CN117106047A - 西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用。本发明涉及药用植物分子生物领域，具体涉及西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用。本发明的PqEXLB1蛋白质为A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物组织人参皂苷含量的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。通过构建PqEXLB1的RNAi干扰载体并将其转入西洋参愈伤组织，对转基因愈伤组织的人参皂苷检测，结果表明干扰PqEXLB1基因的表达可以提高人参皂苷的含量。

Description

西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及药用植物分子生物领域，具体涉及西洋参PqEXLB1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
西洋参(Panax quinquefoliumL.)是我国的传统中药，具有补气养阴、清热生津等功效，多用于气虚阴亏、内热、咳喘痰血、虚热烦倦等症状。人参皂苷是西洋参中主要的药用成分，在降低血脂、改善人体心肌缺血、预防癌症等方面均有明显功效，具有极高的医学价值和保健价值。
近年来西洋参市场需求量急剧增加，临床用药出现供不应求现象，但西洋参对生长环境、气候、栽培技术等要求较高，人工栽培难以满足目前临床所需。植物组织培养技术可以避免田间栽培所带来的的缺点，生产周期短、不受环境限制、具有保护植物资源等优点，为药用植物活性成分大规模生产提供了一种具有成本效益的有效手段。虽然组织培养西洋参愈伤组织是一种快速获得人参皂苷的方式，但用此方式获得的皂苷产量较低，不能满足市场需求，所以借助人工手段来提高西洋参愈伤组织中人参皂苷的含量具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物组织的人参皂苷含量。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质可为如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物组织人参皂苷含量的蛋白质；例如本领域技术人员可根据如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白突变体；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述A1)所述蛋白质的名称为PqEXLB1。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质PqEXLB1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质PqEXLB1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质PqEXLB1且具有蛋白质PqEXLB1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上文中，所述蛋白质来源于西洋参(Panax quinquefolium L.)。
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
B1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下E1)或E2)所示的基因：
E1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
E2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物组织中人参皂苷含量的基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质PqEXLB1。
SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为蛋白质PqEXLB1编码基因(CDS)的核苷酸序列。
本发明所述的PqEXLB1基因可以为任意能够编码蛋白质PqEXLB1的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
B1)所述核酸分子还可包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pBWA(V)BS。
可用现有的植物表达载体构建含有PqEXLB1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用PqEXLB1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的PqEXLB1基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物组织中人参皂苷含量改变的转基因细胞系及转基因植株。携带PqEXLB1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi。所述重组载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi是在pBWA(V)BS载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入序列为SEQ ID No.4的DNA片段，保持pBWA(V)BS载体其他序列不变得到的重组载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。
本发明还提供了前文所述蛋白质PqEXLB1或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一中的应用：
U1)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物组织人参皂苷含量中的应用；
U2)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物组织人参皂苷含量的产品中的应用；
U3)所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物组织中人参皂苷含量改变的植物中的应用；
U4)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育植物组织中人参皂苷含量改变的植物的产品中的应用；
U5)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质PqEXLB1。
上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
