KR101171406B1 - 시료 내의 ｐｕｆａ?ｐｋｓ 동정을 위한 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 예를 들면, 바이오매스(biomass), 특히 미생물과 같은 시료 내의 PUFA-PKS 유전자(PUFA: 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acids; PKS: 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase))를 신속하고 간단하게 동정하는 방법을 기술한다. 이는 PUFA를 생산하는 PKS에 대해 특이적인 DNA 조각을 생체 밖에서 복제하는 것에 특징이 있다. 본 발명은 또한, 그것의 증식을 위한 실험적 조건을 확립하여, 적절한 DNA 서열을 동정하는 것에 기초한다.
Description
본 발명에서는 예를 들면, 바이오매스(biomass), 특히 미생물과 같은 시료 내의 PUFA-PKS 유전자(PUFA: 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acids; PKS: 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase))를 신속하고 간단하게 동정하는 방법을 기술한다. 이는 PUFA를 생산하는 PKS에 대해 특이적인 DNA 조각을 생체 밖에서 복제하는 것에 특징이 있다. 본 발명은 또한, 그것의 증식을 위한 실험적 조건을 확립하여, 적절한 DNA 서열을 동정하는 것에 기초한다.
PUFAs(polyunsaturated fatty acids:고도불포화지방산)이라는 용어는 탄소원자 12개 이상의 사슬 길이를 가지고, 적어도 두 개의 이중결합을 갖는 다중 불포화된 긴-사슬 지방산을 의미한다. PUFA의 두 개의 주요 패밀리로는 오메가-3와 오메가-6 지방산이 있는데, 이들은 알킬 말단에 대한 첫 번째 이중 결합의 위치에 따라 나뉜다. 이는 세포막의 주요성분으로, 지질, 특히 인지질의 형태로 존재한다. PUFAs는 또한 사람과 동물 내에서 프로스타글란딘(prostaglandins), 로이코트리엔(leukotrienes), 프로스타싸이클린(prostacyclins)과 같은 중요한 분자의 예비 단계로서 작용한다(A.P. Simopoulos, essential fatty Acids in health and chronic disease, Am. J. Clin. Nutr. 1999(70), pp. 560-569). 오메가-3 지방산의 중요한 대표적 물질로는 도코사헥사에논산(docsahexaenoic acid:DHA)과 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic aid:EPA)가 있는데, 이는 어류 오일과 해양 미생물에서 발견될 수 있다. 오메가-6 지방산의 주요 대표적 물질로는 아라키돈산(arachidonic acid:ARA)이 있는데, 그것은 예를 들면, 단섬유 균류에서 발견되지만, 또한 간과 콩팥과 같은 동물 조직으로부터 분리할 수도 있다. DHA와 ARA는 사람의 모유 내에서 서로 근접하여 발견된다.
PUFAs는 인간의 적절한 성장과 관련하여, 특히 뇌의 발달, 조직 형성 및 그것의 회복을 위해 필수적이다. 이와 같이, DHA는 사람 세포막, 특히 신경의 주요 성분이다. 더구나, DNA는 뇌 기능의 발달에 있어서 중요한 역할을 하며, 시력의 발달에 있어서도 필수적이다. DHA와 EPA 등의 오메가-3 PUFAs는 영양 보충제로 사용되는데, DHA의 충분한 공급에 의한 균형잡힌 영양상태가 특정 질병을 예방하는데 있어서 유익하기 때문이다(A.P. Simopoulos, Essential fatty acids in health and chronic deseasee, American Journal of Clinical Nutrition 1999(70), pp. 560-569). 예를 들면, 인슐린-비의존성 당뇨병을 가진 성인에게서는 DHA의 결핍이 나타나거나, 또는 적어도 후에 심장병 문제 발생과 관계가 있는 DHA의 불균형이 나타난다. 이와 같이, 알츠하이머 또는 정신분열증과 같은 신경 질환도 낮은 DHA 레벨을 동반한다. DHA를 상업적으로 추출하기 위한 수많은 공급원으로는, 해양 냉수어의 오일, 난황 조각 또는 해양 미생물 등이 있다. n-3 PUFA의 추출에 적합한 미생물로는, 비브리오(예를 들면, Vibrio marinus) 속의 박테리아 또는 편조류(Dinophyta)가 있고, 특히 C. cohnii와 같은 크립테코디니움(Crypthecodinium) 속, 또는 글로소마스틱스(Glossomastix), 파에오모나스(Phaeomonas), 핑귀오키리시스(Pinguiochrysis), 핑귀오코쿠스(Pinguiococcus) 및 폴리포도크리시스(Polypodochrysis)와 같은 핑귀오피세(Pinguiophyceae)와 같은 스트라메노필레스(또는 라비린툴로미코타(Labyrinthulomycota)) 등이 있다. PUFA 생산을 위한 다른 바람직한 미생물로는 트라우스토키트리알레스(트라우스키트리이데아) 목(目), 자포노키트리움(Japonochytrium), 치조키트리움(Schizochytrium), 트라우스토키트리움, 알쏘니아(Althornia), 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides), 아플라노키트리움(Aplanochytrium) 및 울케니아(Ulkenia)가 있다. 모리텔라(Moritella) , 엔토모프토라(Entomophthora), 피지움(Phytium) 및 포르피리디움(Porphyridium) 속의 미생물은 ARA의 상업적 생산을 위해 사용된다.
