CN110628769B - 花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、重组表达载体及其制备方法 - Google Patents

花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、重组表达载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、重组表达载体及其制备方法，该启动子的核苷酸序列选自下述情况之一：(a)，为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(b)，能与(a)中的核苷酸序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；(c)，与(a)或者(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性，并且具有启动子功能的核苷酸序列。其制备方式包括提取花生基因组DNA、PCR扩增以及产物筛选三个过程。该启动子能够驱动GUS基因在花生叶源愈伤组织中高效表达。通过基因枪介导瞬时转化花生叶源愈伤组织实验证明，该启动子在花生叶源愈伤中高强度驱动GUS标记基因的表达，说明Arahy7F1JQP启动子在花生叶源愈伤中高表达，进而驱动目的基因高表达，可作为花生改良的工具。

Description

花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、重组表达载体及 其制备方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，涉及一种花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、含有该启动子的重组表达载体、制备方法及其在花生改良中的应用。
背景技术
通过转基因手段研究作物重要基因功能，已经成为作物品种改良的重要手段。从1996年到2018年，转基因作物商业化已经历时23年，全球转基因作物累计种植面积达到23亿公顷，超过60个国家和地区应用了转基因作物。
植物转基因依赖于启动子和基因DNA序列的功能，可以说启动子和基因是转基因手段的两个重要元件。启动子是位于基因起始位点上游的顺式调控元件，决定了基因表达的时间和空间，在植物发育的不同阶段不同组织差异化地调控基因的表达。
按照作用方式和功能的不同，启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子和条件诱导型启动子。组成型启动子往往驱动表达一些看家基因，同时表达量往往较高。在植物中应用比较广泛的组成型启动子有烟草花叶病毒(CaMV)的35S强启动子或者泛素Ubi强启动子；组织特异性启动子是指在特定时期特定组织中驱动基因表达的启动子，例如根特异性启动子、花药特异性启动子、胚乳特异性启动子等等；条件诱导型启动子是指在添加特殊的物质或者给予特定的条件后诱导驱动基因表达的启动子，例如乳糖启动子、雌激素启动子、热诱导启动子、光诱导启动子等等。启动子的功能千差万别，鉴定发现有功能的启动子，可以促进转基因科学的快速发展，提高作物改良的效率。
花生作为优质食用油的原料，是我国重要的油料作物和经济作物，其总产量和消费量占世界的40％以上，出口量占世界的55％以上(联合国数据中心，2012)，在国际上具有很强的竞争力。花生种子含油量非常丰富，平均含油量可达51％左右，广受市场欢迎。花生油的主要成分有单不饱和脂肪酸油酸oleic acid(C18:1，Δ9)、多不饱和脂肪酸亚油酸linoleic acid(C18:2，Δ9，Δ12)以及饱和脂肪酸软脂酸palmitic acid(C16:0)组成，其中不饱和脂肪酸油酸和亚油酸含量共占总油脂含量的约80％，因此花生油是一种十分营养健康的植物食用油。
尽管基因技术已经发展了数十年，但是面对花生改良中遇到的实际生产问题(如提高含油量、改善油品、抗虫害、抗干旱、抗水涝、抗盐碱、抗病害等)，仍然缺乏有效的手段。应用基因技术改良花生是一条重要的途径，其中重要的花生启动子资源的挖掘和应用为解决花生基因技术改良提供了重要的工具和手段。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，提供了一种花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子、重组表达载体及其制备方法。
本发明的第一目的，提供了一种花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子，该启动子的核苷酸序列选自下述情况之一：
(a)为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(b)能与(a)中的核苷酸序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；
(c)与(a)或者(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性，并且具有启动子功能的核苷酸序列。
该启动子属于组织特异性启动子，其时空表达模式为叶源愈伤组织高表达模式，可驱动目的基因在叶源愈伤组织中进行高丰度的表达，能够精确定位驱动表达所调控的基因；同时该启动子为强启动子，能够高效驱动目的基因在叶源愈伤组织中实现高表达，从而应用于植物基因工程和花生叶源愈伤再生的研究中。
优选的，本发明中的上述启动子能够驱动GUS基因在花生叶源愈伤组织中高效表达。通过基因枪介导瞬时转化花生叶源愈伤组织实验证明，该启动子在花生叶源愈伤中高强度驱动GUS标记基因的表达，说明Arahy7F1JQP启动子在花生叶源愈伤中高表达，进而驱动目的基因高表达。因此，可以用此启动子作为花生改良的工具，改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病、限制外源基因扩散等。
本发明的第二目的，提供了上述花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
A、利用CTAB方法提取花生基因组DNA，所用引物PArahy7F1JQP-F以及PArahy7F1JQP-R的序列如下：
PArahy7F1JQP-F：5’-CCATGGAAAAGTAACTTTATCAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
