JP4555335B2 - 試料中のｐｕｆａ−ｐｋｓを同定するためのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えばバイオマスなどの試料ル中、特に微生物中のＰＵＦＡ ＰＫＳ遺伝子（ＰＵＦＡ＝ポリ不飽和脂肪酸；ＰＫＳ＝ポリケチドシンターゼ）を迅速かつ容易に同定するための方法を説明する。これは、ＰＵＦＡ生成ＰＫＳに特異的なＤＮＡ部分のｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製を特徴とする。本発明は、適切なＤＮＡ配列の同定の他に、それらを増加させるための実験条件の確立にも基づいている。

ＰＵＦＡ（ポリ不飽和脂肪酸）という用語は、鎖長がＣ１２より長くかつ少なくとも２つの二重結合を有する、多数連なった不飽和長鎖脂肪酸を意味する。ＰＵＦＡには、ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸という２種の主要なファミリーがあり、これらは、アルキル末端に対する最初の二重結合の位置によって異なっている。これらは、細胞膜の重要な成分であり、脂質、特にリン脂質の形態で存在している。ＰＵＦＡは、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびプロスタサイクリンなど、ヒトおよび動物において重要な分子の予備段階としても機能する（Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９９（７０）、５６０〜５６９頁）。ω−３脂肪酸のグループの重要な代表例は、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）であり、これらは魚油および海洋微生物中に見出すことができる。ω−６脂肪酸の重要な代表例は、例えば糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔａｒｙ ｆｕｎｇｉ）中に存在するが、肝臓や腎臓などの動物組織からも単離することができるＡＲＡ（アラキドン酸）である。ＤＨＡおよびＡＲＡは、ヒトの母乳中に共に存在する。

ＰＵＦＡは、適切な発育に関して、特に発達中の脳、組織形成およびその修復のために、ヒトにとって不可欠である。したがって、ＤＨＡは、ヒト細胞膜、特に神経の細胞膜の重要な成分である。さらに、ＤＮＡは、脳機能の成熟に重要な役割を果たし、視覚の発達に不可欠である。ＤＨＡの十分な供給を伴うバランスのとれた栄養物はいくつかの疾患の予防に有利であるため、ＤＨＡやＥＰＡなどのω−３ ＰＵＦＡは、栄養補給物として使用されている（Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １９９９（７０）、５６０〜５６９頁）。例えば、非インスリン依存性糖尿病の成人は、後で発生する心臓の問題に関係のある欠乏または少なくとも均衡を欠いたＤＨＡバランスを提示する。同様に、アルツハイマー病や精神分裂病などの神経性疾患は、低いＤＨＡレベルを伴っている。例えば、海洋冷水魚、卵黄部分、または海洋微生物に由来する油など、ＤＨＡを商業用に抽出するための多数の供給源がある。ｎ−３ＰＵＦＡの抽出に適した微生物は、例えば、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の細菌（例えば、ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ））において、または渦鞭毛藻類（渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ））、特に、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉなどのクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属において、または、例えば、グロッソマスチキス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）、ファエオモナス（Ｐｈａｅｏｍｏｎａｓ）、ピングイオクリシス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ピングイオコッカス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｏｃｃｕｓ）、およびポリポドクリシス（Ｐｏｌｙｐｏｄｏｃｈｒｙｓｉｓ）などのピングイオ藻綱（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）などのストラメノパイル（もしくはラビリンツラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）において見出される。ＰＵＦＡを製造するのに好ましい他の微生物は、特に、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属を含むヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）（ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｃｈｙｔｒｉｉｄｅａ））に属する。モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、フィチム（Ｐｈｙｔｉｕｍ）、およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属の微生物は、ＡＲＡの商業的製造に使用されている。