B1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明还提供了一种调控植物组织人参皂苷含量的方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物组织人参皂苷含量。
上述方法中，所述调控目的植物中所述蛋白质PqEXLB1的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入抑制、降低或沉默所述蛋白质的编码基因PqEXLB1的DNA分子，得到植物组织人参皂苷含量改变的目的植物；所述PqEXLB1编码基因编码所述蛋白质PqEXLB1。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。
上述应用及方法中，所述调控可为提高、增强或上调。
上述应用及方法中，所述调控可为抑制、降低或沉默。
本文中，所述调控所述蛋白质的编码基因的表达量可为抑制或降低或下调所述编码基因表达。抑制或降低或下调所述编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knock-out)是指通过基因编辑技术使特定靶基因失活的现象。基因敲除通过DNA序列的改变使特定靶基因失活，包括且不限于基于锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)，转录激活因子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)和CRISPR/Cas系统，CRISPR(clusteredregulatoryinterspaced short palindromic repeat)即成簇的规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，Cas9蛋白在RNA的介导下能够对crRNA–tracrRNA识别的靶序列进行切割。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色反应的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述方法得到的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了一种培育植物组织的人参皂苷含量改变的植物的方法，包括：1)抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到植物组织人参皂苷含量提高的植物；
2)提高、增强和/或上调增加目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到组织中人参皂苷含量降低的植物。
作为本发明的一种实施方案，所述培育人参皂苷含量的提高的植物的方法包括如下步骤：
(1)构建含有调控如SEQ ID No.2所示的目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量的表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体导入植物中；
(3)经筛选和鉴定获得植物组织人参皂苷含量改变的植物。
在一个具体的实施例中，培育人参皂苷含量提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中的编码PqEXLB1蛋白的核酸分子表达，得到人参皂苷含量提高的转基因植物。
本发明中，所述抑制目的植物中的编码PqEXLB1蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码PqEXLB1蛋白的核酸分子为靶标的干扰载体实现。
本发明中，所述抑制目的植物中的编码PqEXLB1蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码PqEXLB1蛋白的核酸分子为靶标的基因编辑载体实现。
具体的，所述以编码PqEXLB1蛋白的核酸分子为靶标的干扰载体为pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi。
所述干扰载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi是在pBWA(V)BS载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入序列为SEQ ID No.4的DNA片段，保持pBWA(V)BS载体其他序列不变得到的干扰载体。
所述干扰载体转入西洋参愈伤组织中的方法可为基因枪法。
本发明中，所述植物组织可为植物愈伤组织。
所述人参皂苷含量的检测方法为利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)对所述转基因愈伤组织人参皂苷含量进行测定。
所述人参皂苷种类具体为人参皂苷Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Re、Rf、F1。
所述转基因植物的愈伤组织的人参皂苷含量与野生型相比显著升高。
本发明中，所述植物育种的目的包括培育人参皂苷含量提高的植物。
上述应用或方法中，所述植物是如下中的任一种：
C1)双子叶植物；
C2)伞形目植物；
C3)五加科植物；
C4)人参属植物；
C5)西洋参。
本发明从西洋参cDNA中获得PqEXLB1基因编码区序列，选择该基因特异性RNAi片段，构建RNAi干扰载体并将植物表达载体转入西洋参愈伤组织。对获得的转基因愈伤组织的人参皂苷检测，结果表明干扰PqEXLB1基因的表达可以提高人参皂苷的含量。本实验获得的西洋参转基因愈伤组织，较野生型相比极大的提高了多种人参皂苷的含量，为实现西洋参组织培养生产人参皂苷的工业化、产业化，解决西洋参临床不足提供有效手段。
附图说明
图1为pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi载体图谱。
图2为抗性愈伤组织筛选结果。
图3为抗性愈伤组织PCR检测。其中泳道M：DNA Marker D2000Plus；泳道1：pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi载体质粒；泳道2-4：阳性愈伤组织RNAi1、RNAi2、RNAi3，5：野生型西洋参愈伤组织；6：无菌水。
图4为转基因愈伤组织PqEXLB1基因表达量分析。
图5为转基因愈伤组织对人参皂苷的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的出发载体pBWA(V)BS购于武汉伯远生物科技有限公司，货号REC22D。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的西洋参愈伤组织由本实验室保存，已记载于：王腾腾,胡进,袁媛等.BBM基因对西洋参愈伤组织生长及人参皂苷含量的影响[J].中国中药杂志,2023,48(12):3156-3161.DOI:10.19540。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例采用Excel 2021对数据进行整理，SPSS20.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异；利用Graphpad Prism 9.0.0软件进行分析绘图。