PArahy7F1JQP-R：5’-AACTATATGATTGAGTGAAGAGGG-3’(SEQ ID NO.3)。
B、PCR扩增
以基因组DNA为模板，以PArahy7F1JQP-F、PArahy7F1JQP-R为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL、10μmol/LPArahy7F1JQP-F5μL、10μmol/L PArahy7F1JQP-R 5μL、花生基因组DNA模板50～300ng，用水补足体积；
扩增过程如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，36个循环；72℃延伸20分钟。
C、产物筛选
PCR产物经质量体积比1％的琼脂糖凝胶检测并回收片段：按目的片段、pEASY-BLUNT载体试剂5:1的体积比混合，25℃连接半小时，获得连接产物；
将连接产物转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜，进行菌落PCR鉴定；而后将阳性重组子接种到含有卡那霉素50mg/L的液体LB培养基中，37℃200rpm转速培养过夜，次日用小量碱裂解提取质粒进行测序分析，获得测序正确的质粒，即获得所述Arahy7F1JQP启动子。
优选的，LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和20g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用；
LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于1000mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用。
本发明的第三目的在于，提供含有Arahy7F1JQP启动子编码基因的重组表达载体，包括含有Arahy7F1JQP启动子编码基因的表达质粒、高表达腺病毒或慢病毒。
优选的，该重组载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。
本发明的第四目的在于，提供上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：
A、克隆如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
B、构建含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组质粒，包括如下步骤：
(a)PCR扩增
以含有Arahy7F1JQP基因启动子序列的基因组或者质粒为模板，以PArahy7F1JQP-F、PArahy7F1JQP-R为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括：2×TransStart FastPfuPCR SuperMix 25μL、10μmol/L PArahy7F1JQP-F 5μL、10μmol/L PArahy7F1JQP-R 5μL、花生基因组DNA模板50～300ng，用水补足体积；
扩增过程如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，36个循环；72℃延伸20分钟。
(b)产物筛选
用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳分离并回收启动子片段(3Kb)；同时对含GUS报告基因的PCAMBIA1300GN载体进行FastDigest EcorV酶切，酶切反应在37℃培养箱中进行，反应10分钟后用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳检测并使用凝胶回收试剂盒回收载体片段(11Kb)；
按照3Kb的启动子片段、11Kb载体片段以3:1的摩尔比混合，加入T4快速连接酶1μL(5个单位)、10×反应缓冲液3μL，用无菌水补足体积至30μL，25℃连接半小时；
用冻融法转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经测序验证对正确的重组质粒命名为p1300GN-PArahy7F1JQP。
本发明的第五目的在于提供一种含有上述重组表达载体的重组细胞。
本发明的第六目的在于提供花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子在花生改良中的用途。优选的该用途包括改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病或限制外源基因扩散。
本发明的有益保障及效果如下：
首先，本发明的PArahy7F1JQP启动子的时空表达模式为叶源愈伤组织高表达模式，可驱动目的基因在叶源愈伤组织中进行高丰度的表达，由于其属于来源于植物内源的组织特异性启动子，能够精确定位驱动表达所调控的基因；同时该启动子为强启动子，可以高效驱动目的基因在叶源愈伤组织中实现高表达的目的，可应用于植物基因工程和花生叶源愈伤再生的研究中。
其次，本发明的启动子能够调控下游GUS基因表达，并通过组织化学分析，获得具有叶源愈伤组织中表达功能的花生启动子。这一具有叶源愈伤组织特异性表达的强启动子在植物基因工程和基因安全中具有应用价值，如改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病、限制外源基因扩散等方面。
第三、本发明克隆到的花生来源的启动子PArahy7F1JQP，从改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病、限制外源基因扩散等方面考虑，具有应用潜力。将PArahy7F1JQP启动子连接到PCAMBIA1300GN质粒上的多克隆位点中，构建p1300GN-PArahy7F1JQP重组植物表达载体，其中的GUS基因受PArahy7F1JQP启动子的调控。通过基因枪介导瞬时转化花生叶源愈伤组织实验证明，该启动子在花生叶源愈伤中高强度驱动GUS基因的表达，可以用此启动子作为花生改良的工具，改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病、限制外源基因扩散等。
