JP5110511B2 - 微生物を用いた高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和脂質の製造方法 - Google Patents
微生物を用いた高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和脂質の製造方法Info
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Description
本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化した形質転換微生物において高度不飽和脂肪酸含量を高める方法に関する。
ある種の海洋性微生物が、ドコサヘキサエン酸（DHA）やエイコサペンタエン酸（EPA）などの高度不飽和脂肪酸を生産することは古くから報告されている。これらの微生物を利用してドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸を製造する方法も報告されている（特許文献１及び特許文献２を参照）。しかしながら、これまで高度不飽和脂肪酸生産細菌における高度不飽和脂肪酸生産の至適化は、高度不飽和脂肪酸生産細菌の中からとりわけ高度に高度不飽和脂肪酸を蓄積する株を選択することから始まり、培養温度、培地の組成、pH等の培養条件の検討に終始してきた。
一方、上記課題を克服するために、高度不飽和脂肪酸を合成する能力をもたない大腸菌にDHAやEPA合成に関与する遺伝子を導入し、遺伝子組換えによって高度不飽和脂肪酸を生産させる方法が提案されている（特許文献３〜５を参照）。また、変異誘発剤処理により得られた不飽和脂肪酸要求性の大腸菌変異株に、EPA合成に関与する遺伝子を導入するとEPA合成量の増加が認められることが示されている（非特許文献１を参照）。しかし、DHAやEPA合成に関与する遺伝子は低温（20℃以下）で特異的に機能するため、遺伝子組み換え大腸菌でDHAやEPAを生産させるためには、遺伝子組換え大腸菌を至適生育温度には遠く及ばない低温で培養する必要が生じ、培養の効率化という面では問題が残る。さらに、大腸菌の不飽和脂肪酸要求変異株利用の有用性が示されているが、変異誘発剤処理により得られた変異株では、不飽和脂肪酸要求変異以外に複数種類のDNA損傷（変異）が突然変異生成に関与している可能性は否定できない。
本発明の目的は、微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の生産量を増加させる方法及び高度不飽和脂肪酸の生産量が増加した微生物を提供することにある。
本発明者らは、培養時間が短く培養制御が容易であり、遺伝子の取得も容易な細菌を利用した高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産法を見出す目的で研究を開始した。本発明者らは、高度不飽和脂肪酸生産細菌の脂肪酸合成機構について種々の研究を行っている過程で、飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより、高度不飽和脂肪酸生産細菌において高度不飽和脂肪酸の生産量が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化し、該微生物を培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[２] 脂肪酸合成酵素遺伝子がfabBである、[１]の高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[３] 高度不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸である[１]又は[２]に記載の高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[１] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化し、該微生物を培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[２] 脂肪酸合成酵素遺伝子がfabBである、[１]の高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[３] 高度不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸である[１]又は[２]に記載の高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[４] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であることを特徴とする[１]〜[３]のいずれかの高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法。
[５] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより得られる、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の生産量が前記遺伝子の不活性化しない前記微生物に比較して増加した、高度不飽和脂肪酸産生微生物。
[５] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより得られる、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の生産量が前記遺伝子の不活性化しない前記微生物に比較して増加した、高度不飽和脂肪酸産生微生物。
[６] 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であることを特徴とする[５]の高度不飽和脂肪酸産生微生物。
[７] 高度高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であり、不活性化した脂肪酸合成酵素遺伝子が、fabBである、受託番号FERM P-21351として寄託されている[６]の高度不飽和脂肪酸産生微生物。
[７] 高度高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であり、不活性化した脂肪酸合成酵素遺伝子が、fabBである、受託番号FERM P-21351として寄託されている[６]の高度不飽和脂肪酸産生微生物。
