부가 쉬조키트리움 내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 7 참조). 또한, 본 발명자들은 전체 쉬조키트리움 orfC 코딩 서열을 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 서열로 완전하고 정확하게 대체하였고, 그 결과 쉬조키트리움 숙주에서의 PUFA 생산 프로파일이 트라우스토키트리움으로 이동하였다 (실시예 8 참조).
본 발명자들은 앞서 PPTase가 이종 PUFA PKS ACP 도메인을 활성화시킬 수 있음을 발견하였다. 적절한 PPTase 유전자 (이 경우, 쉐바넬라 SCRC2738로부터의 유전자)가 존재하는 경우에만, 비브리오 마리누스로부터의 PUFA PKS 유전자로 형질전환된 이. 콜라이에서 DHA가 생산된다 (상기 미국 특허 제6,140,486호 참조). 이는 쉐바넬라 PPTase가 비브리오 PUFA PKS ACP 도메인을 활성화시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 본 발명자들은 바실루스 섭틸리스로부터의 PPTase (sfp)를 이용한, 쉬조키트리움 Orf A로부터의 ACP 도메인의 활성화 (판트에테이닐화)를 입증하였다 (실시예 3 참조). 또한, 본 발명자들은 노스톡(Nostoc)으로부터의 PPTase (HetI로 불림)에 의한, 쉬조키트리움 Orf A로부터의 ACP 도메인의 활성화 (판트에테이닐화)를 입증하였다 (실시예 3 참조). 또한, 재조합 쉬조키트리움 PUFA PKS 유전자를 이용한 이. 콜라이에서의 DHA 및 DPA의 생산에 대해 상기 논의된 바와 같은 실험에서 PPTase로서 HetI 효소를 사용하였다 (실시예 3).
또한, 데이타는 DHA-CoA 및 DPA-CoA가 쉬조키트리움 TAG 및 PL 합성 경로에서의 대사 중간체일 수 있음을 시사한다. 공개된 생화학적 데이타는, 박테리아에서, 새롭게 합성된 PUFA가 PUFA PKS ACP 도메인으로부터 인지질 합성 효소로 직접 전달되는 것임을 시사한다. 한편, 본 발명자들의 데이타는, 쉬조키트리움 (진핵 유기체)에서 PUFA PKS ACP 도메인 상의 PUFA와 표적 TAG 및 PL 분자들 사이에 중간체가 존재할 수 있음을 시사한다. 진핵생물의 세포질에서 지방산의 전형적인 운반체는 CoA이다. 본 발명자들은 쉬조키트리움 세포의 추출물을 조사하여, 유의한 수준의 화합물들이 HPLC 분획 (표준 물질: DHA-CoA, DPA-CoA, 16:0-CoA 및 18:1-CoA) 동안 함께 이동한다는 것을 발견하였다. 추정되는 DHA-CoA 및 DPA-CoA 피크를 질량 분광법에 의해 확인하였다. 한편, 본 발명자들은 비브리오 마리누스의 추출물에서 DHA-CoA를 검출할 수 없었기 때문에, PUFA를 최종 표적으로 전달 (예컨대, PL로 직접 전달)하는 데 있어서 상이한 메카니즘이 박테리아에 존재하는 것으로 판단하였다. 데이타는 새롭게 합성된 PUFA를 CoA로 전달하기 위한 메카니즘 (아마도, ACP에서 CoA로 직접 전달하는 메카니즘)이 쉬조키트리움에 존재함을 시사한다. TAG 및 PL 합성 효소는 모두 PUFA-CoA에 접근할 수 있다. DHA 및 DPA CoA가 생산된다는 사실은 효소 전달 기구가 소정 범위의 PUFA를 인식할 수 있음을 시사한다.
또한, 본 발명자들은 쉬조키트리움에서 Orf A 넉아웃, Orf B 넉아웃 및 Orf C 넉아웃을 생성하였다 (실시예 4 참조). 넉아웃 전략은, 쉬조키트리움에서 일어나는 것으로 입증된 상동성 재조합에 따른다 (상기 미국 특허 출원 제10/124,807호 참조). 넉아웃 구조물의 설계에서는 여러 전략이 이용될 수 있다. 상기 3개의 유전자를 불활성화시키는 데 이용되는 특정 전략에서는, 튜불린 프로모터에 결합된 제오신™ (Zeocin™) 내성 유전자 (pMON50000으로부터 유래됨, 미국 특허 출원 제10/124,807호 참조)를 Orf의 클로닝된 부분에 삽입하는 것이 이용되었다. 따라서, 중단된 코딩 영역을 함유하는 새로운 구조물을, 입자 충격을 통한 야생형 쉬조키트리움 세포의 형질 전환을 위해 사용하였다 (미국 특허 출원 제10/124,807호 참조). 포격된 세포를 제오신™ 및 PUFA 공급물을 함유하는 플레이트 상에 스프레딩하였다 (하기 참조). 이후, 상기 플레이트 상에서 성장한 콜로니를, PUFA가 보강되지 않은 제오신™ 플레이트 상에 스트리킹하였다. 성장을 위해 PUFA의 보강이 필요한 콜로니는, 상동성 재조합을 통해 불활성화된 PUFA PKS Orf를 갖는 경우의 후보이다. 상기 3가지 경우 모두에서, 세포를 각 쉬조키트리움 Orf의 전장 게놈 DNA 클론으로 형질전환시켜 넉아웃을 구조함으로써 상기 가정을 확인하였다. 또한, 일부 경우에서, 구조된 형질전환체에서 제오신™ 내성 유전자가 제거된 것으로 밝혀졌는데 (실시예 6 참조), 이는 도입된 기능성 유전자가 이중 상동성 재조합 (즉, 내성 마커의 결실)에 의해 고유 부위 내로 통합되었음을 나타낸다. 이러한 전략의 성공을 위한 핵심은 PUFA를 함유하는 성장 배지의 보강이다. 이 경우, 효과적인 보강 수단은, 부분적으로 메틸화된 베타-시클로덱스트린과 혼합한 후에 성장 배지에 첨가함으로써 PUFA를 격리(sequestration)시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 6 참조). 또한, 상기 실험은, 본원에 제공된 지침이 주어진 경우, 당업자가 PUFA PKS-함유 미생물 (예를 들어, 쉬조키트리움)에 있는 1종 이상의 PUFA PKS 유전자를 불활성화시키고, (예컨대, 재조합 유기체의 지방산 프로파일을 변경하기 위해) 본 발명에 따라 (예컨대, 다른 PKS 유전자의 도입에 의해) 추가로 유전자 변형시키는 데 사용될 수 있는 PUFA 영양요구체를 생성할 수 있음을 입증하였다.
본 발명의 유기체의 유전자 변형의 한 요소는 트라우스토키트리드 게놈을 직접적으로 형질전환시킬 수 있는 능력이다. 상기 미국 출원 제10/124,807호에서는, 단일 교차 상동성 재조합을 통한 쉬조키트리움의 형질전환, 및 이중 교차 상동성 재조합을 통한 표적화 유전자 치환이 입증되었다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 쉬조키트리움에서의 PUFA-PKA 시스템의 Orf A, Orf B 및 Orf C를 불활성화시키는 상동성 재조합 기술을 이용하였다. 생성된 돌연변이체는 PUFA를 함유하는 매질의 보강 상황에 따라 달라진다. 형질전환을 위한 여러 마커, 도입된 유전자의 고수준 발현을 위한 프로모터 요소, 및 외인성 유전 물질의 전달 방법이 개발되어 이용가능하다. 따라서, 트라우스토키트리드 및 유사한 PUFA PKS 시스템을 갖는 다른 진핵생물의 내인성 PUFA PKS 유전자를 넉아웃시키고, 이들을 다른 유기체, 예를 들어 본원에 기재된 해양 박테리아로부터의 유전자로 대체하기 위한 도구가 필요하며, 이는 상기 제안된 바와 같다.
EPA-풍부 TAG의 생산을 위한 한 방법에서, 생성물이 EPA인 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 이종 유전자 (예를 들어, 본원에 기재된 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로부터의 유전자)를 부가함으로써 쉬조키트리움의 PUFA PKS 시스템을 변경할 수 있다. 내인성 PPTase는 이종 PUFA PKS 시스템의 ACP 도메인을 활성화시킬 것으로 예상되나, 본 발명자들은 또한, 해양 박테리아로부터의 PPTase를 클로닝 및 서열결정하였고, 이를 숙주에 도입할 수 있었다. 또한, EPA가 EPA-CoA로 전환될 것이고, 쉬조키트리움 TAG 및 PL 막에 용이하게 도입될 것으로 예상된다. 따라서, 한 실시양태에서, 생성된 미생물이 EPA 및 DHA를 생산하도록, EPA를 생산하는 이종 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 유전자 (예컨대, 상기 해양 박테리아로부터의 유전자)를, DHA를 천연적으로 생산하는 미생물 (예컨대, 쉬조키트리움)에 도입할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 2종의 상이한 PUFA PKS 시스템을 식물 세포에 도입함으로써 상기 기술을 유전자 변형 식물에 추가로 적용시켜, EPA 및 DHA, 또는 원하는 PUFA들의 임의의 조합을 생산하는 식물을 생성할 수 있다.
상기 방법의 한 변형에서, 최종 생성물이 DHA 및 DPA보다는 EPA가 되도록, 또는 최종 생성물이 EPA 및 DHA 및/또는 DPA가 되도록, 또는 최종 생성물이 DHA 및 DPA 대신에 EPA 및 ARA가 되도록, 내인성 쉬조키트리움 시스템의 관련 도메인을 (이종 유전자의 특이적 영역의 도입, 또는 쉬조키트리움 유전자 자체의 돌연변이유발에 의해) 변형시키는 기술이 이용될 수 있다. 이 기술은 다른 PUFA 최종 생성물의 생산시 적용될 수 있고, PUFA PKS 시스템을 포함하면서 PUFA PKS 시스템의 생성물을 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG)에 효율적으로 전달할 수 있는 임의의 진핵 미생물에 적용될 수 있기 때문에 예시적인 방법이다. 특히, 본 발명은 내인성 PUFA PKS 시스템을 갖는 임의의 트라우스토키트리드 미생물 또는 임의의 다른 진핵생물에 적용될 수 있다 (하기에 예를 통해 상세하게 기재되어 있음). 또한, 본 발명은 임의의 적합한 숙주 유기체 (단, 본원에 기재된 바와 같은 각종 PUFA 프로파일의 생산을 위한 변형된 유전 물질이 이들 유기체 내로 형질전환될 수 있음)에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서, 쉬조키트리움으로부터의 PUFA PKS 시스템은 이. 콜라이 내로 형질전환된다. 이어서, 본원에 기재된 방법에 의해 PUFA 생산 프로파일을 변경하기 위해 상기 형질전환된 유기체를 추가로 변형시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서는, 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템이 아닌 PKS 시스템 및 선행 기술의 PKS 시스템으로부터의 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자 및 핵산 서열이 이용되며, 이는 상기 기재된 제I형 (반복형 또는 모듈형), 제II형 또는 제III형의 PKS 시스템을 비롯하여 박테리아 및 비-박테리아 PKS 시스템로부터의 유전자 및 핵산 서열을 포함한다. 이러한 유형의 PKS 시스템 각각을 발현하는 유기체는 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 유전자 변형 프로세스에서 유용한 핵산의 공급원으로서 기능할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 PUFA PKS 시스템이 아닌 PKS 시스템 또는 여타 PUFA PKS 시스템으로부터의 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자 및 핵산 서열은, PUFA의 생산에 바람직한 성장 특성을 갖는 유기체로부터 단리 또는 유래된다. 특히, 약 15℃ 이상, 2O℃ 이상, 25℃ 이상 또는 30℃ 이상, 또는 약 35℃ 이하의 온도에서, 또는 한 실시양태의 경우 약 20℃ 내지 35℃ 사이에서 1℃씩 증가시킨 임의의 온도에서 유전자 변형 트라우스토키트리드 미생물을 배양할 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 온도에서 기능성 효소 활성을 갖는 PKS 단백질 또는 도메인이 바람직하다. 본원에 기재된 쉐바넬라 올레야나 또는 쉐바넬라 자포니카로부터의 PUFA PKS 유전자는 EPA를 천연적으로 생산하며, 25℃, 30℃ 또는 35℃ 이하의 온도에서 성장하는데, 이로써 이들 미생물은 본 발명의 이 실시양태에서 특히 유용하다 (실시예 1 및 2 참조).
또다른 바람직한 실시양태에서, 1개의 지방산 프로파일을 생성하는 PUFA PKS 시스템으로부터의 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자 및 핵산 서열은 또다른 PUFA PKS 시스템을 변형시키고, 그에 의해 숙주의 지방산 프로파일을 변경시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 트라우스토키트리움 23B (ATCC 20892)는 쉬조키트리움 종 (ATCC 20888)과 그의 지방산 프로파일에서 유의하게 상이하다. 트라우스토키트리움 23B는 쉬조키트리움 (ATCC 20888)에서의 단지 2-3:1에 비해 40:1 만큼 높은 DHA:DPA(n-6) 비율을 가질 수 있다. 트라우스토키트리움 23B는 더 높은 수준의 C20:5(n-3)을 가질 수도 있다. 그러나, 쉬조키트리움 (ATCC 20888)은 트라우스토키트리움 23B에 비해 우수한 오일 생산자이다. 쉬조키트리움은 DHA 및 도코사펜타엔산 (DPA, 22:5ω6)에 다량의 트리아실글리세롤, 예컨대 30％ DHA + DPA (건조 중량)를 풍부하게 축적한다. 따라서, 본원 발명의 발명자들은 트라우스토키트리움 23B에 더 유사한 DHA:DPA 프로파일을 갖는 유전자 변형 쉬조키트리움 (즉, "슈퍼-DHA-생산자" 쉬조키트리움, 여기서 쉬조키트리움의 생산능은 트라우스토키트리움의 DHA:DPA 비율과 조합됨)을 생산하기 위해 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS 유전자를 갖는 쉬조키트리움 내인성 PUFA PKS 시스템의 변형을 본원에 기재한다. 이 변형은 실시예 8에서 입증된다.
따라서, 본 발명은 특정 해양 박테리아 및 임의의 트라우스토키트리드 또는 다른 진핵 PUFA PKS 시스템으로부터의 유전자를 사용하고, PUFA 생성물의 범위를 확장하고/거나 변경하여 EPA, DHA, DPA, ARA, GLA, SDA 등을 포함하기 위해 유전자 믹싱을 추가로 사용한다. 이들 변경된 PUFA 생산 프로파일을 수득하는 방법은 각종 유기체로부터의 유전자를 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자에 유전자 혼합하는 것 및 본원에 기술된 내인성 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자를 유전자 변형시키는 각종 방법을 포함한다. 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템 및 해양 박테리아 PUFA PKS 시스템의 유전적 기초 및 도메인 구조의 지식은 각종 PUFA 프로파일을 생성하는 신규 유전자 변형 유기체를 고안하는 기초를 제공한다. 트라우스토키트리드 등과 같은 미생물에서 제조된 신규 PUFA PKS 구조물은 단리될 수 있으며, 식물의 형질전환에 사용되어 그 식물에 유사한 PUFA 생산 특성을 부여할 수 있다.
