ES2348873T3

ES2348873T3 - Procedimiento de deteccion para la identificacion de pufa-pks en muestras.

Info

Publication number: ES2348873T3
Application number: ES05733438T
Authority: ES
Inventors: Matthias Rusing; Markus Luy
Original assignee: Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Current assignee: Celanese Sales Germany GmbH
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2010-12-16
Anticipated expiration: 2025-04-08
Also published as: DE502005009902D1; AU2005231965B2; KR20070043928A; CA2563430C; ATE474065T1; JP2007532105A; DE102004017369A1; CN104263814A; US20070259355A1; US8409798B2; CA2563430A1; BRPI0509748A; EP1733053A1; KR101171406B1; WO2005098033A8; AU2005231965A1; IL178614A; JP4555335B2; WO2005098033A1; CN101048514A

Abstract

Procedimiento para identificar secuencias de ácido nucleico, específicas del gen PUFA-PKS, en muestras, en donde (a) se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos y una parte de la muestra como plantilla y (b) los productos PCR obtenidos se secuencian y la información obtenida de la secuencia se compara con bancos de datos, para identificar la nueva información de secuencia de PUFA-PKS a través de la coincidencia parcial con secuencias ya conocidas, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados se derivan de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL.

Description

5 La invención describe un procedimiento para la identificación rápida y sencilla de genes PUFA-PKS (PUFA = ácidos grasos poliinsaturados; PKS = policétido sintasa) en muestras, por ejemplo, biomasa, especialmente, en microorganismos. Se caracteriza por una reproducción in vitro de segmentos de DNA producidos específicamente para PKS que producen PUFA. Además de la

10 identificación de la secuencia de ADN correspondiente, la invención también se basa en el establecimiento de las condiciones experimentales para su reproducción. Se entiende por PUFA (ácidos grasos poliinsaturados) los ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados con una longitud de cadena > C12 y, al menos, dos dobles enlaces. Existen dos familias principales de PUFA que, según la posición del

15 primer doble enlace en relación al extremo alquilo, se diferencian entre ácidos grasos omega-3 y omega-6. Sobre todo los fosfolípidos son importantes componentes de las membranas celulares, en donde se hallan en forma de lípidos. Los PUFA también se utilizan como precursores de moléculas importantes en humanos y en animales, por ejemplo, prostaglandinas leucotrienas y prostaciclinas (Simopoulos, A.P. Essential

20 fatty acids in health and chronic disease (ácidos grasos esenciales en la salud y enfermedades crónicas). Am. J Clin. Nutr. 1999 (70) pág. 560-569). Importantes representares del grupo de los ácidos grasos omega-3 son el ácido docosahexaenoico (ADH) y el ácido eicosapentanoico (AEP), presentes principalmente en aceites de pescado pero también en microorganismos marinos. Un importante representante de

25 los ácidos grasos omega-6 es AAR (ácido araquidónico), que se encuentra, por ejemplo, en hongos filamentosos, pero también se puede aislar de tejidos animales como hígado y riñones. En la leche materna humana se encuentra tanto el ADH como así también el AAR. Los PUFA son esenciales para el ser humano y para su desarrollo adecuado,

30 sobre todo, para el desarrollo del cerebro, la formación de tejidos y su reparación. El ADH es un componente importante de las membranas celulares humanas, especialmente, de los nervios. Además, el ADH juega un papel importante en la