PUFA의 공급원으로는 식물 또는 동물이 상업적으로 사용되는데, 그것으로부터 추출된 오일은 종종 매우 이질적인 조성에 의해 특징화된다. 이런 방법으로 추출된 오일은 하나 또는 여러 개의 PUFAs를 풍부하게 하기 위해 고가의 정제 과정을 필요로 한다. 그러한 공급원으로부터의 PUFA의 공급은 또한 조절되지 않는 변동에 당면하게 된다. 그래서, 질병과 날씨 영향이 동물과 또한 식물 산출을 감소시킬 수 있다. 어류로부터의 PUFA의 추출은 계절 변동에 영향을 받기 쉬우며, 또한 물고기 남획이나 기온의 변동(예를 들면, Nino) 때문에 일시적으로 급격히 감소될 수 있다. 동물 오일, 특히 물고기 오일은 먹이 사슬에 의한 환경으로부터 유해 물질이 축적될 수도 있다. 동물은 폴리염화비페닐과 같은 유기염소에 의해 급격한 스트레스를 받는다고 알려져 있는데, 특히 상업적으로 양식장에서 물고기 소비의 측면에서 건강을 해친다(Hites et al. 2004, Global assessment of organic contaminants in farmed salmon, Science 303, pp. 226-229). 물고기 생산의 질에서 결과적 손실은, 오메가-3 PUFA 공급원으로서의 어류와 어류 오일에 대한 소비자의 감소된 수용이라는 결과를 가져온다. 더구나, 어류로부터의 DHA 정제는 상대적으로 고도 기술 장비를 요구하므로 값이 비싸다. 반면, 세포의 총 지방 조성의 대략 50%양의 몇몇 해양 미생물 내에 존재하는 DHA는 큰 발효조에서 상대적으로 경제적으로 배양할 수 있다. 미생물의 다른 장점은 그로부터 추출한 오일의 조성은 몇몇 조성으로 한정된다는 것이다.
긴-사슬 PUFA의 생합성을 위한 두 개의 서로 다른 생촉매 경로가 알려져 있다. Sprecher Pathway라고 불리는 경우, DHA와 EPA와 같은 긴 사슬 PUFAs는 연장과 불포화 단계 및 종료 단축화의 흐름을 거쳐, 팔미트산으로부터 합성된다(H. Sprecher, Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids. Biochimica et Biophysica Acta 1486(2000) pp. 219-231). 이러한 생합성 경로는 대부분의 미생물, 심지어 사람과 식물에서도, 기술한 바와 같이 또는 비슷한 방법으로 수행된다. 그러나 어떤 해양 미생물은 EPA와 DHA 생산에 있어서 다른 생합성 경로를 수행한다. 이러한 PUFA-생산 미생물에는 대표적으로 감마 프로테오박테리아와 현재까지는 진핵 원생생물인 치조키트리움을 포함한다. 그들은 긴-사슬 PUFA를 polyketide synthases(PKS)라고 불리는 경로를 통하여 합성한다. 이러한 PKSs는 케타이드(ketide) 단위를 포함하는 2차 대사산물의 합성을 촉매하는 거대 효소이다(G.W. Wallis, J.L. Watts and J. Browse, Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next? Trends in Biochemical Sciences 27(9) (2000) pp. 467-473). 폴리케타이드의 합성은 수많은 효소 반응을 포함하데, 이는 그러한 지방산 합성과 유사하다(Hopwood & Sherman Annu. Rev. Genet. 24(1990) pp. 37-66; Katz & Donadio Annu. Rev. of Microbiol. 47 (1993) pp. 875-912).
