CN105176942A - 来源于树莓的聚酮合酶RinPKS1及其相关生物材料与应用 - Google Patents

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CN105176942A CN201510471697.5A CN201510471697A CN105176942A CN 105176942 A CN105176942 A CN 105176942A CN 201510471697 A CN201510471697 A CN 201510471697A CN 105176942 A CN105176942 A CN 105176942A
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Abstract

本发明公开了一种来源于树莓的聚酮合酶RinPKS1及其相关生物材料与应用。聚酮合酶RinPKS1是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示的蛋白质；b)在SEQ？ID？No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚酮合酶活性的蛋白质。实验证明，本发明提供的聚酮合酶RinPKS1具有苯亚甲基丙酮合酶活性和/或查尔酮合酶活性，其在作为聚酮合酶中的应用或在制备聚酮合酶产品中的应用中具有重要作用。

Description

来源于树莓的聚酮合酶RinPKS1及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域中来源于树莓的聚酮合酶RinPKS1及其相关生物材料与应用。
背景技术
树莓(RubusidaeusL.)具有抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等多种药理和保健功能，已在医药界和保健产品中广泛使用，其果实经炮制制成传统中药覆盆子，气味甘、平、无毒，有益肾固精缩尿壮阳作用。
覆盆子酮，又名悬钩子酮(Raspberryketone)，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮，(4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone)，分子式为C10H12O2。覆盆子酮在常温下为白色针状结晶，其分子量为164.20，熔点82-84℃，是一种经过美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可使用的一种具有幽雅果香香韵的安全食用香料，FEMA编号为2588，属于国家海关承认、产业政策鼓励发展的高新技术产品，属于具有果香味的暖香型香料，被广泛用于食品、化妆品及医药中间体的合成。覆盆子酮作为树莓果实特征性香味物质，但在树莓植物中含量很低，而且天然树莓资源非常有限，从树莓植物中提取天然覆盆子酮是不经济的。覆盆子酮的生物合成途径见图1。由苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetonesynthase，BAS)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A分子反应生成苯亚甲基丙酮(p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one)，然后苯亚甲基丙酮在还原酶的催化下生成覆盆子酮。可见，苯亚甲基丙酮合酶是覆盆子酮生物合成途径的关键酶和限速酶，也是利用基因工程技术分子调控覆盆子酮生物合成的靶点。
聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、具有查尔酮合酶(Chalconesynthase，CHS)基本骨架的植物次生代谢产物，对聚酮合酶的基因进行调控可用于合成一些难以化学合成的新型天然化合物。近几年来，一系列功能不同的聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)不断被克隆，如查尔酮合酶、芪合酶(Stilbenesynthase，STS)、苯亚甲基丙酮合酶(benzalacetonesynthase，BAS)等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高覆盆子酮的产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有聚酮合酶活性的蛋白质，名称为RinPKS1，来源于树莓(RubusidaeusL.)，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；
b)在SEQIDNo.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚酮合酶的蛋白质。
其中，序列表中序列2由391个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQIDNo.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。上述b)可为在SEQIDNo.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
与RinPKS1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与RinPKS1相关生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：
B1)编码RinPKS1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其核苷酸序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQIDNo.1由1176个核苷酸组成，编码SEQIDNo.2所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码RinPKS1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的RinPKS1的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码RinPKS1且具有聚酮合酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述80％或80％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码RinPKS1的核酸分子的表达盒(RinPKS1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