maduración de la función cerebral y es esencial para el desarrollo de la capacidad visual. Los PUFA omega-3, como el ADH y el AEP, se utilizan como complementos nutritivos, dado que una alimentación equilibrada con suficiente suministro de ADH es ventajosa para la profilaxis de determinadas afecciones (Simopoulos, A.P. 5 Essential fatty acids in health and chronic disease (Ácidos grasos esenciales en la salud y enfermedades crónicas), American Journal of Clinical Nutrition (Revista estadounidense de nutrición clínica), 1999;70: pág. 560-569). Por ejemplo, los adultos con diabetes no insulinodependiente presentan una carencia o, al menos, alteraciones en el equilibrio de ADH, vinculadas con la posterior aparición de 10 problemas cardíacos. Del mismo modo, las enfermedades neurológicas, por ejemplo, el Alzheimer o la esquizofrenia, se vinculan con un nivel bajo de ADH. Existe una gran cantidad de fuentes para la obtención comercial de ADH, por ejemplo, aceites de peces marinos de agua fría, fracciones de yema de huevo o microorganismos marinos. Los microorganismos adecuados para la obtención de PUFA n-3 se 15 encuentran, por ejemplo, en bacterias, en el género Vibrio (por ejemplo, Vibrio Marinus) o entre los dinoflagelados (Dinophyta), entre ellos, sobre todo, el género Crypthecodinium, como C. Cohnii o entre los estramenopilos (o labyrinthulomycota), como los Pinguiophyceae, por ejemplo, Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus y Polypodochrysis. Otros

20 microorganismos preferidos para la obtención de PUFA pertenecen, sobre todo, a la orden de los Thraustochytriales, (Thraustchytriidea) con los géneros Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium y Ulkenia. Para la obtención comercial de AAR se utilizan microorganismos de los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium.

25 Las fuentes de uso comercial de PUFA, como plantas o animales, se caracterizan frecuentemente por una composición muy heterogénea de los aceites obtenidos por ellas. Los aceites obtenidos de ese modo deben ser sometidos a costosos procesos de purificación para poder enriquecer uno o múltiples PUFA. La alimentación con PUFA de dichas fuentes también está sometida a fluctuaciones

30 incontrolables. Por ejemplo, las enfermedades y las influencias climáticas pueden reducir tanto las obtenciones de origen animal como vegetal. La obtención de PUFA de peces depende de fluctuaciones estacionarias y puede sufrir una restricción

transitoria importante por la pesca excesiva o debido a modificaciones climáticas (por ejemplo, El Niño). Los aceites animales, sobre todo, aceites de pescado, pueden acumular sustancias dañinas del medio ambiente a través de la cadena trófica. Sobre todo en granjas piscícolas con fines comerciales se han descubierto elevadas cargas 5 sobre los animales debido a organoclorados, por ejemplo, bifenilos policlorados, que reducen los aspectos saludables del consumo de pescado (Hites et al. 2004, Global assessment of organic contaminants in farmed salmon (Análisis global de contaminantes orgánicos en salmón cultivado), Science 303, pág. 226-229). La pérdida de calidad resultante de los productos piscícolas genera una reducción en la 10 aceptación de los consumidores de pescado o aceite de pescado como fuente de PUFA de omega-3. Además, también es relativamente costosa la purificación de ADH de pescado, debido a los grandes requerimientos técnicos. En algunos microorganismos marinos, por el contrario, el ADH se encuentra en cantidades de, aproximadamente, 50 % de la proporción total de grasas de la célula y pueden

15 cultivarse en grandes fermentadores de manera relativamente económica. Otra ventaja de los microorganismos es una composición limitada a pocos componentes de los aceites obtenidos a partir de ellos.

Para la biosíntesis de PUFA de cadena larga se conocen dos procesos biocatalíticos diferentes. En el caso del denominado proceso Sprecher, los PUFA de 20 cadena larga, como DHA y EPA, se sintetizan partiendo de ácido palmitínico, a través de una sucesión de pasos de elongación y desaturación y posteriores acortamientos (Sprecher, H. Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids (Metabolismo de ácidos grasos altamente insaturados n-3 y n-6), Biochimica et Biophysica Acta 1486 (2000) pág. 219-231). Dicho proceso de biosíntesis es 25 realizado de este modo o de manera similar en la mayoría de los organismos, también en los humanos y vegetales. Sin embargo, cierta cantidad de microorganismos marinos hace uso de otro proceso de biosíntesis para la producción de AEP y ADH. Entre estos microorganismos que producen los PUFA, se encuentran representantes marinos de las proteobacterias Gamma y hasta ahora, el protista eucariótico 30 Schizochytrium. Sintetizan PUFA de cadena larga a través de denominados policétidos sintasa (PKS). Dichos PKS representan grandes enzimas que catalizan la síntesis de metabolitos secundarios que consisten en unidades de quétidos (Wallis,

G.W., Watts, J.L. and Browse, J. Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next? (Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados: ¿En qué pensarán ahora?) Trends in Biochemical Sciences 27 (9) (2002) pág. 467-473). La síntesis se los poliquétidos comprenden una serie de reacciones enzimáticas análogas a aquellas de

5 la síntesis de ácidos grasos (Hopwood & Sherman Annu. Rev. Genet. 24 (1990), pág. 37-66; Katz a & Donadio Annu. Rev. of Microbiol. 47 (1993) pág. 875-912).