本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する酵素遺伝子を不活性化することを特徴とする高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法である。そして、不活性化する脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子としては、fabBが挙げられる。さらに、本発明は上記方法により得られる高度不飽和脂肪酸産生微生物である。この方法により、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物であれば何れの菌株を用いても高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和脂質の生産量を増加させることができる。また、一般に高度不飽和脂肪酸生産細菌は好冷性又は耐冷性の性質を示し、低温下での生産にも適している。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、高度不飽和脂肪酸とは、二重結合を３個以上有する多価不飽和脂肪酸をいい、ドコサヘキサエン酸（DHA)、エイコサペンタエン酸（EPA)、α-リノレン酸（ALA)、γ-リノレン酸（GLA)、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA)、アラキドン酸（AA)等があり、この中でもDHA及びEPAが好ましい。また、これらの高度不飽和脂肪酸を構成成分として含む脂質を高度不飽和脂質という。
本発明において、高度不飽和脂肪酸とは、二重結合を３個以上有する多価不飽和脂肪酸をいい、ドコサヘキサエン酸（DHA)、エイコサペンタエン酸（EPA)、α-リノレン酸（ALA)、γ-リノレン酸（GLA)、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA)、アラキドン酸（AA)等があり、この中でもDHA及びEPAが好ましい。また、これらの高度不飽和脂肪酸を構成成分として含む脂質を高度不飽和脂質という。
本発明で使用する高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物としては特に属、種あるいは
株などを限定するものではなく、DHAやEPA生産能を有する微生物であれば何れを用いることもできる。その例としては、EPA生産能を有する微生物として、シェワネラ(Shewanella)属微生物、Photobacterium属微生物等が挙げられ、例えばシェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）、Photobacterium profundum等がある。DHA生産能を有する微生物として、Moritella属微生物等が挙げられ、例えばMoritellamarina等がある。
株などを限定するものではなく、DHAやEPA生産能を有する微生物であれば何れを用いることもできる。その例としては、EPA生産能を有する微生物として、シェワネラ(Shewanella)属微生物、Photobacterium属微生物等が挙げられ、例えばシェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）、Photobacterium profundum等がある。DHA生産能を有する微生物として、Moritella属微生物等が挙げられ、例えばMoritellamarina等がある。
本発明では、脂肪酸合成酵素遺伝子に変異を導入して脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化し、微生物細胞内の高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質含量を増加させることを特徴の一つとしている。
本発明において、不活性化する脂肪酸合成酵素遺伝子として飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子が挙げられ、例えばβ-ケトアシル-アシルキャリアタンパク質（ACP）合成酵素I（FabB）、マロニル-CoA：ACP転移酵素（FabD）、β-ケトアシル-ACP還元酵素（FabG）、β-ケトアシル-ACP合成酵素II（FabF）、β-ケトアシル-ACP合成酵素III（FabH）、β-ヒドロキシデカノイル-ACP デヒドラターゼ（FabA）、エノイル-ACP還元酵素（FabI）をコードする遺伝子が挙げられる。
脂肪酸合成酵素遺伝子の不活性化とは、該脂肪酸合成酵素遺伝子の機能を欠損させて、脂肪酸合成酵素を発現しないようにすることをいう。
微生物の脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化する方法としては、特に限られる訳ではないが、細胞内に遺伝子を導入した後、相同組換えによって脂肪酸合成酵素遺伝子へ外来遺伝子を挿入し、挿入変異として遺伝子を不活性化する方法が挙げられる。相同組換えとは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象である。相同組換えは、当業者に周知の方法で行うことができる。まず、標的とする脂肪酸合成酵素遺伝子部位の配列を途中で分断する形で、プロモーターと外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を構築し、これを、DHA又はEPA産生微生物細胞に導入してやると、該微生物細胞の内在性の脂肪酸合成酵素遺伝子DNAとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で組換えが起こる。組換え体を同定しやすくするため、相同組換えにより分断され機能を失う導入部位の遺伝子には選択マーカーとなり得る遺伝子を用いればよい。トランスファーベクターは、D. M. Glover他編、加藤郁之進 監訳DNAクローニング4−哺乳類のシステム−（第2版）TaKaRa等に記載の方法に従って作製することができる。ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
また、脂肪酸合成酵素遺伝子へ点突然変異を導入し、その点突然変異が導入された部位のコドンをストップコドンとする方法が挙げられる。さらに、点突然変異を導入する方法について、化学的に合成した変異を導入しようとする塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた一般的に用いられている点突然変異導入法を用いることができる。これらの改変技術は当業者に周知であり、市販の突然変異導入キット等を使用することができる。