植物や動物などＰＵＦＡ用に商業的に使用される供給源は、しばしば、それらから抽出される油の極めて不均一な組成を特徴とする。この方式で抽出される油は、１種または数種のＰＵＦＡの濃縮を可能にするために高価な精製工程にかけられなければならない。このような供給源からのＰＵＦＡの供給は、制御不可能な変動も被る。すなわち、病害および気候の影響により、動物および同様に植物の収量が低減され得る。魚類からのＰＵＦＡの抽出は、季節的変動の影響を受け、また、乱獲または気候の変化（例えば、エルニーニョ現象）のために一時的に著しく限定されることさえある。動物油、特に魚油は、食物連鎖を介して、環境に由来する有害物質を蓄積し得る。動物は、特に商業的な養魚場において、魚消費の健康的な側面の効果を打ち消す、例えばポリ塩化ビフェニルなどの有機塩化物によって著しくストレスを加えられることが知られるようになった（Ｈｉｔｅｓ他、２００４年、Ｇｌｏｂａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｓａｌｍｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３、２２６〜２２９頁）。結果として魚製品の質が低下することにより、消費者は、魚および魚油をω−３ＰＵＦＡ供給源として受け入れないようになる。さらに、魚類からのＤＨＡの精製は、高度な技術を要するため、比較的高価である。一方、ＤＨＡは、数種の海洋微生物中に細胞の全脂肪成分の約５０％の量で存在し、これらの微生物は、大型発酵槽中で比較的経済的に培養することができる。微生物の別の利点は、数種の成分に限定されている、それらから抽出される油の組成である。

長鎖ＰＵＦＡの生合成に関して、２種の異なる生体触媒経路が知られている。いわゆるシュプレッヒャー（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ）経路の場合、ＤＨＡやＥＰＡなどの長鎖ＰＵＦＡは、パルミチン酸から開始し、一連の伸長および不飽和化工程、ならびに短縮の終結によって合成される（Ｈ．Ｓｐｒｅｃｈｅｒ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｎ−３ ａｎｄ ｎ−６ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４８６（２０００年）２１９〜２３１頁）。この生合成経路は、大半の生物において、ヒトおよび植物においてさえ、前述したようにまたは同様の方式で行われる。しかし、いくつかの海洋生物は、ＥＰＡおよびＤＨＡを生成するために異なる生合成経路を利用する。これらのＰＵＦＡ産生微生物としては、γプロテオバクテリア、および、現在までのところ、真核原生生物シゾキトリウムが挙げられる。これらは、いわゆるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって長鎖ＰＵＦＡを合成する。これらのＰＫＳは、ケチド単位からなる二次代謝産物の合成を触媒する大型酵素を表す（Ｇ．Ｗ．Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ．Ｌ．ＷａｔｔｓおよびＪ．Ｂｒｏｗｓｅ、Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｗｈａｔ ｗｉｌｌ ｔｈｅｙ ｔｈｉｎｋ ｏｆ ｎｅｘｔ？ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２７（９）（２０００年）４６７〜４７３頁）。ポリケチドの合成は、脂肪酸合成の酵素反応に類似したいくつかの酵素反応を含む（Ｈｏｐｗｏｏｄ＆Ｓｈｅｒｍａｎ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４（１９９０年）３７〜６６頁；Ｋａｔｚ＆Ｄｏｎａｄｉｏ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７（１９９３年）８７５〜９１２頁）。

様々なＰＵＦＡ-ＰＫＳ（ＰＵＦＡ合成ＰＫＳ）の遺伝子配列が既知である。すなわち、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生成するための情報を有する３８ｋｂのゲノム断片が、海洋細菌シュワネラ種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）から単離された。このゲノム断片中に含有される遺伝子クラスターを導入することによって、大腸菌およびシネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）においてＥＰＡを生成することが可能であった。続いてこの断片が配列決定され、８つの読み取り枠（ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム）が同定された（Ｈ．Ｔａｋｅｙａｍａ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３（１９９７年）２７２５〜２７３１頁）。シュワネラに由来するこれらの読み取り枠のうちの５つは、ポリケチドシンターゼ遺伝子に密接な関係がある。別のＰＫＳ様の遺伝子クラスターも、例えばビブリオ・マリヌスなど他のＰＵＦＡ生成海洋細菌において発見された（Ｍ．Ｔａｎａｋａ他、２１（１９９９年）９３９〜９４５頁）。類似した、ＰＵＦＡを生成するＰＫＳ様のＯＲＦも、真核原生生物シゾキトリウムにおいて同定することができた（Ｍｅｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３（２００１年）２９０〜２９３頁およびＷＯ００／４２１９５号）。シュワネラに由来するＥＰＡ遺伝子クラスターと部分的な一致を示す３つのＯＲＦがシゾキトリウムにおいて決定された。数種の原核生物および真核生物シゾキトリウムにおいてこれらの保存されたＰＫＳ遺伝子が存在することは、原核生物と真核生物の間の、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の水平伝播が可能であることを暗示している。