임의의 하나 이상의 내인성 트라우스토키트리드 PUFA PKS 도메인은 본 발명에 따라 변경 또는 대체할 수 있는데 (예를 들어, 본 발명의 해양 박테리아로부터의 도메인으로), 이는 상기 변형이 원하는 결과를 생성하도록 제공한다 (즉, 미생물의 PUFA 생산 프로파일의 변경). 변경 또는 대체하기에 특히 바람직한 도메인으로는 쉬조키트리움 OrfB 또는 OrfC 중의 도메인에 상응하는 임의의 도메인 (β-케토아실-ACP 신타제 (KS), 아실트랜스퍼라제 (AT), FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH), 쇄 길이 인자 (CLF), 에노일 ACP-리덕타제 (ER), 트랜스-2-아실-ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실-ACP에서 시스-3-아실-ACP로의 가역성 이성질체화를 촉매하는 효소, 및 시스-3-아실-ACP에서 시스-5-β-케토-아실-ACP로의 신장을 촉매하는 효소) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 변경 또는 대체하기에 바람직한 도메인으로는 β-케토아실-ACP 신타제 (KS), FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH), 및 쇄 길이 인자 (CLF) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 트라우스토키트리드 PUFA-PKS PUFA 생산은 CLF (쇄 길이 인자) 도메인을 변형시킴으로써 변경된다. 이 도메인은 제II형 (분리된 효소) PKS 시스템의 특징이다. 그의 아미노산 서열은 KS (케토 신타제 쌍) 도메인에 대해 상동성을 나타내지만, 활성 부위 시스테인를 결실하고 있다. CLF는 신장 주기의 수, 및 그에 따른 최종 생성물의 쇄 길이를 결정하는 기능을 할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서, FAS 및 PKS 합성에 대한 현 상태의 지식을 사용하여, 비-박테리아 PUFA-PKS 시스템의 직접 변형에 의한 ARA의 생산에 대한 합리적 전략을 제공한다. PKS 시스템에서의 CLF의 기능에 관한 문헌에 논쟁이 있고 ([Bisang et al., Nature 401:502 (1999)], [Yi et al., J Am. Chem. Soc. 125:12708 (2003)]), 다른 도메인이 최종 생성물의 쇄 길이의 결정에 관련될 수 있는 것이 실현된다. 그러나, 쉬조키트리움이 DHA (C22:6, ω-3) 및 DPA (C22:5, ω-6)을 모두 생산하는 것은 유의하다. PUFA-PKS 시스템에서 시스 이중 결합은 성장 탄소 쇄의 합성 동안 도입된다. ω-3 및 ω-6 이중 결합의 배치가 분자의 합성 초기에 발생되기 때문에, 이들이 차후 최종 생성물 쇄 길이 결정에 영향을 미칠 것이라고 예상되지 않을 것이다. 따라서, 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본원 발명의 발명자들은 쉬조키트리움 PUFA-PKS 시스템 내로의 (C22 단위 대신) C20 단위의 합성에 관한 인자 (예컨대, CLF)의 도입이 EPA (C20:5, ω-3) 및 ARA (C20:4, ω-6)을 생산시킬 것이라고 여긴다. 예를 들어, 이종 시스템에서, EPA 생산 시스템으로부터 (예컨대, 포토박테리아, 또는 바람직하게는 하기 기재되는 바람직한 성장 요건을 갖는 미생물로부터의 것) 쉬조키트리움 유전자 세트로의 CLF의 직접적 치환에 의해 CLF를 활용할 것이다. 이어서, 생성된 형질전환체의 지방산은 EPA 및/또는 ARA를 생산하는 형질전환체를 동정하는 프로파일에서 변경에 대해 분석될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이 측면에서, 본원에 상세하게 기재된 C20 PUFA-PKS 시스템, 예컨대 해양 박테리아 시스템으로부터의 CLF로 대체된 OrfB의 CLF를 갖는 클론을 작제할 수 있다. 마커 유전자는 코딩 영역의 하류에 삽입될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본원에 기재하고, 미국 특허 출원 제10/124,807호 (상기 문헌)에 상세하게 기재된 트라우스토키트리드의 형질전환에 대한 상동성 재조합 시스템을 사용할 수 있다. 이어서, 야생형 트라우스토키트리드 세포 (예컨대, 쉬조키트리움 세포)를 형질전환시키고, 마커 표현형을 선별하고, 이어서 신규 CLF을 혼입한 것을 스크리닝할 수 있다. 즉, EPA 및/또는 ARA를 생산하는 형질전환체를 동정하는 지방산 프로파일에 대한 임의의 영향에 대해 이들 형질전환체를 분석할 것이다. 대안적이며 일부 경우에, 바람직하게는, 스와핑된 도메인의 영향에 대한 이러한 스크리닝은 이. 콜라이 (하기 기재됨) 또는 다른 시스템, 예컨대 이에 제한되지 않는 효모에서 수행될 수 있다. CLF와 관련된 것 이외에 일부 인자가 최종 생성물의 쇄 길이에 영향을 미치는 것이 발견되는 경우에, 유사한 전략이 그들 인자를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 유기체는 쇄 길이 인자와 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인을 모두 도입시킴으로써 변형된다.
본 발명의 또다른 측면에서, β-히드록시아실-ACP 데히드라제/케토 신타제 쌍의 변형 또는 치환이 고려된다. 이. 콜라이에서 시스-바센산 (C18:1,Δ11) 합성 동안, 시스 이중 결합의 생성은 특이적 DH 효소, β-히드록시아실-ACP 데히드라제, fabA 유전자의 생성물에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 이 효소는 β-케토아실-ACP로부터 HOH를 제거하고, 탄소 쇄에 초기에 트랜스 이중 결합을 생성한다. DH의 서브세트인 FabA-유사는 시스-트랜스 이소머라제 활성을 보유한다 [Heath et al., 1996, (상기 문헌)]. 박테리아 및 비-박테리아 PUFA-PKS 시스템의 신규 측면은 FabA-유사 DH 도메인의 존재이다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본원 발명의 발명자들은 이들 DH 도메인의 하나 또는 모두가 시스-트랜스 이소머라제 활성을 보유할 것으로 여긴다 (DH 도메인의 조작은 하기에 더 상세하게 논의됨).
이. 콜라이에서 불포화 지방산 합성의 또다른 측면은 특정 KS 효소, β-케토아실-ACP 신타제, fabB 유전자의 생성물에 대한 요건이다. 이는 (티오-에스테르 결합에 의해) 활성 부위에서 시스테인 잔기에 연결된 지방산을 말로닐-ACP으로 축합하는 효소이다. 다중-단계 반응에서, CO2는 유리되고, 선형 쇄는 2개 탄소에 의해 연장된다. 이 KS만 이중 결합을 함유한 탄소 쇄를 연장할 수 있는 것으로 여겨진다. 이 연장은 이중 결합이 시스 배위인 경우에만 발생되고, 트랜스 배위인 경우에는, 이중 결합이 에노일-ACP 리덕타제 (ER)에 의해 신장 전에 환원된다 [Heath et al., 1996, (상기 문헌)]. 지금까지 특징규명된 모든 PUFA-PKS 시스템은 2개의 KS 도메인을 가지며, 이들 중 하나는 이. 콜라이의 FabB-유사 KS에 다른 것에 비해 더 높은 상동성을 나타낸다. 또한, 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본원 발명의 발명자들은 PUFA-PKS 시스템에서 DH (FabA-유사) 및 KS (FabB-유사) 효소 도메인의 특이성 및 상호작용이 최종 생성물에서의 시스 이중 결합의 수 및 배치를 결정하는 것으로 여긴다. 2-탄소 신장 반응의 수가 PUFA-PKS 최종 생성물 중에 존재하는 이중 결합의 수보다 크기 때문에, 일부 연장 주기에서 완전한 환원이 발생되는 것을 측정할 수 있다. 따라서, DH 및 KS 도메인은 DHA/DPA 비율 또는 다른 장쇄 지방산 비율의 변경에 대한 표적으로 사용될 수 있다. 이들은 다른 시스템으로부터의 상동성 도메인의 도입 또는 이들 유전자 단편의 돌연변이유발에 의해 변형 및/또는 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, FabA-유사 DH 도메인은 KS 파트너 도메인을 조금도 요구하지 않을 수 있다.
또다른 실시양태에서, ER (에노일-ACP 리덕타제 - 완전 포화된 탄소를 발생시키는 지방 아실-ACP에서 트랜스 이중 결합을 환원시키는 효소) 도메인은 PKS 시스템에 의해 생산된 생성물의 유형을 변화시키기 위해 변형 또는 치환될 수 있다. 예를 들어, 본원 발명의 발명자들은 쉬조키트리움 PUFA-PKS 시스템이 (1개 보다는) 2개의 ER 도메인을 갖는 것 중에서 이전에 기재된 박테리아 시스템과는 상이한 것을 인지한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본원 발명의 발명자들은 이들 ER 도메인이 생성된 PKS 생산 생성물에 강력하게 영향을 미칠 수 있는 것으로 여긴다. 생성된 PKS 생성물은 넉아웃 개개의 도메인을 별개로 넉아웃시키거나, 그들의 뉴클레오티드 서열을 변형시키거나 또는 다른 유기체로부터의 ER 도메인, 예컨대 본원에 기재한 해양 박테리아로부터의 ER 도메인을 치환시킴으로써 변화될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 시스- 및 트랜스-이중 결합의 믹스로 분자를 잠재적으로 생성시키며 이성질체화 활성을 보유하지 않는 DH 도메인에 대한 PUFA-PKS 시스템의 1개의 DH (FabA-유사) 도메인을 치환시키는 것이 고려된다. 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템의 현 생성물은 DHA 및 DPA (C22:5 ω6)이다. 시스템을 조작하여 C20 지방산을 생산하는 경우에, 생성물이 EPA 및 ARA (C20:4 ω6)일 것으로 예상할 것이다. 이는 ARA에 대한 신규 공급원을 제공할 수 있다. 상이한 DHA 대 DPA 비율을 생성하는 관련된 PUFA-PKS 시스템으로부터의 도메인을, 예를 들어 트라우스토키트리움 23B으로부터의 유전자를 사용하여 치환할 수도 있다 (미국 특허 출원 제10/124,800호 (상기 문헌)에서 동정된 PUFA PKS 시스템).
추가로, 한 실시양태에서, ER 도메인 중 하나가 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템에서 (예컨대, 제거 또는 불활성화시킴으로써) 최종 생성물 프로파일을 변경시킨다. 유사한 전략은 다소 복잡한 접근법으로 PUFA-PKS 단백질의 별개 도메인 각각에 대한 직접 방식으로 시도될 수 있다. 물론, 단일 도메인의 조작에 제한되지 않을 것이다. 마지막으로, PUFA-PKS 시스템 및 다른 PKS 또는 FAS 시스템 (예컨대, 제I형, 제II형, 제III형)으로부터의 도메인 믹싱에 의해 접근법을 확장하여 전체 범위의 신규 PUFA 최종 생성물을 생성할 수 있다.
본원에 상세하게 기재된 박테리아 PUFA PKS 유전자가 쉬조키트리움에서 PUFA 생산을 변형시키기 위해 어떻게 사용될 수 있는가에 대한 예로서, 하기 논의를 제공한다. 또한, 본원에 기재한 모든 예는 다른 유전자 변형 미생물의 생성 또는 유전자 변형 식물의 생성에 동등하게 적용시킬 수 있다. 박테리아로부터의 PUFA PKS 유전자의 모든 현재 공지된 예는 3개 유전자 쉬조키트리움 세트에서와 동일한 도메인을 함유한 4개의 인접하게 연결된 유전자로서 존재한다. 더욱이, 본원 발명의 발명자들은 쉐바넬라 올레야나 및 쉐바넬라 자포니카로부터의 PUFA PKS 유전자가 단단히 클러스터된 이 배열로 나타난다는 것을 입증하였다. 본원에 기재한 박테리아 PUFA PKS 유전자의 DNA 서열은 내인성 PUFA PKS 유전자를 결손한 쉬조키트리움 균주의 형질전환을 위한 벡터를 고안하기 위해 당장 사용될 수 있다 (예컨대, 실시예 4, 6 및 7 참조). 온전한 박테리아 유전자 (코딩 서열)는 온전한 쉬조키트리움 유전자 (코딩 서열)를 대체함으로써 쉬조키트리움 유전자 발현 영역을 사용하기 위해 사용될 수 있고, 제4 박테리아 유전자는 게놈 내의 상이한 위치에 표적화될 수 있다. 대안적으로, 개개의 박테리아 PUFA PKS 기능적 도메인은 상동성 재조합의 유사한 기술에 의해 유사한 쉬조키트리움 도메인과 "스와핑(analogous)" 또는 교환될 수 있다. 또다른 별법으로서, 박테리아 PUFA PKS 유전자는 심지어 트라우스토키트리드로부터의 PUFA PKS 시스템에 첨가하여 하나 이상의 PUFA 신타제 활성을 보유한 유기체를 생성할 수 있다. 박테리아 PUFA PKS 유전자 또는 도메인의 서열이 쉬조키트리움 코돈 사용방식의 세부사항을 적응시키기 위해 변형되어야 할 수 있지만, 이는 당업자의 능력 범위 내라는 것이 이해된다.
천연 (내인성, 자연) PKS 시스템 내로 도입시킬 수 있는 다수의 유전자 무작위 또는 지정된 변경이 효소 기능을 불활성화시킬 것이라는 것이 인식된다. 따라서, 제어된 환경에서 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템의 유전자 조작의 효과에 대해 시험하기 위해, 먼저 또다른 숙주, 예컨대 이. 콜라이 중의 재조합 시스템을 사용하여 시스템의 각종 측면을 조작하고, 그 결과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이의 FabB 균주는 불포화 지방산을 합성할 수 없고, 그의 일반 불포화 지방산에 대해 치환시켜 성장시킬 수 있는 지방산을 갖는 배지의 보충을 요구한다 (문헌 [Metz et al. (2001), (상기 문헌)] 참조). 그러나, (배지의 보충에 대한) 이 요건은 균주가 기능적 PUFA-PKS 시스템으로 형질전환되는 경우에 제거될 수 있다 (즉, 이. 콜라이 숙주에서 PUFA 생성을 생산하는 것 - 문헌 [Metz et al. (2001), (상기 문헌), 상기 간행물의 도 2A 참조] 참조). 형질전환된 FabB 균주는 보충 없는 성장을 위해 (불포화 지방산을 생산하기 위해) 기능적 PUFA-PKS 시스템을 즉시 요구한다. 이 예에서 중요한 요소는 광범위한 불포화 지방산의 생산이 충분할 것이라는 것이다 (심지어 불포화 지방산 치환체, 예컨대 분지쇄 지방산). 따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 PUFA PKS 유전자에 많은 다수의 돌연변이를 생성시키고, 이어서 적절하게 변형된 FabB 균주를 형질전환시키고 (예컨대, ER 도메인을 함유한 발현 구조물에서 돌연변이를 생성시키고, 별개의 플라스미드 상의 다른 필수 도메인을 보유한 FabB 균주를 형질전환시키거나 또는 염색체 내에 통합됨) 및 배지의 보충 없이 성장하는 그들 형질전환체에 대해서만 선별한다 (즉, FabB 결손을 보완할 수 있는 분자를 생산하는 능력을 여전히 보유함). 이. 콜라이의 FabA 균주는 FabB 균주와 유사한 표현형을 가지고, 상기한 예에서 별법의 균주로서 사용될 수도 있다.
PUFA PKS의 유전자 변형에 대한 한 시험 시스템은 실시예 단락에서 예시된다. 간략하게는, 숙주 미생물, 예컨대 이. 콜라이는 모든 또는 일부의 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템 (예컨대, 쉬조키트리움의 Orf A, B 및 C)을 포함하는 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 유전자 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 코딩하는 유전자로 형질전환시키며, 이는 활성 할로-ACP를 PKS 시스템에 생산하는 포스포판테테인 보조인자의 부착을 요구한다. PKS 시스템을 코딩하는 유전자는 하나 이상의 변형을 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자에 도입하고/거나 다른 PKS 시스템으로부터의 도메인을 코딩하는 핵산을 트라우스토키트리드 유전자 (비-트라우스토키트리드 미생물로부터의 유전자 및 상이한 트라우스토키트리드 미생물로부터의 유전자를 포함함)에 도입하기 위해 유전적으로 유전자조작될 수 있다. PUFA PKS 시스템을 이. 콜라이에서 발현시키고, PUFA 생산 프로파일을 측정할 수 있다. 이 방식에서, 잠재적인 유전자 변형은 트라우스토키트리드 PUFA 생산 유기체의 조작 전에 평가될 수 있다.
본 발명은 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템 중의 내인성 핵산 분자의 조작 및/또는 쉐바넬라 자포니카 PUFA PKS 시스템, 쉐바넬라 올레야나 PUFA PKS 시스템으로부터의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자의 용도를 포함하고, 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템으로부터의 핵산 서열, 또는 임의의 이러한 핵산 서열의 상동성부를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 하기 단백질 중 하나 이상의 생물학적 활성을 보유한 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자의 변형 및/또는 용도에 관한 것이다: 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT), β-케토아실-ACP 신타제 (KS), 케토리덕타제 (KR), 아실트랜스퍼라제 (AT), FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄 길이 인자 (CLF), 아실 운반체 단백질 (ACP), 에노일 ACP-리덕타제 (ER), 트랜스-2-아실-ACP의 합성을 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP로의 트랜스-2-아실-ACP의 가역성 이성질체화를 촉매하는 효소, 및/또는 시스-5-β-케토-아실-ACP로의 시스-3-아실-ACP의 신장을 촉매하는 효소. 숙주 트라우스토키트리드의 PUFA 생산 프로파일을 변경하기 위해 변형에 바람직한 도메인은 본원에서 이전에 논의되었다.