RinPKS1的DNA，该DNA不但可包括启动RinPKS1基因转录的启动子，还可包括终止RinPKS1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述RinPKS1基因表达盒的重组表达载体，所述植物表达载体包括Gateway系统载体和双元农杆菌载体等，如pDONRTM/Zeo、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，赋予对methatrexate抗性的dhfr基因和赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)，抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)或提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码RinPKS1的核酸分子的表达盒(RinPKS1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RinPKS1的DNA，该DNA不但可包括启动RinPKS1基因转录的启动子，还可包括终止RinPKS1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述RinPKS1基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
上述生物材料中，所述转基因动物细胞系可为昆虫细胞。所述转基因植物细胞系和转基因动物细胞系不包括繁殖材料。
RinPKS1在作为聚酮合酶的应用或在制备聚酮合酶产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述RinPKS1的相关生物材料在制备聚酮合酶产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述所述RinPKS1的制备方法，包括将所述RinPKS1的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述蛋白质。
上述RinPKS1的制备方法中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其核苷酸序列是SEQIDNo.1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQIDNo.1由1176个核苷酸组成，SEQIDNo.1所示的核苷酸编码SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。
上述RinPKS1的制备方法中，将所述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入所述生物细胞。
上述RinPKS1的制备方法中，所述蛋白质的编码基因通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞得到表达所述蛋白质的重组细胞。
上述RinPKS1的制备方法中所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述任一所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichiacoli)。所述大肠杆菌(Escherichiacoli)可为大肠杆菌Rosetta。
上述RinPKS1的制备方法中，包括培养所述重组细胞得到所述蛋白质。
所述重组表达载体可为将pET30a(+)的EcoRI识别序列和XhoI识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子，保持pET30a(+)的其它序列不变得到的RinPKS1基因表达载体，其名称为pET30a-RinPKS1。
所述细菌可为大肠杆菌，所述大肠杆菌可为将pET30a-RinPKS1导入受体大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。所述重组大肠杆菌具体可为将pET30a-RinPKS1导入大肠杆菌Rosetta得到的重组大肠杆菌，其名称为Rosetta/pET30a-RinPKS1。
上述RinPKS1的制备方法中，包括从上述具有聚酮合酶活性的蛋白质制备方法得到具有聚酮合酶活性的蛋白质中纯化得到蛋白质RinPKS1的步骤，所述RinPKS1为聚酮合酶。
上述任一所述聚酮合酶可为苯亚甲基丙酮合酶和/或查尔酮合酶。
本发明提供的聚酮合酶RinPKS1具有苯亚甲基丙酮合酶活性和/或查尔酮合酶活性。
实验证明，如果体系pH值小于7.0(不含7.0)，RinPKS1仅具有查尔酮合酶(CHS)活性，高效生成以柚皮素查尔酮为主的产物；如果体系pH值大于9.5(不含9.5)，RinPKS1仅具有苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性，高效生成以苯亚甲基丙酮的产物；如果体系pH值在7.0至9.5(含7.0，含9.5)，RinPKS1同时具有查尔酮合酶(CHS)和苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性。
附图说明
图1为覆盆子酮的生物合成途径。
图2为树莓gDNA的电泳结果。
图3为克隆RinPKS1基因的电泳结果。
图4为原核表达载体pET30a-RinPKS1示意图。
图5为RinPKS1纯化蛋白的聚丙酰胺凝胶电泳图。
图6为高效液相色谱检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中树莓(RubusidaeusL.)(ZhengD,HrazdinaG.(2008)Molecularandbiochemicalcharacterizationofbenzalacetonesynthaseandchalconesynthasegenesandtheirproteinsfromraspberry(RubusidaeusL.).ArchBiochemBiophys，470:139-145)具体为树莓(RubusidaeusL.)品种紫树莓缤纷，由北京农学院杨明峰副教授于2011年7月采自中国科学院研究所植物园。公众可从北京农学院(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。树莓(RubusidaeusL.)品种紫树莓缤纷在下文中简称树莓。
下述实施例中的大肠杆菌Rosetta为北京康为世纪生物科技有限公司公司产品。下述实施例中的pET30a(+)为Novagen公司产品。
实施例1、RinPKS1蛋白及其编码基因的克隆
RinPKS1蛋白及其编码基因的克隆的步骤如下：