서로 다른 PUFA-PKSs(PIFA-합성 PKSs)의 유전자 서열은 이미 알려져있다. 그래서, 해양 미생물 슈와넬라 종으로부터 추출된 38 kb 유전자 단편은 아이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid;EPA)의 생산에 대한 정보를 포함한다. 그것은 게놈 단편에 포함된 유전자 클러스터를 이동시킴으로써 E.coli와 Synechoccus에서의 EPA의 생산을 가능하게 했다. 그 후, 이러한 단편의 시퀀싱은 8개의 해독프래임(open reading grames(ORFS))의 동정으로 귀착되었다(H. Takeyama et al., Microbiology 143(1997) pp. 2725-2731). 슈와넬라의 이러한 5 개의 해독틀은 폴리케타이드 합성 유전자와 매우 관련이 있다. 더구나 PKS와 같은 유전자 클러스터는 또한 PUFA를 생산하는, 비브리오 마리누스(Vibrio marinus)와 같은 다른 해양 박테리아에서도 발견된다(M. Tanaka, et al. 21 (1999) pp. 939-945). 유사 PUFA-생산, PKS-같은 ORFs 또한 진핵 원생생물 치조키트리움에서 동정될 수 있었다(Metz et al. Science 293 (2001) pp. 290-293 and WO 00.42195). 치조키트리움에서 결정된 3 개의 ORFs는 부분적으로 슈와넬라의 EPA 유전자 클러스터와 동일하다. 몇몇 원핵생물과 진핵생물 치조키트리움에 보존되고 있는 PKS 유전자의 존재는 pro- 와 진핵생물 사이의 PUFA-PKS의 균일한 유전자 이동의 가능성에 대한 암시를 제공한다.
독립적인 종들 간의 PKS의 분배에 대해 현재 알려진 것은 거의 없다. 그래서, 예를 들면 치조키트리움의 경우는 DHA가 풍부한데, 치조키트리움과 계통 발생론적으로 가까운 해양 원생생물인 트라우스토키트리움 종에서는 PKS를 전혀 발견할 수 없다. 다른 것들 중에서는, 좀처럼 델타-4 디세추레이즈(desaturase)를 좀처럼 사용하지 않으면서, 긴-사슬 PUFA를 생산한다. 트라우스토키트리움과 치조키트리움 둘다, 트라우스토키트리알 목에 속하지만, 긴-사슬 PUFA 생산을 위한 생합성 경로는 아주 다르다. 그래서 해양 미생물에서 PUFA-PKS 유전자의 분류를 확정하고자 하는 큰 관심이 있었는데, 특히 상업적 규모로 개별적인 PUFAs의 생산을 가능하게 하기 위한 새로운 잠재적인 PUFA 생산자의 발견과 관련하여 큰 관심이 있었다. 게다가, PUFA 생산자에 대한 고도의 작업량으로 수많은 해양 미생물을 조사하기 위한 효율적인 스크리닝 방법이 현재 필요하다. 더구나, 수많은 서로 다른 PUFA-PKS에 대한 지식은 유전자 배열과 상응하는 효소의 구조, 그리고 서로다른 PUFAs의 생산에 대한 정보를 제공해야 한다. 많은 다른 출원, 예를 들면 미생물 또는 식물로의 유전자도입에 의한 PUFA의 생산에 대한 출원이 특히 중요하다. 서로 다른 PUFA 조합을 가지는 설계 오일은 유전자 변이에 의한 유전자 도입에 의해 생산될 수 있다.
국제 특허 출원 공개 WO 02/083870 A2는 PUFA-PKS 유전자를 포함하는 미생물을 동정하는 방법에 대해 개시하고 있다. 한편, 여기에서는 지방산 스펙트럼에 관한 5개의 선별 기준에 기초를 두고 있는데, 그것은 PUFA-PKS 시스템에 대한 지침으로 작용하기 위한 특정 배양 조건을 제공한다. 더 많은 선별 기준은, PUFA-PKS 시스템을 위한 더 강한 시도를 충족한다. 한편, 그것은 제한효소로 절단된 유전자 DNA의 블럿 막에서의 이동을 분석하는 것에 기초를 두고 있는데, 이는 PUFA-PKS-특이 핵산 서열을 가질 것으로 추정되는 PUFA-PKS 후보(5개의 선별 기준을 만족하는)와 혼성화된다. 이것은 그 후에, 유전자 DNA 은행의 스크리닝에 대한 결과의 확인을 위해 전형적으로 구체화된 두 번째 검출 단계로 확대된다. 또한, 특허 출원 WO 02/083870은 상기 언급된 스크리닝 방법에 대한 사전 선택으로서 적절한 미생물의 부유와 선별을 위한 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나, WO 02/083870 A2에서 개시하고 있는 스크리닝 방법은 당해 기술 분야에 있어서 매우 비싸기 때문에, 고수율 스크리닝을 위해서는 적절하지 못하다. 더구나, 첫 번째 스크리닝 단계에서의 선별 요소의 평가가 매우 모호하여서, 두 번째 스크리닝 단계에서의 부정적인 결과를 가져올 수 있다.