본 발명에 따른 유기체의 유전자 변형은 유기체가 유전자 변형된 내인성 PUFA PKS 시스템을 가지고/거나 재조합 핵산 분자가 유기체 내에 도입되거나 간에 바람직하게는 유기체에 의해 생산되는 PUFA의 유형, 양 및/또는 활성에 영향을 미친다. 본 발명에 따라, PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 것, 예컨대 PUFA 생산 프로파일에 영향을 미치는 것은 유전자 변형의 부재에 비해 유기체에 의해 발현되는 PUFA PKS 시스템의 임의의 생물학적 활성에서 임의의 검출가능 또는 측정가능한 변화 또는 변형을 유발하는 PUFA PKS 시스템과 상호작용하는 PUFA PKS 시스템 또는 유전자 중의 임의의 유전자 변형을 포함한다. 본 발명에 따라, 어구 "PUFA 프로파일", "PUFA 발현 프로파일" 및 "PUFA 생산 프로파일"은 구별없이 사용될 수 있고, 유기체에 의해 발현/생산되는 PUFA의 전체 프로파일을 나타낸다. PUFA 발현 프로파일은 유기체의 의해 발현되는 PUFA의 유형, 뿐만 아니라 생산되는 PUFA의 절대량 및 상대량을 포함할 수 있다. 따라서, PUFA 프로파일은 유기체에 의해 생산되는 서로에 대한 PUFA의 비율, 유기체에 의해 생산되는 PUFA의 유형, 및/또는 유기체에 의해 생산되는 PUFA의 유형 및 절대량 또는 상대량에 관해 기재될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 숙주 유기체는 내인성 PUFA PKS 시스템과 함께 또는 없이 임의의 원핵 또는 진핵 유기체를 포함할 수 있고, 바람직하게는 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG)로의 PUFA PKS 시스템의 생성물의 채널을 효율적으로 개방하는 능력을 보유한 진핵 미생물이다. 바람직한 숙주 미생물은 트라우스토키트리아세애 및 라비린툴라세애 과를 비롯한 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 구성원이다. 이들 과들의 특히 바람직한 숙주 세포는 상기 기재되어 있다. 바람직한 숙주 식물 세포는 상업적으로 유용한 임의의 작물 또는 식물의 식물 세포를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 유전적 유전자조작 및/또는 돌연변이유발 프로그램이 관심 PUFA 생산 프로파일을 갖는 트라우스토키트리드 미생물을 수득하는 선택적 스크리닝 방법과 조합될 수 있다는 것이 고려된다. 돌연변이유발 방법으로는 화학 돌연변이유발법, 유전자의 셔플링(shuffling), 특이적 효소 도메인을 코딩하는 유전자의 스위칭 영역, 또는 이들 유전자의 특이적 영역에 제한된 돌연변이유발법, 뿐만 아니라 기타 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 고처리량 돌연변이유발 방법은 원하는 PUFA 프로파일의 생성에 영향을 미치거나 또는 최적화시키기 위해 사용될 수 있다. 효과적인 모델 시스템이 개발된다면, 고처리량 방식으로 이들 유전자를 변형시킬 수 있다. 이들 기술의 사용은 2개의 수준으로 구상될 수 있다. 첫 번째, 관심 생성물 (예컨대, EPA)의 생산에 대한 충분히 선택적 스크리닝이 고안될 수 있는 경우에, 이는 이 생성물을 생산하는 시스템을 변경하는 시도에 사용될 수 있다 (예컨대, 다른 방법, 예컨대 상기 논의된 것 대신에, 또는 그와 협력하여). 추가로, 상기 약술된 방법이 관심 PUFA 프로파일을 생산하는 유전자 세트를 생성하는 경우에, 고처리량 기술은 이어서 시스템을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도입된 도메인이 비교적 낮은 온도에서만 기능하는 경우에, 선별 방법은 제한을 제거하도록 고안될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서, 유전자 변형 미생물 또는 식물은 원하는 생물활성 분자 (생성물)를 합성하는 증대된 능력 또는 특이적 생성물을 합성하는 (예컨대, 특이적 항생제를 합성하는) 신규 도입된 능력을 보유하는 미생물 또는 식물을 포함한다. 본 발명에 따라, 생성물을 "합성하는 증대된 능력"은 미생물 또는 식물이 동일한 조건하에 배양 또는 성장된 야생형 미생물 또는 식물에 비해 증가된 양의 생성물의 생산물 (이전에 없었던 생성물의 임의의 생산을 포함함)을 생산하도록 생성물의 합성과 관련된 경로에서 임의의 증대, 또는 상향 조절을 나타낸다. 이러한 유전자 변형 유기체를 생산하는 방법은 상기 상세하게 기재되어 있고, 더욱이 임의의 PUFA PKS 시스템을 사용하여 기재된 임의의 예시적 변형이 식물에서의 발현에 적합하게 될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 유전자 변형 미생물 또는 식물을 성장 또는 배양함으로써 원하는 생물활성 분자 (생성물 또는 화합물로서도 지칭됨)의 생산 방법이다. 이러한 방법은 본원 이전에 기재되고, 본 발명에 따른 유전자 변형을 각각 갖는 미생물 또는 식물을 발효 배지에서 배양시키거나 또는 적합한 환경, 예컨대 토양에서 성장시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련된 유전자 변형에 대한 바람직한 숙주 세포가 상기 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 유전자 변형 미생물의 배양에 의한 원하는 PUFA의 생산 방법이다 (상기 상세하게 기재되어 있음). 이러한 방법은 본원 이전에 기재되고, 본 발명에 따른 유전자 변형을 보유하는 미생물을 PUFA(들)의 생산에 효과적인 조건하에 발효 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 적절하거나 또는 효과적인 배지는 트라우스토키트리드 및 다른 미생물을 포함하는 본 발명의 유전자 변형 미생물이 배양시에 원하는 PUFA 생성물(들)을 생산할 수 있는 임의의 배지를 나타낸다. 이러한 배지는 전형적으로 동화가능한 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원을 포함하는 수성 배지이다. 이러한 배지는 적절한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소를 포함할 수도 있다. 본 발명의 임의의 미생물은 통상의 발효 생물반응기에서 배양될 수 있다. 미생물은 배치(batch), 공급-배치, 세포 재순환, 및 연속 발효 등이 있으나 이에 제한되지 않는 임의의 발효 방법에 의해 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 트라우스토키트리드 미생물에 대한 바람직한 성장 조건은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,130,242호, 미국 특허 제5,340,742호, 및 미국 특허 제5,698,244호에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
한 실시양태에서, 유전자 변형 미생물은 약 15℃ 이상의 온도에서 배양되고, 또다른 실시양태에서는 약 20℃ 이상의 온도에서 배양되고, 또다른 실시양태에서는 약 25℃ 이상의 온도에서 배양되고, 또다른 실시양태에서는 약 30℃ 이상의 온도에서 배양되고, 또다른 실시양태에서는 약 35℃ 이하 또는 그 이상의 온도에서 배양되며, 또다른 실시양태에서는 약 20℃ 내지 35℃ 사이에서 1℃씩의 증가분을 갖는 임의의 온도에서 배양된다.
원하는 PUFA(들) 및/또는 유전자 변형 미생물에 의해 생산된 다른 생물활성 분자는 통상의 분리 및 정제 기술로 발효 배지로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 발효 배지를 여과 또는 원심분리하여 미생물, 세포 파편 및 다른 미립자 물질을 제거할 수 있고, 생성물을 통상의 방법, 예컨대, 이온 교환, 크로마토그래피, 추출, 용매 추출, 상 분리, 막 분리, 전기투석, 역 삼투, 증류, 화학 유도체화 및 결정화에 의해 세포-무함유 상등액으로부터 회수할 수 있다. 대안적으로, PUFA(들), 또는 그의 추출물 및 각종 분획을 생산하는 미생물은 생성물로부터 미생물 성분을 제거하지 않고 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 변형 미생물은 EPA (C20:5, ω-3), DHA (C22:6, ω-3), DPA (C22:5, ω-6), ARA (C20:4, ω-6), GLA (C18:3, n-6), 및 SDA (C 18:4, n-3)) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1종 이상의 다중불포화 지방산을 생산한다. 바람직한 한 실시양태에서, 야생형 형태로 고수준의 DHA 및 DPA를 생산하는 쉬조키트리움은 본 발명에 따라 변형되어 고수준의 EPA를 생산하는 유전자이다. 상기 논의된 바와 같이, PUFA를 생산하기 위해 유전자 변형 트라우스토키트리드 미생물을 사용하는 한 이점은 PUFA가 인지질 (PL) 및 트리아실글리세리드 (TAG) 모두 내로 직접적으로 혼입되는 것이다.
바람직하게는, PUFA는 미생물 건조 중량의 약 5％ 초과, 한 측면에서 6％ 초과, 또다른 측면에서 7％ 초과, 또다른 측면에서 8％ 초과, 또다른 측면에서 9％ 초과, 또다른 측면에서, 10％ 초과 등의 양으로, 및 정수 수치의 비율(％)로 미생물 건조 중량의 90％까지 (예컨대, 15％, 20％, 30％, 40％, 50％, 및 이들 중간의 임의의 비율(％)) 생산된다.
본 발명의 원하는 생물활성 화합물의 생산 방법에서, 유전자 변형 식물은 발효 배지에서 배양되거나 또는 적합한 배지, 예컨대 토양에서 성장된다. 적절하거나 또는 효과적인 발효 배지를 상기에 상세하게 논의하였다. 고등 식물에 적합한 성장 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지하는 임의의 다른 미립자 매질 (예컨대 질석, 펄라이트 등) 또는 수경 배양, 뿐만 아니라 적합한 빛, 물 및 고등 식물의 성장을 최적화하는 영양 보충물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 식물에 대한 임의의 성장 배지를 포함한다. 본 발명의 유전자 변형 식물을 유전자조작하여 본 발명에 따라 유전자 변형된 PKS 시스템의 활성을 통해 유의한 양의 원하는 생성물을 생산한다. 상기 화합물은 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 공정을 통해 회수될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물은 식물을 수확함으로써 회수된다. 이 실시양태에서, 식물은 그의 천연 상태로 소비되거나 또는 소비재 생성물로 추가 가공될 수 있다.
생물활성 분자 생산에 유용한 많은 유전자 변형은 본원에 개시된 바와 같이 당업자에게 명백할 것이고, 각종 다른 변형은 본원 이전에 논의되어 왔다. 본 발명은 원하는 생물활성 분자를 생산하는 본원에 기재된 PUFA PKS 시스템과 관련된 임의의 유전자 변형을 고려한다.
본 발명에 따른 생물활성 분자는 생물학적 활성을 가지고, 본원에 기재한 바와 같은 비-박테리아 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능적 도메인의 생물학적 활성을 보유한 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 PKS 시스템에 의해 생산될 수 있는 임의의 분자 (화합물, 생성물 등)를 포함한다. 이러한 생물활성 분자로는 다중불포화 지방산 (PUFA), 소염 제제, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울제, 항-경련제, 항-헬리오박터 파일로리 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환의 치료용 약물, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제제 등이 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 한 이점은 시스 배위의 탄소-탄소 이중 결합을 도입하는 이러한 시스템의 능력, 및 매 3번째 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자의 능력이다. 이 능력은 각종 화합물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 관심 생물활성 화합물은 유전자 변형 미생물에 의해 미생물 건조 중량의 약 0.05％ 초과, 바람직하게는 약 0.1％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.25％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.75％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 1％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 2.5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 5％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 10％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 15％ 초과, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 20％ 초과의 양으로 생산된다. 지질 화합물의 경우에, 바람직하게는, 이러한 화합물은 미생물 건조 중량의 약 5％ 초과의 양으로 생산된다. 소량으로 합성되는 다른 생물활성 화합물, 예컨대 항생제 또는 화합물의 경우, 미생물 건조 중량의 이러한 화합물을 보유하는 이들 균주는 상기 기재된 유형의 신규 PKS 시스템을 예측가능하게 함유하는 바와 같이 확인된다. 일부 실시양태에서, 특정 생물활성 분자 (화합물)은 축적보다는 미생물에 의해 분비된다. 따라서, 이러한 생물활성 분자는 배양 배지로부터 일반적으로 회수되고, 생산된 분자의 농도는 미생물 및 배양 크기에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포 (미생물 또는 식물)에 의해 생산되는 오일을 최종 생성물에 첨가하는 것을 포함하는, (최종 생성물이 1종 이상의 지방산을 이미 가질 수 있으며, 그에 의해 1종 이상의 추가 지방산이 본 발명의 방법에 따라 제공되지만) 1종 이상의 지방산을 함유하도록 최종 생성물을 변형시키는 방법에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템은 쉐바넬라 자포니카 또는 쉐바넬라 올레야나로부터의 박테리아 PUFA PKS 시스템, 또는 보통 (즉, 일반 또는 천연 조건 하에) 온도 22℃ 초과 온도에서 성장하고 PUFA를 생산할 수 있는 다른 박테리아로부터의 임의의 PUFA PKS 시스템을 비롯한 본원에 기재한 임의의 적합한 박테리아 또는 비-박테리아 PUFA PKS 시스템을 포함한다.
바람직하게는, 최종 생성물은 음식, 식이보조제, 제약 제제, 인간화된 동물 유즙 및 분유로 구성된 군에서 선택된다. 적합한 제약 제제로는 소염 제제, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울제, 항-경련제, 항-헬리오박터 파일로리 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환의 치료용 약물, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 최종 생성물은 만성 염증, 급성 염증, 위장 장애, 암, 악액질, 심장 재협착, 신경변성 장애, 간의 퇴행성 질병, 혈액 지질 질병, 골다공증, 골관절염, 자가면역 질환, 자간전증, 조산, 연령 관련 황반병증, 폐 질병, 및 과산화소체 질병으로 구성된 군에서 선택된 상태를 치료하기 위해 사용된다.
적합한 식품으로는 미세 제과 제품, 빵 및 롤, 아침식사용 시리얼, 가공 및 비가공 치즈, 조미료 (케찹, 마요네즈 등), 유제품 (유즙, 요거트), 푸딩 및 젤라틴 디저트, 탄산 음료, 차, 분말 음료 믹스, 가공 어류 제품, 과일-기재 음료, 츄잉 검, 경질 과자류, 동결 유제품, 가공 식육품, 견과 및 견과-기재 스프레드, 파스타, 가공 가금류 제품, 육즙 및 소스, 포테이토 칩 및 기타 칩 또는 크리스프, 초콜렛 및 기타 과자, 수프 및 수프 믹스, 대두 기재 제품 (유즙, 음료, 크림, 화이트너), 식물성유-기재 스프레드, 식물성-기재 음료 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 실시양태는 인간화된 동물 유즙의 생산 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본원에 기재한 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생물학적 활성 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 갖는 유즙-생산 동물의 유즙-생산 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함한다.
숙주 세포를 유전자 변형시키고, 유전자 변형 비-인간, 유즙-생산 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변형시킬 숙주 동물의 예로는 트랜스진 발현 집단의 신속한 증식을 위해 유전자 조작 및 클로닝될 수 있는 소, 양, 돼지, 염소, 야크 등이 있다. 동물의 경우에, PKS-유사 트랜스진은 유전자 조절성 영역의 변형을 통해 표적 세포소기관, 조직 및 체액에서 발현을 위해 개질될 수 있다. 특히, 숙주 동물의 젖에서 PUFA를 생산하는데 관심이 있다.
하기하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
하기 실시예는 특정 EPA-생산 박테리아가 쉬조키트리움의 변형에 적합한 것 으로 여겨지는 PUFA PKS-유사 유전자를 함유한다는 것을 나타낸다.
쉐바넬라 속의 2개 EPA-생산 해양 박테리아 균주는 쉬조키트리움 발효의 전형적 온도에서 성장하고, PUFA PKS-유사 유전자를 보유하는 것으로 나타났다. 쉐바넬라 올레야나 (오스트레일리안 콜렉션 오브 앤타르크틱 마이크로오르가니즘스(Australian Collection of Antarctic Microorganisms, ACAM) 균주 번호 644, [Skerratt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 52, 2101 (2002)])는 EPA를 생산하고, 25 내지 3O℃ 이하에서 성장한다. 쉐바넬라 자포니카 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 균주 번호 BAA-316, [Ivanova et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1027 (2001)])는 EPA를 생산하고, 30 내지 35℃ 이하에서 성장한다.
이들 박테리아 균주로부터 PUFA-PKS 유전자를 동정하고 단리하기 위해서, 박테리아 orf5/pfaA 유전자의 KS-MAT 영역 및 박테리아 orf7/pfaC 유전자의 DH-DH 영역에 대한 변성 PCR 프라이머 쌍을 쉐바넬라 SCRC-2738, 쉐바넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) MR-1, 쉐바넬라 종 GA-22, 포토박테리아 프로펀덤, 및 모리텔라 마리나에 대해 공개된 유전자 서열을 기초로 하여 고안하였다 (상기 논의 참조). 구체적으로, 프라이머 및 PCR 조건은 하기와 같이 고안하였다:
KS / AT 영역에 대한 프라이머: 하기 공개된 서열을 기초로 함.
쉐바넬라 종 SCRC-2738, 쉐바넬라 오네이덴시스 MR-1, 포토박테리아 프로펀덤, 모리텔라 마리나:
prRZ23 GGYATGMTGRTTGGTGAAGG (전방향, 서열 25)
prRZ24 TRTTSASRTAYTGYGAACCTTG (역방향, 서열 26)
DH 영역에 대한 프라이머: 하기 공개된 서열을 기초로 함.