1、以新鲜树莓的叶片作为外植体通过组织培养得到幼苗，取该幼苗的幼嫩叶片1g，加入螯合剂，液氮研磨，然后采用改进的CTAB法(PorebskiS,BaileyL,BaumB.(1997)ModificationofaCTABDNAextractionprotocolforplantscontaininghighpolysaccharideandpolyphenolcomponents.PlantMolBiolRep,15:8-15)提取树莓的基因组DNA(gDNA)。树莓gDNA纯度检测显示平均OD260/OD280值为1.83，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示条带单一，无拖尾现象(图2)。
2、合成简并引物F1和R1，F1和R1的序列信息见表1。
3、以步骤1提取的树莓gDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物，PCR扩增获得约710bp条带并测序。经比对该PCR扩增片段与RiPKS6基因(GenBank号为AAM90652)的同源性为99％；依据RiPKS6基因的全长序列，设计并合成引物E1F、引物E1R、引物E2F、引物E2R、引物F2和引物R2，上述引物的核苷酸序列信息见表1；其中引物E1F和引物E1R为扩增外显子1的引物，引物E2F和引物E2R为扩增外显子2的引物，引物F2(含限制性酶EcoRI酶切位点)和引物R2(含限制性酶XhoI酶切位点)为扩增读码框的引物。
表1.PCR引物序列信息
引物名称 序列信息5'-3'
引物F1 5'-GGAGGCTGCTGTTAAGGCTATCVMNGARTGGGG-3'
引物R1 5'-AAAGAACGCAAGCAGAAGACATRTTNCCRTA-3'
引物E1F 5'-ATGGTGACCGTCGATGAAGTCCGC-3'
引物E1R 5'-TTAAGGTCGCGTACACACTGTTCAGTTACT-3'
引物E2F 5'-AATTCCAGCGCATGTGTGACAAGTCAATGA-3'
引物E2R 5'-AGTTGAAGCTGCCACACTGTGAAG-3'
引物F2 5'-GGGAATTCATGGTGACCGTCGATGAAG-3'
引物R2 5'-AACTCGAGAGTTGAAGCTGCCACA-3'
注：下划线标注为限制性酶切位点。N代表核苷酸A、C、G和T中的任一种，V代表核苷酸A或C或G中的任一种，M代表核苷酸A或C，R代表核苷酸A或G。
4、完成步骤3后，以步骤1提取的树莓gDNA为模板，以引物E1F和引物E2R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1。
5、完成步骤4后，以步骤4中的PCR扩增产物1为模板，以引物E1F和引物E1R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。
6、完成步骤4后，以步骤4中的PCR扩增产物1为模板，以引物E2F和引物E2R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物3。
7、完成步骤5和6后，将PCR扩增产物2和PCR扩增产物3以1:5(质量比)混合得到混合物，以该混合物为模板，以引物F2和引物R2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物4，将PCR扩增产物4进行测序。
结果见图3(图3中：A为PCR扩增产物2，B为PCR扩增产物3，C为PCR扩增产物4)。测序结果显示，PCR扩增产物4的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
RinPKS1基因的编码序列如SEQIDNo.1所示，编码的蛋白命名为RinPKS1，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，由391个氨基酸残基组成，RinPKS1的分子量(Mr)为42.8kDa，等电点(pI)为6.04。
实施例2、RinPKS1的原核表达和纯化
RinPKS1的原核表达和纯化的步骤如下：
1、将质粒pET30a(+)的EcoRI识别序列和XhoI识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子，保持pET30a(+)的其它序列不变得到RinPKS1基因表达载体，将其命名为pET30a-RinPKS1。pET30a-RinPKS1的示意图见图4。
2、完成步骤1后，将重组表达质粒pET30a-RinPKS1导入大肠杆菌Rosetta，经LB固体平板(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)筛选，得到含有pET30a-RinPKS1的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为Rosetta/pET30a-RinPKS1。
3、将步骤2得到的Rosetta/pET30a-RinPKS1接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜得到培养菌液1，然后将培养菌液1以1:100(体积比)接种到LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)中，37℃振荡培养至OD600值0.6得到培养菌液2。
4、向步骤3得到的培养菌液2中加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为1.0mmol/L，25℃，诱导4h，收集菌体后超声破碎，得到菌体破碎液。将该菌体破碎液12000rpm离心10min得到菌体上清液(名称为Rosetta/pET30a-RinPKS1菌体裂解上清液)和菌体沉淀(名称为Rosetta/pET30a-RinPKS1菌体裂解沉淀)。将Rosetta/pET30a-RinPKS1菌体裂解上清液进行SDS-PAGE。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品)从菌体上清液中纯化蛋白，然后利用PD-10柱(GEHealthcare公司产品)脱盐。
实验结果见如图5。结果表明，蛋白质RinPKS1主要存在于Rosetta/pET30a-RinPKS1菌体裂解上清液中，分子量大小为43kDa。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品)从Rosetta/pET30a-RinPKS1菌体裂解上清液中纯化得到带有His标签的纯化蛋白RinPKS1。经过截留分子量(MWCO)10000的滤膜浓缩后，用蛋白储存溶液溶解得到RinPKS1溶液。蛋白储存溶液：溶质及其浓度为：20mMTris(pH7.5)，150mM氯化钠，0.5mMEDTA，25％(v/v)甘油，蛋白储存溶液使用时加入1mMDTT混匀后使用；溶剂为蒸馏水；pH自然。
实施例3、RinPKS1体外酶促反应产物分析