본 발명에서는 그래서, 그 기술분야의 관점에서, 서로 다른 미생물 내에 있는 PUFA-PKS 유전자를 동정하기 위한 방법을 가능하게 하고자 하였다. 그 방법은 미생물을 효율적으로, 경제적으로, 그리고 단시간 내에 광범위하게 스크리닝할 수 있도록 하여야 한다. 그 스크리닝은 비싼 시료의 준비 없이도 고수율이 가능해야 한다.
이러한 과제는 다른 것에 명백히 언급된 것은 아니지만, 명세서의 초기에 언급된 문헌으로부터 손쉽게 유도하거나 결론지을 수 있는 것으로, 본 발명의 청구항으로부터 그 문제는 해결된다.
미생물에서 PUFA-PKS 유전자를 동정하기 위한 유리한 방법은 청구항 1에서 정의된 방법에 의한 것이다. 이 방법은 생체 밖에서, 시료, 바람직하게는 바이오매스, 특히 미생물로부터 유래된 핵산을, 아미노산 연속물 LGIDSIKRVEIL(서열번호 5)로부터 변성된 올리고뉴클레오타이드(프라이머)를 사용하여 PCR을 하여 증폭하는 것을 포함한다. 아미노산 연속물 LGIDSIKRVEIL(서열번호 5)은 예를 들면, 서열 연속물 5'-CTC GGC ATT GAC TCC ATC AAG CGT GTC GAG ATT CTC-3' (서열번호 6)로 나타낼 수 있다. 여기에 개시된, 본 발명에 따른 변성된 프라이머의 사용은, PUFA-생산 미생물에서의 PKS 유전자 단편의 동정을 가능하게 한다.
발명에 따른 방법은, 놀랍게도 상기 언급된 아미노산 서열 조각으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드를 만든다. 또한 놀랍게도, 많은 N 염기, 예를 들면 이노신(inosines)을 포함하는 무거운 변성된 올리고뉴클레오타이드가 대부분 조제될 수 있다.
본 발명의 방법은 PUFA-PKS 유전자를 증폭하고 동정하기 위해, 상기에서 언급된 아미노산 서열 LGIDSIKRVEIL(서열번호 5)로부터 유래될 수 있는 모든 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 그 올리고뉴클레오타이드의 선별은 선택된 부분 서열의 길이와 그것의 배향(센스 또는 안티센스 또는 상보성 또는 비상보성)에 영향을 받지 않는다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 10-36 bp, 바람직하게는 15-25 bp 그리고 특히 바람직하게는 18 bp 길이의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오타이드의 사용양은 존재하는 PUFA-PKS의 검출 방법에 대한 부정적 영향이 없는 한, 다양하게 사용될 수 있다. 이는 또한 PCR 반응에서 다른 조성과 함께 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드와 혼성하는 결합 온도는 45 내지 65 ℃, 바람직하게는 50 내지 60 ℃ 그리고 특히 바람직하게는 53 내지 57 ℃에서 수행한다.
개별적인 PCR을 하는 동안, 변성, 결합, 그리고 연장의 지속시간은 현재 PUFA-PKS를 검출하는 방법에 있어서 부정적 영향이 없는 한, 매우 다양하게 수행할 수 있다.
PCR 순환은 매우 다양하게 수행할 수 있으나, 바람직하게는 20 내지 40, 더 바람직하게는 25 내지 35, 특히 바람직하게는 30회 할 수 있다.
mRAN로부터 생산된 cDNA뿐만 아니라 미생물로부터 단리된 모든 DNA와 RNA 핵산은 PCR의 주형으로 사용될 수 있다. 구체적 양태에서, 세포 또는 바이오매스는 또한 PCR의 주형으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 핵산 을 검출하는 혼성화 프로브로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 미생물의 PUFA-PKS 유전자를 고수율로 스크리닝함에 있어서 적절하다.
따라서, 본 발명은 제 9항에 따른 핵산 서열을 혼성화 프로브로 이용하거나 또는 제 1항 내지 제 7항의 방법으로 얻을 수 있는 핵산을 제공한다. 제 11항에 따른 핵산을 포함하는 미생물 또한 제공한다.