Ya se conocen secuencias de genes de denominados PUFA -PKS (PKS que sintetizan PUFA). Por ejemplo, de la bacteria marina Shewanella sp. se extrajo un fragmento genómico de 38kb, que contiene la información para la producción de

10 ácido eicosapentanoico (AEP). A través de la transmisión del nicho (cluster) de genes de AEP presente en el fragmento genómico se pudo producir AEP en E. Coli y en Synechococcus. La posterior secuenciación de dicho fragmento permitió la identificación de 8 marcos de lectura abiertos (ORF: Open reading frames) (Takeyama, H. et al. Microbiology 143 (1997) pág. 2725-2731). Cinco de estos

15 marcos de lectura abiertos de Shewanella presentan un parentesco cercano con genes de policétidos sintasa. Otros nichos de genes similares a PKS fueron hallados en otras bacterias marinas que producen PUFA, por ejemplo, Vibrio marinus (Tanaka,

M. et al. 21 (1999) pág. 939-945). También se identificaron ORF similares a PKS análogos que producen PUFA en el protista eucarióticos Schizochytrium (Metz et al.

20 Science 293 (2001) pág. 290-293 y en WO 00/42195). En este caso, se determinaron tres ORF en el Schizochytrium que mostraban identificaciones parciales con el nicho de genes EPA de Shewanella. La existencia de dichos genes de PKS conservados en algunos procariontes y el eucarionte Schizochytrium indica una posible transferencia genética horizontal de genes PUFA-PKS entre procariontes y eucariontes.

25 En la actualidad, aún se conoce muy poco acerca de la difusión de PKS entre las diferentes especies. Al parecer, el protista marino Thraustochytrium sp, de parentesco cercano con el Schizochytrium, no presenta PKS, aunque también es rico en ADH, al igual que el Schizochytrium. Produce PUFA de cadena larga, entre otros, utilizando una delta-4-desaturasa muy rara (Qiu, X. et al. J. Biol. Chem. (2001) pág.

30 31561-31566). Ambos, Thraustochytzium y und Schizochytrium, pertenecen a la orden de los Thraustochytriales, pero sus procesos biosintéticos para la producción de PUFA de cadena larga son completamente diferentes. Por ello es especialmente

interesante determinar la difusión de genes PUFA -PKS en microorganismos marinos. Sobre todo teniendo en cuenta el descubrimiento de nuevos potenciales productores de PUFA para la producción eventual de PUFA individuales a escala industrial. A su vez, existe en la actualidad una demanda de métodos de detección 5 muy eficientes para la identificación de alto rendimiento de productores de PUFA en la gran cantidad de microorganismos marinos. Por otro lado, el conocimiento de muchos PUFA-PKS diferentes puede esclarecer la disposición de los genes o la estructura de las correspondientes enzimas y, con ello, la producción de diferentes PUFA. Esto es especialmente importante para muchas otras aplicaciones, por

10 ejemplo, para la producción de PUFA en microorganismos o plantas transgénicos. En este caso, se pueden obtener transgénicamente variaciones genéticas, aceites MCT con diferentes combinaciones de PUFA.