一、RinPKS1体外酶促反应产物分析查尔酮合酶(CHS)活性
RinPKS1体外酶促反应产物分析查尔酮合酶(CHS)活性步骤如下：
实验重复三次，每次重复设10个反应体系。
1、制备250μl体外酶促反应体系1，简称体系1，体系1的pH为9.5，溶剂为0.1mol/L磷酸钾缓冲液(溶质为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶剂为水)，溶质为4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A、实施例2得到的RinPKS1溶液。250μl体系1中含有不同浓度的实施例2制备的RinPKS1溶液(RinPKS1溶液在体系1中的浓度分别为16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L或1mg/L)、150μmol/L4-香豆酰辅酶A，280μmol/L丙二酰辅酶A。
2、完成步骤1后，将步骤1制备的体系1置于不同反应温度下(反应温度分别为60℃、50℃、40℃或30℃)反应不同时间(反应时间分别为35min、30min、25min、20min、15min或10min)，然后加入乙酸，使乙酸在体系中的浓度为5％(体积百分含量)，然后用250μl的乙酸乙酯抽提并10000r/min离心10min。取上层乙酸乙酯层进行真空干燥，得到RinPKS1酶促反应产物，向RinPKS1酶促反应产物中加入50μl50％(体积百分含量)甲醇水溶液，得到RinPKS1酶促反应产物待测样品。
3、完成步骤2后，使用配有WatersSunFireTMC18反相柱(5.0μm，4.6mm×150mm；MachereyNagel公司产品)的WatersHPLC分析步骤2的RinPKS1酶促反应产物待测样品。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8ml/min，使用以下梯度洗脱条件：在0-15min内，流动相中甲醇的体积百分含量由30％匀速增至70％，水的体积百分含量由70％匀速降至30％，进行线性梯度洗脱；再用流动相(由甲醇和水按照7:3的体积比混合得到的溶液)洗脱10min。其中检测波长为289nm时，以柚皮苷查尔酮(Sigma公司产品)为标准品，采用标准曲线法(外标法)进行定量分析RinPKS1体外酶促反应产物的查尔酮合酶(CHS)活性。
按照上述方法，将步骤一体系1中的pH9.5分别替换为pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0和pH9.5，其它步骤均相同，得到不同pH条件下RinPKS1体外酶促反应产物的查尔酮合酶(CHS)活性。
二、RinPKS1体外酶促反应与产物分析苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性
除将步骤一中检测波长289nm替换为323nm，以柚皮苷查尔酮(Sigma公司产品)为标准品替换为以苯亚甲基丙酮(Sigma公司产品)为标准品，其它步骤均相同，得到RinPKS1体外酶促反应产物的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性。
实验结果见表2、表3和图6(图6中，A为RinPKS1体外酶促反应与产物分析的高效液相色谱图，B为RinPKS1体外酶促反应与产物和苯亚甲基丙酮标准品高效液相色谱图，C为苯亚甲基丙酮标准品和RinPKS1体外酶促反应与产物的共色谱图)。
结果表明，RinPKS1与4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A在酶促反应体系中孵育时，体系的pH值不同产物也不同：如果酶促反应体系pH值小于7.0(不含7.0)，RinPKS1仅具有查尔酮合酶(CHS)活性，高效生成以柚皮素查尔酮为主的产物；如果酶促反应体系pH值大于9.5(不含9.5)，RinPKS1仅具有苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性，高效生成以苯亚甲基丙酮为主的产物；如果酶促反应体系pH值在7.0至9.5(含7.0，含9.5)，RinPKS1同时具有查尔酮合酶(CHS)和苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性。RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性和苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的最适反应条件结果见表2。
表2.RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性和苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的最适反应条件
苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性 查尔酮合酶(CHS)活性
最适pH值 9.5 7.5
最适温度(℃) 50 40
最适反应时间(min) 30 15
最适酶浓度(mg/L) 16 4
实施例4、动力学分析
一、RinPKS1的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的动力学常数测定步骤如下：
1、制备250μL体外酶促反应体系2，简称体系2，体系2的pH为9.5，溶剂为0.1mol/L磷酸钾缓冲液(溶质为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶剂为水)，溶质为4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A、实施例2得到的RinPKS1溶液。250μL体系2中含有实施例2制备的RinPKS1溶液16mg/L、150μmol/L4-香豆酰辅酶A，280μmol/L丙二酰辅酶A。
按照上述方法，将体系2中的150μmol/L4-香豆酰辅酶A分别替代为75μmol/L、37.5μmol/L、18.75μmol/L、12.5μmol/L、7.5μmol/L和2.5μmol/L4-香豆酰辅酶A，其他溶质和溶剂的含量均相同，分别得到体系3、体系4、体系5、体系6、体系7和体系8。
按照上述方法，将体系2中的280μmol/L丙二酰辅酶A分别替代为150μmol/L、75μmol/L、45μmol/L、37.5μmol/L、25μmol/L、15μmol/L和5μmol/L丙二酰辅酶A，其他溶质和溶剂的含量均相同，分别得到体系9、体系10、体系11、体系12、体系13、体系14和体系15。