쉐바넬라 종 GA-22, 쉐바넬라 종 SCRC-2738, 포토박테리아 프로펀덤, 모리텔라 마리나:
prRZ28 ATGKCNGAAGGTTGTGGCCA (전방향, 서열 27)
prRZ29 CCWGARATRAAGCCRTTDGGTTG (역방향, 서열 28)
PCR 조건 (박테리아 염색체 DNA를 주형으로 사용함)은 하기와 같았다:
반응 혼합물:
0.2 μM dNTP
0.1 μM 각 프라이머
8％ DMSO
250 ng 염색체 DNA
2.5 U 헤르쿨라세® DNA 폴리머라제 (스트라타진(Stratagene))
1X 헤르쿨라세® 완충제
50 ㎕ 총 부피
PCR 프로토콜:
(1) 3분 동안 98℃, (2) 40초 동안 98℃, (3) 30초 동안 56℃, (4) 90초 동안 72℃, (5) 단계 2 내지 4를 29회 주기 동안 반복, (6) 10분 동안 72℃, (7) 6℃에 유지.
프라이머 쌍 모두의 경우에, PCR은 쉐바넬라 올레야나 또는 쉐바넬라 자포니카로부터의 염색체 DNA 주형을 사용하여 예상된 크기의 별개의 생성물을 제공하였다. 4종의 각각의 PCR 생성물을 pCR-BLUNT II-TOPO (인비트로젠(Invitrogen)) 내에 클로닝하고, 삽입물 서열을 M13 전방향 및 역방향 프라이머로 측정하였다. 모든 경우에서, 이에 의해 수득된 DNA 서열은 공지된 박테리아 PUFA PKS 유전자 영역에 고도로 상동성이었다.
박테리아 PCR 생성물로부터 수득된 DNA 서열을 표준 블라스트엑스 서치(Blastx search)로 쉬조키트리움 ATCC 20888로부터의 공지된 서열 및 PUFA PKS 유전자와 비교하였다 (BLAST 파라미터: 낮은 복합도 필터: On; Matrix: BLOSUM62; Word Size: 3; Gap Costs: Existance11, Extension 1 (문헌 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. ＆ Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 BLAST, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨).
아미노산 수준에서, 쉐바넬라 올레야나 ACAM644 케토아실 신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS-AT) 추정 아미노산 서열에 최고 정도의 상동성을 갖는 서열은 포토박테리아 프로펀덤 pfaA (동일성 = 70％, 양성 = 81％), 쉐바넬라 오네이덴시스 MR-1 "다중-도메인 β-케토아실 신타제" (동일성 = 66％, 양성 = 77％), 및 모리텔라 마리나 ORF8 (동일성 = 56％, 양성 = 71％)이었다. 쉬조키트리움 종 ATCC20888 orfA는 쉐바넬라 올레야나 KS-AT에 대한 추정 아미노산 서열에 대해 41％ 동일하고, 56 ％ 양성이었다.
아미노산 수준에서는, 쉐바넬라 자포니카 ATCC BAA-316 케토아실 신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS-AT) 추정 아미노산 서열에 최고 정도의 상동성을 갖는 서열은 쉐바넬라 오네이덴시스 MR-1 "다중-도메인 β-케토아실 신타제" (동일성 = 67％, 양성 = 79％), 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf5 (동일성 = 69％, 양성 = 77％), 및 모리텔라 마리나 ORF8 (동일성 = 56％, 양성 = 70％)이었다. 쉬조키트리움 종 ATCC20888 orfA는 쉐바넬라 자포니카 KS-AT에 대한 추정 아미노산 서열에 대해 41％ 동일하고, 55％ 양성이었다.
아미노산 수준에서, 쉐바넬라 올레야나 ACAM644 데히드로게나제 (DH) 추정 아미노산 서열에 최고 정도의 상동성을 갖는 서열은 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf7 (동일성 = 77％, 양성 = 86％), 포토박테리아 프로펀덤 pfaC (동일성 = 72％, 양성 = 81％), 및 쉐바넬라 오네이덴시스 MR-1 "다중-도메인 β-케토아실 신타제" (동일성 = 75％, 양성 = 83％)이었다. 쉬조키트리움 종 ATCC20888 orfC는 쉐바넬라 올레야나 DH에 대한 추정 아미노산 서열에 대해 26％ 동일하고, 42％ 양성이었다.
아미노산 수준에서, 쉐바넬라 자포니카 ATCC BAA-316 데히드로게나제 (DH) 추정 아미노산 서열에 최고 정도의 상동성을 갖는 서열은 쉐바넬라 종 SCRC-2738 orf7 (동일성 = 77％, 양성 = 86％), 포토박테리아 프로펀덤 pfaC (동일성 = 73％, 양성 = 83％) 및 쉐바넬라 오네이덴시스 MR-1 "다중-도메인 β-케토아실 신타제" (동일성 = 74％, 양성 = 81％)이었다. 쉬조키트리움 종 ATCC20888 orfC는 쉐바넬라 자포니카 DH에 대한 추정 아미노산 서열에 대해 27％ 동일하고, 42％ 양성이었다.
실시예 2
하기 실시예는 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로부터의 완전한 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 DNA 클론의 생성, 동정, 서열결정 및 분석을 입증한다.
큰 게놈 DNA 단편 (대략 40 kB)으로 구성된 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나 재조합 라이브러리를 코스미드 벡터 수퍼코스(Supercos)-1 (스트라타진)에서 표준 방법에 의해 생성하였다. 코스미드 라이브러리를 표준 콜로니 혼성화 과정에 의해 스크리닝하였다. 쉐바넬라 올레야나 코스미드 라이브러리를 2개의 별개 디곡시제닌-표지된 프로브로 스크리닝하였다. 각 프로브는 실시예 1에 기재한 EPA 생합성 유전자 클러스터의 절편에 상동성인 DNA 단편을 함유하였고, 각각이 클러스터의 양쪽 말단을 나타냈다. 이들 프로브는 주형으로서의 쉐바넬라 올레야나 DNA와 제1 프로브에 대해 프라이머 prRZ23 (서열 25) 및 prRZ24 (서열 26), 및 제2 프로브에 대해 prRZ28 (서열 27) 및 prRZ29 (서열 28)를 사용하여 PCR에 의해 생산하였다. 상기 실시예 1은 EPA 생합성 유전자의 절편에 상동성인 DNA 단편을 함유한 이들 변성 프라이머 및 유래된 PCR 생성물을 기재하였다. 쉐바넬라 자포니카카 특이적 프로브를 유사한 방식으로 생성시키고, 코스미드 라이브러리를 스크리닝하였다. 이 모든 경우에, 특정 코스미드에 대한 개개의 프로브의 강력한 혼성화는 EPA 생합성 유전자 클러스터에 상동성인 DNA를 함유한 클론을 나타냈다.
양쪽 프로브에 대해 강력한 혼성화를 갖는 클론을 이어서 이. 콜라이에서 EPA의 이종 생산에 대해 검정하였다. 이. 콜라이 코스미드 클론의 개개 단리된 세 포를 LB 브로쓰(broth) 2 mL 중에 밤새 3O℃에서 200 rpm 진탕과 함께 성장시켰다. 이 계대배양물 0.5 mL를 사용하여 LB 브로쓰 25 mL를 접종시키고, 세포를 2O℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 세포를 이어서 원심분리로 수거하고, 동결건조에 의해 건조시켰다. 건조된 세포를 표준 가스 크로마토그래피 방법으로 지방 함량, 및 지방산 프로파일 및 함량에 대해 분석하였다. 비어 있는 수퍼코스-1 벡터를 함유한 이. 콜라이의 대조군 세포로부터 생산한 지방산에서 EPA는 검출되지 않았다. 에스. 자포니카 및 에스. 올레야나로부터의 특정 코스미드를 함유한 이. 콜라이 균주는 전형적으로 총 지방산의 3-8％ EPA를 생산하였다.
쉐바넬라 올레야나로부터의 코스미드 9A10 및 쉐바넬라 자포니카카로부터의 코스미드 3F3을 전체 무작위 서열결정을 위해 선별하였다. 코스미드 클론을 무작위적으로 단편화시키고, 서브클로닝하고, 생성된 무작위 클론을 서열결정하였다. 크로마토그램을 분석하고, 프레드, 프라프 및 콘세드(Phred, Phrap and Consed) 프로그램을 사용하여 콘티그로 조립시켰다 ([Ewing, et al., Gemone Res. 8(3):175-185 (1998)], [Ewing, et al., Genome Res. 8(3): 186-194 (1998)], [Gordon et al., Genome Res. 8(3):195-202 (1998)]). 최종 콘티그의 각 뉴클레오티드 염기 쌍은 적어도 최소 응집된 프레드 스코어 40 (신뢰 수준 99.995％)에 의해 보호된다.
코스미드 3F3로부터의 39669 bp 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로서 나타낸다. 코스미드 9A10으로부터의 38794 bp 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 서열 7로서 나타낸다. 쉐바넬라 자포니카 (코스미드 3F3) 및 쉐바넬라 올레야나 (코스 미드 9A10)로부터의 PUFA PKS 유전자 클러스터에 대한 각종 도메인 및 단백질의 서열은 본원에서 이전에 상세하게 기재하고 있고, 서열 2 내지 서열 6 및 서열 8 내지 서열 12로서 각각 나타낸다.
본원에 기재한 단백질 비교를 표준 BLAST 분석으로 수행하였다 (BLAST 파라미터: Blastp, 낮은 복합도 필터 On, 프로그램 - BLOSUM62, Gap cost -Existence: 11, Extension 1; (문헌 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. ＆ Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleics Acids Res. 25:3389-3402)]에 기재된 BLAST). 도메인 동정을 보존된 도메인 데이타베이스 및 서치 서비스 (CD-서치), v2.01로 수행하였다. CD-서치는 미국립 의학 도서관(the National library of Medicine) 및 미국립 보건원 (the National Institutes of Health)에 의해 후원되는 미국립 생명공학 정보 센터(the National Center for Biotechnology Information)에 대한 공공의 데이타베이스를 통해 사용가능한 공공의 접근가능 프로그램이다. CD-서치는 각종 데이타베이스로부터의 단백질 도메인을 함유한다. CD-서치는 조회된 단백질 서열 중의 도메인을 동정하는 BLAST 알고리즘을 사용한다 [Marchler-Bauer A, Bryant SH. "CD-Search: protein domain annotations on the fly." Nucleic Acids Res. 32:W327-331 (2004)]. 마지막으로, 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 동정은 EasyGene 1.0 서버 [Larsen TS, Krogh A. "EasyGene -a prokaryotic gene finder that ranks ORFs by statistical significance", BMC Bioinformatics 2003, 4:21] 및 GeneMar.hmm 2.1 [Lukashin A. and Borodovsky M., "GeneMark.hmm: new solutions for gene finding" Nucleic Acids Res., Vol. 26, No. 4, pp. 1107-1115. 1998]의 사용으로 원조된다. 디폴트 셋팅을 EasyGene 분석에 사용하고, 콜라레균을 참조 유기체로서 사용하였다. 디폴트 셋팅은 GeneMark.hmm 프로그램 및 슈도네이티브.모델(Pseudonative.model)을 모델 유기체에 대한 셋팅으로서 사용하였다. 이들 프로그램은 박테리아 유전자를 예측하기 위해 히든 마르코브 모델 (Hidden Markov Models) 알고리즘을 사용한다.
표 1은 서열 1을 기초로 하는 출발 및 정지 코돈 코디네이트, 각 ORF의 총 뉴클레오티드 길이, 각 예측되는 단백질에 대한 총 아미노산, 각 예측되는 단백질에 대한 계산된 분자량, 공공의 진뱅크 데이타베이스에 대한 BLASTp 조회에서의 최고 상동성, 진뱅크 데이타베이스 중의 최소 상동성 목록의 GI 관리 번호 ("GenInfo 식별자" 서열 식별 번호), 및 제안된 기능 (EPA 생산과 관련된 경우)을 포함하는 쉐바넬라 자포니카로부터의 코스미드 3F3로부터의 ORF의 개요/분석을 나타낸다.
표 2는 서열 7을 기초로 하는 출발 및 정지 코돈 코디네이트, 및 쉐바넬라 자포니카에 대한 표 1에 나타낸 동일한 추가 정보를 포함하는 쉐바넬라 올레야나로부터의 코스미드 9A10으로부터의 ORF의 개요/분석을 나타낸다.
표 3은 쉐바넬라 올레야나 (코스미드 9A10) 및 또한 공공의 서열 데이타베이스에서 최고 수준의 동일성을 보유한 EPA-생산 유기체로부터의 단백질에 비해 쉐바넬라 자포니카 (코스미드 3F3)의 EPA 클러스터로부터의 추정 단백질의 동일성(％)을 나타낸다. 표 4는 뉴클레오티드 동일성과 관련한 표 3과 동일한 분석을 나타낸다.
표 5는 밑줄친 가능한 리보솜 결합 부위를 갖는 모든 표시된 pfa ORF로부터의 23개 뉴클레오티드 상류, 뿐만 아니라 TTG 출발 코돈으로 출발하는 것으로 표시된 ORF에 대한 별법의 출발 코돈 및 상류 뉴클레오티드를 나타낸다.
Figure 112007034967763-PCT00003
*역방향 상보적 가닥 상에
Figure 112007034967763-PCT00004
*역방향 상보적 가닥 상에
Figure 112007034967763-PCT00005
Figure 112007034967763-PCT00006
EPA 생합성 클러스터로부터의 ORF의 예측되는 출발 부위 (출발 코돈은 굵은 글씨로 나타냄) 가능한 리보솜 결합 부위를 밑줄침 모든 pfa ORF
Figure 112007034967763-PCT00007
pfaC 별법의 출발부 비교
Figure 112007034967763-PCT00008
pfaC 별법의 부위 #1은 서열 1의 뉴클레오티드 21514에서 출발함 이는 표시된 pfaC 출발부의 387개 뉴클레오티드 하류임 pfaC 별법의 부위 #2는 서열 1의 뉴클레오티드 21460에서 출발함 이는 표시된 pfaC 출발부의 333개 뉴클레오티드 하류임
Figure 112007034967763-PCT00009
pfaC 별법의 부위 #1은 서열 7의 뉴클레오티드 28370에서 출발함 이는 표시된 pfaC 출발부의 402개 뉴클레오티드 하류임 pfaC 별법의 부위 #2는 서열 7의 뉴클레오티드 28151에서 출발함 이는 표시된 pfaC 출발부의 183개 뉴클레오티드 하류임 pfaE 별법의 출발부 비교
Figure 112007034967763-PCT00010
pfaE 별법의 부위 #1은 서열 7의 뉴클레오티드 13821에서 출발함 이는 표시된 pfaE 출발부의 78개 뉴클레오티드 상류임 pfaE 별법의 부위 #2는 서열 7의 뉴클레오티드 13743에서 출발함 이는 표시된 pfaE 출발부의 156개 뉴클레오티드 상류임
실시예 3
하기 실시예는 쉬조키트리움 Orf A, B 및 C가 이. 콜라이에서 기능적 발현을 통해 기능적 DHA/DPA 합성 효소를 코딩한다는 것을 입증한다.
이. 콜라이 형질전환체의 일반적 제조
DHA 및 DPA (Orf A, B 및 C; 각각 서열 13, 서열 15 및 서열 17)를 생산하는 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 3개 유전자를 단일 이. 콜라이 발현 벡터 (pET21c (노바젠(Novagen))으로부터 유래됨) 내로 클로닝하였다. 상기 유전자는 (T7 RNA-폴리머라제에 의해) 단일 메세지로서 전사하고, 각 유전자 앞에 클로닝된 리보솜-결합 부위는 번역을 개시한다. Orf B 코딩 서열의 변형이 이. 콜라이에서 전장 Orf B 단백질의 생산을 얻기 위해 필요하였다 (하기 참조). PPTase (하기 참조)를 코딩하는 액세서리 유전자를 제2 플라스미드 (pACYC184로부터 유래됨, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 내로 클로닝하였다.