現在のところ、個々の種間のＰＫＳの分布については、いまだほとんど知られていない。したがって、例えば、シゾキトリウムの系統学的な近縁種である海洋原生生物トラウストキトリウム種は、シゾキトリウムと同様にＤＨＡに富んでいるにも関わらず、ＰＫＳを有していないようである。この種は、めったに存在しないδ−４不飽和化酵素を用いて、特に、長鎖ＰＵＦＡを生成する（Ｘ Ｑｉｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１年）３１５６１〜３１５６６頁）。トラウストキトリウムとシゾキトリウムの双方とも、ヤブレツボカビ目に属しているが、長鎖ＰＵＦＡを生成するための生合成経路は全く異なっている。したがって、特に、商業規模で個々のＰＵＦＡを製造できるようにするための新しい潜在的なＰＵＦＡ生産者を発見することに関して、海洋微生物におけるＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の分布を決定することに大きな関心が持たれている。さらに、ＰＵＦＡ生産者を求めて多数の海洋微生物をハイスループットに検査するために、特に効率的なスクリーニング方法が現在必要とされている。さらに、多くの様々なＰＵＦＡ−ＰＫＳを知ることにより、対応する酵素の遺伝子配置および構造に関する情報、ならびに、それによって、様々なＰＵＦＡを製造するための情報が与えられるはずである。このことは、例えば、トランスジェニック微生物または植物におけるＰＵＦＡの製造のためなど多くのさらなる応用にとって特に重要である。遺伝子の変異によってトランスジェニック的に、様々なＰＵＦＡの組合せを有するデザイナーオイルを製造することができるはずである。

特許出願ＷＯ０２／０８３８７０ Ａ２号では、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を有する生物を同定するための方法を記載している。これは、一方では、脂肪酸スペクトルに関する５つの選択基準に基づいており、これらの基準は、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ系に対する指標として機能するように特定の培養条件下で与えられるべきである。より多くの選択基準が満たされるほど、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ系に対する指標はより強くなる。もう一方で、これは、ブロットメンブレン上に移された、制限的に切断されたゲノムＤＮＡが、ＰＵＦＡ−ＰＫＳに特異的な核酸配列を有する潜在的なＰＵＦＡ−ＰＫＳ候補（５つの選択基準を満たすもの）からハイブリダイズされる、サザンブロット解析に基づいている。この第２の検出工程は、続いて、ゲノムＤＮＡバンクのスクリーニングに対する結果を検証するための例示的な実施形態において発展させられた。さらに、特許出願ＷＯ０２／０８３８７０号では、上記のスクリーニング方法のための予備選択として、適切な微生物を濃縮および選択するための戦略を記載している。

しかし、ＷＯ０２／０８３８７０ Ａ２号で記載されているスクリーニング方法が非常に高価であり、したがって、ハイスループットなスクリーニングには不適切であることは、当業者には明らかである。さらに、第１のスクリーニング工程における選択条件の評価は非常にあいまいと思われ、このため、第２のスクリーニング工程において陰性の結果が生じる可能性がある。

したがって、本発明は、現況技術を考慮して、様々な微生物中のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を同定するための方法を利用可能にするという課題を有した。本方法は、効率的に、経済的に、かつ短時間に微生物を広範にスクリーニングすることを可能にするはずである。スクリーニングは、費用のかかるサンプル調製無しでハイスループットに行われるはずである。