微生物細胞内で遺伝子を導入する方法としては、特に限られる訳ではないが、接合伝達を利用して遺伝子導入を行う方法が好適である。またこの場合において、脂肪酸合成酵素遺伝子の一部を保持する相同組換えベクターの内部に、形質転換微生物を選抜するための薬剤耐性遺伝子を挿入しておくことが好適である。遺伝子挿入変異が行われた微生物細胞は薬剤を含む微生物培養用培地上で培養が可能であるため、微生物ゲノムDNAにベクターが挿入され薬剤耐性となった微生物細胞を選抜することで、高度不飽和脂肪酸産生量が増加し、高度不飽和脂肪酸含量が増加した微生物細胞を得ることができるようになる。
このようにして得られた脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化した微生物を培養し、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質を産生させることにより、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質を製造することができる。培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いることもできるが、目的とする高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質を大量に製造するためには、液体培地を用いるのが好ましい。培養は、静置培養、振盪培養、通気・撹拌培養等の好気的条件下で行なえばよい。培地は、微生物により適宜選択することができ、市販の培地を利用することができる。培養温度は菌が生育し、高度不飽和脂肪酸が生産される温度範囲であればいずれの温度でもよい。本発明で用いる高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物には、好冷性又は耐冷性の微生物が含まれ、例えば20℃以下、好ましくは15℃以下、さらに好ましくは10℃以下あるいは４℃前後の低温下で微生物を培養し、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質を製造することができる。pHは6〜9、好ましくは7〜8の範囲である。また、培養時間は、数時間〜数十時間である。
微生物が産生した高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質は、通常の脂質精製方法により菌体から精製することができる。例えば高度不飽和脂質は、培地から遠心分離、濾過などの常用の手段によって菌体を集め、集めた菌体からクロロホルム・メタノール等の有機溶媒により全脂質を抽出し、その後各種クロマトグラフィーによる分画・精製を行うことによって得ることができる。
本発明の微生物を用いた場合、目的とする脂肪酸は全脂肪酸に対して10％以上、好ましくは15％以上含まれる。
本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより得られる、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の生産量が前記遺伝子の不活性化しない野生型の前記微生物に比較して増加した、高度不飽和脂肪酸産生微生物を包含する。高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化した微生物中の高度不飽和脂肪酸の全脂肪酸の割合は、野生型の微生物の1.5倍、好ましくは２倍である。EPA生産能を有し、脂肪酸合成酵素遺伝子であるfabBが不活性化されたシェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）は、識別のための表示 Shewanella marinintestinaIK-1ΔfabB1-8で、2007年8月30日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-21351として寄託されている。
本実施例では、EPA生産細菌シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）の脂肪酸合成酵素遺伝子の一つであるβ-ケトアシル-アシルキャリアタンパク質（ACP）合成酵素I（FabB）遺伝子のホモログに抗生物質耐性遺伝子を挿入した変異脂肪酸合成酵素遺伝子を有する微生物細胞におけるEPA含量への影響の検討を行った。
（１）シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）IK-1株からのゲノムDNA抽出
シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）IK-1株（Satomi, M., et al. (2003) Int J Syst Evol Microbiol 53, 491-499）は、独立行政法人水産総合研究センター中央水産研究所の矢野豊博士より分譲を受けた。
菌体1.5 mlからゲノムDNA抽出キット（ISOPLANT、（株）ニッポンジーン）を用いてIK-1株のゲノムDNAを抽出した。TE buffer 50μl加えてゲノムDNAを溶かし４℃で保存した。
シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）IK-1株（Satomi, M., et al. (2003) Int J Syst Evol Microbiol 53, 491-499）は、独立行政法人水産総合研究センター中央水産研究所の矢野豊博士より分譲を受けた。
菌体1.5 mlからゲノムDNA抽出キット（ISOPLANT、（株）ニッポンジーン）を用いてIK-1株のゲノムDNAを抽出した。TE buffer 50μl加えてゲノムDNAを溶かし４℃で保存した。
（２）PCR法によるfabB遺伝子ホモログ断片の増幅
細菌のFabBで良く保存されているアミノ酸領域からそれらの塩基配列に相当する縮重プライマー、fabB-FW2（配列番号１）、fabB-RV1（配列番号２）をそれぞれ設計し、合成した。調製したIK-1株のゲノムDNAを鋳型にして、fabB-FW2プライマーとfabB-RV1プライマーを用いてPCR反応を行なったところ、アガロースゲル電気泳動で約750bpの遺伝子産物が観察された。このアガロースゲルからこのPCR断片（断片A）を切り出して増幅されたDNAを精製した。断片Ａの塩基配列（配列番号３）をジデオキシ法で決定し、ホモロジー検索を行ったところ、各種細菌のFabBと有為な相同性が認められた。従って、断片Aは、IK-1株のfabB遺伝子の一部であると結論した。
細菌のFabBで良く保存されているアミノ酸領域からそれらの塩基配列に相当する縮重プライマー、fabB-FW2（配列番号１）、fabB-RV1（配列番号２）をそれぞれ設計し、合成した。調製したIK-1株のゲノムDNAを鋳型にして、fabB-FW2プライマーとfabB-RV1プライマーを用いてPCR反応を行なったところ、アガロースゲル電気泳動で約750bpの遺伝子産物が観察された。このアガロースゲルからこのPCR断片（断片A）を切り出して増幅されたDNAを精製した。断片Ａの塩基配列（配列番号３）をジデオキシ法で決定し、ホモロジー検索を行ったところ、各種細菌のFabBと有為な相同性が認められた。従って、断片Aは、IK-1株のfabB遺伝子の一部であると結論した。