第四，本发明的基因启动子PArahy7F1JQP制备方法，操作简单、结果可靠，易于实施；提供的含有该启动子核苷酸序列植物的重组载体，大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过该载体转化花生可以实现GUS基因在花生叶源愈伤组织中高效表达。
附图说明
图1为本发明中PCR扩增PArahy7F1JQP启动子片段的电泳图，泳道1为PCR扩增结果；泳道M代表2K plus ladder的核酸Marker；
图2为本发明中PCAMBIA1300GN使用EcorV限制性内切酶酶切后的载体电泳图，泳道1为pCAMBIA1300GN载体的酶切产物片段；泳道M代表2K ladder的核酸Marker。
图3为本发明构建的p1300GN-PArahy7F1JQP载体示意图；
图4为本发明中的Arahy7F1JQP驱动GUS在花生叶源愈伤组织中表达的组织化学染色结果，A：空白对照；B：阳性对照组pCAMBIA1301-GUS(为35S强启动子驱动GUS表达的载体)；C：实验组p1300GN-PArahy7F1JQP。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
实施例1.花生Arahy7F1JQP启动子的制备
1、花生基因组DNA
利用CTAB方法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)科学出版社)提取栽培种花生(Arachis hypogeaeL.)基因组DNA，所用引物PArahy7F1JQP-F以及PArahy7F1JQP-R的序列如下：
PArahy7F1JQP-F：5’-CCATGGAAAAGTAACTTTATCAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
PArahy7F1JQP-R：5’-AACTATATGATTGAGTGAAGAGGG-3’(SEQ ID NO.3)。
2、PCR扩增
以基因组DNA为模板，以PArahy7F1JQP-F、PArahy7F1JQP-R为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL、10μmol/LPArahy7F1JQP-F 5μL、10μmol/L PArahy7F1JQP-R 5μL、花生基因组DNA模板50～300ng，用水补足体积；
扩增过程如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，36个循环；72℃延伸20分钟。
PCR扩增PArahy7F1JQP启动子片段的电泳图如图1所示，其中泳道1为PCR扩增结果；泳道M代表2K plus ladder的核酸Marker；
3、产物筛选
PCR产物经质量体积比1％的琼脂糖凝胶检测，并采用凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)公司)回收3Kb的片段回收片段：按目的片段、pEASY-BLUNT载体试剂5:1的体积比混合，25℃连接半小时，获得连接产物；
将连接产物转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜，进行菌落PCR鉴定；而后将阳性重组子接种到含有卡那霉素50mg/L的液体LB培养基中，37℃200rpm转速培养过夜，次日用小量碱裂解提取质粒进行测序分析，获得测序正确的质粒，即获得所述Arahy7F1JQP启动子。
LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和20g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用；
LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于1000mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用。
根据该制备方法克隆得到的花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP基因启动子，该启动子的核苷酸序列选自下述情况之一：
(a)为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(b)能与(a)中的核苷酸序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；
(c)与(a)或者(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性，并且具有启动子功能的核苷酸序列。
实施例2.Arahy7F1JQP启动子重组质粒构建
在质粒pCAMBIA1300GN(中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所保存)多克隆位点中的EcorV位点插入PArahy7F1JQP启动子序列获得p1300GN-PArahy7F1JQP载体，其载体示意结构如图3所示。
为完成此目的，首先用EcorV平端单酶切克隆载体pCAMBIA1300-GN，酶切反应在37℃培养箱中进行，约反应20分钟后，用1％(质量体积比，下同)的琼脂糖胶电泳检测(图2)并使用核酸凝胶回收试剂盒回收约11Kb的片段。
将凝胶回收的PArahy7F1JQP启动子片段和pCAMBIA1300-GN酶切回收的片段按照摩尔浓度比3:1的比例混合，加入T4快速连接酶1微升(5个单位)、10×反应缓冲液3μL，用无菌水补足体积至30μL，25℃连接半小时；
用冻融法转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞(上海唯地生物科技有限公司)，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经测序验证对正确的重组质粒命名为p1300GN-PArahy7F1JQP；构建成植物表达载体p1300GN-PArahy7F1JQP(图3)。验证正确的含p1300GN-PArahy7F1JQP质粒的大肠杆菌菌株使用质粒大提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)进行质粒大量提取，-20℃备用。
为了确保载体中启动子的序列信息，以M13F/M13R为引物：
M13F：5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3＇(SEQ ID NO.4)