La declaración de patente WO02/083870 A2 describe un método para la identificación de organismos que contengan genes PUFA-PKS. Éste se basa, por un 15 lado, en cinco criterios de selección correspondientes al espectro de ácidos grasos, que deben darse en determinadas condiciones de cultivo para servir como indicador de un sistema PUFA-PKS. Cuantos más criterios de selección se cumplan, mayor es el indicador de un sistema PUFA-PKS. Y, por otro lado, se basa en los análisis por Southern blot, en los cuales se hibridizan ADN genómicos escindidos por restricción, 20 transferidos a membranas de blot, de potenciales candidatos de PUFA-PKS (cumplimiento de los cinco criterios de selección) con secuencias de ácidos nucleicos específicos de PUFA-PKS. En el ejemplo de ejecución, posteriormente, este segundo paso de detección se extendió, para la verificación del resultado, al análisis de un banco genómico de ADN. Además, la declaración de patente WO02/083870 describe

25 estrategias para el enriquecimiento y la selección de microorganismos adecuados como selección previa al procedimiento de detección mencionado.

Para el especialista está claro que el procedimiento de detección descrito en la memoria WO02/083870 A2 es muy costoso y por ello, no se adecua a una detección de alto rendimiento. Por lo demás, la valoración de los parámetros de

30 selección en el primer paso de detección parece ser muy vaga, lo cual puede generar resultados potencialmente negativos en el segundo paso de detección.

-6Teniendo en cuenta el estado actual de la técnica el objeto de la presente invención fue, por tanto, presentar un procedimiento para la identificación de genes PUFA-PKS en diferentes microorganismos. En este caso, el procedimiento debía posibilitar una detección amplia de microorganismos de manera eficiente, económica 5 y en un tiempo reducido. La detección debía llevarse a cabo con un alto rendimiento sin preparaciones costosas de pruebas. Éste y otros objetivos, no mencionados explícitamente, pero que se desprenden o deducen sin más de las relaciones discutidas en la presente, se logran mediante el objeto definido en las reivindicaciones de la presente invención. 10 Un procedimiento ventajoso para la identificación de genes PUFA-PKS en microorganismos se pone a disposición a través del procedimiento definido en la reivindicación 1. Dicho procedimiento comprende la amplificación in vitro de ácidos nucleicos a partir de muestras, preferentemente, biomasa, especialmente, de microorganismos, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase 15 chain reaction) utilizando oligonucleótidos degenerados (iniciadores), derivados de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL (SEQ ID No 5). Una secuencias de ácido nucleico derivada de la secuencias de aminoácidos LGIDSIKRVEIL (SEQ ID No 5) es, por ejemplo, la secuencia 5’-CTC GGC ATT GAC TCC ATC AAG CGT GTC GAG ATT CTC -3’ (SEQ ID No 6). La utilización acorde a la invención de los 20 iniciadores degenerados descritos permite la identificación de fragmentos de genes PKS en microorganismos que producen PUFA. Sorprendentemente, para el procedimiento acorde a la invención son suficientes los oligonucleótidos derivados solamente de este segmento de la secuencia de aminoácidos que hemos mencionado anteriormente. Es sorprendente, 25 asimismo, que se pueda prescindir en gran medida de los oligonucleótidos muy degenerados que contienen una gran cantidad de bases N o, por ejemplo, inosinas. El procedimiento comprende todos los oligonucleótidos que se pueden derivar de la secuencia de aminoácidos mencionada LGIDSIKRVEIL (SEQ ID No 5) para la amplificación y la identificación de genes PUFA-PKS. A su vez, la selección 30 de los oligonucleótidos es independiente de la longitud de la secuencia parcial seleccionada y de su orientación (sentido o antisentido o complementario o no complementario).