Orf B 유전자는 질량 약 224 kDa의 단백질을 코딩하는 것으로 예측된다. 이. 콜라이에서 상기 유전자의 발현에 대한 초기 시도는 겉보기 분자 질량 약 165 kDa의 단백질을 축적하였다 (SDS-PAGE 동안 공지된 질량의 단백질과 비교함으로써 판단함). Orf B 뉴클레오티드 서열의 조사는 15개의 연속적 세린 코돈 (이들 모두가 TCT 코돈임)을 함유한 영역을 나타냈다. 유전자 코드는 6개 상이한 세린 코돈을 함유하고, 이들 중 3개는 이. 콜라이에서 종종 사용된다. 본원 발명의 발명자들은 4개의 중복 올리고뉴클레오티드를 폴리머라제 쇄 반응 프로토콜과 조합 사용하여 세린 코돈 반복 영역을 함유하는 Orf B 유전자 (약 195개 염기 쌍, BspHI 내지 SacII 제한 효소 단편) 중 작은 일부를 재합성하였다. 합성 Orf B 단편에서, 이. 콜라이에 의해 보통 사용되는 3개 세린 코돈의 무작위 혼합물을 사용하고, 일부 다른 잠재적인 불확실 코돈도 바꾸었다 (즉, 이. 콜라이에 의해 거의 사용되는 않는 다른 코돈). 원래 Orf B 중에 존재하는 BspHI 내지 SacII 단편을 재합성된 단편으로 대체하고 (Orf B*를 수득함), 변형된 유전자를 관련 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 변형된 Orf B*는 여전히 서열 16의 아미노산 서열을 코딩한다. 이. 콜라이에서의 변형된 Orf B* 클론의 발현은 약 224 kDa 단백질을 나타냈으며, 이는 Orf B의 전장 생성물을 생산하였다. 재합성된 Orf B* BspHI 내지 SacII 단편의 서열을 본원에서 서열 29로서 나타낸다. 서열 29로서 지칭하여, Orf B의 재합성된 BspHI 내지 SacII 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. BspHI 제한 부위 및 SacII 제한 부위를 동정하였다. BspHI 부위는 Orf B CDS (서열 15)의 뉴클레오티드 4415에서 출발한다 (주의: Orf B CDS에 총 3개의 BspHI 부위가 있지만, SacII 부위는 단 1개임).
Orf A 단백질 (쉬조키트리움에서의 서열 14)의 ACP 도메인은 기능을 위해 포스포판테테인 군을 첨가함으로써 활성화되어야 한다. 이 일반 유형의 반응을 촉매하는 효소는 포스포판테테인 트랜스퍼라제 (PPTase)로 칭해진다. 이. 콜라이는 2개의 내인성 PPTase를 함유하지만, 쉬조키트리움으로부터의 Orf A ACP 도메인을 인식하지 않을 것으로 예상되었다. 이는 추가 PPTase 없이 이. 콜라이에서 Orf A, B* (상기 참조) 및 C를 발현시킴으로써 확인되었다. 이 형질전환체에서, DHA 생산은 검출되지 않았다. 본 발명의 발명자들은 이. 콜라이 PUFA PKS 발현 시스템에서 2개의 이종 PPTase를 시험하였다: (1) sfp (바실러스 섭틸리스로부터 유래됨) 및 (2) HetI (남조류 노스토크 균주 7120로부터 유래됨).
sfp PPTase는 잘 특징규명되어 있고, 광범위한 기질을 인식하는 그의 능력 때문에 널리 사용되고 있다. 공개된 서열 정보에 기초하여 [Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232:9321], sfp에 대한 발현 벡터는 코딩 영역을 특징지어진 상류 및 하류 플랭킹 DNA 서열과 함께 pACYC-184 클로닝 벡터 내로 클로닝함으로써 작제하였다. 올리고뉴클레오티드
CGGGGTACCCGGGAGCCGCCTTGGCTTTGT (전방향, 서열 30), 및
AAACTGCAGCCCGGGTCCAGCTGGCAGGCACCCTG (역방향, 서열 31)를 사용하여 게놈 비. 섭틸리스 DNA로부터 목적하는 영역을 증폭하였다. 플라스미드: pBR301을 생성하기 위해 중간체인 높은 카피수 벡터 중의 마지막으로 pACYC184의 EcoRV 부위 내에 클로닝을 용이하게 하기 위해 편리한 제한 효소 부위를 올리고뉴클레오티드에 포함시켰다. sfp에 대해 예상되는 이동성을 갖는 신규 단백질의 존재를 나타내는 이 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이의 추출물을 조사하였다. Orf A, B*, C 단백질을 특정 조건하에 발현하는 세포에서의 sfp 구조물의 동시발현은 DHA를 생산하였다. 이 실험은 sfp가 쉬조키트리움 Orf A ACP 도메인을 활성화시킬 수 있음을 입증하였다. 또한, sfp 유전자와 회합된 조절성 요소를 사용하여 발현 카세트를 생성하였으며, 여기서 다른 유전자는 상기 발현 카세트 내에 삽입될 수 있다. 구체적으로, pBR301 중의 sfp 코딩 영역 (ATG의 상류 직전에 존재하는 3개 뉴클레오티드와 함께)은 (이 구조물에 대해) 몇몇 특이한 제한 효소 부위를 함유하도록 고안된 DNA의 53 염기 쌍 절편으로 대체하였다. 이 영역 중의 초기 제한 효소 부위는 NdeI이다. 이 부위에 끼워 넣어진 ATG 서열은 도입된 유전자에 대한 개시 메티오닌 코돈으로서 사용한다. 추가 제한 부위 (BglLL, NotI, SmaI, PmelI, HindIII, SpeI 및 XhoI)를 포함시켜 클로닝 과정을 용이하게 하였다. 이 발현 벡터 카세트의 기능성은 5' 말단에 NdeI 부위 및 3' 말단에 XhoI 부위를 갖는 sfp의 버전을 생산하는 PCR을 사용함으로써 시험하였다. 이 단편을 발현 카세트 내에 클로닝하고, Orf A, B* 및 C 발현 벡터와 함께 이. 콜라이 내로 전달하였다. 적절한 조건 하에, 이들 세포는 DHA를 축적하였으며, 이는 기능적 sfp가 생산되었음을 입증한다.
본원 발명의 발명자들이 알고 있는 바로는, HetI은 이종 상태에서 이전에 시험된 적이 없었다. HetI은 해당 유기체의 이형세포 중에 존재하는 당-지질 층의 성분인 장쇄 히드록시-지방산의 합성을 담당하는 것으로 공지된 노스토크에서의 유전자의 클러스테 중에 존재한다. 본원 발명의 발명자들은 이론에 얽매이는 것은 아니지만, HetI가 해당 클러스터 중에 존재하는 단백질인 Hgl E의 ACP를 활성화시키는 것으로 여겨진다. Hgl E의 2개 ACP 도메인은 쉬조키트리움 Orf A에서 발견되는 ACP 도메인에 대해 높은 정도의 서열 상동성을 가진다. 서열 32는 노스토크 HetI 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. HetI의 내인성 출발 코돈은 동정되지 않았다 (상기 추정적 단백질에는 메티오닌이 존재하지 않음). 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 근처에 몇몇 잠재적인 다른 출발 코돈 (예컨대, TTG 및 ATT)이 있다. 상기 서열에는 메티오닌 코돈 (ATG)이 존재하지 않는다. HetI 발현 구조물을 가장 먼 5'의 잠재적인 다른 출발 코돈 (TTG)을 메티오닌 코돈 (ATG, 상기 기재된 NdeI 제한 효소 인식 부위의 부분으로서)으로 대체하기 위해 PCR을 사용하고, 코딩 서열의 3' 말단에 XhoI 부위를 도입시킴으로써 생산하였다. 변형된 HetI 코딩 서열을 이어서 sfp 조절성 요소를 함유한 pACYC184 벡터 구조물의 NdeI 및 XhoI 부위 내에 삽입하였다. 이. 콜라이에서의 이 HetI 구조물의 발현은 서열 데이타로부터 예상되는 크기의 신규 단백질을 나타냈다. 몇몇의 조건 하에 이. 콜라이에서 쉬조키트리움 Orf A, B*, C와 HetI를 공동-발현시킴으로써 이들 세포에 DHA 및 DPA를 축적시켰다. sfp 및 HetI을 비교하는 모든 실험에서, DHA 및 DPA는 sfp 구조물을 함유한 세포보다 HetI 구조물을 함유한 세포에서 더 축적되었다.
이. 콜라이 형질전환체에서의 DHA 및 DPA 의 생산
(1) 쉬조키트리움 PUFA PKS 유전자 (Orf A, B* 및 C) 및 (2) (sfp 또는 HetI로부터의) PPTase를 코딩하는 2개의 플라스미드로 유도가능 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 이. 콜라이 균주 BL21을 형질전환시켰다. 쉬조키트리움 단백질의 합성을 배지에 IPTG를 첨가함으로서 유도하는 반면에, PPTase 발현은 별개의 조절성 요소로 제어하였다 (상기 참조). 세포를 각종 정의된 조건 하에 2개의 이종 PPTase 유전자를 사용하여 성장시켰다. 상기 세포를 수거하고, 지방산을 메틸-에스테르 (FAME)로 전환시키고, 가스-액체 크로마토그래피로 분석하였다.
몇몇의 조건 하에, DHA 및 DPA는 쉬조키트리움 PUFA PKS 유전자, 및 2개의 이종 PPTases 중 하나를 발현하는 이. 콜라이 세포에서 검출하였다 (데이타는 나타내지 않음). DHA 또는 DPA가 대조군 세포로부터 생산된 FAME에서는 검출되지 않았다 (즉, 상기 세포를 Orf 중 하나가 결실된 플라스미드로 형질전환시킴). 이. 콜라이에서 관찰된 DHA 대 DPA 비율은 쉬조키트리움에서 관찰된 내인성 DHA 및 DPA 생산의 비율에 대략 이른다. 약 17％의 총 FAME를 나타내는 최고 수준의 PUFA (DHA 및 DPA)는 10％ (중량) 글리세롤로 보충된 765 배지 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수가능한 제조법) 중에 32℃에서 성장한 세포에서 발견되었다. PUFA 축적을 5 또는 10％ 글리세롤로 보충된 루리아(Luria) 브로쓰에서 성장시키는 경우 및 20℃에서 성장시키는 경우에도 관찰되었다. 성장 동안 적절한 항생제를 함유하여 유지하고, IPTG (최종 농도 0.5 mM)를 사용하여 Orf A, B* 및 C의 발현을 유도함으로써 각 플라스미드의 존재에 대해 선별하였다.
실시예 4
하기 실시예는 쉬조키트리움 PUFA PKS 효소 복합체를 코딩하는 유전자가 선택적으로 불활성화될 수 있고 (넉아웃), 배지가 다중불포화 지방산으로 보충되지 않는 경우에는 치사 표현형임을 입증한다.
상동성 재조합은 쉬조키트리움에 입증되었다 (동시계류중인 미국 특허 출원 제10/124,807호 참조, 그 전문이 본원에 참고로 도입됨). 쉬조키트리움 Orf A (서열 13)를 불활성화시키기 위해 고안된 플라스미드는 제노신™ 내성 마커를 Orf A 코딩 서열을 함유한 클론의 SmaI 부위 내에 삽입함으로써 생산하였다. 제노신™ 내성 마커는 플라스미드 pMON50000으로부터 수득하였다 (제노신™ 내성 유전자의 발현은 쉬조키트리움 유래 튜불린 프로모터 요소에 의해 유도됨 (미국 특허 출원 제10/124,807호 참조 (동일 문헌))). 따라서, 넉아웃 구조물은 5' 쉬조키트리움 Orf A 코딩 서열, tub-제노신™ 내성 요소 및 3' 쉬조키트리움 Orf A 코딩 서열로 구성되어 있으며, 이들 모두는 pBluescript II SK (+) 벡터 (스트라타진) 내로 클로닝하였다.
플라스미드를 입자 충격에 의해 쉬조키트리움 세로 내로 도입하고, 형질전환체를 제노신™을 함유하고 다중불포화 지방산 (PUFA)으로 보충한 플레이트 상에서 선별하였다 (실시예 5 참조). 제노신™ 및 PUFA 플레이트 상에서 성장한 콜로니를 PUFA 보충이 없는 플레이트 상에서 성장하는 능력에 대해 시험하고, 몇몇이 PUFA를 요구함을 발견하였다. 이들 PUFA 영양요구체는 추정적 Orf A 넉아웃이다. 몇몇의 이들 돌연변이체로부터 추출된 RNA의 노던 블럿 분석으로 전장 Orf A 메세지가 이들 돌연변이체에서 생성되지 않았음을 확인하였다.
이들 실험은 쉬조키트리움 유전자 (예컨대, Orf A)가 상동성 재조합을 통해 불활성화될 수 있고, Orf A의 불활성화는 치사 표현형을 나타내게 하고, 이들 돌연변이체가 PUFA로 배지를 보충하는 것에 의해 구조될 수 있다는 것을 입증하였다.
쉬조키트리움 Orf B (서열 15) 및 Orf C (서열 17)의 불활성화와 관련된 실험의 유사한 세트가 유사한 결과를 생성하였다. 즉, Orf B 및 Orf C는 상동성 재조합에 의해 개별적으로 불활성화될 수 있고, 이들 세포는 성장을 위해 PUFA 보충을 요구한다.
실시예 5
하기 실시예는 PUFA 영양요구체가 EPA로 보충된 배지 상에서 유지될 수 있다는 것을 나타내며, 이는 EPA가 쉬조키트리움에서 DHA를 치환할 수 있음을 입증한다.
실시예 4에 나타낸 바와 같이, PUFA PKS 복합체가 불활성화된 쉬조키트리움 세포는 생존하기 위해 PUFA의 보충을 요구하였다. 쉬조키트리움이 성장을 위해 이 시스템의 생성물에 대해 의존적임을 입증하는 것 이외에, 이 실험적 시스템은 돌연변이체를 구조하는 능력에 대한 각종 지방산의 시험을 허용한다. 돌연변이체 세포(임의의 3개 유전자가 불활성화됨)가 EPA로 보충된 배지 상에서도 성장하지만, DHA로 보충된 배지에서 성장함을 발견하였다. 이 결과는 DHA를 생산하는 내인성 PUFA PKS 복합체가 생성물이 EPA인 것으로 대체되는 경우에 세포가 생존가능할 것임을 나타낸다. 또한, 이들 돌연변이체 세포는 ARA 또는 GLA 보충에 의해 구조될 수 있으며, 이는 이들 생성물을 생산하는 유전자 변형 쉬조키트리움의 생산 가능성을 입증한다. PUFA 보충에 바람직한 방법이 배지에 PUFA 첨가 이전에 유리 지방산과 부분적 메틸화 베타-시클로덱스트린과의 조합을 포함하는 것을 염두에 두어야 한다.
실시예 6
하기 실시예는 불활성화된 PUFA 유전자가 PUFA 합성을 복구하기 위해 유전자의 활성 형태로 동일한 부위에서 대체될 수 있다는 것을 나타낸다.
아세토락테이트 신타제 유전자 부위에서의 이중 상동성 재조합이 쉬조키트리움에서 입증되었다 (미국 특허 출원 제10/124,807호, (상기 문헌) 참조). 본원 발명의 발명자들은 쉬조키트리움 Orf A 넉아웃 균주 (실시예 3에 기재됨)를 전장 쉬조키트리움 Orf A 게놈 클론으로 형질전환시키는 것에 의한 쉬조키트리움 PUFA PKS 유전자의 대체에 대한 이 개념을 시험하였다. 형질전환체는 보충 PUFA 없는 배지 상에서 성장할 수 있는 능력에 의해 선별하였다. 이들 PUFA 원영양체는 이어서 제노신™에 대한 내성에 대해 시험하고, 몇몇이 항생제에 민감성임을 발견하였다. 이들 결과는 도입된 쉬조키트리움 Orf A가 이중 상동성 재조합을 통해 넉아웃 균주에서 제노신™ 내성 유전자를 대체하였음을 나타낸다. 이 실험은 PUFA PKS 유전자 내에서의 유전자 대체에 대한 개념을 입증한다. 쉬조키트리움 Orf B 및 Orf C 넉아웃에 대한 유사한 실험도 동일한 결과를 나타냈다.
실시예 7
이 실시예는 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS 유전자의 모두 또는 일부분이 쉬조키트리움에서 기능할 수 있음을 나타낸다.
미국 특허 출원 제10/124,800호 (상기 문헌)에 기재된 바와 같이, DHA-생산 원생생물 트라우스토키트리움 23B (Th. 23B)는 orfA, orfβ, 및 orfC 상동체를 함유한다는 것을 나타냈다. 3개의 Th. 23B 유전자의 완전한 게놈 클론을 사용하여 동족체 orf "넉아웃"을 함유한 제노신™-내성 쉬조키트리움 균주를 형질전환시켰다 (실시예 4 참조). 상보체화된 형질전환체에 대한 직접 선별을 PUFA 보충 부재하에 수행하였다. 이 방법에 의해, Th. 23B orfA 및 orfC 유전자가 쉬조키트리움 orfA 및 orfC 넉아웃 균주를 각각 PUFA 원영양체로 보완할 수 있음을 나타냈다. 제노신™ 내성을 보유하거나 결실하는 상보체화된 형질전환체를 발견하였다 (마커가 쉬조키트리움 유전자 내로 삽입되었으며, 이에 의해 넉아웃이라 정의함). 제노신™-내성 상보체화 형질전환체는 각 orf 영역의 쉬조키트리움 게놈 외부 내로 전체 트라우스토키트리움 유전자를 단일 교차 통합시킴으로써 발생되는 것 같다. 이 결과는 전체 트라우스토키트리움 유전자가 쉬조키트리움에 기능하고 있다는 것을 시사한다. 제노신™-민감성 상보체화 형질전환체는 일부 (또는 상상할 수 있는 모든) 트라우스토키트리움 유전자가 파괴된 제노신™ 내성 마커를 함유하는 쉬조키트리움 유전자의 동족체 영역을 기능적으로 대체하는 이중 교차 현상에 의해 발생하는 것 같다. 이 결과는 트라우스토키트리움 유전자의 분획이 쉬조키트리움에서 기능하고 있다는 것을 시사한다.