この課題、ならびに明示的に引用はしなかったが、本文書で最初に論じた文脈から容易に推論または推断することができる他の課題は、本発明の特許請求の範囲において定義する主題によって解決される。

微生物中のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を同定するための有利な方法は、請求項１において定義される方法によって利用可能になる。本方法は、アミノ酸連続（ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬ（配列番号５）から導き出される縮重オリゴヌクレオチド（プライマー）を用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ：ポリメラーゼチェーンリアクション）によって、サンプル、好ましくはバイオマス、特に微生物に由来する核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅することを含む。アミノ酸連続ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬ（配列番号５）から導き出される核酸配列は、例えば、配列連続５’−ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＣＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＣＴＣ -３’（配列番号６）に相当する。本明細書において記述する縮重プライマーを本発明に従って使用することにより、ＰＵＦＡ生成微生物中のＰＫＳ遺伝子断片が同定される。

本発明による方法は、驚くべきことに、上述したこの１種のアミノ酸配列部分のみから導き出されるオリゴヌクレオチドで間に合わせる。

さらにまた驚くべきことに、多数のＮ塩基、または例えばイノシンを含有する極めて縮重したオリゴヌクレオチド無しで大抵済ませることができる。

この方法は、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を増幅および同定するために、上述のアミノ酸配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬ（配列番号５）から導き出され得るすべてのオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの選択は、選択された部分の配列の長さおよびその向き（センスもしくはアンチセンスまたは相補的もしくは非相補的）とは無関係である。

好ましい形態では、長さが１０〜３６ｂｐ、好ましくは１５〜２５ｂｐ、特に好ましくは１８ｂｐのオリゴヌクレオチドが、本発明の検出方法において使用される。

使用されるオリゴヌクレオチドの量は、存在するＰＵＦＡ−ＰＫＳの検出方法に対する負の影響が無い限りにおいて、変動してよい。このことは、ＰＣＲ反応において使用される他のすべての成分にも適用される。

好ましい実施形態では、使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、４５℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６０℃、特に好ましくは５３℃〜５７℃のアニーリング温度で行われる。

ＰＣＲの個々の段階すなわち、変性、アニーリング、および伸長の段階の持続期間も、存在するＰＵＦＡ−ＰＫＳの検出方法に対する負の影響が無い限りにおいて、変動してよい。

ＰＣＲサイクルの回数も、変動してよいが、好ましくは２０〜４０サイクル、特に好ましくは２５〜３５サイクル、さらに特に好ましくは約３０サイクルである。

調査対象の微生物から単離可能なすべてのＤＮＡおよびＲＮＡ核酸、ならびにｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用することができる。特定の実施形態では、細胞全体またはバイオマスをＰＣＲ用の鋳型として使用することもできる。

別の実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドを、相補的な核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することもできる。

特に、本発明による方法は、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子についての微生物のハイスループットなスクリーニングに適している。

したがって、本発明は、請求項１から７に記載の方法を用いて、または請求項９に記載の核酸配列をハイブリダイゼーションプローブとして使用することによって得られる（同定可能な）核酸も含む。

請求項１１に記載の核酸を含有している微生物もまた含まれる。

ＰＵＦＡ生成微生物に対する大きな需要があるにも関わらず、本発明より前には、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ含有微生物を同定するためのＰＣＲに基づく公知の効率的な検出方法はなかった。Ｇｅｎｔｉｌｅ他による論文では、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子配列を増幅するために実行できるオリゴヌクレオチドの使用法を記載しているが、記載されているオリゴヌクレオチドはＡＣＰドメインからも、本発明が基づいているアミノ酸配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬからも導き出されていない（Ｇｅｎｔｉｌｅ他、２００３年 Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（９５）１１２４〜１１３３頁）。