PUFA-생산 미생물에 대한 큰 요구에도 불구하고, 본 발명 이전에 PUFA-PKS-포함 미생물 동정에 대한 PCR에 기초한 효과적인 검출 방법으로 알려진 것은 없었다. Gentile et al. 의 논문에서 PUFA-PKS의 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드의 사용 가능성에 대해 개시하였으나; 그 올리고뉴클레오타이드는 ACP 도메인 또는 아미노산 서열 LGIDSIKRVEIL로부터 유래된 것이 아니었다(Gentile et al. 2003 J. Appl. Microbiol. (95) pp. 1124-1133).
다중 카피에 있어서 이미 서열 부분(PKS의 APC 도메인)의 증폭은 여기에 개시된 PCR 방법의 고효율에 기초한 것이라 추측된다. PCR 개시에 있어서의 수많은 목표 서열이 있다는 것은 효율성 증가라는 결과를 가져온다. 그 부분에 대한 이러한 결과는 스크리닝을 하는 동안 높은 비율이다. 그러나, 특히 PUFA-PKS 유전자가 아미노산 서열 LGIDSIKRVEIL로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드의 도움으로 분리될 수 있다는 것은 매우 놀라운데, 이는 APC 도메인이 다른 수많은 유전자, 예를 들면, 일반적으로 펩타이드 합성효소와 지방산 합성효소뿐만 아니라 PUFA에 대해 특이적이지 않은 PKS에서 꽤 나타나기 때문이다. 이는 또한 LGIDSIKRVEIL 서열로부터의 올리고의 유래에 대한 PUFA-PKS 유전자의 클로닝 테스트는 이전에 시도된 적이 없는 다른 관점의 것이다.
반면, 현재까지의 PUFA 생산자의 동정을 위한 바이오마커는 훨씬 시간이 소요되고 불확실한 것이었다(D.S. Nichols and T.A. McMeekin 2002 J. Microbiol. Methods 48 (2-3), pp. 161-170).
도 1은 모리텔라 마린(Moritella marina), 포토박테리움 프로펀덤(Photobacterium profundum )(SS9 계통) 및 치조키트리움(Schizochytrium)의 PUFA-PKS로, 이전에 알려진 아실 운반 단백질의 위치와 수를 비교한 것을 나타낸 것이다. 보존된 서열 LGIDSIKRVEIL의 수많은 반복을 보여준다.
도 2는 LGIDSIKRVEIL 서열, 울케니아 종. SAM 2179, 치조키트리움의PUFA-PKS로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드로 증폭한 PCR 산물(ACP 도메인)의 상동 서열을 나타낸다.
본 발명에 따른 방법에 기초한 검출 방법은 아래의 몇몇 시료를 사용하여 기술되었다. 그러나 그 검출 방법과 본 발명은 이러한 시료에 한정되지 않는다.
실시예
1:
울케니아
종
SAM2179
로부터 분리된 DNA의
PUFA
-
PKS
-특이 서열의 증폭
1.1 유전자
DNA
의 분리
50 ml DH1 배지(50 g/l 글루코오스; 12.5 g/l 효모 추출물; 16.65 g/l Tropic Marin; pH 6.0)를 250 ml 삼각플라스크에 흐름막이를 사용하여 울케니아 종. SAM 2179(Ulkenia spec BP-5601; WO9803671)와 섞어넣고, 28 ℃, 150 rpm에서 48 시간 동안 배양한다. 그리고 세포를 계속적으로 수돗물에서 세척하여 원심분리하고, -85 ℃에서 세포 침전물을 냉동시킨다. 대략 1.25 g 건조 중량의 세포 입자를 얻을 수 있다. 세포 침전물의 정밀 검사를 위해, 막자사발에 옮기고 액체 질소를 넣고 막자로 빻아, 고운 가루로 분쇄한다. 그리고 나서, 가루로 만들어진 세포 물질의 대략 1/10th를 2 ml 용해 버퍼 (50 mM tris/Cl pH 7.2; 50 mM EDTA; 3% (v/v) SDA; 0.01% (v/v) 2-머캅토에탄올)와 혼합하고, 68 ℃에서 1시간 동안 2 ml의 페놀/클로로폼/이소아밀알콜(25:24:1)를 계속적으로 첨가하면서 배양하면서 흔든 다음, 10000 rpm에서 20분 동안 원심분리시킨다. 상층의 액상을 제거한 후, 600 ㎕ 의 새로운 반응 용기로 각각 옮기고, 각각에 페놀/클로로폼/이소아밀알콜(25:24:1)를 혼합하여, 흔든 다음 13000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시킨다. 각각의 상층액 400 ㎕를 새로운 반응 용기에 옮기고, 1 ml 에타놀(100%)을 매번 첨가하면서 2번 내지 3번 전화시킨다. 그리고나서, 침전된 DNA를 유리 막대기로 감아서, 70% 에탄올로 세척하여 건조시키고, 50 ㎕ H2Odist에 2 ㎕ RNase A와 혼합하여 용해시키고, 4℃에서 보관한다.