실시예 8
이 실시예에서, 전체 쉬조키트리움 orfC 코딩 서열은 트라우스토키트리움의 것 쪽으로 이동되는 PUFA 프로파일을 생성하는 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 서열에 의해 완전히 정확하게 대체된다.
쉬조키트리움 orfC 코딩 서열을 결실시키기 위해서, 그 직전 상류 (ATG 출발 코돈까지이지만 ATG 출발 코돈을 포함하지는 않음) 및 그 직후 하류 (TAA 정지 코돈 바로 뒤에서 시작함)의 대략 2kb DNA를 제노신™ 내성 마커 주변에 클로닝하였다. 상류 및 하류 영역은 마커를 갖는 orfC 코딩 서열을 효과적으로 대체한 이중 교차 재조합에 대해 상동성을 제공한다. 형질전환체를 보충 PUFA의 존재하에 제노신™ 내성에 대해 선별하고, PUFA 영양요구체에 대해 스크리닝하고, PCR 및 써던 블럿 분석에 의해 특징규명하였다. 유사하게, 쉬조키트리움 orfC 유전자 영역의 동일한 상류 및 하류 서열이 Th. 23B orf C 코딩 서열 (서열 23) 주변에 클로닝된 플라스미드를 작제하였다. 상기 기재된 바와 같이 이 플라스미드를 제노신™ 내성 PUFA 영양요구체 내로 형질전환시키는 것을 PUFA 원영양체에 대한 선별로 수행하였으며, 이는 쉬조키트리움에서 정확하게 기능하고, PUFA 영양요구체를 상보체화시키는 Th. 23B orfC 유전자에 의존한다. 제노신™ 민감성 형질전환체에 대한 차후 스크리닝은 제노신™ 내성 마커를 Th. 23B orfC 유전자로 대체하는 것에 의해 발생되는 것 같은 형질전환체를 동정하였다. 이들 orfC 대체 균주의 DHA:DPA 비율은 평균적으로 8.3 대 일반 값 ("야생형") 2.3이었다. 더 높은 비율은 이들 성장 조건 하에서 트라우스토키트리움 23B에 대해 대략 값 10에 이른다. 따라서, 이는 쉬조키트리움의 PUFA 프로파일이 PUFA 신타제 효소 복합체의 성분을 치환함으로써 조작될 수 있다는 것을 나타낸다.
더욱 구체적으로, 플라스미드의 제1 쌍은 쉬조키트리움 orfC 유전자 직전의 "상류" 및 그 직후의 "하류" 영역들을 포획하고, orfC 결실 벡터 뿐만 아니라 Th. 23B 대체 벡터를 모두 작제하기 위해 사용하였다.
프라이머 prRZ15 (서열 49) 및 prRZ16 (서열 50)을 사용하여 쉬조키트리움 orfC 영역의 클론으로부터 orfC 코딩 영역의 2000 bp 단편 상류를 증폭시켰다. 프라이머 prRZ15는 단편의 5' 말단에 KpnI 부위를 혼입하고, prRZ16은 쉬조키트리움 서열에 ATG 출발 코돈을 포함하지 않고 그 이하까지 상동성을 함유하고, BamHI 부위를 단편의 3' 말단에 혼입한다. PCR 생성물을 pCR-Blunt II (인비트로젠) 내로 클로닝하여 플라스미드 pREZ21을 생산하였다. 유사한 방식으로, 프라이머 prRZ17 (서열 51) 및 prRZ18 (서열 52)을 사용하여 orfC 코딩 영역 (TAA 정지 코돈은 함유하지 않음) 직후의 하류에 존재하는 1991 bp 단편을 증폭하지만, BamHI 부위를 5' 말단에 및 XbaI 부위를 3' 말단에 혼입하였다. 이 PCR 단편을 pCR-Blunt II (인비트로젠) 내로 클로닝하여 pREZ18을 생성하였다. 3개-성분 라이게이션에서, pREZ21로부터의 상류 영역 (KpnI-BamHI 단편으로서) 및 pREZ18의 하류 영역 (BamHI-XbaI 단편으로서)을 pBlueScriptII SK(+)의 KpnI-XbaI 부위 내에 클로닝하여 pREZ22를 수득하였다. pTUBZEO11-2로부터의 제노신™ 내성 마커 (a.k.a. pMON50000, 미국 특허 출원 제10/124,807호, (상기 문헌) 참조)를 1122 bp BamHI 단편으로서 pREZ22의 BamHI 부위 내에 삽입하여 pREZ23A 및 pREZ23B (제노신™ 내성 마커를 2 배향 중 1 배향으로 함유함)를 생산하였다. pREZ23 플라스미드를 이어서 사용하여 상기 기재한 바와 같이 입자 충격 형질전환에 의해 orfC 코딩 영역의 정확한 결실을 생성시켰다. 원하는 구조를 갖는 균주를 B32-Z1이라 명명하였다.
Th. 23B orfC 유전자의 삽입을 위한 플라스미드를 개발하기 위해, 1) 쉬조키트리움 상류 영역 및 Th. 23 B orfC 코딩 영역의 5' 말단과 2) Th. 23B orfC 코딩 영역의 3' 말단 및 쉬조키트리움 하류 영역 간의 정확한 연결부를 함유한 중간체 구조물을 먼저 생산한다. 이어서, Th. 23B orfC 코딩 영역의 내부 절편을 도입한다.
프라이머 prRZ29a (서열 53) 및 prRZ30 (서열 54)를 사용하여 쉬조키트리움 orfC 코딩 서열의 직전 상류에 존재하는 대략 100 bp를 증폭한다. 프라이머 prRZ29a는 쉬조키트리움 orfC ATG 출발 코돈의 SpeI 제한 부위 대략 95 bp 상류를 포함하고, prRZ30은 쉬조키트리움 orfC ATG 출발 코돈의 직전 상류에 존재하는 상동성부 19 bp 및 Th. 23B orfC 코딩 영역의 출발에 상동성인 15 bp (출발 ATG를 포함함)를 함유한다. 별개로, 대략 450 bp PCR 생성물은 클로닝된 Th. 23B 유전자를 주형으로서 사용하여 Th. 23B orfC 코딩 영역의 5' 말단으로부터 생산한다. 프라이머 prRZ31은 출발 ATG의 직전 상류에 존재하는 쉬조키트리움 orfC 코딩 서열의 15 bp 및 Th. 23B orfC 코딩 영역의 출발에서 상동성부 17 bp를 함유하고, 프라이머 prRZ32는 Th. 23B orfC ATG 출발 코돈의 대략 450 bp 하류에서 위치한 NruI 부위를 혼입하고, NruI 부위의 직전 하류에 존재하는 인공적인 SwaI 제한 부위를 추가로 포함한다. 따라서, 이들 2개 PCR 생성물은 prRZ30 (서열 54) 및 prRZ31 (서열 55)의 서열을 본질적으로 포함하는 출발 ATG에서 약 30 bp의 서로 중복 상동성부를 가진다. 2개 제1회 PCR 생성물 (prRZ29a (서열 53) X prRZ30 (서열 54), 약 100 bp, prRZ31 (서열 55) X prRZ32 (서열 56), 약 450 bp)을 주형으로 및 외부 프라이머 prRZ29a (서열 53) 및 prRZ32 (서열 56)의 믹스를 사용하는 제2회의 PCR은 상류 쉬조키트리움 orfC 영역 및 Th. 23B orf C 코딩 영역의 출발부 사이의 "완전 스티치(perfect stitch)"를 함유한 대략 520 bp 생성물을 생산하였다. 상기 PCR 생성물을 플라스미드 pCR-Blunt II 내로 클로닝하여 pREZ28을 생성하고, 삽입물의 서열을 확인하였다.
프라이머 prRZ33 (서열 57) 및 prRZ34 (서열 58)를 PCR에 사용하며 클로닝된 Th. 23B 유전자를 주형으로서 사용하여 Th. 23B orf C 코딩 영역의 3' 말단에서 대략 65 bp의 단편을 생산하였다. (prRZ33으로부터의) 이 단편의 상류 말단은 인공적인 SwaI 제한 부위를 함유하고, Th. 23B orfC TAA 종결 코돈의 대략 60 bp 상류에 SphI 제한 부위를 포함한다. (prRZ34로부터의) 이 단편의 하류 말단은 Th. 23B orf C 코딩 영역의 3' 말단에서 16 bp 및 orfC 코딩 영역 (종결 코돈을 포함함) 직후의 하류에 존재하는 쉬조키트리움 서열에 상동성인 18 bp를 함유한다. 프라이머 prRZ35 (서열 59) 및 prRZ36 (서열 60)을 사용하여 상기 orfC 코딩 영역 직후의 하류에 존재하며 쉬조키트리움 DNA에 상동성인 대략 250 bp 단편을 생산하였다. (prRZ35로부터의) 이 PCR 단편의 상류 말단은 Th. 23B orf C 코딩 영역 (TAA 정지 코돈을 계수함)의 말단부에 상동성인 15 bp를 함유하고, 하류 말단은 쉬조키트리움 정지 코돈의 약 240 bp 하류에 SalI 제한 부위를 함유하였다. 주형으로서의 2개의 제1회 PCR 생성물 (prRZ33 (서열 57) X prRZ34 (서열 58), 약 65 bp, prRZ35 (서열 59) X prRZ36 (서열 60), 약 250 bp) 및 외부 프라이머 prRZ33 (서열 57) 및 prRZ36 (서열 60)의 믹스를 사용하는 제2회의 PCR은 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 영역과 orfC 코딩 영역 직후의 하류에 존재하는 쉬조키트리움 DNA 영역 간의 "완전 스티치"를 함유한 대략 310 bp 생성물을 생산하였다. 상기 PCR 생성물을 플라스미드 pCR-Blunt II 내로 클로닝하여 pREZ29를 생산하고, 삽입물의 서열을 확인하였다.
다음에, 상류 및 하류 "완전 스티치" 영역을 pREZ22 내로 합하였다 (상기 참조). 3개 성분 라이게이션에서, pREZ28로부터의 SpeI/SwaI 단편 및 pREZ29의 SwaI/SalI 단편을 pREZ22의 SpeI/SalI 부위 내로 클로닝하여 pREZ32를 생산하였다. 마지막으로, 트라우스토키트리움 23B orfC 코딩 영역의 내부 벌크를 NruI/SphI 단편으로서 pREZ32 내로 클로닝하여 pREZ33을 생산하였다. 이어서, 이 플라스미드를 PUFA 원영양체에 대한 선별과 함께 사용하여 orfC 넉아웃 균주 B32-Z1을 형질전환시켰다.
본원에서 언급되거나 논의된 각 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 각종 실시양태가 상세하게 기재되어 있지만, 이들 실시양태가 변형 및 개조될 수 있다는 것은 당업자에 명백하다. 그러나, 이러한 변형 및 개조는 하기하는 청구의 범위에 기재한 바와 같은 본 발명의 범위에 속한다는 것을 분명히 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Weaver, Craig Zirkle, Ross James, Metz G. <120> PUFA Polyketide Synthase Systems and Uses Thereof <130> 2997-49-1-PCT <150> 10/965,017 <151> 2004-10-13 <160> 62 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 39669 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 1 gatctggcga taacttactc cccattccac tgtatcagct gcctgcaacc tttaacggcg 60 atcataaacg cgtcattcgc tggcagacag agtggcaagc ctgtgatgaa ttacaaatgg 120 cagcggccac aaaggctgaa tttgcagcat tagaagaaat taccagtcat caaagtgatt 180 tatttagacg gggctgggat atcaggggcg gagttgagta tttaactaaa atcccaactt 240 attattattt ataccgtgtc ggtggcgaaa accttgccag tgaaaaaaac cgagcttgtc 300 cacgttgcgg ctcaaaagcg tggcgtttag atgagccatt attagacatg ttccacttta 360 ggtgcgagcc atgtcgaatt gtatcgaata tctcatggga tcatcagtaa aattatcttc 420 tcgtcaatag atactaatac aacgagttag ctgataacgc attatcggtt cattcaataa 480 aaaagccaga ccgcatctat agcctgatct atagcctggc ttttttattt tatgtccgaa 540 taagcaatta tttcttgcct ttaatcaaat cattccacat cattttcatt cgctgccaaa 600 tacctggatg agcaacatat tcctctacaa 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tcgcaatgat tgaagtttac 1500 cttgctatcg aaagtgataa tttaatcgaa tcaaaatcgt tcaagttgta tttaaacagc 1560 tttaaccaaa cacgttttga cagtgtagac cacgttcagc aaaccttaac cactgactta 1620 agccaatgcg ctaatggtaa ggtaacagtg aaagtgattg agcctaagca tttcaatact 1680 caacgtattg ttgaactacc tggcaattgt atcgatgagc tagatattga agtcaatgat 1740 tatgaattta accctgagta cttgcaagac agcactgaag agaaaaatgt tgtcgaaaca 1800 ctcacatcaa acttattaaa atctaactgt ttaatcactt cacagcctga ttggggaagt 1860 gtgatgatcc gttatcaagg cccaaagatt aatcatgaaa agctattgcg ctatttaatc 1920 tcattccgcc aacataatga atttcatgag caatgtgtag agcgtatttt taccgaccta 1980 aaacgatact gtcattgtac taagctcact gtttatgcac gttatactcg ccgcggtgga 2040 ttggatatca acccattcag aagcgacctt gagcaacctc cagagacgca ccgtttagca 2100 agacaataaa tagcttattc atcaatcagc ttaatgaata aagcctaatc cctaggcttt 2160 attcatttat tttctgtcgt aataccgagc ccttcatgcc tacagacaat gttacttgtt 2220 taacaccaac aactgacgat attcagtccc ataagcattt caaaatattt aaaccctttg 2280 gttttttaag tcagtttgtg cctgaaactc gaaagaaaaa 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gtgcccataa atcgaaaaat 6540 cgctcacgct gctgactttc aggtaacgcc aataatgcag tttcttctgg ttttgaaaaa 6600 tagtgatgta aaattgaatg gatattcgtg ctttctcggc gacgttcaat atcgaccccc 6660 aattgaatgg gcattgaagc gtcctctttg gagtgaatga caccaataag caaccagtta 6720 ccactgtgac ttaaattaaa ctgtaagccc gtttgtttat attgcacagc cgatagccta 6780 ggtttgccct tctcaccata ctcaaattgc caatcgtctg gttcgatatt tgcaaagttc 6840 gataatacgc tgcgcaaata cccacgcacc attaaccctt gctgttgagc agcctgttga 6900 ataaaacgat ccactttatt tatctcagca tcagataacc atgaacgcac tgtagagacg 6960 gttttctcat ctaataaatt ggtatctaaa ggacaaaaaa ataattgaat agtgggtaaa 7020 gggctcaaac caaactcgca tttataatag caataagaca ttgtcgcttg ttctaggtcg 7080 ctaattcaac acataaacaa tcttgattga aaatgtcgtc taaggtttaa acaaataaag 7140 gaaggtttag acaaataaaa aagggttaag ccatccttaa ccctttgcat atcatctgtt 7200 atttcaataa gtattagcca atcaatctac cagtgctttt accgcctttt taggtaaaac 7260 atcataacgg ctaaactgca ttgaaaactg accttctcca cctgtcatag atttaagctt 7320 tgaagagtag ctactgacat tggcaagtgg cacttcaacg 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ccagagaaat agtcagcatg tttgccatat 35640 aaccacaaca gaagagcatt taatgcaatc caataattta ctggaaaaca ttaatttaag 35700 tgaaaaacat ttcttctttg actgtcaaat tgataatgat ttttatgtat tatctaacca 35760 ataccgtact tatgcccaag tgataattaa gcaacctgac atcaactttc caatgtcgat 35820 gcatatagag gcgaaacttg tcacaattga tggcaagctg ctcaatgtca ccagtggtga 35880 tatctcactt aaacggaaat agctcacatg gaatttgaca caataagaga ttatttactg 35940 actaaacctt ttgctacaga agactttcca ttcggagaat ctactcacgt ttttaaagtt 36000 cactcgaaga tgtttgcact aatgtcatgg cgaaatgatg ctttgatggt taatgtaaag 36060 tgcgatcctg aagactcatt cgccctaaga gagatattta gcaatattac gacgggatat 36120 catatggaca agaaacattg gatttctatc tatttacagt caactgggag tgataaatct 36180 aaagaatctc gattaattcc agatggtgag gtattgcgca ttattgataa ttcataccta 36240 ttagtcgtcg acaaacttcc taagaagcaa caaacagcca tcaaactgca tttataacaa 36300 acaaatcaaa gcgctttata gggtttgagc aagactattt ttcagaaagc agagctgtgt 36360 gcactatttt ttcgatagta ttgtcttgct cacctaagaa ctgacaacca aactcgacac 36420 cattttcgaa taatttaaca 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ccaacttgaa aacaaagcgt 5520 aaatacataa ataactgtcg ttagcgctgt taatcattgg cacgattgac tactagtacg 5580 attaaccact gcctaataac gctgacgcat cgcgcttata accccaaagt taaacggaac 5640 cccatgtttg tcacagagct aagatttgaa tgttttgcgg ataccacaat caccgcagcc 5700 gaaaaagcca ttaaccatta cctcgaatct ttgcgagcca acggccaagc cttgggaaga 5760 gaatttgccg tcgcatttaa tgaaggtgag tttaaagtta ggttattaat gccagaaaaa 5820 accagtctat cgactcgtca taatagtcct tggacgaaac aagcgttaaa ccagctcacc 5880 gaagctaaat tacttgcccc tcgtgaaaag tttattggcc aagatatcaa ctctgaagtc 5940 agtaattcag aaacacctag ctggcaggtg ctttatacta gctacgttca tatgtgctcg 6000 cctataagaa gtggcgataa cttgttgcct attccgcttt atcagatccc agccagcttt 6060 aatggcgatc ataaacgggt tatccgctgg caaacagaat ggcaagcttg tgatgaatta 6120 caaatggctg cagccacaaa agccgaattt gccgctttag aagagattac ctcccataaa 6180 agtgacttat tcagacgagg ttgggacata cgcggtagag ttgaattcat cactaagata 6240 ccgacttact attatctata ccgagtaggc ggcgacagtt tagctagtga aaaagagcgt 6300 gcctgccctc gttgtggttc taaagaatgg cgtttagatg 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gtctattttg acacggaaac 7200 agactagatg acacacaatc acgatcccta tagtgatgca gatgcactta aaggactgac 7260 tttaggtcaa acgacacaat atcaagcaga atatgatgct tcactgctac aaggggttcc 7320 tcgtaaactc aatcgtgatg ccatagcatt aaccgattcg ctcccttttc agggcgcaga 7380 tatctggacc ggctatgaat tatcttggct aaatgccaaa ggcaaaccaa tggttgccat 7440 tattgaagtt tacctcgcta tcgaaagtga taatttaatc gaatctaaat cgtttaaact 7500 gtatctcaac agctttaacc aaacacgttt tgagtcagtt gagcaggtac agcaaacatt 7560 agtcactgac ttaagccatt gtgctaatgg cgaagtgaca gttaaagtga ttgaacctaa 7620 acattttaat actcaacgta ttgtcgaatt accaggtaat tgtatcgacg aacttgatat 7680 tgaagtggat gactacgagt ttaatcctga ctatctacaa gacagtactg aagataaaaa 7740 cgttgtcgaa acagtcacat ctaacttatt gaaatcaaac tgtcttatta cctctcagcc 7800 agattggggt agtgtcatga tccgttatca agggcctaaa attaatcatg agaagttgct 7860 tcgctacttg atttctttcc gccaacataa cgaattccat gagcagtgtg ttgaacgtat 7920 atttactgac ttaaaacgct actgtaactg cactaaacta acggtatatg cccgttatac 7980 tcgacgtggc ggtttagaca ttaatccttt cagaagtgat 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ataaacggta ttaaggagta 8880 cactgttggt gtaaaaagtg gctcagatga atctcgttaa atacctttaa attatgtaac 8940 gagaaatctg gcgattaaaa taagcttcat cgtgttaaaa aacaactgtt atcacctcag 9000 tctgagctac ctgttaagtt tttactgctc gcgtcatcat cttaaaaaat tggttaaaac 9060 tgacttcatg agggttcagt gcatctcctg caaatggacc atataataag gaaccgtata 9120 atatagcctc attgaggttt atagattaag agcaataaca ctactcatgc caaaaccaac 9180 ctgtttaacg gaattaaatc aagagtcgct caatgactct caagagcatc agcactttaa 9240 aatatttaaa ccttatggat ttttgagcca gtttgttcct gaaacacgaa agaaaaagca 9300 cttacttgca gagctctcaa acttccccga aaaaaccatg gcgattggtc gcttagatca 9360 cgattccgaa ggcttactct tgctcacaac agacggcatg atgagtcata aagtaagaag 9420 caaaggcata gaaaaagagt attacgtgca agtggatggc gatattaacg atgaggctgt 9480 atctctgtta caaaatgggg ttgaaattgg catcaatggc acaaaatatc ttaccctgcc 9540 ttgtaaagca ttcaagctaa acgcagagcc aatgcttccc tcacgcggta aaaaaattcg 9600 cgatccaagg catgggccaa ccagttgggt atcgatcacc ttatgtgaag gtaaaaatcg 9660 tcaaataaga aagatgacag cagcagtagg ttttgcgacc 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tcgtctcagt ggggattcac agggccgtcc tttactgtca cagaaggaaa taattccgtg 1980 tacagatgtg cacaactagc caaagatatg cttcaggtta accgagttga tgctgtcgtc 2040 atcgcaggcg ttgatctcaa cggaagcgcc gaaagttttt ttgtccgagc aaatcgtcaa 2100 aagatatcca agctaagtca tccatgtgca agcttcgaca gagatgcaga tggatttttc 2160 gcaggtgagg gctgtggtgc cctagttttc aagaggttag aagactgtgc tcctcaggaa 2220 aaaatttatg ctagtataga ctctatcgca atagataaag agcctactag ctcagctgtg 2280 aaagctgtct accaaagtga ttcgagtctc tccgatattg agctgttaga aatcagtgga 2340 gactccaaac ggtttgcagc attcgaaggc gctgtggaaa ttcaatcaag tgtggaagcc 2400 cagctaaaag gactttccaa agtccttgaa cctgcaaaag gccaaggcgt agcggtggga 2460 agtactcgag caaccgttgg ggatataggg tatgctacag gagcggcaag cctgattaaa 2520 actgcactct gcttatataa tcgctacctt ccggcattag caaactggag tggcccatgt 2580 gaacagtccg cctggggctc aaacatgttc gtttgccatg aaacacggcc gtggatgaaa 2640 aaccagaatg aaaagagatg tgccctcatt tctggaacag atccatctca tacatgcttt 2700 tccctcgtac tatcggatac tgggtgttat gaagagcaca atcgaacgtg ctttgatgtg 2760 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ataaatttcg acaatgatga ccgcattcag cttgggcacg cgggttttcg ggagatgtac 4500 aatacaagat atagcttgta cacaggggcg atggcaaagg gaattgcatc tgcagatctt 4560 gtcattgccg ctgggaaaga gggcatccta gcttcctatg gagctggagg actacctctt 4620 gctactgttc gaaagggaat agacaaaatt caacaagcct tgccaagtgg cccatatgct 4680 gtaaatctta ttcactctcc ctttgacggc