複数のコピーが既に存在しているある配列部位（ＰＫＳのＡＰＣドメイン）の増幅が、本明細書で記載するＰＣＲ法の高効率の根拠であると推測されている。おそらくは、ＰＣＲの開始時に多数の標的配列が存在することにより、効率が高められる。これは、その役目としては、スクリーニング期間中のより高いヒット率をもたらす。しかし、ＡＰＣドメインはかなり多数の他の遺伝子、例えば、ＰＵＦＡに特異的ではないＰＫＳ、ならびに通常ペプチドシンターゼおよび脂肪酸シンターゼ中に存在するため、アミノ酸配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬから導き出されるオリゴヌクレオチドを用いてＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を特異的に単離できたことは極めて驚くべきことであった。このことは、ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬ配列からのオリゴ（ｏｌｉｇｏ）の誘導を用いたＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子のクローニング検査が以前に試行されなかった原因とも考えられている。

他の点では、これまでのところ、ＰＵＦＡ生産者の同定用のバイオマーカーに基づく、はるかに時間がかかり、かつ信頼度の低いスクリーニング方法しか開発されていなかった（Ｄ．Ｓ．ＮｉｃｈｏｌｓおよびＴ．Ａ．ＭｃＭｅｅｋｉｎ ２００２年 Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４８（２〜３）、１６１〜１７０頁）。

図１は、モリテラ・マリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）（ＳＳ９株）、およびシゾキトリウムに由来するいくつかの既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質ドメインの位置および数の比較を示す。保存配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬの反復数も示されている。

図２は、配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬから導き出されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅された、Ｕｌｋｅｎｉａ種ＳＡＭ ２１７９に由来するＰＣＲ生成物（ＡＣＰドメイン）の、シゾキトリウムに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳに対する配列相同性を示す。

いくつかの実施例を用いて、本発明による方法の基礎を構成している検出方法を以下に説明する。しかし、検出方法および本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例
実施例１
ウルケニア種ＳＡＭ２１７９から単離されたＤＮＡからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的配列の増幅

１．１ ゲノムＤＮＡの単離
フロースポイラー（ｆｌｏｗ ｓｐｏｉｌｅｒ）付き２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ ＤＨ１培地（５０ｇ／ｌグルコース；１２．５ｇ／ｌ酵母抽出物；１６．６５ｇ／ｌトロピックマリン（Ｔｒｏｐｉｃ Ｍａｒｉｎ）；ｐＨ６．０）にウルケニア種ＳＡＭ２１７９（ウルケニア種 ＢＰ−５６０１；ＷＯ９８０３６７１号）を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。続いて、滅菌した水道水で細胞を洗浄し、遠心分離し、細胞沈降物を−８５℃で凍結した。乾燥重量約１．２５ｇの細胞の塊が得られた。次いで、さらに検査するために、細胞沈降物を乳鉢に移し、液体窒素下で乳棒を用いて粉砕して微粉末にした。次いで、微粉砕された細胞物質の約１０分の１を２ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス／Ｃｌ ｐＨ７．２；５０ｍＭ ＥＤＴＡ；３％（ｖ／ｖ）ＳＤＡ；０．０１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）と混合し、６８℃で１時間インキュベートした。次いで、２ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上層の水相を除去した後、下層を２つの新しい反応容器中に各６００μｌ移し、再び、各６００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）と混合し、攪拌し、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、個々の上層の相の各４００μｌを新しい反応容器に移し、各例において１ｍｌエタノール（１００％）を添加した後２〜３回逆さにした。次いで、沈殿したＤＮＡをガラス棒上に巻き取り、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５０μｌの蒸留水中に溶解させ、２μｌのＲＮアーゼＡと混合し、４℃で保存した。