1.2 모티브-특정
올리고뉴클레오타이드를
사용하는
PCR
반응
PCR 프라이머 MOF1와 MOR1를 모티브-특정 올리고뉴클레오타이드로 사용하였다.
MOF1: 5'- CTC GGC ATT GAC TCC ATC- 3'(서열번호 7)
MOR1: 5'- GAG AAT CTC GAC ACG CTT- 3'(서열번호 8)
1.1 에서 기술한 울케니아 종. SAM2179로부터 얻은 DNA는 1:100로 희석한다.
이 희석된 용액의 2 ㎕ 는 50 ㎕ 부피의 PCR 반응 혼합물(1 x 버퍼 (시그마; dNTPs (각 200 μM); MOF1 (20 pmol), MOR1 (20 pmol)과 2.5U Taq-DNA 중합효소 (Sigma)로 옮긴다. PCR은 아래의 조건에서 수행된다: 처음 변성은 94 ℃에서 3분, 94 ℃에서 1분 동안, 각각 30 회를 계속적으로 수행하고, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분, 그리고 마지막으로 72 ℃에서 8분 동안 수행한다. PCR 산물은 겔 전기영동으로 분석하고, 적절한 크기의 단편은 벡터 pCR2.1 TOPO에 T/A 클로닝(Invitrogen)한다. E. coli TOP 10F' 형질변환시킨 뒤, 플라스미드 DNA를 분리하고 (Qiaprep Spin, QUAGEN) 서열화한다.
얻어진 서열 데이터(서열번호 1)를 공식적으로 얻은 EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)와 비교하고 평가하였다. 울케니아 종. SAM 2179의 주요 PCR 산물에 대해 FASTAX로 얻은 비교 서열을 얻었는데, 이는 치조키트리움 종. ATCC 20888 (도 7)로부터 PUFA-PKS(ORF A; ORF: 열린 해독틀)의 아실 운반 단백질과 부분적으로, 아미노산 레벨에서 대략 90% 동일하다. 울케니아 종. SAM 2179에서의 PUFA-PKS를 검출하기 위해 한 번의 PCR 실험만 수행하는 것은 놀라운 일이다.
실시예
2:
치조키트리움
종.
SR21
로부터 분리한
DNA
로부터의
PUFA
-
PKS
-특이 서열 증폭
2.1 유전자
DNA
의 분리
50 ml DH1 배지(50 g/l 글루코오스; 12.5 g/l 효모 추출물; 16.65 g/l Tropic Marin; pH 6.0)를 250 ml 삼각플라스크에 흐름막이를 사용하여 치조키트리움 종. SR21((Schizochytrium spec., MYA-1381; EP0823475)와 섞어넣고, 48 시간 동안 28 ℃, 150 rpm에서 배양한다. 그리고 세포를 수돗물에서 두 번 세척하여, 원심분리하고, -85 ℃에서 세포 침전물을 냉동시킨다. 대략 1.4 g 건조 중량의 세포 입자를 얻을 수 있다. 그리고 나서, 세포 침전물의 정밀 검사를 위해 이를 막자사발에 옮기고, 유전자 DNA를 분리하기 위하여 실시예 1에서 기술한 바와 같이 한다.
2.2 모티브-특이
올리고뉴클레오타이드를
이용한
PCR
반응
PCR 프라이머 MOF1와 MOR1(실시예 1을 보라)를 모티브-특정 올리고뉴클레오타이드로 사용하였다.
1.2에서 기술한 바와 같이, 치조키트리움 SR21의 유전자 DNA 2에 대해 PCR을 수행한다.
얻어진 서열 데이터(서열번호 2)를 공식적으로 얻은 EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)와 비교하고 평가하였다. 치조키트리움 종. SR 21의 주요 PCR 산물에 대해 FASTAX로 얻은 비교 서열을 얻었는데, 이는 치조키트리움 종. ATCC 20888로부터 PUFA-PKS(ORF A; ORF: 열린 해독틀)과 아 실 운반 단백질과 부분적으로, 아미노산 레벨에서 대략 90% 동일하다. 치조키트리움. SR 21에서의 검출을 위해 PUFA-PKS를 검출하기 위해 한 번의 PCR 실험만 수행하는 것은 놀라운 일이다.