2、完成步骤1后，将体系2、体系3、体系4、体系5、体系6、体系7和体系8在50℃下反应30min测定苯亚甲基丙酮合酶(BAS)的活性，通过Lineweaver–Burke双倒数法作图，求得回归直线方程，其中直线与X轴的交点为-(Km)-1，与Y轴的交点为(Vm)-1，同时测定纯化后的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)的浓度，以求得Kcat值。实验重复3次。
完成步骤1后，将体系2、体系9、体系10、体系11、体系12、体系13、体系14和体系15在50℃下反应30min测定苯亚甲基丙酮合酶(BAS)的活性，通过Lineweaver–Burke双倒数法作图，求得回归直线方程，其中直线与X轴的交点为-(Km)-1，与Y轴的交点为(Vm)-1，同时测定纯化后的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)的浓度，以求得Kcat值。实验重复3次。
RinPKS1的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的动力学常数测定实验结果见表4。RinPKS1的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的动力学常数结果对树莓中覆盆子酮的生物合成的调控及其应用提供了应用基础。
表4.RinPKS1的苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的反应动力学常数Km及催化常数Kcat
Km(μM) Kcat(min-1) Kcat/Km(M-1s-1)
4-香豆酰辅酶A 12.89 0.65 840.36
丙二酰辅酶A 41.17 0.46 185.53
二、RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性的动力学常数测定步骤如下：
1、制备250μL体外酶促反应体系A，简称体系A，体系A的pH为7.0，溶剂为0.1mol/L磷酸钾缓冲液(溶质为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶剂为水)，溶质为4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A、实施例2得到的RinPKS1溶液。250μL体系A中含有实施例2制备的RinPKS1溶液4mg/L、150μmol/L4-香豆酰辅酶A，280μmol/L丙二酰辅酶A。
按照上述方法，将体系A中的150μmol/L4-香豆酰辅酶A分别替代为75μmol/L、37.5μmol/L、18.75μmol/L、12.5μmol/L、7.5μmol/L和2.5μmol/L4-香豆酰辅酶A，其他溶质和溶剂的含量均相同，分别得到体系B、体系C、体系D、体系E、体系F和体系G。
按照上述方法，将体系A中的280μmol/L丙二酰辅酶A分别替代为300μmol/L150μmol/L、75μmol/L、50μmol/L、30μmol/L和10μmol/L丙二酰辅酶A，其他溶质和溶剂的含量均相同，分别得到体系H、体系I、体系J、体系K、体系L和体系M。
2、完成步骤1后，将体系A、体系B、体系C、体系D、体系E、体系F和体系G在40℃下反应15min测定查尔酮合酶(CHS)的活性，通过Lineweaver–Burke双倒数法作图，求得回归直线方程，其中直线与X轴的交点为-(Km)-1，与Y轴的交点为(Vm)-1，同时测定纯化后的查尔酮合酶浓度，以求得Kcat值。实验重复3次。
完成步骤1后，将体系A、体系H、体系I、体系J、体系K、体系L和体系M在40℃下反应15min测定查尔酮合酶(CHS)的活性，通过Lineweaver–Burke双倒数法作图，求得回归直线方程，其中直线与X轴的交点为-(Km)-1，与Y轴的交点为(Vm)-1，同时测定纯化后的查尔酮合酶浓度，以求得Kcat值。实验重复3次。
RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性的合成的动力学常数实验测定结果见表5。RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性的合成的动力学常数分析结果对树莓中覆盆子酮的生物合成的调控及其应用提供了应用基础。
表5.RinPKS1的查尔酮合酶(CHS)活性的反应动力学常数Km及催化常数Kcat
Km(μM) Kcat(min-1) Kcat/Km(M-1s-1)
4-香豆酰辅酶A 16.42 2.70 2742.00
丙二酰辅酶A 22.83 4.28 3122.00

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；
b)在SEQIDNo.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚酮合酶的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质的相关生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其核苷酸序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.C或D的应用：
C、权利要求1所述蛋白质在作为聚酮合酶的应用或在制备聚酮合酶产品中的应用；
D、权利要求2或3所述生物材料在制备聚酮合酶产品中的应用。
5.根据权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述生物材料或权利要求4所述应用，其特征在于：所述聚酮合酶为苯亚甲基丙酮合酶和/或查尔酮合酶。
6.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括将所述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述蛋白质。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其核苷酸序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述制备方法，其特征在于：将所述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入所述生物细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：将所述蛋白质的编码基因导入所述生物细胞包括通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞得到表达所述蛋白质的重组细胞。
10.根据权利要求6-9任一所述的制备方法，其特征在于：所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
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