１．２ モチーフ特異的な（ｍｏｔｉｖｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドとしてＰＣＲプライマーＭＯＦ１およびＭＯＲ１を使用した。
ＭＯＦ１：５’−ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＣＣ ＡＴＣ−３’（配列番号７）
ＭＯＲ１：５’−ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＣＴＴ−３’（配列番号８）
１．１で説明したウルケニア種ＳＡＭ２１７９から得たゲノムＤＮＡを１：１００に希釈した。次いで、この希釈物２μｌを体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物（１×緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）；ｄＮＴＰ（各２００μＭ）；ＭＯＦ１（２０ｐｍｏｌ）、ＭＯＲ１（２０ｐｍｏｌ）、および２．５Ｕ Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製））に移し入れた。以下の条件下でＰＣＲを実施した：最初の変性を９４℃で３分間、その後に続いて、それぞれ９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、最後に７２℃で８分間。次いで、ゲル電気泳動によってＰＣＲ生成物を解析し、Ｔ／Ａクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によってベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ中に適切なサイズの断片を組み込んだ。大腸菌ＴＯＰ １０Ｆ’を形質転換した後、プラスミドＤＮＡを単離し（Ｑｉａｐｒｅｐスピン、ＱＵＡＧＥＮ社製）、配列決定した。

得られた配列データ（配列番号１）を公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９に由来するＰＣＲの主要生成物について、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質（ＯＲＦ Ａ；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム）と部分的な一致が示され、この一致はアミノ酸レベルで約９０％であった（図７）。驚くべきことに、ウルケニア種ＳＡＭ２１７９中のこのＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するために、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。

実施例２
シゾキトリウム種ＳＲ２１から単離されたＤＮＡからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的配列の増幅

２．１ ゲノムＤＮＡの単離
フロースポイラー付き２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ ＤＨ１培地（５０ｇ／ｌグルコース；１２．５ｇ／ｌ酵母抽出物；１６．６５ｇ／ｌトロピックマリン；ｐＨ６／０）にシゾキトリウム種ＳＲ２１（シゾキトリウム種 ＭＹＡ−１３８１； ＥＰ０８２３４７５号）を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。続いて、水道水で細胞を２回洗浄し、遠心分離し、細胞沈降物を−８５℃で凍結した。乾燥重量約１．４ｇの細胞の塊が得られた。次いで、さらに検査するために、細胞沈降物を乳鉢に移し、ゲノムＤＮＡを単離するために、前述したように（実施例１）して処理した。

２．２ モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドとしてＰＣＲプライマーＭＯＦ１およびＭＯＲ１（実施例１を参照されたい）を使用した。

シゾキトリウム種ＳＲ２１から得た２μｌのゲノムＤＮＡを用いて、１．２で説明したようにしてＰＣＲを実施した。

得られた配列データ（配列番号２）を公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、シゾキトリウム種ＳＲ２１に由来するＰＣＲの主要生成物について、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質（ＯＲＦ Ａ；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム）との約９０％の部分的な一致が示された。驚くべきことに、シゾキトリウムＳＲ２１中のこのＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するためにも、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。

実施例３
シゾキトリウム種ＳＲ２１のバイオマスからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的配列の直接的な増幅

３．１ バイオマスの獲得
フロースポイラー付き２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ ＤＨ１培地（５０ｇ／ｌグルコース；１２．５ｇ／ｌ酵母抽出物；１６．６５ｇ／ｌトロピックマリン；ｐＨ６／０）にシゾキトリウム種ＳＲ２１を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。続いて、水道水で細胞を２回洗浄し、遠心分離した。続いて、この方法で得られたバイオマスを、対応するＰＣＲ反応物に直接加えた。

３．２ モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドとしてＰＣＲプライマーＭＯＦ１およびＭＯＲ１（実施例１を参照されたい）を使用した。

３．１で得たシゾキトリウム種ＳＲ２１に由来するバイオマスの一定量を滅菌爪楊枝を用いて取り出し、体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物（１×緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）；ｄＮＴＰ（各２００μＭ）；ＭＯＦ１（２０ｐｍｏｌ）、ＭＯＲ１（２０ｐｍｏｌ）、および２．５Ｕ Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製））に移し入れた。１．２の項目で説明したようにしてＰＣＲを実施した。

得られた配列データ（配列番号２）を公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、シゾキトリウム種ＳＲ２１に由来するＰＣＲの主要生成物について、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質（ＯＲＦ Ａ；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム）との約９０％の部分的な一致が示された。シゾキトリウムのバイオマスから得られたＰＣＲ生成物の配列は、実施例２の配列と同一であった。