下述实施例中使用的引物信息如下表1。
表1、本发明使用的引物信息
实施例1、西洋参蛋白PqEXLB1的编码基因的克隆
1、西洋参总RNA的提取
以野生西洋参为模板，按照天根公司的RNAprep pure Plant kit试剂盒提取西洋参根部总RNA。
2、cDNA第一条链的合成
使用北京全式金生物公司的cDNA合成试剂盒(TranScript First-StrantcDNASynthesis)对RNA进行反转录获得单链cDNA。
3、从西洋参cDNA中克隆PqEXLB1基因
使用引物1和引物2(具体序列见表1)对获得的单链cDNA进行PCR扩增克隆PqEXLB1基因全长CDS序列。使用FastPfu Fly DNA Polymerase高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。
PqEXLB1基因在西洋参的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2，编码氨基酸序列是SEQID No.1的PqEXLB1蛋白。西洋参的基因组DNA中，编码PqEXLB1蛋白的基因组序列如序列表的SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.3的第267-399位为第一外显子，第783-889位为第二外显子，第1206-1517位为第三外显子，第1624-1821位为第四外显子。
实施例2、干扰载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi的构建及转化
1、干扰载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi的构建
1)设计3对引物(具体序列见表1)，引物3和引物4引物对cDAN进行扩增，获得PCR产物片段的序列为SEQ ID No.5；引物5和引物6对载体试剂盒中的中的Loop(DNA模板)进行扩增，获得PCR产物片段的序列为SEQ ID No.6；引物7和引物8对cDAN进行扩增，获得PCR产物片段的序列为SEQ ID No.7。
2)将PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下对3个目标条带进行切胶，放在一个体系中进行溶胶回收。利用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，根据说明书进行DNA回收及纯化。
3)使用BsaI酶分别对pBWA(V)BS载体和回收产物进行酶切。将载体酶切物和回收片段酶切产物合并一起用PCR纯化试剂盒进行纯化，纯化后使用T4连接酶进行连接，干扰载体图谱如图1。
将步骤3)获得的连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司，货号CD501-03)中，选取阳性菌落进行测序，测序成功后使用TIANprepRapid Mini Plasmid Kit质粒提取试剂盒提取质粒。
干扰载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi的结构描述如下：在pBWA(V)BS载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入序列为SEQ ID No.4的DNA片段，保持pBWA(V)BS载体其他序列不变得到的重组质粒。
2、干扰载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi转化西洋参愈伤组织
1)西洋参愈伤组织的培养：西洋参愈伤组织培养条件为28℃，暗培养，每14天更换一次西洋参愈伤组织MS培养基。
培养基配方如下：
西洋参愈伤组织MS培养基：MS+2,4-D 1mg/L+KT 0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH:5.8。
西洋参愈伤高渗培养基：MS+2,4-D 1mg/L+KT 0.25mg/L+蔗糖90g/L+琼脂8g/L，pH:5.8。
西洋参筛选培养基：MS+2,4-D 1mg/L+KT 0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+草铵膦5mg/L，pH:5.8。
2)金粉-DNA子弹的制备：将30mg金粉加入75％乙醇后涡旋后离心，去上清液后加入95％乙醇重悬金粉，重复3次。用无菌水清洗三次后加入500μl灭菌甘油，涡旋振荡5min，使金粉悬浮液浓度为60mg/mL，分装后保存于-20℃冰箱备用。在灭菌后的1.5mL离心管中加入制备好的金粉悬浮液，依次加入质粒、无菌水、CaCl2、亚精胺，混匀后12000rpm，4℃离心5min，弃上清。无水乙醇清洗两次，加入相应的无水乙醇，涡旋混匀，使金粉悬浮。
3)基因枪轰击愈伤组织：使用基因枪对在高渗培养基上预培养后的愈伤组织进行轰击。
4)轰击后筛选培养：将基因枪轰击后的愈伤组织转入含有草铵膦(澳大利亚巴斯夫(中国)有限公司，货号20181127C1)的筛选培养基中进行培养，每14天更换一次培养基，直至长出具有草铵膦抗性的愈伤组织，之后将获得的抗性愈伤组织分别转入MS培养基中进行单独扩繁培养。。
结果如图2所示：未转入载体pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi的愈伤组织因不具有草铵膦抗性会逐渐褐化进而死亡，而成功转入的愈伤组织会含有Bar基因而产生草铵膦抗性，经过筛选培养后获得具有抗性的转基因愈伤组织。
3、含有pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi载体的阳性愈伤组织分子鉴定及转基因愈伤组织基因表达量分析
1)利用Hi-DNAsecure Plant Kit植物基因组提取试剂盒提取步骤2获得的草铵膦抗性愈伤组织的DNA，以pBWA(V)BS：PqEXLB1RNAi质粒为阳性对照，以野生型愈伤组织及无菌水作为阴性对照，使用引物9和引物10(具体序列见表1)进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，使用凝胶成像系统进行成像分析。
结果显示(图3)：抗性愈伤组织中扩增出与阳性对照大小一致为526bp的条带的基因片段为阳性转基因愈伤组织，分别命名为RNAi1、RNAi2、RNAi3。
2)利用实时荧光定量PCR技术测定转基因愈伤组织PqEXLB1基因表达量，使用引物11和引物12(具体序列见表1)，以转基因愈伤组织的cDNA为模板，以野生型西洋参愈伤组织的cDNA为对照，利用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)试剂盒进行实时荧光定量PCR，采用2-△△CT法分析结果，结果如图4。