M13R：5＇-GTAAAACGACGGCCAGT-3＇(SEQ ID NO.5)。
将pEASY-BLUNT-PArahy7F1JQP进行测序，分析结果，获得了PArahy7F1JQP，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
实施例3.花生叶源愈伤组织的获得及植物表达载体p1300GN-Arahy7F1JQP的基因枪转化
1、花生叶源愈伤组织诱导培养
对鲁花11号花生种子进行消毒，步骤如下：75％酒精消毒10分钟，1％次氯酸钠溶液消毒20分钟；将种子播种到MS培养基中26度，16小时光照/8小时黑暗，培养2周，获得无菌苗；将无菌苗的真叶切成3cm×3cm小片，接种到花生叶源愈伤组织诱导培养基中，26度，16小时光照/8小时黑暗，诱导培养1个月。
其中，1升MS固体培养基配置方法如下：4.43克M519MS粉(PhytoTechnology公司产品)，蔗糖10g，琼脂粉8克，使用KOH调节pH至5.7，100ml每瓶分装到组培瓶中，121℃高温高压灭菌20分钟，常温备用。
1L花生叶源愈伤组织诱导固体培养基配置方法如下：4.43克M519MS粉(PhytoTechnology公司产品)，蔗糖10g，琼脂粉8克，2,4-D植物激素粉末2mg，使用KOH调节pH至5.7，100ml每瓶分装到组培瓶中，121℃高温高压灭菌20分钟，常温备用。
2、植物表达载体p1300GN-Arahy7F1JQP的基因枪转化
金粉质粒准备：0.6μm直径的金粉(Bio-Rad伯乐公司)用超声波震荡30秒，加入2μg植物表达载体质粒，加入0.1M亚精胺30μL，2.5M氯化钙60μL，低速超声波震荡10分钟，5000rpm转速离心15秒，去上清，加入500μL冰纯酒精，5000rpm转速离心15秒，去上清，加入200μL冰纯酒精，混匀(同时，把载体膜(Bio-Rad伯乐公司)嵌入金属盖中)，涂布到载体膜上。
将叶源愈伤组织放置在叶源愈伤组织诱导固体培养基平板的正中央位置。安装好650pa的可裂膜(Bio-Rad伯乐公司)，载物台距离设置为9cm，进行枪击。其中使用的基因枪设备为Bio-Rad伯乐PDS-1000台式基因枪。枪击后的材料，移至含20mg/L卡那霉素的叶源愈伤组织诱导固体培养基中，26度，16小时光照/8小时黑暗，继续筛选培养1个月。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性愈伤材料。
实施例4：花生PArahy7F1JQP启动子的功能分析
本发明首次克隆得到PArahy7F1JQP的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，取出存活的叶源愈伤组织进行GUS染色，染色过程如下：
将样品浸泡在GUS染液中，37℃过夜，第二天拍照。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。其中GUS染液的组成为：X-Gluc 2mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-X100 0.001％(体积比)。
根据图4所示的染色结果发现：在花生叶源愈伤组织中用35S强启动子驱动的GUS的阳性对照结果可以看到蓝色信号(图4B)，而用PArahy7F1JQP启动子驱动GUS表达的蓝色信号十分显著(图4C)，未转化质粒的空白对照未看到蓝色信号(图4A)。由此可见，PArahy7F1JQP启动子驱动的GUS基因表达十分强，说明PArahy7F1JQP启动子在花生叶源愈伤组织中表达丰度高，从而实现高效驱动目的基因在叶源愈伤组织中实现高表达的目的。
实验结果表明，花生Arahy7F1JQP启动子具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在花生叶源愈伤组织中高表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和基因安全(花生改良的工具，改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病、限制外源基因扩散)中具有应用价值。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Figure BDA0002211233310000101
Figure BDA0002211233310000111
Figure BDA0002211233310000121
序列表
<110> 上海弥生生物科技有限公司
<120> 花生叶源愈伤组织Arahy7F1JQP启动子、重组表达载体及其制备方法
<130> 权利要求书 说明书
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccatggaaaa gtaactttat caacacttgt gattttttta agcaaagaac aaacacaagg 60
tggacctttg tttaactcag tatcgacttc aggaaattca aaattagact cctcactcga 120
gtgctccatt tcaatatacg aaatcttttc ctttcgagca aaggtcttac ttttcaactt 180
tttatcactt ttcaactttt ctttttcttt tcgaagaatt tctacctatc gaactcttta 240
acccaaatga gctaaatcag gtatatgcac attaagtaac tttccacgta tataaaaacc 300
taaccccata gttgctattt tcattacttc actttcgaga agtgacacgt aacatcgact 360
ccgagcattc ttaaaacgaa tcatgaagtc atcaatcgac tccctatcat tgcacttcaa 420
agctactaaa tcagtgattg ttacattcaa ttctccttta taaaattgga aatgaaaagc 480
actctccaac tgtgtccaag ttacaatcga attaggcctg agatttaaaa actaagtaaa 540
agtatttttc gttaaagaag gaaaaatttt catttttaaa tttttatcat ttgttaaatt 600