aacttggagc agggaaacgt cgatttgttc 4740 ttggaaaaga acgtccgcgt ggcggaatgt tccgcgttta caacgctaac agtgccagta 4800 gtacactatc gtgctgcagg gcttgttcgg cgccaagatg gaagcatttt gatcaagaac 4860 cgaatcattg ctaaagtatc taggacagaa ctcgctgaga tgttccttcg tccggcacct 4920 caaatcatcc tcgaaaaact ggtagcagca gaaatcattt catctgacca agcgcgtatg 4980 gcagccaaag ttcccatggc ggacgacatc gcagtcgaag ccgactctgg tgggcacacg 5040 gataatcggc ctatgcacgt cattttgccc ctgataattc aactccgcaa tactatactt 5100 gcagagtatg gctgtgccac ggcttttcgt acccgtatag gcgctggagg aggcattggt 5160 tgtccttcag cggccctcgc agcctttgat atgggtgcga gttttgtcgt gactggaagc 5220 ataaatcaaa tttgccgcga ggcagggact tgcgatactg ttcgggagct acttgccaac 5280 tcaagctact cggacgtgac gatggcgcca gcagcagaca tgtttgacca aggtgtgaaa 5340 ctccaagtct taaaacgagg aacgatgttt ccaagcagag caaataaact ccggaagctc 5400 tttgtgaact acgaatctct agaaacactc ccgtcgaaag agttgaaata cctggaaaac 5460 atcatattca agcaagcagt agaccaggtg tgggaggaaa caaagcgctt ttactgtgaa 5520 aaactgaaca atccagataa aattgcaagg gccatgaaag atcctaaatt gaagatgtcg 5580 ctttgctttc ggtggtatct ctccaagagc tctgggtggg ccaacgcagg aattaaatct 5640 cgtgcactcg actaccagat ctggtgtggc ccggcaatgg gctcgttcaa caatttcgcc 5700 agcggcacat ccctcgattg gaaagtgact ggggttttcc ctggcgttgc ggaagtaaac 5760 atggccattt tagatggcgc gcgagaacta gctgctaaac gaaattaa 5808 <210> 22 <211> 1935 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1935) <223> Xaa = Asp, Gly, Ala, or Val <400> 22 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu 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Trp Phe Thr 705 710 715 720 Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr 725 730 735 Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile 740 745 750 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val 900 905 910 Tyr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln 915 920 925 Ala Ile Pro Asp Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro 930 935 940 Gly Lys Thr Gly Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu 945 950 955 960 Leu Glu Val Asp Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu 965 970 975 Val Gln Phe Glu Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile 980 985 990 Lys Pro Cys Ser Ile Ser Asp Leu Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr 995 1000 1005 Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly 1010 1015 1020 Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile 1025 1030 1035 Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ile Ser Ile Val Arg 1040 1045 1050 Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro His Gly Pro Tyr 1055 1060 1065 Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys 1070 1075 1080 Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val Val Glu 1085 1090 1095 Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr Arg 1100 1105 1110 Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 1115 1120 1125 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 1130 1135 1140 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala 1145 1150 1155 Ser Gly Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val 1160 1165 1170 Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 1175 1180 1185 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn 1190 1195 1200 Leu Arg Asn Arg Leu His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu 1205 1210 1215 Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 1220 1225 1230 Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly 1235 1240 1245 Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val 1250 1255 1260 Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala 1265 1270 1275 Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu 1280 1285 1290 Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Tyr Glu 1295 1300 1305 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 25 ggyatgmtgr ttggtgaagg 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 26 trttsasrta ytgygaacct tg 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = a, c, t, or g <400> 27 atgkcngaag gttgtggcca 20 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 28 ccwgaratra agccrttdgg ttg 23 <210> 29 <211> 192 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> BspHI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (188)..(192) <223> SacII restriction site <400> 29 tcatgaagcc ggttgctccg aagttctacg cgcgtctcaa cattgacgag caggacgaga 60 cccgtgatcc gatcctcaac aaggacaacg cgccgtcttc cagctctagc tcctcttcca 120 gctcttccag ctcttccagc ccgtcgccag ctccgtccgc cccagtgcaa aagaaggctg 180 ctccggccgc gg 192 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 30 cggggtaccc gggagccgcc ttggctttgt 30 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 31 aaactgcagc ccgggtccag ctggcaggca ccctg 35 <210> 32 <211> 237 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 32 Leu Leu Gln His Thr Trp Leu Pro Lys Pro Pro Asn Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Asp Glu Val His Leu Trp Arg Ile Pro Leu Asp Gln Pro Glu Ser 20 25 30 Gln Leu Gln Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ser Asp Glu Leu Ala Arg 35 40 45 Ala Asn Arg Phe Tyr Phe Pro Glu His Arg Arg Arg Phe Thr Ala Gly 50 55 60 Arg Gly Ile Leu Arg Ser Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Val Glu Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Lys Phe Asp Tyr Glu Ser Arg Gly Lys Pro Ile Leu Gly 85 90 95 Asp Arg Phe Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Asn Leu Ser His Ser Gln 100 105 110 Asn Leu Ala Leu Cys Ala Val Asn Tyr Thr Arg Gln Ile Gly Ile Asp 115 120 125 Leu Glu Tyr Leu Arg Pro Thr Ser Asp Leu Glu Ser Leu Ala Lys Arg 130 135 140 Phe Phe Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Asp Glu 145 150 155 160 Gln Lys Gln Lys Ile Phe Phe Arg Tyr Trp Thr Cys Lys Glu Ala Tyr 165 170 175 Leu Lys Ala Thr Gly Asp Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Ile Glu Ile 180 185 190 Ala Leu Thr Pro Thr Glu Pro Ala Lys Leu Gln Thr Ala Pro Ala Trp 195 200 205 Ser Leu Leu Glu Leu Val Pro Asp Asp Asn Cys Val Ala Ala Val Ala 210 215 220 Val Ala Gly Phe Gly Trp Gln Pro Lys Phe Trp His Tyr 225 230 235 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 33 ctgaacactg gagactcaaa atg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 34 gctgacttgc aggagtctgt gtg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 35 caattagaag gagaacaatc ttg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 36 agaggcataa aggaataata atg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 37 gcgacctaga acaagcgaca atg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 38 ctgaacactg gagactcaaa atg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 39 gctgatttgc aggagtctgt gtg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 40 caattagaag gagaacaatc ttg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 41 agaggcataa aggaataata atg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 42 caatttagcc tgagcctagt ttg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 43 taaatcgcac tggtattgtc atg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 44 aagcactcaa tgatgctggt gtg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 45 taaaccgcac cggtattgtc atg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 46 acccagctga ctatcaaggt gtg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 47 atgaatcgac tgcgtctatt gtg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Sh. olleyana <400> 48 catctagaga acaaggttta atg 23 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 49 cggtacccgc gaatcaagaa ggtaggc 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 50 cggatcccgt ctctgccgct ttttctt 27 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 51 cggatccgaa agtgaacctt gtcctaaccc 30 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 52 ctctagacag atccgcacca tcggccg 27 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 cactagtacc gctgcggaa 19 <210> 54 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 cactcgcggg cccatcgtct ctgccgcttt ttct 34 <210> 55 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 55 aaagcggcag agacgatggg cccgcgagtg gcgt 34 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 56 gatttaaatc cttctttcgc gacgccaa 28 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 57 cgatttaaat gcatgctgct gcaggccgtc gat 33 <210> 58 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 58 acaaggttca ctttcttaaa gtggctgggt cggc 34 <210> 59 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 59 acccagccac tttaagaaag tgaaccttgt ccta 34 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 60 ggtcgacaaa cattttctt 19 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Shewanella sp. <400> 61 Met Val Arg Gly Tyr Leu Arg 1 5 <210> 62 <211> 54 <212> PRT <213> Shewanella sp. <400> 62 Leu Ile Ser Leu Tyr Phe Cys Pro Leu Thr Ile Gln Glu Cys Asp Asn 1 5 10 15 Gln Thr Thr Glu Leu Val Lys Ser Trp Leu Pro Glu Asp Glu Leu Ile 20 25 30 Lys Val Asn Arg Tyr Ile Lys Gln Glu Ala Lys Thr Gln Gly Leu Met 35 40 45 Val Arg Gly Tyr Leu Arg 50

Claims (86)

  1. (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편을 코딩하는 핵산 서열,
    (c) 서열 2 또는 서열 8과 약 65％ 이상 동일하며, KS 활성, MAT 활성, KR 활성, ACP 활성 및 비-FabA-유사 데히드라제 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (d) 서열 3 또는 서열 9와 약 60％ 이상 동일하며, AT 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (e) 서열 4 또는 서열 10과 약 70％ 이상 동일하며, KS 활성, CLF 활성 및 DH 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (f) 서열 6 또는 서열 12와 약 60％ 이상 동일하며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및
    (g) 서열 11과 약 85％ 이상 동일하거나 서열 5와 약 95％ 이상 동일하며, ER 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이
    (a) 서열 2 또는 서열 8과 약 75％ 이상 동일하며, KS 활성, MAT 활성, KR 활성, ACP 활성 및 비-FabA-유사 데히드라제 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (b) 서열 3 또는 서열 9와 약 70％ 이상 동일하며, AT 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (c) 서열 4 또는 서열 10과 약 80％ 이상 동일하며, KS 활성, CLF 활성 및 DH 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (d) 서열 6 또는 서열 12와 약 70％ 이상 동일하며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및
    (e) 서열 11과 약 95％ 이상 동일하거나 서열 5와 약 96％ 이상 동일하며, ER 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 단리된 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이
    (a) 서열 2 또는 서열 8과 약 85％ 이상 동일하며, KS 활성, MAT 활성, KR 활성, ACP 활성 및 비-FabA-유사 데히드라제 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (b) 서열 3 또는 서열 9와 약 80％ 이상 동일하며, AT 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (c) 서열 4 또는 서열 10과 약 90％ 이상 동일하며, KS 활성, CLF 활성 및 DH 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (d) 서열 6 또는 서열 12와 약 80％ 이상 동일하며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및
    (e) 서열 11과 약 96％ 이상 동일하거나 서열 5와 약 97％ 이상 동일하며, ER 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이
    (a) 서열 2 또는 서열 8과 약 95％ 이상 동일하며, KS 활성, MAT 활성, KR 활성, ACP 활성 및 비-FabA-유사 데히드라제 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (b) 서열 3 또는 서열 9와 약 90％ 이상 동일하며, AT 생물학적 활성을 보유 하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (c) 서열 4 또는 서열 10과 약 95％ 이상 동일하며, KS 활성, CLF 활성 및 DH 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열,
    (d) 서열 6 또는 서열 12와 약 90％ 이상 동일하며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및
    (e) 서열 11과 약 97％ 이상 동일하거나 서열 5와 약 98％ 이상 동일하며, ER 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이
    (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, (b)에 기재한 상기 단편이
    (a) 서열 2의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (b) 서열 2의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (c) 서열 2의 위치 약 1264 내지 위치 약 1889로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 2의 단편,
    (d) 서열 2의 위치 약 2264 내지 위치 약 2398로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (e) 서열 2의 위치 약 2504 내지 위치 약 2516을 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 생물학적 활성을 보유하는 서열 2의 단편,
    (f) 서열 3의 위치 약 378 내지 위치 약 684로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 3의 단편,
    (g) 서열 4의 위치 약 5 내지 위치 약 483으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (h) 서열 4의 위치 약 489 내지 위치 약 771로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (i) 서열 4의 위치 약 1428 내지 위치 약 1570으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (j) 서열 4의 위치 약 1881 내지 위치 약 2019로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (k) 서열 5의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 5의 단편,
    (l) 서열 6의 위치 약 40 내지 위치 약 186으로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 6의 단편,
    (m) 서열 8의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (n) 서열 8의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (o) 서열 8의 위치 약 1275 내지 위치 약 1872로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 8의 단편,
    (p) 서열 8의 위치 약 2240 내지 위치 약 2374로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (q) 서열 8의 위치 약 2480 내지 2492를 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 활성을 보유하는 서열 8의 단편,
    (r) 서열 9의 위치 약 366 내지 위치 약 703으로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 9의 단편,
    (s) 서열 10의 위치 약 10 내지 위치 약 488로 이루어지며, KS 생물학적 활 성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (t) 서열 10의 위치 약 502 내지 위치 약 750으로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (u) 서열 10의 위치 약 1431 내지 위치 약 1573으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (v) 서열 10의 위치 약 1882 내지 위치 약 2020으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (w) 서열 11의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 11의 단편, 및
    (x) 서열 12의 위치 약 29 내지 위치 약 177로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 12의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 단리된 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제1항의 핵산 분자에 완전히 상보적인 핵산 서열로 본질적으로 구성된 단리된 핵산 분자.