실시예
3:
SR21
의
바이오매스로부터
직접적인
PUFA
-
PKS
-특이적 서열의 증폭.
3.1
바이오매스의
획득
50 ml DH1 배지(50 g/l 글루코오스; 12.5 g/l 효모 추출물; 16.65 g/l Tropic Marin; pH 6.0)를 250 ml 삼각플라스크에 흐름막이를 사용하여 치조키트리움 종. SR21와 섞어넣고, 28 ℃, 150 rpm에서 48 시간 동안 배양한다. 그리고 세포를 수돗물에서 두 번 세척하여, 원심분리한다. 이런 방법으로 얻은 바이오매스는 PCR 반응에 직접적으로 첨가한다.
3.2 모티브-특이적
올리고뉴클레오타이드를
사용한
PCR
반응
PCR 프라이머 MOF1와 MOR1(실시예 1을 보라)를 모티브-특정 올리고뉴클레오타이드로 사용하였다.
3.1에서 얻은 치조키트리움 종. SR21의 바이오매스의 일부를 살균한 이쑤시게로 잡아올려서 부피 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물(1 x 버퍼 (시그마; dNTPs (각 200 μM); MOF1 (20 pmol), MOR1 (20 pmol)과 2.5U Taq-DNA 중합효소 (Sigma)로 옮긴다. 그리고 1.2에서 기술한 바와 같이 PCR을 수행한다.
얻어진 서열 데이터(서열번호 2)를 공식적으로 얻은 EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)와 비교하고 평가하였다. 치조키트리움 종. SR 21의 주요 PCR 산물에 대해 FASTAX로 얻은 비교 서열을 얻었는데, 이는 치조키트리움 종. ATCC 20888로부터 PUFA-PKS(ORF A; ORF: 열린 해독틀)과 아실 운반 단백질과 부분적으로, 아미노산 레벨에서 대략 90% 동일하다.
치조키트리움의 바이오매스로부터 얻은 PCR 산물의 서열은 실시예 2에서 얻은 것과 동일하다.
치조키트리움. SR 21의 바이오매스로부터 PUFA-PKS를 검출하기 위해 단 한번의 PCR 실험만 수행하는 것은 놀라운 일이다.
실시예
4: 서로 다른
울케니아의
바이오매스로부터의
직접적인
PUFA
-
PKS
-특이적 서열의 증폭.
4.1
바이오매스의
획득
50 ml DH1 배지(50 g/l 글루코오스; 12.5 g/l 효모 추출물; 16.65 g/l Tropic Marin; pH 6.0)를 250 ml 삼각플라스크에 흐름막이를 사용하여 울케니아 종. SAM 2179 또는 울케니아 비서제니스(Ulkenia visurgensis) 또는 다른 울케니아 종과 함께 넣고, 28 ℃, 150 rpm에서 48 시간 동안 배양한다. 그리고 세포를 수돗물에서 두 번 세척하여, 원심분리한다. 이런 방법으로 얻은 바이오매스는 적절한 PCR 반응에 직접적으로, 계속적으로 첨가한다.
4.2 모티브-특이적
올리고뉴클레오타이드를
사용한
PCR
반응
PCR 프라이머 MOF1와 MOR1(실시예 1을 보라)를 모티브-특정 올리고뉴클레오타이드로 사용하였다.
4.1에서 얻은 서로 다른 울케니아 바이오매스의 일부를 살균한 이쑤시게로 잡아올려서 각각 부피 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물(1 x 버퍼 (시그마; dNTPs (각 200 μM); MOF1 (20 pmol), MOR1 (20 pmol) 그리고 2.5U Taq-DNA 중합효소 (Sigma)로 옮긴다. 그리고 1.2에서 기술한 바와 같이 중합연쇄반응(PCR)을 수행한다.
얻어진 서열 데이터(서열번호 1, 3, 4)를 공식적으로 얻은 EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)와 비교하고 평가하였다. FASTAX 산물로 얻은 비교서열은 치조키트리움 종. ATCC 20888의 PUFA-PKS(ORF A; ORF: 열린 해독틀)의 아실 운반 단백질과 굉장히 부분적으로 동일하였다. 울케니아 종. SAM 2179의 바이오매스로부터 얻은 PCR 산물의 서열은 실시예 1에서 얻은 것과 동일하다.