gcctaattcg accatatatc gagcaatatg ctcagtagtc gattcaccaa cctctcctgc 660
aaacttgtta ttatcttaag gtttttcaca cccctaggta gctctactat ttgcacgatg 720
acaaaaaaat tcagaaacaa agtatggtta attcataaaa ctcacattaa atccgagcct 780
gttaagaaca tcttcaacaa ttcttgtaac ttgataacat tcaccacgtt gattgactca 840
catttgagcc aatacttcat ctgcattttg atcacgtcga actatttaag ggatattttc 900
acccaactgt gtatcatcat ccctatttct aggcatgttc tctgaatcct ctggatttac 960
tttaacattt tgccgatcac cttcatcata atcaacaatt tgagcaatcc attcaacttg 1020
tttagcaaga cgttcaaact ttaactcatg atcaactatc atgggattca aaatagtagt 1080
catctgctga gtcaataaat tgactaagtt atgatgactt ttatcgacat actatcgaaa 1140
tgccgctaat gaatcagggc catttgatgt tgaacccact tgataatcac ggaaaatttg 1200
aagatgctga aaaggtggtt gattgttaat tgcttctgca tttccaaatc gaattggagg 1260
ctcgtaaata tccattggtg gagtataacc tagaagaagg ctgaaaggag gccaacctac 1320
agttactggc ggttgcgttt gtgttggaat aattcgtggg catgaatttc gcccactatt 1380
cccaacgagg aggttgttaa ccgtcgcatt ttctcccaac atactccctt ccacatgcga 1440
tgtcaactct gcagaagttt gtgcaattat aggaacatta tcatttatag atgatccacc 1500
attagtatta aaaattcgtc cgccatatgt atgacacttc cacttctaag ttgcataaac 1560
taaatcatta caaggcactt tttgacacat tttttaaaac tgtcccaccg gatgtgccaa 1620
tttgttatgc atatttttag caaatttgga ttgattcgat atctaatgat ttgagagaga 1680
aacctactcc tctttaaaga ttccagtttt tagttgtgca tcaaagattc atgttggact 1740
agtgatgaaa cgaaaaaatg tagaaatgaa agacagaaac tacaaactat aaaatttgaa 1800
atgaaaaaga taagaaaaac aaagtaaatg attaaattta aagaaaataa ccaatcacct 1860
ttgacatgat caaagaactt taaaatttga attcattaaa atcaaagaaa gaaagaaaaa 1920
aactgcgaaa aaaataaatt gcagaaaaat atttgcaagg aaaattaaaa tgaaactatg 1980
gaagattttg aaaggaacca tacagaaaaa ataaacttcg agcaaaatca aaagtatatg 2040
gggatatgat gttgtgagag ctttttctaa aaatgaattt caactcttat tccttttaaa 2100
ctatgtctat ttatagtcgt ttttaaccaa tcataattcc ttcacgtgct ccacgtataa 2160
agaaaccaaa cttaagccaa caaattataa ctcaaacggt atagtctctc catcctcact 2220
taaaagtctc gaattcgaat ctaattctta actttaaaaa aaaaaaaaat aaacttaact 2280
attcctacca caaaataata taataatcat ctttaattgg ctcaattatt gatctctcca 2340
ctacttcgat tacaaatctt tattttcgat atacatcttc ggccaatcta attttttcat 2400
tgatgatttt ccttggatca ctttaagtat cttttcaaca tagtccaaac acatgtcttc 2460
aatttattca ttatcaatat attttttttt ccacagtaat aaaatatata actccttacc 2520
gtaccaatta ttcttacact tcaggatgaa ctcgatatat tgaagtcaca tgaaaatgat 2580
attttaatat ccaccgcttc attaatttaa tttgtgccag ctgaacactt gtcaatgtaa 2640
aaccaacaca tcatacaccg tctagaagcc ttattgctta tttttttaat tacacaactt 2700
taaattttaa aataaatccg tctactttga ctaattctgg ggtcttgttt gttttccccc 2760
atcccacttc acattgtccc aatacattaa actgatgaga taagcagcca ccttattatt 2820
attattccaa tttgcaacta gctagtgagc catagtgaac ttaattaatt gttctaagct 2880
aatcaaagtg caaaagagtc tctataaata gcacctcttg ctttgttaca aaccgcatca 2940