图4中显示：转基因愈伤组织RNAi1、RNAi2、RNAi3的PqEXLB1基因表达量均显著低于野生型愈伤组织。
实施例3、转基因愈伤组织人参皂苷含量分析
1、供试品溶液制备：将愈伤组织冷冻干燥后，研成粉末后称取0.1g，精密称定后加入70％甲醇2mL，25℃超声提取离心10min，离心后取样品上清液，过0.22μm疏水PTFE微孔滤头，滤液作为供试品溶液置于进样瓶中，重复3次。
2、对照品溶液的制备：分别精密称取适量人参皂苷Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Rf、Re、F1对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为：Z09A9X67397、A09GB144447、M11GB141261、G01O11Y126429、C27N11Q132589、P14O11L127486、P25F12L140073、J25O9A73424、27J9X64348)，以70％的甲醇溶解并定容，摇匀，配制成1g/L的混合对照品储备液。取适量储备液，用甲醇稀释配制成质量浓度分别为1、7、10、70、400、700、1000、4000、10000、15000、3000、4000、5000、6000ng/L混合对照品溶液。
3、Q-TRAP-MS-MS分析条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC-T3(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.05％甲酸水(B)；流速：0.4mL·min-1；进样量：1μL；柱温：40℃，液相色谱梯度如表2所示。质谱条件：离子源Turbo V；电离模式ESI-；气帘气(CUR)体积流量30l/min；喷雾电压(IS)4500V；雾化气(GS1)体积流量55L/min；加热辅助气(GS2)体积流量55L/min；采集方式MRM；离子化温度(TEMP)550℃。质谱条件参数见表3。
表2、液相色谱梯度条件
时间 A(0.1％甲酸-乙腈) B(0.1％甲酸-水)
0min 28％ 72％
2.5min 31％ 69％
3.0min 35％ 65％
4.5min 36％ 64％
6.0min 37％ 63％
7.0min 50％ 50％
9.0min 98％ 2％
11.0mi 98％ 2％
12.0mi 28％ 72％
15.0mi 28％ 72％
表3、UPLC-Q-TRAP-MS-MS质谱条件
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4、利用Excel 2021对数据进行整理，SPSS20.0软件进行单因素方差分析；利用Graphpad Prism 9.0.0软件进行分析绘图。
结果如图5所示：RNAi干扰愈伤组织人参皂苷Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Re、Rf、F1含量较野生型愈伤组织大大升高。其中RNAi1干扰愈伤组织人参皂苷Rd、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Rf、Re、F1含量显著高于野生型愈伤组织，其中Rh1升高约59.7倍、RNAi2干扰愈伤组织人参皂苷Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Re、F1含量显著高于野生型愈伤组织，其中Rb1升高约39.1倍；RNAi3干扰愈伤组织人参皂苷Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Rf、Re、F1含量显著高于野生型愈伤组织，其中Rg2升高约26.8倍。
本研究证明，干扰PqEXLB1基因的表达，可以极大的提高Rd、Ro、20s-Rh1、Rb1、Rg1、Rg2、Re、Rf、F1人参皂苷的含量，对后续研究具有重要的指导意义和应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质，所述蛋白质是如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物组织人参皂苷含量的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质来源于西洋参。
3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下E1)或E2)所示的基因：
E1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
E2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
5.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
U1)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物组织人参皂苷含量中的应用；
U2)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物组织人参皂苷含量的产品中的应用；
U3)权利要求1或2所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育人参皂苷含量改变的植物中的应用；
U4)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育人参皂苷含量提高的植物的产品中的应用；
U5)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为权利要求3所述的生物材料。
7.一种调控植物组织人参皂苷含量的方法，其特征在于：包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物组织人参皂苷含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入抑制所述蛋白质的编码基因的DNA分子，得到植物组织人参皂苷含量高于所述受体植物的目的植物；所述编码基因编码权利要求1或2中所述蛋白质。
9.培育植物组织人参皂苷含量改变的植物的方法，包括：1)抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到组织人参皂苷含量提高的植物；
2)提高、增强和/或上调增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到植物组织人参皂苷含量降低的植物。
10.根据权利要求5或6所述的应用，根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物是如下中的任一种：
C1)双子叶植物；
C2)伞形目植物；
C3)五加科植物；
C4)人参属植物；
C5)西洋参。
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