서로 다른 울케니아 바이오매스의 특정 PUFA-PKS를 검출하기 위해, 각각단 한번의 PCR 실험만 수행하는 것은 놀라운 일이다.
<110> Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
<120> Screening method for the Identification of PUFA-PKS in Samples
<130> IPA9610-697
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> Ulkenia sp.
<400> 1
ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctctg aggtccaggc tatgcttaac 60
gttgaggcca aagatgttga tgctcttagc cgcacccgca ccgttggtga ggttgtcaac 120
gccacgaagg ctgagattgc tagcagctct ggtgctgctg cccctgctcc ggctgctgcc 180
gttgcaccgg cccctgctgc tgcccctgct gtcagcagcg ctctccttga gaaggccgaa 240
tctgttgtca tggaggttct cgccgccaag actggttacg agactgacat gattgaggcc 300
gacatggagc tcgagactga gctcggcatt gactccatca agcgtgtcga gattctc 357
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (149)
<223> n stands for any base
<400> 2
ctcggcattg actccatcaa gctggtcgag attctctctg aggtccaggc tatgcttaac 60
gttgaggcca aggatgttga tgctcttagc cgcacccgca ccgttggtga ggttgtcaac 120
gccatgaagg ctgagattgc tagcagctnt ggtgctgctg cccctgctcc tgctgctgcc 180
gctgcaccgg cccctgctgc tgcccctgct gtcagcagcg ctctccttga gaaggccgaa 240
tctgttgtca tggaggttct cgccgccaag actggttacg agactgacat gattgaggcc 300
gacatggagc tcgagactga g 321
<210> 3
<211> 372
<212> DNA
<213> Ulkenia visurgensis
<400> 3
ctcggcattg actccatcaa acgtgtcgag atcctcagtg aggtgcaggc caagctgaac 60
gtagaggcca aagacgtcga tgcactcagc cgcactcgta ccgtaggtga ggtcgtcgac 120
gcaatgaagg ccgagataca aggatcgccg agtgggtctc ctgctcctcc aaatgctccg 180
aaactgtcta gcccagtctc atccacacca gctccaacca agttaatctc aaccagcacg 240
ctagcaatgg ccgagtctgt ggttatggag gtccttgccg caaagactgg ctacgaaccg 300
gacatgatcg aggcggacat ggagctcgag accgagctcg gcattgactc catcaagcgt 360
gtcgagattc tc 372
<210> 4
<211> 372
<212> DNA
<213> Ulkenia sp.
<400> 4
ctcggcattg actccatcaa acgtgtcgag atcctcagtg aggtgcaggc caagctgaac 60
gtagaggcca aagacgtcga tgcactcagc cgcactcgga ccgtaggtga ggtcgtcgac 120
gcaatgaagg ccgagataca aggatcgccg agtggctctc ctgctcctcc aagtgctccg 180
aaactgtcta gcccagtctc atcctcacca gccccaacca agttaatctc aaccagcacg 240
ctagcaatgg ccgagtctgt ggttatggag gtccttgccg caaagactgg ctacgaaccg 300
gacatgatcg aggcggacat ggagctcgag actgagcttg gcattgactc catcaagcgt 360
gtcgagattc tc 372
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Ulkenia sp.
<400> 5
Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificail sequence
<400> 6
ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctc 36
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 7
ctcggcattg actccatc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 8
gagaatctcg acacgctt 18
Claims (12)
- (a) 시료의 일부를 주형으로 하여, 특정 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고,(b) 얻어진 PCR 산물을 서열화하고, 이미 알려진 서열과 부분적으로 동일한 새로운 PUFA-PKS 서열 정보를 동정하기 위해, 얻어진 서열 정보를 데이터은행과 비교하며,상기 단계 (a)에 사용된 올리고뉴클레오타이드가 LGIDSIKRVEIL 아미노산 서열로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 시료 내의 PUFA-PKS 유전자-특이적 핵산 서열을 결정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변성된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이가 10 내지 36 bp인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 사용된 올리고뉴클레오타이드의 양이 20 pmol인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 결합(annealing) 온도는 45 내지 65℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 순환 횟수는 20 내지 40회인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 바이오매스로부터 단리된 핵산 또는 바이오매스 그 자체가 PCR의 주형으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 6, 7 또는 8로 표시되는 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|
| KR1020067023438A KR101171406B1 (ko) | 2004-04-08 | 2005-04-08 | 시료 내의 ｐｕｆａ?ｐｋｓ 동정을 위한 스크리닝 방법 |
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