-7En una forma preferida, en un método de detección acorde a la invención, se utilizan los oligonucleótidos con un largo de 10-36 bp, preferentemente, de 15-25 bp y, de modo especialmente preferido, de 18 bp. La cantidad utilizada de oligonucleótidos puede variar mientras no se 5 presente un efecto negativo en el método de detección para PUFA-PKS. Esto también vale para todos los demás componentes utilizados en la reacción de PCR. En un modo de realización preferido, la hibridación de los oligonucleótidos se realiza a una temperatura de alineamiento es de 45-65 °C, preferentemente, de 5060 °C, de modo especialmente preferido, 53-57 °C. 10 La duración de cada fase individual de la PCR, es decir, de la desnaturalización, del alineamiento y de la elongación también pueden variar mientras no se presente un efecto negativo en el método de detección para PUFAPKS. La cantidad de ciclos de PCR también puede variar, pero preferentemente 15 se encuentra entre 20 y 40 ciclos, de modo preferido, entre 25 y 35 ciclos y, de modo especialmente preferido, en 30 ciclos. Como plantillas para la PCR pueden utilizarse todos los ácidos nucleicos ADN y ARN aislables de los microorganismos por analizar, así como los ADNc generados a partir de ARNm. En una ejecución especial, también pueden utilizarse células o biomasa como plantillas para la PCR. 20 En otro modo de ejecución, los oligonucleótidos acordes a la invención también pueden ser utilizados como sondas de hibridación para la detección de secuencias complementarias de ácido nucleico. El procedimiento acorde a la invención es especialmente adecuado para una detección de alto rendimiento de genes PUFA-PKS en microorganismos. 25 Correspondientemente, la presente invención también comprende un ácido nucleico que puede obtenerse (identificarse) con el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7 o utilizando las secuencias de ácido nucleico acorde a la reivindicación 9 como sondas de hibridación. Comprende igualmente un microorganismo que contiene un ácido nucleico 30 acorde a la reivindicación 11. Independientemente de la gran demanda de microorganismos productores de PUFA, antes de la presente invención no existían métodos de detección

conocidos, eficientes, basados en PCR, para identificar microorganismos que contienen PUFA-PKS. Un trabajo de Gentile et al. describe la posible implementación de oligonucleótidos para amplificar las secuencias de genes de PUFA-PKS, pero los oligonucleótidos descritos no están derivados del domino de

5 ACP, es decir, de la secuencia de aminoácidos que subyace a la de la invención, LGIDSIKRVEIL (Gentile et al. 2003 J. Appl. Microbiol (95) S. 1124-1133).

Se supone que la base de la elevada eficiencia del método de PCR aquí descrito es la amplificación de un segmento de una secuencia de la cual ya existen múltiples copias (dominios de ACP de PKS). La presencia de una gran cantidad de

10 secuencias diana idénticas en el inicio de la PCR probablemente conduce a un incremento de la eficiencia. De ello resulta una mayor cuota de aciertos en la detección. Fue sorprendente, sin embargo, que mediante oligonucleótidos derivados de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL se pudieran aislar genes específicos de PUFA-PKS, dado que los dominios de ACP se presentan en toda una serie de

15 otros genes, por ejemplo, PKS no específicos para PUFA, así como péptido sintetasa y en general, sintasa de ácidos grasos. Esto también se considera la causa de que hasta ahora no se hayan realizado intentos de clonación de genes PUFA-PKS derivados de oligonucleótidos de la secuencia LGIDSIKRVEIL. Por lo demás, hasta ahora para la identificación de productores de PUFA

20 sólo se han desarrollado métodos de detección que llevan bastante más tiempo y son menos fiables, basados en biomarcadores, (Nichols, D.S. y McMeekin T.A. 2002 J. Microbiol Methods (Métodos de la microbiología) 48 (2-3), pag. 161-170). En la figura 1 podemos ver una comparación de la posición y la cantidad de dominios de proteína transportadora de grupos acilo de algunos PUFA-PKS

25 conocidos de Moritella marina, Photobacterium profundum (cepa SS9) y Schizochytrium. También está indicada la cantidad de repeticiones de la secuencia conservada LGIDSIKRVEIL.

En la figura 2 podemos ver la homología secuencial del producto de PCR amplificado, derivado de la secuencia LGIDSIKRVEIL, con oligonucleótidos 30 (dominio de ACP) de Ulkenia sp SAM 2179 y PUFA-PKS de Schizochytrium. A continuación se describe, a partir de algunos ejemplos, el método de detección en el cual se basa el procedimiento acorde a la invención.