  9. 1개 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제1항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  10. 제9항의 재조합 핵산 분자로 형질감염된 재조합 세포.
  11. 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 생물학적 활성 단백질 또는 그의 도메인을 포함하고 상기 단백질 또는 도메인이 제1항의 핵산 분자에 의해 코딩되는, PKS 시스템을 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  13. 제11항에 있어서, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  14. 제11항에 있어서, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  15. 제11항에 있어서, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  16. 제11항에 있어서, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12를 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  17. 제11항에 있어서,
    (a) 서열 2의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (b) 서열 2의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (c) 서열 2의 위치 약 1264 내지 위치 약 1889로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 2의 단편,
    (d) 서열 2의 위치 약 2264 내지 위치 약 2398로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (e) 서열 2의 위치 약 2504 내지 위치 약 2516을 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 생물학적 활성을 보유하는 서열 2의 단편,
    (f) 서열 3의 위치 약 378 내지 위치 약 684로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 3의 단편,
    (g) 서열 4의 위치 약 5 내지 위치 약 483으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (h) 서열 4의 위치 약 489 내지 위치 약 771로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (i) 서열 4의 위치 약 1428 내지 위치 약 1570으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (j) 서열 4의 위치 약 1881 내지 위치 약 2019로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (k) 서열 5의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 5의 단편,
    (l) 서열 6의 위치 약 40 내지 위치 약 186으로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 6의 단편,
    (m) 서열 8의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (n) 서열 8의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (o) 서열 8의 위치 약 1275 내지 위치 약 1872로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 8의 단편,
    (p) 서열 8의 위치 약 2240 내지 위치 약 2374로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (q) 서열 8의 위치 약 2480 내지 2492를 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 활성을 보유하는 서열 8의 단편,
    (r) 서열 9의 위치 약 366 내지 위치 약 703으로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 9의 단편,
    (s) 서열 10의 위치 약 10 내지 위치 약 488로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (t) 서열 10의 위치 약 502 내지 위치 약 750으로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (u) 서열 10의 위치 약 1431 내지 위치 약 1573으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (v) 서열 10의 위치 약 1882 내지 위치 약 2020으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (w) 서열 11의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 11의 단편, 및
    (x) 서열 12의 위치 약 29 내지 위치 약 177로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 12의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  18. 제11항에 있어서, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 생물학적 활성 단백질 또는 도메인을 발현하도록 추가로 유전자 변형된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  19. 제18항에 있어서, 트라우스토키트리드가 쉬조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)으로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  20. 제18항에 있어서, 상기 단백질 또는 도메인이
    (a) 서열 14, 서열 16 및 서열 18, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  21. 제18항에 있어서, 상기 단백질 또는 도메인이
    (a) 서열 20, 서열 22 및 서열 24, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  22. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3)) 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3))로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 다중불포화 지방산을 생산하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  23. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 DHA를 생산하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  24. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 EPA를 생산하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  25. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 EPA 및 DHA를 생산하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  26. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 ARA 및 DHA를 생산하는 유전자 변 형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  27. 제11항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 ARA 및 EPA를 생산하는 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  28. 제11항에 있어서, 작물인 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  29. 제11항에 있어서, 쌍떡잎 식물인 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  30. 제11항에 있어서, 외떡잎 식물인 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  31. 제11항에 있어서, 캐놀라, 대두, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 식물 또는 상기 식물의 일부.
  32. 제1항의 단리된 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  33. 제32항에 있어서,
    (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  34. 제32항에 있어서, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  35. 제32항에 있어서, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  36. 제32항에 있어서, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  37. 제32항에 있어서, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12를 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  38. 제32항에 있어서,
    (a) 서열 2의 위치 약 32 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (b) 서열 2의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (c) 서열 2의 위치 약 1264 내지 위치 약 1889로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 2의 단편,
    (d) 서열 2의 위치 약 2264 내지 위치 약 2398로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 2의 단편,
    (e) 서열 2의 위치 약 2504 내지 위치 약 2516을 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 생물학적 활성을 보유하는 서열 2의 단편,
    (f) 서열 3의 위치 약 378 내지 위치 약 684로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 3의 단편,
    (g) 서열 4의 위치 약 5 내지 위치 약 483으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (h) 서열 4의 위치 약 489 내지 위치 약 771로 이루어지며, CLF 생물학적 활 성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (i) 서열 4의 위치 약 1428 내지 위치 약 1570으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (j) 서열 4의 위치 약 1881 내지 위치 약 2019로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 4의 단편,
    (k) 서열 5의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 5의 단편,
    (l) 서열 6의 위치 약 40 내지 위치 약 186으로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 6의 단편,
    (m) 서열 8의 위치 약 29 내지 위치 약 513으로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (n) 서열 8의 위치 약 625 내지 위치 약 943으로 이루어지며, MAT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (o) 서열 8의 위치 약 1275 내지 위치 약 1872로 이루어지며, ACP 생물학적 활성을 보유하는 도메인 또는 그의 서브도메인인 서열 8의 단편,
    (p) 서열 8의 위치 약 2240 내지 위치 약 2374로 이루어지며, KR 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 8의 단편,
    (q) 서열 8의 위치 약 2480 내지 2492를 포함하며, 비-FabA-유사 데히드라제 활성을 보유하는 서열 8의 단편,
    (r) 서열 9의 위치 약 366 내지 위치 약 703으로 이루어지며, AT 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 9의 단편,
    (s) 서열 10의 위치 약 10 내지 위치 약 488로 이루어지며, KS 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (t) 서열 10의 위치 약 502 내지 위치 약 750으로 이루어지며, CLF 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (u) 서열 10의 위치 약 1431 내지 위치 약 1573으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (v) 서열 10의 위치 약 1882 내지 위치 약 2020으로 이루어지며, DH 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 10의 단편,
    (w) 서열 11의 위치 약 84 내지 위치 약 497로 이루어지며, ER 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 11의 단편, 및
    (x) 서열 12의 위치 약 29 내지 위치 약 177로 이루어지며, PPTase 생물학적 활성을 보유하는 도메인인 서열 12의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  39. 제32항에 있어서, 트라우스토키트리드의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 생물학적 활성 단백질 또는 도메인을 발현하도록 추가로 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  40. 제39항에 있어서, 트라우스토키트리드가 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 미생물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 단백질 또는 도메인이
    (a) 서열 14, 서열 16 및 서열 18, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 미생물.
  42. 제39항에 있어서, 상기 단백질 또는 도메인이
    (a) 서열 20, 서열 22 및 서열 24, 및
    (b) 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 활성, 아실 운반체 단백질 (ACP) 활성, β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 활성, 아실트랜스퍼라제 (AT) 활성, β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 활성, FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 활성, 비-FabA-유사 데히드라제 활성, 쇄 길이 인자 (CLF) 활성, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라 제 (MAT) 활성 및 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 활성으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 활성을 보유하는, 상기 (a)의 임의의 아미노산 서열의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 미생물.
  43. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3)) 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3))로 구성된 군에서 선택된 다중불포화 지방산을 생산하는 유전자 변형 미생물.
  44. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 DHA를 생산하는 유전자 변형 미생물.
  45. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 EPA를 생산하는 유전자 변형 미생물.
  46. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 EPA 및 DHA를 생산하는 유전자 변형 미생물.
  47. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 ARA 및 DHA를 생산하는 유전자 변 형 미생물.
  48. 제32항에 있어서, 유전자 변형의 결과로서 ARA 및 EPA를 생산하는 유전자 변형 미생물.
  49. 제32항에 있어서, 내인성 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전자 변형 미생물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템이, 그의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을, 상이한 PKS 시스템의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 또다른 단리된 핵산 분자로 치환하여 변형된 것인 유전자 변형 미생물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 상이한 PKS 시스템이 비-박테리아 PUFA PKS 시스템, 박테리아 PUFA PKS 시스템, 제I형 모듈형(modular) PKS 시스템, 제I형 반복형(iterative) PKS 시스템, 제II형 PKS 시스템 및 제III형 PKS 시스템으로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 미생물.
  52. 제49항에 있어서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템이, 그의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을, 제1항의 단리된 핵산 분자로 치환하여 유전자 변형된 것인 유전자 변형 미생물.
  53. 제49항에 있어서, C20 단위의 합성을 지시하는 쇄 길이 인자 또는 쇄 길이 인자와 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 미생물.
  54. 제49항에 있어서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템이 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인을 코딩하는 도메인 및 β-케토아실-ACP 신타제 (KS)를 코딩하는 도메인으로 구성된 군에서 선택된 도메인(들)에서 변형된 것이고, 이때 상기 변형이 변형되지 않은 경우에 비하여 PUFA PKS 시스템에 의해 생산되는 장쇄 지방산의 비율을 변경하는 유전자 변형 미생물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 변형이 내인성 PUFA PKS 시스템의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH)를 이성질체화 활성을 보유하지 않는 DH 도메인으로 치환하는 것을 포함하는 유전자 변형 미생물.
  56. 제54항에 있어서, 상기 변형이 상기 도메인의 전부 또는 일부의 결실, 상이한 유기체로부터의 상동성 도메인에 의한 상기 도메인의 치환, 및 상기 도메인의 돌연변이로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 미생물.
  57. 제49항에 있어서, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템이 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인에서 변형된 것이고, 이때 상기 변형이 변형되지 않은 경우에 비하여 상이한 화합물을 생산하게 하는 유전자 변형 미생물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 변형이 ER 도메인의 전부 또는 일부의 결실, 상이한 유기체로부터의 ER 도메인에 의한 상기 ER 도메인의 치환, 및 상기 ER 도메인의 돌연변이로 구성된 군에서 선택된 유전자 변형 미생물.
  59. 제32항에 있어서, 트라우스토키트리드인 유전자 변형 미생물.
  60. 제59항에 있어서, 트라우스토키트리드가 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 구성된 군에서 선택된 속인 유전자 변형 미생물.
  61. 제32항에 있어서, 박테리아인 유전자 변형 미생물.
  62. 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산에 효과적인 조건하에 제12항의 유전자 변형 식물을 성장시키는 것을 포함하는, 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산 방법.
  63. 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산에 효과적인 조건하에 제29항의 유전자 변형 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 폴리케티드 신타제 시스템에 의해 생산되는 생물활성 분자의 생산 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 유전자 변형이 내인성 PKS 시스템에 의해 생산되는 1종 이상의 생성물을 야생형 유기체에 비해 변화시키는 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 유기체가 유전자 변형이 없는 천연 발생 유기체와는 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로파일을 생성하는 것인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 생물활성 분자가 소염 제제, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울제, 항-경련제, 항-헬리오박터 파일로리(Heliobactor pylori) 약물, 신경변성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환의 치료용 약물, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제제로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 생물활성 분자가 항생제인 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 생물활성 분자가 다중불포화 지방산 (PUFA)인 방법.
  69. 제63항에 있어서, 상기 생물활성 분자가 시스 배위의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 분자인 방법.
  70. 제63항에 있어서, 상기 생물활성 분자가 매 3번째 탄소마다 이중 결합을 포 함하는 분자인 방법.
  71. 제9항의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 식물 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 천연 발생 식물과는 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로파일을 갖는 식물의 생성 방법.
  72. 제9항의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하도록 미생물 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 재조합 미생물의 생성 방법.
  73. 최종 생성물에 제9항의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 오일을 첨가하는 것을 포함하는, 최종 생성물이 1종 이상의 지방산을 함유하도록 하는 최종 생성물의 변형 방법.
  74. 제73항에 있어서, 최종 생성물이 식이보조제, 식품, 제약 제제, 인간화된 동물 유즙(乳汁) 및 분유(infant formula)로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  75. 제9항의 1종 이상의 재조합 핵산 분자를 사용하여 유즙-생산 동물의 유즙-생산 세포를 유전자 변형하는 것을 포함하는, 인간화된 동물 유즙의 생산 방법.
  76. 재조합 박테리아 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템 을 발현하도록 변형되고, 이때 상기 PUFA PKS가 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 상기 PUFA PKS 시스템이
    (a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
    (b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
    (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
    (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
    (e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
    (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
    (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
    (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
    (i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
    을 포함하며 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산하는 것인 재조합 숙주 세포.
  77. 제76항에 있어서, 상기 PUFA PKS 시스템이
    (a) 1개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
    (b) 6개의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
    (c) 2개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
    (d) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
    (e) 1개의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
    (f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
    (g) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
    (h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
    (i) 1개의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
    을 포함하는 재조합 숙주 세포.
  78. 제76항에 있어서, 상기 PUFA PKS 시스템이 쉐바넬라 자포니카(Shewanella japonica) 또는 쉐바넬라 올레야나(Shewanella olleyana)로 구성된 군에서 선택된 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템인 재조합 숙주 세포.
  79. 박테리아 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 도메인을 포함하며, 이때 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템이 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산하고
    (a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
    (b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
    (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
    (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
    (e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
    (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
    (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
    (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
    (i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
    을 포함하며, 상기 유전자 변형이 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 주는 것인 유전자 변형 유기체.
  80. 제79항에 있어서, 박테리아 PUFA PKS 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 도메인을 재조합 발현하도록 변형된 유전자 변형 유기체.
  81. 제79항에 있어서, 박테리아 PUFA PKS 시스템을 재조합 발현하도록 변형된 유전자 변형 유기체.
  82. 제79항에 있어서, 식물인 유전자 변형 유기체.
  83. 제79항에 있어서, 미생물인 유전자 변형 유기체.
  84. 제79항에 있어서, 박테리아 PUFA PKS 시스템이 쉐바넬라 자포니카 및 쉐바넬라 올레야나로 구성된 군에서 선택된 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템인 유전자 변형 유기체.
  85. 제79항에 있어서, 제2의 상이한 PKS 시스템의 1종 이상의 추가의 단백질 또는 도메인을 발현하는 유전자 변형 유기체.
  86. 박테리아 (PUFA) 폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템의 1종 이상의 단백질 또는 기능적 도메인을 코딩하며, 이때 상기 박테리아 PUFA PKS 시스템이 반복형 효소 반응과 비-반복형 효소 반응 모두를 촉매하고 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 생산하고
    (a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인,
    (b) 6개 이상의 아실 운반체 단백질 (ACP) 도메인,
    (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인,
    (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인,
    (e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인,
    (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인,
    (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인,
    (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인, 및
    (i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
    을 포함하는 것인 단리된 재조합 핵산 분자.
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