ccctcactac taattaagaa gttgaatact ctctcaaccc tcttcactca atcatatagt 3000
t 3001
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 2
ccatggaaaa gtaactttat caac 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aactatatga ttgagtgaag aggg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaaaacgac ggccagt 17

Claims (9)

1.一种花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子，其特征在于，该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子，其特征在于：
其中，所述启动子能够驱动GUS基因在花生叶源愈伤组织中高效表达。
3.权利要求1所述的花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、利用CTAB方法提取花生基因组DNA，所用引物PArahy.7F1JQP-F以及PArahy.7F1JQP-R的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
B、PCR扩增
以基因组DNA为模板，以PArahy.7F1JQP-F、PArahy.7F1JQP-R为引物进行PCR扩增，反应体系包括：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix、10μmol/L PArahy.7F1JQP-F、10μmol/LPArahy.7F1JQP-R、花生基因组DNA模板50～300ng，用水补足体积；
扩增过程如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，36个循环；72℃延伸20分钟；
C、产物筛选
PCR产物经质量体积比1％的琼脂糖凝胶检测并回收片段：按目的片段、pEASY-BLUNT载体试剂5:1的体积比混合，25℃连接半小时，获得连接产物；
将连接产物转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜，进行菌落PCR鉴定；而后将阳性重组子接种到含有卡那霉素50mg/L的液体LB培养基中，37℃200rpm转速培养过夜，次日提取质粒进行测序分析，获得测序正确的质粒，即获得所述Arahy.7F1JQP启动子。
4.根据权利要求3所述的花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子的制备方法，其特征在于：
其中，LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和20g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用；
LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于1000mL蓝盖瓶中，121℃、高温高压灭菌20分钟，室温备用。
5.含有权利要求1所述的Arahy.7F1JQP启动子编码基因的重组表达载体，其特征在于：
所述重组表达载体为含有Arahy.7F1JQP启动子编码基因的表达质粒、高表达腺病毒或慢病毒。
6.权利要求5所述的含有Arahy.7F1JQP启动子编码基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、克隆如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
B、构建含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的含有Arahy.7F1JQP启动子编码基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，步骤B中包括如下步骤：
(a)、PCR扩增
以含有Arahy.7F1JQP基因启动子序列的基因组或者质粒为模板，以PArahy.7F1JQP-F、PArahy.7F1JQP-R为引物进行PCR扩增，PArahy.7F1JQP-F以及PArahy.7F1JQP-R的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，反应体系包括：2×TransStart FastPfu PCRSuperMix、10μmol/L的PArahy.7F1JQP-F、10μmol/L的PArahy.7F1JQP-R、花生基因组DNA模板50～300ng，用水补足体积；
扩增过程如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，36个循环；72℃延伸20分钟，
(b)、产物筛选
用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳分离并回收启动子片段；同时对含GUS报告基因的PCAMBIA1300GN载体进行FastDigest EcorV酶切，酶切反应在37℃培养箱中进行，反应10分钟后用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳检测并使用凝胶回收试剂盒回收载体片段；
按照3Kb的启动子片段、11Kb载体片段以3:1的摩尔比混合，加入T4快速连接酶1μL、10×反应缓冲液3μL，用无菌水补足体积至30μL，25℃连接半小时；
用冻融法转化DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经测序验证对正确的重组质粒命名为p1300GN-PArahy.7F1JQP。
8.权利要求1所述的花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子在花生改良中的用途。
9.根据权利要求8所述的花生叶源愈伤组织Arahy.7F1JQP基因启动子在花生改良中的用途，其特征在于：
其中，所述花生改良包括改良花生油品质、提高花生含油量、改良花生抗虫抗病或限制外源基因扩散。
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