驚くべきことに、シゾキトリウム種ＳＲ２１のバイオマスに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するために、この場合でさえ、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。

実施例４
様々なウルケニアのバイオマスからのＰＵＦＡ−ＰＫＳ特異的配列の直接的な増幅
４．１ バイオマスの獲得
フロースポイラー付き２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ ＤＨ１培地（５０ｇ／ｌグルコース；１２．５ｇ／ｌ酵母抽出物；１６．６５ｇ／ｌトロピックマリン；ｐＨ６／０）にウルケニア種ＳＡＭ２１７９もしくはウルケニア・ビサルゲンシス（Ｕｌｋｅｎｉａ ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）または別のウルケニア種を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。続いて、水道水で細胞を２回洗浄し、遠心分離した。続いて、この方法で得られたバイオマスを適切なＰＣＲ反応物中に直接加えた。
４．２ モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応
モチーフ特異的なオリゴヌクレオチドとしてＰＣＲプライマーＭＯＦ１およびＭＯＲ１（実施例１を参照されたい）を使用した。

４．１で得た様々なウルケニアに由来するバイオマスの一定量を滅菌爪楊枝を用いて取り出し、それぞれ、体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物（１×緩衝液（Ｓｉｇｍａ社製）；ｄＮＴＰ（各２００μＭ）；ＭＯＦ１（２０ｐｍｏｌ）、ＭＯＲ１（２０ｐｍｏｌ）、および２．５Ｕ Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製））に移し入れた。１．２の項目で説明したようにしてＰＣＲを実施した。

得られた配列データ（配列番号１、３、および４）を、公式にアクセス可能なＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）と比較し、評価した。ＦＡＳＴＡＸを用いて得られる配列比較により、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８に由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質（ＯＲＦ Ａ；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム）との高率の部分的一致が示された。ウルケニア種ＳＡＭ２１７９のバイオマスから得られたＰＣＲ生成物の配列は、実施例１の配列と同一であった。

驚くべきことに、様々なウルケニアのバイオマスに由来する個々のＰＵＦＡ−ＰＫＳを測定するために、この場合でさえ、毎回、わずか１回のＰＣＲ実験しか実施する必要がなかった。

モリテラ・マリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）（ＳＳ９株）、およびシゾキトリウムに由来するいくつかの既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳのアシルキャリアタンパク質ドメインの位置および数の比較を示す。 配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬから誘導されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅された、Ｕｌｋｅｎｉａ種ＳＡＭ ２１７９に由来するＰＣＲ生成物（ＡＣＰドメイン）の、シゾキトリウムに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳに対する配列相同性を示す。

Claims (11)

1. 試料中のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子に特異的な核酸配列を証明するための方法であって、
   （ａ）ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、かつ前記試料から得られる核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施され、かつ、
   （ｂ）得られたＰＣＲ産物が配列決定され、かつ、既知の配列との部分的一致に基づいて新しいＰＵＦＡ−ＰＫＳ配列情報を特定するために、前記得られた配列情報がデータバンクと比較され、
   使用される前記ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーが、アミノ酸配列ＬＧＩＤＳＩＫＲＶＥＩＬ（配列番号５）をコードするオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする方法。
2. 前記ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーが縮重していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記オリゴヌクレオチドプライマーの長さが１０〜３６ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 使用される前記オリゴヌクレオチドプライマーの量が２０ｐｍｏｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. アニーリング温度が４５〜６５℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. サイクルの回数が２０〜４０回であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列から選択される、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するための核酸プライマー。
8. 配列番号６で表される核酸配列からなる、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するための核酸プライマー。
9. 配列番号７で表される核酸配列からなる、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するための核酸プライマー。
10. 配列番号８で表される核酸配列からなる、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を増幅するための核酸プライマー。
11. 配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列から選択される、または配列番号６から８のいずれかで表される核酸配列からなる、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子特異的核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ。

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