-9Ejemplos

Ejemplo 1: Amplificación de una secuencia específica de PUFA-PKS de ADN aislado de Ulkenia sp. SAM2179

5 1.1 Aislamiento de ADN genómico

50mL de un medio de DH1 (50 g/L de glucosa; 12,5 g/L de extracto de levadura; 16,65 g/L de Tropic Marin; pH 6,0) se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 250mL con chicana, con Ulkenia sp. SAM 2179 (Ulkenia spec BP5601; WO9803671) y se cultivaron durante 48h a 28 °C y 150rpm. Posteriormente,

10 las células se lavaron dos veces con agua corriente, se centrifugaron y el sedimento celular se congeló a -85 °C. Se obtuvo una masa celular de, aproximadamente, 1,25 g de peso en seco. Para un posterior procesamiento, el sedimento celular fue trasvasado a un mortero y triturado con un pilón hasta obtener un polvo fino, bajo nitrógeno líquido. Luego, aproximadamente 1/10 del material celular pulverizado se mezcló

15 con 2mL de tampón de lisis (50mM de Tris/Cl pH 7,2; 50mM de EDTA; 3% (v/v) SDS; 0,01% (v/v) 2-mercaptoetanol) y se incubó durante 1h a 68 °C. Posteriormente se agregaron 2mL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó y se centrifugó durante 20min a 10000 rpm. Tras extraer la fase acuosa superior, ésta se trasvasó a 2 nuevos recipientes de reacción en cantidades iguales de 600 µl y se

20 mezclaron nuevamente con, respectivamente, 600 µl de fenol/cloroformo/y alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó y se centrifugó durante 15min a 13000rpm. 400 µl de cada fase superior fueron trasvasados a un nuevo recipiente de reacción y tras agregar a cada uno 1mL de etanol (100 %) se invirtieron dos a tres veces. Luego el ADN obtenido se recogió con una varilla de vidrio, se lavó con etanol al 70 %, se

25 disolvió en 50 µl de H2O destilada, se mezcló con 2 µl de RNasa A y se almacenó a 4 °C.

1.2 Reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el motivo

Como oligonucleótidos específicos para el motivo se utilizaron los iniciadores de PCR MOF1 y MOR1. 30 MOF1: 5’- CTC GGC ATT GAC TCC ATC - 3’ (SEQ ID No 7) MOR1: 5’- GAG AAT CTC GAC ACG CTT - 3’ SEQ ID No 8)

-10 El ADN genómico descrito en 1.1, de Ulkenia sp SAM2179, se diluyó al

1:100. 2 µl de dicha dilución se convirtieron luego en una mezcla de reacción de PCR de 50 µl en volumen (1 x amortiguador (Sigma); dNTPs (cada uno, 200 µM); MOF1 (20pmol), MOR1 (20pmol) y 2,5U Taq-DNA-polimerasa (Sigma). La PCR se 5 llevó a cabo en las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial 94 °C durante 3min, posteriormente, siguieron le 30 ciclos con, respectivamente, 94 °C durante 1min, 55 °C durante 1min, 72 °C, 1 min. Finalmente, 8min a 72 °C. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel y los fragmentos de tamaño correspondiente se incorporaron mediante clonación T/A (gen in vitro) al vector

10 pCR2.1 TOPO. Tras la transformación de E. coli TOP10F’ se aisló el ADN del plásmido (Qiaprep Spin, QIAGEN) y se lo secuenció. No

Los datos de secuencia obtenidos (SEQ ID 1) se compararon y evaluaron con la base de datos de acceso oficial de secuencias de nucleótidos EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/). Las comparaciones de

15 secuencias obtenidas en FASTAX arrojaron para el producto principal de PCR de Ulkenia sp. SAM 2179 un resultado de una identidad parcial de, aproximadamente, 90 % respecto de la proteína transportadora de grupos acilo de PUFA-PKS (ORF A; ORF: open reading frame) de Schizochytrium sp. ATCC 20888 (figura 3). Sorprendentemente, para determinar dichos PUFA-PKS en Ulkenia sp SAM 2179

20 sólo fue necesario realizar un único experimento de PCR. Ejemplo 2: Amplificación de una secuencia específica de PUFA-PKS de ADN aislado de Schizochytrium sp. SR21

2.1 Aislamiento de ADN genómico

25 50 mL de un medio de DH1 (50 g/L de glucosa; 12,5 g/L de extracto de levadura; 16,65 g/L de Tropic Marin; pH 6,0) se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL con chicana, con Schizochytrium sp. SR21 (Schizochytrium spec., MYA-1381; EP0823475) y se cultivaron durante 48h a 28 °C y 150rpm. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con agua corriente, se centrifugaron

30 y el sedimento celular se congeló a -85 °C. Se obtuvo una masa celular de, aproximadamente, 1,4g de peso en seco. Para un posterior procesamiento, el sedimento celular fue trasvasado a un mortero y tratado como descrito anteriormente (ejemplo 1) para el aislamiento del ADN genómico.