（３）導入プラスミドの構築
PCR反応で増幅された752bpのfabB遺伝子DNA断片を、予め制限酵素Sma Iで処理した開環プラスミドpKNOCK-Cmに結合し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する接合伝達可能な（mobilizable）組み換えプラスミドpKNOCK-Cm::fabBを得た。
PCR反応で増幅された752bpのfabB遺伝子DNA断片を、予め制限酵素Sma Iで処理した開環プラスミドpKNOCK-Cmに結合し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する接合伝達可能な（mobilizable）組み換えプラスミドpKNOCK-Cm::fabBを得た。
（４）接合伝達法による遺伝子導入と形質転換
pKNOCK-Cm::fabBを用いて、定法により大腸菌BW20767株（ATCC47084株）を形質転換した。その形質転換株を遺伝子供与体とし、クロラムフェニコールを含む栄養培地でOD600が0.2になるまで、37℃で培養した。遺伝子受容体であるIK-1株は、マリンブロス培地で、OD600が1.0になるまで、20℃で培養した。既報（Fukuchi, J., et al. (2002) JAMSTECR 46, 157-161）に従って、大腸菌からIK-1株へ接合伝達を行い、導入されたpKNOCK-Cm::fabBがIK-1株細胞内でIK-1株fabB遺伝子と相同組換えを起こし、結果としてゲノムDNA上のIK-1株fabB遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され薬剤耐性となったIK-1株の形質転換株を選抜した（図１）。fabBホモログ遺伝子において相同組換えが起こったことは、ゲノムDNAに存在するfabBホモログ遺伝子に対応するプライマーを用いたPCRを行うことによって確認した。
pKNOCK-Cm::fabBを用いて、定法により大腸菌BW20767株（ATCC47084株）を形質転換した。その形質転換株を遺伝子供与体とし、クロラムフェニコールを含む栄養培地でOD600が0.2になるまで、37℃で培養した。遺伝子受容体であるIK-1株は、マリンブロス培地で、OD600が1.0になるまで、20℃で培養した。既報（Fukuchi, J., et al. (2002) JAMSTECR 46, 157-161）に従って、大腸菌からIK-1株へ接合伝達を行い、導入されたpKNOCK-Cm::fabBがIK-1株細胞内でIK-1株fabB遺伝子と相同組換えを起こし、結果としてゲノムDNA上のIK-1株fabB遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され薬剤耐性となったIK-1株の形質転換株を選抜した（図１）。fabBホモログ遺伝子において相同組換えが起こったことは、ゲノムDNAに存在するfabBホモログ遺伝子に対応するプライマーを用いたPCRを行うことによって確認した。
（５）IK-1株形質転換株におけるEPAの割合
pKNOCK-Cm::fabBで形質転換したIK-1株を20℃で26時間培養した。細胞を回収し、10%塩化アセチル・メタノール溶液で100℃、３時間メタノリシス（methanolysis）した。ヘキサンによって脂肪酸メチルエステルを回収し、これをガスクロマトグラフィにより分析した。形質転換株の脂肪酸組成は、野生株の脂肪酸組成とは異なり、ヘキサデカン酸（16:0）、ヘキサデセン酸（16:1）、ヘプタデカン酸（17:0）、ヘプタデセン酸（17:1）、オクタデセン酸（18:1）の減少及びテトラデカン酸（14:0）およびEPAの増加が認められた（表１）。このとき、野生株のEPAの全脂肪酸に対する割合は8％だったが、形質転換株のEPAの全脂肪酸に対する割合は18％だった。
pKNOCK-Cm::fabBで形質転換したIK-1株を20℃で26時間培養した。細胞を回収し、10%塩化アセチル・メタノール溶液で100℃、３時間メタノリシス（methanolysis）した。ヘキサンによって脂肪酸メチルエステルを回収し、これをガスクロマトグラフィにより分析した。形質転換株の脂肪酸組成は、野生株の脂肪酸組成とは異なり、ヘキサデカン酸（16:0）、ヘキサデセン酸（16:1）、ヘプタデカン酸（17:0）、ヘプタデセン酸（17:1）、オクタデセン酸（18:1）の減少及びテトラデカン酸（14:0）およびEPAの増加が認められた（表１）。このとき、野生株のEPAの全脂肪酸に対する割合は8％だったが、形質転換株のEPAの全脂肪酸に対する割合は18％だった。
Claims (2)
- 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化し、該微生物を培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の製造方法であって、
脂肪酸合成酵素遺伝子がfabBであり、
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であり、
高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸である、
前記製造方法。 - 高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物の飽和及びモノ不飽和脂肪酸合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を不活性化することにより得られる、高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質の生産量が前記遺伝子の不活性化しない前記微生物に比較して増加した、高度不飽和脂肪酸産生微生物であって、
高度不飽和脂肪酸又は高度不飽和脂質がエイコサペンタエン酸であり、
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、シェワネラ・マリンインテスティナ（Shewanella marinintestina）であり、不活性化した脂肪酸合成酵素遺伝子が、fabBである、受託番号FERM P-21351として寄託されている、
前記高度不飽和脂肪酸産生微生物。
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