2.2 Reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el motivo

Como oligonucleótidos específicos para el motivo se utilizaron los 5 iniciadores de PCR MOF1 y MOR1 (ver ejemplo 1). La PCR se llevó a cabo como se describe en 1.2, con 2 µl de ADN genómico de Schizochytrium sp SR21. No

Los datos de secuencia obtenidos (SEQ ID 2) se compararon y evaluaron con la base de datos de acceso oficial de secuencias de nucleótidos EMBL 10 Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/). Las comparaciones de secuencias obtenidas en FASTAX arrojaron para el producto principal de PCR de Schizochytrium sp. SR21 un resultado de una identidad parcial de, aproximadamente, 90 % respecto de la proteína transportadora de grupos acilo de PUFA-PKS (ORF A; ORF: open reading frame) de Schizochytrium sp. ATCC

15 20888. Sorprendentemente, también para determinar los PUFA-PKS en Schizochytrium sp SR21 sólo fue necesario realizar un único experimento de PCR.

Ejemplo 3: Amplificación de una secuencia específica de PUFA-PKS directamente de la biomasa de Schizochytrium sp. SR21

20 3.1 Obtención de la biomasa

50 mL de un medio de DH1 (50 g/L de glucosa; 12,5 g/L de extracto de levadura; 16,65 g/L de Tropic Marin; pH 6,0) se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL con chicana, con Schizochytrium sp. SR21 y se cultivaron durante 48h a 28 °C y 150rpm. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con

25 agua corriente y se centrifugaron. La biomasa obtenida se utilizó directamente en una correspondiente reacción PCR.

3.2 Reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el motivo

Como oligonucleótidos específicos para el motivo se utilizaron los iniciadores de PCR MOF1 y MOR1 (ver ejemplo 1).

30 Una alícuota de la biomasa obtenida por 3.1 de Schizochytrium sp. SR21 se tomó con un mondadientes esterilizado y se convirtió en una mezcla de reacción de PCR de 50 µl en volumen (1 x amortiguador (Sigma); dNTPs (cada uno, 200 µM);

MOF1 (20pmol), MOR1 (20pmol) y 2,5U Taq-DNA-polimerasa (Sigma). La PCR se llevó a cabo como se ha descrito en el punto 1.2. No

Los datos de secuencia obtenidos (SEQ ID 2) se compararon y evaluaron con la base de datos de acceso oficial de secuencias de nucleótidos EMBL 5 Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/). Las comparaciones de secuencias obtenidas en FASTAX arrojaron para el producto principal de PCR de Schizochytrium sp. SR21 un resultado de una identidad parcial de, aproximadamente, 90 % respecto de la proteína transportadora de grupos acilo de PUFA-PKS (ORF A; ORF: open reading frame) de Schizochytrium sp. ATCC

10 20888. La secuencia de la biomasa del producto de PCR obtenido de Schizochytrium fue idéntica a la del ejemplo 2.

Sorprendentemente, también en este caso, para determinar los PUFA-PKS de la biomasa de Schizochytrium sp SR21 sólo fue necesario realizar un único experimento de PCR.

15 Ejemplo 4: Amplificación de una secuencia específica de PUFA-PKS directamente de la biomasa de diferentes Ulkenia.

4.1 Obtención de la biomasa

50 mL de medios de DH1 (50 g/L de glucosa; 12,5 g/L de extracto de

20 levadura; 16,65 g/L de Tropic Marin; pH 6,0) se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL con chicana, con, o bien Ulkenia sp. SAM 2179, o Ulkenia visurgensis y/o una Ulkenia sp. diferente y se cultivaron durante 48h a 28 °C y 150rpm. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con agua corriente y se centrifugaron. La biomasa obtenida se utilizó directamente en una correspondiente

25 reacción PCR.

4.2 Reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el motivo

Como oligonucleótidos específicos para el motivo se utilizaron los iniciadores de PCR MOF1 y MOR1 (ver ejemplo 1). Las alícuotas de las biomasas de diferentes Ulkenia, obtenidas en 4.1, se

30 tomaron, en cada caso, con un mondadientes esterilizado, y se convirtieron en respectivas mezclas de reacción de PCR de 50 µl en volumen (1 x amortiguador (Sigma); dNTPs (cada uno, 200 µM); MOF1 (20pmol), MOR1 (20pmol) y 2,5U TaqDNA-polimerasa (Sigma). La PCR se llevó a cabo como se ha descrito en el punto

1.2. Los datos de secuencia obtenidos (SEQ ID No 1, 3 y 4) se compararon y evaluaron con la base de datos de acceso oficial de secuencias de nucleótidos EMBL

5 Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/). Las comparaciones de secuencias obtenidas en FASTAX arrojaron como resultado identidades parciales elevadas respecto de la proteína transportadora de grupos acilo de PUFA-PKS (ORF A; ORF: open reading frame) de Schizochytrium sp. ATCC 20888. La secuencia de la biomasa del producto de PCR obtenido de Ulkenia sp. SAM 2179 fue idéntica a la

10 del ejemplo 1. Sorprendentemente, también en este caso, para determinar los PUFA-PKS de la biomasa de diferentes Ulkenias, sólo fue necesario realizar un único experimento de PCR.

Protocolo de secuencia 15 <110> Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH

<120> Procedimiento de detección de genes PUFA-PKS

<130> ax04302

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1 20 <210> 1

<211> 357

<212> ADN

<213> Ulkenia sp.

25 <400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 321

<212> ADN

<213> Schizochytrium sp.

<220>

<221> misc_feature

<222> (149)..(149)

<223> n representa cualquier base

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 372

<212> ADN

<213> Ulkenia visurgensis

<400> 3

imagen2

<210> 4

<211> 372

<212> ADN

<213> Ulkenia sp.

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Ulkenia sp.

<400> 5

imagen1

10: <210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> secuencia artificial

15: <400> 6 ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctc 36

20: <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial

<400> 7 ctcggcattg actccatc: 18

25: <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial

30: <400> 8 gagaatctcg acacgctt 18

Claims

Reivindicaciones

1. Procedimiento para identificar secuencias de ácido nucleico, específicas del gen PUFA-PKS, en muestras, en donde

(a) se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

5 utilizando oligonucleótidos específicos y una parte de la muestra como plantilla y

(b) los productos PCR obtenidos se secuencian y la información obtenida de la secuencia se compara con bancos de datos, para identificar la nueva información de secuencia de PUFA-PKS a través de la coincidencia parcial

10 con secuencias ya conocidas, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados se derivan de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL.
2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque los oligonucleótidos están degenerados.

15 3. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la longitud de los oligonucleótidos es de 10-36 bp, preferentemente, 15-25 bp y, de modo especialmente preferido, 18 bp.
4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque la cantidad de oligonucleótidos utilizados es, 20 preferentemente, de 20 pMol.
5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la temperatura de alineamiento es de 45-65 °C, preferentemente, de 50-60 °C, de modo especialmente preferido, 53-57 °C.
6. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores,

25 caracterizado porque la cantidad de ciclos es de, aproximadamente, 20-40, preferentemente, aproximadamente, 25-35 y, de modo especialmente preferido, aproximadamente 30.
7. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque como plantilla para los PCR se utilizan ácido nucleicos 30 aislados de la biomasa o la biomasa misma.
8.

Oligonucleótido que presenta una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ySEQ ID NO: 8.
9.

Utilización del oligonucleótido de la reivindicación 8 como sonda de hibridación.

“Siguen 2 páginas de dibujos” Figura 1 Figura 2